TW201321405A - 經修飾之蛋白質及肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於經修飾之蛋白質及肽，其結合預先存在之抗體之能力有所降低。此等經修飾之蛋白質/肽分子可包含C末端添加、延伸或標籤及/或某些胺基酸取代。此等經修飾之分子(例如融合物及偶聯物)包含蛋白質、肽、抗原結合分子、抗體或抗體片段，例如單一可變結構域，例如人類免疫球蛋白(抗體)單一可變結構域亦及源自非人類來源(例如駱馬或駱駝)之單一可變結構域，例如VHH，包括nanobodyTM(尤其闡述於例如WO 94/04678及WO 95/04079中)。本發明進一步係關於此等經修飾之C末端延伸及/或胺基酸取代分子之用途、包含該等分子之調配物、組合物，且亦係關於產生及表現該等分子之方法。

Description

經修飾之蛋白質及肽
本發明係關於經修飾之蛋白質及肽，其結合預先存在之抗體之能力有所降低。此等經修飾之蛋白質/肽分子可包含C末端添加、延伸或標籤及/或某些胺基酸取代。此等經修飾之蛋白質/肽分子(包括其融合物及偶聯物)可包含抗原結合分子，例如抗體、抗體片段及單一可變結構域，例如人類免疫球蛋白(抗體)單一可變結構域亦及源自非人類來源(例如駱馬或駱駝)之單一可變結構域，例如VHH，包括NanobodyTM(例如尤其如WO 94/04678及WO 95/04079中所述)。本發明進一步係關於此等經修飾之C末端延伸及/或胺基酸取代分子之用途、包含該等分子之調配物、組合物且亦係關於產生及表現該等分子之方法。
人類中存在可結合蛋白質(例如結合宿主免疫球蛋白或免疫球蛋白片段)之天然自體抗體，例如類風濕因子(其結合抗體之Fc區中之表位)、抗個體基因型自體抗體(其結合抗體可變區/CDR區)及抗鉸鏈自體抗體(其結合Fab片段中之Ig恆定結構域之鉸鏈區)。
該等自體抗體可係對存在於人類與非人類靈長類動物二者中之Ig分子內之表位具有特異性之抗免疫球蛋白(Ig)自體抗體多株譜的一部分。除結合完整Fc結構域內之表位之抗IgG自體抗體(即類風濕因子(RF))外，亦已觀察到存在結合IgG之可變CDR區之抗個體基因型自體抗體及與Fab或 F('Ab')2片段之C末端鉸鏈區中之隱性表位反應之抗鉸鏈抗體。該等不同抗IgG自體抗體之功能作用仍不確定。人們已將類風濕因子及抗鉸鏈自體抗體與某些病理學病況關聯，例如自體免疫及某些感染，而在某些自體免疫疾病中，抗個體基因型抗體可賦予針對自體抗體之保護。此外，人們已提出抗IgG自體抗體之調節作用，其中該等自體抗體控制自體反應性B細胞之刺激並調節對外來抗原之免疫反應。抗鉸鏈抗體係與裂解但非完整之IgG反應之抗IgG自體抗體。其在正常人類種群中之高普遍性暗示對IgG片段之預先暴露，此可能係因細菌或內源蛋白酶對IgG之裂解所致。
除結合內源蛋白質(存在於未接受藥物(naïve)之個體中)外，自體抗體亦可結合投與用於治療之個體之蛋白質或肽。結合投與個體之諸如治療性蛋白質及肽等分子的預先存在之抗體可因維持、消除或中和該分子而影響其效能且可導致經治療患者之投與反應、過敏性、臨床反應改變以及生物利用度改變。然而，在一些情形下，該等抗體在藥物治療期間之存在重要性可低於其他情形。
結合治療性蛋白質之自體抗體及因應藥物治療(例如投與治療性蛋白質或肽)而新形成之抗體統稱為抗藥物抗體(ADA)。除非另有明確說明，否則當在此文件中闡述ADA時，其係指預先存在之ADA。
VH及VL結構域抗體係源自完全人類框架序列，且儘管電腦上之預測闡述潛在免疫原性肽顯著較低之發生率，但 可能該等結構域抗體可在人類中具有免疫原性，即其可誘發ADA，且其可結合預先存在之ADA，此端視序列依賴因子及序列獨立因子二者而定。
類似地，多個源自駱駝科動物重鏈之單一dAb(VHH)正處於臨床研究中，且儘管尚未報導過敏性或其他免疫介導之不良事件，但結合預先存在之ADA仍有可能。
因此，可有利地提供治療用分子，其包含蛋白質或肽，例如抗原結合分子，其在投與個體、特定而言人類個體時，結合預先存在之ADA之能力有所降低。
如本文所述，已顯示在來自一些未接受藥物之健康人類個體之血清中，存在可結合VH結構域抗體及VHH分子二者之預先存在之抗VH自體抗體以及可結合VL分子之抗VL(例如V卡帕(kappa)(VK))自體抗體。結合VH dAb之預先存在之ADA與抗鉸鏈抗體類似，此乃因其結合並非在完整IgG上原位發現之彼等相同序列之IgG片段。
特異性免疫分析係如本文所述研發並驗證以在人類中檢測針對VH dAb DOM1H-131-206(SEQ ID NO 1中所示之胺基酸序列)之抗藥物抗體。在分析中篩選一組60名健康人類供體血清試樣之背景反應性。已測定，來自該等個體之約45%血清試樣具有能夠結合DOM1H-131-206之可檢測抗體。此反應性似乎對VH dAb框架序列內之新表位或表位具有特異性，此乃因該反應與結合各種靶抗原之dAb之VH框架交叉反應，但不與完全人類IgG交叉反應。亦在來自 健康人類供體之血清試樣中觀察到結合至VL dAb之預先存在之ADA，但程度低於VH。
採用誘變方法測定對VH框架進行修飾是否可減少該等預先存在之ADA之結合。使用此方法對VH dAb框架之C末端之表位作圖，且例示多個可用於減少或消除預先存在之抗體與VL、VH及VHH分子之結合的方法。特定而言，已顯示，改變dAb C末端、特定而言C末端絲胺酸殘基(即於Kabat位置113處)在VH及VHH dAb中之三維構象之修飾至關重要。另外，dAb C末端之三維構象可藉由添加其他胺基酸殘基(C末端延伸)及/或藉由取代存於VH dAb中14位、41位、108位、110位及112位中一或多者處之胺基酸殘基來改變。
因此，本發明提供與未經修飾之分子相比結合(預先存在)ADA之能力有所降低且適於投與用於治療或預防之個體(例如人類個體)之經修飾的分子。結合能力有所降低意指分子以降低親和力或降低親合力結合預先存在之ADA。此等分子包含蛋白質或肽，例如抗原結合蛋白，例如抗體、抗體片段及單一可變結構域，例如人類免疫球蛋白(抗體)單一可變結構域(VH或VL)亦及源自非人類來源(例如駱馬或駱駝科動物)之單一可變結構域，例如駱駝科動物VHH，包括NanobodyTM(尤其闡述於例如WO 94/04678及WO 95/04079中)。該等分子包含一或多種選自以下之修飾：(a)C末端添加、延伸、缺失或標籤；及/或(b)一或多個胺基酸框架取代。
另外，與不包含C末端延伸、添加、缺失或標籤及/或其他框架修飾之未經修飾之分子(例如未經修飾之dAb)相比，本文所述經修飾之分子及包含該等經修飾之分子之醫藥組合物可具有增強之安全特性及更少副效應，從而減少預先存在之ADA結合。類似地，投與本文所述經修飾之分子或包含該等經修飾之分子之醫藥組合物(其結合預先存在之ADA之能力有所降低)可改進免疫原性且亦可改良效能並改良安全特性且例如可有利地用於向可針對未經修飾之分子(例如dAb)產生自體抗體之患者重複給藥。
因此，在本發明之第一態樣中提供：單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其包含一或多種選自以下之修飾：(a)C末端延伸，其包含具有1個胺基酸至5個胺基酸之胺基酸延伸；或(b)一或多個胺基酸框架取代，其中至少1個取代係選自以下之取代：P14A取代、P41A取代及L108A取代。
在一個實施例中，提供具有1至4個胺基酸之C末端延伸。在另一實施例中，該C末端延伸包含為丙胺酸之胺基酸且其與未經修飾之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)相比與預先存在之ADA之結合有所減少。
在另一態樣中，C末端延伸可係具有1-15個胺基酸(例如1至8個胺基酸或1個、1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個胺基酸)之延伸。特定而言，具有1至8個胺基酸或1個、1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個胺基酸之延伸，其包含丙胺酸殘基，例如單一丙胺酸延伸，或 AS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP延伸。特定而言，提供具有1-5個胺基酸之延伸或1-4個胺基酸之延伸。經修飾之單一免疫球蛋白可變結構域亦可包含胺基酸缺失。單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)可係選自人類VH或人類VLdAb或駱駝科動物VHH。C末端延伸可以與dAb之C末端之直接融合物或偶聯物形式存在。
在另一態樣中，本發明提供單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中(i)該dAb係人類VH或駱駝科動物VHH且該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸：(a)A、(b)AS、(c)AST、(d)ASTK、(e)ASTKG、(f)AAA或(g)T；且其中(ii)該dAb係人類VL(例如Vκ)且該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸：(a)AAA、(b)A、(c)TV、(d)T。
本發明亦提供單價結合靶抗原之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其包含：a)3個對該靶抗原具有特異性之互補決定(CDR)區；以使得該dAb以在5微莫耳至1皮莫耳範圍中之KD結合該抗原b)4個框架(FW)區；及c)由序列VTVS(S)nX或VEIKpRqX組成之C末端序列；及視情況d)與人類生殖系框架序列相比，一或多個於14位、41位、108位、110位或112位處之胺基酸取代其中：n代表獨立地選自0或1之整數； p及q各自代表0或1，以使得當p代表1時，q可係0或1，且使得當p代表0時，q亦代表0；X可存在或不存在，且若存在則代表具有1至8個胺基酸殘基之胺基酸延伸；且另一條件係，若X不存在；則i)n係0，及/或以VTVS(S)n結尾之dAb包含該等胺基酸取代中之一或多者；ii)p及/或q係0，及/或以VEIKpRqX結尾之dAb包含該等胺基酸取代中之一或多者。
KD係指平衡解離常數。熟習此項技術者應瞭解，KD數值愈小，結合愈強。
在此態樣之一個實施例中，該dAb以在約10 pM至約50 nM範圍中之KD結合該抗原。
在此態樣之一個實施例中，該單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)與抗藥物抗體(ADA)之結合親和力及/或親合力低於等效dAb，其中該等效dAb具有與該單一免疫球蛋白可變結構域相同之序列，只是不存在X，n、p及q係1且不存在胺基酸取代。
在又一實施例中，該單一免疫球蛋白可變結構域係該C末端序列係由序列VTVSSX組成者。
在另一實施例中，該單一免疫球蛋白可變結構域係該C末端序列係由序列VEIKRX組成者。
在又一實施例中，該單一免疫球蛋白可變結構域具有一或多個選自由以下組成之群之胺基酸取代：P14A取代、 P41A取代、L108A取代、T110A取代及S112A取代。
在實施例中，存在X，且其係具有1至8個胺基酸或1個、1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個胺基酸之延伸、特定而言具有1至8胺基酸或1個、1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個胺基酸之延伸，其包含丙胺酸殘基，例如單一丙胺酸延伸，或AS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP延伸。
在又一實施例中，該dAb係VH或VL dAb或駱駝科動物VHH。
在再一態樣中，本發明亦提供為本文所述未經修飾之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)序列(例如SEQ ID NO 1-6、10-13)中任一者之胺基酸序列(其隨後經修飾以減少與本文所述ADA之結合)，例如本文所述未經修飾之單一免疫球蛋白可變結構域序列，其經修飾以使得存在X，且該X係具有1至8個胺基酸之延伸、特定而言具有1至8個胺基酸之延伸，該延伸包含丙胺酸殘基，例如單一丙胺酸延伸，或AS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP延伸，及/或使得該單一免疫球蛋白可變結構域具有一或多個胺基酸取代，其中該一或多個胺基酸取代係選自由以下組成之群：P14A取代、P41A取代、L108A取代、T110A取代及S112A取代。
在一個實施例中，本發明提供為人類VH或駱駝科動物VHH之單一免疫球蛋白可變結構域，且該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸：(a)AS、(b)AST、(c)ASTK、(d) ASTKG、(e)AAA或(f)T或(g)ASTKGP，及/或其中以VTVS(S)n結尾之dAb存在胺基酸缺失且該缺失係-S缺失。
在另一實施例中，本發明提供為人類VL(例如Vκ)之單一免疫球蛋白可變結構域，且其中該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸：(a)AAA、(b)A、(c)TV及(d)T，及/或其中以VEIKR結尾之dAb存在胺基酸缺失且該缺失係-R缺失。
在本發明先前態樣之一個替代實施例中，當VL dAb之C末端序列係VEIKRAAA或VEIKRT時，不包括包含兩個藉由抗體之單鏈Fc區隔開之dAb之抗原結合構築體，其中每一dAb皆能夠結合VEGF。
在一個態樣中，本文所述經修飾以減少與ADA結合之dAb(例如VH、諸如Vκ等VL及VHH)與ADA結合之KD係等效但未經修飾之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)序列之KD的150%或更高(例如200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%或更高)。本發明亦提供本文所述經修飾以減少ADA結合之dAb，且其與ADA之結合有所減少，如使用如實例2中所述之確認分析所測定，且其中與具有約98%-100%信號抑制之對照dAb相比，該經修飾之dAb之平均信號抑制%小於90%，例如小於80%，例如小於70%，例如小於60%，例如小於50%，例如小於40%，例如小於30%，例如小於20%，例如小於10%，該對照(未經修飾)dAb具有相同或類似序列，但未經修飾而未減少ADA結合。
本發明亦提供本發明之免疫球蛋白單一可變結構域(dAb)，其用於治療方法，例如用於防止副效應之方法中。此用途可具有特定益處，其中dAb係靶標拮抗劑，該靶標係(例如)選自以下之靶標：TNFα、TNF受體、TNF受體1(TNFR1)、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、白蛋白及TGFβR2。在一個實施例中，該靶標係受體或特定而言聚合物受體或在活化後二聚化之受體，例如TNF受體。在另一實施例中，本文所述經修飾以使得與ADA之結合有所減少之dAb欲用於涉及重複給藥之治療方案。
本發明提供靶標為TNFR1之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，且其係選自鑑別為以下之以下胺基酸序列中任一者之dAb：(a)在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)；(b)在C末端處具有單一丙胺酸延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 17)；(c)具有P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 18)；(d)具有ASTKG C末端延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 19)；及(e)具有ASTKG C末端延伸及P14A胺基酸框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 20)。本發明亦提供(未經修飾之)dAb，其係選自與任何鑑別為以下之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致之序列：DOM1h-131-206(SEQ ID NO 1)、DOM 1h-131-511(SEQ ID NO 2)、DOM 1h-131-202(SEQ ID NO 3)，且其進一步包含包 括(例如)任何本文所述減少與ADA結合之修飾(例如單一丙胺酸C末端延伸)之任何序列。
本發明之dAb包括本文所述或為本文所述分子一部分之任一dAb胺基酸序列(或與此一dAb序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致之胺基酸序列)，例如任一本文實例中所述之任一dAb且其包含(例如)任何本文所述減少與ADA之結合之修飾，例如C末端丙胺酸延伸。本發明亦包含含有上文所述dAb序列之任一本文(例如實例中)所述分子，該分子包含任何本文所述減少與ADA之結合之修飾，此等分子可係(例如)實例12中之任一Vh-Vk dAb-Fc-dAb或任何本文(例如本文實例中)所述mAbdAb。
因此，本發明提供抗IL13 dAb，例如胺基酸序列與任一鑑別為以下之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致之dAb：(a)DOM10h-53-567(SEQ ID NO 13)或(b)DT04-H-033(SEQ ID NO 12)；且該胺基酸序列進一步包含任何本文所述減少與ADA結合之修飾，例如單一丙胺酸C末端延伸。
本發明亦提供抗TNFR1dAb，例如胺基酸序列與鑑別為DOM1h-574-208(SEQ ID NO 10)之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致之dAb；且該胺基酸序列進一步包含任何本文所述減少與ADA結合之修飾，例如單一丙胺酸C末端延伸。
本發明亦提供抗TNFR1dAb-VL融合物，例如胺基酸序 列與鑑別為DOM1h-574-208-VL融合物(SEQ ID NO 11)之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致之融合物；且該胺基酸序列進一步包含任何本文所述減少與ADA結合之修飾，例如存在於融合物分子C末端處之單一(或三)丙胺酸延伸。
本發明亦提供mAbdAb，其係抗IL13mAb：IL-4 Vκ dAb，其進一步包含任何本文所述減少與ADA結合之修飾；例如mAbdAb可包含胺基酸序列與鑑別為mAb-VL '735重鏈分子SEQ ID NO 30之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致之重鏈序列及鑑別為'735輕鏈序列SEQ ID NO 31之輕鏈序列；且該mAbdAb進一步包含任何本文所述減少與ADA之結合之修飾，例如單一(或三)丙胺酸延伸。
本發明亦提供經修飾以減少與本文所述ADA結合之mAbdAb，其係抗IL13mAb：IL-4 Vκ dAb，命名為mAb-VL 15014，其中mAbdAb包含(a)重鏈-連接體-Vκ序列，其胺基酸序列與鑑別為SEQ ID NO 32之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致；及(b)輕鏈序列，其胺基酸序列與鑑別為SEQ ID NO 33之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致。
本發明亦提供經修飾以減少與本文所述ADA之結合之mAbdAb，其係抗IL13mAb：IL-4 Vκ dAb，命名為mAb-VL 15019，其中mAbdAb包含(a)重鏈-連接體-Vκ序列，其胺基 酸序列與鑑別為SEQ ID NO 34之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致；及(b)輕鏈序列，其胺基酸序列與鑑別為SEQ ID NO 35之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致。
本發明亦提供經修飾以減少與本文所述ADA之結合之mAbdAb，其係抗IL13mAb：IL-4 Vκ dAb，命名為mAb-VL 15020，其中mAbdAb包含(a)重鏈-連接體-Vκ序列，其胺基酸序列與鑑別為SEQ ID NO 36之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致；及(b)輕鏈序列，其胺基酸序列與鑑別為SEQ ID NO 37之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致。
本發明亦提供經修飾以減少與本文所述ADA之結合之mAbdAb，其係抗IL13mAb：IL-4 Vκ dAb，命名為mAb-VL 15021，其中mAbdAb包含(a)重鏈-連接體-Vκ序列，其胺基酸序列與鑑別為SEQ ID NO 38之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致；及(b)輕鏈序列，其胺基酸序列與鑑別為SEQ ID NO 39之胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致。
本發明亦提供具有任一本文所述修飾以減少與ADA之結合之VHH序列，例如胺基酸序列與鑑別為SEQ ID NO 7-9之任一胺基酸序列100%、99.5%、99%、98%、97%、 96%、95%、90%、85%或80%一致之VHH。
本發明亦提供編碼本發明任一dAb之核酸，例如任一本文所述核酸，例如圖9(SEQ ID NO 21-23)或圖10(SEQ ID NO 24-29)中所示任一核酸序列。在一個實施例中，本發明提供編碼在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb之核酸(SEQ ID NO 22)、包含核酸(SEQ ID NO 22)之載體，且其亦提供表現核酸(SEQ ID NO 22)之宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)宿主細胞)或表現SEQ ID NO 22之載體(例如Pave011，來自Fujifilm Diosynth)。本發明亦提供產生在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb之方法，其包含在適於表現經延伸dAb之條件下維持包含編碼核酸(SEQ ID NO 22)之載體(例如Pave011)(或核酸)之宿主細胞(例如大腸桿菌)，藉此產生該多肽。
本發明dAb亦可以與其他分子之融合物或偶聯物形式存在。
在本發明內所述本發明其他實施例中，代替在本發明融合物中使用「dAb」，涵蓋熟習此項技術者可使用包含結合靶標之dAb之CDR的結構域且該框架包含本文所述減少與ADA之結合之修飾。
亦提供醫藥組合物，其包含本發明任一態樣或實施例之dAb與(例如)醫藥上或生理學上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑之組合。
本發明進一步提供本發明dAb用於治療或醫療之用途及用以治療或預防疾病或病症之用途。例如ADA結合有所減 少之抗TNFR1 dAb，例如本文所述經修飾以減少ADA結合之DOM1h-131-206 dAb(例如彼等具有圖8a-8e中所示胺基酸序列SEQ ID NO 16-20者)。
