JP7256011B2 - Ｃｄ４０ｌを阻害するポリペプチド - Google Patents

Ｃｄ４０ｌを阻害するポリペプチド Download PDF

Info

Publication number
JP7256011B2
JP7256011B2 JP2018527745A JP2018527745A JP7256011B2 JP 7256011 B2 JP7256011 B2 JP 7256011B2 JP 2018527745 A JP2018527745 A JP 2018527745A JP 2018527745 A JP2018527745 A JP 2018527745A JP 7256011 B2 JP7256011 B2 JP 7256011B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
cd40l
polypeptide
binding
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018527745A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019504822A5 (ja
JP2019504822A (ja
Inventor
パッティン，エルス
ヴァン デ ソムペル，アリエラ
メールツ，ペーター
バイセ，マリー－アンジュ
デヴィルデ，マーテン
ベシュテ，ゲラルト
フラッハ，ジャロミル
ス，ジョナサン
Original Assignee
アブリンクス エン．ヴェー．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アブリンクス エン．ヴェー． filed Critical アブリンクス エン．ヴェー．
Publication of JP2019504822A publication Critical patent/JP2019504822A/ja
Publication of JP2019504822A5 publication Critical patent/JP2019504822A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7256011B2 publication Critical patent/JP7256011B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Description

本発明は、ＣＤ４０Ｌに結合する免疫グロブリンに、より具体的には、１つ以上のかかる免疫グロブリンを含むかまたは本質的にそれからなるポリペプチドに関する（本明細書においては、それぞれ「本発明の免疫グロブリン」および「本発明のポリペプチド」ともまた言われる）。
本発明は、かかるポリペプチドをコードする核酸に（本明細書においては「本発明の核酸（単数もしくは複数）」ともまた言われる；かかるポリペプチドを調製するための方法に；かかるポリペプチドを発現するかまたは発現する能力がある宿主細胞に；かかるポリペプチド、核酸、および／または宿主細胞を含む組成物、特に医薬組成物に；ならびに特に予防および／または治療目的、例えば本明細書において挙げられる予防および／または治療目的のための、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、および／または組成物の使用にもまた関する。
本発明の他の側面、態様、利点、および用途は、本明細書のさらなる記載から明瞭になるであろう。
ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）相互作用は、ＢおよびＴ細胞応答の開始（Grewal & Flavell, 1998 Annu. Rev. Immunol. 16:111-135; Yang & Wilson, 1996 Science 273:1862-1864）および維持（Grewal et al., 1996 Science 273:1864-1867; Buhlmann et al., 1999 J. Immunol. 162:4373-4376）に必要不可欠の役割を果たすことが示されている。ＣＤ４０共刺激分子は、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂリンパ球、マクロファージ、およびＣＤ３４＋細胞前駆体のサブセットを包含する種々の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に、恒常的にまたはインビトロ活性化後にどちらかで発現される（McLellan et al., 1996 Eur. J. Immunol. 26:1204-1210; Rondelli et al., 1999 Blood 94:2293-2300）。ＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞受容体によって媒介される刺激後にＣＤ４＋およびいくつかのＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面上に発現される。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの間の相互作用は、ＡＰＣおよびＴ細胞機能両方に影響する二方向性シグナルに至る。一方では、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌ依存的刺激は、ＤＣおよびマクロファージがＣＤ８０およびＣＤ８６などのＴ細胞共刺激分子を発現することと、ＩＬ－１２などの免疫刺激性サイトカインを産生することとを誘導し、それゆえに、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答両方を開始するそれらの能力を増強する（Kennedy et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24:116-123; Caux et al., 1994 J. Exp. Med. 180:1263-1272）。他方で、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０依存的な刺激は共刺激シグナルを送達し（Brenner et al., 1997 FEBS Letters 417:301-306）、Ｔ細胞活性化に寄与する（Koppenhoefer et al., 1997 FEBS Letters 414:444-448; Blotta et al., 1996 J. Immunol. 156:3133-3140）。動物モデルおよびヒトからの証拠は、種々の自己免疫疾患、例えばループス腎炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ならびにルー・ゲーリッグ病およびシャルコー病としてもまた公知の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）において、病原性の自己抗体および組織損傷の生成に果たすＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ相互作用の必須の役割を支持している。これらの知見は、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断する抗体の開発のきっかけとなった。
ヒトＣＤ４０Ｌを標的とするヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ｈｕ５Ｃ８またはルプリズマブ、Biogen）は、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）がマッチしないドナーからの腎臓移植の非ヒト霊長類モデルにおいて、大部分のレシピエントにおける長期の移植片生着を誘導することが示されている（Kirk et al., 1999 Nat. Med. 5:686-693）。同じ抗体は、ループス腎炎の第ＩＩ相治験でもまた試験された。しかしながら、研究は、心筋梗塞を包含する血栓塞栓事象（ＴＥ）ゆえに中途で終了しなければならなかった（Kawai et al., 2000 Nat. Med. 6:114）。
ＩｇＧ１アイソタイプのヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体toralizumab（ＩＤＥＣ－１３１、ｈｕ２４－３１）はマウス抗ＣＤ４０Ｌハイブリドーマ２４－３１に由来する。ルプリズマブと類似に、toralizumabについて計画された複数の第Ｉ相治験および第ＩＩ相治験もまた、ヒト患者における血栓塞栓事象のリスクが原因で止められた。
開発された第３の抗ＣＤ４０Ｌ抗体はＡＢＩ７９３であった。これはＨｕＭＡｂマウスに由来するヒトＩｇＧ１である（Medarex Inc.）。このケースにおいては、ＴＥがアカゲおよびカニクイ腎移植モデルにおいて既に観察され、それゆえにＡＢＩ７９３のさらなる開発は止められた。
血栓塞栓事象は、種々の疾患バックグラウンドにおいて異なるエピトープに対する抗体によって発生し得、心筋、肺動脈、および末梢静脈を包含する多様な部位における静脈および動脈支配域両方が関わる。しかしながら、抗ＣＤ４０Ｌによって誘導されるＴＥの底にある厳密なメカニズムはまだ解明されていない。主要仮説は：
（ｉ）ＩｇＧモノクローナル抗体の二価性が原因の血小板上のＣＤ４０Ｌのクロスリンク；
（ｉｉ）血小板Ｆｃ受容体との抗ＣＤ４０Ｌ抗体の相互作用、それゆえに血小板凝集および血栓症を促進、
である。
加えて、既存抗体（ＰＥＡ）および／または抗薬物抗体（ＡＤＡ）などの治療蛋白質産物に対する免疫応答は、患者の安全性および産物の有効性両方について問題を呈し得る。これらの免疫学に基づく有害事象は、アナフィラキシー、サイトカイン放出症候群、「輸注反応」、および非急性反応（発熱、発疹、関節痛、筋肉痛、血尿、蛋白尿、漿膜炎、中枢神経系合併症、および溶血性貧血の遅延発症）、ならびに重大な機能を媒介する内在性蛋白質の交差反応性の中和を包含する。また、治療蛋白質産物に対する望まれない免疫応答は、それらの生物学的活性を中和し得、治療蛋白質産物の有効性を阻害することによってのみならず、内在性蛋白質カウンターパートに対して交差反応することによってもまた有害事象をもたらし得、その生理学的機能の喪失に至る。免疫原性の安全性の帰結は幅広く変動し得、治療蛋白質産物を投与された患者において多くの場合には予測不可能である。ＰＥＡおよびＡＤＡは、治療蛋白質産物の非冗長的な内在性カウンターパートまたは近縁蛋白質と交差反応し阻害する場合には深刻な帰結を有し得る（Macdougall et al., 2012 Kidney Int. 2012 81:727-32; Seidl et al., 2012 Pharm Res 29:1454-1467）。
ＷＯ２０１３／０５６０６８は、ＣＤ４０Ｌを標的とするドメイン抗体（ｄＡｂ）のＣ末端にリンクされたＩｇＧ１の改変されたＦｃ断片から構成される二量体融合蛋白質に関する。ＷＯ２０１３／０５６０６８はＰＥＡについて報告していないが、サルにおいてはＡＤＡが蛋白質に対して発生し、速いクリアランス（低い血漿暴露および低い血清中Ｔ１／２）をもたらしたということを報告している。
十分に有効な免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体の報告は明かされていない。現行では、BiogenおよびUCBは既存の抗ＣＤ４０Ｌ抗体をＦａｂ’－ＰＥＧ分子（ＣＤＰ７６５７）として作り替えるために共同研究し、ｈｕ５Ｃ８で見られるＴＥ事象を克服することを試みている。半減期を引き延ばすために、Ｆａｂ’部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングされた。ＰＥＧは工業製造から医療まで多種多様な用途を有し、それゆえにそれはユビキタスに用いられている。最近の知見は、健康な血液ドナーにおける抗ＰＥＧ抗体の２２～２５％の発生率を実証した。抗ＰＥＧ抗体のこの発生は、いくつかの患者においては有効性を限定し得、ＰＥＧが非免疫原性であるという一般的な想定に反する。ゆえに、ＰＥＧ化された治療薬は、特に免疫低下した疾患設定において臨床使用にとっての潜在的重大性を有する。その上に、Ｆａｂ’分子のＰＥＧ化がその活性を４～５倍減少させるということが報告されている（ＵＳ２０１０／０１０４５７３）。Xie et al.はＦｃフォーマットの必要性を記載しており、これは、効力を改善するために分子を二価にすることを包含する（Xie et al., 2014 J. Immunol. 192:4083-4092）。
従って、安全で有効な抗ＣＤ４０Ｌ医薬の必要がある。
本発明者は、機能的なＦｃドメインなしのＣＤ４０Ｌをターゲティングする一価の実体が、血小板凝集および／または活性化による有害事象を誘導することなしにＣＤ４０－ＣＤ４０ＬのＴ細胞共刺激を阻害するであろうモダリティにあたり得るという仮説をたてた。
本発明は、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較して、（例えば、調製の改善された容易さ、良好な安定性、および／または品物の縮減されたコストなどの）他の有利な特性に加えて、改善された予防、治療、および／または薬理学的特性を有するＣＤ４０Ｌに対するポリペプチドを提供することに取りかかった。
非従来的なスクリーニング、キャラクタリゼーション、およびコンビナトリアル戦略に基づいて、本発明者は、意外なことに、スタンドインの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）がインビボの有効性研究およびインビトロの安全性実験において格別な性能であるということを観察した。
その上に、本発明者は、ベンチマークＣＤＰ７６５７よりも高性能であるのみならず、この性能を半減期延長後にもまた保持するように、ＩＳＶＤを作り替えることができた。他方で、本発明のＩＳＶＤは従来技術の抗体よりも有意に安全であることもまた実証された。
従って、本発明は、ＣＤ４０Ｌを標的とするおよび／またはそれに特異的に結合し得る（本明細書において定義される通り）ポリペプチドに関する。
特に、本発明は、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドに関し、ＣＤ４０Ｌへの結合はＣＤ４０Ｌの活性を調節する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する前期ＩＳＶＤは本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦ１からＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）とからなり、
（ｉ）ＣＤＲ１は、
配列番号３３、６１、４０、および６８；ならびに
１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号３３、４０、６１、または６８に対して有するアミノ酸配列、
からなる群から選ばれ；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、
配列番号３５、６３、４２、および７０；ならびに
１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号３５、４２、６３、または７０に対して有するアミノ酸配列、
からなる群から選ばれ；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
配列番号３７、６５、４４、および７２；ならびに
１、２、３、または４個のアミノ酸の違いを配列番号３７、６５、４４、または７２に対して有するアミノ酸配列、
からなる群から選ばれる；
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ１は、
（ａ）配列番号６１；ならびに
（ｂ）１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号６１に対して有し、
－ 位置１においてはＧがＥもしくはＲに変化しており；
－ 位置２においてはＲがＨもしくはＧに変化しており；
－ 位置３においてはＴがＩ、Ａ、Ｓ、もしくはＰに変化しており；
－ 位置４においてはＰがＳに変化しており；
－ 位置５においてはＬがＰに変化しており；
－ 位置６においてはＮがＳ、Ｄ、もしくはＩに変化しており；
－ 位置７においてはＹがＨに変化しており；
－ 位置８においてはＨがＮに変化しており；
－ 位置９においてはＭがＫ、Ｔ、もしくはＶに変化しており；および／または
－ 位置１０においてはＡがＧ、Ｓ、もしくはＴに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ２は、
（ａ）配列番号６３；ならびに
（ｂ）１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号６３に対して有し、
－ 位置１においてはＡがＧに変化しており；
－ 位置２においてはＩがＶに変化しており；
－ 位置４においてはＳがＮ、Ｒ、もしくはＧに変化しており；
－ 位置６においてはＬがＩに変化しており；
－ 位置７においてはＧがＳもしくはＤに変化しており；
－ 位置８においてはＳがＧ、Ｉ、もしくはＦに変化しており；および／または
－ 位置９においてはＴがＰもしくはＳに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ３は、
（ａ）配列番号６５；ならびに
（ｂ）１、２、３、または４個のアミノ酸の違いを配列番号６５に対して有し、
－ 位置１においてはＲがＱもしくはＬに変化しており；
－ 位置２においてはＥがＤもしくはＫに変化しており；
－ 位置３においてはＴがＳ、Ｍ、Ａ、もしくはＫに変化しており；
－ 位置４においてはＴがＩ、Ｓ、Ａ、もしくはＲに変化しており；
－ 位置５においてはＨがＹもしくはＮに変化しており；
－ 位置６においてはＹがＩ、Ｈ、もしくはＮに変化しており；
－ 位置７においてはＳがＴ、Ｇ、Ｎ、もしくはＩに変化しており；
－ 位置８においてはＴがＩもしくはＡに変化しており；
－ 位置９においてはＳがＮもしくはＲに変化しており；
－ 位置１０においてはＤがＡに変化しており；
－ 位置１１においてはＲがＳもしくはＧに変化しており；
－ 位置１３においてはＮがＤ、Ｙ、もしくはＳに変化しており；
－ 位置１４においてはＥがＶ、Ａ、Ｄ、もしくはＮに変化しており；
－ 位置１５においてはＭがＩ、Ｖ、Ｋ、もしくはＴに変化しており；
－ 位置１６においてはＲがＫ、Ｓ、Ｗ、Ｍ、Ｇ、もしくはＴに変化しており；
－ 位置１７においてはＨがＮ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、もしくはＤに変化しており；
－ 位置１９においてはＤがＮに変化しており；および／または
－ 位置２０においてはＹがＨ、Ｆ、もしくはＮに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、
－ ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号３５であり、ＣＤＲ３は配列番号３７であるか；または
－ ＣＤＲ１は配列番号６１であり、ＣＤＲ２は配列番号６３であり、ＣＤＲ３は配列番号６５である。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ＩＳＶＤは配列番号８または配列番号６である。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ１は、
（ａ）配列番号４０；ならびに
（ｂ）１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号４０に対して有し、
－ 位置３においてはＴがＳ、Ｎ、Ａ、もしくはＩに変化しており；
－ 位置４においてはＬがＱ、Ｓ、Ｍ、もしくはＧに変化しており；
－ 位置８においてはＡがＮもしくはＶに変化しており；
－ 位置９においてはＩがＬもしくはＶに変化しており；および／または
－ 位置１０においてはＧがＡに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチド８に関し、ＣＤＲ２は、
（ａ）配列番号４２；ならびに
（ｂ）１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号４２に対して有し、
－ 位置２においてはＩがＶに変化しており；
－ 位置３においてはＳがＧに変化しており；
－ 位置５においてはＥがＧに変化しており；
－ 位置６においてはＧがＳに変化しており；
－ 位置７においてはＳがＧ、Ｎ、Ｔ、もしくはＩに変化しており；
－ 位置８においてはＴがＡ、Ｐ、Ｉ、もしくはＳに変化しており；および／または
－ 位置９においてはＳがＩ、Ｒ、もしくはＧに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ３は、
（ａ）配列番号４４；ならびに
（ｂ）１、２、３、または４個のアミノ酸の違いを配列番号４４に対して有し、
－ 位置４においてはＲがＳに変化しており；
－ 位置７においてはＬがＦ、Ｍ、もしくはＷに変化しており；
－ 位置８においてはＧがＤ、Ａ、もしくはＳに変化しており；
－ 位置９においてはＳがＧ、Ｎ、もしくはＲに変化しており；
－ 位置１０においてはＳがＧ、Ｎ、Ｔ、もしくはＲに変化しており；
－ 位置１２においてはＤがＧ、Ｎ、Ｅ、もしくはＶに変化しており；
－ 位置１３においてはＴがＮもしくはＡに変化しており；
－ 位置１４においてはＱがＨ、Ｋ、Ｌ、もしくはＲに変化しており；
－ 位置１５においてはＳがＰもしくはＴに変化しており；
－ 位置１６においてはＨがＮもしくはＹに変化しており；
－ 位置１７においてはＱがＬ、Ｒ、もしくはＨに変化しており；
－ 位置１８においてはＹがＦに変化しており；
－ 位置１９においてはＤがＧに変化しており；および／または
－ 位置２０においてはＹがＦもしくはＮに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号４４である。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ＩＳＶＤは配列番号７または配列番号３である。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合し、１Ｅ－０７Ｍおよび１Ｅ－１３Ｍの間の、例えば１Ｅ－０８Ｍおよび１Ｅ－１２Ｍの間の、好ましくは多くても１Ｅ－０７Ｍ、好ましくは１Ｅ－０８Ｍもしくは１Ｅ－０９Ｍよりも低い、またはさらには１Ｅ－１０Ｍよりも低い、例えば５Ｅ－１１Ｍ、４Ｅ－１１Ｍ、３Ｅ－１１Ｍ、２Ｅ－１１Ｍ、１．７Ｅ－１１Ｍ、１Ｅ－１１、またはさらには５Ｅ－１２Ｍ、４Ｅ－１２Ｍ、３Ｅ－１２Ｍ、１Ｅ－１２ＭというＫＤを有し、例えばKinExAによって決定される。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合し、１Ｅ－０７Ｍおよび１Ｅ－１２Ｍの間の、例えば１Ｅ－０８Ｍおよび１Ｅ－１１Ｍの間のＩＣ５０を有し、例えばＢ細胞増殖アッセイによって決定またはＢ細胞シグナル伝達アッセイによって決定される。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合し、多くても１Ｅ－０７Ｍ、好ましくは１Ｅ－０８Ｍ、１Ｅ－０９Ｍ、または５Ｅ－１０Ｍ、４Ｅ－１０Ｍ、３Ｅ－１０Ｍ、２Ｅ－１０Ｍ、例えば１Ｅ－１０ＭというＩＣ５０を有する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合し、５Ｅ－０４（ｓ－１）未満のｏｆｆ－ｒａｔｅを有し、例えばＳＰＲによって決定される。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ＣＤ４０Ｌは好ましくはヒトＣＤ４０Ｌ、好ましくは配列番号１８である。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌの活性に拮抗する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらにはより多くのＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合をブロックし、これは例えばリガンド競合、Ｂ細胞活性化アッセイ、AlphaScreen、または競合的結合アッセイ、例えば競合ＥＬＩＳＡもしくは競合ＦＡＣＳ）によって決定される。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ＣＤ８０およびＣＤ８６などのＴ細胞共刺激分子ならびに／またはＩＬ１２などの免疫刺激性分子のＣＤ４０によって媒介される誘導に拮抗する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＢ細胞活性化を阻害する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ジャーカットＴ細胞におけるＪＮＫリン酸化を実質的に誘導しないか、または抗ＣＤ３抗体によって共刺激されたジャーカットＴ細胞によるＩＦＮγ分泌を実質的に誘導しない。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、例えばＴＴ－ＩｇＧアッセイによって決定されるＢ細胞活性化を阻害する。
本発明は、さらに、血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ（ＡＬＢナノボディ）を含む、本明細書に記載されるポリペプチドにもまた関する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）とからなり、ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号７５であり、ＣＤＲ１は配列番号７６である。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、ＡＬＢ１３５（配列番号１５）、ＡＬＢ１２９（配列番号１３）、ＡＬＢ８（配列番号１１）、ＡＬＢ２３（配列番号１２）、およびＡＬＢ１３２（配列番号１４）からなる群から選ばれる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する前記ＩＳＶＤおよび血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、直接的に互いにリンクまたはリンカーを介してリンクされる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記リンカーは、配列番号１８～２９および７７からなる群、好ましくは配列番号２１から選ばれる。
本発明は、さらにＣ末端延長を含む本明細書に記載されるポリペプチドにもまた関する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記Ｃ末端延長はＣ末端延長（Ｘ）ｎであり、式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選ばれる。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、さらに、本明細書に記載される血清アルブミンに結合するＩＳＶＤと、本明細書に記載されるリンカーと、本明細書に記載されるＣ末端延長とを含む。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性をＣ０１０００３３１８（配列番号９）またはＣ０１０００３３１３（配列番号７８）に対して有する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは初代内皮細胞の活性化を実質的に誘導しない。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、例えば血小板活性化アッセイまたは血小板凝集アッセイによって決定される血小板活性化または血小板凝集を実質的に誘導しない。
本発明は、例えばＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０によって媒介される経路の不適切な活性化が関わる個体の疾患または障害の処置すること、防止の方法にもまた関し、方法は、本発明のポリペプチドを前記疾患または障害の症状を処置または防止するために有効な量で前記個体に投与することを含む。
また、本発明は本明細書に記載される方法に関し、前記疾患または障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、移植拒絶、クローン病、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、喘息／アレルギー、動脈硬化症、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、強直性脊椎炎、冠動脈性心疾患、１型糖尿病、および組換え医薬品、例えば血友病における第ＶＩＩ因子に対する免疫応答を含む。
本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載されるポリペプチドにもまた関する。
本発明は、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、移植拒絶、クローン病、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、喘息／アレルギー、動脈硬化症、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、強直性脊椎炎、冠動脈性心疾患、１型糖尿病、および組換え医薬品、例えば血友病における第ＶＩＩ因子に対する免疫応答の症状を処置または防止することへの使用のための、本明細書に記載されるポリペプチドにもまた関する。
また、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ポリペプチド４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つのＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックし、ならびに／またはポリペプチド４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つによってＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックされる。
本発明は、４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つによるＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックするポリペプチドにもまた関し、ならびに／または４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つによってＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックされ、前記ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する少なくとも１つのＶＨ、Ｖ、ｄＡｂ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、ＣＤ４０Ｌへの結合はＣＤ４０Ｌの活性を調節する。
９６個の血清サンプルが、Ｓ１１２Ｋ変異なしの参照ナノボディ（参照Ａ、配列番号１６。図１においては（１）として指示されている）と比較してＳ１１２Ｋ変異を有する代表的なナノボディ（参照Ａ＋Ｓ１１２Ｋ＋Ｃ末端アラニン。図１においては（２）として指示されている）に結合することについて試験されたときの、例６．９．３で得られたデータ点を示すプロット。 １２９個の血清サンプルが、Ｖ８９Ｔ変異なしの参照ナノボディ（参照Ａ、配列番号１６。図２においては（１）として指示されている）と比較してＶ８９Ｔ変異を有する代表的なナノボディ（参照Ａ＋Ｌ１１Ｖ＋Ｖ８９Ｔ＋Ｃ末端アラニン。図２においては（２）として指示されている）に結合することについて試験されたときの、例６．９．３で得られたデータ点を示すプロット； 血小板活性化データＨＶ 血小板活性化データＳＬＥ 血小板凝集データＨＶ 血小板凝集データＳＬＥ 抗ＣＤ４０ＬナノボディはＴＴ－ＩｇＧ応答を損なわせる 指示されている濃度の異なる化合物によるヒトＰＢＭＣ刺激による、ＩＬ－６誘導。
安全で有効な抗ＣＤ４０Ｌ医薬の必要がまだある。それらの医薬は、種々の頻繁に対立する要件に沿うべきである。フォーマットは広く適用可能であるべきである。特に、フォーマットは、好ましくは広範囲の患者に、および好ましくは広範囲のＣＤ４０Ｌによって媒介される障害に対してもまた有用であるべきである。フォーマットは好ましくは安全であるべきであり、いずれかの血栓塞栓事象を誘導するべきではない。加えて、フォーマットは好ましくは患者に優しくあるべきである。例えば、フォーマットは、フォーマットが腎クリアランスによって投与後即座に除去されないような延長した半減期を有するべきである。しかしながら、半減期を延長することは、好ましくはオフターゲット活性および副作用を導入、ＴＥを誘導、または有効性を限定するべきではない。
本発明はこれらの要件の少なくとも１つを実現する。
非従来的なスクリーニング、キャラクタリゼーション、およびコンビナトリアル戦略に基づいて、本発明者は、驚くべきことに、スタンドインの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）がインビボの有効性研究およびインビトロの安全性実験において格別な性能であるということを観察した。
その上に、本発明者は、ベンチマークＣＤＰ７６５７よりも高性能であるのみならず、この性能を半減期延長後にもまた保持するように、ＩＳＶＤを作り替えることができた。他方で、本発明のＩＳＶＤは従来技術の抗体よりも有意に安全であることもまた実証された。
本発明は、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較して、より安全なプロファイルを包含する改善された予防、治療、および／または薬理学的特性を有するＣＤ４０Ｌに拮抗するポリペプチドを提供する。
従って、本発明は、ＣＤ４０Ｌを標的とするおよび／またはそれに特異的に結合（本明細書において定義される通り）およびその活性を調節し得るポリペプチド、具体的にはＣＤ４０Ｌに特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドに関し、ＣＤ４０Ｌへの結合はＣＤ４０Ｌの活性を調節する。
別様に指示または定義されない限り、用いられる全ての用語は当分野におけるそれらの通常の意味を有し、これは当業者には明瞭であろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd. Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987)、Lewin (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985)、Old et al. (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981)；Roitt et al. (Immunology (6th. Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001)、Roitt et al. (Roitt's Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001)、およびJaneway et al. (Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005)、ならびに本明細書において引用される一般的な背景技術の参照がなされる。
別様に指示されない限り、具体的に詳細に記載されない全ての方法、ステップ、技術、および操作は、当業者には明瞭であろう自体公知の様式で行われ得、行われた。再び、例えば、標準的なハンドブックおよび本明細書において挙げられる一般的な背景技術、ならびにそこに引用されているさらなる参照；ならびに例えば次の総説Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006)、Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006)、Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001)、Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000)、Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005)の参照がなされる。これらは、蛋白質工学の技術、例えば、免疫グロブリンなどの蛋白質の特異性および他の所望の特性を改善するための親和性成熟および他の技術を記載している。
本明細書において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明瞭に別様に指示しない限り複数の参照を包含するということに注意しなければならない。それゆえに、例えば、「試薬」の参照はかかる異なる試薬の１つ以上を包含し、「方法」の参照は当業者に公知の同等のステップおよび方法の参照を包含し、それらは改変または本明細書に記載される方法と置換され得る。
