JP2023175822A - 特異的結合分子 - Google Patents

Abstract

【課題】ＶＮＡＲを含むマルチドメイン特異的結合分子、および前記分子を調製する方法を提供する。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）に結合する特異的結合ドメインをも提供する。【解決手段】１以上の特異的抗原の同一または異なるエピトープに結合する２以上のＶＮＡＲドメインを含み、前記ＶＮＡＲドメイン間にスペーサー配列をさらに含むマルチドメイン特異的結合分子であって、前記スペーサー配列が前記マルチドメイン特異的結合分子において示される独立した機能を有し、前記スペーサー配列が免疫グロブリンＦｃ領域であり、前記２以上のＶＮＡＲドメインのそれぞれはＮ－末端からＣ－末端方向にＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の構造を有する、マルチドメイン特異的結合分子を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、ＶＮＡＲを含むマルチドメイン特異的結合分子(multi-domain specific bin
ding molecule)の形成に関する。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合する特異的結合ドメ
インも提供される。

背景
疾病と闘うための、特定の、ますます効果的で、多様化した治療用兵器に関する探索で
は、無数の異なる様式が利用されてきた。伝統的な小分子から漸増的により大きな生物学
的医薬品、例えば、単一結合ドメイン（１０～１５ｋＤａ）から完全ＩｇＧ(～１５０ｋ
Ｄａ）まで。潜在的な治療薬として現在研究されている単一ドメインとしては、多種多様
な別個のタンパク質足場(protein scaffolds)があり、これらはすべて、関連する利点お
よび欠点を伴う。

このような単一ドメイン足場は、異なる種のタンパク質のアレイに由来し得る。新規ま
たは新しい抗原レセプター（ＩｇＮＡＲ）は軟骨魚(cartilaginous fish)の血清中で発見
された約１６０ｋＤａのホモ二量体タンパク質である(Greenberg A. S., et al., Nature
, 1995. 374(6518): p. 168-173, Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p.
25-33; Muller, M.R., et al., mAbs, 2012. 4(6): p. 673-685))。各分子は、単一のＮ
末端可変ドメイン（ＶＮＡＲ）および５つの定常ドメイン（ＣＮＡＲ）から構成される。
ＩｇＮＡＲドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＶＮＡＲ
は、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプター可変ドメインにならびに細胞接着分子に対し
て構造的およびいくつかの配列類似性を有する密に折り畳まれたドメインであり、古典的
な免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターのＮ末端可変ドメイン(N Variable terminal d
omain)に対する類似性によってＶＮＡＲと呼ばれる。ＶＮＡＲは、免疫グロブリンに対し
て限定された配列相同性、例えば、ＶＮＡＲとヒト軽鎖配列との間の２５～３０％類似性
を共有する(Dooley, H. and Flajnik, M. F., Eur. J. Immunol., 2005. 35(3): p. 936-
945)。

Kovaleva M. et al Expert Opin. Biol. Ther. 2014. 14(10): p. 1527-1539およびZie
lonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25は、最近、ＶＮＡＲの構造的特徴と生成の要
約を提供し、これらは参照により組み込まれている。

ＶＮＡＲは、古典的な免疫グロブリン抗体祖先から進化したとは思われない。ＶＮＡＲ
の明確な構造的特徴は、従来の免疫グロブリン可変ドメインに存在するＣＤＲ２ループと
等価な配列の切断、およびＩｇＮＡＲ構造に存在しない軽鎖ドメインとの会合を通常可能
にする疎水性ＶＨ／ＶＬ界面残基の欠損、ならびにＣＤＲ１および３にＮ末端で隣接する
フレームワーク１および３領域におけるシステイン間のカノニカル免疫グロブリンスーパ
ーファミリー架橋(canonical Immunoglobulin superfamily bridge)に加えて追加のジス
ルフィド架橋を形成することが観察されるＣＤＲ領域における追加のシステイン残基のい
くつかのＶＮＡＲサブタイプにおける存在である。

現在まで、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩとして知られるサメＩｇＮＡＲの３つの定義されたタ
イプがある（図１）。これらは、強い選択圧下にあり、したがってほとんど置換されない
非カノニカルシステイン残基(non-canonical cysteine residues)の位置に基づいて分類
されている。

３つのタイプは全て、３６番目の位置の不変トリプトファンと共に、標準免疫グロブリ
ンフォールドを安定化する、３５および１０７番目の位置に古典的免疫グロブリンカノニ
カルシステインを有する（Kabat, E.A. et al. Sequences of proteins of immunologica
l interest. 5th ed. 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS,
NIHにおけるように番号付け）。ＣＤＲ２自体は定義されていないが、ＴＣＲ ＨＶ２お
よびＨＶ４とより密接に比較される配列変異の領域は、それぞれフレームワーク２および
３において定義されている。タイプＩには、フレームワーク２とフレームワーク４に生殖
細胞系列でエンコードされたシステイン残基およびＣＤＲ３内に偶数の追加のシステイン
とを有する。リゾチームに対しておよびリゾチームとの複合体中で単離されたタイプＩ
ＩｇＮＡＲの結晶構造研究により、これらのシステイン残基の寄与を決定することができ
た。フレームワーク２および４のシステインは双方とも、ＣＤＲ３ループがＨＶ２領域に
向かってしっかりと保持される密に充填された構造を形成するＣＤＲ３中のものとジスル
フィド架橋を形成する。今日まで、タイプＩ ＩｇＮＡＲはコモリザメ(nurse shark)に
おいてのみ同定されており、同じオーダーのメンバーを含む、他の全てのエラスモブラン
チは、タイプＩＩまたはこの型のバリエーションのみを有する。

タイプＩＩ ＩｇＮＡＲは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３にシステイン残基を有するものと
して定義され、これらは、これらの２つの領域を近接して保持する分子内ジスルフィド結
合を形成し、結合ポケットまたは溝に導く突出したＣＤＲ３（図２）を生じる。タイプＩ
配列は、一般的に、タイプＩＩより長いＣＤＲ３を有し、それぞれ平均２１および１５残
基である。これは、タイプＩ ＣＤＲ３中の２以上のシステイン残基がそれらのフレーム
ワーク２および４カウンターパートと会合するための強い選択圧(selective pressure)に
起因すると考えられる。体細胞突然変異の蓄積に関する研究により、タイプＩよりもタイ
プＩＩのＣＤＲ１により多数の突然変異が存在するが、タイプＩのＨＶ２領域はタイプＩ
Ｉよりも大きな配列変異を示すことが示される。この証拠は、抗原結合部位内のこれらの
領域の決定された位置とよく相関する。

タイプＩＩＩとして知られる第３のＩｇＮＡＲ型が、新生児において同定されている。
ＩｇＮＡＲファミリーのこのメンバーは、Ｖ遺伝子とのＤ１およびＤ２領域（ＣＤＲ３を
形成する）の生殖細胞融合(germline fusion)のためＣＤＲ３内の多様性を欠く。ほとん
どすべての公知のクローンは、配列多様性をほとんどまたは全く有さない１５残基のＣＤ
Ｒ３長を有する。

ＶＮＡＲの別の構造型は、タイプ（ＩＩＩｂまたはＩＶ）と呼ばれ、２つのカノニカル
システイン残基のみを有する。これまで、このタイプは、主にドッグフィッシュシャーク
(dogfish shark)において見出されており(Liu, J.L., et al. Mol. Immunol. 2007. 44(7
): p. 1775-1783; Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): p. 17408-19)
、ウォベゴングシャーク(wobbegong shark)由来の半合成Ｖ－ＮＡＲライブラリーからも
単離された(Streltsov, V.A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(34):
p. 12444-12449)。

しかし、ＶＮＡＲ配列から形成された合成ライブラリーから単離された特異的ＶＮＡＲ
が他のタンパク質に高い親和性で結合することができ(Shao C.Y. et al. Mol Immunol. 2
007. 44(4): p. 656-65; WO2014/173959)、軟骨魚(cartilaginous fish)が抗原および抗
原に結合する得られた応答性ＩｇＮＡＲで免疫化できるので、ＩｇＮＡＲが適応免疫系の
一部である(Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; WO2003/014161
)ことが示されている。ＩｇＮＡＲは、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターと類似の
ＤおよびＪ配列とＶ様配列との組み合わせ結合(combinatorial joining)のためのメカニ
ズムを有することが示されている(Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25に要約
されている）。

ＶＮＡＲ結合表面は、他の天然免疫グロブリン中の可変ドメインとは異なり、ＦＷ１－
ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の順序で介
在するフレームワーク配列(intervening framework sequences)によって連結された、多
様な４つの領域：ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４およびＣＤＲ３に由来する（Stanfield, R.
L., et al, Science, 2004. 305(5691): p. 1770-1773; Streltsov, V.A., et al, Prote
in Sci., 2005. 14(11): p. 2901-2909; Stanfield, R. L., et al., J Mol. Biol., 200
7. 367(2): p. 358-372をも参照）。天然の軽鎖パートナーの欠如およびＣＤＲ２の欠如
の組み合わせにより、ＶＮＡＲは脊椎動物界における最小の天然に存在する結合ドメイン
となる。

ＩｇＮＡＲは、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ、Hamers-Casterman, C.
et al. Nature, 1993. 363, 446-448; Wesolowski, J., et al., Med Microbiol Immuno
l, 2009. 198(3): p. 157-74）において見出される重鎖のみの免疫グロブリン（ＨＣＡｂ
）といくつかの偶発的特徴を共有する。ＩｇＮＡＲとは異なり、ＨＣＡｂは免疫グロブリ
ンファミリーに明確に由来し、標準的な免疫グロブリンに対して有意な配列相同性を共有
する。重要なことに、ＶＮＡＲの１つの重要な区別としては、古典的な免疫グロブリンま
たはＨＣＡｂとは異なり、分子がその進化のいかなる時点においてもパートナー軽鎖を有
していないことがある。Flajnik M.F. et al PLoS Biol 2011. 9(8): e1001120およびZie
lonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25は、ＶＮＡＲとラクダ科動物由来の免疫グロ
ブリン由来Ｖ_ＨＨ単一結合ドメインとの間の類似性および差異、ならびにそれらの異なる
進化的起源についてコメントしている。

古典的な免疫グロブリンの軽鎖および重鎖（それぞれＶＬおよびＶＨ）に由来する結合
ドメインは、一緒に連結して、免疫グロブリンＶＬおよびＶＨドメインが短いペプチドリ
ンカーによって結合するTraunecker et al. (Traunecker A, et al. EMBO J.1991. 10, p
. 3655-36, Traunecker A, et al. Int J Cancer Suppl.7, 51-52; Neri D. J Mol Biol.
1995. 246(3): p. 367-73)、ｓｃＦｖフォーマット(Bird et al., 1988; Huston et al.
, 1988)において、またはダイアボディとして(Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1993. 90, 6444-6448; Holliger P. et al. Nat. Biotechnol. 15, 632-636。
他の初期の例では、Mack M, et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. 92, p. 7021-702
5, Jost CR, et al Mol. Immunol. 1996. 33, p. 211-219を参照)で、二価または多価の
二重特異性結合体を形成し得ることが示されている。Ｔａｎｄａｂｓは、単一のポリペプ
チド鎖に連結された２対のＶＬおよびＶＨドメインを含む(Kipriyanov S.M. et al., J.
Mol. Biol. 293, 41-56、分子に対して二重特異性および二価を形成する）。

さらに、Ｖ_ＨＨは、一緒に連結して、二価または多価の二重特異性結合体を形成し得る
ことが示されている(Els Conrath et al. J Biol Chem. 2001. 276(10) p.7346-7350)。
同様にして、Ｔ細胞レセプター由来の可変ドメインは免疫グロブリンｓｃＦｖに連結して
、二重特異性フォーマットを形成し得る(McCormack E. et al. Cancer Immunol Immunoth
er. 2013. 62(4): p. 773-85)。古典的免疫グロブリン由来の単一抗体可変ドメイン(ｄＡ
Ｂｓ： Ward E.S. et al. Nature 1989, 341, p. 544-546)もまた、二量体化され得る。
二重特異性結合分子の全体的な概念およびそれらの開発における現在の進歩は最近、例え
ば、Kontermann R. mAbs 2012. 4(2): 185-197; Jost C. and Pluckthun A. Curr Opin S
truct Biol. 2014. 27: p. 102-112; Spiess C. et al. Mol Immunol 2015. 67(2): 95-1
06によって概説されている。

別々の分子上のエピトープを認識する二重特異性分子に加えて、同じタンパク質上の隣
接するエピトープを認識する２つの抗体結合ドメインを連結する概念（ビパラトピック(b
iparatopic)）は、長い歴史を有する(Neri D. J Mol Biol. 1995. 246(3): p. 367-73を
参照のこと）。ビパラトピックＶ_ＨＨ分子が開示されている（例えば、Jahnichen S. et
al Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. 107(47): p. 20565-70; Roovers R.C. et al Int
J Cancer. 2011 129(8): p. 2013-24）。

しかし、Ｖ_ＨＨとは異なり、ＶＮＡＲは二量体融合分子を効率的に形成することができ
ないかもしれないことが示唆されている(Simmons D.P. et al. Immunol Methods. 2006 3
15(1-2): p. 171-84)。（Bispecific Antibodies Konterman R.E. Springer Publishing
2011のコメントもまた参照のこと； Strohl W.R. and Strohl L.M., Therapeutic Antibo
dy Engineering, Woodhead Publishing 2012のｐ３２２／３２３のコメントも参照のこと
）。

発明の要約
本発明は、２以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン特異的結合分子の提供に関
する。より詳細には、本発明は、二価および多価ＶＮＡＲの提供に関する。本発明者らは
、最近、当技術分野における一般的な理解に反して、実際に、ＶＮＡＲの二量体、三量体
および二重特異性融合体が形成され得ることを示した。

最近、Muller M.R. et al mAbs 2012. 4(6): p. 673-685; WO2013/167883)は、１つの
ドメインがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する特異性を有するＶＮＡＲを含む二重特
異的ＶＮＡＲを開示し、これは、二価構造物が血清中でＨＳＡに結合して、これによりパ
ートナードメインの生物学的半減期を延長することを可能にする。ＨＳＡ結合ＶＮＡＲの
Ｎ末端およびＣ末端の両方におけるＶＮＡＲの融合は、ＨＳＡ結合ドメインの機能の保持
と共に実証された。より最近では、ＷＯ ２０１４／１７３９７５で、Ｂ細胞、活性化単
球および樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で構成的に発現される細胞表面抗原で
あるＩＣＯＳＬ(ＣＤ２７５）に結合することができ、Ｂ７ファミリーメンバー、ＩＣＯ
Ｓ(ＣＤ２７８）のリガンドであるＶＮＡＲＳを開示されている(Yoshinaga.S., K., et a
l., Int. Immunol., 2000. 12(10): p. 1439-1447)。これらのＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲのい
くつかは、ＨＳＡ結合ＶＮＡＲＳに連結することができ、両方のドメインが機能性を保持
することが示された。それぞれ異なる抗原（ｈＩＣＯＳＬ、ｍＩＣＯＳＬおよびＨＳＡ）
を認識する三量体を調製することができ、各ドメインは機能を保持することが示された。

しかし、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープを認識する二重特異性または多重特
異的ＶＮＡＲが形成され得ることは、以前に示されていない。さらに、そして予想外にも
、この形態の二重特異性分子は、構成モノマー、またはモノマー形態自体、またはＨＳＡ
を認識するＶＮＡＲに結合したモノマーから形成される二価分子よりも改善された特性を
示す。

本発明は、多価または多重特異性エンティティに組み合わされる能力を有し、そのマル
チドメインエンティティ内で各ドメインが結合機能を保持する特異的ＶＮＡＲドメイン配
列に関する。

従って、本発明の第１の態様において、１以上の特異的抗原の同一または異なるエピト
ープに結合する２以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン特異的結合分子(multi-d
omain specific binding molecule)が提供される。

特定の好ましい実施形態において、本発明の第１の態様のマルチドメイン特異的結合分
子中のＶＮＡＲは、特異的抗原上の同じ抗原に結合する。

さらに好ましい実施形態において、マルチドメイン特異的結合分子のＶＮＡＲは、特異
的抗原上の異なるエピトープに結合する。これらの実施形態によるマルチドメイン特異的
結合分子は、本明細書にさらに記載されるように、バイパラトピック分子(bi-paratopic
molecule)と呼ぶことができる。

一実施形態において、特異的ＶＮＡＲ結合ドメイン配列が多価または多重特異性エンテ
ィティに組み合わされ(combine into)、そのマルチドメインエンティティ内で、各ドメイ
ンが結合機能を保持し、上記結合ドメインは単一の抗原上の異なるエピトープを認識する
。

本発明の好ましい実施形態は、結合特異性が単一の特異的抗原上の異なるエピトープに
対するものであり、得られたエンティティが個々のＶＮＡＲ結合ドメインと比較して改善
された特性を示す２つ（またはそれ以上）の異なるＶＮＡＲドメインを含む二重特異性ま
たは多重特異性結合分子である。改善された特性の例としては、モノマーＶＮＡＲと比較
してアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果の増加がある。

好ましくは、本発明のマルチドメイン特異的結合分子のＶＮＡＲドメインは、スペーサ
ー配列によって分離される。より好ましくは、前記スペーサー配列は、結合分子で示され
る独立した機能性を有する。一実施形態では、前記スペーサー配列は、ＶＮＡＲドメイン
またはその機能的断片である。特定の例では、前記スペーサーは、ヒト血清アルブミンま
たはＩＣＯＳＬなどの、血清アルブミンに結合するＶＮＡＲまたはその機能的断片であり
得る。特定の実施形態では、前記スペーサー配列は、配列番号：６７、７７、７８、７９
、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７または８８のいずれか１つのアミノ
酸配列、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する機能的断片を有する。さら
なる実施形態では、前記スペーサー配列は、以下に制限されないがヒト免疫グロブリンＦ
ｃ領域などの、免疫グロブリンのＦｃ部分であってもよい。改善された特性は、例えば、
ＶＮＡＲドメインを間隔をあけて(in space)受動的に分離することによって、または得ら
れるエンティティについてインビボ半減期をより長くし得る血清アルブミン結合等のスペ
ーサーの固有の特性によって、またはＩＣＯＳＬ等の第２の治療的自己免疫標的(second
therapeutic auto-immune target)の認識によって、または免疫グロブリンＦｃ領域の場
合には、免疫系または補体の細胞との結合(engagement)能の導入によって、スペーサーの
特性に部分的または完全に由来し得る。

スペーサー配列によって分離される２以上のＶＮＡＲドメインを含む本発明のマルチド
メイン特異的結合分子の実施形態は、本明細書では、Ｑｕａｄ－Ｘフォーマット(Quad-X
format)と呼ぶことができる。

他の好ましい実施形態では、マルチドメイン特異的結合分子は、１以上の非ＶＮＡＲド
メインをさらに含み得る。前記１以上の非ＶＮＡＲドメインは、ＶＮＡＲドメインに対し
て任意の位置に配置され得る。典型的には、および好ましい実施形態では、前記非ＶＮＡ
Ｒドメインは、ＶＮＡＲドメインに対してＣ末端またはＮ末端であろう。

２以上のＶＮＡＲドメインと、ＶＮＡＲドメインに対してＣ末端またはＮ末端にある非
ＶＮＡＲドメインとを含む本発明のマルチドメイン特異的結合分子の実施形態は、本明細
書では、Ｑｕａｄ－Ｙフォーマット(Quad-Y format)と呼ぶことができる。

例示的な非ＶＮＡＲドメインとしては、ＴＮＦ Ｒ１および免疫グロブリンＦｃがある
が、これらに限定されない。

特異的抗原(specific antigen)は、サイトカイン、成長因子、酵素、細胞表面関連分子
(cell surface associated molecule)、細胞表面膜成分(cell-surface membrane compone
nt)、細胞内分子、細胞外マトリックス成分、間質抗原、血清タンパク質、骨格抗原(skel
etal antigen)、微生物抗原、または通常は免疫特権のある位置(normally immune-privil
eged location)の抗原からなる群からであり得る。

本発明のさらなる態様は、サイトカインを認識するＶＮＡＲ結合ドメインの特定の組み
合わせである。

また、本発明によって、ヒトＴＮＦを認識し、疾患を治療するために現在使用されてい
る全ての他の十分に特徴付けられた抗ＴＮＦ抗体およびＶＨＨバインダーとは異なるエピ
トープに結合する特異的ドメインが提供される。

