BR112014015238B1

BR112014015238B1 - Método ex vivo para preparar um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse compreendendo identificar sequências de ácido nucleico a partir de linfócitos b de camundongo geneticamente modificado pela colocação de um gene adam6

Info

Publication number: BR112014015238B1
Application number: BR112014015238-1A
Authority: BR
Inventors: Lynn MacDonald; Cagan Gurer; Karolina A. Hosiawa; Sean Stevens; Andrew J. Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2012-12-17
Publication date: 2022-11-16
Also published as: AU2015238803B2; AU2022221449A1; KR102081657B1; JP6728308B2; US9622459B2; IL233153A0; BR112014015238A2; PT2793567T; CY1121638T1; AU2017251797A1; HRP20190897T1; TR201903439T4; IL233153B; JP2015502177A; RU2014127339A; SG11201403326VA; US20230337646A1; KR102156139B1; IN2014DN06094A; JP2020168014A

Abstract

MÉTODO PARA PREPARAR UM ANIMAL NÃO HUMANO, USO DA CÉLULA OU TECIDO DERIVADO DO ANIMAL NÃO HUMANO, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO. São fornecidos animais não humanos, tecidos, células e material genético que compreendem uma modificação de uma sequência de imunoglobulina de cadeia pesada não humana endógena e compreendem uma atividade funcional de ADAM6 em um camundongo, em que os animais não humanos expressam um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana e um domínio variável de cadeia leve (Lambda) de imunoglobulina humana cognata.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO

[0001] São descritos animais férteis, não humanos e geneticamente modificados que expressam sequências variáveis de cadeia leve X de imunoglobulina de humano cognatas com sequências variáveis de cadeia pesada de humano. São descritas as células, embriões e tecidos de camundongos geneticamente modificados que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica um ADAM6a funcional em um locus ADAM6 de camundongo, em que as células, embriões e tecidos de camundongos compreendem segmentos de gene de cadeia leve lambda de imunoglobulina de humano que são capazes de rearranjar para formar um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina funcional. As modificações incluem loci humanos e/ou humanizados de imunoglobulina. Os camundongos que compreendem função de ADAM6 são descritos, incluindo camundongos que compreendem uma sequência ectópica de ácido nucleico que codifica uma proteína de ADAM6. Os camundongos machos geneticamente modificados, que compreendem uma modificação genética de um locus endógeno de região VH de imunoglobulina de camundongo, e que compreendem adicionalmente a atividade de ADAM6 são descritos, incluindo camundongos que compreendem uma sequência ectópica de ácido nucleico que recupera a fertilidade no camundongo macho.

[0002] São descritos animais férteis, não humanos e geneticamente modificados que compreendem uma eliminação ou uma modificação de um gene endógeno ADAM6, ou homólogo ou ortólogo do mesmo, e que compreendem uma modificação genética que recupera a função de ADAM6 (ou homólogo ou ortólogo do mesmo) por completo ou em parte, em que os animais não humanos expressam uma sequência variável X de imunoglobulina de humano no contexto de uma sequência constante de cadeia leve X ou uma K.

FUNDAMENTOS

[0003] As aplicações farmacêuticas para anticorpos nas últimas duas décadas fundamentaram uma grande quantidade de pesquisa no preparo de anticorpos que são adequados para uso como terapêuticos humanos. Os terapêuticos a base de anticorpo iniciais, baseados em anticorpos de camundongos, não eram ideais como terapêuticos de humano em decorrência da administração repetida de anticorpos de camundongo em humanos resultar em problemas de imunogenicidade, que podem levar a regimes de tratamento a longo prazo. As soluções que se baseiam na humanização de anticorpos de camundongo, para torná-los mais parecidos com humano e menos do tipo camundongo foram desenvolvidas. Métodos para expressar sequências de imunoglobulina de humano para posterior uso em anticorpos basearam-se principalmente na expressão in vitro de bibliotecas de imunoglobulina de humano em fagos, bactérias ou leveduras. Finalmente, foram realizadas tentativas para produzir anticorpos humanos utilizáveis a partir de linfócitos de humano in vitro, em camundongos enxertados com células hematopoiéticas de humano, e em camundongos transcromossômicos ou transgênicos com os loci endógenos de imunoglobulina inativados. Nos camundongos transgênicos, foi necessário inativar os genes endógenos de imunoglobulina de camundongo, de maneira a integrar aleatoriamente transgenes completamente humanos que podem funcionar como a fonte de sequências de imunoglobulina expressa no camundongo. Tais camundongos podem produzir anticorpos de humano adequados para uso como terapêuticos de humano, mas estes camundongos exibem problemas substanciais com seus sistemas imunes. Estes problemas (1) tornam os camundongos improváveis para gerar um repertório de anticorpo suficientemente diverso, (2) exigem o uso de reparos genéticos extensivos, (3) fornecem um processo de seleção clonal sub ideal, provavelmente em virtude da incompatibilidade entre elementos de humano e camundongo, e (4) tornam estes camundongos uma fonte não confiável de grandes e diversas populações de sequências variáveis de humano, necessárias para serem verdadeiramente usadas para produzir terapêuticos de humano.

[0004] Os camundongos transgênicos que contêm transgenes de anticorpo completamente humano contêm transgenes inseridos aleatoriamente, que contêm sequências variáveis não rearranjadas de cadeia pesada de imunoglobulina de humano (sequências V, D, e J) ligadas às sequências constantes de cadeia pesada de humano, e sequências variáveis não rearranjadas de cadeia leve de imunoglobulina de humano (V e J) ligadas às sequências constantes de cadeia leve de humano. Portanto, os camundongos geram genes rearranjados de anticorpo a partir dos loci sem ser loci endógenos de camundongo, onde os genes rearranjados de anticorpo são completamente humanos. Em geral, os camundongos contêm sequências de cadeia pesada de humano e sequências de cadeia leve K de humano, embora os camundongos com pelo menos algumas sequências X de humano também tenham sido relatados. Os camundongos transgênicos em geral apresentam loci de imunoglobulina danificados e não funcionais, ou inativação de loci endógenos de imunoglobulina, de maneira tal que os camundongos sejam incapazes de rearranjar sequências de anticorpo de humano em um locus endógeno de imunoglobulina de camundongo. As diferenças de tais camundongos transgênicos os tornam menos que o ideal para gerar um repertório de anticorpo de humano suficientemente diverso em camundongos, provavelmente em virtude pelo menos em parte de um processo de seleção clonal sub ideal, que relaciona moléculas de anticorpo completamente humano em um sistema de seleção endógeno de camundongo.

[0005] Assim , permanece uma necessidade na técnica para produzir melhores animais não humanos geneticamente modificados, que são usados para gerar sequências de imunoglobulina, incluindo sequências de anticorpo de humano, e que são usados para gerar um repertório de anticorpo de humano suficientemente diverso. Também permanece uma necessidade de camundongos que são capazes de rearranjar segmentos de gene de imunoglobulina para formar genes rearranjados de imunoglobulina utilizáveis, incluindo domínios variáveis de cadeia pesada de humano que são cognatos com domínios variáveis X de humano ou K de humano, ou que são capazes de produzir proteínas de loci alterados de imunoglobulina, incluindo loci que contêm uma seleção suficientemente diversa de sequências de cadeia leve X de humano e/ou k de humano. Existe uma necessidade de animais não humanos que podem gerar regiões variáveis de anticorpo tanto a partir de segmentos k de humano quanto X de humano, em que os segmentos k de humano e X de humano são cognatos com domínios variáveis de cadeia pesada de humano. É também uma necessidade aumentar o uso de sequências X de humano de animais geneticamente modificados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] São descritos animais não humanos geneticamente modificados que compreendem uma modificação que reduz ou elimina a atividade de um Gene de ADAM6 ou homólogo ou ortólogo do mesmo, em que a modificação resulta em uma perda de fertilidade, e os animais compreendem adicionalmente uma sequência que codifica uma atividade que complementa ou recupera a perda ou atividade reduzida de ADAM6 (ou atividade homóloga ou ortóloga), e os animais não humanos compreendem adicionalmente modificações que possibilitem que os mesmos expressem regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de humano, que são congnatas com regiões variáveis de cadeia leve X de imunoglobulina de humano. Em vários aspectos, as regiões variáveis de cadeia leve X de imunoglobulina de humano são expressas fundidas a regiões constantes X ou K.

[0007] Em vários aspectos, a sequência que codifica a atividade de ADAM6 é contígua com uma sequência de imunoglobulina de humano. Em vários aspectos, a sequência que codifica a atividade de ADAM6 é contígua com uma sequência de imunoglobulina não humana. Em vários aspectos, a sequência está presente no mesmo cromossomo do locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana endógena do animal não humano. Em vários aspectos, a sequência está presente em um cromossomo diferente do locus de cadeia pesada de imunoglobulina do animal não humano.

[0008] São descritos animais não humanos geneticamente modificados que compreendem uma modificação que mantém a atividade de um gene de ADAM6 ou homólogo ou ortólogo do mesmo, em que a modificação inclui inserção de um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano a montante de uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana, e os animais não humanos compreendem adicionalmente modificações que possibilitem que os mesmos expressem regiões variáveis de cadeia leve X de imunoglobulina de humano cognatas com regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Em vários aspectos, as regiões variáveis de cadeia leve X de imunoglobulina de humano são expressas fundidas a regiões constantes X ou K.

[0009] Em vários aspectos, a inserção de um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano é realizada 3’ ou a jusante do gene de ADAM6 do animal não humano. Em vários aspectos, a inserção de um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano é realizada de uma maneira tal que o(s) gene(s) de ADAM6 do animal não humano não seja interrompido, eliminado e/ou funcionalmente silenciado, de maneira tal que a atividade de ADAM6 do animal não humano esteja no mesmo nível ou em nível comparável em um animal não humano que não contém uma inserção como esta. As interrupções, eliminações e/ou modificações funcionalmente silenciosas exemplares incluem qualquer das modificações que resultam em uma redução, eliminação e/ou perda de atividade da(s) proteína(s) ADAM6 codificada(s) pelo(s) gene(s) de ADAM6 do animal não humano.

[00010] Em um aspecto, são fornecidos construtos de ácido nucleico, células, embriões, camundongos, e métodos para produzir camundongos que compreendem uma modificação que resulta em uma proteína ADAM6 ou gene de ADAM6 endógeno não funcional de camundongo (por exemplo, uma inativação ou uma eliminação em um gene de ADAM6 endógeno), em que os camundongos compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento desta que é funcional em um camundongo macho.

[00011] Em um aspecto, são fornecidos construtos de ácido nucleico, células, embriões, camundongos, e métodos para produzir camundongos que compreendem uma modificação de um locus endógeno de imunoglobulina de camundongo, em que os camundongos compreendem uma proteína ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento desta que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, o locus endógeno de imunoglobulina de camundongo é um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, e a modificação reduz ou elimina atividade de ADAM6 de uma célula ou tecido de um camundongo macho.

[00012] Em um aspecto, são fornecidos camundongos que compreendem uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica um ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste; também são fornecidos camundongos que compreendem uma sequência endógena de nucleotídeo que codifica um ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste, e pelo menos uma modificação genética de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00013] Em um aspecto, são fornecidos métodos para produzir camundongos que compreendem uma modificação de um locus endógeno de imunoglobulina de camundongo, em que os camundongos compreendem uma proteína ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento desta que é funcional em um camundongo macho.

[00014] Em um aspecto, são fornecidos métodos para produzir camundongos que compreendem uma modificação genética de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, em que a aplicação dos métodos resulta em camundongos machos que compreendem um locus modificado de cadeia pesada de imunoglobulina (ou um eliminação deste), e os camundongos machos são capazes de gerar descendentes por cruzamento. Em uma modalidade, os camundongos machos são capazes de produzir espermatozoide que pode transitar de um útero de camundongo até um oviduto de camundongo para fertilizar um óvulo de camundongo.

[00015] Em um aspecto, são fornecidos métodos para produzir camundongos que compreendem uma modificação genética de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina e um locus de cadeia leve de imunoglobulina, em que a aplicação dos métodos para modificar o locus de cadeia pesada resulta em camundongos machos que exibem uma redução na fertilidade, e os camundongos compreendem uma modificação genética que recupera por completo ou em parte a redução na fertilidade. Em várias modalidades, a redução na fertilidade é caracterizada por uma incapacidade do espermatozoide dos camundongos machos migrar de um útero de camundongo até um oviduto de camundongo, para fertilizar um óvulo de camundongo. Em várias modalidades, a redução na fertilidade é caracterizada por espermatozoides que exibem um defeito na migração in vivo. Em várias modalidades, a modificação genética que recupera por completo ou em parte a redução na fertilidade é uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene de ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste que é funcional em um camundongo macho.

[00016] Em uma modalidade, a modificação genética compreende substituir loci endógenos variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina por loci variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de uma outra espécie (por exemplo, uma espécie sem ser camundongo). Em uma modalidade, a modificação genética compreende inserção de loci ortólogos variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina em loci endógenos variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a espécie é humana. Em uma modalidade, a modificação genética compreende eliminação de um locus endógeno variável de cadeia pesada de imunoglobulina por completo ou em parte, em que a eliminação resulta em uma perda de função endógena de ADAM6. Em uma modalidade específica, a perda de função endógena de ADAM6 está associada com uma redução na fertilidade em camundongos machos.

[00017] Em uma modalidade, a modificação genética compreende inativação de um locus endógeno variável de cadeia pesada de imunoglobulina não humana por completo ou em parte, em que a inativação não resulta em uma perda de função endógena de ADAM6. A inativação pode incluir substituição ou eliminação de um ou mais segmentos de gene não humanos endógenos, resultando em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana endógena que é substancialmente incapaz de rearranjar para codificar uma cadeia pesada de um anticorpo que compreende segmentos de gene não humanos endógenos. Inativação pode incluir outras modificações que tornam o locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina incapaz de rearranjar para codificar a cadeia pesada de um anticorpo, em que a modificação não inclui substituição ou eliminação de segmentos de gene endógenos. Modificações exemplares incluem inversões e/ou translocações cromossomais mediadas por técnicas moleculares, por exemplo, usando localização exata de sítios de recombinação específica para sítio (por exemplo, tecnologia Cre-lox). Outras modificações exemplares incluem tornar impossível a ligação operável entre os segmentos de gene variáveis de imunoglobulina não humana e as regiões constantes de imunoglobulina não humana.

[00018] Em uma modalidade, a modificação genética compreende inserir no genoma do animal não humano um fragmento de DNA contendo um ou mais segmentos de gene VH de humano, um ou mais segmentos de gene DH de humano e um ou mais segmentos de gene JH de humano de uma outra espécie (por exemplo, uma espécie sem ser camundongo) operavelmente ligados a uma ou mais sequências de região constante (por exemplo, um gene de IgM e/ou um IgG). Em uma modalidade, o fragmento de DNA é capaz de se submeter a rearranjos no genoma do animal não humano para formar uma sequência que codifica um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade, a espécie é humana. Em uma modalidade, a modificação genética compreende inserção de um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano a jusante ou 3’ de um gene de ADAM6 endógeno do animal não humano, de maneira tal que atividade de ADAM6 (por exemplo, expressão e/ou função de uma proteína codificada) é a mesma ou comparável a um animal não humano que não compreende a inserção.

[00019] Em um aspecto, são fornecidos camundongos que compreendem uma modificação que reduz ou elimina a expressão de ADAM6 de camundongo a partir de um alelo endógeno de ADAM6, de maneira tal que um camundongo macho com a modificação exiba uma fertilidade reduzida (por exemplo, uma capacidade muito reduzida de gerar descendentes por cruzamento), ou seja essencialmente infértil, em virtude da redução ou eliminação de função endógena de ADAM6, em que os camundongos compreendem adicionalmente uma sequência ectópica de ADAM6, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional da mesma. Em um aspecto, a modificação que reduz ou elimina expressão de ADAM6 de camundongo é uma modificação (por exemplo, uma inserção, uma eliminação, uma substituição, etc.) em um locus de imunoglobulina de camundongo.

[00020] Em uma modalidade, a redução ou perda de função de ADAM6 compreende uma incapacidade ou incapacidade substancial dos camundongos em produzir espermatozoide que pode ir de um útero de camundongo até um oviduto de camundongo para fertilizar um óvulo de camundongo. Em uma modalidade específica, pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % das células de espermatozoide produzidas em um volume de ejaculação dos camundongos são incapazes de atravessar por um oviduto in vivo após a cópula e fertilizar um óvulo de camundongo.

[00021] Em uma modalidade, a redução ou perda de função de ADAM6 compreende uma incapacidade de formar ou incapacidade substancial de formar um complexo de ADAM2, e/ou ADAM3, e/ou ADAM6 em uma superfície de uma célula de espermatozoide dos camundongo. Em uma modalidade, a perda de função de ADAM6 compreende uma incapacidade substancial para fertilizar um óvulo de camundongo por cópula com um camundongo fêmea.

[00022] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que perde um gene funcional de ADAM6 endógeno, e compreende uma proteína (ou uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica uma proteína) que confere funcionalidade de ADAM6 nos camundongos. Em uma modalidade, o camundongo é um camundongo macho e a funcionalidade compreende melhor fertilidade comparado a um camundongo que perde um gene funcional de ADAM6 endógeno.

[00023] Em uma modalidade, a proteína é codificada por uma sequência genômica localizada em um locus de imunoglobulina na linhagem germinativa dos camundongo. Em uma modalidade específica, o locus de imunoglobulina é um locus de cadeia pesada. Em ua outra modalidade específica, o locus de cadeia pesada compreende pelo menos um segmento de gene VH de humano, pelo menos um DH de humano e pelo menos um JH de humano. Em uma modalidade, a proteína ectópica é codificada por uma sequência genômica localizada em um locus não associado à imunoglobulina na linhagem germinativa dos camundongos. Em uma modalidade, o locus não associado à imunoglobulina é um locus transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o locus transcricionalmente ativo é o locus ROSA26. Em uma modalidade específica, o locus transcricionalmente ativo está associado com expressão específica do tecido. Em uma modalidade, a expressão específica do tecido está presente em tecidos reprodutivos. Em uma modalidade, a proteína é codificada por uma sequência genômica inserida aleatoriamente na linhagem germinativa dos camundongos.

[00024] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma cadeia leve de humano, ou humano/camundongo quimérico ou humano/rato quimérico (por exemplo, variável de humano, constante de camundongo ou rato) e um variável quimérico de cadeia pesada/constante de humano, camundongo ou de rato. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende um transgene que compreende um variável quimérico de gene de cadeia leve constante de humano/rato ou camundongo operavelmente ligado a um promotor transcricionalmente ativo, por exemplo, um promotor ROSA26. Em uma modalidade adicionalmente específica, o transgene de cadeia leve quimérico de humano/camundongo ou rato compreende uma sequência de região variável de cadeia leve rearranjada de humano na linhagem germinativa dos camundongos.

[00025] Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo é localizada em um locus de imunoglobulina na linhagem germinativa dos camundongos. Em uma modalidade específica, o locus de imunoglobulina é um locus de cadeia pesada. Em uma modalidade, o locus de cadeia pesada compreende pelo menos um segmento de gene VH de humano, pelo menos um DH de humano e pelo menos um JH de humano. Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo é localizada em um locus não associado à imunoglobulina na linhagem germinativa dos camundongos. Em uma modalidade, o locus não associado à imunoglobulina é um locus transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o locus transcricionalmente ativo é o locus ROSA26. Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo está posicionada e inserida aleatoriamente na linhagem germinativa dos camundongos.

[00026] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que perde um gene funcional de ADAM6 endógeno, em que o camundongo compreende uma sequência ectópica de nucleotídeo que complementa a perda de função de ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo confere ao camundongo uma capacidade de produzir descendentes, que é comparável a um camundongo tipo selvagem correspondente que contém um gene funcional de ADAM6 endógeno. Em uma modalidade, a sequência confere ao camundongo uma capacidade de formar um complexo de ADAM2, e/ou ADAM3, e/ou ADAM6 na superfície de célula de espermatozoide dos camundongos. Em uma modalidade, a sequência confere ao camundongo uma capacidade de migrar de um útero de camundongo até um oviduto de camundongo no um óvulo de camundongo, para fertilizar o óvulo.

[00027] Em uma modalidade, o camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno e que compreende a sequência ectópica de nucleotídeo produz pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % do número de ninhadas de uma cepa de camundongo tipo selvagem da mesma idade e produz em um período de tempo de seis meses.

[00028] Em uma modalidade, o camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno e que compreende a sequência ectópica de nucleotídeo produz pelo menos cerca de 1,5 vez, cerca de 2 vezes, cerca de 2,5 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 7 vezes, cerca de 8 vezes, ou cerca de 10 vezes ou mais progênie quando gerado por um período de tempo de seis meses do que um camundongo da mesma idade e da mesma cepa ou similar, que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno e que perde a sequência ectópica de nucleotídeo, que é gerado por substancialmente o mesmo período de tempo e substancialmente nas mesmas condições.

[00029] Em uma modalidade, o camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno e que compreende a sequência ectópica de nucleotídeo produz uma média de pelo menos cerca de 2 vezes, 3 vezes, ou 4 vezes mais o número de filhotes por ninhada em um período de gestação de 4 ou 6 meses do que um camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno, e que perde a sequência ectópica de nucleotídeo, e que pe gerado pelo mesmo período de tempo.

[00030] Em uma modalidade, o camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno e que compreende a sequência ectópica de nucleotídeo é um camundongo macho, e o camundongo macho produz espermatozoide que, quando recuperado dos ovidutos em cerca de 5-6 horas após a cópula reflete uma migração no oviduto que é pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, 100 vezes, 110 vezes, ou 120 vezes ou maior que em um camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno e que perde a sequência ectópica de nucleotídeo.

[00031] Em uma modalidade, o camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno e que compreende a sequência ectópica de nucleotídeo, quando copulado com um camundongo fêmea, gera espermatozoide que é capaz de atravessar o útero e entrar e atravessar o oviduto em cerca de 6 horas, em uma eficiência que é em geral igual ao do espermatozoide de um camundongo tipo selvagem.

[00032] Em uma modalidade, o camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 endógeno e que compreende a sequência ectópica de nucleotídeo produz cerca de 1,5 vez, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, ou cerca de 4 vezes ou mais ninhadas em um período de tempo comparável a um camundongo que perde o gene funcional de ADAM6 e que perde a sequência ectópica de nucleotídeo.

[00033] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende em sua linhagem germinativa uma sequência de ácido nucleico não associada à camundongo que codifica uma proteína imunoglobulina, em que a sequência de imunoglobulina não associada à camundongo compreende uma inserção de um gene de ADAM6 de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina não associada à camundongo compreende uma sequência de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, a sequência compreende uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, a sequência compreende um human sequência de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência compreende um ou mais segmentos de gene V, um ou mais segmentos de gene D, e um ou mais segmentos de gene J; em uma modalidade, a sequência compreende um ou mais segmentos de gene V e um ou mais segmentos de gene J. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene V, D e J, ou um ou mais segmentos de gene V e J, são não rearranjados. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene V, D e J, ou um ou mais segmentos de gene V e J, são rearranjados. Em uma modalidade, após o rearranjo do um ou mais segmentos de gene V, D e J, ou um ou mais segmentos de gene V e J, o camundongo compreende em seu genoma pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene de ADAM6 de camundongo, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, após o rearranjo, o camundongo compreende em seu genoma pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codificam um gene de ADAM6 de camundongo, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, após o rearranjo, o camundongo compreende em seu genoma pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene de ADAM6 de camundongo, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, o camundongo compreende o gene de ADAM6, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional deste em uma célula B. Em uma modalidade, o camundongo compreende o gene de ADAM6, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional deste em uma célula não B.

[00034] Em um aspecto, são fornecidos camundongos que expressam uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano ou fragmento funcional deste a partir de um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, em que os camundongos compreendem uma atividade de ADAM6 que é funcional em um camundongo macho.

[00035] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem um único alelo não modificado endógeno de ADAM6, ou ortólogo, de homólogo ou fragmento funcional deste em um locus endógeno de ADAM6.

[00036] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequência ectópica de ADAM6 de camundongo, ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste que codifica uma proteína que confere função de ADAM6.

[00037] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequência de ADAM6, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional da mesma em um local no genoma do camundongo que se aproxima do local do alelo endógeno de camundongo de ADAM6, por exemplo, 3’ de uma sequência de segmento de gene V e 5’ de um segmento de gene D inicial.

[00038] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequência de ADAM6, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional da mesma flanqueada a montante, a jusante, ou a montante e a jusante (com relação à direção da transcrição da sequência de ADAM6) de uma sequência de ácido nucleico que codifica um segmento de gene variável de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o segmento de gene variável de imunoglobulina é um segmento de gene de humano. Em uma modalidade, o segmento de gene variável de imunoglobulina é um segmento de gene de humano, e a sequência que codifica o camundongo ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste funcional em um camundongo está entre segmentos de gene V de humano; em uma modalidade, o camundongo compreende dois ou mais segmentos de gene V de humano, e a sequência esta em uma posição entre o segmento de gene V final e o penúltimo segmento de gene V; em uma modalidade, a sequência está em uma posição após o segmento de gene V final e o primeiro segmento de gene D.

[00039] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequência de ADAM6, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional da mesma que está localizada em uma posição em um locus endógeno de imunoglobulina, que é o mesmo ou substancialmente o mesmo em um camundongo macho tipo selvagem. Em uma modalidade específica, o locus endógeno é incapaz de codificar a região variável de cadeia pesada de um anticorpo, em que a região variável compreende ou é derivada de um segmento de gene endógeno não humano. Em uma modalidade específica, o locus endógeno está posicionado em um local no genoma dos camundongos macho que torna-o incapaz de codificar a região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em várias modalidades, os camundongos machos compreendem uma sequência de ADAM6 localizada no mesmo cromossomo dos segmentos de gene de imunoglobulina de humano e a sequência de ADAM6 codifica uma proteína ADAM6 funcional.

[00040] Em um aspecto, é fornecido um camundongo macho que compreende um gene de ADAM6 endógeno não funcional, ou uma eliminação de um gene de ADAM6 endógeno, em sua linhagem germinativa; em que células de espermatozoide dos camundongos são capazes de transitar em um oviduto de um camundongo fêmea e fertilizar um óvulo.

[00041] Em um aspecto, é fornecido um camundongo macho que compreende um gene funcional de ADAM6 endógeno e uma modificação em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a modificação é realizada a jusante, ou 3’ do gene de ADAM6 endógeno. Em uma modalidade, a modificação é uma substituição de um ou mais segmentos de gene endógenos de cadeia pesada de imunoglobulina com um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, a modificação é uma inserção de um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano a montante de um gene endógeno de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00042] Em um aspecto, são fornecidos camundongos que compreendem uma modificação genética que reduz função de ADAM6 endógeno de camundongo, em que o camundongo compreende pelo menos alguma funcionalidade de ADAM6 fornecida tanto por um alelo endógeno não modificado, que é funcional por completo ou em parte (por exemplo, um heterozigoto), quanto por expressão de uma sequência ectópica que codifica um ADAM6, ou um ortólogo, ou homólogo ou fragmento funcional deste, que é funcional em um camundongo macho.

[00043] Em uma modalidade, os camundongos compreendem função de ADAM6 suficiente para conferir em camundongos machos a capacidade de gerar descendentes por cruzamento, comparado com camundongos machos que perdem um ADAM6 funcional. Em uma modalidade, a função de ADAM6 é conferida pela presença de uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica um ADAM6 de camundongo, ou um homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, a função de ADAM6 é conferida por um gene de ADAM6 endógeno presente em um locus endógeno de imunoglobulina, em que o locus endógeno de imunoglobulina é incapaz de codificar a região variável de cadeia pesada de um anticorpo. ADAM6, homólogos, ou ortólogos ou fragmentos deste que são funcionais em um camundongo macho incluem aqueles que recuperam, por completo ou em parte, a perda da capacidade de gerar descendentes observada em um camundongo macho, que perde suficiente atividade endógena de ADAM6 de camundongo, por exemplo, a perda na capacidade observada em um ADAM6 inativado de camundongo. Neste sentido, camundongos com ADAM6 inativado incluem camundongos que compreendem um locus endógeno ou fragmento deste, mas que não é funcional, isto é, que não expressa ADAM6 (ADAM6a e/ou ADAM6b) de maneira alguma, ou que expressa ADAM6 (ADAM6a e/ou ADAM6b) em um nível que é insuficiente para auxiliar uma capacidade essencialmente normal de gerar descendentes de um camundongo tipo selvagem macho. A perda de função pode ser, por exemplo, em virtude de uma modificação em um gene estrutural do locus (isto é, em uma região que codifica ADAM6a ou ADAM6b) ou em uma região regulatória do locus (por exemplo, em uma sequência 5’ no gene ADAM6a, ou 3’ da região que codifica ADAM6a ou ADAM6b, em que a sequência controla, por completo ou em parte, a transcrição de um gene de ADAM6, expressão de um RNA DE ADAM6, ou expressão de uma proteína ADAM6). Em várias modalidades, ortólogos, ou homólogos ou fragmentos destes, que são funcionais em um camundongo macho, são aqueles que possibilitam que um espermatozoide de um camundongo macho (ou a maioria das células de espermatozoide na ejaculação de um camundongo macho) transite em um oviduto de camundongo e fertilize um óvulo de camundongo.

[00044] Em uma modalidade, camundongos machos que expressam a região variável de imunoglobulina de humano, ou fragmento funcional da mesma, compreendem atividade suficiente de ADAM6 para conferir aos camundongos machos a capacidade de gerar descendentes por cruzamento com camundongo fêmeas e, em uma modalidade, os camundongos machos exibem uma capacidade de gerar descendentes quando cruzados com camundongo fêmeas, isto é, em uma modalidade pelo menos 25 %, em uma modalidade, pelo menos 30 %, em uma modalidade pelo menos 40 %, em uma modalidade pelo menos 50 %, em uma modalidade pelo menos 60 %, em uma modalidade pelo menos 70 %, em uma modalidade pelo menos 80 %, em uma modalidade pelo menos 90 %, e em uma modalidade cerca dos mesmo camundongos com um ou dois alelos endógenos não modificados de ADAM6.

[00045] Em uma modalidade camundongos machos expressam ADAM6 suficiente (ou um ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste) para possibilitar que uma célula de espermatozoide dos camundongos machos atravesse um oviduto de camundongo fêmea e fertilize um óvulo de camundongo.

[00046] Em uma modalidade, a funcionalidade de ADAM6 é conferida por uma sequência de ácido nucleico que é contígua com uma sequência cromossômica de camundongo (por exemplo, o ácido nucleico é integrado aleatoriamente em um cromossomo de camundongo; ou colocado em um local específico, por exemplo, alvejando o ácido nucleico em um local específico, por exemplo, por inserção mediada por recombinase específica para sítio (por exemplo, mediada por Cre) ou recombinação homóloga). Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 está presente em um ácido nucleico que é distinto de um cromossomo dos camundongos (por exemplo, a sequência de ADAM6 está presente em um epissomo, isto é, extracromossalmente, por exemplo, em um construto de expressão, um vetor, um YAC, um transcromossomo, etc.).

[00047] Em um aspecto, são fornecidos camundongos geneticamente modificados e células que compreendem uma modificação de um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina, em que os camundongos expressam pelo menos uma porção de uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina, por exemplo, pelo menos uma porção de uma sequência de humano, em que os camundongos compreendem uma atividade de ADAM6 que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a modificação reduz ou elimina uma atividade de ADAM6 dos camundongos. Em uma modalidade, o camundongo é modificado de maneira tal que ambos os alelos que codificam a atividade de ADAM6 estão tanto ausentes quanto expressam um ADAM6 que não funciona substancialmente para auxiliar cruzamento normal em um camundongo macho. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma sequência ectópica de ácido nucleico que codifica um ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, a modificação mantém atividade de ADAM6 dos camundongos e torna um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina incapaz de codificar uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade específica, a modificação inclui inversões e ou translocações cromossomais que tornam os segmentos de gene endógenos variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina incapazes de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, que é operavelmente ligada a uma região constante de cadeia pesada.

[00048] Em um aspecto, são fornecidos camundongos geneticamente modificados e células que compreendem uma modificação de um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina, em que a modificação reduz ou elimina a atividade de ADAM6 expressa a partir de uma sequência de locus de ADAM6, e em que os camundongos compreendem uma proteína ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional da mesma. Em várias modalidades, a proteína ADAM6 ou fragmento desta é codificada por uma sequência ectópica de ADAM6. Em várias modalidades, a proteína ADAM6 ou fragmento desta é expressa de um alelo endógeno de ADAM6. Em várias modalidades, o camundongo compreende um primeiro alelo de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo uma primeira modificação que reduz ou elimina expressão de um ADAM6 funcional a partir do primeiro alelo de cadeia pesada de imunoglobulina, e o camundongo compreende um segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma segunda modificação, que não reduz substancialmente ou não elimina a expressão de um ADAM6 funcional a partir do segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00049] Em várias modalidades, a modificação é a inserção de um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano a montante, ou 5’, de um gene endógeno de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina. Em várias modalidades, a modificação mantém o gene de ADAM6 endógeno localizado no locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00050] Em uma modalidade, a segunda modificação é localizada 3’ (com relação à direcionalidade transcricional do segmento de gene V de camundongos) de um segmento de gene V final de camundongo, e localizada 5’ (com relação a o direcionalidade transcricional da sequência constante) de um gene constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo (ou humano/camundongo quimérico), ou fragmento deste (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um: CH1 e/ou dobradiça e/ou CH2 e/ou CH3 de humano e/ou camundongo).

[00051] Em uma modalidade, a modificação é em um primeiro alelo de cadeia pesada de imunoglobulina, em um primeiro locus que codifica um primeiro alelo de ADAM6, e a função de ADAM6 resulta da expressão de um ADAM6 endógeno em um segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina, em um segundo locus que codifica um ADAM6 funcional, em que o segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina compreende pelo menos uma modificação de um segmento de gene V, D, e/ou J. Em uma modalidade específica, a pelo menos uma modificação do segmento de gene V, D, e/ou J é uma eliminação, uma substituição por um segmento de gene V, D, e/ou J de humano, uma substituição por um segmento de gene V, D, e/ou J de camelídeo, uma substituição por um segmento de gene V, D, e/ou J humanizado ou camelizado, uma substituição de uma sequência de cadeia pesada por uma sequência de cadeia leve, e uma combinação destes. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação é a eliminação de um ou mais segmentos de gene V, D e/ou J de cadeia pesada e uma substituição por um ou mais segmentos de gene V e/ou J de cadeia leve (por exemplo, um segmento de gene V e/ou J de cadeia leve de humano) no locus de cadeia pesada.

[00052] Em uma modalidade, a modificação é em um primeiro alelo de cadeia pesada de imunoglobulina em um primeiro locus, e um segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina em um segundo locus, e a função de ADAM6 resulta da expressão de um ADAM6 ectópico em um locus não associado à imunoglobulina na linhagem germinativa dos camundongos. Em uma modalidade específica, o locus não associado à imunoglobulina é o locus ROSA26. Em uma modalidade específica, o locus não associado à imunoglobulina é transcricionalmente ativo em tecido reprodutivo.

[00053] Em uma modalidade, a modificação é em um primeiro alelo de cadeia pesada de imunoglobulina em um primeiro locus, e um segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina em um segundo locus, e a função de ADAM6 resulta de um gene de ADAM6 endógeno na linhagem germinativa dos camundongos. Em uma modalidade específica, o gene de ADAM6 endógeno é justaposto por segmentos de gene de imunoglobulina de camundongo.

[00054] Em uma modalidade, a modificação é em um primeiro alelo de cadeia pesada de imunoglobulina em um primeiro locus, e um segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina em um segundo locus, e a função de ADAM6 resulta da expressão de uma sequência ectópica de ADAM6 em um primeiro alelo de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a modificação é em um primeiro alelo de cadeia pesada de imunoglobulina em um primeiro locus, e um segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina em um segundo locus, e a função de ADAM6 ou atividade resulta da expressão de um ADAM6 ectópico no segundo alelo de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00055] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma inativação heterozigota ou uma homozigota de ADAM6. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma sequência modificada de imunoglobulina, que é uma sequência de imunoglobulina humana ou humanizada, ou uma sequência de imunoglobulina de camelídeo, ou de humano camelizada ou de camundongo. Em uma modalidade, a sequência modificada de imunoglobulina está presente no locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência modificada de imunoglobulina compreende uma sequência de gene variável de cadeia pesada de humano em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência de gene variável de cadeia pesada de humano substitui uma sequência variável endógena de cadeia pesada no locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00056] Em um aspecto, é fornecido um camundongo incapaz de expressar um ADAM6 endógeno funcional de camundongo a partir de um locus de ADAM6 endógeno funcional. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma sequência ectópica de ácido nucleico que codifica um ADAM6, ou fragmento funcional deste, que é funcional no camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência ectópica de ácido nucleico codifica uma proteína que recupera uma perda na capacidade de gerar descendentes exibida por um camundongo macho, que é homozigoto para uma inativação de ADAM6. Em uma modalidade específica, a sequência ectópica de ácido nucleico codifica uma proteína ADAM6 de camundongo.

[00057] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que perde um Locus de ADAM6 endógeno funcional, e que compreende uma sequência ectópica de ácido nucleico que confere a função de ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência endógena de ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, a sequência endógena de ADAM6 de camundongo compreende sequência que codifica ADAM6a e ADAM6b localizada em um camundongo tipo selvagem entre o segmento de gene V de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo 3’ mais (VH) e o segmento de gene D de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo 5’ mais (DH).

[00058] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência que codifica ADAM6a de camundongo ou fragmento funcional da mesma, e/ou uma sequência que codifica ADAM6b de camundongo ou fragmento funcional da mesma, em que ADAM6a e/ou ADAM6b ou fragmento(s) funcional(s) deste é operavelmente ligado a um promotor. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de humano. Em uma modalidade, o promotor é o promotor ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade específica, o promotor ADAM6 compreende sequência localizada entre o primeiro códon do primeiro gene de ADAM6 mais próximo ao segmento de gene DH de camundongo 5’-mais e a sequência de sinal de recombinação do segmento de gene DH 5’-mais, em que 5’ é indicado com relação a direção de transcrição dos genes de imunoglobulina de camundongos. Em uma modalidade, o promotor é um promotor viral. Em uma modalidade específica, o promotor viral é um promotorde citomegalovírus (CMV). Em uma modalidade, o promotor é um promotor de ubiquitina.

[00059] Em uma modalidade, o promotor é um promotor indutível. Em uma modalidade, o promotor indutível regula a expressão em tecidos não reprodutivos. Em uma modalidade, o promotor indutível regula a expressão em tecidos reprodutivos. Em uma modalidade específica, a expressão das sequências ADAM6a e/ou ADAM6b de camundongos ou fragmento funcional(s) destas tem seu desenvolvimento regulado pelo promotor indutível em tecidos reprodutivos.

[00060] Em uma modalidade, o ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b são selecionados da sequência ADAM6a de SEQ ID NO:1 e/ou ADAM6b de SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, o promotor ADAM6 de camundongo é um promotor de SEQ ID NO:3. Em uma modalidade específica, o promotor ADAM6 de camundongo compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:3 diretamente a montante (com relação à direção da transcrição de ADAM6a) do primeiro códon de ADAM6a e que se estende da extremidade de SEQ ID NO:3 a montante da região que codifica ADAM6. Em uma outra modalidade específica, o promotor ADAM6 é um fragmento que se estende de cerca de 5 a cerca de 20 nucleotídeos a montante do códon inicial de ADAM6a a cerca de 0,5kb, 1kb, 2kb, ou 3kb ou mais a montante do códon inicial de ADAM6a.

[00061] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico compreende SEQ ID NO:3 ou um fragmento desta que, quando colocada em um camundongo que é infértil ou que apresenta pouca fertilidade em virtude de uma perda de ADAM6, melhora a fertilidade ou recupera fertilidade em cerca de uma fertilidade tipo selvagem. Em uma modalidade, SEQ ID NO:3 ou um fragmento desta confere a um camundongo macho a capacidade de produzir uma célula de espermatozoide que é capaz de atravessar um oviduto de camundongo fêmea a fim de fertilizar um óvulo de camundongo.

[00062] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é qualquer sequência que codifica um gene de ADAM6, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional deste que, quando colocado ou mantido em um camundongo, rende um nível de fertilidade que é a mesmo ou comparável a um camundongo tipo selvagem. Um nível exemplar de fertilidade pode ser demonstrada pela capacidade de um camundongo macho de produzir uma célula de espermatozoide que é capaz de atravessar um oviduto de camundongo fêmea, a fim de fertilizar um óvulo de camundongo.

[00063] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma eliminação de uma sequência endógena de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6, uma substituição de um segmento de gene VH endógeno de camundongo por um segmento de gene VH de humano, e uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento desta que é funcional em um camundongo macho.

[00064] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma eliminação de um locus endógeno de sequência de imunoglobulina de nucleotídeo que compreende um gene de ADAM6 endógeno, compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina de humano, e em que a sequência ectópica de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 de camundongo está ou é diretamente adjacente à sequência de nucleotídeo que codifica o um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina de humano.

[00065] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH endógenos por uma sequência de nucleotídeo que codifica um ou mais segmentos de gene VH de humano, e a sequência ectópica de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 de camundongo está, ou é diretamente adjacente a, na sequência de nucleotídeo que codifica o um ou mais segmentos de gene VH de humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de um ou mais segmentos de gene DH endógenos por um ou mais segmentos de gene DH de humano no locus de gene DH endógeno. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de um ou mais segmentos de gene JH endógenos por um ou mais segmentos de gene JH de humano no locus endógeno de gene JH. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH, DH e JH endógenos e uma substituição nos loci de gene endógeno VH, DH e JH por segmentos de gene VH, DH, e JH de humano, em que o camundongo compreende uma sequência ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma inserção de segmentos de gene VH, DH e JH de humano em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina, em que o camundongo compreende um gene de ADAM6 que é funcional no camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo é colocada entre o penúltimo segmento de gene VH 3’-mais dos segmentos de gene VH de humano presentes, e o último segmento de gene VH 3’ dos segmentos de gene VH de humano presentes. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma eliminação de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongo, e uma substituição com todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de humano, e a sequência ectópica de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 de camundongo é colocada a jusante de segmento de gene de humano VH1-2 e a montante de segmento de gene de humano VH6-1.

[00066] Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH endógenos por uma sequência de nucleotídeo que codifica um ou mais segmentos de gene VH de humano, e a sequência ectópica de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 de camundongo é, ou é diretamente adjacente a, a sequência de nucleotídeo que codifica o um ou mais segmentos de gene VH de humano.

[00067] Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 de camundongo está presente on um transgene no genoma dos camundongos. Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 de camundongo está presente extracromossalmente no camundongo.

[00068] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma modificação de um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina, em que o camundongo expressa uma célula B que compreende uma sequência de imunoglobulina rearranjada operavelmente ligada a uma sequência de gene de região constante de cadeia pesada, e o célula B compreende em seu genoma (por exemplo, em um cromossomo de célula B) um gene que codifica um ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste, que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina rearranjada e operavelmente ligada à sequência de gene de região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de cadeia pesada V, D, e/ou J de humano; uma sequência de cadeia pesada V, D, e/ou J de camundongo; uma sequência de cadeia leve V e/ou J de humano ou camundongo. Em uma modalidade, a sequência de gene de região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de cadeia pesada de humano ou um camundongo selecionado do grupo que consiste em um CH1, uma dobradiça, um CH2, um CH3, e uma combinação destes.

[00069] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende um locus endógeno funcionalmente silenciado de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina, em que a função de ADAM6 é mantida nos camundongo, e compreende adicionalmente uma inserção de um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina de humano a montante ou 5’ de uma ou mais região constante de cadeia pesada de camundongo. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina de humano incluem um ou mais segmentos de gene VH de humano, um ou mais segmentos de gene DH de humano e um ou mais segmentos de gene JH de humano. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende adicionalmente um locus endógeno funcionalmente silenciado de cadeia leve, em que o camundongo compreende uma atividade de ADAM6 que é a mesma ou comparável a um camundongo tipo selvagem, e compreende adicionalmente uma inserção de um ou mais segmentos de gene de cadeia leve A de humano a montante ou 5’ de uma região constante de cadeia leve de camundongo. Em uma modalidade, os segmentos de gene de cadeia leve A de humano compreendem 12 segmentos de gene Va de humano e um ou mais segmentos de gene JA de humano. Em uma modalidade, os segmentos de gene de cadeia leve A de humano compreendem 12 segmentos de gene VA de humano e quatro segmentos de gene JA de humano. Em uma modalidade, os segmentos de gene de cadeia leve A de humano compreendem 28 segmentos de gene VA de humano e um ou mais segmentos de gene JA de humano. Em uma modalidade, os segmentos de gene de cadeia leve A de humano compreendem 28 segmentos de gene VA de humano e quatro segmentos de gene JA de humano. Em uma modalidade, os segmentos de gene de cadeia leve A de humano compreendem 40 segmentos de gene VA de humano e um ou mais segmentos de gene JA de humano. Em uma modalidade, os segmentos de gene de cadeia leve A de humano compreendem 40 segmentos de gene VA de humano e quatro segmentos de gene JA de humano. Em várias modalidades, o quatro segmentos de gene JA de humano incluem JA1, JA2, JA3 e JA7. Em várias modalidades, a região constante de cadeia leve de camundongo é um CK de camundongo ou um CA de camundongo.

[00070] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado, em que o camundongo compreende um gene de cadeia leve de imunoglobulina funcionalmente silenciado, e compreende adicionalmente uma substituição de um ou mais segmentos de gene endógenos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina por um ou mais segmentos de gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humanos, em que o camundongo perde um locus de ADAM6 endógeno funcional, e em que o camundongo compreende uma sequência ectópica de nucleotídeo que expressa uma proteína ADAM6 de camundongo ou um ortólogo ou homólogo ou fragmento desta, que é funcional em um camundongo macho.

[00071] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que perde um locus ou sequência de ADAM6 endógeno funcional de camundongo, e que compreende uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica um locus ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional de um locus ou sequência de ADAM6 de camundongo, em que o camundongo é capaz de cruzar com um camundongo do sexo oposto para produzir uma progênie que compreende o locus ou sequência de ADAM6 ectópico. Em uma modalidade, o camundongo é macho. Em uma modalidade, o camundongo é fêmea.

[00072] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado, em que o camundongo compreende um segmento de gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano em um locus de gene endógeno de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, o camundongo perde uma sequência funcional endógena de ADAM6 no locus de gene endógeno de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, e em que o camundongo compreende uma sequência ectópica de nucleotídeo que expressa uma proteína ADAM6 de camundongo, ou um ortólogo, ou homólogo ou fragmento desta, que é funcional em um camundongo macho.

[00073] Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo que expressa a proteína ADAM6 de camundongo é extracromossômica. Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo que expressa a proteína ADAM6 de camundongo é integrada em um ou mais loci em um genoma dos camundongos. Em uma modalidade específica, o um ou mais loci incluem um locus de imunoglobulina.

[00074] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que expressa uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina a partir de um locus endógeno modificado de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, em que a cadeia pesada é derivada de um segmento de gene V de humano, um segmento de gene D, e um J segmento de gene, em que o camundongo compreende uma atividade de ADAM6 que é funcional no camundongo.

[00075] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma pluralidade de segmentos de gene V de humano, uma pluralidade de segmentos de gene D, e uma pluralidade de segmentos de gene J. Em uma modalidade, os segmentos de gene D são segmentos de gene D de humano. Em uma modalidade, os segmentos de gene J são segmentos de gene J de humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma sequência de região constante de cadeia pesada humanizada, em que a humanização compreende substituição de uma sequência selecionada de um CH1, dobradiça, CH2, CH3, e uma combinação deste. Em uma modalidade específica, a cadeia pesada é derivada de um segmento de gene V de humano, um segmento de gene D de humano, um segmento de gene J de humano, uma sequência CH1 de humano, uma sequência de dobradiça de humano ou camundongo, uma sequência CH2 de camundongo, e uma sequência CH3 de camundongo. Em uma outra modalidade específica, o camundongo compreende adicionalmente uma sequência constante de cadeia leve de humano.

[00076] Em uma modalidade, o camundongo compreende um gene de ADAM6 que é flanqueado 5’ e 3’ por segmentos de gene endógenos de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene endógenos de cadeia pesada de imunoglobulina são incapazes de codificar uma cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade específica, o gene de ADAM6 dos camundongos está em uma posição que é a mesma em um camundongo tipo selvagem, e os loci de gene variável endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina dos camundongos são incapazes de rearranjar para codificar uma cadeia pesada de um anticorpo.

[00077] Em uma modalidade, o segmento de gene V é flanqueado 5’ (com relação a direção transcricional do segmento de gene V) por uma sequência que codifica uma atividade de ADAM6 que é funcional no camundongo.

[00078] Em uma modalidade, o segmento de gene V é flanqueado 3’ (com relação a direção transcricional do segmento de gene V) por uma sequência que codifica uma atividade de ADAM6 que é funcional no camundongo.

[00079] Em uma modalidade, o segmento de gene D é flanqueado 5’ (com relação a direção transcricional do segmento de gene D) por uma sequência que codifica uma atividade de ADAM6 que é funcional no camundongo.

[00080] Em uma modalidade, a atividade de ADAM6 que é funcional no camundongo resulta da expressão de uma sequência de nucleotídeo localizada 5’ do segmento de gene D 5’-mais e 3’ do segmento de gene V 3’- mais (com relação à direção da transcrição do segmento de gene V) do locus endógeno modificado de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.

[00081] Em uma modalidade, a atividade de ADAM6 que é funcional no camundongo resulta da expressão de uma sequência de nucleotídeo localizada entre dois segmentos de gene V de humano no locus endógeno modificado de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, os dois segmentos de gene V de humano são um segmento de gene VH1-2 e um segmento de gene VH6-1 de humano.

[00082] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo compreende uma sequência selecionada de uma sequência de ADAM6b de camundongo ou fragmento funcional da mesma, uma sequência de ADAM6a de camundongo ou fragmento funcional da mesma, e uma combinação deste.

[00083] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo entre os dois segmentos de gene V de humano é colocada ao contrário da orientação de transcrição com relação aos segmentos de gene V de humano. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeo codifica, de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição de genes de ADAM6, e sequência de ADAM6a seguido por uma sequência de ADAM6b.

[00084] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de uma sequência de pseudogene de ADAM6 de humano entre segmentos de gene V de humano, VH1-2 e VH6-1, com uma sequência de ADAM6 de camundongo ou um fragmento funcional da mesma.

[00085] Em uma modalidade, a sequência que codifica a atividade de ADAM6 que é funcional no camundongo é uma sequência de ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma.

[00086] Em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene endógeno DFL16.1 de camundongo (por exemplo, em um camundongo heterozigoto para o locus endógeno modificado de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo), ou um segmento de gene DH1-1 de humano. Em uma modalidade, o segmento de gene D da cadeia pesada de imunoglobulina expresso pelo camundongo é derivado de um segmento de gene endógeno DFL16.1 de camundongo ou um segmento de gene DH1-1 de humano.

[00087] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste) em uma célula que carrega o DNA de linhagem de célula B não rearranjada, mas não compreende a sequência de ácido nucleico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste) em uma célula B que compreende loci rearranjados de imunoglobulina, em que a sequência de ácido nucleico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional deste) ocorre no genoma em uma posição que é diferente de uma posição em que um gene de ADAM6 de camundongo aparece em um camundongo tipo selvagem. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste) está presente em todas ou substancialmente todas as células que carregam DNA, que são linhagem de célula B não rearranjada; em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está presente em células de linhagem germinativa células dos camundongos, mas não em um cromossomo de uma célula B rearranjada.

[00088] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste) em todas ou substancialmente todas as células que carregam DNA, incluindo células B que compreendem loci rearranjados de imunoglobulina, em que a sequência de ácido nucleico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste) ocorre no genoma em uma posição que é diferente de uma posição em que um gene de ADAM6 de camundongo aparece em um camundongo tipo selvagem. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste) esta em um ácido nucleico que é contíguo com o locus rearranjado de imunoglobulina. Em uma modalidade, o ácido nucleico que é contíguo com o locus rearranjado de imunoglobulina é um cromossomo. Em uma modalidade, o cromossomo é um cromossomo que é encontrado em um camundongo tipo selvagem e o cromossomo compreende uma modificação de um locus de imunoglobulina de camundongo.

[00089] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado, em que o camundongo compreende uma célula B que compreende em seu genoma uma sequência de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste. Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste está em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste está em um locus que não é um locus de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 está em um transgene direcionado por um promotor heterólogo. Em uma modalidade específica, o promotor heterólogo é um promotor não associado à imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a célula B expressa uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste.

[00090] Em uma modalidade, 90 % ou mais das células B dos camundongos compreendem um gene que codifica uma proteína ADAM6, ou um ortólogo desta ou um homólogo desta, ou um fragmento desta que é funcional no camundongo. Em uma modalidade específica, o camundongo é um camundongo macho.

[00091] Em uma modalidade, o genoma da célula B compreende um primeiro alelo e um segundo alelo compreendendo a sequência de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste. Em uma modalidade, o genoma de célula B compreende um primeiro alelo, mas não um segundo alelo que compreende a sequência de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste.

[00092] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma modificação em um ou mais alelos endógenos de cadeia pesada de imunoglobulina, em que a modificação mantém um ou mais alelos endógenos de ADAM6, e o camundongo compreende adicionalmente uma inserção de um ou mais segmentos de gene VX de humano e um ou mais segmentos de gene JX de humano a montante de uma região constante de cadeia leve de camundongo. Em várias modalidades, a região constante de cadeia leve de camundongo é um CK de camundongo ou um CX de camundongo.

[00093] Em uma modalidade, a modificação torna o camundongo incapaz de expressar uma cadeia pesada funcional que compreende segmentos de gene endógenos rearranjados de cadeia pesada de pelo menos um alelo de cadeia pesada, e mantem um alelo endógeno de ADAM6 localizado no pelo menos um alelo endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00094] Em uma modalidade, os camundongos são incapazes de expressar uma cadeia pesada funcional que compreende segmentos de gene endógenos rearranjados de cadeia pesada de pelo menos um dos alelos endógenos de cadeia pesada de imunoglobulina, e os camundongos expressam e proteína ADAM6 de um alelo endógeno de ADAM6. Em uma modalidade específica, os camundongos são incapazes de expressar uma cadeia pesada funcional que compreende segmentos de gene endógenos rearranjados de cadeia pesada de dois alelos endógenos de cadeia pesada de imunoglobulina, e os camundongos expressam uma proteína ADAM6 de um ou mais alelos endógenos de ADAM6.