別様に指示されない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の中のあらゆる要素を言うと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい通例の実験作業を用いて確かめることができるであろう。かかる均等物は本発明によって包摂されることを意図される。
用語「および／または」は、本明細書においてどこで用いられても、「および」、「または」、および「前記用語によって繋がれている要素の全てまたはいずれかの他の組み合わせ」の意味を包含する。
本明細書において用いられる用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲から２０％以内、好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは５％以内を意味する。
本明細書および次の請求項においては、文脈が別様に要求しない限り、単語「含む（comprise）」、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などのバリエーションは、記されている物もしくはステップまたは物もしくはステップの群の包含を含意するが、いずれかの他の物もしくはステップまたは物もしくはステップの群の排除を含意しないと理解される。本明細書において用いられるときに、用語「含む」は、用語「含有する」もしくは「包含する」によって、または本明細書において用いられるときに場合によっては用語「有する」によって置換され得る。
本明細書において（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」、または「蛋白質配列」のような用語に）用いられる用語「配列」は、文脈がより限定された解釈を要求しない限り、該当するアミノ酸配列、およびそれをコードする核酸またはヌクレオチド配列両方を包含すると一般的に理解されるべきである。
アミノ酸残基は、標準的な３文字または１文字アミノ酸コードに従って指示される。ＷＯ０８／０２００７９の４８ページの表Ａ－２の参照がなされる。
核酸またはアミノ酸は、それがソースまたは媒体中において通常結びついている少なくとも１つの他の成分、例えば別の核酸、別の蛋白質／ポリペプチド、別の生物学的成分、もしくは高分子、または少なくとも１つのコンタミナント、不純物、もしくは副成分から分離されているときに、例えばそれが得られた反応媒体または培養媒体と比較して「（本質的に）単離された（形態）（で）」あると考えられる。具体的には、核酸またはアミノ酸は、それが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より具体的には少なくとも１００倍、最大１０００倍以上精製されたときに、「（本質的に）単離されている」と考えられる。好ましくは、「（本質的に）単離された形態で」ある核酸またはアミノ酸は本質的に均質であり、これは好適な技術、例えば好適なクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて決定される。
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列を「含む」または別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「から本質的になる」と言われるときに、これは、後者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列がそれぞれ第１の挙げられたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中に組み込まれているということを意味し得るが、より通常には、これは、第１の挙げられたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列がその配列中にそれぞれ後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基のストレッチを含むということを一般的に意味し、第１の挙げられた配列が実際にどのように生成されたかまたは得られたか（これは、例えば本明細書に記載されるいずれかの好適な方法によってであり得る）にはかかわらない。限定しない例として、本発明のポリペプチドが免疫グロブリン単一可変ドメインを含むと言われるときには、これは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が本発明のポリペプチドの配列中に組み込まれているということを意味し得るが、より通常には、これは、本発明のポリペプチドがその配列中に免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含有するということを一般的に意味し、本発明の前記ポリペプチドがどのように生成されたかまたは得られたかにはかかわらない。また、核酸またはヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むと言われるときには、第１の挙げられた核酸またはヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現産物（例えばポリペプチド）に発現されるときに、後者のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が前記発現産物の一部を形成する（換言すると、後者のヌクレオチド配列が、第１の挙げられたより大きい核酸またはヌクレオチド配列と同じ読み枠である）ようなものである。
「本質的になる」によって、本発明の方法に用いられる免疫グロブリン単一可変ドメインが、本発明のポリペプチドと厳密に同じであるか、または限定された数のアミノ酸残基、例えば１～２０アミノ酸残基、例えば１～１０アミノ酸残基、好ましくは１～６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５、もしくは６アミノ酸残基が免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端およびカルボキシ末端両方に追加された本発明のポリペプチドに対応するかどちらかであるということが意味される。
２つ以上のヌクレオチド配列を比較する目的のためには、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のヌクレオチド配列中の対応する位置のヌクレオチドと同一である第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］によって除算することと、［１００％］によって乗算することとによって計算され得、第１のヌクレオチド配列と比較して第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換、または追加は、単一のヌクレオチド（位置）の違いとして考えられる。代替的には、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、配列アラインメントのための公知のコンピュータアルゴリズム、例えばNCBI Blast v2.0を用いて、標準的な設定を用いて計算され得る。配列同一性の程度を決定するためのいくつかの他の技術、コンピュータアルゴリズム、および設定は、例えばＷＯ０４／０３７９９９、ＥＰ０９６７２８４、ＥＰ１０８５０８９、ＷＯ００／５５３１８、ＷＯ００／７８９７２、ＷＯ９８／４９１８５、およびＧＢ２３５７７６８に記載されている。通常は、本明細書において上で概述した計算方法に従って２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のためには、最多数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列としてとり、別のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列としてとる。
２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的のためには、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書においては「アミノ酸同一性」ともまた言われる）のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置のアミノ酸残基と同一である第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］によって除算することと、［１００％］によって乗算することとによって計算され得、第１のアミノ酸配列と比較して第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換、または追加は、単一のアミノ酸残基（位置）の違いとして、すなわち本明細書において定義される「アミノ酸の違い」として考えられる。代替的には、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、公知のコンピュータアルゴリズム、例えばヌクレオチド配列の配列同一性の程度を決定することについて上で挙げられたものを用いて、再び標準的な設定を用いて計算され得る。通常は、本明細書において上で概述した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のためには、最多数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列としてとり、別のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列としてとる。
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際に、当業者はいわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れ得、これは一般的にはアミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基によって置き換えられたアミノ酸置換として記載され得、これはポリペプチドの機能、活性、または他の生物学的特性に本質的に影響を有さないかまたは僅かしか有さない。かかる保存的アミノ酸置換は当分野においては例えばＷＯ０４／０３７９９９、ＧＢ３３５７６８、ＷＯ９８／４９１８５、ＷＯ００／４６３８３、およびＷＯ０１／０９３００から周知であり；かかる置換の（好ましい）型および／または組み合わせは、ＷＯ０４／０３７９９９およびＷＯ９８／４９１８５ならびにそこに引用されているさらなる参照からの対応する教示に基づいて選択され得る。
好ましくは、かかる保存的置換は、次の群（ａ）～（ｅ）の中の１つのアミノ酸が同じ群の中の別のアミノ酸残基によって置換された置換である：（ａ）小型の脂肪族の非極性または低極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｙ；（ｂ）極性の負荷電残基およびそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎ；（ｃ）極性の正荷電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；（ｄ）大型の脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、およびＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は次の通りである：ＡｌａからＧｌｙもしくはＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎもしくはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＡｌａもしくはＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎもしくはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕもしくはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅもしくはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ、もしくはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ、もしくはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ、もしくはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｅｕ。
本明細書に記載されるポリペプチドに適用されるいずれかのアミノ酸置換は、Schulz et al. ("Principles of Protein Structure", Springer-Verlag, 1978)によって開発された異なる種の相同蛋白質間におけるアミノ酸バリエーションの頻度の分析、Chou and Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978)によって開発された構造形成ポテンシャルの分析、ならびにEisenberg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984)、Kyte and Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981)およびGoldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986)によって開発された蛋白質の疎水性パターンの分析にもまた基づき得、全て参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ナノボディの一次、二次、および三次構造の情報は、本明細書における記載、および上で引用されている一般的な背景技術において与えられている。また、この目的のためには、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造は、例えばDesmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996)、Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996)、およびDecanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999)によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいてＶＨ／ＶＬ境界面を形成するアミノ酸残基のいくつかとそれらの位置における潜在的なラクダ化置換とについてのさらなる情報は、上で引用されている従来技術に見いだされ得る。
アミノ酸配列同士および核酸配列同士は、それらが１００％の配列同一性（本明細書において定義される通り）をそれらの全長に渡って有する場合には「厳密に同じ」と言われる。
ある態様において、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する本発明のポリペプチドは、少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性をＣ０１０００３３１８（配列番号９）またはＣ０１０００３３１３（配列番号７８）に対して有し、ＣＤ４０Ｌへの結合はＣＤ４０Ｌの活性を調節する。
２つのアミノ酸配列を比較するときに、用語「アミノ酸の違い」は、第２の配列と比較して、第１の配列のある位置における単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を言う；２つのアミノ酸配列は１つ、２つ、またはより多くのかかるアミノ酸の違いを含有し得るということが理解される。より具体的には、本発明のアミノ酸配列および／またはポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸の違い」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列のある位置における単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を言う；ＣＤＲ１配列は、元々のＣＤＲ１配列、例えば、例えば配列番号３３、６１、４０、および６８などの具体的な配列識別子（配列番号）によって例示されるＣＤＲ１配列と比較して１、２、または最大３つのかかるアミノ酸の違いを含有し得；ＣＤＲ２は、元々のＣＤＲ２配列、例えば、例えば配列番号３５、６３、４２、および７０などの具体的な配列識別子（配列番号）によって例示されるＣＤＲ２配列と比較して１、２、または最大３つのかかるアミノ酸の違いを含有し得、ＣＤＲ３配列は、元々のＣＤＲ３配列、例えば、例えば配列番号３７、６５、４４、および７２などの具体的な配列識別子（配列番号）によって例示されるＣＤＲ３配列と比較して１、２、３、または最大４つのかかるアミノ酸の違いを含有し得るということが理解される。
「アミノ酸の違い」は、１、２、３、もしくは最大４つの置換、欠失、もしくは挿入のいずれか、またはそのいずれかの組み合わせであり得る。それは本発明のＩＳＶＤの特性を改善するか、あるいはそれは少なくとも本発明のＩＳＶＤの所望の特性または所望の特性のバランスもしくは組み合わせをあまり害さないかどちらかである。これに関して、本発明のもたらされるポリペプチドは、１、２、３、または最大４つの置換、欠失、または挿入なしの１つ以上のＣＤＲ配列を含むＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤを含むポリペプチドと比較して、少なくとも同じ、約同じ、または好ましくはより高い親和性または効力でＣＤ４０Ｌに結合するべきである。親和性は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定され得、例えば、例において用いられているＫｏｆｆ速度によって表現される。例えば、ＩＣ５０によって表現される効力は、例えば例において用いられているＢ細胞増殖アッセイまたはＢ細胞シグナル伝達アッセイによってなどの当分野において公知のいずれかの好適な方法によって測定され得る。
これに関して、ＣＤＲのアミノ酸配列は、自体公知の親和性成熟の１つ以上の技術を用いる親和性成熟によって、例えば例の項において用いられているエラープローンＰＣＲによって、元々のＣＤＲアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であり得る。例の項においては、本発明のＩＳＶＤの親和性および／または効力が改良され、例えばＣＤＲの単一アミノ酸の違いが１．８倍から５．２倍改善されたｏｆｆ－ｒａｔｅをもたらすということが実証された。ＣＤＲのアミノ酸の違いの組み合わせ、例えば１、２、３、もしくは最大４つの置換、欠失、もしくは挿入、またはそのいずれかの組み合わせは、ｏｆｆ－ｒａｔｅをさらに改善した。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合し、それぞれ２８Ｂ０２および４６Ｂ０３よりも良好な、例えば少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、またはさらにはより多く、例えば１０倍良好なＫｏｆｆを有し、例えばＳＰＲによって決定される。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合し、多くても５Ｅ－０４（ｓ－１）、例えば多くても４Ｅ－０４（ｓ－１）、３Ｅ－０４（ｓ－１）、２Ｅ－０４（ｓ－１）、１Ｅ－０４（ｓ－１）、９Ｅ－０５（ｓ－１）、８Ｅ－０５（ｓ－１）、７Ｅ－０５（ｓ－１）、６Ｅ－０５（ｓ－１）、５Ｅ－０５（ｓ－１）、４Ｅ－０５（ｓ－１）、３Ｅ－０５（ｓ－１）、２Ｅ－０５（ｓ－１）、１０Ｅ－０６（ｓ－１）というＫｏｆｆを有し、例えばＳＰＲによって決定される。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合し、１Ｅ－０７Ｍおよび１Ｅ－１２Ｍの間の、例えば１Ｅ－０８Ｍおよび１Ｅ－１１Ｍの間の、好ましくは多くても１Ｅ－０７Ｍ、好ましくは１Ｅ－０８Ｍもしくは１Ｅ－０９Ｍよりも低い、またはさらには５Ｅ－１０Ｍ、４Ｅ－１０Ｍ、３Ｅ－１０Ｍ、２Ｅ－１０Ｍよりも低い、例えば１Ｅ－１０ＭのＩＣ５０を有し、例えばＢ細胞増殖アッセイまたはＢ細胞シグナル伝達アッセイによって決定される。
例えば、本発明のポリペプチドを発現するために用いられる宿主生物に依存して、かかる挿入、欠失、および／または置換は、翻訳後修飾の１つ以上の部位（例えば１つ以上のグリコシル化部位）が除去されるようなやり方で設計され得、これは当業者の能力内であろう。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）とからなり、
（ｉ）ＣＤＲ１は、
配列番号３３、６１、４０、および６８；ならびに
１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号３３、６１、４０、または６８に対して有するアミノ酸配列、
からなる群から選ばれ；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、
配列番号３５、６３、４２、および７０；ならびに
１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号３５、６３、４２、または７０に対して有するアミノ酸配列、
からなる群から選ばれ；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
配列番号３７、６５、４４、および７２；ならびに
１、２、３、または４個のアミノ酸の違いを配列番号３７、６５、４４、または７２に対して有するアミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ１は、
（ａ）配列番号４０；ならびに
（ｂ）１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号４０に対して有し、
－ 位置３においてはＴがＳ、Ｎ、Ａ、もしくはＩに変化しており；
－ 位置４においてはＬがＱ、Ｓ、Ｍ、もしくはＧに変化しており；
－ 位置８においてはＡがＮもしくはＶに変化しており；
－ 位置９においてはＩがＬもしくはＶに変化しており；および／または
－ 位置１０においてはＧがＡに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ２は、
（ａ）配列番号４２；ならびに
（ｂ）１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号４２に対して有し、
－ 位置２においてはＩがＶに変化しており；
－ 位置３においてはＳがＧに変化しており；
－ 位置５においてはＥがＧに変化しており；
－ 位置６においてはＧがＳに変化しており；
－ 位置７においてはＳがＧ、Ｎ、Ｔ、もしくはＩに変化しており；
－ 位置８においてはＴがＡ、Ｐ、Ｉ、もしくはＳに変化しており；および／または
－ 位置９においてはＳがＩ、Ｒ、もしくはＧに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ３は、
（ａ）配列番号４４；ならびに
（ｂ）１、２、３、または４個のアミノ酸の違いを配列番号４４に対して有し、
－ 位置４においてはＲがＳに変化しており；
－ 位置７においてはＬがＦ、Ｍ、もしくはＷに変化しており；
－ 位置８においてはＧがＤ、Ａ、もしくはＳに変化しており；
－ 位置９においてはＳがＧ、Ｎ、もしくはＲに変化しており；
－ 位置１０においてはＳがＧ、Ｎ、Ｔ、もしくはＲに変化しており；
－ 位置１２においてはＤがＧ、Ｎ、Ｅ、もしくはＶに変化しており；
－ 位置１３においてはＴがＮもしくはＡに変化しており；
－ 位置１４においてはＱがＨ、Ｋ、Ｌ、もしくはＲに変化しており；
－ 位置１５においてはＳがＰもしくはＴに変化しており；
－ 位置１６においてはＨがＮもしくはＹに変化しており；
－ 位置１７においてはＱがＬ、Ｒ、もしくはＨに変化しており；
－ 位置１８においてはＹがＦに変化しており；
－ 位置１９においてはＤがＧに変化しており；および／または
－ 位置２０においてはＹがＦもしくはＮに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ１は、
（ａ）配列番号６１；ならびに
（ｂ）１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号６１に対して有し、
－ 位置１においてはＧがＥもしくはＲに変化しており；
－ 位置２においてはＲがＨもしくはＧに変化しており；
－ 位置３においてはＴがＩ、Ａ、Ｓ、もしくはＰに変化しており；
－ 位置４においてはＰがＳに変化しており；
－ 位置５においてはＬがＰに変化しており；
－ 位置６においてはＮがＳ、Ｄ、もしくはＩに変化しており；
－ 位置７においてはＹがＨに変化しており；
－ 位置８においてはＨがＮに変化しており；
－ 位置９においてはＭがＫ、Ｔ、もしくはＶに変化しており；および／または
－ 位置１０においてはＡがＧ、Ｓ、もしくはＴに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ２は、
（ａ）配列番号６３；ならびに
（ｂ）１、２、または３個のアミノ酸の違いを配列番号６３に対して有し、
－ 位置１においてはＡがＧに変化しており；
－ 位置２においてはＩがＶに変化しており；
－ 位置４においてはＳがＮ、Ｒ、もしくはＧに変化しており；
－ 位置６においてはＬがＩに変化しており；
－ 位置７においてはＧがＳもしくはＤに変化しており；
－ 位置８においてはＳがＧ、Ｉ、もしくはＦに変化しており；および／または
－ 位置９においてはＴがＰもしくはＳに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ３は、
（ａ）配列番号６５：ならびに
（ｂ）１、２、３、または４個のアミノ酸の違いを配列番号６５に対して有し、
－ 位置１においてはＲがＱもしくはＬに変化しており；
－ 位置２においてはＥがＤもしくはＫに変化しており；
－ 位置３においてはＴがＳ、Ｍ、Ａ、もしくはＫに変化しており；
－ 位置４においてはＴがＩ、Ｓ、Ａ、もしくはＲに変化しており；
－ 位置５においてはＨがＹもしくはＮに変化しており；
－ 位置６においてはＹがＩ、Ｈ、もしくはＮに変化しており；
－ 位置７においてはＳがＴ、Ｇ、Ｎ、もしくはＩに変化しており；
－ 位置８においてはＴがＩもしくはＡに変化しており；
－ 位置９においてはＳがＮもしくはＲに変化しており；
－ 位置１０においてはＤがＡに変化しており；
－ 位置１１においてはＲがＳもしくはＧに変化しており；
－ 位置１３においてはＮがＤ、Ｙ、もしくはＳに変化しており；
－ 位置１４においてはＥがＶ、Ａ、Ｄ、もしくはＮに変化しており；
－ 位置１５においてはＭがＩ、Ｖ、Ｋ、もしくはＴに変化しており；
－ 位置１６においてはＲがＫ、Ｓ、Ｗ、Ｍ、Ｇ、もしくはＴに変化しており；
－ 位置１７においてはＨがＮ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、もしくはＤに変化しており；
－ 位置１９においてはＤがＮに変化しており；および／または
－ 位置２０においてはＹがＨ、Ｆ、もしくはＮに変化している、
アミノ酸配列、
からなる群から選ばれる。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、
－ ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号３５であり、ＣＤＲ３は配列番号３７であるか；または
－ ＣＤＲ１は配列番号６１であり、ＣＤＲ２は配列番号６３であり、ＣＤＲ３は配列番号６５である。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ＩＳＶＤは配列番号８または配列番号６である。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、ＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号４４である。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ＩＳＶＤは配列番号７または配列番号３である。
本明細書において用いられる「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」、または「ファミリー」は、同一の長さを有し（すなわち、それらの配列中に同数のアミノ酸を有する）、その位置８と位置１０６との間のアミノ酸配列（Kabat付番に従う）が例えば８５％、９０％、９５％、またはさらにはより多く、例えば９９％などの少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するナノボディおよび／またはＶＨＨ配列の群を言う。
交換可能に用いられ得る用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、本発明の免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ＶＨＨ、ナノボディ、および／またはポリペプチドなどの抗原結合分子によって、より具体的には前記分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドまたは蛋白質などの高分子の部分を言う。エピトープは免疫グロブリンにとっての最小結合部位を定義し、それゆえに免疫グロブリンの特異性の標的にあたる。
エピトープを認識する抗原結合分子（例えば、本発明の免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、および／またはポリペプチド）の部分は、「パラトープ」と呼ばれる。
ある種のエピトープ、抗原、または蛋白質（またはその少なくとも１つの部分、断片、またはエピトープ）に「結合」もしくは「特異的に結合」し得る、それに対して「親和性を有する」、および／またはそれに対して「特異性を有する」ポリペプチド（例えば、本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または一般的に抗原結合分子もしくはその断片）は、前記エピトープ、抗原、もしくは蛋白質「に対する」もしくは「を標的とする」と言われるか、またはかかるエピトープ、抗原、もしくは蛋白質に関して「結合」分子であるか、または「抗」エピトープ、「抗」抗原、もしくは「抗」蛋白質（例えば「抗」ＣＤ４０Ｌ）であると言われる。
親和性は、分子相互作用の強さまたは安定性を示す。普通は、親和性はＫＤまたは解離定数として与えられ、これはｍｏｌ／リットル（またはＭ）の単位を有する。親和性は会合定数ＫＡとしてもまた表現され得、これは１／ＫＤに等しく、（ｍｏｌ／リットル）－１（またはＭ－１）の単位を有する。本明細書において、２つの分子間の相互作用の安定性は、主にそれらの相互作用のＫＤ値に換算して表現される；関係ＫＡ＝１／ＫＤに鑑みて、分子相互作用の強さをそのＫＤ値によって規定することが、対応するＫＡ値を計算するためにもまた用いられ得るということは当業者には明瞭である。ＫＤ値は、熱力学的な意味でもまた分子相互作用の強さをキャラクタリゼーションする。なぜなら、それは周知の関係ＤＧ＝ＲＴ．Ｉｎ（ＫＤ）（同等にＤＧ＝－ＲＴ．Ｉｎ（ＫＡ））によって結合の自由エネルギーの変化（ＤＧ）に関係づけられるからであり、式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す。
有意（例えば特異的）と考えられる生物学的相互作用のＫＤは、典型的には１０－１０Ｍ（０．１ｎＭ）から１０－５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強いほど、そのＫＤは低い。
ＫＤは、ｋｏｆｆとして示される複合体の解離速度定数対ｋｏｎとして示されるその会合の速度の比としてもまた表現され得る（その結果、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎかつＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。ｏｆｆ－ｒａｔｅのｋｏｆｆは単位ｓ－１を有する（式中、ｓは秒のＳＩ単位表記である）。ｏｎ－ｒａｔｅのｋｏｎは単位Ｍ－１ｓ－１を有する。ｏｎ－ｒａｔｅは１０２Ｍ－１ｓ－１から約１０７Ｍ－１ｓ－１の間で変動し得、二分子相互作用では拡散律速の会合速度定数に近づく。ｏｆｆ－ｒａｔｅは関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆによって所与の分子相互作用の半減期に関係づけられる。ｏｆｆ－ｒａｔｅは１０－６ｓ－１（複数日のｔ１／２を有するほぼ不可逆的な複合体）から１ｓ－１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変動し得る。
測定されるＫＤは、測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサー上のコーティングに関するアーティファクトによって、関与する分子の固有の結合親和性に何らかに影響する場合に、見かけ上のＫＤに対応し得る。見かけ上のＫＤは、１つの分子が別の分子に対して１つ超の認識部位を含有する場合にもまた測定され得る。かかる状況において、測定される親和性は２つの分子による相互作用のアビディティによって影響され得る。
親和性を評価するために用いられ得る別のアプローチは、Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985)の２ステップＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）手続きである。この方法は、溶液相結合平衡測定を確立し、プラスチックなどの支持体上への分子の１つの吸着に関するあり得るアーティファクトを回避する。
しかしながら、ＫＤの正確な測定は極めて労働集約的であり得、帰結として、多くの場合には、見かけ上のＫＤ値が決定されて、２つの分子の結合強さを評価する。全ての測定が一貫したやり方でなされる（例えば、アッセイ条件を不変に保つ）限り、見かけ上のＫＤ測定は真のＫＤの近似として用いられ得るということに注意すべきであり、ゆえに、本文書において、ＫＤおよび見かけ上のＫＤは等しい重要性または妥当性で扱われるべきである。
最後に、多くの状況において、経験がある科学者は、何らかの参照分子に対して相対的に結合親和性を決定することが便利であると判断し得るということに注意すべきである。例えば、分子ＡおよびＢの間の結合強さを評価するためには、例えば、Ｂに結合することが既知であり、かつフルオロフォアもしくはクロモフォア基または他の化学的部分、例えばＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）における容易な検出のためのビオチンもしくは他のフォーマット（蛍光検出のためのフルオロフォア、吸光検出のためのクロモフォア、ストレプトアビジンによって媒介されるＥＬＩＳＡ検出のためのビオチン）によって好適に標識される参照分子Ｃを用い得る。典型的には、参照分子Ｃは一定濃度に保たれ、Ａの濃度がＢの所与の濃度または量に対して変動させられる。結果として、Ａの不在下においてＣについて測定されるシグナルが半減するＡの濃度に対応するＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆおよび参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であるならば、相互作用Ａ－Ｂの見かけ上のＫＤは次式から得られ得る：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆの場合には、ＫＤ≒ＩＣ５０ということに注意。ＩＣ５０の測定が、比較される結合剤について（例えばｃｒｅｆを一定に保つ）一貫したやり方で行われるならば、分子相互作用の強さまたは安定性はＩＣ５０によって評価され得、この測定は本書においてはＫＤまたは見かけ上のＫＤと同等と判断される。
抗原または抗原決定基へのＩＳＶＤなどの抗原結合蛋白質の特異的結合は、自体公知のいずれかの好適な様式で決定され得、例えば、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびに当分野において自体公知のその異なるバリアント；ならびに本明細書において挙げられる他の技術を包含する。
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、自体公知の異なる技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術によって測定され得（例えばOber et al., 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559を見よ）、そこでは１つの分子がバイオセンサーチップ上に固定化され、別の分子が、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定、ゆえにＫＤ（またはＫＡ）値を与える流れ条件下において固定化された分子上を通過させられる。例えば、これは周知のBiacore装置を用いて行われ得る（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）。速度論的排除法（KinExA）（Drake et al., 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43）は、結合パートナーの標識なしに溶液中の結合事象を測定し、複合体の解離を速度論的に排除することに基づく。
