ES2263984T3

ES2263984T3 - Ligandos doble-especificos con una vida media serica aumentada.

Info

Publication number: ES2263984T3
Application number: ES03738294T
Authority: ES
Inventors: Greg Winter; Ian Tomlinson; Olga Ignatovich; Lucy Holt; Elena De Angelis; Phillip Jones
Original assignee: Domantis Ltd
Current assignee: Domantis Ltd
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2023-06-30
Also published as: EP2135879A2; EP1600459A2; US20060106203A1; US20070093651A1; EP1517921B1; EP1600459A3; WO2004003019A2; EP1517921A2; AU2003244817B2; AU2003244817A1; PT1517921E; DK1517921T3; US20100234570A1; EP2366718A3; GB0501752D0; JP2011125342A; HK1070081A1; CY1105191T1; EP2135879A3; SI1517921T1

Abstract

Ligando doble-específico que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina con cadena pesada que presenta una especificidad de fijación a un primer epítopo o antígeno y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina con cadena ligera que presenta una actividad de fijación a un segundo epítopo o antígeno, en el que la fijación a uno o ambos de dichos antígenos o epítopos actúa para prolongar la vida media del ligando in vivo y en el que dichos primer y segundo dominios no son un dominio variable con cadena pesada y un dominio variable con cadena ligera que comparte la misma especificidad, con la condición de que dicho ligando doble-específico no esté constituido por un dominio VH de anti-HSA y por un dominio Vk de anti-beta galactosidasa.

Description

Ligandos doble-específicos con una vida media sérica aumentada.

La presente invención se refiere a ligandos doble-específicos que comprenden un primer dominio variable simple de inmunoglobulina que se une a un primer antígeno o epítopo, y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina que se une a un segundo antígeno o epítopo, en los que la unión a por lo menos uno de los primer y segundo antígenos o epítopos actúa para prolongar la vida media del ligando in vivo. Se describen ligandos con conformación abierta y cerrada que comprenden más de una especificidad de unión.

Introducción

El dominio de fijación al antígeno de un anticuerpo comprende dos regiones independientes: un dominio variable con cadena pesada (V_{H}) y un dominio variable con cadena ligera (V_{L}) que pueden ser V_{\kappa} o V_{\lambda}. El propio sitio de fijación al antígeno está formado por seis bucles polipeptídicos: tres del dominio V_{H} (H1, H2 y H3) y tres del dominio V_{L} (L1, L2 y L3). Un repertorio primario variado de genes V que codifica los dominios V_{H} y V_{L} es producido por la reconfiguración de segmentos del gen. El gen V_{H} es producido por la recombinación de tres segmentos del gen, V_{H}, D y J_{H}. En los seres humanos, existen aproximadamente 51 segmentos V_{H} operativos (Cook y Tomlison, (1995) Immunol. Today, 16: 237), 25 segmentos B operativos B (Corbett et al., (1997) J. Mol. Biol., 268: 69) y 6 segmentos J_{H} operativos (Ravetch et al., (1981) Cell 27: 583), dependiendo del haplotipo. El segmento V_{H} codifica la región de la cadena polipeptídica que forma los primer y segundo bucles de fijación al antígeno del dominio V_{H} (H1 y H2), mientras que los segmentos V_{H}, D y J_{H} se combinan para formar el tercer bucle de fijación al antígeno del dominio V_{H} (H3). El gen V_{L} es producido por la recombinación de sólo dos segmentos del gen, V_{L} y J_{L}. En los seres humanos, existen aproximadamente 40 segmentos V_{\kappa} operativos (Schäble y Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31 segmentos V_{\lambda} operativos (Williams et al., (1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al., (1997) Genome Res. 7: 250), 5 segmentos J_{\kappa} operativos (Hieter et al., (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516) y 4 segmentos J_{\lambda} operativos (Vasicek y Leder (1990) J. Exp. Med., 172: 609), dependiendo del haplotipo. El segmento V_{L} codifica la región de la cadena polipeptídica que forma los primer y segundo bucles de fijación al antígeno del dominio V_{L} (L1 y L2), mientras que los segmentos V_{L} y J_{L} se combinan para formar el tercer bucle de fijación al antígeno del dominio V_{L} (L3). Los anticuerpos seleccionados de este repertorio primario se considera que son suficientemente variados para unirse casi a todos los antígenos por lo menos con afinidad moderada. Los anticuerpos con gran afinidad son producidos por "maduración de afinidad" de los genes reordenados, en los que se generan mutaciones puntuales y son seleccionados por el sistema inmunitario basándose en el aumento de la fijación.

El análisis de las estructuras y las secuencias de anticuerpos ha demostrado que cinco de los seis bucles de fijación al antígeno (H1, H2, L1, L2 y L3) poseen un número limitado de conformaciones de la cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). Las conformaciones de la cadena principal se determinan mediante (i) la longitud del bucle de fijación al antígeno, (ii) restos de partículas, o tipos de resto, en determina posición clave en el bucle de fijación al antígeno y en el armazón del anticuerpo. El análisis de las longitudes del bucle y de los restos clave ha permitido a los solicitantes la predicción de las conformaciones de la cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 codificadas por la mayoría de secuencias del anticuerpo humano (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol, 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más variada desde el punto de vista de la secuencia, longitud y estructura (debido a la utilización de segmentos D), forma asimismo un número limitado de conformaciones de la cadena principal para longitudes de bucle cortas que dependen de la longitud y la presencia de determinados restos, o tipos de resto, en posiciones clave en el bucle y en el armazón del anticuerpo (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399:1.

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden pares complementarios de regiones V_{H} y V_{L} son conocidos en la materia. Los anticuerpos biespecíficos deben comprender dos pares de V_{H} y V_{L}, fijándose cada par V_{H}/V_{L} a un único antígeno o epítopo. Los métodos descritos implican hibridomas híbridos (Milstein y Cuello A.C., Nature 305:537-40), minibodies (Hu et al., (1996) Cancer Res. 56:3055-3061); diacuerpos (Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; WO 94/13804), anticuerpos recombinantes quelantes (CRAbs; (Neri et al., (1995) J. Mol. Biol. 246, 367-373), biscFv (p. ej. Atwell et al., (1996) Mol. Immunol. 33, 1301-1312), anticuerpos estabilizados por "protuberancias en orificios" (Carter et al., (1997) Protein Sci. 6, 781-788). En cada caso cada especie de anticuerpo comprende dos sitios de fijación al antígeno, modelado cada uno por un par complementario de dominios V_{H} y V_{L}. Cada anticuerpo por esta razón es capaz de unirse a dos antígenos o epítopos diferentes al mismo tiempo, con la fijación a cada antígeno o epítopo mediada por un dominio V_{H} y su V_{L} complementario. Cada una de estas técnicas adolece de sus inconvenientes particulares; por ejemplo en el caso de hibridomas híbridos, los pares V_{H}/V_{L} inactivos pueden reducir en gran medida la fracción de IgG biespecífica. Además, los métodos más biespecíficos se basan en la asociación de los pares V_{H}/V_{L} diferentes o en la asociación de las cadenas V_{H} y V_{L} para recrear los dos sitios de fijación V_{H}/V_{L} diferentes. Por lo tanto es imposible controlar la relación de sitios de fijación a cada antígeno o epítopo en la molécula montada y por lo tanto muchas de las moléculas montadas se unirán a un antígeno o epítopo pero no al otro. En algunos casos ha sido posible modificar genéticamente las cadenas pesada o ligera en las interfases de la subunidad (Carter et al., (1997) a fin de aumentar el número de moléculas que tienen sitios de fijación a ambos antígenos o epítopos pero esto nunca produce todas las moléculas que presentan fijación a ambos antígenos o
epítopos.

Existen algunas pruebas de que dos especificidades diferentes de fijación al antígeno pueden incorporarse en el mismo sitio de fijación, pero éstas representan generalmente dos o más especificidades que corresponden a antígenos o epítopos o a anticuerpos relacionados estructuralmente que son ampliamente interreactivos. Por ejemplo, se han descrito frecuentemente anticuerpos interreactivos, donde los dos antígenos están relacionados en la secuencia y en la estructura, tal como la lisozima de la clara de huevo de gallina y la lisozima del pavo (McCafferty et al., WO 92/01047) o para el hapteno libre y para el conjugado del hapteno con vehículo (Griffiths AD et al. EMBO J. 1994 13:14 3245-60). En un ejemplo adicional, el documento WO 02/02773 (Abbott Laboratories) describe moléculas de anticuerpo con "doble especificidad". Las moléculas de anticuerpo citadas por ser anticuerpos producidos o seleccionados contra antígenos múltiples, de modo que su especificidad abarca más de un solo antígeno. Cada par V_{H}/V_{L} complementario en los anticuerpos del documento WO 02/02773 especifica una sola especificidad de fijación para dos o más antígenos estructuralmente relacionados; los dominios V_{H} y V_{L} en dichos pares complementarios no poseen cada uno una especificidad independiente. Los anticuerpos por lo tanto presentan una especificidad amplia única que comprende dos antígenos, que están relacionados estructuralmente. Además se han descrito anticuerpos naturales que son polirreactivos (Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531), que reaccionan con por lo menos dos (normalmente más) antígenos o epítopos diferentes que no están relacionados estructuralmente. Se ha demostrado también que las selecciones de repertorios de péptidos al azar que utilizan tecnología de presentación del fago en un anticuerpo monoclonal identificarán una gama de secuencias peptídicas que se fija al sitio de fijación al antígeno. Algunas de las secuencias están muy relacionadas, fijando una secuencia de consenso, mientras que otras son muy diferentes y han sido denominadas mimotopos (Lane y Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271). Por lo tanto es evidente que un anticuerpo con cuatro cadenas naturales, que comprende los dominios V_{H} y V_{L} asociados y complementarios, presenta el potencial para unir muchos antígenos diferentes de una gran cantidad de antígenos conocidos. Es menos evidente cómo crear un sitio de fijación a dos antígenos dados en el mismo anticuerpo, particularmente los que no están necesariamente relacionados estructuralmente.

Se ha sugerido que los métodos de modificación genética de proteínas pueden tener relación con esto. Por ejemplo, se ha propuesto asimismo que podría crearse un anticuerpo catalítico con una actividad de fijación a un ión metálico mediante una variable de dominio, y a un hapteno (sustrato) mediante contactos con el ión metálico y un dominio variable complementario (Barbas et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6385-6389). Sin embargo en este caso, se propone que la fijación y la catálisis del sustrato (primer antígeno) requiera la fijación del ión metálico (segundo antígeno). Por lo tanto la fijación del par V_{H}/V_{L} se refiere a un antígeno único pero multicomponente.

Se han descrito métodos para la creación de anticuerpos biespecíficos a partir de los dominios individuales con cadena pesada de anticuerpo camélido en los que se crean contactos de fijación para un antígeno en un dominio variable, y para un segundo antígeno en un segundo dominio variable. Sin embargo los dominios variables no fueron complementarios. Por lo tanto se selecciona un primer dominio variable con cadena pesada contra un primer antígeno, y un segundo dominio variable con cadena pesada contra un segundo antígeno, y a continuación ambos dominios se unen en la misma cadena para proporcionar un fragmento de anticuerpo biespecífico (Conrath et al., J. Biol. Chem. 276, 7346-7350). Sin embargo los dominios simples con cadena pesada bifásica no son frecuentes porque proceden de anticuerpos naturales camélidos que no tienen cadenas ligeras, y de hecho los dominios simples con cadena pesada son incapaces de asociarse con las cadenas ligeras bifásicas para formar pares V_{H} y V_{L} complementarios.

Asimismo se han descrito dominios individuales variables con cadena pesada procedentes de anticuerpos naturales que están normalmente asociados a cadenas ligeras (de anticuerpos monoclonales o de repertorios de dominios; véase el documento EP-A-0368684). Se ha demostrado que estos dominios variables con cadena pesada interactúan específicamente con uno o más antígenos relacionados pero no se han combinado con otros dominios variables con cadena pesada o ligera para crear un ligando con una especificidad para dos o más antígenos diferentes. Además, se ha demostrado que estos dominios individuales presentan una vida media muy corta in vivo. Por consiguiente dichos dominios son de valor terapéutico limitado.

Se ha sugerido para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante fijación de los dominios variables con cadena pesada de diferente especificidad (como se describió anteriormente). El inconveniente de este método es que los dominios variables aislados del anticuerpo pueden presentar una interfase hidrófoba que produce normalmente interacciones con la cadena ligera y está expuesto al disolvente y puede ser "pegajoso" permitiendo que el dominio individual se una a superficies hidrófobas. Además, en ausencia de una cadena ligera asociada, la combinación de dos o más dominios variables con cadena pesada diferentes y su asociación, posiblemente por sus interfases hidrófobas, puede impedirles que se unan a uno en ninguno de los ligandos que son capaces de unirse en aislamiento. Además, en este caso los dominios variables con cadena pesada no estarían asociados a los dominios variables con cadena ligera complementarios y por lo tanto puede ser menos estable y fácilmente despleglable (Worn y Pluckthun, 1998 Biochemistry 37, 13120-7). El documento WO 03/002609 que fue publicado el 9 de enero de 2003 describe ligandos multiespecíficos.

Sumario de la invención

Los inventores han descrito, en su solicitud de patente internacional WO 03/002609 en trámite ligandos de inmunoglobina específicos dobles que comprenden dominios variables independientes de inmunoglobulina que presentan cada uno especificidades diferentes. Los dominios pueden actuar en competencia entre sí o independientemente unirse a antígenos o epítopos en moléculas diana.

En una primera configuración, la presente invención proporciona una mejora adicional en los ligandos doble-específicos desarrollados por los presentes inventores, en la que una especificidad del ligando se refiere a una proteína o polipéptido presente in vivo en un organismo que puede actuar para prolongar la vida media del ligando uniéndose a éste.

Por consiguiente, en un primer aspecto, se proporciona un ligando doble-específico que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina que presenta una especificidad de fijación a un primer antígeno o epítopo y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina complementario que presenta una actividad de fijación a un segundo antígeno o epítopo, en el que uno o ambos de dichos antígenos o epítopos actúa para prolongar la vida media del ligando in vivo y en el que dichos primer y segundo dominios no son un dominio variable con cadena pesada y un dominio variable con cadena ligera que comparte la misma especificidad, con la condición de que dicho ligando doble-específico no esté constituido por un dominio V_{H} de anti-HSA y un dominio V_{\kappa} de anti-\beta galactosidasa. Preferentemente, ni el primer ni el segundo dominio variable se unen a la albúmina de suero humano (HSA).

Los antígenos o epítopos que prolongan la vida media de un ligando descritos en la presente memoria están presentes con ventaja en las proteínas o polipéptidos localizados en un organismo in vivo. Los ejemplos incluyen proteínas de la matriz extracelular, proteínas de la sangre y las proteínas presentes en varios tejidos en el organismo. Las proteínas actúan reduciendo el ritmo de eliminación del ligando en la sangre, por ejemplo actuando como agentes de esponjamiento o anclando el ligando a un punto deseado de actuación. Ejemplos de antígenos/epítopos que prolongan la vida media in vivo se proporcionan a continuación en el Anexo 1.

La prolongación de la vida media es útil en aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y más especialmente fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño. Dichos fragmentos (Fvs, Fvs unido a disulfuro, Fabs, scFvs, dAbs) adolecen de eliminación rápida en el cuerpo; por lo tanto, aunque son capaces de alcanzar la mayoría de las partes del cuerpo rápidamente y son rápidos para producir y facilitar su manipulación, sus aplicaciones in vivo han estado limitadas por su persistencia sólo breve in vivo. La invención resuelve este problema proporcionando una vida media prolongada de los ligandos in vivo y por consiguiente tiempos de persistencia mayores en el cuerpo de la actividad operativa del ligando.

Los métodos para el análisis farmacocinético y la determinación de la vida media del ligando son conocidos por los expertos en la materia. Los detalles pueden encontrarse en Kenneth, A. et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Se hace referencia también a "Pharmacokinetics", M. Gibaldi y D. Perron, publicada por Marcel Dekker, 2ª rev. ex edición (1982) que describe los parámetros farmacocinéticos tales como las vidas medias t alfa y t beta y el área bajo la curva (AUC).

Las vidas medias (t1/2 alfa y t1/2 beta) y AUC pueden determinarse a partir de una curva de concentración del suero del ligando frente al tiempo. El paquete de análisis WinNonlin (disponible en Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA) puede utilizarse, por ejemplo, para modelar la curva. En una primera fase (fase alfa) el ligando está experimentando principalmente la distribución en el paciente, con alguna eliminación. Una segunda fase (fase beta) es la fase terminal cuando el ligando se ha distribuido y la concentración de suero está disminuyendo a medida que el ligando se elimina en el paciente. La vida media t alfa es la vida media de la primera fase y la vida media t beta es la vida media de la segunda fase. Por lo tanto, la presente invención proporciona, con ventaja, un ligando o una composición que comprende un ligando según la invención con una vida media t\alpha comprendida en el intervalo de 15 minutos o más. En una forma de realización, el extremo inferior del intervalo es de 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o alternativamente, un ligando o composición según la invención tendrá una vida media t \alpha comprendida en el intervalo de hasta 12 horas inclusive. En una forma de realización, el extremo superior del intervalo es de 11, 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 horas. Un ejemplo de intervalo adecuado es de 1 a 6 horas, 2 a 5 horas o 3 a 4 horas.

La presente invención proporciona, con ventaja, un ligando o una composición que comprende un ligando según la invención con una vida media t\beta comprendida en el intervalo de 2,5 horas o más. En una forma de realización, el extremo inferior del intervalo es de 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o alternativamente, un ligando o composición según la invención tiene una vida media t\beta comprendida en el intervalo de hasta 21 días inclusive. En una forma de realización, el extremo superior del intervalo es de 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días. Ventajosamente, un ligando o composición según la invención tendrá una vida media t\beta comprendida en el intervalo entre 12 a 60 horas En una forma de realización adicional estará comprendido en el intervalo entre 12 y 48 horas. En una forma de realización adicional estará comprendido en el intervalo entre 12 y 26 horas.

Además, o alternativamente a los criterios anteriores, la presente invención proporciona un ligando o una composición que comprende un ligando según la invención con un valor de AUC (área bajo la curva) comprendido en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una forma de realización el extremo inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 mg.min/ml. Además, o alternativamente, un ligando o composición según la invención presenta un AUC comprendido en el intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una forma de realización, el extremo superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 mg.min/ml. Un ligando según la invención presentará ventajosamente una AUC comprendido en el intervalo seleccionado de entre el grupo constituido por los siguientes: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml y 15 a 50 mg.min/ml.

En una primera forma de realización, el ligando doble-específico comprende dos dominios variables complementarios, es decir, dos dominios variables que, en su medio natural, son capaces de operar conjuntamente como un par o grupo análogo aun si en el contexto de la presente invención se unen por separado a sus epítopos análogos. Por ejemplo, los dominios variables complementarios pueden ser dominios con cadena pesada de inmunoglobulina y con cadena ligera (V_{H} y V_{L}). Los dominios V_{H} y V_{L} son proporcionados ventajosamente por los fragmentos de anticuerpos scFv o Fab. Los dominios variables pueden unirse para formar ligandos polivalentes, por ejemplo: por provisión de una región bisagra del terminal C de cada dominio V y el enlace disulfuro entre las cisteínas en las regiones bisagra; o el suministro de los dAb cada uno con una cisteína en el terminal C del dominio, estando las cisteínas unidas por disulfuro; o la producción de V-CH y V-CL para producir un formado Fab; o la utilización de enlazadores peptídicos (por ejemplo los enlazadores Gly_{4}Ser expuestos más adelante) para producir dímeros, trímeros y polímeros adicionales.

Los inventores han descubierto que la utilización de dominios variables complementarios permite que las dos superficies del dominio se empaqueten y estén secuestradas en el disolvente. Además los dominios complementarios son capaces de estabilizarse entre sí. Además, permite la creación de anticuerpos específicos dobles de IgG sin los inconvenientes de los hibridomas híbridos utilizados en la técnica anterior, o la necesidad de modificar genéticamente cadenas pesadas o ligeras en las interfases de la subunidad. Los ligandos doble-específicos del primer aspecto de la presente invención presentan por lo menos un par V_{H}/V_{L}. Una IgG biespecífica según la presente invención comprenderá por consiguiente dos de dichos pares, un par en cada brazo de la molécula en forma de Y. A diferencia de los anticuerpos o diacuerpos biespecíficos convencionales, por consiguiente, en los que la relación con cadenas utilizada es determinante del éxito de la preparación de las mismas y conduce a dificultades prácticas, los ligandos doble-específicos de la invención están exentos de los resultados del equilibrio de la cadena. El desequilibrio de la cadena en los anticuerpos biespecíficos convencionales procede de la asociación de dos cadenas V_{L} diferentes con dos cadenas V_{H} diferentes, en la que la cadena 1 V_{L} junto con la cadena 1 V_{H} es capaz de unirse al antígeno o epítopo 1 y la cadena 2 V_{L} junto con la cadena 2 V_{H} es capaz de unirse al antígeno o epítopo 2 y los dos pares correctos están de alguna manera unidos entre sí. Por lo tanto, solamente cuando la cadena 1 V_{L} esté emparejada con la cadena 1 V_{H} y la cadena 2 V_{L} esté emparejada con la cadena 2 V_{H} en una sola molécula se crea biespecificidad. Dichas moléculas biespecíficas pueden crearse de dos formas diferentes. En primer lugar, pueden crearse por asociación de dos pares V_{H}/V_{L} existentes que se une cada uno a un antígeno o epítopo diferente (por ejemplo, en una IgG biespecífica). En este caso todos los emparejamientos V_{H}/V_{L} deben venir juntos en una relación 1:1 a fin de crear una población de moléculas todas las cuales son biespecíficas. Esto nunca tiene lugar (aun cuando el dominio CH complementario esté potenciado por la modificación genética "protuberancias en orificios" conduciendo a una mezcla de moléculas biespecíficas y moléculas que solamente son capaces de unirse a un antígeno o epítopo pero no al otro. La segunda forma de crear un anticuerpo biespecífico es mediante la asociación simultánea de dos cadenas V_{H} diferentes con dos cadenas V_{L} diferentes (por ejemplo en un diacuerpo biespecífico). En este caso, aunque tiende a ser una preferencia de la cadena 1 V_{L} para emparejarse con la cadena 1 V_{H} y de la cadena 2 V_{L} para emparejarse con la cadena 2 V_{H} (que puede estar potenciada por modificación genética "protuberancias en orificios" de los dominios V_{L} y V_{H}), este emparejamiento no se consigue nunca en todas las moléculas, lo que conduce a una formulación mezclada por lo que tienen lugar emparejamientos incorrectos que son incapaces de unirse al antígeno o epítopo.

Los anticuerpos biespecíficos construidos de acuerdo con el método del ligando doble-específico según el primer aspecto de la presente invención resuelven todos estos problemas porque la unión al antígeno o epítopo 1 radica en el dominio V_{H} o V_{L} y la unión al antígeno o epítopo 2 radica en el dominio V_{L} o V_{H} complementario, respectivamente. Dado que los dominios V_{H} y V_{L} se emparejan en una base 1:1 todos los pares V_{H}/V_{L} serán biespecíficos y por lo tanto todos los formatos construidos utilizando estos pares V_{H}/V_{L} (Fv, scFvs, Fabs, minicuerpos, IgG, etc.) presentarán el 100% de actividad biespecífica.

En cuanto a la presente invención, se entiende que el primer y segundo "epítopos" son epítopos que no son iguales y no están unidos por un ligando monoespecífico simple. En la primera configuración de la invención, están ventajosamente en diferentes antígenos, uno de los cuales actúa para prolongar la vida media del ligando in vivo. Asimismo, el primer y segundo antígenos no son ventajosamente los mismos.

Los ligandos doble-específicos de la invención no incluyen los ligandos descritos en el documento WO 02/02773. Por lo tanto, los ligandos de la presente invención no comprenden los pares V_{H}/V_{L} complementarios que unen alguno o más antígenos o epítopos de forma operativa conjunta. En lugar de esto, los ligandos según el primer aspecto de la invención comprenden un par V_{H}/V_{L} complementario, en el que los dominios V presentan especificidades
diferentes.

Además, los ligandos según el primer aspecto de la invención comprenden los pares complementarios V_{H}/V_{L} que presentan especificidades diferentes para los epítopos o antígenos no estructuralmente relacionados. Los epítopos o antígenos relacionados estructuralmente son epítopos o antígenos que poseen similitud estructural suficiente para estar unidos mediante un par complementario V_{H}/V_{L} convencional que actúa de manera operativa conjunta para unirse a un antígeno o epítopo; en el caso de los epítopos relacionados estructuralmente, los epítopos son lo suficientemente similares en estructura para que "se fijen" en la misma bolsa de fijación formada en el sitio de fijación al antígeno del dímero V_{H}/V_{L}.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un ligando que comprende un primer dominio variable de inmunoglobulina que presenta una primera especificidad de fijación al antígeno o epítopo y un segundo dominio variable de inmunoglobulina que presenta una segunda especificidad de fijación del antígeno o epítopo en el que uno o ambos de dichos primer y segundo dominios variables se unen a un antígeno que prolonga la vida media del ligando in vivo, y

(i): el primer y el segundo dominios variables de inmunoglobulina son dominios variables con cadena pesada; o

(ii): el primer y el segundo dominios variables de inmunoglobulina son dominios variables con cadena ligera;

con la condición de que cuando el primer y el segundo dominios variables de inmunoglobulina sean dominios VHH de camélidos, el dominio VHH que es específico para un antígeno que prolonga la vida media del ligando in vivo no se una a la lisozima de la clara de huevo de gallina (HEL), a la alfa-amilasa pancreática porcina; a NmC-A, a hcg, al colorante azo RR6 unido a BSA o a las células HG982 de S. mutans.

En una forma de realización, la fijación a un dominio variable modula la fijación del ligando al segundo domino variable.

En esta forma de realización, los dominios variables pueden ser, por ejemplo, pares de dominios V_{H} o pares de dominios V_{L}. La fijación del antígeno al primer punto puede modular, tal como aumentar o inhibir, la fijación de un antígeno al segundo punto. Por ejemplo, la fijación al primer punto inhibe por lo menos parcialmente la fijación de un antígeno a un segundo punto. En dicha forma de realización, el ligando puede mantenerse, por ejemplo, en el cuerpo de un organismo de un sujeto in vivo mediante la fijación a una proteína que prolonga la vida media del ligando hasta un momento tal que se una al segundo antígeno diana y se disocie de la proteína que prolonga la vida media.

La modulación de la fijación en el contexto anterior se consigue como consecuencia de la proximidad estructural del antígeno que une puntos próximos uno del otro. Dicha proximidad estructural puede conseguirse por la naturaleza de los componentes estructurales que se unen a dos o más sitios de fijación del antígeno, p. ej. mediante el suministro de un ligando con una estructura relativamente rígida que mantiene los sitios de fijación del antígeno en estrecha proximidad. De manera ventajosa, los dos o más sitios de fijación del antígeno están en proximidad físicamente estrecha entre sí de manera que un punto modula la fijación del antígeno en otro punto mediante un proceso que implica impedimento estérico y/o cambios de conformación en la molécula de inmunoglobulina.

El primer y el segundo dominios de fijación del antígeno pueden estar asociados por enlace covalente o no covalente. En el caso en que los dominios estén asociados por enlace covalente, entonces la asociación puede estar mediada por ejemplo por enlaces disulfuro o por un enlazador polipéptido tal como (Gly_{4}Ser)_{n}, en el que n = de 1 a 8, p. ej., 2, 3, 4, 5 ó 7.

Los ligandos según la invención pueden combinarse en estructuras poliligando distintas de la inmunoglobulina para formar complejos polivalentes, que fijan moléculas diana con el mismo antígeno, proporcionando de este modo avidez superior, mientras que por lo menos un dominio variable se fija a un antígeno para prolongar la vida media del polímero. Por ejemplo, receptores bacterianos naturales tal como SpA se han utilizado como armazones para el trasplante de los CDR para generar ligandos que se fijan específicamente a uno o más epítopos. Detalles de este procedimiento se describen en el documento US nº 5.831.012. Otros armazones adecuados comprenden las basadas en fibronectina y cuerpos afines. Los detalles de los procedimientos adecuados se describen en el documento WO 98/58965. Otros armazones adecuados incluyen lipocaína y CTLA4, como se describe en van den Beuken et al., J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601, y armazones tales como los descritos en el documento WO 0069907 (Medical Research Council), que están basadas por ejemplo en la estructura anular de GroEL bacteriano u otros polipéptidos de chaperona.

Los soportes de proteínas pueden combinarse; por ejemplo, las CDR pueden injertarse en un soporte CTLA4 y utilizarse junto con los dominios V_{H} o V_{L} de inmunoglobulina para formar un ligando. Asimismo, pueden combinarse fibronectina, lipocallina y otros soportes.

En el caso en que los dominios variables se seleccionen de los repertorios del gen V utilizando por ejemplo la tecnología de presentación del fago como se describe en la presente memoria, entonces estos dominios variables pueden comprender una región con armazón universal, de modo que puedan ser reconocidos por un ligando genérico específico como se define en la presente memoria. La utilización de armazones universales, ligandos genéricos y similares está descrita en el documento WO 99/20749. En la presente invención, la referencia a la presentación del fago incluye la utilización tanto de fagos como de fagómidos.

Cuando se utilicen repertorios del gen V la variación en la secuencia de polipéptidos está situada preferentemente en los bucles estructurales de los dominios variables. Las secuencias de polipéptidos de los dominios variables pueden alterarse desordenado el ADN o por mutación a fin de aumentar la interacción de cada dominio variable con su par complementario.

En una forma de realización preferida de la invención, el "ligando doble-específico" es un fragmento Fv de una sola cadena. En una forma de realización alternativa de la invención, el "ligando doble-específico" está constituido por una región Fab de un anticuerpo. La expresión "región Fab" incluye una región similar a Fab en la que se utilizan dos dominios VH o dos VL.

Las regiones variables pueden proceder de anticuerpos dirigidos contra antígenos o epítopos diana. Alternativamente pueden proceder de un repertorio de dominios con un solo anticuerpo tales como los expresados en la superficie de bacteriófagos filamentosos. La selección puede realizarse como se describe más adelante.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para producir un ligando que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina con una primera especificidad de fijación y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina con una segunda especificidad de fijación (diferente), siendo una o ambas especificidades de fijación específicas para un antígeno que prolonga la vida media del ligando in vivo, comprendiendo el método las etapas siguientes:

(a): seleccionar un primer dominio variable por su capacidad para unirse a un primer epítopo,

(b): seleccionar una segunda región variable por su capacidad para unirse a un segundo epítopo,

(c): combinar los dominios variables; y

(d): seleccionar el ligando por su capacidad para unirse a dicho primer epítopo y a dicho segundo epítopo; en el que dichos dominios variables son un dominio variable con cadena pesada y cadena ligera; el dominio variable con cadena pesada no es un dominio V_{H} específico para HSA.

El ligando puede unirse al primer y segundo epítopos simultáneamente o, cuando existe competencia entre los dominios de fijación para la fijación del epítopo, la fijación de un dominio puede excluir la fijación de otro dominio a su epítopo análogo. En una forma de realización, por consiguiente, la etapa (d) requiere simultáneamente tanto al primer como al segundo (y posiblemente más) epítopos; en otra forma de realización, la fijación al primer y segundo epítopos no es simultánea.

Los epítopos están preferentemente en antígenos separados.

Los ligandos de forma ventajosa comprenden combinaciones V_{H}/V_{L}, o combinaciones V_{H}/V_{H} o V_{L}/V_{L} de dominios variables de inmunoglobulina, como se describió anteriormente. Los ligandos pueden comprender además dominios V_{HH} camélidos, con la condición de que el dominio V_{HH} que es específico para un antígeno que prolonga la vida media del ligando in vivo no se una a la lisozima de la clara de huevo de gallina (HEL), a la alfa-amilasa pancreática porcina o a NmC-A; a hcg, al colorante azo RR6 unido a BSA o a células HG982 de S. mutans, tal como se describe en Conrath et al., (2001) JBC 276: 7346-7350 y el documento WO 99/23221, ninguno de los cuales describe la utilización de una especificidad para un antígeno que prolonga la vida media al prolongar la vida media del ligando
in vivo.

En una forma de realización, se selecciona dicho primer dominio variable para fijarse a dicho primer epítopo en ausencia de un dominio variable complementario. En una forma de realización adicional, se selecciona dicho primer dominio variable para fijar dicho primer epítopo/antígeno en presencia de un tercer dominio variable en el que dicho tercer dominio variable es diferente de dicho segundo dominio variable y es complementario con el primer dominio. Asimismo, el segundo dominio puede seleccionarse en ausencia o presencia de un dominio variable
complementario.

