CN111479825A - 特异性结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含VNAR的多结构域特异性结合分子的形成。本发明还提供了与肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的特异性结合结构域。

Description

特异性结合分子
技术领域
本发明涉及包含VNAR的多结构域特异性结合分子的形成。还提供了与肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的特异性结合结构域。
背景技术
对抗击疾病的特定的、日益有效和多样化的治疗武器的研究已经利用了无数的不同模态。从传统的小分子到逐渐增大的生物药物，例如单结合结构域(10-15kDa)到完整的IgG(～150kDa)。目前正在研究的作为潜在治疗剂的单结构域包括多种不同的蛋白质支架，所有这些都具有它们相关的优点和缺点。
这样的单结构域支架可以源自来自不同物种的蛋白质阵列。新的或新的抗原受体(IgNAR)是在软骨鱼血清中发现的大约160kDa的同型二聚体蛋白质(Greenberg A.S.,etal.,Nature,1995.374(6518):p.168-173,Dooley,H.,et al,Mol.Immunol,2003.40(1):p.25-33；Müller,M.R.,et al.,mAbs,2012.4(6):p.673-685))。每个分子由单个N端可变结构域(VNAR)和五个恒定结构域(CNAR)组成。IgNAR结构域是免疫球蛋白超家族的成员。VNAR是一个紧密折叠的结构域，其结构和某些序列与免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和细胞粘附分子相似，类似于经典免疫球蛋白和T细胞受体的N可变末端结构域，被称为VNAR。VNAR与免疫球蛋白具有有限的序列同源性，例如VNAR与人轻链序列之间有25-30％的相似性(Dooley,H.和Flajnik,M.F.,Eur.J.Immunol.,2005.35(3):p.936-945)。
Kovaleva M.et al Expert Opin.Biol.Ther.2014.14(10):p.1527-1539和Zielonka S.et al mAbs 2015.7(1):p.15-25最近提供了VNAR的结构特征和产生的综述，在此将其引入作为参考。
VNAR似乎不是从经典的免疫球蛋白抗体祖先进化而来的。VNAR的独特结构特征是与存在于常规免疫球蛋白可变区中的CDR2环等价的序列的截短，并且缺乏通常允许与轻链结构域结合的疏水性VH/VL界面残基，所述轻链结构域不存在于IgNAR结构中，并且在某些VNAR亚型中，在CDR区中存在额外的半胱氨酸残基，除了在与CDR1和3的N端相邻的构架(framework)1和3区中的半胱氨酸之间的典型免疫球蛋白超家族桥之外，观察到所述额外的半胱氨酸残基形成额外的二硫桥。
迄今为止，有三种确定类型的鲨鱼IgNAR，称为I、II和III(图1)。这些已经基于非典型半胱氨酸残基的位置进行了分类，所述非典型半胱氨酸残基处于强选择压力下并因此很少被置换。
所有三种类型在35和107位都具有稳定标准免疫球蛋白折叠的经典免疫球蛋白标准半胱氨酸(编号见Kabat,E.A.et al.Sequences of proteins of immunologicalinterest.5th ed.1991,Bethesda:US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH)，以及36位不变的色氨酸。没有确定的CDR2本身，但与TCR HV2和HV4相比更接近的序列变异区域已分别在构架2和构架3中确定。I型在构架2和构架4中具有种系编码的半胱氨酸残基，并且在CDR3内具有偶数个额外的半胱氨酸。针对溶菌酶分离的并与溶菌酶复合的I型IgNAR的晶体结构研究使得能够确定这些半胱氨酸残基的贡献。构架2和4半胱氨酸与CDR3中的那些形成二硫键，形成紧密包装的结构，其中CDR3环被紧紧地向下保持朝向HV2区域。迄今为止，I型IgNARs仅在护士鲨(nurse shark)中被鉴定到-所有其它板鳃亚纲，包括相同目的成员，仅具有II型或这种类型的变体。
II型IgNAR被定义为在CDR1和CDR3中具有半胱氨酸残基，其形成保持这两个区域紧密接近的分子内二硫键，产生有助于结合口袋或沟的突出CDR3(图2)。I型序列通常具有比II型长的CDR3，分别具有平均21和15个残基。这被认为是由于对I型CDR3中的两个或多个半胱氨酸残基与它们的构架2和4对应物相结合的强选择压力。对体细胞突变积累的研究表明，II型CDR1中的突变数量比I型多，而I型HV2区的序列变异比II型大。这一证据与抗原结合位点内这些区域的确定的定位充分相关。
第三种称为III型的IgNAR已在新生儿中被鉴定出来。由于D1和D2区(形成CDR3)与V基因的种系融合，IgNAR家族的这个成员在CDR3中缺乏多样性。几乎所有已知克隆都具有15个残基的CDR3长度，几乎没有或没有序列多样性。
另一种结构类型的VNAR，称为(IIIb或IV)型，只有两个典型的半胱氨酸残基。迄今为止，这种类型主要在狗鲨(dogfish sharks)中发现(Liu,J.L.,etal.Mol.Immunol.2007.44(7):p.1775–1783；Kovalenko O.V.,et al.J BiolChem.2013.288(24):p.17408-19)，并且也从来源于斑纹须鲨(wobbegong sharks)的半合成V-NAR文库中分离(Streltsov,V.A.et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(34):p.12444–12449)。
然而，已经表明从由VNAR序列形成的合成文库中分离的特异性VNAR可以以高亲和力结合其它蛋白质(Shao C.Y.et al.Mol Immunol.2007.44(4):p.656-65；WO2014/173959)，并且IgNAR是适应性免疫系统的一部分，因为软骨鱼可以用抗原免疫并获得结合该抗原的应答IgNAR(Dooley,H.,et al,Mol.Immunol,2003.40(1):p.25-33；WO2003/014161)。已经表明，IgNAR具有将V样序列与D和J序列组合连接的机制，类似于免疫球蛋白和T细胞受体的机制(概述于Zielonka S.et al mAbs 2015.7(1):p.15-25)。
与其它天然免疫球蛋白中的可变结构域不同，VNAR结合表面来自四个多样性区域：CDR1、HV2、HV4和CDR3(也参见Stanfield,R.L.,et al,Science,2004.305(5691):p.1770-1773；Streltsov,V.A.,et al,Protein Sci.,2005.14(11):p.2901-2909；Stanfield,R.L.,et al.,J Mol.Biol.,2007.367(2):p.358-372)，它们通过插入框架序列按以下顺序连接：FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4。缺少天然轻链配偶体和缺少CDR2的组合使得VNARs成为脊椎动物界中最小的天然存在的结合结构域。
IgNAR与骆驼科(骆驼、单峰骆驼和美洲驼，Hamers-Casterman,C.et al.Nature,1993.363,446-448；Wesolowski,J.,et al.,Med Microbiol Immunol,2009.198(3):p.157-74)中发现的只有重链的免疫球蛋白(HCAb)共有一些偶然特征，而不像IgNAR，HCAb显然来源于免疫球蛋白家族，并且与标准免疫球蛋白共有显著的序列同源性。重要的是，VNARs的一个关键区别在于，与经典免疫球蛋白或HCAbs不同，该分子在其进化中的任何点都没有配对轻链。Flajnik M.F.et al PLoS Biol 2011.9(8):e1001120和Zielonka S.etal mAbs 2015.7(1):p.15-25都评论了VNAR和骆驼科动物免疫球蛋白衍生的VHH单结合结构域之间的相似性和差异，以及它们独特的进化起源。
来源于经典免疫球蛋白轻链和重链(分别为VL和VH)的结合结构域已经显示能够连接在一起形成二价或多价和双特异性结合实体，无论是scFv形式(Bird et al.,1988；Huston et al.,1988)，其中免疫球蛋白VL和VH结构域通过短肽接头Trauncker et al.连接(Traunecker A,et al.EMBO J.1991.10,p.3655-36,Traunecker A,et al.Int JCancer Suppl.7,51-52；Neri D.J Mol Biol.1995.246(3):p.367-73)还是双抗体形式(Holliger P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993.90,6444-6448；Holliger P.etal.Nat.Biotechnol.15,632-636.其它早期的实例参见Mack M,et alProc.Natl.Acad.Sci.USA 1995.92,p.7021-7025,Jost CR,et al Mol.Immunol.1996.33,p.211-219)。Tandabs包括两对与单多肽链连接的VL和VH结构域(Kipriyanov S.M.et al.,J.Mol.Biol.293,41-56)以形成双特异和二价分子。
另外，VHH已经显示能够连接在一起形成二价或多价和双特异性结合实体(ElsConrath et al.J Biol Chem.2001.276(10)p.7346–7350)。类似地，来自T细胞受体的可变结构域可以与免疫球蛋白scFv连接以形成双特异性形式(McCormack E.et al.CancerImmunol Immunother.2013.62(4):p.773-85)。来自经典免疫球蛋白的单个抗体可变结构域(dABs:Ward E.S.et al.Nature 1989,341,p.544-546)也可以二聚化。双特异性结合分子的总体概念和目前在它们开发上的进展最近已经由例如Kontermann R.mAbs 2012.4(2):185-197；Jost C.and Pluckthun A.Curr Opin Struct Biol.2014.27:p.102-112；Spiess C.et al.Mol Immunol 2015.67(2):95-106进行了综述。
除了识别单独分子上的表位的双特异性分子之外，连接识别相同蛋白(双互补位)上的相邻表位的两个抗体结合结构域的概念具有很长的历史(参见Neri D.J MolBiol.1995.246(3):p.367-73)。双互补位VHH分子已经被公开(例如，Jahnichen S.et alProc Natl Acad Sci U S A.2010.107(47):p.20565-70；Roovers R.C.et al Int JCancer.2011 129(8):p.2013-24)。
然而，已经表明，与VHH不同，VNARs可能不能有效地形成二聚体融合分子(SimmonsD.P.et al.Immunol Methods.2006 315(1-2):p.171-84)。(也参见双特异性抗体(Bispecific Antibodies)Konterman R.E.Springer出版2011；6.6；也参见Strohl W.R.和Strohl L.M.，治疗性抗体工程(Therapeutic Antibody Engineering)，Woodhead出版2012的p322/323中的评论)。
发明内容
本发明涉及提供包含两个或多个VNAR结构域的多结构域特异性结合分子。更具体地说，本发明涉及提供二价和多价VNAR。本发明的发明人最近已表明，与本领域的一般理解相反，事实上可形成VNAR的二聚、三聚和双特异性融合物。
最近(Muller M.R.et al mAbs 2012.4(6):p.673-685；WO2013/167883)公开了一种双特异性VNAR，它包含VNAR，其中一个结构域对人血清白蛋白(HSA)有特异性，它允许二价结构在血清中结合HSA，因此延长了配偶体结构域的生物学半衰期。在结合HAS的VNAR的N-端和C-端的VNAR的融合，证明HSA结合结构域的功能保留。最近，WO/2014/173975公开了VNARS，其可结合ICOSL(CD275)，一种在抗原呈递细胞(APC)如B细胞、活化的单核细胞和树突细胞上组成型表达的细胞表面抗原，并且是B7家族成员ICOS(CD278)的配体(Yoshinaga.S.,K.,et al.,Int.Immunol.,2000.12(10):p.1439-1447)。这些ICOSL VNARs中的某些可以与结合HSA的VNARs连接，并且显示两个结构域都保留功能。可以制备各自识别不同抗原(hICOSL、mICOSL和HSA)的三聚体形式，并且显示每个结构域保留了功能。
然而，之前没有揭示可形成识别相同抗原上相同或不同表位的双或多特异性VNAR。另外，出乎意料地，这种形式的双特异性分子显示出比由组成单体、或单体形式本身、或与识别HSA的VNAR结合的单体形成的二价分子更优的性质。
本发明涉及具有结合成多价或多特异性实体的能力的特异性VNAR结构域序列，在该多结构域实体中，每个结构域保留结合功能。
因此，在本发明的第一方面，提供了包含两个或多个VNAR结构域的多结构域特异性结合分子，所述VNAR结构域与一种或多种特异性抗原的相同或不同表位结合。
在某些优选的实施方式中，本发明第一方面的多结构域特异性结合分子中的VNAR结合特定抗原上的相同表位。
在进一步优选的实施方式中，多结构域特异性结合分子的VNAR结合特定抗原上的不同表位。根据这些实施方式的多结构域特异性结合分子可以被称为双互补位分子(bi-paratopic molecules)，如本文进一步描述的。
在一个实施方式中，特异性VNAR结合结构域序列被组合成多价或多特异性实体，其中，每个结构域保留结合功能，其中结合结构域识别单一抗原上的不同表位。
本发明的一个优选实施方式是包含两个(或多个)不同VNAR结构域的双特异性或多特异性结合分子，其中结合特异性是针对单一特异性抗原上的不同表位，而且其中所得实体与单个VNAR结合结构域相比显示改进的特性。与单体VNARs相比，改进的性质的实例包括增加的激动或拮抗作用。
优选地，本发明的多结构域特异性结合分子的VNAR结构域被间隔序列隔开。更优选地，间隔序列具有在结合分子中显示的独立功能性。在一个实施方式中，间隔序列是VNAR结构域或其功能片段。在一个具体的实例中，间隔区可以是VNAR或其功能片段，其结合血清白蛋白，包括人血清白蛋白或ICOSL。在某些实施方式中，间隔序列包含SEQ ID NO：67、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87或88的任一氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的功能片段。在另一个实施方式中，间隔序列可以是免疫球蛋白的Fc部分，包括但不限于人免疫球蛋白Fc部分。改进的性质可部分或完全来自于间隔区的性质，例如通过在空间中被动分离VNAR结构域，或通过间隔区的固有性质，如可导致所得实体的更长体内半衰期的血清白蛋白结合，或通过识别第二治疗性自身免疫靶，如ICOSL，或通过引入与免疫系统或补体的细胞接合的能力，在免疫球蛋白Fc部分的情况下。
包含由间隔序列分开的两个或多个VNAR结构域的本发明的多结构域特异性结合分子的实施方式在本文中可被称为Quad-X形式(Quad-X format)。
在其它优选的实施方式中，多结构域特异性结合分子还可包含一个或多个非VNAR结构域。一个或多个非VNAR结构域可以被设置在相对于VNAR结构域的任何位置。典型地，在优选的实施方式中，非VNAR结构域将是VNAR结构域的C-端或N-端。
本发明的包含两个或多个VNAR结构域和非VNAR结构域的多结构域特异性结合分子的实施方式在本文中可被称为Quad-Y形式(Quad-Y format)，其中非VNAR结构域是VNAR结构域的C-端或N-端。
示例性的非VNAR结构域包括但不限于TNF R1和免疫球蛋白Fc。
特异性抗原可以来自包括细胞因子、生长因子、酶、细胞表面相关分子、细胞表面膜组分、细胞内分子、细胞外基质组分、基质抗原、血清蛋白、骨骼抗原、微生物抗原或来自正常免疫豁免位置(immune-privileged location)的抗原的组。
本发明的另一方面是识别细胞因子的VNAR结合结构域的特异性组合。
本发明还提供识别人TNF并与表位结合的特异性结构域，所述表位不同于目前用于治疗疾病的所有其它充分表征的抗TNF抗体和VHH结合区。
因此，在第二个方面，本发明提供了包含下列CDR和超变区(HV)或具有至少60％序列同一性的其功能变体的TNF-α特异性VNAR结合结构域：
CDR1：HCATSS(SEQ ID NO.68)或NCGLSS(SEQ ID NO.69)或NCALSS(SEQ ID NO.70)
HV2：TNEESISKG(SEQ ID NO.71)
HV4：SGSKS(SEQ ID NO.72)或EGSKS(SEQ ID NO.73)
CDR3：ECQYGLAEYDV(SEQ ID NO.1)或SWWTQNWRCSNSDV(SEQ ID NO.6)或YIPCIDELVYMISGGTSGPIHDV(SEQ ID NO.11)。
在特别优选的实施方式中，TNF-α特异性VNAR结合结构域包含SEQ ID 2、7或12的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
在优选的实施方式中，本发明的TNF-α特异性VNAR结构域在一个或多个氨基酸序列位置被修饰，以通过例如人源化、去免疫(deimmunization)或类似技术降低体内免疫原性的可能性，同时保留对特定抗原上特定表位的功能性结合活性。
本发明的一个实施方式是将VNAR结合结构域特异性地组合到所得的多结构域结合分子中，该多结构域结合分子识别TNFα，并且在本发明概述的形式中，其提供了优于单个结合结构域的改进的功能特性。已知可以产生声称识别TNFα的VNAR(Camacho-Villegas T,et al MAbs.2013.5(1):P.80-85；Bojalil R,et al BMC Immunol.2013.14:17；WO2011/056056；US20110129473；US20140044716)。然而，这些VNAR还没有连接形成二聚体或双特异性形式。此外，这些单体形式的结构域的效力比本文所述的单分子抗TNF VNAR结构域低70-200倍。
因此，本发明第二方面的TNF-α特异性VNAR结合结构域可以用作第一方面的多结构域特异性结合分子中的一个或两个VNAR结构域。因此，在优选的实施方式中，提供第一方面的多结构域特异性结合分子，其中一个或多个VNAR结构域具有选自SEQ ID NO.2、7或12的氨基酸序列，或序列同一性至少为60％的其功能变体。在其它优选的实施方式中，提供第一方面的多结构域特异性结合分子，其中两个或多个VNAR结构域具有选自SEQ ID NO.2、7或12的氨基酸序列，或序列同一性至少为60％的其功能变体。
本发明第一方面的其它优选实施方式包括第一方面的多结构域特异性结合分子，其包含一个或多个具有选自SEQ ID NO.65或66的氨基酸序列或具有至少60％序列同一性的其功能变体的VNAR结构域。第一方面的其它实施方式包括第一方面的多结构域特异性结合分子，其包含两个或多个具有选自SEQ ID NO.65或66的氨基酸序列或具有至少60％序列同一性的其功能变体的VNAR结构域。
本发明第一方面中使用的VNAR结构域可以在一个或多个氨基酸序列位置上进行修饰，以降低体内免疫原性的可能性，例如通过人源化、去免疫或类似技术，同时保留对特定抗原上特定表位的功能性结合活性。
本发明还提供了分离的核酸，其包含编码根据本文所述的任何方面或实施方式的结合分子的多核苷酸序列。此外，本发明提供了用于制备根据本发明的结合分子的方法，包括在使得所述宿主细胞产生所述结合分子的条件下培养或维持包含所述多核苷酸的宿主细胞，任选地还包括分离所述结合分子。
根据本发明的另一方面，提供了本发明前述方面的特异性抗原结合分子和/或多结构域特异性结合分子的药物组合物。
本发明的药物组合物可以包含任何合适的和药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或缓冲溶液。组合物可以包含另外的药物活性剂。这样的载体可以包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。
这样的组合物可以包含如所示的另外的药物活性剂。所述其它药剂可以是治疗化合物，例如抗炎药、细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗生素。这些另外的药剂可以以适于对有此需要的患者给药的形式存在，并且这些给药可以是同时、分开或按顺序的。所述组分可以以试剂盒的形式制备，其可以包括适当的说明书。
药物组合物可以以任何有效、方便的方式给药，以有效治疗患者的疾病，包括例如通过口服、局部、静脉内、肌内、鼻内或皮内途径给药等。在治疗或预防中，活性剂可以作为可注射组合物，例如作为无菌水分散体，优选等渗的无菌水分散体，施用给个体。
对于对哺乳动物，特别是人的给药，预期活性剂的日剂量为0.01mg/kg体重，通常为约1mg/kg、2mg/kg、10mg/kg或至多100mg/kg。在任何情况下，医师将根据包括个体的年龄、体重、性别和反应的因素确定最适合于个体的实际剂量。上述剂量是一般情况的示例。当然，可能存在需要更高或更低剂量的情况，并且这些均在本发明的范围内。本发明还提供了试剂盒，其包含本文定义的药物组合物以及使用说明书。
根据本发明的另一方面，提供了前述方面的药物组合物在药物中的用途。这样的用途包括通过施用治疗有效剂量的如上定义的本发明的药物组合物来治疗与本发明的结合结构域的靶抗原和其配体配偶体(ligand partner)之间的相互作用相关的疾病的方法。组合物可包含至少一种本发明的特异性抗原结合分子(VNAR结构域)或多结构域特异性结合分子，或这些分子的组合和/或其人源化变体。
根据本发明的这个方面，提供了用于制备药物的组合物，所述药物用于治疗与本发明的结合结构域的靶抗原和其配体配偶体之间的相互作用相关的疾病。
这样的组合物可以包含如所示的另外的药物活性剂。所述另外的药剂可以是治疗化合物，例如抗炎药、细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗生素。这些另外的药剂可以以适于对有此需要的患者给药的形式存在，并且这些给药可以是同时、分开或按顺序的。所述组分可以以试剂盒的形式制备，其可以包括适当的说明书。
根据本发明，提供了用于药物的本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子。因此，本发明的这一方面延伸至本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域结合分子在制备用于治疗有需要的患者的疾病的药物中的用途。本发明的抗原特异性抗原结合分子也可用于制备包含如上文关于本发明的药物组合物所定义的此类特异性结合分子或多结构域结合分子的融合蛋白。这些用途还包括治疗需要治疗的患者的疾病的方法，包括向患者施用治疗有效剂量的如本文定义的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域结合分子。
如本文所用，术语"治疗"包括任何可有益于人或非人类动物的方案。在兽医学中"非人类动物"的治疗扩展至家畜(包括马和伴侣动物(例如猫和犬))和农场/农业动物(包括绵羊、山羊、猪、牛和马家族的成员)的治疗。治疗可以是针对任何现有病症或障碍的治疗性治疗，或者可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可以是遗传性或获得性疾病的治疗。治疗可以是急性或慢性病症的治疗。治疗可以是与炎症和/或癌症相关的病症/障碍的治疗。本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子可用于治疗疾病，包括但不限于骨关节炎、硬皮病、肾病、类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化、动脉粥样硬化或任何炎性疾病。
在另一方面，本发明提供了治疗由TNFα介导的病症的方法，该方法包括施用治疗有效量的特异性结合TNFα的本发明组合物。
在另一方面，本发明提供了治疗至少一种ICOSL介导的疾病的方法，包括施用有效量的特异性结合ICOSL的本发明组合物。
本发明的另一方面是识别细胞表面分子的VNAR结合结构域的特异性组合。在某些实施方式中，多结构域结合分子的VNAR结合不同类别的配体或靶标。本发明考虑的一个非限制性实例是本发明第一方面的多结构域特异性结合分子，其中至少一个VNAR结构域结合与自身免疫病相关的靶标，而至少一个VNAR结构域结合与炎性反应相关的靶标。
本发明特别优选的多结构域特异性抗原结合分子包括TNF特异性VNAR和ICOSL特异性VNAR。优选地，TNF特异性VNAR是本发明第二方面的VNAR。
本发明的一个实施方式是将VNAR结合结构域特异性地组合到所得的多结构域结合分子中，所述多结构域结合分子识别ICOSL，并且在本发明概述的形式中，其提供了优于单个结合结构域的改进的功能特性。
附图说明
在本申请中，参考了多个附图，其中：
图1：使用抗护士鲨IgNAR杂交瘤抗体对免疫的护士鲨血浆的抗hTNF-αIgNAR滴定结果
免疫动物血清的ELISA滴定，免疫前和放血后5
结合ELISA测量免疫的护士鲨中抗rhTNF-αIgNAR滴度。用GA8单克隆抗护士IgNAR抗体进行检测，并使用抗小鼠IgG-HRP偶联抗体作为第二抗体。
图2：L929细胞中，hTNF-α诱导的细胞毒性的中和
在该测定中，测定了抗TNF结构域(D1和C4)和对照抗人血清白蛋白结构域(BA11)在细胞生物测定中中和hTNF-α活性的能力。D1和C4结构域都显示了相似水平的浓度依赖性中和(计算值见表2)。BA11对照不识别hTNF，因此即使在最高浓度也没有观察到中和。hTNF-α+放线菌素-D作为对照，在没有中和结构域时显示经典的细胞毒性。
图3：L929纤维肉瘤细胞系中rhTNFα的体外中和试验。
A.1×LD80[0.3ng/ml rhTNFα]的中和，n＝3，每个实验一式两份，±SEM；
B.10×LD80[3ng/ml rhTNFα]的中和，n＝2，每个实验一式两份，±SD。
TNF30-Fc是从免疫骆驼科动物分离的抗rhTNFαVHH纳米抗体与IgG Fc融合的融合物(Coppieters et al.,Arthritis and Rheumatism,2006,54(6):1856-1866；Riechmannet al.,J.Immunol.Methods,1999.231:25-38)
Alb8-Fc是与IgG Fc融合的识别HSA的VHH结构域。
2V是阴性对照VNAR，它不识别已知的靶。2V-Fc是2V与IgG Fc的融合物。
只有对hTNF(D1、C4和TNF-30)特异的那些结合物能够证明游离hTNF的活性的中和作用是浓度依赖性的。通过从单体向二价Fc形式的转化增强了中和效力。D1-Fc和C4-Fc一起的组合递送优于单独的D1-Fc或单独的C4-Fc的中和效力。(所有计算的中和值见表2)。两种对照Alb-8和2V即使在这种二价Fc形式中也不能中和。
图4：二价和双特异性构建体形式的图示
图5：二聚体VNAR与TNF-30VHH对照(TNF30-TNF30)的ELISA结合。
所有测试的VNAR结构域D1、C4、B4或者与它们自身配对(例如D1-D1、C4-C4等)，或者在两个可能的方向(例如C4-D1、B4-D1)上彼此配对(例如D1-C4、D1-B4)。ELISA分级将D1-D1二聚体对作为最好的(达到饱和信号所需的VNAR最低浓度)且B4-C4和B4-B4作为在这种ELSA形式中表现最差的。许多VNAR配对优于VHH二聚体对照。
图6：L929通过VNAR二聚体对测量TNF中和作用的分析
使用适当的生物测定评估抗TNFαVNAR二聚体对D1-D1、D1-C4、D1-B4和阳性对照抗TNF VHH二聚体(TNF30-TNF30)的中和能力。在该分析形式中显示最有效的中和活性的结构域对是VNAR对D1-C4(中和的计算值见表2)。hTNFα+放线菌素-D处理的无任何中和结构域的细胞提供了合适的经典的未抑制的细胞毒性对照。
图7：在L929细胞中使用三聚抗-hTNF-αVNARs中和hTNF-α诱导的细胞毒性
通过在两个二聚体构建体的中间掺入抗HSA人源化VNAR(soloMERTM BA11)将前导(lead)抗hTNFαVNAR二聚体(D1-D1和D1-C4)重组为多价三聚体构建体，以分别获得D1-BA11-D1和D1-BA11-C4。在经典L929测定中评估了这些多价三聚体构建体和Humira(阿达木单抗，Adalimumab)和TNF30-BA11-TNF30中和hTNFα的能力。D1-BA11-C4构建体显示与阿达木单抗相当的中和效力，和比VHH三聚体构建体以及抗hTNFα二聚体(D1-C4和D1-D1)VNARs显著改善的效力(计算的ND50值参见表2)。
图8：Caco2在极化的Caco2细胞中的上皮渗透性
Caco-2细胞经处理后与10ng/mL TNFα、LPS和IFNγ+/-抗TNFα蛋白一起孵育18小时。将5μl的10mg/ml FITC-葡聚糖[3000-5000kDa]加入顶室，24小时后测量面向基底外侧室的跨膜转运。
用VNAR/VHH单体和VNAR对照蛋白处理是在50nM浓度下，而用VNAR二聚体(2C和2D)和阿达木单抗处理的是25nM。
BA11和2V是非TNFα结合VNAR对照，而B4是非中和的TNF结合VNAR。
使用这种经典测定法评价抗hTNFαVNAR构建体(单体D1、C4、B4；二聚体D1-D1、D1-C4；三聚体D1-BA11-D1、D1-BA11-C4)、VHH构建体TNF30、TNF30-BA11-TNF30和阿达木单抗在细胞因子处理的Caco-2细胞中预防肠屏障功能障碍的能力。VNAR结构域D1-C4和D1-BA11-C4显示出与阿达木单抗相当的效力。阴性对照BA11和2V不能预防肠屏障功能障碍。
图9：极化的Caco-2细胞中的上皮电阻
处理分化的Caco-2细胞，并与10ng/mL TNFα和IFNγ+/-抗TNFα一起孵育24小时。细胞因子处理对跨上皮电阻的影响使用伏特-欧姆计进行测定。将电阻标准化为处理下的表面积(欧姆·cm2)。
用VNAR/VHH单体和VNAR对照蛋白处理是在50nM浓度下，而用VNAR二聚体(2C和2D)和阿达木单抗处理的是25nM。
BA11和2V是非TNFα结合VNAR对照，而B4是非中和的TNF结合VNAR
[n＝1±SD，每次处理重复≥8次，使用GraphPad Prism 5的单向ANOVA和Dunnett’s Post-Hoc检验)
研究了抗hTNFαVNAR结构域恢复细胞因子处理的Caco-2细胞中的上皮电阻的效力，并与VHH TNF30和临床可用的阿达木单抗在等摩尔剂量范围的效力进行了比较。抗hTNFα二聚体和三聚体VNAR结构域表现出以与阿达木单抗观察到的效果相当的方式恢复上皮电阻的显著能力。阴性对照BA11和2V没有恢复上皮电阻。
图10：ICOSL VNAR-Fc融合物的形式
图11：ICOSL ELISA结合数据
不同的抗ICOSL Quad-XTM构建体与人和小鼠ICOS配体的结合ELISA。
图12：本发明的结合TNF R1结构域、ICOSL VNAR和人IgG Fc的多价和多特异性VNAR的形式。
图13：结合TNF R1结构域、ICOSL VNAR和人IgG Fc的多价和多特异性VNAR的功效数据，其提供了另外的改进的功能特征。
VNAR-TNFR1 Fc双功能构建体在基于细胞的中和试验中显示出特异性和有效的功效
形式1：抗TNFα scFv
形式2：抗mCOSL VNAR(CC3)
形式3：抗hICOSL scFv
形式4：抗hICOSL VNAR(2D4)
图14：VNAR T43角鲨(horn shark)克隆与VNAR护士鲨D1和C4之间的hTNF-α结合特征图。
来自角鲨的VNAR T43与VNAR D1和C4的结合ELISA在1μg/ml hTNFα包被的孔中进行。在所用的实验浓度下不能测定T43克隆的结合特征。
图15：VNAR T43角鲨克隆和VNAR护士鲨D1和C4在L929细胞中hTNF-α的中和效力
比较抗hTNFαVNAR单体D1和C4与等摩尔量的角鲨T43 VNAR的中和效力。T43结构域没有表现出任何剂量依赖性中和效应，并且具有与用hTNFα和放线菌素-D处理的未保护细胞相似的特征(参见表2)
图16：成功人源化的抗hTNF-αD1(也称为D1 soloMERTM)的结合特征
许多逐渐改善的VNAR D1结构域构架人源化形式的结合特征。D1-v1，D1-v2，D1-v3和D1-v4代表不同程度的人源化，而VNAR D1(wt)是亲本VNAR D1结构域。用DPK-9的氨基酸残基置换护士鲨构架氨基酸残基，人种系κ不破坏人源化D1形式识别hTNFα的能力。
图17：D1 soloMERTM在L929细胞中的中和效力
在人源化VNAR D1变体中评估了在L929细胞中中和hTNFα介导的细胞毒性的能力。soloMER D1-v2保留了对hTNFα诱导的细胞毒性的中和效力。
图18：引入人IgG Fc的本发明得多价和多特异性VNAR的形式
图19：多价/多特异性VNAR-Fc构建体的hTNF-α结合特征图
证明了双互补位/双特异性D1-Fc-C4(Quad-XTM)vs双互补位VNAR Fc构建体D1-Fc和C4-Fc的结合特征图。抗hTNF-αVNAR Quad-XTM D1-Fc-C4保留了与hTNFα的结合，其结合特性与D1-Fc和C4-Fc相当，并略有提高。
图20：L929中多价/多特异性VNAR-Fc构建体的hTNF-α中和活性评价结果
在hTNFα介导的细胞毒性的基于L929细胞的测定中评估VNAR Quad-XTM D1-Fc-C4vs Humira(阿达木单抗)的中和效力。VNAR Quad-XTM D1-Fc-C4保留了中和能力，并且显示出比Humira更优异的中和活性(ND50值见表2)。
图21：本发明的引入抗小鼠TNF-αVNAR；以及抗HSA SoloMERTM BA11或ICOSL VNAR结构域、A5或小鼠IgG2A Fc的多价、双互补位VNAR的形式。
图22A：双互补位抗小鼠TNF-αVNAR构建体的小鼠TNF-α结合特征。
将VNAR抗小鼠TNFαS17结构域重组为加入了抗ICOS配体VNAR A5或抗HSA人源化VNAR soloMERTM BA11的多价/多特异性三聚体。两种构建体都保留了对小鼠TNF-α的识别。
图22B：双互补位抗小鼠TNF-αVNAR构建体的HSA结合特征图。
将VNAR抗小鼠TNFαS17结构域重组为加入了抗ICOS配体VNAR A5或抗HSA人源化VNAR soloMERTM BA11的多价/多特异性三聚体。S17-BA11-S17保留了与HSA的结合，阴性对照S17-A5-S17不识别HSA。
图22C：双互补位的二聚/三聚抗ICOSL VNAR构建体的小鼠ICOS配体结合特征图。
重组的S17-A5-S17和A5-A5同二聚体与小鼠ICOS配体的结合特征图证明，在中间引入抗小鼠ICOS配体VNAR A5作为S17-A5-S17的重组三聚体构建体保持与小鼠ICOS配体的结合。
图23A&B：分别显示了双互补位和IgG2A Fc融合抗小鼠TNF-αVNAR S17构建体在L929特征图中的小鼠TNF-α中和结果。
在小鼠TNFα介导的细胞毒性L929测定中评价抗小鼠TNFα构建体(S17-A5-S17，S17-BA11-S17，S17-Fc)的中和效力。三聚体S17和双互补位S17-Fc构建体均证明在L929细胞中具有针对小鼠TNFα介导的细胞毒性的中和活性。在这三个构建体中，S17-A5-S17显示出最高的效力。BA11是分析中的阴性对照，hTNFα+放线菌素D也代表了在没有抗小鼠TNFα抑制剂/中和剂时观察到的经典细胞毒性作用。单独的细胞表示健康的未处理细胞。
图24：基于CHO的huICOS/重组小鼠ICOS配体-Fc(ICOSL-Fc)中和(封闭)测定-基于ELISA的。
在这种封闭测定中，多价VNAR构建体显示了阻断小鼠ICOSL-Fc与CHO细胞上的同源结合配偶体ICOS相互作用的显着能力。这导致在基于细胞的ELISA形式中使用抗人Fc-HRP抗体对小鼠ICOSL-Fc的Fc部分的检测减少/受损。A5-A5二聚体是最有效的阻断剂，接着是S17-A5-S17，而S17单体在该测定中是阴性对照。
图25：抗hTNF-αVNAR vs VHH TNF30和
Figure BDA0002426620980000171
之间的结合交叉反应性差异。
该图显示了VNAR D1-C4与VHH TNF30和Humira相比的结合交叉反应性特征。VNARD1-C4只与人、犬和食蟹猴TNFα结合；VHH TNF30包括与人、犬和食蟹猴TNFα的结合，与猪TNFα以及人TNFβ的结合较弱。Humira结合人、犬、食蟹猴和小鼠TNFα。还参见表3A和3B中这些抗TNFα结构域的详细结合和中和特征。