在一個態樣中，本發明提供具有C末端丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)用於治療或醫療或用作藥劑之用途，例如用以治療或預防發炎疾病或病症或呼吸道或肺部疾病或病症(例如急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫症候群(ARDS))及其併發症。
本發明亦提供編碼ADA結合有所減少之本發明dAb之核酸以及包含該等核酸之載體及宿主細胞。亦提供產生本發明dAb之方法，其包含在宿主細胞(例如微生物宿主細胞，例如大腸桿菌)中表現編碼性載體及核酸。
在又一態樣中，本發明提供包含ADA結合有所減少之本發明dAb之調配物，例如用於肺部遞送之可霧化調配物。亦提供霧化器或吸入器裝置，其包含本發明dAb，例如任一抗TNFR1 dAb，例如彼等具有圖8a-8e中所示胺基酸序列SEQ ID NO 16-20者，例如具有C末端丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)。
在另一態樣中，本發明提供用以治療發炎皮膚病症(例如牛皮癬)之未經修飾之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 1)或以任一本文所述方式修飾以減少ADA結合之DOM1h-131-206 dAb，例如在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)。
本發明之另一態樣係治療人類牛皮癬之方法，其包含以 下步驟：a)鑑別患有牛皮癬之人類；及b)向患有牛皮癬之人類上之牛皮癬斑塊投與治療有效量之結構域抗體(例如未經修飾之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO1)或以任一本文所述方式修飾以減少ADA結合之DOM1h-131-206 dAb，例如在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)；藉此治療牛皮癬。
本發明之另一態樣係用於治療牛皮癬之結構域抗體亦及用於治療牛皮癬之結構域抗體之使用劑量方案。結構域抗體可係未經修飾之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO1)或以任一本文所述方式修飾以減少ADA結合之DOM1h-131-206 dAb，例如在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)。
在又一態樣中，本發明亦提供工具mAb(例如如實例19中所述且具有圖6中所給出胺基酸序列SEQ ID NO 14及15之工具mAb)。工具mAb係使用標準小鼠單株抗體技術產生，即用DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 1)對小鼠實施免疫，收集脾且產生雜交瘤細胞系，然後選殖表現抗體之雜交瘤且使用標準技術將所得抗體分離並測序。工具mAb係結合VH dAb框架且藉此減少VH dAb與ADA結合者。因此，工具mAb似乎結合VH框架上與人類抗VH ADA類似之表位。因此，工具mAb可能有用，例如其可用於測試經修飾之dAb(VH、VHH)及用於測定防止或減少dAb與工具mAb結合之對dAb之修飾。防止與工具mAb結合之對VH dAb之修飾亦可防止或減少VH dAb與ADA之結合。因此， 本發明提供任何經修飾(例如藉由任何本文所述修飾)以防止或減少與工具mAb之結合之dAb。本發明亦提供在分析中使用工具mAb(例如實例19中所述且具有實例19亦及圖6中所給出胺基酸序列SEQ ID NO 14及15之工具mAb)之方法，其用以測試dAb，例如經修飾之dAb(例如(VH、VHH)，例如彼等本文所述者中之任一者，例如TNFR1 dAb，例如彼等本文所述者)，且用於測定彼等與(例如)ADA之結合降低者。在一個態樣中，dAb(例如VH、VHH)經修飾以減少本文所述工具mAb之結合且與工具mAb結合之KD係未經修飾之等效dAb序列之KD的150%或更高(例如200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%或更高)。本發明亦提供藉由此篩選分析鑑別之任何dAb。
在又一態樣中，本發明亦提供工具mAb(例如實例19中所述且具有圖6中所給出胺基酸序列SEQ ID NO 14及15之工具mAb)在分析方法中之用途，其用以量化組織試樣或血漿試樣中存在dAb(例如VH、VHH)之量。
在本說明書中已參照實施例以使說明書能書寫清晰及簡潔之方式闡述本發明。意欲且應瞭解，可以各種方式組合或分開實施例，此並不背離本發明。
除非另有定義，否則本文所用所有技術及科學術語皆具有等同於熟習此項技術者(例如在細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術及生物化學領域)通常所理解之 含義。在分子、遺傳及生物化學方法(一般而言，參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；及Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)，第4版，John Wiley & Sons公司，其以引用方式併入本文中)及化學方法中使用標準技術。
親和力係一種分子(例如本發明抗原結合蛋白)與另一分子(例如其靶抗原)在單一結合位點處結合之強度。抗原結合蛋白與其靶標之結合親和力可藉由標準平衡方法(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如BIACORETM分析)來測定。
本文所用術語「表位」係指抗原中接觸抗原結合蛋白(例如dAb)之特定結合結構域的部分。表位可係線性或構象/不連續表位。構象或不連續表位包含藉由其他序列隔開之胺基酸殘基，即在抗原一級序列中不在連續序列中。儘管該等殘基可來自肽鏈之不同區域，但其在抗原之三維結構中緊密靠近。在多聚抗原之情形下，構象或不連續表位可包括來自不同肽鏈之殘基。表位內所包含之特定殘基可經由電腦建模程式或經由業內已知方法(例如X射線結晶術)獲得之三級結構來確定。
dAb偶聯物係指組合物包含藉助共價或非共價、較佳共價化學偶聯又一分子之dAb。此共價可係經由肽鍵或其他手段，例如經由經修飾之側鏈。非共價鍵結可係直接(例 如，靜電相互作用、疏水相互作用)或間接鍵結(例如，互補結合配偶體(例如，生物素及抗生物素蛋白)之經由非共價結合，其中一種配偶體共價鍵結至藥物且互補結合配偶體共價鍵結至dAbTM)。當採用互補結合配偶體時，一種結合配偶體可直接或經由適宜連接體部分共價鍵結至藥物，且互補結合配偶體可直接或經由適宜連接體部分共價鍵結至dAbTM。
本文所用dAb融合物係指包含dAb及多肽藥物之融合蛋白質。dAb及多肽藥物以單一連續多肽鏈之離散部分(部分)存在。
本文所用「片段」當參照多肽使用時，係胺基酸序列與整個天然多肽胺基酸序列之一部分或全部相同之多肽。片段可係「獨立的」或包含於較大多肽內，其中該等片段在單一較大多肽中作為單一連續區形成一部分或區域。
本文所用術語mAbdAb係指連接至又一結合結構域、特定而言單一可變結構域之單株抗體，例如結構域抗體。mAbdAb具有至少兩個抗原結合位點，其至少一者係來自結構域抗體，且至少一者係來自經配對VH/VL結構域。此等mAbdAb闡述於(例如)WO 2009/068649中。
本文所用「肽」係指約2至約50個經由肽鍵接合在一起之胺基酸。本文所用「多肽」或「蛋白質」係指至少約50個藉由肽鍵接合在一起之胺基酸。多肽及蛋白質通常包含三級結構且摺疊成功能結構域。
本文所用術語「抗體之單鏈Fc區」係指IgG(例如 IgG1、IgG2、IgG3、iGG4或IgG4PE)或IgA抗體之單一重鏈Fc區。單一重鏈Fc區可包含CH1、CH2及CH3恆定區抗體結構域中之一或多者，例如所有3個恆定區抗體結構域或僅CH2及CH3結構域。除包含CH1、CH2及CH3恆定區抗體結構域中之一或多者外，抗體之單一重鏈Fc區可進一步包含抗體鉸鏈區(此一區通常在CH1結構域與CH2結構域之間發現)。
本文所用「功能」描述具有生物學活性(例如特異性結合活性)之多肽或肽。例如，術語「功能多肽」包括經由其抗原結合位點結合靶抗原之抗體或其抗原結合片段。
本文所用「靶配體」係指由多肽或肽特異性或選擇性地結合之配體。例如，當多肽係抗體、其抗原結合片段或免疫球蛋白單一可變結構域時，靶配體可係任何期望抗原或表位。與靶抗原之結合取決於多肽或肽之功能。
本文所用抗體係指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、二硫鍵連接之Fv、scFv、閉合構象多特異性抗體、二硫鍵連接之scFv、雙鏈抗體)，其係源自天然產生抗體之任何物種或藉由重組DNA技術產生；且係自血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母或細菌分離。
片語「免疫球蛋白單一可變結構域」係指獨立於其他V區或結構域特異性結合抗原或表位之抗體可變結構域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白單一可變結構域可呈具有其他可變區或可變結構域之模式(例如同多聚物或異多聚物)，其中該單一免疫球蛋白可變結構域結合抗原時不需 要該等其他區或結構域(即其中免疫球蛋白單一可變結構域以獨立於其他可變結構域之方式結合抗原)。「結構域抗體」或「dAb」與本文所用術語「免疫球蛋白單一可變結構域」相同。「單一免疫球蛋白可變結構域」與本文所用術語「免疫球蛋白單一可變結構域」相同。「單一抗體可變結構域」與本文所用術語「免疫球蛋白單一可變結構域」相同。在一個實施例中，免疫球蛋白單一可變結構域係人類抗體可變結構域，但亦包括來自其他物種之單一抗體可變結構域，其他物種係(例如)齧齒動物(例如如WO 00/29004中所揭示，其內容全文以引用方式併入本文中)、絞口鯊及駱駝科動物VHH dAb。駱駝科動物VHH係源自包括以下在內之物種之免疫球蛋白單一可變結構域多肽：駱駝、駱馬、羊駝、單峰駱駝及原駝，該等物種產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體。VHH可經人類化。本發明範圍內亦涵蓋人類dAb，其已經修飾以成為不完全人類，例如減少聚集之修飾，包括為駱駝科動物基序之相同殘基之突變。
未經修飾之免疫球蛋白單一可變結構域(即未經修飾之dAb)(例如結合靶標之dAb)，在框架結構內包含3個互補決定區(CDR)。而在天然免疫球蛋白鏈之遺傳結構中，V區在CDR3開始處封端，且CDR3之其餘部分係由D區及J區提供(產生V-D-J融合物)，出於本發明目的，dAb包括全部CDR3且在其C末端處以框架4殘基封端。VH dAb在其C末端處以殘基LVTVSS封端。VHH dAb在其C末端處以殘基VTVSS封端。VL dab在其C末端處以VEIKR封端。
「經修飾之dAb」係本文所述另外具有改變dAb C末端三維構象之修飾之dAb。經修飾之dAb包括包含本文所揭示C末端添加、延伸或標籤及/或某些胺基酸取代之dAb。
本發明亦提供上文所述單一免疫球蛋白可變結構域(或包含dAb(例如mAbdAb)之分子)，其與抗藥物抗體之結合親和力及/或親合力低於等效dAb(或包含dAb之分子)(例如，其與ADA結合之KD係等效序列之KD的150%或更高(例如200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%或更高))，該等效dAb具有相同序列，只是X不存在，n、p及q係1且不存在框架突變。此意指，dAb(例如DOM 1H-131-206)(SEQ ID NO 1)當然後經修飾以使得其延伸至含有X，例如C末端單一丙胺酸延伸，或經修飾以去除C末端絲胺酸，或藉由殘基14、41、108、110及/或112中一或多者之框架中之取代修飾(或此等修飾之任一組合)時，可以低於無任何此等修飾之DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 1)之結合親和力及/或親合力結合抗藥物抗體(ADA)。此可在(例如)BiacoreTM上使用表面電漿共振使用標準技術來測定。熟習此項技術者應理解，KD值愈低，結合愈強。
本發明亦提供本文所述經修飾以減少ADA結合之dAb，且其與ADA之結合有所減少，如使用如實例2中所述之確認分析所測定，且其中與具有約98%-100%信號抑制之對照dAb相比，該經修飾之dAb之平均信號抑制%小於90%，例如小於80%，例如小於70%，例如小於60%，例如小於 50%，例如小於40%，例如小於30%，例如小於20%，例如小於10%，該對照(未經修飾)dAb具有相同或類似序列，但未經修飾而未減少ADA結合。
預先存在之ADA係業已存在於欲投與藥物之個體中之ADA。預先存在之ADA可存在於未接受藥物之個體(即尚未投與藥物之個體)中。
「結構域」係經摺疊蛋白質結構，其具有獨立於蛋白質其餘部分之三級結構。通常，結構域負責蛋白質之離散功能性質，且在許多情形下可對其實施添加、去除或將其轉移至其他蛋白質中而不損失蛋白質其餘部分及/或結構域之功能。「單一抗體可變結構域」係包含抗體可變結構域之特徵序列的經摺疊多肽結構域。因此，其包括完整抗體可變結構域及經修飾可變結構域，例如其中一或多個環已經並非抗體可變結構域特徵之序列替代之結構域，或已經截短或包含N-或C-末端延伸之抗體可變結構域，以及至少保留全長結構域之結合活性及特異性之可變結構域之經摺疊片段。
本文所用術語「劑量」係指經限定時間間隔以一次(單位劑量)或兩次或更多次給藥投與個體之融合物或偶聯物量。例如，劑量可指經一天(24小時)(日劑量)、兩天、一週、兩週、三週或一或多數月之時程(例如藉由單次投與或藉由兩次或更多次投與)投與個體之融合物或偶聯物量。給藥間隔可為任一期望時間長度。
「單價」意指結合一個表位。
片語「半衰期」係指在活體內由於(例如)天然機制所致降解及/或清除或螯合而使融合物或偶聯物之血清或血漿濃度降低50%所耗時間。藉由與抵抗降解及/或清除或螯合之血清白蛋白分子(例如人類血清白蛋白(HSA))結合來活體內穩定本發明組合物並延長其半衰期。該等血清白蛋白分子係本身具有較長活體內半衰期之天然蛋白質。若分子功能活性在活體內維持之時間長於對半衰期延長分子無特異性之類似分子，則分子之半衰期延長。
本文所用「流體動力學尺寸」係指基於分子經過水溶液之擴散，分子(例如，蛋白質分子、配體)之表觀尺寸。蛋白質經過溶液之擴散或移動可經處理以獲得蛋白質之表觀尺寸，其中尺寸係藉由蛋白質粒子之「斯托克斯半徑(Stokes radius)」或「流體動力學半徑」給出。蛋白質之「流體動力學尺寸」取決於質量及形狀(構象)二者，以使得具有相同分子量之兩種蛋白質可基於蛋白質之總體構象具有不同流體動力學尺寸。
如下計算兩種序列之間之「同源性」或「一致性」或「相似性」(該等術語在本文中可互換使用)。出於最佳比較目的，比對各序列(例如可在第一及第二胺基酸或核酸序列之一或二者中引入缺口以達成最佳比對，且出於比較目的可忽視非同源序列)。在一實施例中，出於比較目的經比對之參照序列之長度佔參照序列長度至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、80%、90%、100%。然後比較對應胺基酸位置或核苷酸位置處之 胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中佔據一位置之胺基酸殘基或核苷酸與第二序列中之對應位置相同時，該等分子在該位置處一致(本文所用胺基酸或核酸「同源性」等效於胺基酸或核酸「一致性」)。兩種序列間之一致性百分比隨該等序列共有之一致位置數而變化，其中考慮為達成兩種序列最佳比對而需要引入之缺口數及各缺口長度。本文所定義胺基酸及核苷酸序列比對及同源性、相似性或一致性可使用演算法BLAST 2序列以預設參數來準備及測定(Tatusova,T.A.等人，FEMS Microbiol Lett,174：187-188(1999))。
本發明係關於編碼本文所述本發明組合物之經分離及/或重組核酸。
在本文中稱作「經分離」之核酸係已在其初始環境中(例如在細胞中或在諸如文庫等核酸混合物中)自其他材料(例如諸如基因組DNA、cDNA及/或RNA等其他核酸)分離出來之核酸。經分離核酸可分離作為載體(例如質粒)之一部分。
在本文中稱作「重組」之核酸係已藉由重組DNA方法產生之核酸及使用聚合酶鏈式反應(PCR)製備之核酸，該重組DNA方法包括依賴人工重組之方法，例如使用(例如)限制性酶、同源重組、病毒或諸如此類選殖至載體或染色體中。
本發明亦係關於包含(一或多個)重組核酸或表現構築體之重組宿主細胞，例如哺乳動物或微生物，該重組核酸或 表現構築體包含編碼本文所述本發明組合物(例如經修飾以減少與ADA之結合之dAb)之核酸。亦提供製備本文所述本發明組合物之方法，其包含在適於表現融合多肽之條件下維持本發明重組宿主細胞，例如哺乳動物或微生物。若需要，該方法可進一步包含分離或回收融合物之步驟。
例如，可使用任何適於所選宿主細胞之方法(例如轉化、轉染、電穿孔、感染)將編碼本發明分子之核酸分子(即一或多種核酸分子)引入適宜宿主細胞中來產生重組宿主細胞，從而將核酸分子以可操作方式連接至一或多種表現控制元件(例如在載體中、在藉由細胞內處理產生之構築體中、整合至宿主細胞基因組中之控制元件)上。可將所得重組宿主細胞維持在適於表現之條件下(例如在誘導物存在下，在適宜動物中，在補充有適當鹽、生長因子、抗生素、營養補充劑等之適宜培養基中)，藉此產生所編碼肽或多肽。若需要，可分離或回收所編碼肽或多肽(例如自動物、宿主細胞、培養基、乳汁)。此方法涵蓋在轉基因動物宿主細胞中表現(例如參見WO 92/03918，GenPharm International)。
亦可在適宜活體外表現系統中藉由(例如)化學合成或藉由任何其他適宜方法產生本文所述本發明分子。
如本文所述及例示，本發明分子通常以高親和力結合其靶配體。
本發明分子(例如與ADA之結合有所減少之經修飾之dAb)可在大腸桿菌中或在畢赤酵母屬(Pichia)(例如，畢赤 酵母(P.pastoris))中表現。在一個實施例中，dAb係在大腸桿菌中或在畢赤酵母屬(例如，畢赤酵母)；或在哺乳動物細胞培養物(例如CHO或HEK 293細胞)中分泌。儘管本文所述分子在大腸桿菌或畢赤酵母屬或哺乳動物細胞中表現時可為可分泌的，但其可使用任何不採用大腸桿菌或畢赤酵母屬之適宜方法(例如合成化學方法或生物學產生方法)來產生。在一實施例中，可將編碼本發明dAb(例如本文所述TNFR1 dAb)之核酸選殖至適宜表現載體(例如Pave011，來自Fujifilm Diosynth)中，且隨後在諸如大腸桿菌等微生物載體中表現。
在一個實施例中，本發明dAb(例如VH、VL或VHH)可經修飾以防止與ADA結合，以使得該修飾包含存在於C末端處之標籤。此標籤可以與分子之融合物或偶聯物形式存在。標籤可係任何業內已知標籤，例如親和力標籤，例如myc-標籤、FLAG標籤、his-標籤；化學修飾，例如PEG；或蛋白質結構域，例如抗體Fc結構域。特定而言，本發明提供延伸有標籤、化學修飾或蛋白質結構域之本發明分子，其用於降低副效應之方法，如本文所進一步定義。
在另一實施例中，本發明亦提供包含減少預先存在之ADA結合之經修飾之框架之分子(例如dAb)(例如VH或VL或VHH)，例如在14位、41位、108位、110位或112位中之任一位置處包含胺基酸取代之dAb(例如VHH、VH或VL)。例如，該等取代可係一或多種選自以下之修飾：P14A、P14K、P14Q、P14T、P41A、L108A、L108Q、 T110A及S112A。
在此實施例之一個態樣中，dAb(例如VHH、VH或VL)包含一或多種選自以下之修飾：P14A、P14K、P14Q、P14T、P41A、L108A、T110A及S112A；且可進一步包含上文所述任何C末端延伸、添加、缺失或標籤。
在一個實施例中，包含一或多種選自P14A、P14K、P14Q、P14T、P41A、L108A、T110A及S112A之修飾之dAb(例如VHH、VH或VL)亦在dAb之C末端處包含胺基酸延伸，該胺基酸延伸係選自：(a)丙胺酸、或(b)包含選自以下之延伸或由其組成之胺基酸序列：AS、AST、ASTK、ASTKG或ASTKGP。另外，本文所述dAb分子及包含該等分子之醫藥組合物可用於防止或降低副效應。dAb與抗藥物抗體結合可導致兩個dAb會聚在一起。在一些情況下，此可導致安全性擔憂。例如，若dAb之靶標係受體或聚合物靶標，則使兩個dAb會聚在一起可使兩個靶標會聚在一起。此可經由(例如)受體二聚化導致意外之藥理學影響，例如激動作用而非拮抗作用。因此本發明提供本發明分子在防止副效應之方法中之用途。防止意指使用本發明分子與未經修飾之等效分子相比可完全或部分地消除預先存在之抗藥物抗體之結合。減少ADA之結合可降低不期望之藥理學效應程度。因此，與不包含C末端延伸、添加、缺失或標籤及/或其他框架修飾之未經修飾之分子(例如未經修飾之dAb)相比，本發明分子可具有增強之安全特性及更少副效應，從而減少預先存在之ADA結合。類似 地，投與本文所述經修飾之分子或包含該等經修飾之分子之醫藥組合物(其結合預先存在之ADA之能力有所降低)可改進免疫原性，此乃因當未經修飾之分子結合ADA時，其形成免疫複合體且隨後此等免疫複合體可產生免疫反應。另外，投與本文所述經修飾之分子或包含該等經修飾之分子之醫藥組合物亦可改良效能並改良安全特性且例如可有利地用於向可針對未經修飾之分子產生自體抗體之患者重複給藥。另外，能夠將本發明dAb分子投與患者群體而無需預先篩選ADA滴定度以去除具有不良反應風險之個體。在使用分子防止副效應之背景下，本發明亦提供本文所定義單一免疫球蛋白可變結構域之用途，其中藉由Y替代X，其中Y係選自由以下組成之群：標籤，例如親和力標籤、myc標籤、FLAG標籤或his-標籤；化學修飾，例如PEG基團；或蛋白質，例如抗體之Fc部分。
本發明亦提供藉由投與本發明分子或已藉由如上文所定義Y替代X之本發明分子來防止或降低治療方案中之副效應之方法。亦提供修飾本文所述分子以減少其與ADA之結合並降低副效應之方法。
本發明亦提供包含本文所述經修飾之分子之組合物，例如包含經修飾之VHH、VH或VL之組合物。此等組合物可包含以與其他分子(例如其他蛋白質、抗體分子或抗體片段)之融合物或偶聯物形式存在的經修飾之分子。例如，dAb可以模式化dAb形式存在(例如dAb可以dAb-fc融合物或偶聯物形式存在，如(例如)WO 2008/149148中所述)， 或其可以mAbdAb形式存在(如WO 2009/068649中所述)，或dAb可以與半衰期延長性蛋白質或多肽(例如，另一dAb，例如，結合血清白蛋白之dAb(AlbudAbTM))之融合物或偶聯物形式存在，或可以與(例如)聚乙二醇PEG或其他治療性或活性分子之融合物或偶聯物形式存在。在此實施例中，治療性分子當以與dAb(例如VHH、VH或VL)之融合物或偶聯物形式存在時，可連接至dAb之C末端延伸或dAb之N末端。在一個實施例中，一或多種治療性分子係以於dAb之N末端處之融合物(或偶聯物)形式存在。
在一個實施例中，結合ADA之能力有所降低之本發明dAb(亦及諸如mAbdAb等包含dAb之分子，其亦係本發明之一部分)以高親和力結合靶配體，例如，其KD可在5微莫耳至約1 pM範圍中，例如約500 nM至約10 pM，例如約200 nM至約10 pM，例如50 nM至約10 pM，例如約10 nm至約10 pM，如藉由表面電漿共振使用BiacoreTM所量測。在一實施例中，該分子之KD可係約10 nM至約10-30 pM，例如，其可係與ADA結合有所減少之TNFR1 dAb且其KD係約10-30 pM，例如約20 pM。