従って、第２の態様において、本発明は、以下のＣＤＲおよび超可変領域（ＨＶ）を含
むＴＮＦ－α特異的ＶＮＡＲ結合ドメイン、または少なくとも６０％の配列同一性を有す
るその機能的変異体(functional variant thereof)を提供する：

特に好ましい実施形態では、ＴＮＦ－α特異的ＶＮＡＲ結合ドメインは、配列番号２、
７または１２のアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的
変異体を含む。

好ましい実施形態では、本発明のＴＮＦ－α特異的ＶＮＡＲドメインは、特異的抗原上
の特異的エピトープに対する機能的結合活性は保持しながら、例えば、ヒト化、脱免疫化
または類似の技術によって、インビボでの免疫原性の可能性を減少させるように、１以上
のアミノ酸配列位置で修飾される。

本発明の一実施形態は、ＴＮＦαを認識し、本発明に概説される形態において、個々の
結合ドメインよりも改善された機能的特性を提供する、得られるマルチドメイン結合分子
へのＶＮＡＲ結合ドメインの特定の組み合わせ(specific combination)である。ＴＮＦα
を認識すると主張されているＶＮＡＲを産生できることが知られている(Camacho-Villega
s T, et al MAbs. 2013. 5(1): P. 80-85; Bojalil R, et al BMC Immunol. 2013. 14:17
; WO2011/056056; US20110129473; US20140044716)。しかし、これらのＶＮＡＲは、二量
体または二重特異性形態を形成するように連結されていない。さらに、単量体フォーマッ
トのこれらのドメインは、ここで説明した単量体抗ＴＮＦ ＶＮＡＲドメインよりも７０
倍から２００倍効力が低い。

したがって、本発明の第２の態様のＴＮＦ－α特異的ＶＮＡＲ結合ドメインは、第１の
態様のマルチドメイン特異的結合分子における一方または両方のＶＮＡＲドメインとして
使用することができる。したがって、好ましい実施形態では、１以上のＶＮＡＲドメイン
が配列番号２、７もしくは１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくと
も６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、第１の態様のマルチドメイン
特異的結合分子が提供される。他の好ましい実施形態では、２以上のＶＮＡＲドメインが
配列番号２、７もしくは１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも
６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、第１の態様のマルチドメイン特
異的結合分子が提供される。

本発明の第１の態様の他の好ましい実施形態としては、配列番号６５もしくは６６から
なる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその
機能的変異体を有する１以上のＶＮＡＲドメインを含む、第１の態様のマルチドメイン特
異的結合分子がある。第１の態様のさらに別の実施形態としては、配列番号６５もしくは
６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有
するその機能的変異体を有する２以上のＶＮＡＲドメインを含む、第１の態様のマルチド
メイン特異的結合分子がある。

本発明の第１の態様において使用される１以上のＶＮＡＲドメインは、特異的抗原上の
特異的エピトープに対する機能的結合活性を保持しながら、例えば、ヒト化、脱免疫化ま
たは類似の技術によって、インビボでの免疫原能を減少させるように、１以上のアミノ酸
配列位置で修飾され得る。

本発明はまた、本明細書中に記載される任意の態様または実施形態による結合分子をコ
ードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。さらに、本明細書では
、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該宿主細胞が結合分子を産生するような条件
下で培養または維持することを含み、必要であれば前記結合分子を単離することをさらに
含む、本発明に係る結合分子を調製する方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、特異的抗原結合分子および／または本発明の前記態様
のマルチドメイン特異的結合分子を含む医薬組成物が提供される。

本発明の医薬組成物は、任意の適切かつ薬学的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバン
トまたは緩衝溶液を含み得る。本組成物は、さらなる薬学的に活性のある薬剤を含み得る
。そのような担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム
、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに
限定されない。このような組成物は、示されるようなさらなる薬学的に活性のある薬剤を
含み得る。追加の薬剤は、治療用化合物、例えば、抗炎症薬、細胞毒性剤、細胞増殖抑制
剤または抗生物質であってもよい。このような追加の薬剤はそれを必要とする患者への投
与に適した形態で存在してもよく、このような投与は同時、別々、または連続であっても
よい。上記成分は、必要に応じて説明書を含んでもよいキットの形態で調製することがで
きる。

医薬組成物は、例えば、とりわけ、経口、局所、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または皮内
経路による投与などの、患者の疾患を治療するのに有効な任意の有効で便利な様式で投与
することができる。治療においてまたは予防として、活性のある薬剤は、注射可能な組成
物として、例えば、好ましくは等張の、滅菌水性分散液として、個体に投与され得る。

哺乳動物、特にヒトへの投与を目的として、活性のある薬剤の１日あたりの用量は、０
．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、典型的には約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ
または１００ｍｇ／ｋｇ以下であると予想される。いずれにせよ、医師は、個体の年齢、
体重、性別および応答を含む因子に依存するであろう個体に最も適した実際の投薬量を決
定するであろう。上記の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より高い用量ま
たはより低い用量が有益である場合もあり得、そのような場合も本発明の範囲内である。
本発明はまた、使用説明書と共に本明細書に規定される医薬組成物を含むキットを提供す
る。

本発明のさらなる態様によれば、医薬に使用するための先の態様の医薬組成物が提供さ
れる。このような使用は、上記に規定されるような本発明の医薬組成物の治療有効量の投
与による、本発明の結合ドメインの標的抗原とそのリガンドパートナーとの間の相互作用
に関連する疾患の治療のための方法を含む。本組成物は、本発明の少なくとも１つの特異
的抗原結合分子（ＶＮＡＲドメイン）もしくはマルチドメイン特異的結合分子、またはこ
のような分子の組み合わせおよび／またはそのヒト化変異体を含み得る。

本発明のこの態様によると、本発明の結合ドメインの標的抗原とそのリガンドパートナ
ーとの間の相互作用に関連する疾患の治療のための医薬の製造に使用される組成物が提供
される。

このような組成物は、示されるようなさらなる薬学的に活性のある薬剤を含み得る。追
加の薬剤は、治療化合物、例えば、抗炎症薬、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤または抗生物
質であってもよい。このような追加の薬剤はそれを必要とする患者への投与に適した形態
で存在してもよく、このような投与は同時、別々、または連続であってもよい。上記成分
は、必要に応じて説明書を含んでもよいキットの形態で調製することができる。

本発明によれば、医薬に使用される本発明の抗原特異的抗原結合分子(antigen specifi
c antigen binding molecule)またはマルチドメイン特異的結合分子が提供される。従っ
て、本発明のこの態様は、それを必要とする患者における疾患の治療のための医薬の製造
における、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン結合分子のそのような
使用に及ぶ。本発明の抗原特異的抗原結合分子はまた、本発明の医薬組成物に関連して上
記で規定されるような特異的結合分子またはマルチドメイン結合分子を含む融合タンパク
質を調製するために使用され得る。このような使用はまた、本発明の抗原特異的抗原結合
分子またはマルチドメイン結合分子を含む、本明細書中に規定されるような医薬組成物の
治療的に有効な用量の患者への投与を有する、治療を必要とする患者における疾患の治療
方法を包含する。

本明細書で使用される、「治療(treatment)」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物に
利益を与えることができる任意のレジメを含む。獣医学における「非ヒト動物」の治療は
、ウマおよびコンパニオンアニマル（例えば、ネコおよびイヌ）を含む家畜、ならびにヒ
ツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマ科のメンバーを含む農場／農業動物の治療に及ぶ。治
療は、任意の既存の状態または疾患に関する治療的処置であり得る、または予防的（予防
的処置）であり得る。治療は、遺伝性または後天性疾患の治療であってもよい。治療は、
急性または慢性状態の治療であってもよい。治療は、炎症および／または癌に関連する状
態／疾患の治療であってもよい。本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン
特異的結合分子は、以下に制限されないが、変形性関節症、強皮症、腎疾患、関節リウマ
チ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、または任意の炎症性疾患な
どの、疾患の治療に使用され得る。

さらなる態様において、本発明は、ＴＮＦαに特異的に結合する本発明の組成物の治療
有効量の投与を含む、ＴＮＦαによって媒介される状態を治療する方法を提供する。

さらなる態様において、本発明は、ＩＣＯＳＬに特異的に結合する本発明の組成物の有
効量の投与を含む、ＩＣＯＳＬによって媒介される少なくとも１つの状態を治療する方法
を提供する。

本発明のさらなる態様は、細胞表面分子を認識するＶＮＡＲ結合ドメインの特定の組み
合わせである。特定の実施形態では、マルチドメイン結合分子のＶＮＡＲは、異なるクラ
スのリガンドまたは標的に結合する。本明細書に包含される１つの非限定的な例としては
、少なくとも１つのＶＮＡＲドメインが自己免疫疾患に関連する標的に結合し、少なくと
も１つのＶＮＡＲドメインが炎症応答に関連する標的に結合する、本発明の第１の態様の
マルチドメイン特異的結合分子がある。

本発明の特に好ましいマルチドメイン特異的抗原結合分子は、ＴＮＦに特異的なＶＮＡ
ＲおよびＩＣＯＳＬに特異的なＶＮＡＲを含む。好ましくは、ＴＮＦに特異的なＶＮＡＲ
が本発明の第２の態様のＶＮＡＲである。

本発明の１つの実施形態としては、ＩＣＯＳＬを認識し、本発明に概説されるフォーマ
ットにおいて、個々の結合ドメインよりも改善された機能的特性を提供する、得られるマ
ルチドメイン結合分子へのＶＮＡＲ結合ドメインの特定の組み合わせがある。