[00095] Em uma modalidade, os camundongos são incapazes de expressar uma cadeia pesada funcional de cada um dos alelos endógenos de cadeia pesada, e os camundongos compreendem um alelo funcional de ADAM6 localizado em 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ou 120 ou mais Mbp a montante (com relação à direção da transcrição do locus de cadeia pesada de camundongos) de uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade específica, o alelo funcional de ADAM6 está no locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, em uma região intergênica V-D, entre dois segmentos de gene V, entre um segmento de gene V e um D, entre um segmento de gene D e um J, etc.). Em uma modalidade específica, o alelo funcional de ADAM6 está localizado em uma sequência intergênica 90 a 100 kb entre o segmento de gene V final de camundongo e o primeiro segmento de gene D de camundongo.

[00096] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma modificação em um ou mais alelos endógenos de ADAM6.

[00097] Em uma modalidade, a modificação torna o camundongo incapaz de expressar uma proteína ADAM6 funcional de pelo menos um dos um ou mais alelos endógenos de ADAM6. Em uma modalidade específica, o camundongo é incapaz de expressar uma proteína ADAM6 funcional a partir de cada um dos alelos endógenos de ADAM6.

[00098] Em uma modalidade, os camundongos são incapazes de expressar uma proteína ADAM6 funcional de cada alelo endógeno de ADAM6, e os camundongos compreendem uma sequência ectópica de ADAM6.

[00099] Em uma modalidade, os camundongos são incapazes de expressar uma proteína ADAM6 funcional de cada alelo endógeno de ADAM6, e os camundongos compreendem uma sequência ectópica de ADAM6 localizada em 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ou 120 ou mais kb a montante (com relação à direção da transcrição do locus de cadeia pesada de camundongos) de uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência ectópica de ADAM6 está no locus endógeno de cadeia pesada (por exemplo, em uma região intergênica V-D, entre dois segmentos de gene V, entre um segmento de gene V e um D, entre um segmento de gene D e um J, etc.). Em uma modalidade específica, a sequência ectópica de ADAM6 está localizada em uma sequência intergênica 90 a 100 kb entre o segmento de gene V final de camundongo e o primeiro segmento de gene D de camundongo. Em uma outra modalidade específica, a sequência intergênica V-D endógena 90 a 100 kb é removida, e a sequência ectópica de ADAM6 é colocada entre o segmento de gene final V e o primeiro D.

[000100] Em um aspecto, é fornecido camundongo macho não fértil, em que o camundongo compreende uma eliminação de dois ou mais alelos endógenos de ADAM6. Em um aspecto, é fornecido um camundongo fêmea que é um carreador de uma característica da infertilidade do macho, em que o camundongo fêmea compreende em sua linhagem germinativa um alelo de ADAM6 não funcional ou uma inativação de um alelo endógeno de ADAM6.

[000101] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende um segmento de gene V, D, e/ou J endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina que é incapaz de rearranjar para codificar uma cadeia pesada de um anticorpo, em que a maioria das células B dos camundongos compreende um gene funcional de ADAM6. Em várias modalidades, a maioria das células B dos camundongos compreende adicionalmente um ou mais segmentos de gene VX de humano e um ou mais segmentos de gene JX de humano a montante de uma região constante de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, a região constante de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo é selecionada de um CK de camundongo e um CX de camundongo.

[000102] Em uma modalidade, o camundongo compreende segmentos de gene V, D e J endógenos e intactos de cadeia pesada de imunoglobulina que são incapazes de rearranjar para codificar uma cadeia pesada funcional de um anticorpo. Em uma modalidade, o camundongo compreende pelo menos um e até 89 segmentos de gene V, pelo menos um e até 13 segmentos de gene D, pelo menos um e até quatro segmentos de gene J, e uma combinação deste; em que o pelo menos um e até 89 segmentos de gene V, pelo menos um e até 13 segmentos de gene D, pelo menos um e até quatro segmentos de gene J são incapazes de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende um gene funcional de ADAM6 localizado nos segmentos de gene V, D e J endógenos intactos de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus endógeno de cadeia pesada que inclui um locus de ADAM6 endógeno, em que o locus endógeno de cadeia pesada compreende 89 segmentos de gene V, 13 segmentos de gene D, e quatro segmentos de gene J, em que os segmentos de gene endógenos de cadeia pesada são incapazes de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo e o locus de ADAM6 codifica uma proteína ADAM6 que é funcional no camundongo.

[000103] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que perde um segmento de gene V, D, e J endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina, em que uma maioria das células B dos camundongos compreendem uma sequência de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo desta. Em uma modalidade, a maioria das células B dos camundongos expressa uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio variável lambda de humano e uma região constante endógena de cadeia leve de imunoglobulina.

[000104] Em uma modalidade, o camundongo perde segmentos de gene endógenos de cadeia pesada de imunoglobulina selecionados de dois ou mais segmentos de gene V, dois ou mais segmentos de gene D, dois ou mais segmentos de gene J, e uma combinação deste. Em uma modalidade, o camundongo perde segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina selecionados de pelo menos um e até 89 segmentos de gene V, pelo menos um e até 13 segmentos de gene D, pelo menos um e até quatro segmentos de gene J, e uma combinação deste. Em uma modalidade, o camundongo perde um fragmento de DNA genômico do cromossomo 12 compreendendo cerca de três megabases do locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o camundongo perde todos os segmentos de gene V, D e J endógenos funcionais de cadeia pesada. Em uma modalidade específica, o camundongo perde 89 segmentos de gene VH, 13 segmentos de gene DH e quatro segmentos de gene JH.

[000105] Em um aspecto, é fornecido um camundongo, em que o camundongo apresenta um genoma na linhagem germinativa compreendendo uma modificação de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, em que a modificação no locus de cadeia pesada de imunoglobulina compreende a substituição de uma ou mais sequência de região variável de imunoglobulina de camundongo por um ou mais sequência de região variável de imunoglobulina não associada ao camundongo, e em que o camundongo compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade preferida, as sequências DH e JH e pelo menos 3, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 40, pelo menos 60, ou pelo menos 80 sequências VH do locus de cadeia pesada de imunoglobulina são substituídas pela sequência de região variável de imunoglobulina não associada ao camundongo. Em uma modalidade adicional preferida, as sequências DH, JH, e todas as VH do locus de cadeia pesada de imunoglobulina são substituídas pela sequência de região variável de imunoglobulina não associada ao camundongo. A sequência de região variável de imunoglobulina não associada ao camundongo pode ser não rearranjada. Em uma modalidade preferida, a sequência de região variável de imunoglobulina não associada ao camundongo compreende regiões DH e JH completas e não rearranjada, e pelo menos 3, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 40, pelo menos 60, ou pelo menos 80 sequências VH não rearranjadas da espécie não associada ao camundongo. Em uma modalidade adicional preferida, a sequência de região variável de imunoglobulina não associada ao camundongo compreende a região variável completa, incluindo todas a regiões VH, DH, e JH da espécie não associada ao camundongo. A espécie não associada ao camundongo pode ser Homo sapiens e a sequência de região variável de imunoglobulina não associada ao camundongo pode ser sequência de humanos.

[000106] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que expressa um anticorpo que compreende pelo menos um polipeptídeo de domínio variável humano/constante não humano de imunoglobulina, em que o camundongo expressa uma proteína ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo desta, a partir de um locus sem ser um locus de imunoglobulina.

[000107] Em uma modalidade, a proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo desta é expressa em uma célula B dos camundongos, em que a célula B compreende uma sequência de imunoglobulina rearranjada que compreende uma sequência variável de humana sequência e uma sequência constante não humana.

[000108] Em uma modalidade, a sequência constante não humana é uma sequência de roedor. Em uma modalidade, o roedor é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[000109] Em um aspecto, um método é fornecido para produzir um camundongo macho não fértil, compreendendo tornar um alelo endógeno de ADAM6 de uma célula ES doadora não funcional (ou inativar o dito alelo), introduzir a célula ES doadora em um embrião hospedeiro, gerar o embrião hospedeiro em uma mãe substituta, e permitir que a mãe substituta dê origem à progênie derivada por completo ou em parte da célula ES doadora. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente gerar a progênie para obter um camundongo macho não fértil.

[000110] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um camundongo com uma modificação genética de interesse, em que o camundongo é infértil, o método compreendendo as etapas de (a) mascarar uma modificação genética de interesse em um genoma; (b) modificar o genoma para inativar um alelo endógeno de ADAM6, ou render um alelo endógeno de ADAM6 não funcional; e (c) empregar o genoma para mascarar um camundongo. Em várias modalidades, o genoma é de uma célula ES ou usada em um experimento de transferência nuclear.

[000111] Em um aspecto, é fornecido um camundongo produzido usando um vetor de alvejamento, construto de nucleotídeo, ou célula da maneira aqui descrita.

[000112] Em um aspecto, é fornecida uma progênie de um cruzamento de um camundongo da maneira aqui descrita com um segundo camundongo que é um camundongo tipo selvagem ou geneticamente modificado.

[000113] Em um aspecto, é fornecido um método para manter uma cepa de camundongo, em que a cepa de camundongo compreende uma substituição de uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo por uma ou mais sequências heterólogas de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a um ou mais sequências heterólogas de cadeia pesada de imunoglobulina são as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de humano.

[000114] Em uma modalidade, a cepa de camundongo compreende uma eliminação de um ou mais segmentos de gene VH, DH, e/ou JH de camundongo. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente um ou mais segmentos de gene VH de humano, um ou mais segmentos de gene DH de humano, e/ou um ou mais segmentos de gene JH de humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende pelo menos 3, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 40, pelo menos 60, ou pelo menos 80 segmentos VH de humano, pelo menos 27 segmentos de gene DH de humano, e pelo menos seis segmentos de gene JH. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende pelo menos 3, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 40, pelo menos 60, ou pelo menos 80 segmentos VH de humano, o pelo menos 27 segmentos de gene DH de humano, e o pelo menos seis segmentos de gene JH são operavelmente ligados a um gene de região constante. Em uma modalidade, o gene de região constante é um gene de região constante de camundongo. Em uma modalidade, o gene de região constante compreende uma sequência de gene de região constante de camundongo selecionada de um CH1, uma dobradiça, um CH2, um CH3, e/ou um CH4 ou uma combinação destes.

[000115] Em uma modalidade, o método compreende gerar um camundongo macho heterozigoto para substituição dos camundongos sequência de cadeia pesada de imunoglobulina, e cruzar o camundongo macho heterozigoto com um camundongo tipo selvagem fêmea, ou um camundongo fêmea que é homozigoto ou heterozigoto para a sequência de cadeia pesada de humano. Em uma modalidade, o método compreende manter a cepa cruzando de maneira repetida machos heterozigotos com fêmeas que são tipo selvagem ou homozigoto ou heterozigoto para a sequência de cadeia pesada de humano.

[000116] Em uma modalidade, o método compreende obter células de camundongos machos ou fêmeas homozigotos ou heterozigotos para a sequência de cadeia pesada de humano, e empregar aquelas células como células doadoras ou núcleos destas como núcleos doadores, e usar as células ou núcleos para produzir animais geneticamente modificados usando células hospedeiras, e/ou gerar as células e/ou núcleos em mãe substitutas.

[000117] Em uma modalidade, apenas camundongos machos que são heterozigotos para a substituição no locus de cadeia pesada são cruzados com camundongo fêmeas. Em uma modalidade específica, os camundongos fêmeas são homozigotos, heterozigotos ou tipo selvagens com relação a um locus substituído de cadeia pesada.

[000118] Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de sequências variáveis X e/ou K de cadeia leve, em um locus endógeno de cadeia leve de imunoglobulina, por sequências heterólogas de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, as sequências heterólogas de cadeia leve de imunoglobulina são sequências variáveis X e/ou k de cadeia leve de imunoglobulina de humano.

[000119] Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente um transgene em um locus sem ser um locus endógeno de imunoglobulina, em que o transgene compreende uma sequência que codifica uma sequência X ou k heteróloga de cadeia leve rearranjada ou não rearranjada (por exemplo, VL não rearranjada e JL não rearranjada, ou VJ rearranjada) operavelmente ligada (para não rearranjada) ou fundida (para rearranjada) a uma sequência de região constante de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência À ou K heteróloga de cadeia leve é de humano. Em uma modalidade, a sequência de região constante é selecionada de roedor, humano, e primata não humano. Em uma modalidade, a sequência de região constante é selecionada de camundongo, rato e hamster. Em uma modalidade, o transgene compreende um promotor não associado à imunoglobulina que direciona a expressão das sequências de cadeia leve. Em uma modalidade específica, o promotor é um promotor transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o promotor é um promotor ROSA26.

[000120] Em um aspecto, é fornecido um construto de ácido nucleico, compreendendo um braço de homologia a montante e um braço de homologia a jusante, em que o braço de homologia a montante compreende uma sequência que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano, o braço de homologia a jusante compreende uma sequência que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência de região variável de imunoglobulina de humano ou camundongo, e disposto entre os braços de homologia a montante e a jusante está uma sequência que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência que codifica os gene de ADAM6 de camundongo é operavelmente ligada com um promotor de camundongo com o qual o ADAM6 de camundongo é ligado em um camundongo tipo selvagem.

[000121] Em um aspecto, um vetor de alvejamento é fornecido, compreendendo (a) uma sequência de nucleotídeo que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência de segmento de gene de região variável de humano de nucleotídeo; e, (b) uma sequência de nucleotídeo que codifica um ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste, que é funcional em um camundongo.

[000122] Em uma modalidade, o vetor de alvejamento compreende adicionalmente um promotor operavelmente ligado à sequência que codifica o ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade específica, o promotor é um promotor de ADAM6 de camundongo.

[000123] Em um aspecto, é fornecido um construto de nucleotídeo para modificar um locus variável de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, em que o construto compreende pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase específica para sítio e uma sequência que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento desta, que é funcional em um camundongo.

[000124] Em um aspecto, são fornecidos células de camundongo e embriões de camundongo incluindo, mas sem limitação, células ES, células pluripotentes, e células pluripotentes induzidas que compreendem modificações genéticas da maneira aqui descrita. Células que são XX e células que são XY são fornecidas. Células que compreendem um núcleo contendo uma modificação da maneira aqui descrita também são fornecidas, por exemplo, uma modificação introduzida em uma célula por injeção pró- nuclear. Células, embriões, e camundongos que compreendem um gene de ADAM6 introduzido por vírus também são fornecidos, por exemplo, células, embriões e camundongos compreendendo um construto de transdução compreendendo um gene de ADAM6, que é funcional no camundongo.

[000125] Em um aspecto, é fornecida uma célula de camundongo geneticamente modificado, em que a célula perde um locus ADAM6 endógeno funcional de camundongo, e a célula compreende uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade, a célula compreende adicionalmente uma modificação de uma sequência de gene variável endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a modificação da sequência de gene variável endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma eliminação selecionada de uma eliminação de um segmento de gene VH de camundongo, uma eliminação de um segmento de gene DH de camundongo, uma eliminação de um segmento de gene JH de camundongo, e uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma substituição de uma ou mais sequências de imunoglobulina VH, DH, e/ou JH de camundongo por uma sequência de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade específica, a sequência de imunoglobulina de humano é selecionada de uma VH de humano, um VL de humano, um DH de humano, um JH de humano, um JL de humano e uma combinação destes.

[000126] Em uma modalidade, a célula é uma célula totipotente, uma célula pluripotente, ou uma célula pluripotente induzida. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula ES de camundongo.

[000127] Em um aspecto, uma célula B de camundongo é fornecida, em que a célula B de camundongo compreende um gene rearranjado de cadeia pesada de imunoglobulina, em que a célula B compreende em um cromossomo da célula B uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento desta, que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a célula B de camundongo compreende dois alelos da sequência de ácido nucleico.

[000128] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um cromossomo de célula B) que é contígua com o locus rearranjado de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.

[000129] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um cromossomo de célula B), que é distinta da molécula de ácido nucleico que compreende o locus rearranjado de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.

[000130] Em uma modalidade, a célula B de camundongo compreende uma sequência variável de gene rearranjado de imunoglobulina não associada a camundongo operavelmente ligada a um gene de região constante de imunoglobulina de camundongo ou humano, em que a célula B compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento desta, que é funcional em um camundongo macho.

[000131] Em um aspecto, uma célula somática de camundongo é fornecida, compreendendo um cromossomo que compreende um locus modificado de cadeia pesada de imunoglobulina, e uma sequência de ácido nucleico que codifica um ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste, que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está no mesmo cromossomo no locus modificado de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, o ácido nucleico está em um cromossomo diferente do locus modificado de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a célula somática compreende uma única cópia da sequência de ácido nucleico. Em uma modalidade, a célula somática compreende pelo menos duas cópias da sequência de ácido nucleico. Em uma modalidade específica, a célula somática é uma célula B. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula germinativa. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula embrionária.

[000132] Em um aspecto, uma célula germinativa de camundongo é fornecida, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste) em um cromossomo da célula germinativa, em que a sequência de ácido nucleico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste) está em uma posição no cromossomo que é diferente de uma posição em um cromossomo de uma células germinativa de camundongo tipo selvagem. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está em um locus de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está no mesmo cromossomo da célula germinativa como um locus de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está em um cromossomo diferente da célula germinativa do que no locus de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, o locus de imunoglobulina de camundongo compreende uma substituição de pelo menos uma sequência de imunoglobulina de camundongo por pelo menos uma sequência de imunoglobulina não associada à camundongo. Em uma modalidade específica, a pelo menos uma sequência de imunoglobulina não associada à camundongo é uma sequência de imunoglobulina de humano.

[000133] Em um aspecto, uma célula pluripotente, pluripotente induzida ou totipotente derivada de um camundongo, da maneira aqui descrita, é fornecida. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula do tronco embrionário (ES) de camundongo.

[000134] Em um aspecto, uma célula ou tecido derivado de um camundongo, da maneira aqui descrita, é fornecido. Em uma modalidade, a célula ou tecido é derivado de baço, linfonodo ou medula óssea de um camundongo da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, a célula é uma célula B. Em uma modalidade a célula é uma célula do tronco embrionário. Em uma modalidade, a célula é uma célula germinativa.

[000135] Em uma modalidade, o tecido é selecionado de teciso conectivo, muscular, nervoso e epitelial. Em uma modalidade específica, o tecido é tecido reprodutivo.

[000136] Em uma modalidade, a célula e/ou tecido derivado de um camundongo da maneira aqui descrita é isolado para uso em um ou mais ensaios ex vivo. Em várias modalidades, o um ou mais ensaios ex vivo incluem medições de propriedades físicas, térmicas, elétricas, mecânicas ou óticas, um procedimento cirúrgico, medições de interações de diferentes tipos de tecido, o desenvolvimento de técnicas de imageamento, ou uma combinação destes.

[000137] Em aspecto, é fornecido o uso de célula ou tecido derivado de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir um anticorpo. Em um aspecto, é fornecido o uso de uma célula ou tecido derivado de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir um hibridoma ou quadroma.

[000138] Em um aspecto, uma célula não humana compreende um cromossomo ou fragmento deste, de um animal não humano, da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, a célula não humana compreende um núcleo de um animal não humano da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, a célula não humana compreende o cromossomo ou fragmento deste como o resultado de uma transferência nuclear.

[000139] Em um aspecto, um núcleo derivado de um camundongo da maneira aqui descrita é fornecido. Em uma modalidade, o núcleo é de uma célula diplóide que não é uma célula B.

[000140] Em um aspecto, é fornecida uma sequência de nucleotídeo que codifica uma região variável de imunoglobulina produzida em um camundongo da maneira aqui descrita.

[000141] Em um aspecto, é fornecida uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo produzido em um camundongo da maneira aqui descrita.

[000142] Em um aspecto, é fornecida uma sequência de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou cadeia leve de imunoglobulina de nucleotídeo que codifica uma região variável de um anticorpo produzida em um camundongo da maneira aqui descrita.

[000143] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste (por exemplo, Fab, F(ab)2, scFv) produzido em um camundongo da maneira aqui descrita.

[000144] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um camundongo geneticamente modificado, compreendendo substituir um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina a montante (com relação a transcrição dos segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina) de um locus de ADAM6 endógeno dos camundongos por um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano, e substituir um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina a jusante (com relação a transcrição dos segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina) do ADAM6 locus dos camundongos por um ou mais segmentos de gene de cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina de humano que substitui um ou mais segmentos de gene endógenos de imunoglobulina a montante de um locus de ADAM6 endógeno dos camundongos incluem segmentos de gene V. Em uma modalidade, os segmentos de gene de imunoglobulina de humano que substituem um ou mais segmentos de gene endógenos de imunoglobulina a montante de um locus de ADAM6 endógeno dos camundongos incluem segmentos de gene V e D. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina de humano que substitui um ou mais segmentos de gene endógenos de imunoglobulina a jusante de um locus de ADAM6 endógeno dos camundongos incluem segmentos de gene J. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina de humano que substitui um ou mais segmentos de gene endógenos de imunoglobulina a jusante de um locus de ADAM6 endógeno dos camundongos incluem segmentos de gene D e J. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina de humano que substitui um ou mais segmentos de gene endógenos de imunoglobulina a jusante de um locus de ADAM6 endógeno dos camundongos incluem segmentos de gene V, D e J.

[000145] Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina a montante e/ou a jusante do gene de ADAM6 são substituídos em uma célula pluripotente,pluripotente induzida ou totipotente para formar uma célula progenitora geneticamente modificada; a célula progenitora geneticamente modificada é introduzida em um hospedeiro; e o hospedeiro compreendendo a célula progenitora geneticamente modificada é gerado para formar um camundongo que compreende um genoma derivado da célula progenitora geneticamente modificada. Em uma modalidade, o hospedeiro é um embrião. Em uma modalidade específica, o hospedeiro é selecionado de uma pré-mórula de camundongo (por exemplo, estágio de 8- ou 4-células), um embrião tetraplóide, um agregado de células embrionárias, ou um blastocisto.

[000146] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um camundongo geneticamente modificado, compreendendo substituir uma sequência de nucleotídeo de camundongo que compreende um segmento de gene de imunoglobulina de camundongo e uma sequência de nucleotídeo de ADAM6 de camundongo (ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste funcional em um camundongo macho) por uma sequência compreendendo um segmento de gene de imunoglobulina de humano para formar um primeiro locus quimérico, e a seguir inserir uma sequência compreendendo uma sequência que codifica ADAM6 de camundongo (ou uma sequência que codifica um ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste) na sequência compreendendo o segmento de gene de imunoglobulina de humano para formar um segundo locus quimérico.

[000147] Em uma modalidade, o segundo locus quimérico compreende um segmento de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano (VH). Em uma modalidade, o segundo locus quimérico compreende um segmento de gene variável de cadeia leve de imunoglobulina de humano (VL). Em uma modalidade específica, o segundo locus quimérico compreende um segmento de gene VH de humano ou um segmento de gene VL de humano operavelmente ligados a um humano segmento de gene DH e um segmento de gene JH de humano. Em uma modalidade adicionalmente específica, o segundo locus quimérico é operavelmente ligado a um terceiro locus quimérico que compreende uma sequência CH1 de humano, ou uma sequência CH1 de humano e sequência de dobradiça de humano, fundido com uma sequência CH2 + CH3 de camundongo.

[000148] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo que compreende uma sequência ectópica de nucleotídeo compreendendo um locus ou sequência de ADAM6 de camundongo para produzir um camundongo macho fértil, em que o uso compreende cruzar o camundongo que compreende a sequência ectópica de nucleotídeo, que compreende o locus ou sequência de ADAM6 de camundongo, com um camundongo que perde um locus ou sequência de ADAM6 endógeno funcional de camundongo, e obter uma progênie que é uma fêmea capaz de produzir progênie com o locus ou sequência de ADAM6 ectópico, ou que é um macho que compreende o locus ou sequência de ADAM6 ectópico, e o macho exibe uma fertilidade que é aproximadamente a mesma de uma fertilidade exibida por um camundongo tipo selvagem macho.

[000149] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir uma sequência de nucleotídeo de região variável de imunoglobulina.

[000150] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir um Fab completamente humano ou um completamente humano F(ab)2 completamente humano.

[000151] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir uma linhagem de célula imortalizada.

[000152] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir um hibridoma ou quadroma.

[000153] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir uma biblioteca de fago contendo regiões variáveis de cadeia pesada de humano e regiões variáveis de cadeia leve de humano.

[000154] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para gerar uma sequência de região variável para produzir um anticorpo de humano, compreendendo (a) imunizar um camundongo da maneira aqui descrita com um antígeno de interesse, (b) isolar um linfócito do camundongo imunizado de (a), (c) expor o linfócito a um ou mais anticorpos marcados, (d) identificar um linfócito que é capaz de se ligar ao antígeno de interesse, e (e) amplificar uma ou mais sequências de região variável de ácido nucleico a partir do linfócito, gerando por meio deste uma sequência de região variável.

[000155] Em uma modalidade, o linfócito é derivado do baço dos camundongos. Em uma modalidade, o linfócito é derivado de um linfonodo dos camundongos. Em uma modalidade, o linfócito é derivado da medula óssea dos camundongos.

[000156] Em uma modalidade, o anticorpo marcado é um anticorpo conjugado ao fluoróforo. Em uma modalidade, o um ou mais anticorpos conjugados ao fluoróforo são selecionados de uma IgM, uma IgG, e/ou uma combinação destas.

[000157] Em uma modalidade, o linfócito é uma célula B.

[000158] Em uma modalidade, a uma ou mais sequências de região variável de ácido nucleico compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada. Em uma modalidade, a uma ou mais sequências de região variável de ácido nucleico compreende uma sequência de região variável de cadeia leve. Em uma modalidade específica, a sequência de região variável de cadeia leve é uma sequência de região variável de cadeia leve K de imunoglobulina. Em uma modalidade, a uma ou mais sequências de região variável de ácido nucleico compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada e uma cadeia leve k.

[000159] Em uma modalidade, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para gerar uma sequência de região variável de cadeia pesada e leve k para produzir um anticorpo de humano, compreendendo (a) imunizar um camundongo da maneira aqui descrita com um antígeno de interesse, (b) isolar o baço do camundongo imunizado de (a), (c) expor linfócitos B do baço a um ou mais anticorpos marcados, (d) identificar um B linfócito de (c) que é capaz de se ligar a o antígeno de interesse, e (e) amplificar uma sequência de região variável de cadeia pesada de ácido nucleico e uma sequência de região variável de cadeia leve k de ácido nucleico do linfócito B, gerando por meio deste as sequências de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve k.

[000160] Em uma modalidade, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para gerar uma sequência de região variável de cadeia pesada e leve k para produzir um anticorpo de humano, compreendendo (a) imunizar um camundongo da maneira aqui descrita com um antígeno de interesse, (b) isolar um ou mais linfonodos do camundongo imunizado de (a), (c) expor linfócitos B do um ou mais linfonodos a um ou mais anticorpos marcados, (d) identificar um B linfócito de (c) que é capaz de se ligar a o antígeno de interesse, e (e) amplificar uma sequência de região variável de cadeia pesada de ácido nucleico e uma sequência de região variável de cadeia leve k de ácido nucleico do linfócito B, gerando por meio deste as sequências de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve k.

[000161] Em uma modalidade, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para gerar uma sequência de região variável de cadeia pesada e leve K para produzir um anticorpo de humano, compreendendo (a) imunizar um camundongo da maneira aqui descrita com um antígeno de interesse, (b) isolar medula óssea do camundongo imunizado de (a), (c) expor linfócitos B da medula óssea a um ou mais anticorpos marcados, (d) identificar um B linfócito de (c) que é capaz de se ligar a o antígeno de interesse, e (e) amplificar uma sequência de região variável de cadeia pesada de ácido nucleico e uma sequência de região variável de cadeia leve k de ácido nucleico do linfócito B, gerando por meio deste as sequências de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve k. Em várias modalidades, o um ou mais anticorpos marcados são selecionados de uma IgM, uma IgG, e/ou uma combinação destas.

[000162] Em várias modalidades, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para gerar uma sequência de região variável de cadeia leve k e pesada para produzir um anticorpo de humano, compreendendo adicionalmente fundir as sequências amplificadas de região variável de cadeia leve e pesada às sequências de região constante de cadeia leve e pesada de humano, expressando as sequências fundidas de cadeia leve e pesada em uma célula, e recuperando as sequências expressas de cadeia leve e pesada, gerando por meio deste um anticorpo de humano.

[000163] Em várias modalidades, as regiões constantes de cadeia pesada de humano são selecionadas de IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. Em várias modalidades específicas, a IgG é selecionada de uma IgG1, uma IgG2, uma IgG3 e uma IgG4. Em várias modalidades, a região constante de cadeia pesada de humano compreende uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, uma CH4, ou uma combinação deste. Em várias modalidades, a região constante de cadeia leve é uma região constante k de imunoglobulina. Em várias modalidades, a célula é selecionada de uma célula HeLa, uma célula DU145, uma célula Lncap, uma célula MCF-7, uma célula MDA-MB-438, uma célula PC3, uma célula T47D, uma célula THP-1, uma U87, uma célula SHSY5Y (neuroblastoma de humano), uma célula Saos-2, uma célula Vera, uma célula CHA, uma célula GH3, uma célula PC12, uma célula da retina humana (por exemplo, uma célula PER.C6™), e uma célula MC3T3. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula CHO.

[000164] Em um aspecto, é fornecido um método para gerar um anticorpo reverso-quimérico de roedor-humano específico contra um antígeno de interesse, compreendendo as etapas de imunizar um camundongo da maneira aqui descrita com o antígeno, isolar pelo menos uma célula do camundongo que produz um anticorpo reverso-quimérico de camundongo- humano específico contra o antígeno, cultivar pelo menos uma célula que produz o anticorpo reverso-quimérico de camundongo-humano específico contra o antígeno, e obter o dito anticorpo.

[000165] Em uma modalidade, o anticorpo reverso-quimérico de camundongo-humano compreende um domínio variável de cadeia pesada de humano fundido a um gene constante de cadeia pesada de camundongo ou rato, e um domínio variável de cadeia leve de humano fundido a um gene constante de cadeia leve de camundongo, ou rato ou humano.

[000166] Em uma modalidade, o cultivo de pelo menos uma célula que produz o anticorpo reverso-quimérico de roedor-humano específico contra o antígeno é realizada em pelo menos uma célula de hibridoma gerada a partir da pelo menos uma célula isolada dos camundongos.

[000167] Em um aspecto, é fornecido um método para gerar um anticorpo completamente humano específico contra um antígeno de interesse, compreendendo as etapas de imunizar um camundongo da maneira aqui descrita com o antígeno, isolar pelo menos uma célula do camundongo que produz um anticorpo reverso-quimérico de roedor-humano específico contra o antígeno, gerar pelo menos uma célula que produz um anticorpo completamente humano derivado do anticorpo reverso-quimérico de roedor- humano específico contra o antígeno, e cultivar pelo menos uma célula que produz o anticorpo completamente humano, e obter o dito anticorpo completamente humano.

[000168] Em várias modalidades, a pelo menos uma célula isolada do camundongo que produz um anticorpo reverso-quimérico de roedor-humano específico contra o antígeno é um esplenócito ou uma célula B.

[000169] Em várias modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[000170] Em várias modalidades, imunização com o antígeno de interesse é realizada com proteína, DNA, uma combinação de DNA e proteína, ou células que expressam o antígeno.

[000171] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de imunoglobulina ou fragmento desta. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é usada para produzir um anticorpo de humano ou fragmento de ligação de antígeno deste. Em uma modalidade, o camundongo é usado para produzir uma proteína de ligação de antígeno selecionada de um anticorpo, um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico), um Fvsc, um Fvsc biespecífico, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um V-NAR, um VHH, um VL, um F(ab), um F(ab)2, um DVD (isto é, proteína de ligação de antígeno com domínio variável dual), um SVD (isto é, proteína de ligação de antígeno com domínio variável único), ou uma célula T biespecífica (BiTE).

[000172] Em um aspecto, é fornecido o uso de um camundongo da maneira aqui descrita para introduzir uma sequência ectópica de ADAM6 em um camundongo que perde uma sequência de ADAM6 endógena funcional de camundongo, em que o uso compreende cruzar um camundongo da maneira aqui descrita com o camundongo que perde a sequência de ADAM6 endógena funcional de camundongo.

[000173] Em um aspecto, é fornecido o uso de material genético de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir um camundongo com uma sequência ectópica de ADAM6. Em uma modalidade, o uso compreende transferência nuclear usando um núcleo de uma célula de um camundongo da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, o uso compreende clonar uma célula de um camundongo da maneira aqui descrita para produzir um animal derivado da célula. Em uma modalidade, o uso compreende empregar um espermatozoide ou um óvulo de um camundongo da maneira aqui descrita em um processo para produzir um camundongo que compreende a sequência ectópica de ADAM6.

[000174] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um camundongo macho fértil compreendendo um locus modificado de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo fertilizar uma primeira célula germinativa de camundongo que compreende uma modificação de um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina com uma segunda célula germinativa de camundongo que compreende um gene de ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste, que é funcional em um camundongo macho; formar uma célula fertilizada; permitir que a célula fertilizada se desenvolva em um embrião; e, gerar o embrião em um substituto para obter um camundongo.

[000175] Em uma modalidade, a fertilização é atingida por cruzamento um camundongo macho e um camundongo fêmea. Em uma modalidade, o camundongo fêmea compreende o gene de ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste. Em uma modalidade, o camundongo macho compreende o gene de ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento deste.

[000176] Em um aspecto, é fornecido o uso de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou um ortólogo ou homólogo desta, ou um fragmento funcional da proteína ADAM6 correspondente para recuperar ou melhorar a fertilidade de um camundongo com um genoma compreendendo uma modificação de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, em que a modificação reduz ou elimina função endógena de ADAM6.

[000177] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é integrada no genoma dos camundongos em uma posição ectópica. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é integrada no genoma dos camundongos em um locus endógeno de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o locus endógeno de imunoglobulina é um locus de cadeia pesada. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é integrada no genoma dos camundongos em uma posição sem ser um locus endógeno de imunoglobulina.

[000178] Em um aspecto, é fornecido o uso dos camundongos da maneira aqui descrita para a fabricação de um medicamento (por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno), ou para a fabricação de uma sequência que codifica uma sequência variável de um medicamento (por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno), para o tratamento de uma doença ou distúrbio de humano.

[000179] Em um aspecto, uma célula geneticamente modificada de camundongo é fornecida, em que a célula é incapaz de expressar uma cadeia pesada compreendendo segmentos de gene endógenos rearranjados de cadeia pesada de imunoglobulina, e a célula compreende um gene funcional de ADAM6 que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade, a célula compreende adicionalmente uma inserção de segmentos de gene de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene de imunoglobulina de humano são segmentos de gene de cadeia pesada que são operavelmente ligados às regiões constantes de cadeia pesada de camundongo, de maneira tal que o rearranjo codifica uma cadeia pesada funcional de um anticorpo que compreende uma região variável de humano.

[000180] São fornecidos animais não humanos geneticamente modificados, embriões, células, tecidos, bem como construtos de ácido nucleico para modificar os animais não humanos, e métodos e composições para produzir e usar os mesmos. São fornecidos animais e células que geram regiões variáveis lambda (X) (de humano ou não humano) no contexto de uma cadeia leve kappa (K), em que os animais e células compreendem uma modificação de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina que elimina ou reduz a atividade de uma proteína ADAM6 ou homólogo ou ortólogo desta, em que os animais compreendem adicionalmente uma modificação genética que recupera por completo ou em parte a atividade de ADAM6 (ou a atividade do homólogo ou ortólogo do mesmo). São fornecidos camundongos que são férteis e expressam um domínio variável X de humano cognato com um domínio variável de cadeia pesada de humano, em que o domínio variável X de humano é expresso no camundongo, contíguo com uma região constante X ou k, e em várias modalidades a região variável X ou k é uma região constante endógena (por exemplo, camundongo ou rato). Camundongos e células que geram regiões variáveis X de humano no contexto de uma cadeia leve k ou uma X, por exemplo, de um locus de cadeia leve endógeno de camundongo, também são fornecidos. São também fornecidos métodos para produzir anticorpos que compreendem regiões variáveis lambda. Métodos para selecionar cadeias pesadas que expressam com regiões variáveis lambda cognatas também são fornecidos.

[000181] São fornecidas proteínas de ligação de antígeno quiméricas e de humano (por exemplo, anticorpos), e ácido nucleicos que codificam-nas, que compreendem regiões variáveis mutadas de maneira somática, incluindo anticorpos que apresentam cadeias leves compreendendo um domínio variável derivado de um segmento de gene VX de humano e um JX de humano fundido a um domínio constante de cadeia leve de camundongo.

[000182] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que expressa uma sequência de região variável X de humano em uma cadeia leve que compreende uma região constante de camundongo. Em um aspecto, é fornecido um camundongo que expressa uma sequência de região variável X de humano em uma cadeia leve que compreende uma região constante K. Em um aspecto, é fornecido um camundongo que expressa a partir de um locus endógeno de cadeia leve de camundongo uma cadeia leve que compreende uma sequência de região variável X de humano. Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende um gene rearranjado de cadeia leve que compreende uma sequência variável X de humano ligada a uma sequência de região constante de camundongo; em uma modalidade, a sequência de região constante de camundongo é uma sequência constante X; em uma modalidade, a sequência de região constante de camundongo é uma sequência constante k.

[000183] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado, em que o camundongo compreende um segmento de gene não rearranjado variável X de cadeia leve de humano (hVX) e um humano segmento de gene de união X (hJX). Em uma modalidade, o hVX e hJX não rearranjado estão em um locus de cadeia leve de camundongo. Em uma modalidade, o hVX não rearranjado e hJX não rearranjado estão em um transgene e operavelmente ligados a uma sequência de região constante de humano ou camundongo. Em uma modalidade, o hVX não rearranjado e hJX não rearranjado estão em um epissomo. Em uma modalidade, o camundongo é capaz de produzir uma imunoglobulina que compreende uma cadeia leve que é derivada de uma sequência não rearranjada hVX e uma sequência hJX, e uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de camundongo (CL). Também são fornecidos métodos e composições para produzir e usar camundongos geneticamente modificados. São fornecidos anticorpos que compreendem (a) um domínio variável de cadeia pesada de humano (hVH) fundido a uma região constante de cadeia pesada de camundongo, e (b) um domínio humano VD fundido a um CL de camundongo; incluindo o que um ou mais dos domínios variáveis são mutados de maneira somática, por exemplo, durante a seleção de anticorpo ou célula imune em um camundongo da invenção. Em uma modalidade, o IIVA não rearranjado e hJX não rearranjado são operavelmente ligados com uma região constante K de humano ou camundongo (CK). Em uma modalidade, o hVX não rearranjado e hJX não rearranjado são operavelmente ligados com uma região constante X de humano ou camundongo (CX).

[000184] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende em sua linhagem germinativa, em um locus endógeno de cadeia leve de camundongo, uma sequência de região variável X de humano de cadeia leve, em que a sequência de região variável lambda de humano é expressa em uma cadeia leve que compreende um gene de sequência de região constante de imunoglobulina de camundongo.

[000185] Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia leve de camundongo é um locus X. Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia leve de camundongo é um locus k.

[000186] Em uma modalidade, o camundongo perde uma sequência variável endógena de cadeia leve no locus endógeno de cadeia leve de camundongo.

[000187] Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos de gene endógenos de região variável de cadeia leve de camundongo são substituídos por um ou mais segmentos de gene de região variável X de humano.

[000188] Em uma modalidade, a sequência de região variável X de humano de cadeia leve compreende uma sequência JX de humano. Em uma modalidade, a sequência JX de humano é selecionada do grupo que consiste em JX1, JX2, JX3, JX7, e uma combinação destes.

[000189] Em uma modalidade, a sequência de região variável X de humano de cadeia leve compreende um fragmento de agrupamento A do locus de cadeia leve de humano. Em uma modalidade específica, o fragmento de agrupamento A do humano locus X de cadeia leve se estende de hVX3-27 até hVX3-1.

[000190] Em uma modalidade, a sequência de região variável X de humano de cadeia leve compreende um fragmento de agrupamento B do locus de cadeia leve de humano. Em uma modalidade específica, o fragmento de agrupamento B do locus X de cadeia leve de humano se estende de hVX5-52 até hVX1-40.

[000191] Em uma modalidade, a sequência de região variável X de humano de cadeia leve compreende um fragmento genômico de agrupamento A e um fragmento genômico de agrupamento B. Em um uma modalidade, a sequência de região variável X de humano de cadeia leve compreende pelo menos um segmento de gene de agrupamento A e pelo menos um segmento de gene de agrupamento B.

[000192] Em uma modalidade, mais de 10 % do repertório de cadeia leve naive dos camundongos é derivado de pelo menos dois segmentos de gene hVX selecionados de 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, e 9-49. Em uma modalidade, mais de 20 % do repertório de cadeia leve naive dos camundongos é derivado de pelo menos três segmentos de gene hVX selecionados de 2-8, 2-23, 1-40, 545, e 9-49. Em uma modalidade, mais de 30 % do repertório de cadeia leve naive dos camundongos é derivado de pelo menos quatro segmentos de gene hVX selecionados de 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, e 9-49.

[000193] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência variável X de humano fundida a um região constante de camundongo, em que o camundongo exibe uma razão de uso de K para uso de X de cerca de 1:1.

[000194] Em uma modalidade, a cadeia leve de imunoglobulina é expressa a partir de um locus endógeno de cadeia leve de camundongo.

[000195] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma sequência de região variável X de cadeia leve (VX) e pelo menos uma sequência J (J), contígua com uma sequência de região constante de cadeia leve K de camundongo.

[000196] Em uma modalidade, o camundongo perde um segmento de gene funcional VK de camundongo e/ou JK de camundongo .

[000197] Em uma modalidade, o VX é um VX de humano (hVX), e o J é um JX de humano (hJX). Em uma modalidade, o hVX e o hJX são não rearranjados segmentos de gene.

[000198] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma pluralidade de não rearranjada segmentos de gene hVX e pelo menos um segmento de gene hJX. Em uma modalidade específica, a pluralidade de segmentos de gene hVX não rearranjados são pelo menos 12 segmentos de gene, pelo menos 28 segmentos de gene, ou pelo menos 40 segmentos de gene.

[000199] Em uma modalidade, o pelo menos um segmento de gene hJX é selecionado do grupo que consiste em JX1, JX2, JX3, JX7, e uma combinação deste.

[000200] Em uma modalidade, um locus endógeno de cadeia leve X de camundongo é eliminado por completo ou em parte.

[000201] Em uma modalidade, a sequência de região constante de cadeia leve K de camundongo é em um locus endógeno de cadeia leve K de camundongo.

[000202] Em uma modalidade, cerca de 10 % a cerca de 45 % das células B dos camundongos expressam um anticorpo que compreende uma cadeia leve compreendendo um domínio variável de cadeia leve X de humano (VX) e um domínio constante de cadeia leve K de camundongo (CK).

[000203] Em uma modalidade, o domínio variável X de humano é derivado de uma sequência rearranjada hVX/hJX selecionada do grupo que consiste em 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2- 14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 144/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 949/7 e 1-51/1.

[000204] Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma região intergênica VK-JK de humano a partir de um locus K de cadeia leve de humano, em que a região intergênica VK-JK de humano é contígua com a sequência VX e a sequência J. Em uma modalidade específica, a região intergênica VK-JK de humano é colocada entre a sequência VX e a sequência J.

[000205] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende (a) pelo menos 12 a pelo menos 40 segmentos de gene não rearranjados de região variável X de cadeia leve de humano e pelo menos um segmento de gene JX de humano em um locus endógeno de cadeia leve de camundongo; (b) uma sequência intergênica Vk-Jk de humano localizada entre o pelo menos 12 a pelo menos 40 segmentos de gene de região variável de cadeia leve de humano e o pelo menos uma sequência JX de humano; em que o camundongo expressa um anticorpo que compreende uma cadeia leve compreendendo um domínio VX de humano e um domínio Ck de camundongo.

[000206] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que expressa um anticorpo compreendendo uma cadeia leve que compreende uma sequência variável X e uma sequência constante k.

[000207] Em uma modalidade, o camundongo exibe uma razão de uso de k para uso de X de cerca de 1:1.

[000208] Em uma modalidade, uma população de células B imaturas obtidas da medula óssea dos camundongos exibe uma razão de uso de k para uso de X de cerca de 1:1.

[000209] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado, em que o camundongo compreende um segmento de gene VX e um J A não rearranjado de imunoglobulina operavelmente ligado a um locus de cadeia leve de camundongo que compreende um gene CL de camundongo.

[000210] Em uma modalidade, os segmentos de gene Va e/ou Ja são segmentos de gene de humano. Em uma modalidade, os segmentos de gene VA e/ou JA são segmentos de gene de camundongos, e o CL é um CK de camundongo.

[000211] Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia leve de camundongo é um locus k de cadeia leve. Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia leve de camundongo é um locus A de cadeia leve.

[000212] Em uma modalidade, os segmentos de gene VA e JA não rearranjados estão em um locus endógeno de cadeia leve de camundongo.

[000213] Em uma modalidade, os segmentos de gene VA e JA não rearranjados de imunoglobulina estão em um transgene.

[000214] Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de um ou mais segmentos de gene V, D e/ou J de cadeia pesada por um ou mais segmentos de gene V, D e/ou J de humano em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.

[000215] Em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene VA e um JA não rearranjado de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve k de camundongo, que compreende um gene Ck de camundongo.

[000216] Em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene variável de cadeia leve A (VA) não rearranjado de imunoglobulina de humano, e um segmento de gene de união A (JA) em um locus endógeno de cadeia leve A de camundongo que compreende um gene CA de camundongo.

[000217] Em uma modalidade, o locus de gene variável de cadeia leve (o “locus VL”) compreende pelo menos um segmento de gene VA (hVA) de humano. Em uma modalidade, o locus VL compreende pelo menos um segmento de gene JX (hJÀ) de humano. Em uma outra modalidade, o locus VL compreende até quatro segmentos de gene hJX. Em uma modalidade, o locus VL compreende uma sequência contígua compreendendo sequência genômica X de humano e K de humano.

[000218] Em uma modalidade, o locus de gene variável de cadeia leve K (o “locus k”) compreende pelo menos um segmento de gene VX (hVX) de humano. Em uma modalidade, o locus k compreende pelo menos um segmento de gene JX (hJX) de humano. Em uma modalidade, o locus k compreende até quatro segmentos de gene hJX. Em uma modalidade, o locus k compreende pelo menos um hVX e pelo menos um hJX, e perde ou substancialmente perde uma região de segmento de gene funcional Vk e perde ou substancialmente perde uma região de segmento de gene funcional Jk. Em uma modalidade, o camundongo não compreende nenhuma região de segmento de gene funcional Vk. Em uma modalidade, o camundongo não compreende nenhuma região de segmento de gene funcional Jk.

[000219] Em uma modalidade, o locus de gene variável de cadeia leve X (o “locus X”) compreende pelo menos um segmento de gene hVX. Em uma modalidade, o locus X compreende pelo menos um segmento de gene JX (hJX) de humano. Em uma outra modalidade, o locus X compreende até quatro segmentos de gene hJX.

[000220] Em uma modalidade, o locus VL compreende uma pluralidade de hVXs. Em uma modalidade, a pluralidade de hVXs é selecionada de maneira a resultar em expressão de um repertório de região variável de cadeia leve X, que reflete cerca de 10 %, cerca de 20 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, ou cerca de 90 % ou mais do uso de VX observado em um humano. Em uma modalidade, o locus VL compreende segmentos de gene hVX 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, e uma combinação destes.

[000221] Em uma modalidade, os hVXs incluem 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, e 3-12. Em uma modalidade específica, o locus VL compreende uma sequência contígua do locus X de cadeia leve de humano que espaça de VX312 to VX3-1. Em uma modalidade, o locus VL compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 hVXs. Em uma modalidade específica, o hVXs incluem 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, e 3-12. Em uma modalidade específica, o locus VL compreende uma sequência contígua do locus X de humano que espaça de VX3-12 to VX3-1. Em uma modalidade, o locus VL é no locus K endógeno. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus K endógeno e o locus X endógeno de cadeia leve é eliminado em parte ou completamente. Em uma modalidade, o locus VL está no locus X endógeno. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus X endógeno e o locus k endógeno é eliminado em parte ou completamente.

[000222] Em uma modalidade, o locus VL compreende 13 a 28 ou mais hVXs. Em uma modalidade específica, os hVXs incluem 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, e 3-27. Em uma modalidade específica, o locus k compreende uma sequência contígua do humano locus X que espaça de VX3-27 to VX3-1. Em uma modalidade, o locus VL está no locus k endógeno. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus k endógeno e o locus X endógeno de cadeia leve é eliminado em parte ou completamente. Em uma outra modalidade, o locus VL está no locus X endógeno. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus X endógeno e o locus k endógeno é eliminado em parte ou completamente.

[000223] Em uma modalidade, o locus VL compreende 29 a 40 hVXs. Em uma modalidade específica, o locus k compreende uma sequência contígua do locus X de humano que espaça de VX3-29 a VX3-1, e uma sequência contígua do locus X de humano que espaça de VX5-52 a VX1-40. Em uma modalidade específica, todas ou substancialmente todas as sequências entre hVX1-40 e hVX3-29 no camundongo geneticamente modificado consistem essencialmente em uma sequência X de humano de aproximadamente 959 bp encontrada na natureza (por exemplo, na população humana) a jusante do segmento de gene hVX1-40 (a jusante da poção 3’ não traduzida), um sítio de enzima de restrição (por exemplo, PI-SceI), seguido por uma sequência X de humano de aproximadamente 3.431 bp a montante do segmento de gene hV/3-29 encontrado na natureza. Em uma modalidade, o locus VL está no locus K endógeno de camundongo. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus K endógeno de camundongo e o locus endógeno de cadeia leve / de camundongo é eliminado em parte ou completamente. Em uma outra modalidade, o locus VL está no locus / endógeno de camundongo. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus / endógeno de camundongo e o locus k endógeno de camundongo é eliminado em parte ou completamente.

[000224] Em uma modalidade, o locus VL compreende pelo menos um hJ/. Em uma modalidade, o locus VL compreende uma pluralidade de hJ/s. Em uma modalidade, o locus VL compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 hJ/. Em uma modalidade específica, o locus VL compreende quatro hJ/. Em uma modalidade específica, os quatro hJ/s são hJ/1, hJ/2, hJ/3, e hJ/7. Em uma modalidade, o locus VL é um locus k. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus k endógeno e o locus / endógeno de cadeia leve é eliminado em parte ou completamente. Em uma modalidade, o locus VL compreende um hJ/. Em uma modalidade específica, o um hJ/ é hJ/1. Em uma modalidade, o locus VL está no locus k endógeno. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus k endógeno e o locus / endógeno de cadeia leve é eliminado em parte ou completamente. Em uma outra modalidade, o locus VL está no locus / endógeno. Em uma modalidade específica, o locus VL está no locus / endógeno e o locus k endógeno é eliminado em parte ou completamente.

[000225] Em uma modalidade, o locus VL compreende pelo menos um hV/, pelo menos um hJ/, e um gene Ck de camundongo. Em uma modalidade, o locus VL compreende pelo menos um hVX, pelo menos um hJX, e um gene CX de camundongo. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é CX2. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou pelo menos 99 % idêntico a CX2 de camundongo.

[000226] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição no locus K endógeno de camundongo de segmentos de gene endógenos VK de camundongo com um ou mais segmentos de gene hVX, em que os segmentos de gene hVX são operavelmente ligados a um gene endógeno da região Ck de camundongo, de maneira tal que o camundongo rearranja os segmentos de gene VX de humano e expressa uma cadeia leve quimérica reversa de imunoglobulina que compreende um domínio VX de humano e um Ck de camundongo. Em uma modalidade, 90-100 % de segmentos de gene não rearranjados Vk de camundongo são substituídos por pelo menos um segmento de gene hVX não rearranjado. Em uma modalidade específica, todos ou substancialmente todos os segmentos de gene endógenos Vk de camundongo são substituídos por pelo menos um segmento de gene hVX não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição é por pelo menos 12, pelo menos 28, ou pelo menos 40 segmentos de gene hVX não rearranjados. Em uma modalidade, a substituição é por pelo menos 7 segmentos de gene hVX funcionais não rearranjados, pelo menos 16 segmentos de gene hVX funcionais não rearranjados, ou pelo menos 27 segmentos de gene hVX funcionais não rearranjados. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos os segmentos de gene Jk de camundongo por pelo menos um segmento de gene hJX não rearranjado. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento de gene hJX não rearranjado é selecionado de JX1, JX2, JX3, JX4, JX5, JX6, JX7, e uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmento de gene hVX é selecionado de um segmento de gene hVX 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 746, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52, e uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o pelo menos um segmento de gene hJX não rearranjado é selecionado de JX1, JX2, JX3, JX7, e uma combinação destes.

[000227] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de segmentos de gene VX endógenos de camundongo no locus X endógeno de camundongo por um ou mais segmentos de gene VX de humano no locus X endógeno de camundongo, em que os segmentos de gene hVX são operavelmente ligados a um gene da região CX de camundongo, de maneira tal que o camundongo rearranja os segmentos de gene hVX e expressa uma cadeia leve quimérica reversa de imunoglobulina que compreende um domínio hVX e um CX de camundongo. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é CX2. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao CX2 de camundongo. Em uma modalidade, 90-100 % de segmentos de gene VX não rearranjados de camundongo são substituídos por pelo menos um segmento de gene hVX não rearranjado. Em uma modalidade específica, todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VX endógenos de camundongo são substituídos por pelo menos um segmento de gene hVX não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição é por pelo menos 12, pelo menos 28, ou pelo menos 40 segmentos de gene hVX não rearranjados. Em uma modalidade, a substituição é por pelo menos 7 segmentos de gene hVX funcionais não rearranjados, pelo menos 16 segmentos de gene hVX funcionais não rearranjados, ou pelo menos 27 segmentos de gene hVX funcionais não rearranjados. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos os segmentos de gene JX de camundongo por pelo menos um segmento de gene hJX não rearranjado. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento de gene hJX não rearranjado é selecionado de J/J, JX2, JX3, JX4, JX5, JX6, JX7, e uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmento de gene hVX é selecionado de um segmento de gene hVX 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 949, 1-50, 1-51, 5-52, e uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o pelo menos um segmento de gene hJX não rearranjado é selecionado de J/J, JX2, JX3, J/J, e uma combinação destes.

[000228] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado que compreende uma sequência de região intergênica VK-JK de humano localizada em um locus endógeno de cadeia leve K de camundongo.

[000229] Em uma modalidade, a sequência de região intergênica Vk-Jk de humano está em um locus endógeno de cadeia leve k de um camundongo que compreende um segmento de gene hVX e hJX, e a sequência de região intergênica VK-JK de humano é disposta entre os segmentos de gene hVX e hJX. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene hVX e hJX são capazes de recombinar para formar um domínio variável de cadeia leve X de humano funcional no camundongo.

[000230] Em uma modalidade, é fornecido um camundongo que compreende uma pluralidade de hVX e um ou mais hJX, e a sequência de região intergênica Vk-Jk de humano é disposta, com relação a transcrição, a jusante da sequência hVX proximal ou 3’ mais, e a montante ou 5’ da primeira sequência hJX.