本発明のポリペプチドは傑出した親和性を有するということが実証された。従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合し、１Ｅ－０７Ｍおよび１Ｅ－１３Ｍの間の、例えば１Ｅ－０８Ｍおよび１Ｅ－１２Ｍの間の、好ましくは多くても１Ｅ－０７Ｍ、好ましくは１Ｅ－０８Ｍもしくは１Ｅ－０９Ｍよりも低い、またはさらには１Ｅ－１０Ｍよりも低い、例えば５Ｅ－１１Ｍ、４Ｅ－１１Ｍ、３Ｅ－１１Ｍ、２Ｅ－１１Ｍ、１．７Ｅ－１１Ｍ、１Ｅ－１１Ｍ、またはさらには５Ｅ－１２Ｍ、４Ｅ－１２Ｍ、３Ｅ－１２Ｍ、１Ｅ－１２ＭのＫＤを有し、例えばKinExAによって決定される。
Gyrolab（商標）イムノアッセイシステムは、自動バイオ分析および迅速なサンプルターンアラウンドのためのプラットフォームを提供する（Fraley et al., 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）。
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサー上のコーティングに関するアーティファクトによって、関与する分子の固有の結合親和性に何らかに影響する場合に、測定されるＫＤが見かけ上のＫＤに対応し得るということもまた当業者には明瞭であろう。また、見かけ上のＫＤは、１つの分子が別の分子について１つ超の認識部位を含有する場合に測定され得る。かかる状況において、測定される親和性は２つの分子による相互作用のアビディティによって影響され得る。
用語「特異性」は、ＷＯ０８／０２００７９の５３～５６ページのパラグラフｎ）においてそれに与えられている意味を有し；そこで挙げられているように、具体的な抗原結合分子または抗原結合蛋白質（例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチド）が結合し得る抗原または抗原決定基の異なる型の数を言う。抗原結合蛋白質の特異性は、親和性および／またはアビディティに基づいて、ＷＯ０８／０２００７９の５３～５６ページ（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているように決定され得、これは抗原結合分子（例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチド）と対応する抗原との間の結合を測定するためのいくつかの好ましい技術をもまた記載している。典型的には、抗原結合蛋白質（例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチド）はそれらの抗原に結合し、１０－５から１０－１２モル／リットル以下、好ましくは１０－７から１０－１２モル／リットル以下、より好ましくは１０－８から１０－１２モル／リットルという解離定数（ＫＤ）を有する（すなわち、１０５から１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７から１０１２リットル／モル以上、より好ましくは１０８から１０１２リットル／モルという会合定数（ＫＡ）を有する）。１０－４ｍｏｌ／リットルよりも大きいいずれかのＫＤ値（または１０４Ｍ－１よりも低いいずれかのＫＡ値）リットル／ｍｏｌは、一般的には、非特異的結合を指示すると考えられる。好ましくは、本発明の一価のポリペプチドは所望の抗原に結合し、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは、例えば１０および５ｎＭ以下の間などの１０ｎＭ未満の親和性を有する。抗原または抗原決定基への抗原結合蛋白質の特異的結合は、自体公知のいずれかの好適な様式で決定され得、例えば、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびに当分野において自体公知のその異なるバリアント；ならびに本明細書において挙げられる他の技術を包含する。当業者には明瞭であろう通り、ＷＯ０８／０２００７９の５３～５６ページに記載されているように、解離定数は実際のまたは見かけ上の解離定数であり得る。解離定数を決定するための方法は当業者には明瞭であろう。例えば、ＷＯ０８／０２００７９の５３～５６ページに挙げられている技術を包含する。
免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドは、それが第１の抗原に結合し、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原（すなわち第１の標的または抗原とは異なり、例えばＣＤ４０Ｌのエピトープとは異なる）に結合する親和性よりも少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、最大１００００倍以上良好である親和性（上に記載されている通りであり、好適には、ＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度および／またはＫｏｎ速度として表現される）を有するときに、第２の標的または抗原と比較して第１の標的または抗原、例えばＣＤ４０Ｌのエピトープ「に特異的」であると言われる。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドは、前記免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原に結合するＫＤよりも少なくとも１０倍小さい、例えば少なくとも１００倍小さい、好ましくは少なくとも１０００倍小さい、例えば１００００倍小さい、またはさらにはそれ未満のＫＤ値で、第１の標的または抗原に結合し得る。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原と比較して第１の標的または抗原「に特異的」であるときには、それは（本明細書において定義される通り）前記第１の標的または抗原を標的とするが、前記第２の標的または抗原を標的としない。
ＣＤ４０ＬはＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＴＮＦ関連活性化蛋白質（ＴＲＡＰ）、５ｃ８抗原、またはＴ－ＢＡＭとしてもまた公知である。ヒトＣＤ４０Ｌの該当する構造情報は例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９９６５に見いだされ得る。「ヒトＣＤ４０Ｌ」は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤ４０Ｌを言う。ある側面において、本発明のポリペプチドは、これもまたシーケンシングされているHuman sapiens、Mus musculus、Canis familiaris、Bos taurus、Macaca mulatto、Macaca fascicularis、Macaca nemestrina、Aotus tivirgatus、Callithrix jacchus、Cercocebus torquatus atys、Rattus norvegicus、Gallus gallus、Felis catus、および／またはSus scrofaからのＣＤ４０Ｌ、好ましくはヒトＣＤ４０Ｌ、好ましくは配列番号１に特異的に結合する。
用語「（交差）ブロックする（(cross)-block）」、「（交差）ブロックされる（(cross)-blocked）」、「（交差）ブロック（(cross)-blocking）」、「競合的結合」、「（交差）競合する（(cross)-compete）」、「（交差）競合する（(cross)-competing）」、および「（交差）競合（(cross)-competition）」は、本明細書においては交換可能に用いられて、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または他の結合剤が所与の標的への他の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または結合剤の結合に干渉する能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または他の結合剤が標的への別のものの結合に干渉できる度合いと、よってそれが本発明に従って交差ブロックすると言われ得るかどうかとは、例えば、精製されたＩＳＶＤを、例に記載されている競合ＥＬＩＳＡにおいてファージ上に提示されたＩＳＶＤに対してスクリーニングすることによってなどの競合結合アッセイを用いて決定され得る。ＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤがＣＤ４０Ｌに結合する別のＩＳＶＤ（例えば、競合ＥＬＩＳＡにおける精製されたＩＳＶＤ）と完全に競合する場合には、前記ＩＳＶＤ同士は同じエピトープビンに属する。ＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤがＣＤ４０Ｌに結合する別のＩＳＶＤ（例えば、競合ＥＬＩＳＡにおける精製されたＩＳＶＤ）と競合しないかまたは部分的にのみ競合する場合には、前記ＩＳＶＤ同士は異なるエピトープビンに属する。７つの異なるエピトープビンが、ＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤのリードパネルから同定された。
従って、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド、例えば配列番号３、４、５、６、７、８、９、７８、７９、８０、８１、または８２に関し、前記ポリペプチドはあるポリペプチドと競合し、これは例えば競合ＥＬＩＳＡによって決定される。
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド、例えば配列番号３、４、５、６、７、８、９、７８、７９、８０、８１、または８２と競合する競合剤、例えばポリペプチドを決定する方法に関し、本明細書に記載されるポリペプチドは、例えばｈＣＤ４０Ｌ（配列番号１）などのＣＤ４０Ｌへの結合について競合剤ポリペプチドと競合またはそれを交差ブロックし、競合剤のＣＤ４０Ｌへの結合は、本発明のポリペプチドの不在下における競合剤のＣＤ４０Ｌへの結合と比較して、本発明のポリペプチドの存在下においては少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはさらにはより多く、例えば８０％、９０％、またはさらには１００％縮減される（すなわち所与のアッセイにおいて実質的に検出不能）。競合および交差ブロックは、例えば競合ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳアッセイなどの当分野において公知のいずれかの手段によって決定され得る。ある側面において、本発明は本発明のポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ポリペプチド４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つのＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックし、ならびに／またはポリペプチド４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つによってＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックされる。
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド、例えば配列番号３、４、５、６、７、８、９、７８、７９、８０、８１、または８２と競合する競合剤にもまた関し、競合剤は、ＣＤ４０Ｌへの結合について本明細書に記載されるポリペプチドと競合またはそれを交差ブロックし、本発明のポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合は、前記競合剤の不在下における本発明のポリペプチドによるＣＤ４０Ｌへの結合と比較して、前記競合剤の存在下においては少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはさらにはより多く、例えば８０％、またはさらにはより多く、例えば少なくとも９０％、またはさらには１００％縮減される（すなわち所与のアッセイにおいて実質的に検出不能）。ある側面において、本発明は、本発明のポリペプチド、例えば４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）によるＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックするポリペプチドに関し、ならびに／または４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つによってＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックされ、前記ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する少なくとも１つのＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、ＣＤ４０Ｌへの結合はＣＤ４０Ｌの活性を調節する。
本発明に従って、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または他の結合剤が交差ブロックするかまたは交差ブロックする能力があるかどうかを決定するための好適なＦＡＣＳアッセイが下に記載される。アッセイが、本明細書に記載される免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または他の結合剤のいずれかに用いられ得るということは理解されるであろう。ＦＡＣＳ装置（例えばFACS Canto；Becton Dickinson）は製造者の推奨に合わせて運転される。
ＣＤ４０Ｌに結合することについて（例えば、２つの免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはナノボディなどの）２つの結合剤間の「（交差）ブロック」または「（交差）競合」を評価するためには、ＦＡＣＳ競合実験が、（例えばＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３Ｈ細胞などの）ヒトＣＤ４０Ｌを過剰発現する細胞とバックグラウンド細胞株としての親細胞とを用いて行われ得る。異なる検出試薬が用いられ得、例えばモノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、ｃａｔ＃Ｆ１８０４）、モノクローナル抗Ｃ－ｍｙｃ抗体（Sigma-Aldrich、ｃａｔ＃ＷＨ０００４６０９Ｍ２）、モノクローナル抗ＨＩＳタグ抗体（Sigma-Aldrich、ｃａｔ＃ＳＡＢ１３０５５３８）を包含し、それぞれは異なって標識される。
広範囲のフルオロフォアがフローサイトメトリーの標識として用いられ得、当業者に公知である。フルオロフォアまたは単純に「ｆｌｕｏｒ」は、典型的には、ＣＤ４０Ｌを認識する抗体（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはナノボディ）に、または検出試薬として用いられる抗体に取り付けられる。（限定することなしに）例えばAlexa Fluor（登録商標）、DyLight（登録商標）、ローダミン、ＰＥ、ＦＩＴＣ、およびＣｙ３にコンジュゲーションされた抗体などの、種々のコンジュゲーション抗体が利用可能である。
ある標的を標的とする免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または他の結合剤が、本明細書において定義されるように（交差）ブロックする、（交差）ブロックする能力がある、競合的に結合する、または（交差）競合性であるかどうかを決定するための他の方法は、例えばXiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004)、Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011)、および／または本明細書に記載される方法（例えば例７を見よ）に記載されている。
アミノ酸配列は、２つの異なる抗原または抗原決定基（例えば、哺乳動物の２つの異なる種からの血清アルブミン等、例えばヒト血清アルブミンおよびカニクイ（「ｃｙｎｏ」）血清アルブミン等、例えば哺乳動物の異なる種からのＣＤ４０Ｌ、例えばヒトＣＤ４０Ｌ、ｃｙｎｏＣＤ４０Ｌ、およびラットＣＤ４０Ｌ等）について、それがそれらの異なる抗原または抗原決定基に（本明細書において定義される通り）特異的である場合には「交差反応性」であると言われる。２つの異なる抗原に対する結合親和性は例えば係数２、５、１０、５０、１００、またはさらにはより多くだけ異なり得るが、それがそれらの異なる抗原または抗原決定基に（本明細書において定義される通り）特異的であるならば、アミノ酸配列またはポリペプチドは交差反応性であると考えられ得るということは理解されるであろう。
本発明の文脈において、「調節する（modulating）」または「調節する（to modulate）」は、一般的には、好適なインビトロ、細胞、またはインビボアッセイ（例えば本明細書において挙げられるもの）を用いて測定されるＣＤ４０Ｌの活性を変改することを意味する。特に、「調節する（modulating）」または「調節する（to modulate）」は、（例えば、本明細書において挙げられるものなどの）好適なインビトロ、細胞、またはインビボアッセイを用いて測定して、本発明の免疫グロブリンまたはポリペプチドの存在なしでの同じ条件下の同じアッセイにおけるＣＤ４０Ｌの活性と比較して少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％もしくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％以上、ＣＤ４０Ｌの活性を縮減もしくは阻害することまたは代替的には活性を増大させることどちらかを意味し得る。
「調節する」は、ＣＤ４０Ｌが関わる（あるいは、そのシグナル伝達経路または代謝経路およびそれらの関連する生物学的または生理学的効果などの、その基質（単数もしくは複数）、リガンド（単数もしくは複数）、または経路（単数もしくは複数）が関わる）１つ以上の生物学的または生理学的メカニズム、効果、応答、機能、経路、または活性に関して変化を奏することをもまた意味し得る。再び、当業者には明瞭であろう通り、かかる作用は、いずれかの好適な様式で、および／または自体公知のいずれかの好適な（インビトロおよび通常は細胞またはインビボアッセイ）アッセイ、例えば本明細書または本明細書において引用される従来技術に記載されるアッセイを用いて決定され得る。特に、作用は、意図される生物学的または生理学的活性が、本発明の免疫グロブリン、ＩＳＶＤ、またはポリペプチドの存在なしでの同じ条件下の同じアッセイにおける生物学的または生理学的活性と比較してそれぞれ少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％もしくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％以上増大または減少するようなものであり得る。調節には、Ｂ細胞および／またはＴ細胞活性化および／または増殖の縮減および／または阻害が関わり得る。調節には、（望まれない）免疫応答の縮減、阻害、および／または抑制が関わり得る。
「ＣＤ４０Ｌ活性」および「ＣＤ４０Ｌによる活性」（これらの用語は本明細書において交換可能に用いられる）は、ＡＰＣ上のＭＨＣ分子によるＴ細胞受容体刺激と結びついたＡＰＣの共刺激および活性化、サイトカインの存在下における全ての免疫グロブリンアイソタイプの分泌、Ｂ細胞増殖の刺激、Ｂ細胞活性化、サイトカイン産生、抗体クラススイッチ、および親和性成熟を包含するが、これに限定されない。例えば、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群の患者は機能的なＣＤ４０をそれらのＢ細胞上に発現するが、それらの活性化Ｔ細胞は不完全なＣＤ４０Ｌ蛋白質を有し、Ｂ細胞を活性化および免疫グロブリンアイソタイプスイッチを誘導するその不能をもたらす（Aruffo et al., 1993 Cell 72:291-300）。
ＣＤ４０Ｌ活性は他の分子との相互作用によって媒介され得る。「ＣＤ４０Ｌ活性」は、ＣＤ４０Ｌと次の分子との間の機能的な相互作用を包含する：ＣＤ４０（ＣＤ４０Ｌ受容体；例えばｈＣＤ４０、配列番号２）、α５β１インテグリン、およびαＩ３／４β３。例えば、ＣＤ４０Ｌはその受容体ＣＤ４０に結合し、これは種々のＡＰＣ、例えばＢ細胞、マクロファージ、および樹状細胞、ならびに間質細胞、血管内皮細胞、および血小板上に発現されている。このように、ＣＤ４０Ｌ活性は、ＣＤ８０およびＣＤ８６などのＴ細胞共刺激分子ならびにＩＬ１２などの免疫刺激性分子のＣＤ４０によって媒介される誘導を包含する。
本明細書において用いられる用語「活性化する（activate）」、「活性化する（activates）」、および「活性化される（activated）」は、参照に対して相対的に少なくとも１０％、例えば少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、またはさらには１００％以上の、所与の測定可能なＣＤ４０Ｌ活性の増大を言う。ＣＤ４０Ｌ活性は、活性が、拮抗物質の不在に対して相対的に少なくとも１０％、例示的な態様においては少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、またはさらには１００％（すなわち、検出可能な活性なし）縮減される場合には、「拮抗される」。例えば、本発明のポリペプチドはいくらかのまたは全てのＣＤ４０Ｌ活性に拮抗し得る。１つの態様において、本発明のポリペプチドはＢ細胞増殖を活性化しない。別の態様において、本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞または樹状細胞（ＤＣ）によるサイトカイン分泌を活性化せず、ここで、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインである。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌの活性に拮抗することによってＣＤ４０Ｌの活性を調節する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を好ましくは少なくとも７０％、例えば８０％、９０％、９５％、またはさらにはより多くブロックし、これはリガンド競合によって決定／（Ｂ細胞活性化ＦＡＣＳ；AlphaScreenによって決定される。例の項をもまた見よ）によって決定される。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ＣＤ８０およびＣＤ８６などのＴ細胞共刺激分子ならびにＩＬ１２などの免疫刺激性分子のＣＤ４０によって媒介される誘導に拮抗する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＢ細胞活性化に拮抗する。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ジャーカットＴ細胞におけるＪＮＫリン酸化を実質的に誘導しないか、または抗ＣＤ３抗体によって共刺激されたジャーカットＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に誘導しない。
従って、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、例えばマウスまたはサルにおいて、例えばＴＴ－ＩｇＧアッセイによって決定されるＢ細胞活性化に拮抗する。
ある態様において、本発明のポリペプチドは初代内皮細胞の活性化を実質的に誘導しない。
ある態様において、本発明のポリペプチドは、例えば血小板活性化アッセイまたは血小板凝集アッセイによって決定される血小板活性化または血小板凝集を実質的に誘導しない。
本発明のポリペプチドの本明細書において用いられる用語「効力」は、その特異的な効果が起こるために要求される本発明のポリペプチドの量の関数である。これは、単純にそのポリペプチドのＩＣ５０の逆数として測定される。これは、本発明の前記ポリペプチドがＣＤ４０Ｌの活性を調節および／または部分的にもしくは完全に阻害する能力を言う。より具体的には、これは、前記ポリペプチドが本明細書において定義されるＣＤ４０Ｌ活性の活性を縮減またはさらには全く阻害する能力を言い得る。このように、これは、前記ポリペプチドがＴ細胞の増殖を阻害および／またはＴ細胞の活性化を抑制し、インビボのある種の免疫応答の阻害をもたらす能力を言い得る。
効力は、当分野において公知のまたは本明細書に記載されているいずれかの好適なアッセイによって測定され得る。
本発明のポリペプチドの「有効性」は、飽和ポリペプチド濃度における効果そのものの最大の強さを測定する。有効性は、本発明のポリペプチドからの達成可能な最大の応答を指示する。これは、ポリペプチドが所望の（治療）効果を産生する能力を言う。
アミノ酸配列は、文脈文脈に依存して、単一アミノ酸または２つ以上のアミノ酸の非分枝の配列を意味すると解釈される。ヌクレオチド配列は、３ヌクレオチド以上の非分枝の配列を意味すると解釈される。
アミノ酸は、天然に存在する蛋白質中に普通に見いだされるＬ－アミノ酸であり、普通に当分野において公知である。Ｄ－アミノ酸を含有するアミノ酸配列は、この定義によって包摂されることを意図されない。連結部、クロスリンクおよびエンドキャップ、非ペプチジル結合などで改変された配列として発現され得るいずれかのペプチドまたは蛋白質はこの定義によって包摂される。
用語「蛋白質」、「ペプチド」、「蛋白質／ペプチド」、および「ポリペプチド」は本開示においては交換可能に用いられ、それぞれは本開示の目的のためには同じ意味を有する。各用語は、２つ以上のアミノ酸の直鎖から作られた有機化合物を言う。化合物は、１０アミノ酸以上；２５アミノ酸以上；５０アミノ酸以上；１００アミノ酸以上、２００アミノ酸以上、さらには３００アミノ酸以上を有し得る。当業者は、ポリペプチと蛋白質とを区別するアミノ酸数の当分野において認識されるカットオフポイントはないが、ポリペプチドが一般的に蛋白質よりも少数のアミノ酸を含むということと；ポリペプチドは化学合成または組換え法によって作られ得るということと；蛋白質は一般的に当分野において公知の組換え法によってインビトロまたはインビボで作られるということとを理解するであろう。
慣例的に、ポリペプチドの一次構造中のアミド結合はアミノ酸が書かれる順序であり、ポリペプチドのアミン末端（Ｎ末端）は常に左側であり、酸末端（Ｃ末端）は右側である。
本発明のポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌに結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、および好ましくは血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをもまた含む。本発明のポリペプチドにおいて、ＩＳＶＤ同士は直接的にリンクまたはリンカーを介してリンクされ得る。さらにはより好ましくは、本発明のポリペプチドはＣ末端延長を含む。下で詳述されるように、Ｃ末端延長は、ヒト対象／患者の大部分のサンプル中の既存抗体／因子の結合を本質的に防止／除去する。Ｃ末端延長は、最後の（最もＣ末端に在る）ＩＳＶＤの最後のアミノ酸残基（通常はセリン残基）のＣ末端に存在する。
相対的な親和性は、ポリペプチド中のＩＳＶＤの在り処に依存し得る。本発明のポリペプチド中のＩＳＶＤの順序（配置）が当業者の必要に従って選ばれ得るということは理解されるであろう。個々のＩＳＶＤの順序、およびポリペプチドがリンカーを含むかどうかは、設計選択肢の問題である。リンカーありまたはなしのいくつかの配置は、他の配置と比較して好ましい結合性質を提供し得る。例えば、本発明のポリペプチド中の第１のＩＳＶＤ（例えばＩＳＶＤ１）および第２のＩＳＶＤ（例えばＩＳＶＤ２）の順序は（Ｎ末端からＣ末端に）：（ｉ）ＩＳＶＤ１（例えばナノボディ１）－［リンカー］－ＩＳＶＤ２（例えばナノボディ２）－［Ｃ末端延長］；または（ｉｉ）ＩＳＶＤ２（例えばナノボディ２）－［リンカー］－ＩＳＶＤ１（例えばナノボディ１）－［Ｃ末端延長］であり得る；（式中、カギ括弧間の部分、すなわちリンカーおよびＣ末端延長は任意である）。全ての配置は本発明によって包摂される。所望の結合性質を提供するＩＳＶＤの配置を含有するポリペプチドは、通例のスクリーニングによって、例えば例の項に例示されているように容易に同定され得る。好ましい順序はＮ末端からＣ末端に：ＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤ－［リンカー］－血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ－［Ｃ末端延長］であり、式中、カギ括弧間の部分は任意である。
本発明のポリペプチドにおいて、２つ以上のＩＳＶＤ、例えばナノボディは、直接的に互いにリンクされ得（例えばＷＯ９９／２３２２１に記載されている通り）、および／または互いに１つ以上の好適なリンカーもしくはそのいずれかの組み合わせを介してリンクされ得る。本発明のポリペプチドへの使用のための好適なリンカーは当業者には明瞭であろう。一般的には、アミノ酸配列をリンクするために当分野において用いられるいずれかのリンカーであり得る。好ましくは、前記リンカーは、医薬使用を意図される蛋白質またはポリペプチドを構築することへの使用に好適である。
いくつかの特に好ましいリンカーは、抗体断片または抗体ドメインをリンクするために当分野において用いられるリンカーを包含する。それらは、上で引用されている公開に挙げられているリンカー、および例えば、ｄｉａｂｏｄｙまたはＳｃＦｖ断片を構築するために当分野において用いられるリンカーを包含する（しかしながら、これに関しては、ｄｉａｂｏｄｙおよびＳｃＦｖ断片においては、用いられるリンカー配列は、対応するＶＨおよびＶＬドメインが一緒になって完全な抗原結合部位を形成することを許す長さ、柔軟性の程度、および他の特性を有するべきであるが、本発明のポリペプチドに用いられるリンカーの長さまたは柔軟性には特に限定がないということに注意すべきである。なぜなら、ナノボディなどの各ＩＳＶＤはそれ自体が完全な抗原結合部位を形成するからである）。
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸またはアミノ酸配列、特に、１および５０、好ましくは１および３０、例えば１および１０アミノ酸残基の間のアミノ酸配列であり得る。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例は、例えばＷＯ９９／４２０７７に記載されている（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のｇｌｙ－ｓｅｒリンカー、例えば（例えば（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３、ならびに本明細書において挙げられるAblynxによる出願に記載されているＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９、およびＧＳ７リンカー（例えばＷＯ０６／０４０１５３およびＷＯ０６／１２２８２５を見よ）、ならびにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域または類似の配列（例えばＷＯ９４／０４６７８に記載されている）を包含する。好ましいリンカーが表１に示されている。
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（例えばＡＡＡ）、ならびにリンカーＧＳ３０（ＷＯ０６／１２２８２５の配列番号８５）およびＧＳ９（ＷＯ０６／１２２８２５の配列番号８４）である。好ましい側面において、リンカーは、配列番号１８～２９および７７からなる群、好ましくは配列番号２１から選ばれる。
用いられるリンカーの長さ、柔軟性の程度、および／または他の特性（これは通常はＳｃＦｖ断片に用いられるリンカーのためであるので、重大ではないが）が、ケモカインまたは他の抗原の１つ以上に対する親和性、特異性、またはアビディティを包含するがこれに限定されない本発明の最終的なポリペプチドの特性に何らかの影響を有し得るということは本発明の範囲内に包摂される。本明細書における開示に基づいて、当業者は、任意にいくつかの限定された通例の実験後に、本発明の具体的なポリペプチドへの使用にとって最適なリンカーを決定できるであろう。
２つ以上のリンカーが本発明のポリペプチドに用いられるときに、それらのリンカーは同じかまたは異なり得る。再び、本明細書における開示に基づいて、当業者は、任意にいくつかの限定された通例の実験後に、本発明の具体的なポリペプチドへの使用にとって最適なリンカーを決定できるであろう。
本発明のポリペプチドにおいて、ＩＳＶＤはＮ末端延長によって先行され得る。本発明の文脈において、Ｎ末端延長は、少なくとも１つのアミノ酸残基から最大４０アミノ酸残基、好ましくは２および３０アミノ酸残基の間、例えば、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基などの２および２０アミノ酸残基の間のアミノ酸配列からなる。Ｎ末端延長は、本発明のポリペプチドの第１の（すなわち最もＮ末端に在る）ＩＳＶＤの第１の（すなわち、最もＮ末端に在る、一般的にKabat付番に従ってアミノ酸１として指定される）アミノ酸残基のＮ末端に存在する。従って、本発明は、Ｎ末端延長を含む第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドに関する。
後でさらに論じられるように、ＩＳＶＤはＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬドメインに由来し得る。しかしながら、ＩＳＶＤは、それらが本発明の本発明のポリペプチド中においてＶＨおよびＶＬドメインの相補的なペアを形成しないように選ばれる。ナノボディ、ＶＨＨ、およびヒト化ＶＨＨは、それらが軽鎖を有さない天然のラクダ抗体に由来するという点で特別であり、実に、これらのドメインはラクダ軽鎖と結びついて相補的なＶＨＨおよびＶＬのペアを形成する能力がない。それゆえに、本発明のポリペプチドは相補的なＩＳＶＤを含まず、および／または例えば相補的なＶＨ／ＶＬペアなどの相補的なＩＳＶＤペアを形成しない。
本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、前記リンカーは配列番号１８～２９および７７からなる群から選ばれる。
本発明に従うポリペプチドはさらなる分子とコンジュゲーションされ得るということもまた企図される。さらなる分子は、直接的にまたは好適な長さのスペーサーを介してポリペプチドにコンジュゲーションされ得る。治療目的のためには、治療エフェクター基、例えば放射性基、すなわち放射性同位体もしくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３３Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、２０１Ｔｌ、２１３Ｂｉ）を含むかもしくはそれからなる基、毒素、または細胞傷害性基、例えば細胞生育阻害剤とのコンジュゲーションが好適であり得る。別の側面において、本発明のポリペプチドは標識基にカップリングされ得（標識されたポリペプチド）、これはそれから例えば診断目的に用いられ得る。好適な標識基は、放射性同位体（例えば、上で挙げられているもの）または放射性同位体を含有する基、放射性核種、蛍光基（例えば、蛍光蛋白質、例えばＧＦＰ、ＲＦＰなど、Alexa-Fluor（登録商標）色素、ローダミン、フルオレセイン、およびその誘導体、例えばＦＩＴＣ、シアニン色素、例えばＣｙ３（登録商標）およびＣｙ５（登録商標））、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ）、化学発光基、ビオチニル基、金属粒子（例えば金粒子）、磁性粒子（例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）および／またはマグヘマイト（Ｆｅ２Ｏ３）を含有するコアを有する）、所定のポリペプチド基などから選択され得る。
別様に指示されない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、本明細書において重鎖抗体または従来の４鎖抗体を言うために用いられているかどうかにかかわらず、完全なサイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその全ての部分、ドメイン、または断片（抗原結合ドメインまたは断片、例えばそれぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインを包含するが、これに限定されない）両方を包含する一般的用語として用いられる。
（ポリペプチドまたは蛋白質の）本明細書において用いられる用語「ドメイン」は、蛋白質の残りからは独立してその三次構造を保持する能力を有するフォールディングした蛋白質構造を言う。一般的に、ドメインは蛋白質の各独特な機能的特性を担い、多くのケースにおいては、蛋白質および／またはドメインの残りの機能喪失なしに追加、除去、または他の蛋白質に移入され得る。