图26：抗hTNF-αVNAR异二聚体vs VHH TNF30二聚体的BIAcoreTM T200表位归类分析(binning analysis)。
这种表位归类数据证明VNAR D1-C4识别并与hTNFα分子上与VHH TNF30结构域识别的那些表位不同的表位相互作用。该测定包括用第一结合结构域(在这种情况下，VNARD1-C4使用饱和浓度，测定的饱和浓度是其KD值的100倍)达到可利用的表位饱合，然后利用第二结合结构域(TNF30)。
图27：用Quad-XTM和Quad-YTM构建体以ELISA形式与hTNF-α的功能性结合。
图28：L929中多价/多特异性VNAR-Fc构建体的hTNF-α中和活性的评价结果
在基于L929细胞的hTNFα介导的细胞毒性的测定中评估VNAR Quad-XTM D1-Fc-C4、Quad-YTM D1-C4-Fc和C4-D1-Fc vs Humira(阿达木单抗)的中和效力。VNAR Quad-YTM构建体保留了中和能力，D1-C4-Fc构建体在0.3ng/ml或3ng/ml hTNF-α存在下，显示出与Quad-XTM相当的中和活性(ND50值见表2)。
图29：D1-Fc-C4(Quad-XTM)和
Figure BDA0002426620980000181
对实验性Tg197小鼠的体重增加的影响。在研究结束时(10周龄)，从第3周开始每周治疗两次的所有组的平均体重如下：G1-载体＝19.3±1.4g，
Figure BDA0002426620980000182
10mg/kg＝24.4±1.5g，G2-D1-Fc-C4 3mg/kg＝24.1±1.5g，G5-D1-Fc-C4 10mg/kg＝24.1±1.7g，G3-D1-Fc-D4 30mg/kg＝23.4±1.4g。对照小鼠在第3周具有9.8±0.2g的平均体重。误差线表示平均值的标准误差。
图30：D1-Fc-C4(Quad-XTM)和
Figure BDA0002426620980000183
对实验性Tg197小鼠的体内关节炎评分的影响。在研究结束时(10周龄)，从第3周开始每周两次治疗的所有组的平均体内疾病严重性评分如下：G1-载体＝1.36±0.07，
Figure BDA0002426620980000184
10mg/kg＝0.25±0.05，G2-D1-Fc-C43mg/kg＝0.17±0.04，G5-D1-Fc-C4 10mg/kg＝0.17±0.04，和G3-D1-Fc-D4 30mg/kg＝0.17±0.04。对照小鼠在第3周具有体内关节炎评分＝0.13±0.05。误差线指示平均值的标准误差。
图31：D1-Fc-C4(Quad-XTM)和
Figure BDA0002426620980000185
对实验性Tg197小鼠的关节炎组织病理学评分的影响。在研究结束时(10周龄)，从第3周开始每周两次治疗的所有组的平均关节炎组织病理学评分如下：G1-载体＝2.94±0.12，
Figure BDA0002426620980000186
10mg/kg＝0.42±0.07，G2-D1-Fc-C4 3mg/kg＝0.41±0.03，G5-D1-Fc-C4 10mg/kg＝0.50±0.05，G3-D1-Fc-D4 30mg/kg＝0.42±0.07。在第3周，对照小鼠具有组织病理学评分＝1.22±0.10。误差线指示平均值的标准误差。
图32：D1-Fc-C4(Quad-XTM)和
Figure BDA0002426620980000191
对体内关节炎评分的影响与实验性Tg197小鼠的踝组织病理学评分的比较。在研究结束时(10周龄)，从第3周开始每周两次治疗的所有组的平均疾病严重程度评分如下：G1-载体＝2.94±0.12(HS)和1.36±0.07(AS)，
Figure BDA0002426620980000192
10mg/kg＝0.42±0.07(HS)和0.25±0.05(AS)，G2-D1-Fc-C4 3mg/kg＝0.41±0.03(HS)和0.17±0.04(AS)，G5-D1-Fc-C4 10mg/kg＝0.50±0.05(HS)和0.17±0.04(AS)，G3-D1-Fc-D4 30mg/kg＝0.42±0.07(HS)和0.17±0.04(AS)。误差线指示平均值的标准误差。
图33：在Tg197关节炎模型中，0.5、1和3mg/kg的D1-Fc-C4(Quad-XTM)和30mg/kg的D1-BA11-C4 vs 1mg/kg和3mg/kg的
Figure BDA0002426620980000193
在改善关节炎病理方面的功效评价结果。
图34：0.5、1和3mg/kg的D1-Fc-C4(Quad-XTM)和30mg/kg的D1-BA11-C4vs 1mg/kg和3mg/kg的
Figure BDA0002426620980000194
对关节炎Tg197模型的平均组重量的影响。
图35：不同给药方案对体内关节炎和组织学评分的影响。这作为单独的实验进行，但是使用与图29-32所述的那些相同的方法。
图36：用光间受体视黄醇类结合蛋白(IRBP)免疫十二只大鼠，以诱导实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)。在第8天、第10天和第12天，通过腹膜内注射20mg/kg(啮齿类动物蛋白特异性)抗TNFαVNAR-Fc对四只动物进行治疗；在相同的天数内在腹膜内用地塞米松治疗四只动物，并且用相同的载体处理四只动物。在第0、7、10、12、13和14天进行大鼠眼睛的前段和后段的光学相干断层扫描(OCT)。为了使结果的任何科学偏见最小化，由"实验盲化观察者"使用验证的评分系统对OCT图像进行总炎症评分。该实验还包括载体对照和使用标准剂量的地塞米松甾体的阳性对照。
图37A&B：SoloMER VNAR二聚物构建体在L929细胞中的hTNF-α中和活性评价结果。
图38：L929细胞中S17-Fc vs S17-Fc-S17(Quad-XTM)构建体的hTNF-α中和活性评价结果。S17构建体中使用的Fc来自小鼠IgG2a。
图39A、B和C：S17-Quad-XTM和D1-C4 Quad-XTM对人和小鼠TNF-α的交叉反应性结合特征图。
本文提供了如下的多种核苷酸和氨基酸序列：
SEQ ID NO 1
TNF VNAR D1 CDR3氨基酸序列 ECQYGLAEYDV
SEQ ID NO 2
TNF VNAR D1氨基酸序列(CDR1和CDR3以单下划线标示)
Figure BDA0002426620980000201
SEQ ID NO 3
具有HIS和MYC标签(双下划线标示)的TNF VNAR D1氨基酸序列(CDR1和CDR3单下划线标示)
Figure BDA0002426620980000202
SEQ ID NO 4
编码TNF VNAR D1的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000203
SEQ ID NO 5
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR D1的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000211
SEQ ID NO 6
TNF VNAR C4 CDR3氨基酸序列 SWWTQNWRCSNSDV
SEQ ID NO 7
TNF VNAR C4氨基酸序列(CDR1和CDR3以下划线标示)
Figure BDA0002426620980000212
SEQ ID NO 8
具有HIS和MYC标签(双下划线标示)的TNF VNAR C4氨基酸序列(CDR1和CDR3单下划线标示)
Figure BDA0002426620980000213
SEQ ID NO 9
编码TNF VNAR C4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000214
SEQ ID NO 10
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR D1的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000215
SEQ ID NO 11
TNF VNAR B4 CDR3氨基酸序列 YIPCIDELVYMISGGTSGPIHDV
SEQ ID NO 12
TNF VNAR B4氨基酸序列(CDR1和CDR3以单下划线标示)
Figure BDA0002426620980000221
SEQ ID NO 13
具有HIS和MYC标签(双下划线标示)的TNF VNAR B4氨基酸序列(CDR1和CDR3以单下划线标示)
Figure BDA0002426620980000222
SEQ ID NO 14
编码TNF VNAR B4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000223
SEQ ID NO 20
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR B4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000231
SEQ ID NO 21
具有HIS和MYC标签(双下划线标示)的TNF VNAR二聚体D1-D1的氨基酸序列(CDR1和CDR3以单下划线标示，以斜体显示接头)
Figure BDA0002426620980000232
SEQ ID NO 22
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR二聚体D1-D1的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000233
SEQ ID NO 23
具有HIS和MYC标签(双下划线标示)的TNF VNAR二聚体C4-C4的氨基酸序列(CDR1和CDR3以单下划线标示，以斜体显示接头)
Figure BDA0002426620980000234
SEQ ID NO 24
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR二聚体C4-C4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000241
SEQ ID NO 25
具有HIS和MYC标签(双下划线标示)的TNF VNAR二聚体B4-B4的氨基酸序列(CDR1和CDR3以单下划线标示，以斜体显示接头)
Figure BDA0002426620980000242
SEQ ID NO 26
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR二聚体B4-B4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000243
SEQ ID NO 27
具有HIS和MYC标签(双下划线标示)的TNF VNAR二聚体D1-C4的氨基酸序列(CDR1和CDR3以单下划线标示，以斜体显示接头)
Figure BDA0002426620980000251
SEQ ID NO 28
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR二聚体D1-C4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000252
SEQ ID NO 29
具有HIS和MYC标签(双下划线标示)的TNF VNAR二聚体D1-B4的氨基酸序列(CDR1和CDR3以单下划线标示，以斜体显示接头)
Figure BDA0002426620980000253
SEQ ID NO 30
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR二聚体D1-B4核苷酸序列的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000254
SEQ ID NO 31
TNF VNAR二聚体B4-D1氨基酸序列(HIS和MYC标签-双下划线标示，CDR1和CDR3以单下划线标示，接头以斜体显示)
Figure BDA0002426620980000261
SEQ ID NO 32
TNF VNAR二聚体B4-D1核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000262
SEQ ID NO 33
TNF VNAR二聚体C4-B4氨基酸序列(HIS和MYC标签-双下划线标示，CDR1和CDR3以单下划线标示，接头以斜体显示)
Figure BDA0002426620980000263
SEQ ID NO 34
TNF VNAR二聚体C4-B4核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000271
SEQ ID NO 35
TNF VNAR二聚体B4-C4氨基酸序列(HIS和MYC标签-双下划线标示，CDR1和CDR3以单下划线标示，接头以斜体显示)
Figure BDA0002426620980000272
SEQ ID NO 36
TNF VNAR二聚体B4-C4核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000273
SEQ ID NO 37
具有HIS和MYC标签的TNF VNAR D1-BA11-C4的氨基酸序列(His和Myc标签-双下划线标示，CDR1和CDR3以单下划线标示，以斜体显示的接头)
Figure BDA0002426620980000281
SEQ ID NO 38
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR D1-BA11-C4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000282
SEQ ID NO 39
具有HIS和MYC标签的TNF VNAR D1-BA11-D1的氨基酸序列(His和Myc标签-双下划线标示，CDR1和CDR3以单下划线标示，以斜体显示的接头)
Figure BDA0002426620980000283
SEQ ID NO 40
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR D1-BA11-D1的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000291
SEQ ID NO 41
具有HIS和MYC标签的TNF VNAR D1-BA11-B4的氨基酸序列(His和Myc标签-双下划线标示，CDR1和CDR3以单下划线标示，以斜体显示的接头)
Figure BDA0002426620980000292
SEQ ID NO 42
编码具有HIS和MYC标签的TNF VNAR D1-BA11-B4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000301
SEQ ID NO 43
ICOS VNAR 2D4-Fc-2D4氨基酸序列(接头以斜体显示，Fc部分以下划线标示)
Figure BDA0002426620980000302
SEQ ID NO 44
ICOS VNAR 2D4-Fc-2D4核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000311
SEQ ID NO 45
ICOS VNAR 2D4-Fc-CC3氨基酸序列(接头以斜体显示，Fc部分以下划线标示)
Figure BDA0002426620980000312
SEQ ID NO 46
ICOS VNAR 2D4-Fc-CC3核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000313
Figure BDA0002426620980000321
SEQ ID NO 47
ICOS VNAR CC3-Fc-2D4氨基酸序列(接头以斜体显示，Fc部分以下划线标示)
Figure BDA0002426620980000322
SEQ ID NO 48
ICOS VNAR CC3-Fc-2D4核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000331
SEQ ID NO 49
ICOS VNAR CC3-Fc-CC3氨基酸序列(接头以斜体显示，Fc部分以下划线标示)
Figure BDA0002426620980000332
SEQ ID NO 50
ICOS VNAR CC3-Fc-CC3核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000341
SEQ ID NO 51
具有HIS标签的SoloMERTM VNAR D1-v1氨基酸序列
Figure BDA0002426620980000342
SEQ ID NO 52
编码具有HIS标签的SoloMERTM VNAR D1-v1的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000343
SEQ ID NO 53
具有HIS标签的SoloMERTM VNAR D1-v2氨基酸序列
Figure BDA0002426620980000344
SEQ ID NO 54
编码具有HIS标签的SoloMERTM VNAR D1-v2的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000351
SEQ ID NO 55
具有HIS标签的SoloMERTM VNAR D1-v3氨基酸序列
Figure BDA0002426620980000352
SEQ ID NO 56
编码具有HIS标签的SoloMERTM VNAR D1-v3的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000353
SEQ ID NO 57
具有HIS标签的SoloMERTM VNAR D1-v4氨基酸序列
Figure BDA0002426620980000354
SEQ ID NO 58
编码具有HIS标签的SoloMERTM VNAR D1-v4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000355
SEQ ID NO 59
Quad-XTM D1-Fc-C4氨基酸序列(Fc部分下划线标示)
Figure BDA0002426620980000361
SEQ ID NO 60
编码Quad-XTM D1-Fc-C4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000362
SEQ ID NO 61
Quad-Y-D1C4TM D1-C4-Fc氨基酸序列(Fc部分下划线标示)
Figure BDA0002426620980000363
SEQ ID NO 62
编码Quad-Y-D1C4TM氨基酸序列的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000371
SEQ ID NO 63
Quad-Y-C4D1TM C4-D1-Fc氨基酸序列(Fc部分下划线标示)
Figure BDA0002426620980000372
SEQ ID NO 64
编码Quad-Y-C4D1TM氨基酸序列的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000381
SEQ ID NO 65-2D4
Figure BDA0002426620980000382
SEQ ID NO 66-CC3
Figure BDA0002426620980000383
SEQ ID NO 67-BA11
Figure BDA0002426620980000384
SEQ ID NO 68-CDR1
HCATSS
SEQ ID NO 69-CDR1
NCGLSS
SEQ ID NO 70-CDR1
NCALSS
SEQ ID NO 71-HV2
TNEESISKG
SEQ ID NO 72-HV4
SGSKS
SEQ ID NO 73-HV4
EGSKS
Figure BDA0002426620980000391
Figure BDA0002426620980000401
SEQ ID NO 89-具有(Gly4Ser)3氨基酸序列与HIS标签的TNF VNAR二聚体D1-C4(接头以斜体显示，且标签以双下划线标示)
Figure BDA0002426620980000402
SEQ ID NO 90-具有(Gly4Ser)3与HIS标签的TNF VNAR二聚体D1-C4的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000403
SEQ ID NO 91-TNF SoloMERTM二聚体D1v2-C4v1，具有(Gly4Ser)3氨基酸序列和 HIS标签(接头以斜体显示且标签用双下划线标示)
Figure BDA0002426620980000411
SEQ ID NO 92-具有(Gly4Ser)3和HIS标签的TNF SoloMERTM二聚体D1v2-C4v1的核 苷酸序列
Figure BDA0002426620980000412
SEQ ID NO 93-TNF SoloMERTM二聚体D1v2-C4v1，具有(Gly4Ser)5氨基酸序列和 HIS标签(接头以斜体显示且标签以双下划线标示)
Figure BDA0002426620980000413
SEQ ID NO 94-具有(Gly4Ser)5和HIS标签的TNF SoloMERTM二聚体D1v2-C4v1的核 苷酸序列
Figure BDA0002426620980000414
Figure BDA0002426620980000421
SEQ ID NO 95-具有(Gly4Ser)5的TNF S17-Quad-XTM氨基酸序列(Fc部分以下划线 标示)
Figure BDA0002426620980000422
SEQ ID NO 96-具有(Gly4Ser)5的TNF S17-Quad-XTM的核苷酸序列
Figure BDA0002426620980000423
具体实施方式
定义
氨基酸在本文中表示为单字母代码和/或三字母代码。
术语"亲和纯化"是指基于分子与化学或结合配偶体的特异性吸附或结合以形成组合或复合物的分子纯化，所述组合或复合物允许分子与杂质分离，同时保持与配偶体部分结合或吸附。
术语"互补决定区"或CDR(即CDR1和CDR3)指VNAR结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。每个VNAR典型地具有被鉴定为CDR1和CDR3的CDR区。每个互补决定区可以包含来自"互补决定区"的氨基酸残基和/或来自"高变环"(HV)的那些残基。在一些情况下，互补决定区可以包括来自CDR区和高变环的氨基酸。根据VNAR分子的普遍接受的命名法，CDR2区不存在。
"构架区"(FW)是除了CDR残基之外的那些VNAR残基。每个VNAR典型地有五个构架区，分别为FW1，FW2，FW3a，FW3b和FW4。VNAR结构域因此典型地在N-端到C-端方向具有结构FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4。
"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可互换使用(除非上下文另有说明)，并且这样的名称包括细胞或细胞系的所有后代。因此，例如，术语如"转化体"和"转化细胞"包括原代主细胞和从其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不是精确相同的。包括具有与在最初转化的细胞中筛选的相同功能或生物活性的突变后代。
"控制序列"当涉及表达时，是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点等。真核细胞使用控制序列，例如启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
术语"外壳蛋白"是指至少一部分存在于病毒颗粒表面的蛋白。从功能的角度来看，外壳蛋白是在宿主细胞中的病毒装配过程期间与病毒颗粒结合的任何蛋白质，并且保持与装配的病毒结合直到它感染另一个宿主细胞。
在特定分析中化学实体的"检测限"是该实体的最小浓度，其可以在该分析的背景水平之上被检测到。例如，在噬菌体ELISA中，对于展示特定抗原结合片段的特定噬菌体的"检测限"是特定噬菌体产生ELISA信号的噬菌体浓度高于不展示抗原结合片段的对照噬菌体产生的ELISA信号的噬菌体浓度。
"融合蛋白"和"融合多肽"是指具有两个共价连接在一起的部分的多肽，其中每个部分是具有不同性质的多肽。所述性质可以是生物学性质，例如体外或体内活性。该特性也可以是简单的化学或物理特性，例如与靶抗原的结合、反应的催化等。这两个部分可以通过单个肽键直接连接，或者通过含有一个或多个氨基酸残基的肽接头连接。通常，这两个部分和接头将彼此处于阅读框中。优选地，多肽的两个部分从异源或不同多肽获得。
术语"融合蛋白"在本文中一般指通过化学方法(包括氢键或盐桥)或通过蛋白质合成的肽键或两者连接在一起的一种或多种蛋白质。
"异源DNA"是导入宿主细胞的任何DNA。DNA可以来自各种来源，包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和这些的融合物或组合。DNA可以包括来自与宿主或受体细胞相同的细胞或细胞类型的DNA，或来自不同细胞类型的DNA，例如来自同种异体或异种来源的DNA。DNA可以任选地包括标记或选择基因，例如抗生素抗性基因、温度抗性基因等。
"高度多样化的位置(highly diverse position)"是指位于轻链和重链的可变区中的氨基酸的位置，当比较已知和/或天然存在的抗体或抗原结合片段的氨基酸序列时，所述位置具有许多不同的氨基酸。高度多样化的位置通常在CDR区。
"同一性"描述两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。同一性还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性(同源性)的程度，视情况而定，如通过此类序列的符号串(strings)之间的匹配所确定。虽然存在许多测量两个多肽或两个多核苷酸序列之间同一性的方法，但通常用于确定同一性的方法被编码在计算机程序中。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序包括但不限于GCG程序包(Devereux,et al.,Nucleic Acids Res,1984,12,387BLASTP,BLASTN)和FASTA(Atschulet al.,J.Molec.Biol.(1990)215,403)。
优选地，使用HGMP(人类基因组图谱计划)提供的BLAST计算机程序(Atschul etal.,J.Mol.Biol.1990 215,403-410)的默认参数，该蛋白的氨基酸序列与本文公开的氨基酸序列在氨基酸水平具有至少60％的同一性。
更优选地，蛋白质序列在核酸或氨基酸水平上与本文所示的氨基酸序列具有至少65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％和更优选95％(更优选至少96％、97％、98％或99％)的同一性。
该蛋白质也可包含与本文公开的序列具有至少60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，所述同一性使用HGMP提供的BLAST计算机程序的默认参数。
"文库"指多个VNAR或VNAR片段序列或编码这些序列的核酸。文库的来源可以为非天然来源或天然合成来源，其中多样性已经被工程化到天然或天然构架的组合中，或者可以为天然来源，例如从提取自经免疫动物的RNA的VNAR结构域分离的。
"连接(ligation)"是在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。为了连接两个片段，片段的末端必须彼此相容。在一些情况下，末端在内切核酸酶消化后将是直接相容的。然而，可能需要首先将通常在内切核酸酶消化后产生的交错末端转化为平端，以使它们适于连接。为了使末端钝化，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，用约10单位的DNA聚合酶I或T4 DNA聚合酶的Klenow片段在15℃下，在合适的缓冲液中处理DNA至少15分钟。然后通过苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀或通过二氧化硅纯化来纯化DNA。将待连接在一起的DNA片段以大约等摩尔量置于溶液中。溶液还含有ATP、连接酶缓冲液和连接酶，例如T4 DNA连接酶，每0.5\ig DNA约10个单位。如果DNA要连接到载体中，首先通过用合适的限制性内切酶消化使载体线性化。然后用细菌碱性磷酸酶或牛肠磷酸酶(calf intestinal phosphatase)处理线性化片段以防止在连接步骤期间的自连接。
"突变"是相对于参考核苷酸序列(例如野生型序列)的核苷酸的缺失、插入或置换。
"天然的"或"天然存在的"VNAR指从非合成来源，例如从离体获得的组织来源，或从板鳃亚纲(Elasmobranchii)亚类动物的血清中鉴定的VNAR。这些VNAR可以包括在任何类型的免疫应答中产生的VNAR，无论是天然的还是其它诱导的。天然VNAR包括氨基酸序列，以及构成或编码这些抗体的核苷酸序列。本文所用的天然VNAR不同于"合成VNAR"，合成VNAR指已从来源或模板序列发生改变的VNAR序列，例如，通过在某一位置用不同的氨基酸置换、缺失或添加一个氨基酸或一个以上氨基酸，所述不同的氨基酸提供了不同于来源抗体序列的抗体序列。
术语"核酸构建体"通常指任何长度的核酸，其可以是DNA、cDNA或RNA，例如通过克隆获得的或通过化学合成产生的mRNA。DNA可以是单链或双链的。单链DNA可以是编码有义链，或者它可以是非编码链或反义链。对于治疗用途，核酸构建体优选地为能够在待治疗的受试者中表达的形式。
当涉及核酸时，"可操作地连接"是指核酸与另一核酸序列以功能关联的方式放置。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点的位置便于翻译，则其与编码序列可操作连接。通常，"可操作地连接"是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是偶然的和在阅读框中的。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
"噬菌体展示"是一种技术，通过该技术，变体多肽作为融合蛋白展示在噬菌体例如丝状噬菌体颗粒的表面的至少一部分外壳蛋白上。噬菌体展示技术允许制备随机化的蛋白质变体的大文库，其可以快速且有效地分选以高亲和力结合靶抗原的那些序列。肽和蛋白质文库在噬菌体上的展示可以用于筛选数百万种多肽以寻找具有特异结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已经用于通过与编码丝状噬菌体的外壳蛋白pIII、pV III、pVI、pVII或pIX的基因融合来展示小的随机肽和小蛋白。
"噬菌粒"是具有细菌复制起点(例如ColEI)和噬菌体基因间区拷贝的质粒载体。噬菌粒可以用于任何已知的噬菌体，包括丝状噬菌体和人字形噬菌体。质粒通常还含有抗生素抗性的选择标记。克隆到这些载体中的DNA片段可以作为质粒增殖。当携带这些载体的细胞被提供有生产噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式变为滚环复制以产生质粒DNA的一条链的拷贝并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可以形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。该术语包括含有噬菌体外壳蛋白基因或其片段的噬菌粒，所述噬菌体外壳蛋白基因或其片段与异源多肽基因连接作为基因融合物，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。噬菌粒展示载体的实例是pWRIL-1。
术语"噬菌体载体"是指含有异源基因并能够复制的噬菌体的双链复制形式。噬菌体载体具有噬菌体复制起点，允许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成。噬菌体优选是丝状噬菌体，例如M13、fl、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或λ噬菌体，例如λ、21、phi80、phi81或其衍生物。
术语"蛋白质"一般是指通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。它可以互换使用，并且与肽、寡肽、寡聚物或多肽意思相同，包括糖蛋白及其衍生物。术语"蛋白质"还旨在包括蛋白质的片段、类似物、变体和衍生物，其中所述片段、类似物、变体或衍生物保留与参照蛋白质基本上相同的生物活性或功能。蛋白质类似物和衍生物的实例包括肽核酸和DARPins(设计的锚蛋白重复蛋白)。"本发明的多肽"是如本文定义的TNFα特异性抗原结合分子。
蛋白的片段、类似物、变体或衍生物的长度可以是至少25个，优选30或40个，或至多50或100个，或60至120个氨基酸，这取决于其来源的原始蛋白序列的长度。在一些情况下，90至120、100至110个氨基酸的长度可能是方便的。
蛋白质的片段、衍生物、变体或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换并且这种置换的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基的蛋白质，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的蛋白质，或(iii)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合的蛋白质，例如用于纯化多肽的前导序列或辅助序列。根据本文的教导，这样的片段、衍生物、变体和类似物被认为在本领域技术人员的认知范围内。
"寡核苷酸"是通过已知方法(例如使用固相技术的磷酸三酯、亚磷酸盐或亚磷酰胺化学法)化学合成的短链、单链或双链聚脱氧核苷酸，如果基因的整个核酸序列已知，或与编码链互补的核酸序列可用，则进一步的方法包括使用聚合酶链反应(PCR)。或者，如果靶氨基酸序列是已知的，则可以使用每个氨基酸残基的已知和优选的编码残基推断潜在的核酸序列。寡核苷酸可以在聚丙烯酰胺凝胶或分子筛柱上纯化或通过沉淀纯化。当DNA与非核酸杂质(可以是极性、非极性、离子等)分离时，DNA被"纯化"了。
本文所用的"来源"或"模板"VNAR指其抗原结合序列作为模板序列的VNAR或VNAR抗原结合片段，根据本文所述的标准对其进行多样化。抗原结合序列通常在VNAR内优选包括至少一个CDR，优选包括构架区。
"转录调节元件"将含有一个或多个下列成分：增强子元件、启动子、操纵子序列、阻遏基因和转录终止序列。
"转化"是指细胞摄取DNA并成为"转化体"的过程。DNA摄取可以是永久的或瞬时的。"转化体"是已经摄取并保留DNA的细胞，这通过与DNA相关的表型的表达(例如由DNA编码的蛋白质赋予的抗生素抗性)来证明。
起始或参考多肽(例如，原始VNAR或其CDR)的"变体"或"突变体"，例如融合蛋白(多肽)或异源多肽(与噬菌体异源)，是(1)具有与起始或参考多肽不同的氨基酸序列和(2)通过天然或人工诱变从起始或参考多肽衍生的多肽。这样的变体包括，例如，在感兴趣多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。例如，使用包含编码具有变体氨基酸(相对于在原始VNAR或抗原结合片段的相应位置发现的氨基酸)的序列的非随机密码子组的寡核苷酸产生的本发明的融合多肽，将是相对于原始VNAR或抗原结合片段的变体多肽。因此，变体CDR指包含相对于起始或参考多肽序列(如原始VNAR或抗原结合片段的序列)的变体序列的CDR。在本文中，变体氨基酸指与起始或参考多肽序列(如原始VNAR或抗原结合片段)中相应位置的氨基酸不同的氨基酸。可以进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终的变体或突变构建体，条件是最终的构建体具有期望的功能特征。氨基酸改变也可以改变多肽的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。
"野生型"或"参考"序列或"野生型"或"参考"蛋白质/多肽的序列，如外壳蛋白，或原始VNAR的CDR，可以是通过引入突变而衍生变体多肽的参考序列。通常，给定蛋白质的"野生型"序列是自然界中最常见的序列。