在一實施例中，結合ADA之能力有所降低之本發明dAb(亦及諸如mAbdAb等包含dAb之分子，其亦係本發明之一部分)之表現量可係彼等藉由本文所述未經修飾而未減少與ADA之結合之具有相同或類似胺基酸序列之dAb所顯示者的至少3%，例如5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。在又一實施例中，結合 ADA之能力有所降低之本發明分子(例如dAb及諸如mAbdAb等包含dAb之分子)可具有至少0.1 g/升之表現量。
在一實施例中，結合ADA之能力有所降低之本發明dAb(亦及諸如mAbdAb等包含dAb之分子，其亦係本發明之一部分)結合其靶抗原之KD係本文所述未經修飾而未減少與ADA之結合之具有相同或類似胺基酸序列之dAb之KD的約50倍(或更高)(即dAb之效能係1/50)，例如約40倍、約30倍、約20倍、約10倍、約5倍、約4倍。在一實施例中，結合ADA之能力有所降低之本發明dAb(亦及諸如mAbdAb等包含dAb之分子，其亦係本發明之一部分)與其靶抗原之KD與本文所述未經修飾而未減少ADA結合之具有相同或類似胺基酸序列之dAb的KD基本上相同(例如約2倍至1/2)或係其1/2以下。
本發明進一步係關於此等C末端延伸及/或經修飾之分子之用途、包含該等分子之調配物、組合物，且亦係關於產生及表現該等分子之方法。
在一實施例中，本發明提供具有任何上文所述C末端修飾且結合選自以下之靶標之dAb(VH、VL或VHH)：TNFα、TNFR1、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、白蛋白及TGFβR2。
在一個實施例中，本發明提供以下案件中任一者中所述或揭示之dAb：WO 2007/049017(例如命名為2H-131-511之抗TNFR1 dAb或與此dAb至少80%一致(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%一致)之 dAb)、WO 2008/149144(例如選自以下之抗TNFR1 dAb：1h-131-201、1h-131-202、1h-131-203、1h-131-204、1h-131-205或與此dAb至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%一致)一致之dAb)及WO 2008/149148(其內容以引用方式明確地併入本文中)，例如其中之任一抗TNFR1 dAb；且該dAb進一步包含本文所述至少一種減少與ADA之結合親和力及/或親合力之修飾，例如任一上文所述C末端修飾及/或任一上文所述胺基酸取代及/或缺失。
在另一實施例中，本發明提供WO 2007/049017、WO 2008/149144及WO 2008/149148中任一者中所述或揭示未經修飾之dAb(例如任一上文所述dAb序列)，且隨後該dAb經修飾以包含一或多種選自(例如)以下之框架修飾：P14A、P14K、P14Q、P14T、P41A、L108A、T110A及S112A框架突變，且其亦可視情況進一步包含任何本文所述C末端修飾。在一個實例中，未經修飾之dAb可係WO 2007/049017、WO 2008/149144及WO 2008/149148中任一者中所述或揭示之任一抗TNFR1dAb序列。在一實施例中，未經修飾之抗TNFR1 dAb序列可係與鑑別為以下之dAb序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%)一致者：DOM1h-131-206(揭示於WO 2008/149148中)、DOM 1h-131-511(揭示於WO 2007/049017及2008/149144中)及DOM 1h-131-202(揭示於WO 2008/149144中)。
在另一實施例中，本發明提供WO 2008/149147(其內容以引用方式明確地併入本文中)中所述或揭示之VEGF dAb，例如命名為15-26-593之dAb(WO 2008/149147之圖5中所示之胺基酸序列)，且該dAb進一步包含本文所述任何減少與ADA之結合親和力及/或親合力之修飾，例如上文所述任何C末端修飾及/或上文所述任何胺基酸取代及/或缺失。
未經修飾之dAb胺基酸序列如下：
(a)DOM 1H-131-206
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMWWRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 1)
(b)DOM 1H-131-511
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPVGQDPFYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 2)
(c)DOM 1H-131-202
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 3)
(d)VHH純系2(d)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDN AKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO 4)
(e)VHH純系2(e)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGR FITSRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL VQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTL YLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPED TAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 5)
(f)VHH純系2(f)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRF TISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSAAAEVQL VESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFIISR DNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYFWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO 6)。
在另一實施例中，本發明提供選自以下序列之經修飾之VHH dAb：
(a)VHH純系2(d)+A：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDN AKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA (SEQ ID NO 7)
(b)VHH純系2(e)+A：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGR FTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL VQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTL YLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGILVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPED TAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO 8)
(c)VHH純系2(f)+A
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRF TISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSAAAEVQL VESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISR DNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSA (SEQ ID NO 9)。
在另一實施例中，本發明提供結合TNFR1且選自以下胺基酸序列之經修飾之DOM1h-131-206 dAb：
(a)在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO 16)
(b)具有單一丙胺酸延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb：EVQLLESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO 17)
(c)具有P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb： EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSASTKG(SEQ ID NO 19)
(d)具有ASTKG C末端延伸之DOM1h-131-206 dAb EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSASTKG(SEQ ID NO 19)
(e)具有ASTKG C末端延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb EVQLLESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEVWSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSSASTKG(SEQ ID NO 20)。
本發明亦提供編碼本文所述分子之核酸，例如編碼上文所述抗TNFR1 dAb之核酸。亦提供包含該等核酸之宿主細胞，例如非胚胎宿主細胞，例如原核生物或真核生物宿主細胞，例如大腸桿菌或或酵母宿主細胞或哺乳動物細胞。
本發明另外提供與人類血清中之ADA結合有所減少(例如不結合人類血清中之預先存在之ADA)之dAb，且其中該dAb上與ADA結合之表位經遮蔽(即該表位不可再用於結合ADA，此乃因(例如)其已經另一分子覆蓋或遮蔽，從而防止結合，或其空間構象已經變化，從而防止結合)。dAb上之表位可藉由任何本文所述修飾遮蔽以減少ADA結合，例如將化學實體添加至dAb之C末端或藉由框架取代或缺失，如本文所述。添加至dAb之C末端之化學實體可係延伸(例如胺基酸延伸)或標籤或其可係化學修飾，例如聚乙 二醇化或醯胺化。對C末端之修飾可係直接或間接改變dAb上與ADA結合之表位之構象藉此降低dAb結合ADA之能力者。
熟習此項技術者應瞭解，在特定而言根據所用細胞系及分子(例如dAb)之特定胺基酸序列產生本文所述分子(例如dAb)後，可進行轉譯後修飾。例如，此可包括某些前導序列之裂解、在各種糖基化及磷酸化模式中各種糖部分之添加、去醯胺化、氧化、二硫鍵顛倒(scrambling)、異構化、C末端離胺酸剪切(clipping)及N末端麩醯胺酸環化。本發明涵蓋使用此等已經受或已經歷一或多種轉譯後修飾之分子，例如dAb。因此，本發明dAb包括已經歷轉譯後修飾之dAb，例如如下所述：已知抗體在其恆定區中之保守位置之糖基化對抗體功能、尤其效應子功能具有深刻效應，例如，參見Boyd等人(1996)Mol.Immunol.32：1311-1318。涵蓋本發明抗原結合蛋白之糖基化變體，其中一或多個碳水化合物部分經添加、取代、缺失或修飾。引入天冬醯胺-X-絲胺酸或天冬醯胺-X-蘇胺酸基序產生碳水化合物部分之潛在酶促附著位點且因此可用於操作抗體之糖基化。在Raju等人(2001)Biochemistry 40：8868-8876中，使用β-1,4-半乳糖基轉移酶及/或α,2,3唾液酸轉移酶經由再半乳糖基化及/或唾液酸化過程增加TNFR-IgG免疫黏附素之末端唾液酸化。吾人相信增加末端唾液酸化延長免疫球蛋白之半衰期。與多數糖蛋白一樣，抗體通常係以糖型混合物產生。當在原核生物細胞、尤其哺乳動物細胞中產生 抗體時，此混合物尤其明顯。已研發多種方法來製造經界定糖型，參見Zhang等人(2004)Science 303：371：Sears等人(2001)Science 291：2344；Wacker等人(2002)Science 298：1790；Davis等人(2002)Chem.Rev.102：579；Hang等人(2001)Acc.Chem.Res34：727。本文所述抗體(例如具有IgG同種型之抗體，例如IgG1抗體)可包含經界定數目(例如7或更小，例如5或更小，例如2或1)之糖型；去醯胺化係主要將天冬醯胺(N)轉變成約3：1比率之異天冬胺酸及天冬胺酸(D)之酶促反應。麩醯胺酸殘基可以類似方式發生去醯胺化，但程度低得多。CDR之去醯胺化導致分子電荷變化，但通常不會導致抗原結合變化，其亦不會影響PK/PD；氧化可發生在產生及儲存期間(即在氧化條件存在下)並導致蛋白質共價修飾，該修飾係直接藉由反應性氧物質或間接藉由與氧化壓力次級副產物反應誘導。氧化主要發生於甲硫胺酸殘基，但偶爾可發生於色胺酸及游離半胱胺酸殘基；二硫鍵顛倒可發生在產生及鹼性儲存條件期間。在某些情況下，二硫鍵可錯誤地斷裂或形成，從而產生未配對半胱胺酸殘基(-SH)。該等游離(未配對)巰基(-SH)可促進改組；異構化通常發生於產生、純化及儲存期間(在酸性pH下)且通常發生在天冬胺酸經由化學過程轉變成異天冬胺酸時；重鏈及/或輕鏈中之N末端麩醯胺酸可能形成焦麩胺酸鹽(pGlu)。多數pGlu形成發生於產生生物反應器中，但其可以非酶促方式形成，此端視處理pH及溫度以及儲存條件而定。人們認為pGlu形成係重組mAb之主要 降解途徑之一；C末端離胺酸剪切係藉由羥基肽酶催化的酶促反應，且通常在重組mAb中觀察到。此方法之變體包括去除一或兩條重鏈之離胺酸。離胺酸剪切似乎不會影響生物活性且不影響mAb效應子功能。
本發明進一步提供產生以直接融合物形式存在之包含胺基酸延伸之本發明分子的方法，該方法包含在適於表現編碼本發明融合物之重組核酸之條件維持包含該重組核酸及/或構築體之宿主細胞(例如彼等上文所述者)，藉此產生融合物。
本發明亦提供包含經修飾之本發明分子之醫藥組合物。本發明進一步提供本發明醫藥組合物，其用於醫療，例如用於治療或預防(例如)疾病或病況或病症，且其包含向該個體投與治療有效量之本發明醫藥組合物。通常，本發明分子會以純化形式與藥理學或生理學適當載體一起使用。通常，該等載劑可包括水性或醇性/水性溶液、乳液或懸浮液，任一者皆包括鹽水及/或緩衝介質。非經腸媒劑可包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉及乳酸化林格氏右旋糖。若需要保持多肽複合體之懸浮狀態，可能需要自增稠劑(例如羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、明膠及海藻酸鹽)選擇生理上可接受之適宜佐劑。靜脈內媒劑包括流體及營養素補充物及電解質補充物，例如彼等基於林格氏右旋糖者。亦可存在防腐劑及其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版)。可使用多種適宜調配物，包括緩釋調配物。
本發明亦提供治療(治療性或預防性)患有疾病或病症(例如彼等本文所述者)之患者或個體之方法，且其包含向該個體投與治療有效量之本發明醫藥組合物。
本發明醫藥組合物可單獨投與或與其他分子或部分(例如多肽、治療性蛋白質及/或分子)(例如，其他蛋白質(包括抗體)、肽或小分子藥物)組合投與。
本發明亦提供包含本文所述經修飾之抗TNFR1 VH或VL dAb(例如彼等本文所述抗TNFR1 VH或VL dAb、或本文所述經修飾之抗TNFR1 VHH結構域)之本發明醫藥組合物，其用於治療發炎疾病或病症，例如牛皮癬、關節炎、多發性硬化、發炎腸病(例如克隆氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)；或例如選自(例如)以下之呼吸道或肺部疾病或病症：慢性阻塞性肺病、慢性枝氣管炎、慢性阻塞性枝氣管炎及肺氣腫、肺部發炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、過敏性肺炎、伴有嗜酸性球增多症之肺浸潤、環境性肺病、肺炎、枝氣管擴張症、囊性纖維化、間質性肺病、原發性肺高壓、肺血栓栓塞、胸膜病症、縱隔病症、隔膜病症、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸中止症、急性呼吸窘迫症候群、間皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏症、石綿沉著病、麴黴腫、麴黴菌病、枝氣管擴張症、慢性枝氣管炎、肺氣腫、嗜酸性球性肺炎、特發性肺纖維化、侵襲性肺炎鏈球菌感染 症、流行性感冒、非結核分枝桿菌病(nontuberculous mycobacteria)、胸膜積液、肺塵埃沈著病、肺囊蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著病、肺炭疽、肺水腫、肺栓塞、肺部發炎、肺組織球增多病X、肺高血壓、肺奴卡菌病(pulmonary nocardiosis)、肺結核、肺靜脈閉塞性疾病、類風濕肺病、類肉瘤病及韋格納肉芽腫(Wegener's granulomatosis)及急性肺損傷(ALI)亦及急性呼吸窘迫症候群(ARDS)；及其併發症，例如急性腎損傷。
本發明亦提供包含本文所述經修飾之抗TNFR1 dAb(VH、VL或VHH)之本發明醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療上文所述任何指定疾病或病症之藥劑。
本發明亦係關於任一本文所述組合物之用途，其用於治療、診斷或預防上文所述任何發炎疾病或病症或呼吸道或肺部疾病或病症。本發明亦係關於任何本文所述組合物之預防性用途，其用於預防或緩和任何上文所述發炎疾病或病症或呼吸道或肺部疾病或病症。
含有本文所述抗TNFR1 dAb(例如具有C末端丙胺酸延伸之DOM 1H-131-206)之組合物可經投與用於預防性及/或治療性治療且以「治療有效劑量」投與。達成此劑量所需量將取決於疾病嚴重程度及患者自身免疫系統之一般狀態，但通常在0.005 mg至5.0 mg dAb/公斤體重範圍內，更通常使用0.05 mg至2.0 mg/kg/劑量之劑量。對於預防性應用而言，可使用類似或稍低劑量，以預防、抑制或延遲疾病發作(例如，維持緩解或靜止，或防止急性階段)。熟練 臨床醫師將能確定治療、抑制或預防疾病之適當給藥間隔。當投與本文所述抗TNFR1 dAb以治療、抑制或預防慢性發炎疾病時，其可至多每天4次、每週2次、每週1次、每2週1次、每月1次或每2個月1次以(例如)下列劑量投與：約10 μg/kg至約80 mg/kg、約100 μg/kg至約80 mg/kg、約1 mg/kg至約80 mg/kg、約1 mg/kg至約70 mg/kg、約1 mg/kg至約60 mg/kg、約1 mg/kg至約50 mg/kg、約1 mg/kg至約40 mg/kg、約1 mg/kg至約30 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約10 μg/kg至約10 mg/kg、約10 μg/kg至約5 mg/kg、約10 μg/kg至約2.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg或約10 mg/kg。在特定實施例中，可每2週1次或每1個月1次以下列劑量投與抗TNFR1 dAb以治療、抑制或預防慢性發炎疾病：約10 μg/kg至約10 mg/kg(例如，約10 μg/kg、約100 μg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg或約10 mg/kg)。
若一或多種症狀或體徵相對於治療前所呈現之此等症狀、或相對於未經本文所述組合物或其他適宜對照治療之個體(人類或模型動物)中之此等症狀有所降低或緩和(例如降低或緩和至少10%或根據臨床評價量表降低或緩和至少一點)，則認為使用此組合物實施之治療或療法「有效」。症狀可端視靶向疾病或病症之精確性質而明顯不同，但可 由一般熟練臨床醫師或技師來量測。
類似地，若一或多種症狀或體徵之發作或嚴重程度相對於未經本文所述組合物治療之類似個體(人類或動物模型)中之此等症狀有所延遲、降低或消除，則使用此組合物實施之預防「有效」。
本發明分子可進一步經模式化以具有較大流體動力學尺寸，從而進一步延長半衰期，例如，藉由附著PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或其至少轉鐵蛋白結合部分、抗體Fc區或藉由偶聯至抗體結構域來模式化。例如，結合血清白蛋白之dAb可模式化為抗體之較大抗原結合片段(例如，模式化為Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFv)。
在某些實施例中，本發明提供包含雙特異性配體或多特異性配體之本發明組合物，該配體包含第一dAb，其係根據本發明藉由(例如)C末端延伸及/或藉由P14A框架突變進行修飾；及第二dAb，其具有與第一dAb相同或不同之結合特異性；及(視情況在多特異性配體之情形下)其他dAb。第二dAb(或其他dAb)可視情況結合不同靶標且亦可根據本發明視情況包含C末端延伸及/或P14A框架突變。
在一個態樣中，本發明提供藉由非經腸投與遞送之本發明之分子及組合物，例如藉由皮下、肌內或靜脈內注射、吸入、經鼻遞送、穿黏膜遞送、經口遞送、遞送至患者GI道、直腸遞送或眼部遞送。在一個態樣中，本發明提供本發明之分子及組合物在製造藉由以下方式遞送之藥劑中的 用途：皮下注射、吸入、靜脈內遞送、經鼻遞送、穿黏膜遞送、經口遞送、遞送至患者GI道、直腸遞送、經皮或眼部遞送。
在一個態樣中，本發明提供藉由以下方式遞送至患者之方法：皮下注射、肺部遞送、靜脈內遞送、經鼻遞送、穿黏膜遞送、經口遞送、遞送至患者GI道、直腸或眼部遞送，其中該方法包含向該患者投與醫藥有效量之本發明分子。
在一個態樣中，本發明提供包含本發明分子之可注射、可吸入、可霧化經口調配物。
調配物可呈錠劑、丸劑、膠囊、液體或糖漿形式。
本文所定義術語「個體(subject或individual)」包括諸如哺乳動物等動物，包括(但不限於)靈長類動物(例如，人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科動物、羊科動物、馬科動物、犬科動物、貓科動物、齧齒動物或鼠科動物物種。
本發明亦提供用於將本發明之分子及組合物投與個體(例如，人類患者)之套組，其包含本發明之分子或組合物、藥物遞送裝置及視情況使用說明書。該組合物可以調配物(例如冷凍乾燥調配物或緩釋調配物)形式提供。在某些實施例中，藥物遞送裝置係選自由以下組成之群：注射器、吸入器、鼻內或眼部投與裝置(例如，噴霧器、眼用或鼻用滴管)及無針注射裝置。