本明細書において用いられる用語「免疫グロブリンドメイン」は、（例えば、従来の４鎖抗体のもしくは重鎖抗体の鎖などの）抗体鎖の球状領域、または本質的にかかる球状領域からなるポリペプチドを言う。免疫グロブリンドメインは、それらが抗体分子に特徴的な免疫グロブリンフォールドを保持することを特徴とし、これは２つのベータシートに配列した約７つの逆平行ベータストランドの２層のサンドイッチからなり、任意に、保存されたジスルフィド結合によって安定化される。
本明細書において用いられる用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、本質的に４つの「フレームワーク領域」からなる免疫グロブリンドメインを意味し、それらは当分野および下の本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と言われる；これらのフレームワーク領域は３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって分断され、それらは当分野および下の本明細書においてそれぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と言われる。それゆえに、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は次のように指示され得る：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。抗原結合部位を保有することによって抗原について抗体に特異性を授けるのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
好ましいＣＤＲが表Ａ－２に示されており、すなわちＣＤＲ１は配列番号４０、４７、５４、６１、６８、および３３から選ばれ、ＣＤＲ２は配列番号４２、４９、５６、６３、７０、および３５から選ばれ；ＣＤＲ３は配列番号４４、５１、５８、６５、７２、および３７から選ばれる。好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は１つのクローンから選ばれ、例えば、
－ ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号３５であり、ＣＤＲ３は配列番号３７であるか；
－ ＣＤＲ１は配列番号６１であり、ＣＤＲ２は配列番号６３であり、ＣＤＲ３は配列番号６５であるか；
－ ＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号４４であるか；
－ ＣＤＲ１は配列番号６８であり、ＣＤＲ２は配列番号７０であり、ＣＤＲ３は配列番号７２であるか；
－ ＣＤＲ１は配列番号４７であり、ＣＤＲ２は配列番号４９であり、ＣＤＲ３は配列番号５１であるか；または
－ ＣＤＲ１は配列番号５４であり、ＣＤＲ２は配列番号５６であり、ＣＤＲ３は配列番号５８である。
「単一可変ドメイン」と交換可能に用いられる用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在しかつそれによって形成される分子を定義する。これは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリンまたはそれらの断片から、免疫グロブリン単一可変ドメインを際立たせている。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいては、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが相互作用して抗原結合部位を形成する。このケースにおいては、ＶＨおよびＶＬ両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与するであろう。すなわち、合計で６つのＣＤＲが抗原結合部位形成に関わるであろう。
好ましいＩＳＶＤが表Ａ－１に示されており、すなわち配列番号３、４、５、６、７、８、９、７８、７９、８０、８１、および８２、最も好ましくは配列番号８、６、７、および３である。
上の定義に鑑みて、従来の４鎖抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ分子；当分野において公知）、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、例えばジスルフィドによってリンクされたＦｖもしくはｓｃＦｖ断片、またはかかる従来の４鎖抗体に由来するｄｉａｂｏｄｙ（全て当分野において公知）の抗原結合ドメインは、通常は免疫グロブリン単一可変ドメインとは見なされないであろう。なぜなら、これらのケースにおいて、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインによってではなく、軽および重鎖可変ドメインなどの（結びつく）免疫グロブリンドメインのペアによって、すなわち協同してそれぞれの抗原のエピトープに結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬペアによって通常は起こるからである。
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインとペアになることなしに抗原のエピトープに特異的に結合する能力がある。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は単一のＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬドメインによって形成される。ゆえに、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位はせいぜい３つのＣＤＲによって形成される。
このように、単一可変ドメインは、それが単一の抗原結合ユニット（すなわち、単一の抗原結合ドメインが、機能的な抗原結合ユニットを形成するために別の可変ドメインと相互作用することを必要としないような、本質的に単一可変ドメインからなる機能的な抗原結合ユニット）を形成する能力がある限り；軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）もしくはその好適な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列）もしくはその好適な断片であり得る。
本発明の１つの態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）である；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（もしくは（単一）ドメイン抗体としての使用に好適であるアミノ酸）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（もしくはｄＡｂとしての使用に好適であるアミノ酸）、またはナノボディ（本明細書において定義される通りであり、ＶＨＨを包含するがこれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、あるいはそのいずれか１つのいずれかの好適な断片であり得る。
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインはナノボディ（登録商標）（本明細書において定義される通り）またはその好適な断片であり得る。［注意：ナノボディ（登録商標）およびNanoclone（登録商標）はAblynx N.V.の登録商標である］ナノボディの一般的な説明については、下のさらなる記載、および例えばＷＯ０８／０２００７９（１６ページ）に記載されているなどの本明細書において引用される従来技術の参照がなされる。
ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としてもまた公知の「ＶＨＨドメイン」は、元々は「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖が欠如した抗体」；Hamers-Casterman et al. 1993 Nature 363: 446-448）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載された。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（これらは本明細書において「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と言われる）および従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメイン（これらは本明細書において「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン」と言われる）から区別するために選ばれた。ＶＨＨおよびナノボディのさらなる説明については、Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)による総説記事、ならびに次の特許出願の参照がなされ、これらは一般的な背景技術として挙げられる：ブリュッセル自由大学のＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９、およびＷＯ９６／３４１０３；UnileverのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１、およびＷＯ０２／４８１９３；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６、およびＷＯ０３／０５５５２７；Algonomics N.V.およびAblynx N.V.のＷＯ０３／０５０５３１；カナダ国立研究機構によるＷＯ０１／９０１９０；Institute of AntibodiesによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）；およびAblynx N.V.によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７、およびＷＯ０６／１２２８２５、ならびにAblynx N.V.によるさらなる公開特許出願。これらの出願において挙げられているさらなる従来技術、および特に国際出願ＷＯ０６／０４０１５３の４１～４３ページにおいて挙げられている参照の列記の参照もまたなされ、それらの列記および参照は参照によって本明細書に組み込まれる。これらの参照に記載されている通り、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分的ヒト化ナノボディ）は、特に、フレームワーク配列の１つ以上における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在を特徴とし得る。ナノボディのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の改変、部分もしくは断片、誘導体もしくは「ナノボディ融合体」、多価コンストラクト（リンカー配列のいくつかの限定しない例を包含する）、およびナノボディの半減期を増大させるための異なる改変、ならびにそれらの調製を包含するナノボディのさらなる説明は、例えばＷＯ０８／１０１９８５およびＷＯ０８／１４２１６４に見いだされ得る。ナノボディのさらなる一般的な説明については、例えばＷＯ０８／０２００７９（１６ページ）に記載されているものなどの本明細書において引用される従来技術の参照がなされる。
「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」、および「ｄＡｂ」としてもまた公知の「ドメイン抗体」は（用語「ドメイン抗体」および「ｄＡｂ」はGlaxoSmithKlineグループ企業によって商標として用いられている）、例えばＥＰ０３６８６８４、Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989)、Holt et al. (Trends in Biotechnology 21: 484-490, 2003)、およびＷＯ０３／００２６０９、ならびに例えばＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８、およびDomantis Ltdの他の公開特許出願に記載されている。ドメイン抗体は、本質的には、非ラクダほ乳類、特にヒト４鎖抗体のＶＨまたはＶＬドメインに対応する。単一の抗原結合ドメインとして、すなわちそれぞれＶＬまたはＶＨドメインとペアになることなしにエピトープに結合するためには、例えばヒト単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリーを用いることによって、かかる抗原結合特性の特異的選択が要求される。ドメイン抗体は、ＶＨＨのようにおよそ１３からおよそ１６ｋＤａの分子量を有し、完全にヒト配列に由来する場合には、例えばヒトへの治療使用のためのヒト化を要求しない。
それらがほ乳類起源ではないので本発明の文脈においてはより好ましくないが、単一可変ドメインはサメのある種の種に由来し得るということにもまた注意すべきである（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」。例えばＷＯ０５／１８６２９を見よ）。
それゆえに、本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒトソース、好ましくはラクダに由来するポリペプチド、好ましくはラクダ重鎖抗体を含む。それらは以前に記載されたようにヒト化され得る。その上に、用語は、例えばDavies and Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996)およびRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)に記載されているように「ラクダ化」された、非ラクダソース、例えばマウスまたはヒトに由来するポリペプチドを含む。
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)によって与えられるＶＨドメインのための一般的な付番に従って、ラクダ科からのＶＨＨドメインに適用されているように、例えばRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)の図２に示されているように付番される。ＶＨドメインのアミノ酸残基に付番するための代替的な方法は当分野において公知であり、この方法は同様の様式でＶＨＨドメインにもまた適用され得る。しかしながら、本明細書、請求項、および図においては、別様に指示されない限り、上に記載されているＶＨＨドメインに適用されるKabatに従う付番が踏襲される。
ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当分野において周知である通り、ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸残基の総数は変動し得、Kabat付番によって指示されるアミノ酸残基の総数には対応せずにあり得るということに注意すべきである（すなわち、Kabat付番に従う１つ以上の位置が実際の配列中においては占有されずにあり得る。または、実際の配列は、Kabat付番によって許される数よりも多くのアミノ酸残基を含有し得る）。これは、一般的に、Kabatに従う付番が、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の付番に対応し得、または対応せずにあり得るということを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインのアミノ酸残基の総数は、通常は１１０から１２０の範囲内、多くの場合には１１２および１１５の間であろう。しかしながら、より小さい配列およびより長い配列もまた本明細書に記載される目的にとって好適であり得るということに注意すべきである。
ＣＤＲ領域の決定は異なる方法に従ってされ得る。Kabatに従うＣＤＲ決定において、ＶＨＨのＦＲ１は位置１～３０のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は位置３１～３５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は位置３６～４９のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は位置５０～６５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は位置６６～９４のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は位置９５～１０２のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４は位置１０３～１１３のアミノ酸残基を含む。
しかしながら、本願において、ＣＤＲ配列はKontermann and Dubel (Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010)に従って決定された。この方法に従うと、ＦＲ１は位置１～２５のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は位置２６～３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は位置３６～４９のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ２は位置５０～５８のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は位置５９～９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は位置９５～１０２のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は位置１０３～１１３のアミノ酸残基を含む。
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインを包含する）はヒト化に付され得る。特に、ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを包含する）は、以前のパラグラフにおいて一般的に定義されているが、その中にはヒト化置換（本明細書において定義される通り）であるおよび／またはそれに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が（特に、フレームワーク残基の少なくとも１つに）存在する免疫グロブリン単一可変ドメインであり得る。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を１つ以上のごく近縁のヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって確かめられ得る。その後に、このように決定された潜在的に有用なヒト化置換の１つ以上（またはその組み合わせ）は前記ＶＨＨ配列中に（自体公知のいずれかの様式で、本明細書にさらに記載されるように）導入され得、もたらされたヒト化ＶＨＨ配列は、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さおよびレベル、ならびに／または他の所望の特性について試験され得る。このやり方で、トライアル・アンド・エラーの限定された程度によって、他の好適なヒト化置換（またはその好適な組み合わせ）が、本明細書における開示に基づいて当業者によって決定され得る。また、前述に基づいて、ナノボディ（ＶＨＨドメインを包含する）などの免疫グロブリン単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）が部分的ヒト化または完全ヒト化され得る。
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインおよびヒト化ＶＨＨドメインを包含する）は、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列中に１つ以上の変改を導入することによる親和性成熟に付され得る。それらの変改は、それぞれの親分子と比較して、もたらされる免疫グロブリン単一可変ドメインの、そのそれぞれの抗原に対する改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟した免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、当分野において公知の方法によって、例えばMarks et al. (Biotechnology 10:779-783, 1992)、Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994)、Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995)、Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995)、Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995)、Hawkins et al. (J. Mol. Biol. 226: 889 896, 1992)、Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)によって記載されているように調製され得る。
ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ドメイン抗体、またはナノボディなどの免疫グロブリン単一可変ドメインから出発してポリペプチドを設計／選択および／または調製するプロセスは、本明細書においては前記免疫グロブリン単一可変ドメインを「フォーマットする」ともまた言われ；ポリペプチドの一部にされる免疫グロブリン単一可変ドメインは、「フォーマットされる」または前記ポリペプチド「のフォーマットである」と言われる。免疫グロブリン単一可変ドメインがフォーマットされ得るやり方の例、およびかかるフォーマットの例は、本明細書における開示から当業者には明瞭であろう；かかるフォーマットされた免疫グロブリン単一可変ドメインは本発明のさらなる側面を形成する。
例えば、限定なしに、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、ポリペプチドの調製のための「結合ユニット」、「結合ドメイン」、または「ビルディングブロック」（これらの用語は本明細書において交換可能に用いられる）として用いられ得、これは、結合ユニットとして働き得る（すなわち、ＣＤ４０Ｌ上の同じかもしくは別のエピトープに対するおよび／またはＣＤ４０Ｌ以外の１つ以上の抗原、蛋白質、もしくは標的に対する）１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを任意に含有し得る。
一価のポリペプチドは、（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなどの）１つの結合ユニットのみを含むかまたは本質的にそれからなる。（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなどの）２つ以上の結合ユニットを含むポリペプチドは、本明細書においては「多価」ポリペプチドともまた言われ、かかるポリペプチド中に存在する結合ユニット／免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書においては「多価フォーマット」であるともまた言われる。例えば、「二価」ポリペプチドは、任意にリンカー配列を介してリンクされる２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得、「三価」ポリペプチドは、任意に２つのリンカー配列を介してリンクされる３つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得；「四価」ポリペプチドは、任意に３つのリンカー配列を介してリンクされる４つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るなどである。
多価ポリペプチドにおいて、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは同じかまたは異なり得、同じ抗原もしくは抗原決定基（例えば同じ部分（単数もしくは複数）もしくはエピトープ（単数もしくは複数）、または異なる部分もしくはエピトープ）を標的とし得、または代替的には異なる抗原もしくは抗原決定基を標的とし得；あるいはそのいずれかの好適な組み合わせである。少なくとも１つの結合ユニットが第１の抗原（すなわちＣＤ４０Ｌ）を標的とし、少なくとも１つの結合ユニットが第２の抗原（すなわち、ＣＤ４０Ｌとは異なる）を標的とする（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなどの）少なくとも２つの結合ユニットを含有するポリペプチドは、「多重特異性」ポリペプチドともまた言われ、かかるポリペプチド中に存在する（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなどの）結合ユニットは、本明細書においては「多重特異性フォーマット」であるともまた言われる。それゆえに、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＣＤ４０Ｌ）を標的とする少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインと第２の抗原（すなわち、ＣＤ４０Ｌとは異なる）を標的とする少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインとを含むポリペプチドであり、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＣＤ４０Ｌ）を標的とする少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインと、第２の抗原（すなわち、ＣＤ４０Ｌとは異なる）を標的とする少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインと、第３の抗原（すなわち、ＣＤ４０Ｌおよび第２の抗原両方とは異なる）を標的とする少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインとを含むポリペプチドである；などである。
例えば「二重パラトープポリペプチド」または「三重パラトープポリペプチド」などの「多重パラトープポリペプチド」は、それぞれが異なるパラトープを有する２つ以上の結合ユニットを含むかまたは本質的にそれからなる。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、第１のＩＳＶＤ（例えば、ＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤ）と第２のＩＳＶＤ（例えば、血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ）とを含む二重特異性ポリペプチドである。
治療医薬抗体の有効性を改善するための手段は、その血清中残存性を増大させ、それによってより高い循環レベル、より頻繁でない投与、および縮減された用量を許すことである。
当分野においては、インビボの分子の半減期を延長する基または部分、例えばＦｃ領域のＰＥＧ基が記載されている。
しかしながら、抗体のＦｃ領域は、その血清中半減期のみならず、エフェクター機能、例えば補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）をもまた媒介し、これは安全性に負の影響を有する。
しかしながら、前に挙げられた通り、最近の知見は、健康な血液ドナーにおける抗ＰＥＧ抗体の２２～２５％の発生率を実証している。抗ＰＥＧ抗体のこの発生は、いくつかの患者においては有効性を限定し得、ＰＥＧが非免疫原性であるという一般的な想定に反する。ゆえに、ＰＥＧ化された治療薬は、特に免疫低下した疾患設定において臨床使用にとっての潜在的重大性を有する。その上に、抗ＣＤ４０ＬのＦａｂ’分子のＰＥＧ化がその活性を４～５倍減少させるということが報告されている（ＵＳ２０１０／０１０４５７３）。
本発明者は、ベンチマークＣＤＰ７６５７よりも高性能であるのみならず、この性能を半減期延長後にもまた保持するようにＩＳＶＤを作り替えることができた。本明細書にさらに記載される本発明の具体的な限定しない側面において、本発明のポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して増大した血清中半減期（本明細書にさらに記載される通り）を有する。
本発明のポリペプチドの「半減期」は、一般的には、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページのパラグラフｏ）に記載されているように定義され得、そこに挙げられているように、例えばポリペプチドの分解および／または天然のメカニズムによるポリペプチドのクリアランスもしくは隔離が原因で、ポリペプチドの血清中濃度がインビボで５０％縮減されるためにとられる時間を言う。本発明のポリペプチドのインビボ半減期は、自体公知のいずれかの様式で、例えば薬物動態分析によって決定され得る。好適な技術は当業者には明瞭であろう。例えば一般的にはＷＯ０８／０２００７９の５７ページのパラグラフｏ）に記載されている通りであり得る。また、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページのパラグラフｏ）に挙げられている通り、半減期は、ｔ１／２－α、ｔ１／２－β、および曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを用いて表現され得る。例えば、標準的なハンドブック、例えばKenneth et al. (Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc, 1986)およびGibaldi & Perron ("Pharmacokinetics", Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition, 1982)の参照がなされる。用語「半減期の増大」または「増大した半減期」もまたＷＯ０８／０２００７９の５７ページのパラグラフｏ）において定義されている通りであり、特に、ｔ１／２－αおよび／もしくはＡＵＣの増大ありもしくはなしどちらかの、または両方のｔ１／２－βの増大を言う。
本発明の具体的な側面において、本発明のポリペプチドは、血清蛋白質に結合するＩＳＶＤを欠く対応するポリペプチドと比較して増大した半減期を有する。かかるポリペプチドのいくつかの好ましい限定しない例は、本明細書におけるさらなる開示に基づいて当業者には明瞭になるであろう。例えば、血清蛋白質（例えば血清アルブミン）に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチド；または本発明のアミノ酸配列の半減期を増大させる少なくとも１つの部分（特に、少なくとも１つのアミノ酸配列）にリンクされた本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドを含む。かかる半減期延長性部分または免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書におけるさらなる開示に基づいて当業者には明瞭になるであろう；例えば、限定なしに、本発明の１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、１つ以上の血清蛋白質もしくはその断片（例えば、（ヒト）血清アルブミンもしくはその好適な断片）に、または血清蛋白質に結合し得る１つ以上の結合ユニット（例えば、血清蛋白質、例えば血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、ＩｇＧなどの血清免疫グロブリン、またはトランスフェリンに結合し得るＩＳＶＤ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」、またはナノボディなどの；本明細書において挙げられているさらなる記載および参照の参照がなされる）に好適にリンクされたポリペプチド；血清蛋白質に結合し得る１つ以上の小型蛋白質またはペプチド、例えば、限定なしに、ＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６、ＷＯ０２／０７６４８９、ＷＯ２００８／０６８２８０、ＷＯ２００９／１２７６９１、およびＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１５５９に記載されている蛋白質およびペプチドを含む本発明のポリペプチドを包含する。
一般的に、増大した半減期を有する本発明の化合物またはポリペプチドは、好ましくは、本発明の対応するアミノ酸配列、例えばＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤ自体（血清アルブミンに結合するＩＳＶＤなし）の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍超長い半減期を有する。例えば、増大した半減期を有する本発明の化合物またはポリペプチドは、例えばヒトにおいて、本発明の対応するアミノ酸配列、例えばＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤ自体と比較して１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、またはさらには２４、４８、もしくは７２時間超増大した半減期を有し得る。
本発明の好ましい限定しない側面において、本発明のかかる化合物またはポリペプチドは、例えばヒトにおいて、本発明の対応するアミノ酸配列、例えばＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤ自体と比較して１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、またはさらには２４、４８、もしくは７２時間超増大した血清中半減期を有する。
本発明の別の好ましい限定しない側面において、本発明のかかる化合物またはポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにはより好ましくは少なくとも７２時間以上というヒトにおける血清中半減期を見せる。例えば、本発明の化合物またはポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５から１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９から１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０から１５日）、または少なくとも約１１日（例えば約１１から１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２から１８日以上）、または１４日超（例えば約１４から１９日）という半減期を有し得る。
また、好ましい側面において、本発明は本明細書に記載されるポリペプチドに関し、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦ１からＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）とからなり、ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号７５であり、ＣＤＲ１は配列番号７６である（表Ａ－３を見よ）。
本発明の特に好ましい限定しない側面において、本発明は、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）と血清アルブミンに結合する少なくとも１つのＩＳＶＤとを含む本発明のポリペプチドを提供し、例えば、血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、ＡＬＢ１３５（配列番号１５）、ＡＬＢ１２９（配列番号１３）、ＡＬＢ８（配列番号１１）、ＡＬＢ２３（配列番号１２）、およびＡＬＢ１３２（配列番号１４）からなる群、好ましくは配列番号１５から選ばれる。
治療蛋白質産物に対する免疫応答は、患者の安全性および産物の有効性両方について問題を呈し得る。血栓塞栓事象は、蛋白質治療医薬に対する既存抗体（ＰＥＡ）および／または抗薬物抗体（ＡＤＡ）が原因でもまたあり得る。この点で、免疫原性とは、治療蛋白質産物がそれ自体および関連蛋白質に対する免疫応答を生成または免疫学的に関連する臨床的な有害事象を誘導する性向である。
本発明者は、従来技術の抗体よりも有意に安全であるポリペプチドを作り出すことができた。