类似地，"野生型"基因序列是自然界中最常见的基因序列。可以通过天然过程或通过人诱导的方法将突变引入"野生型"基因(和因此其编码的蛋白质)。这些方法的产物是原始"野生型"蛋白质或基因的"变体"或"突变体"形式。
DNA操作的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员公知的。在这方面，参见Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)冷泉港(Cold Spring Harbor)出版。
VNAR的分离
VNAR结构域可从噬菌体展示文库中获得，所述文库是使用靶免疫鲨鱼的组织构建的(Dooley,H.,et al.Mol Immunol,2003.40(1):p.25-33；Nuttall,S.D.,et al,Proteins,2004.55(1):p.187-97；和Dooley,H.,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,2006.103(6):p.1846-51)，WO2003/014161，通过引用将其并入本文，描述了免疫鲨鱼并获得结合结构域的有用方法。
VNAR结合结构域也可从包含VNAR序列的合成文库中获得。WO2014/173959，通过引用并入本文，描述了用于开发VNAR文库和获得结合结构域的有用方法。
另外，已经显示，靶向CDR3的具有合成多样性的文库可用于获得基于VNAR结构的结合结构域(Nuttall,S.D.,et al.Mol Immunol,2001.38(4):p.313-26；Nuttall,S.D.,etal.Eur J Biochem,2003.270(17):p.3543-54；Shao,C.Y.,et al.Mol Immunol,2007.44(4):p.656-65和Liu,J.L.,et al.BMC Biotechnol,2007.7:p.78；WO2005/118629)。
本发明的VNARS可进一步被调整，以便施用给人时降低潜在的免疫原性(人源化)。
抗体可变结构域的人源化是本领域众所周知的技术，以修饰在除人以外的物种中产生的针对治疗上有用的靶标的抗体，使得人源化形式可以在施用于人受试者时避免不想要的免疫反应。涉及人源化的方法总结于Almagro J.C和William Strohl W.TherapeuticMonoclonal Antibodies:From Bench to Clinic.中的Antibody Engineering:Humanization,Affinity Maturation,and Selection Techniques(由An J.2009JohnWiley&Sons,Inc编辑)和Strohl W.R.和Strohl L.M.,Therapeutic AntibodyEngineering(Woodhead出版2012)中。
尽管与免疫球蛋白相比，IgNAR具有不同的来源，并且与免疫球蛋白可变结构域相比具有非常小的序列同源性，但是在免疫球蛋白和IgNAR可变结构域之间存在一些结构相似性，使得相似的过程可以应用于VNAR结构域。例如，WO2013/167883，通过引用并入本文，提供了VNAR人源化的描述，也参见Kovalenko O.V.,et al.J Biol Chem.2013.288(24):p.17408-19。
蛋白质表达
编码本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子的核酸序列可存在于核酸构建体中。这样的核酸构建体可以是载体的形式，例如表达载体，并且可以包括染色体、附加型和病毒衍生的载体，例如，源自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，以及源自其组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒。通常，任何适于在宿主中维持、增殖或表达核酸以表达多肽的载体都可用于这方面的表达。
核酸构建体可适当地包括启动子或控制核酸表达的其它调控序列。控制核酸表达的启动子和其它调控序列已经被鉴定并且是本领域已知的。本领域技术人员将注意到，可能不必使用整个启动子或其它调控序列。可能仅需要最小的必需调控元件，并且事实上，这样的元件可以用于构建嵌合序列或其它启动子。当然，基本要求是要保持组织和/或时间特异性。启动子可以是任何合适的已知启动子，例如人巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV立即早期启动子(CMV immediate early promoter)、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子或逆转录病毒LTRs的启动子，如劳斯肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子。启动子可包含启动子活性所包含的最小单元(例如TATA元件，任选不含增强子元件)，例如CMV启动子的最小序列。优选地，启动子与核酸序列邻接。
如本文所述，核酸构建体可以是载体的形式。载体通常包括一个或多个表达标记，其能够选择用它们转染(或转化)的细胞，并且优选地，能够选择含有掺入异源DNA的载体的细胞。通常将存在合适的开始和停止信号。
载体可以是任何合适的表达载体，例如pET。载体可以包括如所期望的此类额外的控制序列，例如选择性标记(例如抗生素抗性、荧光等)、转录控制序列和启动子，包括起始和终止序列。
启动子可以是任何合适的启动子，用于引起由本发明的核酸序列编码的蛋白质的表达，例如CMV启动子、人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子。
这样的载体可以存在于宿主细胞中。用于表达本发明核酸构建体的合适宿主细胞的代表性实例包括允许将核酸包封到病毒载体中的病毒包装细胞；细菌细胞，如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌；单细胞，如酵母细胞，例如酿酒酵母和曲霉属细胞；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9细胞，动物细胞如CHO、COS、C127、3T3、PHK.293和Bowes黑素瘤细胞以及其它合适的人细胞；和植物细胞，例如拟南芥。合适地，宿主细胞是真核细胞，例如CHO细胞或HEK293细胞。
将表达载体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子-脂质介导的转染、电穿孔、转导、刮擦装载(scrape loading)、定向导入(ballistic introduction)、感染或其它方法实现。这些方法描述于许多标准实验室手册中，例如参见Sambrook et al,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第二版)冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)出版，冷泉港，纽约(1989)。
成熟蛋白可在适当启动子控制下在宿主细胞中表达，包括哺乳动物细胞如CHO细胞、酵母、细菌或其它细胞。可以使用无细胞翻译系统，使用来自本发明第三方面的核酸构建体的RNA来产生这样的蛋白质。用于原核和真核宿主的合适的克隆和表达载体记载在Sambrook et al,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第二版)冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory)出版，冷泉港，纽约(1989)中。
本发明还提供了包含本文所述的本发明的任何多核苷酸和/或载体的宿主细胞。根据本发明，提供了用于生产本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子的方法，其包括在本文所定义的合适宿主细胞中表达编码所述分子的核酸序列的步骤。
可以通过标准方法从重组细胞培养物中回收和纯化蛋白质，所述标准方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、凝集素和/或肝素层析。对于治疗，核酸构建体，例如重组载体形式的核酸构建体，可以通过本领域已知的技术纯化，例如通过柱色谱法，如Sambrook etal,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第二版)冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)出版，冷泉港，纽约(1989)中所述。
因此，本发明的这一方面延及制备本发明融合蛋白的方法，包括通过在宿主细胞中表达而重组产生融合蛋白，通过肽键连接、氢键或盐键或化学交联纯化表达的融合蛋白。在本发明这方面的一些实施方式中，当肽能够多聚化，例如二聚或三聚时，可以使用氢键或盐键制备融合蛋白。
抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子可包含在使用前被切除的额外N-端或C-端序列，其可在如本文所述的分子生产过程中辅助纯化和/或分离。例如，在分子的C-端的(Ala)3(His)6。
本发明还包括具有蛋白质氨基酸序列的变体、类似物、衍生物和片段，其中几个例如5至10个、或1至5个、或1至3个、2个、1个或没有氨基酸残基以任何组合被置换、缺失或添加。其中特别优选的是沉默置换、添加和缺失，它们不改变本发明蛋白质的性质和活性。在这方面还特别优选的是保守置换，其中本发明蛋白质的性质在变体形式中与原始形式相比得到保留。变体还包括包含本发明的抗原特异性抗原结合分子的融合蛋白。
如上所述，本发明变体的实例包括其中一个或多个氨基酸被一个或多个其它氨基酸置换的蛋白质。本领域技术人员知道各种氨基酸具有相似的性质。物质的一个或多个这样的氨基酸通常可以被一个或多个其它这样的氨基酸置换，而不干扰或消除该物质的期望活性。此类置换可称为"非保守性"氨基酸置换。
因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常可以彼此置换(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的置换中，优选甘氨酸和丙氨酸用于彼此置换(因为它们具有相对短的侧链)，并且缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸用于彼此置换(因为它们具有疏水的较大脂肪族侧链)。通常可以彼此置换的其它氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。这种性质的置换通常称为"保守的"或"半保守的"氨基酸置换。
也可以相对于上述融合蛋白的氨基酸序列进行氨基酸缺失或插入。因此，例如，可以缺失对多肽活性没有实质性影响的氨基酸，或至少不消除这种活性的氨基酸。这样的缺失可以是有利的，因为多肽的总长度和分子量可以被降低，同时仍然保持活性。这可以使得特定目的所需的多肽量能够减少-例如，可以降低剂量水平。
也可以实施相对于上述融合蛋白序列的氨基酸插入。可以这样做以改变本发明的物质的性质(例如，以帮助鉴定、纯化或表达，如上文关于融合蛋白所解释的)。
相对于本发明融合蛋白的序列的氨基酸改变可以使用任何合适的技术进行，例如通过使用定点诱变。
应当理解，本发明范围内的氨基酸置换或插入可以使用天然存在或非天然存在的氨基酸进行。无论使用天然或合成氨基酸，优选仅存在L-氨基酸。
本发明的蛋白质可以具有额外的N-端和/或C-端氨基酸序列。可以出于各种原因提供这样的序列，例如糖基化。
融合蛋白可包含与异源肽或蛋白序列融合的本发明的抗原特异性抗原结合分子，所述异源肽或蛋白序列为融合蛋白提供结构元件。在其它实施方式中，融合蛋白可包含与具有生物活性的分子融合的本发明的抗原特异性抗原结合分子。该分子可以是肽或蛋白质序列，或另一种生物活性分子。
例如，抗原特异性抗原结合分子可与异源肽序列融合，所述异源肽序列可以是多氨基酸序列，例如多个组氨酸残基或多个赖氨酸残基(合适地为2、3、4、5或6个残基)，或免疫球蛋白结构域(例如Fc结构域)。
异源肽序列包括来自其它哺乳动物物种如鼠和人的序列，以及任何源自其它VNAR结构域的异源肽序列。
当融合蛋白包含与具有生物活性的分子融合的本发明的抗原特异性抗原结合分子时，生物活性部分可以是具有生物活性的肽或蛋白质，例如酶、免疫球蛋白、细胞因子或其片段。或者，生物活性分子可以是抗生素、抗癌药、NSAID、类固醇、止痛剂、毒素或其它药物活性剂。抗癌药物可以包括细胞毒性或细胞生长抑制药物。
在一些实施方式中，融合蛋白可包含与另一免疫球蛋白可变区或恒定区或本发明的另一抗原特异性抗原结合分子融合的本发明的抗原特异性抗原结合分子。换句话说，本发明的抗原特异性抗原结合分子的融合物具有可变长度，例如二聚体、三聚体、四聚体或更高的多聚体(即五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体或更大)。在具体的实施方式中，这可以表示为单体VNAR亚基的多聚体。
在本发明的融合蛋白中，抗原特异性抗原结合分子可以直接融合或通过接头部分连接至融合蛋白的其他元件。接头可以是肽、肽核酸或聚酰胺连接。合适的肽接头可以包括多个氨基酸残基，例如4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个氨基酸。例如(Gly)4、(Gly)5、(Gly)4Ser、(Gly)4(Ser)(Gly)4或其组合或其多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体或更大)。例如，合适的接头可以是(GGGGS)3。备选的接头包括(Ala)3(His)6或其多聚体。还包括使用HGMP提供的BLAST计算机程序的默认参数，与其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
将根据本发明所述构建的载体导入宿主细胞中以进行扩增和/或表达。可以使用标准转化方法将载体引入宿主细胞，所述方法包括电穿孔、磷酸钙沉淀等。如果载体是感染性颗粒如病毒，载体本身提供进入宿主细胞的入口。转染含有可复制表达载体的宿主细胞，所述载体编码基因融合物，并根据标准方法生产噬菌体颗粒，提供了其中融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面上的噬菌体颗粒。
使用多种方法将可复制的表达载体导入宿主细胞。在一个实施方式中，载体可以使用以下方法引入细胞：细胞在标准培养液中的培养物中生长，任选地在约37℃下生长约6-48小时(或至OD600＝0.6-0.8)，然后离心培养液并除去上清液(例如倾析)。最初的纯化优选通过将细胞沉淀重悬于缓冲液(例如1.0mM HEPES pH7.4)中，然后再离心并除去上清液。将所得细胞沉淀重悬于稀甘油(例如5-20％v/v)中，再次离心以形成细胞沉淀，并除去上清液。通过将细胞沉淀重悬浮在水或稀释的甘油中至所需浓度，获得最终的细胞浓度。
在电穿孔过程中使用较高的DNA浓度(约10×)提高转化效率并增加转化到宿主细胞中的DNA量。使用高细胞浓度也提高了效率(约10×)。转移的DNA的量越大，产生的文库越大，其多样性越大，代表组合文库的独特成员的数目越多。转化的细胞通常通过在含有抗生素的培养基上生长来进行选择。
药物组合物和用途
根据本发明，提供了本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子的药物组合物。这样的组合物包括包含所述抗原特异性抗原结合分子的融合蛋白。
药物组合物还可以包含与治疗性蛋白或其片段融合的本发明的抗原特异性抗原结合分子。治疗性蛋白质可以是激素、生长因子(例如TGFβ、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、集落刺激因子(CSF)、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、胎盘生长因子)；分化因子；凝血因子(例如，因子VIIa、因子VIII、因子IX、VonWillebrand因子或蛋白C)或来自凝血级联的另一种蛋白(例如，抗凝血酶)；细胞因子，例如白细胞介素(例如IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32或IL33，或干扰素(例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、IFN-γ诱导因子(IGIF)、骨形态发生蛋白(BMP，例如BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13)；白介素受体拮抗剂(如IL1ra、IL1RII)；趋化因子(例如MIP(巨噬细胞炎症蛋白)如MIP1α和MIP1β；MCP(单核细胞趋化蛋白)如MCP1、2或3；RANTES(受正常T细胞表达和分泌的活化的调节))；营养因子；细胞因子抑制剂；细胞因子受体；酶，例如自由基清除酶，例如超氧化物歧化酶或过氧化氢酶或前药转化酶(例如血管紧张素转化酶、脱氨酶、脱氢酶、还原酶、激酶和磷酸酶)；肽模拟物；蛋白酶抑制剂；金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP，例如TIMP1、TIMP2、TIMP3或TIMP4)或丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin，丝氨酸蛋白酶的抑制因子)。
在本发明的其它实施方式中，融合蛋白中的治疗性蛋白可以是抗体或其工程化片段，包括Fab、Fc、F(ab')2(包括化学连接的F(ab')2链)、Fab'、scFv(包括其多聚体形式，即di-scFv或tri-scFv)、sdAb或BiTE(双特异性T细胞衔接子)。抗体片段也包括其可变区和片段，以及其它VNAR型片段(IgNAR分子)。
药物组合物可以由许多本发明的抗原特异性抗原结合分子组成，例如与治疗性蛋白质融合的二聚体、三聚体或更高级的多聚体，即二、三、四、五、六、七或八聚体。
本发明的抗原特异性抗原结合分子与治疗性蛋白质的融合可以在蛋白质上的任何方便的位点，并且可以是N-、C-和/或N-/C-末端融合。在本发明的一个实施方式中，本发明的抗原特异性抗原结合分子与治疗性蛋白质的N-和C-端融合。
本发明的药物组合物可以包含任何合适的和药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或缓冲溶液。组合物可以包含另外的药物活性剂。这样的载体可以包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。
这样的组合物可以包含如所示的另外的药物活性剂。所述另外的药剂可以是治疗化合物，例如抗炎药、细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗生素。这些另外的药剂可以以适于对有此需要的患者给药的形式存在，并且这些给药可以是同时、分开或按顺序的。所述组分可以以试剂盒的形式制备，其可以包括适当的说明书。
药物组合物可以以任何有效、方便的方式给药，以有效治疗患者的疾病，包括例如通过口服、局部、静脉内、肌内、鼻内或皮内途径给药等。在治疗或预防中，活性剂可以作为可注射组合物，例如作为无菌水分散体，优选等渗的无菌水分散体，施用给个体。
对于对哺乳动物，特别是人的给药，预期活性剂的日剂量为0.01mg/kg体重，通常为约1mg/kg、2mg/kg或至多4mg/kg。在任何情况下，医师将根据包括个体的年龄、体重、性别和反应的因素确定最适合于个体的实际剂量。上述剂量是一般情况的示例。当然，可能存在需要更高或更低剂量的情况，并且这些均在本发明的范围内。
根据本发明，提供了用作药物的本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子。因此，本发明的这一方面延伸至本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子在制备用于治疗有需要的患者的疾病的药物中的用途。本发明的抗原特异性抗原结合分子也可用于制备包含如上文关于本发明的药物组合物所定义的此类特异性结合分子的融合蛋白。
这些用途还包括治疗需要治疗的患者的疾病的方法，包括对患者施用治疗有效剂量的如本文定义的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子。
如本文所用，术语"治疗"包括任何可能有益于人或非人类动物的方案。在兽医学中"非人类动物"的治疗扩展至家畜(包括马和伴侣动物(例如猫和犬))和农场/农业动物(包括绵羊、山羊、猪、牛和马家族的成员)的治疗。治疗可以是针对任何现有病症或障碍的治疗性治疗，或者可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可以是遗传性或获得性疾病的治疗。治疗可以是急性或慢性病症的治疗。治疗可以是与炎症和/或癌症相关的病症/障碍的治疗。本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子可用于治疗疾病，包括但不限于骨关节炎、硬皮病、肾病、类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化、动脉粥样硬化或任何炎性疾病。
本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子也可用于研究患者中疾病状况的性质。抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子可用于使用诸如X射线、γ射线或PET扫描等成像技术来制备受试者体内的疾病部位的图像。因此，本发明可以扩展到使受试者中的疾病部位成像的方法，其包括向受试者施用合适地可检测标记的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子，并随后扫描受试者的身体。或者，将所述分子施用给受试者可通过在施用所述分子后分析来自受试者的样品来提供测试结果。这样的实施方式可以包括诊断受试者的疾病或医学病症的方法，其包括施用本发明的抗原特异性抗原结合分子或多结构域特异性结合分子。本发明的多结构域特异性结合分子在诊断敏感性方面特别有用，尤其是当使用靶向同一抗原上不同表位的多个VNAR时。
结合的测定
VNAR与靶结合的检测和测定可以用本领域熟知的许多方法进行，包括ELISA和表面等离子体共振。
功能活性
本发明的VNAR可以许多方式起作用，包括结合并中和分子如细胞因子的生物效应，结合到受体上阻止配体结合或在结合后引起生物效应。
测量结合结构域的功能活性的方法是本领域已知的。
通过以下非限制性实施例进一步详细说明本发明。
实施例1：特异性抗原结合VNARs的分离
A.TNF结合VNARs
免疫和选择
将护士鲨[铰口鲨，Ginglymostomoma cirratum]置于含有人造海水的容器中，所述人造海水含有0.1％(w/v)三甘氨酸甲磺酸盐[MS-222]。达到所需麻醉水平后，取出它们进行免疫或放血。使用20号针头将乳化在完全弗氏佐剂[CFA]中的hTNFα[250μg]注射到鲨鱼的侧鳍中。以4周的间隔静脉给药至尾静脉进行加强，作为磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的可溶性抗原[样品0.45μM无菌过滤]。将血样从尾静脉收集到含有200μl猪肝素[在PBS中1000U/ml]的30ml注射器中。将血样以2000rpm旋转10分钟以从血浆中分离血细胞。将血浆上清液部分小心地移入具有RNA稳定缓冲液的无菌试管中，储存于-80℃。
鲨鱼血清中hTNFα特异性IgNAR的检测
ELISA板用1μg/ml rhTNFα包被，37℃温育1小时，然后在4％(w/v)MPBS中在37℃封闭1小时，将鲨鱼血清[前血，血液4和5]以1:2稀释系列加入指定孔中，37℃温育1小时，将板与100μl/孔的纯化抗护士鲨IgNAR单克隆抗体[GA8]在PBS中1:200稀释温育。通过加入在0.1％(v/v)吐温-20PBS(PBST)中1:2000稀释的抗小鼠IgG-HRP产生结合信号，室温温育1小时。在每个步骤后用PBST洗涤平板3次，在与抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体[Sigma]温育后再进行另外的3次PBS洗涤。通过加入SureBlue TMB微孔过氧化物酶底物[Thermo Scientific]使板显色，用1M H2SO4终止反应，并使用酶标仪在450nm波长下测量吸光度。
使用每次加强免疫后获得的血清，通过结合ELISA测定每次免疫加强后rhTNFα特异性IgNAR应答。GA8，一种小鼠单克隆抗-护士鲨IgNAR抗体，稀释在PBS中的杂交瘤组织培养上清液中，用作检测抗体(Haines等，2005；Mulller等，2012)。结果显示免疫后IgNAR随时间增加的令人信服的趋势，如在血液4和5中所示，在采血前样品中观察到的背景应答也表明在免疫前没有显著的rhTNFα特异性IgNAR应答[图1]。
从PBL分离总RNA和PCR扩增
从具有最佳IgNAR应答的血液[血液5]的血浆中收获外周血淋巴细胞[PBL]，并制备总RNA。使用Superscript III第一链合成SuperMix[Invitrogen]，以约2μg/μl使用来自收获的PBLs的总RNA作为cDNA合成的模板。用构架特异性引物NARF4For1[5'-ATA ATC AAGCTT GCG GCC GCA TTC ACA GTC ACG ACA GTG CCA CCT C-3'](SEQ ID NO.74)和NARF4For2[5'-ATA ATC AAG CTT GCG GCC GCA TTC ACA GTC ACG GCA GTG CCA TCT C-3'](SEQ ID NO.75)产生cDNA(参见Dooley,H.,et al,Mol.Immunol,2003.40(1):p.25-33)。cDNA合成后，引入共同框架一个特异性引物NARF1Rev[5'-ATA ATA AGG AAT TCC ATG GCT CGA GTG GAC CAA ACA CCG-3'](SEQ ID NO.76)并使用3步聚合酶链式反应(PCR)扩增方案扩增IgNAR V区DNA。将得到的约400个碱基对的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，切出NAR V区域并纯化[QIAquick纯化试剂盒，QIAGEN]。用限制性酶NcoI和NotI[NewEngland Biolabs]在引物编码的限制性位点消化纯化的DNA，并重新纯化。
文库构建
用限制性酶NcoI和NotI消化噬菌粒载体pHEN2，PCR纯化[QIAquick PCR纯化]并连接到类似制备的PCR产物上。将连接的材料转化到有电穿孔能力的大肠杆菌TG1细胞[Lucigen]中。将转化的细胞铺板于含有2％葡萄糖[w/v]、100μg/ml氨苄青霉素的TYE琼脂平板上，并在37℃下生长过夜，计算文库大小，并从平板上刮下菌落，将文库贮存物的等分试样贮存于-80℃。
噬菌体展示选择
将OD600相当于0.1的文库贮存物的单一等分试样加入到含有2％葡萄糖[w/v]、100μg/ml氨苄青霉素的2x TY生长培养基中，并在用M13K07辅助噬菌体[New EnglandBiolabs]感染之前在37℃生长至对数中期[OD600为0.4至0.6]。在30℃下在2x TY培养基、0.2％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素中过夜进行文库表达，噬菌体用聚乙二醇(PEG)从培养物上清液中沉淀，并用于生物淘选。针对在
Figure BDA0002426620980000611
M-280链霉亲和素珠[Dynabeads，Invitrogen]上捕获的生物素化rhTNFα对文库进行淘选。分别用封闭溶液[3％(w/v)乳，1％(w/v)BSA的PBS溶液]将文库噬菌体和M-280链霉抗生物素蛋白预封闭1小时，在室温下旋转。将生物素化的rhTNFα[400nM]加入封闭的珠子，并在室温旋转温育1小时。在不同的管中，将文库噬菌体与预先封闭的链霉亲和素珠在室温下旋转温育1小时。使用Dynabeads磁性支架回收未结合的噬菌体，回收的噬菌体在此称为返选的噬菌体(deselected phage)。通过与封闭的珠子温育，在室温下旋转1小时，返选噬菌体。生物素-rhTNFα修饰的珠子与返选的噬菌体在室温旋转温育1小时。在用400μl的100mM三乙胺(TEA)严格洗脱8分钟之前，将珠子洗涤5×PBST和5×PBS，并通过加入200μl的1M Tris-HClpH7.5进行中和。将对数中期阶段大肠杆菌TG1细胞[10ml]用400μl洗脱的噬菌体在37℃感染30分钟，然后在37℃在含有2％葡萄糖(w/v)、100μg/ml氨苄青霉素的TYE琼脂平板上生长过夜。进行另外三轮选择，并通过将生物素-rhTNFα的浓度降低至200nM来增加第3和4轮的严格性。
克隆的筛选和选择
使用包被有1μg/ml rhTNFα的ELISA板评价结合抗原的单克隆噬菌体的富集，所述rhTNFα用4％[w/v]乳-PBS封闭。用抗M13-HRP缀合的单克隆抗体检测结合[GEHealthcare]。还分别分析了单克隆噬菌体对链霉亲和素和HSA包被的ELISA板的选择性和特异性。
对该文库进行四轮反复的rhTNFα淘选。生物淘选抗原浓度在第1和2轮中保持恒定，但在随后的淘选轮中降低一半以有利于高亲和性结合物。在每轮生物淘选结束时通过ELISA评价阳性单克隆噬菌体结合物的富集rhTNFα结合。在第2轮中，从预选择的克隆观察到抗原结合的稳定增加，在第3和4轮后，单克隆噬菌体结合物的数量下降。rhTNFα单克隆结合物从第0轮[预选择文库]中的约6％[11/184]增加至第2轮后的99.46％[183/184]。
从文库淘选中鉴定了许多独特序列。这些包括命名为D1、C4和B4的VNAR。
Figure BDA0002426620980000631
CDR1和CDR3中的半胱氨酸(C)残基(双下划线标示)是典型的II型VNARs，并且观察到除了在FW1和FW3b中的半胱氨酸之间的典型免疫球蛋白超家族桥(单下划线标示)之外，还形成了第二个二硫桥。
与TNFα结合的VNARs的表达
SHuffle细胞胞质中可溶性VNAR蛋白的制备
将单克隆噬菌体筛选鉴定的目的IgNAR V区插入片段通过XbaI和EcoRI限制酶位点克隆到表达载体pET28b(+)(Novagen)中。VNAR DNA是从大肠杆菌从TG1培养物获得的(使用QIAprep Miniprep试剂盒，QIAGEN)和使用内部设计的引物对XbaI_NARFW1_#127(SEQ IDNO.26)和EcoRI_stop_myc_#129(SEQ ID NO.29)进行PCR扩增，所述引物对分别引入克隆位点XbaI和EcoRI，而引物SEQ ID NO.29将c-myc、6x组氨酸标记和终止密码子引入VNAR基因序列中。纯化的VNAR DNA PCR产物和pET28b(+)质粒DNA在37℃用50U XbaI和10U EcoRI-HF消化2小时。将消化的样品纯化，连接并转化成电感受态大肠杆菌
Figure BDA0002426620980000632
T7表达细胞[New England Biolabs]，并在含有50μg/ml卡那霉素的TYE琼脂平板上进行选择。在30℃用IPTG诱导后，VNAR抗hTNFα-D1、C4和B4融合蛋白在
Figure BDA0002426620980000633
细胞的细胞质中表达，通过离心收获细胞，用BugbusterTM蛋白提取试剂[Novagen]处理细胞沉淀以裂解细胞并释放可溶性蛋白。通过固定化金属亲和层析[IMAC]经六组氨酸尾纯化VNAR可溶性蛋白，并用500mM咪唑，pH8从IMAC树脂洗脱。使用前，将蛋白质样品用PBS，pH7.4透析。使用Ultraspec6300 proUV/可见光分光光度计[Amersham，Biosciences]测定蛋白质浓度。
在考马斯蓝染色的SDS-PAGE上显现总的纯化蛋白。纯化的VNAR单体蛋白迁移成约14kDa的单一条带[包括六-组氨酸和c-myc标签]，没有蛋白质聚集的迹象。基于SDS-PAGE凝胶估计纯度为约90％。
蛋白质完整性和纯度的测定
变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳[SDS-PAGE]用于评估纯化的蛋白质纯度和大小。在含有5％β-巯基乙醇的
Figure BDA0002426620980000641
LDS样品缓冲液[Life Technologies]中制备蛋白质样品，并加热至95℃5分钟。将变性的蛋白质样品上样到浸入MES SDS电泳缓冲液中的4-12％Bis-Tris凝胶[Life Technologies]上，并在160伏特下电泳55分钟。使用全范围重组蛋白分子量标记[GE Healthcare]作为分子量梯标准。将凝胶在蒸馏水中洗涤，并用考马斯蓝染色1小时，随后在蒸馏水中进行过夜脱色过程。
选择性和特异性的测定
在包被有1μg/ml生物素-TNF和rhTNFα，或10μg/ml HSA、BSA、链霉亲和素、单链DNA、甲状腺球蛋白或溶菌酶的ELISA板上测定结合的特异性和选择性。ELISA板用4％[w/v]乳-PBS适当封闭，蛋白质样品以1μg/ml的最高浓度上样并进行系列稀释。用抗c-myc-HRP偶联的单克隆抗体[Roche]检测结合。
为了获得更准确的结合数据，还使用BIACore T200或Octet RED96仪器，采用表面等离子体共振测量了某些分子。
BIACoreTM T200(GE Healthcare)
胺偶联是将配体固定到芯片表面的非常常见的方法。芯片表面具有用羧基衍生的葡聚糖基质，其在用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)活化后，形成反应性琥珀酰亚胺酯，其允许通过配体上任何可用的伯胺基团(例如赖氨酸)共价捕获配体。
TNFα在10mM乙酸钠缓冲液pH5.5中稀释1/10，注射到活化芯片上。"针对"软件固定向导(“aim for”software immobilisation wizard)或特定时间段可用于针对200RU的固定的TNFα。另外，在没有0.05％吐温20的情况下将运行缓冲液换为PBS，因为认为去污剂可能影响配体活性。获得最终的固定化水平为202RU的配体。
启动循环由以30μL/min的流速注射60s缓冲液、随后30s解离期组成。抗TNFα样品循环包括以30μl/min注射120s样品、随后以30μl/min注射60s 10mM甘氨酸pH2的再生步骤。最后，在每个循环结束时包括120s稳定期以允许在开始下一个循环之前的基线平衡。
筛选的浓度系列和解离期是可变的，如下所示：所有样品在100nM的最高起始浓度和1200s的解离时间下测定，除了所有单体结构域D1、C4、B4、TNF43和TNF30，其中解离时间为600s。B4和TNF43 VNAR分别在500nM和5μM的最高起始浓度下测定。
包括5个空白样品循环以用于产生双重参考数据集。
使用BIACoreTM T200评价软件分析结构域的结合应答，并将双重参考数据拟合为1：1Langmuir模型以获得动力学和亲和力表征。
Figure BDA0002426620980000651
RED96[FortebioTM]
使用生物层干涉测量法(BLI)测定平衡解离常数(KD)。浸渍和读出链霉亲和素生物传感器在PBS、pH7.4中再水合至少30分钟。将20μg/ml生物素化hTNF-α和抗TNF-αVNAR蛋白质加载到传感器上，用100nM的最高浓度连续稀释，而TNF43和VNAR阴性对照在1μM的最高浓度下测定。监测结合10分钟，随后监测5分钟的解离时间。对于所有的抗TNF-αVNAR测量，使用双位点模型拟合动力学数据组，因为曲线拟合数据显示复杂的多相曲线，然而对于对照抗TNF-α纳米抗体，使用TNF30a 1:1Langmuir与质量转运结合模型。
所得数据示于表1。表1表明，与TNF43 VNAR相比，所测试的单体VNAR对TNFα的结合亲和力至少低500倍。
表1.TNF VNAR SPR结合数据
Figure BDA0002426620980000661
体外中和试验
为了测定VNAR结构域的中和能力和ND50，小鼠纤维肉瘤细胞系L929[ATCC，CCL-1]生长在补充了10％热灭活胎牛血清[GIBCO]和1μg/ml放线菌素D[R&D Systems]的Dulbecco改进的Eagle培养基[GIBCO]中。对于每个VNAR克隆，每孔5,000个细胞在96孔板中一式两份地在37℃和5％CO2和湿度下培养24小时。将rhTNFα的LD50[1x在0.25ng/ml]和10x LD50[2.5ng/ml]加入含有连续稀释的VNAR蛋白质或单独细胞的孔中。然后将板在37℃和5％CO2和湿度下温育24小时。通过加入50μl的1:20稀释的WST-1细胞增殖试剂[Roche]，并在37℃、5％CO2和湿度下温育4-8小时，测量细胞毒性或细胞存活率。在450-560nm处读取吸光度。