本發明之分子及組合物可經凍乾用於儲存且在使用前於 適宜載劑中重構。可採用任何適宜凍乾方法(例如，噴霧乾燥、原絲筒乾燥(cake drying))及/或重構技術。彼等熟習此項技術者應瞭解，凍乾及重構可導致不同程度之抗體活性損失且必須調節該使用量以進行補償。在特定實施例中，本發明提供包含本文所述凍乾(冷凍乾燥)組合物之組合物。較佳地，凍乾(冷凍乾燥)組合物當再水合時損失其活性(例如，與血清白蛋白之結合活性)之不超過約20%、或不超過約25%、或不超過約30%、或不超過約35%、或不超過約40%、或不超過約45%、或不超過約50%。活性係在將組合物凍乾前產生組合物之效應所需組合物之量。組合物之活性可在凍乾前使用任何適宜方法測定，且活性可在再水合後使用相同方法測定以測定損失活性之量。
本發明亦提供包含本發明分子之持續或緩慢釋放調配物，此等持續釋放調配物可包含本發明分子與(例如)透明質酸、微球體或脂質體及其他醫藥上或藥理學上可接受之載體、賦形劑及/或稀釋劑之組合。
在一個態樣中，本發明提供包含本發明分子及醫藥上或生理學上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑之醫藥組合物。
在一個實施例中，本發明與提供與ADA結合有所減少之本發明經修飾之TNFR1 dAb，例如具有本文所述減少與ADA之結合之修飾的經修飾之DOM1h-131-206 dAb。例如，本發明提供在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)作為(例如)醫藥組合物，其用於(例如)治療疾病或病症，例如用以治療呼吸道疾病或病 症，例如COPD、ALI或ARDS。當用於治療呼吸道疾病或病症(例如COPD、ALI或ARDS)時，可藉由注射(例如藉由皮下、靜脈內或肌內注射)將在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)(或包含在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb之醫藥組合物)投與個體(例如人類個體)，或者可藉由肺部投與將其給予個體(例如人類個體)，肺部投與係藉由使用標準霧化器進行霧化或藉由吸入(例如藉由使用標準吸入器裝置)來達成。本發明進一步提供包含ADA結合有所減少之本發明經修飾之TNFR1 dAb(例如在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16))的持續釋放及/或冷凍乾燥調配物。亦提供遞送裝置，例如吸入器或霧化器裝置，其包含本發明經修飾之TNFR1 dAb，例如在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb核酸(SEQ ID NO 22)。
在一態樣中，本發明提供未經修飾之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 1)或以任一本文所述方式經修飾以減少ADA結合之DOM1h-131-206 dAb(例如在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16))，以治療發炎皮膚病症(例如牛皮癬)，且本發明亦提供下文所述在牛皮癬治療中使用結構域抗體之任一劑量方案。用於治療牛皮癬之結構域抗體選擇性地靶向與人類TNFR1之天然人類TNF-α配體相同之人類TNFR1結構域，且係TNFR1而非TNFR2之特異性競爭性拮抗劑，並防止TNF-α與 TNFR1結合及此配體經由TNFR1之信號傳導。此一結構域抗體可包含任何本文所揭示已經修飾以減少與ADA結合之抗TNFR1 dAb。特定而言，結構域抗體可係本文所揭示人類結構域抗體，例如具有SEQ ID NO：1中所示胺基酸序列之DOM1h-131-206、具有SEQ ID NO：16中所示胺基酸序列之具有C末端丙胺酸之DOM1h-131-206或本文所述已經修飾以減少ADA結合(即任何減少與ADA之結合之修飾)之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 1)。結構域抗體可提供於含有(例如)100 mg或(例如)40 mg結構域抗體凍乾物之小瓶中。凍乾物可包含蔗糖、甘胺酸、磷酸二氫鈉及聚山梨醇酯80。此結構域抗體凍乾物可首先在5 mL無菌水中重構且隨後用無菌水或另一醫藥上可接受之稀釋劑稀釋，以製備包含20 mg/mL、5 mg/mL及1 mg/mL結構域抗體之醫藥組合物。
結構域抗體可用於治療鑑別為患有牛皮癬之人類患者。特定而言，結構域抗體可用於治療鑑別為患有具有一或多個斑塊區域之慢性輕度、中度或嚴重穩定斑塊型牛皮癬之人類患者。根據National Psoriasis Foundation，輕度斑塊型牛皮癬影響小於3%之人類患者體表面積，中度斑塊型牛皮癬影響3%與10%之間之人類患者體表面積，且嚴重牛皮癬影響超過10%之人類患者體表面積。例如，參見Krajacic,6(5)增刊6,Biotechnology Healthcare，2009年12月及National Psoriasis Foundation,About Psoriasis：Statistics。作參照點，人們認為人類患者手掌佔患者體表 面積之約1%。作為替代方案，牛皮癬之嚴重程度亦可根據Psoriasis Area and Severity Index藉助使用由Fredrikson闡述之基於以下4個標準之分級系統確定：發紅、厚度、鱗狀物及所涉及面積之量。例如，參見Fredrickson,157 Dermatologica 238(1978)。當首先投與結構域抗體時，欲治療牛皮癬斑塊可具有至少200 μm之相當浸潤厚度，如藉由超音波掃描量測所評價。人類患者可係患有在上肢、大腿或軀幹上具有穩定斑塊之慢性斑塊型牛皮癬的男性或女性個體。該等人類患者可係約18至約70歲。人類患者亦可係14至26歲以及14或更大歲。
可藉由注射至牛皮癬斑塊中將結構域抗體投與該等人類患者。特定而言，100 μL包含20 mg/mL、5 mg/mL或1 mg/mL結構域抗體之醫藥組合物可藉由以靶向斑塊中之表皮及淺層真皮之深度注射至牛皮癬斑塊來投與。
可根據治療方案將結構域抗體投與具有牛皮癬斑塊之人類患者，其中在28天治療時段期間每週1次將100 μL包含5 mg/mL結構域抗體之醫藥組合物注射至牛皮癬斑塊中。在此一治療方案中，將向患者投與醫藥組合物4次且在每一投與期間將接受0.5 mg結構域抗體，以使得在28天治療時段期間接受2 mg結構域抗體之總劑量。例如，此意指在跨越28天中之治療方案中，患者將在第1天接受第一100 μL含有0.5 mg結構域抗體之注射劑，在第8天接受第二此注射劑，在第15天接受第三此注射劑，且在第22天接受第四此注射劑。此治療方案中之結構域抗體劑量(例如，100 μL含有0.5 mg結構域抗體之注射劑)係基於mg/患者投與。
亦可根據治療方案將結構域抗體投與具有牛皮癬斑塊之人類患者，其中在28天治療時段期間每週1次將100 μL包含20 mg/mL結構域抗體之醫藥組合物注射至牛皮癬斑塊中。在此一治療方案中，將向患者投與醫藥組合物4次且在每一投與期間將接受2 mg結構域抗體，以使得在28天治療時段期間接受8 mg結構域抗體之總劑量。例如，此意指在跨越28天中之治療方案中，患者將在第1天接受第一100 μL含有2 mg結構域抗體之注射劑，在第8天接受第二此注射劑，在第15天接受第三此注射劑，且在第22天接受第四此注射劑。此治療方案中之結構域抗體劑量(例如，100 μL含有2 mg結構域抗體之注射劑)係基於mg/患者投與。
亦可根據治療方案將結構域抗體投與具有牛皮癬斑塊之人類患者，其中在28天治療時段期間每週2次將100 μL包含5 mg/mL結構域抗體之醫藥組合物注射至牛皮癬斑塊中。在此一治療方案中，將向患者投與醫藥組合物8次且在每一投與期間將接受0.5 mg結構域抗體，以使得在28天治療時段期間接受4 mg結構域抗體之總劑量。例如，此意指在跨越28天之治療方案中，患者將在第1天接受第一100 μL含有0.5 mg結構域抗體之注射劑，在第4天接受第二此注射劑，在第8天接受第三此注射劑，在第11天接受第四此注射劑，在第15天接受第五此注射劑，在第18天接受第六此注射劑，在第22天接受第七此注射劑，且在第25天接受第八此注射劑。此治療方案中之結構域抗體劑量(例 如，100 μL含有0.5 mg結構域抗體之注射劑)係基於mg/患者投與。
亦可根據治療方案將結構域抗體投與具有牛皮癬斑塊之人類患者，其中在28天治療時段期間每週1次將100 μL包含1 mg/mL結構域抗體之醫藥組合物注射至牛皮癬斑塊中。在此一治療方案中，將向患者投與醫藥組合物4次且在每一投與期間將接受0.1 mg結構域抗體，以使得在28天治療時段期間接受0.4 mg結構域抗體之總劑量。例如，此意指在跨越28天中之治療方案中，患者將在第1天接受第一100 μL含有0.1 mg結構域抗體之注射劑，在第8天接受第二此注射劑，在第15天接受第三此注射劑，且在第22天接受第四此注射劑。此治療方案中之結構域抗體劑量(例如，100 μL含有0.1 mg結構域抗體之注射劑)係基於mg/患者投與。
WO 2008/149148闡述測試、分離及產生未經修飾之DOM1h-131-206 dAb之方法，且此等方法適用於與ADA結合有所減少之本發明經修飾之TNFR1 dAb，例如適用於在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)，且將此發明(包括測試、分離及產生之方法)併入本文中。
在以下其他實施例1-36中，本發明亦提供：
1.一種結合(例如)靶標之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)(例如VH、VL或VHH)，其包含一或多種選自以下之修飾： (a)C末端添加、延伸或標籤(b)一或多個胺基酸框架取代，其中至少一個取代係選自以下之取代：P14A取代、P41A取代及L108A取代；且其與未經修飾之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)相比與預先存在之ADA之結合有所減少。
2.如上文1之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係選自人類VH或VL dAb或駱駝科動物VHH。
3.如1或2之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其包含具有至少一個胺基酸之C末端延伸。
4.如3之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該C末端延伸包含具有1個胺基酸至約6個胺基酸之胺基酸延伸。
5.如3或4之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該C末端延伸包含為丙胺酸之胺基酸。
6.如5之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該C末端延伸係由為丙胺酸之單一胺基酸組成。
7.如技術方案5之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸：(a)AS、(b)AST、(c)ASTK、(d)ASTKG或(e)ASTKGP。
8.如1至2中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該C末端具有選自親和力標籤、myc標籤、FLAG標籤、his-標籤之標籤、諸如PEG等化學修飾或諸如抗體Fc結構域等蛋白質結構域。
9.如6之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係VH dAb，且其進一步包含P14A框架取代。
10.如7之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係VH dAb，且其進一步包含P14A框架取代。
11.如前述技術方案中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其結合靶標，其中該靶標係選自：TNFα、TNFR1、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、白蛋白、TGFβR2。
12.如11之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其係選自鑑別為以下之以下胺基酸序列：(a)具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)；(b)具有單一丙胺酸延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 17)；(c)具有P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 18)；(d)具有ASTKG C末端延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 19)；(e)具有ASTKG C末端延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 20)。
13.如11或12之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該靶標係TNFR1且該未經修飾之dAb係選自與鑑別為以下之胺基酸100%、95%、90%、85%或80%一致之胺基酸序列：DOM1h-131-206(SEQ ID NO 1)、DOM 1h-131-511(SEQ ID NO 2)、DOM 1h-131-202(SEQ ID NO 3)。
14.如任一前述技術方案之單一免疫球蛋白可變結構域 (dAb)，其中該dAb係以與其他分子之融合物或偶聯物形式存在。
15.如14之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係以與一或多種選自以下之其他分子之融合物或偶聯物形式存在：另一dAb、蛋白質或多肽或其片段(例如其延長半衰期或係另一治療性或活性分子)、PEG分子、抗體或其片段(例如Fc區)。
16.如15之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係以mAbdAb分子形式存在。
17.一種醫藥組合物，其包含如前述中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)與醫藥上或生理學上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑之組合。
18.如17之醫藥組合物，其進一步包含治療劑或活性劑。
19.如17或18之醫藥組合物，其包含抗TNFR1 dAb。
20.如19之醫藥組合物，其包含如12至13中任一項之抗TNFR1 dAb。
21.如技術方案1至16中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)或如17至20中任一項之組合物，其用於醫療。
22.一種治療或預防至少一種選自發炎疾病或病症或呼吸道或肺部疾病或病症之疾病或病症或病況之方法，其係藉由向個體投與治療或預防有效量之如19至20中任一項之組合物或如11至13之dAb來達成。
23.如22之方法，其中該至少一種疾病或病症或病況係選自：牛皮癬、關節炎、多發性硬化、發炎腸病(例如克隆氏病及潰瘍性結腸炎)；或例如選自(例如)以下之呼吸道或肺部疾病或病症：慢性阻塞性肺病、慢性枝氣管炎、慢性阻塞性枝氣管炎及肺氣腫、肺部發炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、過敏性肺炎、伴有嗜酸性球增多症之肺浸潤、環境性肺病、肺炎、枝氣管擴張症、囊性纖維化、間質性肺病、原發性肺動脈高血壓、肺血栓栓塞、胸膜病症、縱隔病症、隔膜病症、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸中止症、急性呼吸窘迫症候群、間皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏症、石綿沉著病、麴黴腫、麴黴菌病、枝氣管擴張症、慢性枝氣管炎、肺氣腫、嗜酸性球性肺炎、特發性肺纖維化、侵襲性肺炎鏈球菌感染症、流行性感冒、非結核分枝桿菌病、胸膜積液、肺塵埃沈著病、肺囊蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著病、肺炭疽、肺水腫、肺栓塞、肺部發炎、肺組織球增多病X、肺高血壓、肺奴卡菌病、肺結核、肺靜脈閉塞性疾病、類風濕肺病、類肉瘤病及韋格納肉芽腫及急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫症候群(ARDS)；及其併發症。
24.如23之方法，其中該疾病係ALI，且該dAb係如技術方案13之dAb，或該醫藥組合物包含如技術方案13 之dAb。
25.如22至24中任一項之方法，其中該組合物或dAb係藉由皮下、靜脈內或肌內注射遞送至個體。
26.如22至24中任一項之方法，其中該組合物或dAb係經由以下途徑遞送至個體：非經腸、口、直腸、穿黏膜、眼部、肺或GI道遞送。
27.一種可注射、經口、可吸入或可霧化調配物，其包含如1至20中任一項之組合物或dAb。
28.一種持續釋放調配物，其包含如技術方案1至20中任一項之組合物。
29.一種冷凍乾燥調配物，其包含如1至20中任一項之組合物。
30.一種遞送裝置，其包含如1至20中任一項之組合物。
31.一種遞送裝置，其包含如1至20中任一項之組合物，其中該裝置係霧化器或吸入器。
32.一種經分離或重組核酸，其編碼如1至16中任一項之dAb。
33.一種經分離或重組核酸，其編碼如12至13中任一項之dAb。
34.一種載體，其包含如32或33之核酸。
35.一種宿主細胞，其包含如技術方案32或33之核酸或如34之載體。
36.一種產生包含如1至16中任一項之dAb之多肽的方 法，其中該方法包含在適於表現該核酸或載體之條件下維持如35之宿主細胞，藉此產生多肽。
37.如1至16之dAb，其中該dAb以為該未經修飾之dAb之KD之150%或更高(例如200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%或更高)的KD結合ADA。
本發明亦提供以下列示為1b至25b之實施例：
1b.一種單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其不結合(或結合有所減少)人類血清中之預先存在之人類ADA，其中該dAb上與該ADA結合之表位經遮蔽。
2b.如上文1b之dAb，其與ADA結合之KD係表位未經遮蔽之等效序列之KD的150%或更高(例如200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%或更高)。
3b.如1b至2b之dAb，其中該表位係藉由以下遮蔽：a.將化學實體添加至C末端；及/或b.一或多個框架取代；及/或c.一或多個缺失。
4b.如3b之dAb，其中該化學實體包含一或多個胺基酸、C末端標籤或諸如聚乙二醇化或醯胺化等化學修飾。
5b.如3b或4b之dAb，其中(a)、(b)及/或(c)對該表位具有直接構象效應，對該表位具有間接構象效應，及/或在空間上阻礙該表位。
6b.如先前中任一項之dAb，其中該表位： d.與該C末端處之Kabat殘基113重疊；及/或e.與Kabat殘基14、41、108、110、112及113重疊；及/或f.包含該等表面暴露之Kabat殘基14、41、108、110、112及113以及該等位置之5埃內之任一其他殘基；及/或g.包含框架4、框架1及2之β鏈間之環。
7b.如任一前述實施例1b至6b之dAb，其與人類生殖系框架序列相比在Kabat位置14、41、108、110或112處包含一或多個胺基酸取代。
8b.一種人類化單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其在一或多個以下殘基處具有非人類序列：Kabat殘基14、41、108、110及/或112。
9b.如7b或8b之dAb，其中該一或多個位置處之該等胺基酸殘基係丙胺酸殘基。
10b.如前述實施例1b至9b中任一實施例之dAb，其中該遮蔽係藉由將胺基酸延伸提供至該dAb之該C末端來達成。
11b.如10b之dAb，其中該延伸係介於1個胺基酸與8個胺基酸之間。
12b.如10b或11b之dAb，其中該延伸包含丙胺酸殘基。
13b.如12b之dAb，其中該延伸係由單一丙胺酸殘基組成。
14b.如12b之dAb，其中該延伸係選自由以下組成之群：AS、AST、ASTK、ASTKG及ASTKGP。
15b.如1b至14b中任一項之dAb，其中該dAb係VH或VL或VHH dAb。
16b.如1b至15b中任一項之dAb，其中該dAb所結合之靶標係TNFα、TNFR1、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、白蛋白及TGFβR2。
17b.如16b之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其係選自鑑別為以下之以下胺基酸序列：(a)具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)；(b)具有單一丙胺酸延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 17)；(c)具有P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 18)；(d)具有ASTKG C末端延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 19)；及(e)具有ASTKG C末端延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 20)。
18b.如16b或17b之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該靶標係TNFR1且該未經修飾之dAb係選自與鑑別為以下之胺基酸100%、95%、90%、85%或80%一致之序列：DOM1h-131-206(SEQ ID NO 1)、DOM 1h-131-511(SEQ ID NO 2)、DOM 1h-131-202(SEQ ID NO 3)。
19b.一種遮蔽單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)上之表位之方法，該表位結合人類血清中之預先存在之人類ADA，該方法包含修飾該表位之步驟。
20b.一種減少單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)與人類血清中預先存在之人類ADA結合之方法，其包含遮蔽該dAb上與ADA結合之表位。
21b.如19b或20b之方法，其中該遮蔽使與ADA之減少結合減少，從而使得該包含該經遮蔽表位之dAb之KD係表位未經遮蔽之dAb之KD的150%或更高。
22b.如19b至21b中任一項之方法，其中該表位係藉由以下遮蔽：h.將化學實體添加至C末端；及/或i.一或多個框架取代；及/或j.一或多個缺失。
23b.如22b之方法，其中該化學實體包含一或多個胺基酸、C末端標籤或諸如聚乙二醇化或醯胺化等化學修飾。
24b.如22b或23b之方法，其中(a)、(b)及/或(c)對該表位具有直接構象效應，對該表位具有間接構象效應，及/或在空間上阻礙該表位。