本発明に至る研究において、Ｃ末端延長（これは単一のＣ末端アラニン残基ほども単純であり得る。再びＷＯ１２／１７５７４１、例３を見よ）をＩＳＶＤのＣ末端領域または末端に追加することが、ヒト対象／患者の大部分のサンプル中の既存抗体／因子の結合を本質的に防止／除去するということを確立した後に、ヒト対象（健康なボランティア、および／または疾患もしくは障害を患う対象）から得られたサンプルが、Ｃ末端延長が存在するときでさえもナノボディ（または他のＩＳＶＤ）の暴露されたＣ末端領域に結合し得る（他の）既存抗体または因子を可能性として含有するかどうかが検討された。そうする中で、本発明者は、本質的に、Ｃ末端延長したＩＳＶＤに結合するかかる既存抗体は、健康なボランティアの血液もしくは血清中またはいくつもの異なる疾患の１つを患うヒト患者から得られた血液もしくは血清中（いくつかの炎症性疾患または自己免疫障害を包含する。データは示さない）には見いだされ得ないが、ある種の深刻な（自己）免疫障害（例えばＳＬＥ）を患う（全てではないが）ある種のヒト対象から得られたいくつかの血液または血清サンプルは、ＩＳＶＤがＣ末端延長を含むときでさえもＩＳＶＤに結合し得るいくつかの既存抗体／因子を含有するように見えるということを見いだした。
本発明者は、改善されたＩＳＶＤを提供することに取りかかった。それらは、それらが暴露されたＣ末端領域または末端を有するときに、免疫系に深刻に影響／活性化するある種の（自己）免疫疾患または障害（例えばＳＬＥ）を患うヒト対象から得られた血液または血清サンプル中に見いだされるものなどの既存抗体／因子による結合をより被りにくい。
暴露されたＣ末端を有するＩＳＶＤへの既存抗体／因子の結合が、位置１１２のセリン（Kabat付番）からリジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）どちらかへの変異によって（さらに）縮減され得るということが見いだされた。特に、かかるＳ１１２ＫまたはＳ１１２Ｑ変異は、ＳＬＥなどの深刻な自己免疫障害を患うヒト対象の血液または血清中に見いだされる既存抗体／因子などの、Ｃ末端延長を含むＩＳＶＤ（ただしＳ１１２ＫまたはＳ１１２Ｑ変異なし）に結合し得る既存抗体／因子の結合を（さらに）縮減または本質的に防止／除去し得るということが見いだされた。
この知見は広く適用可能である。
本発明の免疫グロブリン（および特に免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、全て「Improved immunoglobulin variable domains」と題する次の同時係属のＵＳ仮出願に記載されている具体的な変異／アミノ酸残基をもまた含有し得る：２０１４年５月１６日出願のＵＳ６１／９９４５５２；２０１４年６月１８日出願のＵＳ６１／０１４，０１５；２０１４年８月２１日出願のＵＳ６２／０４０，１６７；および２０１４年９月８日出願のＵＳ６２／０４７，５６０（全てAblynx N.V.に譲渡し）。
特に、本発明は、ＩＳＶＤ、好ましくはＣ末端に在るＩＳＶＤを含む本明細書に記載されるポリペプチドに関し、さらにはより好ましくは、前記Ｃ末端に在るＩＳＶＤは血清アルブミンに結合するＩＳＶＤであり：（ｉ）位置１１２のアミノ酸残基はＫもしくはＱの１つであり；および／または（ｉｉ）位置８９のアミノ酸残基はＴであり；および／または（ｉｉｉ）位置８９のアミノ酸残基はＬであり、位置１１０のアミノ酸残基はＫもしくはＱの１つであり；かつ（ｉｖ）ケース（ｉ）から（ｉｉｉ）のそれぞれにおいて、位置１１のアミノ酸は好ましくはＶであり；前記ＶＨドメインはＣ末端延長（Ｘ）ｎを含有し、式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選ばれる。
従って、本発明は、ＩＳＶＤ、好ましくはＣ末端に在るＩＳＶＤを含む本明細書に記載されるポリペプチドに関し、さらにはより好ましくは、前記Ｃ末端に在るＩＳＶＤは血清アルブミンに結合するＩＳＶＤであり、：
－ 位置１１のアミノ酸残基はＬ、Ｖ、またはＫの１つであり；かつ
－ 位置１４のアミノ酸残基はＡまたはＰの１つであり；かつ
－ 位置４１のアミノ酸残基はＡまたはＰの１つであり；かつ
－ 位置８９のアミノ酸残基はＴ、Ｖ、またはＬの１つであり；かつ
－ 位置１０８のアミノ酸残基はＱ、またはＬの１つであり；かつ
－ 位置１１０のアミノ酸残基はＴ、Ｋ、またはＱの１つであり；かつ
－ 位置１１２のアミノ酸残基はＳ、Ｋ、またはＱの１つであり；
（ｉ）位置１１２のアミノ酸残基はＫもしくはＱの１つであり；および／または（ｉｉ）位置８９のアミノ酸残基はＴであり；および／または（ｉｉｉ）位置８９のアミノ酸残基はＬであり、位置１１０のアミノ酸残基はＫもしくはＱの１つであり；かつ（ｉｖ）ケース（ｉ）から（ｉｉｉ）のそれぞれにおいて、位置１１のアミノ酸は好ましくはＶである。
前記同時係属のＵＳ仮出願において挙げられている通り、前記変異は、本発明の免疫グロブリンおよび化合物へのいわゆる「既存抗体」の結合を防止または縮減することに有効である。この目的のために、本発明の免疫グロブリンは、（任意に前記変異との組み合わせとして）Ｃ末端延長（Ｘ）ｎをもまた含有し得る（式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選ばれ、これについては再び前記ＵＳ仮出願およびＷＯ１２／１７５７４１の参照がなされる。特に、本発明の免疫グロブリンは、それが蛋白質、ポリペプチド、もしくは他の化合物、またはそれを含むコンストラクトのＣ末端を形成するときに、かかるＣ末端延長を含有し得る（再び、前記ＵＳ仮出願およびＷＯ１２／１７５７４１にさらに記載されている通り）。
従って、本発明は、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、さらに血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含み、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤはＡｌｂ００１２９（Ａｌｂ１１（Ｌ１１Ｖ，Ｖ８９Ｔ）－Ａ）（配列番号１３）およびＡｌｂ００１３２（Ａｌｂ２３（Ｌ５Ｖ，Ｌ１１Ｖ，Ｖ８９Ｔ）－Ａ）（配列番号１４）およびＡＬＢ１１（Ｓ１１２Ｋ）－Ａ（配列番号１５）から選ばれる。好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号９である。
さらに、本発明は本発明のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。医薬組成物が、本発明の前記ポリペプチドを含む核酸、前記核酸を含有するベクターもしくはベクター系、および／または本発明の前記ポリペプチドを産生する好ましくはヒト細胞を含むということもまたあり得る。任意に、医薬組成物は、医薬的に許容される添加剤、アジュバント、および／または担体を含む。
例示的な添加剤としては、崩壊剤、結合剤、フィラー、および滑剤が挙げられ得る。崩壊剤の例は、アガー・アガー、アルギン、炭酸カルシウム、セルロース、コロイド状二酸化珪素、ガム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、および澱粉を包含する。結合剤の例は、微結晶セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキプロピルセルロース、およびポリビニルピロリドンを包含する。フィラーの例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、三塩基性硫酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、セルロース、デキストリン、デキストロース、フルクトース、ラクチトール、ラクトース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、ソルビトール、澱粉、スクロース、糖、およびキシリトールを包含する。滑剤の例は、寒天、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、グリセリン、グリセリルパルミトステアラート、水添植物油、酸化マグネシウム、ステアリン酸塩、マンニトール、ポロキサマー、グリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルナトリウム、ソルビトール、およびタルクを包含する。通常の安定化剤、保存料、湿潤および乳化剤、粘度改善剤、香味改善剤、浸透圧を変動させるための塩、緩衝剤物質、可溶化剤、希釈剤、軟化剤、着色料、およびマスキング剤、および抗酸化剤が医薬アジュバントとして考えられる。
好適な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油、および同類を包含するが、これに限定されない。
医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる活性物質、例えば１つ以上のさらなる抗体またはその抗原結合断片、ペプチド、蛋白質、核酸、有機および無機分子をもまた含み得る。
本発明の好ましい態様において、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は医療または診断法への使用のためである。好ましくは、医薬組成物はヒト医療への使用のためであるが、それらは獣医学目的にもまた用いられ得る。
特に、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドを含む本発明の核酸、ベクターもしくはベクター系、宿主もしくは宿主細胞、または医薬組成物は、ＣＤ４０Ｌの上昇したレベルおよび／または活性に関連する、それによって引き起こされる、またはそれを伴う障害と、上に記載されている本発明のポリペプチドの投与によってＣＤ４０Ｌ活性を阻害および／または中和することによって有益には診断、防止、または処置され得る他の疾患または状態との診断、防止、または処置への使用のためである。さらなる態様において、本発明は、ＣＤ４０Ｌの上昇したレベルおよび／または活性に関連する、それによって引き起こされる、またはそれを伴う障害と、ＣＤ４０Ｌ活性を阻害および／または中和することによって有益には診断、防止、または処置され得る他の疾患または状態との診断、防止、または処置のための方法に関する。
ある態様において、本発明は、医薬としての使用のための、本発明のポリペプチドに関する。
さらなる態様において、本発明は、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、移植拒絶、クローン病、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、喘息／アレルギー、動脈硬化症、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、強直性脊椎炎、冠動脈性心疾患、１型糖尿病、および／または組換え医薬品、例えば血友病における第ＶＩＩ因子に対する免疫応答の症状を処置または防止することへの使用のための、本発明のポリペプチドに関する。
ある態様において、本発明は、例えばＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０によって媒介される経路の不適切な活性化が関わる個体の疾患または障害の処置すること、防止の方法に関し、方法は、本発明のポリペプチドを前記疾患または障害の症状を処置または防止するために有効な量で前記個体に投与することを含む。好ましい医学的適応症は、ＣＤ４０Ｌの上昇したレベルおよび／または活性に関連する自己免疫または炎症性疾患または状態である。疾患または状態は、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、移植拒絶、クローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、喘息／アレルギー、動脈硬化症、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、冠動脈性心疾患、１型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリッグ病およびシャルコー病としてもまた公知）、および組換え医薬品、例えば血友病における第ＶＩＩ因子に対する免疫応答から選択され得る。特に好ましい適応症はＩＴＰ、ＳＬＥ、およびループス腎炎である。
本発明のポリペプチドまたは本発明に従う医薬組成物は、所望の治療または予防効果を得るために有効な量で、その必要がある対象に投与され得る。例えば、前記投与によって達成されるべき１つの所望の効果は、ＣＤ４０Ｌの１つ以上の生物学的機能をブロック、阻害、および／または中和することであり得る。この文脈において、投与は、ポリペプチドがＣＤ４０Ｌ機能をブロック、阻害、および／または中和する能力がある条件下において、好ましくは高いおよび／または異常なレベルでＣＤ４０Ｌを発現することが疑われる細胞または組織と本発明のポリペプチドを接触させることを含み得る。接触はインビトロまたはインビボであり得る。
好適な組成物の投与は、異なるやり方で、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経口、皮内、鼻腔内、または気管支内投与によって奏され得る。投与は直接的に標的部位においてもまた実施され得る。
投薬レジメンは担当医および臨床的因子によって決定されるであろう。医学分野において周知である通り、いずれか一人の患者のための投薬量は多くの因子に依存し、患者のサイズ、重量、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、使用されるポリペプチドの活性（抗体を包含する）、投与の時間および経路、一般的な健康、および他の治療または処置との組み合わせを包含する。蛋白質性の医薬活性物質は、用量あたり１ｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の量で存在し得る；しかしながら、この例示的な範囲よりも下または上の用量もまた想定される。レジメンが連続輸注である場合には、それは分あたり体重のキログラムあたり１ｐｇから１００ｍｇの範囲内であり得る。
本発明の中和ポリペプチドは、当分野において周知の方法によってアッセイされるＣＤ４０Ｌの生物学的機能を少なくとも約５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％、９５％、または最大９９％、最も好ましくはおよそ１００％（本質的に完全に）阻害および／または中和するために、例えば０．０１、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０、または５０ｐｇ／ｍｌの濃度で使用され得る。
本発明のさらなる側面に従うと、本発明のポリペプチドはインビボおよびインビトロの追加の用途に用いられ得る。例えば、本発明のポリペプチドは、診断目的のために、例えばＣＤ４０Ｌの存在を検出および／もしくは定量ならびに／またはＣＤ４０Ｌを精製するように設計されたアッセイに使用され得る。また、ポリペプチドは、具体的な疾患の動物モデルにおいて、毒物学、安全性、および投薬量研究を実施するために試験され得る。
最後に、本発明は、本発明に従う少なくとも１つのポリペプチド、前記成分をコードする少なくとも１つの核酸配列、本発明のベクターもしくはベクター系、および／または本発明に従う宿主細胞を含むキットに関する。キットは、異なる形態で、例えば診断キットとして提供され得るということが企図される。
本発明は、次の例に基づいてより良好に理解され得る。しかしながら、当業者は、論じられている具体的な方法および結果が単に本明細書に記載されている本発明を例解するためであるということを直ちに理解するであろう。
６．例
次の例は、本発明の方法および産物を例解している。当業者に明らかである、分子および細胞生物学の分野において通常遭遇される記載されている条件およびパラメータの好適な改変および適合は、本発明の趣旨および範囲内である。
６．１．材料と方法
６．１．１．フローサイトメトリー（結合）
ペリプラズム抽出物をＦＡＣＳによってヒトＣＤ４０Ｌへの結合について分析した。２×１０５細胞（安定なＣＨＯ－Ｋ１／ヒトＣＤ４０Ｌトランスフェクション細胞）を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１０％ウシ胎児血清（Sigma、Ｆ７５２４）、０．０５％アジ化Ｎａ）中のペリプラズム抽出物の１／１０希釈物と４℃で３０分間インキュベーションした。それから、細胞をＦＡＣＳ緩衝液によって３回洗浄し、最後に、Phycolinkα－ＦＬＡＧ－ＲＰＥ（Prozyme、ＰＪ３１５）を含有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。この混合物を４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を再びＦＡＣＳ緩衝液によって３回洗浄し、死細胞をＴＯＰＲＯ３（Molecular probes、Ｔ３６０５）によって染色した。サンプルをFACSarray（BD Biosciences）によって分析した。
６．１．２．AlphaScreen（ブロック）
ナノボディのＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用ブロック能力を決定するために、ペリプラズム抽出物を、AlphaScreenテクノロジーを用いて蛋白質に基づく競合アッセイによってスクリーニングした。手短には、ビオチニル化ヒトＣＤ４０Ｌ（ＨＥＫ、R&D）をドナービーズ上に捕捉し、ヒトＣＤ４０－Ｆｃキメラを抗ヒトＦｃナノボディコーティングしたアクセプタービーズ上に捕捉した。抗ＣＤ４０Ｌナノボディのブロック能力を評価するために、ペリプラズム抽出物の希釈物をビオチニル化ＣＤ４０Ｌとプレインキュベーションした。この混合物に、ＣＤ４０－Ｆｃ、アクセプタービーズ、およびストレプトアビジンをカップリングしたドナービーズを追加し、さらに室温で１時間インキュベーションした。蛍光を、EnVision多重標識プレートリーダーを用い、６８０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの放出波長を用いて測定した。AlphaScreenシグナルの減少は、ＣＤ４０受容体へのビオチニル化ＣＤ４０Ｌの結合がペリプラズム抽出物中に存在するナノボディによってブロックされるということを指示する。
６．１．３ ＳＰＲ（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）
全てのｏｆｆ－ｒａｔｅはProteOn XPR36装置（Bio-Rad Laboratories, Inc.）によって決定した。ProteOnのＧＬＣセンサーチップを、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチル－アミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）を用いるアミンカップリングによって、１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．５中の組換えヒトＣＤ４０Ｌ（R&D、ＨＥＫ）の１２００～１８００ＲＵによってコーティングした。ランニング緩衝液ProteOnＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０入り）中の抗ＣＤ４０Ｌナノボディ発現大腸菌クローンの１０倍希釈されたペリプラズム抽出物を、センサーチップ上に流した。精製された一価の抗ＣＤ４０Ｌナノボディを、１００ｎＭでセンサーチップ上に流した。親和性成熟（例６．８．を見よ）については実験を３７℃で実施し、全ての他の実験は２５℃で実施した。得られたデータは、スポット間の差し引きとブランク緩衝液注入の差し引きとによって二重参照した。処理後の曲線を、ラングミュア解離モデルに基づくｏｆｆ－ｒａｔｅ分析に用いた。
６．１．４ レポーターアッセイ
このアッセイにおいて、ＣＤ４０Ｌによって誘導されるＣＤ４０シグナル伝達の阻害に及ぼすナノボディの効果は、ＮＦ－κＢ－ＳＥＡＰレポーターシステムによって定量される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の安定なトランスフェクションによるＮＦ－κＢ誘導性のＳＥＡＰコンストラクトの導入によって、リガンド誘導は、胚性アルカリホスファターゼの分泌を誘起する。ＳＥＡＰコンストラクトは、５つのＮＦ－κＢ結合部位に融合されたＩＦＮ－β最小プロモーターのコントロール下のＳＥＡＰレポーター遺伝子からなる（InvivoGen、TDS HEK-Blue（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞、ｃａｔ．Ｈｋｂ－ｃｄ４０）。
ナノボディの希釈系列を、ウェットチャンバー内で、CHO hCD40L 4B11細胞の膜抽出物および５×１０４個のHEK-Blue細胞とアッセイ媒体（ＤＭＥＭ（Invitrogen、Ｃａｔ３１９６６－０２１）＋１０％ＦＢＳ（Sigma、ＣａｔＦ７５２４）＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ（Invitrogen、Ｃａｔ１５１４０－１２２））中において３７℃および５％ＣＯ２で１６ｈインキュベーションした。爾後に、懸濁液の一部を基質に追加し、室温で１ｈインキュベーションした。ＳＥＡＰレベルをEnvision（６２０ｎｍ）（Perkin Elmer）を用いて決定した。
６．１．５ Ｂ細胞活性化アッセイ
ナノボディの希釈系列を、ウェットチャンバー内で、照射された１×１０４のCHO hCD40L 4B11細胞および５×１０４のＢ細胞とアッセイ媒体（ＰＭＩ－１６４０（Invitrogen、Ｃａｔ７２４００－０５４）＋１０％ＦＢＳ（Sigma、ＣａｔＦ７５２４）＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ（Invitrogen、Ｃａｔ１５１４０－１２２））中において３７℃および５％ＣＯ２で５日間インキュベーションした。第５日に、プレートを４℃で５分間２５０ｇ遠心した。それから、細胞を抗体希釈物（マウス抗ヒトＣＤ１９－ＦＩＴＣ（BD Pharmingen、ｃａｔ．：５５５４１２）＋マウス抗ヒトＣＤ８６－ＰＥ（BD Pharmingen、ｃａｔ．：５５５６５８））中に再懸濁し、４℃に３０分間置いた。その後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液によって３回洗浄し、それから、１／１０００希釈したＴＯＰＲＯ３（Molecular Probes、Ｔ３６０５）を含有するＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。サンプルをFACSCanto IIによって分析した。
６．１．６ Ｂ細胞増殖アッセイ
ナノボディの希釈系列を、ウェットチャンバー内で、CHO hCD40L 4B11細胞の膜抽出物および５×１０４個のＢ細胞とアッセイ媒体（ＲＰＭＩ－１６４０（Invitrogen、Ｃａｔ７２４００－０５４）＋１０％ＦＢＳ（Sigma、ＣａｔＦ７５２４）＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ（Invitrogen、Ｃａｔ１５１４０－１２２））中において３７℃および５％ＣＯ２で４日間インキュベーションした。第４日に、トリチウム－チミジン（Perkin Elmer、ｒｅｆ：ＮＥＴ０２７Ｘ００１ＭＣ）をプレートに追加した。プレートはトリチウム－チミジンとの２４ｈのインキュベーション期間後に凍結した。次の日にプレートを収穫し、トップカウント（Perkin Elmer）によって分析した（Ｈ３チミジン取り込みアッセイ）。
６．１．７ 競合ＥＬＩＳＡ
ナノボディがＣＤ４０Ｌ蛋白質上の異なるエピトープを認識するかどうかを評価するために、精製されたナノボディを、競合ＥＬＩＳＡにおいてファージ上に提示されたナノボディのより小さいセットに対してビニングした。９６ウェルＦ底プレートNunc-lmmuno（商標）（NUNC）の各ウェルを、ＰＢＳ中のｈＣＤ４０Ｌ（ＨＥＫ細胞によって産生、R&D、ｃａｔ＃：６４２０－ＣＬ／ＣＦ）蛋白質の５０ｎｇと４℃で一晩インキュベーションした。ＲＴにおける１ｈの４％（ｗ／ｖ）スキムミルクによるブロッキング後に、ナノボディ－ファージを、０．５μＭの精製されたナノボディの存在または不在下において追加した。結合したナノボディ－ファージを抗Ｍ１３－ＨＲＰＭＡｂ（GE Healthcare；ｃａｔ＃２７－９４２１－０１）によって検出し、４５０ｎｍにおける比色検出を、可溶性（高感度）テトラメチルベンジジン基質（ｅｓ（ＨＳ）ＴＭＢ）（SDT）をＨＲＰ基質として用いて行った。精製されたナノボディの存在および不在下における４５０ｎｍの吸光度間の比を用いて、ビニングされたナノボディがＣＤ４０Ｌ分子上の同じかまたはオーバーラップする（しない）エピトープを認識するかどうかを決定した。
６．２ ナノボディ同定
ラマにおいてＣＤ４０Ｌに対する免疫応答を誘起することに鑑みて、異なる種間の相同性を、異なる種のＣＤ４０Ｌのアラインメントされた配列の同一性のパーセンテージと異なる残基の数とを計算するが、細胞外ドメインのみを考えることによって評価した。ヒトＣＤ４０Ｌに対するパーセンテージ同一性は、アカゲザルの９９．５％からラマの８８％ならびにマウスおよびラットの７５％未満までに及ぶ。ラマＣＤ４０Ｌに対するヒトＣＤ４０Ｌ（ｈＣＤ４０Ｌ）の高い相同性は、抗体生成を惑乱させる。ラットおよびマウスＣＤ４０Ｌに対するヒトＣＤ４０Ｌの低い相同性は、交差反応性のナノボディの知見を難しくする。
５頭の非近交ラマを免疫した。２頭のラマを組換えヒトＣＤ４０Ｌによって免疫した（PeproTech、３１０－０２）。３頭のラマを、ｈＣＤ４０Ｌを発現するＬｌａｎａ細胞によって免疫した。ｈＣＤ４０ＬとラマＣＤ４０Ｌとの間の高い相同性にもかかわらず、全てのラマはｈＣＤ４０Ｌに対して強い免疫応答を示した。
免疫ナノボディファージディスプレイライブラリーを、全てのラマの血液サンプルから抽出されたトータルＲＮＡを用いて調製されたｃＤＮＡから生成した。ファージディスプレイライブラリーを、組換えヒトＣＤ４０Ｌ、ヒト細胞上に発現されたヒトＣＤ４０Ｌ、または選択ラウンド間で交替する両方の抗原フォーマットどちらかを用いて探索した。
選択アウトプットを、ナノボディ結合についてはＦＡＣＳによって、ブロッキングについてはAlphaScreen競合アッセイによって、上の例６．１．１および６．１．２に従ってスクリーニングした。
１回の選択ラウンド後に、結合ナノボディの約５０％はＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用をもまたブロックした。大腸菌によって産生された組換えｈＣＤ４０Ｌによって選択されたナノボディを例外として、ＦＡＣＳ結合剤の数およびブロックナノボディの割合は選択ラウンドにつれて増大した。より高いヒット率が、ＣＨＯ－ＣＤ４０Ｌ細胞によって免疫された動物に由来するクローンについて観察された。
ＦＡＣＳおよびAlphaScreenにおけるカットオフ基準を満たす１５００個超のナノボディヒットを爾後にシーケンシングし、２１０個の異なるナノボディファミリーに属する６８９個のユニークなクローンをもたらした。これらのクローンのｏｆｆ－ｒａｔｅを、例６．１．３に述べられているように決定した。
４０個の異なるナノボディクローン、すなわちリードパネルを、さらなるキャラクタリゼーションのために選択した。AlphaScreen（登録商標）においてＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用をブロックし、ＣＤ４０Ｌ（ＦＡＣＳ）の本来の立体配座に結合し、ｏｆｆ－ｒａｔｅ＜４×１０－３を有したクローンのみをさらに考えた。
６．３ ４０個のナノボディのリードパネルのインビトロキャラクタリゼーション
リードパネルの４０個のナノボディをpAX205にクローニングし、P. pastorisによって産生し、さらなるキャラクタリゼーションのために精製した。それらの効力を、AlphaScreen、ならびにレポーターおよびＢ細胞活性化アッセイによって決定した（例６．１．４および６．１．５を見よ）。加えて、ｏｆｆ－ｒａｔｅを確認した。競合ＥＬＩＳＡにおいてファージ上に提示されたナノボディに対して精製されたナノボディをスクリーニングすることによって、エピトープビンを決定した（例６．１．７を見よ）。
７つの異なるエピトープビンが４０個のナノボディのリードパネルから同定された。ナノボディＣ０１０００２８Ｂ０２（ビン６．２）およびＣ０１０００４６Ｂ０３（ビン２．１）はＣＤＰ７６５７（ビン１．１）とは異なるエピトープビンである。最も効力の高いのクローンはエピトープビン６．２に属した。
ヒトおよびラマＣＤ４０Ｌの間の配列保存に鑑みて、７つの異なるエピトープビンに属するナノボディが同定されることは予想されなかった。
６．４ １５個のナノボディのリードパネルのさらなるインビトロ選択
ＣＤ４０Ｌ－ＣＤ４０相互作用によって誘導される重要な表現型は、Ｂ細胞活性化および増殖である。Ｂ細胞は抗原をヘルパーＴ細胞に提示し得る。活性化Ｔ細胞がＢ細胞によって提示されたペプチドを認識する場合には、Ｔ細胞上のＣＤ４０ＬはＢ細胞のそのＣＤ４０受容体に結合し、休止期Ｂ細胞の活性化を引き起こす。Ｔ細胞はＩＬ－４をもまた産生し、これはＢ細胞に直接的に影響する。これらの刺激の結果として、Ｂ細胞は分裂を行い得る。
配列多様性とＢ細胞活性化アッセイにおけるそれらの性能とに基づいて選択された１５個のナノボディを、Ｂ細胞増殖アッセイによって例６．１．６に従って試験した。Ｂ細胞活性化および増殖アッセイの間の主な違いは、読み出し（それぞれＣＤ８６レベルおよびＨ３チミジン取り込みの決定である）およびＢ細胞を活性化するために用いられるＣＤ４０Ｌソース（それぞれ、ＵＶ照射したｈＣＤ４０Ｌ発現ＣＨＯ細胞、およびｈＣＤ４０Ｌ細胞からの膜抽出物）である。両方のアッセイについて、Ｂ細胞は健康なドナーに由来した。Ｈ３チミジン取り込みは、ＣＤ８６発現よりもＢ細胞活性化のさらに下流の指標であり、それゆえに、より妥当な機能的読み出しと考えられる。Ｂ細胞増殖アッセイにおいて、１５クローンのうち６つはＣＤＰ７６５７Ｆａｂに匹敵する効力を有することが見いだされた。
６．５ ４つのリード候補の選択
上に述べられているAlphaScreen、レポーターアッセイ、Ｂ細胞活性化アッセイ、およびＢ細胞増殖アッセイ、および物理化学的安定性データ（データは示さない）に基づいて、リードパネルを、最終的なキャラクタリゼーションステージのための４つのリード候補にまで縮減した。最も高い効力のエピトープビン（ビン６．２；上を見よ）から、異なるファミリーからの２つのリード候補を選択した：Ｃ０１０００２８Ｂ０２（「２８Ｂ０２」）およびＣ０１０００４４Ｂ０７（「４４Ｂ０７」）。Ｃ０１０００２８Ｂ０２はＢ細胞増殖アッセイにおける最良のクローンの１つであったが、Ｃ０１０００４４Ｂ０７はＢ細胞活性化アッセイにおける最も高い効力のクローンかつＢ細胞増殖アッセイにおける非常に高い効力のクローンであった。２つの追加のリード候補を選択した。エピトープビン４．２のＣ０１０００２９Ｃ１０（「２９Ｃ１０」）、これはＢ細胞増殖アッセイにおける高い効力のクローンであった。少なくとも９クローンが種々のアッセイにおいてより良好な性能であるということを指示する上の基準にもかかわらず、本発明者はエピトープビン２．１のＣ０１０００４６Ｂ０３（「４６Ｂ０３」）も選択することに決めた。なぜなら、これは異なる生殖細胞系列にあたったからである。
６．６ フォーマット：半減期延長（ＨＬＥ）の効果
典型的には、自己免疫疾患の処置は薬物が患者において持続的な利用能を有することを要求する。すなわち薬物は長い半減期を有するべきである。薬物の半減期延長の種々の手段が利用可能であり、Ｆｃ融合、ＰＥＧ化、ならびに血清アルブミンおよびアルブミン結合剤への融合を包含する。
Ｆｃ融合体は最も好ましくないオプションであるという仮説をたてた。なぜなら、これはヒト血小板上のＦｃ受容体への結合を可能にし、潜在的に血小板活性化および凝集をもたらすであろうからである。その上に、ＰＥＧ部分は別個の産生ステップにおいてナノボディにコンジュゲーションされ、増大したコストおよび減少した収量をもたらすので、ＰＥＧ化は好ましくない。また、ＰＥＧ化は、多くの場合には、薬物－標的結合相互作用との立体干渉が原因の縮減された結合親和性に至り、高いＰＥＡを患う。これに鑑みて、血清アルブミンに結合するＩＳＶＤへの融合による半減期延長が選好された。
リード候補に及ぼすアルブミン結合の影響を評価するために、半減期延長型の（ＨＬＥ）（ＮＢ－３５ＧＳ－Ａｌｂ１１－ＦＬＡＧ３－ＨＩＳ６）および非ＨＬＥの一価のＩＳＶＤを構築し、ＩＣ５０によって指示されるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の不在および存在下におけるＢ細胞増殖アッセイによって試験した：
－ Ｃ０１００００００６はＣ０１００００２８Ｂ０２－Ａｌｂ１１－ＦＬＡＧ３－ＨＩＳ６であり；
－ Ｃ０１００００００８はＣ０１００００２９Ｃ１０－Ａｌｂ１１－ＦＬＡＧ３－ＨＩＳ６であり；
－ Ｃ０１００００００４はＣ０１００００４４Ｂ０７－Ａｌｂ１１－ＦＬＡＧ３－ＨＩＳ６であり；
－ ＣＯ１０００００１０はＣ０１００００４６Ｂ０３－Ａｌｂ１１－ＦＬＡＧ３－ＨＩＳ６である。
結果は表６．６に示されている。
Figure 0007256011000001
効力の小さい違いのみが観察され、分子の効力に及ぼす半減期延長の限定された影響を指示した。ＰＥＧ化によるＦａｂ’部分の半減期延長が活性を４～５倍減少させたＣＤＰ７６５７とは対照的である（ＵＳ２０１０／０１０４５７３を参照せよ）。
６．７ 種間交差反応性および選択性
６．７．１ 種間交差反応性
アカゲザルの９９．５％からマウスおよびラットの７５％未満までに及ぶヒトＣＤ４０Ｌに対するＣＤ４０Ｌ配列相同性の異なる程度を考えて、マウス、ラット、カニクイ、およびアカゲザルＣＤ４０Ｌに対する種間交差反応性を評価した。
マウスＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ２７５４８）への結合を評価するために、ProteOnのＧＬＣセンサーチップを、１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．５中の組換えマウスＣＤ４０Ｌ（R&D、ＮＳ０）の３０００～４０００Ｕによってコーティングした。精製された一価の抗ＣＤ４０Ｌナノボディを、ProteOnランニング緩衝液：ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０入り）中において、１００ｎＭでセンサーチップ上に流した。処理後の曲線を、ラングミュア解離モデルに基づくｏｆｆ－ｒａｔｅ分析に用いた。全ての４０個のリードパネルクローンを試験した。しかしながら、それらのいずれもマウスＣＤ４０Ｌへの結合を示さなかった。
ラットＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９Ｚ２Ｖ２およびＱ９Ｒ２５４（二次））に対する交差反応性をＦＡＣＳによって試験した。精製されたナノボディを、ラットＣＤ４０Ｌへの結合についてＦＡＣＳによって分析した。２×１０５細胞（一過的にトランスフェクションされたラットＣＤ４０ＬＨＥＫ細胞）を、ＦＡＣＳ緩衝液中の精製されたナノボディと４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を３×洗浄し、再懸濁し、４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を再び３×洗浄し、死細胞をＴＯＰＲＯ３（Molecular probes、Ｔ３６０５）によって染色した。サンプルをFACSarray（商標）（BD Biosciences）によって分析した。最終的な４つのリード候補（Ｃ０１０００２８Ｂ０２、Ｃ０１０００２９Ｃ１０、Ｃ０１０００４４Ｂ０７、およびＣ０１０００４６Ｂ０３）のみを試験した。結合はナノボディのいずれかについては観察されなかった。
カニクイＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｇ７ＰＧ３８）およびアカゲＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｇ７Ｎ４Ｍ５）に対する交差反応性をリガンド競合アッセイによって試験した。精製されたナノボディを、ヒト／アカゲザル／カニクイザルＣＤ４０発現細胞へのビオチニル化ヒトＣＤ４０Ｌ結合との競合についてＦＡＣＳによって分析した。ヒト、アカゲザル、およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ４０Ｌの可溶性形態は配列が同一であるので、ヒトＣＤ４０Ｌを用いた。２×１０５細胞（一過的にトランスフェクションされたＨＥＫ細胞）を、ＦＡＣＳ緩衝液中の精製されたナノボディの希釈系列と４℃で３０分間インキュベーションした。それから、細胞を３×洗浄し、最後に、ストレプトアビジン－ＰＥ（BD Pharmingen、＃５５４０６１）を含有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。この混合物を４℃で３０分間インキュベーションした。細胞は上に述べられているようにさらに取り扱った。結果は表６．７に示されている。
Figure 0007256011000002
ナノボディのそれぞれについて、ＩＣ５０値は、異なるＣＤ４０Ｌ種について実験誤差内で同一であった。
６．７．２ 選択性
Basic Local Alignment Search Tool（Blast）を用いて、ヒト蛋白質データベース中の最も近縁の蛋白質を同定した。最も近縁の蛋白質（非ＣＤ４０Ｌバリアント）はＴＮＦα、ＨＶＥＭ－Ｌ（ＴＮＦ１４）、およびＲＡＮＫＬ（ＴＮＦ１１）であり、それぞれ２７．９％、２７．９％、および２５．４％の配列同一性を有した。ＣＤ４０Ｌについて選択性を評価するために、MaxiSorpプレート（Nunc、４３０３４１）をヒトＣＤ４０Ｌによって一晩コーティングし（４℃）、次にＲＴにおける１時間のブロッキングであった（ＰＢＳ、１％カゼイン）。ナノボディの一定濃度を、１００倍過剰から出発する競合剤（ＴＮＦα、ＨＶＥＭ－Ｌ（ＴＮＦ１４）、およびｈＲＡＮＫＬ（ＴＮＦ１１）；ＣＤ４０Ｌを正のコントロールとして用いた）の希釈系列と一緒に用いた。ナノボディは抗ＦＬＡＧ－ＨＲＰ（Sigma（Ａ８５９２））によって検出した。