[000231] Em uma modalidade, a região intergênica Vk-Jk de humano é uma região localizada cerca de 130 bp a jusante ou 3’ de um segmento de gene Vk4-1 de humano, cerca de 130 bp a jusante da 3’ região não traduzida do segmento de gene Vk4-1 de humano, e espaça a cerca de 600 bp a montante ou 5’ de um segmento de gene Jk1 de humano. Em uma modalidade específica, a região intergênica Vk-Jk de humano é cerca de 22,8 kb em tamanho. Em uma modalidade, a região intergênica VK-JK é cerca de 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, ou cerca de 95 % ou mais idêntica a uma região intergênica Vk-Jk de humano, que se estende da extremidade da região não traduzida 3’ de um segmento de gene Vk4-1 de humano a cerca de 600 bp a montante de um segmento de gene Jk1 de humano. Em uma modalidade, a região intergênica Vk-Jk compreende SEQ ID NO:158. Em uma modalidade específica, a região intergênica Vk-Jk compreende um fragmento funcional de SEQ ID NO:158. Em uma modalidade específica, a região intergênica Vk-Jk é SEQ ID NO:158.

[000232] Em um aspecto, são fornecidos um animal não humano, uma célula não humana (por exemplo, uma célula ES ou uma célula pluripotente), um embrião não humano, ou um tecido não humano que compreendem a sequência de região intergênica Vk-Jk de humano citada, em que a sequência de região intergênica é ectópica. Em uma modalidade específica, a sequência ectópica é colocada em um locus não humano endógeno humanizado de imunoglobulina. Em uma modalidade, o animal não humano é selecionado de um camundongo, um rato, um hamster, uma cabra, uma vaca, uma ovelha e um primata não humano.

[000233] Em um aspecto, é fornecido um construto de ácido nucleico isolado que compreende a sequência de região intergênica Vk-Jk de humano citada. Em uma modalidade, o construto de ácido nucleico compreende braços de alvejamento para alvejar a sequência de região intergênica Vk-Jk de humano em um locus de cadeia leve de camundongo. Em uma modalidade específica, o locus de cadeia leve de camundongo é um locus k. Em uma modalidade específica, os braços de alvejamento alvejam a região intergênica Vk-Jk de humano em um locus k endógeno modificado de camundongo, em que o alvejamento está em uma posição entre uma sequência hVX e uma sequência hJX.

[000234] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado, em que o camundongo compreende não mais de dois alelos de cadeia leve, em que os alelos de cadeia leve compreendem (a) um segmento de gene não rearranjado VX e um JX de imunoglobulina de humano em um locus endógeno de cadeia leve de camundongo, que compreende um gene CL de camundongo; e, (b) um segmento de gene não rearranjado VL e um JL de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve de camundongo, que compreende um gene CL de camundongo.

[000235] Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia leve de camundongo é um locus K. Em uma outra modalidade, o locus endógeno de cadeia leve de camundongo é um locus X.

[000236] Em uma modalidade, não mais de dois alelos de cadeia leve são selecionados de um alelo k e um alelo X, dois alelos k, e dois alelos X. Em uma modalidade específica, um dos dois alelos de cadeia leve é um alelo X que compreende um gene CX2.

[000237] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus funcional de cadeia leve de imunoglobulina e um locus não funcional de cadeia leve, em que o locus funcional de cadeia leve compreende um segmento de gene não rearranjado VX de imunoglobulina de humano e um JX em um locus endógeno de cadeia leve k de camundongo, que compreende um gene Ck de camundongo.

[000238] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus funcional de cadeia leve de imunoglobulina e um locus não funcional de cadeia leve, em que o locus funcional de cadeia leve compreende um segmento de gene não rearranjado VX e um JX de imunoglobulina de humano em um locus endógeno de cadeia leve X de camundongo, que compreende um gene CX de camundongo. Em uma modalidade, o gene CX é CX2. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao CX2 de camundongo.

[000239] Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente pelo menos um alelo de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, o pelo menos um alelo de cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segmento de gene humano VH, um segmento de gene humano DH, e um segmento de gene humano JH em um locus de cadeia pesada endógeno de camundongo que compreende um gene de cadeia pesada de humano, que expressa uma cadeia pesada de humano/camundongo. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende dois alelos de cadeia pesada de imunoglobulina, e o camundongo expressa uma cadeia pesada de humano/camundongo.

[000240] Em uma modalidade, o camundongo compreende um primeiro alelo de cadeia leve que compreende um hVK não rearranjado e um hJK não rearranjado, em um locus K endógeno de camundongo que compreende um gene CK endógeno; e um segundo alelo de cadeia leve que compreende um hVX não rearranjado e um hJX não rearranjado, em um locus K endógeno de camundongo que compreende um gene endógeno Ck. Em uma modalidade específica, o primeiro e o segundo alelos de cadeia leve são os apenas alelos funcionais de cadeia leve do camundongo geneticamente modificado. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende um locus X não funcional. Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado não expressa uma cadeia leve que compreende uma região constante X.

[000241] Em uma modalidade, o camundongo compreende um primeiro alelo de cadeia leve que compreende um hVk não rearranjado e um hJk não rearranjado, em um locus k endógeno de camundongo que compreende um gene Ck endógeno; e um segundo alelo de cadeia leve que compreende um não rearranjada hVX e um hJX não rearranjado, em um locus X endógeno de camundongo que compreende um gene CX endógeno. Em uma modalidade específica, o primeiro e o segundo alelos de cadeia leve são os apenas alelos funcionais de cadeia leve do camundongo geneticamente modificado. Em uma modalidade, o gene Ck endógeno é Ck2. Em uma modalidade específica, o gene Ck de camundongo é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao Ck2 de camundongo.

[000242] Em uma modalidade, o camundongo compreende seis alelos de imunoglobulina, em que o primeiro alelo compreende um segmento de gene não rearranjado de imunoglobulina Vk e Jk em um locus endógeno de cadeia leve K de camundongo, que compreende um gene CK de camundongo, o segundo compreende um segmento de gene não rearranjado VK e JK de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve k de camundongo que compreende um gene Ck de camundongo, o terceiro compreende um segmento de gene não rearranjado Vk e Jk de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve k de camundongo que compreende um gene Ck de camundongo, o quarto e quinto compreendem ada qual independentemente um segmento de gene não rearranjado VH e DH e JH em um locus de cadeia pesada endógeno de camundongo que compreende um gene de cadeia pesada de camundongo, e o sexto compreende tanto (a) um não segmento de gene rearranjado Vk e Jk de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve k de camundongo que compreende um gene Ck de camundongo, (b) um locus k que é não funcional, quanto (c) uma eliminação por completo ou em parte do locus k.

[000243] Em uma modalidade, o primeiro alelo compreende um hVk e hJk não rearranjado. Em uma modalidade, o segundo alelo compreende um hVk e hJk não rearranjado. Em uma modalidade, o terceiro alelo compreende um hVk e hJk não rearranjado. Em uma modalidade, o quarto e quinto compreendem cada qual independentemente um hVH e hDH e hJH não rearranjado. Em uma modalidade, o sexto alelo compreende um locus k endógeno de camundongo que é eliminado por completo ou em parte.

[000244] Em uma modalidade, o camundongo compreende seis alelos de imunoglobulina, em que o primeiro alelo compreende um segmento de gene não rearranjado VA e JX de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve X de camundongo, que compreende um gene CA de camundongo, o segundo compreende um segmento de gene não rearranjado Va e Ja de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve a de camundongo, que compreende um gene Ca de camundongo, o terceiro compreende um segmento de gene não rearranjado VK e JK de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve K de camundongo, que compreende um gene CK de camundongo, o quarto e quinto compreendem cada qual independentemente um segmento de gene não rearranjado VH e DH e JH em um locus de cadeia pesada endógeno de camundongo, que compreende um gene de cadeia pesada de camundongo, e o sexto compreende tanto (a) um segmento de gene não rearranjado Vk e Jk de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve k de camundongo, que compreende um gene Ck de camundongo, (b) um locus k que é não funcional, ou (c) uma eliminação de um ou mais elementos do locus k.

[000245] Em uma modalidade, o primeiro alelo compreende um segmento de gene hVa e hJa não rearranjado. Em uma modalidade, o segundo alelo compreende um segmento de gene hVa e hJa não rearranjado. Em uma modalidade, o terceiro alelo compreende um segmento de gene hVk e hJk não rearranjado. Em uma modalidade, o quarto e quinto compreendem cada qual independentemente um segmento de gene hVH e hDH e hJH não rearranjado. Em uma modalidade, o sexto alelo compreende um locus k endógeno de camundongo que é funcionalmente silenciado.

[000246] Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado compreende uma célula B que compreende um gene de anticorpo rearranjado compreendendo um domínio hVa rearranjado, operavelmente ligado a um domínio CL de camundongo. Em uma modalidade, o domínio CL de camundongo é selecionado de um domínio Ck de camundongo e um Ca de camundongo. Em uma modalidade específica, o domínio Ck de camundongo é derivado de um gene Ck2. Em uma modalidade específica, o domínio Ck de camundongo é derivado de um Ck domínio que é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao Ck2 de camundongo.

[000247] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado que expressa um Vk região em um CL que é um CK. Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado que expressa uma região hVk em um CL selecionado de um Ck de humano, um Ck de humano, ou um Ck de camundongo. Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado que expressa uma região hVk em um Ck de camundongo.

[000248] Em uma modalidade, cerca de 10-50 % dos esplenócitos dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), ou que cerca de 9-28 % expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio hVk fundido a um domínio Ck de camundongo.

[000249] Em uma modalidade específica, cerca de 23-34 % do esplenócitos dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), ou em que cerca de 9-11 % expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio hVk fundido a um domínio Ck de camundongo.

[000250] Em uma modalidade específica, cerca de 19-31 % dos esplenócitos dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), ou cerca de 9-17 % expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio hVk fundido a um domínio Ck de camundongo.

[000251] Em uma modalidade específica, cerca de 21-38 % do esplenócitos dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), ou cerca de 24-27 % expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio hVk fundido a um domínio Ck de camundongo.

[000252] Em uma modalidade específica, cerca de 10-14 % do esplenócitos dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), ou cerca de 9-13 % expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio IIVA fundido a um domínio CK de camundongo.

[000253] Em uma modalidade específica, cerca de 31-48 % do esplenócitos dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), ou cerca de 15-21 % expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio hVX fundido a um domínio CK de camundongo. Em uma modalidade específica, cerca de 30-38 % do esplenócitos dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), dos quais cerca de 33-48 % expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio IIVA fundido a um domínio Ck de camundongo.

[000254] Em uma modalidade, cerca de 52-70 % da medula óssea dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), ou cerca de 31-47 % do células B imaturas (isto é, CD19-positiva/B220-intermediária positiva/IgM- positiva) expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio IIVA fundido a um domínio CK de camundongo.

[000255] Em uma modalidade, cerca de 60 % da medula óssea dos camundongos são células B (isto é, CD19-positiva), ou cerca de 38,3 % das células B imaturas (isto é, CD19-positiva/B220-intermediária positiva/IgM- positiva) expressam uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio IIVA fundido a um domínio CK de camundongo.

[000256] Em uma modalidade, o camundongo expressa um anticorpo compreendendo uma cadeia leve que compreende um domínio variável derivado de um segmento de gene V de humano e um J de humano, e um domínio constante derivado de um gene de região constante de camundongo. Em uma modalidade, o gene de região constante de camundongo é um gene Ck. Em uma outra modalidade, o gene de região constante de camundongo é um gene CX. Em uma modalidade específica, a região CX é CX2. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é derivada de um gene CX que é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao CA2 de camundongo. Em uma modalidade específica, o anticorpo compreende adicionalmente uma cadeia pesada compreendendo um domínio variável derivado de um segmento de gene V de humano, um D de humano e um J de humano, e um domínio constante de cadeia pesada derivado de um gene de região constante de cadeia pesada de camundongo. Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada de camundongo gene compreende uma sequência de dobradiça-CH2- CH3 de um domínio constante de cadeia pesada. Em uma outra modalidade, a região constante de cadeia pesada de gene de camundongo compreende uma sequência CH1-dobradiça-CH2-CH3 de um domínio constante de cadeia pesada. Em uma outra modalidade, o gene de região constante de cadeia pesada de camundongo compreende uma sequência CH1-CH2-CH3-CH4 de um domínio constante de cadeia pesada. Em uma outra modalidade, o gene de região constante de cadeia pesada de camundongo gene compreende uma sequência CH2-CH3-CH4 de um domínio constante de cadeia pesada.

[000257] Em uma modalidade, o camundongo expressa um anticorpo compreendendo uma cadeia leve que compreende uma sequência rearranjada VA-JA de humano e uma sequência CK de camundongo. Em uma modalidade, a sequência rearranjada VA-.IA de humano é derivada de um rearranjo de segmentos de gene hVA selecionados de um segmento de gene 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-14, 3-19, 2-23, 3-25, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 9-49, e 1-51. Em uma modalidade, a sequência rearranjada Va-.a de humano é derivada de um rearranjo de segmentos de gene h.a selecionado do segmento de gene .a1, .a2, .a3, e .a7.

[000258] Em uma modalidade, o camundongo expressa um anticorpo compreendendo uma cadeia leve que compreende uma cadeia leve região variável a rearranjada de imunoglobulina compreendendo uma sequência Va/.a de humano selecionada de 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3- 10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 140/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 746/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 e 1-51/1. Em uma modalidade específica, a célula B expressa um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano fundido a um domínio constante de cadeia pesada de camundongo, e um domínio variável de cadeia leve X de imunoglobulina de humano fundido a um domínio constante de cadeia leve K de camundongo.

[000259] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que expressa um anticorpo compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo um domínio variável de cadeia pesada derivado de um segmento de gene não rearranjado de região variável de cadeia pesada de humano, em que o domínio variável de cadeia pesada é fundido a uma região constante de cadeia pesada de camundongo (CH); e, (b) uma cadeia leve compreendendo um domínio variável de cadeia leve derivado de um hVX e um hJX não rearranjado, em que o domínio variável de cadeia leve é fundido a uma região CL de camundongo.

[000260] Em uma modalidade, o camundongo compreende (i) um locus de cadeia pesada que compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene endógenos funcionais V, D e J de camundongo por todos ou substancialmente todos os segmentos de gene V, D e J funcionais de humano, um gene CH de camundongo, (ii) um primeiro locus k de cadeia leve compreendendo uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene Vk e Jk endógenos funcionais de camundongo pot todos, substancialmente todos, ou uma pluralidade de segmentos de gene hVX e hJX funcionais, e um gene C de camundongo, (iii) um segundo locus k de cadeia leve compreendendo uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene Vk e Jk endógenos funcionais de camundongo por todos, substancialmente todos, ou uma pluralidade de segmentos de gene hVk e hJk funcionais, e um gene Ck de camundongo. Em uma modalidade, o camundongo não expressa um anticorpo que compreende uma região CX. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma eliminação de um gene CX, e/ou um segmento de gene VX e/ou um JX. Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus não funcional X de cadeia leve. Em uma modalidade específica, o locus X de cadeia leve é eliminado por completo ou em parte.

[000261] Em uma modalidade, o camundongo compreende (i) um locus de cadeia pesada que compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos funcional segmentos de gene V, D e J endógenos de camundongo por todos ou substancialmente todos os segmentos de gene V, D e J funcionais de humano, um gene CH de camundongo, (ii) um primeiro locus X de cadeia leve compreendendo uma substituição de todos ou substancialmente todos funcional segmentos de gene VX endógenos de camundongo e JX por todos, substancialmente todos, ou uma pluralidade de, segmentos de gene hVX e hJX funcionais, e um gene CX de camundongo, (iii) um segundo locus X de cadeia leve compreendendo uma substituição de todos ou substancialmente todos funcional segmentos de gene VX endógenos de camundongo e JX por todos, substancialmente todos, ou uma pluralidade de segmentos de gene hVX e hJX funcionais, e um gene CX de camundongo. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é CX2. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é derivado de um gene CX que é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao CX2 de camundongo.

[000262] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma eliminação de um gene CK, e/ou um segmento de gene VK e/ou um JK. Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus K não funcional de cadeia leve.

[000263] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado que expressa um anticorpo é fornecido, em que mais de 10 %, mais de 15 %, mais de 20 %, mais de 25 %, mais de 30 %, mais de 35 %, mais de 40 %, mais de 60 %, mais de 70 %, mais de 80 %, ou mais de 90 % de anticorpo IgG total produzido pelo camundongo compreende um domínio variável derivado de X, e em que o camundongo expressa anticorpos compreendendo um domínio variável derivado de K fundido a uma região CK de camundongo. Em modalidades específicas, cerca de 15-40 %, 20-40 %, 25-40 %, 30-40 %, ou 35-40 % de anticorpo total produzido pelo camundongo compreende um domínio variável derivado de X.

[000264] Em uma modalidade, o domínio variável derivado de X é derivado de um hVX e um hJX. Em uma modalidade, o domínio variável derivado de X está em uma cadeia leve que compreende uma região Ck de camundongo. Em uma modalidade específica, a região variável derivada de X está em uma cadeia leve que compreende uma região CX de camundongo. Em uma outra modalidade específica, a região CX é uma região CX2. Em uma modalidade, o domínio variável derivado de k é derivado de um hVk e um hJk, e em uma modalidade específica está em uma cadeia leve que compreende uma região Ck de camundongo.

[000265] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado que compreende um braço de homologia a montante e um braço de homologia a jusante, em que o braço de homologia a montante e o a jusante alvejam o construto em um locus k de camundongo, e o construto compreende um segmento funcional não rearranjado hVX e um segmento funcional hJX não rearranjado, e uma sequência de seleção ou marcadora.

[000266] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo, de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição, um braço de alvejamento para alvejar uma sequência X de camundongo a montante de VX2 de camundongo, um cassete de seleção flanqueado 5’ e 3’ com sítios de reconhecimento de recombinase, e um braço de alvejamento para alvejar uma sequência X de camundongo 3’ de JX2 de camundongo. Em uma modalidade, o cassete de seleção é um cassete Frt’ed Hyg-TK. Em uma modalidade, o braço de alvejamento 3’ compreende C/2 de camundongo, J/A C/A e melhorador 2,4 de camundongo.

[000267] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo, de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição, um braço de alvejamento para alvejar o locus / 5’ de camundongo com relação a V/1, um cassete de seleção flanqueado 5’ e 3’ com sítios de reconhecimento de recombinase, e um braço de alvejamento 3’ para alvejar uma sequência / de camundongo 3’ com relação a C/1 de camundongo. Em uma modalidade, o cassete de seleção é um cassete de neomicina. Em uma modalidade, o braço de alvejamento 3’ compreende o melhorador / 3’ de camundongo e melhorador / 3’3,1 de camundongo.

[000268] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição, um braço de alvejamento para alvejar o locus / 5’ de camundongo com relação a V/2, um cassete de seleção flanqueado 5’ e 3’ com sítios de reconhecimento de recombinase, e um braço de alvejamento 3’ para alvejar uma sequência / de camundongo 3’ com relação ao J/2 e 5’ de camundongo, com relação ao C/2 de camundongo. Em uma modalidade, o cassete de seleção é um cassete Frt’ed higromicina-TK. Em uma modalidade, o braço de alvejamento 3’ compreende os segmentos de gene C/2 -J/4-C/4 de camundongo e melhorador / 2,4 de camundongo.

[000269] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo, de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição, um braço de alvejamento para alvejar o locus / 5’ de camundongo com relação a V/2, um cassete de seleção flanqueado 5’ e 3’ com sítios de reconhecimento de recombinase, um fragmento genômico de humano compreendendo uma região contígua do locus / de cadeia leve de humano de hV/3-12 a jusante na extremidade de hJ/1, e um braço de alvejamento 3’ para alvejar uma sequência X de camundongo 3’ com relação a JX2 de camundongo. Em uma modalidade, o cassete de seleção é um cassete Frt’ed neomicina. Em uma modalidade, o braço de alvejamento 3’ compreende os segmentos de gene C/2 de camundongo-J/4-C/4 e o melhorados / 2,4 de camundongo.

[000270] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo uma região contígua do locus / de cadeia leve de humano de hV/3-12 a jusante na extremidade de hJ/1.

[000271] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo de 5’ a 3’, com relação à direção da transcrição, um braço de alvejamento para alvejar o locus / 5’ de camundongo com relação a V/2, um cassete de seleção flanqueado 5’ e 3’ com sítios de reconhecimento de recombinase, e um fragmento genômico de humano compreendendo uma contígua região do locus / de cadeia leve de humano de hV/3-27 a jusante na extremidade de hV/2-8. Em uma modalidade, o cassete de seleção é um cassete Frt’ed higromicina. Em uma modalidade, o fragmento genômico de humano compreende um braço de alvejamento 3’. Em uma modalidade específica, o braço de alvejamento 3’ compreende cerca de 53 kb do locus / de cadeia leve de humano de hV/3-12 a jusante na extremidade de hV/2-8.

[000272] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo uma região contígua do locus / de cadeia leve de humano de hV/3-27 a jusante na extremidade de hV/3-12.

[000273] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo, de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição, um braço de alvejamento para alvejar o locus / 5’ de camundongo com relação a V/2, um cassete de seleção flanqueado 5’ e 3’ com sítios de reconhecimento de recombinase, um primeiro fragmento genômico de humano compreendendo uma região contígua do locus / de cadeia leve de humano de hV/5-52 a jusante na extremidade de hV/1-40, um sítio de enzima de restrição, e um segundo fragmento genômico de humano compreendendo uma região contígua do locus X de cadeia leve de humano de hVX3-29 a jusante na extremidade de hVX82K. Em uma modalidade, o cassete de seleção é um cassete Frt’ed neomicina. Em uma modalidade, o sítio de enzima de restrição é um sítio para uma endonuclease endógena. Em uma modalidade específica, a endonuclease endógena é PI-SceI. Em em modalidade, o segundo fragmento genômico de humano é um braço de alvejamento 3’. Em uma modalidade específica, o braço de alvejamento 3’ compreende cerca de 27 kb do locus X de cadeia leve de humano de hVX3-29 a jusante na extremidade de hVX82K.

[000274] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo uma região contígua do locus X de cadeia leve de humano de hVX5-52 a jusante na extremidade de hVX1-40.

[000275] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo, de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição, um braço de alvejamento para alvejar o locus K 5’ de camundongo com relação ao segmentos de gene VK endógenos, dois sítios de reconhecimento de recombinase justapostos, um cassete de seleção 3’ nos sítios de reconhecimento de recombinase justapostos, e um braço de alvejamento 3’ para alvejar uma sequência 5’ k de camundongo com relação aos segmentos de gene de cadeia leve variável k. Em uma modalidade, os sítios de reconhecimento de recombinase justapostos são em orientação contrária com relação um ao outro. Em uma modalidade específica, os sítios de reconhecimento de recombinase são diferentes. Em uma outra modalidade específica, os sítios de reconhecimento de recombinase são um sítio loxP e um sítio lox511. Em uma modalidade, o cassete de seleção é um cassetede neomicina.

[000276] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo, de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição, um braço de alvejamento para alvejar o locus k 5’ de camundongo com relação ao segmentos de gene Jk de camundongo, um cassete de seleção, um sítio de reconhecimento de recombinase 3’ no cassete de seleção, e um braço de alvejamento 3’ para alvejar uma sequência K 3’ de camundongo com relação aos segmentos de gene JK de camundongo e 5’ no melhorador intrônico K de camundongo. Em uma modalidade, o cassete de seleção é um cassete de higromicina-TK. Em uma modalidade, o sítio de reconhecimento de recombinase está na mesma direção com relação a transcrição do cassete de seleção. Em uma modalidade específica, o sítio de reconhecimento de recombinase é um sítio loxP.

[000277] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA isolado, compreendendo, de 5’ a 3’ com relação à direção da transcrição, um primeiro fragmento genômico de camundongo compreendendo sequência 5’ dos segmentos de gene endógenos Vk de camundongo, um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase, um segundo sítio de reconhecimento de recombinase, e um segundo fragmento genômico de camundongo compreendendo sequência 3’ dos segmentos de gene Jk endógenos de camundongo e 5’ do melhorador intrônico k de camundongo.

[000278] Em um aspecto, é fornecido um camundongo geneticamente modificado, em que a modificação genética compreende uma modificação com um ou mais dos construtos de DNA descritos anteriormente ou aqui.

[000279] Em um aspecto, é fornecido o uso de um construto de DNA isolado para produzir um camundongo da maneira aqui descrita. Em um aspecto, é fornecido o uso de um construto de DNA isolado da maneira aqui descrita, em um método para produzir uma proteína de ligação de antígeno.

[000280] Em um aspecto, é fornecida uma célula embrionária não humana que compreende um vetor de alvejamento compreendendo um construto de DNA da maneira descrita anteriormente e aqui. Em um aspecto, é fornecida uma célula embrionária não humana, em que a célula embrionária não humana é derivada de um camundongo aqui descrito.

[000281] Em uma modalidade, a célula embrionária não humana é uma célula do tronco embrionário (ES). Em uma modalidade específica, a célula ES é uma célula ES de camundongo.

[000282] Em um aspecto, é fornecido o uso de uma célula embrionária não humana, da maneira aqui descrita, para produzir um camundongo da maneira aqui descrita. Em um aspecto, é fornecido o uso de uma célula embrionária não humanada maneira, aqui descrita, para produzir uma proteína de ligação de antígeno.

[000283] Em um aspecto, um camundongo embrião é fornecido, em que o embrião de camundongo compreende uma modificação genética da maneira aqui fornecida. Em uma modalidade, um hospedeiro embrião de camundongo que compreende uma célula ES doadora é fornecido, em que a célula ES doadora compreende uma modificação genética da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, o embrião de camundongo é um embrião no estágio de pré- mórula. Em uma modalidade específica, o embrião no estágio de pré-mórula é um embrião no estágio de 4-células ou um embrião no estágio de 8-células. Em uma outra modalidade específica, o embrião de camundongo é um blastocisto.

[000284] Em um aspecto, é fornecido o uso de um embrião de camundongo da maneira aqui descrita, para produzir um camundongo da maneira aqui descrita. Em um aspecto, é fornecido o uso de um embrião de camundongo da maneira aqui descrita, para produzir uma proteína de ligação de antígeno.

[000285] Em um aspecto, é fornecida uma célula não humana, em que a célula não humana compreende uma sequência de gene rearranjado de cadeia leve de imunoglobulina derivada de um camundongo geneticamente modificado, da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, a célula é uma célula B. Em uma modalidade, a célula é um hibridoma. Em uma modalidade, a célula codifica um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina e/ou um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina que são mutados de maneira somática.

[000286] Em um aspecto, é fornecida uma célula não humana, em que a célula não humana compreende uma sequência de gene rearranjado de cadeia leve de imunoglobulina derivado de um camundongo geneticamente modificado, da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, a célula é uma célula B. Em uma modalidade, a célula é um hibridoma. Em uma modalidade, a célula codifica um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina e/ou um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, que são mutados de maneira somática.

[000287] Em um aspecto, é fornecido o uso de uma célula não humana da maneira aqui descrita para produzir um animal não humano, da maneira aqui descrita. Em um aspecto, é fornecido o uso de uma célula não humana da maneira aqui descrita para produzir uma proteína de ligação de antígeno. Em uma modalidade, o animal não humano é selecionado de um camundongo, um rato, um hamster, uma ovelha, uma cabra, uma vaca e um primata não humano.

[000288] Em um aspecto, é fornecida uma célula B de camundongo que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende: (a) uma região variável derivado de um segmento de gene IIVA e um segmento de gene hJA; e, (b) um gene CL de camundongo. Em uma modalidade, o gene CL de camundongo é selecionado de um gene CK e um CA. Em uma modalidade específica, o gene CA é CA2. Em uma modalidade específica, o gene CA de camundongo é derivado de um gene Ca que é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico a CA2 de camundongo. Em uma modalidade, a célula B de camundongo expressa adicionalmente um cognato de cadeia pesada que compreende (c) uma região variável derivada de um segmento hVH, um hDH, e (d) um hJH. Em uma modalidade, a célula B não compreende um gene A rearranjado. Em uma outra modalidade, a célula B não compreende um gene k rearranjado.

[000289] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um anticorpo em um animal geneticamente modificado não humano, compreendendo: (a) expor um animal geneticamente modificado não humano a um antígeno, em que o animal apresenta um genoma compreendendo pelo menos um hVX e pelo menos um hJX em um locus endógeno de cadeia leve, em que o locus endógeno de cadeia leve compreende um gene CL não humano; (b) permitir que o animal geneticamente modificado desenvolva uma resposta imune ao antígeno; e (c) isolar do animal de (b) um anticorpo que reconhece especificamente o antígeno, ou isolar a partir do animal de (b) uma célula compreendendo um domínio de imunoglobulina que reconhece especificamente o antígeno, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve derivada de um hVX, um hJX e um gene CL de animal. Em uma modalidade específica, o gene CL não humano é um gene CK de camundongo. Em uma modalidade, o animal não humano é selecionado de um camundongo, um rato, um hamster, um coelho, uma ovelha, uma cabra, uma vaca e um primata não humano.

[000290] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir um anticorpo em um animal não humano geneticamente modificado, compreendendo: (a) expor um animal geneticamente modificado a um antígeno, em que o animal apresenta um genoma compreendendo pelo menos um hVX em um locus K endógeno e pelo menos um hJX no locus K, em que o locus k compreende um gene Ck não humano; (b) permitir que o animal geneticamente modificado desenvolva uma resposta imune ao antígeno; e, (c) isolar do animal de (b) um anticorpo que reconhece especificamente o antígeno, ou isolar do camundongo de (b) uma célula compreendendo um domínio de imunoglobulina que reconhece especificamente o antígeno, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve derivada de um gene CK hVX, um hJX e um não humano.

[000291] Em uma modalidade, o gene K de cadeia leve constante é selecionado de um gene CK de humano e um gene CK de camundongo.

[000292] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir um anticorpo em um animal não humano geneticamente modificado, compreendendo: (a) expor um animal não humano geneticamente modificado a um antígeno, em que o animal apresenta um genoma compreendendo pelo menos um hVX em um locus X de cadeia leve e pelo menos one JX no locus X de cadeia leve, em que o locus X de cadeia leve compreende um gene CX não humano; (b) permitir que o animal geneticamente modificado desenvolva uma resposta imune ao antígeno; e, (c) isolar a partir do animal de (b) um anticorpo que reconhece especificamente o antígeno, ou isolar a partir do animal de (b) uma célula compreendendo um domínio de imunoglobulina que reconhece especificamente o antígeno, ou identificar no animal de B uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve que se liga ao antígeno, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve derivada de um gene hVX, um hJX e um CX não humano. Em uma modalidade, o animal não humano é selecionado de um camundongo, um rato, um hamster, uma ovelha, uma cabra, uma vaca e um primata não humano.

[000293] Em uma modalidade, o gene X de cadeia leve constante é selecionado de um gene CX de humano e um gene CX não humano. Em uma modalidade, o gene X de cadeia leve constante é um gene CX de humano. Em uma modalidade específica, o gene CX de humano é selecionado de CX1, CX2, CX3 e CX7. Em uma modalidade, o gene X de cadeia leve constante é um gene CX de camundongo ou rato. Em uma modalidade específica, o gene CX de camundongo é selecionado de CX1, CX2 e CX3. Em uma modalidade mais específica, o gene CX de camundongo é CX2. Em uma outra modalidade específica, o gene CX de camundongo é derivada de um gene CX que é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao CX2 de camundongo.

[000294] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um gene rearranjado de anticorpo em um animal não humano geneticamente modificado, compreendendo: (a) expor um animal não humano geneticamente modificado a um antígeno, em que a modificação genética compreende um hVX e um hJX em um locus endógeno de cadeia leve, em que o locus endógeno de cadeia leve compreende um gene CL não humano ou fragmento funcional deste; e, (b) identificar um gene rearranjado de imunoglobulina no dito animal não humano, em que o gene rearranjado de imunoglobulina compreende um segemento de gene de região variável X de cadeia leve, e um gene CL ou fragmento funcional deste.

[000295] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente clonar uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada e/ou leve do animal, em que a região variável de cadeia pesada e/ou leve é de um anticorpo que compreende um VX de humano e um CL de camundongo.

[000296] Em uma modalidade, o gene CL de camundongo ou fragmento funcional deste é selecionado de um gene CL de humano e um gene CL de camundongo, ou fragmento funcional deste.

[000297] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir um gene rearranjado de anticorpo em um animal não humano geneticamente modificado, compreendendo: (a) expor um animal não humano geneticamente modificado a um antígeno, em que a modificação genética compreende um hVX e um hJX em um locus K de cadeia leve, em que o locus K de cadeia leve compreende um gene CK não humano ou fragmento funcional deste; e, (b) identificar um gene rearranjado de imunoglobulina no dito animal, em que o gene rearranjado de imunoglobulina compreende um segmento de gene de região variável de cadeia leve X e um gene Ck ou fragmento funcional deste.

[000298] Em uma modalidade, o gene k de cadeia leve constante ou fragmento funcional deste é selecionado de um gene CK de humano e um gene CK não humano (por exemplo, camundongo ou rato), ou um fragmento funcional deste.

[000299] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente clonar uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada e/ou leve do animal, em que a região variável de cadeia pesada e/ou leve é de um anticorpo que compreende um VA de humano e um CK não humano (por exemplo, camundongo ou rato).

[000300] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir um gene rearranjado de anticorpo em um animal não humano geneticamente modificado é, compreendendo: (a) expor um animal não humano geneticamente modificado a um antígeno, em que a modificação genética compreende um hVa e um hJa em um locus a de cadeia leve não humano, em que o locus a de cadeia leve compreende um gene Ca não humano ou fragmento funcional deste; e, (b) identificar um gene rearranjado de imunoglobulina no dito animal, em que o gene rearranjado de imunoglobulina compreende um segmento de gene de região variável de cadeia leve a e um gene Ca ou fragmento funcional deste.

[000301] Em uma modalidade, o gene a de cadeia leve constante ou fragmento funcional deste é selecionado de um gene Ca de humano e um gene Ca de camundongo ou rato, ou um fragmento funcional deste. Em uma modalidade específica, o gene a de cadeia leve constante é um gene Ca de camundongo ou rato, ou um fragmento funcional deste.

[000302] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente clonar uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada e/ou leve do animal, em que a região variável de cadeia pesada e/ou leve é de um anticorpo que compreende um Va de humano e um Ca não humano (por exemplo, camundongo ou rato).

[000303] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um anticorpo, compreendendo expor um animal não humano da maneira aqui descrita a um antígeno, permitir que o animal monte uma resposta imune que compreende produzir um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno, identificar uma sequência rearranjada de ácido nucleico no animal que codifica cadeia pesada, e uma sequência rearranjada de ácido nucleico no animal que codifica uma sequência de domínio variável de cadeia leve cognata de um anticorpo, em que o anticorpo se liga especificamente ao antígeno, e empregar as sequências de ácido nucleico dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve fundidos aos domínios constantes de humano constant domínios para produzir um anticorpo desejado, em que o anticorpo desejado compreende uma cadeia leve que compreende um domínio VX fundido a um domínio CL. Em uma modalidade, o domínio VX é humano e o domínio CL é um domínio CX de humano, ou camundongo ou rato. Em uma modalidade, o domínio VX é de camundongo ou rato, e o domínio CL é um domínio CK de humano ou camundongo.

[000304] Em uma modalidade, um método para produzir um anticorpo é fornecido, compreendendo expor um animal não humano da maneira aqui descrita a um antígeno, permitir que o animal monte uma resposta imune que compreende produzir um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno, identificar uma sequência rearranjada de ácido nucleico no camundongo que codifica uma cadeia pesada e uma sequência rearranjada de ácido nucleico no animal que codifica uma sequência cognata de domínio variável de cadeia leve de um anticorpo, em que o anticorpo se liga especificamente ao antígeno, e empregar as sequências de ácido nucleico dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve fundidos às sequências de domínios constantes de ácido nucleico de humano para produzir um anticorpo desejado, em que o anticorpo desejado compreende uma cadeia leve que compreende um domínio VX fundido a um domínio Ck.

[000305] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir um anticorpo, compreendendo expor um animal não humano da maneira aqui descrita a um antígeno, permitir que o animal monte uma resposta imune que compreende produzir um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno, identificar uma sequência rearranjada de ácido nucleico no animal que codifica um domínio variável de cadeia pesada e uma sequência rearranjada de ácido nucleico que codifica uma sequência cognata de domínio variável de cadeia leve de um anticorpo, em que o anticorpo se liga especificamente ao antígeno, e empregar as sequências de ácido nucleico fundidas às sequências de ácido nucleico que codificam um domínio constante de cadeia pesada de humano e um domínio constante de cadeia leve de humano para produzir um anticorpo derivado de sequência de humanos, em que o anticorpo que se liga especificamente ao antígeno compreende uma cadeia leve que compreende um domínio VA de humano fundido a uma região CA não humana (por exemplo, camundongo ou rato).

[000306] Em uma modalidade, a região Ca é de camundongo, e em uma modalidade é selecionada de Ca1, Ca2 e Ca3. Em uma modalidade específica, a região Ca de camundongo é Ca2.

[000307] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir uma sequência de gene rearranjado de região variável de cadeia leve de anticorpo, compreendendo (a) expor um animal não humano da maneira aqui descrita a um antígeno; (b) permitir que o animal monte uma resposta imune; (c) identificar uma célula no animal que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência rearranjada de domínio Va de humano fundida a um domínio CL não humano, em que a célula também codifica uma cadeia pesada cognata compreendendo um domínio VH de humano e um domínio CH não humano, e em que a célula expressa um anticorpo que se liga ao antígeno; (d) clonar a partir da célula uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio Va de humano e uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio cognato VH de humano; e, (e) usar a sequência clonada de ácido nucleico que codifica o domínio VX de humano e a sequência clonada de ácido nucleico que codifica o domínio cognato VH de humano para produzir um anticorpo completamente humano. Em uma modalidade, o animal não humano e os domínios não humanos são selecionados de camundongo e rato.

[000308] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir uma sequência de gene rearranjado de região variável de cadeia leve de anticorpo, compreendendo (a) expor um animal não humano da maneira descrita nessa revelação a um antígeno; (b) permitir que o animal monte uma resposta imune; (c) identificar uma célula no animal que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência rearranjada de domínio VX de humano contígua, na mesma molécula de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio CK do animal não humano, em que a célula também codifica uma cadeia pesada cognata compreendendo um domínio VH de humano e um domínio CH do animal não humano, e em que a célula expressa um anticorpo que se liga ao antígeno; (d) clonar a partir da célula uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VX de humano e uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio cognato VH de humano; e, (e) usar a sequência clonada de ácido nucleico que codifica o domínio VX de humano e a sequência clonada de ácido nucleico que codifica o domínio cognato VH de humano para produzir um anticorpo completamente humano.

[000309] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir uma sequência de gene rearranjado de região variável de cadeia leve de anticorpo, compreendendo (a) expor um animal não humano da maneira aqui descrita a um antígeno; (b) permitir que o animal monte uma resposta imune ao antígeno; (c) identificar uma célula no animal que compreende DNA que codifica uma sequência rearranjada de domínio VX de humano fundido a um domínio CX não humano do animal, em que a célula também codifica uma cadeia pesada cognata compreendendo um domínio VH de humano e um domínio CH não humano do animal, e em que a célula expressa um anticorpo que se liga ao antígeno; (d) clonar a partir da célula uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio rearranjado VX de humano e uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio cognato VH de humano; e, (e) usar a sequência clonada de ácido nucleico que codifica o domínio VX de humano e a sequência clonada de ácido nucleico que codifica o domínio cognato VH de humano para produzir um anticorpo completamente humano. Em uma modalidade, o animal não humano é camundongo e o domínio CX é CX2 de camundongo. Em uma modalidade específica, o domínio CX de camundongo é derivado de um gene CX que é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao CX2 de camundongo.

[000310] Em um aspecto, é fornecido um animal não humano geneticamente modificado que expressa uma cadeia leve derivada de X de humano fundida a uma região constante endógena de cadeia leve (CL), em que o animal, mediante imunização com antígeno, produz um anticorpo compreendendo um domínio VX de humano fundido a um domínio CL não humano do animal. Em uma modalidade, o domínio CL não humano é selecionado de um domínio CK e um domínio CX. Em uma modalidade, o domínio CL é um domínio CK. Em uma modalidade, o animal é um camundongo. Em uma modalidade, o domínio CL de camundongo é um domínio CX. Em uma modalidade específica, o domínio CX é CX2. Em uma modalidade específica, o domínio CX de camundongo é derivado de um gene CX que é pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % idêntico ao CX2 de camundongo.

[000311] Em um aspecto, é fornecido um animal não humano geneticamente modificado compreendendo um locus modificado endógeno k ou X de cadeia leve, da maneira aqui descrita, que expressa uma pluralidade de cadeias leves X de imunoglobulina associadas com uma pluralidade de cadeias pesadas de imunoglobulina. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende uma sequência de humano. Em várias modalidades, a sequência de humano é selecionada de uma sequência variável, um CH1, uma dobradiça, um CH2, um CH3, e uma combinação destes. Em uma modalidade, a pluralidade de cadeias leves X de imunoglobulina compreende uma sequência de humano. Em várias modalidades, a sequência de humano é selecionada de uma sequência variável, uma sequência constante, e uma combinação destas. Em uma modalidade, o animal compreende um locus endógeno inativado de imunoglobulina e expressa a cadeia pesada e/ou a cadeia leve X de um transgene ou epissomo extracromossômico. Em uma modalidade, o animal compreende uma substituição em um locus endógeno (não humano) de alguns ou todos os segmentos de gene não humanos endógenos de cadeia pesada (isto é, V, D, J), e/ou algumas ou todas as sequências constantes de cadeia pesada endógenas não humanas (por exemplo, CH1, dobradiça, CH2, CH3, ou uma combinação deste), e/ou algumas ou todas as sequências de cadeia leve endógenas não humanas (por exemplo, V, J, constante, ou uma combinação destas), com uma ou mais sequência de imunoglobulina de humanos. Em uma modalidade, o animal não humano é um camundongo.

[000312] Em um aspecto, é fornecido um animal não humano adequado para produzir anticorpos que apresentam uma cadeia leve X derivada de humano, em que todos ou substancialmente todos os anticorpos produzidos no animal não humano são expressos com uma cadeia leve X derivada de humano. Em uma modalidade, a cadeia leve X derivada de humano é expressa a partir de um locus endógeno de cadeia leve. Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia leve é um locus K de cadeia leve. Em uma modalidade específica, o animal é um camundongo e o locus K de cadeia leve é um locus k de cadeia leve de camundongo.

[000313] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir uma cadeia leve X derivada de humano para um anticorpo de humano, compreendendo obter de um animal não humano da maneira aqui descrita uma sequência de cadeia leve e uma sequência de cadeia pesada, e empregar a sequência de cadeia leve e a sequência de cadeia pesada na produção de um anticorpo de humano.

[000314] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir uma proteína de ligação de antígeno, compreendendo expor um animal não humano da maneira aqui descrita a um antígeno; permitir que o animal não humano monte uma resposta imune; e obter a partir do animal não humano uma proteína de ligação de antígeno que se liga ao antígeno, ou obter do animal não humano uma sequência a ser empregada na produção de uma proteína de ligação de antígeno que se liga ao antígeno.

[000315] Em um aspecto, é fornecida uma célula derivada de um animal não humano (por exemplo, um camundongo ou rato) da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, a célula é selecionada de uma célula do tronco embrionário, uma célula pluripotente, uma célula pluripotente induzida, uma célula B, e um hibridoma.

[000316] Em um aspecto, é fornecida uma célula que compreende uma modificação genética da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, a célula é uma célula de camundongo. Em uma modalidade, a célula é selecionada de um hibridoma e um quadroma. Em uma modalidade, a célula expressa uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência variável X de humano fundida a uma sequência constante de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência constante de camundongo é uma sequência constante K de camundongo.

[000317] Em um aspecto, é fornecido um tecido derivado de um animal não humano da maneira aqui descrita.

[000318] Em um aspecto, é fornecido o uso de um animal não humano ou uma célula da maneira aqui descrita para produzir uma proteína de ligação de antígeno. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é uma proteína de humano. Em uma modalidade, a proteína de humano é um anticorpo de humano.

[000319] Em um aspecto, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno produzida por um animal não humano, célula, tecido, ou método da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é uma proteína de humano. Em uma modalidade, a proteína de humano é um anticorpo de humano.

[000320] Quaisquer das modalidades e aspectos aqui descritos podem ser usado juntos uns com os outros, a menos que de outra forma indicada ou evidente a partir do contexto. Outras modalidades se tornarão evidentes aos versados na técnica a partir de uma revisão da seguinte descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[000321] A FIG. 1A mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, de substituição genômica direta de cerca de três megabases (Mb) de um locus de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo (símbolos fechados) por cerca de uma megabase (Mb) do locus de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo (símbolos abertos).

[000322] A FIG. 1B mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, de substituição genômica direta de cerca de três megabases (Mb) de um locus de gene variável de cadeia leve K de imunoglobulina de camundongo (símbolos fechados) por cerca de 0,5 megabases (Mb) das primeiras, ou próximas, de duas repetições quase idênticas do locus de gene variável de cadeia leve k de imunoglobulina de humano (símbolos abertos).

[000323] A FIG. 2A mostra uma ilustração detalhada, não usada para classificação, de três etapas iniciais (A-C) para a substituição genômica direta de um locus de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, que resulta em eliminação de todos os segmentos de gene VH, DH e JH de camundongo e substituição por três segmentos de gene VH de humano, todos DH de humano e JH. Um vetor de alvejamento para uma primeira inserção de segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano é mostrado (3hVH BACvec) com um braço de homologia de camundongo de 67 kb 5’, um cassete de seleção (retângulo aberto), um sítio de recombinação específica para sítio (triângulo aberto), um fragmento genômico de humano de 145 kb e um braço de homologia de camundongo de 8 kb 3’. Os segmentos de gene de imunoglobulina de humano (símbolos abertos) e camundongo (símbolos fechados), cassetes de seleção adicionais (retângulo abertos) e sítios de recombinação específica para sítio (triângulo abertos) inseridos a partir de vetores de alvejamento subsequente são mostrados.

[000324] A FIG. 2B mostra uma ilustração detalhada, não usada para classificação, de seis etapas adicionais (D-I) para a substituição genômica direta de um locus de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, que resulta na inserção de 77 segmentos de gene adicionais VH de humano e remoção de um cassete de seleção final. Um vetor de alvejamento para inserção de segmentos de gene adicionais VH de humano (18hVH BACvec) na inserção inicial de segmentos de gene D e cadeia pesada de humano (3hVH-CRE Alelo híbrido) é mostrado com um braço de homologia de camundongo 20 kb 5’, um cassete de seleção (retângulo aberto), um fragmento genômico de humano de 196 kb e um braço de homologia de 62 kb de humano que se sobrepõe com a extremidade 5’ da inserção inicial de segmentos de gene D e cadeia pesada de humano, que é mostrado com um sítio de recombinação específica para sítio (triângulo aberto) localizado 5’ dos segmentos de gene de humano. Os segmentos de gene de imunoglobulina de humano (símbolos abertos) e camundongo (símbolos fechados) e cassetes de seleção adicionais (retângulo abertos), inseridos por vetores de alvejamento subsequentes são mostrados.

[000325] A FIG. 2C mostra uma ilustração detalhada, não usada para classificação, de três etapas iniciais (A-C) para a substituição genômica direta de um locus de gene variável de cadeia leve K de imunoglobulina de camundongo, que resulta em eliminação de todos os segmentos de gene de VK e Jk de camundongo (Igk-CRE Alelo híbrido). Cassetes de seleção (retângulo abertos) e sítios de recombinação específica para sítio (triângulo abertos) inseridos a partir dos vetores de alvejamento são mostrados.

[000326] A FIG. 2D mostra uma ilustração detalhada, não usada para classificação, de cinco etapas adicionais (D-H) para a substituição genômica direta de um locus de gene variável de cadeia leve k de imunoglobulina de camundongo, que resulta na inserção de todos os segmentos de gene Vk e Jk de humano na repetição proximal e eliminação do cassete de seleção final (40hVkdHyg Alelo híbrido). Os segmentos de gene de imunoglobulina de humano (símbolos abertos) e camundongo (símbolos fechados), e cassetes de seleção adicionais (retângulo abertos), inseridos por vetores de alvejamento subsequente são mostrados.

[000327] A FIG. 3A mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, de uma estratégia de seleção incluindo os locais de oligonucleotídeo iniciador/sonda de PCR quantitativa (qPCR) para detectar a inserção de sequências de gene de cadeia pesada de humano e a perda de sequências de gene de cadeia pesada de camundongo em células do tronco embrionário (ES) alvejadas. A estratégia de seleção em células ES e camundongos para uma primeira inserção de gene de cadeia pesada de humano é mostrada com conjuntos de oligonucleotídeo iniciador/sonda de qPCR para a região eliminada (“perda” de sondas C e D), a região inserida (“hIgH” sondas G e H) e regiões flanqueantes (“retenção” de sondas A, B, E e F) em um cromossomo de camundongo (parte superior) não modificado e um cromossomo corretamente alvejado(parte inferior).

[000328] A FIG. 3B mostra um cálculo representativo do número de cópias de sonda observado em células ES parentais e modificadas para uma primeira inserção de segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Número de cópias de sonda observado para sondas A até F foi calculado como 2/2ΔΔCt. ΔΔCt é calculado como ave[ΔCt(sample) - medΔCt(control)], onde ΔCt é a diferença em Ct entre sondas teste e de referência (entre 4 e 6 sondas de referência, dependendo do ensaio). O termo medΔCt(control) é a mediana ΔCt de múltiplas (>60) amostras de DNA não alvejadas das células ES parentais. Cada clone modificado de célula ES foi ensaiado em sextuplicata. Para calcular o número de cópias de sondas IgH G e H em células ES parental, presumiu-se que estas sondas apresentavam o número de cópias de 1 nas células ES modificadas, e um Ct máximo de 35 foi usado mesmo que nenhuma amplificação tenha sido observada.

[000329] A FIG. 3C mostra um cálculo representativo de números de cópia para quatros camundongos de cada genótipo, calculado usando apenas sondas D e H. Camundongos tipo selvagem: Camundongos WT; Camundongos heterozigoto para uma primeira inserção de segmentos de gene de imunoglobulina de humano: Camundongos HET; Camundongos homozigotos para uma primeira inserção de segmentos de gene de imunoglobulina de humano: Homos camundongos.

[000330] A FIG. 4A mostra uma ilustração detalhada, não usada para classificação, do três etapas empregadas para a construção de um 3hVH BACvec por recombinação homóloga bacteriana (BHR). Os segmentos de gene de imunoglobulina de humano (símbolos abertos) e camundongo (símbolos fechados), cassetes de seleção (retângulo abertos) e sítios de recombinação específica para sítio (triângulo abertos) inseridos a partir de vetores de alvejamento são mostrados.

[000331] A FIG. 4B mostra eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) de três clones BAC (B1, B2 e B3) após a digestão NotI. Os marcadores M1, M2 e M3 são marcadores de variação baixa, variação média e PFG lambda principal, respectivamente (New England BioLabs, Ipswich, MA).

[000332] A FIG. 5A mostra uma ilustração esquemática, não usada para classificação, de modificações sequenciais do locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongos com maiores quantidades de segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Os camundongos homozigotos foram produzidos de cada um do três diferentes estágios de humanização de cadeia pesada. Símbolos abertos indicam sequência de humano; símbolos fechados indicam sequência de camundongo.

[000333] A FIG. 5B mostra uma ilustração esquemática, não usada para classificação, de modificações sequenciais do locus K de cadeia leve de imunoglobulina de camundongos com maiores quantidades de segmentos de gene de cadeia leve k de imunoglobulina de humano. Os camundongos homozigotos foram produzidos a partir de cada um de três diferentes estágios de humanização de k cadeia leve. Símbolos abertos indicam sequência de humano; símbolos fechados indicam sequência de camundongo.

[000334] A FIG. 6 mostra gráficos de pontos FACS de populações de célula B em camundongos tipo selvagem e VELOCIMMUNE® humanizados. Células de baço (linha de cima, terceira linha a partir da superior e linha inferior) ou linfonodo inguinal (segunda linha a partir da superior) de camundongos tipo selvagem (wt), VELOCIMMUNE® 1 (V1), VELOCIMMUNE® 2 (V2) ou VELOCIMMUNE® 3 (V3) foram coradas para IgM de superfície que expressa células B (linha superior e segunda linha a partir da superior), imunoglobulina de superfície contendo tanto cadeias leves K quanto X (terceira linha a partir da superior) ou IgM de superfície de haplotipos específicos (linha inferior), e populações separadas por FACS.

[000335] A FIG. 7A mostra sequências representativas de cadeia pesada CDR3 de anticorpos VELOCIMMUNE® aleatoriamente selecionados em torno da junção VH-DH-JH (CDR3), demonstrando diversidade juncional e adições de nucleotídeo. As sequências de cadeia pesada CDR3 são agrupadas de acordo com o uso de segmento de gene DH, a linhagem germinativa que é fornecida antes de cada grupo em negrito. Os segmentos de gene VH para cada sequência de cadeia pesada CDR3 são anotados nos parênteses na extremidade 5’ de cada sequência (por exemplo, 3-72 é VH3-72 de humano). Os segmentos de gene JH para cada cadeia pesada CDR3 são anotados nos parêntesis n extremidade 3’ de cada sequência (por exemplo, 3 é JH3 de humano). SEQ ID NOs para cada sequência mostrada são são da maneira a seguir, precedente da parte superior para inferior: SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39.

[000336] A FIG. 7B mostra sequências CDR3 representativas de cadeia leve de anticorpos VELOCIMMUNE® selecionados aleatoriamente em torno da junção VK-JK (CDR3), demonstrando diversidade juncional e adições de nucleotídeo. Os segmentos de gene VK para cada sequência CDR3 de cadeia leve são anotados nos parêntesis na extremidade 5’ de cada sequência (por exemplo, 1-6 é Vk1-6 de humano). Os segmentos de gene Jk para cada CDR3 de cadeia leve são anotados nos parêntesis na extremidade 3’ de cada sequência (por exemplo, 1 é Jk1 de humano). SEQ ID NOs para cada sequência mostrada são da maneira a seguir, precedentes da parte superior para a inferior: SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:51; SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:53; SEQ ID NO:54; SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:58.

[000337] A FIG. 8 mostra frequências de hipermutação somática de cadeia pesadas e leves de anticorpos VELOCIMMUNE® selecionados (após o alinhamento para combinar as sequências de linhagem germinativa) como percentual de sequências trocadas em cada nucleotídeo (NT; coluna à esquerda) ou posição de aminoácido (AA; coluna à direita) entre os conjuntos de 38 (IgM não imunizada), 28 (IgG não imunizada), 32 (IgK de IgG não imunizada), 36 (IgG não imunizada) ou 36 (IgK imunizada de IgG) sequências. As barras escuras indicam a localização de CDRs.

[000338] A FIG. 9A mostra níveis de imunoglobulina sérica para isotipos IgM e IgG em camundongos tipo selvagem (barras abertas) ou VELOCIMMUNE® (barras fechadas).