TNFα在1μg/ml放线菌素D存在下在L929纤维肉瘤细胞中引起细胞毒性，LD50在0.25-0.3ng/ml之间。我们证明我们的VNAR蛋白质结构域在纳摩尔浓度时能够中和高达十倍的rhTNFα的LD50[图3]。在该实验中，VNAR在其C-端通过肽接头与IgG Fc结构域连接，以形成用于与对照抗TNFα抗体MAB210比较的二价分子。
当在中和试验中以单结构域形式测定时，D1和C4 VNARs似乎不如TNF30VHH纳米抗体有效(图2)。这似乎与单位点结合亲和力相关。然而，当作为混合物(图3)或以二价或双特异性形式(图xxxx)组合时，它们出乎意料地显示出比二聚体TNF30 VHH纳米抗体更优的性质。
参数细胞通量测定
人上皮结肠直肠腺癌细胞(Caco-2)在补充了10％(v/v)热灭活FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素(分别为10,000单位/ml和10,000μg/ml)的DMEM中培养。在接种于24孔，0.4μm半透性组织培养Transwell小室(Transwell inserts)(Corning公司)之前，细胞在T75烧瓶中生长至90％细胞覆盖。通过将10μl细胞悬浮液悬浮在90μl的0.4％锥虫蓝排除染料(Beckman Coulter)中，并小心地将混合物转移到附有盖玻片的血球计上来确定活细胞数。
在活细胞数目测定之后，将1×105个细胞接种在100μl的最终DMEM体积中的每个Transwell小室中，同时将600μl无细胞的DMEM转移到外部容纳孔中。将Transwell板在37℃与5％(v/v)CO2下一起温育，每48小时更换用过的DMEM+10％(v/v)FBS。在相差显微镜(40×放大率物镜)下监测细胞增殖，直到细胞达到100％细胞覆盖，通常在接种后5-7天之间。Caco-2细胞再生长21天以允许分化，每48小时更换消耗的培养基直到分化。
用10ng/ml hTNFα、IFNγ、LPS(含有或不含抗TNFαVNAR蛋白质)处理含有10％(v/v)HI-FBS的100μl DMEM中的极化细胞(顶面)的指定小室孔。将处理的细胞在37℃与5％(v/v)CO2下温育18小时。在与细胞因子±抗TNFαVNARs一起孵育18小时后，捕获处理细胞的相差图像，然后向Caco-2单层的顶面(小室孔)加入5μl的10mg/ml异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖，分子量(3-5kDa)。在加入FITC-葡聚糖24小时后，从Transwell小室的基底外侧收集培养基。
使用Synergy HT
Figure BDA0002426620980000681
微板读数器在485nm激发和520nm发射波长下测量荧光强度。
上皮抗性功能障碍测定
人上皮结肠直肠腺癌细胞(Caco-2)在补充了10％(v/v)热灭活FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素(分别为10,000单位/ml和10,000μg/ml)的DMEM中培养。在接种到12或24孔，0.4μm半透性组织培养Transwell小室(Corning公司)之前，细胞在T75烧瓶中生长至90％细胞覆盖。遵循先前描述的方案直到细胞实现完全分化。
用10ng/ml hTNFα和IFNγ(含或不含抗TNFαVNAR蛋白质)处理含有在200μl含10％(v/v)HI-FBS的DMEM中的极化细胞(顶面)的指定小室孔。将处理的细胞在37℃与5％(v/v)CO2和湿度下一起温育24小时。在与细胞因子±抗TNFαVNARs温育24小时后，使用
Figure BDA0002426620980000682
ERS-2上皮(伏特/欧姆)计和MERSTX01探针(Merck Millipore)在顶室中测量跨上皮电阻(TEER)。将测量的电阻值标准化为处理下的表面积。
重要的是，注意到12孔组织培养Transwell小室接种有5×106细胞/孔，其含有500μl DMEM，而外孔(基侧)含有1.5ml DMEM。同样在TEER测量期间，将小室和外孔中的DMEM体积分别增加至500μl和1.5ml，以允许伏特-欧姆计电极完全浸没在培养基中而不接触孔的底部。
B.ICOSL结合VNARS
ICOSL结合VNARS 2D4和CC3的分离和表征公开于WO2014/173975和WO2014/173959中。
2.形成多价和多特异性VNAR。
TNF结合结构域
图3表明，二价形式的D1-Fc和C4-Fc分子的组合显示中和能力增加。因此，VNAR D1和C4及其它组合被制备成二价或双特异性融合物，以证明当它们作为融合物组合在一起时，可以看到中和能力的同样提高。
二聚体和三聚体的构建
图4提供了二价和双特异性构建体形式的图
用下面列出的寡核苷酸组合，建立两个或三个独立的PCR反应以扩增N-端、中间端[在三聚体的情况下]和C-端VNAR结构域，并且每个寡核苷酸含有特异性/独特的克隆位点，和/或6x his-标签和C-myc标签，以便于分别纯化和检测。
二聚体构建PCR寡聚物：
N-端片段寡核苷酸对：
Figure BDA0002426620980000691
C-端寡核苷酸对：
Figure BDA0002426620980000701
三聚体构建PCR寡核苷酸：这里我们使用内部设计的DNA表达盒，其含有BA11基因作为中间片段，在其N-端和C-端分别有Xba1/BamH1和APA1/EcoR1克隆位点。上面列出的寡核苷酸对以及在N-端正向寡核苷酸中含有Xba1和BssH11位点的寡核苷酸可用于PCR扩增步骤，从而允许将三聚体基因亚克隆到内部真核表达载体pEEE2A中。否则所有克隆都在pET28b(+)表达载体中进行。
Xba1/BssH11-FW1 NAR_#197[三聚体表达盒]：SEQ ID 19
Figure BDA0002426620980000702
2μl VNAR DNA(50-100ng)，2μl正向和反向寡核苷酸引物(终浓度1μM)，5μl10XTaq聚合酶缓冲液，0.25μl Taq聚合酶(终浓度25U/ml)，0.5μl dNTPs(终浓度0.1mM)，和38.25μl H2O的PCR反应，终反应体积为50μl。PCR程序开始于98℃下5分钟，接着是94℃30秒、56℃30秒和72℃1分钟的30个循环。最后在72℃延伸5分钟。扩增子通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。洗脱的DNA用适当的限制性内切酶消化。
二聚体和三聚体在大肠杆菌
Figure BDA0002426620980000703
T7表达细胞中的表达
通过XbaI和EcoRI限制性酶切位点将VNAR区克隆到表达载体pET28b(+)中，并将所得的含有VNAR基因的纯化质粒转化到电感受态大肠杆菌
Figure BDA0002426620980000704
T7表达细胞[NEB]中，并在含有50μg/ml卡那霉素的TYE琼脂平板上进行选择。在30℃用IPTG诱导后，在SHuffle细胞的细胞质中表达抗hTNFα VNAR-D1、C4和B4融合蛋白。
转化的大肠杆菌
Figure BDA0002426620980000705
T7表达细胞的单菌落在5ml 2×TY-卡那霉素培养基中生长，直到在37℃、250rpm温育4-6小时之间通常达到OD600 0.4-0.6。将该对数期培养物用于接种50ml含有卡那霉素和PO4盐的TB培养基，在30℃、250rpm温育过夜，直到它们达到OD600 6.0-10.0。将细胞在4000rpm、30℃下离心15分钟，然后重悬于新鲜的TB-卡那霉素-PO4盐培养基中，并在30℃、250rpm下恢复1-2小时。使用1mM的最终IPTG浓度诱导胞质蛋白表达，诱导后细胞在30℃、200rpm温育12-16小时。通过在6000rpm、25℃离心10分钟收获细胞，并测定细胞沉淀湿重。将细胞沉淀重悬于5ml/g湿细胞糊BugBusterTM蛋白提取试剂加
Figure BDA0002426620980000711
(Novagen，UK)中，并将细胞悬浮液以10-15rpm置于振荡平台上，室温20分钟。将细胞悬浮液在6000rpm、4℃离心20分钟，收集在上清液中的可溶性蛋白准备用于使用固定化金属亲和层析(IMAC)树脂(镍-次氮基三乙酸，Ni-NTA或Ni-Sepharose)通过多组氨酸标签进行亲和纯化。用300-500mM咪唑(pH8.0)洗脱VNAR融合蛋白，洗脱液用PBS(1L PBS/1ml洗脱的蛋白)，pH7.4透析过夜，然后更换PBS继续透析3-4小时。通过SDS-PAGE评价蛋白质质量，并使用Ultraspec 6300pro UV/可见光分光光度计(Amersham Biosciences，GEHealthcare)定量。
对于真核细胞表达，克隆到BA11三聚体表达盒中的结构域用BssHII和EcoR1酶消化，并利用CMV启动子亚克隆到pEEE2A真核表达载体中，并转化到用于质粒繁殖的大肠杆菌菌株中。分离和纯化的含有VNAR三聚体基因的质粒载体与线性聚乙烯亚胺[PEI]在室温下共培育20分钟。质粒DNA的混合物：将PEI转移至含有HEK293细胞的细胞培养瓶中，细胞生长密度为90％细胞覆盖。转染的HEK293细胞在37℃，5％v/v CO2下孵育5-7天。收获细胞培养上清液，使用IMAC树脂纯化表达的蛋白，并用PBS透析。
结合和TNF中和数据
图5显示了二聚体和双特异性构建体与TNFα的ELISA结合。
最初的ELISA数据表明，与TNF30纳米抗体二聚体构建体相比，双特异性D1-C4构建体具有增加的亲合力(组合的结合亲和力)。
随后在表面等离子体共振中测定这些中的一些与固定的TNF的结合。
表1表明，在所测量的二聚体分子中，D1-C4双特异性分子与TNF30二价纳米抗体构建体相比显示优越的结合亲和力(亲合力)。
图6显示了与二价TNF纳米抗体相比，多个二价或双特异性VNAR融合物的TNF中和数据。当在L929测定中测试结合分子的TNF中和时，D1-C4二聚体等同于或优于TNF30纳米抗体二聚体构建体。在本实验中，D1-D1二聚体次于D1-B4二聚体。
表1显示了所测试三聚体构建体的SPR结合数据。这表明引入作为TNFα结合结构域之间间隔区的额外结构域似乎显着改善了分子对TNFα的相对亲和力(亲合力)。
当在TNFα中和测定中测量时，D1-BA11-C4三聚体构建体等同于阿达木单抗并且优于TNF30纳米抗体构建体。在该试验中，包含D1结构域的二价分子在效力上与TNF30纳米抗体构建体相当。
图7显示了测量各种VNAR形式中和TNFα功能的能力的实验结果。
表2总结了中和数据。当间隔结构域包括D1-BA11-D1和D1-BA11-C4两者时，显示中和能力的十倍或更好的改善，D1-BA11-C4显示与阿达木单抗和MAB210大约相等的效力。TNF30-BA11-TNF30也显示出比TNF30-TNF30二聚体形式更好的效果，但效果不明显。D1-C4构建体(SEQ ID NO27&28)的GlySer接头长度从(Gly4Ser)2延伸到(Gly4Ser)3，结果是hTNF-α中和效力得到提高。
这些实验的数据示于表2中。进一步的比较数据在表3中给出。
表2：使用0.3ng/ml(LD80)hTNF-α的TNF中和数据(除非另有说明)
Figure BDA0002426620980000721
Figure BDA0002426620980000731
A.本发明的发明人获得的结合(B)和中和(N)数据
Figure BDA0002426620980000732
说明：+++表示强结合/中和活性，++表示中等；+非常弱的活性和-表示没有观察到结合/中和活性。
B.文献中报道的临床可用的抗hTNF-α生物制剂的交叉反应性数据[Cimzia的评估报告，欧洲药品局(2009)，Doc.Ref.:EMEA/664021/2009；Simponi的评估报告，欧洲药品局(2009)。Doc Ref.:EMEA/446762/2009；Enbrel的评价报告，欧洲药品局(2008)。工序号EMEA/H/C/262/11/94；关于Remicade的科学讨论，欧洲药品局(2005)(http:// www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Scientific_Discussion/ human/000240/WC500050885.pdf)最后在2017年9月21日评估；关于Humira的科学讨论，欧洲药品局(2004)(http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_ Scientific_Discu ssion/human/000481/WC500050867.pdf)最后在2017年9月21日评估]
表3：与市售的抗-hTNF-α单克隆抗体和临床前VHH TNF30相比，抗-hTNF-αVNAR前导构建体的交叉反应性特征
Figure BDA0002426620980000741
说明：+/-分别表示是否结合/中和。
功能活性
背景技术
人上皮结直肠腺癌细胞(Caco-2)在合适的平台(例如，塑料盘、硝酸纤维素滤膜)上生长时，会发展正常肠细胞的形态学特征。更多的胶原包被的聚碳酸酯或聚酯膜已经被证明适于Caco-2单层作为肠上皮转运模型系统(Wang,F.,et al.Am.J.Path.166.2(2005):409-419.；Hidalgo,I.J.,et al Gastroenterology 1989.96:736-49.)。
上皮膜的主要功能是维持对亲水性溶质如菊粉和葡聚糖的屏障。该屏障在某些涉及肠上皮的疾病中受损，所述疾病包括但不限于感染性、免疫介导的和自发性疾病(Clayburgh,D.R.,et al Lab Invest.2004.84(3):282-291；Wang,F.,etal.Am.J.Path.2005.166(2):409-419)。肠屏障功能障碍，以细胞旁渗透性增加和肠上皮电阻降低进行表征，与炎性肠病(IBD)密切相关，例如克罗恩病(Irvine E.J.和MarshallJ.K.,Gastroenterology 2000.119.6:1740-1744.；Wyatt et al.,The Lancet1993.341(8858):1437-1439.)。还有证据支持IBD中上皮紧密连接蛋白的减少，从而导致渗漏性腹泻的溶质损失(Schulzke J.D.et al.,Ann N Y Acad Sci.20091165:294-300；Schmitz H.etal.,J.Cell Sci 1999.112(1):137-146)。最后，干扰素-γ(IFN-γ)、TNFα和脂多糖(LPS)已经显示出在人上皮细胞系中协同诱导肠上皮屏障功能障碍(Wang et al.,J.CellScience 1999.112(1):137-146；Schuerer-Maly C.C et al.,Immunology 1994.81(1):85)。
抗TNFα治疗已显示能够修复克罗恩氏病中肠屏障功能障碍(Suenaert P.et al.,Am J Gastroenterol 2002.97(8):2000-2004)，因此我们检查了我们的抗TNF VNAR结构域以证明这些结构域将修复体外诱导的这些功能障碍。我们猜想，当与VNAR单体比较时，双特异性/多价VNAR结构域在预防这些功能障碍方面将更有效。
FITC-葡聚糖跨Caco-2细胞极化单层的细胞旁路流动
人上皮结肠直肠腺癌细胞(Caco-2)在补充了10％(v/v)热灭活FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素(分别为10,000单位/ml和10,000μg/ml)的DMEM中培养。在接种于24孔，0.4μm半透性组织培养Transwell小室(Corning公司)之前，细胞在T75烧瓶中生长至90％细胞覆盖。通过将10μl细胞悬浮液悬浮在90μl的0.4％锥虫蓝排除染料(Beckman Coulter)中，并小心地将混合物转移到附有盖玻片的血球计上来确定活细胞数。
在活细胞数目测定之后，将1×105个细胞接种在100μl的最终DMEM体积中的每个Transwell小室中，同时将600μl无细胞的DMEM转移到外部容纳孔中。将转孔板在37℃与5％(v/v)CO2和湿度下一起温育，并且每48小时替换用过的DMEM+10％(v/v)FBS。在相差显微镜(40×放大率物镜)下监测细胞增殖，直到细胞达到100％细胞覆盖，通常在接种后5-7天之间。Caco-2细胞再生长21天以允许分化，每48小时更换消耗的培养基直到分化。
用10ng/ml hTNFα、IFN-γ和LPS(含有或不含抗TNFαVNAR蛋白质)处理含有在100μl含10％(v/v)HI-FBS的DMEM中的极化细胞(顶面)的指定小室孔。将处理的细胞在37℃与5％(v/v)CO2和湿度下一起温育18小时。在与细胞因子±抗TNFαVNARs一起孵育18小时后，捕获处理细胞的相差图像，然后向Caco-2单层的顶面(小室孔)加入5μl 10mg/ml异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖，分子量(3-5kDa)。在加入FITC-葡聚糖24小时后，从Transwell小室的基底外侧收集培养基。
使用Synergy HT
Figure BDA0002426620980000761
微板读数器在485nm激发和520nm发射波长下测量荧光强度。
图8显示了来自测量跨Caco-2细胞的极化单层的细胞旁路通量的实验的渗透性数据，比较了几种TNF VNAR多结构域结合分子。该实验显示，各种二价和双特异性形式显示超过单体形式的改善的功能，因为较低浓度的二聚体或三聚体递送增加水平的受攻击细胞的保护。
极化Caco-2细胞单层中的上皮电阻功能障碍测定
人上皮结肠直肠腺癌细胞(Caco-2)在补充了10％(v/v)热灭活FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素(分别为10,000单位/ml和10,000μg/ml)的DMEM中培养。在接种到12或24孔，0.4μm半透性组织培养Transwell小室(Corning公司)之前，细胞在T75烧瓶中生长至90％细胞覆盖。遵循先前在第0部分中描述的方案，直到细胞实现完全分化。
用10ng/ml hTNFα和IFN-γ(含或不含抗TNFαVNAR蛋白质)处理含有在200μl含10％(v/v)HI-FBS的DMEM中的极化细胞(顶面)的指定小室孔。将处理的细胞在37℃与5％(v/v)CO2和湿度下一起温育24小时。在与细胞因子±抗TNFαVNARs温育24小时后，使用
Figure BDA0002426620980000771
ERS-2上皮(伏特/欧姆)计和MERSTX01探针(Merck Millipore)在顶室中测量跨上皮电阻(TEER)。将测量的电阻值标准化为处理下的表面积。
重要的是，注意到12孔组织培养Transwell小室接种有5×106细胞/孔，其含有500μl DMEM，而外孔(基侧)含有1.5ml DMEM。同样在TEER测量期间，将小室和外孔中的DMEM体积分别增加至500μl和1.5ml，以允许伏特-欧姆计电极完全浸没在培养基中而不接触孔的底部。
图9显示了测定极化Caco-2细胞中上皮电阻的分析。该实验显示，各种二价和双特异性形式显示比单体形式改善的功能。
B ICOSL结合结构域
多价形式的构建和增强的功效数据。
2D4和CC3 Fc融合物
图10显示本发明的多价和多特异性VNAR的形式，其中结合了ICOSL VNAR(和人IgGFc，它提供了另外的改进的功能特征。
方法
将选择的VNAR单体结构域PCR扩增并亚克隆到真核表达载体中。该克隆在编码人IgG1 Fc的DNA片段(该人IgG1 Fc片段也编码具有5'端最多Cys残基的全长人IgG1铰链序列，所述Cys残基通常二硫键连接至突变为丝氨酸的轻链)的5'端上。
同时进行PCR扩增，用寡核苷酸导入氨基酸残基，在VNAR结构域的羧基端和人IgG1铰链区的N端残基之间插入接头序列，以及与哺乳动物载体表达系统相容的限制性内切核酸酶位点。通过这个过程引入的接头序列是GGGGSGGGGRT，由此编码下划线标示的RT氨基酸残基的核酸序列引入BsiW1限制性内切核酸酶位点，或GGGGSGGGADQ，其中下划线标示的GADQ氨基酸残基的密码子使用引入Bcl1位点。这两个位点都与Fc真核表达载体的不同版本中的克隆位点相容。在所有扩增子的5'端引入一个独特的BssHII位点，该位点与真核载体构建体相容。
设计将接头VNAR结构域融合引入Fc的羧基末端的DNA序列，并通过GeneArt(Invitrogen)合成这些中间片段。这些片段的N-端利用在人IgG1衍生的CH3区内天然存在的BsrGI位点，和在载体中的EcoR1位点。这些构建体在Fc结构域的羧基末端和VNAR结构域的氨基末端之间引入了具有氨基酸序列TAAAATAAAATAAAATAAAA的接头。在接头的下划线标示的三联丙氨酸区域的密码子使用允许引入NotI限制位点，其可以用于随后的克隆工作以装配进一步的双特异性VNAR构建体。
PEI介导的转染和在悬浮HEK293细胞中的瞬时表达后，使用无血清培养基，通过ELISA测定NAR Fc融合蛋白的表达水平。蛋白A在最初的0.2μm过滤澄清步骤以除去细胞碎片后，进行亲和层析以纯化VNAR Fc蛋白。使用离子交换或大小排阻层析，在步骤之间适当交换缓冲液，进行纯化亲和纯化蛋白的第二色谱步骤。使用Amicon超滤装置浓缩蛋白质，并通过UV光谱测定最终的蛋白质浓度。分析SEC和SDS PAGE用于测定最终纯化蛋白质的完整性。
ICOSL中和试验
如下进行配体-受体中和试验：表达人ICOS受体的CHO细胞在96孔细胞培养板(Greiner，Bio-One)中的DMEM/F12+5％FBS培养基中生长至细胞覆盖。将总共20μl的1μg/mlrmB7-H2/Fc(158-B7，R&D Systems)与40μl系列稀释的抗ICOSL-VNAR-Fc在DMEM/F12+2％FBS中预温育1小时，然后加入细胞中。在16℃温育1小时后，用DMEM/F12+2％FBS将细胞温和洗涤三次，并在16℃与在相同培养基中稀释1:10,000的山羊抗人Fc-HRP(SIGMA)温育40分钟。洗涤细胞并用TMB底物显影。
图11显示ELISA结合数据，表明ICOSL VNARS以这些形式结合其同源抗原。
图12显示本发明的多价和多特异性VNAR的形式，其结合了TNF R1结构域、ICOSLVNAR和人IgG Fc，其提供了额外的改进的功能特征。
图13显示本发明的多价和多特异性VNAR的功效数据，其结合了TNF R1结构域、ICOSL VNAR和人IgG Fc，其提供了额外的改进的功能特征。
数据显示融合物能够通过TNFR1结合TNF，并通过VNAR结构域结合mCOSL和hICOSL。该构建体能够抑制m或hICOSL与其同源CHO表达受体的结合。
这些数据证明，组合为多价形式的VNAR能够结合其靶标，并且所述分子能够显示出比单体VNAR改进的性质。
体内临床前研究
研究背景
Tg197类风湿性关节炎的鼠模型是携带和表达野生型和3'-修饰的人肿瘤坏死因子(hTNF-α)转基因的转基因小鼠系。这些转基因小鼠在4-7周龄时发生慢性多关节炎，发病率为100％，这取决于生物活性人TNF-α的过量表达(Keffer et al.1991,EMBO J.,Vol.10,pp.4025-4031)。使用Tg197小鼠模型(Shealy et al.,2002,Arthritis Research&Therapy,4(5),p.R7；Shealy et al.,2010,MAbs(Vol.2,No.4,pp.428-439).Taylor&Francis)建立第一抗TNF-α治疗性抗体，
Figure BDA0002426620980000791
和其它抗TNF-α生物制剂的治疗功效的例证。
本研究的目的是评价抗TNF-αD1-Fc-C4(Quad-XTM)与
Figure BDA0002426620980000792
在预防Tg197转基因小鼠关节炎模型的关节炎症状中的治疗功效。
方法
总共40只小鼠分别被分配到5个试验组G1-G5中(表4)。为了本研究的目的，将转基因小鼠分到由8只小鼠组成的组中，每只小鼠接受试验化合物或载体缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，PBS，pH7.4)，从第三周龄开始，关节炎形成之前，每周皮下两次，持续7周，直至第10周龄。另一组转基因小鼠(2只雄性和2只雌性)未处理的动物用作3周龄的对照小鼠用于组织病理学状态，并在第一次剂量给药前处死。
在进行第一次关节炎评分之前将小鼠分组。年龄和性别平衡的研究由8只((4♂和4♀)G1-G5组小鼠的杂合Tg197组成，这些小鼠是从断奶时同步交配的不同同窝仔汇集的。将小鼠分配到不同的实验组中的方式是在研究开始时确保不同组之间体重的均匀分布。体内关节炎评分如表5所述进行评价。
在10周龄时，处死所有动物，收集每只动物的血液(分离血清并在-80℃下储存)和两个踝关节。将所有实验动物的踝关节解剖、钙化和进一步处理以进行关节炎的组织病理学评价。根据表6中描述的组织病理学评分系统，通过显微镜检查评估脚踝组织病理学，并且在结果切片中仅包括代表性图像。
表4实验组
Figure BDA0002426620980000801
1.以盲法方式进行研究，得到上表中所述的组的随机顺序。
2.在3周龄时开始给药。
3.最后一次剂量给药后48小时处死第1-5组的所有小鼠。在研究开始时，在第一次剂量给药之前处死3周龄的对照动物。
表5体内关节炎评分的评价
Figure BDA0002426620980000811
1在一些评估的评分上增加额外的0.25表示倾向于下一个更严重的表型，即当存在来自下一个严重性等级的一个标准而不是所有标准时。例如，"1.75"是指"1.5"，具有严重的肿胀，但没有关节变形，并且在弯曲时具有一定的力量。
体内关节炎评分与组平均评分在结果部分中描绘为图。
表6用于评估踝关节中的关节炎表型的累积组织病理学标准
Figure BDA0002426620980000812
Figure BDA0002426620980000821
(参见：Pettit,A.R.,et al.,2001,The American journal of pathology,159(5),pp.1689-1699；Mould,A.W.,et al.,2003,Arthritis&Rheumatology,48(9),pp.2660-2669)
1当存在来自下一个更高得分的一些但不是全部特征时，给出一半的分数。因此，"2.5"的评分是指血管翳和纤维组织形成和病灶性软骨下骨侵蚀(评分2)，其中更多的骨侵蚀在软骨下病灶外部和周围扩散，但不是那么宽并且具有软骨破坏，以证明评分"3"是合理的。
具有组平均评分的组织病理学评分在附录的结果部分和表中描绘为柱状图。在附录中还呈现了25X放大率下的说明性组织病理学图像。
结果
按照预防性施用方案，即当小鼠表现出体内关节炎病理和早期组织病理学损伤的轻微证据时，在小鼠第3周龄开始治疗，进行抗hTNF-αD1-Fc-C4(Quad-XTM)和
Figure BDA0002426620980000822
对Tg197关节炎模型的功效评价。到10周龄时，与3周龄的未处理动物相比，在载体处理的对照组G1中的体内关节炎评分显著增加，而在相同年龄时，在G1动物中观察到的组织病理学损伤在统计学上比在3周对照小鼠组中观察到的更严重。
Figure BDA0002426620980000823
测试对象D1-Fc-C4抗hTNFα在体内和组织病理学以及体重关节炎症状中的治疗效果的功效评价
·与载体处理的G1小鼠相比，3、10和30mg/kg剂量方案的D1-Fc-C4测试对象提供了统计学上显著的Tg197体内和组织病理学关节炎病理的稳固抑制。更具体地，在7周的时期内每周两次施用14个剂量后，剂量方案导致：
在3mg/kg D1-Fc-D4试验对象处理G2动物后的体内抑制率为～88且关节炎组织病理学抑制率为～86％
在10mg/kg D1-Fc-C4测试对象处理G5动物后，体内显著抑制为～88％且关节炎组织病理学评分抑制为～83％
在30mg/kg D1-Fc-C4测试对象处理G3动物后，体内显著抑制为～88％且关节炎组织病理学评分抑制为～86％
·在D1-Fc-C4测试对象处理的小鼠的平均体重曲线中观察到类似的发现，与载体处理的小鼠相比，G1小鼠在所有剂量水平中似乎增加更多的体重，尽管统计学显著性仅在3mg/kg和10mg/kg剂量方案中获得。
Figure BDA0002426620980000831
D1-Fc-C4测试对象剂量反应功效评价
·用3、10和30mg/Kg剂量的D1-Fc-D4试验对象治疗没有表现出剂量依赖性反应效果，如体内关节炎评价和体重评分以及组织病理学评价所示，其中所有剂量作用相似，并且它们的治疗效果在统计学上是无差别的。
Figure BDA0002426620980000832
Figure BDA0002426620980000833
在体内和组织病理学以及体重关节炎症状中的疗效评价
·与载体处理的小鼠相比，10mg/kg剂量方案的
Figure BDA0002426620980000834
提供了Tg197体内和组织学关节炎病理的统计学显著性稳固抑制。更具体地，在每周两次施用14个剂量持续7周的时期之后，我们观察到：
在10mg/kg
Figure BDA0002426620980000835
治疗G4动物后，体内抑制为～82％和关节炎组织病理学评分的抑制为～86％
·在
Figure BDA0002426620980000836
处理的小鼠的平均体重曲线中观察到类似的发现，在G1中，与载体处理的小鼠相比，
Figure BDA0002426620980000837
处理的小鼠似乎增加了更多的体重。
Figure BDA0002426620980000838
D1-Fc-C4测试对象和
Figure BDA0002426620980000839
之间的剂量反应比较
在10mg/kg剂量中，D1-Fc-C4测试对象和
Figure BDA00024266209800008310
之间的抑制作用的比较检测显示，它们在所有评价的参数中都是统计学上无差别的，所述参数包括体重、体内关节炎评分和组织病理学评价。
Figure BDA00024266209800008311
D1-Fc-C4测试对象和
Figure BDA00024266209800008312
对3周龄对照动物的作用的组织病理学比较
3、10和30mg/Kg D1-Fc-C4试验对象以及10mg/Kg Humira的抑制作用导致在第10周出现更低的组织病理学损伤，并与3周龄的对照未处理动物具有统计学差异。
表7组平均体重
Figure BDA0002426620980000841
1.数据表示为平均值±SEM
表8组平均体内关节炎评分
Figure BDA0002426620980000842
1.数据表示为平均值±SEM
表9组平均关节炎组织病理学评分
Figure BDA0002426620980000851
1.数据表示为平均值±SEM
此外，进行了使用靶向小鼠TNF-α的VNAR S17 Quad-XTM构建体的体外效力增强的第二个实施例。
VNAR S17是一种特异性抗小鼠TNF-α的物质，对人TNF-α没有结合活性或中和活性。VNAR S17-Fc是一种有效的小鼠TNF-α中和剂，其体外效力(ND50)约为8nM。当设计为Quad-XTM构建体(S17-Fc-S17)时，体外中和效力提高了≈40倍，达0.2nM(图30)。
此外，已证实S17 Quad-XTM和D1-C4 Quad-XTM构建体可识别不同种类的TNF-α(图31)。
讨论和结论
该研究的结果显示，参照
Figure BDA0002426620980000852
和D1-Fc-C4(Quad-XTM)和D1-BA11-C4抗hTNF-α颗粒抑制Tg197动物中观察到的关节炎表型，从而导致与载体治疗的动物相比体重增加和体内和组织病理学关节炎病理减轻。
在10mg/kg剂量下评价参考
Figure BDA0002426620980000853
的治疗效果(图29-32)，并且当与载体处理的小鼠相比时，导致体内关节炎和踝组织病理学评价的统计学显著抑制。在图33中，1mg/kg的
Figure BDA0002426620980000854
在8周时显示明显的疾病突破。在使用1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的
Figure BDA0002426620980000855
给药方案的先前Tg197小鼠模型研究中，显示在用1mg/kg(图33)或3mg/kg
Figure BDA0002426620980000861
(图35)处理的小鼠组中存在显著的疾病突破。这些组小鼠具有与未处理组相似的时间依赖性疾病进展，并且体内关节炎(AS)和组织病理学评分(HS)显著高于用10mg/kg或30mg/kg
Figure BDA0002426620980000862
治疗的组(图33)。
D1-Fc-C4(Quad-XTM)试验对象未显示剂量依赖性反应，因为所有评估的剂量，即0.5、1、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg，证明了相似的和统计学上无差别的治疗效果，完全控制了疾病。此外，体内关节炎和组织病理学评价揭示3mg/kg剂量的D1-Fc-C4测试对象的治疗效果在统计学上与10mg/kg的
Figure BDA0002426620980000863
相当。在10周龄的3mg/kg D1-Fc-C4处理的小鼠中，我们也没有观察到任何疾病爆发的迹象，在8周龄的0.5和1mg/kg D1-Fc-C4的小鼠中，我们也没有观察到任何疾病爆发的迹象。
因此，我们进一步例证了D1-Fc-C4抗hTNF-α结构域在体外(L929和Caco2数据----图2、3、6至8、20、23和28)和体内(图29-35)中和TNF-α的作用方面比标准疗法更有效。我们还证明了非Fc基串联多价VNAR D1-BA11-C4的体内功效(图33和34)。
最后，我们能够揭示，如果以单独的Fc形式全身性施用，抗TNF VNAR(D1-Fc)也能够在炎性眼病的大鼠模型中控制和治疗葡萄膜炎(具有与地塞米松相似的效力)(图36)。
SEQUENCE LISTING
<110> 艾莱斯摩根公司（Elasmogen Ltd）
<120> 特异性结合分子
<130> P111682wo
<150> 62/563948
<151> 2017-09-27
<150> 62/667126
<151> 2018-05-04
<160> 96
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1 CDR3
<400> 1
Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
1 5 10
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1 CDR3
<400> 2
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn
100 105
<210> 3
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1
<400> 3
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Ala Ala Ala His His His
100 105 110
His His His Gly Ala Ala Glu Ser Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
115 120 125
<210> 4
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1
<400> 4
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgcg cttccgagtg ccaatatgga ctggcagaat atgatgtata cggaggtggc 300
actgtcgtga ctgtgaat 318
<210> 5
<211> 384
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1 WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 5
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgcg cttccgagtg ccaatatgga ctggcagaat atgatgtata cggaggtggc 300
actgtcgtga ctgtgaatgc ggccgcacat catcatcacc atcacggcgc cgcagaatca 360
aaactcatct cagaagagga tctg 384
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR C4 CDR3
<400> 6
Ser Trp Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn Ser Asp Val
1 5 10
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR C4
