EA027160B1 - Модифицированные белки и пептиды - Google Patents

Модифицированные белки и пептиды Download PDF

Info

Publication number
EA027160B1
EA027160B1 EA201490262A EA201490262A EA027160B1 EA 027160 B1 EA027160 B1 EA 027160B1 EA 201490262 A EA201490262 A EA 201490262A EA 201490262 A EA201490262 A EA 201490262A EA 027160 B1 EA027160 B1 EA 027160B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
binding
terminal
immunoglobulin
extension
Prior art date
Application number
EA201490262A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490262A1 (ru
Inventor
Клер Эшмэн
Мэри Берчлер
Рудольф М Т Де Вилдт
Клер Холланд
Алан Питер Льюис
Питер Морли
Томас Сандал
Майкл Стюард
Original Assignee
Глаксо Груп Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1121236.2A external-priority patent/GB201121236D0/en
Priority claimed from GBGB1121233.9A external-priority patent/GB201121233D0/en
Priority claimed from GBGB1121226.3A external-priority patent/GB201121226D0/en
Priority claimed from PCT/EP2012/064632 external-priority patent/WO2013014208A2/en
Application filed by Глаксо Груп Лимитед filed Critical Глаксо Груп Лимитед
Publication of EA201490262A1 publication Critical patent/EA201490262A1/ru
Publication of EA027160B1 publication Critical patent/EA027160B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к модифицированным белкам и пептидам, которые обладают уменьшенной способностью к связыванию с предсуществующими антителами. Такие модифицированные белковые/пептидные молекулы могут содержать C-концевые присоединения, удлинения или метки и/или некоторые аминокислотные замены. Такие модифицированные молекулы (например, слияния и конъюгаты) включают белки, пептиды, антигенсвязывающие молекулы, антитела или фрагменты антител, такие как единичные вариабельные домены, например единичные вариабельные домены человеческих иммуноглобулинов (антител) и также единичные вариабельные домены, полученные из нечеловеческих источников, таких как лама или верблюд, например V, включая nanobody™. Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям, содержащим такие модифицированные молекулы, имеющие удлинения на С-конце и/или аминокислотные замены, и также к способам получения и экспрессии этих молекул.