25b.如上文19b至24b中任一項之方法，其中該表位：k.與該C末端處之Kabat殘基113重疊；l.與kabat殘基14、41、108、110、112及113重疊；及/或m.包含該等表面暴露之Kabat殘基14、41、108、110、112及113以及此表面之5埃內之任一其他殘基；及/或n.包含框架4、框架1及2之β鏈間之環。
在以下其他實施例1c至15c中，本發明提供：
1c.一種人類化VHH單一免疫球蛋白可變結構域，其在Kabat殘基14及/或108處保持一或多個駱駝生殖系殘基。
2c.如上文1c之單一免疫球蛋白可變結構域，其與人類血清中之人類ADA結合之KD係殘基14及/或108已經人類化之等效序列之KD的150%或更高(例如200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%或更高)。
3c.如1c或2c之單一免疫球蛋白可變結構域，其中一或多個C末端胺基酸已經缺失。
4c.如3c之單一免疫球蛋白可變結構域，其中一個C末端胺基酸已經缺失。
5c.如1c或2c之單一免疫球蛋白可變結構域，其包含C末端添加、延伸或標籤。
6c.如5c之單一免疫球蛋白可變結構域，其中該添加、延伸或標籤係選自由以下組成之群：一或多個胺基酸延伸、C末端標籤或諸如聚乙二醇化或醯胺化等化學修飾。
7c.如5c或6c之單一免疫球蛋白可變結構域，其中該延伸係介於1個胺基酸與8個胺基酸之間。
8c.如7c之單一免疫球蛋白可變結構域，其中該延伸包含丙胺酸殘基。
9c.如8c之單一免疫球蛋白可變結構域，其中該延伸係由單一丙胺酸殘基組成。
10c.如8c之單一免疫球蛋白可變結構，其中該延伸係 選自由以下組成之群：AS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP、ASTKA、ASTKAP及ASTKAPS。
11c.如前述實施例1c至10c中任一實施例之單一免疫球蛋白可變結構域，其另外在一或多個以下殘基處包含非人類殘基：Kabat殘基41、110及/或112。
12c.如前述實施例中任一實施例之單一免疫球蛋白可變結構域，其中該dAb所結合之靶標係TNFα、TNFR1、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、白蛋白及TGFβR2。
13c.一種人類化駱駝科動物VHH單一免疫球蛋白可變結構域之方法，其包含在Kabat殘基14及/或108處保留一或多個駱駝生殖系殘基。
14c.一種減少駱駝科動物VHH單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)與預先存在之ADA結合之方法，其包含在Kabat殘基14及/或108處保留駱駝生殖系殘基。
15c.如13c或14c之方法，其中該保留使與ADA之結合減少，從而使得在位置14及/或108處包含該等駱駝科動物殘基之VHH與人類血清中人類ADA結合之KD係該等殘基已經人類化之等效序列之VHH之KD的150%或更高。
應注意，本文所用術語dAb係註冊商標。
實例： 實例1：具有針對命名為DOM1H-131-206之dAb之預先存在之ADA之健康個體的頻率 DOM1H-131-206(VH)ADA分析程序
以8：1之生物素莫耳激發比率將DOM1H-131-206(SEQ ID NO 1)生物素化。標記後，對生物素化DOM1H-131-206(SEQ ID NO 1)實施緩衝液交換且將其儲存於含有14 mM磷酸鈉、8.4%蔗糖、0.35%甘胺酸、0.014%聚山梨醇酯80(pH 7.4)之調配物緩衝液中。
以5：1之Sulfo-Tag莫耳激發比率對DOM1H-131-206實施釕標記。標記後，對Sulfo-TAG標記之DOM1H-131-206實施緩衝液交換且將其儲存於含有14 mM磷酸鈉、8.4%蔗糖、0.35%甘胺酸、0.014%聚山梨醇酯80(pH 7.4)之調配物緩衝液中。
抗藥物抗體(ADA)分析係在MSDTM ECL(電化學發光)技術平臺上實施之橋接分析。MSDTM技術(購自Meso scale Discovery,Matyland,USA)利用釕金屬螯合物作為ECL標記，並結合置於塗佈有抗生蛋白鏈菌素之微量滴定板之孔內之碳電極。用於該分析中之經結合Sulfo-TagTM產生當藉由儀器(Meso Scale Discovery SectorTM成像儀6000)施加電壓時觸發之化學發光信號。在ECLTM單元中量測所得發光信號。信號強度與試樣中所檢測抗體之量成正比。在每一分析板上運行陰性(正常人類血清；NHS)及陽性(PC；正常人類血清中摻加之小鼠抗DOM1H-131-206個體基因型抗體)對照試樣(QC)。
分析程序之匯總闡述如下：
1.在室溫下(RT)用150 μL/孔存於PBS中之封阻酪蛋白(1%)將MSDTM抗生蛋白鏈菌素板封阻1至2小時。去 除封阻劑，且不進行洗滌。
2.在1小時預培育後，將存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白)中之含有0.1 μg/mL生物素化DOM1H-131-206(藥物)、0.1 μg/mL釕化(「Sulfo-Tag」TM)DOM1H-131-206(藥物)及2%血清試樣之均質混合物轉移至MSDTM板中且在RT下培育1小時±5分鐘。
3.然後用PBST將MSD板洗滌3次。
4.添加150 μL/孔讀取緩衝液且讀取板。
在此特異性免疫分析驗證期間，在分析中篩選一組60名健康人類供體血清試樣之背景反應性。已測定，約45%來自該等個體之血清試樣具有能夠結合DOM1H-131-206之可檢測VH反應性自體抗體(主要為IgG同種型)(圖1中之結果)。
在此分析中，未經標記之游離DOM1H-131-206競爭ADA結合，從而降低信號強度(高信號抑制%)。使用此「確認分析」來確定DOM1H-131-206之經修飾之形式及基於其他抗體之分子是否可與DOM1H-131-206競爭ADA結合。
實例2：對DOM1h-131-206之VH框架之胺基酸取代
在上文所述DOM1H-131-206 ADA分析中，未經標記之游離DOM1H-131-206競爭ADA結合並降低信號強度。因此，使用此「確認分析」來確定測試材料(例如DOM1H-131-206、DOM1H-131-206之經修飾之形式或基於其他抗體之分子(「試材料」)是否亦可抑制ADA與DOM1H-131-206結合。
為研究是否可減少ADA與VH框架結合，藉由標準定點誘變技術對DOM1h-131-206之框架進行多個胺基酸取代及其他修飾。
使用以下方法分析具有取代之分子(測試材料)(確認分析)：
DOM1H-131-206確認分析程序(其可用於篩選VH dAb與ADA之結合)：
1.在RT下將10 μg/mL DOM1H-131-206或其他測試材料(例如經修飾之dAb)與存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白)中之4% ADA陽性人類血清一起預先培育1小時±5分鐘。
2.在室溫下(RT)用150 μL/孔存於PBS中之封阻酪蛋白(1%)將MSDTM抗生蛋白鏈菌素板封阻1至2小時。去除封阻劑，不進行洗滌。
3.在微量滴定分析板中，將含有ADA陽性人類血清試樣及10 μg/mL測試材料(例如經修飾之dAb)之試樣添加至生物素化DOM1H-131-206(SEQ ID NO 1)(藥物)與釕化(「Sulfo-Tag」TM)DOM1H-131-206(SEQ ID NO 1)(藥物)存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白)中之均質混合物中，以使得最終濃度係2% ADA陽性人類血清、0.1 μg/mL生物素化DOM1H-131-206(SEQ ID NO 1)(藥物)及0.1 μg/mL釕化(「Sulfo-Tag」TM)DOM1H-131-206(SEQ ID NO 1)(藥物)，且在RT下培育1小時±5分鐘。
4.在1小時培育後，將分析試樣轉移至經封阻MSD板中，且在RT下將該板在黑暗中培育1小時±5分鐘。
5.然後用PBST將MSDTM板洗滌3次。
6.添加150 μL/孔讀取緩衝液且讀取板。
對於具有不同親代純系之每一實驗(結果顯示於表1中)而言，在上文確認分析(在實例2中)中測試來自10名ADA陽性個體之人類血清試樣：結果於表1b中以(總體)平均信號抑制%亦及具有ADA結合之個體%二者顯示。信號抑制%愈低，能夠結合ADA之經修飾之化合物愈少。以信號抑制%為約40.5%之截止值顯示可忽略ADA結合。
使用確認分析確定，以下位置處之胺基酸取代顯著減少預先存在之ADA與DOM1H-131-206之結合：P14A、P41A、L108Q，同時保留抗原結合(即與TNFR1結合)效能，如使用實例5c中顯示之TNFR1親和力分析程序所測定(結果顯示於表1中)。
實例3：DOM1H-131-206之VH框架之胺基酸延伸
為確定VH框架之C末端修飾是否可減少ADA結合，藉由標準定點誘變技術對框架進行多個C末端修飾。使用上文實例2中所述「確認分析」來分析具有取代之分子(測試材料)且結果顯示於下表1中。
DOM1H-131-206或其他測試分子之C末端延伸亦顯著減少預先存在之ADA結合(表1、表2)。亦使用上文實例2中 所述「確認分析」獲得顯示於表2中之結果。此可例示為延伸A、AS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP、AAA及所有經測試更長延伸。未經人類化之VHH純系通常具有較低與ADA之結合程度。
抑制%=ADA結合(當在ADA橋接分析(確認分析)中給定蛋白質受到競爭時之信號抑制%)。
抑制%=ADA結合(當在ADA橋接分析中給定蛋白質受到競爭時之信號抑制%)。
FLAG標籤之序列可參見Nature Biotechnology 1988，第16卷，第1204-1210卷。
應注意，以(平均)40%信號抑制(或小於40%信號抑制)顯示可忽略ADA結合。
實例4：DOM1H-131-206之VH框架之胺基酸取代與C末端延伸的組合
為確定VH框架之C末端之胺基酸取代與修飾的組合是否可減少ADA結合，藉由標準定點誘變技術對框架進行多個C末端修飾及/或胺基酸取代。使用上文實例2中所述「確認分析」來分析具有取代之分子。結果顯示於下表3中：
實例5a及5b：DOM1H-131-206 C末端延伸之親和力
實施其他研究以確定對DOM1H-131-206之減少預先存在之ADA結合的修飾是否導致此dAb與其靶標人類TNFR1之親和力的任何變化。
實例5a：藉由ELISA評價TNFR1與DOM1H-131-206突變體之結合
藉由ELISA測定DOM 1H-131-206之經修飾之變體(測試dAb)結合人類TNFR1之能力。吾人觀察到，顯示減少預先存在之ADA結合之框架突變及C末端修飾通常與親代 DOM1H-131-206 dAb相比具有與TNFR1之相當結合。只是具有C末端延伸ASTKGP之DOM1H-131-206之TNFR1結合EC50係親代dAb DOM1H-131-206之約1/5。
TNFR1 ELISA結合分析方案：
1.以0.1 μg/mL之最終濃度將存於碳酸鹽-碳酸氯鹽緩衝液(pH 9.4)(Pierce)中之重組人類TNFR1-Fc(R&D Systems)添加至96孔ELISA板中。
2.在4℃下過夜培育後，藉由用洗滌緩衝液(洗滌緩衝液-0.1% Tween-20/PBS)洗滌3次且用PBS洗滌3次來去除過量TNFR1：Fc。
3.在室溫下用1%存於PBS中之BSA將板封阻1小時。藉由如上文洗滌去除封阻物，且隨後將稀釋於分析稀釋劑(0.1% BSA+0.05% Tween-20/PBS)中之測試dAb試樣添加至板中並在室溫下培育1小時。
4.在如上文洗滌後，以1：1000稀釋度添加存於分析稀釋劑中之多株兔抗人類Ig(具有Vh特異性)且在室溫下培育1小時。
5.在如上文洗滌，以1：10,000稀釋度添加存於分析稀釋劑中之小鼠抗兔HRP偶聯抗體且在室溫下培育1小時。
6.在如上文洗滌後，將100 μL SureBlue TMB受質添加至每一孔中。在顯示足夠藍色後，用100 μL 1 M HCl終止酶促反應且在450 nm下讀取板。
7.藉由繪製濃度對吸光度值之曲線來準備每一測試 dAb之劑量反應曲線。使用Graphpad Prism測定dAb與TNFR1結合之EC50值。
實例5b：使用Biacore TM 之TNFR1親和力分析程序
藉由表面電漿共振使用BiacoreTM T100測定具有C末端A延伸之經修飾之DOM1H-131-206 dAb的親和力。將抗人類IgG抗體固定至CM4晶片，且以約60相對單位之量將人類TNFR1：Fc捕獲於此表面上。將在緩衝液中稀釋至最終濃度為25 nM至0.024 nM(在4倍稀釋範圍中)之測試材料注射於TNFR1：Fc上。使用0 nM測試材料曲線雙重參照結合曲線產生，且將數據擬合成1：1結合模型以產生動力學數據。以相同方式測定測試材料與石蟹獼猴TNFR1之結合。結合動力學於下文顯示於下表4d中。
總之，經修飾(即具有C末端A添加)及未經修飾之TNFR1dAb之結合動力學類似。
(上述數據未計算誤差)
實例6：DOM1H-131-206 C末端延伸之藥物動力學
實施其他研究以確定對DOM1H-131-206之減少預先存在之ADA結合的修飾是否導致此dAb之藥物動力學的任何變化。
藥物動力學程序
在石蟹獼猴中測定DOM 1H-131-206及具有C末端丙胺酸延伸之DOM 1H-131-206之全身性暴露。藉由30分鐘靜脈內輸注將測試材料給與5只石蟹獼猴之單獨群組。在給藥後至多48小時收集血漿試樣並藉由免疫分析測定兩種測試材料之濃度。簡言之，將對測試材料具有特異性之生物素化抗體添加至經抗生蛋白鏈菌素塗佈之96孔微量滴定板中，此後，添加猴血漿試樣。添加經地穀新配質(Digoxiginin) 標記之人類TNFR1：Fc，此後添加辣根過氧化物酶偶聯抗地穀新配質抗體。最後，添加TMB受質(購自R+D systems)且藉由自測試材料標準曲線回算比色信號來測定測試材料之量。
當在石蟹獼猴中靜脈內輸注後比較DOM-1H131-206與DOM-1H131-206+A時，未觀察到性別平均全身性暴露參數之顯著(>2倍)變化。吾人推斷，藉由添加C末端延伸(+A)對DOM1H-131-206之修飾不會影響dAb之藥物動力學(顯示於表5中)。
實例7a：DOM1H-131-206變體之表現
為確定對VH框架之減少預先存在之ADA結合之修飾是否對抗TNFR1 dAb之表現具有影響，比較在1升發酵容器中生長後一組抗TNFR1 DOM1H 131-206 dAb之經修飾之變體與親代純系的產率。測試dAb納入具有或不具有框架取代(P14A)之C末端延伸(+A或+ASTKG)。使用與未經修飾之DOM1H 131-206(SEQ ID NO 1)相同之微生物表現載體(pave011(Avecia))在相同大腸桿菌菌株中表現測試dAb。 在小規模表現量(1 L)下，具有C末端延伸+A或+ASTKG之dAb總體產率與未經修飾之親代純系類似。具有P14A取代及C末端延伸(+A或+ASTKG)之dAb之產率與未經修飾之親代純系相比有所降低(表6a)。
表現程序
藉由用一小瓶在微生物表現載體中表現dAb構築體之大腸桿菌細胞接種100 ml振盪燒瓶來完成「種籽擴充」階段。
在約10小時生長後，使用種瓶來接種1 L發酵槽。產生過程係由3個階段(即分批階段、進料分批階段及誘導階段)組成。初始分批階段持續約13小時，在此期間，培養物在37℃(最後4小時逐步降至30℃)下指數生長直至一級碳源甘油耗盡。在甘油耗盡時，溶解氧(DO)激增並開始營養素進料(進料分批階段)。在開始營養素進料後約5小時(OD600為75)，用IPTG誘導培養物(誘導階段)且在該過程之此階段期間，產物產生並釋放至培養基中。在誘導後約48小時終止分批且藉由HPLC量化上清液中dAb之量。
此實驗之結論如下：
1)DOM1H-131-206 +A、DOM1H-131-206 +ASTKG及野生型突變體展現極佳dAb表現。
最高滴定度係約3000 mg/L。
2)DOM1H-131-206 P14 +A及DOM1H-131-206 p14 +ASTKG突變體不能在此過程中表現dAb。
3)一般而言，DOM1H-131-206 +A及DOM1H-131-206 +ASTKG與野生型在dAb表現量方面相當。
實例7b：具有C末端丙胺酸之DOM1H-131-206之穩定性
使用用於DOM 1H-131-206之經驗證免疫分析(下文所述)測定DOM 1H-131-206 +A之C末端丙胺酸延伸在所量測人類血清、肺均質物或肝均質物中之穩定性，該分析檢測DOM 1H-131-206，但與DOM 1H-131-206+A之交叉反應性極弱。此乃因以下事實：檢測抗體M2.3G10.1G06強有力地結合DOM 1H-131-206，但較弱地結合DOM 1H-131-206 +A。分析模式使用人類TNFR1：Fc作為捕獲試劑且因此視為對完整功能dAb具有特異性。
觀察到，在此分析中，摻加有2 μg/mL DOM 1H-131-206 +A之血漿之讀數為約6.4 ng/mL，而摻加有2 μg/mL GSK2862277之緩衝液之讀數為11.3 ng/mL。因此，估計DOM 1H-131-206 +A在DOM 1H-131-206分析中之交叉反應性介於0.25%與0.5%之間。
為研究轉變，向人類全血、人類肺均質物(10 mg蛋白質/ml)或人類肝均質物(10 mg蛋白質/ml)中摻加1 μg/ml DOM 1H-131-206、DOM 1H-131-206 +A或緩衝液(未添加藥物)。在培育0 h、3 h、6 h或24 h後，藉由離心收集血漿/上清液並將試樣冷凍，隨後使用經驗證免疫分析(工作範圍為0.1 ng/ml至10 ng/ml)分析DOM 1H-131-206。
經24 h，在任一基質中皆無DOM 1H-131-206 +A顯著轉變成DOM 1H-131-206之跡象，此原本已藉由免疫分析中信號之增加(由於形成DOM 1H-131-206)證明。此表明，額外C末端丙胺酸不易於快速蛋白水解裂解。
DOM 11H-131-206驗證免疫分析之方案
將生物素化抗VH mAb(M2.3G10.1G06)稀釋於分析緩衝液(10 mM Tris,150 mM NaCl,0.1% BSA,0.1% Tween20,pH 7.5)中並以10 ng/ml之最終濃度將100 μL添加至經中性鏈親和素(Neutravidin)塗佈之板(Pierce)之每一孔中。將該板密封且在37℃下培育1小時。
使用板洗滌器用300 μL洗滌緩衝液(10 mM Tris,150 mM NaCl,0.1% Tween 20,pH 7.5)將微量滴定板洗滌5次。
每孔添加100 μL稀釋於基質中之標準物及試樣且將板密封並在37℃及恆定振盪下培育約2小時。
用300 μL洗滌緩衝液將微量滴定板洗滌5次。
每孔添加100 μL經地穀新配質標記之hTNFR1：Fc(1：40,000)且將板密封並在37℃下及恆定振盪下培育約2小時。
用300 μL洗滌緩衝液將微量滴定板洗滌5次。
每孔添加100 μL經HRP標記之小鼠抗地穀新配質抗體 (Abcam)(1：20,000)且將經無菌密封帶密封之溶液及板密封，且在37℃及恆定振盪下培育約2小時。
用300 μL洗滌緩衝液將微量滴定板洗滌5次。
每孔添加100 μL TMB受質(Thermo)且在室溫及恆定振盪下將板培育約5分鐘。
每孔添加100 μL TMB受質終止溶液(Sigma)，且使用板讀取器讀取每一孔在450 nm下之吸光度。使用SMS2000將標準曲線擬合成1/×加權4參數邏輯演算法且自該曲線內插未知試樣。
實例7c：具有C末端丙胺酸延伸(+A)之DOM1H-131-206抑制TNFR1信號轉導之能力：
TNFα經由NFκB途徑發送信號且導致包括IL-8在內之各種細胞介素分泌。在未受刺激之細胞中，IL-8 mRNA快速降解。然而，在TNFα存在下，NFκB途徑之活化使IL-8 mRNA穩定。此穩定使mRNA增加並誘導IL-8分泌。因此，在此分析中，誘導IL-8分泌係用於確定添加C末端延伸是否影響DOM1H-131-206或DOM1H-131-206+A(即C末端丙胺酸延伸)抑制TNFR1信號轉導之能力。在人類及石蟹獼猴細胞系亦及人類及石蟹獼猴全血中實施該等研究。 對IC50值之比較指示，在人類或石蟹獼猴細胞中，DOM1H-131-206之減少預先存在之ADA結合之C末端延伸不會負面地影響DOM1H-131-206抑制經由TNFR1信號轉導之能力(表6b)。
用以測定人類肺纖維母細胞中由TNFα誘導之IL-8之抑 制的方案
使用人類肺纖維母細胞MRC-5細胞(ATCC)測定DOM1H-131-206或DOM1H-131-206+A防止人類TNFα結合人類TNFR1並抑制IL-8分泌之能力。將MRC-5細胞與測試試樣一起培育1小時，此後添加TNFα(220 pg/ml)。在37℃及5% CO2下培育24小時後，收穫上清液且將其儲存在-20℃下直至根據用於組織培養試樣之製造商方案實施針對IL-8之MSDTM分析。將上清液以1：12稀釋於所供應校準稀釋劑中，之後進行分析。在GraphPad Prism中實施曲線擬合以測定IC50。
用以測定A549細胞中由TNFα誘導之IL-8之抑制的方案
以2×104細胞/孔之密度將A549細胞接種至96孔板中且在37℃及5% CO2下培育過夜以允許附著。然後在0.01 nM至1000 nM範圍中之不同濃度之DOM1H-131-206或DOM1H-131-206+A存在下將細胞培育1小時。每一濃度以一式兩份孔測試。在37℃及5% CO2下培育24小時後，收穫上清液且將其儲存在-20℃下直至根據用於組織培養試樣之製造商方案實施針對IL-8之MSDTM分析。將上清液以1：5稀釋於所供應校準稀釋劑中，之後進行分析。使用XLFit計算曲線擬合及IC50值。
用以測定CYNOM-K1細胞中由TNFα誘導之IL-8之抑制的方案
在以100 nM開始之不同濃度之DOM1H-131-206或DOM1H-131-206+A存在下將CYNOM-K1細胞培育1小時。 此後用最終濃度為1 ng/ml之TNFα刺激。在37℃及5% CO2下培育24小時後，收穫上清液且將其儲存在-20℃下直至根據用於組織培養試樣之製造商方案實施針對IL-8之MSDTM分析。將上清液以1：12稀釋於所供應校準稀釋劑中，之後進行分析。在GraphPad Prism中實施曲線擬合以測定IC50。
用以測定人類全血中由TNFα誘導之IL-8之抑制的方案
將來自健康志願者供體之血液(獲得符合UK Human Tissue Act之適當同意)收集至肝素鈉中。藉由將1% BSA添加至RPMI-1640培養基(不含酚紅)中來製備分析培養基。將DOM1H-131-206或DOM1H-131-206+A及VH虛擬dAb稀釋於96孔板中之分析培養基中，以使得在添加血液後之最終濃度為800 nM，且以1：2連續稀釋至0.01 nM。每孔添加130 μl血液且將板培育1小時(37℃，5% CO2)以允許結合TNFR1。然後用10 μl稀釋於分析培養基中以使得最終濃度係10 ng/ml之TNFα刺激血液試樣。以一式兩份測試每一條件。再培育(37℃，5% CO2)24小時後，每孔添加110 μl PBS以增加試樣之體積，隨後將該等試樣在板振盪器上以500 rpm攪動10分鐘且以1500 rpm離心5分鐘。將血漿轉移至新板中並儲存在-80℃下直至根據用於血清及血漿試樣之製造商方案實施IL-8 MSDTM分析。使用XLFit計算曲線擬合及IC50值。
用以測定來自石蟹獼猴之全血中由LPS誘導之IL-8之抑制的方案