Los antígenos o epítopos dirigidos por los ligandos de la invención, además de la proteína que prolonga la vida media, puede ser cualquier antígeno o epítopo pero de forma ventajosa es un antígeno o epítopo que está dirigido con utilidad terapéutica. La invención proporciona ligandos, incluyendo la conformación abierta, la conformación cerrada y ligandos aislados del monómero dAb, específicos para cualquiera de dichas dianas, particularmente aquellas dianas más identificadas en la presente memoria. Dichas dianas pueden ser, o formar parte de, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, que pueden ser naturales o sintéticos. A este respecto, el ligando de la invención puede fijar el epítopo o antígeno y actúa como antagonista o agonista (p. ej., el agonista del receptor EPO). Un experto en la materia apreciará que la selección sea extensa y variada. Pueden ser por ejemplo proteínas, citocinas, receptores de citocina, cofactores enzimáticos para enzimas o proteínas de fijación del ADN humanas o animales. Las citocinas y factores de crecimiento adecuados incluyen pero no se limitan a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor 10 de crecimiento de fibroblastos, ligando FLT3, fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-\beta1, insulina, IFN-\gamma, IGF-I, IGF-II, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), inhibina \alpha, inhibina \beta, IP-10, factor 2 de crecimiento de queratinocitos (KGF-2), KGF, leptina, LIF, linfotactina, sustancia inhibidora mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, factor-1 inhibidor precursor mieloide (MPIF-1), NAP-2, neurturina, factor de crecimiento de nervios, \beta-NGF, NT-3, NT-4, oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1\alpha, SDF1\beta, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-\alpha, TGF-\beta, TGF-\beta2, TGF-\beta3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-\alpha, TNF-\beta, el receptor I de TNF, el receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, el receptor 1 de VEGF, el receptor 2 de VEGF, el receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-\beta, GRO-\gamma, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 y HER 4. Los receptores de citocina incluyen los receptores para las citocinas anteriores. Se apreciará que esta lista no sea de ningún modo exhaustiva.

En una forma de realización de la invención, los dominios variables proceden del anticuerpo respectivo dirigido contra el antígeno o epítopo. En una forma de realización preferida los dominios variables proceden de un repertorio de dominios de anticuerpo variables individuales.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una o más moléculas de ácido nucleico que codifican por lo menos un ligando doble-específico definido en la presente memoria. El ligando doble-específico puede estar codificado en una sola molécula de ácido nucleico; alternativamente, cada dominio puede estar codificado por una molécula de ácido nucleico independiente. Cuando el ligando está codificado por una sola molécula de ácido nucleico, los dominios pueden expresarse como un polipéptido de fusión, en forma de molécula scFv, o pueden expresarse por separado y sucesivamente ligados, por ejemplo utilizando agentes de enlace químico. Los ligandos expresados procedentes de ácidos nucleicos independientes estarán ligados por medios apropiados.

El ácido nucleico puede codificar además una secuencia señal para exportación de los polipéptidos procedentes de una célula huésped en la expresión y pueden estar fusionados con un componente de superficie de una partícula filamentosa de bacteriófago (u otro componente de un sistema de presentación de la selección) en el momento de la expresión.

En un aspecto adicional la presente invención proporciona un vector que comprende ácido nucleico que codifica un ligando doble-específico según la presente invención.

En un aspecto adicional todavía, la presente invención proporciona una célula huésped transfectada con un vector que codifica un ligando doble-específico según la presente invención.

La expresión de dicho vector puede configurarse para producir, por ejemplo en la superficie de una partícula de bacteriófago, dominios variables para la selección. Esto permite la selección de regiones variables desplegadas y de este modo la selección de "ligandos doble-específicos" utilizando el método de la presente invención.

Los ligandos doble-específicos según la presente invención comprenden preferentemente combinaciones de dominios con cadena pesada y ligera. Por ejemplo, el ligando doble-específico puede comprender un dominio V_{H} y un dominio V_{L}, que puede estar unido en forma de un scFv. Además, los ligandos pueden comprender uno o más dominios C_{H} o C_{L}. Por ejemplo, los ligandos pueden comprender un dominio C_{H}1, C_{H}2 o C_{H}3 y/o un dominio C_{L} o dominios C\mu1, C\mu2, C\mu3, C\mu4 o cualquier combinación de los mismos. Puede incluirse también un dominio con región de bisagra. Dicha combinación de dominios puede, por ejemplo, simular anticuerpos naturales, tal como IgG o IgM, o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')_{2}. Se contemplan otras estructuras, tal como un solo brazo de una molécula de IgG que comprende los dominios V_{H}, V_{L}, C_{H}1 y C_{L}.

En una forma de realización preferida de la invención, las regiones variables se seleccionan de entre los repertorios del gen V con un solo dominio. Generalmente el repertorio de dominios de anticuerpo simples se despliega sobre la superficie del bacteriófago filamentoso. En una forma de realización preferida cada dominio un solo anticuerpo se selecciona mediante la fijación de un repertorio de fago al antígeno.

En una forma de realización preferida de la invención cada dominio variable simple puede seleccionarse para fijarse a su antígeno o epítopo diana en ausencia de una región variable complementaria. En una forma de realización alternativa, los dominios variables simples pueden seleccionarse para fijarse a su antígeno o epítopo diana en presencia de una región variable complementaria. Por lo tanto el primer dominio variable simple puede seleccionarse en presencia de un tercer dominio variable complementario y el segundo dominio variable puede seleccionarse en presencia de un cuarto dominio variable complementario. El tercer o cuarto dominio variable complementario puede ser el dominio variable análogo que presente la misma especificidad que el dominio simple que se está probando, o un dominio complementario no homólogo, tal como un dominio variable "ficticio".

Preferentemente el ligando doble-específico de la invención comprende solamente dos dominios variables aunque varios de dichos ligandos pueden incorporarse a la misma proteína, por ejemplo dos de dichos ligandos pueden incorporarse a una IgG o una inmunoglobulina polimérica, tal como IgM. Alternativamente, en otra forma de realización se combinan diversos ligandos doble-específicos para formar un polímero. Por ejemplo, se combinan dos ligandos doble-específicos diferentes para crear una molécula tetraespecífica.

Un experto en la materia apreciará que las regiones variables ligeras y pesadas de un ligando doble-específico producidas según el método de la presente invención puedan estar en la misma cadena polipeptídica, o alternativamente, en diferentes cadenas polipeptídicas. En el caso en que las regiones variables estén en diferentes cadenas polipeptídicas, entonces pueden estar unidas por un enlazador, generalmente un enlazador flexible (tal como una cadena polipeptídica), un grupo de enlace químico o por cualquier otro método conocido en la materia.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende un ligando doble-específico, que puede obtenerse por un método de la presente invención, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, la presente invención proporciona un "ligando doble-específico" o una composición del mismo según la presente invención, para su utilización en terapia.

Los inventores han descubierto cuenta de que en determinadas condiciones estructurales, los dominios variables no complementarios (por ejemplo, dos dominios variables con cadena ligera o dos dominios variables con cadena pesada) pueden estar presentes en un ligando de modo que la fijación de un primer epítopo a un primer dominio variable inhibe la fijación de un segundo epítopo a un segundo dominio variable, aun cuando dichos dominios no complementarios no operen conjuntamente como par homólogo.

El ligando comprende de manera ventajosa dos o más pares de dominios variables; esto es, comprende por lo menos cuatro dominios variables. De manera ventajosa, los cuatro dominios variables comprenden armazones de origen humano.

En una forma de realización preferida, los armazones humanos son idénticos a los de las secuencias de la línea germinal humana.

Los presentes inventores consideran que dichos anticuerpos serán de particular utilización en los ensayos de fijación del ligando para terapia y otras utilizaciones.

Según la presente invención la expresión "ligando multiespecífico" se refiere a un ligando que posee más de una especificidad para su fijación al epítopo como se define en la presente memoria.

Tal como se define en la presente memoria la expresión "conformación cerrada" (ligando multiespecífico) significa que los dominios del ligando de fijación al epítopo están unidos o asociados entre sí, opcionalmente mediante un armazón proteico, de modo que la fijación al epítopo mediante un dominio de fijación al epítopo compite con la fijación al epítopo por otro dominio de fijación al epítopo. Esto es, los epítopos análogos pueden estar unidos por cada dominio de fijación al epítopo individualmente pero no simultáneamente. La conformación cerrada del ligando puede conseguirse utilizando los métodos descritos en la presente memoria.

"Conformación abierta" significa que los dominios de fijación al epítopo del ligando están unidos o asociados entre sí, opcionalmente mediante una estructura proteica, tal como la fijación al epítopo por un dominio de fijación al epítopo, de modo que la fijación al epítopo por un epítopo que se fija al dominio no compite con la fijación al epítopo por otro dominio de fijación al epítopo.

Tal como se denomina en la presente memoria, el término "compite" significa que la fijación de un primer epítopo a su dominio de fijación del epítopo análogo se inhibe cuando se fija un segundo epítopo a su dominio de fijación del epítopo análogo. Por ejemplo, la fijación puede inhibirse estéricamente, por ejemplo mediante bloqueo físico de un dominio de fijación o por alteración de la estructura o del medio de un dominio de fijación de modo que su actividad o afinidad es reducida por un epítopo.

En cuanto a la presente invención, se entiende que el primer y segundo "epítopos" son epítopos que no son iguales y no están unidos por un solo ligando monoespecífico. Pueden estar en diferentes antígenos o en el mismo antígeno, pero separados por una distancia suficiente que hace que no formen una sola entidad que podría estar unida mediante un solo par de fijación V_{H}/V_{L} monoespecífico de un anticuerpo convencional. Experimentalmente, si ambos dominios variables individuales en la forma de anticuerpo con una sola cadena (anticuerpos con dominio o dAb) compiten por separado mediante un ligando V_{H}/V_{L} monoespecífico frente a dos epítopos a continuación estos dos epítopos no están lo suficientemente apartados para que se consideren epítopos independientes según la presente
invención.

Los ligandos multiespecíficos de conformación cerrada de la invención no incluyen ligandos tales como los descritos en el documento WO 02/02773. Por lo tanto, los ligandos de la presente invención no comprenden pares V_{H}/V_{L} complementarios que se unan a uno o cualquiera o más antígenos o epítopos de forma cooperante. En su lugar, los ligandos según la invención comprenden preferentemente pares V_{H}-V_{H} o V_{L}-V_{L} no complementarios. Cada dominio V_{H} o V_{L} ventajosamente en cada par V_{H}-V_{H} o V_{L}-V_{L} presenta una especificidad diferente de fijación al epítopo y los sitios de fijación al epítopo están tan ordenados que la fijación de un epítopo a una región compite con la fijación de un epítopo en otro punto.

Según la presente invención, ventajosamente, cada dominio de fijación del epítopo comprende un dominio variable de inmunoglobulina. De forma más ventajosa, cada dominio variable de inmunoglobulina será un dominio variable con cadena ligera (V_{L}) o un dominio variable con cadena pesada V_{H}. En la segunda configuración de la presente invención, los dominios de inmunoglobulina cuando están presentes en un ligando según la presente invención son no complementarios, esto es no se asocian para formar un sitio de fijación del antígeno V_{H}/V_{L}. Por lo tanto, los ligandos multiespecíficos definidos en la segunda configuración de la invención comprenden dominios de inmunoglobulina del mismo subtipo, esto es dominios variable con cadena ligera (V_{L}) o dominios variables con cadena pesada (V_{H}). Además, cuando el ligando según la invención está en la conformación cerrada, los dominios de inmunoglobulina pueden ser del tipo V_{HH} camélidos.

En una forma de realización alternativa el o los ligando(s) según la invención no comprende(n) un dominio V_{HH} camélido. Más particularmente, el o los ligando(s) de la invención no comprende(n) uno o más restos de aminoácido que sean específicos para los dominios V_{HH} camélidos en comparación con los dominios V_{H} humanos.

De manera ventajosa, los dominios variables individuales proceden de los anticuerpos seleccionados para la actividad de fijación contra diferentes antígenos o epítopos. Por ejemplo, los dominios variables pueden aislarse por lo menos en parte por inmunización humana. Los métodos alternativos son conocidos en la técnica, incluyendo el aislamiento de bancos de anticuerpos humanos y la síntesis de genes de anticuerpos artificiales.

Los dominios variables de manera ventajosa se fijan a superantígenos, tales como la proteína A o la proteína L. La fijación a superantígenos es una propiedad de los dominios variables de anticuerpo plegado correctamente y permiten que dichos dominios sean aislados, por ejemplo de bancos de dominios recombinantes o mutantes.

Los dominios de fijación al epítopo según la presente invención comprenden un armazón proteico y puntos de interacción del epítopo (que están ventajosamente en la superficie del armazón proteico).

Los dominios de fijación al epítopo pueden basarse también en soportes o armazones proteicos distintos de los dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, se han utilizado receptores bacterianos naturales tales como SpA como soportes para el trasplante de los CDR destinados a generar ligandos que se unen específicamente a uno o más epítopos. Los detalles de este procedimiento se describen en el documento US nº 5.831.012. Otros soportes adecuados comprenden los basados en fibronectina y cuerpos afines. Los detalles de los procedimientos adecuados se describen en el documento WO 98/58965. Otros soportes adecuados incluyen lipocaína y CTLA4, como se describe en van den Beuken et al., J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601, y soportes tales como los descritos en el documento WO 0069907 (Medical Research Council), que están basadas por ejemplo en la estructura anular de GroEL bacteriano u otros polipéptidos de chaperona.

Los soportes de proteínas pueden combinarse; por ejemplo, los CDR pueden injertarse en un soporte CTLA4 y utilizarse junto con los dominios V_{H} o V_{L} de inmunoglobulina para formar un ligando polivalente. Asimismo, pueden combinarse fibronectina, lipocallina y otros soportes.

Un experto en la materia apreciará que los dominios que fijan el epítopo de un ligando multiespecífico con conformación cerrada producido según el método de la presente invención pueda estar en la misma cadena polipeptídica, o alternativamente, en diferentes cadenas polipeptídicas. En el caso en que las regiones variables estén en diferentes cadenas polipeptídicas, entonces pueden estar unidas por un enlazador, ventajosamente un enlazador flexible (tal como una cadena polipeptídica), un grupo de enlace químico o por cualquier otro método conocido en la materia.

El primer y el segundo dominios de fijación del epítopo pueden estar asociados por enlace covalente o no covalente. En el caso en que los dominios estén asociados por enlace covalente, entonces la asociación puede estar mediada por ejemplo por enlaces disulfuro.

Los epítopos pueden ser, o formar parte de, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, que pueden ser naturales o sintéticos. A este respecto, el ligando de la invención puede fijar el epítopo o antígeno y actúa como antagonista o agonista (p. ej., el agonista del receptor de EPO). El epítopo que fija dominios del ligando en una forma de realización presenta la misma especificidad del epítopo y puede por ejemplo fijar simultáneamente su epítopo cuando están presentes múltiples copias del epítopo en el mismo antígeno. En otra forma de realización se proporcionan estos epítopos en diferentes antígenos, de modo que el ligando pueda unir los epítopos y forman un puente con los antígenos. Un experto en la materia apreciará que la selección sea extensa y variada. Pueden ser por ejemplo proteínas, citocinas, receptores de citocina, cofactores enzimáticos para enzimas o proteínas de fijación del ADN humanas o animales. Las citocinas y factores de crecimiento adecuados incluyen pero no se limitan a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor 10 de crecimiento de fibroblastos, ligando FLT3, fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-\beta1, insulina, IFN-\gamma, IGF-I, IGF-II, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), inhibina \alpha, inhibina \beta, IP-10, factor 2 de crecimiento de queratinocitos (KGF-2), KGF, leptina, LIF, linfotactina, sustancia inhibidora mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, factor-1 inhibidor precursor mieloide (MPIF-1), NAP-2, neurturina, factor de crecimiento de nervios, \beta-NGF, NT-3, NT-4, oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1\alpha, SFF1\beta, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-\alpha, TGF-\beta, TGF-\beta2, TGF-\beta3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-\alpha, TNF-\beta, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor I de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-\beta, GRO-\gamma, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 y HER 4, centro de reconocimiento de TACE, BP-I de TNF y BP-II de TNF, así como cualquier diana expuesta en el Anexo 2 o en el Anexo 3 de esta memoria, si está en la combinación indicada en los Anexos, en una combinación diferente o individualmente.

Los receptores de citocina incluyen los receptores para las citocinas anteriores, por ejemplo IL-1 R1; IL-6R; IL-10R; IL-18R, así como los receptores para citocinas indicados en el Anexo 2 o en el Anexo 3 y también los receptores expuestos en los Anexos 2 y 3. Se apreciará que esta lista no sea de ningún modo exhaustiva. Cuando el ligando multiespecífico se une a dos epítopos (en el mismo o diferentes antígenos), el o los antígeno(s) puede(n) seleccionarse de esta lista.

De forma ventajosa, pueden utilizarse ligandos doble-específicos para citocinas diana y otras moléculas que cooperan sinérgicamente en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. La invención proporciona por consiguiente un método para sinergizar la actividad de dos o más citocinas, que comprende la administración de un ligando doble-específico capaz de unirse a dichas dos o más citocinas. En este aspecto de la invención, el ligando doble-específico puede ser cualquier ligando doble-específico, incluyendo un ligando compuesto de dominios complementarios y/o no complementarios, un ligando en una conformación abierta y un ligando en una conformación cerrada. Por ejemplo, este aspecto de la invención se refiere a combinaciones de dominios V_{H} y de dominios V_{L}, de dominios V_{H} solamente y de dominios V_{L} solamente.

La sinergia en un contexto terapéutico puede conseguirse de numerosas maneras. Por ejemplo, las combinaciones diana pueden ser terapéuticamente activas solamente si ambas dianas están dirigidas por el ligando, mientras que dirigir una diana sola puede proporcionar algún efecto terapéutico bajo o mínimo, pero junto con una segunda diana la combinación proporciona un aumento sinérgico en el efecto terapéutico.

Preferentemente, las citocinas unidas por ligandos doble-específicos de este aspecto de la invención se seleccionan de la lista presentada en el Anexo 2.

Además, pueden utilizarse ligandos doble-específicos en aplicaciones oncológicas, en las que una especificidad dirige CD89, que es expresado por células citotóxicas, y la otra es específica para el tumor. Ejemplos de antígenos tumorales que pueden dirigirse se proporcionan en el Anexo 3.

En una forma de realización de la segunda configuración de la invención, los dominios variables proceden de un anticuerpo dirigido contra el primer y/o segundo antígeno o epítopo. En una forma de realización preferida los dominios de la variable proceden de un repertorio de dominios de anticuerpo variables individuales. En un ejemplo, el repertorio es un repertorio que no se crea en un animal o un repertorio sintético. En otro ejemplo, los dominios variables individuales no se aislan (al menos en parte) por inmunización animal. Por lo tanto, los dominios variables individuales pueden aislarse de un banco natural.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ligando multiespecífico de conformación cerrada que comprende un primer dominio de fijación del epítopo que presenta una primera especificidad de fijación del epítopo y un dominio de fijación del segundo epítopo no complementario que presenta una segunda especificidad de fijación del epítopo en el que las primera y segunda especificidades de fijación son capaces de competir para la fijación del epítopo de modo que el ligando multiespecífico de conformación cerrada no puede unirse a ambos epítopos
simultáneamente.

Los ligandos de conformación abierta comprenden dominios de fijación no complementarios, en los que los dominios son específicos para un epítopo diferente en la misma diana. Dichos ligandos se unen a dianas con avidez aumentada. Asimismo, la invención proporciona ligandos polivalentes que comprenden dominios de fijación no complementarios específicos para el mismo epítopo y dirigidos a dianas que comprenden copias múltiples de dicho epítopo tales como IL-5, PDGF-AA, PDGF-BB, TGF beta, TGF beta2, TGF beta3 y TNF\alpha, por ejemplo el receptor 1 del TNF humano y del TNF\alpha humano.

Los ligandos pueden configurarse para unir epítopos individuales con baja afinidad, de modo que la fijación a epítopos individuales no sea terapéuticamente significativa; pero el aumento de avidez resultante de la fijación a dos epítopos proporciona una utilidad terapéutica. En un ejemplo concreto, los epítopos que están presentes individualmente en tipos de células normales pueden estar dirigidos, pero están presentes conjuntamente solamente en las células anormales o enfermas, tal como las células tumorales. En dicha situación, únicamente las células anormales o enfermas son dirigidas eficazmente por los ligandos biespecíficos según la invención.

Los ligandos específicos para múltiples copias del mismo epítopo, o de epítopos adyacentes, en la misma diana (conocidos como dAb quelantes) pueden ser también ligandos triméricos o poliméricos (tertraméricos o más) que comprenden tres, cuatro o más dominios de fijación no complementarios. Por ejemplo, pueden construirse ligandos que comprenden tres o cuatro dominios V_{H} o dominios V_{L}.

Además, se proporcionan ligandos que se unen a dianas multisubunidad, en los que cada dominio de fijación es específico para una unidad de dicha diana. El ligando puede ser dimérico, trimérico o polimérico.

Preferentemente, los ligandos multiespecíficos según los aspectos anteriores de la invención pueden obtenerse por el método del primer aspecto de la invención.

Según el aspecto anterior de la segunda configuración de la invención, de manera ventajosa el primer epítopo que fija el dominio y el segundo epítopo que fija los dominios son dominios variables de inmunoglobulina no complementarios, como los definidos en la presente memoria. Esto es, dominios variables V_{H}-V_{H} o V_{L}-V_{L}.

Los dAb quelantes en particular pueden prepararse según un aspecto preferido de la invención, a saber, la utilización de los dAb de anclaje, en los que se construye un banco de dAb diméricos, triméricos o poliméricos utilizando un vector que comprende un dAb constante corriente arriba o corriente abajo de una secuencia enlazadora, estando insertado un repertorio del segundo, tercero y más dAb en la otra cara del enlazador. Por ejemplo, el anclaje o vía dAb puede ser TAR1-5 (V_{\kappa}), TAR1-27 (V_{\kappa}), TAR2h-5(VH) o TAR2h-6(V_{\kappa}).

En las metodologías alternativas, puede evitarse la utilización de enlazadores, por ejemplo mediante la utilización de afinidad de enlace no covalente o natural entre los dominios de fijación tales como V_{H} y V_{\kappa}.

Según la presente invención, la expresión "armazón de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que comprende por lo menos un pliegue de inmunoglobulina y que actúa como núcleo para uno o más dominios de fijación del epítopo, definidos en la presente memoria.

Los armazones de inmunoglobulina preferidos definidos en la presente memoria incluyen uno cualquiera o más de los seleccionados de entre los siguientes: una molécula de inmunoglobulina que comprende por lo menos (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de un anticuerpo con cadena pesada; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1, CH2 y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo; o cualquiera del subconjunto (ii) juntamente con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. También puede estar incluido un dominio de la región bisagra. Dichas combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, simular anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM, o fragmentos de los mismos tales como las moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')_{2}. Los expertos en la materia están al corriente de que esta lista no pretende ser exhaustiva.

El enlace del armazón a los dominios de fijación del epítopo, como se define en la presente memoria puede conseguirse en el contexto del polipéptido, que está después de la expresión del ácido nucleico que codifica la estructura y/o los dominios de fijación del epítopo. Alternativamente, la etapa de fijación puede realizarse en el contexto del ácido nucleico. Los métodos de fijación de un armazón de proteína según la presente invención, a uno o más dominios de fijación del epítopo incluyen la utilización de la química de las proteínas y/o las técnicas de biológica molecular que son habituales para los expertos en la materia y se describen en la presente memoria.

De manera ventajosa el ligando multiespecífico de conformación cerrada comprende un primer dominio capaz de fijar una molécula diana, y un segundo dominio capaz de fijar una molécula o grupo que prolonga la vida media del ligando. Por ejemplo, la molécula o grupo puede ser un agente de esponjamiento, tal como HSA o una proteína de la matriz celular. Tal como se utiliza en la presente memoria la frase "molécula o grupo que prolonga la vida media de un ligando" se refiere a una molécula o grupo químico que, cuando se fija a un ligando doble-específico como el descrito en la presente memoria prolonga la vida media in vivo de dicho ligando doble-específico cuando se administra a un animal, en comparación con un ligando que no se fija a esta molécula o grupo. Se describen a continuación ejemplos de moléculas o grupos que prolongan la vida media de un ligando. En una forma de realización preferida, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede ser capaz de fijar la molécula diana solamente en el desplazamiento de la molécula o grupo que prolonga la vida media. Por lo tanto, por ejemplo, un ligando multiespecífico de conformación cerrada se mantiene en circulación en el torrente sanguíneo de un sujeto mediante una molécula esponjosa tal como HSA. Cuando se encuentra una molécula diana, la competencia entre los dominios de fijación del ligando multiespecífico de conformación cerrada produce el desplazamiento de la HSA y la fijación de la diana.

Los ligandos según algún aspecto de la presente invención, así como los monómeros dAb útiles para construir dichos ligandos pueden disociarse de manera ventajosa de su(s) diana(s) homóloga(s) con una K_{d} de 300 nM a 5 pM (es decir, 3 \times 10^{-7} a 5 x 10^{-12} M), preferentemente de 50 nM a 20 pM, o 5 nM a 200 pM o 1 nM a 100 pM, 1 \times 10^{-7} M o menos, 1 \times 10^{-8} M o menos, 1 \times 10^{-9} M o menos, 1 \times 10^{-10} M o menos, 1 \times 10^{-11} M o menos; y/o una K_{off} de
5 \times 10^{-1} a 1 \times 10^{-7} S^{-1}, preferentemente 1 \times 10^{-2} a 1 \times 10^{-6} S^{-1}, o 5 \times 10^{-3} a 1 \times 10^{-5} S^{-1}, o 5 \times 10^{-1} S^{-1} o menos, o 1 \times 10^{-2} S^{-1} o menos, o 1 \times 10^{-3} S^{-1} o menos, o 1 \times 10^{-4} S^{-1} o menos, o 1 \times 10^{-5} S^{-1} o menos, o 1 \times 10^{-6} S^{-1} o menos, determinadas por resonancia de plasmón superficial. La constante de velocidad K_{d} se define como K_{off}/K_{on}.

Un ligando puede comprender un monómero dAb anti-TNF\alpha (o un ligando doble-específico que comprenda dicho dAb), un ligando homodímero, heterodímero u homotrímero en el que cada dAb se une a TNF\alpha. El ligando se fija a TNF\alpha con una K_{d} de 300 nM a 5 pM (es decir, 3 \times 10^{-7} a 5 x 10^{-12} M), preferentemente de 50 nM a 20 pM, más preferentemente de 5 nM a 200 pM y aún más preferentemente de 1 nM a 100 pM, expresado de manera alternativa, la K_{d} es 1 \times 10^{-7} M o menos, preferentemente 1 \times 10^{-8} M o menos, más preferentemente 1 \times 10^{-9} M o menos, ventajosamente 1 \times 10^{-10} M o menos, y más preferentemente 1 \times 10^{-11} M o menos; y/o una constante de velocidad K_{off} de 5 \times 10^{-1} a 1 \times 10^{-7} S^{-1}, preferentemente 1 \times 10^{-2} a 1 \times 10^{-6} S^{-1}, más preferentemente 5 \times 10^{-3} a 1 \times 10^{-5} S^{-1}, por ejemplo 5 \times 10^{-1} S^{-1} o menos, preferentemente 1 \times 10^{-2} S^{-1} o menos, más preferentemente 1 \times 10^{-3} S^{-1} o menos, ventajosamente 1 \times 10^{-4} S^{-1} o menos, más ventajosamente 1 \times 10^{-5} S^{-1} o menos, y aún más preferentemente 1 \times 10^{-6} S^{-1} o menos, determinadas por resonancia de plasmón superficial.

Preferentemente, el ligando neutraliza a TNF\alpha en un ensayo L929 normalizado con un ND50 de 500 nM a 50 pM, preferentemente o 100 nM a 50 pM, ventajosamente de 10 nM a 100 pM, más preferentemente de 1 nM a 100 pM; por ejemplo 50 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, ventajosamente 500 pM o menos, más preferentemente 200 pM o menos y aún más preferentemente 100 pM o menos.

Preferentemente, el ligando inhibe la fijación de TNF alfa al receptor I de TNF alfa (receptor p55) con una IC50 de 500 nM a 50 pM, preferentemente 100 nM a 50 pM, más preferentemente de 10 nM a 100 pM, ventajosamente de 1 nM a 100 pM; por ejemplo 50 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 500 pM o menos, ventajosamente 200 pM o menos y aún más preferentemente 100 pM o menos. Preferentemente, el TNF alfa es TNF alfa humano.

Un ligando puede comprender un monómero dAb del receptor I anti-TNF\alpha o un ligando doble-específico que comprende dicho dAb, que se fija a al receptor I de TNF con una K_{d} de 300 nM a 5 pM (es decir, 3 \times 10^{-7} a 5 x 10^{-12} M), preferentemente de 50 nM a 20 pM, más preferentemente de 5 nM a 200 pM y aún más preferentemente de 1 nM a 100 pM, por ejemplo 1 \times 10^{-7} M o menos, preferentemente 1 \times 10^{-8} M o menos, más preferentemente 1 \times 10^{-9} M o menos, ventajosamente 1 \times 10^{-10} M o menos, y más preferentemente 1 \times 10^{-11} M o menos; y/o una constante de velocidad K_{off} de 5 \times 10^{-1} a 1 \times 10^{-7} S^{-1}, preferentemente 1 \times 10^{-2} a 1 \times 10^{-6} S^{-1}, más preferentemente 5 \times 10^{-3} a 1 \times 10^{-5} S^{-1}, por ejemplo 5 \times 10^{-1} S^{-1} o menos, preferentemente 1 \times 10^{-2} S^{-1} o menos, ventajosamente 1 \times 10^{-3} S^{-1} o menos, más preferentemente 1 \times 10^{-4} S^{-1} o menos, aún más preferentemente 1 \times 10^{-5} S^{-1} o menos, y lo más preferentemente 1 \times 10^{-6} S^{-1} o menos, determinadas por resonancia de plasmón superficial.

Preferentemente, el ligando del monómero dAb neutraliza a TNF\alpha en un ensayo normalizado (p. ej. L929 o en los ensayos con HeLa descritos en la presente memoria) con un ND50 de 500 nM a 50 pM, preferentemente de 100 nM a 50 pM, más preferentemente de 10 nM a 100 pM, ventajosamente de 1 nM a 100 pM; por ejemplo 50 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, ventajosamente 500 pM o menos, ventajosamente 200 pM o menos y lo más preferentemente 100 pM o menos.

Preferentemente, el monómero o el ligando dAb inhibe la fijación de TNF alfa al receptor I de TNF alfa (receptor p55) con una IC50 de 500 nM a 50 pM, preferentemente 100 nM a 50 pM, más preferentemente de 10 nM a 100 pM, ventajosamente de 1 nM a 100 pM; por ejemplo 50 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 500 pM o menos, ventajosamente 200 pM o menos y aún más preferentemente 100 pM o menos. Preferentemente, la diana del receptor I de TNF es TNF\alpha humano.

Un ligando puede comprender un monómero dAb (o un ligando doble-específico que comprende dicho dAb) que se une a la albúmina del suero (SA) con una K_{d} de 1 nM a 500 \muM (es decir, de 1 \times 10^{-9} a 5 \times 10^{-4}), preferentemente de 100 nM a 10 \muM. Preferentemente, para un ligando doble-específico que comprende un primer dAb anti-SA y un segundo dAb en otra diana, la afinidad (p. ej. K_{d} y/o K_{off} medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej. utilizando BiaCore) del segundo dAb para su diana está comprendida entre 1 y 100.000 veces (preferentemente entre 100 y 100.000, más preferentemente entre 1.000 y 100.000 o entre 10.000 y 100.000 veces) la afinidad del primer dAb para SA. Por ejemplo, el primer dAb se une a SA con una afinidad de aproximadamente 10 \muM, mientras que el segundo dAb se une a su diana con una afinidad de 100 pM. Preferentemente la albúmina del suero es albúmina de suero humano (HSA).

En una forma de realización, el primer dAb (o un monómero de dAb) se une a SA (p. ej., HSA) con una K_{d} de aproximadamente 50, preferentemente 70 y más preferentemente 100, 150 ó 200 nM.

La invención proporciona además dímeros, trímeros y polímeros de los monómeros de dAb, mencionados anteriormente, según el siguiente aspecto de la presente invención.

Los ligandos según la invención que incluyen monómeros, dímeros y trímeros de dAb, pueden estar ligados a una región Fc del anticuerpo, que comprende uno o ambos de los dominios C_{H}2 y C_{H}3, y opcionalmente una región bisagra. Por ejemplo, los vectores que codifican ligandos unidos como una sola secuencia de nucleótidos a una región Fc pueden utilizarse para preparar dichos polipéptidos.

En otro aspecto de la invención, la presente invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico según la presente invención.

Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped transfectada con un vector según la presente invención.

La expresión de dicho vector puede configurarse para producir, por ejemplo en la superficie de una partícula de bacteriófago, un epítopo que se une a los dominios para la selección. Esto permite la selección de dominios desplegados y por lo tanto la selección de "ligandos multiespecíficos" utilizando el método de la presente invención.

Todavía en otro aspecto de la invención, la presente invención proporciona una composición que comprende un ligando, que puede obtenerse por un método de la presente invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de enfermedades que utiliza un "ligando multiespecífico de conformación cerrada" o una composición según la presente invención.

En una forma de realización preferida de la invención, la enfermedad es el cáncer o una enfermedad inflamatoria, p. ej., artritis reumatoide, asma o enfermedad de Crohn.

Las secuencias similares u homólogas (p. ej., por lo menos con aproximadamente el 70% de identidad de la secuencia) a las secuencias expuestas en la presente memoria forman asimismo parte de la invención. En algunas formas de realización, la identidad de la secuencia en cuanto a los aminoácidos puede ser 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. En cuanto a los ácidos nucleicos, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. Alternativamente, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico se hibridan en condiciones de hibridación selectiva (p. ej., condiciones de hibridación con severidad muy alta), con el complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en todas las células, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.

Los cálculos de "homología" o de "identidad de secuencia" o de "similitud" entre dos secuencias (en la presente memoria los términos se utilizan indistintamente) se realizan de la forma siguiente. Se alinean las secuencias en aras de la comparación óptima (p. ej., pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para la alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden despreciarse en aras de la comparación). En una forma de realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada a título de comparación es por lo menos del 30%, preferentemente por lo menos del 40%, más preferentemente por lo menos del 50%, aun más preferentemente por lo menos del 60% y aun más preferentemente por lo menos del 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación se comparan los restos de aminoácidos o los nucleótidos en las posiciones de los aminoácidos correspondientes o en las posiciones de los nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición (tal como se utiliza en la presente memoria "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o de ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesita introducir para la alineación óptima de las dos secuencias.