本出願では、下記の多数の図面を参照する：
図１は、抗コモリザメＩｇＮＡＲハイブリドーマ抗体(anti-Nurse shark IgNAR hybridoma antibody)を用いた免疫処置されたコモリザメ血漿の抗ｈＴＮＦ－α ＩｇＮＡＲ滴定(Anti-hTNF-alpha IgNAR titration)を示す。免疫処置された動物、予備免疫、および出血５(bleed 5)後の血清のＥＬＩＳＡ滴定、免疫処置されたコモリザメにおける抗ｒｈＴＮＦ－α ＩｇＮＡＲ力価の結合ＥＬＩＳＡ測定。検出は、ＧＡ８モノクローナル抗コモリザメＩｇＮＡＲ抗体を用いて行われ、抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ結合抗体を二次抗体として用いた。 図２は、Ｌ９２９細胞におけるｈＴＮＦ－α誘発細胞毒性の中和を示す。このアッセイでは、抗ＴＮＦドメイン（Ｄ１およびＣ４）および対照抗ヒト血清アルブミンドメイン（ＢＡ１１）の細胞バイオアッセイにおけるｈＴＮＦ－αの活性の中和能を測定した。Ｄ１およびＣ４ドメインは双方とも、同様のレベルの濃度依存性中和を示した（計算値については表２を参照のこと）。ＢＡ１１対照は、ｈＴＮＦを認識せず、最高濃度でも中和は観察されなかった。ｈＴＮＦ－α＋アクチノマイシン－Ｄは、中和ドメインの非存在下では古典的な細胞毒性を示す対照として作用した。 図３は、Ｌ９２９線維肉腫細胞株におけるインビトロのｒｈＴＮＦα中和アッセイを示す。Ａ．１×ＬＤ８０［０．３ｎｇ／ｍｌ ｒｈＴＮＦα］の中和、１回の実験あたり重複してｎ＝３、±ＳＥＭ；Ｂ．１０×ＬＤ８０［３ｎｇ／ｍｌ ｒｈＴＮＦα］の中和、１回の実験あたり重複してｎ＝２、±ＳＤ。ＴＮＦ３０－Ｆｃは、ＩｇＧ Ｆｃに融合された免疫処置されたラクダ科から単離された抗ｒｈＴＮＦα Ｖ_ＨＨナノボディ(anti-rhTNFα V_HH nanobody)の融合体である(Coppieters et al., Arthritis and Rheumatism, 2006, 54 (6): 1856-1866; Riechmann et al., J. Immunol. Methods, 1999. 231: 25-38)。Ａｌｂ８－Ｆｃは、ＩｇＧ Ｆｃに融合した、ＨＳＡを認識するＶ_ＨＨドメインである。２Ｖは、既知の標的を認識しないネガティブ対照である。２Ｖ－Ｆｃは、２ＶとＩｇＧ Ｆｃとの融合体である。ｈＴＮＦに特異的な結合剤（Ｄ１、Ｃ４およびＴＮＦ－３０）のみが、遊離ｈＴＮＦの活性の中和を濃度依存的に示すことができた。中和能は、単量体から二価Ｆｃフォーマットへの変換によって増強された。Ｄ１－ＦｃとＣ４－Ｆｃとの組み合わせは、Ｄ１－Ｆｃ単独またはＣ４－Ｆｃ単独よりも優れた中和能をもたらした。（全ての計算された中和値について表２を参照のこと）。両方の対照、Ａｌｂ－８および２Ｖは、この二価Ｆｃフォーマットにおいてさえ中和することができなかった。 図４は、二価および二重特異性構築物のフォーマットの図である。 図５は、二量体ＶＮＡＲおよびＴＮＦ－３０ ＶＨＨ対照（ＴＮＦ３０－ＴＮＦ３０）のＥＬＩＳＡ結合を示す。試験したＶＮＡＲドメインＤ１、Ｃ４、Ｂ４はすべて、両方の可能な配向（例えば、Ｃ４－Ｄ１、Ｂ４－Ｄ１）において、それ自体と対になっているか（例えば、Ｄ１－Ｄ１、Ｃ４－Ｃ４など）、または互いに対になっていた（例えば、Ｄ１－Ｃ４、Ｄ１－Ｂ４）。ＥＬＩＳＡランキングでは、Ｄ１－Ｄ１二量体対が最良（飽和シグナルに到達するのに必要な最低濃度のＶＮＡＲ）として、そしてＢ４－Ｃ４およびＢ４－Ｂ４がこのＥＬＳＡフォーマットにおいて最悪の性能として位置付けられた。数多くのＶＮＡＲ対が、ＶＨＨ二量体対照よりも良好であった。 図６は、ＶＮＡＲ二量体対によるＴＮＦ中和を測定するためのＬ９２９アッセイを示す。抗ＴＮＦα ＶＮＡＲ二量体対であるＤ１－Ｄ１、Ｄ１－Ｃ４、Ｄ１－Ｂ４および陽性対照である抗ＴＮＦ ＶＨＨ二量体（ＴＮＦ３０－ＴＮＦ３０）の中和能を、適切なバイオアッセイを用いて評価した。このアッセイフォーマットにおいて最も強力な中和活性を示すドメイン対は、ＶＮＡＲ対Ｄ１－Ｃ４であった（中和の計算値については表２を参照のこと）。中和ドメインを含まないｈＴＮＦα＋アクチノマイシン－Ｄ処置細胞は、適切な古典的非阻害細胞毒性対照を提供した。 図７は、三量体抗ｈＴＮＦ－αＶＮＡＲを用いた、Ｌ９２９細胞におけるｈＴＮＦα誘導細胞毒性の中和を示す。リード抗ｈＴＮＦ αＶＮＡＲ二量体(lead anti-hTNFα VNAR dimers)（Ｄ１－Ｄ１およびＤ１－Ｃ４）を、両方の二量体構築物の中央に抗ＨＳＡヒト化ＶＮＡＲ(ｓｏｌｏＭＥＲ(商標）ＢＡ１１）を組み込むことによって多価三量体構築物に再フォーマットして、それぞれＤ１－ＢＡ１１－Ｄ１およびＤ１－ＢＡ１１－Ｃ４を得た。これらの多価三量体構築物およびＨｕｍｉｒａ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）およびＴＮＦ３０－ＢＡ１１－ＴＮＦ３０のｈＴＮＦαを中和能を、古典的Ｌ９２９アッセイで評価した。Ｄ１－ＢＡ１１－Ｃ４構築物はＡｄａｌＩｍｕｍａｂと同等の中和能を示し、ＶＨＨ三量体構築物、および抗ｈＴＮＦα二量体（Ｄ１－Ｃ４およびＤ１－Ｄ１）ＶＮＡＲよりも有意に改善された効力を示した（ＮＤ_５０計算値については表２を参照のこと）。 図８は、極性を有するＣａｃｏ２細胞(Polarized Caco2 cells)におけるＣａｃｏ２上皮透過性を示す。Ｃａｃｏ－２細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、ＬＰＳおよびＩＦＮγ＋／－抗ＴＮＦαタンパク質と共に１８時間、処置、インキュベートした。１０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ－デキストラン［３０００～５０００ｋＤａ］５μｌを頂端チャンバー(apical chamber)に添加し、膜を横切って基底外側チャンバー(basolateral chamber)への輸送を、２４時間後に測定した。ＶＮＡＲ／ＶＨＨ単量体およびＶＮＡＲ対照タンパク質による処理は５０ｎＭ濃度で行ったが、ＶＮＡＲ二量体（２Ｃおよび２Ｄ）およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂによる処理は２５ｎＭで行った。ＢＡ１１および２Ｖは非ＴＮＦα結合性ＶＮＡＲ対照であり、Ｂ４は非中和ＴＮＦ結合性ＶＮＡＲである。サイトカイン処理Ｃａｃｏ－２細胞における、抗ｈＴＮＦα ＶＮＡＲ構築物（単量体Ｄ１、Ｃ４、Ｂ４；二量体Ｄ１－Ｄ１、Ｄ１－Ｃ４；三量体Ｄ１－ＢＡ１１－Ｄ１、Ｄ１－ＢＡ１１－Ｃ４）、ＶＨＨ構築物ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３０－ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３０－ＢＡ１１－ＴＮＦ３０、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂの腸壁機能不全(intestinal barrier dysfunction)の予防能を、この古典的アッセイを用いて評価した。ＶＮＡＲドメインＤ１－Ｃ４およびＤ１－ＢＡ１１－Ｃ４は、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂに匹敵する有効性を示した。陰性対照であるＢＡ１１および２Ｖは、腸壁機能不全を予防することができなかった。 図９は、極性を有するＣａｃｏ２細胞(Polarized Caco2 cells)における上皮抵抗性を示す。分化したＣａｃｏ－２細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαおよびＩＦＮγ＋／－抗ＴＮＦαと共に２４時間、処置、インキュベートした。経上皮抵抗に関するサイトカイン処理の効果を、ボルトオームメーター(volt-ohm meter)を用いて測定した。抵抗は、処理中の表面積に対して正規化した（オーム・ｃｍ^２）。ＶＮＡＲ／ＶＨＨ単量体およびＶＮＡＲ対照タンパク質による処理は５０ｎＭ濃度で行ったが、ＶＮＡＲ二量体（２Ｃおよび２Ｄ）およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂによる処理は２５ｎＭで行った。ＢＡ１１および２Ｖは非ＴＮＦα結合性ＶＮＡＲ対照であり、Ｂ４は非中和ＴＮＦ結合性ＶＮＡＲである。［１回の処置あたり８回以上の反復でｎ＝１±ＳＤ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を用いた一方向ＡＮＯＶＡ(one-way ANOVA)、およびＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ］。抗ｈＴＮＦα ＶＮＡＲドメインの、サイトカイン処置Ｃａｃｏ－２細胞における上皮抵抗性の回復効力を、等モル用量範囲でＶＨＨ ＴＮＦ３０および臨床的に利用可能なＡｄａｌＩｍｕｍａｂの効力と比較して調査した。抗ｈＴＮＦα二量体および三量体ＶＮＡＲドメインは、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂで観察された効果に匹敵する様式で上皮抵抗性を回復する有意な能力を示した。陰性対照ＢＡ１１および２Ｖは、上皮抵抗性を回復しなかった。 図１０は、ＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲ－Ｆｃ融合体のフォーマットを示す。 図１１は、ＩＣＯＳＬ ＥＬＩＳＡ結合データを示す。異なる抗ＩＣＯＳＬ Ｑｕａｄ－Ｘ（商標）構築物のヒトおよびマウスＩＣＯＳリガンド双方への結合性ＥＬＩＳＡ。 図１２は、ＴＮＦ Ｒ１ドメイン、ＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲおよびヒトＩｇＧ Ｆｃを組み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲのフォーマットである。 図１３は、ＴＮＦ Ｒ１ドメイン、ＩＣＯＳＬを組み込んだ多価および多重特異的ＶＮＡＲの有効性データである。ＶＮＡＲおよびヒトＩｇＧ Ｆｃは、さらなる改善された機能特性を提供する。ＶＮＡＲ－ＴＮＦＲ１ Ｆｃ二機能性構築物は、細胞を用いた中和アッセイにおいて特異的かつ強力な効力を示す。フォーマット１：抗ＴＮＦα ｓｃＦｖフォーマット２：抗ｍＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲ（ＣＣ３）フォーマット３：抗ｈＩＣＯＳＬ ｓｃＦｖフォーマット４：抗ｈＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲ（２Ｄ４）。 図１４は、ＶＮＡＲ Ｔ４３ホーンシャーク(horn shark)クローンとＶＮＡＲ コモリザメ(Nurse shark)Ｄ１およびＣ４との間のｈＴＮＦ－α結合プロフィールを示す。ホーンシャークのＶＮＡＲ Ｔ４３ならびにＶＮＡＲ Ｄ１およびＣ４の１μｇ／ｍｌのｈＴＮＦα被覆ウェルへの結合性ＥＬＩＳＡ。Ｔ４３クローンの結合プロフィールは、使用した実験濃度では決定できなかった。 図１５は、ＶＮＡＲ Ｔ４３ ホーンシャーク(horn shark)クローンならびにＶＮＡＲ コモリザメ(Nurse shark) Ｄ１およびＣ４のＬ９２９細胞におけるｈＴＮＦ－α中和効力を示す。等モル用量範囲でのホーンシャーク(horn shark) Ｔ４３ ＶＮＡＲと比較した抗ｈＴＮＦα ＶＮＡＲ単量体Ｄ１およびＣ４の中和効力の比較。Ｔ４３ドメインは、いかなる用量依存性中和効果も示さず、ｈＴＮＦαおよびアクチノマイシン－Ｄで処置された保護されていない細胞と同様のプロフィールを有する（表２を参照のこと）。 図１６は、成功裏にヒト化された抗ｈＴＮＦ－α Ｄ１（Ｄ１ ｓｏｌｏＭＥＲ（商標）としても知られる）の結合プロフィールを示す。ＶＮＡＲ Ｄ１ドメインの多数の漸進的に改善されたフレームワークヒト化バージョン(progressively improved framework humanised versions)の結合プロフィール。Ｄ１－ｖ１、Ｄ１－ｖ２、Ｄ１－ｖ３、およびＤ１－ｖ４は、様々なヒト化の程度を表し、ＶＮＡＲ Ｄ１（ｗｔ）は、親のＶＮＡＲ Ｄ１ドメインである。コモリザメフレームワークアミノ酸残基をＤＰＫ－９のもので置換すると、ヒト生殖細胞κ(human germline kappa)は、ヒト化Ｄ１バージョンのｈＴＮＦα認識能を破壊しなかった。 図１７は、Ｄ１ ＳｏｌｏＭＥＲ^TMのＬ９２９細胞における中和効力を示す。Ｌ９２９細胞におけるｈＴＮＦα媒介細胞毒性(hTNFα mediated cytotoxicity)を中和する能力を、ヒト化ＶＮＡＲ Ｄ１変異体で評価した。ｓｏｌｏＭＥＲ Ｄ１－ｖ２は、ｈＴＮＦα誘導細胞毒性に対する中和力を保持した。 図１８は、ヒトＩｇＧ Ｆｃを組み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲのフォーマットである。 図１９は、多価／多重特異的ＶＮＡＲ－Ｆｃ構築物のｈＴＮＦ－α結合プロフィールを示す。バイパラトピック／二重特異性(biparatopic/bispecific)Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標）） ｖｓ バイパラトピック(biparatopic)ＶＮＡＲ Ｆｃ構築物 Ｄ１－ＦｃおよびＣ４－Ｆｃの結合プロフィールを示す。抗ｈＴＮＦ－α ＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（商標）Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４は、ｈＴＮＦαへの結合性を保持し、結合性プロフィールがＤ１－ＦｃおよびＣ４－Ｆｃに匹敵し、これらの比べてわずかに改善された。 図２０は、Ｌ９２９における多価／多重特異的ＶＮＡＲ－Ｆｃ構築物のｈＴＮＦ－α中和活性の評価を示す。ＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（商標） Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ ｖｓ Ｈｕｍｉｒａ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の中和能を、ｈＴＮＦα媒介細胞毒性(hTNFα mediated cytotoxicity)のＬ９２９細胞を用いたアッセイで評価する。ＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｘ（商標） Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４は、中和能力を保持し、Ｈｕｍｉｒａと比較して優れた中和活性を示した（ＮＤ_５０値については表２を参照のこと）。 図２１は、抗マウスＴＮＦ－α ＶＮＡＲ；および抗ＨＳＡ ｓｏｌｏＭＥＲ（商標） ＢＡ１１またはＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲドメイン、Ａ５またはマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃを組み込んだ、本発明の多価バイ－パラトピック(bi-paratopic)ＶＮＡＲのフォーマットを示す。 図２２Ａは、バイ－パラトピック抗マウスＴＮＦ－α ＶＮＡＲ構築物のマウスＴＮＦ－α結合プロフィールを示す。抗ＩＣＯＳリガンドＶＮＡＲ Ａ５または抗ＨＳＡヒト化ＶＮＡＲ、ｓｏｌｏＭＥＲ（商標）ＢＡ１１のいずれかを組み込んだ多価／多重特異的三量体としてＶＮＡＲ抗マウスＴＮＦα Ｓ１７ドメインを再フォーマットする。両方の構築物は、マウスＴＮＦ－αに対する認識を保持した。図２２Ｂは、バイ－パラトピック抗マウスＴＮＦ－α ＶＮＡＲ構築物のＨＳＡ結合プロフィールを示す。抗ＩＣＯＳリガンドＶＮＡＲ Ａ５または抗ＨＳＡヒト化ＶＮＡＲ、ｓｏｌｏＭＥＲ（商標）ＢＡ１１のいずれかを組み込んだ多価／多重特異的三量体としてＶＮＡＲ抗マウスＴＮＦα Ｓ１７ドメインを再フォーマットする。Ｓ１７－ＢＡ１１－Ｓ１７は、ＨＳＡへの結合を保持し、陰性対照であるＳ１７－Ａ５－Ｓ１７はＨＳＡを認識しなかった。図２２Ｃは、バイパラトピック二量体／三量体抗ＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲ構築物のマウスＩＣＯＳリガンド結合プロフィールを示す。マウスＩＣＯＳリガンドへの再フォーマットされたＳ１７－Ａ５－Ｓ１７およびＡ５－Ａ５ホモ二量体の結合プロフィールから、Ｓ１７－Ａ５－Ｓ１７として中央に抗マウスＩＣＯＳリガンドＶＮＡＲ Ａ５を組み込んだ再フォーマットされた三量体構築物はマウスＩＣＯＳリガンドへの結合を保持することが示された。 図２３Ａおよび図２３Ｂは、それぞれ、バイ－パラトピックおよびＩｇＧ２ａ Ｆｃ融合抗マウスＴＮＦ－α ＶＮＡＲ Ｓ１７構築物のＬ９２９プロフィールにおけるマウスＴＮＦ－α中和を示す。抗マウスＴＮＦα構築物（Ｓ１７－Ａ５－Ｓ１７、Ｓ１７－ＢＡ１１－Ｓ１７、Ｓ１７－Ｆｃ）の中和効力を、マウスＴＮＦα媒介細胞毒性Ｌ９２９アッセイで評価した。三量体Ｓ１７およびバイ－パラトピックＳ１７－Ｆｃ構築物は双方とも、Ｌ９２９細胞におけるマウスＴＮＦα媒介細胞毒性に対する中和活性を示した。Ｓ１７－Ａ５－Ｓ１７は、３つの構築物の中で最も高い効力を示した。ＢＡ１１は、アッセイにおいて陰性対照であり、また、ｈＴＮＦα＋アクチノマイシンＤは、抗マウスＴＮＦα阻害剤／中和剤の非存在下で観察された古典的な細胞毒性効果を示した。細胞単独は、健常な未処置細胞を示す。 図２４は、ＣＨＯ系ｈｕＩＣＯＳ／組換えマウスＩＣＯＳリガンド－Ｆｃ（ＩＣＯＳＬ－Ｆｃ）中和（ブロッキング）アッセイ－ＥＬＩＳＡ系(CHO-based huICOS/recombinant mouse ICOS Ligand-Fc (ICOSL-Fc) Neutralisation (blocking) Assay-ELISA based)を示す。このブロッキングアッセイにおいて、多価ＶＮＡＲ構築物は、マウスＩＣＯＳＬ－ＦｃがＣＨＯ細胞上のその同族結合パートナー(cognate binding partner)であるＩＣＯＳと相互作用するのをブロックする有意な能力を示した。これにより、細胞を用いたＥＬＩＳＡフォーマットに抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ抗体を用いてマウスＩＣＯＳＬ－ＦｃのＦｃ部分が減少して／損なわれて検出された(leads to reduced/compromised detection)。Ａ５－Ａ５二量体は最も強力な遮断剤であり、Ｓ１７－Ａ５－Ｓ１７がこれに続くが、Ｓ１７単量体はこのアッセイでは陰性対照である。 図２５は、抗ｈＴＮＦ－α ＶＮＡＲとＶＨＨ ＴＮＦ３０およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）との結合交差反応性の相違を示す。この図は、ＶＨＨ ＴＮＦ３０およびＨｕｍｉｒａと比較したＶＮＡＲ Ｄ１－Ｃ４の結合交差反応プロフィールを示す。ＶＮＡＲ Ｄ１－Ｃ４は、ヒト、イヌおよびカニクイザルのＴＮＦαのみに結合し；ヒト、イヌおよびカニクイザルのＴＮＦαへの結合を含むＶＨＨ ＴＮＦ３０はブタのＴＮＦαおよびヒトＴＮＦβに弱く結合する。Ｈｕｍｉｒａは、ヒト、イヌ、カニクイザルおよびマウスのＴＮＦαに結合する。また、これらの抗ＴＮＦαドメインの詳細な結合および中和プロフィールについては、表３Ａおよび表３Ｂを参照のこと。 図２６は、抗ｈＴＮＦ－α ＶＮＡＲ四量体 ｖｓ ＶＨＨ ＴＮＦ３０二量体のＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ Ｔ２００エピトープビニング分析(epitope binning analysis)を示す。このエピトープビニングデータから、ＶＮＡＲ Ｄ１－Ｃ４がＶＨＨ ＴＮＦ３０ドメインによって認識されるのとは異なるｈＴＮＦα分子上のエピトープを認識し、それと相互作用することが示される。このアッセイは、第１の結合ドメイン（この場合、そのＫＤ値の１００倍として決定される飽和濃度を用いたＶＮＡＲ Ｄ１－Ｃ４）、次に第２の結合ドメイン（ＴＮＦ３０）で利用可能なエピトープ飽和に到達することを含む。 図２７は、ＥＬＩＳＡフォーマットにおけるＱｕａｄ－Ｘ^ＴＭおよびＱｕａｄ－Ｙ^ＴＭ構築物によるｈＴＮＦ－αへの機能的結合を示す。 図２８は、Ｌ９２９における多価／多重特異的ＶＮＡＲ－Ｆｃ構築物のｈＴＮＦ－α中和活性の評価を示す。ｈＴＮＦα媒介細胞毒性のＬ９２９細胞を用いたアッセイにおけるＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｘ^ＴＭ Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４、Ｑｕａｄ－Ｙ^ＴＭ Ｄ１－Ｃ４－ＦｃおよびＣ４－Ｄ１－Ｆ ｖｓ Ｈｕｍｉｒａ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の中和力を評価する。ＶＮＡＲ Ｑｕａｄ－Ｙ^ＴＭ構築物は中和能を保持し、Ｄ１－Ｃ４－Ｆｃ構築物は０．３ｎｇ／ｍｌまたは３ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αの存在下でＱｕａｄ－Ｘ^{Ｔ Ｍ}と同等の中和活性を示す（ＮＤ_５０については表２を参照のこと）。 図２９は、実験Ｔｇ１９７マウスの体重増加に関するＤ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果を示す。研究終了（１０週齢）まで、３週目から週２回処置した全群の平均体重は以下の通りであった：Ｇ１－ビヒクル＝１９．３±１．４ｇ、Ｇ４－Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）１０ｍｇ／ｋｇ＝２４．４±１．５ｇ、Ｇ２－Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ ３ｍｇ／ｋｇ＝２４．１±１．５ｇ、Ｇ５－Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ １０ｍｇ／ｋｇ＝２４．１±１．７ｇおよびＧ３－Ｄ１－Ｆｃ－Ｄ４ ３０ｍｇ／ｋｇ＝２３．４±１．４ｇ。３週目の対照マウスは９．８±０．２ｇの平均体重を有していた。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。 図３０は、実験Ｔｇ１９７マウスのインビボ関節炎スコアに関するＤ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（商標）の効果を示す。研究終了（１０週齢）まで、３週目から週２回処置した全群の平均インビボ疾患重篤度スコアは以下の通りであった：Ｇ１－ビヒクル＝１．３６±０．０７、Ｇ４－Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）１０ｍｇ／ｋｇ＝０．２５±０．０５、Ｇ２－Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ ３ｍｇ／ｋｇ＝０．１７±０．０４、Ｇ５－Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ １０ｍｇ／ｋｇ＝０．１７±０．０４およびＧ３－Ｄ１－Ｆｃ－Ｄ４ ３０ｍｇ／ｋｇ＝０．１７±０．０４。３週目の対照マウスは、インビボ関節炎スコア＝０．１３±０．０５であった。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。 図３１は、実験Ｔｇ１９７マウスの関節炎組織病理学スコアに関するＤ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果を示す。研究終了（１０週齢）まで、３週目から週２回処置した全群の平均関節炎組織病理学スコアは以下の通りであった：Ｇ１－ビヒクル＝２．９４±０．１２、Ｇ４－Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）１０ｍｇ／ｋｇ＝０．４２±０．０７、Ｇ２－Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ ３ｍｇ／ｋｇ＝０．４１±０．０３、Ｇ５－Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ １０ｍｇ／ｋｇ＝０．５０±０．０５およびＧ３－Ｄ１－Ｆｃ－Ｄ４ ３０ｍｇ／ｋｇ＝０．４２±０．０７。３週目の対照マウスは、組織病理学スコア＝１．２２±０．１０であった。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。 図３２は、実験Ｔｇ１９７マウスのインビボ関節炎スコア対足首組織病理学スコアに関するＤ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果の比較である。研究終了（１０週齢）まで、３週目から週２回処置した全群の平均疾患重篤度スコアは以下の通りであった：Ｇ１－ビヒクル＝２．９４±０．１２（ＨＳ）および１．３６±０．０７（ＡＳ）、Ｇ４－Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）１０ｍｇ／ｋｇ＝０．４２±０．０７（ＨＳ）および０．２５±０．０５（ＡＳ）、Ｇ２－Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ ３ｍｇ／ｋｇ＝０．４１±０．０３（ＨＳ）および０．１７±０．０４（ＡＳ）、Ｇ５－Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ １０ｍｇ／ｋｇ＝０．５０±０．０５（ＨＳ）および０．１７±０．０４（ＡＳ）およびＧ３－Ｄ１－Ｆｃ－Ｄ４ ３０ｍｇ／ｋｇ＝０．４２±０．０７（ＨＳ）および０．１７±０．０４（ＡＳ）であった。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。 図３３は、関節炎のＴｇ１９７モデルの関節炎病理の改善における、０．５、１および３ｍｇ／ｋｇのＤ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））ならびに３０ｍｇ／ｋｇのＤ１－ＢＡ１１－Ｃ４ ｖｓ １ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）の有効性評価である。 図３４は、関節炎のＴｇ１９７モデルの平均群体重に関する、０．５、１および３ｍｇ／ｋｇのＤ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））ならびに３０ｍｇ／ｋｇのＤ１－ＢＡ１１－Ｃ４ ｖｓ １ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果を示す。 図３５は、インビボでの関節炎スコアおよび組織病理学スコアに関する異なるＨｕｍｉｒａ（登録商標）投薬レジメの効果を示す。これは、図２９～図３２について記載されたものと同一の試験法を使用して、別個の実験として行われた。 図３６は、１２匹のラットを光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）で免疫処置して、実験的自己免疫性ブドウ膜炎（Experimental Auto-Immune Uveitis）（ＥＡＵ）を誘導した。４匹の動物それぞれに対し、８日目、１０日目および１２日目に、２０ｍｇ／ｋｇの（げっ歯類タンパク質特異的）抗ＴＮＦα ＶＮＡＲ－Ｆｃを腹腔内注射により処置した；４匹の動物を同じ日にデキサメタゾンで腹腔内処置し、４匹の動物を同様にビヒクルで処置した。０、７、１０、１２、１３、および１４日目に、ラットの眼の前眼部および後眼部の両方の光学コヒーレンストモグラフィー(Optical Coherence Tomography)（ＯＣＴ）を行った。結果のあらゆる科学的偏りを最小限にするために、ＯＣＴ画像は、有効なスコアリングシステムを使用して全炎症について「実験内容を知らない観察者(experimentally blinded observer)」によってスコアリングされた。実験はまた、ビヒクル対照および標準用量のデキサメタゾンステロイドを使用した陽性対照を含んだ。 図３７Ａおよび図３７Ｂは、Ｌ９２９細胞におけるｓｏｌｏＭＥＲ ＶＮＡＲ二量体構築物のｈＴＮＦ－α中和活性の評価を示す。 図３８は、Ｌ９２９細胞におけるＳ１７－Ｆｃ ｖｓ Ｓ１７－Ｆｃ－Ｓ１７（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））構築物のｈＴＮＦ－α中和活性の評価を示す。Ｓ１７構築物に使用されたＦｃは、マウスＩｇＧ２ａに由来する。 図３９Ａ、図３９Ｂおよび図３９Ｃは、ヒトおよびマウスＴＮＦ－αに対するＳ１７－Ｑｕａｄ－Ｘ（商標）およびＤ１－Ｃ４ Ｑｕａｄ－Ｘ（商標）の交差反応結合プロフィールを示す。

種々のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、以下のように本明細書中に提供される：

発明の詳細な説明
定義
アミノ酸は、本明細書では一文字コードもしくは３文字コードのいずれかとしてまたは
両方として表される。

「アフィニティー精製」という用語は、分子がパートナー部分に結合された(bound)ま
たは誘引された(attracted)ままで不純物から分離されることを可能にする組合せまたは
複合体を形成するための、化学的パートナーまたは結合パートナーへの分子の特異的誘引
または結合に基づく分子の精製を意味する。

「相補性決定領域」またはＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３）という用語は
、その存在が抗原結合に必要であるＶＮＡＲドメインのアミノ酸残基を指す。各ＶＮＡＲ
は、典型的には、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３として同定されるＣＤＲ領域を有する。各相補
性決定領域は、「相補性決定領域」のアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（Ｈ
Ｖ）のアミノ酸残基を含み得る。場合によっては、相補性決定領域は、ＣＤＲ領域および
超可変ループ両方のアミノ酸を含み得る。ＶＮＡＲ分子について一般に受け入れられてい
る命名法によれば、ＣＤＲ２領域は存在しない。

「フレームワーク領域」（ＦＷ）は、ＣＤＲ残基以外のＶＮＡＲ残基である。各ＶＮＡ
Ｒは、典型的には、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂおよびＦＷ４として同定される
５つのフレームワーク領域を有する。したがって、ＶＮＡＲドメインは、典型的には、Ｎ
－末端からＣ－末端方向にＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ
３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の構造を有する。

「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、（文脈上別段の指示がない限り）互
換的に使用され、このような名称には細胞または細胞株のすべての子孫が含まれる。した
がって、例えば、「形質転換体」および「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細
胞および移入(transfer)回数に関係なく上記に由来する培養物が含まれる。また、全ての
子孫は、故意または不注意による突然変異により、ＤＮＡの内容が正確に同一であるとは
限らないことは理解される。元の形質転換された細胞に付きスクリーニングされるのと同
一の機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫は含まれる。

発現に言及する場合の、「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結され
たコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核生物に適した制御配列
には、プロモーター、必要であればオペレーター配列、リボソーム結合部位などが含まれ
る。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーなどの制
御配列を使用する。

「コートタンパク質」という用語は、少なくともその一部がウイルス粒子の表面上に存
在するタンパク質を意味する。機能的な観点から、コートタンパク質は宿主細胞における
ウイルスアセンブリプロセスの間にウイルス粒子と会合し、他の宿主細胞に感染するまで
アセンブリされたウイルスと会合したままであるタンパク質である。