<400> 7
Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile
35 40 45
Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys Ser
50 55 60
Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Cys Lys Leu Ser Trp Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn Ser
85 90 95
Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn
100 105
<210> 8
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR C4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 8
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn
85 90 95
Ser Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Ala Ala Ala
100 105 110
His His His His His His Gly Ala Ala Glu Ser Lys Leu Ile Ser Glu
115 120 125
Glu Asp Leu
130
<210> 9
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR C4
<400> 9
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag caactgtggg ttgtccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacaattaac 180
gaaggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca agttaagctg gtggacccag aactggagat gctcaaattc cgatgtatac 300
ggaggtggca ctgtcgtgac tgtgaat 327
<210> 10
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1 WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 10
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag caactgtggg ttgtccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacaattaac 180
gaaggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca agttaagctg gtggacccag aactggagat gctcaaattc cgatgtatac 300
ggaggtggca ctgtcgtgac tgtgaatgcg gccgcacatc atcatcacca tcacggcgcc 360
gcagaatcaa aactcatctc agaagaggat ctg 393
<210> 11
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR B4 CDR3
<400> 11
Tyr Ile Pro Cys Ile Asp Glu Leu Val Tyr Met Ile Ser Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ser Gly Pro Ile His Asp Val
20
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR B4
<400> 12
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Ala Leu Ser
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Lys Val Tyr Ile Pro Cys Ile Asp Glu Leu Val Tyr Met
85 90 95
Ile Ser Gly Gly Thr Ser Gly Pro Ile His Asp Val Tyr Gly Gly Gly
100 105 110
Thr Val Val Thr Val Asn
115
<210> 13
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR B4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 13
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Ala Leu Ser
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Lys Val Tyr Ile Pro Cys Ile Asp Glu Leu Val Tyr Met
85 90 95
Ile Ser Gly Gly Thr Ser Gly Pro Ile His Asp Val Tyr Gly Gly Gly
100 105 110
Thr Val Val Thr Val Asn Ala Ala Ala His His His His His His Gly
115 120 125
Ala Ala Glu Ser Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
130 135 140
<210> 14
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR B4
<400> 14
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag taactgtgca ttgtccagca tgtactggta tcgcaaaaaa 120
tctggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca aggtatatat accttgcatc gatgaactgg tatatatgat cagtgggggt 300
acctctggcc cgattcatga tgtatacgga ggtggcactg tcgtgactgt gaat 354
<210> 15
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15
<400> 15
gctaggctct agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatataccat ggctcgagtg 60
gaccaaacac c 71
<210> 16
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16
<400> 16
cgcgccggat ccgccacctc cgctaccgcc acctccgcta ccgccacctc cgctaccgcc 60
acctccattc acagtcacga cagtgcc 87
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17
<400> 17
ggtggcggat ccggcgcgca ctccgctcga gtggaccaaa caccgc 46
<210> 18
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18
<400> 18
gtccggaatt ctcacagatc ctcttctgag atgagttttt gttctgcggc ccc 53
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19
<400> 19
aattcccctc tagaaggcgc gcactccgct cgagtggacc aaacaccg 48
<210> 20
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR B4 WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 20
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag taactgtgca ttgtccagca tgtactggta tcgcaaaaaa 120
tctggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca aggtatatat accttgcatc gatgaactgg tatatatgat cagtgggggt 300
acctctggcc cgattcatga tgtatacgga ggtggcactg tcgtgactgt gaatgcggcc 360
gcacatcatc atcaccatca cggcgccgca gaatcaaaac tcatctcaga agaggatctg 420
<210> 21
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER D1-D1 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 21
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro
115 120 125
Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val
130 135 140
Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr
165 170 175
Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn
180 185 190
Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys
195 200 205
Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val
210 215 220
Thr Val Asn Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu
225 230 235 240
Ser Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
245
<210> 22
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER D1-D1 WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 22
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgcg cttccgagtg ccaatatgga ctggcagaat atgatgtata cggaggtggc 300
actgtcgtga ctgtgaatgg aggtggcggt agcggaggtg gtggcggatc cggcgcgcac 360
tccgctcgag tggaccaaac accgcaaaca ataacaaagg agacgggcga atcactgacc 420
atcaactgtg tcctacgaga tagccactgt gcaacctcca gcacgtactg gtatcgcaaa 480
aaatcgggct caacaaacga ggagagcata tcgaaaggtg gacgatatgt tgaaacagtt 540
aacagcggat caaagtcctt ttctttgaga attaatgatc taacagttga agacagtggc 600
acgtatcgat gcgcttccga gtgccaatat ggactggcag aatatgatgt atacggaggt 660
ggcactgtcg tgactgtgaa tgcggccgca catcatcatc accatcacgg ggccgcagaa 720
caaaaactca tctcagaaga ggatctg 747
<210> 23
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER C4-C4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 23
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn
85 90 95
Ser Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp
115 120 125
Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile
130 135 140
Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser Ser Thr Tyr Trp
145 150 155 160
Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly
165 170 175
Gly Arg Tyr Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu
180 185 190
Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys
195 200 205
Leu Ser Trp Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn Ser Asp Val Tyr
210 215 220
Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Ala Ala Ala His His His His
225 230 235 240
His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
245 250 255
<210> 24
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER C4-C4 WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 24
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag caactgtggg ttgtccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacaattaac 180
gaaggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca agttaagctg gtggacccag aactggagat gctcaaattc cgatgtatac 300
ggaggtggca ctgtcgtgac tgtgaacgga ggtggcggta gcggaggtgg tggcggatcc 360
ggcgcgcact ccgctcgagt ggaccaaaca ccgcaaacaa taacaaagga gacgggcgaa 420
tcactgacca tcaactgtgt cctacgagat agcaactgtg ggttgtccag cacgtactgg 480
tatcgcaaaa aatcgggctc aacaaacgag gagagcatat cgaaaggtgg acgatatgtt 540
gaaacaatta acgaaggatc aaagtccttt tctttgagaa ttaatgatct aacagttgaa 600
gacagtggca cgtatcgatg caagttaagc tggtggaccc agaactggag atgctcaaat 660
tccgatgtat acggaggtgg cactgtcgtg actgtgaacg cggccgcaca tcatcatcac 720
catcacgggg ccgcagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctg 765
<210> 25
<211> 273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER B4-B4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 25
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Ala Leu Ser
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Lys Val Tyr Ile Pro Cys Ile Asp Glu Leu Val Tyr Met
85 90 95
Ile Ser Gly Gly Thr Ser Gly Pro Ile His Asp Val Tyr Gly Gly Gly
100 105 110
Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr
130 135 140
Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser
145 150 155 160
Asn Cys Ala Leu Ser Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser
165 170 175
Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val
180 185 190
Asn Ser Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val
195 200 205
Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys Val Tyr Ile Pro Cys Ile Asp
210 215 220
Glu Leu Val Tyr Met Ile Ser Gly Gly Thr Ser Gly Pro Ile His Asp
225 230 235 240
Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Ala Ala Ala His His
245 250 255
His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Leu
<210> 26
<211> 819
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER B4-B4 WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 26
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag taactgtgca ttgtccagca tgtactggta tcgcaaaaaa 120
tctggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca aggtatatat accttgcatc gatgaactgg tatatatgat cagtgggggt 300
acctctggcc cgattcatga tgtatacgga ggtggcactg tcgtgactgt gaatggaggt 360
ggcggtagcg gaggtggtgg cggatccggc gcgcactccg ctcgagtgga ccaaacaccg 420
caaacaataa caaaggagac gggcgaatca ctgaccatca actgtgtcct acgagatagt 480
aactgtgcat tgtccagcat gtactggtat cgcaaaaaat ctggctcaac aaacgaggag 540
agcatatcga aaggtggacg atatgttgaa acagttaaca gcggatcaaa gtccttttct 600
ttgagaatta atgatctaac agttgaagac agtggcacgt atcgatgcaa ggtatatata 660
ccttgcatcg atgaactggt atatatgatc agtgggggta cctctggccc gattcatgat 720
gtatacggag gtggcactgt cgtgactgtg aatgcggccg cacatcatca tcaccatcac 780
ggggccgcag aacaaaaact catctcagaa gaggatctg 819
<210> 27
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER D1-C4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 27
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro
115 120 125
Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr
165 170 175
Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn
180 185 190
Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp
195 200 205
Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn Ser Asp Val Tyr Gly Gly Gly
210 215 220
Thr Val Val Thr Val Asn Ala Ala Ala His His His His His His Gly
225 230 235 240
Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
245 250
<210> 28
<211> 756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER D1-C4 WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 28
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgcg cttccgagtg ccaatatgga ctggcagaat atgatgtata cggaggtggc 300
actgtcgtga ctgtgaatgg aggtggcggt agcggaggtg gtggcggatc cggcgcgcac 360
tccgctcgag tggaccaaac accgcaaaca ataacaaagg agacgggcga atcactgacc 420
atcaactgtg tcctacgaga tagcaactgt gggttgtcca gcacgtactg gtatcgcaaa 480
aaatcgggct caacaaacga ggagagcata tcgaaaggtg gacgatatgt tgaaacaatt 540
aacgaaggat caaagtcctt ttctttgaga attaatgatc taacagttga agacagtggc 600
acgtatcgat gcaagttaag ctggtggacc cagaactgga gatgctcaaa ttccgatgta 660
tacggaggtg gcactgtcgt gactgtgaac gcggccgcac atcatcatca ccatcacggg 720
gccgcagaac aaaaactcat ctcagaagag gatctg 756
<210> 29
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER D1-B4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 29
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Pro Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro
115 120 125
Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Asn Cys Ala Leu Ser Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Lys
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr
165 170 175
Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn
180 185 190
Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys Val Tyr Ile
195 200 205
Pro Cys Ile Asp Glu Leu Val Tyr Met Ile Ser Gly Gly Thr Ser Gly
210 215 220
Pro Ile His Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Ala
225 230 235 240
Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
245 250 255
Ser Glu Glu Asp Leu
260
<210> 30
<211> 783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODIGN FOR THE TNF VNAR DIMER D1-B4
NUCLEOTIDE SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 30
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgcg cttccgagtg ccaatatgga ctggcagaat atgatgtata cggaggtggc 300
actgtcgtga ctgtgaatgg aggtggcggt agcggaggtg gtggcggatc cggcgcgcac 360
tccgctcgag tggaccaaac accgcaaaca ataacaaagg agacgggcga atcactgacc 420
atcaactgtg tcctacgaga tagtaactgt gcattgtcca gcatgtactg gtatcgcaaa 480
aaatctggct caacaaacga ggagagcata tcgaaaggtg gacgatatgt tgaaacagtt 540
aacagcggat caaagtcctt ttctttgaga attaatgatc taacagttga agacagtggc 600
acgtatcgat gcaaggtata tataccttgc atcgatgaac tggtatatat gatcagtggg 660
ggtacctctg gcccgattca tgatgtatac ggaggtggca ctgtcgtgac tgtgaatgcg 720
gccgcacatc atcatcacca tcacggggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 780
ctg 783
<210> 31
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER B4-D1 AMINO ACID SEQUENCE
<400> 31
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Ala Leu Ser
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Lys Val Tyr Ile Pro Cys Ile Asp Glu Leu Val Tyr Met
85 90 95
Ile Ser Gly Gly Thr Ser Gly Pro Ile His Asp Val Tyr Gly Gly Gly
100 105 110
Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr
130 135 140
Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Pro Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Thr Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser
165 170 175
Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val
180 185 190
Asn Ser Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val
195 200 205
Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu
210 215 220
Ala Glu Tyr Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Ala
225 230 235 240
Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
245 250 255
Ser Glu Glu Asp Leu
260
<210> 32
<211> 783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER B4-D1 NUCLEOTIDE SEQUENCE
<400> 32
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag taactgtgca ttgtccagca tgtactggta tcgcaaaaaa 120
tctggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca aggtatatat accttgcatc gatgaactgg tatatatgat cagtgggggt 300
acctctggcc cgattcatga tgtatacgga ggtggcactg tcgtgactgt gaatggaggt 360
ggcggtagcg gaggtggtgg cggatccggc gcgcactccg ctcgagtgga ccaaacaccg 420
caaacaataa caaaggagac gggcgaatca ctgaccatca actgtgtcct acgagatagc 480
cactgtgcaa cctccagcac gtactggtat cgcaaaaaat cgggctcaac aaacgaggag 540
agcatatcga aaggtggacg atatgttgaa acagttaaca gcggatcaaa gtccttttct 600
ttgagaatta atgatctaac agttgaagac agtggcacgt atcgatgcgc ttccgagtgc 660
caatatggac tggcagaata tgatgtatac ggaggtggca ctgtcgtgac tgtgaatgcg 720
gccgcacatc atcatcacca tcacggggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 780
ctg 783
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<211> 263
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER C4-B4 AMINO ACID SEQUENCE
<400> 33
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn
85 90 95
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100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp
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Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile
130 135 140
Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Ala Leu Ser Ser Met Tyr Trp
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu
180 185 190
Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys
195 200 205
Val Tyr Ile Pro Cys Ile Asp Glu Leu Val Tyr Met Ile Ser Gly Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Pro Ile His Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr
225 230 235 240
Val Asn Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln
245 250 255
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
260
<210> 34
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER C4-B4 NUCLEOTIDE SEQUENCE
<400> 34
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aactgtgtcc tacgagatag caactgtggg ttgtccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacaattaac 180
gaaggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca agttaagctg gtggacccag aactggagat gctcaaattc cgatgtatac 300
ggaggtggca ctgtcgtgac tgtgaacgga ggtggcggta gcggaggtgg tggcggatcc 360
ggcgcgcact ccgctcgagt ggaccaaaca ccgcaaacaa taacaaagga gacgggcgaa 420
tcactgacca tcaactgtgt cctacgagat agtaactgtg cattgtccag catgtactgg 480