De forma ventajosa se emplea el algoritmo BLAST (versión 2.0) para la alineación de la secuencia, con parámetros fijados en valores por defecto. El algoritmo BLAST se describe con detalle en la world wide web ("www") del National Center for Biotechnology Information (".ncbi") de los National Institutes of Health ("nih") del gobierno de los Estados Unidos (".gov"), en el directorio "/Blast/", en el archivo "blast_help.html". Los parámetros de búsqueda se definen como se indica a continuación y se ajustan ventajosamente a los parámetros definidos por defecto.

BLAST (herramienta básica de búsqueda de la alineación local) es el algoritmo de búsqueda heurístico empleado por los programas blastp, blasm, blastx, tblastn y tblastx; estos programas asignan significación a sus resultados utilizando los métodos estadísticos de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8 (véase el archivo "blast_help.html", descrito anteriormente) con unas pocas mejoras. Los programas BLAST se ajustaron para la búsqueda de similitud de la secuencia, por ejemplo para identificar homólogos en una secuencia de búsqueda. Los programas generalmente no son útiles para la búsqueda de estilo del motivo. Para una exposición de resultados básicos en la búsqueda de similitud de las bases de datos de la secuencia, véase Altschul et al. (1994).

Los cinco programas BLAST disponibles en la página web del National Center for Biotechnology Information realizan las siguientes tareas:

"blastp" compara una secuencia de búsqueda de aminoácidos frente a una base de datos de la secuencia de proteínas;

"blastn" compara una secuencia de búsqueda de nucleótidos frente a una base de datos de las secuencias de nucleótidos;

"blastx" compara los productos de la traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de búsqueda de nucleótidos (ambas cadenas) frente a una base de datos de las secuencias de proteína;

"tblastn" compara una secuencia de búsqueda de proteínas frente a una base de datos de la secuencia de nucleótidos traducida de forma dinámica en los seis marcos de lectura (ambas cadenas).

"tblastx" compara las producciones de los seis marcos de una secuencia de búsqueda de nucleótidos frente a las traducciones de seis marcos de una base de datos de la secuencia de nucleótidos.

BLAST utiliza los parámetros de búsqueda siguientes:

HISTOGRAM presenta un histograma de puntuaciones para cada búsqueda; por defecto es sí. (Véase el parámetro H en el manual BLAST).

DESCRIPTIONS limita el número de descripciones cortas de secuencias compatibles descritas para el número especificado; el límite por defecto es de 100 descripciones. (Véase el parámetro V en la página del manual). Véase también EXPECT y CUTOFF.

ALIGNMENTS limita las secuencias de la base de datos al número especificado para el que se describen los pares de segmentos de puntuación alta (HSP); el límite por defecto es 50. Si aparecen más secuencias que éstas de la base de datos para satisfacer el umbral de significación estadística durante el informe (véase EXPECT y CUTOFF a continuación), solamente se adscriben las compatibilidades asignadas a la significación estadística mayor. Véase el parámetro B en el manual BLAST).

EXPECT Umbral de significación mayor para describir las equivalencias frente a las secuencias de la base de datos; el valor por defecto es 10, de modo que es de esperar que se encuentren 10 equivalencias meramente por probabilidad, según el modelo estocástico de Karlin y Altschul (1990). Si la significación estadística asignada a una equivalencia es mayor que el umbral EXPECT, la equivalencia no se comunicará. Los umbrales EXPECT inferiores son más severos, lo que conduce a que se comuniquen equivalencias con menor probabilidad. Los valores fraccionarios son aceptables. Véase el parámetro E en el manual BLAST).

CUTOFF Puntuación Cutoff para comunicar pares de segmentos con puntuación elevada. El valor por defecto se calcula a partir del valor EXPECT (véase anteriormente). Solamente se describen los HSP para una secuencia de la base de datos si la significación estadística asignada a ellos es por lo menos tan elevada como se asignaría a HSP solo, teniendo una puntuación igual al valor CUTOFF. Los valores CUTOFF elevados son más severos, lo que conduce a que se comuniquen equivalencias con menor probabilidad. (Véase el parámetro S en el manual BLAST). Típicamente, los umbrales de significación pueden prepararse de manera más intuitiva utilización EXPECT.

MATRIX especifica una matriz de puntuación alternativa para BLASTP, BLASTX, TBLASTN y TBLASTX. La matriz por defecto es BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10915-9). Las opciones alternativas válidas incluyen: PAM40, PAM120, PAM250 e IDENTITY. Ninguna matriz de puntuación alternativa está disponible para BLASTN; lo que especifica que la directiva MATRIX en la petición BLASTN devuelve una respuesta errónea.

STRAND limita una búsqueda de TBLASTN a sólo la cadena superior o inferior de las secuencias de la base de datos; o limita una búsqueda de BLASTN, BLASTX o TBLASTX a sólo los armazones de lectura de la cadena superior o inferior de la secuencia de búsqueda.

FILTER enmascara los segmentos de la secuencia de búsqueda que presentan complejidad de composición baja, determinados mediante el programa SEG de Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163, o los segmentos que constan de repeticiones internas con periodicidad corta, determinados por el programa XNU de Claverie & Status, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201, o, para BLASTN, mediante el programa DUST de Tatusov y Lipman (véase la pág world wide web de la NCBI). El filtrado puede eliminar los informes estadísticamente significativos pero biológicamente no interesantes de los resultados de blast (p. ej., aciertos frente a las regiones comunes ácidas, básicas o ricas en prolina), dejando las regiones más biológicamente interesantes de la secuencia de búsqueda disponibles para la equivalencia específica frente a las secuencias de la base de datos.

La secuencia de baja complejidad hallada mediante un programa de filtración se sustituye utilizando la letra "N" en la secuencia de nucleótidos (p. ej., "N", se repitió 13 veces) y la letra "X" en las secuencias de proteínas (p. ej., "X" se repitió 9 veces).

El filtrado se aplica solamente a la secuencia de búsqueda (o a sus productos de traducción), no a las secuencias de la base de datos. El filtrado por defecto es DUST para BLASTN, SEG para otros programas. No es raro en absoluto que esté enmascarado por SEG, XNU, o ambos, cuando se aplica a las secuencias en SWISS-PROT, por eso no debería esperarse que la filtración produzca siempre un efecto. Además, en algunos casos, se enmascaran las secuencias en su totalidad, lo que indica que la significación estadística de algunas equivalencias descritas frente a la secuencia de búsqueda sin filtrar sería sospechosa.

NCBI-gi da lugar a que los identificadores de NCBI gi se presenten en los resultados, además de la denominación del acceso y/o del locus.

Más preferentemente, se realizan comparaciones de la secuencia utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST sencillo proporcionado en la página world wide bed de NCBI descrita anteriormente en el directorio "/BLAST".

Breve descripción de las figuras

Figura 1: presenta la diversificación de V_{H}/HSA en las posiciones H50, H52, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98 (DVT o NNK codificadas respectivamente) que están en el sitio de fijación del antígeno de HSA de V_{H}. La secuencia de V_{\kappa} está diversificada en las posiciones L50 y L53.

Figura 2: presenta el Banco 1: línea germinal V_{\kappa} /V_{H} de DVT,

\quad: {}\hskip1,2cm el Banco 2: línea germinal V_{\kappa} /V_{H} de NNK,

\quad: {}\hskip1,2cm el Banco 3: línea germinal V_{H}/V_{\kappa} de DVT,

\quad: {}\hskip1,2cm el Banco 4: línea germinal V_{H}/V_{\kappa} de NNK.

\quad: En formato de presentación de fago/ScFv. Se preseleccionaron estos bancos para fijar la proteína A y la proteína L a ligandos genéricos de modo que la mayoría de los clones y de los bancos seleccionados sean operativos. Se seleccionaron los bancos en HSA (primera ronda) y \beta-gal (segunda ronda) o en la selección \beta-gal de HSA o en \beta-gal (primera ronda) y HSA (segunda ronda) selección HSA de \beta-gal. El scFv soluble de estos clones de PCR se amplía en la secuencia. Un clon que codifica un anticuerpo K8 específico doble se seleccionó para el trabajo adicional.

Figura 3: presenta una alineación de las cadenas V_{H} y de las cadenas V_{\kappa}.

Figura 4: presenta la caracterización de la propiedades de fijación del anticuerpo K8, las propiedades de fijación del anticuerpo K8 se caracterizan mediante ELISA del fago monoclonal, se descubrió que el anticuerpo K8 específico doble se fija a HSA y a \beta-gal y se presenta en la superficie del fago sin señales absorbentes mayores de 1,0. No se detectó reactividad cruzada con otras proteínas.

Figura 5: presenta el ELISA de scFv soluble utilizando concentraciones conocidas del fragmento de anticuerpo K8. Se recubrió una placa de 96 pocillos con 100 \mug de HSA, BSA y \beta-gal a 10 \mug/ml y 100 \mug/ml de Proteína A a una concentración de 1 \mug/ml. Se aplicaron 50 \mug de las diluciones en serie del scFv de K8 y se detectaron los fragmentos de anticuerpo fijados con Proteína L-HRP. Los resultados del ELISA confirman la naturaleza específica doble del anticuerpo K8.

Figura 6: presenta las características de fijación del clon K8 V_{\kappa}, V_{H} ficticio analizadas utilizando el ELISA de scFv soluble. La producción de los fragmentos de scFv solubles se produjo por IPTG como describe Harrison et al., Methods Enzymol. 1996; 267:83-109 y el sobrenadante que contiene scFv se analizó directamente. Se realizó el ELISA de scFv soluble como se describe en el ejemplo 1 se detectaron los scFv unidos con la Proteína L-HRP. Los resultados del ELISA pusieron de manifiesto que este clon era capaz todavía de unirse a \beta-gal, mientras que se anuló la fijación de BSA.

Figura 7: presenta la secuencia de los vectores 1 y 2 con dominio variable.

Figura 8: es una cartografía del vector C_{H} utilizado para construir un ligando multiespecífico de V_{H}1/V_{H}2.

Figura 9: es una cartografía del vector V_{\kappa} utilizado para construir un ligando multiespecífico de V_{\kappa}1/V_{\kappa}2.

Figura 10: análisis del receptor TNF que compara el dímero 4, TAR1-5, el dímero 4 TAR1-5-19 y el monómero TAR-5-19.

Figura 11: análisis del receptor TNF que compara los dímeros 1 a 6 de TAR1-5. Todos los dímeros se han purificado por HPLC y se presentan los resultados para las especies diméricas óptimas.

Figura 12: análisis del receptor de TNF de 19 homodímeros de TAR1-5 en diferentes formatos: formato dAb-enlazador-dAb con el enlazador 3U, 5U o 7U, formato Fab y formato del enlazador bisagra de cisteína.

Figura 13: Secuencia V_{H} ficticia para el banco 1. Secuencia del armazón de VH basada en la secuencia DP47-JH4b de la línea germinal. Las posiciones en las que NNK (N= nucleótidos A, T, C o G; K = nucleótidos G o T) se han incorporado al azar al banco 1 se indican el texto subrayados en negrita.

Figura 14: Secuencia V_{H} ficticia para el banco 2. Secuencia del armazón de VH basada en la secuencia DP47-JH4b de la línea germinal. Las posiciones en las que NNK (N= nucleótidos A, T, C o G; K = nucleótidos G o T) se han incorporado al azar en el banco 2 se indican el texto subrayados en negrita.

Figura 15: Secuencia V_{\kappa} ficticia para el banco 3. Secuencia del armazón de V_{\kappa} basada en la secuencia DP_{\kappa}9-J_{\kappa}1 de la línea germinal. Las posiciones en las que NNK (N= nucleótidos A, T, C o G; K = nucleótidos G o T) se ha incorporado al azar en el banco 3 se indican el texto subrayados en negrita.

Figura 16: Secuencia de nucleótidos de aminoácidos de los anti MSA dAb MSA 16 y MSA 26.

Figura 17: Inhibición biacore MSA 16 y 26. Se analizaron los dAb MSA16 y MSA26 purificados mediante inhibición biacore para determinar K_{d}. En resumen, se analizaron los dAb para determinar la concentración de dAb requerida para conseguir 200 UR de respuesta en un kit CM5 biacore recubierto con una densidad elevada de MSA. Una vez se determinaron las concentraciones requeridas de dAb, se premezcló el antígeno MSA en un intervalo de concentraciones alrededor de la K_{d} esperada con el dAb y se incubó durante la noche. La fijación al chip de dAb de biacore recubierto con MSA en cada una de las premezclas se midió a continuación a un caudal elevado de 30 \mul/minuto.

Figura 18: Concentraciones de MSA16 en el suero después de la inyección. Se determinó la vida media en el suero del MSA16 de dAb en ratones. Se administró MSA16 en inyecciones i.v. individuales a aprox. 1,5 mg/kg en ratones CD1. El modelado con un modelo de comportamiento 2 demostró que MSA16 tenía una t1/2\alpha de 0,98 h, una t1/2\beta de 36,5 h y una AUC de 913 h.mg/ml. MSA16 presentó una vida media considerablemente disminuida en comparación con HEL4 (dAb de lisozima de la clara de huevo antigallina) que presentó una t1/2\alpha de 0,06 h y una t1/2\beta de 0,34 h.

Figura 19: ELISA (a) y análisis del receptor TNF (c) que presenta la inhibición de la fijación de TNF con un fragmento de tipo Fab que comprende MSA26Ck y TAR1-5-19CH. La adición de MSA con el fragmento de tipo Fba reduce el nivel de inhibición. Se sondó una placa ELISA recubierta con 1 \mug/ml de TNF\alpha con C_{H} de V_{\kappa} específico doble y un fragmento similar a Fab de C_{\kappa} _{} de V_{\kappa} y asimismo con TFN\alpha de referencia que se une a dAb a una concentración calculada para proporcionar una señal similar en el ELISA. Se utilizaron tanto el dAb específico doble como de referencia para sondar la placa ELISA en presencia y en ausencia de 2 mg/ml de MSA. La señal en el pocillo específico doble se redujo en más del 50% pero la señal en el pocillo dAb no se redujo en absoluto (véase la figura 19a). La misma proteína específica doble se colocó también en el análisis del receptor con y sin MSA y se demostró también la competencia por MSA (véase la figura 19c). Esto demuestra que la fijación de MSA al específico doble es competitiva con la fijación a TNF\alpha.

Figura 20: Análisis del receptor TNF que presenta la inhibición de la fijación de TNF con un heterodímero con puente disulfuro de dAb de TAR1-5-19 y de dAb de MSA16. La adición de MSA con el dímero reduce el nivel de inhibición en función de la dosis. El análisis del receptor TNF (figura 19 (b)) se realizó en presencia de una concentración constante de heterodímero (18 nM) y una dilución en serie de MSA y HSA. La presencia de HSA en un intervalo de concentraciones (hasta 2 mg/ml) no produjo una reducción de la capacidad del dímero para inhibir TNF\alpha. Sin embargo, la adición de MSA produjo una reducción de la capacidad del dímero en función de la dosis para inhibir TNF\alpha (figura 19a). Esto demuestra que MSA y TNF\alpha compiten para la fijación al dímero MSA16, TAR1-5-19fijado en cys. MSA y HSA solos no presentan un efecto sobre el nivel de fijación de TNF en el ensayo.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Complementario Dos dominios de inmunoglobulina son "complementarios" cuando pertenecen a familias de estructuras que forman pares o grupos homólogos o proceden de dichas familias y mantienen esta propiedad. Por ejemplo, un dominio V_{H} y un dominio V_{L} de un anticuerpo son complementarios; dos dominios V_{H} no son complementarios y dos dominios V_{L} no son complementarios. Los dominios complementarios pueden encontrarse en otros miembros de la superfamilia de la inmunoglobulina, tales como los dominios V_{\alpha} y V_{\beta} (o \gamma y \delta) del receptor de linfocitos T. En cuanto a la segunda configuración de la presente invención, los dominios no complementarios no se fijan a una molécula diana de manera cooperativa, pero actúan independientemente sobre diferentes epítopos diana que pueden ser moléculas iguales o diferentes. Los dominios que son artificiales, tales como los dominios a base de armazones de proteínas que no fijan epítopos a menos que se modifiquen genéticamente para hacerlo, son no complementarios. Asimismo, dos dominios a base de (por ejemplo) un dominio de inmunoglobulina y un dominio de fibronectina no son complementarios.

Inmunoglobulina Ésta se refiere a una familia de polipéptidos que conservan la característica de plegado de la inmunoglobulina de moléculas de anticuerpo, que contiene dos hojas \beta y, normalmente, un enlace disulfuro conservado. Los miembros de la superfamilia de la inmunoglobulina están implicados en muchos aspectos de las interacciones celulares y no celulares in vivo, incluyendo las funciones extendidas en el sistema inmunitario (por ejemplo, anticuerpos, moléculas del receptor de linfocitos T y similares), implicación en la adhesión celular (por ejemplo las moléculas ICAM) y en la señalización intracelular (por ejemplo, moléculas receptoras, tal como el receptor de PDGF). La presente invención se aplica a todas las moléculas de la superfamilia de la inmunoglobulina que poseen dominios de fijación. Preferentemente, la presente invención se refiere a anticuerpos.

Combinación Los dominios variables según la invención se combinan para formar un grupo de dominios; por ejemplo, pueden combinarse los dominios complementarios, tales como los dominios V_{L} que se combinan con los dominios V_{H}. Los dominios no complementarios también pueden combinarse. Los dominios pueden combinarse de numerosas maneras, lo que implica el enlace de los dominios por medios covalentes o no covalentes.

Dominio Un dominio es una estructura proteica plegada que conserva su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades operativas discretas de las proteínas, y en muchos casos pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de la función del resto de la proteína y/o del dominio. Dominio simple de la variable del anticuerpo significa un dominio del polipéptido plegado que comprende secuencias características de los dominios variables del anticuerpo. Esto incluye por consiguiente los dominios variables completos de anticuerpo y los dominios variables modificados, por ejemplo en los que uno o más bucles han sido sustituidos por secuencias que no son características de los dominios variables de anticuerpo, o de los dominios variables de anticuerpo que han sido truncados o que comprenden extensiones con terminal N o C, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan por lo menos en parte la actividad de fijación y la especificidad del dominio completo.

Repertorio Colección de diversas variantes, por ejemplo variantes de polipéptido que se diferencian en su secuencia primaria. Un banco utilizado en la presente invención comprenderá un repertorio de polipéptido que comprende por lo menos 1.000 elementos.

Banco El término banco se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. El banco se compone de elementos, cada uno de los cuales presenta una secuencia individual de polipéptidos o de ácidos nucleicos. Hasta cierto punto, banco es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencia entre los elementos del banco son responsables de la presente diversidad en el banco. El banco puede tener la forma de una mezcla sencilla de polipéptidos o de ácidos nucleicos, o puede tener la forma de organismos o células, por ejemplo bacterias, virus, células animales o vegetales y similares, transformados con un banco de ácidos nucleicos. Preferentemente cada organismo o célula individual contiene solamente uno o un número limitado de elementos del banco. De forma ventajosa, los ácidos nucleicos se incorporan a los vectores de expresión, a fin de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En un aspecto preferido, por consiguiente, un banco puede tener la forma de una población de organismos anfitriones, conteniendo cada organismo una o más copias de un vector de expresión que contiene un solo elemento del banco en forma de ácido nucleico que puede expresarse para producir su elemento de polipéptido correspondiente. Por lo tanto, la población de organismos anfitriones tiene potencial para codificar un gran repertorio de variantes de polipéptido genéticamente variadas.

"Ligando multiespecífico con conformación cerrada" describe un ligando multiespecífico como el definido en la presente memoria que comprende por lo menos dos dominios de fijación al epítopo como los definidos en la presente memoria. La expresión "conformación cerrada" (ligando multiespecífico) significa que los dominios de fijación al epítopo del ligando están ordenados de modo que la fijación al epítopo por un dominio de fijación al epítopo compite con la fijación al epítopo por otro dominio de fijación al epítopo. Esto es, los epítopos homólogos pueden fijarse por cada dominio de fijación al epítopo individualmente pero no simultáneamente. La conformación cerrada del ligando puede conseguirse utilizando los métodos descritos en la presente memoria.

Anticuerpo Un anticuerpo (por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE) o fragmento (tales como un Fab, F(ab')_{2}, Fv, Fv ligado por disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico con conformación cerrada, scFv ligado por disulfuro, diacuerpo) si proceden de alguna especie que produce de forma natural un anticuerpo o se crea por tecnología de ADN recombinante; si se aísla del suero, de linfocitos B, de hibridomas, transfectomas, levadura o bacterias).

Ligando doble-específico Ligando que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina como el definido en la presente memoria, en el que las regiones variables son capaces de fijarse a dos antígenos diferentes o a dos epítopos en el mismo antígeno al que no están normalmente unidos por una inmunoglobulina monoespecífica. Por ejemplo, los dos epítopos pueden estar en el mismo hapteno, pero no están en el mismo epítopo o lo suficientemente adyacentes para estar unidos por un ligando monoespecífico. Los ligandos doble-específicos según la invención se componen de dominios variables que presentan diferentes especificidades y no contienen pares de dominio variable mutuamente complementarios que presentan la misma especificidad.

Antígeno Molécula que está unida por un ligando según la presente invención. Típicamente, los antígenos son fijados por los ligandos del anticuerpo y son capaces de producir una respuesta al anticuerpo in vivo. Puede ser un polipéptido, proteína, ácido nucleico u otra molécula. Generalmente, los ligandos doble-específicos según la invención se seleccionan para la especificidad de la diana contra un determinado antígeno. En el caso de los anticuerpos convencionales y de los fragmentos de los mismos, el sitio de fijación al anticuerpo definido por los bucles variables (L1, L2, L3 y H1, H2, H3) es capaz de unirse al antígeno.

Epítopo Unidad de estructura convencionalmente unida por un par V_{H}/V_{L} de inmunoglobulina. Los epítopos definen el sitio de fijación mínimo a un anticuerpo, y por lo tanto representan la diana de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo con un solo dominio, un epítopo representa la unidad de estructura unida mediante un dominio variable en aislamiento.

Ligando genérico Ligando que se une a todos los elementos de un repertorio. Generalmente, no está unido por el sitio de fijación al antígeno definido anteriormente. Los ejemplos no limitativos incluyen la proteína A, la proteína L y la proteína G.

Selección Procedente por cribado o procedente por un proceso de selección darwiniano, en el que las interacciones para la fijación se realizan entre un dominio y el antígeno o epítopo o entre un anticuerpo y un antígeno o epítopo. Por lo tanto, puede seleccionarse un primer dominio variable para la fijación a un antígeno o epítopo en presencia o en ausencia de su dominio variable complementario.

Soporte universal Secuencia individual del armazón del anticuerpo correspondiente a las regiones de un anticuerpo conservado en la secuencia definida por Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services) o correspondiente al repertorio de inmunoglobulina de la línea germinal humana o a la estructura definida por Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917. La invención proporciona la utilización de un solo armazón, o de un conjunto de dichos armazones, que se ha descubierto que permite la derivación de prácticamente cualquier especificidad de fijación mediante la variación en las regiones hipervariables solas.

Vida media Tiempo transcurrido para que la concentración en el suero del ligando se reduzca al 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del ligando y/o la eliminación o secuestro del ligando por mecanismos naturales. Los ligandos de la invención se estabilizan in vivo y su prolongación de la vida media por fijación a moléculas que resisten la degradación y/o la eliminación o secuestro. Típicamente, dichas moléculas son proteínas naturales que presentan ellas mismas una vida media prolongada in vivo. La vida media de un ligando se prolonga si su actividad operativa persiste, in vivo, durante un periodo más largo que un ligando similar que no es específico para la molécula que prolonga la vida media. Por lo tanto, un ligando específico para HSA y una molécula diana se comparan con el mismo ligando en el que la especificidad para HSA no está presente, lo que hace que no se una a HSA pero que se una a otra molécula. Por ejemplo, puede unirse un segundo epítopo en la molécula diana. Típicamente, la vida media se prolonga en el 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más. Son posibles las prolongaciones comprendidas en el intervalo de 2\times, 3\times, 4\times, 5\times, 10\times, 20\times, 30\times, 40\times, 50\times o más de la vida media. Alternativamente, o además, son posibles las prolongaciones comprendidas en el intervalo de hasta 30\times, 40\times, 50\times, 60\times, 70\times, 80\times, 90\times, 100\times, 150\times de la vida media.

Inmunoanálisis homogéneo Inmunoanálisis en el cual se detecta el analito sin necesidad de una etapa de separación de los reactivos ligados y no ligados.

Sustancialmente idéntico (o "sustancialmente homólogo") Una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente de restos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, p. ej., sustituciones de aminoácidos conservados) o de nucleótidos con una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos de modo que la primera y segunda secuencias de aminoácidos o nucleótidos presentan actividades similares. En el caso de los anticuerpos, el segundo anticuerpo presenta la misma especificidad de fijación y presenta al menos el 50% de la afinidad de la misma.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "baja severidad", "media severidad", "alta severidad" o "condiciones a muy alta severidad" describen las condiciones para la hibridación y lavado de los ácidos nucleicos. Las directrices para realizar las reacciones de hibridación pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (198), 6.3.1-6.3.6, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. Los métodos acuoso y no acuoso se describen en esta referencia y ambos pueden utilizarse. Las condiciones de hibridación específicas citadas en la presente memoria son las siguientes: (1) condiciones de hibridación a baja severidad en 6\times cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguidas de dos lavados en 0,2\timesSSC, SDS al 0,1% por lo menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55ºC para las condiciones de baja severidad); (2) condiciones de hibridación a baja severidad en 6\times SSC a aproximadamente 45ºC, seguidas de uno o más lavados en 0,2\timesSSC, SDS al 0,1% a 60ºC; (3) condiciones de hibridación a alta severidad en 6\times SSC a aproximadamente 45ºC, seguidas de uno o más lavados en 0,2\timesSSC, SDS al 0,1% a 65ºC; y preferentemente (4) las condiciones de hibridación a muy alta severidad son fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguidas de uno o más lavados en 0,2\timesSSC, SDS al 1% a 65ºC. Las condiciones (4) a muy alta severidad son las condiciones preferidas y las que deberían utilizarse a menos que se especifique de otra manera.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido normalmente por un experto en la materia (p. ej., en cultivo celular, genética molecular, química de los ácidos nucleicos, técnicas de hibridación y bioquímica). Para los métodos moleculares, genéticos y bioquímicos se utilizan técnicas normalizadas (véase generalmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª ed., John Wiley & Sons, Inc. y métodos químicos.

Preparación de ligandos multiespecíficos a base de inmunoglobulina

Los ligandos doble-específicos según la invención, si son de conformación abierta o cerrada según la configuración deseada de la invención, pueden prepararse según las técnicas creadas anteriormente, utilizadas en el campo de la modificación genética de anticuerpos, para la preparación de scFv, anticuerpos de "fago" y otras moléculas de anticuerpos modificadas genéticamente. Las técnicas para la preparación de anticuerpos, y en particular de anticuerpos biespecíficos, son las descritas por ejemplo en los estudios y en las referencias siguientes citadas en la presente memoria: Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Plueckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al., (1992) Crti. Rev. Immunol. 12:125-168; Holliger, P. y Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carter, et al. (1995) J. Hematother. 4, 463-470; Chester, K. A. y Hawkins, R. E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H. R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Plückthun, A. y Pack, P. (1997) Immunotechnology 3, 83-105; Carter, P. y Merchant, A. M. (1997) Curr. Op. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. y Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45, 128-130.

La invención proporciona la selección de dominios variables contra dos antígenos o epítopos diferentes y la combinación posterior de los dominios variables.

Las técnicas empleadas para la selección de los dominios variables emplean bancos y procedimientos de selección que son conocidos en la materia. Los bancos naturales (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309) que utilizan genes V reordenados recogidos de linfocitos B humanos son bien conocidos por los expertos en la materia. Los bancos de síntesis (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97) se preparan mediante clonación de genes V de inmunoglobulina, utilizando habitualmente PCR. Los errores en el procedimiento PCR pueden conducir a un grado elevado de mezcla al azar. Los bancos de V_{H} y V_{L} pueden seleccionarse contra antígenos o epítopos diana por separado, en cuyo caso la fijación del dominio simple se selecciona directamente por o conjuntamente con éstos.

Un método preferido para preparar un ligando doble-específico según la presente invención comprende la utilización de un sistema de selección en el que se selecciona un repertorio de dominios variables para fijarse a un primer antígeno o epítopo y se selecciona un repertorio de dominios variables para fijarse a un segundo antígeno o epítopo. Los dominios de la primera variable y de la segunda variable seleccionados se combinan a continuación y el ligando doble-específico se selecciona para unirse tanto al primer antígeno o epítopo como al segundo. Los ligandos de conformación cerrada se seleccionan para unirse tanto al primer antígeno o epítopo como al segundo en aislamiento pero no simultáneamente.

A. Sistemas vector de banco

Una variedad de sistemas de selección es sabido en la materia que son adecuados para su utilización en la presente invención. Ejemplos de dichos sistemas se describen a continuación.

Los sistemas de expresión lambda de bacteriófagos pueden cribarse directamente como placas de bacteriófagos o como colonias de lisogenes, ambas descritas anteriormente (Huse et al. (1989) Science, 246: 1275; Caton y Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87; 8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2432) y son de utilización de la invención. Aunque dichos sistemas de expresión pueden utilizarse para cribar hasta 10^{6} elementos diferentes de un banco, no son adecuados realmente para cribar grandes cantidades (más de 10^{6} elementos).

De utilización particular en la construcción de bancos son los sistemas de presentación de la selección, que permiten que un ácido nucleico que debe unirse al polipéptido lo exprese. Tal como se utiliza en la presente memoria, un sistema de presentación de la selección es un sistema que permite la selección, mediante los medios de presentación adecuados, de los elementos individuales del banco uniendo los ligandos genéricos y/o diana.

Los protocolos de selección para aislar elementos deseados de grandes bancos son conocidos en la técnica, tipificados mediante técnicas de presentación de fagos. Dichos sistemas, en los que diversas secuencias peptídicas se presentan en la superficie del bacteriófago filamentoso (Scott y Smith (1990) Science, 249: 386), han demostrado ser útiles para la creación de bancos de fragmentos de anticuerpos (y las secuencias de nucleótidos que los codifican) para la selección in vitro y la ampliación de fragmentos de anticuerpo específicos que se unen a un antígeno diana (McCafferty et al., documento WO 92/01047). Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones V_{H} y V_{L} están unidas a fragmentos de genes que codifican las señales principales que les dirigen al espacio periplásmico de E. coli y como resultado los fragmentos de anticuerpo resultantes se presentan en la superficie del bacteriófago, normalmente como fusiones a las proteínas del recubrimiento del bacteriófago (p. ej., pIII o pVIII). Alternativamente, los fragmentos de anticuerpo se presentan externamente sobre los cápsidos de fago lambda (fagocuerpos). Una ventaja de los sistemas de presentación a base de fagos es que, debido a que son sistemas biológicos, los elementos del banco seleccionados pueden ampliarse simplemente cultivando el fago que contiene el elemento del banco seleccionado en células bacterianas. Además, ya que la secuencia de nucleótidos que codifica el elemento del banco de polipéptidos está contenida en un fago o vector fagómido, el secuenciado, la expresión y subsiguiente manipulación genética son relativamente sencillos.

Los métodos para la construcción de bancos de presentación del anticuerpo bacteriófago y de bancos de expresión del fago lambda son bien conocidos en la técnica (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breiling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) supra; Barbas et al. (1992) supra; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313.

Un método particularmente ventajoso ha consistido en la utilización de bancos de fago scFv (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879- 5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1066-1070; McCafferty et al. (1990) supra; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267). Se han descrito varias formas de realización de bancos de scFv presentados en las proteínas del recubrimiento de bacteriófago. Son conocidos también los perfeccionamientos de los métodos de presentación del fago, por ejemplo como se describe en los documentos WO 96/06213 y WO 92/01047 (Medical Research Council et al.) y en el documento WO 97/08320 (Morphosys).

Otros sistemas para la generación de bancos de polipéptidos implican la utilización de sistemas enzimáticos exentos de células para la síntesis in vitro de los elementos del banco. En un método, se seleccionan moléculas de ARN por rondas alternativas de selección frente a un ligando diana y ampliación por PCR (Tuerk y Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington y Szostak (1990) Nature, 346: 818). Puede utilizarse una técnica similar para identificar las secuencias de ADN que se unen a un factor de transcripción humano predeterminado (Thiesen y Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beudry y Joyce (1992) Science, 257: 635; documentos WO 92/05258 y WO 92/14843). De manera similar, puede utilizarse la traducción in vitro para sintetizar polipéptidos como método de generación de grandes bancos. Estos métodos que comprenden generalmente complejos estabilizados de polisomas, se describen además en los documentos WO 88/08453, WO 90/05785, WO 90/07003, WO 91/02076, WO 91/05058 y WO 92/02536. Los sistemas de presentación alternativos que no están basados en fagos, tales como los descritos en los documentos WO 95/22625 y WO 95/11922 (Affymax) utilizan los polisomas para presentar polipéptidos para la selección.