[000339] A FIG. 9B mostra níveis de imunoglobulina sérica para isotipo IgA em camundongos tipo selvagem (barras abertas) ou VELOCIMMUNE® (barras fechadas).

[000340] A FIG. 9C mostra níveis de imunoglobulina sérica para isotipo IgE em camundongos tipo selvagem (barras abertas) ou VELOCIMMUNE® (barras fechadas).

[000341] A FIG. 10A mostra titulações específicas para antígeno de IgG contra o receptor de interleucina-6 (IL-6R) do soro de sete camundongos VELOCIMMUNE® (VI) e cinco tipo selvagem (WT) após dois (sangria 1) ou três (sangria 2) ciclos de imunização com ectodomínio de IL-6R.

[000342] A FIG. 10B mostra titulações específicas do isotipo IgG específico para de IL-6R a partir de sete camundongos VELOCIMMUNE® (VI) e cinco tipo selvagem (WT).

[000343] A FIG. 11A mostra a distribuição por afinidade de anticorpo monoclonal do receptor anti-interleucina-6, gerado em camundongos VELOCIMMUNE®.

[000344] A FIG. 11B mostra o bloqueio específico para antígeno de anticorpos monoclonais do receptor anti-interleucina-6 gerado em camundongos VELOCIMMUNE® (VI) e tipo selvagem (WT).

[000345] A FIG. 12 mostra uma ilustração esquemática, não usada para classificação, de genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. Um vetor de alvejamento (vetor de alvejamento mADAM6) usado para inserção de ADAM6a e ADAM6b de camundongo em um locus endógeno humanizado de cadeia pesada é mostrado com um cassete de seleção (HYG: higromicina) flanqueado por sítios de recombinação específica para sítio (Frt), incluindo sítios de restrição geneticamente modificados nas extremidades 5’ e 3’.

[000346] A FIG. 13 mostra uma ilustração esquemática, não usada para classificação, de um pseudogene ADAM6 de humano (hADAM6T) localizado entre segmentos de gene variáveis de cadeia pesada 1-2 (VH1-2) e 6-1 (VH6-1) de humano. Um vetor de alvejamento para a recombinação homóloga bacteriana (Vetor de alvejamento hADAM6T) para eliminar um pseudogene ADAM6 de humano, e inserir sítios de restrição exclusivos em um locus de cadeia pesada de humano, é mostrado com um cassete de seleção (NEO: neomicina) flanqueado por sítios de recombinação específica para sítio (loxP), incluindo sítios de restrição geneticamente modificados nas extremidades 5’ e 3’. Uma ilustração, não usada para classificação, do locus de cadeia pesada alvejado resultante, contendo um fragmento genômico que codifica os genes ADAM6a ADAM6b de camundongo e incluindo um cassete de seleção flanqueado por sítios de recombinação específica para sítio, é mostrada.

[000347] A FIG. 14A mostra gráficos de contorno FACS de linfócitos unidos em singlets para a expressão superficial de IgM e B220 na medula óssea de camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano (H+/+K+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano com um fragmento genômico de camundongo inserido compreendendo o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+). O percentual de células B imaturas (B220intIgM+) e maduras (B220highIgM+) é anotado em cada gráfico de contorno.

[000348] A FIG. 14B mostra o número total de células B imaturas (B220intIgM+) e maduras (B220highIgM+) na medula óssea isolada de fêmures de camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano (H+/+K+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+).

[000349] A FIG. 15A mostra gráficos de contorno FACS de células B ligadas a CD19+ para a expressão de superfície de c-kit e CD43 na medula óssea em camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano (H+/+k+/+) e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+). O percentual de células pro-B (CD19+CD43+ckit+) e pre-B (CD19+CD43-ckit-) é anotado nos quadrantes superiores à direita e inferiores à esquerda, respectivamente, de cada gráfico de contorno.

[000350] A FIG. 15B mostra o número total de células pro-B (CD19+CD43+ckit+) e células pre-B (CD19+CD43-ckit-) na medula óssea, isoladas de fêmures de camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano (H+/+k+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo compreendendo gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+).

[000351] A FIG. 16A mostra gráficos de contorno FACS de linfócitos ligados em singlets para a expressão de superfície de CD19 e CD43 na medula óssea em camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano (H+/+K+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+). O percentual de células B imaturas (CD19+CD43-), pre-B (CD19+CD43int) e pro-B (CD19+CD43+) é anotado em cada gráfico de contorno.

[000352] A FIG. 16B mostra histogramas de células B imaturas (CD19+CD43-) e pre-B (CD19+CD43int) na medula óssea de camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano (H+/+k+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+).

[000353] A FIG. 17A mostra gráficos de contorno FACS de linfócitos ligados em singlets para a expressão de superfície de CD19 e CD3 em esplenócitos em camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano (H+/+k+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+). O percentual de células B (CD19+CD3-) e T (CD19-CD3+) é anotado em cada gráfico de contorno.

[000354] A FIG. 17B mostra gráficos de contorno FACs para células B ligadas a CD19+ para a expressão de superfície de cadeia leve de Ig/ e IgK no baço de camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano (H+/+K+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resK+/+). O percentual de células B com Ig/+ (quandrante superior à esquerda) e com IgK' (quandrante inferior à direita) é anotado em cada gráfico de contorno.

[000355] A FIG. 17C mostra o número total de células B CD19+ no baço de camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano (H+/+K+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+).

[000356] A FIG. 18A mostra gráficos de contorno FACs de células B ligadas s CD19+ para a expressão de superfície de IgD e IgM no baço de camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano (H+/+k+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+). O percentual de células B maduras (CD19+IgDhighIgMint) é anotado para cada gráfico de contorno. A seta em o gráfico de contorno à direita ilustra o processo de maturação para células B em relação à expressão superficial de IgM e IgD.

[000357] A FIG. 18B mostra o número total de células B no baço de camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano (H+/+k+/+), e camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve k de humano com um fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica o gene de ADAM6 de camundongos (H+/+A6resk+/+), durante a maturação de CD19+IgMhighIgDint para CD19+IgMintIgDhigh.

[000358] A FIG. 19 mostra uma ilustração detalhada, não usada para classificação, do locus X de cadeia leve de humano, incluindo os agrupamentos de pares da região de segmentos de gene VX (A, B e C) e o JX e CX (pares J-C)

[000359] A FIG. 20 mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, de uma estratégia de alvejamento usada para inativar o locus endógeno de cadeia leve X de camundongo.

[000360] A FIG. 21 mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, de uma estratégia de alvejamento usada para inativar o locus endógeno de cadeia leve K de camundongo.

[000361] A FIG. 22A mostra uma ilustração geral, não usada para classificação de um vetor de alvejamento inicial para alvejar o locus endógeno de cadeia leve X de camundongo com humano sequências de cadeia leve X, incluindo 12 segmentos de gene hVX e 1 segmento de gene hJX (Vetor de alvejamento 12/1-X).

[000362] A FIG. 22B mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, de quatro vetores de alvejamento iniciais para alvejar o locus endógeno de cadeia leve k de camundongo com sequências de cadeia leve X de humano, incluindo 12 segmentos de gene hVX e 1 segmento de gene hJX (Vetor de alvejamento 12/1-k), 12 segmentos de gene hVX e 1, 2, 3 e 7 segmentos de gene hJX (Vetor de alvejamento 12/4-k), 12 segmentos de gene hVX, uma sequência genômica Vk-Jk de humano e 1 segmento de gene hJX (Vetor de alvejamento 12(k)1-k) e 12 segmentos de gene hVX, uma sequência genômica Vk-Jk de humano e 1, 2, 3 e 7 segmentos de gene hJX (Vetor de alvejamento 12(k)4-k).

[000363] A FIG. 23A mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, de uma estratégia de alvejamento para a inserção progressiva de 40 segmentos de gene hVX e um único segmento de gene hJX no locus X de cadeia leve de camundongo.

[000364] A FIG. 23B mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, de uma estratégia de alvejamento para a inserção progressiva de 40 segmentos de gene hVX e um único segmento de gene hJX no locus k de camundongo.

[000365] A FIG. 24 mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, das etapas de alvejamento e modificação genética e molecular empregadas para produzir vetores de alvejamento híbridos exclusivos X-K de humano, para a construção de um locus híbrido de cadeia leve contendo uma sequência intergênica k de humano, múltiplos segmentos de gene hJX ou ambos.

[000366] A FIG. 25A mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, da estrutura do locus para um locus modificado de cadeia leve X de camundongo contendo 40 segmentos de gene hVX, e um único segmento de gene hJX operavelmente ligado ao gene endógeno CX2.

[000367] A FIG. 25B mostra uma ilustração geral, não usada para classificação, da estrutura do locus para quatro loci independentes, modificados de cadeia leve k de camundongo contendo 40 segmentos de gene hVX, e tanto um ou quatro segmentos de gene hJX com ou sem uma sequência genômica contígua Vk-Jk de humano operavelmente ligada ao gene Ck endógeno.

[000368] A FIG. 26A mostra gráfico de contornos de esplenócitos de IgX+ e Igk+ ligados em CD19+ de um camundongo tipo selvagem (WT), um camundongo homozigoto para 12 segmentos de gene hVX e quatro hJX, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano (12hVX-VkJk-4hJX), e um camundongo homozigoto para 40 segmento de gene hVX e um segmento de gene hJX (40hVX-1hJX).

[000369] A FIG. 26B mostra o número total de células B CD19+ nos balos coletados de camundongos tipo selvagem (WT), homozigotos para 12 segmentos de gene hVX e quatro hJX, incluindo uma sequência genômica Vk- Jk de humano (12hVX-VkJk-4hJX) e camundongos homozigotos para 40 segmentos de gene hVX e um hJX (40hVX-1hJX).

[000370] A FIG. 27A, no painel superior, mostra gráfico de contornos de esplenócitos ligados em singlets e corados para células B e T (CD19+ e CD3+, respectivamente), a partir de um camundongo tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto for 40 segmentos de gene hVX e JX, incluindo uma sequência genômica VK-JK de humano (40hVX-VKjK-4hJX). O painel na parte inferior mostra gráficos de contorno de esplenócitos ligados em CD19+ e corados para a expressão de IgX+ e Igk+ de um camundongo tipo selvagem (WT), e um camundongo homozigoto para 40 segmentos de gene hVX e quatro JX, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano (40hVX- VkJk-4hJX).

[000371] A FIG. 27B mostra o número total de células B CD19+, CD19+Igk+ e CD19+IgX+ em baços coletados a partir de camundongos tipo selvagem (WT) e camundongos homozigotos para 40 segmentos de gene hVX e quatro JX, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano (40hVX- VkJk-4hJX).

[000372] A FIG. 27C mostra gráficos de contorno de esplenócitos ligados em CD19+ e corados para imunoglobulina D (IgD) e imunoglobulina M (IgM) de um camundongo tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para 40 segmentos de gene hVX e quatro JX, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano (40hVX-VkJk-4hJX). As células B maduras (72 para WT, 51 para 40hVX-VkJk-4hJX) e transitionais (13 para WT, 22 para 40hVX-VkJk-4hJX) são anotadas em cada um dos gráficos de contorno.

[000373] A FIG. 27D mostra o número total de células B CD19+, células B transicionais (CD19+IgMhiIgDlo) e células B maduras (CD19+IgMloIgDhi) em baços coletados de camundongos tipo selvagem (WT) e camundongos homozigotos para 40 segmentos de gene hVX e quatro JX, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano (40hVX-VkJk-4hJX).

[000374] A FIG. 28A, no painel superior, mostra gráficos de contorno de medula óssea corados para células B e T (CD19+ e CD3+, respectivamente) de um camundongo tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para 40 segmentos de gene hVX e quatro JX, incluindo uma sequência genômica VK-JK de humano (4(.)l]V/-Vi<.li<-4h.l/j. O painel na parte inferior mostra gráficos de contorno de medula óssea ligados em CD19+ e corados para ckit+ e CD43+ de um camundongo tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para 4( segmentos de gene hV/ e quatro J/, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano (4(hV/-VkJk-4hJ/). As células B Pro e Pre são anotadas nos gráficos de contorno do painel na parte inferior.

[000375] A FIG. 28B mostra o número de células B Pro (CD19+CD43+ckit+) e Pre (CD19+CD43-ckit-) na medula óssea, coletado dos fêmures de camundongos tipo selvagem (WT) e camundongos homozigotos para 4( segmentos de gene hV/ e quatro J/, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano (4(hV/-VkJk-4hJ/).

[000376] A FIG. 28C mostra gráficos de contorno de medula óssea ligados em singlets corados para imunoglobulina M (IgM) e B22( de um camundongo tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para 4( segmentos de gene hV/ e quatro J/, incluindo uma sequência genômica Vk- Jk de humano (4(hV/-VkJk-4hJ/). As células B imaturas, maduras e pro/pre são anotadas em cada um dos gráficos de contorno.

[000377] A FIG. 28D mostra o número total de células B imaturas (B22(intIgM+) e maduras (B22(hiIgM+) na medula óssea, isoladas dos fêmures de camundongos tipo selvagem (WT) e camundongos homozigotos para 4( segmentos de gene hV/ e quatro J/, incluindo uma sequência genômica Vk- Jk de humano (4(hV/-VkJk-4hJ/).

[000378] A FIG. 28E mostra gráficos de contorno de medula óssea ligados em células B imaturas (B22(intIgM+) e maduras (B22(hiIgM+) coradas para a expressão de Ig/ e Igk isolada dos fêmures de um camundongo tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para 4( segmentos de gene hV/ e quatro J/, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano (4(hV/-VkJk-4hJ/).

[000379] A FIG. 29 mostra uma sequência de alinhamento de nucleotídeo da junção VX-JX-CK de dezoito clones RT-PCR independentes, amplificados a partir de RNA de esplenócitos de camundongos que carrega sequências de gene de cadeia leve X de humano em um locus endógeno de cadeia leve K de camundongo. A6 = SEQ ID NO: 115; B6 = SEQ ID NO: 116; F6 = SEQ ID NO:117; B7 = SEQ ID NO:118; E7 = SEQ ID NO:119; F7 = SEQ ID NO:120; C8 = SEQ ID NO:121; E12 = SEQ ID NO:122; 1-4 = SEQ ID NO:123; 1-20 = SEQ ID NO:124; 3B43 = SEQ ID NO:125; 5-8 = SEQ ID NO:126; 5-19 = SEQ ID NO:127; 1010 = SEQ ID NO:128; 11A1 = SEQ ID NO:129; 7A8 = SEQ ID NO:130; 3A3 = SEQ ID NO:131; 2-7 = SEQ ID NO:132. As bases em letra minúscula indicam bases de linhagem não germinativa, resultando tanto da mutação quanto da adição de N durante a recombinação. Os aminoácidos consensuais na região de estrutura 4 (FWR4) codificados pela sequência de nucleotídeo de hJX1 e Ck de camundongo são anotados na parte inferior do alinhamento de sequência.

[000380] A FIG. 30 mostra uma sequência de alinhamento de nucleotídeo da junção VX-JX-Ck de doze clones independentes RT-PCR, amplificados a partir do RNA de esplenócito de camundongos que carregam sequências de gene de cadeia leve X de humano, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk contígua de humano em um locus endógeno de cadeia leve k de camundongo. 5-2 = SEQ ID NO:145; 2-5 = SEQ ID NO:146; 1-3 = SEQ ID NO:147; 4B-1 = SEQ ID NO:148; 3B-5 = SEQ ID NO:149; 7A-1 = SEQ ID NO:150; 5-1 = SEQ ID NO:151; 4A-1 = SEQ ID NO:152; 11A-1 = SEQ ID NO:153; 5-7 = SEQ ID NO:154; 5-4 = SEQ ID NO:155; 2-3 = SEQ ID NO:156. As bases em letra minúscula indicam bases de linhagem não germinativa, resultando tanto da mutação quanto da adição de N durante a recombinação. Os aminoácidos consensuais na região de estrutura 4 (FWR4) codificados pela sequência de nucleotídeo de cada JX de humano e Ck de camundongo são anotados na parte inferior do alinhamento de sequência.

[000381] A FIG. 31 mostra uma sequência de alinhamento de nucleotídeo da junção VX-JX-CX de três clones independentes RT-PCR, amplificados a partir de RNA de esplenócito de camundongos que carregam sequênias de gene de cadeia leve X de humano em um locus endógeno de cadeia leve X de camundongo. 2D1 = SEQ ID NO:159; 2D9 = SEQ ID NO:160; 3E15 = SEQ ID NO:161. As bases em letra minúscula indicam bases de linhagem não germinativa, resultando tanto de mutação quanto de adição de N durante a recombinação. Os aminoácidos consensuais na região de estrutura 4 (FWR4) codificados pela sequência de nucleotídeo de hJX1 e CX2 de camundongo são anotados na parte inferior do alinhamento de sequência. DESCRIÇÃO DETALHADA

[000382] Esta invenção não é limitada aos métodos particulares, e condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também entende-se que a terminologia aqui usada é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não é destinada a ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações.

[000383] A menos que de outra forma definido, todos os termos e frases aqui usados incluem os significados que os termos e frases atingiram na tecnologia, a menos que o contrário seja claramente indicado ou claramente evidenciado no contexto em que o termo ou frase é usado. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais particulares são agora descritos. Todos os pedidos de patente mencionados estão aqui incorporados pela referência.

[000384] A frase “substancial” ou “substancialmente” quando usada para se referir a uma quantidade de segmentos de gene (por exemplo, “substancialmente todos” segmentos de gene V) inclui tanto segmentos de gene funcionais quanto não funcionais e incluem, em várias modalidades, por exemplo, 80 % ou mais, 85 % ou mais, 90 % ou mais, 95 % ou mais 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, ou 99 % ou mais de todos os segmentos de gene; em várias modalidades, “substancialmente todos” segmentos de gene inclui, por exemplo, pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % de segmentos de gene funcionais (isto é, não-pseudogene).

[000385] O termo “substituição” inclui em que uma sequência de DNA é colocada em um genoma de uma célula de uma maneira tal a substituir uma sequência no genoma com uma sequência heteróloga (por exemplo, uma sequência de humano em um camundongo), no locus da sequência genômica. A sequência de DNA então colocada pode incluir uma ou mais sequências regulatórias que são parte de DNA da fonte usadas para obter a sequência então colocada (por exemplo, promotores, melhoradores, regiões não traduzidas 5’- ou 3’, sequências de sinal de recombinação apropriada, etc.). Por exemplo, em várias modalidades, a substituição é uma substituição de uma sequência endógena para uma sequência heteróloga que não resulta nenhuma produção de um produto de gene do sequência de DNA então colocada (compreendendo a sequência heteróloga), mas não expressão da sequência endógena; a substituição é de uma sequência genômica endógena com uma sequência de DNA que codifica uma proteína que tem uma função similar à uma proteína codificada pela sequência genômica endógena (por exemplo, a sequência genômica endógena codifica um gene ou domínio de imunoglobulina, e o fragmento de DNA codifica um ou mais genes ou domínios de imunoglobulina humanos). Em várias modalidades, um gene ou fragmento endógeno deste é substituído por um gene ou fragmento humano correspondente deste. Um gene ou fragmento humano correspondente deste é um gene ou fragmento humano que é um ortólogo de, um homólogo de, ou é substancialmente idêntico ou o mesmo em estrutura e/ou função, que o gene ou fragmento endógeno deste que é substituído.

[000386] O termo “contíguo” inclui referência à ocorrência na mesma molécula de ácido nucleico, por exemplo, duas sequências de ácido nucleico são “contíguas” se elas ocorrerem na mesma molécula nucleica, mas são interrompidas por uma outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, uma sequência rearranjada V(D)J é “contígua” com uma região constante gene sequência, embora o códon final da V(D)J sequência não seja seguida imediatamente pelo primeiro códon da sequência de região constante. Em um outro exemplo, duas sequências de segmento de gene V são “contíguas” se elas ocorrerem no mesmo fragmento de genômico, embora elas possam ser separadas pela sequência que não codifica uma região do códon do V, por exemplo, elas podem ser separadas por uma sequência regulatória, por exemplo, um promotor ou outra sequência de não codificação. Em uma modalidade, uma sequência contígua inclui um fragmento de genômico que contém sequências genômicas arranjadas conforme encontrado em um genoma tipo selvagem.

[000387] A frase “derivado de” quando usada com relação a uma região variável “derivada de” um gene ou segmento de gene citado inclui a capacidade de retroceder a sequência a um segmento de gene ou segmentos de gene não rearranjados particulares que foram rearranjados para formar um gene que expressa o domínio variável (responsável, onde aplicável, por pequenas diferenças e mutações somáticas).

[000388] A frase “funcional” quando usada com relação a um segmento de gene de região variável ou segmento de gene de união refere-se ao uso em um anticorpo repertório expresso; por exemplo, em segmentos de gene humanos VX 3-1, 4-3, 2-8, etc. são funcionais, enquanto que segmentos de gene VX 3-2, 3-4, 2-5, etc. não são funcionais.

[000389] Um “locus de cadeia pesada” inclui um local em um cromossomo, por exemplo, um cromossomo de camundongo, em que em uma região de cadeia pesada variável tipo selvagem de camundongo (VH), diversidade de cadeia pesada (DH), união de cadeia pesada (JH), e cadeia pesada constante (CH) sequências de DNAs são encontradas.

[000390] Um “locus K” inclui uma localização em um cromossomo, por exemplo, um cromossomo de camundongo, em que em as sequências de DNA de região variável k (Vk), de união k (Jk), e constante k (Ck) no camundongo tipo selvagem são encontradas.

[000391] Um “locus X” inclui uma localização em um cromossomo, por exemplo, um cromossomo de camundongo, em que em as sequências de DNA de região variável X (VX), de união X (JX), e constante X (CX) camundongo tipo selvagem são encontradas.

[000392] O termo “célula,” quando usado em conjunto com uma sequência de expressão inclui qualquer célula que é adequada para expressar uma sequência recombinante de ácido nucleico. Células incluem os de procariotas e eucariota (célula única ou múltiplas células), células bacterianas (por exemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células micobacterianas, células fúngicas, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células de planta, células de inseto (por exemplo, SF-9, SF-21, células de insto infectadas com baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animal não humano, células de humano, células B, ou fusões de célula, tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, ape, hamster, rato, ou camundongo. Em algumas modalidades, a célula é eucariótica e é selecionada das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), célula retinal, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL- 60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, célula 3T3, L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral e uma linhagem celular derivada de uma célula mencionada anteriormente. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo uma célula retinal que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6™).

[000393] A frase “região que determina complementariedade,” ou o termo “CDR,” inclui uma sequência de aminoácido codificado por uma sequência de ácido nucleico de um genes de imunoglobulina do organismo que normalmente (isto é, em um animal tipo selvagem) aparece entre duas regiões de estrutura em uma região variável de uma cadeia leve ou pesada de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou um receptor de célula T). Um CDR pode ser codificado, por exemplo, por uma sequência de linhagem germinativa ou uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por uma célula B naive ou madura ou uma célula T. Em alguns casos (por exemplo, para um CDR3), CDRs podem ser codificados por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências de linhagem germinativa) que não são contíguas (por exemplo, em uma sequência não rearranjada de ácido nucleico) mas são contíguas em uma sequência de célula B de ácido nucleico, por exemplo, como o resultado de espaçamento ou conexão com as sequências (por exemplo, recombinação V-D-J para formar uma cadeia pesada CDR3).

[000394] A frase “segmento de gene,” ou “segmento” inclui referência a um segmento de gene V (leve ou pesada) ou D ou J (leve ou pesada) de imunoglobulina, que inclui sequências não rearranjadas no loci de imunoglobulina (por exemplo, em humanos e camundongos) que podem participar em um rearranjo (mediadas por, por exemplo, recombinases endógenas) para formar uma sequência rearranjada V/J ou V/D/J. A menos que indicado de outra forma, os segmentos V, D, e J compreendem sequências de sinal de recombinação (RSS) que permitem recombinação V/J ou recombinação V/D/J de acordo com a regra 12/23. A menos que indicado de outra forma, os segmentos compreendem adicionalmente sequências com as quais eles são associados na natureza ou equivalentes funcionais destes (por exemplo, para segmentos V promotor(s) e líder(s)).

[000395] O termo “não rearranjado” inclui o estado de um locus de imunoglobulina, em que os segmentos de gene V e J (para cadeia pesadas, segmentos de gene D igualmente) são mantidos separadamente, mas são capazes de ser unidos para formar um gene V(D)J rearranjado que compreende um único repertório V,(D),J do V(D)J.

[000396] A frase “faixa micromolar” deve significar 1-999 micromolar; a frase “faixa nanomolar” deve significar 1-999 nanomolar; a frase “faixa picomolar” deve significar 1-999 picomolar.

[000397] O termo “animais não humanos” deve incluir quaisquer animais não humanos, tais como ciclostomes, peixes espinhosos, peixe cartilaginoso, tais como tubarões e arraias, anfíbios, répteis, mamíferos, e pássaros. Animais não humanos adequados incluem mamíferos. Mamíferos adequados incluem primatas não humanos, cabras, ovelha, porcos, cães, vacas e roedores. Animais não humanos adequados são selecionados da família do roedor incluindo rato e camundongo. Em uma modalidade, os animais não humanos são camundongos.

[000398] O camundongo como um modelo genético foi muito melhorado por tecnologias transgênicas e de inativação, que permitiram estudar os efeitos da sobre-expressão direta ou eliminação de genes específicos. A despeito de todas as suas vantagens, o camundongo ainda apresenta obstáculos genéticos que o tornam um modelo imperfeito para doenças humanas e uma plataforma imperfeita para testar terapêuticos humanos ou torná-los. Primeiro, embora cerca de 99 % de genes humanos tenham um camundongo homólogo (Waterston et al. (2002), sequenciamento inicial e análise comparativa do genoma do camundongo, Nature 420, 520562), terapêuticas potenciais frequentemente falham ao reagir cruzado, ou inadequadamente reagir cruzado, com camundongos ortólogos realmente destinados aos alvos humanos. Para resolver este problema, genes alvo selecionados podem ser “humanizados,” isto é, o gene do camundongo pode ser eliminado e substituído pela sequência de gene ortólogo humano correspondente (por exemplo, US 6.586.251, US 6.596.541 e US 7.105.348, aqui incorporado pela referência). Inicialmente, esforços para humanizar genes de camundongo por uma estratégia de “inativação-mais-humanização transgênica” cruzamento implicado de um camundongo que carrega uma eliminação (isto é, inativação) do gene endógeno com um camundongo que carrega um transgene humano aleatoriamente integrado (ver, por exemplo, Bril et al. (2006), Tolerance to factor VIII in a transgenic mice expressing human factor VIII cDNA carrying a Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al. (2006), Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine desease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al. (2006), A humanized BAC transgenic/knockout mice model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al. (2006), Differents role for mice and humano CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- e CD3gammadelta- deficient mice, Mol Immunol 43:1741-1750). Mas os esforços foram rampeados por limitações de tamanho; tecnologias de inativação convencionais não foram suficientes para diretamente substituir genes de camundongo grandes com seus pares genômicos humanos grandes. Uma abordagem direta de substituição homóloga direta, em que um gene de camundongo endógeno é diretamente substituído pelo gene par humano no mesmo local genético preciso do gene do camundongo (isto é, no locus do camundongo endógeno), é raramente levada em consideração em decorrência das dificuldades técnicas. Até agora, esforços na substituição direta envolveram procedimentos elaborado e caros, limitando assim o tamanho do material genético que pode ser manuseado e a precisão com a qual pode ser manipulado.

[000399] Transgenes de imunoglobulina humana exogenamente introduzidos rearranjam em células B precursoras em camundongos (Alt et al. (1985), Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). Esta descoberta foi explorada por camundongos de engenharia usando a abordagem inativação-mais-transgênico para expressar anticorpos de humano (Green et al. (1994), Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg, N. (2005), Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23:1117-1125; Lonberg et al. (1994), Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct changes, Nature 368:856-859; Jakobovits et al. (2007), From XenoMouse technology to panitumumab, the first full human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). A cadeia pesada de imunoglobulina endógena de camundongo e loci K de cadeia leve foram inativados nestes camundongos por eliminação alvejada de porções pequenas, mas críticas de cada locus endógeno, seguido pela introdução de loci de gene de imunoglobulina humana como transgenes grandes aleatoriamente integrados, conforme descrito anteriormente, ou minicromossomos (Tomizuka et al. (2000), Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromossome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727). Tais camundongos representaram um avanço importante na engenharia genética; anticorpos monoclonais completamente humanos isolados deles renderam terapêuticas promissoras potenciais para tratar uma variedade de doenças humanas (Gibson et al. (2006), Randomized phase III trial results of panitumumab, a full human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al. (2007), Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cel lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005; Maker et al. (2005), Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T linfocite-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:10051016; McClung et al. (2006), Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, N Engl J Med 354:821-831). Mas, conforme discutido anteriormente, estes camundongos apresentam desenvolvimento de célula B comprometido e deficiências imunes quando comparado aos camundongos tipo selvagem. Tais problemas potencialmente limitam a capacidade dos camundongos de suportar uma resposta humoral vigorosa e, consequentemente, geram anticorpos completos humanos contra alguns antígenos. As deficiências podem ser em virtude de: (1) funcionalidade ineficiente em virtude da introdução aleatória dos transgenes de imunoglobulina humanos e resultando expressão incorreta em virtude de uma perda a montante e a jusante dos elementos de controle (Garrett et al. (2005), Chromatin architecture near a potential 3' end of Igh locus involves modular regulation of histone changes during B-cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al. (2003), Elucidation of a downstream boundary of 3' IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al. (2006), Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of mice Igh locus defined by pro-cell B-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immunol 176I6839-6851); (2) interações interespécie ineficientes entre componentes dos domínios constantes de humano e camundongo do complexo de sinalização do receptor de célula B na superfície da célula, que pode conferir processos de sinalização requeridos para maturação, proliferação, e sobrevivência normal de células B (Hombach et al. (1990), Molecular components of B-cell antigen receptor complex of IgM class, Nature 343:760-762); e (3) interações interespécie ineficiente entre receptores Fc de imunoglobulinas solúveis de humano e camundongo que devem reduzir a seleção da afinidade (Rao et al. (2002). Differential expression of inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB in germinal center cell: implications for selection of high-affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) e immunoglobulin serum concentrations (Brambell et al. (1964), A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans e Anderson, (1996), The protection receptor for IgG catabolism is the beta2- microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al. (2006), Antibody-mediated regulation of immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn e Ravetch, (2007), Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Estas deficiências podem ser corrigidas por humanização in situ apenas do loci das regiões variáveis de imunoglobulina dos camundongos nos locais naturais no loci endógeno de cadeia pesada e leve. Isto pode efetivamente resultar em camundongos que tornam anticorpos “quiméricos reversos” (isto é, humano V: camundongo C) que podem ser capazes de interações normais e seleção com o ambiente do camundongo com base nas regiões de retenção constantes do camundongo. Ainda tais anticorpos quiméricos reversos podem ser prontamente reformatados em anticorpos completamente humanos para propósitos terapêuticos.

[000400] Animais geneticamente modificados que compreendem uma substituição no locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina com sequências heterólogas (por exemplo, de uma outra espécie) de imunoglobulina podem ser produzido junto com substituições em loci endógenos de cadeia leve de imunoglobulina ou junto com transgenes de cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, transgenes quiméricos de cadeia leve de imunoglobulina ou completamente humanos de camundongo, etc.). A espécie a partir da qual as sequências heterólogas de cadeia pesada de imunoglobulina são derivads podem variar muito; assim como as sequências de cadeia leve de imunoglobulina empregadas nas substituições de sequência de cadeia leve de imunoglobulina ou transgenes de cadeia leve de imunoglobulina.

[000401] Sequências do ácido nucleico da região variável de imunoglobulina, por exemplo, segmentos V, D, e/ou J, são em várias modalidades obtidas de um animal humano ou não humano. Animais não humanos adequados para fornecer segmentos V, D, e/ou J incluem, por exemplo, peixes espinhosos, peixe cartilaginoso, tais como tubarões e arraias, anfíbios, répteis, mamíferos, pássaros (por exemplo, galinhas). Animais não humanos incluem, por exemplo, mamíferos. Mamíferos incluem, por exemplo, primatas não humanos, cabras, ovelha, porcos, cães, bovino (por exemplo, vaca, búfalo), veado, camelos, furões e roedores e primatas não humanos (por exemplo, chimpanzés, orangotangos, gorilas, saguis, macacos rhesus). Animais não humanos adequados são selecionados da família do roedor incluindo ratos, camundongos, e hamsters. Em uma modalidade, os animais não humanos sãos camundongos. Conforme evidente no contexto, vários animais não humanos podem ser usados como fontes de segmentos de gene de domínios variáveis ou regiões variáveis (por exemplo, tubarões, arraias, mamíferos, por exemplo, camelos, roedores, tais como camundongos e ratos).

[000402] De acordo com o contexto, animais não humanos também são usados como fontes de sequências de região constante a ser usadas em conjunto com sequências ou segmentos variáveis, por exemplo, sequências constantes de roedor podem ser usadas em transgenes operacionalmente ligados a sequências variáveis humanas ou não humanas (por exemplo, sequências variáveis de primata humano ou não humano operacionalmente ligado às sequências constantes, por exemplo, de roedor, por exemplo, camundongo ou rato ou hamster,). Assim, em várias modalidades, segmentos V, D, e/ou J humanos são operacionalmente ligados às sequências do gene de região constante do roedor (por exemplo, camundongo ou rato ou hamster). Em algumas modalidades, os segmentos V, D, e/ou J humanos (ou um ou mais genes VDJ ou VJ rearranjados) são operacionalmente ligados ou fundidos a uma sequência do gene de região constante de camundongo, rato, ou hamster em, por exemplo, um transgene integrado em um locus que não é um locus de imunoglobulina endógena.

[000403] Em uma modalidade específica, é fornecido um camundongo que compreende uma substituição de VH, DH, e segmentos de gene JH em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina com um ou mais humano VH, DH, e JH segmentos, em que o um ou mais humano VH, DH, e JH segmentos são operavelmente ligados a um endogenous gene constante de cadeia pesada de imunoglobulina; em que o camundongo compreende um transgene em um locus sem ser um locus endógeno de imunoglobulina, em que o transgene compreende um não rearranjada ou rearranjada humano VL e humano JL segment operavelmente ligados a um camundongo ou rato ou humano região constante.

[000404] Em uma modalidade específica, é fornecido um camundongo que compreende uma inserção de em ou mais segmentos de gene VH, DH e JH de humano em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a inserção é a montante de um gene endógeno constante de cadeia pesada de imunoglobulina; em uma modalidade, a inserção é a jusante de um segmento de gene endógeno variável (V); em uma modalidade, a inserção é a jusante de um segmento de gene endógeno de diversidade (D); em uma modalidade, a inserção é a jusante de um segmento de gene endógeno de união (J). Em várias modalidades, a inserção é de maneira tal que o um ou mais segmentos de gene VH, DH e JH de humano estão posicionados em ligação operável com um ou mais genes constantes endógenos de cadeia pesada.

[000405] É descrito um método para uma grande substituição genética in situ dos loci de gene variável de imunoglobina da linhagem germinativa de camundongos por loci de gene variável de imunoglobina da linhagem germinativa de humano, mantendo ao mesmo tempo a capacidade dos camundongos para gerar descendentes. Especificamente, é descrita a substituição exata de seis megabases tanto dos loci de gene variável de imunoglobulina de cadeia pesada quanto de cadeia leve K de camundongo por seus semelhantes de humano counterparts, deixando ao mesmo tempo as regiões constantes de camundongo intactas. Em função disso, camundongos foram criados para apresentar uma substituição exata de seu repertório completo variável de imunoglobulina da linhagem germinativa pelas sequências variáveis equivalentes de imunoglobulina da linhagem germinativa de humano, mantendo ao mesmo tempo as regiões constantes de camundongo. As regiões variáveis de humano são ligadas às regiões constantes de camundongo para formar loci de imunoglobulina quimérica de humano-camundongo, os quais rearranjam e expressam em níveis fisiologicamente apropriados. Os anticorpos expressos são “quimeras reversas,” isto é, compreendem sequências de região variável de humano e sequências de região constante de camundongo. Estes camundongos com regiões variáveis humanizadas de imunoglobulina que expressam anticorpos com humano regiões variáveis e regiões constantes de camundongo são denominados camundongos VELCOIMMUNE®.

[000406] Os camundongos VELOCIMMUNE® humanizados exibem um sistema imune humoral completamente funcional, que é essencialmente indistinguível daquele dos camundongos tipo selvagem. Estes exibem populações de célula normal em todos os estágios de desenvolvimento de célula B. Exibem morfologia de órgão linfóide normal. As sequências de anticorpo de camundongos VELOCIMMUNE® exibem frequências de earranjo normal V(D)J e hipermutação somática normal. As populações de anticorpo nestes camundongos refletem distribuições de isotipo que resultam de troca de classe normal (por exemplo, isotipo normal de troca cis). A imunização de camundongos VELOCIMMUNE® resulta em respostas imunes humorais intensas, que geram um grande e diverso repertório de anticorpo com domínios variáveis de imunoglobulina de humano dequados como candidatos a terapêutico. Esta plataforma fornece uma fonte abundante de sequências de região variável de imunoglobulina de humano com afinidade naturalmente maturada para produzir anticorpos farmaceuticamente aceitáveis e outras proteínas de ligação de antígeno.

[000407] É a substituição exata de sequências variáveis de imunoglobulina de camundongo por sequências variáveis de imunoglobulina de humano que permite a produção de camundongos VELOCIMMUNE®. Ainda uma substituição exaya de sequências endógenas de imunoglobulina de camundongo em locis de cadeia pesada e leve por sequências equivalentes de imunoglobulina de humano, recombiando sequencialmente os espaços muito grandes de sequências de imunoglobulina de humano, pode apresentar certos desafios em virtude da evolução divergente dos loci de imunoglobulina entre camundongo e homem. Por exemplo, sequências intergênicas interspersas nos loci de imunoglobulina não são idênticos entre camundongos e humanos e, em alguns casos, podem ser não funcionalmente equivalentes. Diferenças entre camundongos e humanos no seu loci de imunoglobulina ainda podem resultar em anormalidades em camundongos humanizados, particularmente na humanização ou manipulação de certas porções de cadeia pesada de loci de imunoglobulina endógena de camundongo. Algumas modificações na cadeia pesada de loci de imunoglobulina de camundongo são prejudiciais. Modificações prejudiciais podem incluir, por exemplo, perda da capacidade dos camundongos modificados de acasalar e produzir descendente. Em várias modalidades, engenharia genética das sequências de imunoglobulina de humano no genoma de um camundongo inclui métodos que mantêm sequências endógenas que, quando ausentes em cepas de camundongo modificadas, são prejudiciais. Efeitos prejudiciais exemplares podem incluir incapacidade de propagar cepas modificadas, perda de função de genes essenciais, incapacidade de expressar polipeptídeos, etc. Tais efeitos prejudiciais podem ser direta ou indiretamente relacionados à modificação por engenharia genética no genoma do camundongo.

[000408] Uma substituição exata, em grande escala, in situ de seis megabases das regiões variáveis dos loci de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de camundongos (VH-DH-JH e VK-JK) pelas sequências genômicas de 1,4 megabases correspondentes de humano foi realizada, permitindo ao mesmo tempo o flanqueamento das sequências intactas e funcionais de camundongo nos loci híbridos, incluindo todos os genes de cadeia constante de camundongo e locus de regiões transcricionais controle (FIG. 1A e FIG. 1B). Especificamente, as sequências de gene VH, DH, JH, Vk e Jk de humano foram introduzidas por estapas até a inserção de 13 vetores de alvejamento de BAC quimérico que carrega os fragmentos de sobreposição dos loci variáveis da linhagem germinativa de humano em células ES de camundongo, usando tecnologia de modificação genética VELOCIGENE® (ver, por exemplo, patente U.S. 6.586.251 e Valenzuela, D.M. et al. (2003). High-throughput engineering of the mice genome coupled with high- resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659).

[000409] A humanização dos genes de imunoglobulina de camundongos representa a maior modificação genética no genoma do camundongo até o momento. Embora esforços anteriores com transgenes de imunoglobulina de humano integrados aleatoriamente tenham tido algum sucesso (discutido anteriormente), a substituição direta dos genes de imunoglobulina de camundongos por seus semelhantes de humano aumenta muito a eficiência de quais anticorpos completamente humanos podem ser gerados de maneira eficiente, ao contrário dos camundongos normais. Adicionalmente, tais camundongos exibem uma diversidade acentuadamente maior de anticorpos completamente humanos que podem ser obtidos após a imunização com qualquer antígeno de maneira virtual, comparado com camundongos que carregam loci endógenos indesejáveis e transgenes de anticorpo completamente humano. Múltiplas versões de loci humanizados e substituídos exibem níveis completamente normais de células B maduras e imaturas, ao contrário dos camundongos com transgenes de humano aleatoriamente integrados, que exibem populações significativamente reduzidas de célula B em vários estágios de diferenciação. Embora os esforços para aumentar o número de segmentos de gene de humano em camundongos transgênicos humanizados tenham reduzido tais efeitos, os repertórios expandidos de imunoglobulina não atingiram todos as refuções corretas em populações de célula B, comparado aos camundongos tipo selvagem.

[000410] Não obstante a função imune humoral tipo selvagem vizinha observada em camundongos com loci substituído de imunoglobulina (isto é, VELOCIMMUNE® camundongos), existem outros desafios encontrados empregando uma substituição direta da imunoglobulina que não é encontrada em algumas abordagens que empregam transgenes integrados. Diferenças na composição genética dos loci de imunoglobulina entre camundongos e humanos levaram à descoberta de sequências benéficas para a propagação dos camundongos com segmentos de gene de imunoglobulina substituídos. Especificamente, genes de ADAM de camundongo localizados no locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina são idealmente presentes em camundongos com loci substituído de imunoglobulina, em virtude de seu papel na fertilidade. Localização genômica e função de ADAM6 de camundongo

[000411] Camundongos machos que não têm a capacidade de expressar nenhuma proteína ADAM6 funcional apresentam surpreendentemente um defeito na capacidade dos camundongos de acasalar e gerar descendente. Os camundongos não têm a capacidade de expressar uma proteína ADAM6 funcional em virtude de uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene de região variável de imunoglobulina de camundongo por segmentos de gene variáveis de cadeia leve de humano. A perda da função de ADAM6 resulta em decorrência do locus ADAM6 estar localizado em uma região do locus de gene de região variável endógeno de imunoglobulina, proximal à extremidade 3’ do locus do segmento de gene VH que é a montante dos segmentos de gene DH. De maneira a procriar camundongos que são homozigotos para uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene endógeno de cadeia pesada variável com segmentos de gene variáveis de cadeia leve de humano, no geral é uma abordagem complicada ajustar machos e fêmeas que são cada um homozigotos para a substituição e aguardam um cruzamento produtivo. Ninhadas com êxito são relativamente raras, e tamanho menor médio é muito pequeno. Ao contrário, heterozigotos machos para a substituição foram empregados para acasalar com homozigotos fêmeas para a substituição para gerar progênies que são heterozigotos para a substituição, então procriar um camundongo homozigoto destas. Os inventores determinaram que a causa provável da perda na fertilidade nos camundongos machos é a ausência em camundongos homozigotos machos de uma proteína ADAM6 funcional.

[000412] Em vários aspectos, camundongos machos que compreendem um gene ADAM6 danificado (isto é, não funcional ou marginalmente funcional) apresentam uma redução ou eliminação de fertilidade. Em decorrência dos camundongos (e outros roedores) o gene ADAM6 estar localizado no locus de cadeia pesada de imunoglobulina, os inventores determinaram que de maneira a propagar camundongos, ou criar e manter uma cepa de camundongos, que compreendem modificações em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina, vários esquemas de procriação ou propagação modificados são empregados. A baixa fertilidade, ou infertilidade, de camundongos machos homozigotos para uma substituição do locus de gene variável endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina torna a manutenção de uma modificação como esta em uma cepa de camundongo difícil. Em várias modalidades, a manutenção da cepa compreende evitar os problemas de infertilidade apresentados por camundongos machos homozigoto para uma substituição.

[000413] Em um aspecto, um método para manter uma cepa de camundongo, da maneira aqui descrita, é fornecido. A cepa de camundongo não precisa compreender uma sequência ectópica de ADAM6, e em várias modalidades a cepa de camundongo é homozigota ou heterozigota para uma inativação (por exemplo, uma inativação funcional) de ADAM6.

[000414] A cepa de camundongo compreende uma modificação de um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina que resulta em uma redução ou perda da fertilidade em um camundongo macho. Em uma modalidade, a modificação compreende uma eliminação de uma região regulatória e/ou um região de codificação de um gene ADAM6. Em uma modalidade específica, a modificação compreende uma modificação de um gene ADAM6 endógeno (região regulatória e/ou de codificação) que reduz ou elimina fertilidade de um camundongo macho que compreende a modificação; em uma modalidade específica, a modificação reduz ou elimina fertilidade de um camundongo macho que é homozigoto para a modificação.

[000415] Em uma modalidade, a cepa de camundongo é homozigota ou heterozigota para uma inativação (por exemplo, uma inativação funcional) ou uma eliminação de um gene ADAM6.

[000416] Em uma modalidade, a cepa de camundongo é mantida isolando de um camundongo que é homozigoto ou heterozigoto para a modificação uma célula, e empregando a célula doadora no embrião hospedeiro, e gestando o embrião hospedeiro e célula doadora em uma mãe substituta, e obtendo da mãe substituta uma progênie que compreende a modificação genética. Em uma modalidade, a célula doadora é uma célula ES. Em uma modalidade, a célula doadora é uma célula pluripotente, por exemplo, uma célula pluripotente induzida.

[000417] Em uma modalidade, a cepa de camundongo é mantida isolando de um camundongo que é homozigoto ou heterozigoto para a modificação uma sequência de ácido nucleico compreendendo a modificação, e introduzindo a sequência de ácido nucleico em um hospedeiro núcleo, e gestando uma célula compreendendo a sequência de ácido nucleico e o hospedeiro núcleo em um animal adequado. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é introduzida em um embrião oócito do hospedeiro.

[000418] Em uma modalidade, a cepa de camundongo é mantida isolando de um camundongo que é homozigoto ou heterozigoto para a modificação um núcleo, e introduzindo o núcleo em uma célula hospedeira, e gestando o núcleo e célula hospedeira em um animal adequado para obter uma progênie que é homozigota ou heterozigota para a modificação.

[000419] Em uma modalidade, a cepa de camundongo é mantida empregando fertilização in vitro (IVF) de um camundongo fêmea (tipo selvagem, homozigoto para a modificação, ou heterozigoto para a modificação) empregar um esperma de um camundongo macho compreendendo a modificação genética. Em uma modalidade, o camundongo macho é heterozigoto para a modificação genética. Em uma modalidade, o camundongo macho é homozigoto para a modificação genética.

[000420] Em uma modalidade, a cepa de camundongo é mantida procriando um camundongo macho que é heterozigoto para a modificação genética com um camundongo fêmea para obter progênie que compreende a modificação genética, identificando uma progênie macho e fêmea compreendendo a modificação genética, e empregando um macho que é heterozigoto para a modificação genética em uma procriação com uma fêmea que é tipo selvagem, homozigoto, ou heterozigoto para a modificação genética para obter progênie compreendendo a modificação genética. Em uma modalidade, a etapa de procriar um macho heterozigoto para a modificação genética com uma fêmea tipo selvagem, uma fêmea heterozigota para a modificação genética, ou uma fêmea homozigota para a modificação genética é repetida de maneira a manter a modificação genética na cepa de camundongo.

[000421] Em um aspecto, é fornecido um método para manter uma cepa de camundongo que compreende uma substituição de um locus endógeno de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina com uma ou mais sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de humano, compreendendo cruzar a cepa de camundongo de maneira a gerar camundongos machos heterozigotos, em que os camundongos machos heterozigotos são cruzados para manter a modificação genética no cepa. Em uma modalidade específica, a cepa não é mantida por nenhum cruzamento de um macho homozigoto com uma fêmea tipo selvagem, ou um homozigoto ou heterozigoto fêmea para a modificação genética.

[000422] A proteína ADAM6 é um elemento da família ADAM de proteínas, onde ADAM é um acrônimo para uma Disintegrina E Metaloprotease. A família ADAM de proteínas é grande e diversa, com diversas funções, incluindo a adesão de célula. Alguns elementos da família ADAM são implicados na espermatogênese e fertilização. Por exemplo, ADAM2 codifica uma subunidade da proteína fertilina, que está implicada nas interações espermatozoide-óvulo. ADAM3, ou ciritestina, e parece necessária para a ligação de espermatozoide na zona pelúcida. A ausência tanto de ADAM2 quanto de ADAM3 resulta em infertilidade. Postula-se que ADAM2, ADAM3, e ADAM6 formam um complexo na superfície de células de espermatozoide de camundongo.

[000423] O gene de ADAM6 de humano, em geral encontrado entre segmentos de gene VH de humano VH1-2 e VH6-1, parece ser um pseudogene (FIG. 12). Em camundongos, existem dois genes de ADAM6, ADAM6a e ADAM6b, que são encontrados em uma região intergênica entre os segmentos de gene VH e DH de camundongo, e no camundongo os genes ADAM6a e ADAM6b são orientados ao contrário da orientação transcricional, da mesma maneira que os segmentos de gene de imunoglobulina ao redor (FIG. 12). Em camundongos, um lucos funcional de ADAM6 é aparentemente exigido para a fertilização normal. Um locus ou sequência de ADAM6 funcional, então, se refere a um locus ou sequência de ADAM6 que pode complementar, ou recuperar, a fertilização acentuadamente reduzida que é exibida em camundongos machos com locis endógenos sem sentido ou não funcionais de ADAM6.

[000424] A posição da sequência intergênica em camundongos que codificam ADAM6a e ADAM6b torna a sequência intergênica suscetível à modificação modificando uma cadeia pesada endógena. Quando segmentos de gene VH são deletados ou substituídos, ou quando segmentos de gene DH são deletados ou substituídos, há uma lata probabilidade de um camundongo apresentar um déficit severo na fertilidade. De maneira a compensar o déficit, o camundongo é modificado para incluir uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína que complementará a perda da atividade de ADAM6 em virtude de uma modificação do locus endógeno de ADAM6. Em várias modalidades, a sequência de nucleotídeo de complementação é uma que codifica um ADAM6a de camundongo, um ADAM6b de camundongo, ou um fragmento homólogo ou ortólogo ou funcional deste que resgata o déficit de fertilidade. Alternativamente, métodos adequados para conservar o locus endógeno de ADAM6 podem ser empregados, tornando ao mesmo tempo as sequências de cadeia pesada endógenas de imunoglobulina que flanqueiam o locus ADAM6 de camundongo incapaz de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada funcional endógena. Métodos alternativos exemplares incluem manipulação de porções de cromossomo de camundongos maiores que na posição do loci endógeno de regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de uma maneira tal que eles sejam incapazes de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada funcional que é operacionalmente ligada a um gene constante endógeno de cadeia pesada. Em várias modalidades, os métodos incluem inversões e/ou translocações de fragmentos cromossômicos de camundongo contendo segmentos de gene endógenos de cadeia pesada de imunoglobulina.

[000425] A sequência de nucleotídeo que resgata a fertilidade pode ser colocada em qualquer posição adequada. Ela pode ser colocada em uma região intergênica, ou em qualquer posição adequada no genoma (isto é, ectopicamente). Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo pode ser introduzida em um transgene que aleatoriamente integra no genoma do camundongo. Em uma modalidade, a sequência pode ser mantida episomalmente, isto é, em um ácido nucleico separado em vez de em um cromossomo de camundongo. Posições adequadas incluem posições que são transcricionalmente permissivos ou ativos, por exemplo, um locus ROSA26 (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), um locus BT-5 (Michael et al., 1999, Mech. Dev. 85:35-47), ou um locus Oct4 (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). Sequência de nucleotídeos que alvejam loci transcricionalmente ativos são descritos, por exemplo, em US 7.473.557, aqui incorporado pela referência.

[000426] Alternativamente, a sequência de nucleotídeo que resgata fertilidade pode ser acoplada com um promotor indutível de maneira a facilitar a expressão ideal nas células e/ou tecidos apropriados, por exemplo, tecidos reprodutivos. Promotores indutíveis exemplares incluem promotores ativados por meios físicos (por exemplo, promotor de choque térmico) e/ou químicos (por exemplo, IPTG ou Tetraciclina).

[000427] Adicionalmente, expressão da sequência de nucleotídeo pode ser ligada a outros genes de maneira a alcançar expressão nos estágios específico de desenvolvimento ou em tecidos específicos. Tal expressão pode ser alcançada colocando a sequência de nucleotídeo em ligação operável com o promotor de um gene expresso em um estágio específico de desenvolvimento. Por exemplo, sequências de imunoglobulina de uma espécie modificada por engenharia no genoma de uma espécie hospedeira são colocadas operacionalmente ligadas a uma sequência promotora de um gene CD19 (uma gene específico de célula B) da espécie hospedeira. Expressão de célula B específica em estágios de desenvolvimento precisos quando imunoglobulinas são expressas é alcançada.

[000428] Ainda um outro método para alcançar expressão robusta de uma sequência de nucleotídeo inserida é empregar um promotor constitutivo. Promotores constitutivos exemplares incluem SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK e CAGG. De uma maneira similar, a sequência de nucleotídeo desejada é colocada em ligação operável com um promotor constitutivo selecionado, que fornece alto nível de expressão da proteína(s) codificada pela sequência de nucleotídeo.

[000429] O termo “ectópico” deve incluir um deslocamento, ou uma colocação em uma posição que não é normalmente encontrada na natureza (por exemplo, colocação de uma sequência de ácido nucleico em uma posição que não está na mesma posição que a sequência de ácido nucleico é encontrada em um camundongo tipo selvagem). O termo em várias modalidades é usado no sentido de seu objetivo estar fora de sua posição normal, ou apropriada. Por exemplo, a frase “uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica ...” refere-se a uma sequência de nucleotídeo que aparece em uma posição na qual ela não é normalmente encontrada no camundongo. Por exemplo, no caso de uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo (ou um ortólogo ou homólogo ou fragmento deste que fornece o mesmo benefício da fertilidade ou benefício similar em camundongos machos), a sequência pode ser colocada em uma posição diferente no genoma do camundongo da que é normalmente encontrada em um camundongo tipo selvagem. Em tais casos, junções de sequência inéditas de sequência de camundongo serão criadas colocando a sequência em uma posição diferente no genoma do camundongo que em um camundongo tipo selvagem. Um camundongo ADAM6 homólogo ou ortólogo de funcional é uma sequência que confere um resgate da perda da fertilidade (por exemplo, perda da capacidade de um camundongo macho gerar descendente por cruzamento) que é observado em um camundongo ADAM6-/-. Homólogos ou ortólogos funcionais incluem proteínas que têm pelo menos cerca de 89 % de identidade ou mais, por exemplo, até 99 % de identidade, à sequência de aminoácido de ADAM6a e/ou à sequência de aminoácido de ADAM6b, e que pode complementar, ou recuperar a capacidade de acasalar com sucesso, de um camundongo que tem um genótipo que inclui uma eliminação ou inativação de ADAM6a e/ou ADAM6b.