特定のアッセイにおける化学エンティティの「検出限界」は、当該アッセイのバックグ
ラウンドレベルを超えて検出され得る当該エンティティの最小濃度である。例えば、ファ
ージＥＬＩＳＡでは、特定の抗原結合断片を提示する特定のファージの「検出限界」は、
特定のファージが抗原結合断片を提示しない対照ファージによって産生されるシグナルを
超えるＥＬＩＳＡシグナルを産生するファージ濃度である。

「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、２つの部分が一緒に共有結合して
なるポリペプチドを指し、この際、上記部分はそれぞれ異なる特性を有するポリペプチド
である。上記特性は、インビトロまたはインビボでの活性などの、生物学的特性であって
もよい。上記特性はまた、標的抗原への結合性、反応の触媒作用などの、単純な化学的ま
たは物理的特性であってもよい。上記２つの部分は、単一のペプチド結合によってまたは
１以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して直接連結されてもよい。一般的に
、上記２つの部分およびリンカーは、互いにリーディングフレームに存在するであろう。
好ましくは、ポリペプチドの２つの部分は異種のまたは異なるポリペプチドから得られる
。

本明細書における「融合タンパク質」という用語は、一般的な用語において、水素結合
もしくは塩橋等の、化学的手段によって、またはタンパク質合成を介したペプチド結合に
よってまたはその両方によって一緒に結合された１以上のタンパク質を意味する。

「異種ＤＮＡ」は、宿主細胞に導入される任意のＤＮＡである。ＤＮＡは、ゲノムＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれらの融合物または組み合わせを含む種々の供給源に
由来し得る。ＤＮＡとしては、宿主またはレシピエント細胞と同じ細胞もしくは細胞型由
来のＤＮＡまたは異なる細胞型由来のＤＮＡ、例えば、同種または異種供給源由来のＤＮ
Ａがあり得る。ＤＮＡは、必要に応じて、マーカーまたは選択遺伝子（例えば、抗生物質
耐性遺伝子、温度耐性遺伝子など）を含み得る。

「高度に多様な位置(highly diverse position)」とは、既知および／または天然に存
在する抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合にある位置に表される多数
の異なるアミノ酸を有する軽鎖および重鎖の可変領域に位置するアミノ酸の位置をいう。
高度に多様な位置は、典型的にはＣＤＲ領域にある。

「同一性」は、配列を比較することによって決定される、２以上のポリペプチド配列ま
たは２以上のポリヌクレオチド配列間の関係を記載する。同一性は、場合によっては、そ
のような配列のストリング間の一致によって決定される、ポリペプチド配列またはポリヌ
クレオチド配列間の配列関連性（相同性）の程度を意味する。２つのポリペプチド配列ま
たは２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、
同一性を決定するために一般的に使用される方法は、コンピュータープログラムに体系化
されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムと
しては、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, et al., Nucleic Acids Res, 1984, 12
, 387 BLASTP, BLASTN, and FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. (1990) 215, 403
)があるが、これらに限定されない。

好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列は、ＨＧＭＰ(Human Genome Mapping Project)
によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Atschul et al., J. Mol. Biol
. 1990 215, 403-410)のデフォルトパラメーターを用いて、本明細書に開示されるアミノ
酸配列に対して、アミノ酸レベルで少なくとも６０％の同一性を有する。

より好ましくは、タンパク質配列は、本明細書中に示されるアミノ酸配列に対して、核
酸またはアミノ酸レベルで、少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらにより好ましくは９５％（なおより好ましく
は少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有し得る。

タンパク質はまた、ＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータープログラム
のデフォルトパラメーターを使用して、本明細書中に開示される配列と、少なくとも６０
％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０
％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。

「ライブラリー」とは、複数のＶＮＡＲもしくはＶＮＡＲ断片配列またはこれらの配列
をコードする核酸をいう。ライブラリーの起源は、多様性が天然のフレームワークもしく
は天然のフレームワークの組み合わせになるように設計される性質を有する非天然の供給
源もしくは合成由来であり得る、または免疫動物から抽出されたＲＮＡから単離されたＶ
ＮＡＲドメインから例示されるような天然の供給源由来であり得る。

「連結(ligation)」は、２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセス
である。２つの断片の連結を目的として、断片の末端は、互いに適合するものでなければ
ならない。場合によっては、末端はエンドヌクレアーゼ消化後に直接適合するであろう。
しかしながら、連結に適合させるために、まずエンドヌクレアーゼ消化後に一般的に生成
される互い違いの末端(staggered ends)を平滑末端に変換する必要があるかもしれない。
末端を平滑化するために、ＤＮＡを、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下
で、ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片約１０単位を
用いて、１５℃で少なくとも１５分間、適切な緩衝液中で処理する。次いで、ＤＮＡを、
フェノール－クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によってまたはシリカ精製によって
精製する。一緒に連結されるＤＮＡ断片を、ほぼ等モル量で溶液中に仕込む。この溶液は
また、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、およびリガーゼ（例えば、０．５／ｉｇのＤＮＡあたり
約１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ）を含むであろう。ＤＮＡをベクターに連結する場合
には、ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼでの消化によってまず線状化する。次い
で、線状化された断片を、細菌アルカリホスファターゼまたはウシ腸ホスファターゼで処
理して、連結工程中の自己連結を防止する。

「突然変異」は、野生型配列などの、参照ヌクレオチド配列に対するヌクレオチドの欠
失、挿入、または置換である。

「天然の」または「天然に存在する」ＶＮＡＲは、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏで得られた
組織源から等の、非合成源から、またはＥｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉサブクラスの動物
の血清から同定されたＶＮＡＲを指す。これらのＶＮＡＲとしては、天然または誘導され
た、任意のタイプの免疫応答で生成されたＶＮＡＲがあり得る。天然のＶＮＡＲはアミノ
酸配列、およびこれらの抗体を構成するまたはコードするヌクレオチド配列を含む。本明
細書で使用されるように、天然のＶＮＡＲは「合成ＶＮＡＲ」とは異なり、合成ＶＮＡＲ
は、例えば、異なるアミノ酸による特定の位置の、１アミノ酸または１を超えるアミノ酸
の置換、欠失、または付加によって、源または鋳型配列から変化させたＶＮＡＲ配列を指
し、前記異なるアミノ酸により源の抗体配列とは異なる抗体配列が提供される。

「核酸構築物」との用語は、一般的に、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはクローニングによっ
て得られるまたは化学合成によって製造されるｍＲＮＡなどのＲＮＡであり得る任意の長
さの核酸を指す。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、コー
ドセンス鎖であっても、または非コード鎖もしくはアンチセンス鎖であってもよい。治療
用途を目的として、核酸構築物は、好ましくは処置される対象において発現され得る形態
である。

核酸に言及する場合の「作動可能に連結された(Operably linked)」とは、核酸が別の
核酸配列と機能的な関係にあることを意味する。例えば、プレシーケンス(presequence)
または分泌リーダー(secretory leader)のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレ
タンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結する；プ
ロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に作
動可能に連結する；または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置する場
合には、コード配列に作動可能に連結する。一般的に、「作動可能に連結された(Operabl
y linked)」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合に
は、付随しリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは
必ずしも隣接している必要はない。便利な制限部位でのライゲーションによって連結が行
われる。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまた
はリンカーが従来のプラクティスに従って使用される。

「ファージディスプレイ」は、それによって変異ポリペプチドがファージ（例えば、糸
状ファージ）粒子の表面上のコートタンパク質の少なくとも一部への融合タンパク質とし
てディスプレイさせる技術である。ファージディスプレイ技術により、高い親和性で標的
抗原に結合する配列について迅速かつ効率的に選別することができるランダムなタンパク
質変異体の大きなライブラリーを調製できる。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ラ
イブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を有するものについて何百万ものポリペプ
チドをスクリーニングするために使用できる。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファ
ージのコートタンパク質であるｐｉｌｌ、ｐＶ ＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩまたはｐＩＸ
をコードする遺伝子への融合を介して小さなランダムなペプチドおよび小さなタンパク質
をディスプレイするために使用されてきた。

「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えば、ＣｏｌＥＩ、およびバクテリオファー
ジの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バ
クテリオファージおよびラムドイドバクテリオファージなどの、任意の既知のバクテリオ
ファージで使用され得る。このプラスミドはまた、一般的に、抗生物質耐性のための選択
マーカーを含むであろう。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントは
、プラスミドとして増殖され得る。ファージ粒子の産生に必要な全ての遺伝子を有するこ
れらのベクターを有する細胞が提供されると、プラスミドの複製の様式はローリングサー
クル複製(rolling circle replication)に変化し、プラスミドＤＮＡの１本鎖のコピーを
生成し、ファージ粒子をパッケージする。ファージミドは、感染性または非感染性ファー
ジ粒子を形成し得る。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上にディスプ
レイされるように、遺伝子融合物として異種ポリペプチド遺伝子に連結されたファージコ
ートタンパク質遺伝子またはその断片を含むファージミドを包含する。ファージミドディ
スプレイベクターの一例としては、ｐＷＲＩＬ－１がある。

「ファージベクター」という用語は、異種遺伝子を含み、複製可能なバクテリオファー
ジの二本鎖複製形態を意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子
形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、Ｍ１３、ｆｌ、
ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体等の、糸状バクテリオファージ、またはラムダ
、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１もしくはその誘導体等の、ラムドイドファージである。

「タンパク質」という用語は、概して、ペプチド結合によって一緒に結合された複数の
アミノ酸残基を意味する。それは、ペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー、またはポリ
ペプチドと交換可能に使用され、これらと同じ意味であり、糖タンパク質およびその誘導
体を含む。「タンパク質」という用語は、タンパク質の断片、類似体、変異体および誘導
体を包含すると解され、この際、断片、類似体、変異体または誘導体は参照タンパク質と
本質的に同一の生物学的活性または機能を保持する。タンパク質類似体および誘導体の例
としては、ペプチド核酸、およびＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン反復タンパク質
(Designed Ankyrin Repeat Proteins)）がある。本発明の「ポリペプチド」は本明細書で
定義されるＴＮＦα特異的抗原結合分子である。

タンパク質の断片、類似体、変異体または誘導体は、それが由来する元のタンパク質配
列の長さに応じて、少なくとも２５、好ましくは少なくとも３０もしくは４０、または５
０もしくは１００以下、または６０～１２０アミノ酸長であり得る。９０～１２０、１０
０～１１０のアミノ酸の長さは、場合によっては便利であり得る。

タンパク質の断片、誘導体、変異体または類似体は、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保
存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換され、このような
置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされているものであってもなくてもよ
いもの、または（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ポ
リペプチドの精製に使用されるリーダーまたは補助配列などの、追加のアミノ酸が成熟ポ
リペプチドに融合されているものであってもよい。このような断片、誘導体、変異体およ
び類似体は、本明細書の示唆から当業者の範囲内に含まれるとみなされる。

「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（固相技術を用いた、ホスホトリエステル、ホ
スファイト、またはホスホラミダイト化学など）によって化学的に合成される短鎖、一本
鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。さらなる方法としては、遺伝子の全
核酸配列が既知である、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が利用可能である場合に使
用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。あるいは、標的アミノ酸配列が既知で
ある場合には、各アミノ酸残基について既知であり、好ましいコード残基を使用して潜在
的な核酸配列が推測し得る。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルまたは分子
サイジングカラム(molecular sizing columns)でまたは沈殿によって精製することができ
る。ＤＮＡが非核酸不純物（極性、非極性、イオン性などであり得る）から分離される場
合、ＤＮＡは「精製」される。

本明細書中で使用される、「供給源(source)」または「鋳型(template)」ＶＮＡＲは、
その抗原結合配列が本明細書中に記載される基準に従う多様化が実施される鋳型配列とし
て機能する、ＶＮＡＲまたはＶＮＡＲ抗原結合断片を指す。抗原結合配列は、一般的に、
ＶＮＡＲ内に、好ましくはフレームワーク領域を含む、少なくとも１つのＣＤＲを含むこ
とが好ましい。

「転写調節エレメント」は、以下の成分：エンハンサーエレメント、プロモーター、オ
ペレーター配列、リプレッサー遺伝子、および転写終結配列のうちの１以上を含むであろ
う。

「形質転換」とは、細胞がＤＮＡを取り込んで「形質転換体」になる過程を意味する。
ＤＮＡの取り込みは永続的であっても一過性であってもよい。「形質転換体」は、ＤＮＡ
に関連する表現型（例えば、ＤＮＡによってコードされるタンパク質によって与えられる
抗生物質耐性）の発現によって証明されるように、ＤＮＡを取り込んで維持した細胞であ
る。

融合タンパク質（ポリペプチド）または異種ポリペプチド（ファージに対して異種）な
どの、出発または参照ポリペプチド（例えば、供給源ＶＮＡＲまたはそのＣＤＲ）の「変
異体(variant)」または「突然変異体(mutant)」は、（１）出発または参照ポリペプチド
のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、（２）天然または人工突然変異誘発のい
ずれかによって出発または参照ポリペプチドから誘導されたポリペプチドである。このよ
うな変異体としては、例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失、およ
び／または挿入および／または置換がある。例えば、（供給源ＶＮＡＲまたは抗原結合断
片中の対応する位置に見出されるアミノ酸に関して）変異アミノ酸(variant amino acid)
を有する配列をコードするノンランダムコドンセット(nonrandom codon set)を含むオリ
ゴヌクレオチドを使用して生成される本発明の融合ポリペプチドは、供給源ＶＮＡＲまた
は抗原結合断片に関して変異ポリペプチド(variant polypeptide)である。従って、変異
ＣＤＲ(variant CDR)は、出発または参照ポリペプチド配列（供給源ＶＮＡＲまたは抗原
結合断片のものなど）に関して変異配列を含むＣＤＲを指す。本明細書において、変異ア
ミノ酸は、出発または参照ポリペプチド配列（供給源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片のもの
など）中の対応する位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す。欠失、挿入、および置換
の任意の組み合わせは、最終的な構築物が所望の機能的特徴を有することを条件として、
最終的な変異体または突然変異体構築物に到達するためになされ得る。アミノ酸の変化は
また、グリコシル化部位の数または位置を変えるなど、ポリペプチドの翻訳後プロセスを
変化させるものであってもよい。コートタンパク質、または供給源ＶＮＡＲのＣＤＲなど
の、「野生型」または「参照」配列または「野生型」または「参照」タンパク質／ポリペ
プチドの配列は、変異ポリペプチドが突然変異(mutation)の導入によって誘導される参照
配列であってもよい。一般的に、所定のタンパク質の「野生型」配列は、天然で最も一般
的な配列である。

同様に、「野生型」遺伝子配列は、自然界で最も共通して見られる遺伝子の配列である
。突然変異は、自然の過程によってまたは人為的な手段によって「野生型」遺伝子（した
がって、それがコードするタンパク質）に導入することができる。このような過程の産物
は、元の「野生型」タンパク質または遺伝子の「変異体」または「突然変異体」である。

ＤＮＡ操作、トランスフェクション方法および培養方法のための一般的な方法は、当業
者に周知である。この点に関して、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth E
dition) Cold Spring Harbor Publishingを参照されたい。

ＶＮＡＲの単離
ＶＮＡＲドメインは、標的免疫処置サメ由来の組織を用いて構築されたファージディス
プレイライブラリーから得ることができる(Dooley, H., et al. Mol Immunol, 2003. 40(
1): p. 25-33; Nuttall, S.D., et al, Proteins, 2004. 55(1): p. 187-97; and Dooley
, H., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(6): p. 1846-51)、ＷＯ ２００
３／０１４１６１（参考として援用される）には、サメを免疫処置して、結合ドメインを
得るための有用な方法が記載される。

ＶＮＡＲ結合ドメインはまた、ＶＮＡＲ配列を含む合成ライブラリーから得られ得る。
ＷＯ ２０１４／１７３９５９（参考として援用される）には、ＶＮＡＲライブラリーを
開発して、結合ドメインを得るための有用な方法が記載される。

さらに、ＣＤＲ３を標的とする合成多様性を有するライブラリーを使用して、ＶＮＡＲ
構造に基づく結合ドメインを得ることができることが示されている(Nuttall, S.D., et a
l. Mol Immunol, 2001. 38(4): p. 313-26; Nuttall, S.D., et al. Eur J Biochem, 200
3. 270(17): p. 3543-54; Shao, C.Y., et al. Mol Immunol, 2007. 44(4): p. 656-65 a
nd Liu, J.L., et al. BMC Biotechnol, 2007. 7: p. 78; WO2005/118629。

本発明のＶＮＡＲＳは、ヒトに投与された場合に、潜在的な免疫原性を減少させるよう
にさらに適合され得る（ヒト化）。

抗体可変ドメイン(antibody variable domains)のヒト化は、ヒト化形態がヒト被検者
に投与された場合に望ましくない免疫学的反応を回避し得るように、治療的に有用な標的
に対して、ヒト以外の種において、産生された抗体を改変するための当該分野で周知の技
術である。ヒト化に関連する方法は、Almagro J.C and William Strohl W. Antibody Eng
ineering: Humanization, Affinity Maturation, and Selection Techniques in Therape
utic Monoclonal Antibodiesに：Bench to Clinic. Edited by An J. 2009 John Wiley &
Sons, IncからおよびStrohl W.R. and Strohl L.M., Therapeutic Antibody Engineerin
g, Woodhead Publishing 2012に概説される。

ＩｇＮＡＲは免疫グロブリンと比較して異なる起源を有し、免疫グロブリン可変ドメイ
ンと比較して配列相同性が非常に少ないが、免疫グロブリン可変ドメインとＩｇＮＡＲ可
変ドメインとの間にはいくつかの構造的類似性があり、その結果、類似のプロセスがＶＮ
ＡＲドメインに適用され得る。例えば、ＷＯ ２０１３／１６７８８３（参考として援用
される）には、ＶＮＡＲのヒト化の説明が提供される、Kovalenko O.V., et al. J Biol
Chem. 2013. 288(24): p. 17408-19をも参照のこと。

タンパク質の発現
本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子をコードする核
酸配列は、核酸構築物中に存在し得る。このような核酸構築物は、ベクター、例えば、発
現ベクターの形態であってもよく、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来の
ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソ
ーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、Ｓ
Ｖ４０等の、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ポックスウイ
ルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスに由来するベクター、ならびに、例えば
コスミドおよびファージミドなどの、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメン
トに由来するものなどの、これらの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。一般的
に、宿主でポリペプチドを発現させるために核酸を維持、増殖または発現させるのに適し
た任意のベクターを、この点において発現のために使用することができる。

核酸構築物は、適切には、核酸の発現を制御するプロモーターまたは他の調節配列を適
切に含み得る。核酸の発現を制御するプロモーターおよび他の調節配列は、同定されてお
り、当該分野で既知である。当業者は、プロモーター全体または他の調節配列を利用する
必要がないかもしれないことを知っているであろう。最小限の必須調節エレメントのみが
必要とされ、そして実際、このようなエレメントは、キメラ配列または他のプロモーター
を構築するために使用され得る。もちろん、必須の要件は、組織および／または時間的特
異性を保持することである。プロモーターは、任意の適切な既知のプロモーター（例えば
、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ即時初期プロモーター、Ｈ
ＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、またはレトロウイルスＬ
ＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、および
メタロチオニンプロモーター（例えば、マウスメタロチオニン－Ｉプロモーター）であり
得る。プロモーターは、プロモーター活性にかかわる(comcompromised for)最小限（ＴＡ
ＴＡエレメントなど、必要であればエンハンサーエレメントを含まない）、例えばＣＭＶ
プロモーターの最小配列を含んでもよい。好ましくは、プロモーターは核酸配列に隣接す
る。

本明細書中に記載されるように、核酸構築物は、ベクターの形態であり得る。ベクター
は、しばしば、それらでトランスフェクトされた（または形質転換された）細胞の選択を
可能にし、好ましくは、異種ＤＮＡを組み込むベクターを含む細胞の選択を可能にする、
１以上の発現マーカーを含む。適切な開始および停止シグナルが一般的に存在するであろ
う。

ベクターは、ｐＥＴなどの任意の適切な発現ベクターであってもよい。ベクターは、必
要であれば追加の制御配列、例えば、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性、蛍光など）
、転写制御配列およびプロモーター（開始配列および終結配列を含む）を含み得る。