Todavía otra categoría adicional de técnicas implica la selección de repertorios en compartimentos artificiales, que permiten la unión de un gen con su producto génico. Por ejemplo, un sistema de selección en el que pueden seleccionarse ácidos núcleicos que codifican productos génicos deseables en microcápsulas formadas por emulsiones de agua en aceite está descrito en los documentos WO 99/02671, WO 00/40712 y Tawfik y Griffiths (1998) Nature Biotechnol. 16(7), 652-6. Los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta una actividad deseada están compartimentados en microcápsulas y a continuación transcritos y/o traducidos para producir sus respectivos productos génicos (ARN o proteína) en las microcápsulas. Los elementos genéticos que producen el producto génico con la actividad deseada se clasifican posteriormente. Este método selecciona productos génicos de interés detectando la actividad deseada por una variedad de medios.

B. Construcción del banco

Los bancos propuestos para la selección, pueden construirse utilizando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo las indicadas anteriormente o pueden adquirirse en proveedores comerciales. Los bancos que son útiles en la presente invención se describen, por ejemplo en el documento WO 99/20749. Una vez se selecciona el sistema de vector y se clonan una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de interés en el vector del banco, se pueden generar una diversidad en el interior de las moléculas clonadas acometiendo la mutagénesis antes de la expresión; alternativamente, pueden expresarse las proteínas codificadas y seleccionarse, como se describió anteriormente, antes de realizar la mutagénesis y las rondas de selección adicionales. La mutagénesis de las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos estructuralmente optimizados se realiza por métodos moleculares normalizados. De particular utilización en la reacción en cadena de polimerasa, o PCR, (Mullis y Faloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335, incorporada a la presente memoria como referencia). La PCR, que utiliza múltiples ciclos de replicación de ADN catalizados por una ADN polimerasa dependiente del ADN, termoestable para ampliar la secuencia diana de interés, es bien conocida en la materia. La construcción de varios bancos de anticuerpos se ha expuesto en Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, y referencias citadas en la presente memoria.

La PCR se realiza utilizando la plantilla de ADN (por lo menos 1 fg; más útilmente, 1 a 1.000 ng) y por lo menos 25 pmoles de cebadores de oligonucleótido; puede ser ventajosa la utilización de una cantidad mayor de cebador cuando el grupo cebador sea heterogéneo en exceso, ya que cada secuencia está representada solamente por una pequeña fracción de las moléculas del grupo, y las cantidades se vuelven limitativas en los ciclos de ampliación posteriores. Una mezcla de reacción típica incluye: 2 \mul de ADN, 25 pmoles de cebador oligonucleotídico, 2,5 \mul de 10\times tampón 1 de PCR (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0,4 \mul de dNTP 1,25 \muM, 0,15 \mul (o 2,5 unidades) de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer, Foster City, CA) y agua desionizada hasta un volumen total de 25 \mul. Se cubre con una capa de aceite mineral y se realiza la PCR utilizando un ciclador térmico programable. La longitud y temperatura de cada etapa de un ciclo PCR, así como el número de ciclos, se ajusta de acuerdo con los requisitos de severidad en el efecto. La temperatura y el programa de hibridación se determinan ambos por la eficacia con la que es de esperar que se hibride el cebador a una plantilla y el grado de compatibilidad que debe tolerarse; obviamente, cuando las moléculas de ácido nucleico se amplían simultáneamente y se mutagenizan, se requiere compatibilidad, por lo menos en la primera ronda de la síntesis. La capacidad para optimizar la severidad de las condiciones de hibridación del cebador está dentro de los conocimientos de un experto moderado en la materia. Se utiliza una temperatura de hibridación comprendida entre 30ºC y 72ºC. La desnaturalización inicial de las moléculas de la plantilla normalmente tiene lugar a una temperatura comprendida entre 92ºC y 99ºC durante 4 minutos, seguida de 20 a 40 ciclos consistentes en la desnaturalización (94 a 99ºC durante 15 segundos a 1 minuto), hibridación (temperatura determinada como se expuso anteriormente; 1 a 2 minutos) y ampliación (72ºC durante 1 a 5 minutos, dependiendo de la longitud del producto ampliado). La ampliación final es generalmente de 4 minutos a 72ºC y puede ser seguida por una etapa indefinida (0 a 24 horas) a 4ºC.

C. Combinación de dominios variables individuales

Los dominios útiles en la invención, una vez seleccionados, pueden combinarse mediante una variedad de métodos conocidos en la materia, incluyendo métodos covalentes y no covalentes.

Los métodos preferidos comprenden la utilización de enlazadores polipeptídicos, como los descritos, por ejemplo, en relación con las moléculas scFV (Bird et al., (1988) Science 242: 423-426). La exposición de los enlazadores adecuados se proporciona en Bird et al., Science 242, 423-426; Hudson et al., Journal Immunol. Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883. Los enlazadores son preferentemente flexibles, permitiendo que interactúen los dos dominios individuales. Un ejemplo de enlazador es un enlazador (Gly_{4} Ser)_{n}, en el que n=1 a 8, p. ej., 2, 3, 4, 5 ó 7. Pueden emplearse también los enlazadores utilizados en diacuerpos, que son menos flexibles, (Holliger et al. (1993) PNAS (USA) 90: 6444-6448).

En una forma de realización, el enlazador empleado no es una región bisagra de inmunoglobulina.

Pueden combinarse dominios variables utilizando otros métodos aparte de los enlazadores. Por ejemplo, la utilización de puentes disulfuro, provistos de restos de cisteína naturales o modificados genéticamente, puede aprovecharse para estabilizar dímeros V_{H}-V_{H}, V_{L}-V_{L} o V_{H}-V_{L} (Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7:697-704) o remodelando la interfase entre los dominios variables para aprovechar el "ataque" y por lo tanto la estabilidad de la interacción (Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788).

Pueden emplearse de forma apropiada otras técnicas para unir o estabilizar dominios variables de inmunoglobulinas, y en particular dominios V_{H} de anticuerpos.

Según la presente invención, los ligandos doble-específicos pueden estar en conformaciones "cerradas" en solución. Una configuración "cerrada" es aquella en la que los dos dominios (por ejemplo V_{H} y V_{L}) están presentes en forma asociada, tal como la de un par V_{H}-V_{L} asociado que forma un sitio de fijación al anticuerpo. Por ejemplo, scFv puede estar en una conformación cerrada, dependiendo del ordenamiento del enlazador utilizado para unir los dominios V_{H} y V_{L}. Si éste es suficientemente flexible para permitir que se asocien los dominios, o mantenerlos rígidamente en la posición asociada, es probable que los dominios adopten una conformación cerrada.

Asimismo, los pares del dominio V_{H} y los pares del dominio V_{L} pueden existir en una conformación cerrada. Generalmente ésta será una función de la asociación cerrada de los dominios, tal como mediante un enlazador rígido, en la molécula de ligando. Los ligandos en una conformación cerrada serán incapaces de unirse a la molécula que prolonga la vida media del ligando y a una segunda molécula diana. Por lo tanto, el ligando típicamente se unirá solamente a la segunda molécula diana en la disociación de la molécula que aumenta la vida media del ligando.

Además, la construcción de dímeros V_{H}/V_{H}, V_{L}/V_{L} o V_{H}/V_{L} sin enlazadores proporciona competencia entre los dominios.

Los ligandos según la invención pueden además estar en una conformación abierta, en dicha conformación, los ligandos serán capaces de unirse simultáneamente a la molécula que prolonga la vida media del ligando y a la segunda molécula diana. Típicamente, los dominios variables en una configuración abierta se mantienen (en el caso de los pares V_{H}-V_{L}) lo suficientemente aparte para que los dominios no interactúen y formen un sitio de fijación del anticuerpo y no compitan para unirse a sus respectivos epítopos. En el caso de los dimeros V_{H}/V_{H} o V_{L}/V_{L}, los dominios no están forzados conjuntamente por enlazadores rígidos. Naturalmente, dichos emparejamientos de dominios no competirán para la fijación del antígeno o para formar un sitio de fijación al anticuerpo.

Los fragmentos Fab y los anticuerpos completos existirán principalmente en conformación cerrada, aunque se apreciará que los ligandos doble-específicos abiertos y cerrados es probable que existan en una variedad de equilibrios en diferentes circunstancias. La fijación del ligando a una diana es probable que desplace el equilibrio hacia la configuración abierta. Por lo tanto, determinados ligandos según la invención pueden existir en dos conformaciones en solución, una de las cuales (la forma abierta) puede unir dos antígenos o epítopos independientemente, mientras que la conformación alternativa (forma cerrada) puede unir solamente un antígeno o epítopo; los antígenos o epítopos por lo tanto compiten para unirse al ligando en esta conformación.

Aunque la forma abierta del ligando doble-específico puede pues existir en equilibrio con la forma cerrada en solución, se contempla que el equilibrio favorezca la forma cerrada; además, la forma abierta puede ser secuestrada por la diana que se une en una conformación cerrada. Preferentemente, por consiguiente, determinados ligandos doble-específicos de la invención están presentes en un equilibrio entre dos conformaciones (abierta y cerrada).

Los ligandos doble-específicos según la invención pueden modificarse para favorecer una conformación abierta o cerrada. Por ejemplo, la estabilización de las interacciones V_{H}-V_{L} con enlaces disulfuro estabiliza la conformación cerrada. Además, pueden construirse los enlazadores utilizados para unir los dominios, incluyendo los pares del dominio V_{H} y del dominio V_{L}, de modo que la forma abierta esté favorecida; por ejemplo, los enlazadores pueden impedir estéricamente la asociación de los dominios, como por ejemplo por incorporación de restos de aminoácidos grandes en posiciones oportunas o el diseño de una estructura rígida adecuada que mantenga los dominios físicamente
espaciados.

D. Caracterización del ligando doble-específico

La fijación del ligando doble-específico a sus antígenos o epítopos específicos puede probarse por métodos que serán habituales para los expertos en la materia e incluyen ELISA. En una forma de realización preferida de la invención la fijación se prueba utilizando ELISA del fago monoclonal.

El ELISA del fago puede realizarse según cualquier procedimiento adecuado: a continuación se indica un protocolo a título de ejemplo.

Las poblaciones de fago producidas en cada ronda de selección pueden identificarse por ELISA por fijación al antígeno o epítopo seleccionado, para identificar anticuerpos de fago "policlonales". El fago de colonias bacterianas individuales infectadas de estas poblaciones puede cribarse por ELISA para identificar anticuerpos de fago "monoclonales". Es también deseable identificar fragmentos de anticuerpo solubles para la fijación al antígeno o epítopo, y esto puede acometerse también por ELISA utilizando reactivos, por ejemplo, contra una etiqueta con terminal C o N (véase por ejemplo Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 y referencias citadas en la presente
memoria).

La variedad de anticuerpos monoclonales del fago seleccionados puede evaluarse también por electroforesis en gel de los productos de la PCR (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), sondado (Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) o por secuenciado del ADN del vector.

E. Estructura de los "ligandos doble-específicos"

Como se describió anteriormente, un anticuerpo se define en la presente memoria como un anticuerpo (por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgA, IgE) o fragmento (Fab, Fv, Fv ligado a disulfuro, scFv, diacuerpo) que comprende por lo menos un dominio variable con cadena pesada y ligera, por lo menos dos dominios variables con cadena pesada o por lo menos dos dominios variables con cadena ligera. Puede derivarse por lo menos parcialmente de cualquier especie natural que produzca un anticuerpo o crearse mediante tecnología de ADN recombinante; tanto si se aísla del suero, linfocitos B, hibridomas, transfectomas, levaduras o bacterias.

En una forma de realización preferida de la invención el ligando doble-específico comprende por lo menos un dominio variable con cadena pesada individual de un anticuerpo y un dominio variable con cadena ligera individual de un anticuerpo, o dos dominios variables con cadena pesada y ligera individuales. Por ejemplo, el ligando puede comprender un par V_{H}/V_{L}, un par de dominios V_{H} o un par de dominios V_{L}.

El primer y el segundo dominios variables de dicho ligando pueden estar en la misma cadena polipeptídica. Alternativamente pueden estar en cadenas polipeptídicas separadas. En el caso en que estén en la misma cadena polipeptídica pueden estar ligados por un enlazador, que es preferentemente una secuencia peptídica, descrita anterior-
mente.

El primer y segundo dominios variables pueden estar asociados por enlace covalente o no covalente. En caso de que estén asociados por enlace covalente, los enlaces covalentes pueden ser enlaces disulfuro.

En caso de que los dominios variables se seleccionen de los repertorios del gen V, por ejemplo utilizando una tecnología de presentación del fago como se describió en la presente memoria, entonces estos dominios variables comprenden una región de armazón universal, de modo que pueden ser reconocidos por un ligando genérico específico como se define en la presente memoria. La utilización de armazones universales, ligandos genéricos y similares se describe en el documento WO 99/20749.

Cuando se utilizan repertorios del gen V la variación en la secuencia polipeptídica se sitúa preferentemente en los núcleos estructurales de los dominios variables. Las secuencias polipeptídicas de dominio variable pueden alterarse por desorden del ADN o por mutación a fin de aumentar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. El desorden del ADN es conocido en la materia y dado a conocer, por ejemplo, por Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 y en la patente U.S. nº 6.297.053, ambas de las cuales se incorporan a la presente memoria como referencia. Otros métodos de mutagénesis son bien conocidos por los expertos en la materia.

En una forma de realización preferida de la invención, el "ligando doble-específico" es un fragmento Fv con cadena individual. En una forma de realización alternativa de la invención, el "ligando doble-específico" consiste en un formato Fab.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica por lo menos a un "ligando doble-específico" como se define en la presente memoria.

Un experto en la materia apreciará que, dependiendo del aspecto de la invención, tanto los antígenos como los epítopos pueden unirse simultáneamente a la misma molécula de anticuerpo. Alternativamente, pueden competir para la fijación de la misma molécula de anticuerpo. Por ejemplo, cuando ambos epítopos se unen simultáneamente, ambos dominios variables de un ligando doble-específico son capaces de unirse independientemente a sus epítopos diana. Cuando los dominios compiten, el dominio variable es capaz de unirse a su diana, pero no al mismo tiempo que el otro dominio variable se une a su diana homóloga; o el primer dominio variable es capaz de unirse a su diana, pero no al mismo tiempo que el segundo dominio variable se une a su diana homóloga.

Las regiones variables pueden proceder de anticuerpos dirigidos contra antígenos o epítopos diana. Alternativamente pueden proceder de un repertorio de dominios de anticuerpo individuales tales como los expresados sobre la superficie del bacteriófago filamentoso. La selección puede realizarse como se describe a continuación.

En general, las moléculas de ácido nucleico y los montajes del vector requeridos para la realización de la presente invención pueden montarse y manipularse como se indica en los manuales de laboratorio ordinarios, tal como Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA.

La manipulación de los ácidos nucleicos útiles en la presente invención se realiza normalmente en vectores recombinantes.

Por lo tanto en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende ácido nucleico que codifica por lo menos un "ligando doble-específico" como se define en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, vector se refiere a un elemento discreto que se utiliza para introducir ADN heterólogo en las células para la expresión y/o replicación del mismo. Los métodos mediante los cuales se selecciona o se construye y, posteriormente, se utilizan dichos vectores son bien conocidos por los expertos en la materia. Numerosos vectores están disponibles públicamente, incluyendo plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episómicos. Dichos vectores pueden utilizarse para la clonación simple y la mutagénesis. Alternativamente se emplea el vector de expresión génica. Un vector de utilización según la invención puede seleccionarse para acomodar una secuencia de codificación del polipéptido de un tamaño deseado, típicamente de 0,25 kilobases (kb) a 40 kb o más de longitud. Una célula huésped adecuada se transforma con el vector tras las manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene varios componentes operativos, que generalmente comprenden un punto de clonación (o "polienlazador"), un origen de replicación y por lo menos un gen marcador seleccionable. Si el vector dado es un vector de expresión, posee además uno o más de los siguientes elementos: elemento potenciador, activador, terminación de la transcripción y secuencias señal, cada uno colocado en la proximidad del centro de clonación, de modo que están operativamente ligados al gen que codifica un ligando según la
invención.

Los vectores tanto de clonación como de expresión contienen secuencias de ácido nucleico que permiten al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Típicamente, en los vectores de clonación, esta secuencia es la que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye los orígenes de replicación o las secuencias de replicación de manera autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus.

El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido de 2 micras es adecuado para las levaduras y varios orígenes víricos (p. ej. SV 40, adenovirus) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente, el origen de la replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos a menos que se utilicen en células de mamífero capaces de replicar concentraciones elevadas de ADN, tales como las células COS.

Un vector de clonación o de expresión puede contener de manera ventajosa un gen de selección denominado también marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el cultivo de células huésped transformadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán por consiguiente en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan insuficiencias auxótrofas o suministran nutrientes críticos no disponibles en el medio de cultivo.

Ya que la replicación de los vectores que codifican un ligando según la presente invención se realiza más convenientemente en E. coli, se utiliza un marcador seleccionable de E. coli, por ejemplo, el gen de \beta-lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Éstos pueden obtenerse de los plásmidos de E. coli, tal como el pBR322 o un plásmido pUC tal como el pUC18 o pUC19.

Los vectores de expresión contienen habitualmente un activador que es reconocido por el organismo anfitrión y se une operativamente a la secuencia de codificación de interés. Dicho activador puede ser inducible o constitutivo. La expresión "operativamente ligado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una secuencia de referencia "operativamente ligada" a una secuencia de codificación está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de referencia.

Para su utilización con anfitriones procarióticos los activadores adecuados incluyen, por ejemplo, los sistemas activadores de \beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema activador de triptófano (trp) y activadores híbridos tales como el activador tac. Para su utilización en sistemas bacterianos los activadores generalmente contendrán también una secuencia Shine-Delgarno operativamente ligada a la secuencia de codificación.

Los vectores preferidos son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos que corresponde a un elemento del banco de polipéptidos. Por lo tanto, la selección con el primer y/o segundo antígeno o epítopo puede realizarse por propagación y expresión independientes de un único clon que expresa el elemento del banco de polipéptidos o mediante la utilización de cualquier sistema de presentación de la selección. Como se describió anteriormente, el sistema de presentación de la selección preferido es la presentación del bacteriófago. Por lo tanto, pueden utilizarse vectores de fago o fagómidos, p. ej. pIT1 o pIT2. Las secuencia principales útiles en la invención incluyen peIB, stII, ompA, phoA, bla y pelA. Un ejemplo son los vectores de fagómido que presentan un origen de replicación del E. coli (para la replicación de la doble cadena) y también un origen de replicación del fago (para la producción del ADN de una sola cadena). La manipulación y la expresión de dichos vectores es bien conocida en la materia (Hoogenboom y Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). En resumen, el vector contiene un gen de \beta-lactamasa que confiere selectividad al fagómido y un activador lac corriente arriba de una casete de expresión que consta (terminal N a C) de una secuencia principal pelB (que dirige el polipéptido expresado al espacio periplásmico), un punto de clonación múltiple (para clonar la versión nucleotídica del elemento del banco), opcionalmente, una o más etiquetas peptídicas (para detección), opcionalmente, uno más codones de terminación TAG y la proteína pIII del fago. Por lo tanto, utilizando varias cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, isopropil tio-\beta-D-galactósido (IPTG) o un fago auxiliar, tal como VCS M13, el vector es capaz de replicar como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades del elemento del banco de polipéptidos únicamente o producir fagos, algunos de los cuales contienen por lo menos una copia de la fusión polipéptido-pIII en su superficie.

La construcción de vectores que codifican ligandos según la invención emplean técnicas de ligadura convencionales. Los vectores aislados o los fragmentos de ADN se escinden, se adaptan y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea, el análisis para confirmar que las secuencias correctas están presentes en el vector construido pueden realizarse de un modo conocido. Los métodos adecuados para construir los vectores de expresión, preparando transcritos in vitro, introduciendo ADN en las células huésped y realizando análisis para evaluar la expresión y la función son conocidos por los expertos en la materia. La presencia de una secuencia génica en una muestra es detectada, o su ampliación y/o expresión cuantificada por métodos convencionales, tales como los análisis de Southern o Northern, transferencia Western, transferencia de manchas de ADN, ARN o proteína, hibridación in situ, inmunocitoquímica o análisis de secuencias de moléculas de ácido nucleico o de proteína. Resultará fácilmente evidente para los expertos en la materia cómo pueden modificarse estos métodos, si se desea.

Estructura de ligandos multiespecíficos de conformación cerrada

Según un aspecto de la presente invención, los dos o más dominios de fijación del epítopo no complementarios se unen de modo que están en una conformación cerrada como se definió en la presente memoria. Pueden estar unidos además, de manera ventajosa, a una estructura que puede facilitar, como alternativa o además de un enlazador descrito en la presente memoria, la formación y/o mantenimiento de la conformación cerrada de los sitios de fijación al epítopo con respecto uno al otro.

(I) Armazones

Los armazones pueden basarse en moléculas de inmunoglobulina o pueden ser distintas de inmunoglobulina en origen como se indicó anteriormente. Los armazones de inmunoglobulinas preferidas tal como se define en la presente memoria incluyen alguno o más de los seleccionados de entre los siguientes: una molécula de inmunoglobulina que comprende por lo menos (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1, CH2 y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo; o cualquiera de los subconjuntos (ii) juntamente con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. El dominio de la región bisagra puede estar también incluido. Dichas combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, simular anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM, o fragmentos de los mismos, tales como las moléculas de Fv, scFv, Fab o F(ab')_{2}. Los expertos en la materia podrán apreciar que no se pretende que esta lista sea exhaustiva.

(II) Soportes de proteínas

Cada dominio de fijación al epítopo comprende un soporte de proteínas y uno o más CDR que están implicados en la interacción específica del dominio con uno o más epítopos. De manera ventajosa, un dominio de fijación al epítopo según la presente invención comprende tres CDR. Los soportes de proteínas adecuados incluyen cualquiera de los seleccionados de entre el grupo constituido por los siguientes: los basados en dominios de inmunoglobulina, los basados en fibronectina, los basados en afficuerpos, los basados en CTLA4, los basados en chaperonas tales como GroEL, los basados en lipocallina y los basados en los receptores bacterianos SpA y SpD de Fc. Los expertos en la materia apreciarán que no se pretende que esta lista sea exhaustiva.

F. Soportes para su utilización en la construcción de ligandos doble-específicos i. Selección de la conformación de la cadena principal

Todos los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas comparten un plegamiento similar para su cadena polipeptídica. Por ejemplo, aunque los anticuerpos son muy diferentes desde el punto de vista de su secuencia primaria, la comparación de las secuencias y estructuras cristalográficas ha puesto de manifiesto que al contrario de lo esperado, cinco de los seis bucles de fijación al antígeno de anticuerpos (H1, H2, L1, L2 y L3) adoptan un número limitado de conformaciones de la cadena principal o de estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). El análisis de las longitudes del bucle y de los restos clave ha permitido por consiguiente la predicción de las conformaciones de la cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 localizadas en la mayoría de los anticuerpos humanos (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa desde el punto de vista de la secuencia, longitud y estructura (debido a la utilización de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de la cadena principal para las longitudes de bucle corto que dependen de la longitud y la presencia de restos determinados, o tipos de resto, en posiciones clave en el bucle y el armazón del anticuerpo (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).

Los ligandos doble-específicos de la presente invención se montan de manera ventajosa en bancos de dominios, como por ejemplo bancos de dominios V_{H} y/o bancos de dominios V_{L}. Además, los ligandos doble-específicos de la invención pueden proporcionarse en forma de bancos. En un aspecto de la presente invención, se diseñan bancos de ligandos y/o dominios específicos dobles en los que determinadas longitudes de bucle y restos clave se han seleccionado para asegurar que se conoce la conformación de la cadena principal de los elementos. Estas conformaciones reales de moléculas de la superfamilia de la inmunoglobulina encontradas en la naturaleza, de manera ventajosa, minimizan las probabilidades de que sean no operativas, como se expuso anteriormente. Los segmentos del gen V de la línea germinal sirven de armazón básico adecuado para construir bancos de anticuerpos o de receptor de linfocitos T; también son útiles otras secuencias. Pueden producirse variaciones con baja frecuencia, de modo que un pequeño número de elementos operativos pueden poseer una conformación con cadena principal alterada, que no afecte su función.

La teoría de la estructura canónica se utiliza también para evaluar las numerosas conformaciones diferentes de la cadena principal codificadas por ligandos, para predecir la conformación de la cadena principal basada en secuencias de ligando y para seleccionar restos para la diversificación que no afectan la estructura canónica. Es sabido que, en el dominio V_{\kappa} humano, el bucle L1 puede adoptar una de las cuatro estructuras canónicas, el bucle L2 presenta una única estructura canónica y el 90% de los dominios V_{\kappa} humanos adoptan una de las cuatro o cinco estructuras canónicas del bucle L3 (Tomlinson et al. (1995) supra); por lo tanto, en el dominio V_{\kappa} solo, pueden combinarse las estructuras canónicas diferentes para crear un intervalo de conformaciones diferentes de la cadena principal. Dado que el dominio V_{\lambda} codifica un intervalo diferente de estructuras canónicas para los bucles L1, L2 y L3 y que los dominios V_{\kappa} y V_{\lambda} pueden emparejarse con cualquier dominio V_{H} que puede codificar varias estructuras canónicas para los bucles H1 y H2, el número de combinaciones de la estructura canónica observados para estos cinco bucles es muy grande. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de la cadena principal puede ser esencial para la producción de un amplio intervalo de especificidades de unión. Sin embargo, al construir un banco de anticuerpos basado en una conformación única con cadena principal conocida se ha observado, al contrario de lo esperado, que no se necesita la diversidad en la conformación de la cadena principal para generar diversidad suficiente para dirigir sustancialmente todos los antígenos. Aun más sorprendentemente, la conformación de la cadena principal única no necesita ser una estructura de consenso, puede utilizarse una conformación natural única como base para un banco completo. Por lo tanto, en un aspecto preferido, los ligandos doble-específicos de la invención poseen una conformación única con cadena principal conocida.

La conformación única con cadena principal que se selecciona es preferentemente común entre las moléculas del tipo de la superfamilia de la inmunoglobulina en cuestión. Una conformación es común cuando se observan que un número significativo de moléculas naturales la adoptan. Por consiguiente, en un aspecto preferido de la invención, la aparición natural de las diferentes conformaciones de la cadena principal para cada bucle de fijación de un dominio de inmunoglobulina se considera independientemente y cuando se selecciona un dominio variable natural que posee la combinación deseada de las conformaciones de la cadena principal para los diferentes bucles. Si ninguna está disponible, puede seleccionarse la equivalente más próxima. Es preferible que la combinación deseada de las conformaciones de la cadena principal para los bucles diferentes se cree seleccionando los segmentos del gen de la línea germinal que codifican las conformaciones de la cadena principal deseadas. Es más preferible que los segmentos génicos de la línea germinal seleccionados se expresen frecuentemente en la naturaleza, y lo más preferible es que sean los más frecuentemente expresados de todos los segmentos génicos naturales de la línea germinal.

En el diseño de sus ligandos o bancos específicos dobles puede considerarse independientemente la frecuencia de las diferentes conformaciones de la cadena principal para cada uno de los seis bucles de fijación al antígeno. Para H1, H2, L1, L2 y L3, se selecciona una conformación dada que se adopta entre el 20 y el 30% de los bucles de fijación al antígeno de las moléculas naturales. Típicamente, su frecuencia observada es superior al 35% (es decir, entre el 35% y el 100%) y, teóricamente, superior al 50% o incluso superior al 65%. Ya que la inmensa mayoría de bucles H3 no presentan estructuras canónicas, es preferible seleccionar una conformación con cadena principal que sea común entre los bucles que no presentan estructuras canónicas. Para cada uno de los bucles, se selecciona por consiguiente la conformación que se observa más a menudo en el repertorio natural. En los anticuerpos humanos, las estructuras canónicas (CS) más populares para cada bucle son las siguientes: H1 - CS 1 (79% del repertorio expresado), H2 - CS 3 (46%), L1 - CS 2 de V_{\kappa} (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 - CS 1 de V_{\kappa} (36%) (el cálculo supone una relación \kappa:\lambda de 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Para los bucles H3 que presentan estructuras canónicas, una longitud CDR3 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services) de siete restos con un puente salino desde el resto 94 al resto 101 parece ser la más frecuente. Existen por lo menos 16 secuencias de anticuerpos humanas en el banco de datos EMBL con la longitud de H3 requerida y restos clave que forman esta conformación y por lo menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de la proteína que pueden utilizarse como bases para el modelado del anticuerpo (2cgr y 1tet). Los segmentos génicos de la línea germinal expresados más frecuentemente que esta combinación de estructuras canónicas son el segmento 3-23 de V_{H} (DP-47), el segmento JH4b de J_{H}, el segmento O2/O12 de V_{\kappa} (DPK9) y el segmento J_{\kappa}1 de J_{\kappa}. Los segmentos de DP45 y DP38 de V_{H} son también adecuados. Estos segmentos pueden utilizarse por consiguiente en combinación como base para construir un banco con la conformación con cadena principal única deseada.

Alternativamente, en lugar de seleccionar la conformación con cadena principal única basada en la aparición natural de las diferentes conformaciones con cadena principal para cada uno de los bucles de fijación en aislamiento, la aparición natural de combinaciones de las conformaciones de la cadena principal se utiliza como base para seleccionar la única conformación de la cadena principal. En el caso de los anticuerpos, por ejemplo, puede determinarse la aparición natural de combinaciones de la estructura canónica para cualquiera de los dos, tres, cuatro, cinco o para los seis bucles de fijación al antígeno. Aquí, es preferible que la conformación seleccionada sea común en los anticuerpos naturales y lo más preferible que se observe más frecuentemente en el repertorio natural. Por lo tanto, en los anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando se consideran las combinaciones naturales de los cinco bucles de fijación al antígeno, H1, H2, L1, L2 y L3, se determina la combinación más frecuente de estructuras canónicas y a continuación se combina con la conformación más popular para el bucle H3, como base para seleccionar la conformación única con cadena principal.

ii. Diversificación de la secuencia canónica

Una vez seleccionadas varias conformaciones de la cadena principal conocidas o, preferentemente una sola conformación de la cadena principal conocida, los ligandos doble-específicos según la invención o los bancos para su utilización en la invención pueden construirse variando el sitio de fijación de la molécula a fin de generar un repertorio con diversidad estructural y/u operativa. Esto significa que las variantes se generan de modo que poseen suficiente diversidad en su estructura y/o en su función de modo que son capaces de proporcionar una gama de actividades.

La diversidad deseada se genera de manera típica variando la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones que deben cambiarse pueden seleccionarse al azar o se seleccionan preferentemente. La variación puede conseguirse entonces por mezcla al azar, durante la cual el aminoácido residente se sustituye por cualquier aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, produciendo un gran número de variantes o sustituyendo el aminoácido residente por uno o más de entre un subconjunto definido de aminoácidos, produciendo un número más limitado de variantes.

Se han descrito varios métodos para introducir dicha diversidad. PCR propensa al error (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889), mutagénesis química (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) o cepas mutadoras bacterianas (Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359) pueden utilizarse para introducir mutaciones al azar en los genes que codifican la molécula. Los métodos para mutar posiciones seleccionadas son asimismo bien conocidos en la materia e incluyen la utilización de oligonucleótidos incompatibles y oligonucleótidos degenerados, con o sin la utilización de PCR. Por ejemplo, se han creado varios bancos de anticuerpos sintéticos dirigiendo mutaciones a los bucles de fijación al antígeno. La región H3 del Fab que se fija a la vacuna contra el tétanos humano se ha mezclado al azar para crear una gama de nuevas especificidades de fijación (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Se han agregado las regiones H3 y L3 aleatorias o semialeatorias a los segmentos génicos V de la línea germinal para producir grandes bancos con regiones de armazón no mutadas (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Dicha diversificación se ha ampliado para incluir algunos o todos los demás bucles de fijación al antígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, documento WO 97/08320, supra).

Dado que el mezclado al azar del bucle presenta potencial para crear aproximadamente más de 10^{15} estructuras para H3 solo y un número igualmente grande de variantes para los otros cinco bucles, no es factible utilizar la tecnología de transformación actual o incluso utilizar sistemas exentos de células para producir un banco que representa todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en uno de los bancos mayores construidos hasta la fecha, se generaron 6 \times 10^{10} anticuerpos diferentes, que es solamente una fracción de la diversidad potencial para un banco de este diseño (Griffiths et al., (1994) supra).

En una forma de realización preferida, solamente aquellos restos que están implicados directamente en la creación o modificación de la función deseada de la molécula están diversificados. Para muchas moléculas, la función consistirá en fijar una diana y por lo tanto la diversidad debería concentrarse en el centro de fijación a la diana, si bien impidiendo que cambien los restos que son cruciales para el empaquetamiento total de la molécula o para mantener la conformación de la cadena principal seleccionada.

Diversificación de la secuencia canónica según se aplica a dominios de anticuerpos

En el caso de los ligandos doble-específicos de anticuerpos, el sitio de fijación para la diana es lo más a menudo el sitio de fijación del antígeno. Por lo tanto, en un aspecto muy preferido, la invención proporciona bancos de o para el montaje de ligandos doble-específicos de anticuerpos en los que solamente se varían los restos en el sitio de fijación al antígeno. Estos restos son extremadamente heterogéneos en el repertorio de anticuerpos humanos y son conocidos al entrar en contacto en complejos anticuerpo/antígeno de alta resolución. Por ejemplo, en L2 es conocido que las posiciones 50 y 53 son heterogéneas en los anticuerpos naturales y se observan al entrar en contacto con el antígeno. En cambio, el método convencional habría consistido en diversificar todos los restos en la región determinante de complementariedad (CDR1) correspondiente definida por Kabat et al. (1991, supra), algunos de los siete restos comparados con los dos diversificados en el banco para su utilización según la invención. Esto representa una mejora significativa desde el punto de vista de su diversidad operativa requerida para crear una gama de especificidades de fijación al antígeno.