tatcgcaaaa aatctggctc aacaaacgag gagagcatat cgaaaggtgg acgatatgtt 540
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gaagaggatc tg 792
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<211> 263
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER B4-C4 AMINO ACID SEQUENCE
<400> 35
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1 5 10 15
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Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser
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Asn Cys Gly Leu Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser
165 170 175
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180 185 190
Asn Glu Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val
195 200 205
Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp Trp Thr Gln Asn
210 215 220
Trp Arg Cys Ser Asn Ser Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr
225 230 235 240
Val Asn Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln
245 250 255
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
260
<210> 36
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR DIMER B4-C4 NUCLEOTIDE SEQUENCE
<400> 36
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag taactgtgca ttgtccagca tgtactggta tcgcaaaaaa 120
tctggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgca aggtatatat accttgcatc gatgaactgg tatatatgat cagtgggggt 300
acctctggcc cgattcatga tgtatacgga ggtggcactg tcgtgactgt gaatggaggt 360
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caaacaataa caaaggagac gggcgaatca ctgaccatca actgtgtcct acgagatagc 480
aactgtgggt tgtccagcac gtactggtat cgcaaaaaat cgggctcaac aaacgaggag 540
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gtgaacgcgg ccgcacatca tcatcaccat cacggggccg cagaacaaaa actcatctca 780
gaagaggatc tg 792
<210> 37
<211> 383
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1-BA11-C4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 37
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
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65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
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Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala
115 120 125
His Ser Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
130 135 140
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro
145 150 155 160
Leu Tyr Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys
165 170 175
Glu Gln Ile Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Ser Glu Ser Val Asn Lys Gly
180 185 190
Thr Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser
195 200 205
Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Ser Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp
210 215 220
Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His
245 250 255
Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly
260 265 270
Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu
275 280 285
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Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser
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<211> 1149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE TNF VNAR D1-BA11-C4 WITH HIS
AND MYC TAGS
<400> 38
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1-BA11-D1 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 39
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
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Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
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Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala
115 120 125
His Ser Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
130 135 140
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro
145 150 155 160
Leu Tyr Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys
165 170 175
Glu Gln Ile Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Ser Glu Ser Val Asn Lys Gly
180 185 190
Thr Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser
195 200 205
Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Ser Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp
210 215 220
Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His
245 250 255
Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly
260 265 270
Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr
275 280 285
Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu
290 295 300
Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser
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Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
<210> 40
<211> 1140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE TNF VNAR D1-BA11-D1 WITH HIS
AND MYC TAGS
<400> 40
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
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<211> 392
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF VNAR D1-BA11-B4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS AND MYC TAGS
<400> 41
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
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Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
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Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
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Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala
115 120 125
His Ser Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro
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Leu Tyr Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys
165 170 175
Glu Gln Ile Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Ser Glu Ser Val Asn Lys Gly
180 185 190
Thr Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser
195 200 205
Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Ser Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp
210 215 220
Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His
245 250 255
Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly
260 265 270
Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Ala Leu
275 280 285
Ser Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu
290 295 300
Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser
305 310 315 320
Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly
325 330 335
Thr Tyr Arg Cys Lys Val Tyr Ile Pro Cys Ile Asp Glu Leu Val Tyr
340 345 350
Met Ile Ser Gly Gly Thr Ser Gly Pro Ile His Asp Val Tyr Gly Gly
355 360 365
Gly Thr Val Val Thr Val Asn His His His His His His His Glu Gln
370 375 380
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
385 390
<210> 42
<211> 1176
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE TNF VNAR D1-BA11-B4 WITH HIS
AND MYC TAGS
<400> 42
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgcg cttccgagtg ccaatatgga ctggcagaat atgatgtata cggaggtggc 300
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agcggaggtg gcggtagtgg agctcattca acaagagtgg accaaagtcc aagctctctg 420
tccgccagtg tgggcgaccg cgtgaccatc acctgcgtcc tgactgatac cagctatcct 480
ctgtacagca catactggta tcggaagaat cccggttcca gcaacaagga gcagatttcc 540
atctccggcc gctatagtga atcagtcaac aagggcacta agtcctttac cctgacaatc 600
agttccctgc agcccgagga ctccgccacc tattactgca gagctatgag tacaaatatc 660
tggaccgggg acggagctgg taccaaggtg gagatcaagg gaggtggcgg ttccggaggt 720
ggcggtagcg gaggtggcgg tagcggaggt ggcggtagcg gggcccattc tgctcgagtg 780
gaccaaacac cgcaaacaat aacaaaggag acgggcgaat cactgaccat caactgtgtc 840
ctacgagata gtaactgtgc attgtccagc atgtactggt atcgcaaaaa atctggctca 900
acaaacgagg agagcatatc gaaaggtgga cgatatgttg aaacagttaa cagcggatca 960
aagtcctttt ctttgagaat taatgatcta acagttgaag acagtggcac gtatcgatgc 1020
aaggtatata taccttgcat cgatgaactg gtatatatga tcagtggggg tacctctggc 1080
ccgattcatg atgtatacgg aggtggcact gtcgtgactg tgaatcatca ccatcaccat 1140
caccatgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctg 1176
<210> 43
<211> 485
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ICOS VNAR 2D4-Fc-2D4 AMINO ACID SEQUENCE
<400> 43
Thr Arg Val Asp Gln Thr Pro Arg Thr Ala Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly Thr Thr Asp Trp Glu Arg
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Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val Glu Ser Val Asn Lys Gly Ala Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr
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Tyr Tyr Cys Lys Ala Phe Thr Trp Pro Trp Glu Trp Pro Asp Arg Trp
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100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly Lys Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala
355 360 365
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Arg Val Asp Gln Thr Pro Arg Thr Ala
370 375 380
Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Thr Asp
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Thr Asp Tyr Gly Leu Phe Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly
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Thr Thr Asp Trp Glu Arg Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val Glu Ser
420 425 430
Val Asn Lys Gly Ala Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr
435 440 445
Val Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Ala Phe Thr Trp Pro Trp
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Glu Trp Pro Asp Arg Trp Phe Arg Pro Trp Tyr Asp Gly Ala Gly Thr
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Val Leu Thr Val Asn
485
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<213> Artificial Sequence
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<400> 44
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ccgggtacaa ccgattggga acgtatgagc attggtggtc gttatgttga aagcgtgaat 180
aaaggtgcca aaagctttag cctgcgcatt aaagatctga ccgttgcaga tagcgcaacc 240
tattactgta aagcattcac ttggccgtgg gaatggccgg accgttggtt ccgtccgtgg 300
tatgatggtg caggcaccgt tctgaccgtt aatggcggtg gtggttctgg tggtggtgct 360
gatcaggagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgtc caccgtgccc agcacctgaa 420
ctcctgggtg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 480
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 540
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 600
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 660
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aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 780
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 840
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aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1020
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aaaccgccgc cgccgccacc 1080
gccgccgccg ccaccgccgc cgccgccacc gccgcggccg ccacacgtgt tgatcagaca 1140
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr
65 70 75 80
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly Lys Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala
355 360 365
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Arg Val Asp Gln Thr Pro Arg Thr Ala
370 375 380
Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Thr Asp
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Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly
405 410 415
Thr Thr Asp Trp Glu Arg Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val Glu Ser
420 425 430
Val Asn Lys Gly Ala Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr
435 440 445
Val Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Ala Leu Gly Trp Trp Pro
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Asn
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<213> Artificial Sequence
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tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 840
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aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1020
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gccgccgccg ccaccgccgc cgccgccacc gccgcggccg ccacacgtgt tgatcagaca 1140
ccgcgtaccg caaccaaaga aaccggtgaa agcctgacca ttaattgtgt tctgaccgat 1200
accgagtatg gtttgttctc caccagctgg tttcgtaaaa atccgggtac aaccgattgg 1260
gaacgtatga gcattggtgg tcgttatgtt gaaagcgtga ataaaggtgc caaaagcttt 1320
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aat 1443
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> ICOS VNAR CC3-Fc-2D4 AMINO ACID SEQUENCE
<400> 47
Thr Arg Val Asp Gln Thr Pro Arg Thr Ala Thr Lys Glu Thr Gly Glu
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Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Thr Asp Thr Glu Tyr Gly Leu Phe
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Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly Thr Thr Asp Trp Glu Arg
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Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr
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Gly Gly Gly Gly Arg Thr Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn
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<213> Artificial Sequence
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aat 1443
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ICOS VNAR CC3-Fc-CC3 AMINO ACID SEQUENCE
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Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly Thr Thr Asp Trp Glu Arg
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Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val Glu Ser Val Asn Lys Gly Ala Lys
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Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr
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Gly Gly Gly Gly Arg Thr Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
115 120 125
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe
130 135 140
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
145 150 155 160
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
165 170 175
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
180 185 190
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
195 200 205
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
210 215 220
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
245 250 255
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
290 295 300
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
305 310 315 320
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
325 330 335
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Thr Ala
340 345 350
Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala
355 360 365
Ala Ala Thr Arg Val Asp Gln Thr Pro Arg Thr Ala Thr Lys Glu Thr
370 375 380
Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Thr Asp Thr Glu Tyr Gly
385 390 395 400
Leu Phe Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly Thr Thr Asp Trp
405 410 415
Glu Arg Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val Glu Ser Val Asn Lys Gly
420 425 430
Ala Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala Asp Ser
435 440 445
Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Ala Leu Gly Trp Trp Pro Pro Ala Phe Pro
450 455 460
His Trp Tyr Asp Gly Ala Gly Thr Val Leu Thr Val Asn
465 470 475
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<211> 1431
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ICOS VNAR CC3-Fc-CC3
<400> 50
acacgtgttg atcagacacc gcgtaccgca accaaagaaa ccggtgaaag cctgaccatt 60
aattgtgttc tgaccgatac cgagtatggt ttgttctcca ccagctggtt tcgtaaaaat 120
ccgggtacaa ccgattggga acgtatgagc attggtggtc gttatgttga aagcgtgaat 180
aaaggtgcca aaagctttag cctgcgcatt aaagatctga ccgttgcaga tagcgcaacc 240
tattactgta aagcactggg ttggtggccg ccggctttcc cgcattggta tgatggtgca 300
ggcaccgttc tgaccgttaa tggcggtggt ggttctggtg gtggtggtcg tacggagccc 360
aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgctggggca 420
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 480
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 540
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 600
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 660
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 720
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 780
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 840
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 900
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 960
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1020
cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa accgccgccg ccgccaccgc cgccgccgcc 1080