[000430] A posição ectópica pode ser em qualquer lugar (por exemplo, como com inserção aleatória de um transgene contendo uma sequência ADAM6 de camundongo), ou pode ser, por exemplo, em uma posição que aproxima (mas não é precisamente a mesma) seu local em um camundongo tipo selvagem (por exemplo, em um locus modificado de imunoglobulina endógena, mas tanto a montante ou a jusante de sua posição natural, por exemplo, em um locus modificado de imunoglobulina mas entre diferentes segmentos de gene, ou em uma posição diferente em uma sequência intergênica V-D de camundongo). Um exemplo de uma colocação ectópica é a manutenção da posição normalmente encontrada em camundongos tipo selvagem no locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina tornando ao mesmo tempo os segmentos de gene de cadeia pesada endógenos capazes de rearranjar para codificar uma cadeia pesada funcional contendo uma região constante endógena de cadeia pesada. Neste exemplo, isto pode ser realizado pela inversão do fragmento cromossômico contendo o loci endógenos variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina, por exemplo usando sítios de recombinação modificados por engenharia específicos para sítio colocados nas posições que flanqueiam o locus de região variável. Assim, mediante recombinação os loci da região variável de cadeia pesada endógeno são colocados em uma distância muito grande dos genes endógenos da região constante de cadeia pesada por meio disso evitando que o rearranjo codifique uma cadeia pesada funcional contendo uma região constante endógena de cadeia pesada. Outros métodos exemplares para alcançar silenciamento funcional do locus de gene variável endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina bora mantenham um locus ADAM6 funcional serão evidentes aos versados na tecnologia mediante leitura desta descrição e/ou em combinação com métodos conhecidos na tecnologia. Com uma colocação como esta do locus endógeno de cadeia pesada, os genes ADAM6 endógenos são mantidos e o locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina é funcionalmente silenciado.

[000431] Um outro exemplo de uma substituição ectópica é a substituição em um locus humanizado de cadeia pesada de imunoglobulina. Por exemplo, um camundongo que compreende uma substituição de um ou mais segmentos de gene VH endógenos por segmentos de gene VH de humano, em que a substituição remove uma sequência endógena de ADAM6, pode ser geneticamente modificado para apresentar uma sequência de ADAM6 de camundongo localizada na sequência que contém os segmentos de gene VH de humano. A modificação resultante pode gerar uma sequência (ectópico) ADAM6 de camundongo em uma sequência de gene humana, e a colocação (ectópica) da sequência ADAM6 de camundongo na sequência de gene humana pode aproximar a posição do pseudogene ADAM6 humano (isto é, entre dois segmentos V) ou pode aproximar a posição da sequência ADAM6 de camundongo (isto é, na região intergênica V-D). As junções de sequência resultantes criadas pela união de uma sequência ADAM6 (ectópica) de camundongo em uma sequência de gene humana ou adjacente a ela (por exemplo, uma sequência de gene de cadeia leve de imunoglobulina) na linhagem germinativa do camundongo pode ser inédita comparado com a mesma posição ou posição similar no genoma de um camundongo tipo selvagem.

[000432] Em várias modalidades, são fornecidos animais não humanos que não têm um ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste, em que a falta torna o animal não humano não fértil, ou substancialmente reduz a fertilidade do animal não humano. Em várias modalidades, a falta de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste é em virtude de uma modificação de um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina. Uma redução substancial na fertilidade é, por exemplo, uma redução na fertilidade (por exemplo, frequência de procriação, filhotes por ninhada, ninhadas por ano, etc.) de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou 95 % ou mais. Em várias modalidades, os animais não humanos são suplementados com um gene ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste que é funcional em um macho do animal não humano, em que o gene ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo suplementado, ou fragmento funcional deste resgata a redução na fertilidade como todo ou em parte substancial. Um resgate da fertilidade em parte substancial é, por exemplo, uma restauração da fertilidade de maneira tal que o animal não humano apresente uma fertilidade que é pelo menos 70 %, 80 %, ou 90 % ou mais comparado com um locus de modificação não modificado (isto é, um animal sem uma ao gene ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste) de cadeia pesada.

[000433] A sequência que confere mediante o animal geneticamente modificado (isto é, o animal que perde um ADAM6 funcional ou ortólogo ou homólogo deste, em virtude de, por exemplo, uma modificação de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina) é, em várias modalidades, selecionada de um gene ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste. Por exemplo, em um camundongo, a perda de função de ADAM6 é resgatada adicionando, em uma modalidade, um gene ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade, a perda de função de ADAM6 no camundongo é resgatada adicionando um ortólogo ou homólogo de uma espécie intimamente relacionada com relação ao camundongo, por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo de uma diferente cepa ou espécie, um rato de qualquer espécie, um roedor; em que a adição do ortólogo ou homólogo ao camundongo resgata a perda de fertilidade em virtude de perda de função de ADAM6 ou perda de um gene ADAM6. Ortólogos e homólogos de outras espécie, em várias modalidades, são selecionados de uma espécie filogeneticamente relacionada e, em várias modalidades, apresentam uma identidade de porcentagem com o endógeno ADAM6 (ou ortólogo) que é cerca de 80 % ou mais, 85 % ou mais, 90 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, ou 97 % ou mais; e que resgata perda de fertilidade do ortólogo relacionado ao ADAM6 ou (em um não camundongo) relacionado ao ADAM6. Por exemplo, em um rato macho geneticamente modificado que perde função de ADAM6 (por exemplo, um rato com uma região variável endógena de cadeia pesada de imunoglobulina substituída por uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano, ou uma região de inativação de cadeia pesada de imunoglobulina no rato), perda de fertilidade no rato é resgatada pela adição de um rato ADAM6 ou, em algumas modalidades, um ortólogo de um rato ADAM6 (por exemplo, um ADAM6 ortólogo de uma outra cepa ou espécie de rato ou, em uma modalidade, de um camundongo).

[000434] Assim, em várias modalidades, animais geneticamente modificados que não apresentam fertilidade ou uma redução na fertilidade devido a modificação de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ADAM6 (ou ortólogo ou homólogo deste) ou uma região regulatória operacionalmente ligada com a sequência de ácido nucleico, compreendem uma sequência de ácido nucleico que complementa, ou restores, a perda da fertilidade onde a sequência de ácido nucleico que complementa ou restaura a perda da fertilidade é de uma diferente cepa da mesma espécie ou de uma espécie filogeneticamente relacionada. Em várias modalidades, a sequência de complementação de ácido nucleico é um ortólogo ou homólogo d eADAM6 ou fragmento funcional deste. Em várias modalidades, o ADAM6 ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste de complementação é de um animal não humano que é intimamente relacionado ao animal geneticamente modificado com o defeito de fertilidade. Por exemplo, onde o animal geneticamente modificado é um camundongo de uma cepa particular, um ADAM6 ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste pode ser obtido de um camundongo de uma outra cepa, ou um camundongo de uma espécie relacionada. Em uma modalidade, onde o animal geneticamente modificado compreendendo o defeito de fertilidade é da ordem Rodentia, o ADAM6 ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste é de um outro animal da ordem Rodentia. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado compreendendo o defeito de fertilidade é de uma subordem Myomoropha (por exemplo, jerboas, camundongos saltadores, hamsters tipo camundongo, hamsters, ratos New World e camundongos, voles, camundongos e ratos verdadeiros, gerbilas, camundongos giratórios, ratos coroados, camundongos escaladores, camundongos de rocha, ratos de cauda branca, ratos e camundongos malagasy, dormice espinhoso, ratos, ratos bambú, zokors), e o ADAM6 ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste é selecionado de um animal da ordem Rodentia, ou da subordem Myomorpha.

[000435] Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é da superfamília Dipodoidea, e o ADAM6 ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste é da superfamília Muroidea. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é da superfamília Muroidea, e o ADAM6 ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste é da superfamília Dipodoidea.

[000436] Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é um roedor. Em uma modalidade, o roedor é selecionado de o superfamília Muroidea, e o ADAM6 ortólogo ou homólogo é de uma espécie diferente na superfamília Muroidea. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é de uma família selecionada de Calomyscidae (por exemplo, hamsters tipo camundongo), Cricetidae (por exemplo, hamster, ratos New World e camundongos, voles), Muridae (camundongos e ratos verdadeiros, gerbils, camundongos giratórios, ratos de coroa), Nesomyidae (camundongos escaladores, camundongos de rocha, ratos com cauda, ratos e camundongos Malagasy), Platacanthomyidae (por exemplo, dormice giratória), e Spalacidae (por exemplo, rates mole, ratos bambús, e zokors); e o ADAM6 ortólogo ou homólogo é selecionado de uma espécie diferente da mesma família. Em uma modalidade específica, o roedor geneticamente modificado é selecionado de um camundongo ou rato verdadeiro (família Muridae), e o ADAM6 ortólogo ou homólogo é de uma espécie selecionado de um gerbil, camundongo giratório, ou rato de coroa. Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado é de um membro da família Muridae, e o ADAM6 ortólogo ou homólogo é de uma espécie diferente do família Muridae. Em uma modalidade específica, o roedor geneticamente modificado é um camundongo da família Muridae, e o ADAM6 ortólogo ou homólogo é de um rato, gerbil, camundongo giratório, ou rato de coroa da família Muridae.

[000437] Em várias modalidades, um ou mais roedores ADAM6 ortólogos ou homólogos ou fragmentos funcionais destes de um roedor em um família restores fertilidade a um roedor geneticamente modificado da mesma família que perde um ADAM6 ortólogo ou homólogo (por exemplo, Cricetidae (por exemplo, hamsters, ratos e camundongos New World, voles); Muridae (por exemplo, camundongos e ratos verdadeiros, gerbils, camundongo giratórios, rato de coroas)).

[000438] Em várias modalidades, ADAM6 ortólogos, homólogos, e fragmentos deste são estimados para funcionalidade verificando se o ortólogo, homólogo, ou fragmento restaura a fertilidade a um animal não humano macho geneticamente modificado que perde atividade de ADAM6 (por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo ou rato, que compreende uma inativação de ADAM6 ou seu ortólogo). Em várias modalidades, funcionalidade é definida como a capacidade de um esperma de um animal geneticamente modificado que não tem um ADAM6 endógeno ou ortólogo ou homólogo deste para migrar para um oviduto e fertilizar um óvulo da mesma espécie do animal geneticamente modificado.

[000439] Em vários aspectos, camundongos que compreendem deleções ou substituições do locus endógeno da região variável de cadeia pesada ou porções deste podem ser preparados que contêm uma sequência ectópica de nucleotídeo que codifica uma proteína de conferência similar aos benefícios da fertilidade ao ADAM6 de camundongo (por exemplo, um ortólogo ou um homólogo ou um fragmento deste que é funcional em um camundongo macho). A sequência ectópica de nucleotídeo pode incluir uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína que é um homólogo ou ortólogo de ADAM6 (ou fragmento deste) de uma cepa diferente de camundongo ou de uma espécie diferente, por exemplo, uma espécie diferente de roedor, e que confere um benefício na fertilidade, por exemplo, maior número de ninhadas durante um período de tempo especificado, e/ou maior número de filhotes por ninhada, e/ou a capacidade de uma célula de esperma de um camundongo macho de atravessar por meio de um oviduto de camundongo para fertilizar o óvulo de um camundongo.

[000440] Em uma modalidade, o ADAM6 é um homólogo ou ortólogo que é pelo menos 89 % a 99 % idêntico a uma proteína ADAM6 de camundongo (por exemplo, pelo menos 89 % a 99 % idêntico a ADAM6a de camundongo ou ADAM6b de camundongo). Em uma modalidade, a sequência ectópica de nucleotídeo codifica uma ou mais proteínas independentemente selecionadas de uma proteína pelo menos 89 % idêntico a ADAM6a de camundongo, uma proteína pelo menos 89 % idêntico a ADAM6b de camundongo, e uma combinação destes. Em uma modalidade, o homólogo ou ortólogo é uma proteína de rato, hamster, camundongo, ou porquinho da Índia que é modificada para ser cerca de 89 % ou mais idêntica a ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b de camundongo. Em uma modalidade, o homólogo ou ortólogo é pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico a um ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b de camundongo.

[000441] Em um aspecto, animais não humanos são fornecidos, em que os animais não humanos compreendem (a) uma inserção de um ou mais segmentos de gene VX e JX de humano a montante de uma região constante de cadeia leve de imunoglobulina não humana, (b) uma inserção de um ou mais humano segmentos de gene VH, um ou mais DH e um ou mais JH de humano a montante de uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana, e (c) uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 ou um fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade, as regiões constantes de cadeia pesada e/ou cadeia não humana são regiões constantes de roedor (por exemplo, selecionado de regiões constantes de camundongo, rato ou hamster). Em uma modalidade, a região constante de cadeia leve de não humano é uma região constante de roedor. Em uma modalidade específica, a região constante de cadeia leve é uma região CK de camundongo ou CK de rato. Em uma modalidade específica, a região constante de cadeia leve é uma região de CX de camundongo ou Ck de rato Os animais não humanos adequados incluem roedores, por exemplo, camundongos, ratos e hamsters. Em uma modalidade, o roedor é um camundongo ou um rato.

[000442] Em uma modalidade, o animal não humano compreende pelo menos 12 a pelo menos 40 segmentos de gene VX de humano e pelo menos um segmento de gene JX de humano. Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende 12 segmentos de gene VX de humano e pelo menos um segmento de gene JX de humano. Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende 28 segmentos de gene VX de humano e pelo menos um segmento de gene JX de humano. Em uma modalidade, o animal não humano compreende 40 segmentos de gene VX de humano e pelo menos um segmento de gene JX de humano. Em várias modalidades, o pelo menos one segmento de gene JX de humano é selecionado de JX1, JX2, JX3 e JX7. Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende pelo menos quatro segmentos de gene JX de humano. Em uma modalidade, o pelo menos quatro segmentos de gene JX de humano compreendem pelo menos JX1, JX2, JX3 e JX7.

[000443] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional deste é ectópica no animal não humano. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional deste (que é funcional no animal não humano) está presente no mesmo local comparado a um locus ADAM6 não humano tipo selvagem. Em uma modalidade, o animal não humano é um camundongo e a sequência de nucleotídeo codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional deste e está presente em um local ectópico no genoma do animal não humano. Em uma modalidade o animal não humano é um camundongo e a sequência de nucleotídeo codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional deste e está presente em segmentos de gene de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene de imunoglobulina são segmentos de gene de cadeia pesada. Em uma modalidade, os segmentos de gene de cadeia pesada são humanos. Em uma modalidade, os segmentos de gene de cadeia pesada são segmentos de gene endógenos de cadeia pesada do animal não humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma sequência ectópica contígua compreendendo um ou mais segmentos de gene endógenos não rearranjados de cadeia pesada, e a sequência de ADAM6 está na sequência ectópica contígua.

[000444] Em uma modalidade, o animal não humano perde um segmento de gene endógena VL e/ou um JL de imunoglobulina em um locus endógeno de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, o animal não humano compreende segmentos de gene VL e/ou JL endógenos de imunoglobulina que são incapazes de rearranjar para formar um domínio VL de imunoglobulina no animal não humano. Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos de genes VK e JK endógenos de imunoglobulina são substituídos por um ou mais segmentos de gene VX e JX. Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos de gene endógenos de imunoglobulina VX e JX são substituídos por um ou mais segmentos de gene VX e JX de humano. Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VL e JL endógenos de imunoglobulina são intactos no animal não humano, e o animal não humano compreende um ou mais segmentos de gene VX de humano e um ou mais segmentos de gene JX de humano inserido entre os segmentos de gene VL e/ou JL endógenos de imunoglobulina e uma região constante endógena de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene VL e JL intactos endógenos de imunoglobulina se tornam incapazes de rearranjar para formar um domínio VL de um anticorpo no animal não humano. Em várias modalidades, o locus endógeno de cadeia leve de imunoglobulina do animal não humano é um locus k de cadeia leve de imunoglobulina. Em várias modalidades, o locus endógeno de cadeia leve de imunoglobulina do animal não humano é um locus X de cadeia leve de imunoglobulina. Em várias modalidades, os segmentos de gene VL e JL endógenos de imunoglobulina são segmentos de gene Vk e Jk. Em várias modalidades, os segmentos de gene VL e JL endógenos de imunoglobulina são segmentos de gene VX e JX.

[000445] Em uma modalidade, o animal não humano compreende adicionalmente uma região intergênica VK-JK de humano from um locus K de cadeia leve de humano, em que o região intergênica VK-JK de humano é contígua com o um ou mais humano segmentos de gene VX e JX. Em uma modalidade específica, o região intergênica Vk-Jk de humano é placed entre um humano VX segmento de gene e um segmento de gene JX de humano.

[000446] Em um aspecto, células e/ou tecidos derivados de animais não humanos, da maneira aqui descrita, são fornecidos, em que as células e/ou tecidos compreendem (a) uma inserção de um ou mais Segmentos de gene Vk e Jk de humanos a montante de uma região constante de cadeia leve de imunoglobulina de não humano, (b) uma inserção de um ou mais segmentos de gene VH, um ou mais DH e um ou JH de humano a montante de uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana, e (c) uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 ou um fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade, as regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve não humanas são regiões constantes de camundongo. Em uma modalidade, as regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve não humanas são regiões constantes de rato. Em uma modalidade, as regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve não humanas são regiões constantes de hamster.

[000447] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional deste é ectópico na célula e/ou tecido. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional deste está presente no mesmo local comparado a um locus ADAM6 não humano tipo selvagem. Em uma modalidade a célula não humana e/ou tecido é derivada de um camundongo e a sequência de nucleotídeo codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional deste e está presente em um local ectópico. Em uma modalidade, a célula não humana e/ou tecido é derivado de um camundongo e a sequência de nucleotídeo codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional deste e está presente em segmentos de gene de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene de imunoglobulina são segmentos de gene de cadeia pesada. Em uma modalidade, uma sequência contígua de segmentos de gene endógenos de cadeia pesada são colocados ectopicamente no animal não humano, em que a sequência contígua de segmentos de gene endógenos de cadeia pesada ectopicamente colocados compreende um gene ADAM6 que é funcional no camundongo (por exemplo, em um camundongo macho).

[000448] Em um aspecto, é fornecido uso de um animal não humano, da maneira aqui descrita, para produzir uma proteína de ligação de antígeno, em que o animal não humano expressa (a) um anticorpo que compreende (i) uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende um domínio VX de humano e uma região constante de cadeia leve não humana e (ii) uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende um humano domínio VH e uma região constante não humana; e (b) uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, o antígeno proteína de ligação é humano. Em uma modalidade, o animal não humano é um roedor e as regiões constantes não humanas são regiões constantes de roedor. Em uma modalidade específica, o roedor é um camundongo.

[000449] Em um aspecto, uma célula não humana ou tecido derivado de um animal não humano, da maneira aqui descrita, é fornecida. Em uma modalidade, a célula não humana ou tecido compreende um ou mais segmentos de gene VX, e pelo menos um segmentos de gene JX de imunoglobulina de humano, contíguos com um gene de região constante de cadeia leve de imunoglobulina não humano e um ou mais segmentos de gene VH de humano, um ou mais DH de humano e um ou mais JH de humano contíguos com um gene de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana, em que a célula ou tecido expressa uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade, o gene de região constante de cadeia leve não humano é um CK de camundongo ou Ck de camundongo.

[000450] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 ou fragmento funcional deste é ectópica. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 ou fragmento funcional deste está localizada em uma posição que é a mesma que uma célula não humana tipo selvagem. Em várias modalidades, a célula não humana é uma célula B de camundongo. Em várias modalidades, a célula não humana é uma célula tronco embriônica.

[000451] Em uma modalidade, o tecido é derivado de baço, medula óssea ou linfonodo do animal não humano.

[000452] Em um aspecto, uso de uma célula ou tecido derivado de um animal não humano, da maneira aqui descrita, para produzir um hibridoma ou quadroma é fornecido.

[000453] Em um aspecto, uma célula não humana compreendendo um genoma modificado, da maneira aqui descrita, é fornecido, em que a célula não humana é um oócito, um embrião hospedeiro, ou uma fusão de uma célula de um animal não humano, da maneira aqui descrita, e uma célula de um animal não humano diferente.

[000454] Em um aspecto, use de uma célula ou tecido derivado de um animal não humano da maneira aqui descrita para produzir um anticorpo completamente humano é fornecido. Em uma modalidade, o anticorpo completamente humano compreende um humano domínio VH e um domínio Vk de humano isolado de um animal não humano da maneira aqui descrita.

[000455] Em um aspecto, um método para produzir um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse é fornecido, em que o método compreende (a) expor um animal não humano da maneira aqui descrita a um antígeno de interesse, (b) isolar um ou mais linfócitos B do animal não humano, em que o um ou mais linfócitos B expressam um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, e (c) identificar uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina do anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, em que a cadeia leve de imunoglobulina compreende um domínio VX de humano e um domínio de cadeia leve constante não humano, e (d) empregar a sequência de ácido nucleico de (c) com uma ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina sequência de humano para produzir um anticorpo de humano que se liga ao antígeno de interesse.

[000456] Em uma modalidade, o domínio de cadeia leve constante não humano é um CK de camundongo. Em uma modalidade, o domínio constante decadeia leve não humano é um CX de camundongo. Em uma modalidade, o animal não humano é um camundongo.

[000457] Em um aspecto, um camundongo macho fértil compreendendo uma modificação em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina é fornecido, em que o camundongo macho fértil compreende uma sequência ectópica de ADAM6 que é funcional no camundongo macho. ADAM6 ectópico em camundongos com cadeia pesada humanizada

[000458] Desenvolvimento em genes que alvejam, por exemplo, o desenvolvimento de cromossomos artificiais bacterianos (BACs), agora capazes da recombinação de fragmentos genômicos relativamente grandes. BAC de engenharia genética permitiram a capacidade de produzir grandes deleções e grandes inserções, em células ES de camundongo.

[000459] Camundongos que fazem anticorpos de humano (isto é, regiões variáveis de humano) são disponíveis atualmente. Embora eles representem um avanço importante no desenvolvimento de terapêutica de anticorpos humanos, estes camundongos apresentam inúmeras anormalidades significativas que limitam sua utilidade. Por exemplo, eles apresentam desenvolvimento comprometido de célula B. O desenvolvimento comprometido pode ser em virtude de uma variedade de diferenças entre os camundongos transgênicos e camundongos tipo selvagem.

[000460] Anticorpos de humano não devem idealmente interagir com receptores pré-célula B ou célula B de camundongo na superfície de células de camundongo que sinalizam para maturação, proliferação, ou sobrevivência durante a seleção clonal. Anticorpos completos de humano não devem idealmente interagir com um sistema de receptor Fc de camundongo; receptores Fc que expressam camundongo que não apresentam uma correspondência um-para-um com receptores Fc humanos. Finalmente, vários camundongos que fazem anticorpos completos de humano não incluem todas as sequências de camundongo genuínas, por exemplo, elementos melhoradores a jusante e outros elementos de controle de locus, que pode ser requerido para desenvolvimento de célula B tipo selvagem.

[000461] Camundongos que fazem anticorpos completos de humano no geral compreendem loci endógenos de imunoglobulina que são deficiente de alguma maneira, e transgenes humanos que compreendem segmentos de gene variável e constante de imunoglobulina são introduzidos em um local aleatório no genoma do camundongo. Desde que o locus endógeno seja suficientemente deficiente de maneira a não rearranjar segmentos de gene para formar um gene de imunoglobulina funcional, o objetivo de prepara anticorpos completos de humano em um camundongo como este pode ser alcançado-embora com desenvolvimento e célula B comprometido.

[000462] Embora forçado a produzir anticorpos completos de locus transgene humano, a geração de anticorpos de humano em um camundongo é aparentemente um processo desfavorável. Em alguns camundongos, o processo é tão desfavorável que resulta na formação de cadeias pesadas variável/ constante quimérica humana de camundongo (mas não cadeias leves) até o mecanismo de trans-troca. Por este mecanismos, transcrições que codificam anticorpos completos de humano se submetem a troca de isotipo em trans do isotipo humano para um isotipo de camundongo. O processo é em trans, em decorrência de o transgene completamente humano estar localizado longe do locus endógeno que retém uma cópia não danificada de um gene de região constante de cadeia pesada de camundongo. Embora em tais camundongos a trans-troca seja prontamente evidente, o fenômeno ainda é insuficiente para resgatar desenvolvimento de célula B, que permanece muito piorado. Em qualquer evento, anticorpos trans-trocados feitos em tais camundongos mantêm cadeia leves completamente humanas, uma vez que o fenômeno de trans-troca aparentemente não ocorre com relação às cadeia leves; trans-troca resumidamente diz respeito a sequências de troca em loci endógenos usados (embora diferentemente) em troca de isotipo normal em cis. Assim, mesmo quando camundongos modificados por engenharia para produzir anticorpos completos de humano selecionam um mecanismo de trans-troca para produzir anticorpos com regiões constantes de camundongo, a estratégia ainda é insuficiente para resgatar desenvolvimento de célula B normal.

[000463] Uma preocupação principal no preparo de terapêuticas humanas a base de anticorpo é preparar uma diversidade suficientemente grande de sequências da região variável de imunoglobulina humana para identificar domínios variáveis úteis que especificamente reconhecem epítopos particulares e os ligam com uma afinidade desejável, normalmente-mas nem sempre-com alta afinidade. Antes do desenvolvimento de camundongos VELOCIMMUNE® (aqui descrito), não havia nenhuma indicação de que camundongos que expressam regiões variáveis de humano com regiões constantes de camundongo podem apresentar alguma diferença significativa de camundongos que fazem anticorpos de humano de um transgene. Esta suposição, entretanto, foi incorreta.

[000464] Camundongos VELOCIMMUNE®, que contêm uma substituição precisa de regiões variáveis de imunoglobulina de camundongo com regiões variáveis de imunoglobulina de humano nos loci endógenos, apresentam uma similaridade surpreendente e acentuada aos camundongos tipo selvagem com relação ao desenvolvimento de célula B. Em um desenvolvimento surpreendente e chocante, camundongos VELOCIMMUNE® apresentaram uma resposta a imunização essencialmente normal, tipo selvagem que diferiu apenas em uma relação significativa dos camundongos tipo selvagem-as regiões variáveis geradas na resposta a imunização são completamente humanos.

[000465] Camundongos VELOCIMMUNE® contêm uma substituição precisa, em grande escala de regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de linhagem germinativa de camundongo (IgH) e cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, cadeia leve K, IgK) com correspondentes regiões variáveis de imunoglobulina de humano, nos loci endógenos. No total, cerca de seis megabases de loci de camundongos são substituídos por cerca de 1,5 megabases de sequência genômica de humano. Esta substituição precisa resulta em um camundongo com loci híbridos de imunoglobulina que fazem cadeias pesada e leve que têm regiões variáveis de humano e uma região constante de camundongo. A substituição precisa de VH-DH-JH de camundongo e segmentos Vk- Jk deixou ladeando sequências de camundongo intactas e funcionais nos loci híbridos de imunoglobulina. O sistema imune humoral do camundongo funciona como o de um camundongo tipo selvagem. Desenvolvimento de célula B é não impedida com relação a qualquer significância e uma rica diversidade de regiões variáveis de humano é gerada no camundongo mediante desafio do antígeno.

[000466] Camundongos VELOCIMMUNE® são possíveis em decorrência de segmentos de gene de imunoglobulina para cadeias k pesada e leve rearranjassem similarmente em humanos e camundongos, o que não é o mesmo que dizer que seus loci são os mesmos ou quase isso-claramente eles não são. Entretanto, os loci são similares o suficiente que humanização do locus do gene de cadeia pesada variável pode ser realizada substituindo cerca de três milhões de pares de base da sequência contígua de camundongo que contém todos os segmentos de gene VH, DH, e JH com cerca de um milhão de sequência genômica de bases de contíguas de humano que cobrem basicamente a sequência equivalente de um locus de imunoglobulina de humano.

[000467] Em algumas modalidades, substituição adicional de certas sequências de região constante do gene de camundongo por sequência de gene de humano (por exemplo, substituição de sequência CH1 de camundongo por sequência CH1 de humano, e substituição de sequência CL de camundongo por sequência CL de humano) resulta em camundongos com loci híbridos de imunoglobulina que fazem anticorpos que têm regiões variáveis de humano e regiões parcialmente constantes de humano, adequadas para, por exemplo, fazer fragmentos de anticorpo completamente humanos, por exemplo, Fab completamente de humano. Camundongos com loci híbridos de imunoglobulina apresentam rearranjo normal de segmento de gene variável, hipermutação somática normal, e troca de classe normal. Estes camundongos apresentam um sistema imune humoral que não pode ser distinguido dos camundongos tipo selvagem, e apresentam populações de célula normal em todos os estágios de desenvolvimento de célula B e estruturas de órgão linfóide normais-mesmo onde os camundongos não têm um repertório completo de segmentos de gene de regiões variáveis de humano. A imunização destes camundongos resulta em respostas humorais robustas que apresentam uma ampla diversidade de uso do segmento de gene variável.

[000468] A substituição precisa de segmentos de gene de regiões variáveis da linhagem germinativa de camundongo permitem a produção de camundongos que têm loci parcialmente humanos de imunoglobulina. Em decorrência de o loci parcialmente humanos de imunoglobulina rearranjarem, hipermutarem, e trocarem de classe normalmente, os loci parcialmente humanos de imunoglobulina geram anticorpos em um camundongo que compreende regiões variáveis de humano. Sequência de nucleotídeos que codificam as regiões variáveis podem ser identificadas e clonadas, então fundidas (por exemplo, em um sistema in vitro) com quaisquer sequências de escolha, por exemplo, qualquer isotipo de imunoglobulina adequado para um uso particular, resultando em um anticorpo ou proteína de ligação de antígeno derivada completamente das sequências de humano.

[000469] A humanização em grande escala por métodos de recombinação foi usada para modificar célula do tronco embrionário (ES) de camundongos para substituir exatamente até três megabases dos locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongos, que incluiram essencialmente todos os segmentos de gene VH, DH e JH de camundongos por segmentos de gene equivalentes de humano com até uma sequência genômica de um megabase de humano contendo alguns ou essencialmente todos os segmentos de gene VH, DH, e JH. Até a metade de uma megabase do segmento de genoma de humano, compreendendo uma de duas repetições que codifcam essencialmente todos os segmentos de gene VK e JK de humano, foi usada para substituir um segmento de três megabases do locus K de cadeia leve de imunoglobulina de camundongos contendo essencialmente todos os segmentos de gene Vk e Jk de camundongo.

[000470] Camundongos com tais loci substituídos de imunoglobulina podem compreender uma interrupção ou eliminação do locus de ADAM6 endógeno funcional, que é em geral encontrado entre o segmento de gene VH 3’-mais e o segmento de gene DH 5’-mais no locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. A interrupção nesta região pode levar à redução ou eliminação de funcionalidade do locus de ADAM6 endógeno funcional. Se o repertório de segmentos de gene VH de cadeia pesada 3’-mais de humano for usado em uma substituição, uma região intergênica contendo um pseudogene que parece ser um pseudogene humano ADAM6 está presente entre estes segmentos de gene VH, isto é, entre VH1-2 e VH1-6 de humano. Entretanto, camundongos machos que compreendem esta sequência intergênica de humano exibem uma redução na fertilidade.

[000471] São descritos camundongos que compreendem os loci substituídos da maneira descrita anteriormente, e que também compreendem uma sequência ectópica de ácido nucleico que codifica um ADAM6 de camundongo, onde os camundongos exibem fertilidade essencialmente normal. Em uma modalidade, a sequência ectópica de ácido nucleico compreende um ADAM6a de camundongo e/ou uma sequência de ADAM6b de camundongo, ou funcional fragmentos deste, colocados entre um segmento de gene VH1-2 de humano e um segmento de gene VH6-1 de humano em um locus endógeno modificado de cadeia pesada. Em uma modalidade, a sequência ectópica de ácido nucleico é SEQ ID NO:3, colocada entre VH1-2 e VH1-6 de humano no locus endógeno modificado de cadeia pesada. A direção de transcrição dos genes de ADAM6 de SEQ ID NO:3 são opostas com relação à direção da transcrição dos segmentos de gene VH ao redor de humano. Embora os exemplos aqui mostrem recuperação de fertilidade colocando a sequência ectópica entre os segmentos de gene VH de humano indicados, os versados na técnica reconhecerão que esta substituição da sequência ectópica em qualquer locus transcricionalmente permissivo no genoma do camundongo (ou mesmmo extracromossalmente), será esperado como recuperação similar da fertilidade em um camundongo macho.

[000472] O fenômeno de complementação de um camundongo que perde um locus ADAM6 funcional com uma sequência ectópica que compreende um gene ADAM6 de camundongo ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste é um método geral que é aplicável para resgatar quaisquer camundongos com loci ADAM6 endógeno não funcional ou minimamente funcional. Assim, muitos camundongos que compreendem uma modificação do locus de cadeia pesada de imunoglobulina que rompe ADAM6 podem ser regatados com as composições e métodos do invenção. Desta maneira, a invenção compreende camundongos com uma ampla variedade de modificações de loci de cadeia pesada de imunoglobulina que comprometem a função endógena de ADAM6. Alguns exemplos (não limitantes) são fornecidos nesta descrição. Além dos camundongos VELOCIMMUNE® descritos, as composições e métodos relacionados ao ADAM6 podem ser usados em muitas aplicações, por exemplo, na modificação de um locus de cadeia pesada em uma ampla variedade de maneiras.

[000473] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma sequência ectópica de ADAM6 que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste), uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongos com um ou mais segmentos de gene VH de humano, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene DH e segmentos de gene JH de camundongos com segmentos de gene DH de humano e JH de humano; em que o camundongo perde uma região CH1 e/ou de dobradiça. Em uma modalidade, o camundongo produz uma única proteína de ligação de domínio variável que é um dímero de cadeias de imunoglobulina selecionado de: (a) VH de humano -CH1 de camundongo -CH2 de camundongo -CH3 de camundongo; (b) VH de humano -dobradiça de camundongo -CH2 de camundongo -CH3 de camundongo; e (c) VH de humano -CH2 de camundongo -CH3 de camundongo.

[000474] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeo que recupera fertilidade é colocada em uma sequência de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano (por exemplo, entre segmentos de gene VH1-2 e VH1-6 de humano) em um camundongo que apresenta uma substituição de um ou mais segmentos de gene variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongos (mVH’s, mDH’s, e/ou mJH’s) com um ou mais segmentos de gene variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de humano (hVH’s, hDH’s, e/ou hJH’s), e o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina K de cadeia leve variável de camundongo (mVK’s e/ou mJK’s) com um ou mais segmentos de gene de imunoglobulina k de cadeia leve variável de humano (hVk’s e/ou hJk’s). Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo é colocada entre um segmento de gene VH1-2 de humano e um segmento de gene VH1-6 de humano em um camundongo VELOCIMMUNE® (U.S. 6.596.541 e US 7.105.348, aqui incoporadas pela referência). Em uma modalidade, o camundongo VELOCIMMUNE® assim modificado compreende uma substituição por todos ou substancialmente todos humano segmentos de gene variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina (all hVH’s, hDH’s, e hJH’s), e todos ou substancialmente todos humano imunoglobulina k segmentos de gene de cadeia leve variáveis (hVk’s e hJk’s).

[000475] Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongos compreendem cerca de três megabases do locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongos. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo compreendem pelo menos 89 segmentos de gene VH, pelo menos 13 segmentos de gene DH, pelo menos quatro segmentos de gene JH ou uma combinação destes do locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongos. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de humano compreendem cerca de uma megabase de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de humano compreendem pelo menos 80 segmentos de gene VH, pelo menos 27 segmentos de gene DH, pelo menos seis segmentos de gene JH ou uma combinação deste de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de humano.

[000476] Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene k de imunoglobulina de cadeia leve variável de camundongo compreende cerca de três megabases do locus de imunoglobulina K de cadeia leve de camundongo. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene variáveis K de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo compreendem pelo menos 137 segmentos de gene Vk, pelo menos cinco segmentos de gene Jk ou uma combinação deste do locus de cadeia leve k de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene variáveis k de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreendem cerca de uma metade de megabase de um locus de cadeia leve k de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene variáveis k de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreendem a repetição proximal (com relação à região constante k de imunoglobulina) de um locus de cadeia leve k de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene variáveis k de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreendem pelo menos 40 segmentos de gene Vk, pelo menos cinco segmentos de gene Jk ou uma combinação deste de um locus de cadeia leve k de imunoglobulina de humano.

[000477] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo é colocada entre dois segmentos de gene de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade específica, os dois segmentos de gene de imunoglobulina de humano são segmentos de gene de cadeia pesada.

[000478] Em um aspecto, um locus funcional de ADAM6 de camundongo (ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste) está presente na metade dos segmentos de gene de camundongos que estão presentes no locus endógeno de região variável de cadeia pesada de camundongo, o dito locus incapaz de rearranjar para codificar uma cadeia pesada funcional contendo uma região constante endógena de cadeia pesada. Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia pesada de camundongo compreende pelo menos um e até 89 segmentos de gene VH, pelo menos um e até 13 segmentos de gene DH, pelo menos um e até quatro segmentos de gene JH e uma combinação destes. Em várias modalidades, um locus funcional de ADAM6 de camundongo (ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste) codifica uma ou mais proteínas de ADAM6 que são funcionais no camundongo, em que a uma ou mais proteínas ADAM6 compreendem SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou uma combinação destes.

[000479] Em um aspecto, um locus funcional de ADAM6 de camundongo (ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional deste) está presente na metade dos segmentos de gene VH de humano que substituem os segmentos de gene VH endógenos de camundongo. Em uma modalidade, pelo menos 89 segmentos de gene VH de camundongo são removidos e colocados com um ou mais segmentos de gene VH de humano, e o locus ADAM6 de camundongo está presente imediatamente adjacente à exremidade 3’ dos segmentos de gene VH de humano, ou entre dois segmentos de gene VH de humano. Em uma modalidade específica, o locus ADAM6 de camundongo está presente entre dois segmentos de gene VH em cerca de 20 kilo bases (kb) a cerca de 40 kilo bases (kb) da terminação 3’ dos segmentos de gene VH de humano inseridos. Em uma modalidade específica, o locus ADAM6 de camundongo está presente entre dois segmentos de gene VH em cerca de 29 kb a cerca de 31 kb da terminação 3’ dos segmentos de gene VH de humano inseridos. Em uma modalidade específica, o locus ADAM6 de camundongo está presente em cerca de 30 kb da terminação 3’ dos segmentos de gene VH de humano inseridos. Em uma modalidade específica, o locus ADAM6 de camundongo está presente em cerca de 30.184 bp da terminação 3’ dos segmentos de gene VH de humano inseridos. Em uma modalidade específica, a substituição inclui segmentos de gene VH de humano, VH1-2 e VH6-1, e o locus ADAM6 de camundongo está presente a jusante do segmento de gene VH1-2 e a montante do segmento de gene VH6-1. Em uma modalidade específica, o locus ADAM6 de camundongo está presente entre um segmento de gene VH1-2 de humano e um segmento de gene VH6-1 de humano, em que a extremidade 5’ doo locus ADAM6 de camundongo está a cerca de 13.848 bp da terminação 3’ do segmento de gene VH1-2 de humano, e a extremidade 3’ do locus ADAM6 está cerca de 29.737 bp 5’ do segmento de gene VH6-1 de humano. Em uma modalidade específica, o locus ADAM6 de camundongo compreende SEQ ID NO:3 ou um fragmento deste que confere função de ADAM6 nas células dos camundongos. Em uma modalidade específica, o arranjo de segmentos de gene VH de humano é então o seguinte (a partir de a montante até a jusante, com relação a direção de transcrição dos segmentos de gene VH de humano): VH1-2 de humano - locus ADAM6 de camundongo - VH6-1 de humano. Em uma modalidade específica, o pseudogene ADAM6 entre VH1-2 de humano e VH6-1 de humano é colocado com o locus ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade, a orientação de um ou mais ADAM6a de camundongo e ADAM6b de camundongo do locus ADAM6 de camundongo é oposta com relação a direção de transcrição, comparada com a orientação dos segmentos de gene VH de humano. Alternativamente, o locus ADAM6 de camundongo está presente na região intergênica entre o segmento de gene VH de humano 3’-mais e o segmento de gene DH 5’-mais. Isto pode ser o caso se o segmento DH 5’-mais for de camundongo ou humano.

[000480] De maneira similar, um camundongo modificado com um ou mais segmentos de gene VL de humano (por exemplo, segmentos VK ou VÀ) que substitui todos ou substancialmente todos os segmentos de gene endógenos VH pode ser modificado, de maneira tal a manter o locus endógeno de ADAM6, conforme descrito anteriormente, por exemplo, empregando um vetor de alvejamento com um braço de homologia a jusante que inclui um locus ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional deste, ou substituir um locus ADAM6 de camundongo danificado com uma sequência ectópica posicionada entre dois segmentos de gene VL de humano ou entre os segmentos de gene VL de humano e um segmento de gene DH (seja humano ou de camundongo, por exemplo, VX + m/hDH), ou um segmento de gene J (seja humano ou camundongo, por exemplo, VK + JH). Em uma modalidade, a substituição inclui dois ou mais segmentos de gene VL de humano, e o locus ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional deste é colocado entre os dois segmentos de gene VL 3’-máximo. Em uma modalidade específica, o arranjo de segmentos de gene VL de humano é então o seguinte (de a montante para a jusante com relação à direção de transcrição dos segmentos de gene de humano): VL 3’-1 de humano - locus ADAM6 de camundongo - VL 3’ de humano. Em uma modalidade, a orientação de um ou mais de ADAM6a de camundongo e ADAM6b de camundongo do locus ADAM6 de camundongo é oposta com relação à direção de transcrição comparada com a orientação dos segmentos de gene VL de humano. Alternativamente, o locus ADAM6 de camundongo está presente na região intergênica entre o segmento de gene VL 3’-mais de humano e o segmento de gene DH 5’-mais. Este pode ser o caso se o segmento DH 5’-mais for de camundongo ou humano.

[000481] Em um aspecto, é fornecido um camundongo com uma substituição de um ou mais segmentos de gene VH endógenos de camundongo, e que compreende pelo menos um segmento de gene DH endógeno de camundongo. Em um camundongo como este, a modificação dos segmentos de gene VH endógenos de camundongo pode compreender uma modificação de um ou mais dos segmentos de gene VH 3’-mais, mas não do segmento de gene DH 5’-mais, onde toma-se cuidado se a modificação do um ou mais segmentos de gene VH 3’-mais não interrompe ou torna o locus de ADAM6 endógeno funcional não funcional. Por exemplo, em uma modalidade o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH endógenos de camundongo com um ou mais segmentos de gene VH de humano, e o camundongo compreende um ou mais de gene DH endógenos de camungondo e um locus ADAM6 endógeno funcional de camundongo.

[000482] Em uma outra modalidade, o camundongo compreende a modificação de segmentos de gene VH endógenos de camundongo 3’-mais, e uma modificação de um ou mais segmentos de gene DH endógenos de camundongo, e a modificação é realizada de maneira a manter a integridade do locus de ADAM6 endógeno funcional até um grau em que o locus de ADAM6 endógeno permanece funcional. Em um exemplo, uma modificação como esta é realizada em duas etapas: (1) substituir os segmentos de gene VH 3’-mais endógenos de camundongo com um ou mais segmentos de gene VH de humano que empregam um vetor de alvejamento com um braço de homologia a montante, e um braço de homologia a jusante, em que o braço de homologia a jusante inclui todo ou uma porção de um locus ADAM6 funcional de camundongo; (2) a seguir substituir o segmento de gene DH endógeno de camundongo com um vetor de alvejamento com um braço de homologia a montante, que inclui um todo ou uma porção funcional de um locus ADAM6 de camundongo.

[000483] Em vários aspectos, o emprego de camundongos que contêm uma sequência ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou um ortólogo ou homólogo ou funcional homólogo deste é usado onde modificações rompem a função de endógeno ADAM6 de camundongo. A probabilidade de ruptura da função endógena de ADAM6 no camundongo é alta fazendo modificações nos loci de imunoglobulina de camundongo, em particular na modificação das regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo e sequências circundantes. Desta forma, tais camundongos fornecem benefício particular fazendo loci de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo que são deletados por completo ou em parte, são humanizados por completo ou em parte, ou são substituídos (por exemplo, com sequências VK ou V X) por completo ou em parte. Métodos para produzir as modificações genéticas descritas para os camundongos descritos a seguir são conhecidos por versados na tecnologia.

[000484] Camundongos contendo uma sequência ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo, ou uma proteína substancialmente idêntica ou similar que confere os benefícios de fertilidade de uma proteína ADAM6 de camundongo, são particularmente usados em conjunto com modificações de um locus de gene de cadeia pesada variável de imunoglobulina de camundongo que rompe ou deleta a sequência endógena de ADAM6. Embora primariamente descrito em conjunto com camundongos que expressam anticorpos com regiões variáveis de humano e regiões constantes de camundongo, tais camundongos são usados em conjunto com quaisquer modificações genéticas que rompem genes ADAM6 endógenos. Versados perceberão que isto engloba uma ampla variedade de camundongos geneticamente modificados que contêm modificações de loci de gene de cadeia pesada variável de imunoglobulina de camundongo. Estes incluem, por exemplo, camundongos com uma eliminação ou uma substituição de todos ou uma porção de segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, independente de outras modificações. Exemplos não limitantes são descritos a seguir.

[000485] Em alguns aspectos, camundongos geneticamente modificados que são fornecidos compreendem um camundongo ectópico, roedor, ou outro gene ADAM6 (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento) funcional em um camundongo, e um ou mais segmentos de gene de região variável e/ou constante de imunoglobulina de humano. Em várias modalidades, outros genes ADAM6 ortólogos ou homólogos ou fragmentos funcionais em um camundongo podem incluir sequências de bovino, canino, primata, coelho ou outras sequências de não humano.

[000486] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma sequência ectópica de ADAM6 que codifica uma proteína ADAM6 funcional, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongos com um ou mais segmentos de gene VH de humano; uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene DH de camundongos com um ou mais segmentos de gene DH de humano; e uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene JH de camundongo com um ou mais segmentos de gene JH de humano.

[000487] Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de uma sequência de nucleotídeo CH1 de camundongo por uma sequência de nucleotídeo CH1 de humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de uma sequência de nucleotídeo de dobradiça de camundongo por uma sequência de nucleotídeo de dobradiça de humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de um locus de cadeia leve de imunoglobulina variável (VL e JL) por um locus de cadeia leve variável de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente uma substituição de uma sequência de nucleotídeos de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo com uma sequência de nucleotídeos de cadeia leve região constante de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade específica, os VL, JL, e CL são sequências de cadeia leve K de imunoglobulinas. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma sequência de região constante de imunoglobulina CH2 de camundongo e CH3 de camundongo fundida a uma dobradiça de humano e uma sequência CH1 de humano, de maneira tal que os loci de imunoglobulina de camundongos rearranjem para formar um gene que codifica uma proteína de ligação compreendendo (a) uma cadeia pesada que tem uma região variável de humano, uma região CH1 de humano, uma região da dobradiça de humano, e um CH2 de camundongo e uma região CH3 de camundongo; e (b) um gene que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende um domínio variável de humano e uma região constante de humano.

[000488] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma sequência ectópica de ADAM6 que codifica uma proteína ADAM6 funcional, uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene VH de camundongo por um ou mais segmentos de gene VL de humano, e opcionalmente uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene DH e/ou segmentos de gene JH por um ou mais segmentos de gene DH de humano e/ou segmentos de gene JH de humano, ou opcionalmente uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene DH e segmentos de gene JH por um ou mais segmentos de gene JL de humano.

[000489] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene VH, DH, e JH de camundongo por um ou mais segmentos de gene VL, um ou mais DH, e um ou mais J (por exemplo, JK ou JX), em que os segmentos de gene são operacionalmente ligados a uma região da dobradiça de camundongo, em que o camundongo forma um gene de cadeia de imunoglobulina rearranjado que contém, de 5’ a 3’ na direção de transcrição, VL de humano -DH de humano ou camundongo -J de humano ou camundongo -dobradiça de camundongo - CH2 de camundongo -CH3 de camundongo. Em uma modalidade, a região J é uma região Jk de humano. Em uma modalidade, a região J é uma região JH de humano. Em uma modalidade, a região J é uma região JX de humano. Em uma modalidade, a região VL de humano é selecionado de uma região VX de humano e uma região Vk de humano.

[000490] Em modalidades específicas, o camundongo expressa um único anticorpo de domínio variável com uma região constante de camundongo ou humano e uma região variável derivada de um Vk de humano, um DH de humano e um Jk de humano; um Vk de humano, um DH de humano, e um JH de humano; um VX de humano, um DH de humano, e um JX de humano; um VX de humano, um DH de humano, e um JH de humano; um VK de humano, um DH de humano, e um JX de humano; um VA de humano, um DH de humano, e um JK de humano. Em modalidade específica, sequências de reconhecimento de recombinação são modificadas de maneira tal a permitir que rearranjos produtivos ocorram entre os segmentos de gene V, D, e J citados ou entre segmentos de gene V e J citados.

[000491] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma sequência ectópica de ADAM6 que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste), uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene VH de camundongo por um ou mais segmentos de gene VL de humano, uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene DH de camundongo e segmentos de gene JH por segmentos de gene JL de humano; em que o camundongo perde uma região CH1 e/ou da dobradiça.

[000492] Em uma modalidade, o camundongo perde uma sequência que codifica um domínio CH1. Em uma modalidade, o camundongo perde uma sequência que codifica uma região da dobradiça. Em uma modalidade, o camundongo perde uma sequência que codifica um domínio CH1 e uma região da dobradiça.

[000493] Em uma modalidade específica, o camundongo expressa uma proteína de ligação que compreende um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina de humano (a ou k) fundido a um camundongo domínio CH2 que é anexado a um domínio CH3 de camundongo.

[000494] Em um aspecto, é fornecido um camundongo que compreende uma sequência ectópica de ADAM6 que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste), uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene VH de camundongo por um ou mais segmentos de gene VL de humano, uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene DH e JH de camundongo por segmentos de gene JL de humano.

[000495] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma eliminação de uma sequência genética de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina que codifica uma região CH1, uma região da dobradiça, uma região CH1 e uma da dobradiça, ou uma região CH1 e uma região da dobradiça e uma região CH2.

[000496] Em uma modalidade, o camundongo faz uma proteína de ligação de domínio variável único compreendendo um homodímero selecionado do seguinte: (a) VL de humano -CH1 de camundongo -CH2 de camundongo -CH3 de camundongo; (b) VL de humano -dobradiça de camundongo -CH2 de camundongo -CH3 de camundongo; (c) VL de humano - CH2 de camundongo -CH3 de camundongo.

[000497] Em um aspecto, é fornecido um camundongo com um locus endógeno inativado de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo um locus inativado ou eliminado de ADAM6 endógeno funcional, em que o camundongo compreende uma sequência de ácido nucleico que expressa um anticorpo humano ou de camundongo, ou humano/camundongo, ou outro quimérico. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está presente em um transgene integrado, que é integrado aleatoriamente no genoma do camundongo. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é em um epissomo (por exemplo, um cromossomo) não encontrado em um camundongo tipo selvagem.

[000498] Em uma modalidade, o camundongo compreende adicionalmente um locus endógeno inativado de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o locus endógeno de cadeia leve de imunoglobulina é selecionado de um locus de cadeia leve kappa (K) e um lambda (X). Em uma modalidade específica, o camundongo compreende um locus K inativado endógeno de cadeia leve e um locus X inativado de cadeia leve, em que o camundongo expressa um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano e um domínio de cadeia leve de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, o domínio de cadeia leve de imunoglobulina de humano é selecionado de um domínio de cadeia leve K de humano e um domínio de cadeia leve X de humano. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende um locus k inativado endógeno de cadeia leve, em que o camundongo expressa um anticorpo que compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina de humano/camundongo (isto é, variável de humano/contante de camundongo) e uma cadeia leve de imunoglobulina de humano/camundongo compreendendo um domínio VX de humano. Em uma modalidade, a cadeia leve de imunoglobulina de humano/camundongo compreende um camundongo Ck. Em uma modalidade, a cadeia leve de imunoglobulina de humano/camundongo compreende um CX de camundongo. Em uma modalidade específica, o CX de camundongo é um CX2.

[000499] Em um aspecto, é fornecido um animal geneticamente modificado que expressa um anticorpo quimérico e expressa uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo desta, que é funcional no animal geneticamente modificado.

[000500] Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é selecionado de um camundongo e um rato. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é um camundongo, e a proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo desta é de uma cepa de camundongo que é uma cepa diferente do animal geneticamente modificado. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é um roedor da família Cricetidae (por exemplo, um hamster, um rato do novo mundo ou camundongo, um rato toupeiro), e o ortólogo ou homólogo da proteína ADAM6 é de um roedor da família Muridae (por exemplo, camundongo ou rato verdadeiro, gerbil, rato espinhoso, crested rato). Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é um roedor do família Muridae, e o ortólogo ou homólogo da proteína ADAM6 é de um roedor da família Cricetidae.

[000501] Em uma modalidade, o anticorpo quimérico compreende um domínio variável de humano e uma sequência de região constante de um roedor. Em uma modalidade, o roedor é selecionado de um roedor da família Cricetidae e um roedor da família Muridae, Em uma modalidade específica, o roedor da família Cricetidae e da família Muridae é um camundongo. Em uma modalidade específica, o roedor da família Cricetidae e da família Muridae é um rato. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico compreende um domínio variável de humano e um domínio constante de um animal selecionado de um camundongo ou rato; em uma modalidade específica, o camundongo ou rato é selecionado da família Cricetidae e da família Muridae. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico compreende um domínio variável de cadeia pesada de humano, um domínio variável de humano de cadeia leve e uma sequência de região constante derivada de um roedor selecionado de camundongo e rato, em que o domínio variável de cadeia pesada de humano e a cadeia leve de humano são cognatos. Em uma modalidade específica, cognato inclui que os domínios variáveis de cadeia pesada de humano e de cadeia leve de humano são de uma única célula B que expressa o domínio variável de humano de cadeia leve e o domínio variável de cadeia pesada de humano juntos, e apresenta os domínios variáveis juntos na superfície de uma célula B individual.

[000502] Em uma modalidade, o anticorpo quimérico é expresso a partir de um locus de imunoglobulina. Em uma modalidade, a domínio variável de cadeia pesada do anticorpo quimérico é expresso a partir de um locus endógeno rearranjado de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a domínio variável de cadeia leve do anticorpo quimérico é expresso a partir de um locus endógeno rearranjado de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, a domínio variável de cadeia pesada do anticorpo quimérico e/ou a domínio variável de cadeia leve do anticorpo quimérico é expresso a partir de um transgene rearranjado (por exemplo, uma sequência rearranjada de ácido nucleico derivado de uma sequência não rearranjada de ácido nucleico integrado no genoma do animal em um locus sem ser um locus endógeno de imunoglobulina). Em uma modalidade, a domínio variável de cadeia leve do anticorpo quimérico é expresso a partir de um transgene rearranjado (por exemplo, uma sequência rearranjada de ácido nucleico derivado de uma sequência não rearranjada de ácido nucleico integrado no genoma do animal, em um locus sem ser um locus endógeno de imunoglobulina).