En la naturaleza, la diversidad de anticuerpos es el resultado de dos procesos: recombinación somática de los segmentos génicos V, D y J de la línea germinal para crear un repertorio principal natural (denominado diversidad de la línea germinal y de la unión) e hipermutación somática de los genes V reordenados resultantes. El análisis de las secuencias de anticuerpos humanos ha demostrado que la diversidad en el repertorio principal está centrada al centro del sitio de fijación al antígeno mientras que la hipermutación somática extiende la diversidad a regiones en la periferia del sitio de fijación al antígeno que están muy conservadas en el repertorio principal (véase Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813). Esta complementariedad se ha desarrollado probablemente como una estrategia eficaz para el espacio de la secuencia de búsqueda y, aunque aparentemente exclusiva para los anticuerpos, puede fácilmente aplicarse a otros repertorios de polipéptido. Los restos que se varían son un subconjunto de los que forman el sitio de fijación para la diana. Si se desea, subconjuntos diferentes (incluyendo la superposición) de restos en el sitio de fijación a la diana se diversifican en diferentes etapas durante la selección.

En el caso de un repertorio de anticuerpos, se crea un repertorio "natural" inicial en el que, algunos pero no todos, los restos en el sitio de fijación al antígeno se diversifican. Tal como se utiliza en la presente memoria, en este contexto, el término "natural" se refiere a moléculas de anticuerpo que presentan diana no predeterminada. Estas moléculas se parecen a las que son codificadas por los genes de inmunoglobulina de un individuo que no ha experimentado diversificación inmunitaria, como es el caso de los fetos y de individuos recién nacidos, cuyos sistemas inmunitarios no han sido todavía sometidos a una prueba de provocación mediante una amplia variedad de estímulos antigénicos. Este repertorio se selecciona a continuación frente a una gama de antígenos o epítopos. Si se requiere, puede introducirse a continuación más diversidad fuera de la región diversificada en el repertorio inicial. Este repertorio madurado puede seleccionarse para la función, especificidad o afinidad modificadas.

La invención proporciona dos repertorios naturales diferentes de dominios de fijación para la construcción de ligandos doble-específicos, o un banco natural de ligandos doble-específicos, en el que se varían alguno o todos los restos en el sitio de fijación al antígeno. El banco "primario" simula el repertorio primario natural, con diversidad restringida a los restos en el centro del sitio de fijación al antígeno que son variados en los segmentos génicos V de la línea germinal (diversidad de la línea germinal) o se diversifican durante el proceso de recombinación (diversidad de unión). Estos restos que están diversificados comprenden, pero no se limitan a, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 y L96. En el banco "somático", la diversidad está restringida a los restos que se diversifican durante el proceso de recombinación (diversidad de unión) o están muy somáticamente mutados. Los restos que están diversificados comprenden, pero no se limitan a: H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 y L96. Todos los restos enumerados anteriormente como adecuados para la diversificación de estos bancos son conocidos por entrar en contactos con uno o más complejos anticuerpo-antígeno. Dado que en ambos bancos, no todos los restos en el sitio de fijación del antígeno se varían, se incorpora una diversidad adicional durante la selección variando los restos que quedan, si se desea hacerlo así. Es evidente para un experto en la materia que cualquier subconjunto de cualquiera de estos restos (o de los restos adicionales que comprenden el sitio de fijación al antígeno) puede utilizarse para la diversificación inicial y/o posterior del sitio de fijación al antígeno.

En la construcción de bancos para su utilización en la invención, la diversificación de posiciones seleccionada se consigue típicamente en cuanto al ácido nucleico, alterando la secuencia de codificación que especifica la secuencia del polipéptido de modo que en esta posición puede incorporarse un número de posibles aminoácidos (los 20 o un subconjunto de los mismos). Utilizando la nomenclatura de la IUPAC, el codón más versátil es NNK, que codifica todos los aminoácidos así como el codón de terminación TAG. El codón NNK se utiliza preferentemente para introducir la diversidad requerida. Se utilizan también otros codones que consiguen los mismos fines, incluyendo el codón NNN, que conduce a la producción de los codones de terminación TGA y TAA adicionales.

Una característica de la diversidad con cadenas laterales en el sitio de fijación al antígeno de anticuerpos humanos es un sesgo pronunciado que favorece determinados restos de aminoácidos. Si se suma la composición de los aminoácidos de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones V_{H}, V_{\kappa} y V_{\lambda}, más del 76% de la diversidad de la cadena lateral procede solamente de siete restos diferentes, siendo éstos, serina (24%), tirosina (14%), asparagina (11%), glicina (9%), alanina (7%), aspartato (6%) y treonina (6%). Este sesgo hacia los restos hidrófilos y pequeños restos que pueden proporcionar flexibilidad a la cadena principal refleja probablemente la evolución de las superficies que están predispuestas a unirse a una gama amplia de antígenos o epítopos y puede ayudar a explicar la promiscuidad de anticuerpos requerida en el repertorio principal.

Dado que es preferible simular esta distribución de aminoácidos, la distribución de aminoácidos en las posiciones que deben variarse preferentemente simula que se observan en el sitio de fijación al antígeno de los anticuerpos. Dicho sesgo en la sustitución de los aminoácidos que permite la selección de determinados polipéptidos (no sólo polipéptidos de anticuerpo) frente a una gama de antígenos diana se aplica fácilmente a cualquier repertorio de polipéptidos. Existen varios métodos para sesgar la distribución de aminoácidos en la posición que debe variarse (incluyendo la utilización de mutagénesis de trinucleótidos, véase el documento WO 97/08320), de los cuales el método preferido, debido a la facilidad de la síntesis, es la utilización de codones degenerados convencionales. Comparando el perfil de aminoácido codificado por todas las combinaciones de codones degenerados (con simple, doble, triple y cuádruple degeneración en relaciones iguales en cada posición) con la utilización de aminoácidos naturales es posible calcular el codón más representativo. Los codones (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C y (AGT)(AGC)(CT), esto es, DVT, DVC y DVY, utilizando respectivamente la nomenclatura de la IUPAC, son los más próximos al perfil de aminoácido deseado: codifican el 22% de serina y 11% de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína. Preferentemente, por consi-
guiente, los bancos se construyen utilizando el codón DVT, DVC o DVY en cada una de las posiciones diversificadas.

G: Antígenos capaces de prolongar la vida media del ligando

Los antígenos específicos dobles según la invención, son capaces de unirse a una o más moléculas que pueden prolongar la vida media del ligando in vivo. Típicamente, dichas moléculas son polipéptidos que existen en la naturaleza in vivo y que resisten la degradación o eliminación por mecanismos endógenos que eliminan el material indeseable para el organismo. Por ejemplo, la molécula que prolonga la vida media del organismo puede seleccionarse de entre las siguientes:

Proteínas de la matriz extracelular: por ejemplo colágeno, lamininas, integrinas y fibronectina. Los colágenos son las proteínas principales de la matriz extracelular. Se conocen actualmente aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno, localizadas en diferentes partes del cuerpo, p. ej. colágeno de tipo I (totalizando el 90% del colágeno corporal) localizado en los huesos, piel, tendones, ligamentos, córnea, órganos internos o colágeno de tipo II localizado en los cartílagos, disco intervertebral, notocordio y humor vítreo del ojo.

Las proteínas localizadas en la sangre, incluyen:

Proteínas del plasma tales como la fibrina, \alpha-2 macroglobulina, albúmina del suero, fibrinógeno A, fibrinógeno B, proteína A amiloide del suero, heptaglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina y \beta-2-microglobulina;

Enzimas e inhibidores tales como plasminógeno, lisozima, cistatina C, alfa-1-antitripsina e inhibidor de la tripsina pancreática. El plasminógeno es el precursor inactivo de la serina proteasa plasmina de tipo tripsina. Se encuentra normalmente circulando en todo el torrente circulatorio. Cuando el plasminógeno se activa y se convierte en plasmina, despliega un potente dominio enzimático que disuelve las fibras de fibrinógenos que retienen las células sanguíneas en un coágulo sanguíneo. Esto se denomina fibrinólisis.

Proteínas del sistema inmunitario, tales como IgE, IgG e IgM.

Proteínas de transporte tales como la proteína de fijación al retinol, \alpha-1 microglobulina.

Defensinas tales como beta-defensina 1, defensinas 1, 2 y 3 neutrófilas.

Proteínas localizadas en la barrera sangre-cerebro o en los tejidos nerviosos, tales como el receptor de melanocortina, la mielina y el transportador de ascorbato.

Proteínas de fusión ligando-agente neurofarmacéutico específicas para el receptor de transferrina (véase el documento U.S. nº 5.977.307); receptor de células endoteliales capilares del cerebro, transferrina, receptor de transferrina, insulina, receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF 1), receptor del factor 2 de crecimiento similar a la insulina (IGF 2), receptor de insulina.

Proteínas localizadas en el riñón, tales como policistina, colágeno de tipo IV, transportador K1 de aniones orgánicos y antígeno de Heymann.

Proteínas localizadas en el hígado, por ejemplo la alcohol deshidrogenasa, G250.

: Factor X de coagulación de la sangre

: \alpha1 antitripsina

: HNF 1\alpha

Proteínas localizadas en los pulmones, tal como el componente secretor (que se une a IgA).

Proteínas localizadas en el corazón, por ejemplo HSP 27. Ésta está asociada a la miocardiopatía dilatada.

Proteínas localizadas en la piel, por ejemplo queratina.

Proteínas óseas específicas, tales como las proteínas óseas morfógenas (BMP) que son un subconjunto de la superfamilia del factor \beta de crecimiento transformante que presenta actividad osteógena. Los ejemplos comprenden BMP-2, -4, -5, -6, -7 (denominada también proteína osteógena (OP-1) y -8 (OP-2).

Proteínas tumorales específicas, incluyendo el antígeno del trofoblasto humano, el receptor de herceptina, el receptor del estrógeno, catepsinas, p. ej., catepsina B (localizada en el hígado y en el bazo).

Proteínas específicas de enfermedades, tales como los antígenos expresados solamente en los linfocitos T activados: incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocitos), ligando de osteoprotegerina (OPGL) véase Nature 402, 304-309; 1999, OX40 (miembro de la familia del receptor de TNF, expresado en linfocitos T activados y la única molécula del linfocito T coestimulante conocida por ser regulada por incremento específicamente en las células que producen el virus tipo-I de la leucemia de linfocitos T humanos (HTLV-I)). Véase J. Immunol. 1 jul. 2000; 165(1):263-70; metaloproteasas (asociadas a artritis/cánceres), incluyendo la Drosophila CG6512, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH murina; factores de crecimiento angiógenos, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), factor-a de crecimiento transformante (TGF a), factor alfa de la necrosis tumoral (TNF-\alpha), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento de la placenta (PIGF), midcina, factor-BB de crecimiento derivado de plaquetas de tipo medio (PDGF), fractalquina.

Proteínas del estrés (proteínas del choque térmico)

Las HSP se encuentran normalmente en el interior de las células. Cuando se encuentran en el exterior de las células, es un indicador de que una célula ha muerto y se esparce su contenido. Esta muerte celular no programada (necrosis) solo ocurre cuando como resultado del traumatismo, enfermedad o lesión y por lo tanto in vivo las HSP extracelulares desencadenan una respuesta del sistema inmunitario que combate la infección y la enfermedad. Un ligando doble-específico que se une a la HSP extracelular puede localizarse en un punto de la enfermedad.

Proteínas implicadas en el transporte de Fc

Receptor de Brambell (conocido también como FcRB)

Este receptor de Fc presenta dos funciones, las cuales son potencialmente útiles para su administración.

Las funciones son

(1): El transporte de IgG de la madre al niño a través de la placenta

(2): La protección de IgG de la degradación prolongando por esta razón su vida media en el suero de la IgG. Se cree que el receptor recicla la IgG del endosoma.

Véase Holliger et al., Nat. Biotechnol. Jul. de 1997; 15(7):632-6.

Los ligandos según la invención pueden diseñarse para que sean específicos para las dianas anteriores. Los ligandos según la invención pueden ser específicos para las dianas seleccionadas de entre las anteriores que son específicas para el tejido, permitiendo de este modo el direccionamiento específico al tejido del ligando doble-específico. Además, cuando el ligando o el monómero dAb se dirige al riñón o al hígado, este puede redireccionar el ligando o el monómero dAb a una serie de reacciones de eliminación alternativa in vivo (por ejemplo, el ligando puede ser dirigido lejos de la eliminación en el hígado a la eliminación en el riñón).

Las utilizaciones terapéuticas y profilácticas de los ligandos multiespecíficos preparados según la invención implican la administración de ligandos según la invención a un mamífero receptor, tal como un ser humano. La multiespecificidad puede permitir que los anticuerpos se unan a un antígeno polimérico con gran avidez. Los ligandos multiespecíficos pueden permitir la reticulación de dos antígenos, por ejemplo incorporando linfocitos T citotóxicos para mediar la destrucción de las líneas celulares del tumor.

En la presente solicitud, el término "prevención" implica la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a la administración de la composición después de un caso inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" implica la administración de la composición protectora una vez se han manifestado los síntomas de la enfermedad.

Están disponibles sistemas de modelo animal que pueden utilizarse para identificar la eficacia de los anticuerpos o de sus proteínas de fijación en la protección contra la enfermedad o en el tratamiento de ésta. Los métodos para la experimentación del lupus eritematoso diseminado (SLE) en ratones sensibles son conocidos en la materia (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New. Eng. J. Med., 299: 515). La miastemia grave (MG) se experimenta en ratones hembra SJL/J provocando la enfermedad con la proteína AchR soluble procedente de otra especie (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). La artritis es provocada en una cepa sensible de ratones mediante la inyección de colágeno de tipo II (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Se ha descrito un modelo mediante cuyo adyuvante se provoca la artritis en ratas sensibles mediante la inyección de proteína microbacteriana del choque térmico (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). La tiroiditis se provoca en los ratones mediante la administración de tiroglobulina según describe (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). La diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) se produce de forma natural o puede provocarse en determinas cepas de ratones tales como los descritos por Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113. EAE en ratón y rata sirve como modelo para MS en el hombre. En este modelo, se provoca la enfermedad de desemielinación mediante la administración de la proteína básica mielina (véase Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune y Stratton, Nueva York, págs. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478; y Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179).

Generalmente, los presentes ligandos se utilizarán en forma purificada junto con vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones acuosas o alcohólico/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo alguna solución salina y/o medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen la solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico y solución de Ringer lacteada. Adyuvantes adecuados fisiológicamente aceptables, si son necesarios para mantener un complejo polipeptídico en suspensión, pueden seleccionarse de entre espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.

Los vehículos intravenosos comprenden reabastecedores de fluido y nutrientes y reabastecedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer. Pueden estar también presentes conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición).

Los ligandos de la presente invención pueden utilizarse como composiciones administradas independientemente o junto con otros agentes. Estos pueden comprender varios fármacos inmunoterapéuticos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino, e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender "mezclas" de varios agentes citotóxicos u otros juntamente con los ligandos de la presente invención, o incluso combinaciones de ligandos según la presente invención con diferentes especificidades, tal como los ligandos seleccionados que utilizan diferentes antígenos o epítopos diana, estén o no agrupados antes de la administración.

La vía de administración de las composiciones farmacéuticas según la invención puede ser cualquiera de las conocidas frecuentemente por los expertos en la materia. Para la terapia, incluyendo sin limitación la inmunoterapia, sus ligandos seleccionados de la invención pueden administrarse a cualquier paciente según las técnicas habituales. La administración puede ser por cualquier medio apropiado, incluyendo por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, pulmonar, o también, de manera apropiada, mediante infusión directa con un catéter. La dosis y frecuencia de administración dependerá de la edad, sexo y estado del paciente, de la administración simultánea de otros fármacos, de las contraindicaciones y de otros parámetros que deben ser considerados por el médico.

Los ligandos de la presente invención pueden liofilizarse durante el almacenamiento y redisolverse en un vehículo adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con las inmunoglobulinas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y redisolución conocidas en la materia. Los expertos en la materia apreciarán que la liofilización y la redisolución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo (p. ej., con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a presentar mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de IgG) y estos niveles de utilización pueden tener que ajustarse hacia arriba para compensar.

Las composiciones que contienen los presentes ligandos o una mezcla de las mismas pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En determinadas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para realizar por lo menos la inhibición, supresión, modulación, destrucción parcial, o algunos otros parámetros mensurables, de una población de células seleccionadas se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades necesarias para conseguir esta dosis dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del sistema inmunitario del propio paciente, pero generalmente oscilan entre 0,005 y 5,0 mg de ligando, p. ej., anticuerpo, receptor (p. ej., un receptor de linfocitos T) o de su proteína de fijación por kilogramo de peso corporal, utilizándose más frecuentemente dosis de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis. Para las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes ligandos o sus mezclas pueden administrarse también en dosis similares o ligeramente inferiores.

El tratamiento realizado utilizando las composiciones descritas en la presente memoria se considera "eficaz" si se reducen uno o más síntomas (p. ej., en por lo menos el 10% o por lo menos un punto en una escala de evaluación clínica), en comparación con dichos síntomas presentes antes del tratamiento, o en comparación con dichos síntomas en un individuo (humano o modelo animal) no tratado con dicha composición. Los síntomas variarán obviamente dependiendo de la enfermedad o trastorno al que se refieren, pero pueden ser medidos por un médico o especialista experto. Dichos síntomas pueden medirse, por ejemplo, controlando la concentración de uno o más indicadores bioquímicos de la enfermedad o trastorno (concentraciones de una enzima o metabolito correlacionados con la enfermedad, número de células afectadas, etc.), controlando las manifestaciones físicas (p. ej., inflamación, tamaño del tumor, etc.) o mediante una escala de evaluación clínica aceptada, por ejemplo, la escala de estado de discapacidad ampliada (para la esclerosis múltiple), el cuestionario para la enfermedad inflamatoria de los intestinos de Irvine (la valoración de 32 puntos evalúa la calidad de vida con respecto a la función intestinal, síntomas generales, función social y estado emocional, intervalos de puntuación de 32 a 224, indicando las puntuaciones mayores una mejor calidad de vida), escala de calidad de vida para la artritis reumatoide u otras escalas de evaluación clínica aceptadas conocidas en este campo. Una reducción mantenida (p. ej., un día o más, preferentemente más) de los síntomas de la enfermedad o del trastorno en por lo menos el 10% o en uno o más puntos en una escala clínica dada es indicadora de tratamiento "eficaz". Asimismo, la profilaxis realizada que utiliza una composición descrita en la presente memoria es "eficaz" si el comienzo o gravedad de uno o más síntomas se retarda, reduce o elimina en comparación con dichos síntomas en un individuo similar (modelo humano o animal) no tratado con la composición.

Una composición que contiene un ligando o una mezcla de la misma según la presente invención puede utilizarse en instalaciones profilácticas y terapéuticas para ayudar a la alteración, inactivación, destrucción o eliminación de una población de células diana seleccionada en un mamífero. Además, los repertorios de polipéptidos seleccionados descritos en la presente memoria pueden utilizarse extracorporalmente o selectivamente in vitro para destruir, eliminar o eliminar de manera eficaz una población celular diana de una colección heterogénea de células. La sangre de un mamífero puede combinarse extracorporalmente con los ligandos, p. ej. anticuerpos, receptores de la superficie celular o proteínas de fijación de los mismos por lo cual las células indeseables se destruyen o se eliminan de la sangre para reintegrarla al mamífero según técnicas normalizadas.

I: Utilización de ligandos doble-específicos de prolongación de la vida media según la invención

Los ligandos doble-específicos según el método de la presente invención pueden emplearse en aplicaciones terapéuticas y profilácticas in vivo, aplicaciones para diagnóstico in vivo y similares.

Las utilizaciones terapéuticas y profilácticas de los ligandos doble-específicos preparados según la invención implican la administración de ligandos según la invención a un mamífero receptor, tal como el hombre. Los anticuerpos específicos dobles según la invención comprenden por lo menos una especificidad para una molécula que prolonga la vida media; una o más especificidades adicionales pueden dirigirse contra moléculas diana. Por ejemplo, una IgG específica doble puede ser específica para cuatro epítopos, uno de los cuales está en una molécula que prolonga la vida media. La especificidad doble puede permitir que los anticuerpos se unan al antígeno polimérico con gran avidez. Los anticuerpos específicos dobles pueden permitir la reticulación de dos antígenos, por ejemplo incorporando linfocitos T citotóxicos para mediar en la descripción de líneas celulares tumorales.

Sustancialmente los ligandos puros o sus proteínas de fijación, tales como los monómeros dAb, de por lo menos el 90 al 95% de homogeneidad se prefieren para la administración a un mamífero, y el 98 al 99% o más de homogeneidad es más preferida para las utilizaciones farmacéuticas especialmente cuando el mamífero es un ser humano. Una vez purificados, parcialmente o hasta su homogeneidad según se desee, los ligandos pueden ser utilizados para diagnóstico o terapia (incluyendo extracorporalmente) o en el desarrollo y ejecución de los procedimientos de análisis, tinciones inmunofluorescentes y similares (Lefkovite y Pernis, (1979 y 1981) Immunological Methods, volúmenes I y II, Academic Press, NY).

Los ligandos de la presente invención hallarán utilización normalmente en la prevención, supresión o tratamiento de estados inflamatorios, hipersensibilidad alérgica, cáncer, infección bacteriana o vírica y trastornos autoinmunitarios (que incluyen, pero no se limitan a, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso diseminado, enfermedad de Crohn y miastenia grave).

En la presente solicitud, el término "prevención" implica la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a la administración de la composición después de un caso inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" implica la administración de la composición protectora una vez se han manifestado los síntomas de la enfermedad.

Están disponibles sistemas de modelo animal que pueden utilizarse para identificar la eficacia de los ligandos doble-específicos en la protección contra la enfermedad o en el tratamiento de ésta. Los métodos para la experimentación del lupus eritematoso diseminado (SLE) en ratones sensibles son conocidos en la materia (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New. Eng. J. Med., 299: 515). La miastemia grave (MG) se experimenta en ratones hembra SJL/J provocando la enfermedad con la proteína AchR soluble procedente de otra especie (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). La artritis se provoca en una cepa sensible de ratones mediante la inyección de colágeno de tipo II (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Se ha descrito un modelo mediante cuyo adyuvante se provoca la artritis en ratas sensibles mediante la inyección de proteína microbacteriana del choque térmico (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). La tiroiditis se provoca en los ratones mediante la administración de tiroglobulina según describe (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). La diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) se produce de forma natural o puede provocarse en determinas cepas de ratones tales como los descritos por Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113. EAE en ratón y rata sirve como modelo para MS en el hombre. En este modelo, se provoca la enfermedad de desmielinación mediante la administración de la proteína básica mielina (véase Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune y Stratton, Nueva York, págs. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478; y Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179).

Los ligandos doble-específicos según la invención y los monómeros dAb capaces de fijarse a dianas extracelulares implicadas en la endocitosis (p. ej. Clatrina) permiten a los ligandos doble-específicos ser endocitosados, lo que permite otra especificidad capaz de unirse a una diana intracelular para ser liberada en un medio intracelular. Esta estrategia requiere un ligando doble-específico con propiedades físicas que permitan mantenerlo operativo en el interior de la célula. Alternativamente, si el destino final del compartimento intracelular es la oxidación, puede que no se necesite que un ligando bien plegado esté exento de disulfuro.

Generalmente, los presentes ligandos se utilizarán en forma purificada junto con vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones acuosas o alcohólico/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo alguna solución salina y/o medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen la solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico y solución de Ringer lacteada. Si son necesarios adyuvantes adecuados fisiológicamente aceptables, para mantener un complejo polipeptídico en suspensión, pueden seleccionarse de entre espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.

Los ligandos de la presente invención pueden utilizarse como composiciones administradas independientemente o junto con otros agentes. Estos pueden comprender varios fármacos inmunoterapéuticos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino, e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender "mezclas" de varios agentes citotóxicos u otros juntamente con los ligandos de la presente invención.

La vía de administración de las composiciones farmacéuticas según la invención puede ser cualquiera de las conocidas habitualmente por los expertos en la materia. Para la terapia, incluyendo sin limitación la inmunoterapia, sus ligandos seleccionados de la invención pueden administrarse a cualquier paciente según las técnicas habituales. La administración puede ser por cualquier medio apropiado, incluyendo por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, pulmonar, o también, de manera apropiada, mediante infusión directa con un catéter. La dosis y frecuencia de administración dependerá de la edad, sexo y estado del paciente, de la administración simultánea de otros fármacos, de las contraindicaciones y de otros parámetros que deben ser tenidos en cuenta por el médico.

Los ligandos de la presente invención pueden liofilizarse durante el almacenamiento y redisolverse en un vehículo adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con las inmunoglobulinas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y redisolución conocidas en la materia. Los expertos en la materia apreciarán que la liofilización y la redisolución puedan conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo (p. ej., con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a presentar mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de IgG) y estos niveles de utilización pueden tener que ajustarse hacia arriba para compensar.

Las composiciones que contienen los presentes ligandos o una mezcla de las mismas pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En determinadas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para realizar por lo menos la inhibición, supresión, modulación, destrucción parcial, o algunos otros parámetros mensurables, de una población de células seleccionadas se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades necesarias para conseguir esta dosis dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del sistema inmunitario del propio paciente, pero generalmente oscilan entre 0,005 y 5,0 mg de ligando por kilogramo de peso corporal, utilizándose más frecuentemente dosis de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis. Para las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contie-
nen los presentes ligandos o sus mezclas pueden administrarse también en dosis similares o ligeramente inferiores.

Una composición que contiene un ligando o una mezcla de la misma según la presente invención puede utilizarse en instalaciones profilácticas y terapéuticas para ayudar a la alteración, inactivación, destrucción o eliminación de una población de células diana seleccionada en un mamífero.

Además, los repertorios de polipéptidos seleccionados descritos en la presente memoria pueden utilizarse extracorporalmente o selectivamente in vitro para destruir, eliminar o eliminar de manera eficaz una población celular diana de una colección heterogénea de células. La sangre de un mamífero puede combinarse extracorporalmente con los ligandos, p. ej. anticuerpos, receptores de la superficie celular o proteínas de fijación de los mismos por lo cual las células indeseables se destruyen o se eliminan de la sangre para reintegrarla al mamífero según técnicas normalizadas.

La invención se describe además, a título de ilustración únicamente, en los ejemplos siguientes. Como se utiliza en la presente memoria, en aras de la nomenclatura de dAb, el TNF\alpha humano se denomina TAR1 y el receptor de TNF\alpha humano (receptor p55) se denomina TAR2.

Ejemplo 1 Selección de un anticuerpo scFv específico doble (K8) dirigido contra la albúmina del suero humano (HSA) y la \beta-galactosidasa (\beta-gal)

Este ejemplo explica un método para preparar un anticuerpo específico doble dirigido contra \beta-gal y HSA en el que se selecciona un repertorio de dominios variables V_{\kappa} ligados a un dominio V_{H} de la línea germinal (ficticia) para fijarse a \beta-gal y se selecciona un repertorio de dominios variables V_{H} unidos a un dominio V_{\kappa} de la línea germinal (ficticia) para fijarse a HSA. Los dominios HSA de V_{H} y \beta-gal de V_{\kappa} variables seleccionados se combinan a continuación y se seleccionan los anticuerpos para fijarse a \beta-gal y HSA. HSA es una proteína que prolonga la vida media localizada en la sangre humana.

En este experimento se utilizaron cuatro bancos de anticuerpos de fago humano.

Banco 1	Línea germinal V_{\kappa} /DVT V_{H}	8,46 \times 10^{7}
Banco 2	Línea germinal V_{\kappa} /NNK V_{H}	9,64 \times 10^{7}
Banco 3	Línea germinal V_{H}/DVT V_{\kappa}	1,47 \times 10^{8}
Banco 4	Línea germinal V_{H}/NNK V_{\kappa}	1,45 \times 10^{8}

Todos los bancos se basan en un armazón humano individual para V_{H} (V3-23/DP47 y J_{H}4b) y V_{\kappa} (O12/O2/DP49 y J_{\kappa}1) con la diversidad de la cadena lateral incorporada a regiones determinantes de complementariedad (CDR2 y CDR3).

El banco 1 y el banco 2 contienen una secuencia V_{\kappa} ficticia, mientras que la secuencia de V_{H} se diversifica en las posiciones H50, H52, H52a, H53, H56, H58, H95, H96, H97 y H98 (DVT o NNK codificados, respectivamente) (Figura 1). El banco 3 y el banco 4 contienen una secuencia V_{H} ficticia, mientras que la secuencia de V_{\kappa} se diversifica en las posiciones L50, L52, L91, L92, L93, L94 y L96 (DVT o NNK codificados, respectivamente) (Figura 1). Los bancos están en formato de fagómido pIT2/ScFv (Figura 2) y se han preseleccionado para fijarse a ligandos genéricos, proteína A y proteína L, de modo que la mayoría de los clones en los bancos no seleccionados son operativos. Las dimensiones de los bancos presentados anteriormente corresponden a las dimensiones tras la preselección. El banco 1 y el banco 2 se mezclaron antes que las selecciones en el antígeno proporcionen un banco de V_{H} simple/V_{\kappa} ficticio y el banco 3 y el banco 4 se mezclaron para formar un banco V_{\kappa} simple /V_{H} ficticio.

Se realizaron tres rondas de selecciones en \beta-gal utilizando el banco V_{\kappa} /V_{H} ficticio y se realizaron tres rondas de selecciones en HSA utilizando el banco V_{H}/V_{\kappa} ficticio. En el caso de \beta-gal los títulos del fago estaban comprendidos entre 1,1 \times 10^{6} en la primera ronda y 2,0 \times 10^{8} en la tercera ronda. En el caso de HSA los títulos del fago estaban comprendidos entre 2 \times 10^{4} en la primera ronda y 1,4 \times 10^{9} en la tercera ronda. Las selecciones se realizaron como describe Griffith et al., (1993), excepto que se utilizó el fago auxiliar KM13 (que contiene una proteína pIII con una secuencia de escisión de proteasa entre los dominios D2 y D3) y el fago se eluyó con 1 mg/ml de tripsina en PBS. La adición de tripsina escinde las proteínas pIII procedentes del fago auxiliar (pero no las del fagómido) y eluye las fusiones scFv-fago unidas mediante la escisión en la etiqueta c-myc (Figura 2), proporcionando de este modo un enriquecimiento adicional para los fagos que expresan los scFv operativos y una reducción correspondiente del fondo (Kristensen y Winter, Folding & Design 3: 321-328, 9 jul., 1998). Se realizaron selecciones utilizando inmunotubos recubiertos con HSA o \beta-gal a una concentración de 100 \mug/ml.

Para comprobar el enlace, se cribaron 24 colonias de la tercera ronda de cada selección mediante ELISA del fago monoclonal. Se produjeron partículas de fago tal como describe Harrison et al., Methods Enzymol. 1996;267:83-109. Se recubrieron las placas de ELISA de 96 pocillos con 100 \mul de HSA o \beta-gal a una concentración de 10 \mug/ml en PBS durante la noche a 4ºC. Se siguió un protocolo ELISA estándar (Hoogenboom et al., 1991) utilizando la detección del fago unido con conjugado anti-M13-HRP. Una selección de clones proporcionó señales de ELISA mayores de 1,0 con 50 \mul de sobrenadante.

A continuación, se elaboraron preparaciones de ADN a partir del banco V_{H}/V_{\kappa} ficticio seleccionado en HSA y del banco V_{\kappa} /V_{H} ficticio en \beta-gal utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Para acceder a la mayor parte de la diversidad, se elaboraron preparaciones de ADN de cada una de las tres rondas de selecciones y a continuación se extrajeron de cada uno de los antígenos. Las preparaciones de ADN se digirieron a continuación con SalI/NotI durante la noche a 37ºC. Tras la purificación en gel de los fragmentos, las cadenas V_{\kappa} del banco V_{\kappa} /V_{H} ficticio seleccionadas en \beta-gal se ligaron en lugar de una cadena V_{\kappa} ficticia del banco V_{H}/V_{\kappa} ficticio seleccionado en HSA creando un banco de 3,3 \times 10^{9} clones.

Este banco se seleccionó a continuación en HSA (primera ronda) y \beta-gal (segunda ronda), las selecciones se realizaron como se describió anteriormente. En cada caso, después de la segunda ronda se probó la fijación de 48 clones a HSA y a \beta-gal por ELISA del fago monoclonal (como se describió anteriormente) y por ELISA de fragmentos de scFv solubles. Se produjeron fragmentos de anticuerpo solubles y se siguió el protocolo ELISA estándar, Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133, excepto que se utilizó Tween al 2%/PBS como tampón de bloqueo y se detectaron los scFv unidos con proteína L-HRP. Estos clones (E4, E5 y E8) procedentes de la selección HSA/\beta-gal y dos clones (K8 y K10) procedentes de la seleccion \beta-gal/HSA eran capaces de fijar ambos antígenos. Los scFv de estos clones se ampliaron por PCR y se secuenciaron tal como describe Ignatovich et al., (1999) J. Mol. Biol. 26 nov. 1999; 294(2):457-65, utilizando los cebadores LMB3 y pHENseq. El análisis de la secuencia puso de manifiesto que todos los clones eran idénticos. Por consiguiente, solamente se seleccionó un clon que codifica un anticuerpo específico doble (K8) para la investigación posterior (Figura 3).