プロモーターは、本発明の核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を引き起こ
すのに適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナ
ーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーター）であり得る。

このようなベクターは、宿主細胞中に存在し得る。本発明の核酸構築物の発現のための
適切な宿主細胞の代表的な例としては、ウイルスベクターへの核酸のカプセル化を可能に
するウイルスパッケージング細胞(virus packaging cells)；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ
、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｅ． ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等の、細菌細胞; 酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞などの、単一細
胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの、
昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＰＨＫ．２９３、ならびにＢｏｗｅｓメ
ラノーマ細胞および他の適切なヒト細胞などの、動物細胞；ならびに植物細胞、例えば、
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａが挙げられる。適切には、宿主細胞は、ＣＨ
Ｏ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの、真核細胞である。

宿主細胞への発現ベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ－デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン－脂
質媒介トランスフェクション(cationic - lipid-mediated transfection)、エレクトロポ
レーション、トランスダクション、スクレープロード(scrape loading)、弾道導入(balli
stic introduction)、感染または他の方法によって達成され得る。このような方法は、Sa
mbrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)などの、多くの標準的な
実験室マニュアルに記載されている。

成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、酵母
、細菌、または他の細胞など）などの宿主細胞で発現され得る。無細胞翻訳系を用いて、
本発明の第３の態様の核酸構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を生産
してもよい。原核生物および真核生物宿主と共に使用するための適切なクローニングおよ
び発現ベクターは、Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に
記載される。

本発明はまた、本明細書中に記載される本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベク
ターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本発明によれば、本発明の抗原特異的抗原結
合分子またはマルチドメイン特異的結合分子の製造方法であって、本明細書に規定される
ように適切な宿主細胞中で前記分子をコードする核酸配列を発現させる工程を含む方法が
提供される。

タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマト
グラフィー、レクチンおよび／またはヘパリンクロマトグラフィーを含む標準的な方法に
よって組換え細胞培養物から回収および精製することができる。治療を目的として、例え
ば、組換えベクターの形態の、核酸構築物を、Sambrook et al, Molecular Cloning, a L
aboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, N.Y. (1989)に記載されるようなカラムクロマトグラフィー手段によるなどの
、当技術分野で既知の技術によって精製することができる。

したがって、本発明のこの態様は、宿主細胞での発現による融合タンパク質の組換え的
産生、ペプチド結合(peptide bond linkage)、水素もしくは塩結合または化学的架橋の手
段による発現融合タンパク質の精製を含む、本発明の融合タンパク質の調製方法に及ぶ。
本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ペプチドが可能で
ある水素もしくは塩結合または多量体化、例えば、二量体化もしくは三量体化を使用して
調製することができる。

抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子は、本明細書に記載され
るように分子の生産のためのプロセスの間の精製および／または単離を補助し得る使用前
に切断される追加のＮ末端またはＣ末端配列を含んでもよい。例えば、分子のＣ末端の（
Ａｌａ）₃（Ｈｉｓ）₆。

いくつかの、例えば、５～１０、または１～５、または１～３、２、１、または０のア
ミノ酸残基が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されるタンパク質のアミノ酸配
列を有する変異体、類似体、誘導体および断片もまた、本発明に含まれる。本発明のタン
パク質の特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失がこれらの中で
特に好ましい。また、本発明のタンパク質の特性が元の形態と比較して変異形態で保存さ
れる保存的置換も、この点で特に好ましい。また、変異体としては、本発明に係る抗原特
異的抗原結合分子を含む融合タンパク質がある。

上記したように、本発明の変異体の例としては、１以上のアミノ酸が１以上の他のアミ
ノ酸で置換されているタンパク質がある。当業者は、種々のアミノ酸が類似の特性を有す
ることを知っている。物質の１以上のこのようなアミノ酸は、しばしば、その物質の所望
の活性を妨害または排除することなく、１以上の他のこのようなアミノ酸によって置換さ
れ得る。このような置換は、「非保存的」アミノ酸置換(“non-conservative” amino ac
id substitutions)と呼ばれ得る。

したがって、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンのアミノ酸は
、しばしば、互いに置換され得る（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換
のうち、グリシンおよびアラニンが互いに置換するために使用され（それらは比較的短い
側鎖を有するため）、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが互いに置換するために使用
される（それらは疎水性であるより大きな脂肪族側鎖を有するため）ことが好ましい。し
ばしば互いに置換され得る他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシンおよびト
リプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（
塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有する
アミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびに
システインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。この性質
の置換はしばしば、「保存的」または「半保存的」アミノ酸置換と呼ばれる。

アミノ酸の欠失または挿入はまた、上記の融合タンパク質のアミノ酸配列に対してなさ
れ得る。従って、例えば、ポリペプチドの活性に対して実質的な効果を有さないまたは少
なくともこのような活性を排除しないアミノ酸は欠失され得る。このような欠失は、活性
は維持したままポリペプチドの全長および分子量を減少させることができるので、有利で
あり得る。これにより、特定の目的に必要なポリペプチドの量を減少させることができる
、例えば、用量レベルを減少させることができる。

上記の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸の挿入もまた、なされ得る。これは、本
発明の物質の特性を変化させるために（例えば、融合タンパク質に関して上記で説明した
ように、同定、精製または発現を補助するために）行うことができる。

本発明の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸の変更は、適切な技術を使用して、例
えば、部位特異的突然変異誘発を使用することによって、なされ得る。

本発明の範囲に含まれるアミノ酸の置換または挿入は、天然に存在するまたは天然に存
在しないアミノ酸を使用してなされ得ると理解されるべきである。天然または合成アミノ
酸が使用されるか否かにかかわらず、Ｌ－アミノ酸のみが存在することが好ましい。

本発明に係るタンパク質は、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸配列をさらに有し得
る。このような配列は種々の理由（例えば、グリコシル化）のために提供され得る。

融合タンパク質は、本発明の抗原特異的抗原結合分子が融合タンパク質に構造エレメン
トを提供する異種ペプチドまたはタンパク質配列に融合されてなり得る。他の実施形態で
は、融合タンパク質は、本発明の抗原特異的抗原結合分子が生物学的活性を有する分子と
融合されてなり得る。この分子は、ペプチドもしくはタンパク質配列、または別の生物学
的に活性な分子であり得る。

例えば、抗原特異的抗原結合分子は、ポリアミノ酸配列、例えば、複数のヒスチジン残
基もしくは複数のリジン残基（適切には２、３、４、５、もしくは６残基）、または免疫
グロブリンドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）であり得る異種ペプチド配列に融合され得
る。

異種ペプチド配列への言及には、他の哺乳動物種（例えば、マウスおよびヒト）由来の
配列、ならびに他のＶＮＡＲドメインに由来する異種ペプチド配列が含まれる。

融合タンパク質が本発明の抗原特異的抗原結合分子が生物学的活性を有する分子と融合
されてなる場合、生物学的に活性な部分は、酵素、免疫グロブリン、サイトカインまたは
その断片のような生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質であり得る。あるいは
、生物学的に活性な分子は、抗生物質、抗癌剤、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、鎮痛剤、毒素
または他の薬学的に活性な薬剤であり得る。抗癌剤には、細胞傷害性または細胞増殖抑制
性の薬剤が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗原特異的抗原結合分子が別の
免疫グロブリン可変または定常領域、または本発明の別の抗原特異的抗原結合分子に融合
されてなり得る。換言すれば、可変長の本発明の抗原特異的抗原結合分子、例えば、二量
体、三量体、四量体、またはより高い多量体の融合体（すなわち、五量体、六量体、七量
体、八量体、九量体、または十量体、またはそれ以上）。特定の実施形態では、これは単
量体ＶＮＡＲサブユニットの多量体として表すことができる。

本発明の融合タンパク質において、抗原特異的抗原結合分子は、融合タンパク質の他の
エレメントに、直接融合されてもまたはリンカー部分を介して連結されてもよい。リンカ
ーは、ペプチド、ペプチド核酸、またはポリアミド結合であり得る。適切なペプチドリン
カーとしては、（Ｇｌｙ）₄、（Ｇｌｙ）₅、（Ｇｌｙ）₄Ｓｅｒ、（Ｇｌｙ）₄（Ｓｅｒ）
（Ｇｌｙ）₄、またはそれらの組み合わせもしくはそれらの多量体（例えば、二量体、三
量体、四量体またはそれ以上）などの、複数のアミノ酸残基、例えば、４、５、６、７、
８、９、１０、１５、２０または２５アミノ酸を含み得る。例えば、好適なリンカーは（
ＧＧＧＧＳ）₃であってもよい。別のリンカーとしては、（Ａｌａ）₃（ＨＩｓ）₆または
その多量体が挙げられる。ＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータープログ
ラムのデフォルトパラメーターを使用して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％
、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列もまた含まれる。

本発明に従って記載されるように構築されたベクターは、増幅および／または発現のた
めに宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈
殿などの標準的な形質転換法を用いて宿主細胞に導入することができる。ベクターがウイ
ルスのような感染性粒子である場合には、ベクター自体が宿主細胞への侵入を提供する。
標準的な手順による遺伝子融合物をコードする複製可能な発現ベクターを含む宿主細胞の
トランスフェクションおよびファージ粒子の産生により、融合タンパク質がファージ粒子
の表面上に提示されるファージ粒子が提供される。

複製可能な発現ベクターは、種々の方法を用いて宿主細胞に導入される。一実施形態で
は、ベクターは以下を使用して細胞に導入され得る：必要であれば約３７℃で約６～４８
時間（またはＯＤ６００＝０．６～０．８になるまで）、標準的な培養ブロス中で培養し
て細胞を成育させた後、ブロスを遠心分離して上清を除去する（例えば、デカントする）
。最初の精製は、好ましくは緩衝溶液（例えば、１．０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４
）中で細胞ペレットを再懸濁した後、再遠心分離および上清除去を行うことによる。得ら
れた細胞ペレットを希釈グリセロール（例えば、５～２０％ ｖ／ｖ）に再懸濁し、再び
遠心分離して、細胞ペレットを形成し、上清を除去する。最終細胞濃度は、細胞ペレット
を水または希釈グリセロール中に所望の濃度になるように再懸濁することによって得られ
る。

エレクトロポレーション中により高いＤＮＡ濃度（約１０倍）を使用することにより、
形質転換効率を増加させ、宿主細胞に形質転換されるＤＮＡの量を増加させる。また、高
い細胞濃度を使用することにより、効率を増加させる（約１０倍）。移入されたＤＮＡの
量が多いほど、より大きな多様性を有し、コンビナトリアルライブラリーのより多数の独
特なメンバーを表すより大きなライブラリーが生成される。形質転換された細胞は、一般
的に、抗生物質含有培地で成育することにより選択される。

医薬組成物および用途
本発明によれば、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分
子の医薬組成物が提供される。このような組成物は、前記抗原特異的抗原結合分子を含む
融合タンパク質を含む。

医薬組成物はまた、治療用タンパク質に融合された本発明の抗原特異的抗原結合分子、
またはその断片を含んでもよい。治療用タンパク質は、ホルモン、成長因子（例えば、Ｔ
ＧＦβ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（Ｎ
ＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、胎盤成
長因子）；分化因子；血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ
因子、フォンヴィレブランド因子(VonWillebrand Factor)またはプロテインＣ）；または
血液凝固カスケード由来の別のタンパク質（例えば、アンチトロンビン）；サイトカイン
、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－
５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、
ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１
９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ
－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２も
しくはＩＬ－３３）、またはインターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－βおよび
ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子（ＴＧＦ）、ＩＦＮ－γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、骨形態形成
タンパク質（ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ－１、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭ
Ｐ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－８、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１０、ＢＭＰ－１１、ＢＭＰ－
１２、ＢＭＰ－１３）；インターロイキンレセプターアンタゴニスト（例えば、ＩＬ－１
ｒａ、ＩＬ－ＲＩＩ）；ケモカイン（例えば、ＭＩＰ（マクロファージ炎症性タンパク質
）、例えば、ＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１β；ＭＣＰ（単球走化性タンパク質）、例えば、
ＭＣＰ１、２または３；ＲＡＮＴＥＳ（活性化、正常なＴ細胞の発現と分泌で調節((regu
lated upon activation normal T-cell expressed and secreted)）；栄養因子；サイト
カインインヒビター；サイトカインレセプター；酵素、例えば、フリーラジカル捕捉酵素
(free-radical scavenging enzyme)、例えば、スーパーオキシドジスムターゼまたはカタ
ラーゼまたはプロドラッグ変換酵素（例えば、アンギオテンシン変換酵素、デアミナーゼ
、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、キナーゼおよびホスファターゼ）；ペプチド模倣体
(peptide mimetic)；プロテアーゼインヒビター；メタロプロテイナーゼの組織インヒビ
ター（ＴＩＭＰ、例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３またはＴＩＭＰ４）また
はセルピン(serpin)（セリンプロテアーゼのインヒビター）であってもよい。

本発明の他の実施形態では、融合タンパク質中の治療用タンパク質は、抗体、またはＦ
ａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）₂（化学的に連結されたＦ（ａｂ’）₂鎖を含む）、Ｆａｂ’、
ｓｃＦｖ(その多量体形態、すなわち、ｄｉ－ｓｃＦｖ、またはｔｒｉ－ｓｃＦｖを含む
）、ｓｄＡｂ、またはＢｉＴＥ(二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）などの、その操作さ
れた断片であってもよい。抗体断片はまた、可変ドメインおよびその断片、ならびに他の
ＶＮＡＲ型断片（ＩｇＮＡＲ分子）を含む。

医薬組成物は、多数の本発明の抗原特異的抗原結合分子、例えば、二量体、三量体、ま
たはより高次の多量体、すなわち、２、３、４、５、６、７、または８量体が治療用タン
パク質に融合されて構成され得る。

本発明の抗原特異的抗原結合分子の治療用タンパク質への融合は、タンパク質上の任意
の好都合な部位で行われてもよく、Ｎ－末端、Ｃ－末端および／またはＮ－／Ｃ－末端融
合であってもよい。本発明の一実施形態では、本発明の抗原特異的抗原結合分子の融合は
、治療タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に対するものである。

本発明の医薬組成物は、適切かつ薬学的に許容できる担体、希釈剤、アジュバントまた
は緩衝溶液を含み得る。組成物は、さらなる薬学的に活性のある薬剤を含み得る。そのよ
うな担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グ
リセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定され
ない。

このような組成物は、示されるような追加の薬学的に活性のある薬剤を含み得る。追加
の薬剤は、治療化合物、例えば、抗炎症薬、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤または抗生物質
であってもよい。そのような追加の薬剤はそれを必要とする患者への投与に適した形態で
存在してもよく、そのような投与は同時、別々、または連続であってもよい。成分は、必
要に応じて説明書を含むことができるキットの形態で調製されてもよい。

医薬組成物は、例えば、とりわけ、経口、局所、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または皮内
経路による投与を含む、患者の疾患を治療するのに有効な任意の有効で便利な様式で投与
することができる。治療においてまたは予防として、活性のある薬剤は、注射可能な組成
物として、例えば、好ましくは等張の、無菌水性分散液として個体に投与され得る。

哺乳動物、特にヒトへの投与のために、活性のある薬剤の１日の用量は、０．０１ｍｇ
／ｋｇ体重以上、典型的には約１ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以上または４ｍｇ／ｋｇ
以下であると予想される。いずれにせよ、医師が個体に最も適した実際の投薬量を決定す
るが、この量は個体の年齢、体重、性別および応答を含む因子に依存するであろう。上記
の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より高い用量またはより低い用量が有
益である場合もあり得、そのような場合も本発明の範囲内である。

本発明によれば、医薬に使用するための本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチ
ドメイン特異的結合分子が提供される。したがって、本発明のこの態様は、それを必要と
する患者における疾患の治療のための医薬の製造における本発明の抗原特異的抗原結合分
子またはマルチドメイン特異的結合分子のそのような使用に及ぶ。本発明の抗原特異的抗
原結合分子はまた、本発明の薬剤組成物に関連して上記で規定されるような特異的結合分
子を含む融合タンパク質を調製するために使用できる。

このような使用はまた、治療を必要とする患者における疾患の治療方法であって、本発
明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子を含む本明細書中に規
定されるような医薬組成物の治療的に有効な投薬量を患者に投与することを含む方法を包
含する。

本明細書で使用される「治療(treatment)」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物に利
益を与えることができる任意のレジメを含む。獣医学における「非ヒト動物」の治療は、
ウマを含む家畜およびコンパニオンアニマル（例えば、ネコおよびイヌ）およびヒツジ、
ヤギ、ブタ、ウシおよびウマ科のメンバーを含む農場／農業動物の治療に及ぶ。治療は、
現在の症状(condition)または障害(disorder)に関する治療的処置であっても、または予
防（予防的処置）であってもよい。治療は、遺伝性または後天性病気の治療であってもよ
い。治療は、急性または慢性状態の治療であってもよい。治療は、炎症および／または癌
に関連する症状／障害であってもよい。本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチド
メイン特異的結合分子は、変形性関節症、強皮症、腎疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患
、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、または任意の炎症性疾患を含むがこれらに限
定されない障害の処置に使用され得る。

本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子はまた、患者に
おける疾患状態の性質を調べるために使用され得る。抗原特異的抗原結合分子またはマル
チドメイン特異的結合分子は、Ｘ線、ガンマ線、またはＰＥＴスキャニングなどの画像診
断技術(imaging techniques)を用いて被検体の身体における疾患部位の画像を調製するた
めに使用され得る。したがって、本発明は、適切に検出可能に標識された抗原特異的抗原
結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子を被検体に投与し、続いて被検体の身体を
スキャンすることを含む、被検体における疾患の部位を画像診断する(imaging)方法に及
ぶことができる。あるいは、被検体に前記分子を投与することにより、分子の投与後に被
検体からのサンプルを分析することによって、試験結果が得られ得る。このような実施形
態は、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子の投与を含
む、被検体における病気(disease)または医学的状態の診断方法を含み得る。本発明のマ
ルチドメイン特異的結合分子は、特に同じ抗原上の異なるエピトープを標的とする複数の
ＶＮＡＲが使用される場合に、診断感度に関して特に有用であり得る。

結合の測定
標的へのＶＮＡＲの結合の検出および測定は、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴な
どの当該分野で周知の多くの方法で測定することができる。

機能活性
本発明のＶＮＡＲは、サイトカインなどの分子への結合及び当該分子の生物学的効果の
中和、リガンド結合を妨げるレセプターへの結合、または結合後の生物学的効果を引き起
こすことを含む、多くの方法で機能し得る。

結合ドメインの機能的活性を測定する方法は、当該分野で知られている。

以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１：特異的抗原結合ＶＮＡＲの単離
Ａ．ＴＮＦ結合ＶＮＡＲ
免疫処置および選択
コモリザメ(Nurse sharks)［Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍ］を、０
．１％（ｗ／ｖ）トリカインメタンスルホネート(tricaine methanesulfonate)［ＭＳ－
２２２］を含む人工海水を含有する容器に入れた。所望のレベルの麻酔を行った後、コモ
リザメを免疫処置または採血(bleeding)のため取り出した。完全フロイントアジュバント
［ＣＦＡ］中に乳化させたｈＴＮＦα［２５０μｇ］を、２０ゲージ針を用いてサメの横
ひれ(lateral fin)に注射した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）における可溶性抗原［
試料０．４５μＭ滅菌濾過］として、ブーストを４週間隔で尾静脈に静脈内投与した。血
液サンプルを、尾静脈から２００μｌのブタヘパリン［ＰＢＳ中１０００Ｕ／ｍｌ］を含
む３０ｍｌシリンジ中に集めた。血液サンプルを２０００ｒｐｍで１０分間遠心して、血
漿から血液細胞を分離した。血漿上清画分を、ＲＮＡ安定化緩衝液を含む滅菌チューブ中
に注意深く除去し、－８０℃で保存した。