將12 ml來自4只石蟹獼猴之血液收集至肝素鈉中。藉由 將1% BSA添加至RPMI-1640培養基(不含酚紅)中來製備分析培養基。將DOM1H-131-206或DOM1H-131-206+A及VH虛擬dAb於96孔板中之分析培養基中稀釋至15×最終濃度。每一濃度以一式三份測試。每孔添加130 μl血液且將板培育1小時(37℃，5% CO2)，隨後用10 μl稀釋於分析培養基中以使得最終濃度為94 ng/ml之LPS刺激。然後將板再培育24 hr(37℃，5% CO2)。在培育後，每孔添加110 μl PBS以增加試樣之體積，隨後將該等試樣在板振盪器上以500 rpm攪動10分鐘且以2000 rpm離心5分鐘。將血漿轉移至新板中並儲存在-80℃下直至使用針對人類IL-8之MSDTM分析量測IL-8，該分析係根據用於血清及血漿試樣之製造商方案實施。在該分析中，血漿未經稀釋。使用XLFit計算曲線擬合及IC50值。
實例7d：DOM1h-131-206結構域抗體用於治療牛皮癬之用途
在該等研究中，利用DOM1h-131-206結構域抗體(具有SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列)以及此結構域抗體之齧齒動物直系同源物。使用利用該等分子獲得之數據來選擇欲用於治療欲投與以下藥物之人類患者之牛皮癬及牛皮癬斑塊的本文所述劑量及治療方案：DOM1h-131-206(具有SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列)或具有末端丙胺酸之DOM1h-131-206 ADA固定分子(具有SEQ ID NO：16中所示之胺基酸序列)或包含任一ADA固定物(即減少dAb與ADA結合之任何修飾)之DOM1h-131-206 ADA固定分子，如本文所揭示。
例如，源自石蟹獼猴活體內研究之藥物動力學顯示，DOM1h-131-206結構域抗體(具有SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列)之血漿清除速率係2.4 mL/min/kg，此接近該等猴之腎小球濾過速率(GFR)且產生約3小時之消除半衰期。此結構域抗體之分佈體積係0.26 L/kg，此約等於血管外體積且表明於中央/血漿區室外部之分佈。當將DOM1h-131-206結構域抗體投與血管外區室中時(例如當吸入肺中時)，所觀察反映吸收速率限制動力學之消除半衰期僅有小的變化。
此外，在將齧齒動物直系同源物抗TNFR1 dAb(「Dom1m-15-12」)經真皮內給予小鼠後，觀察到甚至更長之吸收滯後。此可歸因於在經由真皮內途徑給藥後GFR 與吸收速率清除間之較大差異。所觀察小鼠血漿中之末端消除速率係約40分鐘，此長於在靜脈內遞送後(約20分鐘)。藉由顯示5至7小時之末端消除速率(Ke 0.1-0.14 h-1)之真皮組織PK來確證在真皮內遞送後於血漿中發現之較慢消除速率(Ke)，但估計驅使明顯延長之消除速率之劑量分數較小(0.5%)。至血漿中之真皮吸收速率(Ka)係自利用真皮內給予齧齒動物直系同源物dAb之大鼠研究界定且相對較快(Ka=4.1 h-1)，從而在給藥後約1小時觀察到Tmax。估計10%結構域抗體保留在大鼠真皮區室內，其中經假設皮膚消除速率與小鼠類似。因此，似乎在真皮內注射後，DOM1h-131-206結構域抗體分佈至皮膚(例如，真皮)中之血管化組織中，其中該抗體快速抽出至血漿中且經由腎過濾消除。經過皮膚組織之初始分佈及吸收階段係以在血漿暴露(plasma exposure)變得可量測前之吸收滯後時間反映。考慮到齧齒動物與人類皮膚間之解剖學差異，預計人類之吸收速率較長，此進而會導致DOM1h-131-206結構域抗體之血漿暴露較低/不可量測。此意指，人類血漿暴露預測係基於來自齧齒動物研究之觀察結果且因此用作人類血漿暴露之保守估計。
亦經由靜脈內輸注(至多3小時持續時間)以至多2 mg/kg將DOM1h-131-206結構域抗體(具有SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列)給予健康志願者，且在進行中之試驗中經由吸入給予健康志願者。所得藥物動力學參數通常與石蟹獼猴之臨床前數據極為一致。在靜脈內投與後，清除速率係 介於0.6 mL/min/kg與1.5 mL/min/kg之間(在人類中之GFR為約1.8 mL/min/kg)，且所得消除半衰期為5小時。約0.3 L/kg之分佈體積與血管外體積類似。在IV投與後經由枝氣管肺泡灌洗量測(肺上皮內襯流體)確認，DOM1h-131-206結構域抗體快速分佈至血管外區室中。在3小時輸注後，在肺血管外流體中之濃度係在給藥開始後5小時量測之血漿濃度的約4-14%。
已基於真皮區室及人類活體外細胞係數據內之觀察及預測暴露估計來估計在人類中之效能之預測。已使用該等活體外系統(不同複雜性及細胞類型)中之IC50範圍(8-40 ng/mL)作為真皮區室內之目標穀值濃度，且其有助於選擇治療本文所述人類患者之牛皮癬及牛皮癬斑塊之結構域抗體劑量及治療方案。例如，選擇0.5 mg之起始劑量來達成低於彼等在ADA陽性個體中所觀察到在FTIH靜脈內研究中所達成為激動之血漿暴露之血漿暴露，假設最差情形為全身性暴露。在此初始起始劑量下預計，在給藥後，TNFR1介導之信號傳導在注射位點周圍之離散區內(<2 cm2表面積)立即被抑制至90%之程度。隨時間之TNFR1抑制取決於自真皮區室遞送、保留及隨後消除之藥物量。假設為最低值(10%真皮保留及Ke 0.1-0.14 h-1，如在大鼠中)，則預計濃度將在真皮內注射0.5 mg DOM1h-131-206結構域抗體後最少3天維持在IC50(在注射/測試區內)。
為選擇結構域抗體劑量及治療方案，預測在真皮內給予 DOM1h-131-206結構域抗體後之人類血漿暴露。該等預測假設真皮內注射可達成之最大可能暴露。在具有固定吸收速率(按比例自齧齒動物真皮吸收縮放)及100%之生物利用度之人類真皮PK模型中使用來自靜脈內投與之DOM1h-131-206結構域抗體之實際人類血漿濃度-時間數據。然後檢查本文所述最大結構域劑量及治療方案(每週2 mg+每兩週0.5 mg)之人類血漿濃度-時間曲線。此顯示，所預測峰值血漿濃度在給藥後30 min內快速達到Tmax，且濃度在24小時內快速降至低於現行血漿分析量化下限(0.1 ng/mL)之濃度。預計即使使用此最大可能暴露預測，在重複給藥後血漿中仍不會有累積。然而，此預測代表最高可能血漿暴露且暴露可顯著低於預測且甚至低至血漿暴露可能不可能量測之程度。使用目標抑制濃度(基於基於活體外細胞之分析)預測，在IC90(在給藥後立即)或IC50(穀值)下，在本文所述治療方案中在皮膚中之濃度將分別在30 ng/mL至80 ng/mL或8 ng/mL至40 n/mL範圍中。
基於上文資訊，在下表6b中顯示28天內之第一劑量、最大日劑量及累積劑量之預測血漿暴露(Cmax及AUC)以及相對於臨床前安全性之安全性限度。
經14天重複給藥，基於雄性平均(第1天、第4天及第14天)暴露(Cmax及AUC(0-24h)分別為48.5 μg/mL及249 μg．h/mL)，在雄性猴(20 mg/kg/天)中之石蟹獼猴優良實驗室操作毒理學研究。
最後，使用上文自活體外研究、活體內研究及相關分析呈現之資訊來選擇用於治療人類患者之牛皮癬之結構域抗體劑量及治療方案。
根據本文所揭示治療方案投與結構域抗體可用於治療牛皮癬。可藉由利用超音波掃描量測斑塊及/或臨床評價來確認結構域抗體在(例如)特定治療方案中用於治療牛皮癬之效能。
可使用20 MHz高頻率音譜儀(DUB USB,Taberna pro Medicum,Lueneburg)實施基於超音波掃描高頻率超音之量測。可構成連續A-掃描且以皮膚剖面形式呈現於監視器上。橫向解析度可能且較佳為約200 μm且軸向解析度可能且較佳為80 μm。端視回波圖形而定，呈現表皮、真皮及皮下層之組份且可準確量測皮膚厚度。發現牛皮癬斑塊位點處之發炎性牛皮癬浸潤物呈可明顯界定之低於入口回波之無回波帶。可在投與結構域抗體之前及在投與結構域抗體之後，測定並記錄無回波牛皮癬帶之厚度。此厚度可以μm量測。在投與結構域抗體後無回波牛皮癬帶厚度減小顯示，根據(例如)本文所揭示治療方案投與結構域抗體已有效治療人類患者之牛皮癬及牛皮癬斑塊。例如，參見Bangha等人，9 Skin Pharmacol.298(1996)。
可使用5點評分來實施臨床評價，該評分係藉由在臨床中比較已注射結構域抗體之經治療牛皮癬斑塊與至少一個靠近該經治療牛皮癬斑塊之未經治療斑塊來確定。根據比較，分配以下臨床評價評分(在首先投與結構域抗體之前，藉由定義，臨床評價評分為0)：
-1=惡化
0=未變化(無效應)
1=輕微改良
2=明顯改良，但未完全癒合
3=完全癒合
因此，基於此，在根據本文所揭示治療方案投與結構域抗體後臨床評價評分增加指示治療人類患者之牛皮癬及牛 皮癬斑塊之效能。
實例8：VHH純系之單一丙胺酸延伸
使用實例2中所用確認分析(用於DOM1H-131-206)觀察ADA與VHH之結合。為確認可藉由修飾VHH序列達成ADA結合之類似抑制，測試具有如圖2(d)、(e)及(f)中所示胺基酸序列之3種VHH純系：純系VHH2(d)係雙特異性模式，其具有藉由GGGGSGGGS連接至人類血清白蛋白結合模組之IL6R結合模組，如WO2010100135中所述。(胺基酸序列顯示於圖2 d中：SEQ ID NO 4)
純系VHH2(e)係雙特異性模式，其具有使用GGGGSGGGS作為連接體連接至血清白蛋白結合模組進而連接至TNF結合模組之TNF結合模組，如WO2010077422中所述。(胺基酸序列顯示於圖2 e中：SEQ ID NO 5)
純系VHH2(f)係二價單特異性模式，其包含兩個藉由Ala-Ala-Ala連接體連接之相同模組，每一模組係可結合溫韋伯氏因子(Von-Willebrand factor)之A1結構域之dAb，如WO2009115614A2中所示。(胺基酸序列顯示於圖2f中：SEQ ID NO 6)
藉由將C末端丙胺酸添加至末端絲胺酸殘基來修飾所有上文3種純系，並使用實例2之分析比較經修飾及未經修飾之純系。如可在下文表7及圖4中發現，結果顯示，單一丙胺酸胺基酸殘基之C末端延伸減少ADA結合。
實例9：具有針對一系列基於V H 及V L dAb之分子之預先存在之ADA之健康個體的頻率 ADA分析程序
與實例1中針對DOM1H-131-206所述程序類似，將測試分子DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 1)、DOM 1H-131-206+C末端丙胺酸延伸(SEQ ID NO 16)、mAb-VH(SEQ ID NO)、肽-VL序列、VH-VL(SEQ ID NO 11)、'735分子(SEQ ID NO 30及31)生物素化，實施緩衝液交換並儲存於調配物緩衝液中。該等測試分子亦經釕標記且隨後經緩衝液交換並儲存於調配物緩衝液中。
每一分子之抗藥物抗體(ADA)分析係在MSDTM ECL(電化學發光)技術平臺上實施之橋接分析，如前文所述。此實驗中所用分析程序之匯總闡述如下：
1.在室溫下(RT)用150 μL/孔存於PBS中之封阻酪蛋白(1%)將MSDTM抗生蛋白鏈菌素板封阻1至2小時。去除封阻劑，且不進行洗滌。
2.在1小時預培育後，將存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白)中之含有0.1 μg/mL生物素化測試分子、0.1 μg/mL釕化(「Sulfo-Tag」TM)測試分子及2%血清試樣之均 質混合物轉移至MSDTM板中且在RT下培育1小時±5分鐘。
3.然後用PBST將MSD板洗滌3次。
4.添加150 μL/孔讀取緩衝液且讀取板。
上述濃度及培育時間用於DOM1H-131-206分子。
熟習此項技術者應理解，精確濃度及培育時間應經最佳化，例如DOM1H-131-206(及經修飾之形式)可與(例如)DOM10H-53-567或肽-VL序列相比具有略微不同之濃度及培育時間。
在分析中篩選一組100名健康人類供體血清試樣之反應性。亦在正常人類血清試樣中檢測到針對可變重鏈(VL)框架之預先存在之抗體(ADA)，但量值及頻率低於先前針對VH及VHH結構域所觀察到者(參見圖4)。結果顯示於圖5中，其中Y軸顯示與ADA之結合程度，且VH dAb具有最高ADA結合發生率。
結論為：顯示於圖5中之結果顯示預先存在之ADA與DOM 1H-131-206之結合程度及添加C末端延伸對經修飾之DOM 1H-131-206與ADA結合之效應。亦可自圖5觀察到，當VH dAb融合至mAb(mAb-VH)時，亦觀察到與VH dAb結合之預先存在之ADA。圖5亦顯示，存在與V卡帕(Vk)(VL)dAb結合之預先存在之ADA，且所示實例包括肽：VL、VH-VL融合物及mAb-VL融合物。
實例10：VL框架之胺基酸延伸
由於亦在正常人類血清試樣中檢測針對VL(VK)框架之預先存在之抗體，但含量通常低於針對VH框架所觀察到 者(參見圖5)，因此確定VK dAb之C末端區修飾是否可減少預先存在之ADA結合，如已針對含有VH之分子證明。
基於mAb：連接體：VL分子(命名為'735-此分子係「mAbdAb」-其係IL-13mAb：連接體：IL-4(vκ)dAb)，藉由標準定點誘變產生一組測試mAb：連接體：VL分子，且其含有相同VL dAb序列，但VL dAb之C末端修飾不同。該等測試材料(命名為「15014」、「15019」、「15020」及「15021」)經改造以具有C末端延伸(+AAA、+T或+TV)或具有C末端缺失(-R)(顯示於下表8中)。
使用與上文針對VH dAb所述類似之下文所述「確認分析」來分析測試材料。藉由評估個別化合物與經標記分析特異性化合物競爭結合預先存在之抗體的能力來實施化合物測試。分析信號之任何潛在降低報告為抑制%。大於先前所測定之該特定分析之確認截點之抑制程度%表明，測試化合物與分析特異性化合物競爭結合抗VK抗體，且因此可與該分析特異性化合物共用表位。
用於量測針對Vκ之預先存在之ADA之頻率的'735 ADA確認分析程序：
1.在微量滴定分析板中，在RT下將2%存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白)中之ADA陽性血清試樣與最終濃度為10 μg/mL之'735或其他測試材料(例如經修飾之dAb)一起培育1小時±5分鐘。
2.在1小時預培育後，將存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白)中之含有0.05 μg/mL生物素化'735及0.05 μg/mL釕化(「Sulfo-Tag」TM)'735之均質混合物添加至分析板中且在RT下培育過夜。
3.在培育後，然後用PBST將MSD板洗滌3次，將分析試樣轉移至MSD板中，且在RT下將該板在黑暗中培育1小時±5分鐘。
4.然後用PBST將MSDTM板洗滌3次。
5.添加150 μL/孔讀取緩衝液且讀取板。
該等化合物篩選結果呈現於表8中。所有所測試C末端修飾(+AAA、+T、+TV及-R)皆在'735確認分析中顯示抑制有所降低。此表明，VL dAb之C末端修飾以與VH dAb類似之方式消除預先存在之抗體(ADA)之結合。
實例11：DOM10H-53-567(抗IL-13 dAb)之VH框架之胺基酸延伸
由於抗TNFR1 VH dAb DOM 1H-131-206之C末端修飾減少預先存在之ADA結合，因此確定C末端修飾是否可減少 ADA與不同VH分子之結合。藉由標準定點誘變技術對DOM10H-53-567之VH框架進行C末端修飾。使用上文所述「確認分析」來分析具有取代之分子(測試材料)。
DOM10H-53-567之C末端延伸亦顯著減少預先存在之ADA結合(結果顯示於下表9中)。此可例示為延伸A、AS、AST、ASTK、ASTKG及ASTKG。該等修飾不會負面地影響DOM10H-53-567純系結合並抑制其靶抗原IL-13之能力，如藉由下文所述IL-13 dAb活性分析及表9b中所示結果所確認。
IL-13 dAb活性分析方案：
使用生物分析來量測DOM10H-53-567分子變體抑制HEKBlue-STAT6細胞中活體外產生重組人類IL-13刺激之鹼性磷酸酶的能力。將HEK-STAT6細胞(Invivogen)(其在 STAT6依賴性啟動子控制下表現經分泌胚胎鹼性磷酸酶(SEAP))平鋪至96孔板中。在室溫下將濃度為3 ng/mL之人類IL-13及DOM1-H-53-567分子之稀釋系列預先平衡1小時且隨後添加至細胞中並在37℃下保持24小時。在培育後，藉由添加Quanti-Blue(Invivogen)並獲得在640 nm下讀取之光密度來測定該等細胞因IL-13刺激而產生之SEAP之上清液濃度。自劑量反應曲線使用Graphpad Prism計算IC50值。
DOM10H-53-567之減少預先存在之ADA結合之C末端延伸不會負面地影響DOM10H-53-567 dAb結合並抑制其靶抗原(人類IL-13)之能力。
實例12a：具有經修飾之C末端之抗VEGF VH/Vk dAb-Fc-dAb分子的選殖
Vk dAb部分之C末端經修飾之Vh-Vk dAb-Fc-dAb：藉由以下方式來改造DMS30047-30054：藉由PCR產生變體Vk dAb序列且隨後再選殖至DMS30045(SEQ ID NO 40)及DMS30046(SEQ ID NO 41)中，以分別產生經修飾之哺乳動物表現載體。自DMS30045：(i)去除C末端精胺酸殘基以產生DMS30047(DMS30037 -R)，(ii)添加C末端丙胺酸以產生DMS30048(其係DMS30037+A)(SEQ ID NO 43)，(iii)添加3個C末端丙胺酸以產生DMS30049(DMS30037+AAA)(SEQ ID NO 44)，及添加C末端蘇胺酸以產生DMS30050(DMS30037+T)(SEQ ID NO 45)。自DMS30046(SEQ ID NO 41)：(i)去除C末端精胺酸殘基以產生DMS30051(DMS30038 -R)(SEQ ID NO 46)，(ii)添加C末端丙胺酸以產生DMS30052((DMS30038+A)(SEQ ID NO 47)，(iii)添加3個C末端丙胺酸以產生DMS30053(DMS30038+AAA)(SEQ ID NO 48)，及添加C末端蘇胺酸以產生DMS30054(DMS30038+T)(SEQ ID NO 43)。
上述分子之說明如下：DMS30045：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb((TGLDSP)×4)，DMS30046：具有C末端K-044-085 dAb((TGLDSP)×4)之DMS1576，DMS30047(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb-C末端R((TGLDSP)×4)，DMS30048(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044- 085 dAb+A((TGLDSP)×4)，DMS30049(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb +AAA((TGLDSP)×4)，DMS30050(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb+T((TGLDSP)×4)，DMS30051(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb-C末端R((TGLDSP)×4)之DMS1576，DMS30052(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb +A((TGLDSP)×4)之DMS1576，DMS30053(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb+AAA((TGLDSP)×4)之DMS1576，DMS30054(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb +T((TGLDSP)×4)之DMS1576(該等分子之胺基酸序列顯示於圖12及SEQ ID NO 40-49中)。
實例12B：C末端區經修飾之VEGF V K dAb啞鈴分子(DMS30037及DMS30038)與預先存在之抗體之結合有所減少 用於量測針對Vκ之預先存在之ADA之頻率的Vκ ADA確認分析程序：
1.在微量滴定分析板中，在RT下將10%存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白)中之ADA陽性血清試樣與最終濃度為10 μg/mL之測試材料(例如經修飾之dAb)一起培育1小時±5分鐘。
2.在1小時預培育後，將ADA陽性血清/測試材料與存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白)中之均質混 合物一起添加至分析板中，該均質混合物含有生物素化V κ dAb(未經修飾)及釕化(「Sulfo-Tag」TM)'Vκ dAb(未經修飾)(最終濃度為約0.025 μg/mL之生物素化dAb、約0.0125 μg/mL釕化(「Sulfo-Tag」TM)dAb)及5% ADA陽性血清。在RT下將該板培育1小時±5分鐘。
3.在室溫下(RT)用150 μL/孔存於PBS中之封阻酪蛋白(1%)將MSDTM抗生蛋白鏈菌素板封阻1至2小時。去除封阻劑，且不進行洗滌。
4.在1小時預培育後，將均質混合物添加至MSDTM抗生蛋白鏈菌素分析板中且在RT下培育1小時±5分鐘。
5.在1小時培育後，然後用PBST將MSD板洗滌3次，將分析試樣轉移至MSD板中，且在RT下將該板在黑暗中培育1小時±5分鐘。
6.然後用PBST將MSDTM板洗滌3次。
7.添加150 μL/孔讀取緩衝液且讀取板。
熟習此項技術者應理解，確認分析中之精確濃度及培育時間應經最佳化，例如1H-131-206(及經修飾之形式)可與DOM10H-53-567相比具有略微不同之濃度及培育時間。
該等化合物篩選結果呈現於下表9B中。在上述'697確認分析中，對Vκ dAb測試之所有C末端修飾(+T、+A、+AAA及-R)皆顯示抑制有所降低。此表明，該等Vκ dAb之C末端修飾以與Vh dAb類似之方式減少預先存在之抗體(ADA)之結合。
實例13：具有經修飾之C末端之抗VEGF VH/Vk dAb-Fc-dAb分子(DMS30047-30054)的表現
將編碼上文實例12a中所述相關抗VEGF dAb-Fc-dAb分子之表現質粒瞬時轉染至HEK293 6E細胞中且以500 ml規模表現以產生抗體片段分子，其中使用此實例下文中所述方法。按常規，達成>30 mg/L上清液之表現量。
在哺乳動物表現載體中將dAb序列選殖至人類IgG1同種型之一般Fc之N-或C-末端上。使用連接體序列將dAb連接至Fc：N末端連接體係AAAS或TVAAPS且C末端連接體係((GS(TVAAPSGS)×3)或白蛋白結構域3。
實例14：具有經修飾之C末端之抗VEGF VH/Vk dAb-Fc-dAb分子的純化
自上清液親和力純化dAb-Fc-dAb分子，如針對上文實例所述。
實例15：藉由尺寸排除層析(SEC)對具有經修飾之C末端之抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子進行分子分析
然後藉由SDS-PAGE及分析型尺寸排除層析(SEC)分析已經純化之抗VEGF dAb-Fc-dAb分子之完整性、均質性及純度%。因此藉由SDS-PAGE及SEC確認該等蛋白質為>95%純之靶蛋白質，隨後在生物學分析中進一步分析。
實例16：具有經修飾之C末端之抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子在Biacore上與VEGF之結合.