Description

Изобретение относится к модифицированным белкам и пептидам, которые обладают уменьшенной способностью к связыванию с предсуществующими антителами. Такие модифицированные белковые/пептидные молекулы могут содержать С-концевые присоединения, удлинения или метки и/или некоторые аминокислотные замены. Такие модифицированные молекулы (например, слияния и конъюгаты) включают белки, пептиды, антигенсвязывающие молекулы, антитела или фрагменты антител, такие как единичные вариабельные домены, например единичные вариабельные домены человеческих иммуноглобулинов (антител) и также единичные
027160 В1 вариабельные домены, полученные из нечеловеческих источников, таких как лама или верблюд, например Унн, включая иаиоЪойу™. Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям, содержащим такие модифицированные молекулы, имеющие удлинения на С-конце и/или аминокислотные замены, и также к способам получения и экспрессии этих молекул.
027160 Β1
027160 Β1
Настоящее изобретение относится к модифицированным белкам и пептидам, обладающим уменьшенной способностью к связыванию с предсуществующими антителами. Такие модифицированные белковые/пептидные молекулы могут содержать С-концевые присоединения, удлинения или метки и/или некоторые аминокислотные замены. Такие модифицированные белковые/пептидные молекулы (включающие слитые молекулы и их конъюгаты) могут содержать антигенсвязывающие молекулы, такие как антитела, фрагменты антител и единичные вариабельные домены, например единичные вариабельные домены человеческого иммуноглобулина (антитело), и также единичные вариабельные домены, полученные из не-человеческих источников, таких как лама или верблюд, например Унн, включая ЫаиоЪобу™ (например, описанные среди прочего в \УО 94/04678 и \УО 95/04079). Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям, содержащим такие модифицированные молекулы с С-концевыми удлинениями и/или аминокислотными заменами, и также к способам получения и экспрессии этих молекул.
Предшествующий уровень техники
У людей существуют встречающиеся в природе аутоантитела, которые могут связываться с белками, например с хозяйскими иммуноглобулинами или фрагментами иммуноглобулинов, например ревматоидный фактор (который связывает эпитопы в Ре-области антител), антиидиотипические аутоантитела (которые связываются с вариабельными/СЭК (определяющими комплементарность) областями антитела) и аутоантитела против шарнира (которые связываются с шарнирной областью константного домена 1д в фрагментах РаЪ).
Эти аутоантитела могут представлять собой часть поликлонального репертуара аутоантител против иммуноглобулинов (1д) со специфичностью к эпитопам на всем протяжении молекулы 1д, которые представлены как у людей, так и у приматов, отличающихся от людей. В дополнение к аутоантителам против 1§С, которые связываются с эпитопами в интактном домене Рс (т.е. ревматоидным факторам (КР)), также рассмотрено присутствие антиидиотипических аутоантител, которые связываются с вариабельными областями СЭР в 1§С, и антителами против шарнира, которые вступают в реакцию с критическими эпитопами в С-концевых шарнирных областях во фрагментах РаЪ или Р(аЪ)2. Функциональная роль этих различных аутоантител против 1§С остается неясной. Ревматоидный фактор и аутоантитела против шарнира связаны с некоторыми патологическими состояниями, такими как аутоиммунитет и некоторые инфекции, тогда как антиидиотипические антитела могут обеспечивать защиту против аутоантител при некоторых аутоиммунных заболеваниях. Кроме того, выдвинуто предположение об иммунорегуляторной роли аутоантител против 1§С, где эти аутоантитела контролируют стимуляцию аутореактивных В-клеток и регулируют иммунные ответы на чужеродные антигены. Антитела против шарнира представляют собой аутоантитела против 1§С, которые взаимодействуют с расщепленным, но не интактным 1§С. Их преобладание в нормальной человеческой популяции связано с предшествующим контактом с фрагментами 1§С, возможно в результате расщепления 1§С бактериальными или эндогенными протеазами.
Наряду со связыванием с эндогенными белками (присутствующими у интактных субъектов), аутоантитела также могут связываться с белками или пептидами, которые вводят субъекту для лечения. Предсуществующие антитела, которые связываются с молекулами, такими как терапевтические белки и пептиды, введенные субъекту, могут влиять на их эффективность и могут приводить в результате к реакциям на введение, гиперчувствительности, измененному клиническому ответу у подвергнутых лечению пациентов, а также измененной биодоступности путем удерживания, устранения или нейтрализации молекулы. Тем не менее, в некоторых случаях существование этих антител может быть менее значимым во время лечения лекарственным средством, чем в других случаях.
Терапевтические связывающиеся с белками аутоантитела и антитела, которые заново образуются в ответ на лечение лекарственным средством (такое как введение терапевтического белка или пептида) обобщенно называют антителами против лекарственного средства (ΑΌΑ). Когда в данном документе описаны ΑΌΑ, тогда авторы изобретения, если специально не указано иное, ссылаются на предсуществующие ΑΌΑ.
Ун и Уь доменные антитела получены из полностью человеческих каркасных последовательностей, и, хотя в предсказаниях путем компьютерного моделирования описывается очевидно низкая частота потенциально иммуногенных пептидов, возможно, что эти доменные антитела могут оказаться иммуногенными у людей т.е. они могут приводить в высвобождению ΑΌΑ, и они могут связываться с предсуществующими ΑΌΑ в зависимости как от зависящих от последовательности, так и от не зависящих от последовательности факторов.
Аналогично, множество единичных άΑЪ (доменных антител (единичных вариабельных доменов иммуноглобулина)), происходящих из тяжелой цепи антитела камелид (СатеМ; представителей семейства верблюдовых) (Унн), исследуются в клинике, и ,хотя не сообщали ни о гиперчувствительности, ни о других опосредованных иммунной системой нежелательных явлениях, сохраняется возможность связывания с предсуществующими ΑΌΑ.
Таким образом, благоприятно предложить молекулы для терапии, которые содержат белки или пептиды, например антигенсвязывающие молекулы, которые обладают уменьшенной способностью к связыванию с предсуществующими ΑΌΑ после введения субъекту, в частности субъекту-человеку.
- 1 027160
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы изобретения продемонстрировали, как здесь описано, что в сыворотке крови некоторых здоровых интактных субъектов-людей присутствуют предсуществующие аутоантитела против Ун, которые могут связываться как с Ун доменными антителами, так и с молекулами Унн, а также аутоантителами против Уъ (например, У каппа (УК)), которые могут связываться с молекулами Уъ. Предсуществующие АО А, которые связываются с Ун 6АЬ. похожи на антитела против шарнира тем, что они связываются с фрагментами 1§О, но не теми же самыми последовательностями, обнаруженными ίη δίΐιι на интактных 1§О.
Разработан и валидирован описанный здесь специфический иммуноанализ для обнаружения антител против лекарственных средств к Ун 6АЬ Ό0Μ 1н-131-206 (аминокислотная последовательность представлена в 8ЕО ГО N0: 1) у людей. Панель из 60 образцов сыворотки крови здоровых доноровлюдей отбирали в отношении базовой реактивности в анализе. Определили, что приблизительно в 45% образцов сыворотки крови, отобранных у этих субъектов, были обнаруживаемые антитела, которые обладали способностью к связыванию с Ό0Μ Ш-131-206. Указанная реактивность, по-видимому, является специфичной к неоэпитопу или эпитопам в каркасной последовательности Ун 6АЬ, поскольку ответ был перекрестно-реактивным с каркасными областями Ун в 6АЬ, связывающимися с различными антигенами-мишенями, но не с полноразмерным человеческим 1§О. Предсуществующие ΑΌΑ к Уъ 6АЬ также обнаружены в образцах сыворотки крови здоровых доноров-людей, но в меньшей степени чем к Ун.
Учитывая подход с мутагенезом, авторы изобретения определили то, могут ли модификации каркасной области Ун уменьшить связывание с этими предсуществующими ΑΌΑ. С использованием указанного подхода авторы изобретения картировали эпитоп на С-конце каркасной области Ун 6АЬ, и авторы изобретения привели примеры множества подходов, которые могут быть использованы для уменьшения или устранения связывания предсуществующих антител с молекулами Уъ, Ун и Унн. В частности, авторы изобретения продемонстрировали, что модификации, которые изменяют трехмерную конформацию С-конца 6АЬ, в частности С-концевого остатка серина (т.е. в положении КаЬа! 113) в Ун и Унн 6АЬ, являются важными. Кроме того, трехмерная конформация С-конца 6АЬ может быть изменена путем добавления дополнительных аминокислотных остатков (удлинение С-конца) и/или путем замены аминокислотных остатков, представленных в одном или более чем одном положении из 14, 41, 108, 110 и 112 в Ун бАЬ.
Таким образом, в настоящем изобретении предложены модифицированные молекулы, которые обладают уменьшенной способностью к связыванию с (предсуществующими) ΑΌΑ по сравнению с немодифицированной молекулой и подходят для введения субъекту, например субъекту-человеку, для терапии или профилактики. Под уменьшенной способностью к связыванию понимают, что молекула связывается с уменьшенной аффинностью или уменьшенной авидностью с предсуществующими ΑΌΑ. Такие молекулы включают белки или пептиды, например антигенсвязывающие белки, например антитела, фрагменты антител и единичные вариабельные домены, например единичные вариабельные домены (Ун или Уъ) человеческого иммуноглобулина (антитело), и также единичные вариабельные домены, полученные из не-человеческих источников, таких как лама или верблюд, например Унн антитела камелид, включая №поЬобу™ (описано, среди прочих, например в АО 94/04678 и АО 95/04079). Указанные молекулы содержат одну или более чем одну модификацию, выбранную из (а) С-концевого добавления, удлинения, делеции или метки и/или (б) одной или более чем одной замены аминокислот каркасной области.
Кроме того, описанные здесь модифицированные молекулы и фармацевтические композиции, содержащие эти модифицированные молекулы, могут обладать улучшенным профилем безопасности и меньшими побочными эффектами, чем немодифицированные молекулы, например немодифицированные 6АЬ, которые не содержат С-концевого удлинения, добавления, делеции или метки, и/или другой модификации каркасной области, для уменьшения связывания с предсуществующими АОА. Аналогично, введение описанных здесь модифицированных молекул или фармацевтических композиций, содержащих эти модифицированные молекулы (которые обладают уменьшенной способностью к связыванию с предсуществующими АОА), может привести к модифицированной иммуногенности и может также привести в результате к улучшенной эффективности и улучшенному профилю безопасности и, например, может быть благоприятно использовано для повторного дозирования пациентам, у которых могут возникать аутоантитела против немодифицированных молекул, например бАЬ.
Таким образом, в первом аспекте изобретения предложен: единичный вариабельный домен иммуноглобулина (6АЬ), который содержит одну или более чем одну модификацию, выбранную из (а) С-концевого удлинения, которое включает аминокислотное удлинение от 1 до 5 аминокислот; или (б) одну или более чем одну замену аминокислот каркасной области, где по меньшей мере одна замена представляет собой замену, выбранную из: замены Р14А, замены Р41А и замены Ь108А.
В одном из воплощений предложено удлинение С-конца от одной до 4 аминокислот. В еще одном воплощении указанное удлинение С-конца включает аминокислоту, которая представляет собой аланин, и которая обладает уменьшенным связыванием с предсуществующими ΑΌΑ по сравнению с немодифицированным единичным вариабельным доменом иммуноглобулина (бАЬ).
- 2 027160
В еще одном аспекте С-концевое удлинение может представлять собой удлинение на 1-15 аминокислот, например от 1 до 8 аминокислот, или 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 аминокислот. В частности, удлинение на 1-8 аминокислот, или 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 аминокислот, которое содержит остаток аланина, например удлинение на один аланин, или удлинение А8, Л8Т, Л8ТК, Л8ТКС, Л8ТКСР. В частности предложено удлинение на 1-5 аминокислот или удлинение на 1-4 аминокислот. Модифицированный единичный вариабельный домен иммуноглобулина также может включать делецию аминокислоты. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (6АЬ) может быть выбран из человеческого νΗ или человеческого V 6ЛЬ или νΗΗ камелид. Удлинение С-конца может быть представлено в виде прямого слияния или конъюгата с С-концом 6ЛЬ.
В еще одном аспекте изобретения предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина (6ЛЬ), где:
(1) указанный 6ЛЬ представляет собой человеческий νΗ или νΗΗ камелид, и указанное С-концевое удлинение включает аминокислотное удлинение, выбранное из (а) А, (б) А8, (в) А8Т, (г) А8ТК, (д) А8ТКС, (е) ААА или (ж) Т; и (2) указанный 6АЬ представляет собой человеческий ν2 (такой как V каппа) и указанное С-концевое удлинение включает аминокислотное удлинение, выбранное из (а) ААА, (б) А, (в) Εν, (г) Т.
В изобретении также предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина (САЬ), моновалентно связывающийся с антигеном-мишенью, содержащий:
а) три определяющие комплементарность (СОК) области, специфичные в отношении указанного антигена-мишени; так, что указанный 6АЬ связывается с указанным антигеном с Кс в диапазоне от 5 мкмоль до 1 пмоль
б) четыре каркасные (Р^) области и
в) С-концевую последовательность, состоящую из последовательности νΓν8(8)ηΧ или VΕIКрК^X; и возможно
г) одну или более чем одну аминокислотную замену в положениях 14, 41, 108, 110 или 112 по сравнению с человеческой каркасной последовательностью эмбрионального типа, где η представляет собой целое число, независимо выбранное из 0 или 1;
каждое из р и с| представляет собой 0 или 1, таким образом, что, когда р представляет собой 1, с| может представлять собой 0 или 1, и, таким образом, что, когда р представляет собой 0, с| также представляет собой 0;
X может присутствовать или отсутствовать, и если присутствует, то представляет собой аминокислотное удлинение на 1-8 аминокислотных остатков;
также при условии, что, если X отсутствует;
1) η представляет собой 0, и/или 6АЬ, оканчивающийся νΓν8(8)η содержит одну или более чем одну из указанных аминокислотных замен;
2) р и/или с| представляет собой 0, и/или 6АЬ, оканчивающийся VΕIКрК^X, содержит одну или более чем одну из указанных аминокислотных замен.
К[; относится к равновесной константе диссоциации. Специалисту в данной области техники понятно, что чем меньше числовое значение Кс, тем сильнее связывание.
В одном из воплощений этого аспекта указанный 6АЬ связывается с указанным антигеном с Кс в диапазоне от приблизительно 10 пМ до приблизительно 50 нМ.
В одном из воплощений этого аспекта указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина (САЬ) обладает меньшей связывающей аффинностью и/или авидностью в отошении антитела против лекарственного средства (АОА), чем эквивалентный 6АЬ, где указанный эквивалентный 6АЬ имеет ту же самую последовательность, как указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина, за исключением того, что X отсутствует, η, р и с| представляют собой 1 и аминокислотные замены отсутствуют.
В еще одном воплощении указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой домен, где указанная С-концевая последовательность состоит из последовательности νΓν88Χ.
В еще одном воплощении указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой домен, где указанная С-концевая последовательность состоит из последовательности νΕΚ^.
В еще одном воплощении указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина имеет одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из замены Р14А, замены Р41А, замены Ь108А, замены Т110А и замены 8112А.
В воплощении присутствует X и присутствует удлинение из 1-8 аминокислот или 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 аминокислот, в частности удлинение из 1-8 аминокислот, или 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 аминокислот, которое содержит остаток аланина, например удлинение на один аланин, или удлинение А8, А8Т, А8ТК, А8ТКО, А8ТКОР.
В еще одном воплощении указанный 6АЬ представляет собой νΗ, или ν2 6АЬ, или νΗΗ камелид.
В еще одном аспекте изобретения также предложена аминокислотная последовательность, которая представляет собой любую из описанных здесь последовательностей немодифицированного единичного
- 3 027160 вариабельного домена иммуноглобулина (ЙЛЬ) (например, δΕφ ГО N0: 1-6, 10-13), которую затем модифицируют для уменьшения связывания с ΛΌΆ, как здесь описано, например описанная здесь последовательность немодифицированного единичного вариабельного домена иммуноглобулина, который модифицирован таким образом, что X присутствует, и представляет собой удлинение на 1-8 аминокислот, в частности удлинение на 1-8 аминокислот, которое содержит остаток аланина, например удлинение на один аланин, или удлинение Αδ, ΑδΤ, ΑδΤΚ, ΑδΤΚΟ, ΑδΤΚΟΡ, и/или указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина имеет одну или более чем одну аминокислотную замену, где указанная одна или более чем одна аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из замены Р14А, замены Р41А, замены Ь108А, замены Т110А и замены δ112Α.
В одном из воплощений изобретения предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который представляет собой человеческий Ун или Унн камелид, и указанное С-концевое удлинение содержит аминокислотное удлинение, выбранное из (а) Αδ, (б) ΑδΤ, (в) ΑδΤΚ, (г) ΑδΤΚΟ, (д) ААА или (е) Т или (ж) ΑδΤΚΟΡ, и/или где существует делеция аминокислот в ЙЛЬ. оканчивающемся νΤνδ(δ)η, и указанная делеция представляет собой -δ делецию.
В еще одном воплощении изобретения предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который представляет собой человеческий Уъ, например У каппа, и где указанное С-концевое удлинение включает аминокислотное удлинение, выбранное из: (а) ААА, (б) А, (в) ΤΑ и (г) Т, и/или где существует делеция аминокислот в ύΑΓ оканчивающимся УЕГОГО и указанная делеция представляет собой -К делецию.
В одном из альтернативных воплощений предыдущих аспектов изобретения, когда С-концевая последовательность для Уъ άΑЬ представляет собой УЕIΚКΑΑΑ или УЕКГОГ, тогда антигенсвязывающие конструкции содержащие два ύΑΓ разделенные одноцепочечной областью Рс антитела, где каждый άΑЬ способен связываться с УЕОР (фактор роста эндотелия сосудов), исключены.
В одном из аспектов ύΑΚ модифицированные для уменьшения связывания с ΑΌΑ, как здесь описано (например, Ун, Уъ, такие как У каппа и Унн), обладают ΚΒ связывания с ΑΌΑ, составляющей 150% или более (например, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650% или более) относительно ΚΒ эквивалентной, но немодифицированной последовательности единичного вариабельного домена иммуноглобулина (άΑφ. Также в изобретении предложены ύΑΓ модифицированные как здесь описано, обладающие уменьшенным связыванием с ΑΌΑ и обладающие уменьшенным связыванием с ΑΌΑ, определенным с использованием подтверждающего анализа, описанного в примере 2, и где указанные модифицированные άΑЬ имеют средний % ингибирования сигнала, который составляет менее чем 90%, например менее чем 80%, например менее чем 70%, например менее чем 60%, например менее чем 50%, например менее чем 40%, например менее чем 30%, например менее чем 20%, например менее чем 10% по сравнению с контрольным ύΑΚ который обладает приблизительно 98-100% ингибированием сигнала, где указанный контрольный (немодифицированный) άΑЬ имеет ту же самую или похожую последовательность, но не модифицирован для уменьшения связывания с ΑΌΑ.
В настоящем изобретении также предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина (άΑφ по изобретению для применения в способе терапии, например для применения в способе предупреждения побочных эффектов. Это применение может быть особенно выгодным тогда, когда άΑЬ представляет собой антагонист мишени, например мишени, выбранной из ΤΝΡα (фактор некроза опухоли альфа), рецептора ΤΝΡ, ΤΝΡ рецептора 1 (ΤΝΡΚ1), УЕОР, ГО-1К (интерлейкин 1К), ГО-6К, ГО-4, ГО-5, ГО-13, ΌΕ'-δΙΟΝ (специфический для дендритных клеток 1СУМ-3(молекула межклеточной адгезии-3)захватывающий неинтегрин), ΑδΟΡΚ (асиалогликопротеиновый рецептор), альбумина и ΤΟΡβΚ2 (рецептор К2 трансформирующего фактора роста бета). В одном из воплощений мишень представляет собой рецептор, или, в частности, рецептор, который полимеризуется, или рецептор, который димеризуется при активации, например рецептор ΤΝΡ. В еще одном воплощении άΑЬ модифицирован, как описано здесь таким образом, что, обладая уменьшенным связыванием с ΑΌΑ, используется в схеме лечения, которая включает повторное введение доз.
В изобретении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина (άΑφ, где мишень представляет собой ΤΝΡΚ1, который представляет собой ύΑΚ выбранный из любой из следующих аминокислотных последовательностей, идентифицированных как (а) Ό0Μ Ш-131-206 άΑЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (δΕφ ΙΌ N0: 16); (б) Ό0Μ Ш-131-206 άΑЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце и мутацией в каркасной области Р14А (δΕφ ΙΌ N0: 17); (в) Ό0Μ Ш-131-206 άΑЬ с мутацией в каркасной области Р14А (δΕφ ΙΌ N0: 18); (г) Ό0Μ Ш-131-206 άΑЬ с удлинением на С-конце ΑδΤΚΟ (δΕφ ΙΌ N0: 19) и (д) Ό0Μ Ш-131-206 άΑЬ с удлинением на С-конце ΑδΤΚΟ и мутацией аминокислот в каркасной области Р14А (δΕφ ГО N0: 20). В изобретении также предложен (немодифицированный) ύΑΚ который выбран из последовательности, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична любой из аминокислотных последовательностей, идентифицированных как Ό0Μ 1н131-206 (δΕΟ ΙΌ N0: 1), Ό0Μ Ш-131-511 (δΕΟ ΙΌ N0: 2), Ό0Μ Ш-131-202 (δΕΟ ΙΌ N0: 3), и которые также содержат любые последовательности, включающие, например, любые из описанных здесь модификаций, которые уменьшают связывание с ΑΌΑ, например С-концевое удлинение на единичный ала- 4 027160 нин.
ЙАЬ по изобретению включают любую из аминокислотных последовательностей ЙЛЬ. которые описаны здесь или которые представляют собой часть описанных здесь молекул (или аминокислотную последовательность, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична такой последовательности ЙЛЬ), например любую из ЙЛЬ, описанных здесь в любом из примеров, и которая, например, содержит любую из описанных здесь модификаций для уменьшения связывания с ΆΌΆ, такую как С-концевое удлинение на аланин. Изобретение также содержит любую из описанных здесь молекул (например, в примерах), содержащих описанную выше последовательность ЙЛЬ, которая содержит любую из описанных здесь модификаций для уменьшения связывания с ΛΌΆ, где такие молекулы могут, например, представлять собой любую из УН-Ук ЙАЬ-Рс-ЙАЬ в примере 12 или любую из тЛЬйЛЬ, описанных здесь, например, в примерах.
Таким образом, в изобретении предложен ЙЛЬ против 1Ь-13, например ЙЛЬ с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична любой из аминокислотных последовательностей, идентифицированных как (а) Э0М10Н-53-567 (8ЕО ГО N0: 13) или (б) ΌΤ04-Η-033 (8ЕО ГО N0: 12); и где аминокислотная последовательность дополнительно содержит любую из описанных здесь модификаций, которые уменьшают связывание с ΛΌΆ, например С-концевое удлинение на единичный аланин.
В изобретении также предложен ЙЛЬ против ΤΝΡΚ1, например ЙЛЬ с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как Ό0Μ 1Η-574-208 (8ЕО ГО N0: 10); и которая дополнительно содержит любую из описанных здесь модификаций, которые уменьшают связывание с ΛΌΆ, например Сконцевое удлинение на единичный аланин.
В изобретении также предложено слияние ЙЛЬ против Т№ТО1-Уь, например, с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как слияние Ό0Μ 1Н-574-208-Уь (8ЕО ГО N0: 11); и которая также содержит любую из описанных здесь модификаций, которые уменьшают связывание с ΛΌΆ, например удлинение на единичный (или тройной) аланин, представленное на С-конце слитой молекулы.
В изобретении также предложено тЛЬйЛЬ, которое представляет собой тАЬ против ГО-13: ГО-4 У каппа ЙАЬ, которое также содержит любую из описанных здесь модификаций, которые уменьшают связывание с АЭА; например тАЬйАЬ могут содержат последовательность тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как тАЬ-Уь молекула тяжелой цепи '735 8Е0 ГО N0: 30; и последовательность легкой цепи, идентифицированную как последовательность легкой цепи '735 8Е0 ГО N0: 31; и которое также содержит любую из описанных здесь модификаций, которые уменьшают связывание с АГОА, например удлинение на единичный (или тройной) аланин.
В изобретении также предложено тАЬйАЬ, которое представляет собой тАЬ против ГО-13: ГО-4У каппа ЙАЬ, обозначенное тАЬ-Уь 15014, модифицированное для уменьшения связывания с АЭА, как здесь описано, где тАЬйАЬ содержит (а) последовательность тяжелая цепь-линкер-У каппа с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как 8Е0 ГО N0: 32; и (б) последовательность легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как 8Е0 ГО N0: 33.
В изобретении также предложено тАЬйАЬ, которое представляет собой тАЬ против ГО-13: ГО-4 У каппа ЙАЬ, обозначенное тАЬ-Уь 15019, модифицированное для уменьшения связывания с АЭА, как здесь описано, где тАЬйАЬ содержит (а) последовательность тяжелая цепь-линкер-У каппа с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как 8Е0 ГО N0: 34; и (б) последовательность легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как 8Е0 ГО N0: 35.
В изобретении также предложено тАЬйАЬ, которое представляет собой тАЬ против ГО-13: ГО-4 У каппа ЙАЬ, обозначенное тАЬ-Уъ 15020, модифицированное для уменьшения связывания с АЭА, как здесь описано, где тАЬйАЬ содержит (а) последовательность тяжелая цепь-линкер-У каппа с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как 8Е0 ГО N0: 36; и (б) последовательность легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как 8Е0 ГО N0: 37.
В изобретении также предложено тАЬйАЬ, которое представляет собой тАЬ против ГО-13: ГО-4 У каппа ЙАЬ, обозначенное тАЬ-Уь 15021, модифицированное для уменьшения связывания с АЭА, как здесь описано, где тАЬйАЬ содержит (а) последовательность тяжелая цепь-линкер-У каппа аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как 8Е0 ГО N0: 38; и (б) последовательность легкой цепи с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80%
- 5 027160 идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как ЗЕф ГО N0: 39.
В изобретении также предложена последовательность Унн с любой из описанных здесь модификаций для уменьшения связывания с ΛΌΆ, например Унн с аминокислотной последовательностью, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична любой из аминокислотных последовательностей, идентифицированных как ЗЕф ГО N0: 7-9.
В изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из бЛЬ по изобретению, например любая из нуклеиновых кислот, описанных здесь, например любая из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных на фиг. 9 (ЗЕф ГО N0: 21-23) или фиг. 10 (ЗЕф ГО N0: 24-29). В одном из воплощений изобретения предложена нуклеиновая кислота (ЗЕф ГО N0: 22), которая кодирует Б0М ЕИ-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце, вектор, содержащий нуклеиновую кислоту (ЗЕф ГО N0: 22), и также предложена клетка-хозяин, например клетка-хозяин Е.сой, экспрессирующая нуклеиновую кислоту (ЗЕф ГО N0: 22), или вектор, такой как Рауе011 (от Еи)тИт Бювуйй), экспрессирующий ЗЕф ГО N0: 22. Также предложен способ получения Б0М Ш-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце, при котором поддерживают клетку-хозяина, такую как Е.сой, содержащую вектор, такой как Рауе011 (или нуклеиновую кислоту), кодирующий нуклеиновую кислоту (ЗЕф ГО N0: 22), в условиях, подходящих для экспрессии удлиненного бЛЬ, таким образом, с получением полипептида.
бЛЬ по изобретению также могут быть представлены в виде слияний или конъюгатов с другими молекулами.
В других воплощениях изобретения, описанных в данном описании, вместо использования бЛЬ в слиянии по изобретению предполагается, что специалисты в данной области техники могут использовать домен, который содержит СБК из бЛЬ, который связывается со своей мишенью, и каркас которого содержит модификации, как описано здесь, для уменьшения связывания с ЛБА.
Также предложены фармацевтические композиции, содержащие бАЬ в соответствии с любым из аспектов или воплощений изобретения, например в комбинации с фармацевтически или физиологически приемлемым(и) носителем(ями), эксципиентом(ами) или разбавителем(ями).
В изобретении дополнительно предложено применение бАЬ по изобретению для терапии или медицины и применение для лечения или предупреждения заболеваний или расстройств. Например, бЛЬ против ТОТТО, обладающие уменьшенным связыванием с ЛБЛ, например Б0М Ш-131-206 бЛЬ, модифицированные, как описано здесь, для уменьшения связывания с ЛБЛ (например, имеющие аминокислотные последовательности, представленные на фиг. 8а-8е: ЗЕф ГО N0: 16-20).
В одном из аспектов изобретения предложено применение Б0М Ш-131-206 бЛЬ с С-концевым удлинением на аланин (ЗЕф ГО N0: 16) для применения в терапии или медицине или в качестве лекарственного средства, например для лечения или предупреждения воспалительного заболевания или расстройства или респираторного или легочного заболевания или расстройства, такого как острое повреждение легких (ЛЬ1) и острый респираторный дистресс-синдром (ЛКБЗ) и их осложнения.
В изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие бЛЬ по изобретению, обладающие уменьшенным связыванием с ЛБЛ, и векторы и клетки-хозяева, содержащие эти нуклеиновые кислоты. Также предложены способы получения бЛЬ по изобретению, при которых экспрессируют кодирующие векторы и нуклеиновые кислоты в клетках-хозяевах, например микробных клетках-хозяевах, таких как Е.сой.
В еще одном аспекте изобретения предложены препараты, содержащие бЛЬ по изобретению, обладающие уменьшенным связыванием с ЛБЛ, например распыляемые препараты для доставки в легкие. Также предложены распылители или ингаляторные устройства, содержащие бЛЬ по изобретению, например любое одно из бЛЬ против ТМЕК1, например, имеющие аминокислотные последовательности, представленные на фиг. 8а-8е: ЗЕф ГО N0: 16-20, например Б0М Ш-131-206 бЛЬ с С-концевым удлинением на аланин (ЗЕф ГО N0: 16).
В еще одном аспекте изобретения предложено немодифицированное Б0М Ш-131-206 бЛЬ (ЗЕф ГО N0: 1) или Б0М Ш-131-206 бЛЬ, модифицированное любым из описанных здесь путей для уменьшения связывания с ЛБЛ, например Б0М Ш-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (ЗЕф ГО N0: 16) для лечения воспалительного кожного расстройства, например псориаза.
Еще один аспект описания представляет собой способ лечения псориаза у человека, включающий стадии а) идентификации человека, страдающего от псориаза; и б) введения терапевтически эффективного количества доменного антитела (например, немодифицированного Б0М Ш-131-206 бЛЬ (ЗЕф ГО N0: 1) или Б0М Ш-131-206 бЛЬ, модифицированного любым из описанных здесь путей для уменьшения связывания с ЛБЛ, например Б0М Ш-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (ЗЕф ГО N0: 16), в псориатическую бляшку человека, страдающего от псориаза; посредством чего лечат псориаз.
Еще один аспект описания представляет собой доменное антитело для применения в лечении псориаза, а также схему введения доз для применения доменного антитела в лечении псориаза. Доменное антитело может представлять собой немодифицированное Б0М Ш-131-206 бЛЬ (ЗЕф ГО N0: 1) или Б0М 1н-131-206 бЛЬ, модифицированное любым из описанных здесь путей для уменьшения связыва- 6 027160 ния с ΆΌΆ, например Ό0Μ 1Н-131-206 бАЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (81Т) ГО N0: 16).
В еще одном аспекте изобретения также предложено инструментальное тАЬ (например, инструментальное тАЬ, описанное в примере 19 и имеющее аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 6: 8Е0 ГО N0: 14 и 15). Инструментальное тАЬ получено с использованием стандартной технологии мышиного моноклонального антитела, т.е. мышей иммунизировали ΌΟΜ 1Н-131-206 (8Е0 ГО N0: 1), образцы селезенки собирали и получали линию гибридомных клеток, где гибридомы, экспрессирующие антитело, затем клонировали и получающееся в результате антитело выделяли и секвенировали с использованием стандартных способов. Инструментальное тАЬ представляет собой антитело, которое связывается с каркасной областью УН бАЬ и, таким образом, уменьшает связывание УН бАЬ с ΛΌΛ. Таким образом, инструментальное тАЬ, по видимому, связывается с похожим эпитопом на каркасной УН с человеческим АЭА против УН. Таким образом, инструментальные тАЬ могут быть полезными, например они могут быть использованы для тестирования модифицированных бАЬ (УН, УНН) и для определения того, какие модификации бАЬ предупреждают или уменьшают связывание бАЬ с инструментальным тАЬ. Модификации УН бАЬ, которые предупреждают связывание с инструментальным тАЬ, также предупреждают или уменьшают связывание УН бАЬ с АЭА. Таким образом, в изобретении предложены любые бАЬ, которые являются модифицированными (например, при помощи любой из описанных здесь модификаций) для предупреждения или уменьшения связывания с инструментальным тАЬ. В изобретении также предложен способ применения инструментального тАЬ (например, инструментального тАЬ, описанного в примере 19, и имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в примере 19 и также на фиг. 6: 8Е0 ГО N0: 14 и 15) в анализе тестирования бАЬ, например модифицированных бАЬ (например, (УН, УНН), например любого из описанных здесь, например Т№К1 бАЬ, такого как здесь описано) и для определения, например антител, обладающих уменьшенным связыванием с АЭА. В одном из аспектов бАЬ (например, (УН, УНН)) модифицированы для уменьшения связывания с инструментальным тАЬ, как здесь описано, и имеют Кс (константа диссоциации) связывания с инструментальным тАЬ, которая составляет 150% или более (например, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650% или более) относительно К эквивалентной последовательности бАЬ, которая не модифицирована. В изобретении также предложены любые бАЬ, идентифицированные при помощи данного скринингового исследования.
В еще одном аспекте изобретения также предложено применение инструментального тАЬ (например, инструментального тАЬ, описанного в примере 19, и имеющего аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 6: 8Е0 ГО N0: 14 и 15) в способе анализа для количественной оценки того, сколько бАЬ (например, УН, УНН) присутствует в образце ткани или образце плазмы крови.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: демонстрирует частоту предсуществующих антител против лекарственных средств в сыворотке крови группы здоровых субъектов-людей.
Фиг. 2: демонстрирует аминокислотные последовательности немодифицированных бАЬ против 'ТЫЕКТ, идентифицированных как (а) (немодифицированный) Ό0Μ 1Н-131-206 (8Е0 ГО N0: 1); (Ь) (немодифицированный) Ό0Μ 1Н-131-511 (8Е0 ГО N0: 2); (с) (немодифицированный) Ό0Μ 1Н-131-202 (8Е0 ГО N0: 3); и последовательности УНН, идентифицированные как (б), которые представляют собой биспецифический формат, имеющий модуль связывания с ГО-6К, связанный посредством ОООО8ООО8 с модулем связывания с человеческим сывороточным альбумином, как описано в А0 2010/100135 (8Е0 ГО N0: 4); (е) представляет собой биспецифический формат, имеющий модуль связывания с ТИР, связанный с модулем связывания с сывороточным альбумином, в свою очередь связанным с модулем связывания с ТОТ1, с использованием ООООЗОООЗ в качестве линкера, как описано в А02010077422 (8Е0 ГО N0: 5); (ί) представляет собой бивалентный моноспецифический формат, содержащий два идентичных модуля, связанных линкером А1а-А1а-А1а, где каждый модуль представляет собой бАЬ, который может связывать домен А1 фактора фон Виллебранда, как представлено в А0 2009/115614А2 (8Е0 ГО N0: 6); (д) клон УНН2(б) представляет собой биспецифический формат, имеющий модуль связывания с ГО-6К, связанный посредством ОООО8ООО8 с модулем связывания с человеческим сывороточным альбумином, как описано в А0 2010/100135, с удлинением на аланин (8Е0 ГО N0: 7); (И) биспецифический формат, имеющий модуль связывания с ТОТ1, связанный с модулем связывания с сывороточным альбумином, в свою очередь связанным с модулем связывания с ТЫР, с использованием ОООО8ООО8 в качестве линкера, как описано в А0 2010/077422, с удлинением на аланин (8Е0 ГО N0: 8); (ί) бивалентный моноспецифический формат, содержащий два идентичных модуля, связанных линкером А1а-А1а-А1а, где каждый модуль представляет собой бАЬ, который может связываться с доменом А1 фактора фон Виллебранда, как представлено в А02009115614А2, с удлинением на аланин (ЗЕО ГО N0: 9), (ί) Ό0Μ 1Н-574-208 (ЗЕО ГО N0: 10); (к) слияние Ό0Μ 1Н-574-208 - Уъ (ЗЕО ГО N0: 11); (1) ПТ04-Н-033 (ЗЕО ГО N0: 12); (т) Пот10П-53-567 (ЗЕО ГО N0: 13).
Фиг. 3: демонстрирует модельную кристаллическую структуру Ό0Μ 1Н-131-206 с выделенными остатками, которые влияют на связывание с АЭА после мутации. Осуществляли моделирование поверхностных остатков, и получающиеся в результате мутанты отбирали в анализе АЭА в отношении связы- 7 027160 вания с предсуществующими ΛΌΆ (например, описанными в примере 2). Обнаружено, что остатки, обозначенные как 14 и С-конец, оказывают сильное влияние на связывание с ЛЭЛ после мутации, обнаружено, что остатки, обозначенные как 112, 110, 108 и 41, оказывают умеренное влияние на связывание с
ΛΏΆ после мутации, и обнаружено, что остатки, обозначенные как 13, 11, 91, 43, 44, 83 и 84, оказывают слабое влияние на связывание с ΛΏΆ после мутации.
Фиг. 4: Демонстрирует прекращение связывания с ЛЭЛ. вызванное добавлением единичного удлиняющего аминокислотного остатка аланина к клонам Унн 2(й), 2(е) и 2(ί).
Фиг. 5: демонстрирует уровни связывания с ΛΌΆ и Ун йАЬ или Уъ йАЬ или молекулами, содержащими эти йАЬ.
Фиг. 6а и 6Ь: демонстрируют аминокислотные последовательности инструментального тАЬ (М2.3010.1006), фиг. 6а демонстрирует последовательность легкой цепи (8ЕЦ ГО N0: 14); и фиг. 6Ь демонстрирует последовательность тяжелой цепи. СОК подчеркнуты на фигуре (8ЕЦ ГО N0: 15).
Фиг. 7: демонстрирует сигнал в конкурентном анализе (ось х) в присутствии образцов сыворотки крови субъектов с диапазоном сигналов предсуществующих АЭА против Ун. Сыворотка крови ряда человеческих доноров с предсуществующими айа против Ун конкурирует с тАЬ против Ун М2.3010.1006 за связывание с Ό0Μ Ш-131-206, приводя в результате к ингибированию сигнала в конкурентном анализе.
Фиг. 8: демонстрирует аминокислотные последовательности модифицированных ΤΝΕΚ1 йАЬ, идентифицированных как (а) Ό0Μ Ш-131-206 йАЬ с удлинением на единичный аланин (8ЕЦ ГО N0: 16); (Ь) Ό0Μ 1н-131-206 йАЬ с удлинением на единичный аланин и мутацией в каркасной области Р14А (8ЕЦ ГО N0: 17); (с) Ό0Μ Ш-131-206 йАЬ с мутацией в каркасной области Р14А (8ЕЦ ГО N0: 18); (й) Ό0Μ Ш-131-206 йАЬ с удлинением на С-конце А8ТКО (δΗΟ ГО N0: 19); и (е) Ό0Μ Ш-131-206 йАЬ с удлинением на С-конце А8ТК0 и мутацией Р14А в каркасной области (8ЕЦ ГО N0: 20).
Фиг. 9: демонстрирует последовательности нуклеиновых кислот Т№К1 йАЬ (а) Ό0Μ Ш-131-206 йАЬ (8ЕЦ ГО N0: 21) (Ь) Ό0Μ Ш-131-206 йАЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (8ЕЦ ГО N0: 22) (с) Ό0Μ Ш-131-206 йАЬ с С-концевым удлинением на А8ТК0 (δΗΟ ГО N0: 23).
Фиг. 10: демонстрирует нуклеиново-кислотные последовательности, кодирующие (а) последовательность Унн, имеющего аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2й (8Е0 ГО N0: 24); (Ь) последовательность Унн, имеющего аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2е (8ЕЦ ГО N0: 25); (с) последовательность Унн, имеющего аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2ί (8ЕЦ ГО N0: 26); (й) последовательность Унн, которая представляет собой биспецифический формат, имеющий модуль связывания с ГО-6К, связанный посредством ООООЗОООЗ с модулем связывания человеческого сывороточного альбумина с удлинением на единичный аланин (8ЕЦ ГО N0: 27); (е) последовательность Унн, имеющего аминокислотную последовательность, представленную на 2е, дополнительно содержащую удлинение на единичный аланин (8Е0 ГО N0: 28); (ί) последовательность Унн, имеющего аминокислотную последовательность, представленную на 2ί, также содержащей удлинение на единичный аланин (8ЕЦ ГО N0: 29).
Фиг. 11: демонстрирует аминокислотные последовательности тАЬ:Уъ йАЬ (1Ь-13тАЬ: молекулы ГО-4У каппа йАЬ): (а) тАЬ-Уь молекула '735 (1Ь-13тАЬ: ГО-4У каппа йАЬ) (8ЕЦ ГО N0: 30 и 31), (Ь) тАЬ-Уъ 150154 (8ЕЦ ГО N0: 32 и 33), (с) тАЬ-Уъ 15019 (8ЕЦ ГО N0: 34 и 35), (й) тАЬ-Уъ 15020 (8ЕЦ ГО N0: 36 и 37), (е) тАЬ-Уъ 15021 (8ЕЦ ГО N0: 38 и 39).
Фиг. 12: демонстрирует аминокислотные последовательности (а) ΌΜ830045: Ό0Μ15-26-597 йАЬ ^(линкер УЕРКЗЗОК) и С-концевой К-044-085 йАЬ ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) (δΗΟ ΙΌ N0: 40), (Ь) ΌΜ830046: ΌΜ81576 с С-концевым К-044-085 йАЬ ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) (8ЕО ΙΌ N0: 41), (с) ΌΜ830047 (содержит модифицированный С-конец): Ό0Μ15-26-597 йАЬ ^(линкер УЕРК88ЭК) и С-концевой К-044-085 йАЬ без С-концевого К ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) (8ЕЦ ΙΌ N0: 42), (й) ΌΜ830048 (содержит модифицированный С-конец): Ό0Μ15-26-597 йАЬ Щлинкер УЕРК881Ж) и С-концевой К-044-085 йАЬ + А ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) (8Е0 ΙΌ N0: 43), (е) ΌΜ830049 (содержит модифицированный С-конец): Ό0Μ15-26-597 йАЬ ^(линкер УЕРКЗЗОК) и С-концевой К-044-085 йАЬ + ААА ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) (δΗΟ ΙΌ N0: 44), (ί) ΌΜ830050 (содержит модифицированный С-конец): Ό0Μ15-26-597 йАЬ ^(линкер ΑΈΡ^δΌ^ и С-концевой К-044-085 йАЬ + Τ ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) (ЪЕО ГО N0: 45), (д) ΌΜδ30051 (содержит модифицированный С-конец): ΌΜδ1576 с С-концевым К-044-085 йАЬ без С-концевого К ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) ^ЕЦ ГО N0: 46), (Ь) ΌΜδ30052 (содержит модифицированный С-конец): ΌΜδ1576 с С-концевым К-044-085 йАЬ + Λ((Τ0Ε0δΡ)χ4) (ЪЕО ГО N0: 47), (ί) ΌΜδ30053 (содержит модифицированный С-конец): ΌΜδ1576 с С-концевым К-044-085 йАЬ + ААА ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) (ЪЕО ГО N0: 48), (|) ΌΜδ30054 (содержит модифицированный С-конец): ΌΜδ1576 с С-концевым К-044-085 йАЬ + Τ ((Τ0ΕΌδΡ)χ4) (ЪЕО ГО N0: 49).
- 8 027160
Подробное описание изобретения
Изобретение описано со ссылкой на воплощения таким путем, который дает возможность для написания ясного и четкого описания. Предполагается и понятно, что воплощения могут быть различным образом скомбинированы или разделены без отделения от изобретения.
Если не определено иное, то все использованные здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, как обычно понимается специалистами в данной области техники (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, способах гибридизации и биохимии). Используются стандартные способы для молекулярных, генетических и биохимических методов (в общем см. ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЩгу Мапиа1, 2'1 еб. (1989), Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогакгу Рге88, Со1б 8ргшд НагЬог, Ν.Υ. и Аи8иЬе1 е! а1., 5>1юг1 РгоЮсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1999), 4'1' Еб, 1оЬп АПеу & 8оп§, 1пс, которые включены в описание путем ссылки) и химических методов.
Аффинность представляет собой силу связывания одной молекулы, например антигенсвязывающего белка по изобретению, с другой молекулой, например его антигеном-мишенью, по единичному сайту связывания. Аффинность связывания антигенсвязывающего белка с его мишенью может быть определена при помощи стандартных равновесных способов (например, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЬ1§А) или радиоиммуноанализ (РТА)) или кинетических способов (например, анализ В1АСОКЕ™).
Используемый здесь термин эпитоп относится к фрагменту антигена, который создает контакт с конкретным связывающим доменом антигенсвязывающего белка, например бАЬ. Эпитоп может быть линейным или конформационным/дискретным. Конформационный или дискретный эпитоп содержит аминокислотные остатки, которые разделены другими последовательностями, т.е. не в непрерывной последовательности в первичной последовательности антигена. Хотя остатки могут быть из отличающихся областей пептидной цепи, они находятся в тесной близости в трехмерной структуре антигена. В случае мультимерных антигенов конформационный или дискретный эпитоп может включать остатки из различных пептидных цепей. Конкретные остатки, расположенные внутри эпитопа, могут быть определены при помощи программ компьютерного моделирования или при помощи трехмерных структур, полученных при помощи способов, известных в области техники, таких как рентгеноструктурная кристаллография.
Конъюгат бАЬ относится к композиции, содержащей бАЬ, с которым химически конъюгирована еще одна молекула при помощи ковалентной или нековалентной связи, предпочтительно ковалентной связи. Такая ковалентная связь может осуществляться через пептидную связь или другими способами, такими как через модифицированную боковую цепь. Нековалентное связывание может быть прямым (например, электростатическое взаимодействие, гидрофобное взаимодействие) или опосредованным (например, путем нековалентного связывания комплементарно связывающихся партнеров (например, биотин и авидин), где один партнер ковалентно связан с лекарственным средством, а комплементарно связывающийся партнер ковалентно связан с бАЬ™). Когда используют комплементарно связывающиеся партнеры, тогда один из связывающихся партнеров может быть ковалентно связан с лекарственным средством прямо или посредством подходящей линкерной группировки, а комплементарно связывающийся партнер может быть ковалентно связан с бАЬ™ прямо или посредством подходящей линкерной группировки.
Использованный здесь термин слияние бАЬ относится к слитому белку, который содержит бАЬ и полипептидное лекарственное средство. бАЬ и полипептидное лекарственное средство представлены в виде отдельных частей (группировок) единичной непрерывной полипептидной цепи.
Используемый здесь термин фрагмент, будучи использованным в отношении полипептида, представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является такой же как часть, но не вся аминокислотная последовательность полноразмерного природного полипептида. Фрагменты могут быть свободными или включены в состав более крупного полипептида, в котором они образуют часть или область в виде единичной непрерывной области в единичном более крупном полипептиде.
Использованный здесь термин тАЬбАЬ относится к моноклональному антителу, связанному с еще одним связывающим доменом, в частности единичным вариабельным доменом, таким как доменное антитело. тАЬбАЬ имеет по меньшей мере два антигенсвязывающих сайта, по меньшей мере один из которых происходит из доменного антитела, и по меньшей мере один происходит из парного домена УН/УЬ. Такие тАЬбАЬ описаны, например в АО 2009/068649.
Использованный здесь термин пептид относится приблизительно к 2-50 аминокислотам, связанным вместе при помощи пептидных связей. Использованные здесь термины полипептид или белок относятся по меньшей мере приблизительно к 50 аминокислотам, связанным вместе при помощи пептидных связей. Полипептиды и белки, как правило, имеют третичную структуру и сложены в функциональные домены.
Использованный здесь термин одноцепочечная область Рс антитела относится к области Рс единичной тяжелой цепи антитела 1дС. такой как 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1§О4 или 1§С4РЕ, или антитела 1дА. Область Рс единичной тяжелой цепи может содержать один или более чем один из доменов СН1, СН2 и СН3 константной области антитела, например все три домена константной области антитела или только
- 9 027160 домены СН2 и СН3. Дополнительно к тому, что область Рс единичной тяжелой цепи содержит один или более чем один из доменов СН1, СН2 и СН3 константной области антитела, она может дополнительно содержать шарнирную область антитела (такая область обычно находится между доменами СН1 и СН2).
Использованный здесь термин функциональный описывает полипептид или пептид, обладающий биологической активностью, такой как специфическая связывающая активность. Например, термин функциональный полипептид включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с антигеном-мишенью посредством своего антигенсвязывающего сайта.
Использованный здесь термин лиганд-мишень относится к лиганду, который специфически или избирательно связывается с полипептидом или пептидом. Например, когда полипептид представляет собой антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или единичный вариабельный домен иммуноглобулина, тогда лиганд-мишень может представлять собой любой желаемый антиген или эпитоп. Связывание с антигеном-мишенью зависит от функционального полипептида или пептида.
Использованный здесь термин антитело относится к 1§О, Ι§Μ, 1§Л, Ι§ϋ или 1дЕ или фрагменту (такому как РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν, связанный дисульфидной связью Ρν, ксРу, имеющее закрытую конформацию мультиспецифическое антитело, связанный дисульфидными связями 5сΡν, диатело), полученному у любых видов, продуцирующих в естественных условиях антитело, или полученному способами рекомбинантной ДНК; выделенному из сыворотки крови, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
Фраза единичный вариабельный домен иммуноглобулина относится к вариабельному домену антитела (νΗ, νΗΗ, Уь), который специфически связывается с антигеном или эпитопом независимо от других ν-областей или доменов. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимер) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания антигена единичным вариабельным доменом иммуноглобулина (т.е., когда единичный вариабельный домен иммуноглобулина связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). Используемый здесь термин доменное антитело или 4ЛЬ представляет собой то же самое, что и единичный вариабельный домен иммуноглобулина. Используемый здесь термин единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой то же самое, что и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен. Используемый здесь термин единичный вариабельный домен антитела представляет собой то же самое, что и единичный вариабельный домен иммуноглобулина. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина в одном из воплощений представляет собой вариабельный домен человеческого антитела, но также включает единичные вариабельные домены антител других видов, таких как грызуны (например, раскрытые в \УО 00/29004, содержание которого включено сюда путем ссылки), акула-нянька и νΗΗ ЙЛЬ камелид. νΗΗ камелид представляют собой полипептиды единичного вариабельного домена иммуноглобулина, полученные у видов, включающих верблюда, ламу, альпака, одногорбого верблюда и гуанако, которые продуцируют антитела, имеющие тяжелую цепь, но естественным образом лишенные легких цепей. νΗΗ могут быть гуманизированы. Также в объеме настоящего изобретения находятся человеческие ЙЛЬ. которые модифицированы таким образом, чтобы не быть полностью человеческими, например модификации, которые получают для уменьшения агрегации, включающие мутацию тех же самых остатков, которые представляют собой мотивы камелид.
Немодифицированный единичный вариабельный домен иммуноглобулина (т.е. немодифицированное ЙЛЬ), например ЙЛЬ, которое связывается с мишенью, содержит три определяющие комплементарность области (СИК) внутри каркасной структуры. Хотя в генетике природных иммуноглобулиновых цепей область ν заканчивается в начале СИКЗ, тогда как оставшаяся часть СИК3 обеспечивается областями Ό и 1 (приводя в результате к слиянию ν-О-!), для задач настоящего изобретения 4ЛЬ включает все СИКЗ и заканчивается в каркасном 4 остатке на его С-конце. νΗ ЙЛЬ заканчивается по остаткам ЬУТУ88 на своем С-конце. νΗΗ ЙЛЬ заканчивается по остаткам УТУ88 на своем С-конце. νΒ ЙЛЬ заканчивается по νΕΙΚΚ на своем С-конце.
Модифицированное ЙЛЬ представляет собой описанное здесь ЙЛЬ, которое дополнительно имеет модификацию, которая изменяет трехмерную конформацию С-конца ЙЛЬ. Модифицированное ЙЛЬ включает ЙЛЬ, которое содержит раскрытые здесь С-концевые присоединения, удлинения или метки и/или некоторые аминокислотные замены.
В настоящем изобретении также предложен описанный выше единичный вариабельный домен иммуноглобулина (или молекулы, содержащие ЙЛЬ, например а шЛЬйЛЬ), который обладает меньшей связывающей аффинностью и/или авидностью (например, который имеет Κ связывания с ΆΌΆ, которая составляет 150% или более (например, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650% или более относительно Κ эквивалентной последовательности) в отношении антител против лекарственного средства по сравнению с эквивалентным 4ЛЬ (или молекулой, содержащей 4ЛЬ), где эквивалентное ЙЛЬ имеет ту же самую последовательность, за исключением того, что X отсутствует, η, р и с| представляют собой 1 и мутации каркасной области отсутствуют. Под этим понимают, что ЙЛЬ, например ΌΟΜ 1Η-131-206 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1), будучи модифицировано таким образом, что удлиняется таким образом, что содержит X, например С-концевое удлинение на единичный аланин, или модифицирован для удаления С-концевого
- 10 027160 серина, или модифицирован путем замены в каркасной области одного или более чем одного из остатков 14, 41, 108, 110 и/или 112 (или любую комбинацию таких модификаций), связывается с антителом против лекарственного средства (ЛИЛ) с меньшей связывающей аффинностью и/или авидностью по сравнению с Ό0Μ 1Н-131-206 (8ЕО ГО N0: 1) без какой-либо из этих модификаций. Они могут быть определены с использованием поверхностного плазмонного резонанса, например на Ыасоге ΤΜ с использованием стандартных способов. Специалисту в данной области техники понятно, что чем ниже значение Кс, тем сильнее связывание.
Также в изобретении предложено бЛЬ. модифицированное, как здесь описано, таким образом, чтобы обладать уменьшенным связыванием с ЛИЛ, и которое обладает уменьшенным связыванием с ЛИЛ, как определено с использованием подтверждающего анализа, описанного в примере 2, и где указанное модифицированное бЛЬ обладает средним % ингибирования сигнала, который составляет менее чем 90%, например менее чем 80%, например менее чем 70%, например менее чем 60%, например менее чем 50%, например менее чем 40%, например менее чем 30%, например менее чем 20%, например менее чем 10%, по сравнению с контрольным бЛЬ, которое обладает приблизительно 98-100% ингибированием сигнала, где указанное контрольное (немодифицированное) бЛЬ имеет ту же самую или похожую последовательность, но не модифицировано для уменьшения связывания с ЛИЛ.
Предсуществующие ЛИЛ представляют собой ЛИЛ, уже присутствующие у субъекта, которому должно вводиться лекарственное средство. Предсуществующие ЛИЛ могут быть представлены у интактного субъекта (т.е. субъекта, которому лекарственное средство ранее никогда не вводили).
Домен представляет собой сложенную белковую структуру, которая имеет третичную структуру независимо от оставшейся части белка. Как правило, домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены на другие белки без утраты функции оставшейся части белка и/или домена. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой сложенный полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Таким образом, он включает полноразмерные вариабельные домены антитела и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более чем одна петля заменена на последовательности, которые не характерны для вариабельных доменов антитела, или вариабельные домены антитела, которые являются усеченными или содержат Ν- или С-концевое удлинение, а также сложенные фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Использованный здесь термин доза относится к количеству слитого белка или конъюгата, вводимого субъекту одновременно (стандартная разовая доза), или в течение двух или более чем двух введений в течение определенного интервала времени. Например, доза может относиться к количеству слитого белка или конъюгата, вводимого субъекту в течение суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более чем одного месяца (например, при единичном введении двух или более чем двух введений). Интервал между дозами может представлять собой любой желаемый промежуток времени.
Моновалентное обозначает связывание с одним эпитопом.
Фраза период полувыведения относится к периоду времени, в течение которого концентрация слитого белка или конъюгата в сыворотке крови или плазме крови уменьшается на 50%, ίη νίνο, например, вследствие деградации, и/или клиренса, или секвестрирования при помощи естественных механизмов. Композиции по изобретению стабилизированы ίη νίνο, и их период полувыведения увеличивался путем связывания с молекулами сывороточного альбумина, например человеческого сывороточного альбумина (Н8Л), которые устойчивы к деградации, и/или клиренсу, или секвестрированию. Эти молекулы сывороточного альбумина представляют собой встречающиеся в природе белки, которые сами по себе обладают длительным периодом полувыведения ίη νίνο. Период полувыведения молекулы увеличивается в том случае, если сохраняется ее функциональная активность ίη νίνο в течение более длительного периода времени по сравнению с похожей молекулой, которая не является специфической в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения.
Используемый здесь термин гидродинамический размер относится к приблизительному размеру молекулы (например, белковой молекулы, лиганда) на основе диффузии молекулы в водном растворе. Диффузия или подвижность белка в растворе может быть рассчитана для оценки приблизительного размера белка, где размер приводится в виде радиуса Стокса или гидродинамического радиуса белковой частицы. Гидродинамический размер белка зависит от массы и формы (конформация), таким образом, что два белка, имеющие одинаковую молекулярную массу, могут иметь отличающиеся гидродинамические размеры на основе общей конформации белка.
Расчеты гомологии или идентичности, или сходства между двумя последовательностями (термины здесь использованы взаимозаменяемо) осуществляют следующим образом. Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены пробелы в одной или обоих из первой и второй последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности могут быть проигнорированы для целей сравнения). В воплощении длина эталонной последовательности, выровненной в целях сравнения, составляет