Ejemplo 2 Caracterización de las propiedades de fijación del anticuerpo K8

En primer lugar, las propiedades de fijación del anticuerpo K8 se caracterizaron mediante ELISA de fago monoclonal. Se recubrieron placas de 96 pocillos con 100 \mul de HSA y \beta-gal junto con fosfatasa alcalina (APS), albúmina de suero bovino (BSA), aglutinina de cacahuete, lisozima y citocromo c (para comprobar la reactividad cruzada) a una concentración de 10 \mug/ml en PBS toda la noche a 4ºC. El fagómido del clon K8 se recuperó con KM13 tal como describe Harrison et al., (1996) y el sobrenadante (50 \mul) que contiene el fago se analizó directamente. Se siguió un protocolo del ELISA estándar (Hoogenboom et al., 1991) utilizando la detección del fago unido con conjugado anti-M13-HRP. Se observó que el anticuerpo K8 específico doble se une a HSA y a \beta-gal cuando se presenta en la superficie del fago con señales de absorbancia mayores de 1,0 (Figura 4). La fijación firme a BSA se observó también (Figura 4). Ya que HSA y BSA son 76% homólogas en cuanto a aminoácidos, no es sorprendente que el anticuerpo K8 reconozca estas proteínas estructuralmente relacionadas. Se detectó reactividad cruzada con otras proteínas
(Figura 4).

En segundo lugar, las propiedades de fijación del anticuerpo K8 se determinaron en un ELISA de scFv soluble. La producción del fragmento scFv soluble fue provocada por IPTG como describe Harrison et al., (1996). Para determinar los niveles de expresión de scFv de K8, se purificaron los fragmentos de anticuerpo solubles del sobrenadante de 50 \mul de inducciones que utilizan columnas con proteína A-sefarosa como describe Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor. Se determinó a continuación la DO_{280} y se calculó la concentración de proteínas como describe Sambrook et al., (1989). Se produjo scFv de K8 en el sobrenadante a razón de 19 mg/l.

Se realizó a continuación ELISA de scFv soluble utilizando concentraciones conocidas del fragmento de anticuerpo K8. Se recubrió una placa de 96 pocillos con 100 \mul de HSA, BSA y \beta-gal a 10 \mug/ml y 100 \mul de proteína A a una concentración de 1 \mug/ml. Se aplicaron 50 \mul de diluciones en serie de scFv de K8 y se detectaron los fragmentos de anticuerpo ligados con proteína L-HRP. Los resultados del ELISA confirmaron la naturaleza específica doble del anticuerpo K8 (Figura 5).

Para confirmar que la fijación a \beta-gal es determinada mediante el dominio V_{\kappa} y la fijación a HSA/BSA mediante el dominio V_{H} del anticuerpo scFv de K8, se cortó el dominio V_{\kappa} procedente del ADN con scFv de K8 mediante digestión con SalI/NotI y se ligó en un vector pIT2 digerido con SalI/NotI que contiene la cadena V_{H} ficticia (Figuras 1 y 2). Las características de fijación del clon K8 V_{\kappa} /V_{H} ficticio resultante se analizaron por ELISA de scFv soluble. La producción de fragmentos scFv fue inducida por IPTG tal como describe Harrison et al., (1996) y el sobrenadante (50 \mu) que contiene los scFv analizados directamente. Se realizó el ELISA de scFv soluble como se describe en el Ejemplo 1 y se detectaron los scFv ligados con proteína L-HRP. Los resultados del ELISA pusieron de manifiesto que este clon era capaz de unirse todavía a \beta-gal, mientras que la fijación aBSA se eliminó (Figura 6).

Ejemplo 3 Selección de anticuerpos con dominio V_{H} simple contra los antígenos A y B y los anticuerpos con dominio V_{\kappa} individual dirigido contra los antígenos C y D

Este ejemplo describe un método de preparación de anticuerpos con dominio V_{H} individual dirigido contra los antígenos A y B y anticuerpos con dominio V_{\kappa} dirigidos contra los antígenos C y D seleccionando repertorios de dominios variables con anticuerpo individual virgen para fijarse a estos antígenos en ausencia de dominios variables complementarios.

Las selecciones y la caracterización de los clones de fijación se realiza como se describió anteriormente (véase Ejemplo 5, documento PCT/GB 02/003014). Se seleccionan cuatro clones para la investigación adicional:

: VH1 - Anti A V_{H}

: VH2 - Anti B V_{H}

: VK1 - Anti C V_{\kappa}

: VK2 - Anti D V_{\kappa}.

Los procedimientos descritos anteriormente en los Ejemplos 1 a 3 pueden utilizarse, de manera similar a la descrita, para producir moléculas de dímero que comprenden combinaciones de dominios V_{H} (es decir ligandos V_{H}-V_{H}) y combinaciones de dominios V_{L} (ligandos V_{L}-V_{L}).

Ejemplo 4 Creación y caracterización de anticuerpos ScFv específicos dobles (VH1/VH2 dirigidos contra los antígenos A y B y VK1/VK2 dirigidos contra los antígenos C y D)

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos ScFv específicos dobles (VH1/VH2 dirigidos contra los antígenos A y B y VK1/VK2 dirigidos contra los antígenos C y D) pudieron crearse combinando los dominios individuales V_{\kappa} y V_{H} seleccionados contra los antígenos respectivos en un vector ScFv.

Para crear el anticuerpo VH1/VH2 específico doble, el dominio VH1 individual se escinde del vector 1 con dominio variable (Figura 7) por digestión con NcoI/XhoI y se liga en el vector 2 con dominio variable digerido con NcoI/XhoI (Figura 7) para crear VH1/vector 2 con dominio variable. El dominio individual VH2 se amplía por PCR a partir del vector 1 con dominio variable utilizando cebadores para introducir las secuencias de restricción SalI en el extremo 5' y la secuencia de restricción NotI en el extremo 3'. El producto de PCR se digiere a continuación con SalI/NotI y se liga en VH1/vector 2 con dominio variable digerido con SalI/NotI para crear VH1/VH2/vector 2 con dominio variable.

El vector 2 con dominio variable VK1/VK2 se crea de manera similar. La natural específica doble del ScFv de VH1/VH2 producido y de ScFv de VK1/VK2 se determina en un ELISA de ScFv soluble tal como se describió anteriormente (véase el Ejemplo 6, documento PCT/GB02/003014). Se realiza el ELISA de competición como se describió anteriormente (véase el Ejemplo 8, documento PCT/GB02/003014).

Resultados posibles:

-: ScFv de VH1/VH2 es capaz de unirse a los antígenos A y B simultáneamente

-: ScFv de VK1/VK2 es capaz de unirse a los antígenos C y D simultáneamente

-: La fijación de ScFv de VH1/VH2 es competitiva (cuando se fija al antígeno A, ScFv de VH1/VH2 no puede fijarse al antígeno B)

-: La fijación de ScFv de VK1/VK2 es competitiva (cuando se fija al antígeno C, ScFv de VK1/VK2 no puede fijarse al antígeno D)

Ejemplo 5 Construcción de Fab de VH1/VH2 específico doble y Fab de VK1/VK2 y análisis de sus propiedades de fijación

Para crear Fab de VH1/VH2, el dominio individual VH1 se liga en el vector CH digerido con NcoI/XhoI (Figura 8) para crear VH1/CH y el dominio individual VH2 se liga en el vector CK digerido en SalI/NotI (Figura 9) para crear VH2/CK. El ADN del plásmido procedente de VH1/CH y de VH2/CK se utiliza para transformar conjuntamente las células competentes de E. coli descritas anteriormente (véase Ejemplo 8, documento PCT/GB02/003014).

El clon que contiene los plásmidos VH1/CH y VH2/CK es introducido a continuación por IPTG para producir Fab de VH1/VH2 soluble como se describió anteriormente (véase Ejemplo 8, documento PCT/GB02/003014).

Fab de VK1/VK2 se produce de manera similar.

Las propiedades de fijación de los Fab producidos se analizan por ELISA de competencia descrito anteriormente (véase Ejemplo 8, documento PCT/GB 02/003014).

Resultados posibles:

-: Fab de VH1/VH2 es capaz de unirse a los antígenos A y B simultáneamente

-: Fab de VK1/VK2 es capaz de unirse a los antígenos C y D simultáneamente

-: La fijación de Fab de VH1/VH2 es competitiva (cuando se fija al antígeno A, Fab de VH1/VH2 no puede fijarse al antígeno B)

-: La fijación de Fab de VK1/VK2 es competitiva (cuando se fija al antígeno C, Fab de VK1/VK2 no puede fijarse al antígeno D)

Ejemplo 6 Dimeros de dAb quelantes Sumario

Los homodímeros VH y VK se crean en formato dAb-enlazador-dAb utilizando enlazadores polipeptídicos flexibles. Los vectores se crean en el formato dAb-enlazador-dAb que contiene los enlazadores glicina-serina de diferentes longitudes 3U:(Gly_{4}Ser)_{3}, 5U:(Gly_{4}Ser)_{5}, 7U:(Gly_{4},Ser)_{7}. Se crearon bancos de dímero utilizando de guía dAb corriente arriba del enlazador: TAR1-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) o TAR2-6(VK) y un banco de segundos dAb correspondientes tras el enlazador. Utilizando este método, se seleccionaron nuevos dAb diméricos. El efecto de la dimerización sobre la fijación del antígeno se determinó por ELISA y por estudios de BIAcore y en la neutralización celular y ensayos de fijación del receptor. La dimerización tanto de TAR1-5 como de TAR1-27 produjo una mejora significativa de la afinidad de fijación y de los niveles de neutralización.

1.0 Métodos 1.1 Generación del banco 1.1.1 Vectores

Se diseñaron los vectores pEDA3U, pEDA5U y pEDA7U para introducir diferentes longitudes de enlazador compatibles con el formato dAb-enlazador-dAb. Para pEDA3U, se hibridaron oligoenlazadores de 73 pares de bases transcritos y complementarios utilizando un programa de hibridación lenta (95ºC-5 min., 80ºC-10 min., 70ºC-15 min., 56ºC-15 min., 42ºC hasta su utilización) en tampón que contiene NaCl 0,1 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,4 y se clonaron utilizando las secuencias de restricción XhoI y NotI. Los enlazadores comprendían 3 unidades (Gly_{4}Ser) y una región de relleno ubicada entre las secuencias de clonación SalI y NotI (esquema 1). Para reducir la posibilidad de los dAb monoméricos que se seleccionan para la presentación del fago, se diseñó la región de relleno que incluye 3 codones de terminación, una secuencia de restricción SacI y una mutación de desplazamiento del marco para colocar la región fuera del marco cuando no estaba presente el segundo dAb. Para pEDA5U y 7U debido a la longitud de los enlazadores requeridos, se diseñaron oligoenlazadores de superposición para cada vector, se hibridaron y se alargaron utilizando Klenow. Se purificó a continuación el fragmento y se digirió utilizando las enzimas apropiadas antes de la clonación utilizando las secuencias de restricción XhoI y NotI.

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Esquema 1

1

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1.1.2 Preparación del banco

El gen V con terminal N correspondiente al dAb de guía se clonó corriente arriba del enlazador utilizando las secuencias de restricción NcoI y XhoI. Los genes VH presentan secuencias existentes compatibles, sin embargo la clonación de los genes VK requería la introducción de secuencias de restricción adecuadas. Esto se consiguió utilizando los cebadores de PCR con modificación (VK-DLIBF: 5' cggccatggcgtcaacggacat; VKXhoIR: 5' atgtgcgctcgagcgttt
gattt 3') en 30 ciclos de ampliación por PCR utilizando una mezcla 2:1 de SuperTaq (HTBiotechnology Ltd) y pfu turbo (Stratagene). Esto mantuvo las secuencias NcoI en el extremo 5' mientras que se destruía la secuencia SalI adyacente y se introdujo la secuencia XhoI en el extremo 3'. Los 5 dAb de guía se clonaron en cada uno de los 3 vectores del dímero: TAR1-5 (VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH), TAR2-6(VK) y TAR2-7(VK). Todos los montajes se verificaron por análisis de secuencias.

Una vez clonados los dAb de guía corriente arriba del enlazador en cada uno de los vectores (pEDA3U, 5U y 7U): TAR1-5 (VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) o TAR2-6(VK) un banco de los segundos dAb correspondientes se clonó después del enlazador. Para conseguir esto, los bancos de dAb complementarios se ampliaron por PCR procedente del fago recuperado de las selecciones de la ronda 1 de un banco de VK contra TNF\alpha humano (a una densidad aproximada de 1 \times 10^{6} después de la ronda 1) cuando TAR1-5 o TAR1-27 son los dAb de guía, o un banco VH o VK contra el receptor de TNF p55 humano (ambos a aproximadamente una diversidad de 1 \times 10^{5} después de la ronda 1) cuando TAR2-5 o TAR2-6 respectivamente son los dAb de guía. Para los bancos de VK se realizó la ampliación por PCR utilizando cebadores en 30 ciclos de ampliación por PCR utilizando una mezcla 2:1 de SuperTaq y pfu turbo. Los bancos de VH se ampliaron por PCR utilizando cebadores para introducir una secuencia de restricción SalI y el extremo 5' del gen. Las PCR del banco de dAb se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas, se ligaron en los correspondientes vectores corriente abajo de enlazador, utilizando las enzimas de restricción SalI/NotI y se electroporaron en células TG1 competentes recién preparadas.

Los títulos conseguidos para cada banco son los siguientes:

: TAR1-5: pEDA3U = 4\times10^{8}, pEDA5U = 8\times10^{7}, pEDA7U = 1\times10^{8}

: TAR1-27: pEDA3U = 6,2\times10^{8}, pEDA5U = 1\times10^{8}, pEDA7U = 1\times10^{9}

: TAR2h-5: pEDA3U = 4\times10^{7}, pEDA5U = 2\times10^{8}, pEDA7U = 8\times10^{7}

: TAR2h-6: pEDA3U = 7,4\times10^{8}, pEDA5U = 1,2\times10^{8}, pEDA7U = 2,2\times10^{8}.

1.2 Selecciones 1.2.1 TNF\alpha

Se realizaron selecciones utilizando TNF\alpha recubiertos de forma pasiva en inmunotubos. En resumen, se revistieron inmunotubos toda la noche con 1 a 4 ml de antígeno requerido. Los inmunotubos se lavaron a continuación 3 veces con PBS y se bloquearon con leche en polvo al 2% en PBS durante 1 a 2 h. y se lavaron 3 veces más con PBS. La solución del fago se diluye en leche en polvo al 2% en PBS y se incuba a temperatura ambiente durante 2 h. Los tubos se lavan a continuación con PBS y el fago se eluye con 1 mg/ml de tripsina-PBS. Se investigaron tres estrategias de selección para los bancos del dímero TAR1-5. Las selecciones de la primera ronda se realizaron en inmunotubos TNF\alpha humano recubierto con 1 \mug/ml o 20 \mug/ml con 20 lavados en Tween al 0,1% en PBS. Las células TG1 se infectan con el fago eluido y se determinan los títulos (p. ej., Marks et al. J. Mol. Biol. 5 dic. 1991; 222(3):581-97, Richmann et al. Biochemistry, 31 ag. 1993; 32(34):8848-55).

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Los títulos recuperados fueron:

: pEDA3U = 2,8\times10^{7} (1 \mug/ml TNF) 1,5\times10^{8} (20 \mug/ml TNF),

: pEDA5U = 1,8\times10^{7} (1 \mug/ml TNF), 1,6\times10^{8} (20 \mug/ml TNF)

: pEDA7U = 8\times10^{6} (1 \mug/ml TNF), 7\times10^{7} (20 \mug/ml TNF).

Las selecciones de la segunda ronda se realizaron utilizando 3 métodos diferentes.

1.: En inmunotubos, 20 lavados con incubación durante la noche seguida de 10 lavados más.

2.: En inmunotubos, 20 lavados seguidos de 1 h de incubación a t.a. en tampón de lavado con (1 \mug/ml de TNF\alpha) y 10 lavados más.

3.: Selección en perlas de estreptavidina utilizando 33 pmoles de TNF\alpha humano biotinilado (Henderikx et al., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, ed. O'Brien and Atkin, Humana Press). Los clones individuales de las selecciones de la ronda 2 se seleccionaron en placas de 96 pocillos y se elaboraron preparaciones de sobrenadante en bruto en un formato de placa de 96 pocillos de 2 ml.

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	Ronda 1	Ronda 2	Ronda 2	Ronda 2
	Concentración de recubrimiento del	Selección del	Selección del	Selección del
	inmunotubo con TNF\alpha humano	método 1	método 2	método 3
pEDA3U	1 \mug/ml	1 \times 10^{9}	1,8 \times 10^{9}	2,4 \times 10^{10}
pEDA3U	20 \mug/ml	6 \times 10^{9}	1,8 \times 10^{10}	8,5 \times 10^{10}
pEDA5U	1 \mug/ml	9 \times 10^{8}	1,4 \times 10^{9}	2,8 \times 10^{10}
pEDA5U	20 \mug/ml	9,5 \times 10^{9}	8,5 \times 10^{9}	2,8 \times 10^{10}
pEDA7U	1 \mug/ml	7,8 \times 10^{8}	1,6 \times 10^{8}	4 \times 10^{10}
pEDA7U	20 \mug/ml	1 x 10^{10}	8 \times 10^{9}	1,5 \times 10^{10}

Las selecciones para TAR1-27 se realizaron como se describió anteriormente con las modificaciones siguientes: Las selecciones de la primera ronda se realizaron en inmunotubos utilizando TNF\alpha humano recubierto con 1 \mug/ml o 20 \mug/ml con 20 lavados en Tween al 0,1% en PBS. Las selecciones de la segunda ronda se realizaron en inmunotubos utilizando 20 lavados con incubación durante la noche seguida de 20 lavados más. Los clones individuales de las selecciones de la ronda 2 se seleccionaron en placas de 96 pocillos y se elaboraron preparaciones de sobrenadante en bruto en un formato de placa de 96 pocillos de 2 ml.

Los títulos de TAR1-27 son los siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

	Conc. de recubrimiento inmunotubo con TNF\alpha humano	Ronda 1	Ronda 2
pEDA3U	1 \mug/ml	4 \times 10^{9}	6 \times 10^{9}
pEDA3U	20 \mug/ml	5 \times 10^{9}	4,4 \times 10^{10}
pEDA5U	1 \mug/ml	1,5 \times 10^{9}	1,9 \times 10^{10}
pEDA5U	20 \mug/ml	3,4 \times 10^{9}	3,5 \times 10^{10}
pEDA7U	1 \mug/ml	2,6 \times 10^{9}	5 \times 10^{9}
pEDA7U	20 \mug/ml	7 \times 10^{9}	1,4 \times 10^{10}

1.2.2 Receptor 1 del TNF (receptor p55; TAR2)

Las selecciones se realizaron como se describió anteriormente para los bancos TARh-5 solamente. Las rondas de selecciones se realizaron en inmunotubos utilizando 1 \mug/ml del receptor TNF humano o 10 \mug/ml del receptor TNF p55 humano con 20 lavados en PBS en incubación durante la noche seguida de 20 lavados más. Los clones individuales de las selecciones de la ronda 2 y 3 se seleccionaron en placas de 96 pocillos y se elaboraron preparaciones de sobrenadante en bruto en un formato de placa de 96 pocillos de 2 ml.

Los títulos de TAR2h-5 son los siguientes:

	Ronda 1	Ronda 1	Ronda 2	Ronda 3
	Concentración de recubrimiento del
	inmunotubo con TNF p55 humano
pEDA3U	1 \mug/ml	2,4 \times 10^{6}	1,2 \times 10^{7}	1,9 \times 10^{9}
pEDA3U	10 \mug/ml	3,1 \times 10^{7}	7 \times 10^{7}	1 \times 10^{9}
pEDA5U	1 \mug/ml	2,5 \times 10^{6}	1,1 \times 10^{7}	5,7 \times 10^{8}
pEDA5U	10 \mug/ml	3,7 \times 10^{7}	2,3 \times 10^{8}	2,9 \times 10^{9}
pEDA7U	1 \mug/ml	1,3 \times 10^{6}	1,3 \times 10^{7}	1,4 \times 10^{9}
pEDA7U	10 \mug/ml	1,6 x 10^{7}	1,9 \times 10^{7}	3 \times 10^{10}

\vskip1.000000\baselineskip

1.3 Cribado

Se seleccionaron clones individuales de las selecciones de la ronda 2 ó 3 de cada uno de los bancos 3U, 5U y 7U de los diferentes métodos de selecciones, cuando procedía. Se cultivaron los clones en 2\timesTY con 100 \mug/ml de ampicilina y glucosa al 1% a 37ºC. Se inoculó una dilución al 1/100 de este cultivo en 2 ml de 2\timesTY con 100 \mug/ml de ampicilina y glucosa al 0,1% en formato de placa de 96 pocillos de 2 ml y se cultivó a 37ºC agitando hasta que la DO600 fue aproximadamente 0,9. Se produjo a continuación el cultivo con IPTG 1 mM toda la noche a 30ºC. Se clarificaron los sobrenadantes por centrifugación a 4.000 rpm durante 15 min. en una centrifugadora de placa sorval. Las preparaciones del sobrenadante se utilizaron para el cribado inicial.

1.3.1 ELISA

La actividad de fijación de las proteínas recombinantes diméricas se comparó a la del monómero por ELISA de la proteína A/L o por ELISA del antígeno. En resumen, se recubre una placa de 96 pocillos con antígeno o proteína A/L durante la noche a 4ºC. Se lava la placa con Tween al 0,05%-PBS, se bloquea durante 2 h con Tween al 2%-PBS. Se añade la muestra a la placa incubada durante 1 h. a temperatura ambiente. Se lava la placa y se incuba con el reactivo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Se lava la placa y se revela con sustrato TMB. Se utilizó proteína A/L-HRP o India-HRP como reactivo secundario. Para los ELISA del antígeno, las concentraciones de antígeno utilizadas fueron 1 \mug/ml en PBS para TNF\alpha humano y el receptor 1 del THF humano. Debido a la presencia del dAb de guía en la mayoría de los casos, los dímeros proporcionaron una señal positiva de ELISA, por consiguiente la determinación del índice off se examinó por BIAcore.

1.3.2 BIAcore

El análisis BIAcore se realizó para los clones TAR1-5 y TAR2h-5. Para el cribado, se acopló TNF\alpha humano a un chip de CM5 a alta densidad (aproximadamente 10.000 UR). Se acoplaron 50 \mul de TNF\alpha humano (50 \mug/ml) al chip a 5 \mul/min. en tampón de acetato, pH 5,5. La regeneración del chip después del análisis utilizando métodos normalizados no es posible debido a la inestabilidad del TNF\alpha humano, por lo tanto después de analizar cada muestra, se lavó el chip durante 10 min. con tampón.

Para TAR1-5, los sobrenadantes de los clones de la selección de la ronda 2 se identificaron por BIAcore.

Se cribaron 48 clones de cada uno de los bancos 3U, 5U y 7U adquiridos, utilizando los métodos de selección siguientes:

R1:: 1 \mug/ml de inmunotubo de TNF\alpha humano, R2 1 \mug/ml de inmunotubo de TNF\alpha humano, lavado durante la noche.

R1:: 20 \mug/ml de inmunotubo de TNF\alpha humano, R2 20 \mug/ml de inmunotubo de TNF\alpha humano, lavado durante la noche.

R1:: 1 \mug/ml de inmunotubo de TNF\alpha humano, R2 33 pmoles de TNF\alpha humano en perlas biotinilado.

R1:: 20 \mug/ml de inmunotubo de TNF\alpha humano, R2 33 pmoles de TNF\alpha humano en perlas biotinilado.

Para el cribado, se acopló el receptor de TNF de p55 humano a un chip de CM5 a alta densidad (aproximadamente 4.000 UR). Se acoplaron 100 \mul del receptor TNF de p55 humano al chip en 5 \mul/ml en tampón de acetato, pH 5,5. Se examinaron las condiciones de regeneración habituales (glicina a pH 2 o pH 3) pero en cada caso se eliminó el antígeno de la superficie del chip, por consiguiente como con TNF\alpha, por lo tanto después de analizar cada muestra, se lavó el chip durante 10 min. con tampón.

Para TAR2-5, se identificaron los sobrenadantes de los clones de la selección de la ronda 2.

Se cribaron 48 clones de cada uno de los bancos 3U, 5U y 7U, utilizando los métodos de selección siguientes:

R1:: 1 \mug/ml de inmunotubo del receptor de TNF\alpha p55 humano, R2 1 \mug/ml del receptor de inmunotubo TNF\alpha p55 humano, lavado durante la noche.

R1:: 10 \mug/ml de inmunotubo del receptor de TNF\alpha p55 humano, R2 10 \mug/ml de inmunotubo del receptor de TNF\alpha p55 humano, lavado durante la noche.

1.3.3 Análisis del receptor y de las células

La capacidad de los dímeros para neutralizar en el análisis del receptor se realizó de la forma siguiente:

Fijación del receptor

Se determinó la capacidad de los dAb anti-TNF para inhibir la fijación de TNF al receptor 1 del TNF recombinante (p55). En resumen, se incubaron toda la noche placas Maxisorp con 30 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón Fc antihumano (Zymed, San Francisco, USA). Se lavaron los pocillos con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween-20 al 0,05% y a continuación se bloquearon con BSA al 1% en PBS antes de ser incubados con 100 ng/ml de proteína de fusión Fc con receptor 1 de TNF (R&D Systems, Minneapolis, USA). La fijación del TNF se detectó con 0,2 mg/ml de anticuerpo anti-TNF biotinilado (HyCult biotechnology, Uben, Holanda) seguido de una dilución 1 en 500 de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, UK) y a continuación la incubación con sustrato TMB (KPL, Gaithersburg, USA). La reacción se interrumpió mediante la adición de HCl y se leyó la absorbancia a 450 nm. La actividad de dAb anti-TNF condujo a una disminución en la fijación
de TNF y por lo tanto a una disminución de la absorbancia en comparación con el TNF de referencia solamente.

Análisis de citotoxicidad en L929

Se determinó también la capacidad de los dAb anti-TNF para neutralizar la actividad citotóxica de TNF en fibroblastos L929 de ratón (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). En resumen, se incubaron toda la noche células L929 en placas de microvaloración con dAb anti-TNF, 100 pg/ml de TNF y 1 mg/ml de actinomicina D (Sigma, Poole, UK). Se midió la viabilidad celular leyendo la absorbancia a 490 nm después de una incubación con [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (Promega, Madison, USA). La actividad de dAb anti-TNF condujo a una disminución de la citotoxicidad de TNF y por consiguiente a un aumento de la absorbancia en comparación con la referencia TNF solamente.

En el cribado inicial, se utilizaron los sobrenadantes preparados para el análisis BIAcore, descritos anteriormente, también en el análisis del receptor. Se realizaron más análisis de dímeros seleccionados en el análisis del receptor y de células utilizando proteínas purificadas.

Análisis de IL-8 en HeLa

Se determinó la capacidad de los dAb anti-TNF o anti-TNF R1 para neutralizar la producción de secreción de IL-8 por TNF en células HeLa (método adaptado del de Akeson, L. et al. (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523, que describe la producción de IL-8 por IL-1 en HUVEC; aquí los investigadores estudian la producción por TNF alfa humano y los investigadores utilizan células HeLa en lugar de la línea celular HUVEC). En resumen, se incubaron toda la noche células colocadas en placas de microvaloración con dAb y 300 pg/ml de TNF. Tras la incubación se aspiró el sobrenadante de las células y se midió la concentración de IL-8 mediante un ELISA en sandwich (R&D Systems). La actividad de dAb anti-TNFR1 condujo a una disminución de IL-8 en el sobrenadante en comparación con la referencia TNF solamente.

El análisis de L929 se utiliza en todos los experimentos siguientes; sin embargo, se prefiere la utilización del análisis de HeLa IL-8 para medir los ligandos del receptor 1 anti-TNF (p55); la presencia de p55 de ratón en el análisis de L929 posee determinadas limitaciones en su utilización.

1.4 Análisis de la secuencia

Se secuenciaron los dímeros que demostraron poseer propiedades interesantes en el BIAcore y los cribados del análisis del receptor. Las secuencias de detallan en el listado de secuencias.

1.5 Formateado 1.5.1 Dímeros de TAR1-5-19

Los dímeros TAR1-5 que se demostró que presentaban buenas propiedades de neutralización se volvieron a formatear y se analizaron en los análisis de células y de receptores. El dAb de guía de TAR1-5 se sustituyó por el clon TAR1-5-19. Para conseguir esto se clonó TAR1-5 del par del dímero individual y se sustituyó con TAR1-5-19 que había sido ampliado por PCR. Además, se construyeron también los homodímeros de TAR1-5-19 en los vectores 3U, 5U y 7U. La copia con terminal N del gen se amplió por PCR y se clonó como se describió anteriormente y el fragmento del gen con terminal C se clonó utilizando las secuencias de restricción SalI y NotI.

1.5.2 Mutagénesis

El codón de terminación ámbar presente en dAb2, uno de los dAb con terminal C en los pares del dímero TAR1-5 se mutó a una glutamina por mutagénesis dirigida al punto.

1.5.3 Fab

Los dímeros que contenían TAR1-5 o TAR1-5-19 se volvieron a formatear en vectores de expresión Fab. Los dAb se clonaron en vectores de expresión que contenían los genes CK o CH utilizando las secuencias de restricción SfiI y NotI y se comprobaron por análisis de la secuencia. El vector CK procede del vector resistente a la ampicilina a base de pUC y el vector CH procede de un vector pACYC resistente al cloranfenicol. Para la expresión de Fab los montajes dAb-CH y dAb-CK se transformaron conjuntamente en células HB2151 y se cultivaron en 2\timesTY que contenía glucosa al 0,1%, 100 \mug/ml de ampicilina y 10 \mug/ml de cloranfenicol.

1.5.4 Dimerización bisagra

Se examinó la dimerización de los dAb mediante la formación del enlace con cistina. Una secuencia corta de aminoácidos EPKSGDKTHTCPPCP, forma modificada de la bisagra IgGC1 humana se modificó genéticamente en la región del terminal C del dAb. Un oligo enlazador que codifica esta secuencia se sintetizó y se hibridó, como se describió anteriormente. El enlazador se clonó en el vector pEDA que contenía TAR1-5-19 utilizando las secuencias de restricción XhoI y NotI. La dimerización tiene lugar in situ en el periplasma.

1.6 Expresión y purificación 1.6.1 Expresión

Se prepararon sobrenadantes en el formato de placa de 96 pocillos de 2 ml para el cribado inicial como se describió anteriormente. Después del proceso de cribado inicial los dímeros seleccionados se continuaron analizando. Los montajes de dímero se expresaron en células TOP10F' o HB2151 como sobrenadantes. En resumen, una colonia individual de una placa recién estriada se cultivó toda la noche a 37ºC en 2\timesTY con 100 \mug/ml de ampicilina y glucosa al 1%. Se inoculó una dilución al 1/100 de este cultivo en 2\timesTY con 100 \mug/ml de ampicilina y glucosa al 0,1% y se cultivó a 37ºC agitando hasta que la DO600 fue aproximadamente 0,9. Se produjo a continuación el cultivo con IPTG 1 mM toda la noche a 30ºC. Se eliminaron las células por centrifugación y se purificó el sobrenadante con proteína A o agarosa L.

Fab y los dímeros bisagra de cisteína se expresaron como proteínas periplásmicas en células HB2152. Una dilución al 1/100 de un cultivo de toda la noche se inoculó en 2\timesTY con glucosa al 0,1% y los antibióticos apropiados y se cultivó a 30ºC agitando hasta que la DO600 fue aproximadamente 0,9. Se produjo a continuación el cultivo con IPTG 1 mM durante 3 a 4 horas a 25ºC. Se recogieron las células por centrifugación y se volvió a poner en suspensión el sedimento en tampón de preparación periplásmico (Tris-HCl 30 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, sacarosa al 20%). Después de la centrifugación se conservó el sobrenadante y se volvió a poner en suspensión el sedimento en MgSO_{4} 5 mM. Se recogió de nuevo el sobrenadante por centrifugación, se agrupó y se purificó.

1.6.2 Purificación de la proteína A/L

Se examinó la optimización de la purificación de proteínas dímeras a partir de la agarosa con proteína L (Affitech, Noruega) o proteína A agarosa (Sigma, UK). Se eluyó la proteína por lotes o por elución en columna utilizando una bomba peristáltica. Se examinaron tres tampones tampón de fosfato-citrato 0,1 M, pH 2,6, glicina 0,2 M pH 2,5 y glicina 0,1 M pH 2,5. Se determinó la condición óptima que eran condiciones con bomba peristáltica utilizando más de 10 volúmenes de columna de glicina 0,1 M pH 2,5. Se realizó la purificación de la proteína A en las condiciones con bomba peristáltica utilizando glicina 0,1 M pH 2,5.

1.6.3 Purificación por FPLC

La purificación adicional se realizó mediante análisis FPLC en el Explorer 100 system de AKTA (Amersham Biosciences Ltd.). Los dímeros TAR1-5 y TAR1-5-19 se fraccionaron por cromatografía de intercambio catiónico (1 ml de Resource S - Amersham Biosciences Ltd.) eluido con gradiente de NaCl 0 a 1 M en tampón de acetato 50 mM, pH 4. Se purificaron los dímeros bisagra por intercambio iónico (1 ml de Resource K - Amersham Biosciences Ltd.) eluido con un gradiente de NaCl 0 a 1 M en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0. Se purificaron los Fab por cromatografía por exclusión de tamaño utilizando una columna Superose 12 (Amersham Biosciences Ltd.) a un caudal de 0,5 ml/min. en PBS con Tween al 0,05%. Tras la purificación se concentraron las muestras utilizando concentradores del corte 5K de vivaspina (Vivascience Ltd.).