[000503] Em uma modalidade específica, o transgene é expresso a partir de um locus transcricionalmente ativo, por exemplo, um locus ROSA26, por exemplo, um locus ROSA26 de murino (por exemplo, camundongo).

[000504] Em um aspecto, é fornecido um animal não humano, compreendendo um locus humanizado de cadeia pesada de imunoglobulina, em que o locus humanizado de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência não humana de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo desta.

[000505] Em uma modalidade, o animal não humano é um roedor selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[000506] Em uma modalidade, o ortólogo ou homólogo de ADAM6 não humano é uma sequência que é ortóloga e/ou homóloga a uma sequência de ADAM6 de camundongo, em que o ortólogo ou homólogo é funcional no animal não humano.

[000507] Em uma modalidade, o animal não humano é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 é de um animal não humano selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster. Em uma modalidade específica, o animal não humano é um camundongo e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 é de um animal que é selecionado de uma espécie diferente de camundongo, um rato, e um hamster. Em modalidade específica, o animal não humano é um rato, e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 é de um roedor que é selecionado de uma espécie diferente de rato, um camundongo, e um hamster. Em uma modalidade específica, o animal não humano é um hamster, e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 é de um roedor que é selecionado de uma espécie diferente de hamster, um camundongo, e um rato.

[000508] Em uma modalidade específica, o animal não humano é da subordem Myomorpha, e a sequência de ADAM6 é de um animal selecionada de um roedor da subfamília Dipodoidea e um roedor da subfamília Muroidea. Em uma modalidade específica, o roedor é um camundongo da subfamília Muroidea, e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 é de um camundongo ou um rato ou um hamster da subfamília Muroidea.

[000509] Em uma modalidade, o locus humanizado de cadeia pesada compreende um ou mais segmentos de gene VH de humano, um ou mais segmentos de gene DH de humano e um ou mais segmentos de gene JH de humano. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene VH de humano, um ou mais segmentos de gene DH de humano e um ou mais segmentos de gene JH de humano são operavelmente ligados a um ou mais genes de região constante de humano, quimérico e/ou roedor (por exemplo, camundongo ou rato). Em uma modalidade, os genes de região constante são de camundongo. Em uma modalidade, os genes de região constante são de rato. Em uma modalidade, os genes de região constante são de hamster. Em uma modalidade, os genes de região constante compreendem a uma sequência selecionada de uma dobradiça, um CH2, um CH3, e uma combinação destes. Em modalidade específica, os genes de região constante compreendem uma dobradiça, um CH2, e um CH3 sequência.

[000510] Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 não humano é contígua com uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 não humano é posicionada em uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia pesada de imunoglobulina de humano compreende um segmento de gene V, D e/ou J.

[000511] Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 não humano é justaposta com um segmento de gene V. Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 não humano é posicionada entre dois segmentos de gene V. Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 não humano é justaposta entre um segmento de gene V e um D. Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 de camundongo é posicionada entre um segmento de gene V e um J. Em uma modalidade, a sequência de ADAM6 de camundongo é justaposta entre um segmento de gene D e um J.

[000512] Em um aspecto, é fornecido um animal não humano geneticamente modificado, compreendendo uma célula B que expressa um domínio VH de humano cognato com um domínioVL de humano a partir de um locus de imunoglobulina, em que o animal não humano expressa uma proteína não imunoglobulina não humana a partir do locus de imunoglobulina. Em uma modalidade, a proteína não imunoglobulina não humana é um proteína ADAM. Em uma modalidade específica, a proteína ADAM é uma proteína ADAM6, ou homólogo, ou ortólogo ou fragmento funcional da mesma.

[000513] Em uma modalidade, o animal não humano é um roedor (por exemplo, camundongo ou rato). Em uma modalidade, o roedor é da família Muridae. Em uma modalidade, o roedor é da subfamília Murinae. Em uma modalidade específica, o roedor da subfamília Murinae é selecionado de um camundongo e um rato.

[000514] Em uma modalidade, a proteína não imunoglobulina não humana é uma proteína de roedor. Em uma modalidade, o roedor é da família Muridae. Em uma modalidade, o roedor é da subfamília Murinae. Em uma modalidade específica, o roedor é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[000515] Em uma modalidade, os domínios VH e VL de humano são anexados diretamente ou até um ligados em uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a sequência de domínio constante compreende uma sequência selecionada de uma dobradiça, um CH2 um CH3, e uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o domínio VL de humano é selecionado de um Domínio VK ou um VX.

[000516] Em um aspecto, um animal não humano geneticamente modificado é fornecido, compreendendo em sua linhagem germinativa uma sequência de imunoglobulina de humano, em que o espermatozoide de um animal não humano macho é caracterizado por um defeito na migração in vivo. Em uma modalidade, o defeito na migração in vivo compreende uma incapacidade do espermatozoide do animal não humano macho migrar de um útero até um oviduto de um animal não humano fêmea da mesma espécie. Em uma modalidade, o animal não humano perde uma sequência de nucleotídeo que codifica e proteína ADAM6 ou fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade específica, a proteína ADAM6 ou fragmento funcional da mesma inclui uma proteína ADAM6a e/ou uma ADAM6b ou fragmentos funcionais desta. Em uma modalidade, o animal não humano é um roedor. Em uma modalidade específica, o roedor é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[000517] Em um aspecto, é fornecido um animal não humano, compreendendo uma sequência de imunoglobulina de humano contígua com uma sequência não humana que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo, ou homólogo, ou fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade, o animal não humano é um roedor. Em uma modalidade específica, o roedor é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[000518] Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina de humano é uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina compreende um ou mais segmentos de gene VH. Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina de humano compreende um ou mais segmentos de gene DH. Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina de humano compreende um ou mais segmentos de gene JH. Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina de humano compreende um ou mais segmentos de gene VH, um ou mais segmentos de gene DH e um ou mais segmentos de gene JH.

[000519] Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina compreende um ou mais segmentos de gene VH apresentam uma frequência elevada em repertórios naturais de humano. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene VH compreendem não mais de dois segmentos de gene VH, não mais de três segmentos de gene VH, não mais de quatro segmentos de gene VH, não mais de cinco segmentos de gene VH, não mais de seis segmentos de gene VH, não mais de sete segmentos de gene VH, não mais de oito segmentos de gene VH, não mais de nove segmentos de gene VH, não mais de 10 segmentos de gene VH, não mais de 11 segmentos de gene VH, não mais de 12 segmentos de gene VH, não mais de 13 segmentos de gene VH, não mais de 14 segmentos de gene VH, não mais de 15 segmentos de gene VH, não mais de 16, segmentos de gene VH, não mais de 17 segmentos de gene VH, não mais de 18 segmentos de gene VH, não mais de 19 segmentos de gene VH, não mais de 20 segmentos de gene VH, não mais de 21 segmentos de gene VH, não mais de 22 segmentos de gene VH ou não mais de 23 segmentos de gene VH.

[000520] Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene VH compreendem cinco segmentos de gene VH. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene VH compreendem 10 segmentos de gene VH. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene VH compreendem 15 segmentos de gene VH. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene VH compreendem 20 segmentos de gene VH.

[000521] Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2- 26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4- 59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 e VH3-74. Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH1-2, VH1-8, VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4- 39, VH4-59, VH5-51 e VH6-1. Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH4-34, VH4-39, VH4-59 e VH5- 51. Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-43, VH3-48, VH4-39, VH4-59 e VH5-51. Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH1-18, VH3-11, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH4- 39 e VH4-59. Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH1-18, VH3-21, VH3-23, VH3-30 e VH4-39. Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH1-18, VH3-23 e VH4-39. Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH3-21, VH3-23 e VH3-30. Em várias modalidades, os segmentos de gene VH são selecionados de VH3-23, VH3-30 e VH4-39.

[000522] Em uma modalidade específica, sequência de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 18 segmentos de gene VH, 27 segmentos de gene DH e seis segmentos de gene JH. Em uma modalidade específica, a sequência de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 39 segmentos de gene VH, 27 segmentos de gene DH e seis segmentos de gene JH. Em uma modalidade específica, a sequência de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 80 segmentos de gene VH, 27 segmentos de gene DH e seis segmentos de gene JH.

[000523] Em uma modalidade, o animal não humano é um camundongo, e o camundongo compreende uma substituição de segmentos de gene endógenos VH de camundongo por um ou mais segmentos de gene VH de humano, em que os segmentos de gene VH de humano são operavelmente ligados a um gene de região CH de camundongo, de maneira tal que o camundongo rearrange os segmentos de gene VH de humano e expresse uma cadeia pesada quimérica reversa de imunoglobulina que compreende um domínio VH de humano e um CH de camundongo. Em uma modalidade, 90100 % de segmentos de gene VH não rearranjados camundongos são substituídos por pelo menos um segmento de gene VH não rearranjado de humano. Em uma modalidade específica, todos ou substancialmente todos os segmentos de gene endógenos de camundongo VH são substituídos por pelo menos um segmento de gene VH não rearranjado de humano. Em uma modalidade, a substituição é por pelo menos 19, pelo menos 39, ou pelo menos 80 ou 81 segmentos de gene VH não rearranjados de humano. Em uma modalidade, a substituição é por pelo menos 12 segmentos de gene VH funcionais não rearranjados de humano, pelo menos 25 segmentos de gene VH funcionais não rearranjados de humano, ou pelo menos 43 segmentos de gene VH funcionais não rearranjados de humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos os segmentos DH e JH de camundongo por pelo menos um segmento DH não rearranjado de humano, e pelo menos um segmento JH não rearranjado de humano. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento DH não rearranjado de humano é selecionado de 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, e uma combinação destes. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento JH não rearranjado de humano é selecionado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, e uma combinação destes. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmento de gene VH de humano é selecionado de um segmento de gene 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, um 6-1 VH de humano, e uma combinação destes.

[000524] Em várias modalidades, a sequência de imunoglobulina de humano está operavelmente ligada a uma região constante na linhagem germinativa do animal não humano (por exemplo, o roedor, por exemplo, o camundongo, rato, ou hamster). Em uma modalidade, a região constante é uma região constante de humano, humano/camundongo quimérico ou humano/rato quimérico ou humano/hamster quimérico, um camundongo, um rato, ou um hamster. Em uma modalidade, a região constante é uma região constante de roedor (por exemplo, camundongo ou rato ou hamster). Em uma modalidade específica, o roedor é um camundongo ou rato. Em várias modalidades, a região constante compreende pelo menos um domínio CH2 e um domínio CH3.

[000525] Em uma modalidade, a sequência de cadeia pesada de imunoglobulina de humano está localizada em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina na linhagem germinativa do animal não humano (por exemplo, o roedor, por exemplo, o camundongo ou rato ou hamster). Em uma modalidade, a sequência de cadeia pesada de imunoglobulina de humano está localizada em um locus de cadeia nçao pesada de imunoglobulina na linhagem germinativa do animal não humano, em que o locus de cadeia não pesada é um locus transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o locus de cadeia não pesada é um locus ROSA26.

[000526] Em vários aspectos, o animal não humano compreende adicionalmente uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano (por exemplo, uma ou mais sequências não rearranjadas de cadeia leve V e J, ou uma ou mais sequências rearranjadas VJ) na linhagem germinativa do animal não humano. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina é uma sequência de cadeia leve X de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende um ou mais segmentos de gene VX. Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende um ou mais segmentos de gene JX. Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende um ou mais segmentos de gene VX e um ou mais segmentos de gene JX.

[000527] Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 12 segmentos de gene VX e um segmento de gene JX. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 12 segmentos de gene VX e quatro segmentos de gene JX.

[000528] Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 28 segmentos de gene VX e um segmentos de gene JX. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 28 segmentos de gene VX e quatro segmentos de gene JX.

[000529] Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 40 segmentos de gene VX e um segmento de gene JX. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano compreende pelo menos 40 segmentos de gene VX e quatro segmentos de gene JX.

[000530] Em várias modalidades, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano está operavelmente ligada a uma região constante na linhagem germinativa do animal não humano (por exemplo, roedor, por exemplo, camundongo ou rato ou hamster). Em uma modalidade, a região constante é uma região constante de humano, humano/roedor quimérico, camundongo, rato, ou hamster. Em uma modalidade específica, a região constante é uma região constante de camundongo ou rato. Em uma modalidade específica, a região constante é uma região constante K de camundongo (mCK) ou uma região constante K de rato (rCK). Em uma modalidade específica, a região constante é uma região constante X de camundongo (mCl) ou uma região constante X de rato (rCX). Em uma modalidade, região CX de camundongo é uma região CX2 de camundongo.

[000531] Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano está localizada em um locus de cadeia leve de imunoglobulina na linhagem germinativa do animal não humano. Em uma modalidade específica, o locus de cadeia leve de imunoglobulina na linhagem germinativa do animal não humano é um locus K de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o locus de cadeia leve de imunoglobulina na linhagem germinativa do animal não humano é um locus X de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve de imunoglobulina de humano está localizada em um locus de cadeia não leve de imunoglobulina na linhagem germinativa do animal não humano, que é transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o locus não associado à imunoglobulina é um locus ROSA26.

[000532] Em um aspecto, é fornecido um método de produzir um anticorpo de humano, em que o anticorpo de humano compreende domínios variáveis derivados de uma ou mais sequências de ácido nucleico de região variável codificadas em uma célula de um animal não humano da maneira aqui descrita.

[000533] Em um aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica, compreendendo um polipeptídeo que compreende anticorpo ou fragmento de anticorpo que é derivado de uma ou mais sequências de ácido nucleico de região variável isoladas de um animal não humano da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo. Em uma modalidade, o polipeptídeo é uma anticorpo apenas de cadeia pesada. Em uma modalidade, o polipeptídeo é um fragmento variável de cadeia única (por exemplo, um Fvsc).

[000534] Em um aspecto, é fornecido o uso de um animal não humano da maneira aqui descrita para produzir um anticorpo. Em várias modalidades, o anticorpo compreende um ou mais domínios variáveis que são derivados de uma ou mais sequências de ácido nucleico de região variável isoladas do animal não humano. Em uma modalidade específica, as sequências de ácido nucleico de região variável compreendem segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, as sequências de ácido nucleico de região variável compreendem segmentos de gene de cadeia leve de imunoglobulina. Camundongos que expressam domínios variáveis k de humano

[000535] Animais não humanos geneticamente modificados (por exemplo, camundongos, ratos, etc) compreendendo uma modificação que reduz fertilidade, em virtude da perda de uma ativudade de proteína ADAM (por exemplo, ADAM6-dependent), podem ser cruzados com animais não humanos da maneira aqui descrita, que compreendem sequências variáveis k de humano em genes endógenos não humanos, ou (por exemplo, transgênicos), leves constantes. Por exemplo, os animais não humanos tais como camundongos ou ratos que compreendem um gene danificado de ADAM6 (ou um gene de ADAM6 eliminado), por exemplo, animais com loci de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada , são combinados com camundongos que compreendem um locus de cadeia leve (endógeno ou transgênico) que compreende segmentos X de humano e segmentos JL ligados os genes de região constante de cadeia leve de humano ou não humano (por exemplo, endógeno de camundongo ou rato), em que os animais não humanos compreendem uma atividade que recupera a fertilidade dependente de ADAM. A modificação genética que recupera a fertilidade dependente de ADAM pode ser tanto no animal não humano, por exemplo, em um camundongo com uma cadeia pesada humanizada, quanto em um camundongo com segmentos variáveis X humanizados. A progênie compreende genes que formam um locus humanizado de cadeia pesada (isto é, resulta na expressão de um domínio variável de cadeia pesada de humano) e um humanizado de cadeia leve (isto é, resulta na expressão de um domínio variável de cadeia leve X de humano, fundido a uma região X ou K de humano ou não humano), em que os animais exibem uma fertilidade que é maior comparada a um camundongo que perde a atividade de ADAM6, ou atividade de um ortólogo ou homólogo de ADAM6.

[000536] Os camundongos geneticamente modificados VELOCIMMUNE® compreendem uma substituição de segmentos de gene V(D)J não rearranjados em loci endógenos de camundongo por segmentos de gene V(D)J de humano. Os camundongos VELOCIMMUNE® expressam anticorpos quiméricos com domínios variáveis de humano e domínios constantes de camundongo (ver, por exemplo, patente U.S. 7.605.237). Ainda outros lelatos dizem respeito a camundongos que expressam anticorpos completamente humanos a partir de transgenes completamente humanos em camundongos que apresentam loci endógenos inativados de imunoglobulina.

[000537] As cadeias leves de anticorpo são codificadas por um de dois loci separados: kappa (k) e lambda (X). As cadeias leves de anticorpo de camundongo são principalmente do tipo k. Camundongos que produzem anticorpos de camundongo, e camundongos modificados que produzem anticorpos completamente humanos ou quiméricos de humano-camundongo, exibem uma tendência no uso de cadeia leve. Os humanos também exibem tendência à cadeia leve, mas não tão pronunciado quanto em camundongos; a razão de cadeias leves k para cadeias leves X em camundongos é cerca de 95:5, ao passo que em humans a razão é cerca de 60:40. A tendência mais evidente em camundongos é não saber afetar gravimente a diversidade do anticorpo, em decorrência de nos camundongos o locus X variável não ser tão diverso quanto no primeiro exemplo. Esto não é apenas em humanos. O locus X de cadeia leve de humano é muito diverso.

[000538] O locus X de cadeia leve de humano se estende por 1.000 kb e contém mais de 80 genes que codificam segmentos variáveis (V) ou de união (J) (FIG. 19). No locus X de cadeia leve de humano, quase metade de todos os domínios VX observados são codificados pelos segmentos de gene 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, e 3-21. No geral, acredita-se que cerca de 30 ou mais do segmentos de gene VX de humano sejam funcionais. Existem sete segmentos de gene JX, apenas quatro dos quais são em geral relacionados como segmentos de gene funcionais JX-JX1, JX2, JX3, e JX7.

[000539] O locus X de cadeia leve em humans é similar em estrutura ao locus X tanto de camundongos quanto de humans, em que o locus X de cadeia leve de humano apresenta vários segmentos de gene de região variável que são capazes de recombinar para formar uma proteína de cadeia leve funcional. O locus X de cadeia leve de humano contém aproximadamente 70 segmentos de gene V e 7 pares de segmento de gene JX-CX. Apenas quatro destes pares de segmento de gene JX-CX parecem ser funcionais. Em alguns alelos, um quinto par de segmento de gene JX-CX é relatado como um pseudo gene (CX6). Os 70 segmentos de gene VX parecem conter 38 segmentos de gene funcionais. As 70 sequências VX são arranjadas em três agrupamentos, todos os quais contêm diferentes elementos de grupos distintos de gene da família V (agrupamentos A, B e C; FIG. 19). Esta é uma fonte potencialmente rica de diversidade relativamente inexplorada para gerar anticorpos com regiões V de humano em animais não humanos.

[000540] Em grande contraste, o locus X de cadeia leve de camundongo contém apenas dois ou três (dependendo da cepa) segmentos de gene de região VX de camundongo (FIG. 20). Pelo menos por esta razão, a grande tendência K em camundongos não é conhecida como particularmente detrimental à diversidade total de anticorpo.

[000541] De acordo com os mapas publicados dos locus X de cadeia leve de camundongos, o locus consiste essencialmente em dois agrupamentos de segmentos de gene em um espaço de aproximadamente 200 kb (FIG. 20). O dois agrupamentos contêm dois conjuntos de genes V, J, e C que são capazes de rearranjo independente: VX2-JX2-CX2-JX4-CX4 e VX1-JX3-CX3-JX1-CX1. Embora tenha-se observado V/2 recombinar com todos os segmentos de gene JX, V/J parece recombinar exclusivamente com C/J. Acredita-se que CX4 seja um pseudo gene com sítios de união defeituosos.

[000542] O locus K de cadeia leve de camundongo é muito diferente. A estrutura e número de segmentos de gene que participam nos eventos de recombinação levam a uma locus na proteína de cadeia leve funcional do camundongo k que é muito mais complexa (FIG. 21). Assim, as cadeias leve / de camundongonão contribuem muito para a diversidade de uma população de anticorpo em um camundongo típico.

[000543] Explorar a rica diversidade do locus de cadeia leve / de humano em camundongos pode resultar provavelmente em, entre outras coisas, uma fonte de um repertório humano mais completo de domínios V de cadeia leve. As tentativas anteriores para explorar esta diversidade usaram transgenes de humano contendo fragmentos do locus / de humano de cadeia leve incorporados aleatoriamente no genoma do camundongo (ver, por exemplo, U.S. 6.998.514 e U.S. 7.435.871). Camundongos contendo estes transgenes aleatoriamente integrados expressam de maneira relatada cadeias leves / completamente humas, entretanto, em alguns casos, um ou ambos os loci endógenos de cadeia leve permanecem intactos. Esta situação não é desejável para a sequência de cadeia leves / de humano, que lida com a cadeia leve (k ou /) de camundonga no repertório de anticorpo expresso dos camundongos.

[000544] Ao contrário, os inventores descrevem camundongos geneticamente modificados que são capazes de expressar um ou mais sequências de cadeia leve / de ácido nucleico diretamente a partir de um locus de cadeia leve de camundongo, incluindo por substituição em um locus endógeno de cadeia leve de camundongo. Camundongos geneticamente modificados capazes de expressar sequência de cadeia leves / de humano a partir de um locus endógeno podem ser cruzados adicionalmente com os camundongos que compreendem um locus de cadeia pesada de humano e, assim, serem usados para expressar anticorpos compreendendo regiões V (pesada e leve) que são completamente humanas. Em várias modalidades, as regiões V expressam as regiões constantes de camundongo. Em várias modalidades, nenhum dos segmentos de gene endógenos de imunoglobulina de camundongo estão presentes e as regiões V expressam com regiões constantes de humano. Estes anticorpos podem ser usados em várias aplicações, tanto diagnósticas quanto terapêuticas.

[000545] Muitas vantagens podem ser realizadas para várias modalidades de expressar proteínas de ligação derivadas de segmentos de gene VX e JX de humano em camundongos. As vantagens podem ser realizadas colocando as sequências X de humano em um locus endógeno de cadeia leve, por exemplo, o locus K ou X de camundongo. Anticorpos produzidos a partir de tais camundongos podem apresentar cadeias leves que compreendem domínios VX de humano fundidos a uma região CL de camundongo, especificamente uma região Ck ou CX de camundongo. Os camundongos também expressarão domínios VX de humano que são adequados para a identificação e clonagem para uso com regiões CL de humano, especificamente regiões Ck e/ou CX. Em decorrência do desenvolvimento de célula B em tais camundongos ser diferente do normal, é possível gerar domínios VX compatíveis (incluindo domínios VX mutados de maneira somática) no contexto tanto das regiões CX quanto Ck.

[000546] São descritos camundongos geneticamente modificados que compreendem um segmento de gene VX não rearranjado em um locus k ou X de cadeia leve de imunoglobulina. São descritos camundongos que expressam anticorpos que compreendem uma cadeia leve com um domínio VX humano fundido a uma região Ck e/ou CX.

[000547] Em um aspecto, é descrito um animal não humano geneticamente modificado que compreende (1) um ou mais segmentos de gene não rearranjados VX de humano e um ou mais segmentos de gene não rearranjados JX de humano, em um locus endógeno de cadeia leve de imunoglobulina do animal não humano, (2) um ou mais segmentos de gene VH de humano, um ou mais segmentos de gene DH de humano, e um ou mais segmentos de gene JH de humano, em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina do animal não humano, em que o animal não humano é capaz de expressar uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional da mesma, em que a proteína ADAM6 é funcional em um animal não humano macho. Em um aspecto, é descrito um animal não humano geneticamente modificado que expressa anticorpos contendo cadeias pesadas que compreendem domínios VH de humano e regiões constantes de cadeia pesada não humana e cadeia leves que compreendem domínios VX de humano e regiões constantes de cadeia leve não humanas, em que os animais não humanos são capazes de expressar uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional da mesma. Em várias modalidades, o animal não humano é um roedor. Em uma modalidade, o roedor é um camundongo ou um rato.

[000548] Em uma modalidade, o domínio constante de cadeia leve não humano é um domínio CK ou um CX. Em uma modalidade, a proteína ADAM6 ou fragmento funcional da mesma é codificada por uma sequência ectópica na linhagem germinativa dos camundongos. Em uma modalidade, a proteína ADAM6 ou fragmento funcional da mesma é codificada por uma sequência endógena do animal não humano.

[000549] Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia leve do animal não humano é um locus X de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, o locus endógeno de cadeia leve do animal não humano é um locus k de cadeia leve de imunoglobulina.

[000550] Em uma modalidade, o animal não humano perde um segmento de gene VL e/ou JL endógeno no locus endógeno de cadeia leve. Em uma modalidade específica, o segmento de gene VL e/ou JL é um segmento de gene VK e/ou JK. Em uma modalidade específica, o segmento de gene VL e/ou JL é um segmento de gene VX e/ou JX,

[000551] Em uma modalidade, os segmentos de gene VL e JL do animal não humano são substituídos por um ou mais segmentos de gene VX de humano e um ou mais JX de humano. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene VL e JL do animal não humano são segmentos de gene k. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene VL e JL do animal não humano são segmentos de gene X.

[000552] Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene VX de humano são de um fragmento de agrupamento A do locus X de cadeia leve de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade específica, o fragmento de agrupamento A se estende de VX3-27 de humano até VX3-1 de humano. Em uma modalidade específica, o fragmento de agrupamento A se estende de VX3-12 de humano até JX1 de humano. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene VX de humano são de um fragmento de agrupamento B do locus X de cadeia leve de imunoglobulina de humano. Em uma modalidade específica, o fragmento de agrupamento B se estende de VX5-52 de humano até VX1-40 de humano. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene VX de humano são de um fragmento de agrupamento A e de um fragmento de agrupamento B do locus X de cadeia leve de imunoglobulina de humano da maneira aqui descrita.

[000553] Em uma modalidade, o animal não humano compreende pelo menos 12 segmentos de gene VX de humano. Em uma modalidade, o animal não humano compreende pelo menos 28 segmentos de gene VX de humano. Em uma modalidade, o animal não humano compreende pelo menos 40 segmentos de gene VX de humano.

[000554] Em uma modalidade, o pelo menos um segmento de gene JX de humano é selecionado do grupo que consiste em JX1, JX2, JX3, JX7, e uma combinação destes.

[000555] Em um aspecto, um animal não humano macho e fértil é fornecido, em que o animal não humano fértil expressa (1) uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio VX de humano ou um domínio VK de humano, e (2) uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um domínio VH de humano, em que o animal não humano macho compreende um locus de região variável modificada de cadeia pesada e um gene ectópico de ADAM6 que é funcional no animal não humano macho. Em uma modalidade, o animal não humano macho é um camundongo.

[000556] Em um aspecto, é fornecido o uso de um animal não humano da maneira aqui descrita para produzir uma proteína de ligação de antígeno. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é humana. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno compreende um domínio VH de humano e/ou um domínio VX de humano derivado de um animal não humano da maneira aqui descrita.

[000557] Em um aspecto, uma célula ou tecido derivado de um animal não humano da maneira aqui descrita é fornecida. Em uma modalidade, o tecido é derivado de um baço, medula óssea ou um linfonodo. Em uma modalidade, a célula é uma célula B. Em uma modalidade, a célula é uma célula do tronco embrionário (ES). Em uma modalidade, a célula é uma célula germinativa.

[000558] Em um aspecto, é fornecido um oócito compreendendo um genoma diplóide de um animal não humano geneticamente modificado da maneira aqui descrita. Transcritos estéreis do locus K de cadeia leve de imunoglobulina

[000559] As variações no tema de expressar sequências X de imunoglobulina de humano em camundongos são refletidas em várias modalidades de camundongos geneticamente modificados capzaes de tal expressão. Assim, em algumas modalidades, os camundongos geneticamente modificados compreendem certa(s) sequência(s) não codificante(s) a partir de um locus humano. Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado compreende segmentos de gene VX e JX de humano em um locus K endógeno de cadeia leve, e compreende adicionalmente um fragmento genômico de cadeia leve K de humano. Em uma modalidade específica, o fragmento genômico de cadeia leve K de humano é uma sequência não codificante naturalmente encontrada entre um segmento de gene VK de humano e um segmento de gene JK de humano.

[000560] Os loci de cadeia leve K de humano e camundongo contêm sequências que codificam transcritos estéreis que perdem tanto um códon inicial quanto um quadro de leitura aberto, e que são relacionados como elementos que regulam a transcrição dos loci de cadeia leve K. These transcritos estéreis surgem de uma sequência intergênica localizada a jusante ou 3’ do segmento de gene VK mais proximal, e a montante ou 5’ do melhorador intrônico de cadeia leve K (EKi), que está a montante do gene de região constante K de cadeia leve (CK). O transcritos estéreis surgem do rearranjo da sequência intergênica para formar um segmento VKJK1 fundido a um CK.

[000561] Uma substituição do locus K de cadeia leve a montante do gene CK pode remover a região intergênica que codifica os transcritos estéreis. Portanto, em várias modalidades, uma substituição de sequência de cadeia leve K de camundongo a montante do gene CK de camundongo com segmentos de gene de cadeia leve X de humano pode resultar em um locus K humanizado de cadeia leve de camundongo, que contém segmentos de gene VX e JX de humano, mas não a região intergênica de cadeia leve K que codifica os transcritos estéreis.

[000562] Da maneira aqui descrita, humanização do locus endógeno de cadeia leve K de camundongo com segmentos de gene de cadeia leve X de humano, em que a humanização remove a região intergênica, resulta em uma queda acentuada no uso do locus K de cadeia leve, acoplado a um aumento significativo no uso da cadeia leve X. Portanto, embora um camundongo humanizado que perde a região intergênica seja usado para que possa produzir anticorpos com domínios variáveis de cadeia leve de humano (por exemplo, domínios X ou k de humano), o uso a partir do locus diminui.

[000563] É também descrita a humanização do locus endógeno de cadeia leve k de camundongo com segmentos de gene VX e JX de humano acoplados a uma inserção de uma região intergênica k de humano para criar um locus VX que contém, com relação a transcrição, entre o segmento de gene VX final de humano e o primeiro segmento de gene JX de humano, uma região intergênica k; que exibe uma população de célula B com uma maior expressão de um locus que perde a região intergênica k. Esta observação é consistente com uma hipótese de que a região intergênica, diretamente até um transcrito estéril, ou indiretamente, suprime o uso do locus X endógeno de cadeia leve. Uma hipótese como esta, incluindo a região intergênica, pode resultar em uma diminuição no uso do locus X endógeno de cadeia leve, deixando o camundongo com uma escolha restrita, mas para empregar o locus modificado (X em k) para gerar anticorpos.

[000564] Em várias modalidades, uma substituição de sequência de cadeia leve k de camundongo a montante do gene Ck de camundongos com sequência de cadeia leve X de humano compreende adicionalmente uma região intergênica k de cadeia leve de humano disposta, com relação a transcrição, entre a região não traduzida 3’ do segmento de gene VX 3’ mais e 5’ no primeiro segmento de gene JX de humano. Alternativamente, uma região intergênica como esta pode ser omitida de um locus k endógeno de cadeia leve (a montante dos genes Ck de camundongo) substituído cruzando uma eliminação no locus X endógeno de cadeia leve. Do mesmo modo, nesta modalidade, o camundongo gera anticorpos de um locus k endógeno de cadeia leve contendo sequências de cadeia leve X de humano. Abordagens para modificar geneticamente camundongos para expressar domínios Vk de humano

[000565] São descritas várias abordagens para produzir camundongos geneticamente modificados que produzem anticorpos, que contêm uma cadeia leve que apresenta um domínio VX de humano fundido a uma região endógena CL (por exemplo, CK ou CX). São descritas modificações genéticas que, em várias modalidades, compreendem uma eliminação de um ou ambos os loci endógenos de cadeia leve. Por exemplo, para eliminar cadeias leves X de camundongo a partir do repertório de anticorpo endógeno, uma eliminação de um primeiro agrupamento de gene VX-JX-CX e substituição, por completo ou em parte, dos segmentos de gene VX-JX de um segundo agrupamento de gene com segmentos de gene VX-JX de humano pode ser produzida. Embriões, células, e construtos de alvejamento de camundongo geneticamente modificado para produzir os camundongos, embriões de camundongo, e células também são fornecidos.

[000566] A eliminação de um agrupamento de gene VX-JX-CX endógeno e a substituição dos segmentos de gene VX-JX de um outro agrupamento de gene VX-JX-CX endógeno emprega uma interrupção relativamente mínima na associação de região constante de anticorpo natural e função no animal, em várias modalidades, em decorrência de genes CX endógenos serem deixados intactos e, portanto, mantendo funcionalidade normal e capacidade de se associar com a região constante de uma cadeia pesada endógena. Assim, em tais modalidades, a modificação não afeta outras regiões constantes endógenas de cadeia pesada dependentes das regiões constantes funcionais de cadeia leve paraa montagem de uma molécula de anticorpo funcional contendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Adicionalmente, em várias modalidades, a modificação não afeta a montagem de uma molécula de anticorpo funcional ligada à membrana envolvendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve endógenas, por exemplo, um domínio hVk ligado a uma região Ck de camundongo. Em decorrência de pelo menos um gene Ck funcional ser mantido no locus endógeno, animais contendo uma substituição dos segmentos de gene Vk-Jk de um agrupamento de gene Vk-Jk-Ck endógeno por segmentos de gene Vk-Jk de humano podem ser capazes de produzir cadeias leves k normais, que são capazes de se ligar ao antígeno durante uma resposta imune até os segmentos de gene Vk-Jk de humano presentes no repertório expresso de anticorpo do animal.

[000567] Uma ilustração esquemática (não usada para classificação) de um agrupamento de gene Vk-Jk-Ck endógeno de camundongo eliminado é fornecida na FIG. 20. Da maneira ilustrada, o locus k de cadeia leve de camundongo é organizado em dois agrupamento de genes, ambos os quais contêm função de segmentos de gene capazes de recombinar para formar uma função cadeia leve k de camundongo. O agrupamento de gene endógeno Vk1- Jk3-Ck3-Jk1-Ck1 de camundongo é eliminado por um construto de alvejamento (Vetor de alvejamento 1) com um cassete de neomicina flanqueado por sítios de recombinação. O outro agrupamento de gene endógeno (Vk2-Vk3-Jk2-Ck2-Jk4-Ck4) é eliminado em parte por um construto de alvejamento (Vetor de alvejamento 2) com um cassete higromicina-timidina quinase flanqueado por sítios de recombinação. Neste segundo evento de alvejamento, os segmentos de gene Ck2-Jk4-Ck4 endógenos são mantidos. O segundo construto de alvejamento (Vetor de alvejamento 2) é construído usando sítios de recombinação que são diferentes daqueles no primeiro construto de alvejamento (Vetor de alvejamento 1), permitindo por meio disso a eliminação seletiva do cassete de seleção após um alvejamento satisfatório ter sido atingido. O locus duplamente alvejado que resulta é funcionalmente silenciado, em que nenhuma cadeia leve k endógena pode ser produzida. Este locus modificado pode ser usado para a inserção de segmentos de gene Vk e Jk de humano, para criar um locus k endógeno de camundongo compreendendo segmentos de gene VX e JX de humano, em que mediante recombinação no locus modificado, o animal produz cadeias leves X compreendendo segmentos de gene rearranjados VX e JX de humano ligados a um segmento de gene endógeno CX de camundongo.

[000568] Modificar geneticamente um camundongo para tornar segmentos de gene X endógenos não funcionais, em várias modalidades, resulta em um camundongo que exibe exclusivamente cadeias leves K em seu repertório de anticorpo, produzindo o camundongo usado para avaliar o papel de cadeias leves X na resposta imune, e usado para produzir um repertório de anticorpo compreendendo domínios Vk, mas não domínios VX.

[000569] Um camundongo geneticamente modificado que expressa um hVX ligado a um gene CX de camundongo, que é recombinado no locus endógeno de cadeia leve X de camundongo, pode ser produzido por qualquer método reconhecido na técnica. Uma ilustração esquemática (não usada para classificação) da substituição do segmentos de gene endógenos VX2-VX3-JX2 de camundongo por segmentos de gene VX e JX de humano é fornecida na FIG. 22A. Da maneira ilustrada, um locus endógeno de cadeia leve X de camundongo que foi tornado não funcional é substituído por um construto de alvejamento (Vetor de alvejamento 12/1-X) que inclui um cassete de neomicina flanqueado por sítios de recombinação. Os segmentos de gene VX2-VX3-JX2 são substituídos por um fragmento genômico contendo sequência X de humano, que inclui 12 segmentos de gene hVX e um único segmento de gene hJX.

[000570] Assim, esta primeira abordagem posiciona um ou mais segmentos de gene hVX no locus X endógeno de cadeia leve contígua com um único segmento de gene hJX (FIG. 22A).

[000571] As modificações adicionais no locus X endógeno modificado de cadeia leve podem ser atingidas usando técnicas similares para inserir mais segmentos de gene hVX. Por exemplo, ilustrações esquemáticas de dois construtos de alvejamento adicionais (vetores de alvejamento +16-X e +12-X) usados para inserção progressiva da adição de segmentos de gene hVX de humano são fornecidas na FIG. 23A. Da maneira ilustrada, fragmentos genômicos adicionais contendo segmentos de gene hVX específicos de humano são inseridos no locus X endógeno modificado de cadeia leve, em etapas sucessivas, usando homologia fornecida pela inserção prévia de sequências de cadeia leve X de humano. Mediante recombinação com cada construto de alvejamento ilustrado, de maneira sequencial, 28 segmentos de gene hVX adicionais são inseridos no locus X endógeno modificado de cadeia leve. Isto cria um locus quimérico que produz uma proteína de cadeia leve X que compreende segmentos de gene VX-JX de humano ligados a um gene CX de camundongo.

[000572] As abordagens anteriores para inserir segmentos de gene de cadeia leve X de humano no locus X de camundongo, mantêm os melhoradores posicionados a jusante dos segmentos de gene CX2-JX4-CX4 (determinados Enh 2.4, Enh e Enh 3.1 FIG. 22A e FIG. 23A). Esta abordagem resulta em um único alelo modificado no locus endógeno de cadeia leve X de camundongo (FIG. 25A).

[000573] Composições e métodos para produzir um camundongo que expressa uma cadeia leve compreendendo segmentos de gene hVX e JX operavelmente ligados a um segmento de gene CX de camundongo, são fornecidos, incluindo composições e método para produzir um camundongo que expressa tais genes a partir de um locus endógeno de cadeia leve X de camundongo. Os métodos incluem ternar seletivamente um agrupamento de gene VX-JX-CX endógeno de camundongo não funcional (por exemplo, por uma eliminação alvejada), e empregar um segmento de gene hVX e JX no locus endógeno de cadeia leve X de camundongo para expressar um domínio hVX em um camundongo.

[000574] Alternativamente, em uma segunda abordagem, segmentos de gene de cadeia leve X de humano podem ser posicionados no locus K endógeno de cadeia leve. A modificação genética, em várias modalidades, compreende uma eliminação do locus k endógeno de cadeia leve. Por exemplo, para eliminar cadeias leves k de camundongo a partir do repertório de anticorpo endógeno, pode ser produzida uma eliminação dos segmentos de gene Vk e Jk de camundongos. Embriões, células, e construtos de alvejamento de camundongo geneticamente modificado para produzir os camundongos, embriões de camundongo, e células também são fornecidos.

[000575] Por razões declaradas anteriormente, a eliminação dos segmentos de gene Vk e Jk de camundongos emprega uma interrupção relativamente mínima. Uma ilustração esquemática (não usada para classificação) de segmentos de gene Vk e Jk eliminados de camundongo é fornecida na FIG. 21. Os segmentos de gene Vk e Jk endógenos de camundongo são eliminados por meio de eliminação mediada por recombinase de posição das sequências de camundonga entre dois vetores de alvejamento exatamente posicionados, empregando cada qual sítios de recombinação específica para sítio. Um primeiro vetor de alvejamento (vetor de alvejamento Jk) é empregado em um primeiro evento de alvejamento para eliminar os segmentos de gene Jk de camundongo. Um segundo vetor de alvejamento (vetor de alvejamento Vk) é empregado em um segundo evento de alvejamento sequancial para eliminar uma sequência localizada 5’ do segmento de gene Vk de camundongo mais distal. Ambos os vetores de alvejamento contêm sítios de recombinação específica para sítio, permitido por meio disso a eliminação seletiva de ambos os cassetes de seleção e de toda a sequência de intervenção de cadeia leve k de camundongos após um alvejamento satisfatório ser atingido. O locus eliminado resultante é silenciado funcionalmente, em que nenhuma cadeia leve k endógena pode ser produzida. Este locus modificado pode ser usado para a inserção de segmentos de gene hVX e JX para criar um locus k endógeno de camundongo compreendendo segmentos de gene IIVA e JX,em que, mediante recombinação no locus modificado, o animal produz cadeias leves X compreendendo segmentos de gene rearranjados hVX e JX, operavelmente ligados a um segmento de gene CK endógeno de camundongo. Vários vetores de alvejamento compreendendo sequências de cadeia leve X de humano podem ser usados junto com este locus k eliminado de camundongo para criar um locus híbrido de cadeia leve contendo segmentos de gene X de humano operavelmente ligados com uma região Ck de camundongo.

[000576] Assim, em uma segunda abordagem, um ou mais segmentos de gene VX de humano são posicionados no locus k de cadeia leve de camundongo contíguo com um único segmento de gene JX de humano (Vetor de alvejamento 12/1-k, FIG. 22B).

[000577] Em várias modalidades, modificações nesta abordagem podem ser produzidas para adicionar segmentos de gene e/ou sequências regulatórias para otimizar o uso das sequências de cadeia leve X de humano do locus k de camundongo no repertório de anticorpo de camundongo.

[000578] Em uma terceira abordagem, um ou mais segmentos de gene hVX são posicionados no locus k de camundongo de cadeia leve contígua com quatro sequências de gene hJX (Vetor de alvejamento 12/4-k, FIG. 22B).

[000579] Em uma terceira abordagem, um ou mais segmentos de gene hVX são posicionados no locus k de camundongo de cadeia leve contígua com uma sequência intergênica k de humano e uma única sequência de gene hJX (Vetor de alvejamento 12(k)1-k, FIG. 22B).

[000580] Em uma quarta abordagem, um ou mais segmentos de gene hVX são posicionados no locus k de camundongo de cadeia leve contígua com uma sequência intergênica k de humano e quatro sequências de gene hJX (12(k)4-k Vetor de alvejamento FIG. 22B).

[000581] Todas as abordagens anteriores para inserir segmentos de gene de cadeia leve X de humano no locus k de camundongo, mantêm o elemento melhorador intrônico K a montante do gene CK (determinado EKÍ, FIG. 22B e FIG. 23B) e o melhorador K 3’ a jusante do gene CK (determinado EK3’, FIG. 22B e FIG. 23B). As abordagens resultam em quatro alelos modificados separados no locus k endógeno de camundongo de cadeia leve (FIG. 25B).

[000582] Em várias modalidades, camundongos geneticamente modificados compreendem uma inativação do locus endógeno de cadeia leve X de camundongo. Em uma modalidade, o locus X de cadeia leve é inativado por uma estartégia que elimina a região que espaça de VX2 a JX2, e a região que espaça de VX1 a CX1 (FIG. 20). Qualquer estratégia que reduz ou elimina a capacidade do locus X endógeno de cadeia leve expressar os domínio X endógenos é adequada para uso com modalidades nesta revelação. Anticorpos com domínio lambda de camundongos geneticamente modificados

[000583] Camundongos compreendendo sequências X de humano tanto no locus de cadeia leve k quanto X de camundongo expressarão uma cadeia leve que compreende uma região hVX fundida a uma região CL de camundongo (Ck ou CX). Estes são vantajosamente cruzados com os camundongos que (a) compreendem um locus de cadeia leve funcionalmente silenciado (por exemplo, uma inativação do locus k ou X endógeno de cadeia leve de camundongo); (b) compreendem um locus endógeno de cadeia leve X de camundongo que compreende segmentos de gene hV e hJ operavelmente ligados a um gene endógeno CX de camundongo; (c) compreendem um locus endógeno de cadeia leve k de camundongo que compreende segmentos de gene hVk e hJk operavelmente ligados a um gene Ck endógeno de camundongo; e, (d) um camundongo em que um alelo k compreende hVks e hJks; o outro alelo k compreendendo hVXs e hJXs; um alelo X compreendendo hVXs e hJXs e um alelo X silenciado ou iativado, ou ambos os alelos X compreendendo hVXs e hJXs; e, dois alelos de cadeia pesada compreendendo cada qual hVHs, hDHs, e hJHs.

[000584] Os anticorpos que compreendem os domínios hVX expressos no contexto tanto de CK quanto de CX são usados para produzir anticorpos completamente humanos, clonando os ácidos nucleicos que codificam os domínios hVX em construtos de expressão que carregam genes que codificam CX humano. Os construtos de expressão resultantes são transfectados em células hospedeiras adequadas para expressar anticorpos que exibem um domínio completamente hVX fundido a hCX.

EXEMPLOS

[000585] Os exemplos a seguir são fornecidos de maneira a descrever como produzir e usar métodos e composições da invenção, e não pretende-se que sejam limitantes do escopo no qual os inventores relatam como sua invenção. A menos que de outra maneira indicada, a temperatura é indicada em Celsius, e a pressão é atmosférica ou próxima a esta. Exemplo 1. Humanização de genes de imunoglobulina de camundongo

[000586] Os cromossomos artificiais bacterianos de humano e de camundongo (BACs) foram usados para modificar geneticamente 13 diferentes vetores de alvejamento BAC (BACvecs) para humanização dos loci de cadeia pesada e cadeia leve k de imunoglobulina de camundongos. Tabelas 1 e 2 apresentam descrições detalhadas das etapas realizadas para a construção de todos os BACvecs empregados na humanização dos loci de cadeia pesada e cadeia leve k de imunoglobulina de camundongo, respectivamente.

[000587] Identificação de BACs de humano e camundongo. BACs de camundongo que espaçam as extremidades 5’ e 3’ dos loci de cadeia pesada e cadeia leve k de imunoglobulina foram identificados por hibridização de filtros manchados com biblioteca de BAC ou por seleção de PCR de biblioteca de camundongo de agrupamentos de DNA de BAC. Os filtros foram hibridizados em condições padrões usando sondas que correspondem às regiões de interesse. Os agrupamentos de biblioteca foram selecionados por PCR usando pares de oligonucleotídeo iniciador exclusivos que flanqueiam a região de interesse alvejada. A PCR adicional usando os mesmos oligonucleotídeos iniciadores foi realizada para deconvoluir um poço isolado e isolar o BAC de interesse correspondente. Tanto os filtros de BAC quanto os agrupamentos de biblioteca foram gerados a partir de células ES de camundongo 129 SvJ (Incyte Genomics/Invitrogen). Os BACs de humano que apresentam os loci inteiros de cadeia pesada e cadeia leve K de imunoglobulina foram identificados tanto por hibridização de filtros manchados com biblioteca de BAC (Caltech B, C, ou D libraries & RPCI-11 libraries, Research Genetics/Invitrogen) quanto por seleção de agrupamentos de biblioteca de BAC de humano (Caltech biblioteca, Invitrogen) por um método a base de PCR ou usando uma base de dados de sequência final de BAC (Caltech D library, TIGR).

[000588] Construção de BACvecs por recombinação e ligação homóloga bacteriana. Recombinação homóloga bacteriana (BHR) foi realizada da maneira descrita (Valenzuela et al., 2003; Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J.P., e Stewart, A.F. (1998). A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat Genet 20, 123-128). Em muitos casos, fragmentos lineares foram gerados ligando caixas de homologia derivadas de PCR aos cassetes clonados, seguido por isolamento em gel de produtos de ligação e eletroporação em bactérias compententes para BHR que carregam o BAC alvo. Após seleção em placas de Petri com antibióticos adequados, BACs recombinados corretamente foram identificados por PCR em ambas as junções inéditas seguido por análise de restrição em géis de campo pulsado (Schwartz, D.C., e Cantor, C.R. (1984). Separation of yeast chromossome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell 37, 67-75) e verificação de mancha por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores distribuídos pelas sequências de humano.

[000589] Um BACvec 3hVH foi construído usando três etapas sequenciais de BHR para a etapa inicial de humanização do locus de cadeia pesada de imunoglobulina (FIG. 4A e Tabela 1). Na primeira etapa (Etapa 1), um cassete foi introduzido em um BAC parental de humano a montante do segmento de gene VH1-3 de humano, que contém uma região de homologia com o locus de cadeia pesada de imunoglobulina (HB1) de camundongo, um gene que confere resistência à canamicina em bactérias e resistência à G418 em células G418 (kanR), e um sítio de recombinação específica para sítio (por exemplo, loxP). na segunda etapa (Etapa 2), um segundo cassete foi introduzido exatamente a jusante do último segmento JH que contém uma segunda região de homologia com o locus de cadeia pesada de imunoglobulina (HB2) de camundongo, e um gene que confere resistência em bactérias à espectinomicina (specR). Esta segunda etapa incluiu eliminar locus de cadeia pesada de sequências de imunoglobulina de humano a jusante do gene JH6 e de resistência ao cloranfenicol do vetor BAC (cmR). Na terceiro etapa (Etapa 3), o BAC de humano duplamente modificado (B1) foi então linearizado usando sítios I-CeuI que foram adicionados durante as primeiras duas etapas e integrados em um BAC de camundongo (B2) por BHR até as duas regiões de homologia (HB1 e HB2). As seleções de medicamento para a primeira (cm/kan), segunda (spec/kan) e terceira (cm/kan) etapas foram determinadas para serem específicas para os produtos desejados. Os clones modificados de BAC foram analisados por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), após a digestão com enzimas de restrição para determinar construção apropriada (FIG. 4B).

[000590] Em uma maneira similar, 12 BACvecs adicionais foram geneticamente modificados por humanização dos loci de cadeia pesada e cadeia leve K. Em alguns exemplos, a ligação ao BAC foi realizada no lugar de BHR para co-unir dois BACs grandes até a introdução de sítios de restrição raros em ambos os BACvecs parentais por BHR, junto com substituição cuidadosa de marcadores selecionáveis. Isto permitiu a sobrevivência do produto de ligação desejado mediante seleção com combinações de marcador de medicamento específico. Os BACs recombinantes obtidos por ligação após a digestão com raras enzimas de restrição foram identificados e selecionados em uma maneira similar àqueles obtidos por BHR (da maneira descrita anteriormente).

[000591] Modificação de célula do tronco embrionário (ES)s e geração de camundongos. O alvejamento de célula ES (F1H4) foi realizado usando o método de alteração genética VELOCIGENE®, da maneira descrita (Valenzuela et al., 2003). A derivação de camundongos a partir de células ES modificadas tanto por blastocisto (Valenzuela et al., 2003) quanto por injeção de 8 células (Poueymirou et al., 2007) foi da maneira descrita. As células ES e camundongos alvejados foram confirmados selecionando DNA de células ES ou camundongos com conjuntos exclusivos de sondas e oligonucleotídeos iniciadores em um ensaio a base de PCR (por exemplo, FIG. 3A, 3B e 3C). Todos os estudos com camundongo foram observados e aprovados por Regeneron’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

[000592] Análise do cariótipo e hibridização fluorescente in situ (FISH). Análise do cariótipo foi realizada por Coriell Cell Repositories (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). FISH foi realizada em células ES alvejadas, da maneira descrita (Valenzuela et al., 2003). Sondas que correspondem tanto ao DNA de BAC de camundongo quanto o DNA de BAC de humano foram marcadas por tradução com corte (Invitrogen) com os espectro laranja ou espectro verde de nucleotídeos dUTP marcados de maneira fluorescente (Vysis).

[000593] Locus de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina. Humanização da região variável do locus de cadeia pesada foi atingida em nove etapas sequenciais pela substituição direta de cerca de três milões de pares de bases (Mb) de sequência genômica contígua de camundongo contendo todos os segmentos de gene VH, DH e JH com cerca de um Mb de sequência de humano genômica contígua contendo os segmentos de gene equivalentes humano (FIG. 1A e Tabela 1), usando tecnologia de alteração genética VELOCIGENE® (ver, por exemplo, patente U.S. 6.586.251 e Valenzuela et al., 2003).

[000594] O intron entre segmentos de gene JH e genes de região constante (o intron J-C) contém um melhorador transcricional (Neuberger, M.S. (1983). Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells. Embo J 2, 1373-1378), seguido por uma região de repetições simples exigidas para recombinação durante a troca de isotipo (Kataoka, T., Kawakami, T., Takahashi, N., e Honjo, T. (1980). Rearrange of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavya-chain class switch. Proc Natl Acad Sci U S A 77, 919-923). A junção entre região VH-DH-JH de humano e a região CH de camundongo (a junção proximal) foi escolhida para manter o melhorador intrônico de cadeia pesada de camundongo e trocar o domínio a fim de conservar tanto a expressão eficiente quanto a classe trocando o locus humanizado de cadeia pesada nos camundongo. A posição exata do nucleotídeo destas e subsequentes junções em todas as substituições foi possível pelo uso do método DE ALTERAÇÃO GENÉTICA VELOCIGENE® (supra), que empregou a recombinação homóloga bacteriana direcionada pelos oligonucleotídeos sintetizados. Assim, a junção proximal foi colocada cerca de 200 bp a jusante do último segmento de gene JH e a junção distal foi colocada a várias centenas a montante do segmento de gene VH 5’ mais do locus de humano, e cerca de 9 kb a jusante do segmento de gene VH1-86 de camundongo, também conhecido como J558.55. O segmento de gene VH1-86 (J558.55) de camundongo é o segmento de gene variável de cadeia pesada mais distal, relatado como um pseudogene em camundongos C57BL/6, mas potencialmente ativos, no entanto com pouca sequência RSS, no alelo alvejado 129. A extremidade distal do locus de cadeia pesada de camundongos pode conter supostamente elementos de controle que regulam a expressão e/ou rearranjo do locus (Pawlitzky et al., 2006).

[000595] Uma primeira inserção de sequência de DNA de imunoglobulina de humano no camundongo foi atingida usando 144 kb da extremidade proximal do locus de cadeia pesada de humano contendo 3 segmentos de gene VH, todos os 27 DH e 9 JH de humano inseridos na extremidade proximal do locus IgH de camundongos, com uma eliminação concomitante de 16,6 kb de sequência genômica de camundongo, usando cerca de 75 kb de braços de homologia de camundongo (Etapa A, FIG. 2A; Tabelas 1 e 3, 3hVH). Esta grande inserção de 144kb e que acompanha a eliminação de 16,6 kb foi realizada em uma única etapa (Etapa A), que ocorreu com uma frequência de 0,2 % (Tabela 3). As células ES corretamente alvejadas foram selecionadas por uma ensaio de perda de alelo natural (LONA) (Valenzuela et al., 2003) usando sondas e flanqueando a sequência eliminada de camundongo, e na sequência de humano inserida, e a integridade da grande inserção de humano foi verificada usando múltiplas sondas que espaçam completamente a inserção (FIG. 3A, 3B e 3C). Em decorrência de muitos ciclos de alvejamento sequencial de célula ES serem antecipados, os clones de célula ES alvejada nesta etapa, e em todas as subsequentes, foram submetidos à análise cariotípica (supra) e apenas aqueles clones que exibem cariótipos normais em pelo menos 17 de 20 dispersões foram utilizados nas etapas subsequentes.