- 11 027160 по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70, 80, 90, 100% относительно длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Когда положение в первой последовательности занято тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными по данному положению (как использовано здесь, гомология по аминокислотам или нуклеиновым кислотам эквивалентна идентичности по аминокислотам или нуклеиновым кислотам). Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от количества идентичных положений, общих для этих последовательностей, с учетом количества пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивания и гомология, сходство или идентичность аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, как определено здесь, могут быть получены и определены с использованием алгоритма ВЬА§Т 2 Зсциспес5 с использованием параметров по умолчанию (Та1и8оуа, Т.А. с( а1., ΡΕΜδ МюгоЬюИ Ье«., 174:187-188 (1999)).
Изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим описанные здесь композиции по изобретению.
Нуклеиновые кислоты, названные как выделенные, представляют собой нуклеиновые кислоты, которые отделены от другого материала (например, других нуклеиновых кислот, таких как геномная ДНК, кДНК и/или РНК) в своей исходной среде (например, в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, такой как библиотека). Выделенная нуклеиновая кислота может быть выделена как часть вектора (например, плазмиды).
Нуклеиновые кислоты, названные здесь как рекомбинантные, представляют собой нуклеиновые кислоты, которые получены методиками рекомбинантной ДНК, включающими методы, основанные на искусственной рекомбинации, такие как клонирование в вектор или хромосому с использованием, например, рестриктаз, гомологичная рекомбинация, вирусы и т.п., и нуклеиновые кислоты, полученные с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяину, например, клетке млекопитающего или микробной, которая содержит (одну или более чем одну) рекомбинантную нуклеиновую кислоту или экспрессирующуюся конструкцию, содержащую нуклеиновую(ые) кислоту(ы), кодирующую(ие) описанную здесь композицию по изобретению, например ЙАЬ. модифицированное для уменьшения связывания с АОА. Также предложен способ приготовления описанной здесь композиции по изобретению, при котором поддерживают рекомбинантную клетку-хозяина, например млекопитающего или микроба по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии слитого полипептида. Этот способ при желании может дополнительно включать стадию выделения или очистки слитой молекулы.
Например, молекула нуклеиновой кислоты (т.е. одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты), кодирующая молекулу по изобретению, может быть введена в подходящую клетку-хозяина для получения рекомбинантной клетки-хозяина с использованием любого из методов, подходящих для выбранной клетки-хозяина (например, трансформация, трансфекция, электропорация, инфицирование), таким образом, что молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана(ы) с одним или более чем одним элементом контроля экспрессии (например, в векторе, в конструкции, созданной при помощи процессов в клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полученную в результате рекомбинантную клетку-хозяина можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем животном, в подходящих культуральных средах, дополненных подходящими солями, факторами роста, антибиотиками, питательными добавками и т.д.), посредством чего получают кодируемый пептид или полипептид. При желании, кодируемый пептид или полипептид может быть выделен или очищен (например, из животного, клетки-хозяина, среды, молока). Указанный способ охватывает экспрессию в клетке-хозяине трансгенного животного (см., например, \УО 92/03918, ОеиРЬатт 1п1егиайоиа1).
Описанные здесь молекулы по изобретению также могут быть получены в подходящей системе экспрессии ίη νίίτο, например, путем химического синтеза или при помощи любого другого подходящего способа.
Описанные здесь молекулы по изобретению, примеры которых здесь приведены, как правило, связываются со своими лигандами-мишенями с высокой аффинностью.
Молекулы по изобретению, например, модифицированные ЙАЬ, обладающие уменьшенным связыванием с АОА, могут экспрессироваться в Е.соИ или в видах РЫиа (например, Р.раь1ог15). В одном из воплощений ЙАЬ секретируется у Е.соИ или видов РЫйа (например, Р.ра5(оп5) или в культуре клеток млекопитающих (например, клеток СНО или ΗΕΚ 293). Хотя описанные здесь молекулы могут секретироваться, будучи экспрессироваными в Е.соИ или в видах РЫйа или в клетках млекопитающих, они могут быть получены с использованием любого подходящего способа, такого как способы химического синтеза или способы биологической продукции, в которых не используются Е.соИ или виды РюЫа. В воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая ЙАЬ по изобретению, например, описанные здесь ΤΝΡΚ.1 ЙАЬ могут быть клонированы в подходящий вектор экспрессии, например Раνе011 (от Рирй1т ОюкуИИ),
- 12 027160 и затем экспрессированы в микробном векторе, таком как Е.соП.
В одном из воплощений изобретения бЛЬ, например Ун, Уь или Унн, могут быть модифицированы для предупреждения связывания с ΛΌΆ, таким образом, что модификация содержит метку, присутствующую на С-конце. Эта метка может быть представлена в виде слияния или конъюгата с молекулой. Эта метка может представлять собой любую метку, известную в области техники, например аффинные метки, такие как тус-метки, РЬЛО метки, Ыз-метки, химическую модификацию, такую как РЕО (полиэтиленгликоль, ПЭГ), или белковые домены, такие как домен Рс антитела. В частности, в настоящем изобретении предложена молекула по изобретению, удлиненная на метку путем химической модификации или на белковый домен для применения в способе уменьшения побочных эффектов, как здесь также определено.
В еще одном воплощении в изобретении также предложена молекула, например бЛЬ (такая как Ун, или Уъ, или Унн), которая содержит модифицированную каркасную область, уменьшающую связывание с предсуществующими ΛΌΆ, например бЛЬ (такая как Унн, Ун или Уь), которая содержит аминокислотную замену по любому из положений 14, 41, 108, 110 или 112. Например, эти замены могут представлять собой одну или более чем одну модификацию, выбранную из Р14А, Р14К, Р14Ц, Р14Т, Р41А, Ь108А, Ь108 О, Т110А и 8112А.
В одном из аспектов данного воплощения бАЬ (например, Унн, Ун или Уъ) содержит одну или более чем одну модификацию, выбранную из Р14А, Р14К, Р14Ц, Р14Т, Р41А, Ь108А, Т110А и 8112А; и может также содержать любое из вышеописанных: С-концевых удлинений, добавлений, делеций или меток.
В одном из воплощений бАЬ (например, Унн, Ун или Уь), которое содержит одну или более чем одну модификацию, выбранную из Р14А, Р14К, Р14Ц, Р14Т, Р41А, Ь108А, Т110А и 8112А, также содержит аминокислотное удлинение на С-конце бАЬ, выбранное из (а) аланина или (б) аминокислотной последовательности, содержащей или состоящей из удлинения, выбранного из А§, А8Т, А8ТК, А8ТКО, или А8ТКОР. Кроме того, описанные здесь молекулы бАЬ и фармацевтические композиции, содержащие эти молекулы, могут быть полезны в предупреждении или уменьшении побочных эффектов. Связывание антител против лекарственных средств с бАЬ может привести к двум бАЬ, доставляемым вместе. В некоторых случаях это может привести к проблемам с безопасностью. Например, если мишень бАЬ представляет собой рецептор или полимерную мишень, тогда доставка вместе двух бАЬ может доставлять вместе две мишени. Это может привести к неожиданным фармакологическим последствиям, например к агонизму вместо антагонизма, например путем димеризации рецептора. Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение молекул по изобретению в способе предупреждения побочных эффектов. Под предупреждением понимают, что применение молекул по изобретению устраняет полностью или частично связывание с предсуществующими антителами против лекарственного средства по сравнению с эквивалентной молекулой, которая не была модифицирована. Уменьшение связывания АЭА приводит к снижению уровня нежелательных фармакологических эффектов. Таким образом, молекулы по изобретению могут обладать улучшенным профилем безопасности и меньшими побочными эффектами по сравнению с немодифицированными молекулами, например немодифицированными бАЬ, которые не содержат С-концевое удлинение, добавление, делецию или метку, и/или другую модификацию каркасной области, для уменьшения связывания с предсуществующими АЭА. Аналогично, введение описанных здесь модифицированных молекул или фармацевтических композиций, содержащих эти модифицированные молекулы (которые обладают уменьшенной способностью к связыванию с предсуществующими ЛЭЛ). может привести к модифицированной иммуногенности, ввиду того что, когда немодифицированные молекулы связываются с АЭА, они образуют иммунные комплексы, и такие иммунные комплексы затем могут вызывать иммунный ответ. Кроме того, введение описанных здесь модифицированных молекул или фармацевтических композиций, содержащих эти модифицированные молекулы, также может привести к улучшенной эффективности и улучшенному профилю безопасности и, например, благоприятно может быть использовано для повторного дозирования пациентам, у которых могут продуцироваться аутоантитела против немодифицированных молекул. Кроме того, молекулы бАЬ по изобретению можно вводить популяции пациентов без необходимости предварительного скрининга титров АЭА для исключения субъектов, имеющих риск неблагоприятной реакции. В контексте применения молекул для предупреждения побочных эффектов в настоящем изобретении предложено также применение единичного вариабельного домена иммуноглобулина, как определено здесь, в котором X заменен на Υ, где Υ выбран из группы, состоящей из: метки, такой как аффинная метка, метка тус, метка РЬАО или Нз-метка, химической модификации, такой как группа РЕО, или белка, такого как Рс-часть антитела.
В настоящем изобретении также предложен способ предупреждения или уменьшения побочных эффектов в схеме лечения путем введения молекул по изобретению, или молекул по изобретению, в которых X заменен на Υ, как определено выше. Также предложен способ модификации описанной здесь молекулы для уменьшения ее связывания с АЭА и для уменьшения побочных эффектов.
В изобретении также предложены композиции, которые содержат описанные здесь модифицированные молекулы, например композиции, содержащие модифицированные Унн, Ун или Уь. Такие композиции могут содержать модифицированные молекулы, представленные в виде слияния или конъюгата с
- 13 027160 другими молекулами, например другими белками, молекулами антител или фрагментами антител. Например, бАЬ могут быть представлены в виде форматированных бЛЬ (например, бАЬ могут быть представлены в виде слияния бАЬ-Тс или конъюгата, как описано, например, в \7О 2008/149148) или они могут быть представлены в виде шЛЬбЛЬ (как описано в \7О 2009/068649), или бЛЬ могут быть представлены в виде слияния или конъюгата с белками или полипептидами, увеличивающими период полувыведения, например еще одним бЛЬ. например бЛЬ. которое связывается с сывороточным альбумином (А1ЬибЛЬ™), или, например, с полиэтиленгликолем РЕО, или дополнительными терапевтическими или активными молекулами. В этом воплощении терапевтическая(ие) молекула(ы), будучи представлена(ы) в виде слияния или конъюгата с бАЬ (например, Унн, Ун или Уъ), может(гут) быть связана(ы) с удлинением на С-конце бАЬ или Ν-конце бАЬ. В одном из воплощений одна или более чем одна терапевтическая молекула представлена в виде слияния (или конъюгата) по Ν-концу бАЬ.
В одном из воплощений бАЬ по изобретению (и также молекулы, содержащие бАЬ, такие как тАЬбАЬ, которые также представляют собой часть изобретения), которые обладают уменьшенной способностью связываться с АНА, связываются с лигандом-мишенью с высокой аффинностью, например, они могут иметь Кс, измеренную при помощи поверхностного плазмонного резонанса с использованием В1асоге™, находящуюся в диапазоне от 5 мкмоль до приблизительно 1 пМ, например от приблизительно 500 нМ до приблизительно 10 пМ, например от приблизительно 200 нМ до приблизительно 10 пМ, например от 50 нМ до приблизительно 10 пМ, например от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10 пМ. В воплощении молекула может иметь К от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10-30 пМ, например она может представлять собой ΤΝΡΚ1 бАЬ, обладающее уменьшенным связыванием с АНА и которое имеет К приблизительно 10-30 пМ, например приблизительно 20 пМ.
В воплощении бАЬ по изобретению (и также молекулы, содержащие бАЬ, такие как тАЬбАЬ, которые также представляют собой часть изобретения), которые обладают уменьшенной способностью связываться с АНА, могут иметь уровни экспрессии, которые составляют по меньшей мере 3%, например 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% относительно представленных для бАЬ, имеющих ту же самую или похожую аминокислотную последовательность, которая не модифицирована, как здесь описано, для уменьшения связывания с АИА. В еще одном воплощении молекулы по изобретению (например, бАЬ и молекулы, содержащие бАЬ, такие как тАЬбАЬ), которые обладают уменьшенной способностью связываться с АИА, могут иметь уровни экспрессии по меньшей мере 0,1 г/л.
В воплощении бАЬ по изобретению (и также молекулы, содержащие бАЬ, такие как тАЬбАЬ, которые также представляют собой часть изобретения), обладающие уменьшенной способностью связываться с АИА, имеют Кс связывания со своим антигеном-мишенью, которая приблизительно в 50 раз выше (или более чем в 50 раз) (т.е. бАЬ в 50 раз менее сильные), например приблизительно в 40 раз выше, приблизительно в 30 раз выше, приблизительно в 20 раз выше, приблизительно в 10 раз выше, приблизительно в 5 раз выше, приблизительно в 4 раза выше, чем Кс бАЬ с той же самой или похожей аминокислотной последовательностью, которая не модифицирована, как здесь описано, для уменьшения связывания с АИА. В воплощении бАЬ по изобретению (и также молекулы, содержащие бАЬ, такие как тАЬбАЬ, которые также представляют собой часть изобретения), обладающие уменьшенной способностью связываться с АИА, имеют Кс со своим антигеном-мишенью, которая, по существу, является такой же (например, приблизительно от в 2 раза выше до в 2 раза меньше) или более чем в 2 раза меньше, чем Кс для бАЬ, имеющего ту же самую или похожую аминокислотную последовательность, которая не модифицирована, как здесь описано, для уменьшения связывания с АИА.
Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям, содержащим такие удлиненные на С-конце и/или модифицированные молекулы, и также к способам получения и экспрессии этих молекул.
В воплощении изобретения предложено бАЬ (Ун, Уь, или Унн), которое имеет любую из описанных выше С-концевых модификаций, и которое связывается с мишенью, выбранной из ΤΝΡα, ΤΝΡΚ.1, УЕОР, 1Ь-1К, 1Ь-6К, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-13, ИС-δΙΟΝ, А8ОРК, альбумина и Τ0ΡβΚ2.
В одном из воплощений изобретения предложено бАЬ, которое описано или раскрыто в любой из \7О 2007/049017 (например, бАЬ против ΤΝΡΚ.1, обозначенное 2Н-131-511, или бАЬ, которое по меньшей мере на 80% идентично ему (например, на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% идентично), \7О 2008/149144 (например, бАЬ против ΤΝΡΚ.1, выбранное из 1Р-131-201, 1Р-131-202, 1Р-131-203, 1Р-131-204, 1Р-131-205, или бАЬ, которое по меньшей мере на 80% идентично ему (например, на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% идентично) и \7О 2008/149148 (содержание которого однозначно включено в описание путем ссылки), например любое из бАЬ против ΤΝΡΚ.1 в этом источнике; и где бАЬ также содержит по меньшей мере одну из описанных здесь модификаций для уменьшения аффинности и/или авидности связывания с АИА, например любую из описанных выше С-концевых модификаций и/или любую из описанных выше аминокислотных замен и/или делеций.
В еще одном воплощении изобретения предложено немодифицированное бАЬ, которое описано или раскрыто в любой из \7О 2007/049017, \7О 2008/149144 и \7О 2008/149148 (например, любая из описанных выше последовательностей бАЬ) и где бАЬ затем модифицировано таким образом, что содержит
- 14 027160 одну или более чем одну из модификаций каркасной области, например, выбранную из мутаций каркасной области Р14А, Р14К, Р14к, Р14Т Р41А, Б108Л, Т110А и 8112А, и которое также может дополнительно содержать любую из описанных здесь С-концевых модификаций. В одном из примеров немодифицированное ЙАЬ может представлять собой любое из последовательностей ЙАЬ против ΪΝΡΚ1, описанных или раскрытых в любой из АО 2007/049017, АО 2008/149144 и АО 2008/149148. В воплощении немодифицированная последовательность ЙАЬ против ΨΝΡΚ1 может представлять собой последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100%) идентична последовательности ЙАЬ, идентифицированной как ΌΟΜ 1Η-131-206 (раскрытой в АО 2008/149148), ΌΟΜ 1Н-131-511 (раскрытой в АО 2007/049017 и 2008/149144) и 1)ОМ 1Η-131-202 (раскрытой в АО 2008/149144).
В еще одном воплощении изобретения предложено νΕΟΡ ЙАЬ, которое описано или раскрыто в АО 2008/149147, например ЙАЬ, обозначенное как 15-26-593 (аминокислотная последовательность, представленная на фиг. 5 в АО 2008/149147) (содержание которой однозначно включено в описание путем ссылки), и где ЙАЬ дополнительно содержит любую из описанных здесь модификаций для уменьшения аффинности и/или авидности связывания с АОА, например любую из С-концевых модификаций, как описано выше, и/или любую из аминокислотных замен и/или делеций, как описано выше.
Немодифицированные аминокислотные последовательности ЙАЬ представляют собой следующие:
(а) ϋΟΜ 1Н-131-206
ΕνθΙ_Ι_ΕδΟΟΟΙ_νθΡΟΟδΙ_ΗΙ_δΟΑΑδΟΕΤΕΑΗΕΤΜννννΗΟΑΡΟΚΟΙ_ΕνννδΗΙΡΡΟΟ
ΟΟΡΕΥΑΟδνΚΟΡΕΤΙδβΟΝδΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝδΙ_βΑΕΟΤΑνΥΗΟΑΙ_Ι_ΡΚβΟΡννΕΟΥννθ οοτι_ντνδδ (δΕΟ ΙϋΝΟ 1) (б) ϋΟΜ 1Η-131-511
Εν0Ι_Ι_Εδ000Ι_ν0Ρ00δΙ_Η!_δ0ΑΑδ0ΕΤΕΑΗΕΤΜννννΗ0ΑΡ0Κ0Ι_ΕνννδΗΙΡΡν0
ΟΟΡΕΥΑΟδνΚΟΒΕΤΙδβΟΝδΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝδΙ_βΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΙ_Ι_ΡΚΡΟΡννΕΟΥννθ οοτι_ντνδδ (δΕΟ Ю ΝΟ 2) (в) ϋΟΜ 1Η-131-202
ΕνθΕΙΕδΟΟΟΙ_νθΡΟΟδΙ_ΗΙ_δΟΑΑδΟΕΤΕΑΗΕΤΜννννΗΟΑΡΟΚΟΙ_ΕνννδΗΙΡΡΟΟ
ΟΟΡΕΥΑΟδνΚΟΒΕΤΙδβΟΝδΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝδΙ_βΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΙ_Ι_ΡΚΡΟΡννΕΟΥννθ οοτι_ντνδδ (δΕΟ Ю ΝΟ 3) (г) УНН клон 2(г):
ΕνΟίνΕδΟΟΟίνΟΡΟΟδΙ-ΗΙ-δΟΑΑδΟδνΕΚΙΝνΜΑννΥΗΟΑΡΟΚΟΗΕΙ-νΑΟΙ
ΙδΟΟδΤδΥΑϋδνΚΟΗΕΤΙδΗΟΝΑΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝδΙ_ΗΡΕΟΤΑνΥΥΟΑΕΙΤΤΕδϋΥΟΙ_ΟΗ
ΗΥνν000Τίντνδδ0000δ000δΕν0ΐνΕδ000Ι_ν0Ρ0ΝδΙ_ΗΙ_δ0ΑΑδ0ΕΤΕδδΕ
ΟΜδνννΗΟΑΡΟΚΟίΕνννδδΙδΟδΟδΟΤΙ_ΥΑΟδνΚΟΗΕΤΙδΗΟΝΑΚΤΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝδΙ_Η
ΡΕϋΤΑνΥΥΟΤΙΟΟδΙ_δΗδδΟΟΤΙ_ντνδδ (δΕΟ Ю N0 4) (д) УНН клон 2(д):
Εν0Ι_νΕδ000Ι_ν0Ρ00δΙ-ΗΙ-δ0ΑΑδ0ΕΤΕδ0ΥννΜΥνννΗ0ΑΡ0Κ0Ι_Ενννδ
ΕΙΝΤΝΟΙ_ΙΤΚΥΡϋδνΚΟΗΕΤΙδΗΟΝΑΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝδΙ_ΗΡΕΟΤΑνΥΥΟΑΗδΡδΟΕΝΗΟ
00Τΐντνδδ0000δ000δΕν0Ι_νΕδ000Ι_ν0Ρ0ΝδΙ_ΡΙ_δ0ΑΑδ0ΕΤΕδδΕ0Μδνν νΗΟΑΡΟΚΟίΕνννδδΙδΟδΟδΟΤΙ_ΥΑΟδνΚΟΗΕΤΙδΗΟΝΑΚΤΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝδΙ_ΗΡΕΟΤΑ νΥΥ0ΤΙ00δΙδΗδδ00Τΐντνδδ0000δ000δΕν0Ι_νΕδ000Ι_ν0Ρ00δΙ_ΗΙ_δ0Α
ΑδΟΕΤΕδϋΥννΜΥνννΗΟΑΡΟΚΟΙ_ΕνννδΕΙΝΤΝΟΙ_ΙΤΚΥΡΟδνΚΟΗΕΤΙδΗΟΝΑΚΝΤΙ_
ΥίΟΜΝδΙ_ΗΡΕΟΤΑνΥΥΟΑΗδΡδΟΕΝΗΟΟΟΤΙ_ντνδδ (δΕΟ Ю ΝΟ 5) (θ) ΥΗΗ клон 2(θ)
- 15 027160
Εν0Ι_νΕ3000Ι_ν0Ρ003Ι_ΒΙ_30ΑΑ50ΒΤΕ3ΥΝΡΜ0ννΕβ0ΑΡ0Κ0βΕΙ_νΑΑ
Ι3ΡΤ003ΤΥΥΡ03νΕΟβΕΤΙ3βΟΝΑΚβΜνΥΙ_ΟΜΝ3Ι_βΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΑΑθνβΑΕΟΟ
ΒνΒΤΙ_Ρ3ΕΥΤΕνν000Τ0ντν33ΑΑΑΕν0Ι_νΕ3000Ι_ν0Ρ003Ι_βΙ_30ΑΑ30βΤΕ3
ΥΝΡΜθννΕΒΟΑΡΟΚΟΒΕΐνΑΑΙ3ΒΤΟΟ3ΤΥΥΡ03νΕΟΒΕΤΙ3Β0ΝΑΚΒΜνΥΙΟΜΝ3
Ι_ΒΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΑΑθνβΑΕΟΟΒνβΤΙ_Ρ3ΕΥΤΕννθΟΟΤθντν33 (ЗЕО Ю ΝΟ 6)
В еще одном воплощении изобретения предложено модифицированное УНН с1АЬ, выбранное из следующих последовательностей:
(а) УНН клон 2(г)+А:
Εν0Ι_νΕ3<30<3Ι_ν0Ρ0<33Ι_ΗΙ_30ΑΑ5<33νΡΚΙΝνΜΑ\Λ/ΥΗ0ΑΡ0Κ<3ΗΕΙ_νΑ<3Ι
Ι3ΟΟ3Τ5ΥΑ03νΚΟΗΕΤΙ5Η0ΝΑΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_ΗΡΕ0ΤΑνΥΥ0ΑΕΠΊΈ30Υ0Ι_ΟΗ
ΒΥνν000Τΐντν33000030003Εν0Ι_νΕ3000Ι_ν0Ρ0Ν3Ι_ΡΙ_30ΑΑ30ΕΤΕ33Ε
ΟΜ3νννΒΟΑΡΟΚΟΙ_Εννν53Ι3Ο3Ο30ΤΙ_ΥΑ03νΚΟβΕΤΙ3Β0ΝΑΚΤΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_β
ΡΕ0ΤΑνΥΥ0ΤΙΟΟ3Ι_3Β35ΟΟΤΙ_ντν33Α (ЗЕО Ю ΝΟ 7) (б) УНН клон 2(д)+А:
ЕУО1_УЕЗ<3<3<31_УОРО<331_Н1_ЗСАА5ОРТР30У\Л/МУ\Л/УНОАРОК<31_Е\Л/УЗ ΕΙΝΤΝΟΙ_ΙΤΚΥΡ03νΚΟΗΕΤΙ3ΗΟΝΑΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_ΗΡΕΟΤΑνΥΥΟΑΗ3Ρ30ΕΝΗΟ 00ΤΙ_ντν33000030003Εν0Ι_νΕ3000Ι_ν0Ρ0Ν3Ι_ΗΙ_30ΑΑ30ΕΤΕ33Ε0Μ3νν УНОАРО КО1_ЕМ ν33Ι30303ϋΤΙ_ΥΑ03νΚ0 ΗΕΤΙ3ΗΟΝΑΚΤΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_ΗΡΕϋΤΑ УУУСТ1ООЗЬЗНЗЗООТ1_УТУЗЗООООЗОООЗЕУО1_УЕЗООО1_УОРОО31_Н1_ЗСА Α30ΕΤΕ3ϋΥννΜΥνννβΟΑΡΟΚΟΙ_Εννν3ΕΙΝΤΝΟΙ_ΙΤΚΥΡ03νΚΟβΕΤΙ3βΟΝΑΚΝΤΙ_ ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_ΗΡΕΟΤΑνΥΥΟΑΗ3Ρ30ΕΝΗΟΟΟΤΙ_ντν33Α (ЗЕО Ю ΝΟ 8) (в) УНН клон 2(е)+А
ЕУОЬУЕЗООО1_УОРОО31_Н1_ЗСАА5ОНТЕЗУНРМО\Л/ЕНОАРОКОНЕ1_УАА
Ι3ΗΤ003ΤΥΥΡ03νΕΟΗΕΤΙ3ΗΟΝΑΚΗΜνΥΙ_ΟΜΝ3Ι_ΗΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΑΑθνΗΑΕϋΟ
НУНТ1_Р5ЕУТР\Л/<ЗО<ЗТОУТУЗЗАААЕУО1_УЕЗ<3<ЗО1_УОРО<331_Н1_ЗСААЗ<ЗНТРЗ
ΥΝΡΜθννΕΒΟΑΡΟΚΟΒΕΐνΑΑΙ3ΒΤΟΟ3ΤΥΥΡ03νΕΟΒΕΤΙ3Β0ΝΑΚΒΜνΥΙΟΜΝ3
1_НАЕОТАУУУСАААОУНАЕО<ЗНУНТ1_РЗЕУТР\Л/<ЗООТОУТУЗЗА (ЗЕО Ю ΝΟ 9)
В еще одном воплощении изобретения предложено модифицированное ΌΟΜ Ш-131-206 дЛЪ, которое связывается с ΤΝΡΚ1 и которое выбрано из следующих аминокислотных последовательностей:
- 16 027160 (а) ООМ1И-131-206 с1АЬ с удлинением на единичный аланин на Сконце:
еуоыезоооьуороозьвьзсаазоетеанетмт^увоарокоье^л/узн
ΙΡΡΟΟΟΟΡΕΥΑ03νΚΟΒΕΤΙ3βΟΝ3ΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_βΑΕΟΤΑνΥΗΟΑΙ_Ι_ΡΚβΟΡννΕ ϋΥνν000ΤΙ_ντν33Α (ЗЕО Ю N0 16) (б) ООМ1И-131-206 с1АЬ с удлинением на единичный аланин и мутацией Р14А в каркасной области:
Εν0Ι_Ι_Ε5000Ι_ν0Α005Ι_ΗΙ_50ΑΑ50ΡΤΡΑΗΕΤΜν\/ννΗ0ΑΡ0Κ0Ι_Ε\/νν5Η
ΙΡΡΟΟΟΟΡΕΥΑ03νΚΟβΕΤΙ3ΒΟΝ3ΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_βΑΕΟΤΑνΥΗΟΑΙ_Ι_ΡΚβΟΡννΕ ϋγννοοοτι_ντν33Α (ЗЕО Ю N0 17) (в) ϋΟΜ1 ή-131-206 с1АЬ с мутацией Ρ14А в каркасной области:
Εν0Ι_Ι_Ε5000Ι_ν0Α005Ι_ΗΙ_50ΑΑ50ΡΤΡΑΗΕΤΜν\/ννΗ0ΑΡ0Κ0Ι_Ε\/νν5Η
ΙΡΡΟΟΟΟΡΕΥΑ03νΚΟβΕΤΙ3ΒΟΝ3ΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_βΑΕΟΤΑνΥΗΟΑΙ_Ι_ΡΚβΟΡννΕ ϋγννοοοτι_ντν33 (ЗЕО Ю N0 18) (г) ϋΟΜ1 ή-131 -206 с1АЬ с удлинением на С-конце АЗТКО
Εν0Ι_Ι_Ε30<3<3Ι_ν0Ρ0<33Ι_ΗΙ_30ΑΑ3<3ΡΤΡΑΗΕΤΜν\/ννΗ0ΑΡ0Κ<3Ι_Ε\/νν3Η
ΙΡΡΟΟΟΟΡΕΥΑ03νΚΟβΕΤΙ3ΒΟΝ3ΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_βΑΕΟΤΑνΥΗΟΑΙ_Ι_ΡΚβΟΡννΕ ϋΥνν000ΤΙ_ντν33Α3ΤΚα (ЗЕО Ю N0 19) (д) ϋΟΜ1ή-131-206 с1АЬ с удлинением на С-конце АЗТКО и мутацией Р14А в каркасной области
Εν0Ι_Ι_Ε3000Ι_ν0Α003Ι_ΗΙ_30ΑΑ30ΡΤΡΑΗΕΤΜν\Λ/νΗ0ΑΡ0Κ0Ι_Ε\/νν3Η
ΙΡΡΟΟΟΟΡΕΥΑ03νΚΟΒΕΤΙ3ΒΟΝ3ΚΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ3Ι_ΒΑΕΟΤΑνΥΗΟΑΙ_Ι_ΡΚΒΟΡννΕ ϋΥνν000ΤΙ_ντν33Α3ΤΚα (ЗЕО Ю N0 20)
В изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные здесь молекулы, например нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные выше бАЬ против ΤΝΕΚ1. Также предложены клетки-хозяева, например неэмбриональные клетки-хозяева, например прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, такие как Е.соН или дрожжевые клетки-хозяева, или клетки млекопитающих, которые содержат эти нуклеиновые кислоты.
В изобретении дополнительно предложено бАЬ, которое обладает уменьшенным связыванием с АГ)А в сыворотке крови человека (например, не связывается с предсуществующими АГ)А в сыворотке крови человека), и где эпитоп на бАЬ, с которым связывается ΑΏΑ, замаскирован (т.е. эпитоп не доступен для связывания с ΑΏΑ, поскольку, например, он закрыт или замаскирован другой молекулой, таким образом предотвращая связывание, или его стерическая конформация изменена таким образом, чтобы предотвращать связывание). Эпитоп на бАЬ может быть замаскирован при помощи любой из описанных здесь модификаций для уменьшения связывания с ΑΏΑ, например добавления химической группировки к С-концу бАЬ или путем замен или делеций в каркасной области, как здесь описано. Химическая группировка, добавляемая к С-концу бАЬ, может представлять собой удлинение (например, аминокислотное удлинение) или метку, или она может представлять собой химическую модификацию, такую как пэгилирование или амидирование. Модификация по С-концу может представлять собой модификацию, которая прямо или опосредованно изменяет конформацию эпитопа на бАЬ, который связывается с ΑΏΑ, таким образом уменьшая способность бАЬ к связыванию с АГ)А.
Специалисту в данной области техники понятно, что при получении описанных здесь молекул, например бАЬ, в частности, в зависимости от используемой клеточной линии и конкретной аминокислотной последовательности молекулы, например бАЬ, могут возникать посттрансляционные модификации. Например, они могут включать отщепление некоторых лидерных последовательностей, добавление различных сахарных группировок в различных паттернах гликозилирования и фосфорилирования, деамидирование, окисление, перестановку дисульфидной связи, изомеризацию, отщепление С-концевого лизина и циклизацию Ν-концевого глутамина. Настоящее изобретение охватывает применение таких молекул, например бАЬ, которые подвержены одной или более чем одной посттрансляционной модификации или претерпели одну или более чем одну посттрансляционную модификацию. Таким образом, бАЬ по изобретению включает бАЬ, которое претерпело посттрансляционную модификацию, такую как модифика- 17 027160 ция, описанная далее: известно, что гликозилирование антител в консервативных положениях в их константных областях обладает сильным воздействием на функцию антитела, в частности эффекторную функцию, см., например, Воуй е! а1. (1996), Мо1. Ιιηιηιιηοΐ. 32: 1311-1318. Рассмотрены варианты гликозилирования антигенсвязывающих белков по изобретению, где добавляют, замещают, удаляют или модифицируют одну или более чем одну углеводную группировку. Введение мотива аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин создает потенциальный сайт для ферментативного присоединения углеводных группировок и поэтому может использоваться для манипуляции гликозилированием антитела. В Ка_)и е! а1. (2001), ВюсНетМгу 40: 8868-8876 концевое сиалирование иммуноадгезина Τ^Κ-Ι^Ο увеличивалось в процессе регалактозилирования и/или ресиалирования с использованием бета-1,4галактозилтрансферазы и/или альфа-2,3-сиалилтрансферазы. Полагают, что увеличение концевого сиалирования увеличивает период полувыведения иммуноглобулина. Антитела, вместе с большинством гликопротеинов, как правило, продуцируются в виде смеси гликоформ. Эта смесь особенно заметна тогда, когда антитела продуцируются в эукариотических клетках, в частности клетках млекопитающих. Различные способы разработаны для получения определенных гликоформ, см. Ζ1ι;·ιη§ е! а1. (2004), δαепсе, 303: 371, δο;·ΐΓ5 е! а1. (2001), Зйепсе, 291: 2344; ХУаскег е! а1. (2002), Зйепсе, 298: 1790; Эау15 е! а1. (2002), СНет. Кеу. 102: 579; Иапд е! а1. (2001), Αα. СНет. Ке8 34: 727. Описанные здесь антитела (например, изотипа ΙβΟ, например Ι§Ο1) могут содержать определенное количество (например, 7 или менее, например 5 или менее, такое как две или одна) гликоформ; деамидирование представляет собой ферментативную реакцию, главным образом превращающую аспарагин (№) в изоаспарагиновую кислоту и аспарагиновую кислоту (Ό) в отношении приблизительно 3:1. В гораздо меньшей степени деамидирование может происходить с остатками глутамина сходным образом. Деамидирование в СОК приводит к изменению заряда молекулы, но, как правило, не приводит к изменению связывания антигена, а также не влияет на ΡΚ/ΡΌ; окисление может происходить в процессе получения и хранения (т.е. в присутствии окислительных условий) и приводит к ковалентной модификации белка, вызываемой непосредственно активными формами кислорода или опосредованно путем взаимодействия со вторичными побочными продуктами окислительного стресса. Окисление происходит главным образом с остатками метионина, но иногда может возникать по остаткам триптофана и свободного цистеина; перестановка дисульфидных связей может происходить во время получения и в основных условиях хранения. В некоторых случаях дисульфидные связи могут разрушаться или образовываться некорректно, приводя к неспаренным цистеиновым остаткам (^н). Эти свободные (неспаренные) сульфгидрилы (^н) могут способствовать перестановке; изомеризация, как правило, происходит во время получения, очистки и хранения (при кислых рН) и обычно возникает, когда аспарагиновая кислота превращается в изоаспарагиновую кислоту посредством химического процесса; ^концевой глутамин в тяжелой цепи и/или легкой цепи, вероятно, образует пироглутамат (ρΟ1ι.ι). Большая часть образования ρΟ1υ происходит в производственном биореакторе, но он может образовываться неферментативно, в зависимости от рН и температуры обработки и условий хранения. Образование ρΟ1ιι рассматривают как один из основных путей деградации рекомбинантных тДЬ; отщепление С-концевого лизина представляет собой ферментативную реакцию, катализируемую карбоксипептидазами, и обычно обнаруживается в рекомбинантных тДЬ. Варианты этого процесса включают удаление лизина из одной или обеих тяжелых цепей. Отщепление лизина, по-видимому, не влияет на биологическую активность и не оказывает эффекта на эффекторную функцию тДЬ.
В изобретении также предложен способ получения молекулы по настоящему изобретению, содержащей аминокислотное удлинение, представленное в виде прямого слияния, включающий поддержание клетки-хозяина, такой как описанные выше, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту и/или конструкцию, кодирующую слитый белок по изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты, благодаря чему получают слитый белок.
В изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие модифицированные молекулы по изобретению. В изобретении также предложена фармацевтическая композиция по изобретению для применения в медицине, например для применения в лечении или предупреждении, например заболевания или состояния либо расстройства, и при котором вводят указанному индивиду терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции по изобретению. Как правило, молекулы по изобретению будут использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически или физиологически приемлемыми носителями. Как правило, эти носители могут включать водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включающие физиологический раствор и/или забуференные среды. Носители для парентерального введения могут включать раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия и раствор Рингера с лактозой. Подходящие физиологически-приемлемые адъюванты, если необходимо сохранять комплекс полипептида в суспензии, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты. Носители для внутривенного введения включают жидкие и пищевые добавки и электролитные добавки, такие как добавки, основанные на декстрозе Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как антимикробные агенты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты и инертные газы (Маск (1982), Кет1пд!оп'8 ΡЬа^тасеиί^са1 δ^ι^δ, 16* Εάίίίοη). Может быть использовано множество подходящих препаратов, включающих препараты с длительным высвобождением.
- 18 027160
В изобретении также предложен способ лечения (терапевтического или профилактического) пациента или субъекта, страдающего от заболевания или расстройства, такого как описанные здесь, включающий введение указанному индивиду терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению.
Фармацевтические композиции по изобретению могут быть введены сами по себе или в комбинации с другими молекулами или группировками, например полипептидами, терапевтическими белками и/или молекулами (например, другими белками (включая антитела), пептиды или лекарственные средства в виде небольших молекул.
В изобретении также предложены фармацевтические композиции по изобретению, содержащие УН или Уъ ЙАЬ против Т№К1, модифицированные, как здесь описано, например, описанные здесь УН или Уь ЙАЬ против Т№К1, или УНН домены против Т№К1, модифицированные, как здесь описано, для применения в лечении воспалительных заболеваний или расстройств, например псориаза, артрита, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника (например) болезни Крона и неспецифического язвенного колита; или, например респираторных или легочных заболеваний или расстройств, например выбранных из: хронического обструктивного заболевания легких, хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы, воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительного пневмонита, легочного инфильтрата с эозинофилией, заболевания легких, связанного с влиянием окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального заболевания легких, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, апноэ во время сна, острого респираторного дистресс-синдрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, заболевания трансплантат против хозяина, рака легких, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергилломы, аспергиллоза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического легочного фиброза, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий, плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцитоза, пневмонии, легочного актиномикоза, легочного альвеолярного протеиноза, легочной сибирской язвы, отека легких, легочной эмболы, воспаления легких, легочного гистиоцитоза X, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, туберкулеза легких, веноокклюзионной болезни легких, ревматоидной болезни легких, саркоидоза и гранулематоза Вегенера и острого повреждения легких (ЛЫ) и острого респираторного дистресс-синдрома (АКОЗ) и их осложнений, таких как острая почечная недостаточность.
В изобретении также предложено применение фармацевтической композиции по изобретению, содержащей ЙАЬ против Т№К1 (УН, Уъ или УНН), модифицированные, как здесь описано, в изготовлении лекарственного средства для лечения любого из указанных выше заболеваний или расстройств.
Изобретение также относится к применению любой из описанных здесь композиций в терапии, диагностике или профилактике любого из описанных выше воспалительных заболеваний или расстройств, или респираторных или легочных заболеваний или расстройств. Изобретение также относится к профилактическому применению любой из описанных здесь композиций для предупреждения или ослабления любого из описанных выше воспалительных заболеваний или расстройств или респираторных или легочных заболеваний или расстройств.
Композиции, содержащие описанные здесь ЙАЬ против Т№К1, например Ό0Μ 1Н-131-206 с С-концевым удлинением на аланин, могут быть введены для профилактических и/или терапевтических лечений и введены в виде терапевтически эффективной дозы. Количества, необходимые для достижения этой дозы, зависят от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента, но, как правило, находятся в диапазоне от 0,005 до 5,0 мг ЙАЬ на 1 кг массы тела, причем обычно используют дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза. Для профилактических применений могут быть использованы похожие или слегка меньшие дозы для предупреждения, ингибирования или замедления возникновения заболевания (например, для поддержания ремиссии или состояния покоя или для предупреждения острой фазы). Практикующий врач-специалист в данной области техники способен определить подходящий интервал доз для лечения, подавления или предупреждения заболевания. Когда описанное здесь ЙАЬ против Т№К1 вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, оно может быть введено до четырех раз в сутки, дважды в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз в месяц или один раз каждые два месяца в дозе, составляющей, например от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 80 мг/кг, от приблизительно 100 мкг/кг до приблизительно 80 мг/кг, до приблизительно 70 мг/кг, до приблизительно 50 мг/кг, до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 80 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 60 мг/кг, от приблизительно от приблизительно до приблизительно 40 мг/кг, 1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно от приблизительно от приблизительно от приблизительно
1 1 1 до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9 или приблизительно 10 мг/кг. В конкретных воплощениях ЙАЬ против Т№К1 может быть введено для лечения, подавления или предупреж- 19 027160 дения хронического воспалительного заболевания один раз каждые две недели или один раз в месяц в дозе от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг (например, приблизительно 10, приблизительно 100 мкг/кг, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9 или приблизительно мг/кг.)
Лечение или терапию, проводимые с использованием описанных здесь композиций, рассматривают как эффективные в том случае, если один или более чем один симптом или показатель заболевания уменьшается или ослабляется (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на одну точку по шкале клинической оценки) относительно таких симптомов, которые присутствовали до лечения, или относительно таких симптомов у индивида (человека или модельного животного), которого не лечили с использованием такой композиции, или другого подходящего контроля. Симптомы, очевидно, варьируют в зависимости от точной природы заболевания или расстройства, против которого направлено лечение, но могут быть измерены обычным специалистом-врачом или лаборантом.
Аналогично, профилактика, проведенная с использованием описанной здесь композиции, является эффективной, если возникновение или тяжесть одного или более чем одного симптома или показателя заболевания замедляются, уменьшаются или устраняются относительно таких симптомов у похожего индивида (человека или модельного животного), которого не лечили с использованием композиции.
Молекулам по изобретению также можно придать формат такой, чтобы они имели большой гидродинамический размер для дополнительного увеличения периода полувыведения, например путем присоединения группы РЕО, сывороточного альбумина, трансферрина, трансферринового рецептора или, по меньшей мере, его трансферринсвязывающего фрагмента, области Ес антитела, или путем конъюгации с доменом антитела. Например, 4ЛЬ, которое связывается с сывороточным альбумином, может быть придан формат в виде более крупного антигенсвязывающего фрагмента антитела (например, придан формат в виде ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ)2, Е(аЬ')2, 1дО, ксЕу).
В некоторых воплощениях изобретения предложена композиция по изобретению, которая содержит имеющий двойную специфичность лиганд или мультиспецифичный лиганд, который содержит первое 4ЛЬ, модифицированное в соответствии с изобретением, например путем С-концевого удлинения и/или путем мутации Р14А в каркасной области, и второе 4ЛЬ, которое имеет такую же специфичность связывания, как и первое 4ЛЬ, или отличающуюся специфичность связывания, и возможно в случае мультиспецифичных лигандов дополнительные 4ЛЬ. Второе 4ЛЬ (или дополнительные 4ЛЬ) может связываться с отличающейся мишенью и может также содержать С-концевое удлинение и/или мутацию Р14А в каркасной области в соответствии с изобретением.
В одном из аспектов изобретения предложены молекулы и композиции по изобретению для доставки путем парентерального введения, например при помощи подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции, ингаляции, назальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, ректальной доставки или глазной доставки. В одном из аспектов изобретения предложено применение молекул и композиций по изобретению в приготовлении лекарственного средства для доставки при помощи подкожной инъекции, ингаляции, внутривенной доставки, назальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК тракт пациента, ректальной доставки, трансдермальной или глазной доставки.
В одном из аспектов изобретения предложен способ доставки пациенту при помощи подкожной инъекции, внутрилегочной доставки, внутривенной доставки, назальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК тракт пациента, ректальной или глазной доставки, где способ включает введение пациенту фармацевтически эффективного количества молекул по изобретению.
В одном из аспектов изобретения предложен препарат для перорального введения, инъекции, ингаляции, распыления, содержащий молекулу по изобретению.
Препарат может находиться в форме таблетки, пилюли, капсулы, жидкости или сиропа.
Определенный здесь термин субъект или индивид включает животных, таких как млекопитающие, включая приматов (например, людей), коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, кроликов, морских свинок, крыс, мышей или другие виды коровьих, овечьих, лошадиных, собачьих, кошачьих, грызунов или виды мышиных, но не ограничиваясь ими.
В изобретении также предложен набор для применения в введении молекул и композиций по изобретению субъекту (например, пациенту-человеку), содержащий молекулу или композицию по изобретению, устройство для доставки лекарственного средства и, возможно, инструкцию по применению. Композиция может быть предложена в виде препарата, такого как лиофилизированный препарат или препарат с длительным высвобождением. В некоторых воплощениях устройство для доставки лекарственного средства выбрано из группы, состоящей из шприца, ингалятора, устройства для интраназального или глазного введения (например, аэрозольного генератора, устройства для закапывания в глаз или нос), и безыгольного инъектора.
Молекулы и композиции по изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и разведены в подходящем носителе перед применением. Может быть использован любой подходящий способ лиофи- 20 027160 лизации (например, распылительная сушка, сушка в слое) и/или способы разведения. Специалисту в данной области техники понятно, что лиофилизация и разведение могут привести к различным степеням утраты активности антитела и что уровни применения могут быть скорректированы для компенсации. В конкретном воплощении изобретения предложена композиция, содержащая описанную здесь лиофилизированную (высушенную путем замораживания) композицию. Предпочтительно лиофилизированная (высушенная путем замораживания) композиция теряет не более чем приблизительно 20%, или не более чем приблизительно 25%, или не более чем приблизительно 30%, или не более чем приблизительно 35%, или не более чем приблизительно 40%, или не более чем приблизительно 45%, или не более чем приблизительно 50% своей активности (например, активности связывания с сывороточным альбумином) после регидратации. Активность представляет собой количество композиции, которое требуется для достижения действия композиции до ее лиофилизации. Активность композиции может быть определена с использованием любого подходящего способа до лиофилизации, и активность может быть определена с использованием того же самого способа после регидратации для количественного определения утраченной активности.
В изобретении также предложены препараты с длительным или медленным высвобождением, содержащие молекулы по изобретению, где такие препараты с длительным высвобождением могут содержать молекулы по изобретению в комбинации, например, с гиалуроновой кислотой, микросферами или липосомами и другими фармацевтически или фармакологически приемлемыми носителями, эксципиентами и/или разбавителями.
В одном из аспектов изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая молекулу по изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
В одном из воплощений изобретения предложены модифицированные ΤΝΡΚ1 бЛЬ по настоящему изобретению, которые обладают уменьшенным связыванием с ΛΌΆ, например, такие как модифицированные Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ с модификацией как описано здесь для уменьшения связывания с ΛΌΆ. Например, в изобретении предложено Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (5>ЕО ГО N0: 16), например, в виде фармацевтической композиции, например, для применения для лечения заболевания или расстройства, например для лечения респираторного заболевания или расстройства, такого как С0РИ (хроническое обструктивное заболевание легких), ЛЫ или ΛΚΟδ. Когда Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (8ЕЩ ГО N0: 16) (или фармацевтическая композиция, содержащая Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце) используют для лечения респираторного заболевания или расстройства, такого как С0РИ, ЛЫ или ΆΚΌδ, тогда оно может быть введено субъекту, например субъекту-человеку, путем инъекции (например, при помощи подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции) или, альтернативно, может быть введено субъекту, например субъекту-человеку, путем внутрилегочного введения, например путем распыления с использованием стандартного распылителя или путем ингаляции, например с использованием стандартного ингалятора. В изобретении дополнительно предложены препараты с длительным высвобождением и/или лиофилизированные препараты, содержащие модифицированные ΤΝΡΚ1 бЛЬ по настоящему изобретению, обладающие уменьшенным связыванием с ΛΌΆ, такие как Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (8ЕЩ ГО N0: 16). Также предложено устройство для доставки, например ингалятор или распылитель, который содержит модифицированные Т№К1 бЛЬ по настоящему изобретению, такие как Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце нуклеиновой кислоты (8Е0 ГО N0: 22).
В аспекте изобретения предложено немодифицированное Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ (8ЕЩ ГО N0: 1) или Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ, модифицированное любым из описанных здесь путей для уменьшения связывания с ΆΌΆ, например Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (8Е0 ГО N0: 16), для лечения воспалительного кожного расстройства, например псориаза, и также предложена любая из нижеописанных схем введения доз для применения доменного антитела при лечении псориаза. Доменное антитело, полезное для лечения псориаза, избирательно нацелено на тот же самый домен человеческого Т№К1, как человеческий ТОТ-альфа, представляющий собой природный лиганд этого рецептора, и представляет собой специфический, конкурентный антагонист Т№К1, но не Т№К2, и предотвращает связывание ТОТ-альфа с Т№К1 и сигнальный путь с этого лиганда через Т№К1. Такое доменное антитело может содержать любое ЙЛЬ против Т№К1, которое модифицировано для уменьшения связывания с ΆΌΆ, как здесь раскрыто. В частности, доменное антитело может представлять собой человеческое доменное антитело, такое как Ό0Μ 1Н-131-206, имеющее аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 1, Ό0Μ 1Н-131-206 с С-концевым аланином, имеющее аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 16, или Ό0Μ 1Н-131-206 бЛЬ (8Е0 ГО N0: 1), модифицированное для уменьшения связывания с ΆΌΆ, как здесь описано (т.е. любая модификация для уменьшения связывания с ΑΌΑ), как здесь раскрыто. Доменное антитело может быть предоставлено во флаконе, содержащем, например, 100 или, например, 40 мг лиофилизата доменного антитела. Лиофилизат может содержать сахарозу, глицин, дигидрофосфат натрия и полисорбат 80. Указанный лиофилизат доменного антитела исходно может быть разведен в 5 мл стерильной воды и затем
- 21 027160 разбавлен стерильной водой или другими фармацевтически приемлемыми разбавителями с получением фармацевтических композиций, содержащих 20, 5 и 1 мг/мл доменного антитела.
Доменное антитело может быть использовано для лечения пациентов-людей, идентифицированных как страдающих от псориаза. В частности, доменное антитело может быть использовано для лечения пациентов-людей, идентифицированных как страдающих от хронического слабого, умеренного или тяжелого типа псориаза со стабильными бляшками с одной или двумя областями бляшек. В соответствии с №-Июпа1 Р8ог1а818 Роипбайоп (Национальный фонд по лечению псориаза) слабый тип псориаза с бляшками поражает менее 3% площади поверхности тела пациента-человека, умеренный тип псориаза с бляшками поражает от 3 до 10% площади поверхности тела пациента-человека и тяжелый тип псориаза поражает более 10% площади поверхности тела пациента-человека. См., например Кга_)ас1с, 6(5), §ирр1етеп1 6, Вю1есЬпо1оду НеаИЪсаге, ЭесетЬег 2009 и №-Июпа1 Рюпа^к РоипбаДоп, АЬои! Рюпа^к: §1аЙ8Йс8. Для сравнения, ладонь пациента-человека составляет приблизительно 1% от площади поверхности пациентачеловека. Тяжесть псориаза также может быть определена, в качестве альтернативы, в соответствии с Р8ог1а818 Агеа апб ЗеуегПу 1пбех (Индекс площади и тяжести псориаза) путем применения градационной системы, описанной Ргебпкьоп, которая основана на четырех критериях: краснота, толщина, чешуйчатость и вовлеченная площадь поверхности. См., например Ргебпсккоп, 157 Эегта1о1од1са 238 (1978). Псориатические бляшки могут иметь относительную толщину инфильтрата по меньшей мере 200 мкм, оцениваемую при помощи эхографических измерений, когда сначала вводится доменное антитело. Пациенты-люди могут представлять собой мужчин или женщин, страдающих от хронического типа псориаза со стабильной(ыми) бляшкой(ами) на верхних конечностях, бедрах или туловище. Эти пациенты-люди могут иметь возраст от приблизительно 18 до приблизительно 70 лет. Пациенты-люди также могут иметь возраст от 14 до 26 лет, а также 14 лет или больше.
Доменное антитело может быть введено этим пациентам-людям путем инъекции в псориатическую бляшку. В частности, 100 мкл фармацевтической композиции, содержащей 20, 5 или 1 мг/мл доменного антитела, могут быть введены путем инъекции в псориатическую бляшку на глубину, которая нацеливает на эпидермис и поверхностную дерму в бляшке.
Доменное антитело может быть введено пациенту-человеку, имеющему псориатическую бляшку, в соответствии с протоколом лечения, в котором 100 мкл фармацевтической композиции, содержащей 5 мг/мл доменного антитела, инъецируют в псориатическую бляшку один раз в неделю в течение периода лечения, составляющего 28 суток. В соответствии с таким протоколом лечения пациенту вводят фармацевтическую композицию четыре раза, и он получает по 0,5 мг доменного антитела при каждом введении, таким образом, что общая доза 2 мг доменного антитела достигается в течение периода лечения, составляющего 28 суток. Это означает, например, что в протоколе лечения, имеющем продолжительность 28 суток, пациент получает первую 100 мкл инъекцию, содержащую 0,5 мг доменного антитела в первые сутки, вторую такую инъекцию в восьмые сутки, третью такую инъекцию в 15е сутки и четвертую такую инъекцию в 22 сутки. Дозы доменного антитела (например, 100 мкл инъекцию, содержащую 0,5 мг доменного антитела) в указанном протоколе лечения вводят в миллиграммовом количестве на пациента.
Доменное антитело также может быть введено пациенту-человеку, имеющему псориатическую бляшку, в соответствии с протоколом лечения, в котором 100 мкл фармацевтической композиции, содержащей 20 мг/мл доменного антитела, инъецируют в псориатическую бляшку один раз в неделю в течение периода лечения, составляющего 28 суток. В соответствии с таким протоколом лечения пациенту вводят фармацевтическую композицию четыре раза, и он получает 2 мг доменного антитела при каждом введении, таким образом, что общая доза 8 мг доменного антитела достигается в течение периода лечения, составляющего 28 суток. Это означает, например, что в протоколе лечения, имеющем продолжительность 28 суток, пациент получает первую 100 мкл инъекцию, содержащую 2 мг доменного антитела в первые сутки, вторую такую инъекцию в восьмые сутки, третью такую инъекцию в 15 сутки и четвертую такую инъекцию в 22 сутки. Дозы доменного антитела (например, 100 мкл инъекцию, содержащую 2 мг доменного антитела) в указанном протоколе лечения вводят в миллиграммовом количестве на пациента.
Доменное антитело также может быть введено пациенту-человеку, имеющему псориатическую бляшку, в соответствии с протоколом лечения, в котором 100 мкл фармацевтической композиции, содержащей 5 мг/мл доменного антитела, инъецируют в псориатическую бляшку два раза в неделю в течение периода лечения, составляющего 28 суток. В соответствии с таким протоколом лечения пациенту вводят фармацевтическую композицию восемь раз, и он получает 0,5 мг доменного антитела при каждом введении таким образом, что общая доза 4 мг доменного антитела достигается в течение периода лечения, составляющего 28 суток. Это означает, например, что в протоколе лечения, имеющем продолжительность 28 суток, пациент получает первую 100 мкл инъекцию, содержащую 0,5 мг доменного антитела в первые сутки, вторую такую инъекцию в четвертые сутки, третью такую инъекцию в восьмые сутки, четвертую такую инъекцию в 11 сутки, пятую такую инъекцию в 15 сутки, шестую такую инъекцию в 18 сутки, седьмую такую инъекцию в 22 сутки и восьмую такую инъекцию в 25 сутки. Дозы доменного антитела (например, 100 мкл инъекцию, содержащую 0,5 мг доменного антитела) в указанном протоколе
- 22 027160 лечения вводят в миллиграммовом количестве на пациента.
Доменное антитело также может быть введено пациенту-человеку, имеющему псориатическую бляшку, в соответствии с протоколом лечения, в котором 100 мкл фармацевтической композиции, содержащей 1 мг/мл доменного антитела, инъецируют в псориатическую бляшку один раз в неделю в течение периода лечения, составляющего 28 суток. В соответствии с таким протоколом лечения пациенту вводят фармацевтическую композицию четыре раза, и он получает 0,1 мг доменного антитела при каждом введении таким образом, что общая доза 0,4 мг доменного антитела достигается в течение периода лечения, составляющего 28 суток. Это означает, например, что в протоколе лечения, имеющем продолжительность 28 суток, пациент получает первую 100 мкл инъекцию, содержащую 0,1 мг доменного антитела в первые сутки, вторую такую инъекцию в восьмые сутки, третью такую инъекцию в 15 сутки и четвертую такую инъекцию в 22 сутки. Дозы доменного антитела (например, 100 мкл инъекцию, содержащую 0,5 мг доменного антитела) в указанном протоколе лечения вводят в миллиграммовом количестве на пациента.
В А0 2008/149148 описаны способы тестирования, выделения и получения немодифицированных Ό0Μ 1Н-131-206 бАЬ, и такие способы применимы в отношении модифицированных ТНРР1 бАЬ по настоящему изобретению, обладающих уменьшенным связыванием с АЭА, например, в отношении Ό0Μ 1Н-131-206 бАЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (8ЕО ГО N0: 16), и это описание включено в данный документ (включая способы тестирования, выделения и получения).
В дополнительных воплощениях 1-37 ниже в изобретении также предложены:
1. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) (например, УН, Уъ или УНН), например, который связывается с мишенью, который содержит одну или более чем одну модификацию, выбранную из:
(а) добавления, удлинения или метки на С-конце;
(б) одной или более чем одной замены аминокислот каркасной области, где по меньшей мере одна замена представляет собой замену, выбранную из замены Р14А, замены Р41А и замены Ь108А;
и который обладает уменьшенным связыванием с предсуществующими АЭА по сравнению с немодифицированным единичным вариабельным доменом иммуноглобулина (бАЬ).
2. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.1, где указанный бАЬ выбран из человеческого УН или Уъ бАЬ, или УНН камелид.
3. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.1 или 2, который содержит С-концевое удлинение по меньшей мере на одну аминокислоту.
4. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.3, где указанное С-концевое удлинение содержит аминокислотное удлинение размером от одной аминокислоты до приблизительно шести аминокислот.
5. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.3 или 4, где указанное С-концевое удлинение содержит аминокислоту, которая представляет собой аланин.
6. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.5, где указанное С-концевое удлинение состоит из одной аминокислоты, которая представляет собой аланин.
7. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.5, где указанное С-концевое удлинение содержит аминокислотное удлинение, выбранное из (а) А8, (б) А8Т, (в) А8ТК, (г) А8ТКО или (д) А8ТКОР.
8. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по любому из пп.1, 2, где С-конец имеет метку, выбранную из аффинной метки, метки тус, метки РЬАО, Ык-меток, химической модификации, такой как РЕО, или белковых доменов, таких как домен Рс антитела.
9. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.6, где указанный бАЬ представляет собой УН бАЬ и также содержит замену Р14А в каркасной области.
10. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.7, где указанный бАЬ представляет собой УН бАЬ и также содержит замену Р14А в каркасной области.
11. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по любому из пп.1-10, который связывается с мишенью, где указанная мишень выбрана из ЮТа, Т№ТО1, УЕОР, ГО-1К, ГО-6К, 1Ь-4, 1Ь-5, ГО-13, ЭС-81ОК, А8ОРК, альбумина, ТОРЗК2.
12. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.11, который выбран из следующей аминокислотной последовательности, идентифицированной как (а) Ό0Μ 1Н-131-206 бАЬ с удлинением на единичный аланин (8ЕО ГО N0: 16), (б) Ό0Μ 1Н-131-206 бАЬ с удлинением на единичный аланин и мутацией Р14А в каркасной области (8Е0 ГО N0: 17), (в) Ό0Μ 1Н-131-206 бАЬ с мутацией Р14А в каркасной области (8Е0 ГО N0: 18), (г) Ό0Μ 1Н-131-206 бАЬ с удлинением на С-конце А8ТКО (8Е0 ГО N0: 19), (д) Ό0Μ 1Н-131-206 бАЬ с удлинением на С-конце А8ТКО и мутацией Р14А в каркасной области (8Е0 ГО N0: 20).
13. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (бАЬ) по п.11 или 12, где мишень представляет собой Т№ТО1, и немодифицированный бАЬ выбран из аминокислотной последовательности, которая на 100, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как
- 23 027160
ΌΟΜ 1Η-131-206 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1), ΌΟΜ 1Η-131-511 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2), ΌΟΜ 1Η-131-202 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3).
14. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (ЙЛЬ) по любому из пп.1-13, где ЙЛЬ представлен в виде слияния или конъюгата с дополнительными молекулами.
15. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (ЙЛЬ) по п.14, где ЙЛЬ представлен в виде слияния или конъюгата с одной или более чем одной дополнительной молекулой, выбранной из дополнительного ЙЛЬ, белка или полипептида, или его фрагмента, например, который увеличивает период полувыведения или представляет собой дополнительную терапевтическую или активную молекулу, молекулы РЕО, антитела или его фрагмента, например области Рс.
16. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (ЙЛЬ) по п.15, где ЙЛЬ представлен в виде молекулы шЛЬйЛЬ.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая единичный вариабельный домен иммуноглобулина (ЙЛЬ) по любому из пп.1-16 в комбинации с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем.
18. Фармацевтическая композиция по п.17, которая содержит дополнительные терапевтические или активные агенты.