藉由表面電漿共振(SPR)使用Biacore T100來測定某些抗VEGF dAb-Fc-dAb分子(具有小C末端修飾)與VEGF165之結合親和力。藉由一級胺偶合將蛋白質A固定於C1晶片上且然後使用此表面來捕獲抗VEGF構築體。使用人類重組VEGF165(「內部」源自HEK293細胞之瞬時轉染)之32 nM至0.03125 nM之4倍稀釋系列作為分析物。利用緩衝液注射物(即0 nM)來雙重參照所有結合曲線且將數據擬合成T100所固有之1：1模型。使用50 mM NaOH實施再生。在37℃下使用HBS-EP作為運行緩衝液實施運行。所得數據顯示於表10A、10B及10C中。自表10A中之數據，DMS30037及C末端經修飾之若干以下變體之性質在Biacore上似乎相當：DMS30037+A(DMS30048)、 DMS30037+AAA(DMS30049)及DMS30037+T(DMS30050)(關於該等分子之其他細節，參見實例12a)，且C末端修飾相對於親代似乎不會降低效能。
其他數據集合顯示於表10B中，其中在Biacore中比較DMS30037及DMS30038二者與C末端經修飾之以下變體及貝伐珠單抗(Bevacizumab)(癌思停，Avastin)之性能：DMS30037-R(標記為+R(DMS30047))、DMS30037+T(DMS30050)及DMS30038-R(標記為+R(DMS30051))。在此數據集合中，再次，所有分子之性質似乎在Biacore上相當，且C末端修飾相對於親代似乎不會降低效能。不能捕獲有意義之數據，只能觀察癌思停曲線。又一數據集合展示於表10C中，其中比較分子(DMS30037及DMS30038)與C末端經修飾之以下變體以及貝伐珠單抗(癌思停)：DMS30037-R(DMS30047)、DMS30037+T(DMS30050)、DMS30038-R(DMS30051)及DMS30038+T(DMS30054)。再次，所有dAb-Fc-dAb分子之性質似乎在Biacore上相當，且C末端修飾相對於親代似乎不會降低效能。在此數據集合中，參見表10C，因解離速率過快而不能適當地量測貝伐珠單抗(癌思停)數據。
實例17：對具有經修飾之C末端之抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子之VEGF R2受體結合分析
使用經改進之方法(即不進行預培育)在VEGF受體2(R2)結合分析中比較基於DMS30037及DMS30038且具有C末端修飾之抗VEGF_Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子與野生型分子及貝 伐珠單抗(癌思停)的效能，如此實例下文中所述。數據顯示於表11A中，所有測試dAb-Fc-dAb分子(DMS30037、DMS30037+T(DMS30050)、DMS30037-R(DMS30047)、DMS30038、DMS30038-R(DMS30051))似乎皆具有相當效能且比貝伐珠單抗(癌思停)顯著更有效(表11A)。在該分析中藉由該等分子達成之最大抑制百分比之變化很小，其中所有分子皆達成>93-98%最大抑制(數據未顯示)。
在相同分析模式中產生其他數據以比較dAb-Fc-dAb：DMS30038、DMS30038+T、(DMS30050)及DMS30038-R(DMS30051)與貝伐珠單抗(癌思停)，數據展示於表11B中。根據該數據，DMS30038及其C末端變體(表11B)具有在RBA分析中藉由EC50值判斷之類似效能，且根據此標準其似乎比貝伐珠單抗(癌思停)顯著更有效。在該分析中藉由該等分子達成之最大抑制百分比之變化很小，其中所有分子皆達成>94%最大抑制(數據未顯示)。
VEGF R2受體結合分析：在VEGF受體結合分析中分析與貝伐珠單抗(癌思停)相比之效能。此分析量測VEGF165與VEGF R1或VEGF R2之結合及測試分子封阻此相互作用之能力。將結合MSD標準之96孔板(L11XA-3)用存於碳酸氫鹽緩衝液中之0.25 μg/ml VEGF R1(R&D Systems 321-FL)或VEGF R2(R&D 357-KD)(50 μl/孔)塗佈，用板密封器覆蓋且在4℃下培育過夜。第二天，用300 μl/孔Tris洗滌緩衝液將MSD板洗滌3×且經紙巾墊吸乾以去除各孔之過量洗滌緩衝液。然後用3%存於PBS中之BSA(250 μl/孔)阻封 MSD板且在室溫下振盪(750 RPM)培育1小時。再次洗滌MSD板，隨後添加2×濃度之抗VEGF分子(25 μl/孔)且在室溫下振盪(750 RPM)培育10分鐘，之後添加2×濃度之rhVEGF(25 μl/孔)(R&D Systems,293-VE/CF，使用桿狀病毒在昆蟲細胞中製得)或GSK「內部」VEGF源(自HEK293哺乳動物細胞製得，後一數據未顯示，表3A除外)。抗VEGF分子及VEGF係使用0.1%存於PBS中之BSA製得。利用將抗VEGF分子與VEGF一起預培育之步驟來實施初始分析。藉由將等體積之2×濃度之抗VEGF分子添加至等體積之2×濃度之VEGF(R&D,293-VE/CF)中且在室溫下保持30分鐘來製備預培育物。所用最終VEGF濃度係10 ng/ml。亦不包括VEGF及VEGF單獨對照。在室溫下將MSD板振盪(750 RPM)培育2小時，此後再次將其洗滌，隨後添加0.25 μg/ml檢測試劑(50 μL/孔，山羊抗人類VEGF生物素化抗體-R&D Systems BAF293)(存於1%存於PBS中之BSA中)且在室溫下振盪(750 RPM)培育1小時。再次洗滌MSD板，隨後添加2 μg/ml抗生蛋白鏈菌素Sulfo-TAG(50 μl/孔，MSD R32AD-1)(存於1%存於PBS中之BSA中)且在室溫下振盪(750 RPM)培育30分鐘。在MSD Sector成像儀6000中量測電化學發光之前，洗滌MSD板並添加150 μl/孔之2×讀取緩衝液T(MSD R92TC-1)。使用GraphPad Prism實施曲線擬合及EC50計算。如所述測定測試抗VEGF分子及貝伐珠單抗(癌思停)抑制VEGF與VEGFR1及VEGFR2結合之能力。
經改進之方法：實施第二分析，其中在添加至經VEGF 受體塗佈之MSD板之前不預培育抗VEGF劑及VEGF。實施此分析且僅使用源自R&D Systems之VEGF(293-VE/CF)。如上文所述測定抗VEGF分子及貝伐珠單抗(癌思停)抑制VEGF與VEGFR1及VEGFR2結合之能力，但無預培育步驟。
實例18-人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖分析：利用含有C末端修飾之抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子進行抑制
使用下文所述方法比較基於DMS30037及DMS30038且具有C末端修飾之dAb-Fc-dAb分子(DMS30037-R(DMS30047) 及DMS30037+T(DMS30050)、DMS30038-R(DMS30051)及DMS30038+T(DMS30054))與貝伐珠單抗(癌思停)之抑制人類臍靜脈內皮細胞增殖之能力，但具有以下差異：(i)使用整個96孔板，而非留出外孔不含細胞，及(ii)使用GraphPad Prism使用S形曲線擬合分析數據，可變斜率參見非線性回歸(可變斜率)。在個別板上獨立地評價測試化合物與比較分子貝伐珠單抗(癌思停)；在至少3種單獨情形下實施分析，且每種分子之數據集合如下：貝伐珠單抗(癌思停)：15；DMS30037：7；DMS30038：8；DMS30037-R(DMS30047)：3；DMS30037+T(DMS30050)：4；DMS30038-R(DMS30051)：4及DMS30038+T(DMS30054)：4(數據未顯示)。重點在於在分析中分析藉由比較某些分子與貝伐珠單抗(癌思停)獲得之最大抑制度與相對EC50值二者。
使用GraphPad Prism使用S形曲線擬合分析數據，可變斜率參見非線性回歸(可變斜率)。針對每一分子且在每一天擬合個別曲線擬合。由於有一些差擬合，因此決定引入對曲線之限制，其中在較低濃度下未觀察到平穩態。根據分析排除一個板，此乃因儘管有限制，但曲線擬合仍較差。此限制將等於在最低濃度下各點之平均值。針對最低值是否受到限制來手動選擇數據，且基於此標準選擇自動更新曲線擬合及參數。使用加權混合模型方差分析且使用1/(標準誤差)2([SE]2)作為加權來分析曲線最大值及標準誤差之估計值。使用隨機效應項針對板與天間之可變性調節分 析。根據此分析，估計預測平均值且再與癌思停(對照)比較(參見表12A)。然後按log10規模針對IC50實施相同分析，且將結果逆轉化。據此，產生幾何平均值之估計值且再以與癌思停(對照)之比率形式與癌思停比較，即0.5之比率將指示自癌思停下降50%(參見表12B)。
人類臍帶內皮細胞(HUVEC)增殖分析：
分析抗VEGF分子與貝伐珠單抗(癌思停)相比抑制人類臍靜脈內皮細胞增殖之能力。此分析量測藉由界定濃度之VEGF165誘導之內皮細胞增殖程度及VEGF拮抗劑封阻此效應之能力。以5000個細胞/孔將HUVEC接種於96孔塗佈明膠之板中，留出外孔不含細胞，且培育若干小時以允許附著。以等克分子濃度(最大為3.33×10-08 M)及2倍連續稀釋液(每一者為一式三份)分析測試分子。在基礎培養基中製備VEGF165以達成75 ng/ml最終濃度。自細胞單層手動去除培養基並添加50 μl基礎培養基以防止細胞脫水。視需要添加25 μl含有VEGF165之培養基及25 μl基礎培養基或含有測試抗體之培養基。將細胞培育72 hr，隨後使用Cell Titre Glo測定細胞總數。用VEGF165處理HUVEC與未經VEGF165處理之細胞相比使細胞總數在72 hr後按預計增加(數據未顯示)。此VEGF介導之增加應解釋為代表VEGF對HUVEC增殖與防止HUVEC細胞死亡二者之累積效應。在個別板上相對於比較分子貝伐珠單抗(癌思停)獨立地評價測試化合物。
根據此分析，分子(DMS30037、DMS30037+T及DMS30037-R)似乎在HUVEC分析中產生最大抑制且其性能超過癌思停組，由於信賴區間不與零參照重疊，因此該數據在統計學上顯著不同於癌思停，數據未顯示(參見表12A)。
表12B：在HUVEC分析中，C末端經修飾之抗VEGF dAb-Fc-dAb與親代及貝伐珠單抗(癌思停)相比之IC50的幾何平均值(95%信賴區間(CI))：
對95%信賴區間(CI)而言，對IC50值之幾何平均值之類似分析顯示，幾乎所有dAb-Fc-dAb分子(DMS30037、DMS30037+T、DMS30038、DMS30038+T及DMS30038-R)皆具有在統計學上顯著低於癌思停之IC50值，數據未顯示(參見表18B)。DMS30037-R之數據集合高度可變，且具有低n數(3)。
總之，數據表明，C末端經修飾之兩種dAb-Fc-dAb(DMS30037及DMS30038)在HUVEC分析中之IC50值及最大抑制濃度與親代分子極為類似，且二者在最大抑制百分比與較低IC50方面似乎比貝伐珠單抗(癌思停)皆更有效(參見表12A及12B)。
實例19(工具mAb)：使用抗VH mAb來確定預先存在之抗VH ADA之結合表位：
單株抗體(抗VH mAb M2.3G10.1G06)結合DOM1H-131-206之VH框架，且已測定，此mAb與DOM1H-131-206 +A 之結合顯著減少；因此，此抗體似乎結合與預先存在之人類抗VH ADA類似之表位。
抗VH mAb M2.3G10.1G06之CDR序列：自雜交瘤細胞系擴增並測序抗VH mAb M2.3G10.1G06之CDR序列。mAb M2.3G10.1G06之重鏈及輕鏈序列顯示於[胺基酸序列顯示於圖6a及6b中]。將序列選殖至人類IgG1 mAb表現載體中並轉染至哺乳動物細胞中以表現經鑑別mAb。
自細胞上清液純化所得抗體且測試其結合VH dAb框架之能力。
抗VH mAb M2.3G10.1G06之特異性：藉由在MSDTM平臺(關於MSDTM平臺之細節，參見實例1)上實施之TNFR1：dAb結合分析中量測mAb M2.3G10.1G06之結合來測定mAb M2.3G10.1G06與VH dAb框架(具有或不具有消除預先存在之ADA結合之修飾)結合之特異性。TNFR1：dAb結合分析詳細闡述於下文中。已顯示，當藉由丙胺酸延伸修飾C末端時，釕化抗VH mAb M2.3G10.1G06與VH框架之結合減少高達85%(殘餘結合為1至15%)(結果顯示於表13中)。
預先存在之抗VH ADA與mAb M2.3G10.1G06間之競爭：為確認抗VH mAb M2.3G10.1G06結合與預先存在之血清抗VH ADA相同之表位，實施競爭分析。已測定，來自一系列具有預先存在之抗VH ADA之人類供體的血清可與抗VH mAb M2.3G10.1G06競爭結合DOM1H-131-206(數據顯示於圖7中)。吾人推斷，預先存在之人類抗VH ADA及 抗VH mAb M2.3G10.1G06共用VH框架上之重疊表位。
可基於抗VH mAb M2.3G10.1G06之結合預測VH dAb之破壞預先存在之ADA結合用表位的修飾。因此，可使用抗VH mAb M2.3G10.1G06之結合來分析減少預先存在之ADA結合之修飾。
所用方法： TNFR1：dAb結合分析方案
1.將TNFR1：Fc捕獲至hi-bind MSD板上在4℃下過夜。然後用MSD/TRIS洗滌緩衝液將MSD板洗滌3次。
2.在室溫下用3%存於PBS中之BSA將板封阻1.5小時。然後用MSD/TRIS洗滌緩衝液將MSD板洗滌3次。
3.添加測試dAb(DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 1)或具有C末端丙胺酸延伸之DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 16))之稀釋系列且在RT下保持2 h。然後用MSD/TRIS洗滌緩衝液將MSD板洗滌3次。
4.添加最終濃度為1 μg/ml之釕化mAb M2.3G10.1G06且在室溫下保持1小時。然後用MSD/TRIS洗滌緩衝液將MSD板洗滌3次。
5.添加150 μL/孔讀取緩衝液且讀取板。
預先存在之抗VH ADA及mAb M2.3G10.1G06之競爭分析方案
1.在RT下將0.2 μg/mL生物素化測試分子(dAb)(其係DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 1))及20%血清試樣(存於分析稀釋劑(1%存於PBS中之酪蛋白中)中)在圓 底分析板中培育1小時±5分鐘。
2.添加最終濃度為0.5 μg/mL之釕化抗VH mAb M2.3G10.1G06且在室溫下保持1小時。
3.在室溫下(RT)用150 μL/孔存於PBS中之封阻酪蛋白(1%)將MSDTM抗生蛋白鏈菌素板封阻1至2小時。
4.將試樣轉移至MSDTM抗生蛋白鏈菌素板中且在室溫(RT)下培育1至2小時。
5.然後用PBST將MSD板洗滌3次。
6.添加150 μL/孔讀取緩衝液且讀取板。
此mAb結合VH dAb(例如DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 1))之框架，但具有+A C末端修飾之dAb(例如具有C末端丙胺酸延伸之DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 16))中之結合顯著減少。已自寄存於Biocat中之雜交瘤測定重鏈及輕鏈序列。僅有一條LC序列，但有兩條HC序列：一條功能序列(參見下文)及一條非功能序列，包括終止密碼子及移碼。
基於下文所預測功能序列，mAb之表現及針對上文兩種分子之結合之確認將使得可確認具有歸檔用正確mAb序列。組裝pTT5構築體之方式意指，僅非斜體序列係來自雜交瘤，斜體係來自pTT載體之嵌合體(其選殖至該載體中)(此並非結合分析所需)。
輕鏈
DIVMTQSQKFMSPTVGDRVSITC KASONVGTAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYT GVPDRFTGSGSGTDFTLTINNMQSEDLADYFC QQYGSYPLT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重鏈
EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTLT ESYMH WVKQSHGKSLEWIG VISPYNGGTSYNQKFKD KATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCTR RGIYYDPSWFAY WGQGTLVTVSAAKTTPPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVICVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIELTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK正常字體為可變區。
下劃線/粗體為CDR。
斜體為Fc之嵌合體序列。
Fc係人類IgG1。
工具mAb之序列顯示於圖6中(SEQ ID NO 14及15)。
圖1：顯示一組健康人類個體之血清中預先存在之抗藥物抗體的頻率。
圖2：顯示鑑別為以下之未經修飾之抗TNFR1 dAb之胺基酸序列：(a)(未經修飾之)DOM 1H-131-206(SEQ ID NO 1)；(b)(未經修飾之)DOM 1H-131-511(SEQ ID NO 2)；(c)(未經修飾之)DOM 1H-131-202(SEQ ID NO 3)；及鑑別為以下之VHH序列：(d)其係雙特異性模式，其具有藉由GGGGSGGGS連接至人類血清白蛋白結合模組之IL6R結合模組，如WO2010100135中所述(SEQ ID NO 4)；(e)係雙特異性模式，其具有使用GGGGSGGGS作為連接體連接至血清白蛋白結合模組，進而連接至TNF結合模組之TNF結合模組，如WO2010077422中所述(SEQ ID NO 5)；(f)係雙價單特異性模式，其包含兩個藉由Ala-Ala-Ala連接體連接之相同模組，每一模組係可結合溫韋伯氏因子之A1結構域之dAb，如WO2009115614A2中所示(SEQ ID NO 6)；(g)純系VHH2(d)係雙特異性模式，其具有藉由GGGGSGGGS連接至人類血清白蛋白結合模組之IL6R結合模組，如WO2010100135中所述，且具有丙胺酸延伸(SEQ ID NO 7)；(h)雙特異性模式，其具有使用GGGGSGGGS作 為連接體連接至血清白蛋白結合模組，進而連接至TNF結合模組之TNF結合模組，如WO2010077422中所述，且具有丙胺酸延伸(SEQ ID NO 8)；(i)雙價單特異性模式，其包含兩個藉由Ala-Ala-Ala連接體連接之相同模組，每一模組係可結合溫韋伯氏因子之A1結構域之dAb，如WO2009115614A2中所示，且具有丙胺酸延伸(SEQ ID NO 9)；(j)DOM 1H-574-208(SEQ ID NO 10)；(k)DOM 1H-574-208-VL融合物(SEQ ID NO 11)；(l)DT04-H-033(SEQ ID NO 12)；(m)Dom10h-53-567(SEQ ID NO 13)。
圖3：顯示DOM1H-131-206之晶體結構模型，其中突出顯示在突變時影響ADA結合之殘基。對表面殘基實施建模且在ADA分析中針對與預先存在之ADA之結合篩選所得突變體(例如如實例2中所述)。發現指示為14及「C末端」之殘基在突變時對ADA結合具有強烈影響，發現指示為112、110、108及41之殘基在突變時對ADA結合具有中度影響，且發現指示為13、11、91、43、44、83及84之殘基在突變時對ADA結合具有弱影響。
圖4：顯示因將單一丙胺酸胺基酸殘基延伸添加至VHH純系2(d)、2(e)及2(f)所引起之與ADA結合之消除。
圖5：顯示與ADA之結合程度及VH dAb或VL dAb或包含該等dAb之分子之程度。下方之Dom131-206係指Dom1h-131-206 dAb。
圖6a及6b：顯示工具mAb(M2.3G10.1G06)之胺基酸序列，圖6a顯示輕鏈序列(SEQ ID NO 14)；且圖6b顯示重鏈 序列。CDR以加下劃線形式顯示於圖中(SEQ ID NO 15)。
圖7：顯示在來自具有一系列預先存在之抗VH ADA信號之個體之血清試樣存在下的競爭分析信號(x軸)。來自一系列具有預先存在之抗VH ada之人類供體之血清與抗VH mAb M2.3G10.1G06競爭結合DOM 1H-131-206，從而抑制競爭分析信號。
圖8：顯示鑑別為以下之經修飾之TNFR1 dAb之胺基酸序列：(a)具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 16)；(b)具有單一丙胺酸延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 17)；(c)具有P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 18)；(d)具有ASTKG C末端延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 19)；及(e)具有ASTKG C末端延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 20)。
圖9：顯示以下TNFR1 dAb之核酸序列：(a)DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 21)；(b)在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 22)；(c)具有C末端延伸ASTKG之DOM1h-131-206 dAb(SEQ ID NO 23)。
圖10：顯示編碼以下胺基酸序列之核酸序列：(a)具有圖2d中所示胺基酸序列之VHH序列(SEQ ID NO 24)；(b)具有圖2e中所示胺基酸序列之VHH序列(SEQ ID NO 25)；(c)具有圖2f中所示胺基酸序列之VHH序列(SEQ ID NO 26)；(d)VHH序列，其為雙特異性模式且具有藉由GGGGSGGGS連 接至人類血清白蛋白結合模組之IL6R結合模組，且具有單一丙胺酸延伸(SEQ ID NO 27)；(e)具有2e中所示胺基酸序列之VHH序列，其進一步包含單一丙胺酸延伸(SEQ ID NO 28)，(f)具有2f中所示胺基酸序列之VHH序列，其進一步包含單一丙胺酸延伸(SEQ ID NO 29)。
圖11：顯示以下mAb：VL dAb(IL-13mAb：IL-4Vκ dAb分子)之胺基酸序列：(a)mAb-VL '735分子(IL-13mAb：IL-4Vκ dAb)(SEQ ID NO 30及31)；(b)mAb-VL 150154(SEQ ID NO 32及33)；(c)mAb-VL 15019(SEQ ID NO 34及35)；(d)mAb-VL 15020(SEQ ID NO 36及37)；(e)mAb-VL 15021(SEQ ID NO 38及39)。
圖12：顯示以下之胺基酸序列：(a)DMS30045：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb((TGLDSP)×4)(SEQ ID NO 40)；(b)DMS30046：具有C末端K-044-085 dAb((TGLDSP)×4)之DMS1576(SEQ ID NO 41)；(c)DMS30047(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb-C末端R((TGLDSP)×4)(SEQ ID NO 42)；(d)DMS30048(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb+A((TGLDSP)×4)(SEQ ID NO 43)；(e)DMS30049(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb+AAA((TGLDSP)×4)(SEQ ID NO 44)；(f)DMS30050(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N- (VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb +T((TGLDSP)×4)(SEQ ID NO 45)；(g)DMS30051(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb-C末端R((TGLDSP)×4)之DMS1576(SEQ ID NO 46)；(h)DMS30052(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb+A((TGLDSP)×4)之DMS1576(SEQ ID NO 47)；(i)DMS30053(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb+AAA((TGLDSP)×4)之DMS1576(SEQ ID NO 48)；(j)DMS30054(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb+T((TGLDSP)×4)之DMS1576(SEQ ID NO 49)。
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<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未經修飾之dAb DOM 1H-131-206(抗TNR1)
<400> 1
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未經修飾之dAb DOM 1H-131-511(抗TNR1)
<400> 2
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未經修飾之dAb DOM 1H-131-202(抗TNR1)
<400> 3
<210> 4
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH2
<400> 4
<210> 5
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH2
<400> 5
<210> 6
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH2
<400> 6
<210> 7
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH2
<400> 7
<210> 8