サメ血清中のｈＴＮＦα特異的ＩｇＮＡＲの検出
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦαでコーティングし、３７℃で１時間
インキュベートした後、４％（ｗ／ｖ）ＭＰＢＳ中で３７℃で１時間ブロッキングした。
サメ血清［プレブリード(pre-bleed)、ブリード４および５］を、１：２希釈系列で所定
のウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ中で１：２
００の希釈率で１００μｌ／ウェルの精製抗コモリザメ(Nurse shark)ＩｇＮＡＲモノク
ローナル抗体［ＧＡ８］と共にインキュベートした。結合シグナルは０．１％（ｖ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ－２０ ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で１：２０００の希釈率で抗マウスＩｇＧ－Ｈ
ＲＰを添加することによって生成し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、各
工程後にＰＢＳＴで３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
）結合抗体［Ｓｉｇｍａ］とのインキュベーション後にさらに３回ＰＢＳで洗浄した。Ｓ
ｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質(SureBlue TMB Microwell
Peroxidase Substrate)［Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を添加することによっ
てプレートを発色させ、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー
を用いて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。

各追加免疫(boost)後に得られた血清を用いて結合性ＥＬＩＳＡ(binding ELISA)によっ
て、各免疫処置追加免疫(immunisation boost)後のｒｈＴＮＦα特異的ＩｇＮＡＲ応答を
測定した。ＰＢＳ中のハイブリドーマ組織培養上清として希釈した、マウスモノクローナ
ル抗コモリザメＩｇＮＡＲ抗体であるＧＡ８を検出抗体として使用した(Haines et al.,
2005; Muller, et al. 2012)。結果から、ブリード４および５に示されるように、免疫処
置後は経時的にＩｇＮＡＲが増加する説得力のある傾向が示され、また、プレブリードサ
ンプルにおいて見られるバックグラウンド応答から、免疫処置前には有意なｒｈＴＮＦα
特異的ＩｇＮＡＲ応答がないことが示唆された［図１］。

ＰＢＬからの全ＲＮＡ単離およびＰＣＲ増幅
末梢血リンパ球［ＰＢＬ］を、ＩｇＮＡＲ応答が最もよかったブリード［ブリード５］
の血漿から採取し、全ＲＮＡを調製した。集めたＰＢＬからの全ＲＮＡを、Superscript
III First strand synthesis supermix [Invitrogen]を用いてｃＤＮＡ合成用の鋳型とし
て約２μｇ／μｌで使用した。フレームワーク特異的プライマーである、ＮＡＲＦ４Ｆｏ
ｒ１［５’－ＡＴＡ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＣ
Ａ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＣＡ ＧＴＧ ＣＣＡ ＣＣＴ Ｃ－３’］（配列番号７４）お
よびＮＡＲＦ４Ｆｏｒ２［５’－ＡＴＡ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＣ Ｇ
ＣＡ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＧＣＡ ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＣＴ Ｃ－３’］
（配列番号７５）を用いて、ｃＤＮＡを得た（Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003.
40(1): p. 25-33を参照のこと）。ｃＤＮＡ合成後、共通フレームワークワン特異的プラ
イマー(common framework one specific primer)である、ＮＡＲＦ１Ｒｅｖ［５’－ＡＴ
Ａ ＡＴＡ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＴＧ ＧＡＣ ＣＡ
Ａ ＡＣＡ ＣＣＧ－３’］（配列番号７６）を導入し、３段階ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）増幅プロトコールを用いてＩｇＮＡＲ Ｖ領域ＤＮＡを増幅した。得られた約４
００塩基対のＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで泳動し、ＮＡＲ Ｖ領域を切り出し
、精製した[QIAquick purification kit, QIAGEN]。精製したＤＮＡを、制限酵素Ｎｃｏ
ＩおよびＮｏｔＩ[New England Biolabs]を用いてプライマーコード制限部位［下線］で
消化し、再精製した。

ライブラリー構築
ファージミドベクターｐＨＥＮ２を制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＰＣＲ
精製し[QIAquick PCR purification]、同様に調製したＰＣＲ産物に連結した。連結した
材料を、エレクトロポレーション－コンピテント大腸菌ＴＧ１細胞(Electroporation-com
petent E. coli TG1 cells)［Lucigen］に形質転換した。形質転換細胞を、２％グルコー
ス［ｗ／ｖ］、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥ寒天プレート上に播種し
、３７℃で一晩成育させた。ライブラリーサイズを計算し、コロニーをプレートから掻き
取り、ライブラリーストックのアリコートを－８０℃で保存した。

ファージディスプレイの選択
ＯＤ_６００が０．１に相当するライブラリーストックの単一アリコートを、２％グルコ
ース［ｗ／ｖ］、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＴＹ増殖培地に添加し、
３７℃で対数期中期［ＯＤ_６００が０．４～０．６］になるまで増殖させた後、Ｍ１３Ｋ
０７ヘルパーファージ[New England Biolabs]で感染させた。ライブラリーの発現を、２
×ＴＹ培地、０．２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ
カナマイシン中で、３０℃で一晩行った。ファージをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
で培養上清から沈殿させ、バイオパニング(bio-panning)に使用した。ライブラリーを、
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズ[Dynabeads, Invi
trogen]上に捕捉されたビオチン化ｒｈＴＮＦαに対してパニングした。ライブラリファ
ージおよびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズを、別
々に、室温で回転させながら、ブロック液［ＰＢＳにおいて、３％（ｗ／ｖ）ミルク、１
％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ］で１時間予めブロックした。ビオチン化－ｒｈＴＮＦα［４００ｎ
Ｍ］をブロックしたビーズに添加し、室温で回転させながら１時間インキュベートした。
異なるチューブにおいて、ライブラリーファージを、予めブロックしたストレプトアビジ
ンビーズと共に、室温で１時間回転させながらインキュベートした。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ
磁気ラック(Dynabeads magnetic rack)を用いて非結合ファージを回収し、回収したファ
ージをここでは非選択ファージと呼ぶ。室温で回転させながら、１時間、ブロックされた
ビーズと一緒にインキュベートすることにより、ファージを選択解除した(deselected)。
ビオチン－ｒｈＴＮＦα修飾ビーズを、室温で回転させながら、非選択ファージと１時間
インキュベートした。ビーズを５×ＰＢＳＴおよび５×ＰＢＳで洗浄した後、１００ｍＭ
トリエチルアミン（ＴＥＡ）４００μｌで厳密に８分間溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
（ｐＨ ７．５）２００μｌを添加することによって中和した。対数中期の大腸菌ＴＧ１
細胞［１０ｍｌ］を、３７℃で３０分間、４００μｌの溶出ファージで感染させた。次に
、２％グルコース（ｗ／ｖ）、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥ寒天プレ
ート上で３７℃で一晩増殖させた。さらに３ラウンドの選択を行い、ビオチン－ｒｈＴＮ
Ｆαの濃度を２００ｎＭに低下させることにより、ラウンド３および４においてストリン
ジェンシーを増加させた。

クローンのスクリーニングおよび選択
抗原結合モノクローナルファージの富化を、４％［ｗ／ｖ］ミルク－ＰＢＳでブロック
した、１μｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦαでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて評価
した。結合は、抗Ｍ１３－ＨＲＰ結合モノクローナル抗体[GE Healthcare]を用いて検出
した。また、ストレプトアビジンおよびＨＳＡ被覆ＥＬＩＳＡプレートに対する選択性お
よび特異性について、それぞれモノクローナルファージを分析した。

ライブラリーをｒｈＴＮＦαに対する４回の反復パニングに供した。バイオパニング抗
原濃度はラウンド１およびラウンド２では一定に保ったが、高親和性バインダーを優先す
るために、次のラウンドのパンニングでは半減した。陽性モノクローナルファージ結合体
の富化(Enrichment)を、ＥＬＩＳＡによるｒｈＴＮＦα結合に関するバイオパニングの各
ラウンドの終わりに評価した。予め選択されたクローンからラウンド２までは抗原結合の
着実な増加が観察され、ラウンド３および４後にモノクローナルファージ結合体の数が減
少した。ｒｈＴＮＦαモノクローナル結合体は、ラウンド０［予め選択されたライブラリ
］での約６％［１１／１８４］からラウンド２後の９９．４６％［１８３／１８４］にま
で増加した。

ライブラリーパニングから多数のユニークな配列が同定された。これらには、Ｄ１、Ｃ
４およびＢ４と称されるＶＮＡＲがある。

ＣＤＲ１およびＣＤＲ３におけるシステイン（Ｃ）残基（二重下線）は、タイプＩＩ
ＶＮＡＲに典型的であり、ＦＷ１およびＦＷ３ｂにおけるシステイン（一重下線）間の標
準的な免疫グロブリンスーパーファミリー架橋(canonical Immunoglobulin superfamily
bridge)に加えて第２のジスルフィド架橋を形成することが観察される。

ＴＮＦαに結合するＶＮＡＲの発現
ＳＨｕｆｆｌｅ細胞の細胞質における可溶性ＶＮＡＲタンパク質の調製
モノクローナルファージスクリーニングから同定された目的のＩｇＮＡＲ Ｖ領域イン
サートを、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を介して発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（
＋）(Novagen)にクローニングした。ＶＮＡＲ ＤＮＡを（QIAprep miniprep kit, QIAGE
Nを用いて）大腸菌ＴＧ１培養物から調製し、ｉｎ－ｈｏｕｓｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐ
ｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ＸｂａＩ＿ＮＡＲＦＷ１＿＃１２７（配列番号２６）およびＥｃ
ｏＲＩ＿ｓｔｏｐ＿ｍｙｃ＿＃１２９（配列番号２９）を用いてＰＣＲ増幅して、それぞ
れクローニング部位ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを導入する一方、プライマー配列番号２９
を組み込んだｃ－ｍｙｃ(primer SEQ ID 29 incorporated c-myc)、６ｘヒスチジンタグ
および終止コドンをＶＮＡＲ遺伝子配列に導入した。精製したＶＮＡＲ ＤＮＡ ＰＣＲ
産物およびｐＥＴ２８ｂ（＋）プラスミドＤＮＡを、５０Ｕ ＸｂａＩおよび１０Ｕ Ｅ
ｃｏＲＩ－ＨＦで、３７℃で２時間消化した。消化サンプルを精製し、ライゲーションし
、エレクトロコンピテン大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞[N
ew England Biolabs]に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＴＹＥ寒天プレ
ート上で選択した。ＶＮＡＲ抗ｈＴＮＦα－Ｄ１、Ｃ４およびＢ４融合タンパク質を、３
０℃でのＩＰＴＧでの誘導に際してＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）細胞の細胞質において発
現させた。細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットをＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）
タンパク質抽出試薬[Novagen]で処理して、細胞を溶解し、可溶性タンパク質を放出させ
た。ＶＮＡＲ可溶性タンパク質を、ヘキサ－ヒスチジンテールを介して固定化金属アフィ
ニティークロマトグラフィー[IMAC]によって精製し、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８で
ＩＭＡＣ樹脂から溶出させた。タンパク質サンプルを、使用前にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）
で透析した。タンパク質濃度をUltraspec 6300 pro UV/Visible spectrophotometer [Ame
rsham, Biosciences]を用いて測定した。全精製タンパク質をクーマシーブルー染色ＳＤ
Ｓ－ＰＡＧＥで可視化した。精製されたＶＮＡＲ単量体タンパク質は約１４ｋＤａの単一
バンド［ヘキサヒスチジンおよびｃ－ｍｙｃタグを含む］として移動し、タンパク質凝集
は認められなかった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに基づく純度は約９０％と推定された。

タンパク質の完全性および純度の決定
変性ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動［ＳＤＳ－ＰＡＧＥ］
を用いて、精製タンパク質の純度およびサイズを評価した。タンパク質サンプルを、５％
β－メルカプトエタノールを含有するＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッフ
ァー[Life Technologies]中で調製し、９５℃に５分間加熱した。変性タンパク質サンプ
ルを、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液に浸漬したＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４～１２％Ｂｉｓ
－Ｔｒｉｓゲル[Life Technologies]上にのせ、電気泳動を、１６０ボルトで５５分間行
った。全範囲の組換えタンパク質分子量マーカー[GE Healthcare]を分子量ラダー標準物
質として使用した。ゲルを蒸留水で洗浄し、クーマシーブルーで１時間染色した後、蒸留
水中で一晩脱染色した。

選択性および特異性の決定
結合の特異性および選択性を、１μｇ／ｍｌ ビオチン－ＴＮＦおよびｒｈＴＮＦα、
または１０μｇ／ｍｌ ＨＳＡ、ＢＳＡ、ストレプトアビジン、一本鎖ＤＮＡ、サイログ
ロブリンもしくはリゾチームのいずれかで被覆したＥＬＩＳＡプレートで測定した。ＥＬ
ＩＳＡプレートを４％［ｗ／ｖ］％のミルク－ＰＢＳで適切にブロッキングし、タンパク
質サンプルを１μｇ／ｍｌのトップ濃度でのせ、系列希釈を行った。抗ｃ－ｍｙｃ－ＨＲ
Ｐ結合モノクローナル抗体[Roche]を用いて、結合を検出した。

また、より正確な結合データを得るために、ＢＩＡＣｏｒｅ Ｔ２００またはＯｃｔｅ
ｔ ＲＥＤ９６機器による表面プラズモン共鳴を用いて、特定の分子を測定した。

ＢＩＡＣｏｒｅ^ＴＭ Ｔ２００(GE Healthcare)
アミンカップリングは、リガンドをチップ表面に固定化するための非常に一般的なアプ
ローチである。チップ表面は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチ
ル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）による活性化後、リ
ガンド上の利用可能な第一級アミン基（例えば、リジン）を介してリガンドを共有結合捕
捉(covalent capturing)できる反応性スクシンイミドエステルを形成するカルボキシル基
で誘導体化されたデキストランマトリックスを有する。

ＴＮＦαを１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で１／１０倍に希釈し、活性
化チップに注入した。「エイム フォー」ソフトウェア固定化ウィザード(“aim for” s
oftware immobilisation wizard)または特定の期間を使用して、２００ＲＵの固定化ＴＮ
Ｆαを目指して(aim for)もよい。さらに、おそらく界面活性剤がリガンド活性に影響を
及ぼし得ると考えられるので、泳動緩衝液を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０が存在しないＰ
ＢＳに変更した。２０２ＲＵの最終リガンド固定化レベルが得られた。

スタートアップサイクルは、３０μｌ／分の流速での６０秒の緩衝液注入、続いて３０
秒の解離期間から構成された。抗ＴＮＦαサンプルサイクルは、サンプルを３０μｌ／分
で１２０秒注入した後、１０ｍＭグリシン（ｐＨ ２）を３０μｌ／分で６０秒注入する
再生工程を含んだ。最後に、次のサイクルを開始する前に、ベースライン平衡を可能にす
るために、各サイクルの終わりに１２０秒の安定化期間を含めた。

スクリーニングした濃度系列および解離期間は可変であり、以下の通りであった：解離
時間が６００秒であったすべての単量体ドメインＤ１、Ｃ４、Ｂ４、ＴＮＦ４３およびＴ
ＮＦ３０を除いて、すべてのサンプルを、１００ｎＭのトップスタート濃度および１２０
０秒解離時間でアッセイした。Ｂ４およびＴＮＦ４３ ＶＮＡＲを、それぞれ５００ｎＭ
および５μＭのトップスタート濃度でアッセイした。５つのブランクサンプルサイクルを
含めて、二重参照データセットを生成するために使用した。

ドメインに対する結合応答を、ＢＩＡＣｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを使
用して分析し、二重参照データを１：１ラングミュアモデルに適合させて、動力学的およ
び親和性の特徴を得た。

ＯＣＴＥＴ（登録商標） ＲＥＤ９６［ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）］
バイオレイヤ干渉法(Biolayer interferometry )（ＢＬＩ）を用いて、平衡解離定数（
Ｋ_Ｄ）を決定した。ディップアンドリードストレプトアビジンバイオセンサー(Dip and r
ead streptavidin biosensors)を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で少なくとも３０分間再水和
した。センサーに２０μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＴＮＦ－αをのせ、抗ＴＮＦ－α ＶＮ
ＡＲタンパク質を１００ｎＭのトップ濃度で連続希釈し、一方、ＴＮＦ４３およびＶＮＡ
Ｒ陰性対照を１μＭのトップ濃度でアッセイした。結合会合(Binding association)を１
０分間モニターし、続いて５分間の解離時間をモニターした。すべての抗ＴＮＦ－α Ｖ
ＮＡＲ測定について、カーブフィットデータが複雑な多相曲線を示したので、動態データ
セットを２部位モデル(two-site model)を用いてフィッティングしたが、対照の抗ＴＮＦ
－αナノボディ、ＴＮＦ３０については、質量輸送モデル(Mass Transport model)での１
：１ラングミュア結合を用いた。

得られたデータを表１に示す。表１から、試験した単量体ＶＮＡＲがＴＮＦ ４３ Ｖ
ＮＡＲと比較して、ＴＮＦαに対して少なくとも５００倍低い結合親和性を有することを
示す。

インビトロでの中和試験
ＶＮＡＲドメインに関する中和能力およびＮＤ_５０を決定するために、マウス線維肉腫
細胞株Ｌ９２９［ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１］を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清[GIBCO]およ
び１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ[R & D systems]を補充したダルベッコ改変イーグル
培地[GIBCO]中で成育させた。それぞれのＶＮＡＲクローンについて、１ウェルあたり５
，０００個の細胞を、５％のＣＯ_２および湿気を用いて、３７℃で２４時間、９６ウェル
プレート中で二連でインキュベートした。ＬＤ_５０［０．２５ｎｇ／ｍｌで１ｘ］および
１０ｘ ＬＤ_５０［２．５ｎｇ／ｍｌ］のｒｈＴＮＦαを、連続希釈したＶＮＡＲタンパ
ク質または細胞単独のいずれかを含むウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で２
４時間、５％のＣＯ_２および湿気でインキュベートした。５０μＬの１：２０希釈ＷＳＴ
－１細胞増殖剤[Roche]を添加し、５％ ＣＯ_２および湿気で３７℃で４～８時間インキ
ュベートすることによって、細胞毒性または細胞生存を測定した。吸光度を４５０～５６
０ｎｍで読み取った。

１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤの存在下でのＴＮＦαは、Ｌ９２９線維肉腫細胞に
おいて細胞毒性を引き起こし、この際、ＬＤ_５０は０．２５～０．３ｎｇ／ｍｌであす。
我々は、ナノモル濃度でのＶＮＡＲタンパク質ドメインがｒｈＴＮＦαのＬＤ_５０を最大
１０倍中和することができることを示した［図３］。この実験では、対照抗ＴＮＦα抗体
ＭＡＢ２１０と比較するための二価分子を形成するために、ＶＮＡＲのＣ末端をペプチド
リンカーによってＩｇＧ Ｆｃドメインに結合させた。

中和アッセイにおいて単一ドメインとして測定した場合、Ｄ１およびＣ４ ＶＮＡＲは
、ＴＮＦ３０ ＶＨＨナノボディほど有効ではなかった（図２）。これは、単一部位結合
親和性と相関すると考えられる。しかしながら、混合物（図３）としてまたは二価もしく
は二重特異性フォーマット（図ｘｘｘｘ）で組み合わせた場合、予想できなったことに、
それらは二量体ＴＮＦ３０ ＶＨＨナノボディを超える改善された特性を示した。

傍細胞フラックスアッセイ(Paracellular flux assay)
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ－２）を、１０（％ ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ
および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（それぞれ、１０，０００単位／
ｍｌおよび１０，０００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フ
ラスコ中で９０％コンフルエンスまで増殖させた後、２４ウェルの０．４μｍ半透過性組
織培養トランスウェルインサート(semipermeable tissue culture transwell inserts)(C
orning Inc.)に播種した。１０μｌの細胞懸濁液を９０μｌの０．４％トリパンブルー排
除色素(trypan blue exclusion dye)(Beckman Coulter)に懸濁し、カバースリップを取り
付けた血球計上に混合物を注意深く移すことによって、生存細胞数を測定した。

生存細胞数を測定した後、トランスウェルインサート当たり１×１０^５個の細胞を１０
０μｌの最終ＤＭＥＭ容積に播種する一方、細胞を含まない６００μｌのＤＭＥＭを外側
含有ウェル(outer containing wells)に移した。トランスウェルプレートを、５％（ｖ／
ｖ）ＣＯ_２で３７℃でインキュベートし、この際、使用済みのＤＭＥＭ＋１０％（ｖ／ｖ
）ＦＢＳを４８時間毎に交換した。細胞増殖を、細胞が１００％コンフルエンスに達する
まで（通常、播種後５～７日間）、位相差顕微鏡（倍率４０倍の対物レンズ）下でモニタ
ーした。Ｃａｃｏ－２細胞をさらに２１日間増殖させて分化させ、この際、使用済みの培
地を分化まで４８時間毎に交換した。