19. Фармацевтическая композиция по п.17 или 18, которая содержит 4ЛЬ против ΤΝΡΚ1.
20. Фармацевтическая композиция по п.19, которая содержит 4ЛЬ против ΤΝΡΚ1 по любому из пп.12, 13.
21. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (ЙЛЬ) по любому из пп.1-16 или композиция по любому из пп.17-20 для применения в медицине.
22. Способ лечения или предупреждения по меньшей мере одного заболевания или расстройства, или состояния, выбранного из воспалительного заболевания или расстройства или респираторного или легочного заболевания или расстройства, включающий введение субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества композиции по любому из пп.19, 20 или 4ЛЬ по п. 11-13.
23. Способ по п.22, где указанное по меньшей мере одно заболевание, или расстройство, или состояние выбрано из псориаза, артрита, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, например болезни Крона и неспецифического язвенного колита; или, например, респираторных или легочных заболеваний или расстройств, например, выбранных из хронического обструктивного заболевания легких, хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы, воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительного пневмонита, легочного инфильтрата с эозинофилией, заболевания легких, связанного с влиянием окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального заболевания легких, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, апноэ во время сна, острого респираторного дистресс-синдрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, заболевания трансплантат против хозяина, рака легких, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергилломы, аспергиллоза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического легочного фиброза, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий, плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцитоза, пневмонии, легочного актиномикоза, легочного альвеолярного протеиноза, легочной сибирской язвы, отека легких, легочной эмболы, воспаления легких, легочного гистиоцитоза X, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, туберкулеза легких, веноокклюзионной болезни легких, ревматоидной болезни легких, саркоидоза и гранулематоза Вегенера и острого повреждения легких (ЛЫ) и острого респираторного дистресс-синдрома (ΑΚΌδ) и их осложнений.
24. Способ по п.23, где указанное заболевание представляет собой ΑΌΙ и указанный ЙАЬ представляет собой ЙАЬ по п.13 или указанная фармацевтическая композиция содержит ЙАЬ по п.13.
25. Способ по любому из пп.22-24, где указанную композицию или ЙАЬ доставляют субъекту путем подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции.
26. Способ по любому из пп.22-24, где указанную композицию или ЙАЬ доставляют субъекту путем парентеральной, пероральной, ректальной, трансмукозальной, глазной, внутрилегочной доставки или доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт.
27. Инъецируемый, пероральный, ингалируемый или распыляемый препарат, который содержит композицию или ЙАЬ по любому из пп. 1-20.
28. Препарат с длительным высвобождением, который содержит композицию по любому из пп.1-20.
29. Лиофилизированный препарат, который содержит композицию по любому из пп.1-20.
30. Устройство для доставки, содержащее композицию по любому из пп.1-20.
31. Устройство для доставки, содержащее композицию по любому из пп.1-20, где указанное устройство представляет собой распылитель или ингалятор.
32. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая ЙАЬ по любому из пп.1-16.
33. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая ЙАЬ по любому из пп.12, 13.
34. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.32 или 33.
- 24 027160
35. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.32 или 33 или вектор по п.34.
36. Способ получения полипептида, содержащего йАЬ по любому из пп.1-16, включающий поддержание клетки-хозяина по п.35 в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты или вектора, посредством чего получают полипептид.
37. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (йАЬ) по пп.1-16, где йАЬ связывается с АОА с Кс, которая составляет 150% или более относительно К для немодифицированного йАЬ (например, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650% или более).
В изобретении также предложены следующие воплощения, перечисленные как 1Ь-25Ь:
1Ь. йАЬ, который не связывается (или обладает уменьшенным связыванием) с предсуществующими человеческими АОА в сыворотке крови человека, где эпитоп на йАЬ, с которым связывается АОА, замаскирован.
2Ь. йАЬ по п.1Ь, который имеет Кс связывания с АОА, составляющую 150% или более (например, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650% или более) относительно Кс для эквивалентной последовательности, в которой эпитоп не замаскирован.
3Ь. йАЬ по пп.1Ь, 2Ь, где эпитоп замаскирован посредством:
a) добавления химической группировки к С-концу; и/или
b) одной или более чем одной замены в каркасной области; и/или
c) одной или более чем одной делеции.
4Ь. йАЬ по п.3Ь, где химическая группировка содержит одну или более чем одну аминокислоту, С-концевую метку или химическую модификацию, такую как пэгилирование или амидирование.
5Ь. йАЬ по п.3Ь или 4Ь, где (а), (Ь) и/или (с) оказывают прямое конформационное действие на эпитоп, опосредованное конформационное действие на эпитоп и/или стерически затрудняют доступ к эпитопу.
6Ь. йАЬ по любому из пп.1Ь-5Ь, где указанный эпитоп: й) перекрывается с остатком ΚаЬаί 113 на С-конце; и/или е) перекрывается с остатками ΚаЬаί 14, 41, 108, 110, 112 и 113; и/или
ί) содержит выставленные на поверхности остатки ΚаЬаί 14, 41, 108, 110, 112 и 113, и любой другой остаток в пределах 5 ангстрем относительно этих положений; и/или
д) содержит каркасную область 4 и петли между бета-цепями каркасных областей 1 и 2.
7Ь. йАЬ по любому из предшествующих воплощений 1Ь-6Ь, который содержит одну или более чем одну аминокислотную замену в положениях ΚаЬаί 14, 41, 108, 110 или 112 по сравнению с человеческой каркасной последовательностью эмбрионального типа.
8Ь. Гуманизированный единичный вариабельный домен иммуноглобулина (йАЬ), который имеет нечеловеческую последовательность по одному или более чем одному из следующих остатков: остатки ΚаЬаί 14, 41, 108, 110 и/или 112.
9Ь. йАЬ по п.7Ь или 8Ь, где аминокислотные остатки в указанном одном или более чем одном положении представляют собой остатки аланина.
10Ь. йАЬ по любому из предшествующих воплощений 1Ь-9Ь, где указанной маскировки достигают при помощи аминокислотного удлинения на С-конце йАЬ.
11Ь. йАЬ по п.10Ь, где указанное удлинение составляет от 1 до 8 аминокислот.
12Ь. йАЬ по п.10Ь или 11Ь, где указанное удлинение содержит остаток аланина.
13Ь. йАЬ по п.12Ь, где указанное удлинение состоит из единичного остатка аланина.
14Ь. йАЬ по п.12Ь, где указанное удлинение выбрано из группы, состоящей из А8, А8Т, А8ТК, А8ТКО и А8ТКОР.
15Ь. йАЬ по любому из пп.1Ь-14Ь, где указанный йАЬ представляет собой νΗ, или Уь, или νΗΗ йАЬ.
16Ь. йАЬ по любому из пп.1Ь-15Ь, где мишень, с которой связывается йАЬ, представляет собой ТОТа, ТМРК1, νΕΟΡ, 1Ь-1К, 1Ь-6К, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-13, ОС-δΙΟΝ, А8ОРК, альбумин и ТОРЗК2.
17Ь. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (йАЬ) по п.16Ь, выбранный из следующих аминокислотных последовательностей, идентифицированных как (а) ΟΟΜ 1Η-131-206 йАЬ с удлинением на единичный аланин (δΕΟ ΙΟ ΝΟ: 16); (б) ΟΟΜ 1Η-131-206 йАЬ с удлинением на единичный аланин и мутацией Р14А в каркасной области (δΕΟ ГО ΝΟ: 17) (в) ΟΟΜ 1Η-131-206 йАЬ с мутацией Р14А в каркасной области (δΕΟ ГО ΝΟ: 18); (г) ΟΟΜ 1Η-131-206 йАЬ с удлинением на С-конце АδΤΚΟ (δΕΟ ГО ΝΟ: 19); и (д) ΟΟΜ 1Η-131-206 йАЬ с удлинением на С-конце АδΤΚΟ и мутацией Р14А в каркасной области (δΕΟ ГО ΝΟ: 20).
18Ь. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (йАЬ) по п.16Ь или 17Ь, где мишень представляет собой ТМРКЙ, и немодифицированный йАЬ выбран из последовательности, которая на 100, 95, 90, 85 или 80% идентична аминокислотной последовательности, идентифицированной как
ΟΟΜ 1Η-131-206 (δΕΟ ГО ΝΟ: 1), ΟΟΜ 1Η-131-511 (δΕΟ ГО ΝΟ: 2), ΟΟΜ 1Η-131-202 (δΕΟ ГО ΝΟ: 3).
19Ь. Способ маскировки эпитопа на единичном вариабельном домене иммуноглобулина (йАЬ), где эпитоп связывается с предсуществующими человеческими АОА в сыворотке крови человека, включающий стадию модификации эпитопа.
- 25 027160
20Ь. Способ уменьшения связывания единичного вариабельного домена иммуноглобулина (бАЬ) с предсуществующими человеческими АОА в сыворотке крови человека, включающий маскировку эпитопа на бАЬ, с которым связывается АОА.
21Ь. Способ по п.19Ь или 20Ь, при котором указанная маскировка приводит к уменьшению связывания с АОА, таким образом, что бАЬ, содержащий замаскированный эпитоп, имеет Кс, которая составляет 150% или более чем 150% относительно Кс для бАЬ, в котором эпитоп не замаскирован.
22Ь. Способ по любому из пп.19Ь-21Ь, где эпитоп замаскрован посредством:
1ι) добавления химической группировки к С-концу; и/или ί) одной или более чем одной каркасной замены; и/или _)) одной или более чем одной делеции.
23Ь. Способ по п.22Ь, где химическая группировка содержит одну или более чем одну аминокислоту, С-концевую метку или химическую модификацию, такую как пэгилирование или амидирование.
24Ь. Способ по п.22Ь или 23Ь, где (а), (Ь) и/или (с) оказывают прямое конформационное действие на эпитоп, опосредованное конформационное действие на эпитоп и/или стерически затрудняют доступ к эпитопу.
25Ь. Способ по любому из пп.19Ь-24Ь, где указанный эпитоп:
k) перекрывается с остатком КаЬа! 113 на С-конце;
l) перекрывается с остатками КаЬа! 14, 41, 108, 110, 112 и 113; и/или
т) содержит выставленные на поверхности остатки КаЬа! 14, 41, 108, 110, 112 и 113, и любые другие остатки в пределах 5 ангстрем на этой поверхности; и/или
п) содержит каркасную область 4 и петли между бета-цепями каркасных областей 1 и 2.
В дополнительных воплощениях 1с-15с изобретения ниже предложены:
1с. Гуманизированный единичный вариабельный домен иммуноглобулина Унн, который сохраняет один или более чем один остаток эмбрионального типа камелид среди остатков КаЬа! 14 и/или 108.
2с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.1с, который имеет Кс связывания с человеческими АОА в сыворотке крови человека, которая составляет 150% или более (например, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650% или более) относительно Кс для эквивалентной последовательности, в которой остатки 14 и/или 108 гуманизированы.
3с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.1с или 2с, в котором одна или более чем одна аминокислота на С-конце удалена.
4с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.3с, где одна аминокислота на С-конце удалена.
5с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.1с или 2с, который содержит добавление, удлинение или метку на С-конце.
6с Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.5с, где указанное добавление, удлинение или метка выбраны из группы, состоящей из удлинения на одну или более чем одну аминокислоту, С-концевой метки или химической модификации, такой как пэгилирование или амидирование.
7с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.5с или 6с, в котором указанное удлинение составляет от 1 до 8 аминокислот.
8с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.7с, где указанное удлинение содержит остаток аланина.
9с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.8с, где указанное удлинение состоит из единичного остатка аланина.
10с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.8с, где указанное удлинение выбрано из группы, состоящей из А8, А8Т, А8ТК, А8ТКО, А8ТКОР, А8ТКА, А8ТКАР и А8ТКАР8.
11с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из предшествующих воплощений 1с-10с, который дополнительно содержит нечеловеческие остатки по одному или более чем одному из следующих остатков: остатки КаЬа! 41, 110 и/или 112.
12с. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из предшествующих воплощений, где мишень, с которой связывается бАЬ, представляет собой ТОТа, ТЫРК1, УЕОР, 1Ь-1К, 1Ь-6К, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-13, ПС-δΙΟΝ, А8ОРК, альбумин и ТОРЗК2.
13с. Способ гуманизации единичного вариабельного домена иммуноглобулина Унн камелид, включающий сохранение одного или более чем одного остатка эмбрионального типа камелид среди остатков КаЬак 14 и/или 108.
14с. Способ уменьшения связывания единичного вариабельного домена иммуноглобулина (бАЬ) Унн камелид с предсуществующими АОА, включающий сохранение остатка эмбрионального типа камелид среди остатков КаЬак 14 и/или 108.
15с. Способ по п.13с или 14с, где указанное сохранение приводит к уменьшению связывания с АОА, таким образом, что Унн, содержащие камелидные остатки в положениях 14 и/или 108, имеют Кс связывания с человеческими АОА в сыворотке крови человека, которая составляет 150% или более чем 150% относительно Кс для Унн с эквивалентной последовательностью, в которой эти остатки гуманизи- 26 027160 рованы.
Следует отметить, что используемый здесь термин йАЬ представляет собой зарегистрированный товарный знак.
Примеры
Пример 1. Частота здоровых субъектов с предсуществующими АЭА к йАЬ, обозначаемыми Ό0Μ Ш-131-206.
Процедура анализа Ό0Μ Ш-131 -206 (Ун) АОА.
Ό0Μ 1н-131-206 (δερ ΙΌ N0: 1) биотинилировано в молярном отношении биотина 8:1. После мечения биотинилированный Ό0Μ Ш-131-206 (ГЕР ΙΌ N0: 1) подвергают замене буфера и хранят в буферной смеси, содержащей 14 мМ фосфат натрия, 8,4% сахарозу, 0,35% глицин, 0,014% полисорбат 80, с рН 7,4.
Ό0Μ 1н-131-206 мечено рутением в молярном отношении сульфо^ад 5:1. После мечения меченые сульфоМА0 Ό0Μ 1н-131-206 подвергают замене буфера и хранят в буферной смеси, содержащей 14 мМ фосфат натрия, 8,4% сахарозу, 0,35% глицин, 0,014% полисорбат 80, с рН 7,4.
Анализ антитела против лекарственного средства (АЭА) представляет собой анализ связывания, осуществляемый на платформе с технологией ΜδΌ™ ЕСЬ (электрохемилюминесценция). Технология ΜδΌ™ (доступная от Μе5о кса1е ОЖоуегу, Μаίу1аηй, ^А) использует рутениевый металло-хелат в качестве ЕСЬ-метки в сочетании с углеродными электродами, помещенными в лунки микротитровального планшета, покрытые стрептавидином. Связанный сульфо^ад™, используемый в анализе, генерирует хемилюминесцентный сигнал, который запускается, когда в приборе прикладывается напряжение тока ^еко δса1е Э|5соуегу δесΐо^™ Енадег 6000). Образующийся в результате люминесцентный сигнал измеряется в единицах ЕСЬ™. Интенсивность сигнала прямо пропорциональна количеству обнаруживаемых антител в образце. Отрицательные (нормальная человеческая сыворотка крови; М^) и положительные (ТС; мышиное идиотипическое антитело против Ό0Μ Ш-131-206, введенное в нормальную человеческую сыворотку крови) контрольнные образцы (ОС) анализируют в каждом планшете.
Ниже описано обобщение процедур анализа.
1. ΜδΌ™ стрептавидиновый планшет блокируют 150 мкл/лунку блокирующим казеином в ΡΒδ (физиологический раствор, забуференный фосфатом) (1%) при комнатной температуре (КТ) в течение 1-2 ч. Блокатор удаляют без промывки.
2. После 1 ч предварительной инкубации гомогенную смесь, содержащую 0,1 мкг/мл биотинилированного Ό0Μ Ш-131-206 (лекарственное средство), 0,1 мкг/мл рутенилированного (сульфо-Τад™) Ό0Μ 1н-131-206 (лекарственное средство) и 2% образец сыворотки крови в разбавителе для анализа (1% казеин в ΡΒδ), переносят в планшет ΜδΌ™ и инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин при КТ.
3. ΜδΌ-планшет затем трижды промывают ΡΒδΤ (ΡΒδ, содержащий Жуееп 20).
4. Добавляют 150 мкл/лунку буфера для визуализации и содержимое планшета подвергают визуализации.
Во время валидации этого специфического иммуноанализа панель из 60 образцов сыворотки крови здоровых доноров-людей скринировали в отношении базовой реактивности в анализе. Определили, что приблизительно 45% образцов сыворотки крови этих субъектов демонстрировали обнаруживаемые Ун-реактивные аутоантитела, большая часть из которых имела изотип Ι§0, которые обладали способностью к связыванию с Ό0Μ Ш-131-206 (результаты представлены на фиг. 1).
Свободное немеченное Ό0Μ Ш-131-206 конкурирует за связывание с АОА в этом анализе, приводя к уменьшению интенсивности сигнала (высокий % ингибирования сигнала). Этот подтверждающий анализ использовали для определения того, могут ли модифицированные варианты Ό0Μ Ш-131-206 и молекулы, основанные на другом антителе, конкурировать с Ό0Μ Ш-131-206 за связывание с АОА.
Пример 2. Аминокислотные замены в каркасной области Ун Ό0Μ Ш-131-206.
Свободное немеченное Ό0Μ Ш-131-206 конкурирует за связывание с АОА и приводит к уменьшенной интенсивности сигнала в анализе Ό0Μ Ш-131-206 АОА, как описано выше. Таким образом, этот подтверждающий анализ использовали для определения того, могут ли тестируемые материалы, например Ό0Μ Ш-131-206, модифицированные варианты Ό0Μ Ш-131-206 или другие молекулы, основанные на антителе (тестируемый материал), также ингибировать связывание АОА с Ό0Μ Ш-131-206.
Для исследования того, может ли быть уменьшено связывание АОА с каркасными областями Ун, осуществляли множество аминокислотных замен и других модификаций в каркасных областях Ό0Μ 1н-131-206 при помощи стандартных способов сайт-направленного мутагенеза.
Молекулы с заменами (тестируемые материалы) анализировали с использованием следующего способа (Подтверждающий анализ):
Ό0Μ 1н-131-206 Процедура подтверждающего анализа (который может быть использован для скрининга Ун йАЬ в отношении связывания с АОА):
1. 10 мкг/мл Ό0Μ 1н-131-206 или другого тестируемого материала, такого как модифицированные йАЬ, предварительно инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин при КТ с 4% положительной в отношении АОА человеческой сывороткой в разбавителе для анализа (1% казеин в ΡΒδ).
- 27 027160
2. Покрытый стрептавидином планшет МЗБ™ блокируют 150 мкл/лунку блокирующего казеина в РВЗ (1%) при комнатной температуре (КТ) в течение 1-2 ч. Блокатор удаляют без промывки.
3. В микротитровальном планшете для анализа образец, содержащий образец сыворотки крови человека, положительной в отношении ЛБЛ, и 10 мкг/мл тестируемого материала, такого как модифицированные 4ЛЬ, добавляют в гомогенную смесь биотинилированного Б0М Ш-131-206 (ЗЕф 1Б N0: 1) (лекарственное средство) и рутенилированного (сульфо-Тад™) Б0М Ш-131-206 (ЗЕф 1Б N0: 1) (лекарственное средство) в разбавителе для анализа (1% казеин в РВЗ), таким образом, что конечные концентрации составляют 2% положительной в отношении ЛБЛ сыворотки крови человека, 0,1 мкг/мл биотинилированного Б0М 1н-131-206 (ЗЕф 1Б N0: 1) (лекарственное средство) и 0,1 мкг/мл рутенилированного (сульфо-Тад™) Б0М Ш-131-206 (ЗЕф 1Б N0: 1) (лекарственное средство) и инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин при КТ.
4. После инкубации в течение 1 ч анализируемые образцы переносят в блокированный МЗБ-планшет и планшет инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин в темноте при КТ.
5. Планшет МЗБ™ затем трижды промывают РВЗТ.
6. Добавляют 150 мкл/лунку буфера для визуализации и содержимое планшета подвергают визуализации.
Для каждого эксперимента с отличающимся родительским клоном (результаты, представленные в табл. 1) человеческих образцов сыворотки крови от 10 положительных в отношении ЛБЛ субъектов тестировали в вышеприведенном подтверждающем анализе (в примере 2)/ Результаты представлены в табл. 1Ь в виде (общего) среднего % ингибирования сигнала и также % субъектов со связыванием с ЛБЛ. Чем меньше % ингибирования сигнала, тем меньше модифицированное соединение было способно связываться с ЛБЛ. Отсечение, составляющее приблизительно 40,5% в % ингибирования сигнала, использовали для того, чтобы продемонстрировать незначительное связывание с ЛБЛ.
С использованием подтверждающего анализа определили, что аминокислотные замены в следующих положениях значимо уменьшали связывание предсуществующих ЛБЛ с Б0М Ш-131-206, в то же время сохраняя способность к связыванию с антигеном, т.е. связывание с 'ТЫЕК1, как определено с использованием процедуры анализа аффинности в отношении ТМЕК1, представленной в примере 5с (результаты представлены в табл. 1): Р14А, Р41А, Е108О.
Пример 3. Аминокислотные удлинения в каркасной области Ун Б0М Ш-131-206.
Для определения того, может ли модификация С-конца каркасной области Ун уменьшать связывание с ЛБЛ, осуществили множество С-концевых модификаций каркасной области при помощи стандартных методик сайт-направленного мутагенеза. Молекулы с заменами (тестируемые материалы) анализировали с использованием подтверждающего анализа, как ранее описано в примере 2), и результаты представлены ниже в табл. 1.
Удлинение на С-конце Б0М Ш-131-206 или других тестируемых молекул также значимо уменьшало связывание с предсуществующими ЛБЛ (табл. 1, 2). Результаты, представленные в табл. 2, также получены с использованием подтверждающего анализа, как описано ранее в примере 2. Примеры представляют собой удлинения Л, ЛЗ, ЛЗТ, ЛЗТК, ЛЗТКО, ЛЗТКОР, ЛЛЛ и все более длинные тестируемые удлинения. Клоны Унн, которые не были гуманизированными, как правило, обладали меньшими уровнями связывания с ЛБЛ.
- 28 027160
Оценка связывания АБА с мутантами Ό0Μ 1Н-131-206
Таблица 1
Родительский клон Модификация последовательности Средний % ингибирования сигнала в подтверждающем анализе (среднее значение - для 10 субъектов) % субъектов со связыванием οΑϋΑ (Ю субъектов)
ϋΟΜ 1Н-131-206 Немодифицированная 99,47 100
ϋΟΜ 1Н-131-206 01 ЗА 99,21 100
ϋΟΜ 1Н-131-206 Р14А 58,32 100
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р41А 87,35 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 К43А 99,51 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 О44Е 99,47 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Н83А 99,32 100
ЭОМ 1 Η-131-206 Н913 99,38 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 1_108О 90,92 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Р14А, О44Е 61,61 100
ЭОМ 1 Η-131-206 О44Е, Н913 99,11 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Р14А, Н913 50,23 60
ϋΟΜ 1 Η-131-206 О44Е, 1_108О 91,29 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Немодифицированная 96,13 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая А 15,74 0
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая АЗ 16,28 0
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая АЗТ 26,41 50
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая АЗТК 19,60 40
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая АЗТКО 28,27 40
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая АЗТКО Р 42,63 60
% ингибирования - связывание с АСА (% ингибирования сигнала, когда данный белок конкурирует в анализе связывания с АСА (подтверждающий анализ)).
- 29 027160
Оценка связывания с АЭА молекул Унн и доменных антител Ун с С-концевыми удлинениями
Таблица 2
Родительский клон Модификация последовательности Средний % ингибирования сигнала в подтверждающем анализе (среднее значение - для 10 субъектов) % субъектов со связыванием οΑϋΑ (Ю субъектов)
Пасколизумаб -ϋΤ04-Η-033 Немодифицированная 99,48 100
Пасколизумаб -ϋΤ04-Η-033 С-концевая ААА 3,46 0
Пасколизумаб -ϋΤ04-Η-033 С-концевая ΑδΤ 3,44 0
Пасколизумаб -ϋΤ04-Η-033 С-концевая Αδ 4,12 0
Пасколизумаб -ϋΤ04-Η-033 С-концевая А 7,46 0
ϋΟΜ1ή-574- 208 Немодифицированная 94,13 100
ϋΟΜ1ή-574- 208 - УЬ слияние С-концевая УЬ бАЬ 4,43 0
ОТ04-Н-033 С-концевая ААА 10,98 0
ϋΤ04-Η-033 С-концевая ΑδΤ 14,00 0
ϋΤ04-Η-033 С-концевая Αδ 8,26 0
ϋΤ04-Η-033 С-концевая А 12,48 0
- 30 027160
ϋΤ04-Η-033 С-концевая Р1_АС (последовательность пептида из 6 аминокислот) 12,80 0
νΗΗ клон 2 - 40842 (11_6Н) Немодифицированная 18,66 20
УНН клон 7 - 40842 (11_6Н) Немодифицированная 21,96 20
УНН клон 3 - 40955 (ΒΑΝΚΙ-- камелидный) Немодифицированная 23,68 20
νΗΗ клон 8 - 41015 (ΒΑΝΚΙ-- камелидный) Немодифицированная 20,08 20
νΗΗ клон 9 - 41016 (ΒΑΝΚΙ-- гуманизиро- ванный) Немодифицированная 88,45 100
% ингибирования - связывание с ΑΌΑ (% ингибирования сигнала, когда данный белок конкурирует в анализе связывания ΑΌΑ).
Последовательность метки ΡΕΑΟ может быть найдена в №!иге Вю1есйпо1о§у, 1988, Уо1. 16, р. 12041210.
Следует отметить, что (в среднем) 40% ингибирование сигнала (или менее чем 40% ингибирование сигнала) учитывают для того, чтобы продемонстрировать незначительное связывание с ΑΟΑ.
Пример 4. Комбинирование аминокислотных замен и С-концевого удлинения с каркасными областями Ун Э0М Ш-131-206.
Для определения того, может ли комбинация аминокислотных замен и модификация С-конца каркасной области Ун уменьшить связывание с ΑΌΑ, осуществили множество С-концевых модификаций и/или аминокислотных замен в каркасных областях при помощи стандартных методик сайтнаправленного мутагенеза. Молекулы с заменами анализировали с использованием подтверждающего анализа, описанного ранее в примере 2. Результаты представлены в табл. 3.
- 31 027160
Таблица 3
Родительский клон Модификация последовательности Средний % ингибирования сигнала в подтверждающем анализе (среднее значение - для 10 субъектов) % субъектов со связыванием οΑϋΑ (Ю субъектов)
ϋΟΜ 1Н-131-206 С-концевая А 1,12 0
ϋΟΜ 1Н-131-206 С-концевая АЗТКС 1,77 0
ϋΟΜ 1Н-131-206 Р14А + С-концевая А 8,76 0
ϋΟΜ 1Η-131 -206 Р14А + С-концевая АЗТКС 11,93 0
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая А8Т 34,96 20
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая делеция 5 (Δ5) 44,67 40
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Р14Е 47,22 60
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Р14К 46,70 50
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Ρ14Θ 52,87 60
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Р14Т 68,86 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 1_11А 97,96 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 А84Т 90,96 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Ι_108А 94,30 100
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Т110А 78,84 100
ЭОМ 1 Η-131-206 3112А 77,11 80
ЭОМ 1 Η-131-206 Р14К + С-концевая А 29,13 10
ϋΟΜ 1Н-131-206 Ρ14Κ + С-концевая АЗТКС 25,01 10
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Ρ14Θ + С-концевая А 29,66 20
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Ρ14Θ + С-концевая АЗТКС 21,76 10
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Р14Т + С-концевая А 32,97 20
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Р14Т + С-концевая АЗТКС 17,19 0
Примеры 5а и 5Ь. Аффинность С-концевого удлинения Ώ0Μ 1Н-131-206.
Дальнейшие исследования осуществляли для определения того, приводят ли модификации Ώ0Μ 1Н-131-206, уменьшающие связывание с предсуществующими АБА, к каким-либо изменениям аффинности этого бАЬ в отношении своей мишени, человеческого Т№К.1.
Пример 5а. Оценка связывания ТПРК1 с мутантами Ώ0Μ 1Н-131-206 при помощи ЕЫ8А (иммуноферментный анализ).
Способность модифицированных вариантов Ώ0Μ 1Н-131-206 (тестируемые бАЬ) связываться с человеческим ТМ;К1 определяли при помощи ЕЫ8А. Обнаружили, что мутация в каркасной области и Сконцевые модификации, которые, как продемонстрировано, уменьшают связывание с предсуществующими АБА, как правило, обладали сравнимым связыванием с Т№К.1 по сравнению с родительским Ώ0Μ 1Н-131-206 бАЬ. Исключение составлял только Ώ0Μ 1Н-131-206 с С-концевым удлинением А8ТКОР, который обладал приблизительно в 5 раз меньшей ЕС50 (средней эффективной концентрацией) связывания с Т№’К1 по сравнению с родительским бАЬ Ώ0Μ 1Н-131-206.
- 32 027160
Протокол ЕЫЗЛ-анализа связывания с ТЖ'Н1.
1. Рекомбинантный человеческий ТЖ'Н1-Ес (Κ&Ό Зу§1ет§) добавляют в 96-луночные планшеты для ЕЫЗЛ в конечной концентрации 0,1 мкг/мл в карбонатном-бикарбонатном буфере с рН 9,4 (Р1егсе).
2. После инкубации в течение ночи при 4°С избыток ТЖ'Н1:Ес удаляют путем трехкратного промывания промывочным буфером (промывочный буфер - 0,1% Т^ееп-20/РВЗ) и трехкратного промывания РВЗ.
3. Планшеты блокируют 1% ВЗЛ (бычий сывороточный альбумин) в РВЗ в течение 1 ч при комнатной температуре. Блок удаляют путем промывания, как описано выше, и затем тестируемые образцы ЕЛЬ, разведенные в разбавителе для анализа (0,1% ВЗЛ + 0,05% Т^ееп-20/РВЗ) добавляют в планшет и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. После промывки, как описано выше, добавляют поликлональные кроличьи антитела против человеческого 1д (УЕ специфические) в разведении 1:1000 в разбавителе для анализа и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. После промывки, как описано выше, конъюгат мышиного антитела против кроличьего антитела с нКР (пероксидаза хрена) добавляют в разведении 1:10000 в разбавителе для анализа и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
6. После промывки, как описано выше, в каждую лунку добавляют по 100 мкл субстрата ЗигеВ1ие ТМВ. После развития достаточного синего окрашивания ферментативную реакцию останавливают при помощи 100 мкл 1 М нС1 и содержимое планшета подвергают визуализации при 450 нм.
7. Кривые зависимости ответа от дозы для каждого тестируемого ЕЛЬ строят путем нанесения концентрации в зависимости от значений поглощения. Значения ЕС50 для связывания ЕЛЬ с ТЖ'Н1 определяют с использованием ОгарЕраЕ Рпзт.
Таблица 4а
Оценка связывания с ТЖ'Н1 для мутантов 1)0М Ш-131-206
Родительский клон Модификация последовательности Средняя ЕС50 для связывания ΟΤΝΕΗ1 (нМ)
ϋΟΜ 1Н-131-206 Немодифицированная 1,99
ϋΟΜ 1Н-131-206 Θ1 ЗА 1,75
ϋΟΜ 1Н-131-206 Р14А 1,22
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р41А 0,59
ϋΟΜ 1 Η-131-206 К43А 0,67
ϋΟΜ 1 Η-131-206 О44Е 0,86
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Н83А 0,76
ϋΟΜ 1Н-131-206 Η913 0,96
ЭОМ 1 Η-131-206 И 080 0,85
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Ρ14Α, Ο44Ε 2,03
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Ο44Ε, Η913 3,50
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Ρ14Α, Η913 0,75
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Ο44Ε, Ι_108Ο 1,64
ϋΟΜ 1 Η-131-206 Немодифицированная 1,99
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая А 1,21
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая ΑδΤΚ 1,59
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая ΑδΤΚΟ 1,11
ϋΟΜ 1 Η-131-206 С-концевая ΑδΤΚΟР 11,89
- 33 027160
Таблица 4Ь
Оценка связывания с ΤΝΡΚ1 для мутантов ΌΟΜ 1Η-131-206
Родительский клон Модификация последовательности Средняя ЕС50 для связывания ΟΤΝΕΒ1 (нМ)
ϋΟΜ 1Н-131-206 Немодифицированная 0,67
ϋΟΜ 1Н-131-206 Ρ14Α + С-концевая А 0,57
ϋΟΜ 1Н-131-206 Р14А + С-концевая ΑδΤΚΟ 1,47
ϋΟΜ 1Η-131-206 С-концевая ΑδΤ 1,99
ϋΟΜ 1Η-131-206 С-концевая делеция δ (Δδ) 0,50
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р14Е 0,64
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р14К 0,72
ϋΟΜ 1Η-131-206 Ρ14Θ 0,91
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р14Т 0,77
ϋΟΜ 1Η-131-206 Ι_11А 0,51
ϋΟΜ 1Η-131-206 А84Т 0,79
ϋΟΜ 1Η-131-206 Ι_108А 0,70
ϋΟΜ 1Η-131-206 Т110А 0,29
ϋΟΜ 1Η-131-206 5112А 1,19
ϋΟΜ 1Η-131-206 Ρ14Κ + С-концевая А 0,46
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р14К + С-концевая ΑδΤΚΟ 0,48
ϋΟΜ 1Η-131-206 Ρ14Θ + С-концевая А 0,46
ϋΟΜ 1Η-131-206 Ρ14Θ + С-концевая ΑδΤΚΟ 1,10
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р14Т + С-концевая А 0,66
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р14Т + С-концевая ΑδΤΚΟ 0,72
Таблица 4с
Оценка связывания с ΤΝΡΚ1 для мутантов ΌΟΜ 1Η-131-206
Родительский клон Модификация последовательности Средняя ЕС50 для связывания οΤΝΕΗΙ (нМ)
ϋΟΜ 1Н-131-206 Немодифицированная 1,97
ϋΟΜ 1Н-131-206 С-концевая А 2,71
ϋΟΜ 1Н-131-206 Р14А + С-концевая А 2,22
ϋΟΜ 1Η-131-206 С-концевая А5ТКО 1,90
ϋΟΜ 1Η-131-206 Р14А + С-концевая ΑδΤΚΟ 4,64
Пример 4Ь. Процедура анализа аффинности ΤΝΡΚ1 с использованием В1асоге™.
Аффинность модифицированного ΌΟΜ 1Η-131-206 бАЬ с С-концевым удлинением А определяли при помощи поверхностного плазмонного резонанса с использованием В1асоге™ Т100. Антитело против человеческого Ι§Ο иммобилизовали на чипе СМ4 и человеческий ТЖКРРс захватывали на этой поверхности до уровня, составляющего приблизительно 60 относительных единиц. Тестируемые вещества, разбавленные в буфере до конечных концентраций от 25 до 0,024 нМ (в 4-кратном диапазоне разведения), водили над ТЖКРРс. Полученные кривые связывания подвергали двойному сравнению с эталонными
- 34 027160 значениями с использованием кривой тестируемого материала 0 нМ и данные подгоняли к модели связывания 1:1 для получения кинетических данных. Связывание тестируемого материала с ΤNРΚ1 яванского макака определяли тем же самым путем. Данные кинетики связывания представлены в табл. 4б.
В заключение, кинетики связывания модифицированных (т.е. с добавлением С-концевого А) и немодифицированных ΤNРΚ1 бАЬ были похожи.
Таблица 4б
Модификация ООМ1Н- 131-206 Кинетика связывания
Ка (М-1.с-1) (х106) Кб (с-1) (х104) Κϋ(Μ) (х10-11)
Человеческий ΤΝΕΒ1 С-концевая А 9,02 2,29 2,53
Немодифицированная 9,94 1,42 1,43
ΤΝΕΗ1 яванского макака Немодифицированная 10,10 1,51 1,50
С-концевая А 9,60 1,89 1,97
Для приведенных выше данных ошибки не рассчитывали.
Пример 6. Фармакокинетика удлинения ΌΟΜ 1Н-131-206 на С-конце.
Дополнительные исследования осуществляли для определения того, приводят ли модификации ΌΟΜ 1Н-131-206, которые уменьшают связывание с предсуществующими АОЛ, к каким-либо изменениям в фармакокинетике этого бАЬ.
Фармакокинетическая процедура.
Системное воздействие ΌΟΜ 1Н-131-206 и ΌΟΜ 1Н-131-206 с С-концевым удлинением на аланин определяли у яванского макака. Отдельным группам из 5 яванских макак вводили дозы тестируемых материалов 30-минутной внутривенной инфузией. Образцы плазмы крови собирали до 48 ч после введения дозы и уровни двух тестируемых материалов определяли при помощи иммуноанализа. Кратко, биотинилированное антитело, специфическое в отношении тестируемого материала, добавляли в покрытый стрептавидином 96-луночный микротитровальный планшет, в который затем добавляли образцы плазмы крови макака. Добавляли меченный дигоксигинином человеческий ΤΝΙ;Η1:ΙΑ, после чего добавляли конъюгированное с пероксидазой хрена антитело против дигоксигинина. Наконец, добавляли субстрат ТМВ (тетраметилбензидин) (доступный от Κ+Ό зуз1;етз) и количество тестируемого материала определяли при помощи обратного расчета колориметрического сигнала на основании стандартной кривой для тестируемого материала.
Не обнаружено никаких примечательных (более чем 2-кратных) изменений усредненных для пола параметров системного воздействия, когда ЭОМ-1Н131-206 сравнивали с ЭОМ-1Н131-206+А у яванского макака после внутривенной инфузии. Авторы изобретения сделали заключение, что модификации ΌΟΜ 1Н-131-206 путем добавления С-концевого удлинения (+А) не влияли на фармакокинетику бАЬ (представлены в табл. 5).
Таблица 5
Фармакокинетика мутантов ΌΟΜ 1Н-131-206 после единичной внутривенной дозы у яванского макака
Родительски й клон Модификация последовательности Период полувыведения из плазмы крови + стандартное отклонение Клиренс (мл/мин/ кг) Объем распределе- ния + стандартное отклонение
ϋΟΜ 1Н- 131-206 Немодифициро- ванная 2,80 + 0,32 1,48 + 0,21 0,25 + 0,05
ϋΟΜ 1Н- 131-206 С-концевая А 2,57 + 0,64 2,31 + 0,49 0,34 + 0,04
- 35 027160
Пример 7а. Экспрессия вариантов БОМ Ш-131-206.
Для определения того, оказывают ли модификации каркасной области Ун, которые уменьшают связывание с предсуществующими АБА, влияние на экспрессию ЙАЬ против ΤΝΡΚ1, выход для панели модифицированных вариантов БОМ Ш-131-206 ЙАЬ против ΤΝΡΚ1 сравнивали с родительским клоном после выращивания в ферментационных сосудах объемом 1 л. Тестируемые ЙАЬ включали С-концевое удлинение (+А или тАЗ^О), с заменой в каркасной области (Р14А) или без нее. Тестируемые ЙАЬ экспрессировали в том же самом штамме Е.сой с использованием того же самого микробного вектора экспрессии (рауе011 (Ауеша)) в виде немодифицированного БОМШ 131-206 (ЗЕ^ 1Б NО: 1). При низкомасштабном уровне экспрессии (1 л) общий выход для ЙАЬ с С-концевыми удлинениями + А или +А31КО был сходным с немодифицированным родительским клоном. Выход для ЙАЬ с заменой Р14А и С-концевым удлинением (+А или +АЗГГКО) был снижен по сравнению с немодифицированным родительским клоном (табл. 6а).
Процедура экспрессии.
Стадию удлинения затравки завершали путем внесения во встряхиваемую колбу объемом 100 мл флакона с клетками Е.сой, экспрессирующими конструкцию ЙАЬ в микробном векторе экспрессии.
После приблизительно 10 ч роста колбу с затравкой используют для внесения в ферментер объемом 1 л. Процесс продукции осуществляют в течение до трех стадий, замеса, подпитки и индукции. Начальная фаза замеса длится в течение приблизительно 13 ч, в течение которых культуру выращивают экспоненциально при 37°С (с пошаговым понижением до 30°С в течение последних 4 ч) до тех пор, пока не истощится основной источник углерода глицерин. В момент истощения глицерина наблюдается пик растворенного кислорода (БО), и начинается подача питательной среды (стадия подпитки). Приблизительно через 5 ч после начала подачи питательной среды (при ОБ600 (оптическая плотность при 600 нм), равной 75) культуру индуцируют ΙΡΤΟ (изопропилтиогалактозид) (стадия индукции), и во время этой фазы процесса продукт продуцируется и высвобождается в среду. Партию останавливают приблизительно через 48 ч после индукции и количество ЙАЬ в супернатанте оценивают при помощи ПРЕС (высокоэффективная жидкостная хроматография).
Таблица 6а
Экспрессия титров вариантов БОМ 1н-131-206
Родительский Модификация Титр собираемого
клон последовательности супернатанта (г/л)
ϋΟΜ1 Н-131-206 Немодифицированная 2,71
ϋΟΜ1 Н-131 -206 С-концевая А 3,15
ϋΟΜ1 Н-131-206 С-концевая А8ТКС 2,22
ϋΟΜ1 Н-131 -206 Р14А + С-концевая А 0,29
ϋΟΜ1 Н-131 -206 Р14А + С-концевая А8ТКС 0,18
Заключения по результатам этого эксперимента были следующими:
1) БОМ 1н-131-206 + А, БОМ 1н-131-206 + АЗГКО и мутанты дикого типа демонстрировали очень хорошую экспрессию ЙАЬ.
Самый высокий титр составлял приблизительно 3000 мг/л.
2) Мутанты БОМ 1н-131-206 Р14 + А и БОМ 1н-131-206 р14 + АЗГКО не могли экспрессировать ЙАЬ в процессе.
3) В общем, БОМ 1н-131-206 + А и БОМ 1н-131-206+АЗгГКО были сравнимы с диким типом в отношении уровня экспрессии ЙАЬ.
Пример 7Ь. Стабильность БОМ 1н-131 -206 с С-концевым аланином.
Стабильность БОМ 1Н-131-206 + А с С-концевым удлинением на аланин определяли в сыворотке крови человека, легочном гомогенате или печеночном гомогенате путем измерения с использованием валидированного иммуноанализа для БОМ 1Н-131-206 (описанного ниже), который обнаруживает БОМ 1Н-131-206, но очень слабо перекрестно-реактивен в отношении БОМ 1Н-131-206 + А. Это является следствием того, что обнаруживающее антитело М2.3О10.1 О06 сильно связывается с БОМ 1Н-131-206, но слабо с БОМ 1Н-131-206 + А. В формате анализа применяется человеческий ΤΝ1;Η1:1%' в качестве захватывающего реагента и, таким образом, рассматривается как специфичный в отношении интактного функционального ЙАЬ.
Обнаружено, что плазма крови, в которую введены 2 мкг/мл БОМ 1Н-131-206 + А, демонстрировала обнаружение приблизительно 6,4 нг/мл в этом анализе, тогда как буфер, в который введены 2 мкг/мл ОЗК2862277, демонстрировал обнаружение 11,3 нг/мл. Таким образом, перекрестная реактивность БОМ Ш-131-206 + А в анализе БОМ Ш-131-206 оценивалась как 0,25-0,5%.
- 36 027160
Для исследования превращения в цельную кровь человека в гомогенат легких человека (10 мг белка/мл) или в гомогенат печени человека (10 мг белка/мл) вводили 1 мкг/мл ΌΟΜ 1Η-131-206, ΌΟΜ 1Η-131-206 + А или буфер (без добавления лекарственного средства). После инкубации в течение 0, 3, 6 или 24 ч плазму/супернатант собирали путем центрифугирования, и образцы замораживали перед анализом в отношении ΌΟΜ 1Η-131-206 с использованием валидированного иммуноанализа (рабочий диапазон от 0,1 до 10 нг/мл).
В течение 24 ч отсутствовало значимое превращение ΌΟΜ 1Η-131-206 + А в ΌΟΜ 1Η-131-206 в любой из матриц, о чем может свидетельствовать увеличение сигнала в иммуноанализе (вследствие образования ΌΟΜ 1Н-131-206). Это свидетельствует о том, что дополнительный С-концевой аланин не предрасположен к быстрому протеолитическому расщеплению.
Протокол для валидированного иммуноанализа ΌΟΜ 11Н-131-206.
Биотинилированные тАЬ против νΗ (Μ2.3010.1006) разбавляют в буфере для анализа (10 мМ Тгй, 150 мМ №С1, 0,1% ВδА, 0,1% Т\уееп 20, рН 7,5) и 100 мкл добавляют с конечной концентрацией 10 нг/мл в каждую лунку планшета, покрытого нейтравидином (Р1егсе). Планшет закрывают и инкубируют в течение 1 ч при 37°С.
Микротитровальный планшет 5 раз промывают 300 мкл промывочного буфера (10 мМ ТгЬ, 150 мМ №С1, 0,1% Т\уееп 20, рН 7,5) с использованием аппарата для промывания планшетов.
Добавляют по 100 мкл/лунку стандартов, и образцов, разведенных в матрице, и планшет закрывают и инкубируют при постоянном встряхивании в течение приблизительно 2 ч при 37°С.
Микротитровальный планшет 5 раз промывают 300 мкл промывочного буфера.
Добавляют по 100 мкл/лунку меченного дигоксигенином ИТ№К1:Рс (1:40000) и планшет закрывают и инкубируют при постоянном встряхивании в течение приблизительно 2 ч при 37°С.
Микротитровальный планшет 5 раз промывают 300 мкл промывочного буфера.
Добавляют по 100 мкл/лунку меченного ИКР мышиного антитела против дигоксигенина (АЬсат)(1:20000), и закрывают асептической закрывающей пленкой, и планшет закрывают и инкубируют при постоянном встряхивании в течение приблизительно 2 ч при 37°С.
Микротитровальный планшет 5 раз промывают 300 мкл промывочного буфера.
Добавляют по 100 мкл/лунку субстрата ТМВ (ТИегто) и планшет инкубируют при постоянном встряхивании в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре.
Добавляют 100 мкл/лунку останавливающего раствора для субстрата ТМВ (δίβΐηη) и поглощение при 450 нм для каждой лунки визуализируют с использованием аппарата для визуализации планшетов. Стандартную кривую подгоняют в соответствии с 1х взвешенным четырехпараметрическим логистическим алгоритмом с использованием δΜδ2000, и неизвестные образцы интерполируют на основе кривой.
Пример 7с. Способность ΌΟΜ 1Η-131-206 с С-концевым удлинением на аланин (+А) ингибировать передачу сигнала 'ТЫРКР
Сигнал ТЫРа идет через путь ΝΡκΒ и приводит к секреции различных цитокинов, включая 1Ь-8. В нестимулированных клетках мРНК 1Ь-8 быстро деградирует. Однако в присутствии ТОТа активация пути КРИВ приводит к стабилизации мРНК 1Ь-8. Эта стабилизация приводит к увеличению мРНК и вносит вклад в индукцию секреции 1Ь-8. Следовательно, в этом анализе индукция секретируемого 1Ь-8 позволяет определить, влияет ли С-концевое удлинение на способность ΌΟΜ 1Η-131-206 или ΌΟΜ 1Η-131-206 + А (т.е. С-концевое удлинение на аланин) ингибировать передачу сигнала ТНРК1. Эти исследования осуществляли в линиях клеток человека и яванского макака, и также в цельной крови человека и яванского макака. Сравнение значений 1С50 продемонстрировало, что удлинение С-конца ΌΟΜ 1Η-131-206, которое уменьшало связывание с предсуществующими АОА, не оказывало негативного воздействия на способность ΟΟΜ 1Η-131-206 ингибировать передачу сигнала через ТНРК1 в человеческих клетках или клетках яванского макака (табл. 6Ь).
Протокол определения ингибирования ТОТа-индуцированного 1Ь-8 в фибробластах легких человека.
Способность ΟΟΜ 1Η-131-206 или ΟΟΜ 1Η-131-206 + А предупреждать связывание человеческого ТОТа с человеческим ТНРК1 и ингибировать секрецию 1Ь-8 определяли с использованием клетокфибробластов легких человека ΜΡΟ-5 (АТСС). Клетки ЫКС-5 инкубировали с тестируемыми образцами в течение 1 ч, после чего добавляли ТОТа (220 пг/мл). После инкубации при 37°С и 5% СΟ2 в течение 24 ч супернатанты собирали и хранили при -20°С до проведения анализа Μδϋ™ в отношении 1Ь-8 в соответствии с протоколом производителя для образцов культуры ткани. Супернатанты разводили 1:12 в поставляемом разбавителе-калибраторе до анализа. Подгонку кривой осуществляли в ОгарИ Рай Ргйт для определения 1С50 (средней ингибирующей концентрации).
Протокол определения ингибирования ТОТа-индуцированного 1Ь-8 в клетках А549.
Клетки А549 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2х104 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% СΟ2, чтобы дать им возможность адгезировать. Клетки затем инкубировали в течение 1 ч в присутствии ΟΟΜ 1Η-131-206 или ΟΟΜ 1Η-131-206 + А в различных концентрациях в диапазоне 0,01-1000 нМ. Каждую концентрацию тестировали в двух параллельных лунках. После инку- 37 027160 бации при 37°С и 5% СО2 в течение 24 ч супернатанты собирали и хранили при -20°С до проведения анализа ΜδΌ™ в отношении ΙΌ-8 в соответствии с протоколом производителя для образцов культуры ткани. Супернатанты разбавляли 1:5 в поставляемом разбавителе-калибраторе до анализа. Подгонку кривой и значения 1С50 рассчитывали с использованием ХЬРй.
Протокол определения ингибирования ТОТа-индуцированного ΙΌ-8 в клетках СΥNΟΜ-К1.
Клетки СΥNΟΜ-К1 инкубировали в течение 1 ч в присутствии ΌΘΜ Ш-131-206 или
ΌΘΜ 1н-131-206 + А в различных концентрациях, начиная с 100 нМ. Затем производили стимуляцию ΊΝΡα в конечной концентрации 1 нг/мл. После инкубации при 37°С и 5% СО2 в течение 24 ч супернатанты собирали и хранили при -20°С до проведения анализа ΜδΌ™ в отношении ΙΌ-8 в соответствии с протоколом производителя для образцов культуры ткани. Супернатанты разводили 1:12 в поставляемом разбавителе-калибраторе до анализа. Подгонку кривой осуществляли в ОгарЬРаб Рпзт для определения 1С50.
Протокол определения ингибирования ТОТа-индуцированного ΙΌ-8 в цельной крови человека.
Кровь здоровых доноров-добровольцев (с согласием, заполненным в соответствии с ИК нитап Т155ие Ас!) собирали в гепарин натрия. Готовили среду для анализа путем добавления 1% ΒδА в среды ΚРΜI-1640 (без фенолового красного). ΌΟΜ Ш-131-206 или ΌΟΜ Ш-131-206 + А и модельное Ун бАЬ разводили в 96-луночных планшетах в среде для анализа таким образом, что конечная концентрация после добавления крови составляла 800 нМ, и подвергали серийным разведениям 1:2 до 0,01 нМ. Добавляли 130 мкл крови на лунку и планшеты инкубировали в течение 1 ч (37°С, 5% СО2), чтобы дать возможность для связывания с ТОТШ. Образцы крови затем стимулировали 10 мкл ТОТа, разведенного в среде для анализа, таким образом, что конечная концентрация составляла 10 нг/мл. Каждые условия тестировали в двух параллелях. После дальнейшей инкубации в течение 24 ч (37°С, 5% СО2) 110 мкл РΒδ добавляли в лунку для увеличения объема образцов, которые затем встряхивали на шейкере в течение 10 мин при 500 об/мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Плазму переносили в новый планшет и хранили при -80°С до проведения анализа ΙΌ-8 ΜδΌ™ в соответствии с протоколом производителя для образцов плазмы крови. Подгонку кривой и значения Ιί\0 рассчитывали с использованием ХЬРй.
Протокол определения ингибирования индуцированного ΡΒδ (липополисахаридами) ΙΌ-8 в цельной крови яванского макака.
мл крови от 4 яванских макаков собирали в гепарин натрия. Среду для анализа готовили путем добавления 1% ΒδА в среды ΚРΜI-1640 (без фенолового красного). ΌΟΜ Ш-131-206 или ΌΟΜ РИ-131-206 + А и имитирующее Ун бАЬ разбавляли в 96-луночных планшетах в среде для анализа до 15х конечной концентрации. Каждую концентрацию тестировали в трех параллелях.
Добавляли 130 мкл крови на лунку и планшеты инкубировали в течение 1 ч (37°С, 5% СО2) перед стимуляцией 10 мкл ΙΒδ, разведенными в среде для анализа, таким образом, что конечная концентрация составляла 94 нг/мл. Планшеты затем инкубировали в течение еще 24 ч (37°С, 5% СО2). После инкубации добавляли 110 мкл РΒδ на лунку для увеличения объема образцов, которые затем встряхивали на шейкере для планшетов в течение 10 мин при 500 об/мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин. Плазму крови переносили в новый планшет и хранили при -80°С до проведения измерения ΙΌ-8 с использованием анализа ΜδΌ™ в отношении человеческого ΙΌ-8 в соответствии с протоколом производителя для образцов сыворотки и плазмы крови. Плазму крови в анализе не разводили. Подгонку кривой и значения Κ.'50 рассчитывали с использованием ХЬРй.
- 38 027160
Таблица 6Ь
Обобщение способности Г)0М Ш-131-206 по сравнению с Г)0М Ш-131 -206 + А в анализах, основанных на клетках человека и яванского макака
1С5о (нМ) ± стандартное отклонение
ϋΟΜ1 Н-131 -206 ϋΟΜΙΗ-131- 206+А
МВС5 фибробласты легких человека (п=3) 4,8+2,4 3,5 + 2,5
А549 эпителий легких человека (п=2) 1,0 + 0,23 1,0 + 0,28
ΟΥΝΟΜΚ1 фибробласты кожи яванского макака (п=2) 4,8+0,4 4,7+0,7
Цельная кровь человека (п=3-5) 1,6 + 1,0 0,9 + 0,3
Цельная кровь яванского макака (п=3) 0,5 + 0,4 0,4 + 0,3
Пример 7ά. Применение доменного антитела Г)0М Ш-131-206 для лечения псориаза.
В этих исследованиях использовали доменное антитело Г)0М Ш-131-206 (имеющее аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ГО N0: 1), а также ортологи этого доменного антитела у грызунов. Данные, полученные для этих молекул, использовали для отбора доз и описанных здесь протоколов лечения, используемых для лечения псориаза и псориатических бляшек у пациентов-людей, которым вводили или Г)0М Ш-131-206 (имеющее аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ГО N0: 1) или фиксированную молекулу Г)0М Ш-131-206 ΑϋΑ с концевым аланином (имеющую аминокислотные последовательности, представленные в δΕΟ ГО N0: 16), или фиксированную молекулу Ώ0Μ1Η131206 ΑϋΑ, содержащую любое фиксированное ΑΏΑ (т.е. любую модификацию, уменьшающую связывание άΑЬ с ΑϋΑ), как здесь раскрыто.
Например, фармакокинетика, полученная в результате исследований ίη У1уо на яванских макаках продемонстрировала, что доменное антитело Г)0М Ш-131-206 (с аминокислотной последовательностью, представленной в δΕΟ ГО N0: 1) обладает клиренсом из плазмы крови 2,4 мл/мин/кг, который приблизительно равен скорости клубочковой фильтрации (ΟΡΚ) у макаков и приводит к элиминационному периоду полувыведения приблизительно 3 ч. Объем распределения для данного доменного антитела составлял 0,26 л/кг, что приблизительно соответствует экстраваскулярному объему и свидетельствует о распределении вне центрального/плазматического компартмента. Когда доменное антитело Г)0М Ш-131-206 вводили в экстраваскулярный компартмент (например, при ингаляции в легкие), тогда проявлялось лишь небольшое изменение в обнаруженном элиминнационном периоде полувыведения, что отражало лимитирующую кинетику скорости абсорбции.
Кроме того, после внутрикожного введения мышам дозы ортолога для άΑЬ против 'Ш1;К1 у грызунов ('ГОот1т-15-12) обнаруживали еще более длительную задержку абсорбции. Это может являться следствием большего различия между клиренсом ΟΡΚ и скорости абсорбции после введения дозы внутрикожным путем. Обнаруженный период терминальной элиминации из плазмы крови мышей составлял приблизительно 40 мин, что превосходило период после внутривенной доставки (приблизительно 20 мин). Меньшая скорость элиминации ^е), обнаруженная в плазме крови после внутрикожной доставки, подтверждалась ΡΚ (фармакокинетика) в кожной ткани, для которой продемонстрировали период терминальной элиминации, составляющий 5-7 ч (Κ 0,1-0,14 ч-1), хотя фракция дозы, приводящая к очевидно продолжительному периоду элиминации, была, как оценено, небольшой (0,5%). Скорость кожной абсорбции (1<а) в плазму крови определили в результате исследований на крысах с внутрикожным введением дозы ортолога грызунов для ά/\Ο и она оказалась относительно быстрой (1<а 4,1 ч-1), приводя к обнаруженному Τ1Π.1Χ приблизительно 1 ч после введения дозы. Оценили, что 10% доменного антитела удерживались у крыс в кожном компартменте с предполагаемой скоростью элиминации из кожи, близкой к мышиной. Таким образом, по-видимому, после внутрикожной инъекции доменное антитело Г)0М 1н-131-206 распределяется в васкуляризованных тканях в коже (например, в дерме), откуда оно быстро экстрагируется в плазму крови и элиминируется путем почечной фильтрации. Фаза исходного распределения и абсорбции в тканях кожи отражается на времени задержки абсорбции до того, как количества в плазме крови станет возможным измерять. Учитывая анатомические различия между кожей человека и
- 39 027160 грызунов, время абсорбции у людей, как ожидают, будет больше, что, в свою очередь,. может привести к меньшему/не поддающемуся измерению количеству в плазме крови доменного антитела Ό0Μ
1Н-131-206. Это означает, что ожидания относительно количества в плазме крови человека основаны на наблюдениях в исследованиях на грызунах и, таким образом, служат в качестве консервативной оценки количества в плазме крови у людей.
Дозу доменного антитела Ό0Μ 1Н-131-206 (имеющего аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 1) также вводили здоровым добровольцам путем внутривенной инфузии (продолжительностью до 3 ч) до 2 мг/кг и в непрерывном исследовании путем ингаляции здоровым добровольцам. Рассчитанные фармакокинетические параметры в общем находились в очень хорошем соответствии с преклиническими данными для яванского макака. После внутривенного введения клиренс составлял 0,6-1,5 мл/мин/кг (ОРК у человека приблизительно 1,8 мл/мин/кг) с получающимся в результате элиминирующим периодом полувыведения 5 ч. Объем распределения приблизительно 0,3 л/кг был близок экстраваскулярному объему. Быстрое распределение доменного антитела Ό0Μ 1Н-131-206 в экстраваскулярном компартменте подтверждали при помощи измерения бронхоальвеолярного лаважа (жидкость, выстилающая легочный эпителий) после IV (внутривенного) введения. Уровни в легочной экстраваскулярной жидкости составляли приблизительно 4-14% относительно уровней в плазме крови, измеренных через 5 ч после начала введения дозы после 3-часовой инфузии.
Предположения об эффективности у людей оценивали на основе оценок обнаруженного и предсказанного количества в кожном компартменте и данных для человеческой линии клеток ίη νίίτο. Диапазоны 1С50 (8-40 нг/мл) в этих системах ίη νίίτο (варьируя сложность и тип клеток) использовали в качестве целевых минимальных уровней в кожном компартменте, и они способствовали выбору доз доменного антитела и протоколов лечения псориаза и псориатических бляшек у описанных здесь пациентов-людей. Например, выбирали исходную дозу 0,5 мг для достижения количества в плазме крови, предполагая самое неблагоприятное системное воздействие, меньше чем доза, достигаемая в РТ1Н (первое исследование на людях) внутривенном исследовании, в котором обнаружен агонизм у ΑΌΑ-положительных субъектов. При этой исходной дозе ожидают, что опосредованная Т№К1 передача сигнала ингибируется в отдельной зоне вокруг сайта инъекции (площадь поверхности меньше 2 см2) до уровня не менее 90% немедленно после введения дозы. Ингибирование Т№К1 со временем зависит от доставленного, удерживаемого и затем элиминируемого из кожного компартмента количества лекарственного средства. Предполагая минимум (10% удержание в коже и Ке 0,1-0,14 ч-1 как у крыс), ожидали, что уровни будут поддерживаться на уровне не менее 1С50 (в зоне инъекции/тестируемой зоне) в течение как минимум 3 суток после внутрикожной инъекции 0,5 мг доменного антитела Ό0Μ 1Н-131-206.
Для выбора доз доменного антитела и протоколов лечения осуществили предсказания количества в человеческой плазме крови после внутривенного ведения дозы доменного антитела Ό0Μ 1Н-131-206. Эти предсказания допускали максимальное возможное количество, которое может быть достигнуто для внутрикожной инъекции. Реальные данные для концентрации в плазме крови человека в зависимости от времени после внутривенного введения доменного антитела Ό0Μ 1Н-131-206 использовали в человеческой кожной РК (фармакокинетической) модели с фиксированной скоростью абсорбции (масштабированной относительно кожной абсорбции у грызунов) и биодоступностью 100%. Затем исследовали профиль зависимости концентрации в плазме крови человека от времени для максимальной(ых) дозы(доз) доменного антитела и описанных здесь протоколов лечения (2 мг каждую неделю + 0,5 мг каждые две недели). Это выявило, что предполагаемые максимальные концентрации в плазме крови быстро достигают Ттах в течение 30 мин после введения дозы, и уровни быстро падают до уровней, находящихся ниже нижней границы подсчета в текущем анализе плазмы (0,1 нг/мл) в течение 24 ч. Никакого накопления в плазме крови не ожидали после повторного дозирования, даже при использовании этого предсказания максимально возможного количества. Тем не менее, данное предсказание представляет собой самое высокое возможное количество в плазме крови, и эти возможные количества могут быть значительно меньше, чем предполагаемые, и оказаться столь низкими, что количество в плазме крови может не поддаваться измерению. С использованием целевых уровней ингибирования (основанных на клеточных анализах ίη νίίτο) предположили, что уровни 1С90 (непосредственно после введения дозы) или 1С50 (минимум) в коже в описанных здесь протоколах лечения будут находиться в пределах 30-80 нг/мл или 8-40 нг/мл соответственно.
На основе вышеприведенной информации предполагаемые количества в плазме крови (Стах и ΑυΟ (площадь под кривой)) для первой дозы, максимальной суточной дозы и кумулятивной дозы в течение 28 суток представлены в следующей табл. 6Ь вместе с границами безопасности на основе предклинической безопасности.
- 40 027160
Таблица 6Ь
Первая доза - 0,5 мг еженедельно Безопасность Множественная1
Стах А11С(0-48ч) А11С(0-28д) 52 117 464 нг/мл нг.ч/мл нг.ч/мл 933 2137 537
Максимальная доза 2 мг
еженежельно + 0,5 мг каждые две
недели
Стах 260 нг/мл 187
А11С(0-48ч) 583 нгч/мл 427
А11С(о-7д) 700 нгч/мл 356
А11С(0-28д) 2800 нгч/мл 89
В течение 14-суточного токсикологического исследования с повторными дозами на самцах яванского макака в соответствии с надлежащей лабораторной практикой (20 мг/кг/сутки), основанных на средних количествах для самцов (1,4 и 14 сутки) (Стах и АИС(0-24ч) 48,5 мкг/мл и 249 мкг-ч/мл соответственно).
Наконец, представленную выше информацию из исследований ΐη νΐΐΐΌ, исследований ΐη νίνο и связанных анализов использовали для выбора доз доменного антитела и протоколов лечения, полезных в лечении псориаза у пациентов-людей.
Введение доменных антител в соответствии протоколом лечения, как раскрыто здесь, полезно в лечении псориаза. Эффективность доменного антитела для лечения псориаза, такого как в конкретном протоколе лечения, может быть подтверждено путем измерения бляшек при помощи эхографии и/или клинических оценок.