accgccgccg ccgccaccgc cgcggccgcc acacgtgttg atcagacacc gcgtaccgca 1140
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ttgttctcca ccagctggtt tcgtaaaaat ccgggtacaa ccgattggga acgtatgagc 1260
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<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SoloMER? VNAR D1-v1 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS TAG
<400> 51
Ala Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
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Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
100 105 110
<210> 52
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE SoloMER? VNAR D1-v1 WITH HIS
TAG
<400> 52
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tccggctcca agtccttctc cctgcgcatc aacgacctga ccgtggagga ctccggcacc 240
taccgctgcg cctccgagtg ccagtacggc ctggccgagt acgacgtgta cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaagca ccaccaccac caccac 336
<210> 53
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SoloMER? VNAR D1-v2 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS TAG
<400> 53
Ala Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
100 105 110
<210> 54
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE SoloMER? VNAR D1-v2 WITH HIS
TAG
<400> 54
gcccgcgtgg accagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgaccg cgtgaccatc 60
acctgcgtgc tgcgcgactc ccactgcgcc acctcctcca cctactggta ccgcaagaag 120
tccggctcca ccaacgagga gtccatctcc aaggggggcc gctacgtgga gaccgtgaac 180
tccggctcca agtccttcac cctgaccatc tcctccctgc agcccgagga cttcgccacc 240
tactactgcg cctccgagtg ccagtacggc ctggccgagt acgacgtgta cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaagca ccaccaccac caccac 336
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<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SoloMER? VNAR D1-v3 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS TAG
<400> 55
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1 5 10 15
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20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
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<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE SoloMER? VNAR D1-v3 WITH HIS
TAG
<400> 56
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acctgcgtgc tgcgcgactc ccactgcgcc acctcctcca cctactggta ccagcagaag 120
cccggcaaga ccaacgagga gtccatctcc aaggggggcc gctacgtgga gaccgtgaac 180
tccggctcca agtccttcac cctgaccatc tcctccctgc agcccgagga cttcgccacc 240
tactactgcg cctccgagtg ccagtacggc ctggccgagt acgacgtgta cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaagca ccaccaccac caccac 336
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<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SoloMER? VNAR D1-v4 AMINO ACID SEQUENCE WITH HIS TAG
<400> 57
Ala Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Pro Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
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100 105 110
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<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE SoloMER? VNAR D1-v4 WITH HIS
TAG
<400> 58
gcccgcgtgg accagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgaccg cgtgaccatc 60
acctgcgtgc tgcgcgactc ccactgcgcc acctcctcca cctactggta ccgcaagaag 120
cccggctcca ccaacgagga gtccatctcc aaggggggcc gcttctccgg ctccggctcc 180
tccggctcca agtccttcac cctgaccatc tcctccctgc agcccgagga cttcgccacc 240
tactactgcg cctccgagtg ccagtacggc ctggccgagt acgacgtgtt cggccagggc 300
accaaggtgg agatcaagca ccaccaccac caccac 336
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Quad-X? D1-Fc-C4 AMINO ACID SEQUENCE
<400> 59
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1 5 10 15
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20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
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50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Ser Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
145 150 155 160
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
165 170 175
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180 185 190
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
210 215 220
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
245 250 255
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile
370 375 380
Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp
385 390 395 400
Ser Asn Cys Gly Leu Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly
405 410 415
Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr
420 425 430
Ile Asn Glu Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr
435 440 445
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Thr Val Asn
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE Quad-X? D1-Fc-C4
<400> 60
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
aactgtgtcc tacgagatag ccactgtgca acctccagca cgtactggta tcgcaaaaaa 120
tcgggctcaa caaacgagga gagcatatcg aaaggtggac gatatgttga aacagttaac 180
agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgcg cttccgagtg ccaatatgga ctggcagaat atgatgtata cggaggtggc 300
actgtcgtga ctgtgaatgg atccggtggt gggtccggag gaggtggctc aggagagccc 360
aaatctagcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 420
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 480
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 540
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 600
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 660
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 720
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 780
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 840
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 900
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 960
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1020
cagaagagcc tctccctgtc tccggggaaa ggaggtggcg gttccggagg tggcggtagc 1080
ggaggtggcg gtagcggagg tggcggtagc ggggcccatt ctgctcgagt ggaccaaaca 1140
ccgcaaacaa taacaaagga gacgggcgaa tcactgacca tcaactgtgt cctacgagat 1200
agcaactgtg ggttgtccag cacgtactgg tatcgcaaaa aatcgggctc aacaaacgag 1260
gagagcatat cgaaaggtgg acgatatgtt gaaacaatta acgaaggatc aaagtccttt 1320
tctttgagaa ttaatgatct aacagttgaa gacagtggca cgtatcgatg caagttaagc 1380
tggtggaccc agaactggag atgctcaaat tccgatgtat acggaggtgg cactgtcgtg 1440
actgtgaat 1449
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Quad-Y-D1C4? D1-C4-Fc AMINO ACID SEQUENCE
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Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro
115 120 125
Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr
165 170 175
Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn
180 185 190
Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp
195 200 205
Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn Ser Asp Val Tyr Gly Gly Gly
210 215 220
Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
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370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 62
<211> 1416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE Quad-Y-D1C4? AMINO ACID
SEQUENCE
<400> 62
gctcgagtgg accaaacacc gcaaacaata acaaaggaga cgggcgaatc actgaccatc 60
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tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg gggaaa 1416
<210> 63
<211> 472
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Quad-Y-C4D1? C4-D1-Fc AMINO ACID SEQUENCE
<400> 63
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn
85 90 95
Ser Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Val Asp
115 120 125
Gln Thr Pro Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile
130 135 140
Asn Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser Ser Thr Tyr Trp
145 150 155 160
Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly
165 170 175
Gly Arg Tyr Val Glu Thr Val Asn Ser Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu
180 185 190
Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Ala
195 200 205
Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val Tyr Gly Gly Gly
210 215 220
Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 64
<211> 1416
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FOR THE Quad-Y-C4D1? AMINO ACID
SEQUENCE
<400> 64
Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala
1 5 10 15
Cys Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala Ala Cys
20 25 30
Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly Ala Ala
35 40 45
Thr Cys Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly
65 70 75 80
Cys Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Thr Cys Cys
85 90 95
Ala Gly Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys
100 105 110
Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Gly Gly Cys Thr Cys
115 120 125
Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys
130 135 140
Ala Thr Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys
145 150 155 160
Gly Ala Thr Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr
165 170 175
Thr Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly
180 185 190
Thr Cys Cys Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Thr Thr Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr
210 215 220
Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Cys Gly
225 230 235 240
Thr Ala Thr Cys Gly Ala Thr Gly Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ala Ala
245 250 255
Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala
260 265 270
Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Ala Ala Thr
275 280 285
Thr Cys Cys Gly Ala Thr Gly Thr Ala Thr Ala Cys Gly Gly Ala Gly
290 295 300
Gly Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys
305 310 315 320
Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys
325 330 335
Gly Gly Thr Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly
340 345 350
Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Cys Ala
355 360 365
Cys Thr Cys Cys Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala
385 390 395 400
Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly
405 410 415
Cys Gly Ala Ala Thr Cys Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys
420 425 430
Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly
435 440 445
Ala Thr Ala Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys
450 455 460
Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly
465 470 475 480
Thr Ala Thr Cys Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Gly
485 490 495
Gly Cys Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala
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Gly Ala Gly Cys Ala Thr Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr
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Gly Gly Ala Cys Gly Ala Thr Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala
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Cys Ala Gly Thr Thr Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys
545 550 555 560
Ala Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly
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Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala
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Cys Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly
595 600 605
Cys Ala Cys Gly Thr Ala Thr Cys Gly Ala Thr Gly Cys Gly Cys Thr
610 615 620
Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Ala Ala Thr Ala Thr Gly
625 630 635 640
Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala
645 650 655
Thr Gly Thr Ala Thr Ala Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys
660 665 670
Ala Cys Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly Ala
675 680 685
Ala Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly
690 695 700
Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Ala
705 710 715 720
Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ala Gly Cys Gly
725 730 735
Ala Cys Ala Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Gly
740 745 750
Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala
755 760 765
Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly
770 775 780
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Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Ala Cys Cys Cys
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835 840 845
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Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly
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Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys
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Ala Thr Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala
930 935 940
Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly
945 950 955 960
Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys
965 970 975
Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr
980 985 990
Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly
995 1000 1005
Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Cys
1010 1015 1020
Ala Ala Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys
1025 1030 1035
Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala
1040 1045 1050
Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys
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Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys
1070 1075 1080
Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Ala Ala Gly Gly Gly
1085 1090 1095
Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala
1100 1105 1110
Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly
1115 1120 1125
Cys Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Thr
1130 1135 1140
Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys
1145 1150 1155
Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys
1160 1165 1170
Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys
1175 1180 1185
Thr Thr Cys Thr Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys
1190 1195 1200
Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly
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Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly
1220 1225 1230
Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys
1235 1240 1245
Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys Cys
1250 1255 1260
Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys
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Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys
1280 1285 1290
Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala Cys Cys
1295 1300 1305
Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Gly
1310 1315 1320
Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala Cys
1325 1330 1335
Gly Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys Cys
1340 1345 1350
Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr
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Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys
1370 1375 1380
Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys
1385 1390 1395
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly
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Ala Ala Ala
1415
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<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2D4
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CC3
<400> 66
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20 25 30
Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly Thr Thr Asp Trp Glu Arg
35 40 45
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50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Lys Ala Leu Gly Trp Trp Pro Pro Ala Phe Pro His Trp
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<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BA11
<400> 67
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20 25 30
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35 40 45
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<211> 6
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<220>
<223> TNF-alpha specific VNAR binding domain CDR1
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Ser Gly Ser Lys Ser
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha specific VNAR binding domain hyper-variable region 4
<400> 73
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<211> 46
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NARF4For2 primer