2.0 Resultados 2.1 Dímeros TAR1-5

Se seleccionaron 6 \times 96 clones de la selección de la ronda 2 que comprende todos los bancos y las condiciones de selección. Se elaboraron preparaciones del sobrenadante y se analizaron mediante ELISA, con antígeno y proteína L, BIAcore y en los análisis del receptor. En los ELISA, se identificaron clones con fijación positiva en cada método de selección y se distribuyeron entre los bancos 3U, 5U y 7U. Sin embargo, como el dAb de guía está siempre presente no fue posible discriminar entre los aglutinantes de alta y baja afinidad por este método por lo tanto se realizó el análisis BIAcore.

Se realizó el análisis BIAcore utilizando 2 ml de sobrenadantes. El análisis BIAcore puso de manifiesto que los índices K_{off} del dímero estaban ampliamente mejorados en comparación con los de TAR1-5 monomérico. El índice K_{off} del monómero estaba comprendido en el intervalo de 10^{-1} M en comparación con los índices K_{off} del dímero que estaban comprendidos en el intervalo entre 10^{-3} y 10^{-4} M. Se seleccionaron 16 clones que parecía que presentaban índices K_{off} muy bajos, todos procedían de los bancos 3U, 5U y 7U y se secuenciaron. Además se analizó la capacidad de los sobrenadantes para neutralizar TNF\alpha humano en el análisis del receptor.

6 clones principales (d1-d6 a continuación) que se neutralizaron en estos análisis y se habían secuenciado. Los resultados demuestran que fuera de los 6 clones obtenidos existen solamente 3 segundos dAb diferentes (dAb1, dAb2 y dAb3) sin embargo cuando se encuentra el segundo dAb más de una vez están ligados con enlazadores de diferentes longitudes.

TAR1-5d1: enlazador 3U 2º dAb=dAb1 - 1 \mug/ml de inmunotubo Ag lavado toda la noche

TAR1-5d2: enlazador 3U 2º dAb=dAb2 - 1 \mug/ml de inmunotubo Ag lavado toda la noche

TAR1-5d3: enlazador 5U 2º dAb=dAb2 - 1 \mug/ml de inmunotubo Ag lavado toda la noche

TAR1-5d4: enlazador 5U 2º dAb=dAb3 - 20 \mug/ml de inmunotubo Ag lavado toda la noche

TAR1-5d5: enlazador 5U 2º dAb=dAb1 - 20 \mug/ml de inmunotubo Ag lavado toda la noche

TAR1-5d6: enlazador 7U 2º dAb=dAb1 - R1: 1 \mug/ml de inmunotubo Ag lavado toda la noche, R2: perlas

Se continuaron examinando los 6 clones principales. La proteína se produjo del periplasma y el sobrenadante, se purificó con proteína L agarosa y se examinó en los análisis de células y receptores. Los niveles de neutralización fueron variables (Tabla 1). Se determinaron las condiciones óptimas para la preparación de proteínas. La proteína producida a partir de células HB2151 como sobrenadantes proporcionó el rendimiento mayor (aproximadamente 10 mg/l de cultivo). Los sobrenadantes se incubaron con proteína L agarosa durante 2 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4ºC. Se lavaron las perlas con PBS/NaCl y se rellenaron en una columna FPLC utilizando una bomba peristáltica. Se lavaron las perlas con 10 volúmenes de columna de PBS/NaCl y se eluyeron con glicina 0,1 M pH 2,5. En general, la proteína dimérica se eluye después del monómero.

Los dímeros TAR1-5d1-6 fueron purificados por FPLC. Se obtuvieron tres especies, por purificación por FPLC y fueron identificados por SDS PAGE. Una especie corresponde al monómero y las otras dos especies corresponden a los dímeros de dimensiones diferentes. La mayor de las dos especies es posiblemente debida a la presencia de etiquetas con terminal C. Estas proteínas se examinaron en el análisis del receptor. Los datos presentados en la Tabla 1 representan los resultados óptimos obtenidos a partir de dos especies diméricas (Figura 11).

Los tres segundos dAb de los pares del dímero (es decir, dAb1, dAb2 y dAb3) se clonaron como monómeros y se examinaron por ELISA y en el análisis de células y receptores. Los tres dAb se unen específicamente a TNF mediante el ELISA del antígeno y no interreaccionan con plástico o BSA. Como los monómeros, ninguno de los dAb se neutraliza en los análisis de células o receptores.

2.1.2 Dímeros TAR1-5-19

TAR1-5-19 se sustituyó por TAR1-5 en los 6 clones principales. El análisis de todos los dímeros TAR1-5-19 en el análisis de células y receptores se realizó utilizando la proteína completa (proteína L purificada solamente) a menos que se indique de otra manera (Tabla 2). TAR1-5-19d4 y TAR1-5-19d3 presentan la mejor ND_{50} (\sim5 nM) en el análisis de células, lo que es coherente con los resultados del análisis del receptor y es una mejora sobre el monómero TAR1-5-19 (ND_{50}\sim30 nM). Aunque los dímeros TAR1-5 purificados proporcionaron resultados variables en los análisis del receptor y de la célula, los dímeros TAR1-5-19 fueron más coherentes. La variabilidad se demostró al utilizar diferentes tampones de elución durante la purificación de la proteína. La elución que utiliza tampón fosfato-citrato 0,1 M pH 2,6 o glicina 0,2 M pH 2,5 si bien eliminando toda la proteína de la proteína L agarosa en la mayoría de los casos le hizo menos operativo.

TAR1-5-19d4 se expresó en el fermentador y se purificó por FPLC de intercambio catiónico para dar un dímero completamente puro. Como con TAR1-5d4 se obtuvieron tres especies, mediante purificación por FPLC que corresponden al monómero y dos especies de dímero. Este dímero era aminoácido secuenciado. El monómero TAR1-5-19 y TAR1-5-19b4 se examinaron a continuación en el análisis del receptor y el IC50 resultante para el monómero fue 30 nM y para el dímero fue 8 nM. Los resultados del ensayo del receptor en comparación con el monómero TAR1-5-19, TAR1-5-19d4 y TAR1-5d4 se presentan en la figura 10.

Se prepararon homodímeros de TAR1-5-19 en los vectores 3U, 5U y 7U, se expresaron y se purificaron en la proteína L. Se examinaron las proteínas en los análisis de células y receptores y se determinaron los IC_{50} resultantes (para el análisis del receptor) y de ND_{50} (para el análisis de células) (tabla 3, figura 12).

2.2 Fab

Se clonaron asimismo los dímeros TAR1-5 y TAR1-5-19 en formato Fab, se expresaron y se purificaron en proteína L agarosa. Se evaluaron los Fab en los análisis del receptor (Tabla 4). Los resultados demostraron que para ambos dímeros TAR1-5-19 y TAR1-5 los niveles de neutralización fueron similares a los de los dímeros del enlazador Gly_{4}Ser original de los que proceden. Un Fab de TAR1-5-19 en el que se desplegó TAR1-5-19 se expresó en ambos CH y CK, la proteína L se purificó y se evaluó en el análisis del receptor. La IC50 resultante fue aproximadamente de 1 nM.

2.3 Dímeros TAR1-27

Se seleccionaron 3 \times 96 clones de la selección de la ronda 2 que comprende todos los bancos y las condiciones de selección. Se realizaron preparaciones de 2 ml de sobrenadante para el análisis en ELISA y bioanálisis. El ELISA del antígeno proporcionó 71 clones positivos. El análisis del receptor de sobrenadantes en bruto proporcionó 42 clones con propiedades inhibidoras (fijación de TNF 0 al 60%). En la mayoría de los casos las propiedades inhibidoras se correlacionaron con la señal potente del ELISA. Se secuenciaron 42 clones, 39 de éstos presentan secuencias únicas del dAb segundo. Los 12 dímeros que proporcionaron las mejores propiedades inhibidoras se continuaron
analizando.

Los 12 clones neutralizantes se expresaron como 200 ml de preparaciones del sobrenadante y se purificaron en la proteína L. Éstos fueron evaluados mediante la proteína L y el ELISA con antígeno, BIAcore y en el análisis del receptor. Se obtuvieron en todos los casos señales positivas potentes de ELISA. El análisis BIAcore puso de manifiesto que todos los clones presentan índices rápidos on y off. Los índices off mejoraron en comparación con el TAR1-27 monomérico, sin embargo los índices off de los dímeros TAR1-27 fueron más rápidos (K_{off} está comprendido aproximadamente en el intervalo de 10^{-1} y 10^{-2} M) que los dímeros TAR1-5 examinados anteriormente (K_{off} está comprendido aproximadamente en el intervalo de 10^{-3} y 10^{-4} M). La estabilidad de los dímeros purificados se cuestionó y por consiguiente para mejorar la estabilidad, se incluyó la adición en glicerol al 5%, Triton X100 al 0,5% o NP40 al 0,5% (Sigma) en la purificación de los 2 dímeros TAR1-27 (d2 y d16). La adición de NP40 o Triton X100^{TM} mejoró el rendimiento del producto purificado aproximadamente 2 veces. Ambos dímeros se evaluaron en el análisis del receptor. TAR1-27d2 dio un IC_{50} de \sim30 nM en todas las condiciones de purificación. TAR1-27d16 no presentó ningún efecto de neutralización cuando se purificó sin la utilización de agentes estabilizantes pero dio un IC_{50}
de \sim50 nM cuando se purificó en las condiciones de estabilización. No se realizó ningún análisis más.

2.4 Dímeros TAR2-5

Se seleccionaron 3 \times 96 clones de las selecciones de la segunda ronda que comprenden todos los bancos y las condiciones de selección. Se elaboran preparaciones de 2 ml de sobrenadante para análisis. Se realizaron los ELISA de la proteína A y del antígeno para cada placa. Se identificaron 30 clones interesantes que presentaban buenos índices de K_{orr} por BIAcore (intervalos de K_{off} entre 10^{-2} y 10^{-3} M). Se secuenciaron los clones y se identificaron 13 dímeros únicos por análisis de secuencias.

TABLA 1 Dímeros TAR1-5

Dímero	Tipo de célula	Purificación	Fracción proteica	Condiciones de	Análisis de
				elución	receptor/célula
TAR1-5d1	HB2151	Proteína L + FPLC	Especies diméricas	Glicina 0,1 M pH 2,5	RA\sim30 nM
			pequeñas
TAR1-5d2	HB2151	Proteína L + FPLC	Especies diméricas	Glicina 0,1 M pH 2,5	RA\sim50 nM
			pequeñas
TAR1-5d3	HB2151	Proteína L + FPLC	Especies diméricas	Glicina 0,1 M pH 2,5	RA\sim300 nM
			grandes
TAR1-5d4	HB2151	Proteína L + FPLC	Especies diméricas	Glicina 0,1 M pH 2,5	RA\sim3 nM
			grandes
TAR1-5d5	HB2151	Proteína L + FPLC	Especies diméricas	Glicina 0,1 M pH 2,5	RA\sim200 nM
			grandes
TAR1-5d6	HB2151	Proteína L + FPLC	Especies diméricas	Glicina 0,1 M pH 2,5	RA\sim100 nM
			grandes
\begin{minipage}[t]{160mm} *obsérvese que el dímero 2 y el dímero 3 presentan el mismo dAb segundo (denominado dAb2), sin embargo presentan diferentes longitudes de enlazador (d2 = (Gly_{4}Ser)_{3}, d3 = (Gly_{4}Ser)_{3}). dAb1 es el dAb asociado a los dímeros 1, 5 y 6. dAb3 es el dAb asociado al dímero 4. Ninguno de los dAb asociados se neutraliza solo. La purificación por FPLC es por intercambio catiónico a menos que se indique de otro modo. Las especies diméricas óptimas para cada dímero obtenidas por FPLC se determinaron en estos análisis.\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Dímeros TAR1-5-19

Dímero	Tipo de célula	Purificación	Fracción proteica	Condiciones	Análisis de
				de elución	receptor/célula
TAR1-5-19d1	TOP10F'	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M	RA\sim15 nM
				pH 2,0
TAR1-5-19d2	TOP10F'	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M pH	RA\sim2 nM
(sin codón de				2,0 + NP40
terminación)				al 0,05%
TAR1-5-19d3	TOP10F'	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M pH	RA\sim8 nM
(sin codón de				2,5 + NP40
terminación)				al 0,05%
TAR1-5-19d4	TOP10F'	Proteína L +	Fracción purificada	Glicina 0,1 M	RA\sim2-5 nM
		FPLC	por FPLC	pH 2,0	CA\sim12 nM
TAR1-5-19d5	TOP10F'	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M pH	RA\sim8 nM
				2,0 + NP40	CA\sim10 nM
TAR1-5-19d6	TOP10F'	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M	RA\sim10 nM
				pH 2,0

TABLA 3 Homodímeros TAR1-5-19

Dímero	Tipo de	Purificación	Fracción proteica	Condiciones	Análisis de
	célula			de elución	receptor/célula
TAR1-5-19	HB2151	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M	RA\sim20 nM
homodímero 3U				pH 2,5	CA\sim30 nM
TAR1-5-19	HB2151	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M	RA\sim2 nM
homodímero 5U				pH 2,5	CA\sim3 nM
TAR1-5-19	HB2151	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M	RA\sim10 nM
homodímero 7U				pH 2,5	CA\sim15 nM
TAR1-5-19	HB2151	Proteína L + FPLC	Fracción de dímero	Glicina 0,1 M	RA\sim2 nM
bisagra cys			purificada por FPLC	pH 2,5
TAR1-5-19CH/	HB2151	Proteína	Proteína total	Glicina 0,1 M	RA\sim1 nM
TAR1-5-19 CK				pH 2,5

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TABLA 4 Fab de TAR1-5/TAR1-5-19

Dímero	Tipo de	Purificación	Fracción proteica	Condiciones de	Análisis de
	célula			elución	receptor/célula
TAR1-5-CH/dAb1 CK	HB2151	Proteína L	Proteína total	Citrato 0,1 M pH 2,6	RA\sim90 nM
TAR1-5-CH/dAb2 CK	HB2151	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M pH 2,5	RA\sim30 nM
					CA\sim60 nM
DAb3CH/TAR1-5CK	HB2151	Proteína L	Proteína total	Citrato 0,1 M pH 2,5	RA\sim30 nM
					CA\sim60 nM
TAR1-5-19CH/dAb1 CK	HB2151	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M pH 2,0	RA\sim100 nM
dab1CH/TAR 1-5-19CK	HB2151	Proteína L	Glicina 0,1 M,	Myc/flag	RA\sim30 nM
			pH 2,0
TAR1-5-19CH/dab2 CK	HB2151	Proteína	Proteína total	Glicina 0,1 M pH 2,0	RA\sim8 nM
					CA\sim12 nM
TAR1-5-19CH/dab3 CK	HB2151	Proteína L	Proteína total	Glicina 0,1 M pH 2,0	RA\sim3 nM

Ejemplo 7 Dimerización de dAb por enlace de cisteína terminal Sumario

Para la dimerización de dAb, se ha modificado genéticamente una cisteína libre en el terminal C de la proteína. Cuando se expresa la proteína forma un dímero que puede purificarse por un método de purificación en dos etapas.

Construcción por PCR del dímero TAR1-5-19CYS

Véase el ejemplo 8 que describe el trímero de dAb. El protocolo del trímero da lugar a una mezcla de monómero, dímero y trímero.

Expresión y purificación del dímero TAR1-5-19CYS

El dímero se purificó a partir del sobrenadante del cultivo por captura en proteína L agarosa como se esboza en el ejemplo 8.

Separación del monómero TAR1-5-19CYS del dímero TAR1-5-19CYS

Antes de la separación por intercambio catiónico, la muestra de monómero/dímero mezclada era tampón intercambiado en tampón de acetato sódico 50 mM pH 4,0 utilizando una columna PD-10 (Amersham Pharmacia), siguiendo las instrucciones del fabricante. La muestra se aplicó a continuación a una columna de intercambio catiónico Resource S de 1 ml (Amersham Pharmacia), que había sido equilibrada previamente con acetato sódico 50 mM pH 4,0. Se separaron el monómero y el dímero utilizando el siguiente gradiente salino en acetato sódico 50 mM, pH 4,0:

: Cloruro sódico 150 a 200 mM sobre 15 volúmenes de columna

: Cloruro sódico 250 a 450 mM sobre 10 volúmenes de columna

: Cloruro sódico 450 a 1000 mM sobre 15 volúmenes de columna.

Se identificaron las fracciones que contienen solamente dímero utilizando SDS-PAGE y a continuación se agruparon y el pH se aumentó hasta 8 mediante la adición de 1/5 volumen de Tris 1 M, pH 8,0.

Análisis de fijación operativa in vitro: Análisis del receptor de TNF y análisis de células

Se determinó la afinidad del dímero para TNF\alpha humano utilizando el receptor TNF y el análisis de células. El IC50 en el análisis del receptor fue aproximadamente de 0,3 a 0,8 nM; el ND50 en el análisis de células fue aproximadamente de 3 a 8 nM.

Otros formatos posibles del dímero TAR1-5-19CYS Dímeros de PEG y dímeros de maleimida sintética habituales

Nektar (Shearwater) ofrece una gama de PEG con bi-maleimida [mPEG2-(MAL)_{2} o mPEG-(MAL)_{2}] que permitiría al monómero ser formateado como dímero, con un enlazador pequeño que separa los dAb y estando ambos ligados a un PEG de tamaño comprendido entre 5 y 40 kDa. Se ha demostrado que el mPEG-(MAL)_{2} de 5 kDa (es decir, [TAR1-5-19]-Cys-maleimida-PEG \times 2, en el que las maleimidas están ligadas en el dímero) presenta una afinidad en el análisis del receptor de TNF de \sim1 a 3 nM. Asimismo puede también producirse el dímero utilizando TMEA (Tris[2-maleimidoetil]amina) (Pierce Biotechnology) u otros enlazadores bifuncionales.

También es posible producir el dímero del disulfuro utilizando un procedimiento de acoplamiento químico que utiliza 2,2'-ditiodipiridina (Sigma Aldrich) y el monómero reducido.

Adición de un enlazador polipeptídico o de una bisagra al terminal C del dAb

Un enlazador pequeño, (Gly_{4}Ser)_{n} donde n=1 a 10, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, una inmunoglobulina (por ejemplo, la región bisagra de IgG o la secuencia peptídica al azar (p. ej., seleccionada de entre un banco de secuencias peptídicas al azar) puede modificarse genéticamente entre el dAb y el resto de cisteína terminal. Esto puede utilizarse a continuación para preparar dímeros como se esbozó anteriormente.

Ejemplo 8 Trimerización de dAb Sumario

Para la trimerización de dAb, se requiere una cisteína libre en el terminal C de la proteína. El resto de cisteína, una vez reducido para dar el tiol libre, puede utilizarse a continuación para acoplar específicamente la proteína a una molécula de maleimida trimérica, por ejemplo TMEA (Tris[2-maleimidoetil]amina).

Construcción por PCR de TAR1-5-19CYS

Se utilizaron los oligonucleótidos siguientes para TAR1-5-19 por PCR específicamente con unas secuencias SalI y BamHI para clonación y también para introducir un resto de cisteína con terminal C:

2

(*comienzo de la secuencia TAR1-5-19CYS)

Cebador transcrito

: 5'-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3'

Cebador complementario

: 5'-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3'.

La reacción PCR (50 \mul de volumen) se planteó de la forma siguiente: dNTP 200 \muM, cada cebador 0,4 \muM, 5 \mul de 10\times tampón PfuTurbo (Stratagene), 100 ng de plásmido plantilla (que codifica a TAR1-5-19), 1 \mul de enzima PfuTurbo (Stratagene) y se ajustó el volumen a 50 \mul utilizando agua esterilizada. Se utilizaron las siguientes condiciones de PCR: etapa de desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 min., a continuación 25 ciclos de 94ºC durante 30 s., 64ºC durante 30 s. y 72ºC durante 30 s. Una etapa de ampliación final se incluyó también de 72ºC durante 5 min. El producto de la PCR se purificó y se digirió con SalI y BamHI y se ligó en el vector que también se había cortado con las mismas enzimas de restricción. Se verificaron los clones correctos por secuenciado de ADN.

Expresión y purificación de TAR1-5-19CYS

El vector TAR1-5-19CYS se transformó en células químicamente competitivas BL21 (DE3) pLysS (Novagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se seleccionaron las células que llevan el plásmido dAb para utilizar 100 \mug/ml de carbenicilina y 37 \mug/ml de cloranfenicol. Los cultivos se colocaron en matraces con tabiques de 2 l que contenían 500 ml de caldo de cultivo fabuloso (Sigma-Aldrich), 100 \mug/ml de carbenicilina y 37 \mug/ml de cloranfenicol. Los cultivos se cultivaron a 30ºC a 200 rpm hasta una D.O.600 de 1 a 1,5 y a continuación se indujeron con IPTG 1 mM (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido, de Melford Laboratories). Se dejó continuar la expresión del dAb durante 12 a 16 h. a 30ºC. Se observó que la mayoría de los dAb estaba presente en el medio de cultivo. Por consiguiente, se separaron las células del medio por centrifugación (8.000\timesg durante 30 min.) y se utilizó el sobrenadante para purificar el dAb. Se añadieron 30 ml de proteína L agarosa (Affitech) por litro de sobrenadante y se dejó que el dAb aglutinase el lote en agitación durante 2 horas. Se dejó sedimentar la resina a continuación por gravedad durante una hora más antes de sifonar el sobrenadante. La agarosa se empaquetó a continuación en una columna XK 50 (Amersham Pharmacia) y se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS. El dAb ligado se eluyó con glicina 100 mM pH 2,0 y las fracciones que contienen la proteína se neutralizaron a continuación mediante la adición de 1,5 volúmenes de Tris 1 M pH 8,0. Se aislaron
20 mg de proteína pura por litro de sobrenadante del cultivo, que contenía una relación 50:50 de monómero a dímero.

Trimerización de TAR1-5-19CYS

Se redujeron 2,5 ml de TAR1-5-19CYS 100 \muM con ditiotreitol 5 mM y se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. La muestra se intercambió a continuación con tampón utilizando una columna PD-10 (Amersham Pharmacia). La columna se había equilibrado previamente con EDTA 5 mM, fosfato sódico 50 mM, pH 6,5 y la muestra se aplicó y se eluyó siguiendo las orientaciones de los fabricantes. Se colocó la muestra en hielo hasta que se necesitó. TMEA (Tris[2-maleimidoetil]amina) se adquirió en Pierce Biotechnology. Se preparó una solución madre 20 mM de TMEA en DMSO (sulfóxido de dimetilo) al 100%. Se observó que una concentración de TMEA mayor del 3:1 (relación molar de dAb:TMEA) producía la precipitación rápida y la reticulación de la proteína. Asimismo la velocidad de la precipitación y reticulación era mayor a medida que aumentaba el pH. Por consiguiente utilizando TAR1-5-19CYS 100 \muM reducida, se añadió TMEA 25 \muM para trimerizar la proteína y se dejó que prosiguiera la reacción a temperatura ambiente durante dos horas. Se observó que la adición de aditivos tales como glicerol o etilenglicol hasta el 20% (v/v), reducía de manera significativa la precipitación del trímero a medida que proseguía la reacción de acoplamiento. Tras el acoplamiento, el análisis por SDS-PAGE demostró la presencia de monómero, dímero y trímero en solución.

Purificación del TAR1-5-19CYS trimérico

Se añadió 40 \mul de ácido acético glacial al 40% por ml de la reacción TMEA-TAR1-5-19cys para reducir el pH hasta \sim4. La muestra se aplicó a continuación a una columna de intercambio catiónico Resource S de 1 ml (Amersham Pharmacia), que había sido equilibrada previamente con acetato sódico 50 mM pH 4,0. El dímero y el trímero se separaron parcialmente utilizando un gradiente salino de cloruro sódico 340 a 450 mM, acetato sódico 50 mM pH 4,0 sobre 30 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían el trímero solamente se identificaron utilizando SDS-PAGE y a continuación se agruparon y se aumentó el pH a 8 mediante la adición de 1/5 volúmenes de Tris 1 M pH 8,0. Para evitar la precipitación del trímero durante las etapas de concentración (utilizando concentradores de Vivaspina de del corte5K; Vivascience), se añadió glicerol al 10% a la muestra.

Análisis de fijación operativa in vitro: análisis del receptor TNF y análisis de células

Se determinó la afinidad del trímero para TNF\alpha humano utilizando el receptor de TNF y el análisis de células. El IC50 en el análisis del receptor fue 0,3 nM; ND50 en el análisis de células estaba comprendido en el intervalo entre 3 y 10 nM (p. ej. 3 nM).

Otros formatos posibles del trímero TAR1-5-19CYS

TAR1-5-19CYS puede formatearse también en un trímero utilizando los reactivos siguientes:

Trímeros de PEG y trímeros de maleimida sintética habituales

Nektar (Shearwater) ofrece una gama de PEG multibrazo, que puede modificarse químicamente en el extremo terminal del PEG. Por consiguiente utilizando un trímero de PEG con un grupo funcional maleimida en el extremo de cada brazo permitiría la trimerización del dAb de manera similar a la esbozada anteriormente utilizando TMEA. El PEG puede también adolecer del inconveniente de aumentar la solubilidad del trímero impidiendo de este modo el problema de acumulación. Por lo tanto, se pudo producir un trímero de dAb en el que cada dAb tiene una cisteína terminal C que está ligada a un grupo funcional de maleimida, estando ligados los grupos funcionales de maleimida a un trímero de PEG.

Adición de un enlazador polipeptídico o de una bisagra al terminal C del dAb

Un enlazador pequeño, (Gly_{4}Ser)_{n} donde n=1 a 10, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, una inmunoglobulina (por ejemplo, la región bisagra de IgG o la secuencia peptídica al azar (p. ej., seleccionada de entre un banco de secuencias peptídicas al azar) puede modificarse genéticamente entre el dAb y el resto de cisteína terminal. Cuando se utiliza para preparar polímeros (p. ej., dímeros o trímeros), esto introduciría otra vez un grado mayor de flexibilidad y distancia entre los monómeros individuales, que pueden mejorar las características de fijación a la diana, p. ej. una multisubunidad diana tal como el TNF\alpha humano.

Ejemplo 9 Selección de una colección de anticuerpos de dominio individual (dAb) dirigidos contra albúmina de suero humano (HSA) y albúmina de suero de ratón (MSA)

Este ejemplo explica un método para preparar un anticuerpo con dominio individual (dAb) dirigido contra la albúmina de suero. Se describe la selección de los dAb tanto contra la albúmina de suero de ratón (MSA) como contra la albúmina de suero humano (HSA). En este experimento se utilizaron tres bancos de anticuerpos para la presentación de fago humano, basado cada uno en un solo armazón humano para V_{H} (véase la Figura 13: secuencia del V_{H} ficticio basada en V3-23/DP47 y JH4b) o V_{\kappa} (véase la Figura 15: secuencia de V_{\kappa} ficticia basada en o12/o2/DPK9 y Jk1) con diversidad con cadena lateral codificada por los codones NNK incorporados a las regiones de determinación de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).

Banco 1 (V_{H}):

: Diversidad en las posiciones: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97 y H98.

: Tamaño del banco: 6,2 \times 10^{9}

Banco 2 (V_{H}):

: Diversidad en las posiciones: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a y H100b.

: Tamaño del banco: 4,3 \times 10^{9}

Banco 3 (V_{\kappa}):

: Diversidad en las posiciones: L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94 Y L96.

: Tamaño del banco: 2 \times 10^{9}.

Los bancos de V_{H} y V_{\kappa} se han preseleccionado para fijarse a LA proteína A y proteína L respectivamente de ligandos genéricos de modo que la mayoría de los clones en los bancos no seleccionados son operativos. Las dimensiones de los bancos presentados anteriormente corresponden a las dimensiones después de la preselección.

Se realizaron dos rondas de selección en albúmina de suero que utiliza cada uno de los bancos por separado. Para cada selección, se recubrió el antígeno en inmunotubo (nunc) en 4 ml de PBS a una concentración de 100 \mug/ml. En la primera ronda de selección, cada uno de los tres bancos se apelmazó por separado contra HSA (Sigma) y MSA (Sigma). En la segunda ronda de selección, el fago de cada una de las seis selecciones de la primera ronda se apelmazó contra (i) el mismo antígeno otra vez (p. ej. MSA de la 1ª ronda, HSA de la 2ª ronda) e (ii) contra el antígeno recíproco (p. ej. MSA de la 1ª ronda, HSA de la 2ª ronda) produciendo un total de doce selecciones de la 2ª ronda. En este caso, después de la segunda ronda de selección se analizó la fijación a HSA y MSA en 48 clones. Se produjeron fragmentos solubles de dAb como describió para los fragmentos scFv Harrison et al., Methods Enzymol. 1996;267:83-109 y se siguió el protocolo ELISA estándar (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133) excepto que se utilizó PBS en Tween al 2% como tampón de bloqueo y los dAb unidos se detectaron con proteína L-HRP (Sigma) (para los V_{\kappa}) y proteína A-HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (para los V_{H}).

Los dAb que proporcionan una señal por encima del fondo que indica que se unen a MSA, HSA o a ambos se analizaron en la forma insoluble de ELISA para la fijación a plástico solo pero también eran específicos para la albúmina del suero. Se secuenciaron a continuación los clones (véase la tabla a continuación) poniendo de manifiesto que se habían identificado 21 secuencias únicas de dAb. La similitud mínima (en cuanto a aminoácidos) entre los clones dAb de V_{\kappa} seleccionados fue del 86,25% ((69/80)\times100; resultado cuando todos los restos diversificados son diferentes, p. ej. los clones 24 y 34). La similitud mínima entre los clones de dAb de los V_{H} seleccionados fue del 94% ((127/136)\times100).

A continuación se determinó la capacidad de la albúmina de suero para unirse a los dAb para capturar el antígeno biotinilado procedente de la solución. Se siguió el protocolo ELISA (como anteriormente) excepto que la placa de ELISA se recubrió con 1 \mug/ml de proteína L (para los clones de V_{\kappa}) y 1 \mug/ml de proteína A (para los clones de V_{H}). Se capturó el dAb soluble de la solución como en el protocolo y la detección se hizo con MSA o HSA biotinilados y estreptavidina HRP. El MSA y el HSA biotinilados se han preparado según las instrucciones del fabricante, con objeto de conseguir un promedio de 2 biotinas por molécula de albúmina de suero. Se identificaron veinticuatro clones que capturaron MSA biotinilado de la solución en el ELISA. Dos de éstos (los clones 2 y 38 a continuación) capturaron también HSA biotinilado. A continuación, se determinó la capacidad de los dAb para unirse a MSA recubierto en un chip biacore CM5. Se observó que ocho clones se unen a MSA en el biacore.

3

En todos los casos los armazones eran idénticos a los armazones en la secuencia ficticia correspondiente, con diversidad en las CDR como se indica en la tabla anterior.

De los ocho clones que se unen a MSA en el biacore, dos clones que están muy expresados en E. coli (clones MSA16 y MSA26) se seleccionaron para el estudio ulterior (véase el ejemplo 10). En la figura 16 se proporcionan todas las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para MSA16 y 26.

Ejemplo 10 Determinación de la afinidad y de la vida media del suero en ratones de MSA16 y MSA26 de los dAb que se unen a MSA

Los MSA16 y MSA26 de los dAb se expresaron en el periplasma de E. coli y se purificaron utilizando la absorción en lotes en la resina con afinidad a la proteína L-agarosa (Affitech, Noruega) seguido de elución con glicina a pH 2,2. Los dAb purificados se analizaron a continuación por biacore de inhibición para determinar K_{d}. En resumen se analizaron MSA16 y MSA26 purificados para determinar la concentración del dAb requerido para conseguir 200 UR de respuesta en un chip CM5 de biacore recubierto con una densidad elevada de MSA. Una vez determinadas las concentraciones requeridas de dAb, se premezcló el antígeno MSA, en un intervalo de concentraciones en torno a la K_{d} esperada, con el dAb y se incubó durante la noche. Se midió a continuación la fijación al chip de biacore recubierto con MSA de dAb en cada una de las premezclas a un caudal elevado de 30 \mul/minuto. Se utilizaron las curvas resultantes para crear diagramas de Klotz, que proporcionaron una K_{d} estimada de 200 nM para MSA16 y de 70 nM para MSA26 (Figura 17 A & B).

A continuación, se clonaron los clones MSA16 y MSA26 en un vector de expresión con la etiqueta HA (secuencia de ácidos nucleicos: TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA y la secuencia de aminoácidos: YPYDVPDYA) y cantidades de 2 a 10 mg se expresaron en E. coli y se purificaron en el sobrenadante con resina de afinidad a la proteína L-agarosa (Affitech, Noruega) y se eluyeron con glicina a pH 2,2. Se determinó la vida media en el suero de los dAb en ratones. Se dosificaron MSA26 y MSA16 en inyecciones i.v. individuales a aproximadamente 1,5 mg/kg en ratones CD1. El análisis de las concentraciones en el suero fue por captura de anti-HA de cabra (Abcam, UK) y detección por ELISA de la proteína L-HRP (Invitrogen) que se bloqueó con Marvel al 4%. El lavado se hizo con PBS en Tween al 0,05%. Se crearon curvas patrón de concentraciones conocidas de dAb en presencia de 1\timessuero de ratón para asegurar la comparación con las muestras de ensayo. El modelado con un modelo de 2 compartimentos demostró que MSA-26 presentaba una t1/2\alpha de 0,16 h., una t1/2\beta de 14,5 h. y un área bajo la curva (AUC) de 465 h.mg/ml (datos no representados) y MSA-16 presentó una t1/2\alpha de 0,98 h., una t1/2\beta de 36,5 h. y un AUC de 913 h.mg/ml (figura 18). Ambos clones anti-MSA habían prolongado considerablemente la vida media en comparación con HEL4 (dAb de la lisozima de la clara de huevo anti-gallina) que presentó una t1/2\alpha de 0,06 h. y una t1/2\beta de 0,34 h.