Эхографические высокочастотные ультразвуковые исследования могут быть осуществлены с использованием 20 МГц высокочастотного сонографа (ΌϋΒ И8В, ТаЬегпа рго МеШсиш, ЬиепеЬигд). Серийные А-сканы могут быть комбинированы и представлены на мониторе в виде среза кожи. Возможно и предпочтительно латеральное разрешение приблизительно 200 мкм и осевое разрешение 80 мкм. В зависимости от картин отражения присутствуют компоненты эпидермиса, дермы и подкожного слоя, и возможно точное измерение толщины кожи. Воспалительный псориатический инфильтрат в области псориатической бляшки обнаруживается в виде ясно определяемой светлой полосы отражения ниже входного отражения. Толщина эхоплотной полосы для бляшки может быть определена и документирована перед введением доменного антитела и после введения доменного антитела. Эта толщина может быть измерена в мкм. Уменьшение толщины эхоплотной полосы для псориатической бляшки после введения доменного антитела демонстрирует, что введение доменного антитела, такое как в соответствии с раскрытым здесь протоколом лечения, является эффективным для лечения псориаза и псориатических бляшек у пациента-человека. См., например ВапдНа е! а1., 9 Зкт РНагтасо1. 298 (1996).
Клиническая оценка может быть осуществлена с использованием 5-точечной оценки, определяемой путем сравнения в клинике обработанной псориатической бляшки, в которую инъецировано доменное антитело, по меньшей мере с одной необработанной бляшкой около обработанной псориатической бляшки. В соответствии с этим сравнением присвоены следующие клинические оценки (клинические оценки равны 0 по определению перед первым введением доменного антитела):
-1 = ухудшение, = без изменений (отсутствие эффекта), = легкое улучшение, = явное улучшение, но не полное излечение, = полное излечение.
Таким образом, на этой основе повышенная клиническая оценка после введения доменного антитела в соответствии протоколом лечения, как раскрыто здесь, свидетельствует об эффективности в лечении псориаза и псориатических бляшек у пациента-человека.
Пример 8: Удлинения на единичный аланин клонов УНН.
Связывание АЭА с УНН обнаружили с использованием подтверждающего анализа, используемого в примере 2 (для Ό0Μ 1Н-131-206). Для подтверждения того, что похожее ингибирование связывания с АВА может быть достигнуто путем модификации последовательностей УНН, тестировали три клона УНН с аминокислотными последовательностями, представленными на фиг. 2(6)-(1).
Клон УНН 2(6) представляет собой биспецифический формат, имеющий модуль связывания с 1Ь-6К, связанный посредством СССС8ССС8 с модулем связывания человеческого сывороточного альбумина, как описано в Ш0 2010/100135. (Аминокислотная последовательность представлена на фиг. 26:
- 41 027160 δί ГО ΙΌ N0: 4).
Клон Унн 2(е) представляет собой биспецифический формат, имеющий модуль связывания с ΤΗΡ, связанный с модулем связывания с сывороточным альбумином, в свою очередь связанным с модулем связывания с ΤNБ, с использованием 0000δ000δ в качестве линкера, как описано в Ж.) 2010/077422.
(Аминокислотная последовательность представлена на фиг. 2 е: δΗ) ГО N0: 5).
Клон Унн 2(ί) представляет собой бивалентный моноспецифический формат, содержащий два идентичных модуля, связанные линкером А1а-А1а-А1а, где каждый модуль представляет собой йАЬ, которое может связывать домен А1 Фактора фон Виллебранда, как показано в Ж.) 2009/115614 А2. (аминокислотная последовательность представлена на фиг. 2ί: δЕ^ ГО N0: 6).
Все три вышеописанных клона были модифицированы путем добавления С-концевого аланина к концу остатка серина и модифицированные и немодифицированные клоны сравнивали с использованием анализа в соответствии с примером 2. Как можно видеть в табл. 7 и на фиг. 4, результаты демонстрируют, что С-концевое удлинение на единичный аминокислотный остаток аланина уменьшает связывание с АБА.
Таблица 7
Образец УНН2(й) УНН2(й) +А УНН2(е) УНН2(е) +А УНН2(1) УНН2(1) +А
Средний % Ингибирования 93,23 18,86 94,93 16,95 94,15 17,46
Пример 9. Частота здоровых субъектов с предсуществующими АБА для диапазона молекул на основе Ун и Уь йАЬ.
Процедура анализа АБА.
По аналогии с процедурой, описанной в примере 1 для БСЖ Ш-131-206, тестируемые молекулы (Γ)0Μ Ш-131-206 (δЕ^ ГО N0: 1), БСЖ Ш-131-206 + С-концевое удлинение на аланин (δЕ^ ГО N0: 16), тАЬ-Ун (δЕ^ ГО N0), последовательность пептид-Уь Ун-Ун (δЕ^ ГО N0: 11), молекула '735 (δЕ^ ГО N0: 30 и 31) биотинилировали, подвергали замене буфера и хранили в буферной смеси. Эти тестируемые молекулы также метили рутением и затем подвергали замене буфера и хранили в буферной смеси.
Антитело против лекарственного средства (АБА) для каждой молекулы представляет собой анализ связывания, осуществляемый на технологической платформе ΜδΡ™ ЕСЬ (электрохемилюминисценция), как описано ранее.
Обобщение процедуры измерения, используемой в этом эксперименте, описано ниже.
1. Стрептавидиновый планшет ΜδΡ™ блокируют 150 мкл/лунку блокирующего казеина в ΡΒδ (1%) при комнатной температуре (КТ) в течение 1-2 ч. Блокатор удаляют без промывки.
2. После 1 ч предварительной инкубации гомогенную смесь, содержащую 0,1 мкг/мл биотинилированной тестируемой молекулы, 0,1 мкг/мл рутенилированной (сульфо-Τаβ™) тестируемой молекулы и 2% образец сыворотки крови в разбавителе для анализа (1% казеин в ΡΒδ) переносят в планшет ΜδΡ™ и инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин при КТ.
3. ΜδΡ-планшет затем трижды промывают ΡΒδΤ.
4. Добавляют 150 мкл/лунку буфера для визуализации и содержимое планшета подвергают визуализации.
Вышеприведенные концентрации и периоды инкубации использовали для молекул Ι)0Μ Ш-131-206.
Специалисту в данной области техники понятно, что точные концентрации и периоды инкубации будут оптимизированы, например БСЖ Ш-131-206 (и модифицированные варианты) могут иметь слегка отличающиеся концентрации и периоды инкубации по сравнению, например, с БСЖ 10н-53-567 или последовательностью пептид-Уь
Панель из 100 образцов сыворотки крови здоровых доноров-людей скринировали в отношении реактивности в анализе. Предсуществующие антитела (АБА) против вариабельной области легкой цепи (Уь), каркаса также обнаруживали в нормальных человеческих образцах сыворотки крови, хотя с меньшей интенсивностью и частотой по сравнению с ранее обнаруженным против доменов Ун и Унн (см. фиг. 4). Результаты представлены на фиг. 5, где ось Υ демонстрирует уровни связывания с АБА, а Ун йАЬ обладают самой высокой частотой связывания с АБА.
Сделаны следующие заключения: результаты, представленные на фиг. 5, демонстрируют уровень связывания предсуществующих АБА с БСЖ 1Н-131-206 и эффект добавления С-концевого удлинения на связывание модифицированного БСЖ 1н -131-206 с АБА. Кроме того, на фиг. 5 можно видеть, что связывание предсуществующих АБА с Ун йАЬ также было обнаружено тогда, когда оно слито с тАЬ (тАЬ-Ун). Фиг. 5 также демонстрирует то, что существуют предсуществующие АБА, связывающиеся с У каппа (Ук) (Уь) йАЬ, и представленные примеры включают пептид:Уь слияния Уц-Ун и слияние тАЬ-Уь
- 42 027160
Пример 10. Аминокислотные удлинения каркасной области УЕ.
Поскольку предсуществующие антитела против каркасной области УЕ (УК) также были обнаружены в нормальных человеческих образцах сыворотки крови, хотя, как правило, на меньшем уровне по сравнению с обнаруженным для каркасной области Ун (см. фиг. 5), определили, могут ли модификации С-концевой области УК 4АЬ уменьшить связывание с предсуществующими ΑΌΑ, как было доказано для содержащих Ун молекул.
На основе молекулы тАЬ:линкер:УЕ (обозначенной '735 - указанная молекула представляет собой тАМАЬ - представляет собой 1Ь-13тАЬ:линкер:1Ь-4 (У каппа) 4АЬ), панель молекул тестируемого тАЬ:линкер: УЕ получали при помощи стандартного сайт-направленного мутагенеза, и которая содержала ту же самую последовательность УЕ 4АЬ, но имела различные С-концевые модификации УЕ 4АЬ. Эти тестируемые материалы, обозначенные '15014', '15019', '15020' и '15021', были сконструированы таким образом, что содержали С-концевое удлинение (+ААА, +Т или +ТУ) или имели С-концевую делецию (-К) (представлены в табл. 8).
Тестируемые материалы анализировали с использованием описанного ниже подтверждающего анализа, аналогичного тому, который описан ранее для Ун 4АЬ. Тестирование соединений осуществляли путем оценки способности индивидуальных соединений конкурировать с мечеными специфическими для анализа соединениями за связывание с предсуществующими антителами. Любые потенциальные уменьшения в сигнале в анализе представлены как %ингибирования. Уровни процентного ингибирования больше чем определенная ранее подтверждающая точка отсечения для данного конкретного анализа свидетельствует о том, что тестируемое соединение конкурирует со специфическим для анализа соединением за связывание с антителами против УК, и, таким образом, может иметь общий(е) эпитоп(ы) со специфическим для анализа соединением.
Процедура подтверждающего анализа '735 ΑΌΑ, использованная для измерения частоты предсуществующих ΑΌΑ к У каппа.
1. В микротитровальном планшете для анализа 2% ΑΌΑ-положительный образец сыворотки крови в разбавителе для анализа (1% казеин в РВЗ) инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин при КТ с конечной концентрацией 10мкг/мл '735 или другого тестируемого материала, такого как модифицированные 4АЬ.
2. После предварительной инкубации в течение 1 ч гомогенную смесь, содержащую 0,05 мкг/мл биотинилированного '735 и 0,05 мкг/мл рутенилированного (сульфо-Тад™) '735 в разбавителе для анализа (1% казеин в РВЗ), добавляют в планшет для анализа и инкубируют в течение ночи при КТ.
3. После инкубации МЗР-планшет затем трижды промывают РВ8Т, анализируемые образцы переносят в МЗР-планшет и планшет инкубируют в течение 1 ч ±5 мин в темноте при КТ.
4. Планшет МЗР™ затем трижды промывают РВЗТ
5. Добавляют 150 мкл/лунку буфера для визуализации и содержимое планшета подвергают визуализации.
Результаты этих скринингов соединений представлены в табл. 8. Все протестированные С-концевые модификации (+ААА, +Т, +ТУ и -К) демонстрировали уменьшенное ингибирование в подтверждающем анализе '735. Это свидетельствует о том, что С-концевые модификации УЕ 4АЬ снимают связывание с предсуществующими антителами (ΑΌΑ) по аналогии с Ун 4АЬ.
Таблица 8
Оценка связывания с ΑΌΑ для мутантов тАЬ:УЕ '735
Клон Модификация последовательности (в отношении компонента с1АЬ молекулы тАЬс1АЬ) % ингибирования в подтверждающем анализе (среднее значение для 7 субъектов- доноров) % субъектов со связыванием οΑϋΑ
‘735 Немодифицированная 74,92 100
15014 +ААА -4,40 14,29
15019 +Т 12,88 14,29
15020 +τν 8,53 0
15021 -В 20,08 0
Пример 11. Аминокислотные удлинения каркасной области Ун ΌΟΜ 10н-53-567 (4АЬ против 1Ь-13).
Поскольку С-концевые модификации в Ун 4АЬ против Ί'ΝΙ;Κ1 ΌΟΜ 1Н-131-206 уменьшали связывание с предсуществующими ΑΌΑ, определяли, может ли модификация С-конца уменьшить связывание ΑΌΑ с другой молекулой Ун. С-концевые модификации осуществляли в каркасной области Ун в ΌΟΜ 10н-53-567 при помощи стандартных методик сайт-направленного мутагенеза. Молекулы с заме- 43 027160 нами (тестируемые материалы) анализировали с использованием описанного ранее подтверждающего анализа.
Удлинение на С-конце ЭОМ 10Η-53-567 также значимо уменьшало связывание с предсуществующими АОА (результаты представлены в табл. 9). В качестве примеров можно привести удлинения А, А8, А8Т, А8ТК, А8ТКО и А8ТКО. Эти модификации не оказывали отрицательного действия на способность клонов ЭОМ 10Η-53-567 связываться и ингибировать их антиген-мишень ΙΡ-13, как подтверждено в описанном ниже анализе активности ΙΙ.-Ρ3 йАЬ и результатах, представленных в табл. 9Ь.
Таблица 9а
Оценка связывания с АЭА для мутантов 1)ОМ 10Η-53-567
Родительский клон Модификация последовательности % ингибирования в подтверждающем анализе (среднее значение для 10 субъектов- доноров) % субъектов со связыванием οΑϋΑ
ϋΟΜ 10Н-53-567 Немодифицированная 95,06 100
ϋΟΜ 10Н-53-567 С-концевая А 12,84 10
ϋΟΜ 10Н-53-567 С-концевая Αδ 14,79 10
ϋΟΜ 10Η-53-567 С-концевая ΑδΤ 29,02 20
ϋΟΜ 10Η-53-567 С-концевая ΑδΤΚ 27,67 20
ϋΟΜ 10Η-53-567 С-концевая ΑδΤΚΟ 13,39 10
Протокол анализа активности ΙΙ.-Ρ3 йАЬ.
Биологический анализ использовали для измерения способности вариантов молекул □ОМ 10Η-53-567 ингибировать стимулированную рекомбинантным человеческим ΙΡ-13 продукцию щелочной фосфатазы в клетках ΗΕКΒ1ие-8ТАТ6 ιη νΐΐΓΟ. Клетки ΗΕК-8ТАТ6 (Ιηνΐνο§ϋη) (которые экспрессируют секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (8ЕАР) под контролем 8ТАТ6-зависимого промотора) высевали в 96-луночные планшеты. Человеческий ΙΡ-13 в концентрации 3 нг/мл и серии разведений молекул 1)ОМ 1Η-53-567 предварительно уравновешивали в течение 1 ч при комнатной температуре и затем добавляли к клеткам на 24 ч при 37°С. После инкубации концентрации в супернатанте 8ЕАР, продуцированной клетками в результате стимуляции ΙΡ-13, определяли путем добавления Риаий-ВШе (Ιηνΐνο§ϋη) и визуализации оптической плотности при 640 нм. Значения ΙΟ50 рассчитывали на основании кривых зависимости ответа от дозы с использованием ОгарБрай Рп§ш.
Таблица 9Ь
Оценка активности для мутантов ЭОМ 10Η-53-567
Средняя Ю50 (нМ) для ингибирования вызыванного 11_-13 δΕΑΡ
Родительский клон Модификация последовательности (среднее значение между 2 и 4 экспериментами)
ϋΟΜ 10Н-53-567 Немодифицированная 0,56
ϋΟΜ 10Н-53-567 С-концевая А 0,59
ϋΟΜ 10Н-53-567 С-концевая Αδ 0,56
ϋΟΜ 10Η-53-567 С-концевая ΑδΤ 0,68
ϋΟΜ 10Η-53-567 С-концевая ΑδΤΚ 0,75
ϋΟΜ 10Η-53-567 С-концевая ΑδΤΚΟ 0,40
Удлинение на С-конце ЭОМ 10Η-53-567, которое уменьшало связывание с предсуществующими АОА, не оказывало отрицательного воздействия на способность 1)ОМ 10Η-53-567 йАЬ связываться с их антигеном-мишенью (человеческий ΙΡ-13) и ингибировать его.
Пример 12а. Клонирование молекул νΗ/ν^: йАЬ-Рс-йАЬ против VΕΟР с модифицированными С-концами.
VБ-Vк йАЬ-Рс-йАЬ с модификациями, произведенными на С-конце части Vк йАЬ: ЭМ830047-30054 конструировали путем создания вариантов последовательностей Vк йАЬ при помощи ПЦР (полимеразная цепная реакция) и затем путем повторного клонирования в ЭМ830045 (8ΕΡ ГО NΟ: 40) и ЭМ830046
- 44 027160 (8ЕЦ ΙΌ N0: 41) соответственно с получением модифицированных векторов экспрессии млекопитающих. Из ΌΜ830045: (1) С-концевой остаток аргинина удаляли с получением ΌΜ830047 (ΌΜ830037 - К), (2) С-концевой аланин добавляли с получением ΌΜ830048 (который представляет собой ΌΜ830037 + А) (8ЕЦ ГО N0: 43), (3) добавляли три С-концевых аланина с получением ΌΜ830049 (ΌΜ830037 + ААА) (8ЕЦ ГО N0: 44) и добавляли С-концевой треонин с получением ΌΜ830050 (ΌΜ830037 + Т) (8ЕЦ ГО N0: 45). Из ΌΜ830046 (8ЕЦ ГО N0: 41): (1) С-концевой остаток аргинина удаляли с получением ΌΜ830051 (ΌΜ830038 - К) (8ЕЦ ГО N0: 46), (2) С-концевой аланин добавляли с получением ΌΜ830052 ((ΌΜ830038 + А) (8ЕЦ ГО N0: 47), (3) три С-концевых аланина добавляли с получением ΌΜ830053 (ΌΜ830038 + ААА) (8ЕЦ ГО N0: 48) и С-концевой треонин добавляли с получением ΌΜ830054 (ΌΜ830038 + Т) (8ЕЦ ГО N0: 43).
Описания вышеуказанных молекул:
ΌΜ830045: Ό0Μ15-26-597 бАЬ №(УЕРК88ВК линкер) и С-концевой К-044-085 бАЬ ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830046: ΌΜ81576 с С-концевым К-044-085 бАЬ ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830047 (содержит модифицированный С-конец): Ό0Μ15-26-597 бАЬ ^(УЕРКЗЗОК линкер) и С-концевой К-044-085 бАЬ минус С-концевой К ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830048 (содержит модифицированный С-конец): Ό0Μ15-26-597 бАЬ ^(УЕРК88ОК линкер) и С-концевой К-044-085 бАЬ + А ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830049 (содержит модифицированный С-конец): Ό0Μ15-26-597 бАЬ ^(УЕРК88ОК линкер) и С-концевой К-044-085 бАЬ + ААА ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830050 (содержит модифицированный С-конец): Ό0Μ15-26-597 бАЬ ^(УЕРК88ОК линкер) и С-концевой К-044-085 бАЬ + Т ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830051 (содержит модифицированный С-конец): ΌΜ81576 с С-концевым К-044-085 бАЬ минус С-концевой К ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830052 (содержит модифицированный С-конец): ΌΜ81576 с С-концевым К-044-085 бАЬ + А ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830053 (содержит модифицированный С-конец): ΌΜ81576 с С-концевой К-044-085 бАЬ + ААА ((ТСЬП8Р)х4),
ΌΜ830054 (содержит модифицированный С-конец): ΌΜ81576 с С-концевой К-044-085 бАЬ + Т ((ТСЬО8Р)х4) (аминокислотные последовательности молекул представлены на фиг. 12 и 8ЕЦ ГО N0: 40-49).
Пример 12В. Модификации С-концевой области УЕСР УК бАЬ гантелевидных молекул ΌΜ830037 и ΌΜ830038 обладают уменьшенным связыванием с предсуществующими антителами.
Процедура подтверждающего анализа V каппа ЛОА, использованного для измерения частоты предсуществующих АЭА к V каппа.
1. В микротитровальном планшете для анализа 10% АОА-положительный образец сыворотки крови в разбавителе для анализа (1% казеин в РВ8) инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин при КТ с конечной концентрацией 10 мкг/мл тестируемого материала, такого как модифицированные бАЬ.
2. После предварительной инкубации в течение 1 ч АОА-положительную сыворотку крови/тестируемый материал добавляют в планшет для анализа с гомогенной смесью, содержащей биотинилированное V каппа бАЬ (немодифицированное) и рутенилированное (сульфо-Тад™) 'V каппа бАЬ (немодифицированное) до конечной концентрации приблизительно 0,025 мкг/мл биотинилированного бАЬ, приблизительно 0,0125 мкг/мл рутенилированного (сульфо-Тад™) бАЬ и 5% АОА-положительной сыворотки крови в разбавителе для анализа (1% казеин в РВ8). Планшет инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин при КТ.
3. Стрептавидиновый планшет Μ8Ό™ блокируют 150 мкл/лунку блокирующего казеина в РВ8 (1%) при комнатной температуре (КТ) в течение 1-2 ч. Блокатор удаляют без промывки.
4. После предварительной инкубации в течение 1 ч гомогенную смесь добавляют в стрептавидиновый планшет для анализа Μ8Ό™ и инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин при КТ.
5. После инкубации в течение 1 ч ΜδΌ-планшет затем трижды промывают РВ8Т, анализируемые образцы переносят в ΜδΟ-планшет и планшет инкубируют в течение 1 ч ± 5 мин в темноте при КТ.
6. Планшет Μ8Ό™ затем трижды промывают РВ8Т.
7. Добавляют 150 мкл/лунку буфера для визуализации и содержимое планшета подвергают визуализации.
Специалисту в данной области техники понятно, что точные концентрации и периоды инкубации будут оптимизированы, например 1Н-131-206 (и модифицированные варианты) могут иметь слегка отличающиеся концентрации и периоды инкубации по сравнению с Ό0Μ 10Н-53-567.
Результаты этих скринингов соединений представлены в табл. 9Ь. Все С-концевые модификации, протестированные на V каппа бАЬ (+Т, +А, +ААА и -К) демонстрировали уменьшенное ингибирование в вышеописанном подтверждающем анализе '697. Это свидетельствует что С-концевые модификации этих
- 45 027160
У каппа бАЬ уменьшают связывание с предсуществующими антителами (АБА) по аналогии с УИ бАЬ.
Таблица 9Ь
Оценка связывания с АБА мутантов βΜ83007 и βΜ83008
Родительский клон Модификация последовательности Средний % ингибирования сигнала в подтверждающем анализе (среднее значение - для 6 субъектов) % субъектов со связыванием с ΑϋΑ (среднее значение - для 6 субъектов)
ϋΜ330037 Немодифицированная 60,46 100
ϋΜ330050 Добавление С- концевого Т 20,97 16,67
ϋΜ330048 Добавление С- концевого А 12,86 16,67
ϋΜ330049 Добавление С- концевого ААА 8,36 16,67
ϋΜ330047 Делеция С-концевого -В 6,17 16,67
ϋΜ330038 Немодифицированная 70,65 100
ϋΜ330054 Добавление С- концевого Т 14,66 16,67
ϋΜ330051 Делеция С-концевого -В -5,91 16,67
Пример 13. Экспрессия молекул УН/Ук бАЬ-Рс-бАЬ против УЕОР с модифицированными С-концами (βΜ830047-30054).
Экспрессирующиеся плазмиды, кодирующие релевантные молекулы бАЬ-Рс-бАЬ против УЕОР, описанные выше в примере 12а, временно трансфицировали в клетки НЕК293 6Е и экспрессировали в масштабе 500 мл для получения молекул фрагментов антител с использованием способа, описанного ниже в этом примере. Стандартно достигали уровней экспрессии больше 30 мг/л супернатанта.
Последовательности бАЬ клонировали на N или С-конце родового Рс человеческого изотипа 1дО1 в вектор экспрессии млекопитающих. бАЬ связывались с Рс с использованием линкерной последовательности: Н-концевой линкер представлял собой ААА8 или ТУААР8, и С-концевой линкер представлял собой ((О8(ТУААР8О8)х3) или домен альбумина 3.
Пример 14. Очистка молекул УН/Ук бАЬ-Рс-бАЬ против УЕОР с модифицированными С-концами.
Молекулы бАЬ-Рс-бАЬ подвергали аффинной очистке из супернатантов, как описано для вышеприведенного примера.
Пример 15. Молекулярный анализ при помощи гель-хроматографии (8ЕС) молекул УИ/Ук бАЬ-РсбАЬ против УЕОР с модифицированными С-концами.
Молекулярная целостность, гомогенность и % чистоты молекул бАЬ-Рс-бАЬ против УЕОР, которые были очищены, затем анализировали при помощи 8Б8-РАОЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и аналитической гель-хроматографии (8ЕС). Таким образом, подтверждалось, что белки представляли собой имеющий более 95% частоты белок-мишень при помощи 8Б8-РАОЕ и 8ЕС перед последующими биологическими анализами.
Пример 16. Связывание молекул УИ/Ук бАЬ-Рс-бАЬ против УЕОР с модифицированными С-концами с УЕОР на В1асоге.
Аффинность связывания некоторых молекул бАЬ-Рс-бАЬ против УЕОР (с небольшими С-концевыми модификациями) в отношении УНОР165 определяли при помощи поверхностного плазмонного резонанса (8РК) с использованием В1асоге Т100. Белок А иммобилизовали на чипе С1 сочетанием первичных аминов и эту поверхность затем использовали для захвата конструкций против УЕОР. Человеческий рекомбинантный УЕОР165 (полученный своими силами в результате временной трансфекции клеток НЕК293) использовали в качестве аналита в концентрации от 32 до 0,03125 нМ в 4-кратных сериях разведений. Все кривые связывания подвергали двойному сравнению с контролем путем инъекции буфера (т.е. 0 нМ) и данные подгоняли к модели 1:1, присущей Т100. Регенерацию осуществляли с использованием 50 мМ №0Н. Анализ осуществляли при 37°С с использованием НВ8-ЕР в качестве буфера для анализа. Полученные данные представлены в табл. 10а-10с. На основе данных в табл. 10а поведение βΜ830037 и нескольких вариантов, модифицированных на С-конце: βΜ830037 + А (βΜ830048),
- 46 027160 □МЗ30037 + ЛЛЛ (БМЗ30049) и БМЗ30037 + Т (БМЗ30050) (см. пример 12а в отношении дополнительной информации по этим молекулам) по-видимому сравнимо на В1асоге? и С-концевые модификации, по-видимому, не уменьшают силу по сравнению с родительскими молекулами.
Дополнительный набор данных представлен в табл. 10ν, где эффективность БМЗ30037 и БМЗ30038 сравнивали с вариантами, модифицированными на С-конце: БМЗ30037-К, (обозначен как + К (БМЗ30047), БМЗ30037 + Т (0МЗ30050) и 0МЗ30038 - К, (обозначен как + К (0МЗ30051) и бевацизумаб (Авастин) в В1асоге. В этом наборе данных вновь поведение всех молекул, по-видимому, сравнимо на В1асоге, и С-концевые модификации, по видимому, не уменьшают силу по сравнению с родительскими молекулами. Значимые данные не могут быть получены за исключением получения кривой для Авастина. Дополнительный набор данных представлен в табл. 10с, где молекулы БМЗ30037 и БМЗ30038 сравнивали с вариантами, модифицированными на С-конце: БМЗ30037 - К, (БМЗ30047), БМЗ30037 + Т (БМЗ30050), БМЗ30038 - К (0МЗ30051) и 0МЗ30038 + Т (0МЗ30054) и бевацизумабом (Авастином). Поведение всех молекул ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ вновь было, по-видимому, сравнимо на В1асоге и С-концевые модификации, по-видимому, не уменьшали силу по сравнению с родительскими молекулами. В этом наборе данных, см. табл. 10С, данные для бевацизумаба (Авастина) не могли быть измерены подходящим образом вследствие того, что скорость диссоциации была слишком ограниченной.
Таблица 10а
Связывание молекулы ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ против УЕОЕ: БМЗ30037 с С-концевыми модификациями с УЕОЕ165 и сравнение с БМЗ30037
Лиганд Ка (М-1.с-1) КЕ (с-1) Κϋ (М)
ϋΜ330037 8,18Е+06 4,34Е-05 5,ЗОЕ-12
ОМ330037+А 8,25Е+06 5,21 Е-05 6,32Е-12
ϋΜ330037+ΑΑΑ 7,74Е+06 5,37Е-05 6,94Е-12
ОМ330037+Т 8,03Е+06 4,21 Е-05 5,24Е-12
Таблица 10Ь
Связывание молекул ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ против УЕОЕ: БМЗ30037 и БМЗ30038 с С-концевыми модификациями с УЕОЕ 165 и сравнение с родительским ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ и бевацизумабом (Авастином)
Лиганд Ка (М-1.с-1) КЕ (с-1) Κϋ (М)
ОМ330037 1,04Е+07 4,39Е-05 4,22Е-12
ОМ330037+Н 1,07Е+07 4,22Е-05 3,94Е-12
ϋΜδ30037+Τ 1,10Е+07 4,27Е-05 3,90Е-12
ϋΜ330038 1,03Е+07 4,79Е-05 4,64Е-12
ϋΜδ30038+Β 1,23Е+07 5,31 Е-05 4,31Е-12
Авастин 8,39Е+05 Вне диапазона Вне диапазона
Таблица 10с
Связывание молекул ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ против УЕОЕ: БМЗ30037 и БМЗ30038 с С-концевыми модификациями УЕОЕ 165 и сравнение с родительским ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ и бевацизумабом (Авастином)
Лиганд ка кЕ Κϋ
ϋΜ530037 5,60Ε+06 Ц46Е-04 2,61Е-11
ϋΜδ30037+Τ 5,38Ε+06 Ε42Ε-04 2.64Ε-11
ϋΜδ30037-Η 6,97Ε+06 Ε55Ε-04 2.22Ε-11
ϋΜδ30038 5,69Ε+06 Ε55Ε-04 2.73Ε-11
ϋΜδ30038-Η 5,90Ε+06 Ε58Ε-04 2.68Ε-11
ϋΜδ30038+Τ 8,28Ε+06 Ц22Е-04 Ц47Е-11
Авастин 1,24Ε+06 Вне диапазона Вне диапазона
Пример 17. Анализ связывания с рецептором УЕОЕ К2 для молекул УЬ/Ук ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ против УЕОЕ с модифицированными С-концами.
Силу молекул УЬ/Ук ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ против УЕОЕ, основанных на БМЗ30037 и БМЗ30038, но с С-концевыми модификациями, сравнивали с молекулами дикого типа и бевацизумабом (Авастином) в анализе связывания с рецептором УЕОЕ 2 (К2) с использованием модифицированного способа, т.е. без предварительной инкубации, как описано ниже в примере. Данные представлены в табл. 11а, все протестированные молекулы ЕЛЬ-Ес-ЕЛЬ: 0МЗ30037, 0МЗ30037+Т (0МЗ30050), 0МЗ30037-К (0МЗ30047), БМЗ30038, БМЗ30038-К (БМЗ30051), по-видимому, обладают сравнимой силой, и они значительно более сильные, чем бевацизумаб (Авастин), табл. 11а. Обнаружена небольшая вариация максимального процента ингибирования, достигаемая молекулами в анализе, где все молекулы достигали максимального ингибирования более 93-98%, (данные не представлены).
- 47 027160
Дополнительные данные были получены при сравнении άΑ6-Ρε-άΑ6: ΏΜ530038, ΏΜ530038 + Т, (ΏΜ530050) и ΏΜ530038 - К, (ΏΜ530051) с бевацизумабом (Авастином) в таком же формате анализа, данные представлены в табл. 11Ь. Эти данные свидетельствуют, что ΏΜ530038 и его С-концевые варианты (табл. 11ν) обладают близкими силами, исходя из значений ЕС50 в анализе ΚΒΑ (анализ связывания с рецептором), и, по-видимому, являются значительно более сильными по сравнению с бевацизумабом (Авастином) в соответствии с этими критериями. В анализе наблюдалась небольшая вариация в отношении максимального процентного ингибирования, достигаемого молекулами, где все молекулы достигали максимального ингибирования более 94%, (данные не представлены).
Анализ связывания рецептора νΕΟΡ К2: Силы анализировали в анализе связывания с рецептором νΕΟΡ по сравнению с таковым для бевацизумаба (Авастина). В этом анализе измеряли связывание νΕΟΡι65 с νΕΟΡ К1 или νΕΟΡ К2, а также способность тестируемых молекул блокировать это взаимодействие. На стандартный связывающий Μδϋ 96-луночный планшет (Π1ΧΑ-3), наносили 0,25 мкг/мл νΕΟΡ К1 (К&Э δуδίетδ 321-РЬ) или νΕΟΡ К2 (К&Э 357-Ко) в бикарбонатном буфере (50 мкл/лунку), закрывали пленкой для планшетов и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующий день Μδϋ-планшет промывали 3x300 мкл/лунку промывающим буфером Тгк и промокали тканевым тампоном, чтобы удалить избыток промывочного буфера из лунок. Затем Μδϋ-планшет блокировали 3% ΒδΑ в ΡΒδ (250 мкл/лунку) и инкубировали при встряхивании (750 об/мин.) при комнатной температуре в течение 1 ч. Μδϋ-планшет снова промывали перед добавлением 2х концентрации молекулы против νΕΟΡ (25 мкл/лунку) и инкубировали при встряхивании (750 об/мин.) при комнатной температуре в течение 10 мин до добавления 2х концентарции τΗνΕΟΡ, 25 мкл/лунку, К&Э δуδίетδ (293-νΕ/ΟΡ, получен в клетках насекомых с использованием бакуловируса) или источника νΕΟΡ собственного производства ΟδΚ (получен из клеток млекопитающих НΕК293, последние данные не показаны, за исключением табл. 3 а).
Молекулы против νΕΟΡ и νΕΟΡ готовили с использованием 0,1% ΒδΑ в ΡΒδ. Первоначальный анализ проводили со стадией, на которой молекулу против νΕΟΡ предварительно инкубировали с νΕΟΡ. Предварительные инкубации осуществляли путем добавления равного объема 2х концентрации молекулы против νΕΟΡ к равному объему 2х концентрации νΕΟΡ (К&Э, 293-νΕ/ΟΡ) в течение 30 мин при комнатной температуре. Конечная используемая концентрация νΕΟΡ составляла 10 нг/мл. Не были включены νΕΟΡ и νΕΟΡ сами по себе в качестве контролей. Μδϋ-планшет инкубировали при встряхивании (750 об/мин.) при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего промывали снова перед добавлением детектирующего реагента (50 мкл/лунку, козьего биотинилированного антитела против человеческого νΕΟΡ- К&Э δуδίетδ ΒΑΡ293) в концентрации 0,25 мг/мл в 1% ΒδΑ в ΡΒδ, и инкубировали при встряхивании (750 об/мин.) при комнатной температуре в течение 1 ч. Μδϋ-планшет вновь промывали до добавления стрептавидина сульфо-ΤΑΟ (50 мкл/лунку, Μδϋ Κ32ΑΏ-1) в концентрации 2 мкг/мл в 1% ΒδΑ в ΡΒδ и инкубировали при встряхивании (750 об/мин.) при комнатной температуре в течение 30 мин. До измерения электрохемилюминесценции в Μδϋ δесίο^ 1та§ег 6000 Μδϋ-планшет промывали и добавляли 150 мкл/лунку 2х буфера для визуализации Т (Μδϋ К92ТС-1). Подгонку кривых и расчеты ΕΟ50 проводили с использованием СиарИРаб Ргкт. Способность тестируемых молекул против νΕΟΡ и бевацизумаба (Авастина) ингибировать связывание νΕΟΡ с νΕΟΡΚ1 и νΕΟΡΚ2 определяли, как было описано.
Модифицированный способ: второй анализ проводили при условии, что агент против νΕΟΡ и νΕΟΡ предварительно не инкубировали до добавления в Μδϋ-планшет, покрытый рецептором νΕΟΡ. Этот анализ проводили и использовали только νΕΟΡ, полученный от К&Э δуδίетδ, (293-νΕ/ΟΡ). Способность молекул против νΕΟΡ и бевацизумаба (Авастина) ингибировать связывание νΕΟΡ с νΕΟΡΚ1 и νΕΟΡΚ2 определяли, как описано выше, но без стадии предварительного инкубирования.
Таблица 11а
Значения ΕΟ50 для άΑό-Ιχ'-άΑό против νΕΟΡ с С-концевыми модификациями по сравнению с бевацизумабом (Авастином) в анализе связывания с рецептором νΕΟΡΚ2:
Подбор кривых и расчеты ΕΟ50 проводили с использованием ΟπιρΗ Раб Ргкт
УЕСЕВ2 КВА ЕС50 ЕС50
(г/мл) (пМ)
Авастин 1,21Е-07 806
ОМ530037 2,99Е-09 28
ϋΜ330037+Τ 2,98Е-09 28
ОМ330037-К 2,66Е-09 25
ϋΜ330038 3,37Е-09 32
ОМ330038-К 3,84Е-09 37
- 48 027160
Таблица 11Ь
Значения ЕС50 для ЙАЬ-Рс-ЙАЬ против УЕОР с С-концевыми модификациями по сравнению с бевацизумабом (Авастином) в анализе связывания рецептора УЕОРК2:
Подбор кривых и расчеты ЕС50 проводили с использованием ОгарН Рай Рпзт
УЕСЕ Н2 РВА ЕС50 ЕС50
(г/мл) (пМ)
Авастин 3,4Е-07 2266
ϋΜ330038 5,28Е-09 50
ϋΜ330038+Τ 4,31 Е-09 41
ОМ330038-Р 4,53Е-09 43
Пример 18. Анализ пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека (ниУЕС): ингибирование молекулами УН/Ук йАЬ-Рс-йАЬ против УЕОР, содержащими С-концевые модификации.
Способности молекул йАЬ-Рс-йАЬ, основанных на ΏΜδ30037 и ΏΜδ30038, но с С-концевыми модификациями: ΏΜδ30037 - К (ΏΜδ30047) и ΏΜδ30037 + Т (ΏΜδ30050), ΏΜδ30038-Κ (ΏΜδ30051) и ΏΜδ30038 + Т (ΏΜδ30054) подавлять пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека сравнивали с бевацизумабом (Авастином) с использованием способа, описанного ниже со следующими отклонениями (1) вместо того, чтобы оставить внешние лунки свободными от клеток, использовали 96луночный планшет целиком, и (2) данные анализировали с использованием ОгарйРай Рпзт, использующего построение сигмовидной кривой с вариабельным углом наклона по сравнению с нелинейной регрессией (вариабельный наклон). Тестируемые соединения независимо оценивали в индивидуальных планшетах против молекулы сравнения, бевацизумаба (Авастина); анализ проводили по меньшей мере в трех отдельных параллелях, с общим набором данных на молекулу бевацизумаба (Авастина): 15; ΏΜδ30037: 7; ΏΜδ30038: 8; ΏΜδ30037 - К (ΏΜδ30047): 3; ΏΜδ30037 + Т (ΏΜδ30050): 4; ΏΜδ30038 К (ΏΜδ30051): 4 и ΏΜδ30038 + Т (ΏΜδ30054): 4, (данные не представлены). Фокус был направлен на анализ степени максимального ингибирования и относительные значения ЕС50 в анализе, создаваемые некоторыми молекулами по сравнению с этими значениями для бевацизумаба (Авастина).
Данные анализировали с использованием ОгарйРай Рпзт, использующего построение сигмовидной кривой с вариабельным углом наклона по сравнению с нелинейной регрессией (вариабельный наклон). На каждые сутки для каждой молекулы строили отдельные кривые. Из-за некоторого неудовлетворительного соответствия было решено ввести ограничения для кривой без плато при более низкой концентрации. Один планшет исключили из анализа вследствие неудовлетворительного подбора кривой, несмотря на ограничения. Это ограничение может быть равным значению точек при самой низкой концентрации. Данные отбирали вручную в зависимости от того, был ли ограничен минимум или нет, а построение кривой и параметры автоматически обновлялись на основании этого критерия отбора. Оценки максимумов кривой и стандартные ошибки анализировали с использованием взвешенной смешанной модели дисперсионного анализа, с использованием 1/(стандартная ошибка)2, |ЬЕ]2, в качестве весового коэффициента. Анализ корректировали для различий между планшетами и сутками с использованием случайных эффектов. На основании этих анализов оценивали прогнозируемые значения, и проводили обратные сравнения с Авастином (контроль) (см. табл. 12а). Затем проводили такой же анализ ΙΟ50 по 1од10-шкале с обратным преобразованием результатов. По этим результатам проводили оценку средних геометрических значений и обратные сравнения с авастином в форме отношения к авастину (контролю), т.е. отношение 0,5 означало снижение на 50% по сравнению с авастином (см. табл. 12Ь).
Анализ пролиферации эндотелиальных клеток пупочного канатика человека (ниУЕС).
Молекулы против УЕОР оценивали в отношении их способности подавлять пролиферацию эндотелиальных клеток пупочного канатика человека по сравнению с этой способностью бевацизумаба (Авастина). При этом анализе измеряли степень пролиферации эндотелиальных клеток, вызванной определенной концентрацией УЕОР165, и способность антагонистов УЕОР блокировать это действие. ниУЕС высевали по 5000 клеток/лунку в 96-луночные покрытые желатином планшеты, оставляя внешние лунки свободными от клеток, и инкубировали в течение нескольких часов, чтобы дать возможность для адгезии. Тестируемые молекулы анализировали в эквимолярных концентрациях (максимально 3,33 х10-08 М) с серийными двукратными разведениями, каждую в трех параллелях. УЕОР165 готовили на базовой среде, чтобы достичь конечной концентрации 75 нг/мл. Среду отбирали вручную из клеточных монослоев и добавляли 50 мкл базовой среды, чтобы предотвратить высыхание клеток. 25 мкл содержащей УЕОР^ среды и 25 мкл базовой среды или содержащей тестируемые антитела среды? добавляли соответствующим образом. Клетки инкубировали в течение 72 ч, после чего определяли общее количество клеток с использованием Се11 Тйге О1о. Обработка клеток ниУЕС УЕОР^ приводила к ожидаемому увеличению общего количества клеток через 72 ч по сравнению с необработанными УЕОР165 клетками (данные не представлены). Это опосредованное УЕОР увеличение интерпретировали как проявление кумулятивных эффектов УЕОР в отношении пролиферации ниУЕС и предотвращение клеточной гибели ниУЕС. Тестируемые соединения оценивали независимо в индивидуальных планшетах против молекулы сравнения, бевацизумаба (Авастина).
- 49 027160
Таблица 12а
Предполагаемые геометрические средние значения максимального процента ингибирования модифицированных на С-конце 6АЬ-Рс-6АЬ против УЕОР с 95% доверительными интервалами (С1) по сравнению с родительской молекулой и бевацизумабом (Авастином) в анализе НИУЕС
Предполагаемые средние значения для максимального % ингибирования
тАЬ Оценка Нижний 95% С1 Верхний 95% С1
Авастин 71,0316 61,6741 80,3891
ОМ330037 85,4759 74,9164 96,0354
ОМ330037+Т 89,9852 78,2698 101,70
ϋΜ330037-Η 82,2693 69,9929 94,5457
ОМ330038 73,5602 63,7180 83,4023
ОМ330038+Т 79,0343 67,1904 90,8782
ϋΜ330038-Η 77,6519 65,5487 89,7550
На основании этого анализа молекулы ΌΜ830037, ^Μ830037+Τ и ΌΜ830037-Κ, по-видимому, приводят к наибольшему максимальному ингибированию в анализе НИУЕС, и они превосходят группу Авастина, доверительный интервал не перекрывал нулевого эталонного значения, таким образом, данные статистически значимо отличались от данных для Авастина, данные не представлены (см. табл. 12а).
Таблица 12Ь
Геометрические средние значения 1С50 для модифицированных на С-конце 6АЬ-Рс-6АЬ против УЕОР с 95% доверительными интервалами (С1) по сравнению с родительской молекулой и бевацизумабом (Авастином) в анализе НИУЕС
Геометрические средние значения для 1С50
тАЬ Оценка Нижний 95% С1 Верхний 95% С1
Авастин 3,829Е-9 3,11Е-9 4,7Е-9
ϋΜ330037 1,903Е-9 1,473Е-9 2,46Е-9
ϋΜ530037+Τ 2,332Е-9 1,758Е-9 3,092Е-9
ОМ330037-Н 7,365Е-9 2,06Е-10 2,639Е-7
ϋΜ330038 2,163Е-9 1,723Е-9 2,715Е-9
ϋΜ330038+Τ 2,649Е-9 1,877Е-9 3,738Е-9
ϋΜ830038-Η 2,234Е-9 1,699Е-9 2,936Е-9
Похожий анализ геометрических средних значений 1С50 с 95% доверительными интервалами (С1) показал, что почти все молекулы 6АЬ-Рс-6АЬ ΌΜ830037, ΌΜ830037 + Т, ΌΜ830038, ΌΜ830038 + Т и ΌΜ830038 - К имели статистически значимо более низкие значения 1С50, чем Авастин, данные не представлены (см. табл. 18Ь). Набор данных по ΌΜ830037-Κ был высоковариабельным с низким числом η (3).
В целом данные позволяют предполагать, что С-концевые модификации обоих 6АЬ-Рс-6АЬ: ΌΜ830037 и ΌΜ830038 имеют очень близкие значения 1С50 и уровни максимального ингибирования в анализе НИУЕС с родительскими молекулами и, по-видимому, являются более сильными, чем бевацизумаб (Авастин), как с точки зрения максимального процента ингибирования, так и более низких значений 1С50 (см. табл. 12а и 12Ь).
Пример 19 (Инструментальное шАЬ). Применение шАЬ против УН для определения эпитопа для связывания с предсуществующими АИА против УН.
Моноклональное антитело (шАЬ против УН Μ2.3Θ10.1Θ06) связывается с каркасной областью УН Ό0Μ 1Н-131-206, и определили, что это шАЬ обладает гораздо более уменьшенным связыванием с Ό0Μ 1Н-131-206 + А; следовательно, это антитело, по-видимому, связывается с эпитопом, похожим на предсуществующие человеческие АИА против УН.
Последовательности СОК шАЬ против УН Μ2.3Θ10.1Θ06.
Последовательности СОК шАЬ против УН Μ2.3Θ10.1Θ06 были амплифицированы и секвенированы из гибридомной клеточной линии. Последовательности тяжелой и легкой цепей шАЬ Μ2.3Θ10.1Θ06 представлены в [аминокислотные последовательности представлены на фиг. 6а и 6Ь]. Последовательности клонировали в человеческий 1§О1 шАЬ вектор экспрессии и трансфицировали в клетки млекопитающих для экспрессии идентифицированных шАЬ. Полученное антитело очищали из клеточного супернатанта и тестировали в отношении его способности связывать каркасную область УН 6АЬ.
Специфичность шАЬ против УН Μ2.3Θ10.1Θ06.
Специфичность шАЬ Μ2.3Θ10.1Θ06 к связыванию с каркасной областью УН 6АЬ (с модификацией, которая снимает связывание с предсуществующими АИА или без нее) определяли путем измерения связывания шАЬ Μ2.3Θ10.1Θ06 при анализе связывания Т№К1:6АЬ, который проводили на платформе Μ8Ό™ (см. пример 1 для получения более подробной информации о платформе Μ8Ό™). Анализ связывания Т№К1:6АЬ подробно описан ниже. Показано, что рутенилированное шАЬ против УН
- 50 027160
М2.3О10.1О06 обладает уменьшенным связыванием с каркасной областью Ун вплоть до 85%, когда
С-конец модифицирован путем удлинения на аланин (1-15% остаточное связывание) (результаты представлены в табл. 13).
Конкуренция между предсуществующими АБА против Ун и тАЬ М2.3О10.1О06: Для подтверждения того, что тАЬ против Ун М2.3О10.1О06 связывается с тем же эпитопом, что и предсуществующие сывороточные АБА против Ун, проводили конкурентный анализ. Определили, что сыворотка ряда доноров-людей с предсуществующими АБА против Ун может конкурировать с тАЬ против Ун М2.3О10.1О06 в отношении связывания с БОМ Ш-131-206 (данные представлены на фиг. 7). Авторы сделали вывод, что предсуществующие человеческие АБА против Ун и тАЬ против Ун М2.3О10.1О06 имеют перекрывающийся эпитоп в каркасной области Ун.
Модификации в Ун РАВ, которые разрушают связывание с эпитопом для предсуществующих АБА, могут быть спрогнозированы на основании связывания тАЬ против Ун М2.3О10.1О06. Таким образом, связывание тАЬ против Ун М2.3О10.1О06 можно применять в анализе модификаций, которые приводят к уменьшенному связыванию с предсуществующими АБА.
Использованные способы.
Протокол анализа связывания
1. ΤΝΡΚ1 :Рс наносят на МЗБ-планшет с высоким связыванием в течение ночи при 4°С. МЗБ-планшет затем промывают 3 раза промывочным буфером МЗБ/ΤΚΙδ.
2. Планшет блокируют 3% ВЗА в РВЗ в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем МЗБ-планшет промывают 3 раза промывочным буфером МЗБ/РК1З.
3. Серии разведений тестируемого РАЬ (БОМ Ш-131-206 (ЗЕр 1Б NО: 1) или БОМ Ш-131-206 с С-концевым удлинением на аланин (ЗЕр 1Б NО: 16)) добавляют на 2 ч при КТ. Затем МЗБ-планшет промывают 3 раза промывочным буфером МЗБ^ЫЗ.
4. Рутенилированные тАЬ М2.3О10.1О06 в конечной концентрации 1 мкг/мл добавляют на 1 ч при комнатной температуре. Затем МЗБ-планшет промывают 3 раза промывочным буфером МЗБ^ЫЗ.
5. Добавляют 150 мкл/лунку буфера для визуализации и содержимое планшета подвергают визуализации.
Протокол конкурентного анализа для предсуществующих АБА против Ун и тАЬ М2.3О10.1О06.
1. 0,2 мкг/мл биотинилированной тестируемой молекулы (РАЬ), которая представляла собой БОМ Ш-131-206 (ЗЕр 1Б NО: 1), и 20% образца сыворотки крови в разбавителе для анализа (1% казеин в РВЗ) инкубировали в планшете для анализа с закругленным дном в течение 1 ч ± 5 мин при КТ.
2. Рутенилированные тАЬ против Ун М2.3О10.1О06 в конечной концентрации 0,5 мкг/мл добавляли на 1 ч при комнатной температуре.
3. Стрептавидиновый планшет МЗБ™ блокировали 150 мкл/лунку блокирующим казеином в РВЗ (1%) при комнатной температуре (КТ) в течение 1-2 ч.
4. Образцы переносили в стрептавидиновый планшет МЗБ™ и инкубировали при комнатной температуре (КТ) в течение 1-2 ч.
5. МЗБ-планшет затем промывали 3 раза РВЗ.
6. Добавляли 150 мкл/лунку буфера для визуализации и содержимое планшета подвергали визуализации.
Таблица 13
Дифференциальное связывание тАЬ против Ун с БОМ Ш-131-206 или БОМ Ш-131-206, модифицированных путем С-концевого удлинения
Концентрация тестируемого с1АЬ (пг/мл) Сигнал в анализе связывания Среднее значение ЕС!_ ± δϋ Относительное связывание с ООМ1Н131-206 + С-концевой А (%)
ϋΟΜ1 Н-131 -206 ϋΟΜ1 Н-131 -206 + С-концевой А
270000 1168024 ± 3643 81489 ±4537 7
90000 1078743 ±17931 66020 ± 3207 6
30000 377493 ± 9653 11300 ±266 3
10000 108173 ±3413 1507 ±69 1
3333 34479 ±1397 743 ± 14 2
1111 12026 ±243 847 ± 226 7
370 4387 ± 41 669 ±13 15
0 623 ±2 621 ±5
Это тАЬ связывается с каркасной областью Ун РАЬ, например БОМ 1Н-131-206 (ЗЕр 1Б NО: 1), но связывание очень уменьшено для РАЬ с С-концевой модификацией + А, например БОМ Ш-131-206 с С-концевым удлинением на аланин (ЗЕр 1Б NО: 16). Последовательности легких и тяжелых цепей были
- 51 027160 определены из гибридомы, размещенной в Вюса1. Существовала только одна последовательность легкой цепи (ЬС), и две последовательности тяжелой цепи (НС): одна функциональная (см. ниже) и одна нефункциональная последовательность, включая стоп-кодоны и сдвиги рамки считывания.
Экспрессия тАЬ и подтверждение связывания против двух молекул, описанных выше, основанное на спрогнозированной функциональной последовательности, приведенной ниже, позволяет авторам изобретения подтвердить, что авторы изобретения имеют правильную последовательность тАЬ для подачи заявки. Способ, с помощью которого собирали конструкции рТТ5, означает, что только последовательность, не обозначенная курсивом, происходит из гибридомы, курсивом обозначена химерная последовательность из вектора рТТ, в который она была клонирована (не требуется для проведения анализа связывания).
Легкая цепь:
Р1УМТОЗОКЕМ8РТУОРВУ31ТСКА5ОМУСТАУАУУУСЮКРСЮЗРКШУ5А
5ΝΒΥΤ0νΡΡΒΕΤ03030ΤΡΕΤΙ-ΤΙΝΝΜ03ΕΡΙ_ΑΡΥΕ000Υ05ΥΡΙ-ΤΕ000ΤΚΙ_ΕΙΚ
ΗΤνΑΑΡ3νΕΙΕΡΡ3ΡΕ0ΕΚ30ΤΑ3νν0Ι_Ι_ΝΝΕΥΡΗΕΑΚν0ννκνΡΝΑΙ_030Ν30Ε3ν
ΤΕΟΡ3ΚΡ3ΤΥ3Ι_33ΤΙ_ΤΙ_3ΚΑΡΥΕΚΗΚνΥΑΟΕνΤΗΘ(3Ι_33ΡνΤΚ3ΡΝΗΟΕΟ
Тяжелая цепь:
ЕУОЬООЗеРУЬУКРСАЗУКМЗСКАЗеУТЬТЕ5ХМНМУКОЗНеК31_ЕМ1еУ1 5ΡΥΝΟΟΤ5ΥΝΟΚΕΚΡΚΑΤΙ-ΤνΡΚ333ΤΑΥΜ Ε Ι_ Ν3Ι.Τ3Ε РЗА УУУСТ В ВС1УУРРЗУУ ЕАУ\Л/ОООТ1_УТУЗААКТТРРЗУЕР1_АРЗЗКЗТЗООТАА1_ОС1_УКРУЕРЕРУТУЗ\/\/Ы ЗеАЬТЗСУНТЕРАУ1_033е1_У31_ЗЗУУТУР3331_еТ0ТУ1СЫУ1\1НКР31\1ТКУРККУЕ РКЗСРКТНТСРРСРАРЕ1_1_ССРЗУЕ1_ЕРРКРКРТ1_М13ВТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУ ΚΕΝννΥνΡ0νΕνΗΝΑΚΤΚΡΒΕΕΘΥΝ3ΤΥΒνν3νΐ_Τνΐ_ΗΘΡννΐ_Ν0ΚΕΥΚ0Κν3ΝΚΑΙ_ ΡΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑΚ<30ΡΒΕΡ0νΥΤΙ_ΡΡ3ΒΡΕΙ_ΤΚΝ0ν3Ι_Τ0Ι_νΚ<3ΕΥΡ3ΡΙΑνΕ\Λ/Ε3Ν0 ОРЕЫЫУКТТРРУЬРЗРСЗЕЕЬУЗК1_ТУРКЗВ\Л/СЮеЫУЕЗСЗУМНЕА1_Н1\1НУТОКЗ ЬЗЬЗРСК
Вариабельный участок обозначен нормальным шрифтом. СОК выделены подчеркиванием/жирным шрифтом Химерная последовательность для Рс обозначена курсивом. Рс представляет собой человеческий 1§О1.
Последовательности для инструментального тАЬ представлены на фиг. 6 (ЗΕ^ ГО N0: 14 и 15).
- 52 027160
Перечень последовательностей <110> Глаксо Труп Лимитед Морли, Питер Льюис, Алан Сандал, Томас Эшмэн, Клэр Стюард, Майкл Де Вилдт, Рудольф Холланд, Клэр Бёрчлер, Мэри <120> МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ <130> ΡΒ64743νο <150> из 61/524,488 <151> 2011-08-17 <150> СВ 1121226.3 <151> 2011-12-12 <150> СВ 1121233.9 <151> 2011-12-12 <150> СВ 1121236.2 <151> 2011-12-12 <150> РСТ/ЕР2012/064632 <151> 2012-07-25 <160> 49 <170> РазЬЗЕО для Νίηάονζ3 версия 4.0 <210> 1 <211> 119 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Немодифицированный с1АЪ ϋΟΜ 1Н-131-206 (против ΤΝΕΚ1) <400> 1
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе А1а Нтз С1и
20 25 30
ТЬг МеЬ Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег ΗΪ3 Не Рго Рго Азр С1у С1п Азр Рго РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Низ Суз
А1а Ьеи Ьеи Рго 85 Ьуз Агд С1у Рго Тгр 90 РЬе Азр Туг Тгр С1у 95 С1п С1у
ТЬг Ьеи Уа1 115 100 ТЬг Уа1 Зег Зег 105 110
<210> 2 <211> 119 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Немодифицированный ЬАЪ ϋΟΜ 1Н-131-511 (против ΤΝΕΚ1)
<400> 2
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а АЬа Зег С1у РЬе ТЬг РЬе А1а Низ С1и
20 25 30
ТЬг МеЬ \7а1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег ΗΪ5 Не Рго Рго Уа1 С1у С1п Азр Рго РЬе Туг АЬа Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьеи Ьеи Рго Ьуз Агд С1у Рго Тгр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 3 <211> 119 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Немодифицированный ЙАЬ ϋΟΜ 1Η-131-202 (против ΤΝΕΚ1) <400> 3
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе АЬа ΗΪ3 С1и
20 25 30
ТЬг МеЬ Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег ΗΪ5 11е Рго Рго Азр С1у С1п Азр Рго РЬе Туг АЬа Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг АЬа Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьеи Ьеи Рго Ьуз Агд С1у Рго Тгр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 4 <211> 245 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> УНН2 <400> 4
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у Зег Уа1 РНе Ьуз 11е Азп
20 25 30
Уа1 МеЬ А1а Тгр Туг Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Агд С1и Ьеи Уа1
35 40 45
А1а С1у Не 11е Зег С1у С1у Зег ТНг Зег Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
50 55 60
С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
РНе Не ТНг ТНг С1и Зег Азр Туг Азр Ьеи С1у Агд Агд Туг Тгр С1у
100 105 110
С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 61у
115 120 125
С1у Зег С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго
130 135 140
С1у Азп Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег
145 150 155 160
Зег РНе С1у МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и
165 170 175
Тгр Уа1 Зег Зег 11е Зег С1у Зег С1у Зег Азр ТНг Ьеи Туг А1а Азр
180 185 190
Зег Уа1 Ьуз 61у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз ТНг ТНг
195 200 205
Ьеи Туг Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг
210 215 220
Туг Суз ТНг 11е С1у С1у Зег Ьеи Зег Агд Зег Зег С1п С1у ТНг Ьеи
225 230 235 240
Уа1 ТНг Уа! Зег Зег
245
<210> 5 <211> 363 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> УНН2
<400> 5
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Азр Туг
20 25 30
Тгр МеЬ Туг Тгр ν3ι Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и Не Азп ТНг Азп С1у Ьеи Не ТНг Ьуз Туг Рго Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Рго Зег С1у РНе Азп Агд С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг
100 105 110
Уа1 Зег Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у Зег С1и Уа1 С1п Ьеи
115 120 125
Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у Азп Зег Ьеи Агд Ьеи
130 135 140
Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Зег РНе С1у МеЬ Зег Тгр
145 150 155 160
Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 Зег Зег Не Зег
165 170 175
С1у Зег С1у Зег Азр ТНг Ьеи Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РНе
180 185 190
ТНг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз ТНг ТНг Ьеи Туг Ьеи С1п МеЬ Азп
195 200 205
Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТНг Не С1у С1у
210 215 220
Зег Ьеи Зег Агд Зег Зег С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег С1у
225 230 235 240
С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у Зег С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у
245 250 255
С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а
260 265 270
Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Азр Туг Тгр МеЬ Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а
275 280 285
Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 Зег С1и Не Азп ТНг Азп С1у Ьеи
290 295 300
Не ТНг Ьуз Туг Рго Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд
305 310 315 320
Азр Азп А1а Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Рго
325 330 335
С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а Агд Зег Рго Зег С1у РНе Азп
340 345 350
Агд С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг νβΐ Зег Зег
355 360
<210> 6 <211> 259 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> УНН2
<400> 6
С1и Уа1 С1п Ьеи \7а1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у Агд ТНг РНе Зег Туг Азп
20 25 30
Рго Мер С1у Тгр РЬе Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Агд С1и Ьеи Уа1
35 40 . 45
А1а А1а Не Зег Агд ТЬг С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг Рго Азр Зег Уа1
50 55 60
С1и С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Агд Мер Уа1 Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а А1а А1а С1у Уа1 Агд А1а С1и Азр С1у Агд Уа1 Агд ТЬг Ьеи Рго
100 105 110
Зег С1и Туг ТЬг РЬе Тгр С1у С1п С1у ТЬг С1п Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
А1а А1а А1а С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п
130 135 140
Рго С1у С1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у Агд ТЬг РЬе
145 150 155 160
Зег Туг Азп Рго Мер С1у Тгр РЬе Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Агд
165 170 175
С1и Ьеи Уа1 А1а А1а Не Зег Агд ТЬг С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг Рго
180 185 190
Азр Зег Уа1 С1и С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Агд
195 200 205
Мер Уа1 Туг Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1
210 215 220
Туг Туг Суз А1а А1а А1а С1у Уа1 Агд А1а С1и Азр С1у Агд Уа1 Агд
225 230 235 240
ТЬг Ьеи Рго Зег С1и Туг ТЬг РЬе Тгр С1у С1п С1у ТЬг С1п Уа1 ТЬг
245 250 255
Уа1 Зег Зег
<210> 7 <211> 364 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> УНН2
<400> 7 С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр Туг
20 25 30
Тгр Мер Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и Не Азп ТЬг Азп С1у Ьеи Не ТЬг Ьуз Туг Рго Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Рго Зег С1у РЬе Азп Агд С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг
100 105 НО
Уа1 Зег Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у Зег С1и Уа1 С1п Ьеи
115 120 125
Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у Азп Зег Ьеи Агд Ьеи
- 57 027160
130 135 140
Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег РЬе С1у Мер Зег Тгр
145 150 155 160
Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 Зег Зег 11е Зег
165 170 175
С1у Зег С1у Зег Азр ТЬг Ьеи Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе
180 185 190
ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз ТЬг ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п Мер Азп
195 200 205
Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг 11е С1у С1у
210 215 220
Зег Ьеи Зег Агд Зег Зег С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег С1у
225 230 235 240
С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у Зег С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у
245 250 255
С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а
260 265 270
Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр Туг Тгр Мер Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а
275 280 285
Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 Зег С1и 11е Азп ТЬг Азп С1у Ьеи
290 295 300
Не ТЬг Ьуз Туг Рго Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд
305 310 315 320
Азр Азп А1а Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд Рго
325 330 335
С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а Агд Зег Рго Зег С1у РЬе Азп
340 345 350
Агд С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а
355 360
<210> 8 <211> 364 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> УНН2
<400> 8 С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр Туг
20 25 30
Тгр МеР Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и 11е Азп ТЬг Азп С1у Ьеи 11е ТЬг Ьуз Туг Рго Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Рго Зег С1у РЬе Азп Агд С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг
100 105 110
Уа1 Зег Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у Зег С1и Уа1 С1п Ьеи
115 120 125
Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у Азп Зег Ьеи Агд Ьеи
130 135 140
Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег РЬе С1у МеЬ Зег Тгр
145 150 155 160
Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 Зег Зег 11е Зег
165 170 175
С1у Зег С1у Зег Азр ТЬг Ьеи Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе
180 185 190
ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз ТЬг ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п МеЬ Азп
195 200 205
Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг 11е С1у С1у
210 215 220
Зег Ьеи Зег Агд Зег Зег С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег С1у
225 230 235 240
С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у Зег С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у
245 250 255
С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а
260 265 270
Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр Туг Тгр МеЬ Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а
275 280 285
Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 Зег С1и 11е Азп ТЬг Азп С1у Ьеи
290 295 300
Не ТЬг Ьуз Туг Рго Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд
305 310 315 320
Азр Азп А1а Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Рго
325 330 335
С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а Агд Зег Рго Зег С1у РЬе Азп
340 345 350
Агд С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а
355 360
<210> 9 <211> 260 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> УНН2
<400> 9
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у 61у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у Агд ТЬг РЬе Зег Туг Азп
20 25 30
Рго МеЬ С1у Тгр РЬе Агд 61п А1а Рго С1у Ьуз С1у Агд С1и Ьеи Уа1
35 40 45
А1а А1а 11е Зег Агд ТЬг С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг Рго Азр Зег Уа1
50 55 60
С1и С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Агд МеЬ Уа1 Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а А1а А1а С1у Уа1 Агд А1а С1и Азр С1у Агд Уа1 Агд ТЬг Ьеи Рго
100 105 110
Зег С1и Туг ТЬг РЬе Тгр С1у С1п С1у ТЬг С1п Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
А1а А1а А1а С1и Уа1 С1п Ьеи 7а1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п
130 135 140
Рго С1у С1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у Агд ТЬг РЬе
145 150 155 160
8ег Туг Азп Рго МеЬ С1у Тгр РНе Агд С1п 170 А1а Рго С1у Ьуз СЯу 175 Агд
165
С1и Ьеи Уа1 А1а А1а 11е Зег Агд ТНг С1у С1у Зег ТНг Туг Туг Рго
180 185 190
Азр Зег Уа1 С1и С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Агд
195 200 205
МеЬ Уа1 Туг Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1
210 215 220
Туг Туг Суз А1а А1а А1а С1у Уа1 Агд А1а С1и Азр С1у Агд Уа1 Агд
225 230 235 240
ТНг Ьеи Рго Зег С1и Туг ТНг РНе Тгр С1у С1п С1у ТНг С1п Уа1 ТНг
245 250 255
Уа1 Зег Зег А1а
260
<210> <211> <212> <213> 10 119 ПРТ Искусственная последовательность
<220>
<223> Ьот 1Н-574-208
<400> 10
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи 61и Зег СЯу С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Азр Ьуз Туг
20 25 30
Зег МеЬ С1у Тгр Уа1 Агд СЯп А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1п 11е Зег Азр ТНг А1а Азр Агд ТНг Туг Туг А1а НЬз А1а Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а 11е Туг ТНг С1у Агд Тгр Уа1 Рго РНе С1и Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115
<210> 11 <211> 230 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слияние Пот 1Н-574-208-УЬ <400> 11
СЯи 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 СЯи Зег С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а
Зег МеЬ С1у Тгр Уа1 Агд С1п А1а
С1у СЯу Ьеи Уа1 СЯп Рго СЯу 15 С1у
10
Зег С1у РНе ТНг РНе Азр Ьуз Туг
25 30
Рго СЯу Ьуз СЯу Ьеи 61и Тгр Уа1
35 40 45
Зег 61п Не Зег Азр ТЬг А1а Азр Агд ТЬг Туг Туг А1а НЬз А1а Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Не Туг ТЬг С1у Агд Тгр Уа1 Рго РЬе С1и Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Азр Не С1п МеЬ ТЬг С1п
115 120 125
Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг
130 135 140
Суз Агд А1а Зег Агд Рго Не С1у ТЬг ТЬг Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п
145 150 155 160
Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Ьеи Тгр Азп Зег Агд Ьеи
165 170 175
С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег 61у ТЬг Азр
180 185 190
РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг
195 200 205
Туг Суз А1а С1п А1а С1у ТЬг ΗΪ3 Рго ТЬг ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг
210 215 220
Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
225 230
<210> 12 <211> 119 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ϋΤ04-Η-033 (родительский 1Ь-13 дАЬ)
<400> 12
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе А1а Азр Туг
20 25 30
С1у МеЬ А1а Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег ТЬг Не Зег Туг Азп С1у Ьеи Туг ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Ьуз Туг С1и Туг Зег Рго С1и Зег Азр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 13 <211> 118 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность
- 61 027160 <220>
<223> Ьош 10Ь-53-567 <400> 13
С1у Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у О1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Уа1 РЬе А1а Тгр Туг
20 25 30
Азр МеЬ С1у Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег Не Азр Тгр ΗΪ3 С1у С1и Уа1 ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а ТНг А1а С1и Азр С1и Рго С1у Туг Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг
100 105 но
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 14 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тАЬ против УН М2.3С10. .1006
<400> 14 Азр 11е Уа1 МеЬ ТЬг С1п Зег С1п Ьуз РЬе МеЬ Зег Рго ТЬг Уа1 О1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 Зег 11е ТЬг Суз Ьуз А1а Зег С1п Азп Уа1 01 у ТЬг А1а
20 25 30
Уа1 А1а Тгр Туг С1п О1п Ьуз Рго С1у С1п Зег Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Зег А1а Зег Азп Агд Туг ТЬг С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе ТЬг С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Азп Азп МеЬ О1п Зег
65 70 75 80
С1и Азр Ьеи А1а Азр Туг РЬе Суз С1п С1п Туг С1у Зег Туг Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе О1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 15 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> тАЬ против УН М2. ЗОЮ. 1006 <400> 15
С1и Уа1 О1п Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго Уа1 Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у А1а
- 62 027160
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз МеЬ Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг Ьеи ТЬг С1и Зег
20 25 30
Туг МеЬ НЬз Тгр Уа1 Ьуз С1п Зег ΗΪ5 С1у Ьуз Зег Ьеи С1и Тгр 11е
35 40 45
С1у Уа1 Не Зег Рго Туг Азп С1у С1у ТЬг Зег Туг Азп С1п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ С1и Ьеи Азп Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
ТЬг Агд Агд С1у 11е Туг Туг Азр Рго Зег Тгр РЬе А1а Туг Тгр С1у
100 105 110
С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
115 120
<210> 16 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220> <223> РОМ1Ь- -131- -206 бАЬ
<400> 16 С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи \7а1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе А1а НЬз С1и
20 25 30
ТЬг МеЬ Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег НЬз 11е Рго Рго Азр С1у С1п Азр Рго РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг НЬз Суз
85 90 95
А1а Ьеи Ьеи Рго Ьуз Агд С1у Рго Тгр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а
115 120
<210> 17 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220> <223> ООМ1Ь-131-206 бАЬ
<400> 17 С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п А1а С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе А1а НЬз С1и
20 25 30
ТЬг МеЬ Уа1 Тгр Уа! Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
40 45
Зег Ηίε Не Рго Рго Азр С1у 55 С1п Азр Рго РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1 60
50
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг ΗΪ3 Суз
85 90 95
А1а Ьеи Ьеи Рго Ьуз Агд С1у Рго Тгр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 но
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а
115 120
<210> 18 <211> 119 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220> <223> ЬОМ1Ь- -131- -206 6АЬ
<400> 18 С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 61п А1а С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе А1а ΗΪ3 С1и
20 25 30
ТЬг МеЬ Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег НЬз 11е Рго Рго Азр С1у С1п Азр Рго РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг ΗΪ3 Суз
85 90 95
А1а Ьеи Ьеи Рго Ьуз Агд С1у Рго Тгр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> <211> <212> <213> 19 124 ПРТ Искусственная последовательность
<220>
<223> ООМ1Ь-131-206 <±АЬ
<400> 19
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе А1а ΗΪ3 С1и
20 25 30
ТЬг МеЬ Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег ΗΪ5 11е Рго Рго Азр С1у С1п Азр Рго РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а 61и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг НЬз Суз
85 90 95
А1а Ьеи Ьеи Рго Ьуз Агд С1у Рго Тгр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
115 120
<210> <211> <212> <213> 20 124 ПРТ Искусственная последовательность
<220>
<223> ООМ1Ь-131-206 ЬАЬ
<400> 20
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п АЬа С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе А1а НЬз С1и
20 25 30
ТЬг МеЬ Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег НЬз 11е Рго Рго Азр С1у С1п Азр Рго РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд АЬа С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг НЬз Суз
85 90 95
А1а Ьеи Ьеи Рго Ьуз Агд С1у Рго Тгр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
115 120
<210> 21 <211> 357 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ϋΟΜΙΗ-131-206 ЬАЬ <400> 21 даадЬасаас ЬдсЬддадад сддЬддсддс сЬддЬЬсаас сдддЬддЬЬс ссЬдсдссЬд 60
ЬссЬдЬдсдд саЬсЬддЬЬЬ сассЬЬсдса сасдааасда ЬддЬдЬдддЬ ЬсдссаадсЬ 120 ссдддсааад дссЬддааЬд ддЬаадссас аЬЬссЬссад аЬддссадда сссаЬЬсЬаЬ 180 дсддаЬЬссд ЬЬаадддЬсд сЬЬЬассаЬЬ ЬсЬсдЬдаЬа асЬссааааа сасссЬдЬас 240 сЬдсадаЬда асЬсссЬдсд сдссдаддаЬ асЬдсддЬдЬ ассаЬЬдЬдс дсЬдсЬдссЬ 300 ааасдЬддсс сдЬддЬЬсда ЬЬасЬддддЬ садддЬасЬс ЬддЬсассдЬ аадсадс 357 <210> 22 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 65 027160 <223> ϋοιη1Η-131-206 <400> 22 даадСасаас СдсСддадад сддСддсддс сСддССсаас сдддСддССс ссСдсдссСд 60
СссСдСдсдд саСсСддССС сассССсдса сасдааасда СддСдСдддС СсдссаадсС 120 ссдддсааад дссСддааСд ддСаадссас аССссСссад аСддссадда сссаССсСаС 180 дсддаССссд ССаадддСсд сСССассаСС СсСсдСдаСа асСссааааа сасссСдСас 240 сСдсадаСда асСсссСдсд сдссдаддаС асСдсддСдС ассаССдСдс дсСдсСдссС 300 ааасдСддсс сдСддССсда ССасСддддС садддСасСс СддСсассдС аадсадсдсд 360 <210> 23 <211> 372 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΩοπιΙΗ-131-206 <400> 23 даадСасаас СдсСддадад сддСддсддс сСддССсаас сдддСддССс ссСдсдссСд 60
СссСдСдсдд саСсСддССС сассССсдса сасдааасда СддСдСдддС СсдссаадсС 120 ссдддсааад дссСддааСд ддСаадссас аССссСссад аСддссадда сссаССсСаС 180 дсддаССссд ССаадддСсд сСССассаСС СсСсдСдаСа асСссааааа сасссСдСас 240 сСдсадаСда асСсссСдсд сдссдаддаС асСдсддСдС ассаССдСдс дсСдсСдссС 300 ааасдСддсс сдСддССсда ССасСддддС садддСасСс СддСсассдС аадсадсдсд 360
СсСассааад дС 372 <210> 24 <211> 735 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> УНН против 1Ь6 <400> 24 даадСдсадс СддССдааСс СддсддСддС сСддССсадс сдддСддССс СсСдсдСсСд 60
СсССдсдсад сдСсСддСад сдССССсааа аСсаасдСда СддсдСддСа СсдСсаддсС 120 ссдддсааад дСсдСдаасС ддССдсдддС аСсаСССсСд дсддСадсас ССссСасдсд 180 дасСссдССа ааддСсдССС сассаСсадс сдсдасаасд сдааааасас ссСдСассСд 240 садаСдаасС сСсСдсдСсс ддаадаСасс дсддСССасС аССдсдсдСС саСсассасс 300 дааСсСдасС асдассСддд СсдСсдССаС СддддСсадд дСасСсСддС аассдСаСсс 360
СсСддСддСд дСддССсСдд СддСддССсс даадСасадс СддСддааСс СддсддСддС 420 сСддСасадс сдддСаасСс СсСдсдСсСд СсССдСдсдд сССсСддССС сассССсСсс 480 адсССсддСа СдСсССдддС СсдСсаддса ссдддсааад дСсСддааСд ддСдСсСадс 540 аСсСсСддса дсддССсСда СасссСдСас дсСдасСссд СдаааддСсд СССсасСаСс 600
Ссссдсдаса асдсдаааас сасссСдСас сСдсадаСда асСсСсСдсд Сссддаадас 660 ассдсСдССС асСасСдсас саСсддСддС адссСдСссс дССсССсСса дддСасссСд 720
дССасСдСда дсСсС 735
<210> 25 <211> 1089 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> УНН против ΤΝΓ альфа
- 66 027160 <400> 25 даадрдсадс
РсРРдсдсад ссдддРааад ссддасРссд сРдсадаРда
РсРддРРРса ддсддРддРР
РсРсРдсдРс дРРсдРсадд дасасссРдР ассасссРдР ассаРсддРд ддрддрддар садссдддРд
РддаРдРасР ассаасддРс дасаасдсда дРРРаРРасР дРаРссРсР
РддРадааРс сРРсРддсРР дРсРддааРд
РдаааддРсд асРсРсРдсд ассдРддРса сРдаадРРса
РдРсРРдРдс сассдддРаа асдсРдасРс аРсРдсадаР дсРсРсРдРс ссддрддсдд дРРсРсРдсд дддРРсдРса
РдаРсассаа аааасасссР дсдсасдРРс
РддсддРддР сассРРсРсс ддрдрсрдаа
РРРсассаРс
РссддаадаР дддРасРсРд дсРддРРдаа ддсРРсРддс аддссрддаа
РдРРаааддс даасРсссРд
РсдРРсРРсР
РадсдаадРР
РсРдРсРРдР ддсассдддр аРасссддас драссрдсад
РссдРсРддР сРддРасадс дасРасРдда аРсаасасса
Рсссдсдаса ассдсддРРР дРРассдРаа адсддРддРд
РРсассРРсР
РдддРРРссР сдсРРсасса сдРссддаад садддРассс садсРддРРд дсадсдРсРд аааддРсРдд адсдрдааад аРдаасРсРс
РРсаассдРд сдддРддРРс
РдРаРРдддР асддссРдаР асдсдааааа асРаРРдРдс дсРсРддРдд дРсРддРаса ссРсРРРсдд сРаРсРсРдд
РсРсссдРда аРассдсРдР
РддРРассдР ааРсРддсдд дсРРсассРР ааРдддРдРс дРсдРРРсас
РдсдРссдда дРсадддРас
РсРдсдРсРд
РсдРсаддсд сассаааРас сасссРдРас дсдРРсРссд
РддРддаРсс дссдддРаас
РаРдРсРРдд
РадсддРРсР саасдсдааа аРасРасРдс аРсРадсддР
РддРсРддРР садсдаРРас
РдаааРсаас саРсадссдР адасасРдсд ссРддРРасР
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1089 <210> 26 <211> 777 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> УНН против фактора фон Виллебранда <400> 26 даддРасадс
РсРРдсдсад ссдддРааад ссддасРссд сРдсадаРда дРРсдРдсРд ддРасссадд ддРсРддРас
РссРасаасс дсааРсРсРс аРсРсРсдРд дасассдсад асссРдссда рддрддааад сРРсРддссд дРсдРдаасР
РддааддРсд асадссРдсд аадасддРсд
РРассдРРРс адссдддрдд сдаРдддРРд дсасРддРдд асаасдсдаа
РРРаРРасРд дсдааРасас сддрддрддр
РассРРсадс ддррдсддсд
РРРсассаРс сдсРдаадас
РдРРсдРасс
РРсРдсадсд
РРсРсРдсдР дРРссдРсад сРсРассРас асдрарддрд сдсддсадсР сРРсРддддР сРддРРсадс
Расаасссда аРсРсРсдРа
Рсссдсдаса ассдсддРРР сРдссдРссд дсддаадРдс сРдРсРРдРд дсассдддРа
РасссддасР
РассРдсада ддрдррсдрд садддРассс сдддРддРРс
РдддРРддРР ссддРддсРс асдсдааасд асРаРРдРдс ааРасассРР адсРддРРда сРдсдРсРдд ааддРсдРда сРдРРдаадд
РдаасРсссР садаадасдд аддРаассдР
РсРдсдРсРд 60 ссдРсаддсР 120 РассРасРаР 180 РаРддРаРас 240 РдсадсдддР 300 сРддддРсад 360 аРсРддсддР 420 РсдсассРРс 480 асРддРадсд 540 ссдсРРсасс 600 дсдрдсддаа 660 РсдРдРРсдР 720 аРсРРсР 777 <210> 27 <211> 738 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> УНН против 1Ь6 <400> 27 даадрдсадс РддРРдааРс РддсддРддР сРддРРсадс сдддРддРРс РсРдсдРсРд 60
РсРРдсдсад сдРсРддРад сдРРРРсааа арсаасдрда РддсдРддРа РсдРсаддсР 120 ссдддРааад дРсдРдаасР ддРРдсдддР аРсаРРРсРд дсддРадсас РРссРасдсд 180 дасРссдРРа ааддРсдРРР сассаРсадс сдсдасаасд сдааааасас ссРдРассРд 240
- 67 027160 садабдаасб сйсйдсдбсс ддаадайасс дсддбббасб аббдсдсдбб сайсассасс 300 даабсбдасб асдассбддд бсдбсдббаб бддддбсадд дбасбсбддб аассдбабсс 360 бсбддбддбд дбддббсбдд бддбддббсс даадбасадс бддбддаабс бддсддбддб 420 сйддбасадс сдддбаасбс бсбдсдйсбд бсббдбдсдд сббсбддббД сассббсбсс 480 адсббсддба бдбсббдддб бсдбсаддса ссдддбааад дбсбддаабд ддбдбсбадс 540 абсбсбддса дсддббсбда Расссбдбас дсбдасбссд бдаааддбсд бббсасбабс 600 бсссдсдаса асдсдаааас сасссбдбас сбдсадабда асбсбсбдсд бссддаадас 660 ассдсбдббб асбасбдсас сабсддбддб адссбдбссс дббсббс-Ьса дддбасссЬд 720 дббасбдбда дсйсЬдсд 738 <210> 28 <211> 1092 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> УНН против ΤΝΓ альфа <400> 28 даадйдсадс бддбадаабс бддсддбддб сбддбасадс сдддбддббс Ссбдсдбсйд 60 бсббдсдсад сббсбддсбб сассббсбсс дасбасбдда бдбаббдддб бсдбсаддсд 120 ссдддбааад дбсбддаабд ддбдбсбдаа абсаасасса асддссбдаб сассааабас 180 ссддасбссд бдаааддбсд бббсассабс бсссдсдаса асдсдааааа сасссбдбас 240 сбдсадабда асбсбсбдсд бссддаадаб ассдсддббб асбаббдбдс дсдббсбссд 300 бсбддбббса ассдбддбса дддбасбсбд дббассдбаа дсбсбддбдд бддбддабсс 360 ддсддбддбб сбдаадббса дсбддббдаа адсддбддбд дбсбддбаса дссдддбаас 420 бсбсбдсдбс бдбсббдбдс ддсббсбддс ббсассббсб ссбсбббсдд бабдбсббдд 480 дббсдбсадд сассдддбаа аддссбддаа бдддбббссб сбабсбсбдд бадсддббсб 540 дасасссбдб асдсбдасбс бдббаааддс сдсббсасса бсбсссдбда саасдсдааа 600 ассасссбдб абсбдсадаб даасбсссбд сдбссддаад абассдсбдб абасбасбдс 660 ассабсддбд дсбсбсбдбс бсдббсббсб садддбассс бддббассдб абсбадсддб 720 ддбддбддаб ссддбддсдд бадсдаадбб садсбддббд аабсбддсдд бддбсбддбб 780 садссдддбд дббсбсбдсд бсбдбсббдб дсадсдбсбд дсббсассбб садсдаббас 840 бддабдбасб дддббсдбса ддсассдддб аааддбсбдд аабдддбдбс бдааабсаас 900 ассаасддбс бдабсассаа абасссддас адсдбдааад дбсдбббсас сабсадссдб 960 дасаасдсда аааасасссб дбассбдсад абдаасбсбс бдсдбссдда адасасбдсд 1020 дбббаббасб дсдсасдббс бссдбсбддб ббсаассдбд дбсадддбас ссбддббасб 1080 дбабссбсбд сд 1092 <210> 29 <211> 780 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> УНН против фактора фон Виллебранда <400> 29 даддбасадс бддбддааад сддбддбддб сбддббсадс сдддбддббс бсбдсдбсбд 60 бсббдсдсад сббсбддссд бассббсадс басаасссда бдддббддбб ссдбсаддсб 120 ссдддбааад дбсдбдаасб ддббдсддсд абсбсбсдба ссддбддсбс бассбасбаб 180 ссддасбссд бддааддбсд бббсассабс бсссдсдаса асдсдааасд бабддбабас 240 сбдсадабда асадссбдсд сдсбдаадас ассдсддббб асбаббдбдс бдсадсдддб 300 дббсдбдсбд аадасддбсд бдббсдбасс сбдссдбссд аабасассбб сбддддбсад 360 ддбасссадд ббассдбббс ббсбдсадсд дсддаадбдс адсбддббда абсбддсддб 420 ддбсбддбас адссдддбдд ббсбсбдсдб сбдбсббдбд сбдсдбсбдд бсдсассббс 480 бссбасаасс сдабдддббд дббссдбсад дсассдддба ааддбсдбда асбддбадсд 540 дсаабсбсбс дсасбддбдд сбсбассбас басссддасб сбдббдаадд ссдсббсасс 600
- 68 027160 аЬсЬсЬсдЬд асаасдсдаа асдЬаЬддЬд ЬассЬдсада ЬдаасЬсссЬ дсдЬдсддаа 660 дасассдсад ЬЬЬаЬЬасЬд сдсддсадсЬ ддЬдЬЬсдЬд садаадасдд ЬсдЬдЬЬсдЬ 720 асссЬдссда дсдааЬасас сЬЬсЬддддЬ садддЬассс аддЬаассдЬ аЬсЬЬсЬдсд 780 <210> 30 <211> 581 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> шАЬ-УЬ молекула '735 (1Ь-13гаАЬ: 1Ь-4У каппа <ЬАЪ) молекула '735 <400> 30
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и УаЬ Ьуз Ьуз Рго С1у Зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег 61у РНе Туг Не Ьуз Азр ТНг
20 25 30
Туг МеЬ НЬз Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр МеЬ
35 40 45
С1у ТНг Не Азр Рго А1а Азп С1у Азп ТНг Ьуз Туг νβΐ Рго Ьуз РНе
50 55 60
С1п С1у Агд Уа1 ТНг Не ТНг А1а Азр С1и Зег ТНг Зег ТНг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Не Туг Азр Азр Туг НЬз Уа1 Азр Азр Туг Туг А1а МеН
100 105 110
Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг
115 120 125
Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег
130 135 140
С1у С1у ТНг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и
145 150 155 160
Рго Уа1 ТНг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 НЬз
165 170 175
ТНг РНе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег 61у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег
180 185 190
Уа1 Уа1 ТНг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТНг С1п ТНг Туг Не Суз
195 200 205
Азп Уа1 Азп НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз \7а1 С1и
210 215 220
Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТНг НЬз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго
225 230 235 240
С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз
245 250 255
Азр ТНг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 УаЬ УаЬ
260 265 270
Азр Уа1 Зег НЬз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр
275 280 285
С1у Уа1 С1и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг
290 295 300
Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг УаЬ Ьеи НЬз С1п Азр
305 310 315 320
Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи
325 330 335
Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд
340 345 350
С1и Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТНг Ьуз
355 360 365
Азп С1п νβΐ Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр
370 375 380
11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз
385 390 395 400
ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег
405 410 415
Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РНе Зег
420 425 430
Суз Зег Уа1 МеЬ Ηίδ С1и А1а Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТНг С1п Ьуз Зег
435 440 445
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз С1у Зег ТНг Уа1 А1а А1а Рго Зег С1у
450 455 460
Зег ТНг Уа1 А1а А1а Рго Зег С1у Зег Азр Не С1п МеЬ ТНг С1п Зег
465 470 475 480
Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз
485 490 495
Агд А1а Зег Агд Рго 11е Зег Азр Тгр Ьеи НЬз Тгр Туг С1п С1п Ьуз
500 505 510
Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не А1а Тгр А1а Зег Зег Ьеи С1п
515 520 525
С1у С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе
530 535 540
ТНг Ьеи ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг
545 550 555 560
Суз С1п С1п С1и С1у Тгр С1у Рго Рго ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз
565 570 575
Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
580
<210> 31 <211> 219 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> молекула 735 <400> 31
Азр Не Уа1 МеЬ ТНг С1п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТНг Рго С1у
1 5 10 15
С1и Рго А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег С1п Азп Не Уа1 НЬз 11е
20 25 30
Азп С1у Азп ТНг Туг Ьеи С1и Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз Рго С1у С1п Зег
35 40 45
Рго Агд Ьеи Ьеи Не Туг Ьуз Не Зег Азр Агд РНе Зег С1у Уа1 Рго
50 55 60
Азр Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи Ьуз 11е
65 70 75 80
Зег Агд Уа1 С1и А1а Азр Азр Уа1 С1у Не Туг Туг Суз РНе С1п С1у
85 90 95
Зег НЬз Уа1 Рго Тгр ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105 110
Агд ТНг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РНе Не РНе Рго Рго Зег Азр С1и
115 120 125
С1п Ьеи 130 Ьуз Зег С1у ТНг А1а Зег 135 Уа1 УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп 140 РНе
Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи СЯп
145 150 155 160
Зег С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТНг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег
165 170 175
ТНг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и
180 185 190
Ьуз НЬз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТНг Н13 С1п С1у Ьеи Зег Зег
195 200 205
Рго Уа1 ТНг Ьуз Зег РНе Азп Агд С1у С1и Суз
210 215 <210> 32 <211> 571 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 15014 <400> 32
С1п Уа1 ТНг Ьеи Агд С1и Зег С1у Рго А1а Ьеи Уа1 Ьуз Рго ТНг С1п
1 5 10 15
ТНг Ьеи ТНг Ьеи ТНг Суз ТНг РНе Зег С1у РНе Зег Ьеи Зег ТНг Зег
20 25 30
СЯу МеЬ СЯу Уа1 Зег Тгр Не Агд С1п Рго Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и
35 40 45
Тгр Ьеи А1а НЬз 11е Туг Тгр Азр Азр Азр Ьуз Агд Туг Азп Рго Зег
50 55 60
Ьеи Ьуз Зег Агд Ьеи ТНг 11е Зег Ьуз Азр ТНг Зег Агд Азп С1п Уа1
65 70 75 80
Уа1 Ьеи ТНг МеЬ ТНг Азп МеЬ Азр Рго Уа1 Азр ТНг А1а ТНг Туг Туг
85 90 95
Суз А1а Агд Агд С1и ТНг Уа1 РНе Туг Тгр Туг РНе Азр Уа1 Тгр С1у
100 105 110
Агд С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег
115 120 125
Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег С1у С1у ТНг А1а
130 135 140
А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго Уа1 ТНг Уа1
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 НЬз ТНг РНе Рго А1а
165 170 175
Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТНг Уа1
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТНг С1п ТНг Туг Не Суз Азп Уа1 Азп НЬз
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз
210 215 220
Азр Ьуз ТНг НЬз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у
225 230 235 240
С1у Рго Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеЬ
245 250 255
Не Зег Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 УаЬ Азр Уа1 Зег НЬз
260 265 270
С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и ν3ι
275 280 285
ΗΪ5 Азп А1а 290 Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг
295 300
Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нхз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у
305 310 315 320
Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не
325 330 335
С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1
340 345 350
Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег
355 360 365
Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и
370 375 380
Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго
385 390 395 400
Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1
405 410 415
Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ
420 425 430
Нхз С1и А1а Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег
435 440 445
Рго С1у Ьуз С1у Зег ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег ТЬг Азр Не С1п МеЬ
450 455 460
ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг
465 470 475 480
11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Агд Рго 11е Зег Азр Тгр Ьеи Нхз Тгр Туг
485 490 Не 495
С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи А1а Тгр А1а Зег
500 505 510
Зег Ьеи С1п С1у С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у
515 520 525
ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а
530 535 540
ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п С1и С1у Тгр С1у Рго Рго ТЬг РЬе С1у С1п
545 550 555 560
С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд А1а А1а А1а
565 570
<210> 33 <211> 218 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 15014
<400> 33
Азр 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Ьуз А1а Зег С1п Зег Уа1 Азр Туг Азр
20 25 30
С1у Азр Зег Туг МеЬ Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго
35 40 45
Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег С1у Не Рго Зег
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг РЬе ТЬг Не Зег
65 70 75 80
Зег Ьеи С1п Рго С1и 85 Азр Не А1а ТНг Туг 90 Туг Суз С1п С1п Зег Азп 95
С1и Азр Рго Рго ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 61и 11е Ьуз Агд
100 105 110
ТНг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РНе 11е РНе Рго Рго Зег Азр С1и С1п
115 120 125
Ьеи Ьуз Зег 61у ТНг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РНе Туг
130 135 140
Рго Агд С1и А1а Ьуз \7а1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег
145 150 155 160
С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТНг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТНг
165 170 175
Туг Зег Ьеи Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз
180 185 190
ΗΪ3 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТНг Низ С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго
195 200 205
Уа1 ТНг Ьуз Зег РНе Азп Агд С1у С1и Суз
210 215
<210> 34 <211> 569 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тАЬ-УЬ 15019
<400> 34
С1п Уа1 ТНг Ьеи Агд С1и Зег С1у Рго А1а Ьеи Уа1 Ьуз Рго ТНг С1п
1 5 10 15
ТНг Ьеи ТНг Ьеи ТНг Суз ТНг РНе Зег С1у РНе Зег Ьеи Зег ТНг Зег
20 25 30
С1у МеН С1у Уа1 Зег Тгр Не Агд С1п Рго Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и
35 40 45
Тгр Ьеи А1а НЬз 11е Туг Тгр Азр Азр Азр Ьуз Агд Туг Азп Рго Зег
50 55 60
Ьеи Ьуз Зег Агд Ьеи ТНг 11е Зег Ьуз Азр ТНг Зег Агд Азп С1п Уа1
65 70 75 80
Уа1 Ьеи ТНг МеН ТНг Азп МеЬ Азр Рго Уа1 Азр ТНг А1а ТНг Туг Туг
85 90 95
Суз А1а Агд Агд С1и ТНг Уа1 РНе Туг Тгр Туг РНе Азр Уа1 Тгр С1у
100 105 но
Агд С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег
115 120 125
Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег 61у С1у ТНг А1а
130 135 140
А1а Ьеи 61у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго Уа1 ТНг УаЬ
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 НЬз ТНг РНе Рго А1а
165 170 175
Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТНг УаЬ
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТНг С1п ТНг Туг 11е Суз Азп УаЬ Азп НЬз
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Ьуз УаЬ С1и Рго Ьуз Зег Суз
210 215 220
Азр Ьуз ТНг НЬз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у
225 230 235 240
С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ
245 250 255
11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег НЬз
260 265 270
С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1
275 280 285
НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг
290 295 300
Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у
305 310 315 320
Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не
325 330 335
С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз 61у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1
340 345 350
Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег
355 360 365
Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и
370 375 380
Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго
385 390 395 400
Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1
405 410 415
Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ
420 425 430
НЬз С1и А1а Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег
435 440 445
Рго С1у Ьуз С1у Зег ТЬг Уа1 АЬа А1а Рго Зег ТЬг Азр Не С1п МеЬ
450 455 460
ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг
465 470 475 480
11е ТЬг Суз Агд АЬа Зег Агд Рго 11е Зег Азр Тгр Ьеи НЬз Тгр Туг
485 490 495
С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не АЬа Тгр А1а Зег
500 505 510
Зег Ьеи С1п С1у С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у
515 520 525
ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а
530 535 540
ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п С1и С1у Тгр С1у Рго Рго ТЬг РЬе С1у С1п
545 550 555 560
С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд ТЬг
565
<210> 35 <211> 218 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> тАЬ-УЬ 15019 <400> 35
Азр 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п 5 Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Ьуз А1а Зег С1п Зег Уа1 Азр Туг Азр
20 25 30
С1у Азр Зег Туг МеЬ Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз 40 Рго С1у Ьуз А1а 45 Рго
35
Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг А1а А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег С1у 11е Рго Зег
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг РЬе ТЬг 11е Зег
65 70 75 80
Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр 11е А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Азп
85 90 95
С1и Азр Рго Рго ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
100 105 110
ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п
115 120 125
Ьеи Ьуз Зег С1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг
130 135 140
Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз ν3ι Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег
145 150 155 160
С1у Азп Зег С1п С1и Зег \7а1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг
165 170 175
Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз
180 185 190
ΗΪ3 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг НЬз С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго
195 200 205
Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз
210 215
<210> 36 <211> 570 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тАЬ-7Ь 15020
<400> 36
С1п Уа1 ТЬг Ьеи Агд С1и Зег С1у Рго А1а Ьеи Уа1 Ьуз Рго ТЬг С1п
1 5 10 15
ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи ТЬг Суз ТЬг РЬе Зег С1у РЬе Зег Ьеи Зег ТЬг Зег
20 25 30
С1у МеЬ С1у Уа1 Зег Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и
35 40 45
Тгр Ьеи А1а НЬз 11е Туг Тгр Азр Азр Азр Ьуз Агд Туг Азп Рго Зег
50 55 60
Ьеи Ьуз Зег Агд Ьеи ТЬг 11е Зег Ьуз Азр ТЬг Зег Агд Азп С1п Уа1
65 70 75 80
Уа1 Ьеи ТЬг Мер ТЬг Азп Мер Азр Рго Уа1 Азр ТЬг А1а ТЬг Туг Туг
85 90 95
Суз А1а Агд Агд С1и ТЬг Уа1 РЬе Туг Тгр Туг РЬе Азр Уа1 Тгр С1у
100 105 110
Агд С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег
115 120 125
Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег 61у 61у ТЬг А1а
130 135 140
А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 НЬз ТЬг РЬе Рго А1а
165 170 175
Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п ТЬг Туг 11е Суз Азп ν31 Азп Низ
195 200 205
Ьув Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз
210 215 220
Азр Ьуз ТЬг Низ ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у
225 230 235 240
С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ
245 250 255
11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ
260 265 270
С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у ν3ι С1и Уа1
275 280 285
ΗΪ5 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг
290 295 300
Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у
305 310 315 320
Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е
325 330 335
С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1
340 345 350
Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег
355 360 365
Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и
370 375 380
Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго
385 390 395 400
Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1
405 410 415
Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ
420 425 430
Низ С1и А1а Ьеи Низ Азп Низ Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег
435 440 445
Рго С1у Ьуз С1у Зег ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег ТЬг Азр 11е С1п МеЬ
450 455 460
ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг
465 470 475 480
11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Агд Рго 11е Зег Азр Тгр Ьеи Низ Тгр Туг
485 490 495
С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е А1а Тгр А1а Зег
500 505 510
Зег Ьеи С1п С1у С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у
515 520 525
ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а
530 535 540
ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п С1и С1у Тгр С1у Рго Рго ТЬг РЬе С1у С1п
545 550 555 560
С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд ТЬг Уа1
565 570
<210> 37 <211> 218 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> тАЬ-νίί 15020
- 76 027160 <400> 37
Азр 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи 10 Зег А1а Зег Уа1 С1у 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Ьуз А1а Зег С1п Зег Уа1 Азр Туг Азр
20 25 30
С1у Азр Зег Туг МеЬ Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго
35 40 45
Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег С1у Не Рго Зег
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг РЬе ТЬг Не Зег
65 70 75 80
Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр Не А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Азп
85 90 95
С1и Азр Рго Рго ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105 НО
ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п
115 120 125
Ьеи Ьуз Зег 61у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг
130 135 140
Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег
145 150 155 160
С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг
165 170 175
Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз
180 185 190
НЬз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг НЬз С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго
195 200 205
Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз
210 215
<210> <211> <212> <213> 38 530 ПРТ Искусственная последовательность
<220>
<223> тАЬ-УЬ 15021
<400> 38
Тгр Не Агд С1п Рго Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Ьеи А1а НЬз Не
1 5 10 15
Туг Тгр Азр Азр Азр Ьуз Агд Туг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз Зег Агд Ьеи
20 25 30
ТЬг Не Зег Ьуз Азр ТЬг Зег Агд Азп С1п Уа1 УаЬ Ьеи ТЬг МеЬ ТЬг
35 40 45
Азп МеЬ Азр Рго Уа1 Азр ТЬг А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а Агд Агд С1и
50 55 60
ТЬг УаЬ РЬе Туг Тгр Туг РЬе Азр Уа1 Тгр С1у Агд С1у ТЬг Ьеи Уа1
65 70 75 80
ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а
85 90 95
Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег С1у С1у ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи
100 105 НО
Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг νβΐ Зег Тгр Азп Зег С1у
115 120 125
А1а Ьеи ТЬг Зег С1у УаЬ НЬз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег
130 135 140
С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи
145 150 155 160
С1у ТЬг С1п ТЬг Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Низ Ьуз Рго Зег Азп ТЬг
165 170 175
Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг ΗΪ3 ТЬг
180 185 190
Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег νπΐ РЬе
195 200 205
Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мер Не Зег Агд ТЬг Рго
210 215 220
С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С1и Уа1
225 230 235 240
Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и \7а1 Низ Азп А1а Ьуз ТЬг
245 250 255
Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1
260 265 270
Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз
275 280 285
Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег
290 295 300
Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п 7а1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго
305 310 315 320
Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1
325 330 335
Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у
340 345 350
С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр
355 360 365
С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр
370 375 380
С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер Низ С1и А1а Ьеи Низ
385 390 395 400
Азп Низ Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз С1у Зег
405 410 415
ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег ТЬг Азр Не С1п Мер ТЬг С1п Зег Рго Зег
420 425 430
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а
435 440 445
Зег Агд Рго Не Зег Азр Тгр Ьеи Низ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у
450 455 460
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не А1а Тгр А1а Зег Зег Ьеи С1п С1у С1у
465 470 475 480
Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи
485 490 495
ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п
500 505 510
С1п С1и С1у Тгр С1у Рго Рго ТЬг РЬе 61у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и
515 520 525
Не Ьуз
530
<210> 39 <211> 218 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность
- 78 027160 <220>
<223> тАЪ-УЬ 15021 <400> 39
Азр Не Уа1 Ьеи ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз Ьуз А1а Зег С1п Зег Уа1 Азр Туг Азр
20 25 30
С1у Азр Зег Туг МеР Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго
35 40 45
Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег С1у Не Рго Зег
50 55 60
Агд РНе Зег 61у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг РНе ТНг Не Зег
65 70 75 80
Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр Не А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Азп
85 90 95
С1и Азр Рго Рго ТНг РНе 61у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105 НО
ТНг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РНе Не РНе Рго Рго Зег Азр С1и С1п
115 120 125
Ьеи Ьуз Зег С1у ТНг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РНе Туг
130 135 140
Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег
145 150 155 160
С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТНг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТНг
165 170 175
Туг Зег Ьеи Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз
180 185 190
ΗΪ3 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТНг ΗΪ5 С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго
195 200 205
Уа1 ТНг Ьуз Зег РНе Азп Агд С1у С1и Суз
210 215
<210> 40 <211> 481 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ОМ330045: ООМ15-26-597 с1АЪ Ν-(УЕРКЗЗЬК линкер) и
С-концевой К-044-085 ЪАЪ ((ТСЬО5Р)х4)
<400> 40
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго Мер Мер Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и Не Зег Рго Зег С1у Зег Азп ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 61у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1
100 105 НО
ТЬг Уа1 Зег Зег Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз
115 120 125
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи
130 135 140
РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и
145 150 155 160
Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег НЬз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз
165 170 175
РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз
180 185 190
Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи
195 200 205
ТЬг Уа1 Ьеи НЬз 61п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз
210 215 220
Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз
225 230 235 240
А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п \7а1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег
245 250 255
Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз
260 265 270
С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п
275 280 285
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у
290 295 300
Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
305 310 315 320
С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер НЬз С1и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп
325 330 335
НЬз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз ТЬг С1у Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг
355 360 365
С1у Ьеи Азр Зег Рго Азр 11е С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи
370 375 380
Зег А1а Зег Уа1 61у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п
385 390 395 400
Тгр 11е С1у Рго С1и Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у Ьуз А1а
405 410 415
Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг НЬз С1у Зег 11е Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго
420 425 430
Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е
435 440 445
Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг
450 455 460
МеЬ Туг Туг Рго НЬз ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
465 470 475 480
Агд <210> 41 <211> 475 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ОМ330046: ΩΜ31576 с С-концевым К-044-085 бАЬ ((ТСЬОЗР)х4)
- 80 <400> 41
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 61п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго МеС МеС Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и 11е Зег Рго Зег С1у Зег Азп ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд АЬа С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Нгз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго
115 120 125
С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз
130 135 140
Азр ТЬг Ьеи МеС 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1
145 150 155 160
Азр Уа1 Зег Шз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр
165 170 175
С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг
180 185 190
Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нгз С1п Азр
195 200 205
Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи
210 215 220
Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд
225 230 235 240
С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз
245 250 255
Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр
260 265 270
Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз
275 280 285
ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег
290 295 300
Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег
305 310 315 320
Суз Зег Уа1 МеС Нгз С1и А1а Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег
325 330 335
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго Азр
355 360 365
11е С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр
370 375 380
Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд АЬа Зег С1п Тгр Не С1у Рго С1и Ьеи
385 390 395 400
Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг
405 410 415
Низ С1у Зег 11е Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег
420 425 430
С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и
435 440 445
- 81 027160
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Мер Туг Туг Рго Ηίδ ТЬг
450 455 460
РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
465 470 475
<210> 42 <211> 480 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΏΜ330047 (содержит модифицированный С-конец) :
ϋΟΜ15-26-597 с!АЬ Ν-(УЕРКЗЗОК линкер) и С-концевой К-044-085 ЙАЬ минус С-концевой К ((ТСЬОЗР)х4) <400> 42
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго МеР МеР Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и 11е Зег Рго Зег С1у Зег Азп ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеР Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи νβΐ
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз
115 120 125
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи
130 135 140
РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеР 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и
145 150 155 160
Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз
165 170 175
РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз
180 185 190
Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи
195 200 205
ТЬг Уа1 Ьеи Н13 С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз
210 215 220
Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз
225 230 235 240
А1а Ьуз 61у С1п Рго Агд С1и Рго СПп Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег
245 250 255
Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз
260 265 270
С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп 61у С1п
275 280 285
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у
290 295 300
Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр 61п
305 310 315 320
С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ ΗΪ3 С1и А1а Ьеи Низ Азп
325 330 335
ΗΪ3 Туг ТНг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз ТНг С1у Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТНг 61у Ьеи Азр Зег Рго ТНг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТНг
355 360 365
61у Ьеи Азр Зег Рго Азр Не С1п Меб ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи
370 375 380
Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а Зег С1п
385 390 395 400
Тгр Не С1у Рго С1и Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а
405 410 415
Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг ΗΪ5 С1у Зег Не Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго
420 425 430
Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не
435 440 445
Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Туг
450 455 460
Меб Туг Туг Рго Нгз ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
465 470 475 480
<210> 43 <211> 482 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ϋΜ330048 (содержит модифицированный С-конец):
ЦОМ15-26-597 с!АЪ Ν-(νΕΡΚ33ϋΚ линкер) и С-концевой К-044-085 άΑΗ + А ((ТСЬЦЗР)х4 <400> 43
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго Меб Меб Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и Не Зег Рго Зег С1у Зег Азп ТНг Туг Туг А1а Азр Зег \7а1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61п Меб Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1
100 105 110
ТНг Уа1 Зег Зег Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТНг ΗΪ3 ТНг Суз
115 120 125
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РНе Ьеи
130 135 140
РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи Меб Не Зег Агд ТНг Рго С1и
145 150 155 160
Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нгз С1и Азр Рго 61и νβΐ Ьуз
165 170 175
РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ5 Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз
180 185 190
Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи
195 200 205
ТНг Уа1 Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп СЯу Ьуз (Ни Туг Ьуз Суз Ьуз
210 215 220
νβΐ Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е (Ни Ьуз ТНг Не Зег Ьуз
225 230 235 240
А1а Ьуз С1у СЯп Рго Агд С1и Рго СЯп Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег
245 250 255
Агд Азр (Ни Ьеи ТНг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи \7а1 Ьуз
260 265 270
(Ну РНе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 (Ни Тгр (Ни Зег Азп (Ну СЯп
275 280 285
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр СЯу
290 295 300
Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
305 310 315 320
СЯп (Ну Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ НЬз (Ни А1а Ьеи НЬз Азп
325 330 335
НЬз Туг ТНг СЯп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго (Ну Ьуз ТНг (Ну Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТНг СЯу Ьеи Азр Зег Рго ТНг СЯу Ьеи Азр Зег Рго ТНг
355 360 365
(Ну Ьеи Азр Зег Рго Азр 11е С1п МеЬ ТНг СЯп Зег Рго Зег Зег Ьеи
370 375 380
Зег А1а Зег Уа1 СЯу Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег СЯп
385 390 395 400
Тгр 11е (Ну Рго (Ни Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п СЯп Ьуз Рго (Ну Ьуз А1а
405 410 415
Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг НЬз (Ну Зег 11е Ьеи С1п Зег (Ну Уа1 Рго
420 425 430
Зег Агд РНе Зег С1у Зег (Ну Зег (Ну ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не
435 440 445
Зег Зег Ьеи СЯп Рго СЯи Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п СЯп Туг
450 455 460
МеЬ Туг Туг Рго НЬз ТНг РНе (Ну С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 (Ни Не Ьуз
465 470 475 480
Агд А1а
<210> <211> <212> <213> 44 484 ПРТ Искусственная последовательность
<220>
<223> ΩΜ330049 (содержит модифицированный С-конец):
ΩΟΜ15-26-597 <ЬАЪ Ν-(νΕΡΚ33ΩΚ линкер) и С-концевой
К-044-085 сЬАЬ +ААА ((ТСЬЭЗР)х4)
<400> 44
(Ни Уа1 СЯп Ьеи Ьеи Уа1 Зег СЯу СЯу СЯу Ьеи Уа1 СЯп Рго СЯу СЯу
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СЯу РНе ТНг РНе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго МеЬ МеЬ Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго (Ну Ьуз СЯу Ьеи (Ни Тгр Уа1
35 40 45
Зег СЯи Не Зег Рго Зег СЯу Зег Азп ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз СЯу Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг Нхз ТЬг Суз
115 120 125
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи
130 135 140
РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго С1и
145 150 155 160
Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нхз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз
165 170 175
РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Нхз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз
180 185 190
Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи
195 200 205
ТЬг Уа1 Ьеи Нхз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз
210 215 220
Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз
225 230 235 240
А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег
245 250 255
Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз
260 265 270
С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п
275 280 285
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у
290 295 300
Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
305 310 315 320
С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Нхз С1и А1а Ьеи Нхз Азп
325 330 335
НХЗ Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз ТЬг С1у Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг
355 360 365
С1у Ьеи Азр Зег Рго Азр Не С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи
370 375 380
Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег 61п
385 390 395 400
Тгр Не С1у Рго С1и Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а
405 410 415
Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Нхз С1у Зег Не Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго
420 425 430
Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не
435 440 445
Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг
450 455 460
МеЬ Туг Туг Рго Нхз ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
465 470 475 480
Агд А1а А1а А1а
<210> 45
<211> 482
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> ОМ830050 (содержит модифицированный С-конец):
ООМ15-26-597 <ЬАЬ Ν-(УЕРКЗЗЭК линкер) и С-концевой К-044-085 с!АЬ +Т ((ТСЬЬ5Р)х4) <400> 45
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго МеЬ МеЬ Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и 11е Зег Рго Зег С1у Зег Азп ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а 61и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1
100 105 110
ТНг Уа1 Зег Зег Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТНг НЬз ТНг Суз
115 120 125
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег УаЬ РНе Ьеи
130 135 140
РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТНг Рго С1и
145 150 155 160
Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег НЬз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз
165 170 175
РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз
180 185 190
Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи
195 200 205
ТНг Уа1 Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз
210 215 220
Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТНг 11е Зег Ьуз
225 230 235 240
А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд 61и Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег
245 250 255
Агд Азр С1и Ьеи ТНг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз
260 265 270
С1у РНе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п
275 280 285
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у
290 295 300
Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
305 310 315 320
С1п С1у Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ НЬз С1и А1а Ьеи НЬз Азп
325 330 335
НЬз Туг ТНг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз ТНг С1у Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТНг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТНг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТНг
355 360 365
С1у Ьеи Азр Зег Рго Азр 11е С1п МеЬ ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи
370 375 380
Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег С1п
385 390 395 400
Тгр Не С1у Рго С1и 405 Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п С1п 410 Ьуз Рго С1у Ьуз 415 А1а
Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг НЬз С1у Зег 11е Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго
420 425 430
Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не
435 440 445
Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Туг
450 455 460
Мей Туг Туг Рго НЬз ТНг РНе С1у С1п 61у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
465 470 475 480
Агд ТНг
<210> 46 <211> 474 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ΌΜ330051 (содержит модифицированный С-конец): ΩΜ31576
с С-концевым К-044-085 <ЬАЪ минус С-концевой К
( (ТСШ5Р)х4)
<400> 46
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго Мей Мей Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и 11е Зег Рго Зег С1у Зег Азп ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1
100 105 110
ТНг Ца1 Зег Зег А1а Зег ТНг НЬз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго
115 120 125
С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз
130 135 140
Азр ТНг Ьеи Мер Не Зег Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 νβΐ Уа1
145 150 155 160
Азр Ца1 Зег НЬз С1и Азр Рго С1и УаЬ Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр
165 170 175
С1у Уа1 С1и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и СЬп Туг
180 185 190
Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Ца1 Ьеи НЬз СЬп Азр
195 200 205
Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи
210 215 220
Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у СЬп Рго Агд
225 230 235 240
С1и Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТНг Ьуз
245 250 255
Азп СЬп Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр
260 265 270
Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз
275 280 285
ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег
290 295 300
Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп νβΐ РЬе Зег
305 310 315 320
Суз Зег Уа1 МеР Нгз 61и А1а Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег
325 330 335
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у Ьуз ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго Азр
355 360 365
Не С1п МеР ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр
370 375 380
Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Не С1у Рго С1и Ьеи
385 390 395 400
Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг
405 410 415
Ηίβ С1у Зег Не Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег
420 425 430
С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и
435 440 445
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг МеР Туг Туг Рго Нгз ТЬг
450 455 460
РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
465 470
<210> 47 <211> 476 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ОМ330052 (содержит модифицированный С-конец): ОМ31576
с С-концевым К-044-085 ПАР +А ((ТСЬОЗР)х4)
<400> 47
С1и νβΐ С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго Мер МеР Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и Не Зег Рго Зег С1у Зег Азп ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Нгз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго
115 120 125
С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз
130 135 140
Азр ТЬг Ьеи МеР Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1
145 150 155 160
Азр Уа1 Зег НЬз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр
165 170 175
С1у Уа1 61и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг
180 185 190
Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи НЬз С1п Азр
195 200 205
Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи
210 215 220
Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд
225 230 235 240
С1и Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТНг Ьуз
245 250 255
Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр
260 265 270
11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз
275 280 285
ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег
290 295 300
Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп νβΐ РНе Зег
305 310 315 320
Суз Зег Уа1 МеЬ НЬз С1и А1а Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТНг С1п Ьуз Зег
325 330 335
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз ТНг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТНг С1у Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТНг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТНг С1у Ьеи Азр Зег Рго Азр
355 360 365
11е С1п МеЬ ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 61у Азр
370 375 380
Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Не С1у Рго С1и Ьеи
385 390 395 400
Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг
405 410 415
НЬз С1у Зег Не Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег
420 425 430
С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и
435 440 445
Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Туг МеЬ Туг Туг Рго НЬз ТНг
450 455 460
РНе 61у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд А1а
465 470 475
<210> 48 <211> 478 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ϋΜ530053 (содержит модифицированный С-конец): ΩΜ31576 с С-концевым К-044-085 <ЬАЬ +ААА ((ТСЬОЗР)х4)
<400> 48
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Ьуз А1а Туг
20 25 30
Рго МеЬ МеЬ Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег СЬи 11е Зег Рго Зег СЬу Зег Азп ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп МеЬ Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ
100 105 110
ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго
115 120 125
С1и Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз
130 135 140
Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ
145 150 155 160
Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго С1и УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр
165 170 175
СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг
180 185 190
Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр
195 200 205
Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи
210 215 220
Рго АЬа Рго 11е СЬи Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд
225 230 235 240
С1и Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр СЬи Ьеи ТЬг Ьуз
245 250 255
Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр
260 265 270
11е АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз
275 280 285
ТЬг ТЬг Рго Рго ЧаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег
290 295 300
Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп ЧаЬ РЬе Зег
305 310 315 320
Суз Зег УаЬ МеЬ НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег
325 330 335
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз ТЬг СЬу Ьеи Азр Зег Рго ТЬг СЬу Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТЬг СЬу Ьеи Азр Зег Рго ТЬг СЬу Ьеи Азр Зег Рго Азр
355 360 365
11е СЬп МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу Азр
370 375 380
Агд УаЬ ТЬг 11е ТЬг Суз Агд АЬа Зег СЬп Тгр 11е СЬу Рго СЬи Ьеи
385 390 395 400
Ьуз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг
405 410 415
НЬз СЬу Зег 11е Ьеи СЬп Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
420 425 430
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
435 440 445
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Туг МеЬ Туг Туг Рго НЬз ТЬг
450 455 460
РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи ТЬе Ьуз Агд АЬа АЬа АЬа
465 470 475
<210> 49
<211> 476 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΏΜ330054 (содержит модифицированный С-конец): ЭМ51576 с С-концевым К-044-085 ЙАЬ +Т ((ТСЬЭЗР)х4) <400> 49
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи Уа1 Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Ьуз АЬа Туг
20 25 30
Рго МеЬ МеЬ Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1и Не Зег Рго Зег С1у Зег Азп ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг АЬа Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Ьуз Азр Рго Агд Ьуз Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго
115 120 125
61и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз
130 135 140
Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 νβΐ Уа1
145 150 155 160
Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр
165 170 175
С1у Уа1 С1и Уа1 НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг
180 185 190
Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи НЬз С1п Азр
195 200 205
Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи
210 215 220
Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд
225 230 235 240
С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз
245 250 255
Азп 61п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр
260 265 270
Не АЬа Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз
275 280 285
ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег
290 295 300
Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег
305 310 315 320
Суз Зег Уа1 МеЬ Низ С1и А1а Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег
325 330 335
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи
340 345 350
Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго ТЬг С1у Ьеи Азр Зег Рго Азр
355 360 365
Не С1п МеЬ ТЬг 61п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр
370 375 380
Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Не С1у Рго С1и Ьеи
385 390 395 400
Ьуз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Ь1е Туг
405 410 415
НЬз СЬу Зег Пе Ьеи СЬп Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
420 425 430
С1у Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
435 440 445
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Туг МеЬ Туг Туг Рго НЬз ТЬг
450 455 460
РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз Агд ТЬг
465 470 475
- 91 027160