ヒトＴＮＦα、ＨＶＥＭ－Ｌ（ＴＮＦ１４）、およびｈＲＡＮＫＬ（ＴＮＦ１１）に対する結合は、Ｃ０１０００２８Ｂ０２、Ｃ０１０００２９Ｃ１０、Ｃ０１０００４４Ｂ０７、およびＣ０１０００４６Ｂ０３のいずれかについて観察されなかった。
６．８ 親和性成熟
４つの選択されたナノボディ（Ｃ０１０００２８Ｂ０２、Ｃ０１０００２９Ｃ１０、Ｃ０１０００４４Ｂ０７、およびＣ０１０００４６Ｂ０３）は、Ｂ細胞増殖アッセイにおいてナノモル範囲の効力を有した。これはＩＣ５０によって指示される（表６．８を見よ）。
Figure 0007256011000003
さらに効力を増大させるために、ナノボディを親和性成熟した。親のナノボディの親和性成熟バリアントのスクリーニングのために、ｏｆｆ－ｒａｔｅを決定した。
親和性成熟は、各親のナノボディクローンから生成したエラープローンライブラリーをスクリーニングすることによって行った。このアプローチでは、アミノ酸置換は、エラープローンＰＣＲによって、ナノボディをコードするＤＮＡ中への変異のランダムな導入からもたらされる。帰結として、アミノ酸置換がＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）両方に見いだされる。５ラウンドのファージディスプレイ選択を、組換えＣＤ４０Ｌの（５０ｎＭから０．０５ｐＭに）減少して行く濃度を用いて溶液中で行った。ファージディスプレイ後に、個々のナノボディをシーケンシングし、ｏｆｆ－ｒａｔｅをＳＰＲ分析によって決定した（例６．１．３を参照せよ）。ｏｆｆ－ｒａｔｅデータに基づいて、有益な効果を有する変異をさらに検討した。
６．８．１ Ｃ０１０００２８Ｂ０２（２８Ｂ０２）
４１３個の配列が選択後に得られ、そのうち２９４クローンがシーケンシングに基づいて非冗長的であった。これらのユニークなクローンのうち、２７１クローンのｏｆｆ－ｒａｔｅをProteOnによって試験した。
本質的に、ナノボディ上のそこここに散在するフレームワーク変異（１クローンに最大６つ）は、ｏｆｆ－ｒａｔｅに影響しないか、または最小限にのみ影響した（データは示さない）。ＦＲ変異のいずれも保持されなかった。ＣＤＲ変異は下の表に示されている。
クローンのおよそ２５％は親のナノボディと比べて最大２倍改善されたｏｆｆ－ｒａｔｅを提示した。
Figure 0007256011000004
Figure 0007256011000005
Figure 0007256011000006
ＣＤＲ３中の３つの変異を、このデータセットに基づくさらなる検討のために選択した：
Ｌ１００ａＦ：この変異は１．３倍改善されたｏｆｆ－ｒａｔｅを（好ましくはＫ４３Ｒとの組み合わせによって）もたらした；
Ｄ１０１Ｇ：この変異は、ｏｆｆ－ｒａｔｅの１．３倍の改善をもたらした；および
Ｙ１０２Ｆ：この変異は、ｏｆｆ－ｒａｔｅの１．８倍の改善をもたらした。
最終的なバリアントはＣ０１０００２３６６（配列番号７）であった。
６．８．２ Ｃ０１０００４６Ｂ０３（４６Ｂ０３）
７３１個の配列が得られ、そのうち２２９クローンが非冗長的であった。全ての２２９クローンをProteOnによって試験した。
本質的に、ナノボディ上のそこここに散在するフレームワーク変異（１クローンに最大６つ）は、ｏｆｆ－ｒａｔｅに影響しないか、または最小限にのみ影響した（データは示さない）。ＦＲ変異のいずれも保持されなかった。ＣＤＲ変異は下の表に示されている。
Figure 0007256011000007
Figure 0007256011000008
Figure 0007256011000009
クローンのおよそ２５％は親のナノボディと比べて最大５．２倍改善されたｏｆｆ－ｒａｔｅを提示した。６つの位置を、このデータセットに基づくさらなる検討のために選択した：
・ Ｙ１００Ｈ：ｏｆｆ－ｒａｔｅに及ぼす効果なし
・ Ｙ１００Ｉ：１．５倍改善されたｏｆｆ－ｒａｔｅ
・ Ｓ１００ａＴ：ｏｆｆ－ｒａｔｅに及ぼす効果なし
・ Ｎ１００ｇＤ：効果は目立たない
・ Ｅ１００ｈＶ：ｏｆｆ－ｒａｔｅに及ぼす効果なし
・ Ｍ１００ｉＩ：ｏｆｆ－ｒａｔｅに及ぼす効果なし
・ Ｈ１００ｋＮ：単一の変異、２．６倍改善されたｏｆｆ－ｒａｔｅ
・ Ｈ１００ｋＡ：約２倍改善されたｏｆｆ－ｒａｔｅ
・ Ｈ１００ｋＳ：約２倍改善されたｏｆｆ－ｒａｔｅ
最終的なバリアントはＣ０１０００３２９０（配列番号８）であった。
６．９ Ａｌｂバリアント
本発明に至る研究において、Ｃ末端延長をナノボディのＣ末端領域に追加することは、健康なヒト対象の血漿／血清サンプルの大多数において既存抗体の結合を本質的に防止するということが発見された（下を見よ）。しかしながら、ＳＬＥを包含するある種の深刻な（自己）免疫障害を患ういくつものヒト対象からの血液および血清は、ナノボディがＣ末端延長を含むときでさえもナノボディに結合し得るいくつかの既存抗体／因子を含有するように見える。
下の例においては、用いられた（すなわち、健康なボランティアおよびＳＬＥ患者からの）サンプル中に存在する既存抗体の、試験されたナノボディへの結合を、次のようにProteOnを用いて決定した：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上に捕捉されたナノボディへの既存抗体の結合を、ProteOn XP 36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として用い、実験は２５℃で行った。ProteOnのＧＬＣセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流量３０μｌ／ｍｉｎ）によって活性化し、ＨＳＡをProteOn酢酸緩衝液ｐＨ４．５中の１０μｇ／ｍｌで注入して（流量１００μｌ／ｍｉｎ）、固定化レベルをおよそ３２００ＲＵにした。固定化後に、表面をエタノールアミンＨＣｌによって不活性化した（流量３０μｌ／ｍｉｎ）。ナノボディをＨＳＡ表面に４５μｌ／ｍｉｎで２分間注入し、ナノボディ捕捉レベルをおよそ２００ＲＵにした。既存抗体を含有するサンプルを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）によって１：１０希釈した後に、４５μｌ／ｍｉｎで２分間注入し、次に爾後の４００秒の解離ステップであった。各サイクル後に（すなわち、新たなナノボディ捕捉および血液サンプル注入ステップ前に）、ＨＳＡ表面を４５μｌ／ｍｉｎのＨＣｌ（１００ｍＭ）の２分の注入によって再生した。センサーグラム処理およびデータ分析をProteOn Manager 3.1.0（Bio-Rad Laboratories, Inc.）によって行った。既存抗体の結合を示すセンサーグラムは、１）ナノボディ－ＨＳＡ解離および２）参照リガンドレーンへの非特異的結合を差し引くことによる二重参照後に得られた。既存抗体の結合レベルは、報告時点を１２５秒に（会合の終わりの５秒後に）設定することによって決定した。既存抗体結合のパーセンテージ縮減は、参照ナノボディの１２５秒における結合レベルに対して相対的に計算した。参照Ａ＝Ａｌｂ８（配列番号１６）；参照Ｂ＝Ａｌｂ８＋Ａ（配列番号１７）（表２を見よ）。
６．９．１：ヒトＳＬＥサンプル中に存在する既存抗体の結合に及ぼすＳ１１２Ｋ変異の影響
参照Ａおよび参照Ｂを、ＳＬＥについて陽性と確認された患者から得られた７つの血清サンプルからの既存抗体による結合について試験した。比較のために、２人の健康なヒトボランティアからの血漿サンプルを包含した。
試験されたサンプル中の既存抗体のナノボディへの結合を、上で概述した一般的なプロトコールに従ってProteOnによって測定した。結果は下の表６．９．１に示されている。
参照Ａおよび参照Ｂならびに本発明のナノボディの結合データの比較から分かるように、ＳＬＥ患者のいくつかから得られたサンプルは、Ｃ末端アラニン残基の存在下においてさえもナノボディに尚結合し得るある種の既存抗体を含有するように見える（Ｃ末端アラニン残基は、健康なボランティアからの血漿サンプル中に存在する既存抗体の全ての結合を（部分的にまたは本質的に完全に）本質的に防止／除去はしなかった）。
ＳＬＥサンプルからのそれらの既存抗体の結合が、位置１１および１１２の変異によって（位置１１２のケースにおいては、特にＳ１１２Ｋによって）大いに縮減され得たということもさらに分かる。
６．９．２：ヒトＳＬＥサンプル中に存在する既存抗体の結合に、組み合わせられたフレームワーク変異およびＣ末端延長が及ぼす影響
４つの異なるナノボディ（具体的なフレームワーク変異を有し、Ｃ末端アラニン延長ありまたはなし）を、ＳＬＥについて陽性と確認された患者から得られた５つの血清サンプルからの既存抗体の結合について試験した。比較のために、健康なヒトボランティアからの１つの血漿サンプルを包含した。
試験されたナノボディへのサンプル中の既存抗体の結合を、上で概述した一般的なプロトコールに従ってProteOnによって測定した。結果は下の表６．９．２（ａ）および６．９．２（ｂ）に示されている。
参照Ａおよび参照Ｂの結合データの比較から分かるように、ＳＬＥ患者から得られたサンプルは、Ｃ末端アラニン残基の存在下においてさえもナノボディに尚結合し得るある種の既存抗体を含有するように見える。Ｃ末端アラニン残基は、健康なボランティアからの血漿サンプル中に存在する既存抗体の全ての結合を本質的に防止／除去はしなかった。
ＳＬＥサンプルからのそれらの既存抗体の結合が、位置１１および１１２の変異によって（位置１１２のケースにおいては、特にＳ１１２Ｋによって）大いに縮減され得たということもさらに分かる。
６．９．３：ＳＬＥ患者からのサンプル中の既存抗体の結合にＶ８９Ｔ変異が及ぼす影響．
本明細書に記載される通り、ある種のＳＬＥ患者から得られたサンプルは、Ｃ末端延長が存在するときでさえもＶＨドメインの暴露されたＣ末端に結合し得るある種の既存抗体／因子を含有するように見える。Ｖ８９Ｔ変異が、Ｃ末端延長の存在ありまたはなしで、かかる結合を縮減または防止／除去し得るかどうかを検討した。結果は下の表６．９．２（ｂ）および６．９．３（ａ）にもまた示されている。
分かる通り、Ｖ８９Ｔ変異は、ＳＬＥ患者から得られたサンプル中に存在する既存抗体の結合を、Ｓ１１２Ｋ変異と類似の程度まで本質的に防止／除去し得た。しかしながら、Ｃ末端延長なしのＶ８９Ｔ変異を有するナノボディおよびＣ末端延長なしのＳ１１２Ｋ変異を有する類似のナノボディについて表６．９．２（ｂ）および６．９．３（ａ）に与えられているデータを比較することから分かるように、Ｃ末端延長なしのナノボディの位置１１２に変異を有することは、一般的には、健康なボランティアからのサンプル中の既存抗体の結合をＶ８９Ｔ変異よりも大きい程度まで縮減する（すなわち、それぞれＳ１１２Ｋナノボディの１００％、８５％、および６４％対Ｖ８９Ｔナノボディの９％、１１％、および１６％）。この理由で、位置１１２の変異（具体的にはＳ１１２ＫまたはＳ１１２Ｑ）の使用は、位置８９の変異（例えばＶ８９Ｔ）の使用と比べて多くの場合には好ましいであろう。
しかしながら、表６．９．２（ｂ）および６．９．３（ａ）のデータからもまた分かる通り、Ｃ末端アラニンをＶ８９Ｔナノボディに追加することは、健康なボランティアから得られたサンプル中の既存抗体の結合を完全に防止／除去した。この理由から、Ｖ８９ＴナノボディまたはＶＨドメインが、その中にそれが存在する蛋白質またはポリペプチドにおいて（例えば、それのＣ末端を形成するので）暴露されたＣ末端領域を有するか、または有することを意図される場合には、本明細書に記載されるＶ８９Ｔ変異とＣ末端延長との組み合わせが通常は好ましいであろう（すなわち、Ｃ末端延長なしのＶ８９Ｔの使用と比べて）。
上の表からの結果／知見が広く適用可能であるということを確認するために、Ｓ１１２Ｋおよび／またはＶ８９Ｔ変異を有する代表的なナノボディを、９６個（Ｓ１１２Ｋ）および１２９個（Ｖ８９Ｔ）のヒト血清サンプルの試験パネルに対して試験した。結合は上に述べられているプロトコールを用いてProteOnによって決定された。
結果は図１および表６．９．３（ｂ）にまとめられている（Ｓ１１２Ｋ変異を有する代表的なナノボディ）。図１においては、Ｓ１１２Ｋ変異を有するナノボディ（参照Ａ＋Ｓ１１２Ｋ＋Ｃ末端アラニン。上の表６．９．２（ｂ）を見よ）を参照ナノボディ（参照Ａ；配列番号１６）と比較した。Ｓ１１２Ｋ変異を有するナノボディおよび参照Ａを、両方とも血清サンプルのそれぞれに対して試験し、１２５秒における結合レベル（ＲＵ）を決定した。それから、データを図１にプロットした。各点は、参照Ａ（図１においては（１）として指示されている）またはＳ１１２Ｋ変異体（図１においては（２）として指示されている）どちらかについて１つのサンプルによって測定された結合を提示している。点線は、２０ＲＵという測定された結合レベルを指示している。
同じデータは、表６．９．３（ｂ）において数値的にもまた表されている。これは、それぞれ参照ＡおよびＳ１１２Ｋ変異体について、２０ＲＵ超、２０ＲＵ未満（すなわち０および２０ＲＵの間）、および１０ＲＵ未満という１２５秒における結合レベルを与えた試験されたサンプルの総数を挙げている。
図１にプロットされ、表６．９．３（ｂ）に示されているデータから分かる通り、参照Ａでは、試験された９６サンプルの半分超が２０ＲＵ超の結合レベルを与え（いくつかのケースにおいては、１５０～２００ＲＵほども高い）、サンプル中に存在する既存抗体が参照Ａに結合しているということを指示した。比較として、Ｓ１１２Ｋ変異体では、いずれのサンプルも２０ＲＵ超の結合レベルを与えず（大部分は１０ＲＵ未満）、Ｓ１２２Ｋ変異が試験された９６サンプルの全てにおいて本質的に既存抗体の結合を縮減／防止する能力があるということを指示した。
類似のプロットおよび類似のデータが、１２９個の血清サンプルに対して試験されたＶ８９Ｔ変異を有する代表的なナノボディ（参照Ａ＋Ｌ１１Ｖ＋Ｖ８９Ｔ＋Ｃ末端アラニン；上の表６．９．３（ａ）を見よ）についてそれぞれ図２および表６．９．３（ｃ）に示されており、再び参照Ａ（図２においては（１）によって指示されている；Ｖ８９Ｔ変異体は図２においては（２）によって指示されている）と比較されている。
再び、図２のプロットおよび表６．９．３（ｃ）のデータから、少数の例外（すなわち試験されたサンプルの１０％未満。それから、これらはそれぞれが約１００ＲＵ以下という１２５秒後の絶対結合値を与えた）を除いて、Ｖ８９Ｔ変異は、試験された１２９サンプルの大部分において既存抗体の結合を縮減／防止する能力があったが、Ｖ８９Ｔ変異なしの参照は、試験されたサンプルの大部分において既存抗体によって結合されたということが分かる。
Figure 0007256011000010
Figure 0007256011000011
６．１０ 最終的なフォーマット
既存抗体の結合を縮減するためにＡｌｂバリアントを最適化するデータに基づいて（例６．９を見よ）、ＣＤ４０Ｌに結合するＩＳＶＤを最適化されたＡｌｂバリアントに融合し、さらに試験した。
６．１０．１ 最終的なフォーマットの既存抗体の結合．
Ｃ０１０００２８Ｂ０２およびＣ０１０００４６Ｂ０３を、それぞれＡｌｂ１１およびＡｌｂ２３バリアント、すなわちＡｌｂ００１２９（Ａｌｂ１１（ＬｌｌＶ，Ｖ８９Ｔ）－Ａ）およびＡｌｂ００１３２（Ａｌｂ２３（Ｌ５Ｖ，ＬｌｌＶ，Ｖ８９Ｔ）－Ａ）に融合した（表６．１０を見よ）。
Figure 0007256011000012
既存抗体への結合の不在を、本質的に上において６．９に述べられている最終的なフォーマットについて評価した。
Ｃ末端アラニンを追加することとＬ１１ＶおよびＶ８９ＴをＡｌｂ８ビルディングブロック中に作り出すこととによって、ＨＬＥ延長型リードへの既存抗体の結合の有意な縮減／防止があった。類似の既存抗体結合プロファイルがＣ０１０００３３１３（「３３１３」）およびＣ０１０００３３２０（「３３２０」）で見られた。これは、既存抗体の結合プロファイルがリンカーに非依存的であるように見えるということをもまた実証している。
Ｃ末端Ａｌａを追加することとＳ１１２ＫをＡｌｂ８ビルディングブロック中に作り出すこととによって、ＨＬＥ延長型リードへの既存抗体の有意な縮減／防止があった。
類似の既存抗体結合プロファイルが、Ｃ０１０００３３２６（「３３２６」）と比較してＣ０１０００３３１８（「３３１８」）で見られた。再び、これは、最適化されたＡｌｂバリアントを追加することによる既存抗体の縮減または防止が、最適化されたＡｌｂバリアントにリードナノボディをリンクするために用いられるリンカーに非依存的であるように見えるということを実証している。
その上に、これは、このケースにおいては、コンストラクト全体への既存抗体の結合の有意な縮減／防止を獲得するためには、Ｃ末端ビルディングブロック（このケースにおいては、最適化されたＡｌｂバリアント）のみが改変されることを必要とするということをもまた実証している。
６．１１ Ｂ細胞活性化および増殖アッセイにおける効力
リード候補Ｃ０１０００３３１８の効力をＢ細胞活性化およびＢ細胞増殖アッセイによって評価した（例６．１．６および６．４を参照せよ）。効力を５Ｃ８および非ＰＥＧ化ＣＤＰ７６５７と比較した。結果は表６．１１にまとめられている。
Figure 0007256011000013
Ｂ細胞増殖データに基づいて、Ｃ０１０００３３１８は５Ｃ８と比較して１０から６倍低い効力を有するが、Ｃ０１０００３３１８は非ＰＥＧ化ＣＤＰ７６５７よりも高い効力を有するということが実証された。
Ｂ細胞活性化データに基づいて、非ＰＥＧ化ＣＤＰ７６５７および５Ｃ８は、Ｃ０１０００３３１８よりも約係数２だけ高い効力であるように見えるということが分かる。
結論として、５Ｃ８は、これらのインビトロアッセイにおいてＣ０１０００３３１８よりも約２～１０倍高い効力である。より妥当なＢ細胞増殖アッセイにおいて（例６．４を参照せよ）、Ｃ０１０００３３１８はＣＤＰ７６５７よりも明らかに高い効力である。Ｂ細胞活性化アッセイにおいては、ＣＤＰ７６５７はＣ０１０００３３１８よりも約係数２だけ高い効力であるように見える。しかしながら、例６．６において指示されたように、ＣＤＰ７６５７のＰＥＧ化は活性を４～５倍減少させた（ＵＳ２０１０／０１０４５７３を参照せよ）。
ゆえに、Ｃ０１０００３３１８は全てのアッセイにおいてＣＤＰ７６５７よりも高い効力であるように見える。
６．１２ ＣＤ４０Ｌに対する親和性
ｈＣＤ４０Ｌに対する最終的な二重特異性ＨＬＥリードナノボディの親和性を定義するために、速度論的排除法（KinExA）をKinExA 3200（Sapidyne Inc.）によって実行した。
それから、応答をKinExA Proソフトウェアｖ３．２．６に入力し、遊離ナノボディのパーセンテージをｈＣＤ４０Ｌ濃度に対してプロットした。外れ値はフィッティングから排除されなかった。ドリフトまたはリガンドに関係づけられる非特異的結合の補正は必要ではなかった。低い変動が観察された。プロットされた値は「Affinity, Standard」分析法を用いてフィッティングした。ＫＤの結果は表６．１２に示されている。
Figure 0007256011000014
６．１３ マウスおよびカニクイにおけるＴＴ研究は、ナノボディがインビボのＣＤ４０Ｌ活性を中和することに有効であるということを実証する
リードナノボディのＣＤ４０Ｌ中和能力をインビボで評価するために、破傷風トキソイド（ＴＴ）負荷研究をヒト化マウスおよびカニクイザルにおいて行った。
６．１３．１ ナノボディはヒト化マウスのＴＴ研究においてＣＤ４０Ｌ活性を中和する．
ナノボディはマウスＣＤ４０Ｌと交差反応性ではなかったので（例６．７．１を見よ）、ヒト化マウスを破傷風毒素（ＴＴ）によって免疫し、ＴＴ特異的なＩｇＧ抗体応答にＣＤ４０Ｌ中和が及ぼす効果を異なる時点において評価した。ナノボディを、ＴＴ負荷に先立って、３日毎に、個体あたり合計で１０回の投与になるように投与した。ＴＴを第１日および第３１日に投与した。抗ＣＤ４０Ｌ３３１８ナノボディこれらのマウスにおけるＴＴ－ＩｇＧ応答を損なわせ、この効果は有意であった（データは示さない）。免疫抑制効果は用量依存的であったが、試験された全ての用量はコントロールよりも良好にＩｇＧ応答を縮減した。ナノボディの免疫抑制効果は、これらのナノボディ処置されたマウスの脾臓における成熟ヒトＢ細胞の不在によって確認された。類似に、マウスＴＴ研究において、ナノボディ３３１３および３３２０は、基剤群と比較されたときにＴＴ－ＩｇＧ応答を有意に縮減することに有効であることが判明した。加えて、これらのナノボディは、ＴＴ免疫されたヒトＰＢＭＣグラフト免疫不全マウスの脾臓におけるｈｕＰＢＬの定着および生育をも損なわせる（データは示さない）。
ゆえに、試験された全てのナノボディはインビボのＣＤ４０Ｌ活性を中和することに有効である。
６．１３．２ ナノボディは、カニクイザルのＴＴ研究においてＣＤ４０Ｌ活性を中和する．
カニクイザルＴＴ研究を例６．１３．１と類似に行った。手短には、カニクイザルを破傷風毒素によって毎日免疫し、ＴＴ特異的なＩｇＧ抗体応答に及ぼすＣＤ４０Ｌ中和の効果を異なる時点において評価した。ナノボディ、５Ｃ８、および基剤を第０日および第３１日に投与した。第１日＋４ｈおよび第３１日に、ＴＴを投与した。図７に示されているように、抗ＣＤ４０ＬのＣ０１０００３３１８ナノボディはこれらのサルにおけるＴＴ－ＩｇＧ応答を損なわせ、この効果は有意であった。免疫抑制効果は用量依存的であったが、試験された全ての用量は、ＩｇＧ応答をコントロールよりも良好に縮減した。データは、全てのナノボディ用量における可溶性標的の飽和を指示している。
ゆえに、試験された全てのナノボディはインビボのＣＤ４０Ｌ活性を中和することに有効である。カニクイザルのデータは、マウスにおけるデータを確認しており、機能的なＦｃ領域なしでさえもナノボディの広い適用可能性を証明している。とりわけ、抗ＣＤ４０ＬのＦｃエフェクター機能は、ＴＴに対する液性応答に影響することが示された（Shock et al. 2015 Arthritis Research & Therapy 17:234）。
６．１４ ＴＥ／血栓症のリスクのインビトロ評価
前に挙げたように、臨床的効果の有望な証拠にもかかわらず、ｈｕ５Ｃ８のさらなる開発は、処置中に現れる心血管血栓症事象（ＴＥ）の増大した発生率ゆえに中止された。また、アカゲザルにおける５Ｃ８の研究において、肺血管血栓および血管症を包含する様々なＴＥが５Ｃ８の投与後に見いだされた（Wakefield et al. 2010 Arthritis Rheum. 62:1243）。
ゆえに、抗ＣＤ４０Ｌナノボディが臨床的に用いられ得る前に、その安全性の評価は最大限の重要性がある。安全性をインビボおよびインビトロの種々のシステムによって評価した。次の方法およびアプローチを、インビボのＴＥおよび／または血栓症のリスクを評価するために設計した。
６．１４．１ インビトロの安全性 － 血小板アッセイ．
抗ＣＤ４０ＬｍＡｂは、ＦｃｇＲＩＩａを血小板上にクラスター化する免疫複合体によって血小板活性化および凝集を誘導し得るということがRoth et al.によって記載されているので、抗ＣＤ４０Ｌナノボディを血小板活性化および凝集アッセイによって試験して、血小板を刺激するそれらの固有のポテンシャルを検討した（Roth et al., 2004 Transplantation 78:1238-9）。
Ｃ０１０００３３１３およびＣ０１０００３３１８を、前に述べられた血小板活性化アッセイおよび血小板凝集アッセイによってアッセイした。５Ｃ８およびＡＤＰをこれらのアッセイにおける正のコントロールとしてとり上げた。健康なボランティアおよびＳＬＥ患者両方について、血小板活性化が５Ｃ８で観察された。対照的に、Ｃ０１０００３３１３およびＣ０１０００３３１８は健康なボランティアおよびＳＬＥ患者において非活性化プロファイルを実証した（それぞれ図３および図４）。加えて、これらのナノボディは健康なボランティアおよびＳＬＥ患者の血液による血小板凝集アッセイによって試験され、血小板凝集を誘導しないと結論づけられたが、５Ｃ８はした。血小板凝集アッセイの結果は図５（健康なボランティア）および図６（ＳＬＥ患者）に示されている。
ゆえに、インビトロの血小板活性化および凝集アッセイにおいて、ナノボディは血小板を誘導しないが、５Ｃ８はするということが実証された。
６．１４．２ インビトロの安全性 － 内皮細胞活性化システム
膜ＣＤ４０Ｌは、主としてＣＤ４＋Ｔ細胞に限られる活性化した成熟Ｔ細胞上に一過的に発現されるが、休止期Ｔ細胞上にはされない。膜ＣＤ４０Ｌの発現は、Ｔリンパ球以外の細胞、すなわち活性化血小板、初代細胞、肥満細胞、好塩基球、および好酸球上にもまた検出されているが、ＣＤ４０発現は、ある種の条件下においてＢ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞上に、幅広く内皮細胞、線維芽細胞、および表皮細胞を包含する非造血細胞上に実証されている。内皮細胞は血小板の次に止血の鍵となるプレーヤーであるので、抗ＣＤ４０Ｌ剤が内皮細胞に及ぼす影響を、初代ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を含有する２つのシステムにおいて評価した：刺激ありの３Ｃシステム（心血管疾患／慢性炎症を模倣するため）および未刺激のＨＮｏシステム（健康な血管内皮を模倣するため）（Bioseek）。抗ＣＤ４０Ｌナノボディ、無関係なコントロールナノボディ、５Ｃ８、および正のコントロールとしてのpiclamilastを、このシステムにおいて４つの異なる濃度で試験した。
結果は、ナノボディプロファイルが、内皮細胞に及ぼすいずれかの効果を指示しないと考えられたということを実証している（データは示さない）。他方で、piclamilastは炎症状態に関連したが、最も著しい結果は５Ｃ８によって得られた。今のところ、内皮細胞に及ぼす５Ｃ８からの影響は報告されていないが、両方の細胞系において、明瞭な用量依存的応答が観察された。具体的には、モニターされた全てのマーカー（炎症性、免疫調節、組織リモデリング、および止血）は１つのまたは両方の細胞系において５Ｃ８が原因で増大した。
結論として、試験されたナノボディは初代内皮細胞の活性化を誘導しなかったが、５Ｃ８はした。ゆえに、抗ＣＤ４０Ｌナノボディは安全であるように見える。
６．１４．３．インビトロの安全性 － 抗ＣＤ４０Ｌナノボディは逆行性シグナル伝達を開始しない
その受容体ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合は、細胞の活性化状態および細胞上の受容体の発現レベルに依存して順行性シグナルを誘導する。加えて、ＴＮＦＲファミリーメンバー（例えばＣＤ４０）へのリガンドの結合は逆行性シグナル伝達を開始し得、細胞増殖、サイトカイン分泌、酸化バースト、クラススイッチ、およびＴ細胞成熟を制御するということが公知である。しかしながら、ＴＮＦαファミリーのメンバーによる無制御なまたは不均衡な逆行性シグナル伝達はサイトカインストームをもたらし得、これは一般的に炎症性サイトカインの過剰なまたはコントロールされない放出として公知である（Eissner et al., 2004 Cytokine & Growth Factor Reviews 15:353-366）。
安全性をさらに評価するために、逆行性シグナル伝達が原因のサイトカインストームを開始するナノボディのポテンシャルを評価した。
１０人の健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを、異なる濃度の異なる化合物によって刺激した：アバスチン、モノクローナル抗ＣＤ３抗体、ＣＤＰ７６５７、および抗ＣＤ４０ＬナノボディＣ０１０００３３１８。また、ＰＢＭＣの応答性を評価するためにＳＥＢおよびＬＰＳをとり上げた。アバスチンは負のコントロールとして（Min & Kawabata, 2009 in EMA Workshop "in vitro cytokine release assays"）、抗ＣＤ３抗体は正のコントロールとして用いた。
ヒトＰＢＭＣを用いてインビトロのサイトカイン放出を評価するための方法は、３つの連続したステップからなる：バフィーコートからのヒトＰＢＭＣの単離および凍結、ヒトＰＢＭＣの融解および異なる化合物による刺激、ならびに最後にアッセイ上清中のサイトカインの定量。サンプル分析はEurofins Panlabs Inc.においてLuminexプラットフォーム（Life Technologies）を用いて行われた。測定されたサイトカインはＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γであった。サイトカインは２つの異なるLuminexアッセイによって分析した。第１のアッセイはＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＩＬ－１０を測定し、第２のアッセイはＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γを測定した。提供者によって決定されたキットの検出限界と各サイトカインの刺激グレードを見積もったAblynxにおいて行われた実験とに基づいて、サンプルの希釈を両方のアッセイについて調整した。アッセイはキットインサートに指示されている通りに行われ、各サンプルは二重で分析された。得られた結果について統計データ分析を行って、全ての化合物をブランク（未刺激のＰＢＭＣ）と比較した。
結果は、ヒトＰＢＭＣにおいてアバスチンおよびモノクローナル抗ＣＤ３抗体によって誘導されたサイトカイン産生が未刺激のＰＢＭＣのものよりも高かったということを実証している。また、正のコントロール化合物ＳＥＢおよびＬＰＳによって誘導されたサイトカインのレベルはブランクのものよりも高かった。化合物ＣＤＰ７６５７では、サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γのレベルはブランクのものに匹敵したが、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、およびＩＬ－１０については、試験された濃度に依存していくつかの違いが観察された。ＰＢＭＣ刺激によるＩＬ－６誘導からの例解的な結果が図８に示されている。特に、抗ＣＤ３化合物およびアバスチンによる総体的なサイトカイン誘導は、未刺激のサンプルと比較して陽性であることが実証された。ＣＤＰ７６５７化合物による誘導は、ブランクサンプルのものよりも高いＩＬ－６レベルをもたらした。ナノボディＣ０１０００３３１８によって誘導されたＩＬ－６レベルは、未刺激のサンプルにおいて測定されたＩＬ－６レベルに総体的に類似していた。２０ｎＭ濃度は例外であり、測定されたＩＬ－６レベルは最小限にではあるがブランクよりも高かった（これは外れ値であると思われる）。正のコントロール化合物ＳＥＢおよびＬＰＳはブランクと比較して陽性であることが示された。
総体的に、例示的なナノボディＣ０１０００３３１８によるサイトカイン誘導は未刺激のＰＢＭＣのものに匹敵した。
結論として、抗ＣＤ４０Ｌナノボディは、インビトロ設定においては、逆行性シグナル伝達が原因のサイトカインストームを開始しない。これは再びナノボディの安全性を確認している。
６．１５ インビボの安全性 － 抗ＣＤ４０Ｌナノボディはアカゲザルでは安全である
さらなる研究をセットアップして、インビボの抗ＣＤ４０Ｌナノボディの安全性を評価した。具体的には、抗ＣＤ４０Ｌナノボディの皮下投与がアカゲザルにおけるインビボのＴＥの欠如に至るかどうかをもまた決定した。
例示的なナノボディＣ０１０００３３１８を、３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、および３００ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ３匹の雌アカゲザルに４週間に渡って毎週１回投与した。
次のパラメータおよびエンドポイントを本研究においては評価した：臨床兆候、体重、体重変化、体温、臨床的な病理パラメータ（血液学、凝固、臨床化学、検尿、およびリンパ球表現型検査）、免疫原性（抗薬物抗体（ＡＤＡ））、毒物動態、薬力学、肉眼的剖検所見、臓器重量、および病理組織学的検査。検査は次を包含した。
下に列記されているｉｎ－ｌｉｆｅ手続き、観察、および測定を全ての動物について行った。動物は、一般的な健康、死亡、および異常について各日の午前に１回および午後に１回チェックした。その上に、動物は第－２週から毎日観察された。第１日から（投薬日に）、動物を投薬前、および投薬後に少なくとも３回観察した。非投薬日に、動物を午前および午後にチェックした。第－２週に始まり少なくとも週１回、全ての動物は詳細な臨床的観察を受けた。各投薬日には、日中に定期的に、全ての動物を処置に対する反応について検査した。兆候の発症、強度、および持続時間を記録した；投薬の間および投薬後の最初の１時間は動物に特に注意を払った。
注射部位は、処置に対する反応についてモニターした。第－２週から始めて毎週体重を記録した。剖検の予定日に重量を記録した。全ての動物は、前処置の間に１回（午後に、投薬前測定の所期時に）体温を記録された。投薬期間の間に、全ての動物は、各投薬日の投薬のおよそ８ｈ後に、および剖検前に毎週体温を記録された。
血液サンプル（０．５ｍＬ）をＫ２ＥＤＴＡチューブに収集し、表６．１５Ａに規定されているパラメータについて分析した。
Figure 0007256011000015
血液サンプル（１ｍＬ）を、３．８％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウムを含有するチューブにとり、血漿に処理し、これをパラメータの活性化部分トロンボプラスチン時間、フィブリノゲンおよびプロトロンビン時間について分析した。
血液サンプル（１．５ｍＬ）を、リチウムヘパリンを含有するチューブにとり、血漿に処理し、これを表６．１５Ｂに規定されているパラメータについて分析した。
Figure 0007256011000016
表６．１５Ｃに同定されている組織の代表的なサンプルを全ての動物から収集し、別様に指示されない限り１０％中性緩衝ホルマリン中で保管した。
Figure 0007256011000017
表６．１５Ｃに同定されている組織をパラフィン包埋し、切片化し（４～６μｍ）、スライドガラスにマウントし、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。実験動物病理の訓練および経験を有する獣医学病理学者によって病理組織学的評価が行われた。病理ピアレビューが試験施設の第２の病理学者によって実施された。
３０、１００、または３００ｍｇ／ｋｇ、毎週１回の４週間のアカゲザルへのＣ０１０００３３１８の皮下投与は、脾臓および全ての用量レベルにおけるリンパ節（腋窩、鼠径、下顎、および腸間膜）の胚中心のリンパ球減少、ならびに３０および１００ｍｇ／ｋｇにおける脾臓の胚中心のヒアリン化という顕微鏡的所見に関連した。これらの知見は試験品の予想された薬理学的効果であり、よって有害ではないと考えられた。臓器重量または肉眼的病理に及ぼす試験品に関係づけられる効果はなかった。観察された臨床兆候の試験品に関係づけられる変化、または体重の変化はなかった。臨床的な病理パラメータについて、試験品に関係づけられる効果はなかった。
結論として、４週間の毎週１回の皮下の例示的なナノボディＣ０１０００３３１８の投与は、雌アカゲザルにおいては最大３００ｍｇ／ｋｇ／週のレベルで良好に忍容された。標的臓器効果（リンパ組織）が３０から３００ｍｇ／ｋｇ／週のレベルで観察されたが、試験品の薬理学的活性の結果であり、よって有害ではないと考えられた。
これらの結果に基づいて、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は（試験された）最も高い投薬量として３００ｍｇ／ｋｇ／週であると考えられた。
引き延ばされた高用量暴露後でさえも、抗ＣＤ４０ＬナノボディがインビボでＴＥを誘導するという証拠はない。
６．１６ 免疫原性（ＡＤＡ）評価
免疫原性の評価のために、血液サンプルを全ての動物から収集して（例６．１５を見よ）、既存抗体（ＰＥＡ）（例６．９を参照せよ）または現れた抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在を決定した。
毒物動態評価および／または安全性評価を支持するために、ＡＤＡサンプル分析を行った。（ＭＳＤプラットフォームによって）ＡＤＡサンプル分析のための認証された電気化学発光（ＥＣＬ）に基づくブリッジングフォーマットを用いて、血漿サンプルを抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在について評価した。基剤によって処置（ｎ＝３）または３０、１００、もしくは３００ｍｇ／ｋｇナノボディによって処置されたどちらかの全ての４動物群から、サンプルを収集した。研究の始まり前に（研究前の第－７日）、および第１５日および第２９日にその日の投与に先立って、血液サンプルを全ての動物から収集した。
全てのサンプルからの応答はスクリーニングカットポイントよりも下であった。そのため、研究前の第－７日サンプルにおいてｐｒｅＡｂは検出されず、基剤によって処置またはナノボディを投薬された動物からのサンプルのいずれかにおいて処置中に現れるＡＤＡは検出されなかったということが結論づけられた。また、これらの結果は例６．９の知見を裏付けている。
ゆえに、既存のまたは処置中に現れるＡＤＡは、研究中には、十分に高感度の薬物忍容性のＡＤＡアッセイによって検出されなかった。
本願に引用される参照の全て（文献参照、交付済み特許、公開特許出願、および同時係属の特許出願を包含する）の内容全体は、特に本明細書において上で参照されている教示について、参照によって明示的にここで組み込まれる。
Figure 0007256011000018
Figure 0007256011000019
Figure 0007256011000020
Figure 0007256011000021
Figure 0007256011000022
Figure 0007256011000023
Figure 0007256011000024
Figure 0007256011000025
Figure 0007256011000026