[000596] As células ES alvejadas da etapa A foram re-alvejadas com um BACvec que produziu uma eliminação de 19 kb na extremidade distal do locus de cadeia pesada (Etapa B, FIG. 2A). BACvec da etapa B continha um gene de resistência à higromicina (hyg), ao contrário do gene de resistência à neomicina (neo) contido no BACvec da etapa A. Os gene de resistência dos dois BACvecs foram determinados de maneira tal que, mediante alvejamento satisfatório no mesmo cromossomo, aproximadamente três locus de gene variável de cadeia pesada Mb dos camundongos contendo todos os camundongos segmentos de gene VH, sem ser VH1-86, e todos os segmentos de gene DH, sem ser DQ52, bem como os dois gene de resistência, foram flanqueados pelos sítios loxP; DQ52 e todos os segmentos de gene da cadeia JH dos camundongos foram eliminados na etapa A. Os clones de célula ES duplamente alvejados no mesmo cromossomo foram identificados direcionando o cassete proximal 3hVH para homozigosidade em G418 elevado (Mortensen, R.M. et al. (1992) Producttion of homozygot mutant ES cells with a single targeting consctruto. Mol Cell Biol 12, 2391-2395), e após o destino do cassete distal hyg. Os segmentos até quatro Mb em tamanho de camundongo, foram modificados de uma maneira serem flanqueados pelos sítios loxP, foram eliminados satisfatoriamente em células ES por expressão transiente de recombinase CRE com eficiências elevadas (até ~11 %), mesmo na ausência de seleção de medicamento (Zheng, B. et al. (2000) Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Mol Cell Biol 20, 648-655). De uma maneira similar, os inventores atingiram uma eliminação de três Mb em 8 % dos clones de célula ES após a expressão transiente de CRE (Etapa C, FIG. 2A; Tabela 3). A eliminação foi selecionada pelo ensaio LONA usando sondas tanto na extremidade da sequência eliminada de camundongo, bem como na perda de neo e hyg e no aparecimento de um produto de PCR por meio do ponto de eliminação contendo apenas o sítio loxP restante. Adicionalmente, a eliminação foi confirmada por hibridização por fluorescência in situ (dados não mostrados).

[000597] O restante da região variável de cadeia pesada de humano foi adicionado ao alelo 3hVH em uma série de 5 etapas, usando o método de alteração genética VELOCIGENE® (Etapas E-H, FIG. 2B), com cada etapa envolvendo a inserção exata de até 210 kb de sequências de gene humano. Para cada etapa, a extremidade proximal de cada novo BACvec foi determinada para se sobrepor na sequência mais distal de humanos da etapa prévia, e na extremidade distal de cada novo BACvec contido na mesma região distal de homologia com camundongo, da maneira usada na etapa A. Os BACvecs das etapas D, F e H continham cassetes de seleção neo, ao passo que aqueles das etapas E e G continham cassetes de seleção hyg, assim, as seleções foram alternadas entre G418 e higromicina. O alvejamento na etapa D foi ensaiado pela perda do produto de PCR exclusivo por meio do sítio loxP distal do alelo híbrido 3hVH. O alvejamento das etapas E até I foi ensaiado pela perda do cassete de seleção prévio. Na etapa final (Etapa I, FIG. 2B), o cassete de seleção neo flanqueado pelos sítios Frt (McLeod, M. et al. (1986) Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination on the Saccharomyces cerevisiae plasmide 2 microns circle. Mol Cell Biol 6, 33573367), foi removido pela expressão transiente de FLPe (Buchholz, F. et al. (1998) Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol 16, 657-662). As sequências de humano dos BACvecs para as etapas D, E e G foram derivadas de dois BACs parentais de humano cada, ao passo que aqueles da etapas F e H foram de um único BACs. A retenção de sequências de humano foi confirmada em cada etapa usando múltiplas sondas espaçando a sequência de humanos inserida (da maneira descrita anteriormente, por exemplo, FIG. 3A, 3B e 3C). Apenas aqueles clones com cariótipo normal e linhagem germinativa potencial foram usados em cadaetapa. As células ES da etapa final foram ainda capazes de contribuir com a linhagem germinativa após nove manipulações sequenciais (Tabela 3). Os camundongos homozigotos para cada alelo de cadeia pesada estavam viáveis, aparentemente saudáveis e demonstravam um sistema imune humoral essencialmente tipo selvagem (ver Exemplo 3).

[000598] Locus K de gene variável de cadeia leve de imunoglobulina. A região variável de cadeia leve K foi humanizada em oito etapas sequenciais pela substituição direta de cerca de três Mb de sequência de camundongo contendo todos os segmentos de gene Vk e Jk, com cerca de 0,5 Mb de sequência de humano contendo os segmentos de gene Vk e Jk proximais de humano de uma maneira similar àquela da cadeia pesada (FIG. 1B; Tabelas 2 e 4).

[000599] A região variável do locus k de cadeia leve de humano contém duas repetições quase idênticas de 400 kb separadas por um espaçador de 800 kb (Weichhold, G.M. et al. (1993) The human immunoglobulin kappa locus consists in two copies that are organized in opposite polarity. Genomics 16, 503-511). Em decorrência de as repetições serem tão similares, quase toda a diversidade do locus pode ser reproduzida em camundongos usando a repetição proximal. Adicionalmente, um alelo natural de humano do locus k de cadeia leve que perde a repetição distal foi relatado (Schaible, G. et al. (1993) The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals. Hum genet 91, 261-267). Os inventores substituiram cerca de três Mb de sequência de gene variável de cadeia leve K de camundongo por cerca de 0,5 Mb de sequência de gene variável de cadeia leve K de humano, para substituir eficientemente todos os segmentos de gene Vk e Jk de camundongos pelos segmentos de gene proximais Vk de humano e todos os segmentos de gene Jk de humano (FIG. 2C e 2D; Tabelas 2 e 4). Ao contrário do método descrito no exemplo 1 para o locus de cadeia pesada, a região inteira do gene Vk de camundongo, contendo todos os segmentos de gene Vk e Jk, foi eliminada em um processo de três etapa antes de qualquer sequência de humano ser adicionada. Primeiro, um cassete neo foi introduzido na extremidade proximal da região variável (Etapa A, FIG. 2C). A seguir, um cassete hyg foi inserido na extremidade distal do locus k (Etapa B, FIG. 2C). Os sítios LoxP foram novamente situados em cada cassete de seleção, de maneira tal que o tratamento de CRE induziu a eliminação de 3 Mb restantes da região Vk de camundongos junto com ambos os genes de resistência (Etapa C, FIG. 2C).

[000600] Um fragmento genômico de humano de cerca de 480 kb em tamanho, contendo a região variável inteira de cadeia leve k de imunoglobulina, foi inserido em quatro etapas sequenciais (FIG. 2D; Tabelas 2 e 4), com até 150 kb de sequência de cadeia leve k de imunoglobulina de humano inserida em uma única etapa, usando métodos similares àqueles empregados para a cadeia pesada (ver exemplo 1). O gene de resistência à higromicina final foi removido por expressão transiente de FLPe. Assim como na cadeia pesada, os clones de célula ES alvejados foram avaliados em relação à integridade da inserção total em humano, cariótipo normal e potencial de linhagem germinativa após cada etapa. Camundongos homozigotos para cada um dos alelos de cadeia leve k foram gerados e observou-se que eram saudáveis e de aparência normal.

Exemplo 2. Geração de Camundongos completamente humanizados por combinação de múltiplos alelos de imunoglobulina humanizada

[000601] Em vários pontos, as células ES que carregam uma porção do repertórios variáveis de cadeia pesada ou cadeia leve K de imunoglobulina de humano, da maneira descrita no exemplo 1, foram microinjetadas e os camundongos resultantes foram cruzados para criar múltiplas versões de camundongos VELOCIMMUNE® com frações progressivamente maiores dos repertórios de imunoglobulina da linhagem germinativa de humano (Tabela 5; FIG. 5A e 5B). Os camundongos VELOCIMMUNE® 1 (V1) possuem 18 segmentos de gene VH de humano e todos os segmentos de gene DH e JH de humano combinados com 16 segmentos de gene Vk de humano e todos os segmentos de gene Jk de humano. Os camundongos VELOCIMMUNE® 2 (V2) e VELOCIMMUNE® (V3) tiveram maiores repertórios variáveis que carregam um total de 39 VH e 30 Vk, e 80 VH e 40 Vk, respectivamente. Uma vez que as regiões genômicas que codificam os segmentos de gene VH, DH e JH de camundongo, e segmentos de gene Vk e Jk foram completamente substituídas, os anticorpos produzidos por qualquer versão de camundongos VELOCIMMUNE® contém regiões variáveis de humano ligadas às regiões constantes de camundongo. Os loci de cadeia leve X de camundongo permanecem intactos em todas as versões dos camundongos VELOCIMMUNE®, e funcionam como um comparador para a eficiência de expressão do vários loci de cadeia leve k de VELOCIMMUNE®.

[000602] Camundongos duplamente homozigoto tanto para humanização de cadeia pesada quanto cadeia leve K de de imunoglobulina foram gerados a partir de um subconjunto do alelos descritos no exemplo 1. Todos os genótipos observados durante o curso de cruzar para gerar os camundongos duplamente homozigotos ocorreram em proporções aproximadamente mendelianas. A progênie de macho homozigoto para cada um dos alelos de cadeia pesada de humano mostrou fertilidade reduzida. A fertilidade reduzida resultou da perda de atividade de ADAM6 de camundongo. O locus de gene variável de cadeia pesada de camundongo contém dois genes funcionais de ADAM6 inseridos (ADAM6a e ADAM6b). Durante a humanização do locus de gene variável de cadeia pesada de camundongo, a sequência genômica inserida de humano continha um pseudogene ADAM6. ADAM6 de camundongo pode ser exigido para fertilidade, e assim a perda do gene de ADAM6 de camundongos em loci de gene variável de cadeia pesada humanizada pode levar à fertilidade reduzida nestes camundongos, apesar da presença do pseudogene humano. Exemplos 7-9 descrevem a substituição exata do gene de ADAM6 eliminado de camundongo colocado em um locus do gene variável de cadeia pesada humanizado, e a recuperação de um nível de fertilidade tipo selvagem em camundongos com um locus humanizado de cadeia pesada de imunoglobulina.

Exemplo 3. Populações de linfócito em camundongos com genes humanizados de imunoglobulinas

[000603] As populações de célula B madura nas três diferentes versões de camundongos VELOCIMMUNE® foram avaliadas por citometria de fluxo.

[000604] Resumidamente, as suspensões de célula da medula óssea, baço e timo foram produzidas usando métodos padrões. As células foram ressuspensas em 5x105 células/mL em tampão de coloração BD Pharmingen FACS, bloqueadas com anti-camundongo CD16/32 (BD Pharmingen), coradas com o coquetel apropriado de anticorpos e fixas com BD Cytofix™, tudo de acordo com as instruções do fabricante. Os precipitados de célula finais foram ressuspensos em 0,5 mL de tampão de coloração e analisados usando um software BD FACSCALIBUR™ e BD CELLQUEST PRO™. Todos os anticorpos (BD Pharmingen) foram preparados em uma diluição/coquetel de massa e adicionados em uma concentração final de 0,5 mg/105 células. Os coquetéis de anticorpo para corar a medula óssea (A-D) foram da seguinte maneira: A: anti-camundongo IgMb-FITC, anti- camundongo IgMa-PE, anti-camundongo CD45R(B220)-APC; B: anti- camundongo CD43(S7)-PE, anti-camundongo CD45R(B220)-APC; C: anti- camundongo CD24(HSA)-PE; anti-camundongo CD45R(B220)-APC; D: anti-camundongo BP-1-PE, anti-camundongo CD45R(B220)-APC. Os coquetéis de anticorpo para corar baço e linfonodo inguinal (E-H) foram da seguinte maneira: E: anti-camundongo IgMb-FITC, anti-camundongo IgMa- PE, anti-camundongo CD45R(B220)-APC; F: anti-camundongo Ig, □ I, D2, □ 3 Cadeia leve-FITC, anti camundongo IgK-PE de cadeia leve, anti- camundongo CD45R(B220)-APC; G: anti-camundongo Ly6G/C-FITC, anti- camundongo CD49b(DX5)-PE, anti-camundongo CD11b-APC; H: anti- camundongo CD4(L3T4)-FITC, anti-camundongo CD45R(B220)-PE, anti- camundongo CD8a-APC. Os resultados são mostrados na FIG. 6.

[000605] Os linfócitos isolaados do baço ou linfonodo de camundongos homozigoto VELOCIMMUNE® foram corados para a expressão de superfície dos marcadores B220 e IgM e analisados usando citometria de fluxo (FIG. 6). Os tamanhos das populações de célula B madura B220+ IgM+ em todas as versões de camundongos VELOCIMMUNE® testados foram virtualmente idênticos àqueles de camundongos tipo selvagem, independente do número de segmentos de gene VH que continha. Além disso, camundongos contendo loci híbridos homozigotos de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada, mesmo aqueles com apenas 3 segmentos de gene VH, mas normais para loci de cadeia leve K de imunoglobulina de camundongo ou camundongos contendo loci homozigotos híbridos humanizados de cadeia leve k com loci normais de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, também apresentaram números normais de células B220+ IgM+ em compartimentos periféricos (não mostrado). Estes resultados indicam que loci quiméricos com regiões constantes de segmentos de gene V variávies de humano e camundongo podem aumentar a população completamente de compartimento de célula B madura. Adicionalmente, o número de segmentos de genes variáveis tanto nos loci de cadeia pesada quanto de cadeia leve k, e assim na diversidade teórica do repertório de anticorpo, não se correlaciona com a capacidade de gerar populações tipo selvagem de células B maduras. Ao contrário, os camundongos com transgenes de imunoglobulina completamente humanos e integrados aleatoriamente e loci inativados de imunoglobulina de camundongo apresentam números reduzidos de células B nestes compartimentos, com a gravidade do déficit dependendo do número de segmentos de gene variáveis incluídos no transgene (Green, L.L., e Jakobovits, UM. (1998). Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes. J Exp Med 188, 483-495). Isto demonstra que a estratégia de “humanização genética in sito” resulta em uma resposta funcional fundamentalmente diferente dos transgenes integrados aleatoriamente, atingidos na abordagem “inativação-e-transgênico”.

[000606] Exclusão alélica e rscolha de locus. A capacidade de manterm exclusão alélica foi examinda em camundongos heterozigotos para as diferentes versões do locus humanizado de cadeia pesada de imunoglobulina.

[000607] A humanização dos loci de imunoglobulina foi realizada em uma linhagem F1 ES (F1H4 (Valenzuela et al., 2003)), derivada de embriões heterozigotos 129S6/SvEvTac e C57BL/6NTac. As sequências de gene variáveis de cadeia pesada da linhagem germinativa de humano são alvejadas no alelo 129S6, que carrega o halotipo IgMa, ao passo que o alelo não modificado C576BL/6N de camundongo carrega o halotipo IgMb. Estas formas alélicas de IgM podem ser distinguidas por citometria de fluxo usando anticorpos específicos aos polimorfismos encontrados nos alelos IgMa ou IgMb. Da maneira mostrada na FIG. 6 (fileira inferior), as células B identificadas em camundongos heterozigotos para cada versão do locus humanizado de cadeia pesada expressam apenas um único alelo, tanto IgMa (o alelo humanizado) quanto IgMb (o alelo tipo selvagem). Isto demonstra que os mecanismos envolvidos em exclusão de alélico são intactos em camundongos VELOCIMMUNE®. Além disso, o número relativo de células B positivas para o alelo humanizado (IgMa) é provavelmente proportional ao número de segmentos de gene VH presentes. O locus humanizado de imunoglobulina é expresso em aproximadamente 30 % das células B em camundongos heterozigotos VELOCIMMUNE® 1, apresentam 18 segmentos de gene VH de humano, e em 50 % das células B em camundongos heterozigotos VELOCIMMUNE® 2 e 3 (não mostrado), com 39 e 80 segmentos de gene VH de humano, respectivamente. De maneira notável, a razão de células que expressam o alelo de camundongo humanizado versus tipo selvagem (0,5 para camundongos VELOCIMMUNE® 1 e 0,9 para camundongos VELOCIMMUNE® 2) é mais da razão do número de segmentos de gene variáveis contido nos loci humanizados versus tipo selvagem (0,2 para camundongos VELOCIMMUNE® 1 e 0,4 para camundongos VELOCIMMUNE® 2). Isto pode indicar que a probabilidade de escolha de alelo é intermediária entre uma escolha aleatória de um ou outro cromossomo, e uma escolha aleatória de qualquer RSS de segmento V particular. Adicionalmente, pode existir uma fração de células B, mas não todas, em que um alelo se torna acessível para recombinação, completa o processo e desativa a recombinação antes do outro alelo se tornar acessível. Além disso, a mesma distribuição de células que apresenta IgM de superfície (sIgM) derivada tanto do locus humanizado híbrido de cadeia pesada quanto do locus de cadeia pesada de camundongo tipo selvagem é evidência de que o locus híbrido é funcional em um nível normal. Ao contrário, os transgenes de imunoglobulina de humano integrados aleatoriamente competem muito pouco com os loci de imunoglobulina de camundongo tipo selvagem (Bruggemann, M. et al. (1989) A repertoire of monoclonal antibodie with human heavy chains from transgenic mice. PNAS 86, 6709-6713; Green et al., 1994; Tuaillon, N. et al. (1993) Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu and gamma transcripts. Proc Natl Acad Sci U S UM 90, 3720-3724). Isto demonstra adicionalmente que as imunoglobulinas produzidas por camundongos VELOCIMMUNE® são funcionalmente diferentes daquelas produzidas por transgenes integrados aleatoriamente em camundongos produzidos por abordagens “inativação-e-transgênico”.

[000608] Polimorfismos das regiões CK não são disponíveis em 129S6 ou C57BL/6N para examinar a exclusão de alélico de loci de cadeia leve K humanizados versus não humanizados. Entretanto, os camundongos VELOCIMMUNE® possuem todos loci de cadeia leve X de camundongo tipo selvagem, portanto, é possível observar se o rearranjo e expressão de loci de cadeia leve k humanizados podem prevenir a expressão de cadeia leve X de camundongo. A razão do número de células que expressam a cadeia leve k humanizada com relação ao número de células que expressam cadeia leve X de camundongo foi relativamente não alterada em camundongos VELOCIMMUNE®, comparado aos camundongos tipo selvagem, independente do número de segmentos de gene VK de humano inseridos no locus K de cadeia leve (FIG. 6, terceira linha a partir da superior). Além disso, não existe nenhum aumento no número de células duplamente positivas (k e X), indicando que a recombinação produtiva nos loci híbridos de cadeia leve K resulta na supressão adequada de recombinação dos loci de cadeia leve X de camundongos. Ao contrário, os camundongos contendo transgenes de cadeia leve k integrados aleatoriamente com loci inativados de cadeia leve k de camundongo, mas loci de cadeia leve X de camundongo tipo selvagem, exibem razões X/k muito acentuadas (Jakobovits, 1998), implicando que os transgenes introduzidos de cadeia leve k não funcionam bem em tais camundongos. Isto demonstra adicionalmente as diferentes respostas funcionais observadas em imunoglobulinas produzidas por camundongos VELOCIMMUNE®, comparado àqueles produzidos por camundongos “inativação-e-transgênico”.

[000609] Desenvolvimento de célula B. Em decorrência das populações de célula B madura em camundongos VELOCIMMUNE® se assemelhar àquelas de camundongos tipo selvagem (descrito anteriormente), é possível que os defeitos na diferenciação de célula B inicial sejam compensados pela expansão de populações de célula B madura. Os vários estágios de diferenciação de célula B foram examinados por análise de populações de célula B usando citometria de fluxo. A tabela 6 apresenta a razão da fração de células em cada linhagem de célula B definida por FACs, usando marcadores de superfície celular específicos, em camundongos VELOCIMMUNE® comparados aos filhotes tipo selvagem.

[000610] O desenvolvimento inicial de célula B ocorre na medula óssea, e diferentes estágios de diferenciação de célula B são caracterizados por alterações nos tipos e quantidades de expressão de marcador de superfície de célula. Estas diferenças na expressão da superfície estão relacionadas com as alterações moleculares que ocorrem no loci de imunoglobulina dentro da célula. A transição pró-B para pré-célula B exige o rearranjo e expressão satisfatórios de proteína de cadeia pesada funcional, embora a transição do pre-B para o estágio B maduro seja admimistrado pelo rearranjo e expressão corretos de uma cadeia leve K ou X. Assim, a transição ineficiente entre os estágios de diferenciação de célula B pode ser detectada por alterações nas populações relativas de células B em um dado estégio.

[000611] Nenhum defeito importante foi observado na diferenciação de célula B em qualquer dos camundongos VELOCIMMUNE®. A introdução de segmentos de gene D de cadeia pesada de humano não parece afetar a transição de pró-B para pré-B, e a introdução de segmentos de gene de cadeia leve k de humano não afeta a transição de pré-B para B em camundongos VELOCIMMUNE®. Isto demonstra que as moléculas “reversas quiméricas” de imunoglobulina, que possuem regiões variáveis de humano e constantes de camundongo, funcionam normalmente no contexto de sinalização de célula B e moléculas co-receptoras, levando à diferenciação adequada de célula B em um ambiente de camundongo. Ao contrário, o equilíbrio entre as diferentes populações durante a diferenciação de célula B é perturbado em diferenes variações em camundongos que contêm transgenes de imunoglobulina aleatoriamente integrados e loci endógenos inativados de cadeia pesada ou cadeia leve k (Green e Jakobovits, 1998). Exemplo 4. Repertório de gene variável em camundongos com imunoglobulina humanizada

[000612] O uso de segmentos de gene variáveis de humano no repertório humanizado de anticorpo de camundongos VELOCIMMUNE® foi analisado por reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa (RT- PCR) de regiões variáveis de humano, a partir de múltiplas fontes, incluindo esplenócitos e célula de hibridomas. A sequência de região variável, segmento de gene usado, hipermutação somática e diversidade juncional de segmentos de gene rearranjados de região variável foram determinados.

[000613] Resumidamente, o RNA total foi extraído de 1 x 107-2 x 107 esplenócitos ou cerca de 104-105 célula de hibridomas usando TRIZOL™ (Invitrogen) ou estojo Qiagen RNEASY™ Mini (Qiagen), e preparado com oligonucleotídeos iniciadores específicos de região constante de camundongo usando o sistema SUPERSCRIPT™ III One-Etapa RT-PCR (Invitrogen). As reações foram realizadas com 2-5 μL de RNA de cada amostra usando o oligonucleotídeos iniciadores específicos de 3’ constante anteriormente mencionados, pareados com oligonucleotídeos iniciadores principais agrpados para cada família de regiões variáveis de humano, tanto para a cadeia pesada quanto a cadeia leve K, separadamente. Os volumes de reagentes e oligonucleotídeos iniciadores e as condições de RT-PCR/PCR foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. As sequências de oligonucleotídeos iniciadores basearam-sem em múltiplas fontes (Wang, X. e Stollar, B.D. (2000) Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR. J Immunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen). Onde adequado, reações de PCR aninhadas e secundárias foram realizadas com oligonucleotídeos iniciadores de estrutura específica de família agrupados e o mesmo oligonucleotídeo iniciador específico de imunoglobulina constante 3’ de camundongo usado na reação principal. Aliquotas (5 μL) de cada reação foram analisadas por eletroforese em agarose e os produtos de reação foram purificados a aprtir da agarose usando um estojo de extração em gel MONTAGE™ (Millipore). Os produtos purificados foram clonados usando o sistema de clonagem TOPO™ TA (Invitrogen) e transformados em células DH10β de E.coli por eletroporação. Os clones individuais foram selecionados de cada reação de transformação e crescidos em 2 mL de cultura em caldo LB com seleção de antibiótico, por toda a noite, a 37 oC. O DNA plasmidial foi purificado a partir de culturas bacterianas por uma abordagem baseada em estojo (Qiagen).

[000614] Uso de gene variável de imunoglobulina. DNA plasmidial de ambos os clones de cadeia pesada e cadeia leve K foram sequenciados tanto com oligonucleotídeos iniciadores reversos T7 quanto com M13 no analisador genético ABI 3100 (Applied Biosystems). Os dados brutos de sequência foram importados em SEQUENCHER™ (v4.5, Gene Codes). cada sequência foi montada em sequências contíguas e alinhadas em sequências de imunoglobulina de humano usando pesquisa de função de IMGT V-Quest (Brochet, X., Lefranc, M.P., e Giudicelli, V. (2008). IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG e TR standardized V-J e V-D- J sequence analysis. Nucleic acids Res 36, W503-508) para identificar o uso de segmento VH, DH, JH e Vk e Jk de humano. Sequências foram comparadas com as sequências de linhagem germinativa por análise de junção de hipermutação somática e recombinação junction.

[000615] Camundongos foram gerados a partir de células ES contendo a modificação de cadeia pesada inicial (Alelo híbrido 3hVH-CRE, parte inferior da FIG. 2A) por complementação de RAG (Chen, J. et al. (1993) RAG-2- deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4528-4532), e DNAc foi preparado a partir do RNA de esplenócito. O DNAc foi amplificado usando conjuntos de oligonucleotídeo iniciador (descritos anteriormente) específicos para o RNAm de cadeia pesada quimérico previsto, que pode se originar por recombinação de V(D)J nos segmentos de gene de humano inseridos e na união subsequente de cada um dos domínios constantes IgM ou IgG de camundongo. As sequências derivadas destes clones de DNAc (não mostrado) demonstraram que a recombinação ideal de V(D)J ocorreu nas sequências de gene variável de humano, que os segmentos de gene V(D)J rearranjados de humano foram unidos adequadamente em alinhamento com os domínios contantes de camundongo e que a recombinação por troca de classe não ocorreu. Análises adicionais de sequência de produtos de RNAm de loci híbridos subsequentes de imunoglobulina foram realizadas.

[000616] Em um experimento similar, as células B de camundongos tipo selvagem não imunizados e VELOCIMMUNE® fora separadas por citometria de fluxo, com base na expressão superficial de B220 e IgM ou IgG. As células de superfície B220+ IgM+ ou IgG+ (sIgG+) foram agrupadas e as sequências VH e VK foram obtidas após a amplificação de RT-PCR e clonagem (descrita anteriormente). O uso representativo de gene em um conjunto de DNAcs amplificados por RT-PCR, a partir de camundongos VELOCIMMUNE® 1 não imunizados (Tabela 7) e camundongos VELOCIMMUNE® 3 (Tabela 8), foi registrado (*RSS defectivo; fsem sentido ou pseudogene).

[000617] Da maneira mostrada nas tabelas 7 e 8, quase todos os segmentos de gene VH, DH, JH, Vk e Jk funcionais de humano são utilizados. Dos segmentos de gene variáveis funcionais descritos, mas não detectados nos camundongos VELOCIMMUNE® deste experimento, vários foram relatados por possuir sequências de sinal de recombinação defectivas (RSS) e, assim, não se espera que sejam expressos (Feeney, A.J. (2000) Factors that influence formation of B cell repertoire. Immunol Res 21, 195-202). A análise de vários outros conjuntos de sequências de imunoglobulina de vários camundongos VELOCIMMUNE®, isolados tanto de repertórios naive quanto imunizados, foi usada nestes segmentos de gene, no entanto em frequências menores (dados não mostrados). Os dados de uso de gene agregado mostraram que todos os segmentos de gene VH, DH, JH, VK e JK funcionais de humano contidos em camundongos VELOCIMMUNE® foram observados em vários repertórios de naive e imunizados (dados não mostrados). Embora o segmento de gene VH7-81 de humano tenha sido identificado na análise de locus de sequências de cadeia pesada de humano (Matsuda, F. et al. (1998) The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. J Exp Med 188, 2151-2162), não está presente nos camundongos VELOCIMMUNE® confirmados por re-sequenciamento do genoma inteiro de camundongo VELOCIMMUNE® 3.

[000618] As sequências de pesada e cadeia leve de anticorpos são conhecidas por mostrar variabilidade excepcional, especialmente em segmentos curtos de polipeptídeos no domínio variável rearranjado. Estas regiões, conhecidas como regiões hipervariáveis ou regiões de determinação complementar (CDRs) criam o sítio de ligação para antígeno na estrutura da molécula de anticorpo. As sequências de polipeptídeo de intervenção são denominadas regiões de estrutura (FRs). Existem três CDRs (CDR1, CDR2, CDR3) e 4 FRs (FR1, FR2, FR3, FR4) tanto em cadeias pesadas quanto leves. uma CDR, CDR3, é exclusiva, em que esta CDR é criada por recombinação de ambos os segmentos de gene VH, DH e JH e Vk e Jk, e gera uma quantidade significativa de diversidade de repertório antes do antígeno ser encontrado. Esta união é imprecisa em virtude de ambas as eliminações de nucleotídeo por meio da atividade de exonuclease e adições codificadas sem molde por meio de desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) e, assim, permite que as sequências inéditas resultem do processo de recombinação. Embora FRs possam mostrar mutação somática substancial em virtude da elevada mutabilidade da região variável como um todo, a variabilidade não é, entretanto, distribuída através da região variável. CDRs são regiões concentradas e localizadas de alta variabilidade na surface da molécula de anticorpo, que permite a ligação de antígeno. As sequências de cadeia pesada e de cadeia leve dos anticorpos selecionados de camundongos VELOCIMMUNE® em torno da junção CDR3, que demonstram diversidade juncional, são mostradas na FIG. 7A e 7B, respectivamente.

[000619] Da maneira mostrada na FIG. 7A, adições de nucleotídeo condificado sem molde (adições N) são observadas em ambos as uniões VH- DH e DH-JH em anticorpos de camundongos VELOCIMMUNE®, indicando função ideal de TdT com os segmentos de humano. Os pontos finais dos segmentos VH, DH e JH com relação aos seus semelhantes de linhagem germinativa indicam que a atividade de exonuclease também ocorreu. Ao contrário do locus de cadeia pesada, os rearranjos de cadeia leve K de humano exibem pouca ou nenhuma adição TdT em CDR3, que é formada pela recombinação dos segmentos Vk e Jk (FIG. 7B). Isto é esperado em virtude da perda da expressão TdT em camundongos durante os rearranjos de cadeia leve na transição de pré-B para célula B. A diversidade observada na CDR3 de regiões Vk rearranjadas de humano é introduzida predominantemente até a atividade de exonuclease durante o evento de recombinação.

[000620] Hipermutação somática. A diversidade adicional é adicionada às regiões variáveis de genes rearranjados de imunoglobulina durante a reação do centro germinal por um processo denominado hipermutação somática. As células B que expressam regiões variáveis mutadas de maneira somática competem com outras células B para acessar o antígeno apresentado pelas células dendríticas foliculares. Estas células B com maior afinidade com o antígeno se expandirá adiconalmente e se submeterá à troca de classe antes de sair para a periferia. Assim, as células B que expressam isotipos trocados se deparam tipicamente com antígeno e se submetem às reações de centro germinal, e aumentarão os números de mutações com relação às células B naive. Adicionalmente, as sequências de região variável de células B predominantemente naive sIgM+ podem ser esperadas para apresentar mutações relativamente menores que as sequências variáveis de células B sIgG+, que se submetem à seleção de antígeno.

[000621] Sequências de clones aleatórios VH ou VK de células B sIgM+ ou sIgG+ de camundongos VELOCIMMUNE® não imunizados ou células B sIgG+ de camundongo imunizados foram comparadas com seus segemntos de gene variáveis de linhagem germinativa, e trocadas com relação à sequência de linhagem germinativa anotada. As sequências de nucleotídeo resultantes foram traduzidas in silico e as mutações que levaram às trocas de aminoácido também foram anotadas. Os dados foram coletados de todas as regiões variáveis e a troca percentual em uma dada posição foi calculada (FIG. 8).

[000622] Da maneira mostrada na FIG. 8, as regiões variáveis de cadeia pesada de humano derivadas de células B sIgG+ de camundongos VELOCIMMUNE® não imunizados exibem muito mais nucleotídeos em relação às células B sIgM+ B dos mesmos agrupamentos de esplenócito, e as regiões variáveis de cadeia pesada derivadas de camundongos imunizados exibem ainda mais alterações. O número de alterações é maior nas regiões de determinação de complementariade (CDRs) em relação às regiões de estrutura, indicando seleção de antígeno. As sequências de aminoácido correspondentes das regiões variáveis de cadeia pesada de humano também exibem números significativamente maiores de mutações em IgG vs IgM, e ainda mais em IgG imunizado. Estas mutações parecem novamente ser mais frequentes nas CDRs, comparada com as sequências de estrutura, sugerindo que os anticorpos foram selecionados por antígeno in vivo. Um aumento similar no número de mutações de nucleotídeo e aminoácidos é observado nas sequências VK derivadas de células B IgG+ de camundongo imunizados.

[000623] O uso do gene e hipermutação somática observado em camundongos VELOCIMMUNE® demonstra que essencialmente todos os segmentos de gene presentes são capazes de rearranjar para formar anticorpos quiméricos reversos completamente funcionais nestes camundongos. Adicionalmente, os anticorpos VELOCIMMUNE® participam totalmente do sistema imune do camundongo para se submeter à seleção e maturação por afinidade, para criar anticorpos compeltamente maduros de humano que podem neutralziar de maneira eficiente seu antígeno alvo. Os camundongos VELOCIMMUNE® são capazes de montar respostas imunes robustas para multiplicar classes de antígenos que resultam no uso de uma ampla faixa de anticorpos de humano, que são tanto de alta finidade quanto adequados para uso terapêutico (dados não mostrados). Exemplo 5. Análise de estrutura linfóide e isotipos séricos

[000624] As estruturas grossas de baço, linfonodos inguinais, placas de Peyer e timo de amostras de tecido dos camundongos tipo selvagem ou VELOCIMMUNE®, coradas com H&E, foram examinadas por microscopia de luz. Os níveis de isotipos de imunoglobulina no soro coletado de camundongos tipo selvagem e VELOCIMMUNE® foram analisados usando tecnologia LUMINEX™.

[000625] Estrutura do órgão linfóide. A estrutura e função dos tecidos linfóides são em parte dependentes do desenvolvimento adequado de células hematopoiéticas. Um defeito no desenvolvimento ou função de célula B pode ser exibido como uma alteração na estrutura dos tecidos linfóides. Mediante análise de secções de tecido corado, nenhuma diferença significativa na aparência de órgão linfóides secundários entre camundongos tipo selvagem e VELOCIMMUNE® foiidentificada (dados não mostrados).

[000626] Níveis séricos de imunoglobulina. O nível de expressão de cada isotipo é similar em camundongos tipo selvagem e VELOCIMMUNE® (FIG. 9A, 9B e 9C). Isto demonstra que a humanização dos segmentos de gene variáveis não aparenta efeito adverso mediante troca de classe ou expressão e secreção de imunoglobulina e, portanto, mantém aparentemente todas as sequências endógenas de camundongo necessárias para estas funções. Exemplo 6. Imunização e produção de anticorpo em camundongos com imunoglobulina humanizada

[000627] Diferentes versões de camundongos VELOCIMMUNE® foram imunizados com antígeno para examinar a resposta humoral para desafiar o antígeno estrangeiro.

[000628] Imunização e desenvolvimento de hibridoma. Os camundongos VELOCIMMUNE® e tipo selvagem podem ser imunizados com um antígeno na forma de proteína, DNA, uma combinação de DNA e proteína, ou células que expressam o antígeno. Os animais são vacinados novamente, de maneira típica, a cada três semanas por um total de duas a três vezes. Após cada reforço de antígeno, amostras séricas de cada animal são coletadas e analisadas para respostas específicas de antígeno-anticorpo, por determinação da titulação sérica. Antes da fusão, os camundongos receberam um reforço final pré-fusão de 5 μg de proteína ou DNA, da maneira desejada, por meio de injeções intra-peritoniais e/ou intravenosas. Os esplenócitos são coletados e fundidos em células de mieloma Ag8.653 em uma câmara de eletrofusão, de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD). Dez dias após a cultura, os hibridomas são selecionados pela especificidade com antígeno usando um ensaio de ELISA (Harlow, E. e Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque). Alternativamente, antígenos especificos de células B são isolados diretamente de camundongos VELOCIMMUNE® imunizados e selecionados usando técnicas padrões, incluindo aquelas aqui descritas, para obter anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse.

[000629] Determinação da titulação sérica. Para monitorar as respostas séricas anti-antígeno do animal, amostras séricas são coletadas cerca de 10 dias após cada reforço e as titulações são determinadas usando ELISA específico do antígeno. Resumidamente, placas Nunc MAXISORP™ de 96 poços são revestidas com 2 μg/mL de antígeno por toda a noite a 4° C e bloqueadas com albumina sérica bovina (Sigma, St. Louis, MO). Amostras séricas em uma diluição seriada de 3 vezes são permitidas para se ligar às placas por uma hora em temperatura ambiente. As placas são então lavadas com PBS contendo 0,05 % de Tween-20 e a IgG ligada é detectada usando Fc anti-camundongo de cabra conjugado com HRP (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) para titulação total de IgG, ou isotipo marcado com biotina específico ou anticorpos policlonais específicos de cadeia leve (SouthernBiotech Inc.) para titulações de isotipo específico, respectivamente. Para os anticorpos marcados com biotina, após a lavagem da placa, estreptavidina conjugada com HRP (Pierce, Rockford, IL) é adicionada. Todas as placas são desenvolvidas usando sobstratos colorimétricos tais como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Após a reação parar com ácido fosfórico 1 M, as absorções óticas em 450 nm são registradas e os dados são analizados usando o software PRISM™ de Graph Pad. As diluições exigidas para obter dois tempos de sinal de fundo são definidas como titulação.

[000630] Em um experimento, camundongos VELOCIMMUNE® foram imunizados com receptor interleucina-6 de humano (hIL-6R). Um conjunto representativo de titulações séricas para camundongos VELOCIMMUNE® e tipo selvagem imunizados com hIL-6R é mostrado na FIG. 10A e 10B.

[000631] Os camundongos VELOCIMMUNE® e tipo selvagem montaram respostas fortes para o IL-6R com variações de titulação similar (FIG. 10A). Vários camundongos dos cohorts VELOCIMMUNE® e tipo selvagem atingiram uma resposta máxima após um único reforço de antígeno. Estes resultados indicam que a resposta imune reta e cinética para este antígeno foi similar nos camundongos VELOCIMMUNE® e tipo selvagem. Estas respostas específicas de antígeno-anticorpo foram analisadas adicionalmente para examinar os isotipos particulares dos anticorpos antígeno-especificos encontrados nos soros. Ambos os grupos de VELOCIMMUNE® e tipo selvagem elicitaram predominantemente uma resposta IgG1 (FIG. 10B), sugerindo que a troca de classe durante a resposta humoral seja similar em camundongos de cada tipo.

[000632] Determinação da afinidade de ligação de anticorpo com antígeno em solução. Um ensaio de competição de colução a base de ELISA é desenhado tipicamente para determinar a afinidade de ligação ao anticorpo com o antígeno.

[000633] Resumidamente, os anticorpos em meio condicionado são pré- misturados com diluições seriadas de proteína de antígeno que varia de 0 a 10 mg/mL. As soluções da mistra de anticorpo e antígeno são então incubadas por duas a quatro horas em temperatura ambiente para atingir o equilíbrio de ligação. As quantidades de anticorpo livre nas misturas são então medidas usando um ELISA sanduiche quantitativo. Placas MAXISORB™ de noventa e seis poços (VWR, West Chester, PA) são revestidas com 1 μg/mL de proteína de antígeno em solução PBS por toda a noite em 4 oC, seguido por bloqueio não específico de BSA. A mistura de soluções de anticorpo-antígeno são então transferidas para estas placas, seguido por uma hora de incubação. As placas são então lavadas com tampão de lavagem e os anticorpos ligados na placa foram detectados com um reagente de anticorpo policlonal anti- camundongo IgG de cabra conjugado com HRP (Jackson Immuno Research Lab), e desenvolvidos usando substratos colorimétricos tais como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Após a reação ser parada com ácido fosfórico 1 M, absorções óticas em 450 nm são registradas e os dados são analisados usando software PRISM™ da Graph Pad. A dependência dos sinais nas concentrações de antígeno em solução é analisada com um ajuste de 4 parâmetros e relatada como IC50, a concentração de antígeno exigida para atingir 50 % de redução do signal das amostras de anticorpo sem a presença de antígeno em solução.

[000634] Em um experimento, os camundongos VELOCIMMUNE® foram imunizados com hIL-6R (da maneira descrita anteriormente). As FIGS. 11A e 11B mostram um conjunto representativo de medições de afinidade para anticorpos anti-hIL6R de camundongos VELOCIMMUNE® e tipo selvagem.

[000635] Após os camundongo imunizados receberem um terceiro reforço de antígeno, as titulações séricas são determinadas por ELISA. Esplenócitos são isolados de cohorts selecionados de camundongo tipo selvagem e VELOCIMMUNE® e fundidos às células de mieloma Ag8.653 para formar hibridomas e crescidos em seleção (da maneira descrita anterior). De um total de 671 anti-IL-6R hibridomas produzidos, observou-se que 236 expressam anticorpos específicos para antígeno. Os meios coletados a partir dos poços positivos para antígeno foram usados para determinar a afinidade de anticorpo de ligação ao antígeno usando uma solução de ELISA por competição. Anticorpos derivados de camundongos VELOCIMMUNE® exibem uma ampla faixa de afinidade em se ligar ao antígeno em solução (FIG. 11A). Além disso, observou-se que 49 dos de 236 anti-IL-6R hibridomas bloquearam IL-6 de se ligar ao receptor em um em bioensaio in vitro (dados não mostrados). Adicionalmente, estes 49 anti-IL-6R que bloqueiam anticorpos exibiram uma faixa de solução de alta afinidade, similar àqueles anticorpos de bloqueio derivados da imunização paralela de camundongos tipo selvagem (FIG. 11B). Exemplo 7. Construção de um vetor de alvejamento de ADAM6 de camundongo

[000636] Um vetor de alvejamento para a inserção de genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo em um locus humanizado de cadeia pesada foi construído usando tecnologia de alteração genética VELOCIGENE® (supra) para modificar um cromossomo bacteriano artificial (BAC) 929d24, obtido do Dr. Fred Alt (Havard University). O DNA de BAC 929d24 foi geneticamente modificado para conter fragmentos genômicos contendo os genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo e um cassete de higromicina para eliminação alvejada de um pseudogene ADAM6 de humano (I1ADAM6T). localizado entre os segmentos de gene VH1-2 e VH6-1 de humano de um locus humanizado de cadeia pesada (FIG. 12).

[000637] Primeiro, um fragmento genômico contendo o gene ADAM6b de camundongo, ~800 bp da sequência a montante (5’) e ~4800 bp da sequência a jusante (3’), foi subclonado a partir do clone de BAC 929d24. Um segundo fragmento genômico contendo o gene ADAM6a de camundongo, ~300 bp da sequência a montante (5’) e ~3400 bp da sequência a jusante (3’), foi subclonado separadamente do clone BAC 929d24. Os dois fragmentos genômicos contendo os genes ADAM6b de camundongo e ADAM6 foram ligados a um cassete de higromicina flanqueado pelos sítios de recombinação Frt para criar o vetor de alvejamento (vetor de alvejamento ADAM6 de camundongo, FIG. 20; SEQ ID NO:3). Diferentes sítios de enzima de restrição foram geneticamente modificados na extremidade 5’ do vetor de alvejamento após o gene ADAM6b de camundongo, e na extremidade 3’ após o gene ADAM6a de camundongo (parte inferior da FIG. 12) para ligação no locus humanizado de cadeia pesada.

[000638] Uma modificação separada foi produzida em um clone de BAC contendo uma substituição do locus de cadeia pesada de camundongos pelo locus de cadeia pesada de humano, incluindo o pseudogene ADAM6 de humano localizado entre os segmentos de gene VH1-2 e VH6-1 de humano do locus humanizado para a ligação subsequente do vetor de alvejamento ADAM6 de camundongo (FIG. 13).

[000639] Resumidamente, um cassete de neomicina flanqueado pelos sítios de recombinação loxP foi geneticamente modificado para conter braços de homologia contendo a sequência de humano genômica em posições 3’ do segmento de gene VH1-2 de humano (5’ com relação a I1ADAM6T) e 5’ de segmento de gene VH6-1 de humano (3’ com relação a I1ADAM6T; ver a parte média da FIG. 13). A localização do sítio de inserção deste construto de alvejamento era cerca de 1,3 kb 5’ e ~350 bp 3’ do pseudogene ADAM6 de humano. O construto de alvejamento também incluiu os mesmos sítios de restrição como o vetor de alvejamento ADAM6 de camundongo para permitir subsequente ligação de BAC entre o clone de BAC contendo a eliminação do pseudogene ADAM6 de humano e o vetor de alvejamento ADAM6 de camundongo.

[000640] Apóa a digestão de DNA de BAC derivado de ambos os construtos, os fragmentos genômicos foram ligados juntos para construir um clone de BAC geneticamente modificado contendo um locus humanizado de cadeia pesada que contém uma sequência genômica ectopicamente colocada compreendendo sequências de nucleotídeo ADAM6a e ADAM6b de camundongo. O construto de alvejamento final para a eliminação de um gene de ADAM6 de humano em um locus humanizado de cadeia pesada, e inserção de sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo em células ES continha, de 5’ a 3’, um fragmento genômico 5’ contendo ~13 kb de sequência genômica de humano 3’ do segmento de gene VH1-2 de humano, ~800 bp de sequência genômica de camundonga a jusante do gene ADAM6b de camundongo, o gene ADAM6b de camundongo, ~4800 bp de sequência genômica a montante do gene ADAM6b de camundongo, um sítio 5’ Frt, um cassete de higromicina, um sítio 3’ Frt, ~300 bp de sequência genômica de camundongo a jusante do gene ADAM6a de camundongo, o gene ADAM6a de camundongo, ~3400 bp de sequência genômica de camundongo a montante do gene ADAM6a de camundongo, e um fragmento genômico 3’ contendo ~30 kb de sequência genômica de humano 5’ do segmento de gene VH6-1 de humano (parte inferior da FIG. 13).

[000641] O clone BAC geneticamente modificado (descrito anteriormente) foi usado para electroporarte células ES de camundonga que continha um locus humanizado de cadeia pesada para criar células ES modificadas compreendendo uma sequência genômica de camundonga, colocado ectopicamente, que compreende sequências de ADAM6a e ADAM6b de camundongo em um locus humanizado de cadeia pesada. As células ES positivas contendo o fragmento genômico ectópico de camundongo no locus humanizado de cadeia pesada foram identificadas por um ensaio de PCR quantitativa usando sondas TAQMAN™ (Lie, Y.S. e Petropoulos, C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5’nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48). As regiões a montante e a jusante fora da porção modificada do locus humanizado de cadeia pesada foram confirmadas por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores e sondas localizadas na região modificada, para confirmar a presença da sequência genômica ectópica de camundongo no locus humanizado de cadeia pesada, bem como no cassete de higromicina. A sequência de nucleotídeo através da do ponto de inserção a montante incluiu a seguinte, que indica a sequência genômica de cadeia pesada de humano a montante do ponto de inserção e um sítio de restrição I-Ceu I (contido nos parênteses a seguir) ligado contiguamente à sequência genômica de camundongo presente no ponto de inserção: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEQ ID NO:4). A sequência de nucleotídeo através so ponto de inserção a jusante na extremidade 3’ da região alvejada incluiu a seguinte, que indica sequência genômica de camundongo e um sítio de restrição PI-Sce I (contido nos parênteses a seguir) ligado contiguamente com a sequência de cadeia pesada de humano genômica a jusante do ponto de inserção: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT) ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG (SEQ ID NO:5).

[000642] As células ES alvejadas descritas anteriormente foram usadas como célula ES doadoras e introduzidas em um embrião de camundongo no estágio de 8-células pelo método de modificação genética de camundongo VELOCIMOUSE® (ver, por exemplo, patentes U.S. 7.6598.442, 7.576.259, 7.294.754). Camundongos que carregam um locus humanizado de cadeia pesada contendo uma sequência genômica ectópica de camundongo compreendendo sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo foram identificadas por genotipagem, usando um ensaio de modificação de alelo (Valenzuela et al., 2003) que detectou a presença dos genes de camundongo ADAM6a e ADAM6b no locus humanizado de cadeia pesada.

[000643] Camundongos que carregam um locus humanizado de cadeia pesada que contém genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo são cruzados com uma cepa eliminadora FLPe de camundongo (ver, por exemplo, Rodríguez, C.I. et al. (2000) ) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140) a fim de removee qualquer cassete de higromicina Frt’ed introduzido pelo vetor de alvejamento que não é removido, por exemplo, no estágio de célula ES ou no embrião. Opcionalmentey, o cassete de higromicina é mantido nos camundongos.

[000644] Os filhotes são genotipados e um filhote heterozigoto para um locus humanizado de cadeia pesada contendo um fragmento genômico ectópico de camundongo, que compreende as sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo, é selecionado para caracterizar o gene de ADAM6 de expressão e fertilidade de camundongo. Exemplo 8. Caracterização de camundongos com ADAM6 recuperado

[000645] Citometria de fluxo. Três camundongos em idade de 25 semanas, homozigoto para loci de gene variável de cadeia pesada de humano e cadeia leve K de humano (H/K), e três camundongos em idade de 18-20 semanas, homozigotos para cadeia pesada de humano e cadeia leve K de humano, com o fragmento genômico ectópico de camundongo que codifica os genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo em ambos os alelos do locus de cadeia pesada de humano (H/k-A6) foram sacrificados para identificação e análise de populações de célula de linfócito por FACs no sistema BD LSR II (BD Bioscience). Os linfócitos foram ligados por linhagens celulare específicas e analisados por progressão até vários estágios de desenvolvimento de célula B. Os tecidos coletados dos animais incluiram sangue, baço e medula óssea. O sangue foi coletado em tubos BD microtainer com EDTA (BD Biosciences). Medula óssea foi coletada dos fêmures nivelando com meio RPMI completo e suplementado com soro fetal bovino, piruvato de sódio, HEPES, 2-mercaptoetanol, aminoácidos essenciais e gentamicina. As células vermelhas do sangue a partir ds preparações de sangue, baço e medula óssea foram lisadas com um tampão de lise a base de cloreto de amônio (por exemplo, tampão de lise ACK), seguido por lavagem com meio completo RPMI.

[000646] Para a coloração de populações de células, 1 x 106 células das várias fontes de tecido foram incubadasted com anti-camundongo CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) no gele por 10 minutos, seguido por marcação com um ou uma combinação dos seguintes coquetéis de anticorpo por 30 minutos no gelo.

[000647] Medula óssea: anti-camundongo FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences).

[000648] Sangue periférico e baço: anti-camundongo FITC-K (187.1, BD Biosciences), PE-X (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (1452C11, BD), A700-CD19 (1D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience). Após a incubação com os anticorpos marcados, as células foram lavadas e fixas em 2 % de formaldeído. Os dados de aquisição foram realizados em um citômetro de fluxo LSRII e analisados com FlowJo. Os resultados representativos de um camungondo H/k e H/k-A6 são mostrados nas FIGS. 14 - 18.

[000649] Os resultados demonstram que as células B de camundongos H/k-A6 progridem até os estágios de desenvolvimento de célula B, em uma maneira similar aos camundongos H/k na medula óssea e compartimentos periféricos, e mostram padrões normais de maturação, uma vez que entram na periferia. Os camundongos H/k-A6 demonstraram uma maior população de célula CD43intCD19+ comparado aos camundongos H/k (FIG. 16B). Isto pode indicar uma expressão de IgM acelerada a partir do locus humanizado de cadeia pesada, contendo um fragmento genômico ectópico de camundongo compreendendo as sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo em camundongos H/k-A6. No periferia, as populações e células B e T de camundongos H/k-A6 parecem normais e similares aos camundongos H/k.

[000650] Morfologia de testículos e caracterização de espermatozoide. Para determinar se a infertilidade em camundongos com loci variáveis humanizados de cadeia pesada de imunoglobulina é em virtude de defeitos na produção de testículos e/ou espermatozoide, a morfologia de testículos e conteúdo de espermatozoide do epidídimo foram examinados.

[000651] Resumidamente, os testículos de dois grupos de cinco camundongos por grupo (Grupo 1: camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e cadeia leve K de humano, mADAM6-/-; Grupo 2: camundongos heterozigoto para loci de gene variável de cadeia pesada de humano e homozigoto para loci de gene variável de cadeia leve k, mADAM6+/-) foram dissecados com o epidídimo intacto e pesados. Os espécimes foram então fixos, mergulhados em parafina, seccionados e corados com corante hematoxilina e eosina (HE). As secções de testículos (2 testes por camundongo, por um total de 20) foram examinadas em relação aos defeitos na morfologia e evidência de produção de espermatozoide, enquanto as secções de epidídimo foram examinadas pela presença de espermatozoide.

[000652] Neste experimento, nenhuma diferença no peso ou morfologia dos testículos foi observada entre camundongos mADAM6-/- e camundongos mADAM6+/-. O espermatozoide foi observado em todos os genótipos, tanto no testículo quanto no epidídimo. Estes resultados estabelecem que a ausência de genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo não leva a alterações detectáveis na morfologia dos testículos, e que o espermatozoide é produzido em camundongos na presença e ausência destes dois genes. As deficiências na fertilidade de camundongos ADAM6-/- machos são, portanto, não provavelmente em virtude da pouca produção de espermatozoide.

[000653] Motilidade e migração de espermatozoide. Camundongos que perdem outros elementos da família do gene ADAM são inférteis em virtude de defeitos na motilidade ou migração de espermatozoide. A migração de espermatozoide é definida como a capacidade do espermatozoide passar do útero no oviduto, e é em geral necessário para a fertilização em camundongos. Para determinar se a eliminação de ADAM6a e ADAM6b de camundongo afeta este processo, a migração de espermatozoide foi avaliada em camundongos mADAM6-/-. A motilidade de espermatozoide também foi examinada.

[000654] Resumidamente, espermatozoide foi obtido de testes de (1) camundongos heterozigoto para loci de gene variável de cadeia pesada de humano e homozigoto para loci de gene variável de cadeia leve K de humano (ADAM6+/-); (2) camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada de humano e homozigoto para loci de gene variável de cadeia leve k de humano (ADAM6-/-); (3) camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada de humano e homozigoto para cadeia leve k tipo selvagem (ADAM6-/-mk); e, (4) camundongos tipo selvagem C57 BL/6 (WT). Nenhuma anormalidade signifiativa foi observada na contagem de espermatozoide ou motilidade geral de espermatozoide por inspeção. Para todos os camundongos, a dispersão cumulus foi observada, indicando que cada amostra de espermatozoide era capaz de penetrar nas células de cumulus e se ligar à zona pelúcida in vitro. Estes resultados estabelecem que camundongos ADAM6-/- apresentam espermatozoides que são capazes de penetrar o cumulus e se ligar à zona pelúcida.