Claims (2)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (РАЬ), который выбран из группы, состоящей из человеческого Ун РАЬ, человеческого Уь РАЬ (например, У каппа) и Унн камелида, и который моновалентно связывается с антигеном-мишенью, содержащий:
    а) три определяющие комплементарность области (СОК), специфичные в отношении указанного антигена-мишени, так что указанный РАЬ связывается с указанным антигеном с Кс (равновесная константа диссоциации) в пределах от 5 мкМ до 1 пМ;
    б) четыре каркасные (Р^) области;
    в) С-концевую последовательность, состоящую из последовательности VРУЗ(З)ηX или УЕ1Кр1К1:|Х; и возможно
    г) одну или более чем одну аминокислотную замену в положениях 14, 41, 108, 110 или 112 по сравнению с человеческой каркасной последовательностью эмбрионального типа, где п представляет собой целое число, независимо выбранное из 0 или 1;
    каждое из р и ц представляет собой 0 или 1, таким образом, что, когда р представляет собой 1, ц может представлять собой 0 или 1, и, таким образом, что, когда р представляет собой 0, ц также представляет собой 0;
    Х может присутствовать или отсутствовать, и, если присутствует, представляет собой аминокислотное удлинение на 1-5 аминокислотных остатков;
    при дополнительном условии, что, если X отсутствует:
    (1) п представляет собой 0, и/или РАЬ, оканчивающийся УУЗ(З)п, содержит одну или более чем одну из указанных аминокислотных замен;
  2. (2) р и/или с| представляют собой 0, и/или РАЬ, оканчивающийся УЕ1КрКч, содержит одну или более чем одну из указанных аминокислотных замен.
    2. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (РАЬ) который выбран из группы, состоящей из человеческого Ун РАЬ, человеческого Уъ РАЬ (например, У каппа) и Унн камелида;
    который содержит одну или более чем одну модификацию, выбранную из:
    (а) С-концевого удлинения, которое содержит аминокислотное удлинение размером от 1 аминокислоты до 5 аминокислот; или (б) одной или более чем одной замены аминокислот каркасной области, где по меньшей мере одна замена представляет собой замену, выбранную из замены Р14А, замены Р41А и замены Ь108А;
    (в) С-концевой делеции; и который обладает уменьшенным связыванием с предсуществующими АЭА (антитела против лекарственного средства) по сравнению с немодифицированным единичным вариабельным доменом иммуноглобулина (РАЬ).
    3. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п. 1 или 2, где:
    (1) когда указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой человеческий Ун или Унн камелид, тогда указанное С-концевое удлинение содержит или состоит из аминокислотного удлинения, выбранного из (а) А, (б) АЗ, (в) АЗ, (г) АЗК, (д) АЗКО, (е) ААА или (ж) Т, или содержит С-концевую делецию, которая представляет собой -З делецию; и (2) когда указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой человеческий Уъ, такой как У каппа, тогда указанное С-концевое удлинение содержит или состоит из аминокислотного удлинения, выбранного из (а) ААА, (б) А, (в) У и (г) Т, или содержит С-концевую делецию, которая представляет собой -К делецию; или единичный вариабельный домен иммуноглобулина, где указанная одна или более чем одна аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из замены Р14А, замены Р41А, замены Ь108А, замены Т110А и замены З112А.
    4. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (РАЬ) по любому из пп.1-3, который связывается с мишенью, выбранной из рецептора, полимерной мишени, ΤΝΡα (фактор некроза опухоли альфа), рецептора ΤΝΡ, ΤΝΡ рецептора 1 (ΤΝΡΚ1), УЕОР (фактор роста эндотелия сосудов), 1Ь-1К (интерлейкин 1К), 1Ь-6К, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-13, ПС-ЗЮЫ (специфический для дендритных клеток 1САМ-3 (молекула межклеточной адгезии-3)-захватывающий неинтегрин), АЗОРК (асиалогликопротеиновый рецептор), альбумина, фактора фон Виллебранда, домена А1 фактора фон Виллебранда и ΤΟΡβΚ2 (рецептор К2 трансформирующего фактора роста бета).
    5. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (РАЬ) по п.4, где мишень представляет собой ΤΝΡΚ1, и РАЬ выбран из любой из следующих аминокислотных последовательностей, идентифицированных как (а) ЭОМ 1И-131-206 РАЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (представленной на фиг. 8а: ЗЕЦ ГО NО: 16); (б) ЭОМ Ш-131-206 РАЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце и мутацией Р14А в каркасной области (представленной на фиг. 8Ь: ЗЕЦ ГО NО: 17); (в) ЭОМ Ш-131-206 РАЬ с мутацией Р14А в каркасной области (представленной на фиг. 8с: ЗЕЦ ГО NО: 18); (г) ЭОМ Ш-131-206
    - 92 027160
    САЬ с удлинением А8ТКО на С-конце (представленной на фиг. 8С: 8Еф ГО NΟ: 19) и (д) ЭОМ 1Η-131206 САЬ с удлинением А8ТКО на С-конце и мутацией Р14А в каркасной области (представленной на фиг. 8е: 8ЕО ГО 20).
    6. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (САЬ) по любому из пп.4, 5, где мишень представляет собой ΊΝΡΚ.1, и немодифицированный САЬ выбран из аминокислотной последовательности, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична любой из аминокислотных последовательностей, идентифицированных как ЭОМ 1Η-131-206 (представленная на фиг. 2а: 8Еф ГО NΟ: 1), ЭОМ 1Η-131-511 (представленная на фиг. 2Ь: 8Еф ГО NΟ: 2), ЭОМ 1Η-131-202 (представленная на фиг. 2с: 8ЕО ГО 3).
    7. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (САЬ) по любому из пп.1-6, где САЬ представлен в виде слияния или конъюгата с дополнительными молекулами, выбранными из дополнительного САЬ или белка, или полипептида или его фрагмента, белка или полипептида, или его фрагмента, который может увеличивать период полувыведения или представляет собой дополнительную терапевтическую или активную молекулу, молекулы РЕО (полиэтиленгликоль), антитела или его фрагмента или области Рс.
    8. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (САЬ) по любому из пп.1-7, где САЬ представлен в виде молекулы тАЬСАЬ, в виде линейного слияния или в форме гантели.
    9. Фармацевтическая композиция, содержащая единичный вариабельный домен иммуноглобулина (САЬ) по любому из пп.1-8 в комбинации с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем.
    10. Применение единичного вариабельного домена иммуноглобулина по любому из пп.1-8 в способе предупреждения побочных эффектов.
    11. Применение единичного вариабельного домена иммуноглобулина по любому из пп.1-8 в медицине.
    12. Применение фармацевтической композиции, содержащей (САЬ) по п.5 или 6, в лечении или предупреждении по меньшей мере одного заболевания или расстройства либо состояния, выбранного из воспалительного заболевания или расстройства, или респираторного заболевания или расстройства, или легочного заболевания или расстройства.
    13. Применение единичного вариабельного домена иммуноглобулина (САЬ) по п.5, который представляет собой ЭОМ 1Η-131-206 САЬ с удлинением на единичный аланин на С-конце (с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 8а: 8Еф ГО NΟ: 16), в лечении или предупреждении по меньшей мере одного заболевания или расстройства либо состояния, которое выбрано из артрита, псориаза, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, например болезни Крона и неспецифического язвенного колита или, например, респираторных или легочных заболеваний или расстройств, например, выбранных из астмы, хронического обструктивного заболевания легких, хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы, воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительного пневмонита, легочного инфильтрата с эозинофилией, заболевания легких, связанного с влиянием окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального заболевания легких, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, апноэ во время сна, острого респираторного дистресс-синдрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, заболевания трансплантат против хозяина, рака легких, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергилломы, аспергиллоза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического легочного фиброза, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий, плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцитоза, пневмонии, легочного актиномикоза, легочного альвеолярного протеиноза, легочной сибирской язвы, отека легких, легочной эмболы, воспаления легких, легочного гистиоцитоза X, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, туберкулеза легких, веноокклюзионной болезни легких, ревматоидной болезни легких, саркоидоза и гранулематоза Вегенера и острого повреждения легких (АЫ) и острого респираторного дистресс-синдрома (АКО8) и их осложнений.
    14. Инъецируемый, пероральный, ингалируемый или распыляемый препарат, или препарат с длительным высвобождением, или лиофилизированный препарат, который содержит композицию или САЬ по любому из пп.1-9.
    15. Устройство для доставки, содержащее САЬ по любому из пп.1-8.
    16. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая САЬ по любому из пп.1-8.
    17. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота, имеющая нуклеиново-кислотную последовательность, представленную на фиг. 9Ь (8Еф ГО NΟ: 22) и кодирующую ИОМ 1Η-131-206 САЬ с удлинением на единичный аланин.
    Частота предсуществующих антител против лекарственного средства в сыворотке крови здоровых субъектов
    - 93 027160
EA201490262A 2011-08-17 2012-08-13 Модифицированные белки и пептиды EA027160B1 (ru)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161524488P 2011-08-17 2011-08-17
GBGB1121236.2A GB201121236D0 (en) 2011-12-12 2011-12-12 Proteins and peptides
GBGB1121233.9A GB201121233D0 (en) 2011-12-12 2011-12-12 Modified proteins and peptides
GBGB1121226.3A GB201121226D0 (en) 2011-12-12 2011-12-12 Modified proteins and peptides
PCT/EP2012/064632 WO2013014208A2 (en) 2011-07-27 2012-07-25 Antigen binding constructs
PCT/EP2012/065782 WO2013024059A2 (en) 2011-08-17 2012-08-13 Modified proteins and peptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201490262A1 EA201490262A1 (ru) 2014-09-30
EA027160B1 true EA027160B1 (ru) 2017-06-30