Claims (15)

  1. ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、および血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、
    ＣＤ４０Ｌへの結合がＣＤ４０Ｌの活性を調節し、
    ＣＤ４０Ｌに特異的に結合するＩＳＶＤが、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）とからなり、ここで、
    ＣＤＲ１が配列番号３３であり、ＣＤＲ２が配列番号３５であり、ＣＤＲ３が配列番号３７である；
    ＣＤＲ１が配列番号６１であり、ＣＤＲ２が配列番号６３であり、ＣＤＲ３が配列番号６５である；
    ＣＤＲ１が配列番号４０であり、ＣＤＲ２が配列番号４２であり、ＣＤＲ３が配列番号４４である；または
    ＣＤＲ１が配列番号６８であり、ＣＤＲ２が配列番号７０であり、ＣＤＲ３が配列番号７２である、
    前記ポリペプチド。
  2. ＩＳＶＤが配列番号８、配列番号６、配列番号７または配列番号３である、
    請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ＣＤＲ１が配列番号４０であり、ＣＤＲ２が配列番号４２であり、ＣＤＲ３が配列番号４４であり、
    ＩＳＶＤが配列番号７または配列番号３である、
    請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. ポリペプチドがＣＤ４０Ｌに結合し、
    － １Ｅ－０７Ｍおよび１Ｅ－１３Ｍの間のＫＤを有し、
    － １Ｅ－０７Ｍおよび１Ｅ－１２Ｍの間のＩＣ５０を有し、および／または
    － ５Ｅ－０４（ｓ－１）未満のｏｆｆ－ｒａｔｅを有する、
    請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. ＣＤ４０ＬがヒトＣＤ４０Ｌである、
    請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 活性の調節が
    － ＣＤ４０Ｌの活性に拮抗することであり、
    － 少なくとも２０％の、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合をブロックすることであり、
    － Ｔ細胞共刺激分子ならびに／または免疫刺激性分子のＣＤ４０によって媒介される誘導に拮抗することであり、
    － Ｂ細胞活性化を阻害することであり、
    － ジャーカットＴ細胞におけるＪＮＫリン酸化を実質的に誘導しないことであり、
    － 抗ＣＤ３抗体によって共刺激されたジャーカットＴ細胞によるＩＦＮγ分泌を実質的に誘導しないことであり、
    － 初代内皮細胞の活性化を実質的に誘導しないことであり、および／または
    － 血小板活性化または血小板凝集を実質的に誘導しないことである、
    請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. Ｃ末端延長をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦ１からＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）とからなり、
    ＣＤＲ１が配列番号７４であり、ＣＤＲ２が配列番号７５であり、ＣＤＲ３が配列番号７６である、
    請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、ＡＬＢ１３５（配列番号１５）、ＡＬＢ１２９（配列番号１３）、ＡＬＢ８（配列番号１１）、ＡＬＢ２３（配列番号１２）、およびＡＬＢ１３２（配列番号１４）からなる群から選ばれる、
    請求項８に記載のポリペプチド。
  10. Ｃ末端延長がＣ末端延長（Ｘ）ｎであり、式中、ｎが１から１０であり；各Ｘが独立して選ばれるアミノ酸残基である、
    請求項７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. ポリペプチドが、少なくとも８０％の配列同一性をＣ０１０００３３１８（配列番号９）またはＣ０１０００３３１３（配列番号７８）に対して有する、
    請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０によって媒介される経路の不適切な活性化が関わる個体の疾患または障害の処置または防止のために用いられる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 医薬としての使用のための、
    請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、移植拒絶、クローン病、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、喘息／アレルギー、動脈硬化症、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、強直性脊椎炎、冠動脈性心疾患、１型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および／または組換え医薬品に対する免疫応答の症状を処置または防止することへの使用のための、
    請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. ポリペプチドが、ポリペプチド４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つのＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックし、ならびに／またはポリペプチド４６Ｂ０３（配列番号６）、２８Ｂ０２（配列番号３）、Ｃ０１０００３２９０（配列番号８）、およびＣ０１０００３３１８（配列番号９）の少なくとも１つによってＣＤ４０Ｌへの結合を交差ブロックされる、
    請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
JP2018527745A 2015-11-27 2016-11-28 Ｃｄ４０ｌを阻害するポリペプチド Active JP7256011B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562260411P 2015-11-27 2015-11-27
US62/260,411 2015-11-27
US201662345967P 2016-06-06 2016-06-06
US62/345,967 2016-06-06
PCT/EP2016/079048 WO2017089618A1 (en) 2015-11-27 2016-11-28 Polypeptides inhibiting cd40l