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ataatcaagc ttgcggccgc attcacagtc acggcagtgc catctc 46
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NARF1Rev primer
<400> 76
ataataagga attccatggc tcgagtggac caaacaccg 39
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<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E06
<400> 77
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Tyr Ile Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 78
Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro Leu Tyr
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys Glu Gln
35 40 45
Ile Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Ser Glu Ser Val Asn Lys Gly Thr Lys
50 55 60
Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 79
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AC9
<400> 79
Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro Leu Tyr
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys Glu Gln
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50 55 60
Ser Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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<210> 80
<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD4
<400> 80
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Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG11
<400> 81
Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
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Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AH7
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Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys Glu Gln
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Ile Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Ser Glu Ser Val Asn Lys Gly Thr Lys
50 55 60
Ser Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
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Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BB10
<400> 83
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1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro Leu Tyr
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Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys Glu Gln
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Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Phe Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
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<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BB11
<400> 84
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1 5 10 15
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Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys Glu Gln
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Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Ala Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BC3
<400> 85
Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro Leu Tyr
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Asn Asn Lys Glu Gln
35 40 45
Ile Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Ser Glu Ser Val Asn Lys Gly Thr Lys
50 55 60
Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
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<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BD12
<400> 86
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1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro Leu Tyr
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Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys Glu Gln
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Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BE4
<400> 87
Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
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Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Ser Leu Tyr
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Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys Glu Gln
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Ile Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Ser Glu Ser Val Asn Lys Gly Thr Lys
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Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Ile Trp Thr Gly Asp Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
<210> 88
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BH4
<400> 88
Thr Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Pro Leu Tyr
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Pro Gly Ser Ser Asn Lys Glu Gln
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Ile Ser Ile Ser Gly Arg Tyr Ser Glu Ser Val Asn Lys Gly Thr Lys
50 55 60
Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
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Tyr Tyr Cys Arg Ala Met Gly Thr Asn Leu Trp Thr Gly Asp Gly Ala
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Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 89
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Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser
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Tyr Arg Cys Ala Ser Glu Cys Gln Tyr Gly Leu Ala Glu Tyr Asp Val
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Tyr Gly Gly Gly Thr Val Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro
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Gln Thr Ile Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val
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Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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agcggatcaa agtccttttc tttgagaatt aatgatctaa cagttgaaga cagtggcacg 240
tatcgatgcg cttccgagtg ccaatatgga ctggcagaat atgatgtata cggaggtggc 300
actgtcgtga ctgtgaatgg aggtggcggt agcggaggtg gtggcggatc cggcggtggt 360
tccgctcgag tggaccaaac accgcaaaca ataacaaagg agacgggcga atcactgacc 420
atcaactgtg tcctacgaga tagcaactgt gggttgtcca gcacgtactg gtatcgcaaa 480
aaatcgggct caacaaacga ggagagcata tcgaaaggtg gacgatatgt tgaaacaatt 540
aacgaaggat caaagtcctt ttctttgaga attaatgatc taacagttga agacagtggc 600
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<210> 91
<211> 239
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 91
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Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
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Tyr Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Val Asp Gln Ser Pro
115 120 125
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Val
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Leu Arg Asp Ser Asn Cys Gly Leu Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys
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Lys Ser Gly Ser Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr
165 170 175
Val Glu Thr Ile Asn Glu Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn
180 185 190
Asp Leu Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp
195 200 205
Trp Thr Gln Asn Trp Arg Cys Ser Asn Ser Asp Val Tyr Gly Gly Gly
210 215 220
Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala His His His His His His
225 230 235
<210> 92
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 92
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acctgcgtgc tgcgcgactc ccactgcgcc acctcctcca cctactggta ccgcaagaag 120
tccggctcca ccaacgagga gtccatctcc aaggggggcc gctacgtgga gaccgtgaac 180
tccggctcca agtccttcac cctgaccatc tcctccctgc agcccgagga cttcgccacc 240
tactactgcg cctccgagtg ccagtacggc ctggccgagt acgacgtgta cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaaggg aggtggcggt agcggaggtg gtggcggatc cggcggtggt 360
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<210> 93
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 93
Ala Arg Val Asp Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
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Arg Val Thr Ile Thr Cys Val Leu Arg Asp Ser His Cys Ala Thr Ser
20 25 30
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145 150 155 160
Gly Leu Ser Ser Thr Tyr Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Thr Asn
165 170 175
Glu Glu Ser Ile Ser Lys Gly Gly Arg Tyr Val Glu Thr Ile Asn Glu
180 185 190
Gly Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp
195 200 205
Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Lys Leu Ser Trp Trp Thr Gln Asn Trp Arg
210 215 220
Cys Ser Asn Ser Asp Val Tyr Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
Ala Ala Ala His His His His His His
245
<210> 94
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 94
gcccgcgtgg accagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgaccg cgtgaccatc 60
acctgcgtgc tgcgcgactc ccactgcgcc acctcctcca cctactggta ccgcaagaag 120
tccggctcca ccaacgagga gtccatctcc aaggggggcc gctacgtgga gaccgtgaac 180
tccggctcca agtccttcac cctgaccatc tcctccctgc agcccgagga cttcgccacc 240
tactactgcg cctccgagtg ccagtacggc ctggccgagt acgacgtgta cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaaggg tggtggtggt agcggtggtg gcggttcagg tggcggtggt 360
tctggcggtg gcggtagtgg cggaggtggt agtgcccgcg tggaccagtc cccctcctcc 420
ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc atcacctgcg tgctgcgcga ctccaactgc 480
ggcctgtcct ccacctactg gtaccgcaag aagtccggct ccaccaacga ggagtccatc 540
tccaagggcg gccgctacgt ggagaccatc aacgagggct ccaagtcctt ctccctgcgc 600
atcaacgacc tgaccgtgga ggactccggc acctaccgct gcaagctgtc ctggtggacc 660
cagaactggc gctgctccaa ctccgacgtg tacggcggcg gcaccaaggt ggagatcaag 720
gcggccgcac atcatcatca ccatcac 747
<210> 95
<211> 484
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 95
Ala Ser Val Asn Gln Thr Pro Arg Thr Ala Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Thr Asp Thr His Ala Lys Val Phe
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly Thr Thr Asp Trp Glu Arg
35 40 45
Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val Glu Ser Val Asn Lys Gly Ala Lys
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Arg Ala Gly Gly Tyr Leu Ser Gln Pro Arg Val Tyr Trp
85 90 95
Asp Val Tyr Gly Ala Gly Thr Val Leu Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Arg Thr Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro
115 120 125
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
145 150 155 160
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
165 170 175
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
180 185 190
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val
195 200 205
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
210 215 220
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
225 230 235 240
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
245 250 255
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys
260 265 270
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn
275 280 285
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
290 295 300
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys
305 310 315 320
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
325 330 335
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Ser Val Asn Gln Thr Pro Arg
370 375 380
Thr Ala Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu
385 390 395 400
Thr Asp Thr His Ala Lys Val Phe Thr Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn
405 410 415
Pro Gly Thr Thr Asp Trp Glu Arg Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val
420 425 430
Glu Ser Val Asn Lys Gly Ala Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp
435 440 445
Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Ile Cys Arg Ala Gly Gly Tyr
450 455 460
Leu Ser Gln Pro Arg Val Tyr Trp Asp Val Tyr Gly Ala Gly Thr Val
465 470 475 480
Leu Thr Val Asn
<210> 96
<211> 1452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 96
gcaagcgtta atcagacacc gcgtaccgca accaaagaaa ccggtgaaag cctgaccatt 60
aattgtgttc tgaccgatac ccatgctaaa gttttcacta ccagctggtt tcgtaaaaat 120
ccgggtacaa ccgattggga acgtatgagc attggtggtc gttatgttga aagcgtgaat 180
aaaggtgcca aaagctttag cctgcgcatt aaagatctga ccgttgcaga tagcgcaacc 240
tatatctgtc gtgccggtgg ttacctgtct cagccgcgtg tttactggga tgtttatggt 300
gcaggcaccg ttctgaccgt taatggcggt ggtggttctg gtggtggtgg tcgtacggag 360
cctcgaggcc ccacaatcaa gccctgtcct ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg 420
ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca aagatcaagg atgtactcat gatctccctg 480
agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc 540
agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac acagctcaga cacaaaccca tagagaggat 600
tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt 660
ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc 720
atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa 780
gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa 840
gacatttacg tggagtggac caacaacggg aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa 900
ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag 960
aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 1020
cacacgacta agagcttctc ccggactccg ggtaaaggag gtggcggttc cggaggtggc 1080
ggtagcggag gtggcggtag cggaggtggc ggtagcgggg cccattctgc aagcgttaat 1140
cagacaccgc gtaccgcaac caaagaaacc ggtgaaagcc tgaccattaa ttgtgttctg 1200
accgataccc atgctaaagt tttcactacc agctggtttc gtaaaaatcc gggtacaacc 1260
gattgggaac gtatgagcat tggtggtcgt tatgttgaaa gcgtgaataa aggtgccaaa 1320
agctttagcc tgcgcattaa agatctgacc gttgcagata gcgcaaccta tatctgtcgt 1380
gccggtggtt acctgtctca gccgcgtgtt tactgggatg tttatggtgc aggcaccgtt 1440
ctgaccgtta at 1452

Claims (34)

1.一种多结构域特异性结合分子，其特征在于，该多结构域特异性结合分子包含两个或多个与一种或多种特异性抗原的相同或不同表位结合的VNAR结构域。
2.根据权利要求1所述的多结构域特异性结合分子，其中，与单体VNAR相比，多结构域特异性结合分子中的一个或多个VNAR结构域对其靶标表现出更高的结合亲和力。
3.根据权利要求1或2所述的多结构域特异性结合分子，还包含在VNAR结构域之间的间隔序列。
4.根据权利要求3所述的多结构域特异性结合分子，其中，所述间隔序列具有在所述结合分子中表现出来的独立的功能性。
5.根据权利要求4所述的多结构域特异性结合分子，其中，所述间隔序列是VNAR结构域或其功能片段。
6.根据权利要求5所述的多结构域特异性结合分子，其中，所述间隔序列是与血清白蛋白结合的VNAR或其功能片段。
7.根据权利要求6所述的多结构域特异性结合分子，其中，所述的间隔序列是与人血清白蛋白结合的VNAR或其功能片段。
8.根据权利要求7所述的多结构域特异性结合分子，其中，所述间隔序列具有包含SEQID NO：67、SEQ ID NO：67、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87或88中任一氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的功能片段。
9.根据权利要求4所述的多结构域特异性结合分子，其中，所述间隔序列源自免疫球蛋白Fc部分。
10.根据权利要求9所述的多结构域特异性结合分子，其中，所述间隔序列源自人免疫球蛋白Fc部分。
11.根据权利要求1或2所述的多结构域特异性结合分子，还包含一个或多个非VNAR结构域。
12.根据权利要求11所述的多结构域特异性结合分子，其中，所述非VNAR结构域为VNAR结构域的C-端或N-端。
13.根据权利要求11或12所述的多结构域特异性结合分子，其中，至少一个非VNAR结构域选自包括TNF R1和免疫球蛋白Fc的组中。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的多结构域特异性结合分子，其特征还在于，所述特异性抗原来自包括细胞因子、生长因子、酶、激素、细胞表面相关分子、细胞表面膜组分、细胞内分子、细胞外基质组分、基质抗原、血清蛋白、骨骼抗原、微生物抗原或来自正常免疫豁免位置的抗原的组中。
15.TNF-α特异性VNAR结合结构域，包含下列CDR和超变区(HV)：
CDR1：HCATSS或NCGLSS或NCALSS
HV2：TNEESISKG
HV4：SGSKS或EGSKS
CDR3：ECQYGLAEYDV或SWWTQNWRCSNSDV或YIPCIDELVYMISGGTSGPIHDV
或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
16.根据权利要求15所述的TNF-。特异性VNAR结合结构域，其中，所述VNAR结合结构域包含SEQ ID NO.2、7或12的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
17.根据权利要求15或16所述的TNF-α特异性VNAR结合结构域，其中，所述VNAR结构域是人源化的或去免疫的。
18.根据权利要求1所述的多结构域特异性结合分子，其中，一个或多个所述VNAR结构域具有选自包括SEQ ID NO.2、7或12的组中的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
19.根据权利要求17所述的多结构域特异性结合分子，其中，两个或多个所述VNAR结构域具有选自包括SEQ ID NO.2、7或12的组中的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
20.根据权利要求1所述的多结构域特异性结合分子，其中，一个或多个所述VNAR结构域具有选自包括SEQ ID NO.65或66的组中的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
21.根据权利要求19所述的多结构域特异性结合分子，其中，两个或多个所述VNAR结构域具有选自包括SEQ ID NO.65或66的组中的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
22.根据权利要求8所述的多结构域特异性结合分子，其中，两个或多个所述VNAR结构域具有选自包括SEQ ID NO.2、7或12的组中的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
23.根据权利要求8所述的多结构域特异性结合分子，其中，两个或多个所述VNAR结构域具有选自包括SEQ ID NO.65或66的组中的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
24.根据权利要求10所述的多结构域特异性结合分子，其中，两个或多个所述VNAR结构域具有选自包括SEQ ID NO.2、7或12的组中的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
25.根据权利要求10所述的多结构域特异性结合分子，其中，两个或多个所述VNAR结构域具有选自包括SEQ ID NO.65或66的组中的氨基酸序列，或具有至少60％序列同一性的其功能变体。
26.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其在一个或多个氨基酸序列位置处被修饰，以在施用于人时降低潜在的免疫原性。
27.一种分离的核酸，包含编码根据前述权利要求中任一项所述的结合分子的多核苷酸序列。
28.一种制备结合分子的方法，该方法包括在使宿主细胞产生结合分子的条件下培养或维持包含权利要求26所述的多核苷酸的宿主细胞，任选地还包括分离所述结合分子。
29.一种药物组合物，包含权利要求1-24中任一项所述的多结构域特异性结合分子和任选的至少一种药学上可接受的载体。
30.根据权利要求1-24中任一项所述的多结构域特异性结合分子，其用于治疗。
31.权利要求1-24中任一项所述的特异性抗原结合分子在制备用于治疗有此需要的患者的疾病的药物中的用途。
32.一种治疗需要治疗的患者的疾病的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效剂量的权利要求28所述的药物组合物。
33.一种治疗由TNFN介导的疾病的方法，该方法包括施用治疗有效量的特异性结合TNF病的权利要求28所述的组合物。
34.一种治疗至少一种ICOSL介导的疾病的方法，该方法包括施用有效量的特异性结合ICOSL的权利要求28所述的组合物。
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