１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ－ＦＢＳを含む１００μｌのＤＭＥＭ中に極性を有する細胞(pol
arized cells)（頂端側(apical side)）を含有する所定のインサートウェルを、抗ＴＮＦ
α ＶＮＡＲタンパク質を含むまたは含まない１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦα、ＩＦＮγ、
ＬＰＳで処理した。処理細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２で３７℃で１８時間インキュベー
トした。サイトカイン±抗ＴＮＦα ＶＮＡＲと共に１８時間インキュベートした後、処
理細胞の位相差画像を得、続いて、Ｃａｃｏ－２単層の頂端側(apical side)（インサー
トウェル）に５μｌの１０ｍｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラ
ン、分子量（３～５ｋＤａ）を添加した。ＦＩＴＣ－デキストランを添加してから２４時
間後に、トランスウェルチャンバーの基底外側(basolateral side)の培地を回収した。

蛍光強度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））マイクロプレートリ
ーダーを使用して、４８５ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光波長で測定した。

上皮抵抗性機能不全アッセイ
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ－２）を、１０（％ ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ
および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（それぞれ、１０，０００単位／
ｍｌおよび１０，０００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フ
ラスコ中で９０％コンフルエンスになるまで増殖させた後、１２または２４ウェルの０．
４μｍ半透過性組織培養トランスウェルインサート(semipermeable tissue culture tran
swell inserts)(Corning Inc.)に播種した。細胞が完全に分化するまで、前記プロトコー
ルと同様に行った。

１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ－ＦＢＳを含む１００μｌのＤＭＥＭ中に極性を有する細胞(pol
arized cells)（頂端側(apical side)）を含有する所定のインサートウェルを、抗ＴＮＦ
α ＶＮＡＲタンパク質を含むまたは含まない１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦα、およびＩＦ
Ｎγで処理した。処理細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２および湿気で３７℃で２４時間イン
キュベートした。サイトカイン±抗ＴＮＦα ＶＮＡＲと共に２４時間インキュベートし
た後、上皮間電気抵抗(transepithelial electrical resistance)（ＴＥＥＲ）を、Ｍｉ
ｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）ＥＲＳ－２ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ（Ｖｏｌｔ／Ｏｈｍ）メ
ーターおよびＭＥＲＳＳＴＸ０１プローブ(Merck Millipore)を使用して頂端チャンバー
中で測定した。測定された抵抗値は、処理下の表面積に対して正規化された。

１２ウェルの組織培養トランスウェルインサートに、５００μＬのＤＭＥＭを含有する
ウェルあたり５×１０^６個の細胞を播種し、外側ウェル（基底外側(basolateral side)）
が１．５ｍＬのＤＭＥＭを含有することに留意することが重要である。また、ＴＥＥＲ測
定中に、インサートウェルおよび外側ウェル中のＤＭＥＭ容積を、それぞれ５００μｌお
よび１．５ｍｌに増加させて、ボルト－オームメーター電極(volt-ohm meter electrodes
)が、ウェルの底部に触れることなく、培地中に完全に浸漬させた。

Ｂ．ＩＣＯＳＬ結合ＶＮＡＲＳ
ＩＣＯＳＬ結合ＶＮＡＲＳ ２Ｄ４およびＣＣ３の単離および特徴付けは、ＷＯ２０１
４／１７３９７５およびＷＯ２０１４／１７３９５９に開示されている。

２．多価および多重特異的ＶＮＡＲの形成
Ａ．ＴＮＦ結合ドメイン
図３から、Ｄ１－ＦｃおよびＣ４－Ｆｃ分子の組み合わせが、二価形態で中和能力が増
加することが示された。したがって、ＶＮＡＲ ＤＮＡ１およびＣ４ならびに他の組み合
わせを、二価または二重特異性融合体として調製し、融合体として一緒に組み合わせた場
合、中和能力における同じ改善が見られることが示された。

二量体および三量体の構築
図４は、二価および二重特異性構築物のフォーマットの図を提供する。

２または３の別々のＰＣＲ反応を設定して、以下に列挙するオリゴヌクレオチドの組み
合わせを用いて、Ｎ末端、中間末端（三量体の場合）、およびＣ末端ＶＮＡＲドメインを
増幅し、各オリゴヌクレオチドは、それぞれ、精製および検出を容易にするための特異的
／独特のクローニング部位、ならびに／または６×ｈｉｓタグおよびｃ－ｍｙｃタグを有
する。

三量体構築ＰＣＲオリゴヌクレオチド：ここでは、それぞれＮ末端およびＣ末端上のＸ
ｂａ１／ＢａｍＨ１およびＡＰＡ１／ＥｃｏＲ１クローニング部位に隣接する中間断片と
してＢＡ１１遺伝子を有するインハウス設計ＤＮＡカセット(in-house designed DNA cas
sette)を利用した。上記に列挙したオリゴヌクレオチド対、ならびにＮ末端フォワードオ
リゴヌクレオチド中のＸｂａ１およびＢｓｓＨ１１部位の両方を有するオリゴヌクレオチ
ドを、ＰＣＲ増幅工程において利用することができ、これによりインハウス真核生物発現
ベクター(in-house eukaryotic expression vector)、ｐＥＥＥ２Ａ中への三量体遺伝子
をサブクローニングすることができる。それ以外は、全てのクローニングは、ｐＥＴ２８
ｂ(+)発現ベクターで行われる。

２μｌのＶＮＡＲ ＤＮＡ（５０～１００ｎｇ）、２μｌのフォワードおよびリバース
オリゴヌクレオチドプライマー（最終濃度１μＭ）、５μｌの１０Ｘ Ｔａｑポリメラー
ゼ緩衝液、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（最終濃度２５Ｕ／ｍｌ）、０．５μｌの
ｄＮＴＰ（最終濃度０．１ｍＭ）、および３８．２５μｌのＨ_２Ｏを含むＰＣＲ反応物（
最終反応容積は５０μｌ）。ＰＣＲプログラムを、９８℃で５分間で開始した。次いで、
９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクルを行った。７２℃
で５分間の最終延長を行った。アンプリコンをアガロースゲル電気泳動によりチェックし
、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。溶出したＤＮＡを適切な制限
エンドヌクレアーゼで消化した。

大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ(E. coli SHuffle)（登録商標）Ｔ７発現細胞における二量体お
よび三量体の発現
ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を介して発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（＋）にク
ローニングされたＶＮＡＲ領域、および得られたＶＮＡＲ遺伝子を含有する精製プラスミ
ドを、エレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ(E. coli SHuff
le)（登録商標）Ｔ７発現細胞[NEB]に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有す
るＴＹＥ寒天プレート上で選択した。抗ｈＴＮＦα ＶＮＡＲ－Ｄ１、Ｃ４およびＢ４融
合タンパク質を、３０℃でＩＰＴＧで誘導した際にＳＨｕｆｆｌｅ細胞の細胞質において
発現させた。

形質転換大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７発現細胞の単一コロニーを、ＯＤ_６０
０が０．４～０．６になるまで（通常、３７℃、２５０回転／分で、４～６時間のインキ
ュベーション）、５ｍＬの２×ＴＹ－カナマイシン培地中で成育させた。この対数期培養
物を用いて、カナマイシンおよびＰＯ_４塩を含む５０ｍＬのＴＢ培地に接種し、ＯＤ_６０
０が６．０～１０．０に達するまで３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。細
胞を４０００ｒｐｍ、３０℃で１５分間遠心分離し、次いで新鮮なＴＢ－カナマイシン－
ＰＯ_４塩培地に再懸濁し、３０℃、２５０ｒｐｍで１～２時間回復させた。最終ＩＰＴＧ
濃度１ｍＭを用いて細胞質タンパク質発現を誘導し、細胞を誘導後１２～１６時間、３０
℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。６０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間の遠心分離
によって細胞を回収し、細胞ペレット湿重量を測定した。細胞ペレットを、５ｍｌ／ｇの
湿潤細胞ペーストＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出試薬＋Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ
（登録商標）(Novagen, UK)に再懸濁し、細胞懸濁液を１０～１５ｒｐｍ、室温で２０分
間、振盪プラットフォームに置いた。細胞懸濁液を６０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心
分離し、上清中に収集した可溶性タンパク質を、固定化金属アフィニティークロマトグラ
フィー(immobilised metal affinity chromatography)（ＩＭＡＣ）レジン（ニッケル－
ニトリロ三酢酸、Ｎｉ－ＮＴＡまたはＮｉ－セファロース）を用いたポリヒスチジンタグ
によるアフィニティー精製のために準備した。ＶＮＡＲ融合タンパク質を、３００～５０
０ｍＭイミダゾール（ｐＨ ８．０）で溶出し、溶出物をＰＢＳ（１Ｌ ＰＢＳ／１ｍｌ
溶出タンパク質）（ｐＨ ７．４）に対して一晩透析した後、ＰＢＳを交換してさらに３
～４時間透析した。タンパク質の質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価し、Ultraspec 6300
pro uv/visible spectrophotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare)を用いて
定量した。

真核細胞発現のために、ＢＡ１１三量体カセットにクローニングしたドメインを、Ｂｓ
ｓＨＩＩおよびＥｃｏＲ１酵素を用いて消化し、ＣＭＶプロモーターを用いてｐＥＥＥ２
Ａ真核発現ベクターにサブクローニングし、プラスミド増殖のために大腸菌株に形質転換
した。ＶＮＡＲ三量体遺伝子を含む単離・精製されたプラスミドベクターを、線状ポリエ
チレンイミン［ＰＥＩ］と室温で２０分間共インキュベートした。プラスミドＤＮＡ：Ｐ
ＥＩの混合物を、９０％コンフルエンスの細胞増殖密度を有するＨＥＫ２９３細胞を含有
する細胞培養フラスコに移した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を３７℃、５％
ｖ／ｖ ＣＯ_２で５～７日間インキュベートした。細胞培養上清を集め、ＩＭＡＣ樹脂を
用いて発現タンパク質を精製し、ＰＢＳに対して透析した。

結合性およびＴＮＦ中和データ
図５は、二量体および二重特異性構築物のＴＮＦαへのＥＬＩＳＡ結合性を示す。

最初のＥＬＩＳＡデータから、二重特異性Ｄ１－Ｃ４構築物がＴＮＦ３０ナノボディ二
量体構築物と比較してアビディティ(avidity)（結合親和性と組み合わせた）が増加した
ことが示された。

これらのいくつかを、後に、表面プラズモン共鳴における固定化ＴＮＦへの結合性につ
いて測定した。

表１から、測定された二量体分子のうち、Ｄ１－Ｃ４二重特異性分子が、ＴＮＦ３０二
価ナノボディ構築物と比較して優れた結合親和性（アビディティ(avidity)）を示したこ
とが示される。

図６は、二価ＴＮＦナノボディと比較した、多くの二価または二重特異的ＶＮＡＲ融合
体についてのＴＮＦ中和データを示す。結合分子を、Ｌ９２９アッセイにおいてＴＮＦ中
和について試験した場合、Ｄ１－Ｃ４二量体は、ＴＮＦ３０ナノボディ二量体構築物と同
等またはそれより優れていた。この実験では、Ｄ１－Ｄ１二量体はＤ１－Ｂ４二量体より
も劣っていた。

表１は、試験した三量体構築物についてのＳＰＲ結合データを示す。これから、ＴＮＦ
α結合ドメイン間のスペーサーとして作用する、追加のドメインの導入がＴＮＦαに対す
る分子の相対親和性（アビディティ(avidity)）を有意に改善するように見えることが示
される。

ＴＮＦα中和アッセイで測定した場合、Ｄ１－ＢＡ１１－Ｃ４三量体構築物はａｄａｌ
ｉｍｕｍａｂと同等であり、ＴＮＦ３０ナノボディ構築物よりも優れていた。このアッセ
イにおいて、Ｄ１ドメインを含む二価分子は、ＴＮＦ３０ナノボディ構築物と有効性が同
等であった。

図７は、種々のＶＮＡＲフォーマットのＴＮＦα機能の中和能を測定した実験の結果を
示す。

表２は、中和データを要約する。スペーサードメインが含まれる場合、Ｄ１－ＢＡ１１
－Ｄ１およびＤ１－ＢＡ１１－Ｃ４は双方とも中和能において１０倍以上の改善を示し、
Ｄ１－ＢＡ１１－Ｃ４はａｄａｌｉｍｕｍａｂおよびＭＡＢ２１０とほぼ同等の効力を示
す。また、ＴＮＦ３０－ＢＡ１１－ＴＮＦ３０は、ＴＮＦ３０－ＴＮＦ３０二量体形態よ
りも改善を示すが、それほど顕著ではない。Ｄ１－Ｃ４構築物（配列番号２７および２８
）のＧｌｙＳｅｒリンカー長は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２から（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３に延長
され、その結果ｈＴＮＦ－α中和能が改善した。

これらの実験からのデータを表２に示す。さらなる比較データを表３に示す。

機能活性
背景
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ－２）は、適切なプラットフォーム（例えば、プ
ラスチックディッシュ、ニトロセルロースフィルター）上で増殖させると、正常な腸細胞
の形態学的特徴を発達させる。さらにコラーゲンコーティングされたポリカーボネートま
たはポリエステル膜は、腸上皮輸送モデルシステムとしてのＣａｃｏ－２単層に適してい
ることが示された(Wang, F., et al. Am. J. Path. 166.2 (2005): 409-419.; Hidalgo,
I.J., et al Gastroenterology 1989. 96: 736-49.)。

上皮膜の主な機能としては、イヌリンおよびデキストランなどの親水性溶質に対する障
壁の維持がある。この障壁は、以下に制限されないが、感染性、免疫媒介性および特発性
疾患などの、腸上皮にかかわる特定の疾患で損なわれる(Clayburgh, D.R., et al Lab In
vest. 2004. 84(3): 282-291; Wang, F., et al. Am. J. Path. 2005. 166(2): 409-419)
。傍細胞透過性の増加および腸上皮抵抗性の減少として測定される、腸障壁機能不全(int
estinal barrier dysfunction)は、クローン病等の、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と密接に関
連する(Irvine E.J. and Marshall J.K., Gastroenterology 2000. 119.6: 1740-1744.;
Wyatt et al., The Lancet 1993. 341(8858): 1437-1439.)。また、その結果漏出流下痢(
leak flux diarrhea)を生じる溶質の損失に寄与する、ＩＢＤにおける上皮タイトジャン
クションタンパク質(epithelial tight junction proteins)の減少を支持する証拠がある
(Schulzke J.D. et al., Ann N Y Acad Sci. 2009 1165:294-300; Schmitz H. et al., J
. Cell Sci 1999. 112(1): 137-146)。最後に、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、
ＴＮＦαおよびリポ多糖（ＬＰＳ）は、ヒト上皮細胞株において腸上皮障壁機能不全を相
乗的に誘導することが示されている(Wang et al., J. Cell Science 1999. 112(1): 137-
146; Schuerer-Maly C.C et al., Immunology 1994. 81(1): 85)。

抗ＴＮＦα処置はクローン病における腸障壁機能不全を修復することが示されており(S
uenaert P. et al., Am J Gastroenterol 2002. 97(8): 2000-2004)、ゆえに、我々は、
我々の抗ＴＮＦ ＶＮＡＲドメインがインビトロで誘導されるこれらの機能不全を修復す
ることを示すために、抗ＴＮＦ ＶＮＡＲドメインを試験した。我々は、二重特異性／多
価ＶＮＡＲドメインが、ＶＮＡＲ単量体と比較した場合、これらの機能不全の予防により
有効であると仮定した。

Ｃａｃｏ－２細胞の極性を有する単層を横切るＦＩＴＣ－デキストラン傍細胞流(FITC-
Dextran paracellular flux across polarised monolayer of Caco-2 cells)
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ－２）を、１０（％ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳお
よび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（それぞれ、１０，０００単位／ｍ
ｌおよび１０，０００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フラ
スコ中で９０％コンフルエンスまで増殖させた後、２４ウェルの０．４μｍ半透性組織培
養トランスウェルインサート(semipermeable tissue culture transwell inserts)(Corni
ng Inc.)に播種した。１０μｌの細胞懸濁液を９０μｌの０．４％トリパンブルー排除色
素(trypan blue exclusion dye)(Beckman Coulter)に懸濁し、この混合物をカバースリッ
プを取り付けた血球計上に注意深く移した。

生存細胞数を測定した後、トランスウェルインサート当たり１×１０^５個の細胞を１０
０μｌの最終ＤＭＥＭ容積に播種する一方、細胞を含まない６００μｌのＤＭＥＭを外側
含有ウェル(outer containing wells)に移した。トランスウェルプレートを、５％（ｖ／
ｖ）ＣＯ_２および湿気で３７℃でインキュベートし、この際、使用済みのＤＭＥＭ＋１０
％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを毎に交換した。細胞増殖を、細胞が１００％コンフルエンスに達す
るまで（通常、播種後５～７日間）、位相差顕微鏡（倍率４０倍の対物レンズ）下でモニ
ターした。Ｃａｃｏ－２細胞をさらに２１日間増殖させて分化させ、この際、使用済みの
培地を分化まで４８時間毎に交換した。

１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ－ＦＢＳを含む１００μｌのＤＭＥＭ中に極性を有する細胞（頂
端側）を含有する所定のインサートウェルを、抗ＴＮＦα ＶＮＡＲタンパク質を含むま
たは含まない１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＬＰＳで処理した。処理細胞を、
５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２および湿気で３７℃で１８時間インキュベートした。サイトカイン
±抗ＴＮＦα ＶＮＡＲと共に１８時間インキュベートした後、処理細胞の位相差画像を
得、続いて、Ｃａｃｏ－２単層の頂端側(apical side)（インサートウェル）に５μｌの
１０ｍｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン、分子量（３～５ｋ
Ｄａ）を添加した。ＦＩＴＣ－デキストランを添加してから２４時間後に、トランスウェ
ルチャンバーの基底外側(basolateral side)の培地を回収した。

蛍光強度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））マイクロプレートリ
ーダーを使用して、４８５ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光波長で測定した。

図８は、いくつかのＴＮＦ ＶＮＡＲマルチドメイン結合分子を比較した、Ｃａｃｏ－
２細胞の極性を有する単層(polarised monolayer)を横切る傍細胞流(paracellular flux)
を測定する実験の透過性データを示す。この実験から、より低い濃度の二量体または三量
体がチャレンジセル(challenged cells)のより高い保護レベルをもたらしたため、様々な
二価および二重特異性形態が単量体形態よりも改善された機能を示すことが示される。

極性を有するＣａｃｏ－２細胞単層における上皮抵抗性機能不全アッセイ
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ－２）を、１０（％ ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ
および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（それぞれ、１０，０００単位／
ｍｌおよび１０，０００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フ
ラスコ中で９０％コンフルエンスになるまで増殖させた後、１２または２４ウェルの０．
４μｍ半透過性組織培養トランスウェルインサート(semipermeable tissue culture tran
swell inserts)(Corning Inc.)に播種した。細胞が完全に分化するまで、セクション０に
前記したプロトコールと同様に行った。

１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ－ＦＢＳを含む２００μｌのＤＭＥＭ中に極性を有する細胞(pol
arized cells)（頂端側(apical side)）を含有する所定のインサートウェルを、抗ＴＮＦ
α ＶＮＡＲタンパク質を含むまたは含まない１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦα、およびＩＦ
Ｎγで処理した。処理細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２および湿気で３７℃で２４時間イン
キュベートした。サイトカイン±抗ＴＮＦα ＶＮＡＲと共に２４時間インキュベートし
た後、上皮間電気抵抗(transepithelial electrical resistance)（ＴＥＥＲ）を、Ｍｉ
ｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）ＥＲＳ－２ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ（Ｖｏｌｔ／Ｏｈｍ）メ
ーターおよびＭＥＲＳＳＴＸ０１プローブ(Merck Millipore)を使用して頂端チャンバー
中で測定した。測定された抵抗値は、処理下の表面積に対して正規化された。１２ウェル
の組織培養トランスウェルインサートに、５００μＬのＤＭＥＭを含有するウェルあたり
５×１０^６個の細胞を播種し、外側ウェル（基底外側(basolateral side)）が１．５ｍＬ
のＤＭＥＭを含有することに留意することが重要である。また、ＴＥＥＲ測定中に、イン
サートウェルおよび外側ウェル中のＤＭＥＭ容積を、それぞれ５００μｌおよび１．５ｍ
ｌに増加させて、ボルト－オームメーター電極(volt-ohm meter electrodes)が、ウェル
の底部に触れることなく、培地中に完全に浸漬させた。