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2019504822A JP2019504822A (ja) 2019-02-21
JP2019504822A5 JP2019504822A5 (ja) 2020-01-16
JP7256011B2 true JP7256011B2 (ja) 2023-04-11

Family

ID=57471837

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018527745A Active JP7256011B2 (ja) 2015-11-27 2016-11-28 Ｃｄ４０ｌを阻害するポリペプチド

Country Status (22)

Country Link
US (1) US11248055B2 (ja)
EP (2) EP3380517B1 (ja)
JP (1) JP7256011B2 (ja)
KR (1) KR20180080337A (ja)
CN (1) CN108473561B (ja)
AU (1) AU2016360987A1 (ja)
BR (1) BR112018010802A2 (ja)
CA (1) CA3006398A1 (ja)
CL (1) CL2018001400A1 (ja)
CO (1) CO2018005921A2 (ja)
DO (1) DOP2018000128A (ja)
EC (1) ECSP18046820A (ja)
GT (1) GT201800102A (ja)
IL (1) IL259249A (ja)
MA (1) MA43302A (ja)
MX (1) MX2018006377A (ja)
PE (1) PE20181956A1 (ja)
PH (1) PH12018501114A1 (ja)
RU (1) RU2018122255A (ja)
SG (2) SG11201803976VA (ja)
TN (1) TN2018000180A1 (ja)
WO (1) WO2017089618A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018104444A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Ablynx Nv Improved serum albumin binding immunoglobulin single variable domains
US11414481B2 (en) 2017-01-17 2022-08-16 Ablynx N.V. Serum albumin binders
KR102653724B1 (ko) 2017-01-17 2024-04-02 아블린쓰 엔.브이. 개선된 혈청 알부민 결합제
JP7410024B2 (ja) * 2017-11-17 2024-01-09 ナンジン レジェンド バイオテク カンパニー リミテッド Ｐｄ－ｌ１に対する単一ドメイン抗体とその多様体
CN114149508B (zh) * 2021-11-25 2023-04-28 苏州普乐康医药科技有限公司 一种结合cd40l的融合蛋白及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012167112A (ja) 2005-05-18 2012-09-06 Ablynx Nv 腫瘍壊死因子−アルファに対する改良ナノボディ（商標）
WO2015143209A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating transplant rejection using a domain antibody directed against cd40l

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB335768A (en) 1929-10-24 1930-10-02 Jacoviac Maurice Improvements in protecting devices for gramophone disc records
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
ES2162823T5 (es) 1992-08-21 2010-08-09 Vrije Universiteit Brussel Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.
AU6796094A (en) 1993-04-29 1994-11-21 Raymond Hamers Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of (camelidae)
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
CA2258518C (en) 1996-06-27 2011-11-22 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Recognition molecules interacting specifically with the active site or cleft of a target molecule
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
US6670453B2 (en) 1997-10-27 2003-12-30 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent antigen-binding proteins
EP1051493A2 (en) 1998-01-26 2000-11-15 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
ID26964A (id) 1998-02-19 2001-02-22 Xcyte Therapies Inc Komposisi dan metode untuk pengaturan pengaktifan limfosit
EP0967284A1 (en) 1998-05-28 1999-12-29 Pfizer Limited Phosphodiesterases
BR9916765A (pt) 1999-01-05 2001-09-25 Unilever Nv Processo para produzir um material imunoadsorvente, uso de uma proteìna que é ligada por meio de uma ligação covalente a um fragmento de anticorpo, material imunadsorvente, uso de um material, e, kit de teste diagnóstico
ATE276359T1 (de) 1999-01-19 2004-10-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten
WO2000046383A2 (en) 1999-02-05 2000-08-10 Rijksuniversiteit Leiden Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells
CA2367955C (en) 1999-03-15 2009-05-19 University Of British Columbia Abc1 polypeptide and methods and reagents for modulating cholesterol levels
WO2000065057A1 (en) 1999-04-22 2000-11-02 Unilever Plc Inhibition of viral infection using monovalent antigen-binding proteins
AR024576A1 (es) 1999-06-18 2002-10-16 Univ Washington Composiciones y metodos para aumentar el flujo de salida de colesterol y aumentar la hdl usando la proteina abc1 transportadora del cassette que une elatp
AU6322900A (en) 1999-08-02 2001-02-19 Keygene N.V. Method for generating resistance against cgmmv in plants, genetic constructs for use in said method, and cgmmv-resistant plants obtained via said method
GB9922124D0 (en) 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
DE19955408A1 (de) 1999-11-18 2001-05-23 Bayer Ag GABA-B-Rezeptoren
AU1859201A (en) 1999-11-29 2001-06-12 Unilever Plc Immobilisation of proteins
AU2161501A (en) 1999-11-29 2001-06-25 Unilever Plc Immobilized single domain antigen-binding molecules
ATE337403T1 (de) 1999-12-24 2006-09-15 Genentech Inc Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen
EP1134231B1 (en) 2000-03-14 2009-04-15 Unilever N.V. Antibody heavy chain variable domains against human dietary lipases, and their uses
GB0006398D0 (en) 2000-03-16 2000-05-03 Novartis Ag Organic compounds
AU2001268855A1 (en) 2000-05-26 2001-12-03 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
DK1360207T3 (da) 2000-12-13 2011-09-05 Bac Ip B V Proteinarray af variable domæner af tunge immunoglobulinkæder fra kameler
CA2440582A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2003025020A1 (fr) 2001-09-13 2003-03-27 Institute For Antibodies Co., Ltd. Procede pour creer une banque d'anticorps de chameaux
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US20050214857A1 (en) 2001-12-11 2005-09-29 Algonomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
US20050037358A1 (en) 2001-12-21 2005-02-17 Serge Muyldermans Method for cloning of variable domain sequences
EP1461085A2 (en) 2002-01-03 2004-09-29 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Immunoconjugates useful for treatment of tumours
US7521543B2 (en) 2002-10-23 2009-04-21 Ludwig Institute For Cancer Research A34 and A33-like 3 DNA, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same
AU2003286003B2 (en) 2002-11-08 2011-05-26 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
WO2005044858A1 (en) 2003-11-07 2005-05-19 Ablynx N.V. Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
JP2006524036A (ja) 2002-11-08 2006-10-26 アブリンクス エン．ヴェー． 腫瘍壊死因子αを標的とする単一ドメイン抗体およびその使用
EP2390270A1 (en) 2003-01-10 2011-11-30 Ablynx N.V. Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and for use in modulating platelet-mediated aggregation
US7461263B2 (en) 2003-01-23 2008-12-02 Unspam, Llc. Method and apparatus for a non-revealing do-not-contact list system
WO2005018629A1 (en) 2003-08-12 2005-03-03 Yarbrough William M Treatment for acne vulgaris and method of use
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
WO2006040153A2 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti -amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as alzheimer's disease
EP1844073A1 (en) 2005-01-31 2007-10-17 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
NZ563392A (en) 2005-05-20 2009-12-24 Ablynx Nv Improved Nanobodies(TM) for the treatment of aggregation-mediated disorders
US8629244B2 (en) 2006-08-18 2014-01-14 Ablynx N.V. Interleukin-6 receptor binding polypeptides
JP2010511397A (ja) 2006-12-05 2010-04-15 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合可能なペプチド
CN101663319A (zh) 2007-02-21 2010-03-03 埃博灵克斯股份有限公司 针对血管内皮生长因子的氨基酸序列和包括其的多肽用于治疗特征在于过量和/或病理性血管发生或新血管形成的病症和疾病
NZ580245A (en) 2007-03-22 2012-01-12 Biogen Idec Inc Binding proteins, including antibodies, antibody derivatives and antibody fragments, that specifically bind cd154 and uses thereof
CN104231082B (zh) 2007-05-24 2018-12-21 埃博灵克斯股份有限公司 用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
RU2010153578A (ru) * 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
US8962807B2 (en) * 2009-12-14 2015-02-24 Ablynx N.V. Single variable domain antibodies against OX40L, constructs and therapeutic use
UY33827A (es) * 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión a media-inmunoglobulina y sus usos
AU2012271974B2 (en) * 2011-06-23 2017-01-12 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
SG10201805064SA (en) 2011-06-23 2018-07-30 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
KR102143506B1 (ko) 2011-08-17 2020-08-12 글락소 그룹 리미티드 변형된 단백질 및 펩티드
AR088455A1 (es) * 2011-10-13 2014-06-11 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos que antagonizan cd40l
AU2014326674B2 (en) 2013-09-26 2020-03-12 Ablynx Nv Bispecific nanobodies
IL256800B2 (en) 2015-07-14 2023-04-01 Immunext Inc An anti-cd154 antibody with improved binding, functional and safety properties and use in human immunotherapy
ES2944982T3 (es) 2015-08-05 2023-06-27 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-CD154 y métodos para utilizarlos

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012167112A (ja) 2005-05-18 2012-09-06 Ablynx Nv 腫瘍壊死因子−アルファに対する改良ナノボディ（商標）
WO2015143209A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating transplant rejection using a domain antibody directed against cd40l

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，２０１４，Ｖｏｌ．１９２，Ｎｏ．９，ｐ．１－１０

Also Published As

Publication number Publication date
US11248055B2 (en) 2022-02-15
ECSP18046820A (es) 2018-07-31
SG10201913503VA (en) 2020-03-30
CN108473561A (zh) 2018-08-31
BR112018010802A2 (pt) 2018-11-27
AU2016360987A1 (en) 2018-06-07
CL2018001400A1 (es) 2018-10-26
EP3380517B1 (en) 2021-08-04
TN2018000180A1 (en) 2019-10-04
MX2018006377A (es) 2018-09-05
US20180355050A1 (en) 2018-12-13
IL259249A (en) 2018-07-31
GT201800102A (es) 2019-08-15
SG11201803976VA (en) 2018-06-28
PE20181956A1 (es) 2018-12-17
EP3380517A1 (en) 2018-10-03
WO2017089618A1 (en) 2017-06-01
CA3006398A1 (en) 2017-06-01
KR20180080337A (ko) 2018-07-11
CN108473561B (zh) 2022-12-16
PH12018501114A1 (en) 2019-01-28
RU2018122255A3 (ja) 2020-04-06
CO2018005921A2 (es) 2018-06-20
RU2018122255A (ru) 2019-12-19
MA43302A (fr) 2021-03-17
EP3932945A1 (en) 2022-01-05
JP2019504822A (ja) 2019-02-21
DOP2018000128A (es) 2018-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7093380B2 (ja) Ｉｌ－１７ａ、ｉｌ－１７ｆおよび／またはｉｌ１７－ａ／ｆに対するアミノ酸配列および前記アミノ酸配列を含むポリペプチド
US11919966B2 (en) Methods for inhibiting tumor growth or treating cancer by administering an immunoglobulin single variable domain that binds glucocorticoid-induced TNFR family-related receptor (GITR)
JP7256011B2 (ja) Ｃｄ４０ｌを阻害するポリペプチド
US20200079850A1 (en) Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
JP6159684B2 (ja) Ｉｌ−６ｒ関連疾患及び障害の治療のためのｉｌ−６ｒに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
US20220098312A1 (en) Anti-neuropilin antigen-binding proteins and methods of use thereof
JP6822848B2 (ja) Ｋｖ１．３結合免疫グロブリン
KR102574071B1 (ko) 항-gitr 항원-결합 단백질 및 그의 사용 방법
US10618964B2 (en) Nanobody against IL-6R
JP2023123448A (ja) Ａｄａｍｔｓ結合免疫グロブリン
US20210188986A1 (en) Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting tnfa and ox40l
US20240052055A1 (en) Gpc3 antibody and application thereof
US20200190192A1 (en) Pd-1/tim-3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191127

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20191127

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201216

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210315

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20210830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211227

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20211227

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20211227

C11 Written invitation by the commissioner to file amendments

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11

Effective date: 20220121

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20220221

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20220222

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20220422

C211 Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211

Effective date: 20220426

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20230105

C23 Notice of termination of proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23

Effective date: 20230210

C03 Trial/appeal decision taken

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03

Effective date: 20230303

C30A Notification sent

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012

Effective date: 20230303

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230330

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7256011

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150