Ejemplo 11 Creación de fragmentos similares a Fab específicos dobles de V_{H}-V_{H} y de V_{\kappa} - V_{\kappa}

Este ejemplo describe un método para preparar fragmentos similares a Fab específicos dobles de V_{H}-V_{H} y de V_{\kappa}-V_{\kappa}. Antes de construir cada uno de los fragmentos similares a Fab descritos, los dAb que se unen a las dianas de selección se seleccionaron en primer lugar de bancos de dAb similares a los descritos en el ejemplo 9. Se aisló un dAb de V_{H}, HEL4, que se une a la lisozima del huevo de gallina (Sigma) y se aisló también un segundo dAb de V_{H} (TAR2h-5) que se fija al receptor de TNF\alpha (sistemas R y D). Las secuencias de éstos se proporcionan en el listado de secuencias. El dAb de V_{\kappa} que se une a TNF\alpha (TAR1-5-19) se aisló por selección y maduración de afinidad y la secuencia se indica también en el listado de secuencias. Un segundo dAb de V_{\kappa} (MSA 26) descrito en el ejemplo 9 cuya secuencia está en la figura 17B se utilizó también en estos experimentos.

El ADN procedente de los vectores de expresión que contienen los cuatro dAb descritos anteriormente se digirió con las enzimas SalI y NotI para escindir el ADN que codifica el dAb. Se purificó una banda del tamaño esperado (300 a 400 bp) realizando la digestión en un gel de agarosa y escindiendo la banda, seguido de purificación en gel que utiliza el kit de purificación en gel de Qiagen (Qiagen, UK). La codificación del ADN para los dAb se insertó a continuación en los vectores C_{H} o C_{\kappa} (Figuras 8 y 9) como se indica en la tabla a continuación.

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dAb	Antígeno diana	V_{H} de dAb o	Insertado en	Etiqueta	Resistencia al
		V_{\kappa} de dAb	el vector	(terminal C)	antibiótico
HEL4	Lisozima de huevo de gallina	V_{H}	C_{H}	myc	Cloranfenicol
TAR2-5	Receptor de TNF	V_{H}	C_{K}	flag	Ampicilina
TAR1-5-19	TNF \alpha	V_{\kappa}	C_{H}	myc	Cloranfenicol
MSA 26	Albúmina de suero de ratón	V_{\kappa}	C_{K}	flag	Ampicilina

Se transformaron conjuntamente los montajes V_{H} C_{H} y V_{H} C_{\kappa} _{} en células HB2151. Independientemente, los montajes V_{\kappa} C_{H} y V_{\kappa} C_{\kappa} se transformaron conjuntamente en células HB2151. Los cultivos de cada una de las líneas celulares cotransfectadas se cultivaron toda la noche (en 2xTy que contenían glucosa al 5%, 10 \mug/ml de cloranfenicol y 100 \mug/ml de ampicilina para mantener la selección del antibiótico para ambos plásmidos C_{H} y C_{\kappa}). Los cultivos de toda la noche se utilizaron para inocular medio reciente (2xTy, 10 \mug/ml de cloranfenicol y 100 \mug/ml de ampicilina) y se cultivaron hasta una D.O. de 0,7 a 0,9 antes de la inducción por adición de IPTG para expresar sus montajes C_{H} y C_{\kappa}. El fragmento expresado similar a Fab se purificó a continuación en el periplasma mediante purificación de la proteína A (para los V_{H} C_{H} y V_{H} C_{\kappa} cotransformados) y purificación mediante la resina de afinidad para MSA (para los V_{\kappa} C_{H} y V_{\kappa} C_{\kappa} cotransformados).

V_{H}-V_{H} específico doble

Se determinó la expresión del V_{H} C_{H} y del V_{H} C_{\kappa} específicos dobles introduciendo la proteína en un gel. El gel se transfirió y se pudo detectar una banda del tamaño esperado para el fragmento Fab en la transferencia Western mediante la etiqueta myc y la etiqueta flag, indicando que ambas partes V_{H} C_{H} y V_{H} C_{\kappa} del fragmento similar a Fab estaban presentes. A continuación, para determinar si las dos mitades del específico doble estaban presentes en el mismo fragmento similar a Fab, se recubrió una placa de ELISA durante la noche a 4ºC con 100 \mul por pocillo de lisozima de huevo de gallina (HEL) a razón de 3 mg/ml en tampón de bicarbonato sódico. Se bloqueó a continuación la placa (como se describe en el ejemplo 1) con PBS en Tween al 2% seguido de incubación con el fragmento similar a Fab V_{H} C_{H}/V_{H} C_{\kappa} específico doble. La detección del enlace del específico doble al HEL fue mediante la cadena no afín que utiliza 9e10 (anticuerpo monoclonal que se une a la etiqueta myc, Roche) e IgG-HRP antirratón (Amersham Pharmacia Biotech). La señal para el fragmento similar a Fab de V_{H} C_{H}/V_{H} C_{\kappa} específico doble fue 0,154 comparada con una señal de fondo de 0,069 para la cadena V_{H} C_{\kappa} expresada sola. Esto demuestra que el fragmento similar a Fab presenta especificidad de enlace para el antígeno diana.

V_{\kappa} - V_{\kappa} específico doble

Después de purificar el fragmento similar a Fab de V_{\kappa} C_{H} y V_{\kappa} C_{\kappa} específico doble cotransformado en una resina de afinidad a MSA, se utilizó la proteína resultante para sondar una placa de ELISA recubierta con 1 \mug/ml de TNF\alpha y una placa de ELISA recubierta con 10 \mug/ml de MSA. Como estaba previsto, era la señal por encima del fondo cuando se detectaba con proteína L-HRP en placas de ELISA (datos no representados). Esto indicaba que la fracción de proteína capaz de unirse a MSA (y por consiguiente purificadas en la columna de afinidad a MSA) era también capaz de unirse a TNF\alpha en un ELISA posterior, confirmando la especificidad doble del fragmento de anticuerpo. Esta fracción de proteína se utilizó a continuación para dos experimentos posteriores. En primer lugar, una placa de ELISA recubierta con 1 \mug/ml de TNF\alpha se sondó con un fragmento similar a Fab de V_{\kappa} C_{H} y V_{\kappa} C_{\kappa} específico doble y también con un TNF\alpha de referencia que se une a dAb a una concentración calculada para proporcionar una señal similar en el ELISA. Se utilizaron tanto el específico doble como el dAb de referencia para sondar la placa ELISA en presencia y en ausencia de 2 mg/ml de MSA. La señal en el pocillo específico doble se redujo en más del 50% pero la señal en el pocillo de dAb no se redujo completamente (véase la figura 19a). La misma proteína se colocó también en el análisis del receptor con y sin MSA y la competición por MSA se demostró también (véase la figura 19c). Esto demuestra que la fijación de MSA al específico doble es competitiva con la fijación al TNF\alpha.

Ejemplo 12 Creación de un V_{\kappa} - V_{\kappa} específico doble unido al V_{\kappa} - V_{\kappa} cis específico doble con especificidad para albúmina de suero de ratón y TNF\alpha

Este ejemplo describe un método para preparar un fragmento específico de anticuerpo específico doble para albúmina de suero de ratón y TNF\alpha por acoplamiento químico mediante un enlace disulfuro. Tanto MSA16 (del ejemplo 1) como los dAb de TAR1-5-19 se volvieron a clonar en un vector pET basado en un vector con una cisteína con terminal C y sin etiquetas. Los dos dAb se expresaron a concentraciones de 4 a 10 mg y se purificaron en el sobrenadante utilizando resina de afinidad a la proteína L-agarosa (Affitech, Noruega). Los dAb marcados con cisteína se redujeron a continuación con ditiotreitol. dAb de TAR1-5-19 se acopló a continuación con ditiodipiridina para la reforma del bloque de enlace disulfuro que producen la formación homodímeros PEP 1-5-19. Los dos dAb diferentes se mezclaron a continuación a pH 6,5 para favorecer la formación del enlace disulfuro y la generación de los heterodímeros TAR1-5-19, enlazados en cis por MSA16. Este método para la producción de conjugados de dos proteínas diferentes fue descrito originalmente por King et al. (King TP, Li Y., Kochoumian L. Biochemistry. 1978 vol. 17:1499-506. Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation). Se separaron los heterodímeros de las especies monoméricas por intercambio catiónico. La separación se confirmó por la presencia de una banda del tamaño esperado en un gel de SDS. Se probaron las especies heterodiméricas resultantes en el análisis del receptor de TNF y se observó que presentaban un IC50 para neutralizar el TNF de aproximadamente 18 nM. A continuación, se repitió el análisis del receptor con una concentración constante de heterodímero (18 nM) y una dilución en serie de MSA y HSA. La presencia de HSA en un intervalo de concentraciones (hasta 2 mg/ml) no produjo una reducción de la capacidad del dímero para inhibir TNF\alpha. Sin embargo, la adición de MSA produjo una reducción dependiente de la dosis en la capacidad del dímero para inhibir TNF\alpha (figura 20). Esto demuestra que MSA y TNF\alpha compiten para unirse al TAR1-5-19 unido en cys, dímero MSA16.

Resumen de datos

En el Anexo 4 se indica un resumen de datos obtenido en los experimentos indicados en los ejemplos anteriores.

Todas las publicaciones mencionadas en la presente memoria y las referencias citadas en dichas publicaciones, se incorporan a la presente memoria como referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y del sistema descritos de la invención serán evidentes para los expertos en la materia sin apartarse del alcance ni del espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en relación con las formas de realización específicas preferidas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debería estar limitada indudablemente a dichas formas de realización específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos de poner en práctica la invención descritos que son obvios para los expertos en biología molecular o en los campos relacionados se pretende que estén dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

\newpage

Anexo 1

Polipéptidos que prolongan la vida media in vivo

\vskip1.000000\baselineskip

: Glucoproteína alfa-1 (orosomucoide) (AAG)

: Antiquiromotripsina alfa-1 (ACT)

: Antitripsina alfa-1 (AAT)

: Microglobulina alfa-1 (proteína HC) (AIM)

: Macroglobulina alfa-2 (A2M)

: Antitrombina III (AT III)

: Apoliproteína A-1 (Apo A-1)

: Apoliproteína B (Apo B)

: Beta-2-Microglobulina (B2M)

: Ceruloplasmina (Cp)

: Componente complementario (C3)

: Componente complementario (C4)

: Inhibidor de C1 esterasa (C1 INH)

: Proteína C-reactiva (CRP)

: Cistacina C (Cys C)

: Ferritina (FER)

: Fibrinógeno (FIB)

: Fibronectina (FN)

: Haptoglobina (Hp)

: Hemopexina (HPX)

: Inmunoglobulina A (IgA)

: Inmunoglobulina D (IgD)

: Inmunoglobulina E (IgE)

: Inmunoglobulina G (IgG)

: Inmunoglobulina M (IgM)

: Cadenas ligeras de inmunoglobulina (kappa/lambda)

: Lipoproteína(a) [Lp(a)]

: Proteína de unión a la manosa (MBP)

: Mioglobina (Myo)

: Plasminógeno (PSM)

: Prealbúmina (transtirretina) (PAL)

\newpage

Anexo 1 (continuación)

\vskip1.000000\baselineskip

: Proteína que se une al retinol (RBP)

: Factor reumatoide (RF)

: Amiloide A del suero (SAA)

: Receptor soluble de transferrina (sTfR)

: Transferrina (Tf)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Anexo 2

4

5

6

7

8

9

10

11

Anexo 3

Combinaciones oncológicas

12

13

14

15

16

17

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18

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

19

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\cr}

20

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\cr}

21

\newpage

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\cr}

22

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\cr}

23

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24

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25

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26

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\cr}

27

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

28

<110> Domantis Limited

\hskip1cm

Winter, Greg

\hskip1cm

Tomlinson, Ian

\hskip1cm

Ignatovich, Olga

\hskip1cm

Holt, Lucy

\hskip1cm

De Angelis, Elena

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Ligando

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P014435WO ATM

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/GB 03/02804

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2003-06-30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/GB2002/003014

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-06-28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 0230202.4

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-12-27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HEL4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(360)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HEL4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR2-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(348)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR2-5

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5-19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5-19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR2-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR2-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(360)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR2-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

40

\vskip0.800000\baselineskip

: 41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5-19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5-19

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5-19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb1: Pareja de dAB en TAR1-5d1 (3U linker), d5 (5U ligador), d6 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb1: Pareja de dAB en TAR1-5d1 (3U ligador), d5 (5U ligador), d6 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

50

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb2: Pareja de dAB en TAR1-5d2 (3U ligador), d3 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb2: Pareja de dAB en TAR1-5d2 (3U ligador), d3 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly}

\sac{Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala}

\sac{Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb2: Pareja de dAB en TAR1-5d2 (3U ligador), d3 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

55

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb2: Pareja de dAB en TAR1-5d2 (3U ligador), d3 (5U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb3: Pareja de dAB en TAR1-5d4 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb3: Pareja de dAB en TAR1-5d4 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

59

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero - dAb3: Pareja de dAB en TAR1-5d4 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-27

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

64

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d1 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

67

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d1 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly}

\sac{Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d1 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d1 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d2 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d2 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly}

\sac{Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d2 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d2 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d7 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

77

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d7 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d7 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d7 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d8 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d8 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly}

\sac{Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d8 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d8 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d12 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

88

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d12 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly}

\sac{Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d12 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d12 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d16 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d16 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d16 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d23 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

97

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d23 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly}

\sac{Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d23 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d23 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d30 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d30 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly}

\sac{Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d30 (7U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d30 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d31 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

105

106

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<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d31 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d31 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d31 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d36 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

110

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d36 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d36 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

113

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d36 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d37 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

116

117

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d37 (7U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d37 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d39 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d39 (7U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR1-27d39 (7U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

123

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR2h-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(345)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR2h-5

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR2h-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

127

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d1 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d1 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d1 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

131

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d2 (3U ligador)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(345)

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<223>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

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133

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<210> 81

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d2 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

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<211> 58

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d2 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d2 (3U ligador)

\newpage

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136

137

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<210> 84

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<211> 357

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d3 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(357)

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<223>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

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138

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<210> 85

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<211> 29

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d3 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

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\sa{Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly}

\sac{Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d3 (3U ligador)

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139

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<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d3 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

140

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d4 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(357)

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<223>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

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141

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d4 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly}

\sac{Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d4 (3U ligador)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

143

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d4 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

144

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

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<211> 357

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d5 (3U ligador)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(357)

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<223>

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip1.000000\baselineskip

145

146

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d5 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d5 (3U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

148

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d6 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(345)

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<223>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

149

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d6 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly}

\sac{Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d6 (3U ligador)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

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151

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<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d6 (3U ligador)

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d7 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(357)

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<223>

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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157

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d7 (3U ligador)

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d8 (3U ligador)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(357)

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d8 (3U ligador)

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<212> ADN

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<220>

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<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d9 (3U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(357)

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<223>

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\vskip0.400000\baselineskip

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165

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<212> PRT

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<220>

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<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d9 (3U ligador)

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\sa{Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly}

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<211> 86

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d9 (3U ligador)

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167

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d9 (3U ligador)

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d10 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

169

170

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d10 (5U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

171

172

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d10 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

173

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d11 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

174

175

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d11 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly}

\sac{Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d11 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

176

177

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d11 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

178

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d12 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d12 (5U ligador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

180

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d12 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

182

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d13 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

183

184

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d13 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly}

\sac{Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d13 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

185

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monómero de pareja de dAB en TAR2h-5d13 (5U ligador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

186

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 720

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Anticuerpo específico dual

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(720)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

187

188

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Anticuerpo específico dual

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

189

190

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vectores 1 y 2 de dominio variables

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (69)..(332)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

191

192

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vectores 1 y 2 de dominio variables

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

193

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vectores 1 y 2 de dominio variables

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Inserción en el dominio V únicamente del vector 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

1000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Inserción en el dominio V únicamente del vector 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His His His His His His Gly Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH K8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

194

195

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VH2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

196

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VH4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VH4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VHC11

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

199

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VHA10sd

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

200

\vskip0.800000\baselineskip

: 201

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VHA10sd

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

202

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VHA1sd

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

203

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VHa5sd

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VHA5sd

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

206

207

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VHC5sd

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

208

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de VH VHC11sd

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de Vkappa K8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

210

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de Vkappa E5sd

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de Vkappa C3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena de Vkappa C3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de VH para la biblioteca 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(348)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de VH para la biblioteca 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

216

217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de VH para la biblioteca 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

218

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de VH para la biblioteca 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(360)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (307)..(308)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó t ó c ó g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (310)..(311)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó t ó c ó g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (313)..(314)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó t ó c ó g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (316)..(317)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó t ó c ó g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

219

220

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (103)..(103)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" en la situación 103 se codifica mediante nnk, que codifica todos los aminoácidos así como el codón TAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (104)..(104)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" en la situación 104 se codifica mediante nnk, que codifica todos los aminoácidos así como el codón TAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (105)..(105)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" en la situación 105 se codifica mediante nnk, que codifica todos los aminoácidos así como el codón TAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (106)..(106)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "Xaa" en la situación 106 se codifica mediante nnk, que codifica todos los aminoácidos así como el codón TAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de VH para la biblioteca 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

221

222

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de VH para la biblioteca 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44)..(45)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó t ó c ó g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47)..(48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó t ó c ó g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (50)..(51)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó t ó c ó g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (53)..(54)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó t ó c ó g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

223

224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de Vkappa para la biblioteca 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de Vkappa para la biblioteca 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia ficticia de Vkappa para la biblioteca 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

227

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> anti MSA dAb MSA 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

228

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> anti MSA dAb MSA 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

229

230

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> anti MSA dAb MSA 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

231

232

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> anti MSA dAb MSA 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

233

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly}

\sac{Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly}

\sac{Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly}

\sac{Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly}

\sac{Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly}

\sac{Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly}

\sac{Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly}

\sac{Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly}

\sac{Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly}

\sac{Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador de polipéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

300

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggccatggc gtcaacggac at

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtgcgctc gagcgtttga ttt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Forma modificada de la articulación humana IgGC1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5-19CYS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

234

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5-19CYS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

236

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TAR1-5-19CYS

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

237

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggagcgcgt cgacggacat ccagatgacc cagtctcca

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagcagccg gatccttatt agcaccgttt gatttccac

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Tyr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Lys Ser Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Tyr His Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Tyr Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Asn Trp Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Trp His Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Tyr Leu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Tyr His Leu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Trp His Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Arg Tyr Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Lys Tyr Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Tyr Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ser Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg His Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Lys Tyr Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Tyr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Lys His Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Lys His Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Val Tyr Gln Met Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH CDR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ser Tyr Gln Met Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa ficticia CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa se codifica mediante nkk, que codifica todos los aminoácidos así como el codón TAG.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Ser Xaa Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Ser Pro Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ala Ser Tyr Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ala Ser Val Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Ser Ser Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ala Ser Leu Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ala Ser His Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ala Ser Lys Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Ser Arg Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Ser Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ala Ser His Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Trp Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH dummy CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ile Ser Ala Phe Gly Ala Lys Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH CDR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa ficticia CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Thr Tyr Ser Val Pro Pro Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Thr Tyr Arg Ile Pro Pro Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Val Val Tyr Trp Pro Val Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Arg Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Gly Leu Tyr Pro Pro Ile Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Asn Val Val Ile Pro Arg Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Ser Ala Val Tyr Pro Lys Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Arg Leu Leu Tyr Pro Lys Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Arg Ala Arg Trp Pro Arg Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Val Ala Arg Val Pro Arg Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Tyr Val Gly Tyr Pro Arg Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Thr Thr Tyr Tyr Pro Ile Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Val Leu Tyr Tyr Pro Gln Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Val Val Tyr Trp Pro Ala Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

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\sa{Gln Gln Asn Leu Phe Trp Pro Arg Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

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\sa{Gln Gln Met Leu Phe Tyr Pro Lys Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Vkappa CDR3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Val Gly Arg Tyr Pro Lys Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gly Lys Phe Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Asp His Asn Tyr Ser Leu Phe Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HA tag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatccttatg atgttcctga ttatgca

\hfill

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HA tag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala}

Claims

1. Ligando doble-específico que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina con cadena pesada que presenta una especificidad de fijación a un primer epítopo o antígeno y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina con cadena ligera que presenta una actividad de fijación a un segundo epítopo o antígeno, en el que la fijación a uno o ambos de dichos antígenos o epítopos actúa para prolongar la vida media del ligando in vivo y en el que dichos primer y segundo dominios no son un dominio variable con cadena pesada y un dominio variable con cadena ligera que comparte la misma especificidad, con la condición de que dicho ligando doble-específico no esté constituido por un dominio V_{H} de anti-HSA y por un dominio V_{\kappa} de anti-\beta galactosidasa.

2. Ligando doble-específico según la reivindicación 1, en el que se proporcionan dominios variables como un fragmento de anticuerpo scFv.

3. Ligando doble-específico según la reivindicación 1, en el que se proporcionan dominios variables como una región Fab del anticuerpo.

4. Inmunoglobulina IgG con cuatro cadenas que comprende un ligando doble-específico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Inmunoglobulina IgG con cuatro cadenas según la reivindicación 4, en la que dicha IgG comprende dos ligandos doble-específicos siendo dichos ligandos doble-específicos idénticos en sus dominios variables.

6. Inmunoglobulina IgG con cuatro cadenas según la reivindicación 4, en la que dicha IgG comprende dos ligandos doble-específicos, siendo dichos ligandos doble-específicos diferentes en sus dominios variables.

7. Ligando que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina que presenta una primera especificidad de fijación al antígeno o epítopo y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina que presenta una segunda especificidad de fijación del antígeno o epítopo en el que uno o ambos de dichos primer y segundo dominios variables se unen a un antígeno que prolonga la vida media del ligando in vivo, y

(ii): el primer y el segundo dominios variables de inmunoglobulina son dominios variables con cadena ligera.

con la condición de que cuando los primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina sean dominios VHH camélidos, el dominio VHH que es específico para un antígeno que prolonga la vida media del ligando in vivo no se una a la lisozyma de la clara de huevo de gallina (HEL), a la alfa-amilasa pancreática porcina; a NmC-A, a hcg, al colorante azo RR6 unido a BSA o a las células HG982 de S. mutans.

8. Ligando según la reivindicación 7, en el que el ligando comprende los primer y segundo dominios VHH camélidos.

9. Ligando según la reivindicación 7, en el que el primer y/o el segundo dominio variable es humano.

10. Ligando doble-específico según la reivindicación 8 ó 9, en el que los dominios variables simples son idénticos.

11. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los primer y segundo dominios se unen independientemente, de manera que el ligando doble-específico puede unirse simultáneamente tanto a los primeros como a los segundos epítopos o antígenos.

12. Ligando según la reivindicación 11, en el que el ligando doble-específico comprende una primera forma y una segunda forma en equilibrio en solución, en el que ambos epítopos o antígenos se unen a la primera forma independientemente pero compiten para unirse a la segunda forma.

13. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichos primer y segundo epítopos están presentes en antígenos separados.

14. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dichos primer y segundo epítopos están presentes en el mismo antígeno.

15. Ligando doble-específico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los dominios variables están asociados de manera no covalente.

16. Ligando doble-específico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las regiones variables están asociadas de manera covalente.

17. Ligando doble-específico según la reivindicación 16, en el que la asociación covalente está mediada por enlaces disulfuros.

18. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un dominio variable simple específico para TNF\alpha, que presenta una constante de disociación (K_{d}) de 1x10^{-8} M o menos para TNF\alpha humano, y una constante de velocidad K_{off} de 1x10^{-3} s^{-1} o menos, determinadas por resonancia de plasmón superficial.

19. Ligando según la reivindicación 18, en el que el dominio específico para TNF\alpha es V_{\kappa}.

20. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para el receptor 1 de TNF (p55), que presenta una constante de disociación (K_{d}) de 1x10^{-8} M o menos para el receptor 1 de TNF, y una constante de velocidad K_{off} de 1x10^{-3} s^{-1} o menos, determinadas por resonancia de plasmón superficial.

21. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que un dominio específico para TNF\alpha o p55 neutraliza TNF\alpha o el receptor 1 de TNF\alpha humanos en un análisis de células estándar con una ND50 de 50 nM o menos.

22. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para el receptor 1 de TNF (p55), en el que el dAb antagoniza la actividad del receptor 1 de TNF en un análisis de células estándar con una ND50 \leq 100 nM y a una concentración \leq 10 \muM el dAb agoniza la actividad del receptor 1 de TNF por \leq 5% en el análisis.

23. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un dominio variable simple específico para la albúmina del suero (SA) que presenta una constante de disociación (K_{d}) comprendida entre 1 nM y 500 \muM para SA, como es determinada por resonancia de plasmón superficial.

24. Ligando según la reivindicación 23, en el que el dominio específico para SA se une a SA en un ensayo estándar de fijación del ligando con un IC50 comprendido entre 1 nM y 500 \muM.

25. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para TNF\alpha, y que comprende la secuencia de aminoácidos de TAR1-5-19 identificada por su secuencia en las páginas 2 y 3 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

26. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para TNF\alpha, y que comprende la secuencia de aminoácidos de TAR1-5 identificada por su secuencia en las páginas 2 y 3 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

27. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para TNF\alpha, y que comprende la secuencia de aminoácidos de TAR1-27 identificada por su secuencia en la página 4 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

28. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para el receptor 1 de TNF, y que comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-10 identificada por su secuencia en la página 2 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

29. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para el receptor 1 de TNF, y que comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-10 identificada por su secuencia en la página 2 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 90% homóloga a ésta.

30. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para el receptor 1 de TNF, y que comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-5 identificada por su secuencia en la página 1 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

31. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para el receptor 1 de TNF, y que comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-5 identificada por su secuencia en la página 1 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 90% homóloga a ésta.

32. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para SA, y que comprende la secuencia de aminoácidos de MSA-16 identificada por su secuencia en la figura 16 o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

33. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende un dominio variable simple específico para SA, y que comprende la secuencia de aminoácidos de MSA-26 identificada por su secuencia en la figura 16 o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

34. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, que comprende un dominio variable simple específico para SA como se ha definido en la reivindicación 23 ó 24.

35. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 34, en el que TNF\alpha, el receptor 1 de TNF o SA es una forma humana.

36. Ligando doble-específico que comprende un dAb de TNF alfa anti-humano y un dAb anti-SA.

37. Ligando según la reivindicación 36, en el que los dAb son dominios V_{HH} camélidos.

38. Ligando según la reivindicación 37, en el que el dAb anti-TNF alfa es un dominio específico para TNF\alpha como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 18, 19, 21 y 25 a 27.

39. Ligando según la reivindicación 37, en el que el dAb anti-SA es un dominio específico para SA como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 23, 24, 32 y 33.

40. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un armazón universal.

41. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un armazón V_{H} seleccionado de entre el grupo constituido por DP47, DP45 y DP38; y/o un armazón V_{L} que es DPK9.

42. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un sitio de fijación para un ligando genérico.

43. Ligando según la reivindicación 42, en el que el sitio de fijación a un ligando genérico se selecciona de entre el grupo constituido por proteína A, proteína L y proteína G.

44. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando comprende un dominio variable que presenta una o más regiones con armazón que comprenden una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región con armazón correspondiente codificada por un segmento génico del anticuerpo de la línea germinal humana o las secuencias de aminoácidos de una o más de dichas regiones con armazón que comprende en conjunto hasta 5 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de dicha
región con armazón correspondiente codificada por un segmento génico del anticuerpo de la línea germinal humana.

45. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, en el que el ligando comprende un dominio variable, en el que las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 son las mismas que las secuencia de aminoácidos de las regiones con armazón correspondientes codificadas por un segmento génico del anticuerpo de la línea germinal humana o las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 contienen en conjunto hasta 10 diferencias de aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de las regiones con armazón correspondientes codificadas por dicho segmento génico del anticuerpo de la línea germinal humana.

46. Ligando según las reivindicaciones 44 ó 45, que comprende un dominio variable de anticuerpo que comprende las regiones de FW1, FW2 y FW3, y las secuencias de aminoácidos de dichos FW1, FW2 y FW3 son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones con armazón correspondientes codificadas por los segmentos génicos del anticuerpo de la línea germinal humana.

47. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46, en el que dicho segmento génico del anticuerpo de la línea germinal humana se selecciona de entre el grupo constituido por DP47, DP45 y DP48 y DPK9.

48. Ligando según la reivindicación 1 ó 7, en el que cada dominio variable con cadena pesada no es un dominio variable de camélidos de inmunoglobulina.

49. Ligando según la reivindicación 1 ó 7, que comprende por lo menos un dominio variable con cadena pesada que no contiene uno o más aminoácidos que son específicos para los dominios variables de camélidos de inmunoglobulina en comparación con los dominios V_{H} humanos.

50. Método para la producción de un ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglobulina que presenta una primera especificidad de fijación y un segundo dominio variable simple de inmunoglobulina simple que presenta una segunda especificidad de fijación, siendo una o ambas especificidades de fijación específicas para un antígeno que prolonga la vida media del ligando in vivo, comprendiendo el método las etapas siguientes:

(c): combinar las regiones variables; y

(d): seleccionar el ligando por su capacidad para unirse a dichos primer y segundo epítopos; en el que, cuando dichos dominios variables son un dominio variable con cadena pesada y cadena ligera; el dominio variable con cadena pesada no es un dominio V_{H} específico para HSA.

51. Método según la reivindicación 50, en el que dicho primer dominio variable se selecciona para unirse a dicho primer epítopo en ausencia de un dominio variable complementario.

52. Método según la reivindicación 51, en el que dicho primer dominio variable se selecciona para unirse a dicho primer epítopo en presencia de un tercer dominio variable complementario en el que dicho tercer dominio variable es diferente de dicho segundo dominio variable.

53. Ácido nucleico que codifica por lo menos un ligando doble-específico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 49.

54. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de TAR1-5-19 identificada por su secuencia en las páginas 2 y 3 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 70% homóloga a ésta.

55. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de TAR1-5 identificada por su secuencia en la página 3 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 70% homóloga a ésta.

56. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de TAR1-27 identificada por su secuencia en la página 4 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 70% homóloga a ésta.

57. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de TAR2-10 identificada por su secuencia en la página 2 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 70% homóloga a ésta.

58. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de TAR2-10 identificada por su secuencia en la página 2 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

59. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de TAR2-5 identificada por su secuencia en la página 1 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 70% homóloga a ésta.

60. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de TAR2-5 identificada por su secuencia en la página 1 del listado de secuencias o una secuencia que es por lo menos 80% homóloga a ésta.

61. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de MSA-16 identificada por su secuencia en la figura 16 o una secuencia que es por lo menos 70% homóloga a ésta.

62. Ácido nucleico según la reivindicación 53, que comprende la secuencia de ácido nucleico de MSA-26 identificada por su secuencia en la figura 16 o una secuencia que es por lo menos 70% homóloga a ésta.

63. Vector que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 53 a 62.

64. Vector según la reivindicación 63, que comprende además componentes necesarios para la expresión de un ligando doble-específico.

65. Célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 64.

66. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 49 para su utilización en terapia.

67. Composición farmacéutica que comprende un ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 49, y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

68. Ligando doble-específico que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglogulina que presenta especificidad de fijación para la albúmina de suero (SA) y un segundo dominio variable simple de inmunoglogulina que presenta especificidad de fijación para un antígeno seleccionado de entre el grupo constituido por el receptor de EPO, ApoE, Apo-SAA, BDNF, cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor 10 de crecimiento de fibroblastos, ligando FLT3, fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-\beta1, insulina, IFN-\gamma, IGF-I, IGF-II, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), inhibina \alpha, inhibina \beta, IP-10, factor 2 de crecimiento de queratinocitos (KGF-2), KGF, leptina, LIF, linfotactina, sustancia inhibidora mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, factor-1 inhibidor precursor mieloide (MPIF-1), NAP-2, neurturina, factor de crecimiento de nervios, \beta-NGF, NT-3, NT-4, oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1\alpha, SDF1\beta, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-\alpha, TGF-\beta, TGF-\beta2, TGF-\beta3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-\alpha, TNF-\beta, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-\beta, GRO-\gamma, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 y HER 4.

69. Ligando doble-específico que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglogulina que presenta especificidad de fijación para la albúmina de suero (SA) y un segundo dominio variable simple de inmunoglogulina que presenta especificidad de fijación para un antígeno seleccionado de entre el grupo constituido por proteínas humanas o animales, citocinas, receptores de citocina, enzimas, cofactores enzimáticos y proteínas de fijación al ADN.

70. Ligando doble-específico que comprende un primer dominio variable simple de inmunoglogulina que presenta especificidad de fijación para la albúmina de suero (SA) y un segundo dominio variable simple de inmunoglogulina que presenta especificidad de fijación para un receptor de una citosina indicada en la reivindicación 68.

71. Ligando según la reivindicación 68, 69 ó 70, en el que cada uno de entre los primer y segundo dominios es

(i): un dominio variable con cadena pesada o

(ii): un dominio variable con cadena ligera.

72. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 68 a 71, en el que el dominio anti-SA es como se ha definido según cualquiera de las reivindicaciones 23, 24, 32 y 33.

73. Ácido nucleico que comprende dichas secuencias de ácidos nucleicos como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 53 a 62.

74. Vector que comprende ácido nucleico según la reivindicación 73.

75. Célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 74.

76. Ligando según cualquiera de las reivindicaciones 68 a 72 para su utilización en terapia.

77. Composición farmacéutica que comprende un ligando según cualquiera de las reivindicaciones 68 a 72 y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.