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH2
<400> 8
<210> 9
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH2
<400> 9
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Dom 1h-574-208
<400> 10
<210> 11
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Dom 1h-574-208-VL融合物
<400> 11
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DT04-H-033(親代IL-13 dAb)
<400> 12
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Dom 10h-53-567
<400> 13
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VH mAb M2.3G10.1G06
<400> 14
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VH mAb M2.3G10.1G06
<400> 15
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DOM1h-131-206 dAb
<400> 16
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DOM1h-131-206 dAb
<400> 17
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DOM1h-131-206 dAb
<400> 18
<210> 19
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DOM1h-131-206 dAb
<400> 19
<210> 20
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DOM1h-131-206 dAb
<400> 20
<210> 21
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DOM1h-131-206 dAb
<400> 21
<210> 22
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Dom1h-131-206
<400> 22
<210> 23
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Dom1h-131-206
<400> 23
<210> 24
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗IL6 VHH
<400> 24
<210> 25
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNFα VHH
<400> 25
<210> 26
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗溫韋伯氏VHH
<400> 26
<210> 27
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗IL6 VHH
<400> 27
<210> 28
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNFα VHH
<400> 28
<210> 29
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗溫韋伯氏VHH
<400> 29
<210> 30
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb-VL '735分子(IL-13mAb：IL-4Vκ dAb)‘735分子
<400> 30
<210> 31
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 735分子
<400> 31
<210> 32
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15014
<400> 32
<210> 33
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15014
<400> 33
<210> 34
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb-VL 15019
<400> 34
<210> 35
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb-VL 15019
<400> 35
<210> 36
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb-VL 15020
<400> 36
<210> 37
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb-VL 15020
<400> 37
<210> 38
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb-VL 15021
<400> 38
<210> 39
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb-VL 15021
<400> 39
<210> 40
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30045：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSKD連接體)及C末 端K-044-085 dAb((TGLDSP)×4)
<400> 40
<210> 41
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30046：具有C末端K-044-085 dAb((TGLDSP)×4)之 DMS1576
<400> 41
<210> 42
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30047(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb-C末端R ((TGLDSP)×4)
<400> 42
<210> 43
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30048(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb +A ((TGLDSP)×4)
<400> 43
<210> 44
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30049(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb +AAA ((TGLDSP)×4)
<400> 44
<210> 45
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30050(含有經修飾之C末端)：DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDK連接體)及C末端K-044-085 dAb +T ((TGLDSP)×4)
<400> 45
<210> 46
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30051(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb-C 末端R((TGLDSP)×4)之DMS1576
<400> 46
<210> 47
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30052(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb+A((TGLDSP)×4)之DMS1576
<400> 47
<210> 48
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30053(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb+AAA((TGLDSP)×4)之DMS1576
<400> 48
<210> 49
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DMS30054(含有經修飾之C末端)：具有C末端K-044-085 dAb +T((TGLDSP)×4)之DMS1576
<400> 49

Claims (59)

  1. 一種單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其包含一或多種選自以下之修飾：(a)C末端延伸，其包含具有1個胺基酸至5個胺基酸之胺基酸延伸；或(b)一或多個胺基酸框架取代，其中至少一個取代係選自以下之取代：P14A取代、P41A取代及L108A取代；且其與未經修飾之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)相比與預先存在之ADA之結合有所減少。
  2. 如請求項1之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係選自人類VH或人類VLdAb或駱駝科動物VHH。
  3. 如請求項1或2之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其包含具有1個胺基酸至4個胺基酸之C末端延伸。
  4. 如請求項1或2之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該C末端延伸包含為丙胺酸之胺基酸。
  5. 如請求項1或2之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中(i)當該單一免疫球蛋白可變結構域係人類VH或駱駝科動物VHH時，該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸或由其組成：(a)A、(b)AS、(c)AST、(d)ASTK、(e)ASTKG、(f)AAA或(g)T；且(ii)當該單一免疫球蛋白可變結構域係諸如Vκ等人類VL時，該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸或由其組成：(a)AAA、(b)A、(c)TV及(d)T。
  6. 一種單價結合靶抗原之單一免疫球蛋白可變結構域 (dAb)，其包含：a. 3個對該靶抗原具有特異性之互補決定(CDR)區；以使得該dAb以在5 μM至1 pM範圍中之KD結合該抗原b. 4個框架(FW)區；及c.由序列VTVS(S)nX或VEIKpRqX組成之C末端序列；及視情況d.與人類生殖系框架序列相比，一或多個於14位、41位、108位、110位或112位處之胺基酸取代其中：n代表獨立地選自0或1之整數；p及q各自代表0或1，以使得當p代表1時，q可係0或1，且使得當p代表0時，q亦代表0；X可存在或不存在，且在存在時代表具有1至5個胺基酸殘基之胺基酸延伸；且另一條件係若X不存在；則i. n係0及/或以VTVS(S)n結尾之dAb包含該等胺基酸取代中之一或多者；ii. p及/或q係0，及/或以VEIKpRq結尾之dAb包含該等胺基酸取代中之一或多者。
  7. 如請求項6之單一免疫球蛋白可變結構域，其與抗藥物抗體之結合親和力及/或親合力低於等效dAb，該等效dAb具有相同序列，只是在該等效dAb中，X不存在，n、p及q係1且不存在胺基酸取代。
  8. 如請求項6之單一免疫球蛋白可變結構域，其KD在約10 pM或更小至約50 nM範圍中。
  9. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域，其係選自由以下組成之群：人類VH dAb、人類VL dAb(例如Vκ)及駱駝科動物VHH。
  10. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域，其中該一或多個胺基酸取代係選自由以下組成之群：P14A取代、P41A取代、L108A取代、T110A取代及S112A取代。
  11. 如請求項6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域，其中存在X。
  12. 如請求項6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域，其中X係具有1至5個胺基酸之延伸。
  13. 如請求項11之單一免疫球蛋白可變結構域，其中X係具有1至5個胺基酸之延伸，該延伸包含丙胺酸殘基或由其組成。
  14. 如請求項13之單一免疫球蛋白可變結構域，其中X係選自由以下組成之群之延伸：A、AS、AST、ASTK、ASTKG。
  15. 如請求項6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域，其中該C末端序列對於VH或VHH dAb而言係由序列VTVSSX組成，或對於諸如Vκ等VL dAb而言係由序列VEIKRX組成；且其中X係具有1至5個胺基酸之胺基酸延伸。
  16. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結 構域，其中(i)當該單一免疫球蛋白可變結構域係人類VH或駱駝科動物VHH時，該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸：(a)A、(b)AS、(c)AST、(d)ASTK、(e)ASTKG、(f)AAA或(g)T，或該結構域具有為-S缺失之C末端缺失；或(ii)當該單一免疫球蛋白可變結構域係諸如Vκ等人類VL時，該C末端延伸包含選自以下之胺基酸延伸：(a)AAA、(b)A、(c)TV及(d)T，或該結構域具有為-R缺失之C末端缺失。
  17. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其結合選自以下之靶標：TNFα、TNF受體、TNF受體1(TNFR1)、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、白蛋白、溫韋伯氏因子(Von Willebrand factor)、溫韋伯氏因子A1結構域及TGFβR2。
  18. 如請求項17之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該靶標係TNFR1，其係選自鑑別為以下之以下胺基酸序列中之任一者：(a)在C末端處具有單一丙胺酸延伸之DOM1h-131-206 dAb(顯示於圖8a中：SEQ ID NO 16)；(b)在C末端處具有單一丙胺酸延伸及P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(顯示於圖8B中：SEQ ID NO 17)；(c)具有P14A框架突變之DOM1h-131-206 dAb(顯示於圖8c中：SEQ ID NO 18)；(d)具有ASTKG C末端延伸之DOM1h-131-206 dAb(顯示於圖8d中：SEQ ID NO 19)；及(e)具有ASTKG C末端延伸及P14A框架突變之DOM1h- 131-206 dAb(顯示於圖8e中：SEQ ID NO 20)。
  19. 如請求項17之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該靶標係TNFR1且該未經修飾之dAb係選自與鑑別為以下之胺基酸序列中之任一者100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%一致的胺基酸序列：DOM1h-131-206(顯示於圖2a中：SEQ ID NO 1)、DOM 1h-131-511(顯示於圖2b中：SEQ ID NO 2)、DOM 1h-131-202(顯示於圖2c中：SEQ ID NO 3)。
  20. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係以與其他分子之融合物或偶聯物形式存在。
  21. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係以與一或多種選自以下之其他分子之融合物或偶聯物形式存在：另一dAb或蛋白質或多肽或其片段、可延長半衰期或係另一治療性或活性分子之蛋白質或多肽或其片段、PEG分子、抗體或其片段或Fc區。
  22. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係以mAbdAb分子形式存在。
  23. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係以串聯融合物形式存在。
  24. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係以啞鈴模式存在。
  25. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至24中任一項之單 一免疫球蛋白可變結構域(dAb)與醫藥上或生理學上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑之組合。
  26. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一可變結構域(dAb)或如請求項25之醫藥組合物，其用於治療方法或醫療中。
  27. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域或如請求項25之醫藥組合物，其用於防止副效應之方法中。
  28. 如請求項6之單一免疫球蛋白可變結構域，其用於防止副效應之方法中，其中藉由Y替代X，其中Y係選自由以下組成之群：標籤，例如親和力標籤、myc標籤、FLAG標籤或his標籤；化學修飾，例如PEG基團；或蛋白質，例如抗體之Fc部分。
  29. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域或如請求項25之醫藥組合物，其中該dAb係其靶標之拮抗劑。
  30. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域或如請求項25之醫藥組合物，其中該dAb之該靶標係受體。
  31. 如請求項29之單一免疫球蛋白可變結構域或醫藥組合物，其中該受體在活化後二聚化。
  32. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域或如請求項25之醫藥組合物，其中該靶標係聚合物靶標。
  33. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結 構域(dAb)，其經修飾以減少ADA結合，其中該dAb(i)維持以dAb胺基酸序列之至少50%之親和力結合靶標之能力，該dAb胺基酸序列與該經修飾之dAb相同，只是其不包含任何如本文所述減少與ADA之結合之修飾；及/或(ii)以dAb胺基酸序列之至少10%之量表現，該dAb胺基酸序列與該經修飾之dAb相同，只是其不包含任何減少與ADA之結合之修飾。
  34. 如請求項1、2及6至8中任一項之單一免疫球蛋白可變結構域，其用於醫療中。
  35. 如請求項18之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)或如請求項25之包含(dAb)之醫藥組合物，其用於治療或預防至少一種選自以下之疾病或病症或病況：發炎疾病或病症，或呼吸道疾病或病症，或肺部疾病或病症。
  36. 如請求項18之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係在該C末端處具有單一丙胺酸延伸之該DOM1h-131-206 dAb(具有圖8a中所示之胺基酸序列：SEQ ID NO 16)，其用於醫療中。
  37. 如請求項36之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)，其中該dAb係在該C末端處具有單一丙胺酸延伸之該DOM1h-131-206 dAb(具有圖8a中所示之胺基酸序列：SEQ ID NO 16)，且係用於治療或預防至少一種選自以下之疾病或病症或病況：關節炎、牛皮癬、多發性硬化、發炎腸病(例如克隆氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)；或例如選自例如以下之呼吸道或肺部疾病或病症：哮喘、 慢性阻塞性肺病、慢性枝氣管炎、慢性阻塞性枝氣管炎及肺氣腫、肺發炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、過敏性肺炎、伴有嗜酸性球增多症之肺浸潤、環境性肺疾病、肺炎、枝氣管擴張症、囊性纖維化、間質性肺疾病、原發性肺動脈高血壓、肺血栓栓塞、胸膜病症、縱隔病症、隔膜病症、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸中止症、急性呼吸窘迫症候群、間皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏症、石綿沉著病、麴黴腫、麴黴菌病、枝氣管擴張症、慢性枝氣管炎、肺氣腫、嗜酸性球性肺炎、特發性肺纖維化、侵襲性肺炎鏈球菌感染症、流行性感冒、非結核分枝桿菌病(nontuberculous mycobacteria)、胸膜積液、肺塵埃沈著病、肺囊蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著病、肺炭疽、肺水腫、肺栓塞、肺部發炎、肺組織球增多病X、肺高血壓、肺奴卡菌病(pulmonary nocardiosis)、肺結核、肺靜脈閉塞性疾病、類風濕性肺病、類肉瘤病及韋格納肉芽腫(Wegener's granulomatosis)及急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫症候群(ARDS)；及其併發症。
  38. 如請求項37使用之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)(具有圖8a中所示之胺基酸序列：SEQ ID NO 16)，其係用於治療或預防急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。
  39. 一種如請求項18之單一免疫球蛋白可變結構域(dAb)之用 途，其中該dAb係在該C末端處具有單一丙胺酸延伸之該DOM1h-131-206 dAb(具有圖8a中所示之該胺基酸序列：SEQ ID NO 16)，其用於製造用以治療或預防急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之藥劑。
  40. 一種如請求項18至19中任一項之dAb或如請求項25之包含(dAb)之醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療或預防至少一種選自以下之疾病或病症或病況之藥劑：發炎疾病或病症或呼吸道或肺部疾病或病症。
  41. 如請求項40之用途，其中該dAb係在該C末端處具有單一丙胺酸延伸之該DOM1h-131-206 dAb(具有圖8a中所示之該胺基酸序列：SEQ ID NO 16)。
  42. 如請求項40或41之用途，其中該至少一種疾病或病症或病況係彼等如請求項37中所指定者中之任一者。
  43. 如請求項41之用途，其中該疾病係急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。
  44. 如請求項40、41及43中任一項之用途，其中該藥劑或dAb係藉由皮下、靜脈內或肌內注射遞送至個體。
  45. 如請求項40、41及43中任一項之用途，其中該藥劑或dAb係經由以下途徑遞送至個體：非經腸、口、直腸、穿黏膜、眼部、肺或GI道遞送。
  46. 一種可注射、經口、可吸入或可霧化調配物，其包含如請求項1至33中任一項之組合物或dAb。
  47. 一種持續釋放調配物，其包含如請求項1至33中任一項之組合物或dAb。
  48. 一種冷凍乾燥調配物，其包含如請求項1至33中任一項之組合物或dAb。
  49. 一種遞送裝置，其包含如請求項1至33中任一項之組合物或dAb。
  50. 一種遞送裝置，其包含如請求項1至33中任一項之組合物或dAb，其中該裝置係霧化器或吸入器。
  51. 一種經分離或重組核酸，其編碼如請求項1至24中任一項之dAb。
  52. 一種經分離或重組核酸，其編碼如請求項13至14或18中任一項之dAb。
  53. 如請求項52之經分離或重組核酸，其具有圖9b中所示之核酸序列(SEQ ID NO 22)且編碼具有單一丙胺酸延伸之該DOM1h-131-206 dAb。
  54. 一種載體，其包含如請求項51至53中任一項之核酸。
  55. 如請求項54之載體，其係pave011且其表現該SEQ ID NO 22之核酸。
  56. 一種宿主細胞，其包含如請求項51至53中任一項之核酸或如請求項54至55中任一項之載體。
  57. 如請求項56之宿主細胞，其係大腸桿菌(E.coli)且其表現如請求項55之載體。
  58. 一種產生包含如請求項1至24中任一項之dAb之多肽的方法，其中該方法包含在適於表現該核酸或載體之條件下維持如請求項56至57中任一項之宿主細胞，藉此產生多肽。
  59. 如請求項58之方法，其中該多肽係dAb，其具有鑑別為在該C末端處具有單一丙胺酸延伸之該DOM1h-131-206(SEQ ID NO 16)之胺基酸序列，且該方法包含在適於表現該pave011載體之條件下維持大腸桿菌宿主細胞，該pave011載體表現該SEQID NO 22之核酸。
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