Family

ID=47715521

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490262A EA027160B1 (ru) 2011-08-17 2012-08-13 Модифицированные белки и пептиды

Country Status (24)

Country Link
US (2) US10808040B2 (ru)
EP (3) EP2744822B1 (ru)
JP (3) JP6297976B2 (ru)
KR (2) KR102143506B1 (ru)
CN (2) CN103917557B (ru)
AR (1) AR087521A1 (ru)
AU (3) AU2012296961B2 (ru)
BR (1) BR112014003679B1 (ru)
CA (1) CA2845029A1 (ru)
CO (1) CO7020851A2 (ru)
DO (1) DOP2014000029A (ru)
EA (1) EA027160B1 (ru)
ES (1) ES2813432T3 (ru)
HK (1) HK1214281A1 (ru)
IL (1) IL230918A0 (ru)
MA (1) MA35428B1 (ru)
MX (1) MX2014001883A (ru)
MY (1) MY167125A (ru)
PE (1) PE20141522A1 (ru)
SG (2) SG10201605891TA (ru)
TW (1) TW201321405A (ru)
UA (1) UA118833C2 (ru)
UY (1) UY34254A (ru)
WO (1) WO2013024059A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10843420B2 (en) 2015-12-21 2020-11-24 Hexcel Composites Limited Relating to electrically conducting materials

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2860453T3 (es) 2009-10-30 2021-10-05 Novartis Ag Bibliotecas universales del dominio de unión del lado inferior de la fibronectina de tipo III
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
CN108659121A (zh) 2011-06-23 2018-10-16 埃博灵克斯股份有限公司 用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术
AU2012271974B2 (en) 2011-06-23 2017-01-12 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
EP3363812A1 (en) * 2011-06-23 2018-08-22 Ablynx NV Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
EA027160B1 (ru) 2011-08-17 2017-06-30 Глаксо Груп Лимитед Модифицированные белки и пептиды
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
WO2014043509A2 (en) * 2012-09-13 2014-03-20 Novartis Ag Antigen binding molecule with terminal modifications
WO2014111550A1 (en) * 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
WO2015104322A1 (en) * 2014-01-09 2015-07-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Treatment of inflammatory diseases with non-competitive tnfr1 antagonists
WO2015173342A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Ablynx Nv Methods for detecting and/or measuring anti-drug antibodies, in particular treatment-emergent anti-drug antibodies
HUE050007T2 (hu) * 2014-05-16 2020-11-30 Ablynx Nv Immunglobulin variábilis domének
CA2974192C (en) 2015-01-21 2024-02-20 Inhibrx Biopharma LLC Non-immunogenic single domain antibodies
US11306139B2 (en) * 2015-03-20 2022-04-19 Ablynx N.V. Glycosylated immunoglobulin single variable domains
EA035638B1 (ru) 2015-03-31 2020-07-20 ВиЭйчСКВЕАРД ЛИМИТЕД Полипептиды
RU2021111382A (ru) * 2015-07-16 2021-05-21 Инхибркс, Инк. Мультивалентные и мультиспецифические гибридные белки, связывающиеся с dr5
WO2017059397A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Labeling of antibodies
CN115925962A (zh) * 2015-10-30 2023-04-07 豪夫迈·罗氏有限公司 铰链修饰的抗体片段和其制备方法
RU2018119732A (ru) 2015-10-30 2019-12-03 Аблинкс Нв Полипептиды против il-23
WO2017081265A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-18 Ablynx Nv Improved p2x7 receptor binders and polypeptides comprising the same
NO2768984T3 (ru) 2015-11-12 2018-06-09
CA3005061A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Ablynx Nv Improved serum albumin-binding immunoglobulin variable domains
EP3377526A1 (en) 2015-11-18 2018-09-26 Merck Sharp & Dohme Corp. PD1/CTLA4 Binders
CN108473564B (zh) * 2015-11-18 2022-04-08 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂
MX2018006246A (es) 2015-11-18 2018-08-01 Merck Sharp & Dohme Aglutinantes ctla4p.
MY189018A (en) 2015-11-18 2022-01-19 Merck Sharp & Dohme Pd1 and/or lag3 binders
CN108473561B (zh) 2015-11-27 2022-12-16 埃博灵克斯股份有限公司 抑制cd40l的多肽
WO2017093478A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopic polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
BR112018076569A2 (pt) * 2016-06-23 2019-04-02 Ablynx Nv ensaios farmacocinéticos melhorados para domínios variáveis simples de imunoglobulina
EP3519438A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 VHsquared Limited Compositions
AU2017373746A1 (en) 2016-12-07 2019-05-30 Ablynx Nv Improved serum albumin binding immunoglobulin single variable domains
SG11201906341XA (en) 2017-01-17 2019-08-27 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
MX2019008496A (es) 2017-01-17 2019-09-18 Ablynx Nv Aglutinantes de albumina serica mejorados.
CA3056727A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Ablynx N.V. Improved immunogenicity assays
MX2019014331A (es) 2017-05-31 2020-01-27 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos que antagonizan la se?alizacion wnt en celulas tumorales.
JP7268005B2 (ja) 2017-09-08 2023-05-02 武田薬品工業株式会社 拘束され、条件的に活性化された結合タンパク質
EP3688030A1 (en) 2017-09-27 2020-08-05 Elasmogen Ltd Specific binding molecules
EP3749696A1 (en) * 2018-02-06 2020-12-16 Ablynx N.V. Methods of treating initial episode of ttp with immunoglobulin single variable domains
EP3569618A1 (en) 2018-05-19 2019-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Antagonizing cd73 antibody
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
SG11202012835RA (en) * 2018-07-10 2021-01-28 Regeneron Pharma Modifying binding molecules to minimize pre-existing interactions
CN109096394B (zh) * 2018-09-21 2021-11-05 成都阿帕克生物科技有限公司 一种抗葡萄球菌蛋白a的b亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用
FR3088640A1 (fr) 2018-10-14 2020-05-22 Smart Diagnostix Pharma Nouveau polypeptide se liant specifiquement a la proteine p16
WO2020089811A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Novartis Ag Dc-sign antibody drug conjugates
GB201818460D0 (en) * 2018-11-13 2018-12-26 Crescendo Biologics Ltd Single domain antibodies that bind human serum albumin
JP2022524338A (ja) 2019-03-05 2022-05-02 武田薬品工業株式会社 拘束され、条件的に活性化された結合タンパク質
CN114466864A (zh) 2019-06-21 2022-05-10 索瑞索制药公司 多肽
CN114514243A (zh) 2019-06-21 2022-05-17 索瑞索制药公司 多肽
TW202128756A (zh) 2019-10-02 2021-08-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於癌症治療之多重專一性結合蛋白
GB201914468D0 (en) 2019-10-07 2019-11-20 Crescendo Biologics Ltd Binding Molecules
WO2021119531A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 Cullinan Management, Inc. Anti-serum albumin antibodies
CA3161283A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 Cullinan Oncology, Inc. Anti-cd19 antibodies and multi-specific binding proteins
AR121706A1 (es) * 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
KR20230048146A (ko) 2020-08-17 2023-04-10 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 제약된, 조건부 활성화 결합 단백질들
CN114075282B (zh) * 2020-08-20 2024-01-02 南京融捷康生物科技有限公司 Il-5的结合分子及其制备方法和应用
EP4208480A2 (en) 2020-09-04 2023-07-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding protein constructs with human serum albumin domains
CN112225807B (zh) * 2020-10-30 2021-09-07 上海洛启生物医药技术有限公司 抗il5纳米抗体及其应用
MX2023006869A (es) 2020-12-14 2023-08-14 Takeda Pharmaceuticals Co Proteinas de union condicionalmente biespecificas.
CN112341543B (zh) * 2021-01-11 2021-04-23 广东赛尔生物科技有限公司 包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用
MX2023011777A (es) 2021-04-06 2023-11-14 Takeda Pharmaceuticals Co Métodos terapéuticos que usan proteínas de unión activadas condicionalmente restringidas.
WO2023093899A1 (zh) * 2021-11-29 2023-06-01 江苏恒瑞医药股份有限公司 经修饰的蛋白或多肽
WO2023110190A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Heraeus Medical Gmbh Tests and methods for detecting bacterial infection
WO2023147426A2 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 Janssen Biotech, Inc. Enhanced protein compositions
TW202342521A (zh) 2022-02-23 2023-11-01 日商武田藥品工業股份有限公司 條件性雙特異性結合蛋白
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
EP4357778A1 (en) 2022-10-20 2024-04-24 Heraeus Medical GmbH Treatment of microbial infections diagnosed using the biomarker d-lactate
CN115819599B (zh) * 2022-11-29 2024-01-16 江苏耀海生物制药有限公司 一种利用重组大肠杆菌分泌表达纳米抗体Cablivi的方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000029004A1 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Peptor Ltd. Small functional units of antibody heavy chain variable regions
WO2006003388A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2006030220A1 (en) * 2004-09-17 2006-03-23 Domantis Limited Compositions monovalent for cd40l binding and methods of use
WO2006129843A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Canon Kabushiki Kaisha Bispecific capturing molecule
WO2007063311A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
WO2007063308A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
WO2007085814A1 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Domantis Limited Fusion proteins that contain natural junctions
WO2008076257A2 (en) * 2006-12-13 2008-06-26 Schering Corporation Treating cancer with anti-igflr antibody 19d12 = sch 717454
WO2008149143A2 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
WO2009068627A2 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
WO2012042026A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
WO2013024059A2 (en) * 2011-08-17 2013-02-21 Glaxo Group Limited Modified proteins and peptides

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0656946T4 (da) 1992-08-21 2010-07-26 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2003080672A1 (en) 2002-03-22 2003-10-02 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
ATE328906T1 (de) 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
GB0521621D0 (en) 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
CA2960105A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-23 Ablynx Nv Single domain vhh antibodies against von willebrand factor
DE102005023617A1 (de) * 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
JP2007008925A (ja) * 2005-05-31 2007-01-18 Canon Inc 標的物質捕捉分子
AU2006292871A1 (en) * 2005-09-23 2007-03-29 Academisch Ziekenhuis Leiden VHH for the diagnosis, prevention and treatment of diseases associated with protein aggregates
US8629244B2 (en) 2006-08-18 2014-01-14 Ablynx N.V. Interleukin-6 receptor binding polypeptides
BRPI0811857A2 (pt) 2007-05-14 2014-10-21 Biogen Idec Inc Regiões fc (scfc) de cadeia simples, polipeptídeos de aglutinação que as compreendem e métodos relacionados.
JP2010528647A (ja) 2007-06-06 2010-08-26 ドマンティス リミテッド ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
KR20100018040A (ko) * 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법
CL2008003561A1 (es) 2007-11-30 2010-02-05 Glaxo Group Ltd Construccion de union a il - 13 que comprende a lo menos un dominio simple (dab) de anticuerpo injertado en un anticuerpo monoclonal ( mabdab); polinucleotido y celula huesped; procedimiento para preparar la construccion; composicion farmaceutica que la comprende y uso para tratar cancer o enfermedades inflamatorias.
EP2220115A2 (en) 2007-12-13 2010-08-25 Glaxo Group Limited Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
CA2718081A1 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Ablynx Nv Von willebrand factor specific binders and methods of use therefor
US8020937B2 (en) * 2008-07-31 2011-09-20 Lear Corporation Layered technology for energy management of vehicle seating
US20110319597A1 (en) * 2008-08-14 2011-12-29 Caphalon Australia Pty. Ltd. Variant domain antibodies
US9393304B2 (en) 2008-10-29 2016-07-19 Ablynx N.V. Formulations of single domain antigen binding molecules
WO2010100135A1 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
JP5647222B2 (ja) * 2009-04-10 2014-12-24 アブリンクス エン．ヴェー． Ｉｌ−６ｒ関連疾患及び障害の治療のためのｉｌ−６ｒに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
HUE051430T2 (hu) * 2009-07-10 2021-03-01 Ablynx Nv Eljárás variábilis domének elõállítására
GB201005063D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
DK2513147T3 (en) * 2009-12-18 2016-10-24 Sanofi Sa Hitherto UNKNOWN ANTAGONIST ANTIBODIES AND THEIR FAB FRAGMENTS AGAINST GPVI AND USES THEREOF
EP3363812A1 (en) * 2011-06-23 2018-08-22 Ablynx NV Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
CN108659121A (zh) * 2011-06-23 2018-10-16 埃博灵克斯股份有限公司 用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000029004A1 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Peptor Ltd. Small functional units of antibody heavy chain variable regions
WO2006003388A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2006030220A1 (en) * 2004-09-17 2006-03-23 Domantis Limited Compositions monovalent for cd40l binding and methods of use
WO2006129843A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Canon Kabushiki Kaisha Bispecific capturing molecule
WO2007063311A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
WO2007063308A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
WO2007085814A1 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Domantis Limited Fusion proteins that contain natural junctions
WO2008076257A2 (en) * 2006-12-13 2008-06-26 Schering Corporation Treating cancer with anti-igflr antibody 19d12 = sch 717454
WO2008149143A2 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
WO2009068627A2 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
WO2012042026A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
WO2013024059A2 (en) * 2011-08-17 2013-02-21 Glaxo Group Limited Modified proteins and peptides

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDWARD G ROUTLEDGE: "Reshaping antibodies for therapy - 5. Prospects for producing non-immunogenic monoclonal antibodies", 1 January 1996 (1996-01-01), XP055040855, [retrieved on 20121012] *
FIONA A HARDING: "Eur J Immunol. 1983 Jul;13(7):533-40.", MABS, vol. 2, no. 3, 1 June 2010 (2010-06-01), pages 256 - 265, XP055040346 *
HOLT, L.J. HERRING, C. JESPERS, L.S. WOOLVEN, B.P. TOMLINSON, I.M.: "Domain antibodies: proteins for therapy", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY., ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE., GB, vol. 21, no. 11, 1 November 2003 (2003-11-01), GB, pages 484 - 490, XP004467495, ISSN: 0167-7799, DOI: 10.1016/j.tibtech.2003.08.007 *
KUEPPER MICHAEL B; HUHN MICHAEL; SPIEGEL HOLGER; MA JULIAN KC; BARTH STEFAN; FISCHER RAINER; FINNERN RICARDA: "Generation of human antibody fragments against Streptococcus mutans using a phage display chain shuffling approach", BMC BIOTECHNOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD. LONDON, GB, vol. 5, no. 1, 25 January 2005 (2005-01-25), GB, pages 4, XP021005985, ISSN: 1472-6750, DOI: 10.1186/1472-6750-5-4 *
PETER DURAND SKOTTRUP; PAUL LEONARD; JAKUB ZBIGNIEW KACZMAREK; FLORIAN VEILLARD; JAN JOHANNES ENGHILD; RICHARD OKENNEDY; ANETA SRO: "Diagnostic evaluation of a nanobody with picomolar affinity toward the protease RgpB from", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 415, no. 2, 11 April 2011 (2011-04-11), AMSTERDAM, NL, pages 158 - 167, XP028378085, ISSN: 0003-2697, DOI: 10.1016/j.ab.2011.04.015 *
WARD E. S., ET AL.: "BINDING ACTIVITIES OF A REOPERTOIRE OF SINGLE IMMUNOGLOBULIN VARIABLE DOMAINS SECRETED FROM ESCHERICHIA COLI.", NATURE, MACMILLAN JOURNALS LTD., ETC, vol. 341., no. 6242., 12 October 1989 (1989-10-12), pages 544 - 546., XP000086104, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/341544a0 *
WO 2007/063308 A2 *
Z ESHHAR: "Monoclonal anti-VH antibodies recognize a common VH determinant expressed on immunoglobulin heavy chains from various species.", EUR J IMMUNOL., vol. 13, no. 7, 1 July 1983 (1983-07-01), pages 533 - 540, XP055040345, DOI: 10.1002/eji.1830130704 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10843420B2 (en) 2015-12-21 2020-11-24 Hexcel Composites Limited Relating to electrically conducting materials

Also Published As

Publication number Publication date
EP2744822A2 (en) 2014-06-25
DOP2014000029A (es) 2014-10-31
KR102162413B1 (ko) 2020-10-07
KR102143506B1 (ko) 2020-08-12
JP2018117623A (ja) 2018-08-02
KR20190113996A (ko) 2019-10-08
TW201321405A (zh) 2013-06-01
AU2012296961A1 (en) 2014-03-13
IL230918A0 (en) 2014-03-31
CO7020851A2 (es) 2014-08-11
JP2020054374A (ja) 2020-04-09
KR20140054262A (ko) 2014-05-08
EP2744822B1 (en) 2020-06-24
AR087521A1 (es) 2014-03-26
SG2014010482A (en) 2014-04-28
MY167125A (en) 2018-08-13
EP3339322A2 (en) 2018-06-27
EP2987806A3 (en) 2016-07-13
WO2013024059A9 (en) 2014-04-03
CN108178800B (zh) 2022-06-17
CN108178800A (zh) 2018-06-19
EP3339322A3 (en) 2018-10-31
BR112014003679A2 (pt) 2017-03-07
HK1214281A1 (zh) 2016-07-22
MA35428B1 (fr) 2014-09-01
UY34254A (es) 2013-04-05
UA118833C2 (uk) 2019-03-25
CN103917557B (zh) 2018-03-20
WO2013024059A3 (en) 2014-05-30
CA2845029A1 (en) 2013-02-21
WO2013024059A2 (en) 2013-02-21
NZ621203A (en) 2016-03-31
BR112014003679B1 (pt) 2022-08-30
US20140227259A1 (en) 2014-08-14
AU2019201505A1 (en) 2019-03-28
US10808040B2 (en) 2020-10-20
AU2012296961B2 (en) 2017-02-16
CN103917557A (zh) 2014-07-09
JP6979446B2 (ja) 2021-12-15
AU2016277685A1 (en) 2017-01-19
JP2014525752A (ja) 2014-10-02
EP2987806A2 (en) 2016-02-24
ES2813432T3 (es) 2021-03-23
AU2016277685B2 (en) 2019-03-28
PE20141522A1 (es) 2014-11-17
MX2014001883A (es) 2014-05-27
JP6297976B2 (ja) 2018-03-20
EA201490262A1 (ru) 2014-09-30
SG10201605891TA (en) 2016-09-29
US20210017293A1 (en) 2021-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA027160B1 (ru) Модифицированные белки и пептиды
JP7142618B2 (ja) イヌ化抗体
US20210040223A1 (en) Antibodies to Canine Interleukin-4 Receptor Alpha
JP2021513323A (ja) Ｃ−ｋｉｔ抗体
JP2022526595A (ja) Ｐｓｍａに結合する重鎖抗体
EA022796B1 (ru) Антитело, способное связывать тимусный стромальный лимфопоэтин, нуклеиновая кислота, его кодирующая, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин, гибридома, способ получения антитела и его применение
EP2069402A2 (en) Serum albumin binding proteins with long half-lives
US9926375B2 (en) Anti-endoglin antibodies and uses thereof
EP3922647A1 (en) Anti-pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
US11981725B2 (en) Antigen binding molecules targeting SARS-CoV-2
JP2023506922A (ja) アトピー性皮膚炎を処置するための二重特異性イヌ化抗体
CN116406293A (zh) 用于治疗滤泡性淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
US20230138315A1 (en) Anti-angptl3 antibody and use thereof
WO2013103783A1 (en) Murine il-13 antibodies
JP2023076596A (ja) ＴＧＦ－βＲＩＩ結合タンパク質
US20220251193A1 (en) Semaphorin 3a antibodies and uses thereof
JP2023538098A (ja) Ｆｇｆｒ３抗体および使用の方法
RU2807484C2 (ru) Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и его фармацевтическое применение
US20240132603A1 (en) Ccr8 antibody and application thereof
US20240228635A9 (en) Ccr8 antibody and application thereof
TW202417513A (zh) TGF-β-RII結合蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM KG TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AZ BY KZ TJ RU