図９は、極性を有するＣａｃｏ－２細胞における上皮抵抗性を測定するアッセイを示す
。この実験から、種々の二価および二重特異性形態が単量体形態よりも改善された機能を
示すことが示される。

Ｂ ＩＣＯＳＬ結合ドメイン
多価形態の構築の構築および有効性データ
２Ｄ４およびＣＣ３ Ｆｃ融合体
図１０は、ＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲ（およびヒトＩｇＧ Ｆｃ、これはさらなる改善され
た機能的特性を提供する）を組み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲのための
フォーマットを示す。

方法
所定のＶＮＡＲ単量体ドメインをＰＣＲ増幅し、真核生物発現ベクターにサブクローニ
ングした。このクローニングは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃをコードするＤＮＡ断片（このヒト
ＩｇＧ１ Ｆｃ断片はまた、セリンに変異した軽鎖に通常ジスルフィド架橋する５プライ
ム最多Ｃｙｓ残基(5 prime most Cys residue)を有する全長ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列をコ
ードした）の５’末端上に行った。

ＰＣＲ増幅に供する間、オリゴヌクレオチドを用いて、ＶＮＡＲドメインのカルボキシ
ル末端とヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のＮ末端残基との間にリンカー配列を挿入するアミノ酸
残基、ならびに哺乳動物ベクター発現系と適合する制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し
た。このプロセスによって導入されたリンカー配列は、下線を引いたＲＴアミノ酸残基を
コードする核酸配列がＢｓｉＷ１制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するＧＧＧＧＳＧＧ
ＧＧＲＴ、または下線を引いたＧＡＤＱアミノ酸残基のコドンの使用がＢｃｌ１部位を導
入するＧＧＧＧＳＧＧＧＡＤＱのいずれかであった。これらの部位は双方とも、Ｆｃ真核
生物発現ベクターの異なるバージョンにおけるクローニング部位と適合する。全てのアン
プリコンの５’末端に、真核生物ベクター構築に適合する独特のＢｓｓＨＩＩ部位を導入
する。

Ｆｃのカルボキシル末端にリンカーＶＮＡＲドメイン融合体を導入するためのＤＮＡ配
列を設計し、これらの中間体断片の合成をＧｅｎｅＡｒｔ(InvItrogen)によって行った。
これらの断片のＮ末端は、ヒトＩｇＧ１由来ＣＨ３領域内の天然に存在するＢｓｒＧＩ部
位、およびベクター中のＥｃｏＲ１部位を利用した。これらの構築物は、Ｆｃドメインの
カルボキシル末端とＶＮＡＲドメインのアミノ末端との間に、アミノ酸配列ＴＡＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡを有するリンカーを導入した。リンカーの下線を引いた三
重アラニン領域でのコドンを使用することによりＮｏｔＩ制限部位の導入を可能にし、こ
れは、さらなる二重特異的ＶＮＡＲ構築物を組み立てるためのその後のクローニング作業
において利用され得る。

血清を含まない培地を用いたＨＥＫ ２９３細胞懸濁液におけるＰＥＩ仲介トランフェ
クションおよび一時的発現後(Post PEI-mediated transfection and transient expressi
on)、ＥＬＩＳＡによりＮＡＲ Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルを測定した。細胞残屑
を除去するための最初の０．２μｍ濾過清澄化工程の後に、ＶＮＡＲ Ｆｃタンパク質を
精製するためのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを行った。アフィニティ
ー精製タンパク質を完成するための第２のクロマトグラフィー工程を、必要に応じて工程
間で緩衝液を交換して、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフ
ィーを使用して行った。Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いてタンパク質を濃縮し、Ｕ
Ｖ分光法によって最終タンパク質濃度を測定した。分析ＳＥＣおよびＳＤＳ ＰＡＧＥを
使用して、最終精製タンパク質の完全性(integrity)を決定した。

ＩＣＯＳＬ中和アッセイ
リガンド－レセプター中和アッセイを以下のようにして行った：ヒトＩＣＯＳレセプタ
ーを発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェル細胞培養プレート(Greiner, Bio-One)のＤＭＥＭ
／Ｆ１２＋５％ ＦＢＳ培地中でコンフルエントになるまで増殖させた。１μｇ／ｍｌの
ｒｍＢ７－Ｈ２／Ｆｃ（１５８－Ｂ７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の計２０μｌを、ＤＭ
ＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＦＢＳ中の４０μｌの連続希釈抗ＩＣＯＳＬ－ＶＮＡＲ－Ｆｃと共
に１時間プレインキュベートした後、細胞に添加した。１６℃で１時間インキュベートし
た後、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＦＢＳで３回穏やかに洗浄し、同じ培地で１：１
０，０００に希釈したヤギ抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ(SIGMA)と共に１６℃で４０分間インキュ
ベートした。細胞を洗浄し、ＴＭＢ基質で発色させた。

図１１は、ＥＬＩＳＡ結合データを示し、ＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲＳがこれらのフォーマ
ットにおいてそれらの同族抗原に結合することを示す。

図１２は、ＴＮＦ Ｒ１ドメイン、ＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲおよびヒトＩｇＧ Ｆｃを組
み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲのフォーマットを示し、これらはさらな
る改善された機能特性を提供する。

図１３は、ＴＮＦ Ｒ１ドメイン、ＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲおよびヒトＩｇＧ Ｆｃを組
み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲについての有効性のデータを示し、これ
はさらなる改善された機能特性を提供する。

これらのデータから、融合体が、ＴＮＦＲ１を介してＴＮＦに、およびＶＮＡＲドメイ
ンを介してｍＩＣＯＳＬおよびｈＩＣＯＳＬに結合することができることが示される。こ
れらの構築物は、ｍＩＣＯＳＬまたはｈＩＣＯＳＬのそれらの同族のＣＨＯ発現レセプタ
ーへの結合を阻害することができる。

これらのデータから、多価フォーマットに組み合わされたＶＮＡＲがそれらの標的に結
合することができ、上記分子が単量体ＶＮＡＲよりも改善された特性を示すことができる
ことが示される。

インビボでの前臨床研究
研究の背景
関節リウマチのＴｇ１９７マウスモデルは、野生型および３’修飾ヒト腫瘍壊死因子（
ｈＴＮＦ－α）トランスジーンを保有し、発現するトランスジェニックマウス系である。
これらのトランスジェニックマウスは、生物活性ヒトＴＮＦ－αの過剰発現に依存して、
４～７週齢で１００％の発生率で慢性多発性関節炎を発症する(Keffer et al. 1991, EMB
O J., Vol. 10, pp. 4025-4031)。第１の抗ＴＮＦ－α治療抗体である、Ｒｅｍｉｃａｄ
ｅ（登録商標）および他の抗ＴＮＦ－α生物製剤の治療効力の例示はＴｇ１９７マウスモ
デルを使用して確立された(Shealy et al., 2002, Arthritis Research & Therapy, 4(5)
, p.R7; Shealy et al., 2010, MAbs (Vol. 2, No. 4, pp. 428-439). Taylor & Francis
)。

本研究の目的は、関節炎のＴｇ１９７トランスジェニックマウスモデルにおける関節炎
症状の予防における、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）と比較した抗ＴＮＦ－α Ｄ１－Ｆｃ－
Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））の治療効果を評価することであった。

方法
合計４０匹のマウスを、５つの試験群、Ｇ１～Ｇ５の各々に割り当てた（表４）。この
研究の目的のために、トランスジェニックマウスを、８匹のマウスからなる群に割り当て
、それぞれに、試験化合物またはビヒクルバッファー（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、
ｐＨ ７．４）を、関節炎の確立前の、第３週齢から週２回、皮下に投与を開始して、第
１０週齢まで７週間にわたって継続した。トランスジェニックマウス（２匹の雄および２
匹の雌）の未処置動物の追加の１群を、組織病理学的状態のために３週齢の対照マウスと
して使用し、最初の用量投与の前に剖検した。

最初の関節炎スコアリングを行う前に、マウスをグループに分けた。年齢および性別の
バランスのとれた研究は、離乳時に同調した交配の異なる同腹仔からプールしたＧ１～Ｇ
５群の８匹（４匹の雄および４匹の雌）のヘテロ接合性Ｔｇ１９７から構成された。異な
る実験群へのマウスの割り当ては、研究の開始時に異なる群で体重が確実に等しく分布す
るように行った。インビボ関節炎スコアを表５に記載のように評価した。

１０週齢で、すべての動物を剖検し、各動物の血液（血清を単離し、－８０℃で保存）
および２つの足首関節を集めた。すべての実験動物の足関節を解剖し、石灰化し、さらに
処理して関節炎の組織病理学的評価を行った。足首の組織病理学は、表６に記載される組
織病理学スコアリングシステムに従って顕微鏡検査によって評価され、代表的な画像のみ
が結果セクションに含まれた。

群の平均スコアを有するインビボでの関節炎スコアを、結果セクションでグラフとして
示す。

グループ平均スコアを有する組織病理学的スコアを、結果のセクションで棒グラフとし
ておよび付録に表として示す。２５倍の倍率での例示的な組織病理学的画像もまた、付録
に提示される。

結果
Ｔｇ１９７関節炎モデルに対する抗ｈＴＮＦ－α Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（
商標））およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効力の評価を予防的投与計画に従って行った
、すなわち、マウスがインビボ関節炎病理学および初期組織病理学的病変の軽度の証拠を
示したマウスの３週齢で処置を開始した。１０週齢まで、ビヒクル処置対照群Ｇ１におけ
るインビボでの関節炎スコアは３週齢の未処置動物と比較して劇的に増加したが、同じ年
齢ではＧ１の動物において観察された組織病理学的病変が３週齢対照マウス群において観
察されたものよりも統計的により重篤であった。

被験物質Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ 抗ｈＴＮＦαのインビボおよび組織病理学的ならびに体重
関節炎症状における治療効果の有効性評価
・Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質の３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ用量レジメにより、Ｇ１
のビヒクル処置マウスと比較して、インビボおよび組織病理学的関節炎病理学において、
Ｔｇ１９７の統計的に有意な強固な阻害が与えられた。より具体的には、週に２回、７週
間の期間にわたり１４回の用量を投与した後、用量レジメは以下の結果をもたらした：
Ｇ２の動物の３ｍｇ／ｋｇのＤ１－Ｆｃ－Ｄ４被験物質処置後のインビボでの約８８の
阻害および関節炎の組織病理スコアの約８６％の阻害
Ｇ５の動物の１０ｍｇ／ｋｇのＤ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質処置後のインビボでの約８８
％の有意な阻害および関節炎の組織病理学的スコアの約８３％の阻害
Ｇ３の動物の３０ｍｇ／ｋｇのＤ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質処置後のインビボでの約８８
％の有意な阻害および関節炎の組織病理学的スコアの約８６％の阻害
・統計的有意性は３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量レジメにおいてのみ得られた
が、Ｇ１のビヒクル処置マウスと比較して全ての用量レベルにおいてより多くの体重増加
が見られた同様の知見が、Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質処置マウスの平均体重曲線において
観察された。

Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質の用量反応有効性評価
・３、１０および３０ｍｇ／Ｋｇ用量のＤ１－Ｆｃ－Ｄ４被験物質による処置では、イ
ンビボでの関節炎評価および体重スコア、ならびにすべての用量が同様に作用し、それら
の治療効果は統計的に区別されなかった(undifferentiated)組織病理学的評価によって示
される用量依存的な応答効果を示さなかった。

Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）のインビボおよび病理組織学的ならびに体重関節炎症状にお
ける治療効果の有効性評価
・Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）の１０ｍｇ／ｋｇ用量レジメにより、Ｇ１のビヒクル処置
マウスと比較して、インビボおよび組織学的関節炎病理学において、Ｔｇ１９７の強固な
統計的に有意な阻害が与えられた。より具体的には、週２回、７週間の期間にわたり１４
回の容量を投与した後、我々は以下を観察した：
Ｇ４の動物の１０ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）処置後のインビボでの約８２
％の阻害および関節炎の組織病理スコアの約８６％の阻害
・Ｇ１のビヒクル処置マウスと比較してより多くの体重増加が見られた同様の知見が、
Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）処置マウスの平均体重曲線において観察された。

Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質とＨｕｍｉｒａ（登録商標）との用量反応の比較
１０ｍｇ／ｋｇ用量でのＤ１－Ｆｃ－Ｃ４試験物質とＨｕｍｉｒａ（登録商標）との阻
害効果の比較試験から、体重、インビボでの関節炎スコア及び組織病理学的評価を含む、
全ての評価パラメータにおいて統計的に区別されないことが判明した。

３週齢対照動物に対するＤ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の
効果の組織病理学的比較
３、１０および３０ｍｇ／ＫｇのＤ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質ならびに１０ｍｇ／Ｋｇ
Ｈｕｍｉｒａの阻害作用により、１０週目でより組織病理学的病変が軽減し、３週齢の対
照未処置動物と統計的に区別された。

さらに、マウスＴＮＦ－αを標的とするＶＮＡＲ Ｓ１７ Ｑｕａｄ－Ｘ（商標）構築
物を用いたインビトロでの効力促進の第２の例示を行った。

ＶＮＡＲ Ｓ１７は、ヒトＴＮＦ－αに対する結合または中和活性を有さない特異的抗
マウスＴＮＦ－αである。ＶＮＡＲ Ｓ１７－Ｆｃは、約８ｎＭのインビトロ効力（ＮＤ
５０）を有するマウスＴＮＦ－αの強力な中和剤である。Ｑｕａｄ－Ｘ^ＴＭ構築物（Ｓ１
７－Ｆｃ－Ｓ１７）として設計した場合、インビトロでの中和能は０．２ｎＭにまで約４
０倍向上した（図３０）。

さらに、Ｓ１７ Ｑｕａｄ－Ｘ^ＴＭおよびＤ１－Ｃ４ Ｑｕａｄ－Ｘ^ＴＭ構築物がＴＮ
Ｆ－αの異なる種を認識することが示された（図３１）。

討論および結論
この研究の結果から、参照Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）およびＤ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａ
ｄ－Ｘ（商標））およびＤ１－ＢＡ１１－Ｃ４抗ｈＴＮＦ－α物質がＴｇ１９７動物にお
いて観察される関節炎表現型を阻害し、これにより、ビヒクル処置動物と比較して、体重
が増加しならびにインビボおよび組織病理学的関節炎病理学が軽減することが示される。

参照Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）の治療効果は、１０ｍｇ／ｋｇ用量で評価され（図２９
～図３２）、ビヒクル処置マウスと比較した場合、インビボ関節炎および足首の組織病理
学的評価の統計的に有意な阻害をもたらした。図３３において、１ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉ
ｒａ（登録商標）は、８週間で有意な疾患の改善(breakthrough)を示す。１ｍｇ／ｋｇ、
３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）の投薬
レジメを用いた以前のＴｇ１９７マウスモデル研究では、１ｍｇ／ｋｇ（図３３）または
３ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）（図３５）のいずれかで処置されたマウスの群
において有意な疾患の改善が存在することが示された。これらのマウス群は未処置群と同
様の時間依存性疾患進行を有し、インビボ関節炎（ＡＳ）および組織病理学スコア（ＨＳ
）は１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）のいずれかで処置
した群よりも有意に高かった（図３３）。

Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４（Ｑｕａｄ－Ｘ（商標））被験物質は、全ての評価された用量、すな
わち、０．５、１、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇが疾患の完全な
制御を伴う類似のかつ統計的に区別できない治療効果を示したため、用量依存性応答を示
さなかった。さらに、インビボでの関節炎および組織病理学的評価から、３ｍｇ／ｋｇ用
量のＤ１－Ｆｃ－Ｃ４被験物質の治療効果が１０ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）
の治療効果に統計的に匹敵することが明らかになった。また、１０週齢の３ｍｇ／ｋｇの
Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４処置マウスにおいて、疾患改善の徴候は観察されず、８週齢の０．５お
よび１ｍｇ／ｋｇのＤ１－Ｆｃ－Ｃ４についても観察されなかった。

したがって、我々はさらに、Ｄ１－Ｆｃ－Ｃ４ 抗ｈＴＮＦ－αドメインが標準的な治
療法であるＨｕｍｉｒａ（登録商標）よりも、インビトロ（Ｌ９２９およびＣａｃｏ２デ
ータ－－図２、３、６～８、２０、２３および２８）およびインビボ（図２９～３５）双
方におけるＴＮＦ－αの効果を中和する効果が大きいことを示した。また、我々は、非Ｆ
ｃベースのタンデム多価ＶＮＡＲ(non-Fc based tandem multivalent VNAR)である、Ｄ１
－ＢＡ１１－Ｃ４のインビボ有効性を示した（図３３および図３４）。

最後に、我々は、抗ＴＮＦ ＶＮＡＲ（Ｄ１－Ｆｃ）がまた、Ｆｃ単独フォーマットで
全身投与された場合、炎症性眼疾患のラットモデルにおいて（デキサメタゾンと同様の効
力で）ブドウ膜炎を制御および治療し得ることを示すことができた（図３６）。

Claims (14)

1. １以上の特異的抗原の同一または異なるエピトープに結合する２以上のＶＮＡＲドメイ
   ンを含み、前記ＶＮＡＲドメイン間にスペーサー配列をさらに含むマルチドメイン特異的
   結合分子であって、前記スペーサー配列が前記マルチドメイン特異的結合分子において示
   される独立した機能を有し、前記スペーサー配列が免疫グロブリンＦｃ領域であり、前記
   ２以上のＶＮＡＲドメインのそれぞれはＮ－末端からＣ－末端方向にＦＷ１－ＣＤＲ１－
   ＦＷ２－ＨＶ２－ＦＷ３ａ－ＨＶ４－ＦＷ３ｂ－ＣＤＲ３－ＦＷ４の構造を有する、マル
   チドメイン特異的結合分子。
2. 前記２以上のＶＮＡＲドメインが、１の特異的抗原上の同じまたは異なるエピトープに
   結合する、請求項１に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
3. 前記２以上のＶＮＡＲドメインが、１の特異的抗原上の異なるエピトープに結合する、
   請求項２に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
4. 前記２以上のＶＮＡＲドメインが、異なる特異的抗原に結合する、請求項１に記載のマ
   ルチドメイン特異的結合分子。
5. 前記スペーサー配列が、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１に記載のマルチ
   ドメイン特異的結合分子。
6. 前記特異的抗原が、サイトカイン、成長因子、酵素、ホルモン、細胞表面結合分子(cel
   l surface associated molecule)、細胞表面膜成分、細胞内分子、細胞外マトリックス成
   分、間質抗原、血清タンパク質、骨格抗原、または微生物抗原を含む群からのものである
   ことをさらに特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結
   合分子。
7. 前記ＶＮＡＲドメインの少なくとも一が以下のＣＤＲおよび超可変領域（ＨＶ）を含む
   ＴＮＦ－α特異的ＶＮＡＲ結合ドメインである、請求項１～６のいずれか１項に記載のマ
   ルチドメイン特異的結合分子：
   ＣＤＲ１：ＨＣＡＴＳＳまたはＮＣＧＬＳＳまたはＮＣＡＬＳＳ
   ＨＶ２：ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ
   ＨＶ４：ＳＧＳＫＳまたはＥＧＳＫＳ
   ＣＤＲ３：ＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶまたはＳＷＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶまたはＹＩ
   ＰＣＩＤＥＬＶＹＭＩＳＧＧＴＳＧＰＩＨＤＶ
   または少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的変異体。
8. 前記ＶＮＡＲドメインのうちの１以上が、配列番号２、７もしくは１２を含む群から選
   択されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的変異体
   を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
9. 前記ＶＮＡＲドメインのうちの２以上が、配列番号２、７もしくは１２を含む群から選
   択されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的変異体
   を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
10. ヒトに投与されると潜在的な免疫原性を減少させるように、１以上のアミノ酸配列位置
    で修飾される、請求項１～９のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結合分子をコードするポ
    リヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
12. 宿主細胞が結合分子を産生するような条件下で請求項１１に記載のポリヌクレオチドを
    含む前記宿主細胞を培養または維持することを含み、必要に応じて、前記結合分子を単離
    することをさらに含む、結合分子を調製する方法。
13. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結合分子、および必要で
    あれば少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
14. それを必要とする患者における疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１～１
    ０のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的分子の使用。