[000655] Fertilização de camundongo in vitro (IVF) foi realizada usando espermatozoide de camundongos da maneira descrita anteriormente. Um pequeno número de embriões clivados estava presente para ADAM6-/- no dia seguinte da IVF, bem como um número reduzido de espermatozoides se ligou aos óvulos. Estes resultados establelecem que espermatozoides de camundongos ADAM6-/-, uma vez expostos a um óvulo, são capazes de penetrar o cumulus e se ligar à zona pelúcida.

[000656] Em um outro experimento, a capacidade de espermatozoide de camundongos ADAM6-/- migrarem do útero até o oviduto foi determinada em um ensaio de migração de espermatozoide.

[000657] Resumidamente, um primeiro grupo de cinco camundongos fêmeas superovuladas foi acasalado com cinco machos ADAM6-/-. Um segundo grupo de cinco camundongos fêmeas superovulados foi acasalado com cinco machos ADAM6+/-. Os pares de cruzamento foram observado por cópula, e cinco a seis horas após a cópula o útero e oviduto anexado de todas as fêmeas foram removido e corados para análise. As soluções de coloração foram verificadas por óvulos para verificar a ovulação e obter uma contagem de espermatozoide. A migração de espermatozoide foi avaliada de duas maneiras diferentes. Primeiro, ambos os ovidutos foram removidos do útero, lavados com salina, e qualquer espermatozoide identificado foi contado. A presença de óvulos também foi observada como evidência de ovulação. Segundo, os ovidutos foram deixados anexados ao útero e ambos os tecidos foram fixos, mergulhados em parafina, seccionados e corados (da maneira descrita anteriormente). As secções foram examinadas em relação à presença de espermatozoide, tanto no útero quanto nos ovidutos.

[000658] Para as cinco fêmeas acasaladas com os cinco machos ADAM6-/-, muito pouco espermatozoide foi encontrado na solução corada do oviduto. As soluções coradas dos ovidutos das cinco fêmeas acasaladas com os cinco machos ADAM6+/- exibiram um nível de espermatozoide de cerca de 25- a 30 vezes maior (média, n = 10 ovidutos) do que o presente nas soluções coradas dos ovidutos das cinco fêmeas acasaladas com os cinco machos ADAM6-/-.

[000659] As secções histológicas de útero e oviduto foram preparadas. As secções foram examinadas pela presença de espermatozoide no útero e no oviduto (o colículo tubário). A inspeção de secções histológicas de oviduto e útero revelaram que para os camundongos fêmeas acasalados com camundongos ADAM6-/-, espermatozoide foi encontrado no útero, mas não no oviduto. Adicionalmente, as secções de fêmeas acasaladas com camundongos ADAM6-/- revelaram que o espermatozoide não foi encontrado na junção úterotubal (UTJ). Em secções de fêmeas acasaladas com camundongos ADAM6+/-, o espermatozoide foi identificado no UTJ e no oviduto.

[000660] Estes resultados estabelecem que camundongos que perdem os genes ADAM6a e ADAM6b produzem espermatozoides que exibem um defeito na migração in vivo. Em todos os casos, o espermatozoide foi observado no útero, indicando que a cópula e liberação de espermatozoide correm aparentemente de maneira normal, mas pouco ou nenhum espermatozoide foi observado nos ovidutos após a cópula, da maneira medida tanto por contagem de espermatozoide quanto por observação histológica. Estes resultados estabelecem que camundongos que perdem os genes ADAM6a e ADAM6b produzem espermatozoides que exibem uma incapacidade de migrar do útero para o oviduto. Este defeito leva aparentemente a infertilidade, em decorrência do espermatozoide ser incapaz de cruzar a junção uterina-túbulo no oviduto, onde os óvulos são fertilizados. Obtidos juntos, todos estes resultados convergem para auxiliar a hipótse de que o gene de ADAM6 de camundongos auxilia diretamente o espermatozoide com motilidade normal a migrar para fora do útero, até a junção útero-tubal e no oviduto e, assim, aborda um óvulo para atingir o evento de fertilização. O ecanismo pelo qual ADAM6 atinge isto pode ser diretamente por ação das proteínas ADAM6, ou até expressão coordenada com outras proteínas, por exemplo, outras proteínas ADAM, na célula de espermatozoide, da maneira descrita a seguir.

[000661] Expressão do gene da família ADAM. Um complexo de proteínas ADAM são conhecidos como presentes como um complexo na superfície de espermatozoide que está amadurecendo. Camundongos que perdem outros elementos de gene da família ADAM perdem este complexo como espermatozoide maduro, e exibem uma redução de múltiplas proteínas ADAM no espermatozoide maduro. Para determinar se uma perda de genes ADAM6a e ADAM6b afeta outras proteínas ADAM de uma maneira similar, Western blots de extratos de proteína dos testículos (espermatozoide imaturo) e epidídimo (espermatozoide amadurecendo) foram analisados para determinar os níveis de expressão de outros elementos de gene da família ADAM.

[000662] Neste experimento, extratos de proteína foram analisados a partir de quatro camundongos ADAM6-/- e quatro ADAM6+/-. Os resultados mostram que a expressão de ADAM2 e ADAM3 não foi afetada em extratos de testículos. Entretanto, tanto ADAM2 quanto ADAM3 foram muito reduzidos nos extratos de epidídimo. Isto demonstra que a ausência de ADAM6a e ADAM6b em espermatozoide de camundongos ADAM6-/- pode apresentar um efeito direto na expressão e, talvez, na função de outras proteínas ADAM como espermatozoides maduros (por exemplo, ADAM2 e ADAM3). Isto sugere que ADAM6a e ADAM6b são parte de um complexo de proteína ADAM na superfície de espermatozoide, que pode ser importante para a migração adequada de espermatozoide. Exemplo 9. Utilização de gene variável de cadeia pesada de humano em camundongos que recuperam ADAM6

[000663] O uso de gene variável de cadeia pesada de humano selecionado foi determinado para camundongos homozigotos para loci de gene variável de cadeia pesada e leve K de humano, tanto perdendo osgenes ADAM6a e ADAM6b de camundongo (mADAM6-/-) quanto contendo um fragmento genômico ectópico que codifica genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo (ADAM6+/+; ver exemplo 1) por um ensaio de PCR quantitativa usando sondas TAQMAN™ (da maneira descrita anteriormente).

[000664] Resumidamente, células B CD19+ foram purificadas dos baços de camundongos mADAM6-/- e ADAM6+/+ usando microesferas de camundongo CD19 (Miltenyi Biotec), e o RNA total foi purificado usando o estojo RNEASY™ Mini (Qiagen). O RNA genômico foi removido usando um tratamento em coluna de DNAse livre de RNase (Qiagen). Cerca de 200 ng de RNAm foram transcritos reversamente em DNAc usando o estojo de síntese First Stand DNAc (Invitrogen), e a seguir foram amplificados com a mistura principal TAQMANTM Universal PCR (Applied Biosystems) usando o sistema de detecção de sequência ABI 7900 (Applied Biosystems). A expressão relativa de cada gene foi normalizada no constante K de camundongo (mCK). Tabela 9 apresenta as combinações de sonda sentido/antissenso/TAQMANTM MGB usadas neste experimento.

[000665] Neste experimento, a expressão de todos os quatro genes VH de humano foi observada nas amostra analisadas. Adicionalmente, os níveis de expressão foram comparáveis entre camundongos mADAM6-/- e ADAM6+/+. Estes resultados demonstram que os genes VH de humano que foram tanto distais no sítio de modificação (VH3-23 e VH1-69) quanto proximais no sítio de modificação (VH1-2 e VH6-1) também foram capazes de recombinar para formar uma cadeia pesada de humano funcionalmente expressa. Estes resultados demonstram que o fragmento genômico ectópico compreendendo sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo inseridas em uma sequência de cadeia pesada de humano genômica não afetou a recombinação de segmentos de gene V(D)J e cadeia pesada de de humano no locus, e estes camundongos são capazes de recombinar segmentos de gene D e cadeia pesada de humano de maneira normal para produzir proteínas de cadeia pesada funcional de imunoglobulina. Exemplo 10. Eliminação dos loci de cadeia leve de imunoglobulina de camundongos

[000666] Vários construtos de alvejamento foram produzidos usando tecnologia VELOCIGENE® (ver, por exemplo, patente U.S. 6.586.251 e Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652- 659) para modificar as bibliotecas genômicas de cromossomo bacteriano artificial de camundongo (BAC), para inativar os loci de cadeia leve K e X.

[000667] Eliminação do locus k de cadeia leve de camundongos. O DNA do clone de BAC RP23-135k15 de camundongo (Invitrogen) foi modificado por recombinação homóloga para inativar o locus endógeno de cadeia leve X de camundongo até a eliminação alvejada do agrupamento de gene VX-JX-CXs (FIG. 20).

[000668] Resumidamente, o agrupamento proximal inteiro, compreendendo segmentos de gene VX1-JX3-CX3-JX1-CX1, foi eliminado em um único evento de alvejamento usando um vetor de alvejamento que compreende um cassete de neomicina flanqueado pelos sítios loxP, com um braço de homologia 5’ de camundongo contendo a sequência 5’ do segmento de gene VX1 e um braço de homologia 3’ de camundongo contendo a sequência 3’ do segmento de gene CX1 (FIG. 20, Vetor de alvejamento 1).

[000669] Um segundo construto de alvejamento foi preparado para eliminar exatamente o agrupamento de gene X distal endógeno de camundongo contendo VX2-JX2-CX2-JX4-CX4, com a exceção de que o construto de alvejamento continha um braço de homologia 5’ de camundongo que continha a sequência 5’ do segmento de gene VX2, e um braço de homologia 3’ de camundongo que continha sequência 5’ do segmento de gene endógeno CX2 (FIG. 20, Vetor de alvejamento 2). Assim, o segundo construto de alvejamento eliminou exatamente VX2-JX2, deixando ao mesmo tempo CX2-JX4-CX4 intacto no locus X endógeno de camundongo. As células ES contendo um locus X endógeno inativado (da maneira descrita anteriormente) foram confirmadas por cariotipagem e métodos de seleção (por exemplo, TAQMAN®) conhecidos na técnica. O DNA foi então isolado das células ES modificadas e submetido ao tratamento com recombinase CRE, mediado por meio disso a eliminação do cassete de alvejamento proximal contendo o gene marcador de neomicina, deixando apenas um único sítio loxP no ponto de eliminação (FIG. 20, parte inferior).

[000670] Eliminação do locus K de cadeia leve de camundongos. Vários construtos de alvejamento foram produzidos usando métodos similares descritos anteriormente para modificar DNA de clones BAC de camundongo RP23-302g12 e RP23-254m04 (Invitrogen), por recombinação homóloga, para inativar o locus K de cadeia leve de camundongo em um processo de duas etapas (FIG. 21).

[000671] Resumidamente, os segmentos de gene Jk (1-5) do locus endógeno de cadeia leve k de camundongo foram eliminados em um único evento de alvejamento usando um vetor de alvejamento compreendendo um cassete higromicina-timidina kinase (hyg-TK), contendo um único sítio loxP 3’ do cassete hyg-TK (FIG. 21, vetor de alvejamento Jk). Os braços de homologia usados para produzir este vetor de alvejamento continham sequência genômica 5’ e 3’ de camundongo dos segmentos de gene Jk endógenos de camundongo. Em um segundo evento de alvejamento, um segundo vetor de alvejamento foi preparado para eliminar uma porção de sequência genômica de camundongo a montante (5’) do segmento de gene Vk endógeno mais distal de camundongo (FIG. 21, vetor de alvejamento Vk). Este vetor de alvejamento continha um sítio lox511 invertido, um sítio loxP e um cassete de neomicina. Os braços de homologia usados para produzir este vetor de alvejamento continham sequência genômica de camundongo a montante do segmento de gene VK mais distal de camundongo. Os vetores de alvejamento foram usados em uma maneira sequencial (isto é, JK e a seguir Vk) para alvejar o DNA em células ES. Células ES que carregam um cromossomo duplamente alvejado (isto é, um único locus k endógeno de camundongo alvejado com ambos os vetores de alvejamento) foram confirmadas por cariotipagem e métodos de seleção (por exemplo, TAQMAN™) conhecidos na técnica. DNA foi então isolado das células ES modificadas e submetido ao tratamento com recombinase Cre, mediando por meio disso a eliminação de segmentos de gene endógenos Vk de camundongo e ambos os cassetes de seleção, deixando ao mesmo tempo dois sítios lox justapostos em orientação contrária, um com relação ao outro (FIG. 21, parte inferior; SEQ ID NO:59).

[000672] Assim, dois loci modificados endógenos de cadeia leve (K e X) contendo melhoradores intactos e regiões constantes foram criados para inserir de maneira progressiva os segmentos de gene não rearranjados X da linhagem germinativa de humano, de uma maneira exata usando vetores de alvejamento deacritos a seguir. Exemplo 11. Substituição de loci de cadeia leve de camundongo por um mini-locus de cadeia leve k de humano

[000673] Múltiplos vetores de alvejamento foram geneticamente modificados para a inserção progressiva de segmentos de gene X de humano nos loci de cadeia leve k e X endógenos de camundongo, usando métodos similares da maneira descrita anteriormente. As modificações iniciais múltiplas e independentes foram produzidas nos loci endógenos de cadeia leve, cada qual produzindo um locus quimérico de cadeia leve contendo segmentos de gene hVX e JX operavelmente ligados aos genes constantes de cadeia leve e melhoradores de camundongo.

[000674] Um mini-locus k de humano contendo 12 segmentos de gene Vk de humano e um segmento de gene Jk de humano. Uma série de vetores de alvejamento iniciais foi geneticamente modificada para conter os primeiros 12 segmentos de gene VX consecutivos de humano do agrupamento A, e um segmento de gene hJX1 ou quatro segmentos de gene hJX, usando um clone BAC de humano denominado RP11-729g4 (Invitrogen). As FIGS.. 22A e 22B mostram os vetores de alvejamento que foram construídos para produzir uma inserção inicial de segmentos de gene de cadeia leve X de humano nos loci de cadeia leve X e K de humano, respectivamente.

[000675] Para um primeiro conjunto de vetores de alvejamento iniciais, um fragmento de DNA de 124.125 bp do clone BAC 729g4 contendo 12 segmentos de gene hVX e um segmento de gene hJX1 foi geneticamente modificado para conter um sítio PI-SceI 996 bp a jusante (3’) do segmento de gene hJX1, para ligação de um braço de homologia 3’ de camundongo. Dois consjuntos diferentes de braços de homologia foram usados para a ligação a este fragmento de humano; um conjunto de braços de homologia continha sequência X endógena de camundongos do clone BAC 135k15 (FIG. 22A), e um outro conjunto continha sequência k endógena 5’ e 3’ dos segmentos de gene Vk e Jk de camundongos dos clones BAC RP23-302g12 e RP23- 254m04 de camundongo, respectivamente (FIG. 22B).

[000676] For o vetor de alvejamento 12/1-X (FIG. 22A), um sítio PISceI foi geneticamente modificado na extremidade 5’ de um fragmento de DNA de 27.847 bp contendo o CX2-JX4-CX4 de camundongo e melhorador 2,4 do locus modificado X de camundongo descrito no exemplo 10. O fragento de ~28 kb de camundongo foi usado como um braço de homologia 3’ por ligação ao fragmento X ~124 kb de humano, que criou uma junção 3’ contendo, de 5’ a 3’, um segmento de gene hJX1, 996 bp de sequência X 3’de humano do segmento de gene hJXD, 1229 bp de sequência X de camundongo 5’ no gene CX2 de camundongo, no gene CX2 de camundongo e na porção restante do fragmento de ~28 kb de camundongo. A montante (5’) do segmento de gene VX3-12 de humano estava uma sequência adicional X de 1456 bp de humano, antes do início do braço de homologia 5’ de camundongo, que continha 23.792 bp de DNA genômico de camundongo correspondente na sequência 5’ do locus X endógeno de camundongo. Entre o braço de homologia 5’ e o início da sequência X de humano estava um cassete de neomicina flanqueado pelos sítios Frt.

[000677] Assim, o vetor de alvejamento 12/1-X incluiu, de 5’ a 3’, um braço de homologia 5’ contendo ~24 kb de sequência X genômica de camundongo, 5’ do locus X endógeno, um sítio Frt 5’, um cassete de neomicina, um sítio 3’ Frt, ~123 kb de sequência X genômica humana contendo os primeiros 12 segmentos de gene hVX consecutivos e um segmento de gene hJX1, um sítio PI-SceI, e um braço de homologia 3’ contendo ~28 kb de sequência genômica de camundonga, incluindo os segmentos de gene endógenos CX2-JX4-CX4, a sequência do melhorador 2.4 de camundongo e sequência genômica adicional de camundongo a jusante (3’) do melhorador 2.4 (FIG. 22A).

[000678] Em uma maneira similar, o vetor de alvejamento 12/1-K (FIG. 22B) empregou o mesmo fragmento X ~124 de humano, com a exceção de que os braços de homologia de camundongo contendo sequência K de camundongo foram usados, de maneira tal que o alvejamento do locus K endógeno pudesse ser atingido por recombinação homóloga. Assim, o vetor de alvejamento 12/1-k incluiu, de 5’ a 3’, um braço de homologia 5’ contendo ~23 kb de sequência genômicade camundongo, 5’ do locus k endógeno, um sítio I-CeuI, um sítio 5’ Frt, um cassete de neomicina, um sítio 3’ Frt, ~124 kb de sequência genômica X de humano contendo os primeiros 12 segmentos de gene hVX consecutivos e um segmento de gene hJX1, um sítio PI-SceI, e um braço de homologia 3’ contendo ~28 kb de sequência genômica de camundongo, incluindo o gene gene Ck, Eki e Ek3’ endógeno de camundongo e sequência genômica adicional de camundongo a jusante (3’) de Ek3’ (FIG. 22B, Vetor de alvejamento 12/1-k).

[000679] A recombinação homóloga com cada um destes dois vetores de alvejamento iniciais para criar um locus modificado de cadeia leve (K ou X) de camundongo contendo 12 segmentos de gene hVk e um segmento de gene hJX1 operavelmente ligados ao gene constante de cadeia leve endógeno de camundongo e genes melhoradores (Ck ou CX2 e Eki/Ek3’ ou Enh 2.4/Enh 3.1) que, mediante recombinação, levam à formação de uma cadeia leve X quimérica.

[000680] Um mini-locus k de humano com 12 segmentos de gene Vk de humano e quatro Jk de humano. Em uma outra abordagem para adicionar diversidade a um locus quimérico X de cadeia leve, um terceiro vetor de alvejamento inicial foi geneticamente modificado para inserir os primeiros 12 segmentos de gene VX consecutivos de humano, do agrupamento A, e segmentos de gene hJX1, 2, 3 e 7 no locus k de cadeia leve de camundongo (FIG. 22B, 12/4-k Vetor de alvejamento). Um segmento de DNA contendo segmentos de gene hJX1, JX2, JX3 e JX7 foi produzido por síntese de DNA de novo (Integrated DNA Technologies), incluindo cada segmento de gene JX e sequência genômica de humano de ~100 bp de ambas as regiões intermediárias 5’ e 3’ de cada segmento de gene JX. Um sítio PISceI foi geneticamente modificado na extremidade 3’ deste fragmento de DNA de ~1 kb e ligado a um cassete de cloranfenicol. Braços de homologia foram amplificados por PCR a partir da sequência de humano X nas posições 5’ e 3’, com relação ao segmento de gene hJX1 do clone BAC 729g4 de humano. A recombinação homóloga com este vetor de alvejamento intermediário foi realizada em um clone BAC 729g4 modificado que foi previamente alvejado a montante (5’) do segmento de gene Vk3DD2 de humano com um cassete de neomicina flanqueado por sítios Frt, que também continham um sítio I-CeuI 5’ no sítio 5’ Frt. O clone BAC 729g4 duplamente alvejado incluiu de 5’ a 3’ um sítio I-CeuI, um sítio 5’ Frt, um cassete de neomicina, um sítio 3’ Frt, um fragmento de ~123 kb contendo os primeiros 12 segmentos de gene hVX, um fragmento de ~1 kb contendo segmentos de gene J/J, 2, 3 e 7 de humano, um sítio PI-SceI sítio, e um cassete de cloranfenicol. Este vetor de alvejamento intermediário foi digerido junto com I-CeuI e PI-SceI e subsequentemente ligadp no clone BAC modificado de camundongo (descrito anteriormente) para criar o terceiro vetor de alvejamento.

[000681] Esta ligação resultou em um terceiro vetor de alvejamento para a inserção de sequências X de humano no locus K endógeno de cadeia leve, que incluiu, de 5’ a 3’, um braço de homologia 5’ de camundongo contendo ~23 kb de sequência genômica 5’ do locus k endógeno de camundongo, um sítio I-CeuI, um sítio 5’ Frt, um cassete de neomicina, um sítio 3’ Frt, um fragmento de ~123 kb contendo os primeiros 12 segmentos de gene hVX, um fragmento de ~1 kb contendo segmentos de gene hJX1, 2, 3 e 7, um sítio PISceI e um braço de homologia 3’ contendo ~28 kb de sequência genômica de camundongo, incluindo o gene endógeno de camundongo Ck, Eki e Ek3’, e sequência genômica adicional de camundongo a jusante (3’) de Ek3’ (FIG. 22B, 12/4-k Vetor de alvejamento). A recombinação homóloga com este terceiro vetor de alvejamento criou um locus k modificado de cadeia leve de camundongo contendo 12 segmentos de gene hVX e quatro segmentos de gene hJX operavelmente ligados ao gene endógeno Ck de camundongo que, mediante recombinação, leva à formação de uma cadeia leve quimérica X de humano/cadeia leve k de camundongo.

[000682] Um mini-locus k de humano com uma sequência de cadeia leve K de humano integrada. Em uma maneira similar, dois vetores de alvejamento adicionais similares àqueles geneticamente modificados para produzir uma inserção inicial de segmentos de gene X de humano no locus k endógeno de cadeia leve (FIG. 22B, 12/1-k e 12/4-k Vetores de alvejamento), foram geneticamente modificados para inserir progressivamente segmentos de gene de cadeia leve X de humano, usando exclusivamente vetores de alvejamento contendo sequências genômicas contíguas Xe K de humano. Estes vetores de alvejamento foram contruídos para incluir uma sequência genômica k de ~ 23 kb de humano localizada naturalmente entre os segmentos de gene Vk4-1 e Jk1 de humano. Esta sequência genômica k de humano estava posicionada especificamente nestes dois vetores de alvejamento adicionais entre os segmentos de gene VX e JX de humano (FIG. 22B, 12(k)1-k e 12(k)4-k Vetores de alvejamento).

[000683] Ambos os vetores de alvejamento contendo a sequência genômica k de humano foram produzidos usando o clone BAC RP11-729g4 modificado e descrito anteriormente (FIG. 24). Este clone BAC modificado foi alvejado com um cassete de seleção de espectinomicina flanqueado por sítios de restrição NotI e AsiSI (FIG. 24, na parte superior à esquerda). A recombinação homóloga com o cassete de espectinomicina resultou em um clone BAC 729g4 duplamente alvejado que incluiu, de 5’ a 3’, um sítio I- CeuI, um sítio 5’ Frt, um cassete de neomicina, um sítio 3’ Frt, um fragmento de ~123 kb contendo os primeiros 12 segmentos de gene hVX, um sítio NotI cerca de 200 bp a jusante (3’) da sequência nonâmera do segmento de gene hVX3-1, um cassete de espectinomicina e um sítio AsiSI. Um clone BAC de humano separado contendo sequência k de humano (CTD-2366j12) foi alvejado duas vezes em sítios de restrição geneticamente modificados, em locais entre os segmentos de gene hVk4-1 e hJk1, para permitir a clonagem subsequente de um fragmento de ~23 kb para ligação com os segmentos de gene hVX contidos no clone BAC 729g4 modificado duplamente alvejado (FIG. 24, parte superior, à direita).

[000684] Resumidamente, o clone BAC 2366j12 tem cerca de 132 kb em tamanho e contém segmentos de gene hVk 1-6, 1-5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1, sequência genômica k de humano a jusante dos segmentos de gene Vk, segmentos de gene hJk 1-5, o hCk e cerca de 20 kb da sequência genômica adicional do locus locus k de humano. Este clone foi primeiro alvejado com um vetor de alvejamento contendo um cassete de higromicina flanqueado por sítios Frt e um sítio NotI a jusante (3’) do sítio 3’ Frt. Os braços de homologia para este vetor de alvejamento continham sequência genômica de humano 5’ e 3’ dos segmentos de gene VK no clone BAC, de maneira tal que mediante a recombinação homóloga com este vetor de alvejamento, os segmentos de gene Vk forma eliminados e um sítio NotI foi geneticamente modificado ~133 bp a jusante do segmento de gene hVk4-1 (FIG. 24, parte superior à direita). Este clone BAC 2366j12 modificado foi alvejado independentemente com dois vetores de alvejamento na extremidade 3’ para eliminar os segmentos de gene hJk com um cassete de cloranfenicol, que também continham cada qual um segmento de gene hJX1, um sítio PI-SceI e um sítio AsiSI ou um fragmento genômico X de humano contendo quatro segmentos de gene hJX (supra), um sítio PI-SceI e um sítio AsiSI (FIG. 24, parte superior à direita). Os braços de homologia para estes dois vetores de alvejamento similares continham sequência 5’ e 3’ dos segmentos de gene hJk. A recombinação homóloga com estes segundos vetores de alvejamento e o clone de BAC 2366j12 modificado rendeu um clone 2366j12 duplamente alvejado que incluiu, de 5’ a 3’, um sítio 5’ Frt, um cassete de higromicina, um sítio 3’ Frt, um sítio NotI, um fragmento genômico de 22.800 bp do locus k de humano contendo a região intergênica entre os segmentos de gene Vk4-1 e Jk1, tanto um segmento de gene hJX1 quanto um fragmento genômico X de humano contendo hJX1, JX2, JX3 e JX7, um sítio PI-SceI e um cassete de cloranfenicol (FIG. 24, parte superior à direita). Dois vetores de alvejamento finais para produzir as duas modificações adicionais foram atingidos por duas etapas de ligação usando os clones 729g4 e 2366j12 duplamente alvejados.

[000685] O clones 729g4 e 2366j12 duplamente alvejados foram digeridos com NotI e AsiSI, rendendo um fragmento contendo o cassete de neomicina e segmentos de gene hVX, e um outro fragmento contendo o fragmento genômico de ~23 kb do locus k de humano contendo a região intergênica entre os segmentos de gene VK4-1 e JK1, tanto um segmento de gene hJ/1 quanto um fragmento genômico contendo segmentos de gene hJ/1, J/2, J/3 e J/7, o sítio PI-SceI e o cassete de cloranfenicol, respectivamente. A ligação destes fragmentos gerou dois clones BAC exclusivos contendo de 5’ a 3’ dos segmentos de gene hV/, a sequência genômica K de humano entre os segmentos de gene VK4-1 e JK1, tanto um segmento de gene hJ/1 quanto um fragmento genômico contendo os segmentos de gene h.l/J. J/2, J/3 e J/7, um sítio PI-SceI e um cassete de cloranfenicol (FIG. 24, parte inferior). Estes novos clones BAC foram então digeridos com I-CeuI e PI-SceI para liberar os fragmentos exclusivos contendo o cassete de neomicina a montante e as sequências contíguas / e k de humano, e ligados em um clone BAC 302g12 modificado de camundongo que continha, de 5’ a 3’, a sequência genômica 5’ de camundongo do locus k endógeno, um sítio I-CeuI, um sítio 5’ Frt, um cassete de neomicina, um sítio 3’ Frt, segmentos de gene hV/ (3-12 a 3-1), um sítio NotI ~200 bp a jusante de V/3-1, ~23 kb de sequência k de humano naturalmente encontrada entre os segmentos de gene Vk4-1 e Jk1 de humano, tanto um segmento de gene hJ/1 quanto um fragmento genômico contendo os segmentos de gene hJ/1, J/2, J/3 e J/7, o gene Eki de camundongo, os genes Ck e Ek3’de camundongo (FIG. 22, 12hV/-VkJk-hJ/1 e 12hV/-VkJk-4hJ/ Vetores de alvejamento). A recombinação homóloga com ambos destes vetores de alvejamento criou dois loci separados e modificados de cadeia leve k de camundongo contendo 12 segmentos de gene hV/, sequência genômica k de humano, e tanto um quanto quatro segmentos de gene hJ/ operavelmente ligados ao gene Ck endógeno de camundongo que, mediante recombinação, leva à formação de uma cadeia leve / quimérica de humano/cadeia leve k de camundongo. Exemplo 12. Segmentos de gene Vk de humano adicionais e geneticamente modificados em um mini-locus k de cadeia leve de humano

[000686] Os segmentos de gene adicionais hV/ foram adicionados independentemente de cada uma das modificações iniciais descritas no exemplo 11, usando vetores de alvejamento e métodos similares (FIG. 23A, +16-X Vetor de alvejamento e FIG. 23B, +16-K Vetor de alvejamento).

[000687] Introdução de 16 segmentos de gene adicionais Vk de humano. A montante, braços de homologia (5’) usados na construção de vetores de alvejamento para adicionar 16 segmentos de gene adicionais hVx aos loci modificados de cadeia leve, descritos no exemplo 11, continham sequência genômica 5’ de camundongo de cada um dos loci endógenos de cadeia leve X K ou. Os braços de homologia 3’ foram os mesmos para todos os vetores de alvejamento e continham sequência genômica de humano que se sobrepõe com a extremidade 5’ da sequência X de humano das modificações da maneira descrita no exemplo 11.

[000688] Resumidamente, dois vetores de alvejamento foram geneticamente modificados pela introdução de 16 segmentos de gene adicionais hVX nos loci modificados de cadeia leve de camundongo, descritos no exemplo 11 (FIG. 23A e 5B, +16-X ou +16-k Vetor de alvejamento). Um fragmento de DNA de ~172 kb do clone BAC de humano RP11-761l13 (Invitrogen), contendo 21 segmentos de gene hVX consecutivos do agrupamento A, foi geneticamente modificado com um braço de homologia 5’ contendo sequência genômica 5’ de camundongo tanto nos loci endógenos de cadeia leve k quanto X, e um braço de homologia 3’ contendo sequência genômica X de humano. Os braços de homologia 5’ k ou X de camundongo usados nestes construtos de alvejamento foram os mesmos do braço de homologia 5’ descrito no exemplo 11 (FIG. 23A e 23B). O braço de homologia 3’ incluiu uma sobreposição de 53.057 bp de sequência genômica X de humano, que corresponde à extremidade equivalente a 5’ da sequência de fragmento genômico X de ~123 kb de humano descrita no exemplo 11. Estes dois vetores de alvejamento incluiram, de 5’ a 3’, um braço de homologia 5’ de camundongo contendo tanto ~23 kb de sequência genômica 5’ do locus endógeno de cadeia leve K de camundongo quanto ~24 kb de sequência genômica 5’ do locus X endógeno de cadeia leve de camundongo, um sítio 5’ Frt, um cassete de higromicina, um sítio 3’ Frt e sequência genômica X de 171.457 bp de humano contendo 21 segmentos de gene hVX consecutivos, ~53 kb dos quais se sobrepõem com a extremidade 5’ da sequência X de humano described no exemplo 12, e funciona como o braço de homologia 3’ para este construto de alvejamento (FIG. 23A e 23B, Vetores de alvejamento +16-X ou +16-k). A recombinação homóloga com estes vetores de alvejamento criou loci independentemente modificados de cadeia leve k e X de camundongo, contendo cada qual 28 segmentos de gene hVX e um segmento de gene hJX1 operavelmente ligados aos genes constantes endógenos de camundongo (Ck ou CX2) que, mediante recombinação, leva à formação de uma cadeia leve quimérica.

[000689] Em uma maneira similar, o vetor de alvejamento +16-k também foi usado para introduzir os 16 segmentos de gene adicionais hVX nas outras modificações iniciais descritas no exemplo 11, que incorporaram múltiplos segmentos de gene hJX com e sem uma sequência k integrada de humano (FIG. 22B). A recombinação homóloga com este vetor de alvejamento no locus k endógeno de camundongo contendo as outras modificações iniciais criou loci de cadeia leve k de camundongo contendo 28 segmentos de gene hVX e 1, 2, 3 e 7 segmentos de gene hJX com e sem uma sequência genômica Vk-Jk de humano operavelmente ligada ao gene Ck endógeno de camundongo que, mediante recombinação, leva à formação de uma cadeia leve quimérica X e k.

[000690] Introdução de 12 segmentos de gene adicionais Vk de humano. Segmentos de gene adicionais hVX foram adicionados independentemente de cada uma das modificações descritas anteriormente, usando vetores de alvejamento e métodos similares. A estrutura do locus final resultante da recombinação homóloga com vetores de alvejamento contendo segmentos de gene adicionais hVX é mostrada na FIG. 25A e 25B.

[000691] Resumidamente, um vetor de alvejamento foi geneticamente modificado por introdução de 12 segmentos de gene adicionais hVX nos loci de cadeia leve K e X modificados de camundongo descritos anteriormente (FIG. 23A e 23B, Vetores de alvejamento +12-X ou 12-K). Um fragmento de DNA de 93.674 bp do clone BAC de humano RP11-22I18 (Invitrogen), contendo 12 segmentos de gene hVX consecutivos do agrupamento B, foi geneticamente modificado com um braço de homologia 5’ contendo sequência genômica 5’ de camundonga tanto nos loci endógenos de cadeia leve k quanto X de camundongo, e um braço de homologia 3’ contendo a sequência genômica X de humano. Os braços de homologia 5’ usados neste construto de alvejamento foram os mesmos braços de homologia 5’ usados para a adição de 16 segmentos de gene hVX descritos anteriormente (FIG. 23A e 23B). O braço de homologia 3’ foi produzido por modificação genética de um sítio PI-SceI ~3431 bp 5’ no segmento de gene VX3-29P de humano, contido em uma sequência X de fragmento genômico de 27.468 bp de humano do clone BAC RP11-761I13. Este sítio PI-SceI funciona como um ponto de ligação para unir a sequência X do fragmento adicional de ~94 kb de humano á sequência X de fragmento de ~27 kb de humano que se sobrepõe à extremidade 5’ da sequência X de humano na modificação prévia, usando os vetores de alvejamento +16-X ou +16-k (FIG. 23A e 23B). Estes dois vetores de alvejamento incluíram, de 5’ a 3’, um braço de homologia 5’ contendo tanto uma sequência genômica de ~23 kb de camundongo 5’ do locus k endógeno de cadeia leve quanto uma sequência genômica de ~24 kb de camundongo 5’ do locus X endógeno de cadeia leve, um sítio 5’ Frt, um cassete de neomicina, um sítio 3’ Frt e 121.188 bp de sequência X genômica de humano contendo 16 segmentos de gene hVX e um sítio PI-SceI, ~27 kb que se sobrepõem a extremidade 5’ da sequência X de humano da inserção de 16 segmentos de gene hVX adicionais, e funciona como o braço de homologia 3’ para este construto de alvejamento (FIG. 23A e 23B, Vetores de alvejamento +12-X ou 12-K). A recombinação homóloga com este vetores de alvejamento criou independentemente loci modificados de cadeia leve K e X de camundongo contendo 40 segmentos de gene hVX e JK1 de humano operavelmente ligados aos genes constantes endógenos de camundongo (Ck ou CX2) que, mediante recombinação, levam à formação de uma cadeia leve quimérica (parte inferior da FIG. 23A e 23B).

[000692] Em uma maneira similar, o vetor de alvejamento +12-k também foi usado para introduzir os 12 segmentos de gene adicionais hVX nas outras modificações iniciais, que incorporaram múltiplos segmentos de gene hJX com e sem uma sequência k integrada de humano (FIG. 22B). A recombinação homóloga com este vetor de alvejamento no locus k endógeno de camundongo contendo as outras modificações criou um locus de cadeia leve k de camundongo contendo 40 segmentos de gene hVX e 1, 2, 3 e 7 segmentos de gene hJX, com e sem uma sequência genômica Vk-Jk de humano operavelmente ligada ao gene Ck endógeno de camundongo que, mediante recombinação, leva à foração de uma cadeia quimérica k e leve X. Exemplo 13. Identificação de células ES alvejadas que carregam segmentos de gene de cadeia leve k de humano

[000693] O DNA de BAC alvejado e produzido de acordo com os exemplos precedentes foi usado para eletroporar as células ES de camundongo para criar células ES modificadas, para gerar camundongos quiméricos que expressam segmentos de gene de cadeia leve X de humano. As células ES contendo uma inserção de segmentos de gene não rearranjados de cadeia leve X de humano foram identificadas por um ensaio quantitativo TAQMAN®, Os conjuntos de oligonucleotídeos iniciadores específicos e sondas foram determinados por inserção de sequências X de humano e associados aos cassetes de seleção (ganho de alelo, GOA), perda de sequências endógenas de camundongo e qualquer dos cassetes de seleção (perda de alelo, LOA), e retenção de sequências de flanqueamento de camundongo (retenção de alelo, AR). Para cada inserção adicional de sequências X de humano, conjuntos adicionais de oligonucleotídeo iniciador e sondas foram usados para confirmar a presence das sequências adicionais X de humano, bem como os conjuntos prévios de oligonucleotídeo iniciador e sondas usados para confirmar a retenção da sequência de humanos previamente alvejada. A tabela 10 mostra os oligonucleotídeos iniciadores e sondas associdas usados no ensaio de PCRs quantitativas. A tabela 11 mostra as combinações usadas para confirmar a inserção de cada secção de segmentos de gene de cadeia leve X de humano em clones de célula ES.

[000694] As células ES que carregam os segmentos de gene de cadeia leve X de humano são opcionalmente transfectadas com um construto que expressa FLP, a fim de remover o cassete Frt’ed neomicina introduzido pela inserção do construto de alvejamento contendo segmentos de gene VX5-52 - VX1-40 de humano (FIG. 23A e 23B). O cassete de neomicina pode ser opcionalmente removido pelo cruzamento dos camundongos que expressam FLP recombinase (por exemplo, U.S. 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é mantido nos camundongos.

Exemplo 14. Geração de camundongos que expressam cadeia leve k de humano a partir de um locus endógeno de cadeia leve

[000695] As células ES alvejadas, descritas anteriormente, foram usadas como as célula ES doadoras e introduzidas em um embrião de camundongo no estágio de 8 células pelo método VELOCIMOUSE® (ver, por exemplo, patente U.S. 7.294.754 e Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99. VELOCIMICE® (camundongos F0 totalmente derivados da célula ES doadora) que carregam independentemente segmentos de gene X de humano foram identificados por genotipagem usando um ensaio de modificação de alelo (Valenzuela et al., supra) que detectou a presença dos segmentos X exclusivos de gene de humano (supra).

[000696] Uso de cadeia leve K:k de camundongos que carregam segmentos de gene de cadeia leve k de humano. Camundongos homozigotos para cada uma de três inserções sucessivas de segmentos de gene hVX com um único segmento de gene hJX (FIG. 23B), e camundongos homozigotos para uma primeira inserção de segmentos de gene hVX tanto com um único segmento de gene hJX quanto com quatro segmentos de gene JX de humano, incluindo uma sequência genômica VK-JK de humano (FIG. 22B), foram analisados em relação à expressão de cadeia leve K e X em esplenócitos usando citometria de fluxo.

[000697] Resumidamente, os baços foram coletados de grupos de camundongos (variando de três a sete animais por grupo) e triturados usando lâminas de vidro. Após a lise de células vermelhas do sangue (RBCs) com tampão de lise ACK (Lonza Walkersville), os esplenócitos foram corados com anticorpos conjugados com corante fluorescente específico para CD19 de camundongo (Clone 1D3; BD Biosciences), CD3 de camundongo (17A2; Biolegend), IgK de camundongo (187.1; BD Biosciences) e IgX de camundongo (RML-42; Biolegend). Os dados foram adquiridos usando um citômetro de fluxo BD™ LSR II (BD Biosciences) e analisados usando software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Tabela 12 apresenta os valores percentuais médios para a expressão de células B (CD19+), cadeia leve K (CD19+IgK+IgX-) e cadeia leve X (CD19+IgK—IgV) observada em esplenócitos de grupos de animais que carregam tal modificação genética.

[000698] Em um experimento similar, os conteúdos de célula B do compartimento esplênico de camundongos homozigotos para uma primeira inserção de 12 hVX e quatro segmentos de gene hJX, incluindo uma sequência genômica VK-JK de humano operavelmente ligada ao gene CK de camundongo (parte inferior da FIG. 22B), e camundongos homozigotos para 40 segmentos de gene hVX e um hJX (parte inferior da FIG. 23B ou top de FIG. 25B) foram analisados em relação à expressão de IgK e IgX usando citometria de fluxo (da maneira descrita anteriormente). A FIG. 26A mostra a expressão de IgX e IgK em células B CD19+ para um camundongo representativo de cada grupo. O número de células B CD19+ por baço também foi registrado para cada camundongo (FIG. 26B).

[000699] Em um outro experimento, os conteúdos de célula B do baço e compartimentos de medula óssea dos camundongos homozigotos para 40 segmentos de gene hVX e quatro hJX, incluindo uma sequência genômica VK- JK de humano operavelmente ligada ao gene CK de camundongo (parte inferior da FIG. 26B) foram analisados em relação à progressão até o desenvolvimento de célula B usando citometria de fluxo de vários marcadores de superfície de célula.

[000700] Resumidamente, dois grupos (N=3 cada, 9-12 semanas, macho e fêmea) de camundongos tipo selvagem e homozigotos para 40 segmentos de gene IIVA e quatro hJX, incluindo uma sequência genômica VK-JK de humano operavelmente ligada ao gene CK de camundongo foram sacrificados e os baços e medula óssea foram coletados. A medula óssea foi coletada dos fêmures corando com meio RPMI completp (meio RPMI suplementado com soro fetal bovino, piruvato de sódio, Hepes, 2-mercaptoetanol, aminoácidos não essenciais, e gentamicina). As preparações RBCs de baço e medula óssea foram lisadas com tampão de lise ACK (Lonza Walkersville), seguido por lavagem com meio RPMI completo. 1x106 células foram incubadas com anti- camundongo CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) no gelo por 10 minutos, seguido por marcação com um painel de anticorpo selecionado por 30 minutos no gelo.

[000701] Painel de medula óssea: anti-camundongo FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD) e Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend).

[000702] Painel de medula óssea e baço: anti-camundongo FITC-Igk (187.1, BD), PE-IgX (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, ebioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD).

[000703] Após coloração, as células foram lavadas e fixas em formaldeido a 2 %. A aquisição de dados foi realizada em um citômetro de fluxo FACSCANTOII™ (BD Biosciences) e analisada com software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). As FIGS. 27A - 27D mostram o resultado para o compartimento esplênico de um camundongo representativo de cada grupo. As FIGS. 28A - 28E mostram o resultado para o compartimento de medula óssea de um camundongo representativo de cada grupo. Tabela 13 apresenta os valores percentuais médios para a expressão de células B (CD19+), cadeia leve K (CD19+IgK+Igk-)D e cadeia leve X (CD19+IgK-Igk+) observada em esplenócitos dos grupos de animais que carregam várias modificações genéticas. Tabela 14 apresenta os valores percentuais médios para células B (CD19+), células B maduras (B220hiIgM+), células B imaturas (B220intIgM+), células B imaturas expressando cadeia leve K (B220intIgM+IgK+) e células B imaturas expressando cadeia leve X (B220intIgM+IgX+) observados na medula óssea de camundongos tipo selvagem e homozigotos para 40 segmentos de gene hVX e quatro hJX, incluindo uma sequência genômica VK-JK de humano operavelmente ligada ao gene CK de camundongo. Este experimento foi repetido com grupos adicionais dos camundongos descritos anteriormente e demonstrou resultado similar (dados não mostrados).

[000704] Uso de gene Vk de humano em camundongos que carregam segmentos de gene de cadeia leve k de humano. Camundongos heterozigotos para uma primeira inserção de sequências X de humano (hVX3- 12 - hVX3-1 e hJX1, FIG. 23B) e homozigotos para uma terceira inserção de sequências X de humano (hVX5-52 - hVX3-1 e hJX1, FIG. 23B) foram analisados em relação ao uso do gene de cadeia leve X de humano, por reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa (RT-PCR) usando RNA isolado dos esplenócitos.

[000705] Resumidamente, os baços foram coletados e perfundido em 10 mL de RPMI-1640 (Sigma) com 5 % de HI-FBS em sacolas descartáveis estéreis. Cada sacola contendo um único baço foi então colocada em um STOMACHER™ (Seward) e homogenizada em um ajuste médio por 30 segundos. Os baços homogenizados foram filtrados usando uma peneira celular de 0,7μm e a seguir precipitados com uma centrifuge (1.000 rpm por 10 minutos), e RBCs foram isados em BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) por três minutos. Os esplenócitos foram diluídos com RPMI- 1640 e centrifugados novamente, seguido por ressuspensão em 1 mL de PBS (Irvine Scientific). O RNA foi isolado dos esplenócitos precipitados usando técnicas padrões conhecidas na tecnologia.

[000706] RT-PCR foi realizada em RNA de esplenócito usando oligonucleotídeos iniciadores específicos para segmentos de gene hVX de humano e o gene CK de camundongo (Tabela 15). Os produtos de PCR foram purificados em gel e clonados no vetor pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), e sequenciados com oligonucleotídeos iniciadores M13 sentido (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ ID NO:113) e M13 reverso (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO:114) localizados no vetor em locais que flanqueiam o sítio de clonagem. Um total de oitenta e quatro clones derivados da primeira e terceira inserções de sequências X de humano foram sequenciados para determinar o uso do gene hVX (Tabela 16). A sequência de nucleotídeo da junção hVX-hJX1-mCk para clones selecionados por RT-PCR é mostrada na FIG. 29.

[000707] Em uma maneira similar, camundongos homozigotos para uma terceira inserção de sequências de gene de cadeia leve X de humano (isto é, 40 segmentos de gene hVX e quatro segmentos de gene hJX, incluindo uma sequência genômica Vk-Jk de humano, parte inferior da FIG. 25B) operavelmente ligado ao gene gene Ck endógeno de camundongo foram analisados em relação o uso de gene de cadeia leve X de humana por RT-PCR, usando RNA isolado de esplenócitos (da maneira descrita anteriormente). O segmento de gene de cadeia leve X de humano usado para 26 clones selecionados por RT-PCR é mostrado na tabela 17. A sequência de nucleotídeo da junção hVX-hJX-mCK para clones de RT-PCR selecionados é mostrada na FIG. 30.

[000708] Em uma maneira similar, os camundongos homozigotos para uma primeira inserção de segmentos de gene de cadeia leve X de humano (12 segmentos de gene hVX e hJX1, FIG. 22A & FIG. 23A), operavelmente ligados ao gene endógeno CX2 de camundongo foram analisados em relação ao uso de gene de cadeia leve X de humano por RT-PCR usando RNA isolado de esplenócitos (da maneira descrita anteriormente). Os oligonucleotídeos iniciadores específicos para segmentos de gene hVX (Tabela 15) fora pareados com um de dois oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene CX2 de camundongo; CX2-1 (SEQ ID NO:162) ou CX2-2 (SEQ ID NO:163).

[000709] Múltiplos segmentos de gene hVX rearranjados em hX1 foram observados a partir dos clones por RT-PCR de camundongos que carregam segmentos de gene de cadeia leve X de humano no locus endógeno de cadeia leve X de camundongo. A sequência de nucleotídeo da junção hVX-hJX-mCX2 para clones selecionados por RT-PCR é mostrada na FIG. 31.

[000710] A FIG. 29 mostra a sequência da junção hVX-hJX1-mCK para clones de RT-PCR de camundongos que carregam uma primeira e terceira inserções de segmentos de gene hVX com um único segmento de gene hJX. A sequência mostrada na FIG. 29 ilustra rearranjos exclusivos que envolvem diferentes segmentos de gene hVX com hJX1 recombinado no gene CK de v. Os camundongos heterozigotos que carregam um único locus modificado K endógeno contendo 12 segmentos de gene hVX e hJX1, e camundongos homozigotos que carregam dois loci k endógenos modificados contendo 40 segmentos de gene hVX e hJX1 foram ambos capazes de produzir segmentos X de gene de humano, operavelmente ligados ao gene Ck de camundongo e produzem células B que expressam cadeias leves X de humano. Estes rearranjos demonstram que os loci quiméricos eram capazes de rearranjar independentemente dos segmentos X de gene de humano em múltiplas células B independentes nestes camundongos. Adicionalmente, estas modificações no locus K endógeno de cadeia leve não tornam nenhum dos segmentos de gene IIVA inoperantes ou previnem o locus quimérico de recombinar múltiplos segmentos de gene hVA e um segmento de gene hJA (JÀ1) durante o desenvolvimento de célula B, da maneira evidenciada pelos 16 segmentos de gene IIVA diferentes que foram observados rearranjando com hJAl (Tabela 16). Adicionalmente, estes camundongos produziram anticorpos funcionais contendo segmentos de gene rearranjados VA-.IA de humano, operavelmente ligados aos genes CK de camundongo como parte do repertório endógeno de cadeia leve de imunoglobulina.

[000711] A FIG. 30 mostra a sequência da junção hVa-h.a-mCK para clones selecionados por RT-PCR a partir de camundongos homozigotos para 40 segmentos de gene hVa e quatro h.a, incluindo uma sequência genômica VK-.K de humano. As sequências mostradas na FIG. 30 ilustram rearranjos adicionais exclusivos que envolvem múltiplos segmentos de gene hVa diferentes, que espaçam o locus quimérico inteiro, com múltiplos segmentos de gene h.a diferentes rearranjados e operavelmente ligados ao gene CK de camundongo. Os camundongos homozigotos que carregam loci K endógenos modificados contendo 40 segmentos de gene hVa e quatro h.a também foram capazes de produzir segmentos de gene a de humano operavelmente ligados ao gene CK de camundongo e produzem células B que expressam cadeias leves a de humano. Estes rearranjos demonstram adicionalmente que todos os estágios de loci quiméricos foram capazes de rearranjar independentemente segmentos de gene a de humano em múltiplas células B independentes nestes camundongos. Adicionalmente, estas modificações adicionais no locus K endógeno de cadeia leve demonstra que cada inserção de segmentos de gene a de humano não tornou nenhum dos segmentos de gene hVa e/ou .a inoperantes ou evitou que o locus quimérico recombinasse com os segmentos de gene hVa e .a durante desenvolvimento de célula B, da maneira evidenciada por 12 segmentos de gene hVa diferentes daqueles que foram observados por rearranjar com todos os quatro segmentos de gene hJX (Tabela 17) dos 26 clones selecionados por RT-PCR. Adicionalmente, estes camundongos produziram igualmente anticorpos funcionais contendo segmentos de gene VX-JX de humano operavelmente ligados às regiões CK de camundongo como parte do repertório endógeno de cadeia leve de imunoglobulina.

[000712] A FIG. 31 mostra a sequência da junção hVX-hJX-mCX para três clones individuais por RT-PCR de camundongos homozigotos para 12 segmentos de gene hVX e hJX1. As sequências mostradas na FIG. 31 ilustram rearranjos adicionais exclusivos que envolvem diferentes segmentos de gene hVX, que espaçam o tamanho da primeira inserção, com hJX1 rearranjado e operavelmente ligado ao gene CX2 de camundongo (2D1 = VX2-8JX1; 2D9 = VX3-10JX1; 3E15 = VX3-1JX1). Um clone demonstrou um rearranjo não produtivo em virtude das adições N na junção hVX-hJX (2D1, FIG. 31). Isto não é incomum na recombinação V(D)J, uma vez que a união de segmentos de gene durante a recombinação demonstrou ser imprecisa. Embora este clone represente um recombinante não produtivo presente no repertório de cadeia leve destes camundongos, isto demonstra que o mecanismo genético que contribui para a diversidade juncional entre os genes de anticorpo é funcionalmente normal nestes camundongos, e leva a um repertório de anticorpo contendo cadeias leves com maior diversidade.

[000713] Camundongos homozigotos que carregam loci endógenos modificados X, contendo 12 segmentos de gene hVX e hJX1, também fora capazes de produzir segmentos X de gene de humano operavelmente ligados a um gene endógeno CX de camundongo e produzir células B que expressam cadeias leves X reversas quiméricas contendo regiões hVX ligadas às regiões CX de camundongo. Estes rearranjos demonstram adicionalmente que os segmentos de gene de cadeia leve X de humano colocados no outro locus de cadeia leve (isto é, o locus X) eram capazes de rearranjar independente dos segmentos de gene X de humano em múltiplas células B independentes nestes camundongos. Adicionalmente, as modificações no locus X endógeno de cadeia leve demonstram que a inserção de segmentos de gene X de humano não tornou nenhum dos segmentos de gene hVX e/ou hJX1 inoperante ou preveniu o locus quimérico de recombinar os segmentos de gene hVX e hJX1 durante o desenvolvimento de célula B. Adicionalmente, estes camundongos também produziram anticorpos funcionais contendo segmentos de gene VX-JX de humano operavelmente ligados a uma região CX de camundongo, como parte do repertório endógeno de cadeia leve de imunoglobulina.

[000714] Da maneira mostrada neste exemplo, camundongos que carregam segmentos de gene de cadeia leve X de humano nos loci endógeno de cadeia leve K e X são capazes de rearranjar segmentos de gene de cadeia leve X de humano, e expressá-los no contexto de uma região CK e/ou CX de camundongo como parte do repertório normal de anticorpo dos camundongos, em decorrência de uma cadeia leve funcional ser exigida em vários pontos de verificação no desenvolvimento de célula B tanto no baço quanto na medula óssea. Adicionalmente, subconjuntos iniciais de células B (por exemplo, pré-, pró- e células B transicionais) demonstram um fenótipo normal nestes camundongos, comparados aos filhotes tipo selvagem (FIGS. 27D, 28A e 28B). Um pequeno déficit na medula óssea e populações de células B periféricas foi observado, o que pode ser atribuído a uma eliminação de um subconjunto de células B imaturas auto-reativas e/ou uma associação sub ideal de cadeia leve X de humano com cadeia pesada de camundongo. Entretanto, o uso de Igk/IgX observado nestes camundongos demonstra uma situação que mais provável de expressão de cadeia leve de humano do que observado em camundongos. Exemplo 15. Cruzamento de camundongos que expressam cadeias leves X de humano a partir de um locus endógeno de cadeia leve

[000715] Para otimizar o uso do segmentos de gene X de humano em um locus endógeno de cadeia leve de camundongo, os camundongos que carregam os segmentos de gene X de humano não rearranjados são cruzados com um outro camundongo contendo uma eliminação no locus endógeno de cadeia leve oposto (tanto K quanto X). Por exemplo, os segmentos de gene X de humano posicionados no locus K endógeno podem ser apenas os segmentos de gene de cadeia leve funcionais presentes em um camundongo que também realizou uma eliminação no locus X endógeno de cadeia leve. Desta maneira, a progênie obtida pode expressar apenas cadeias leves X de humano, da maneira descrita nos exemplos precedentes. O cruzamento é realizado por técnicas padrões reconhecidas na tecnologia e, alternativamente, por companias comerciais, por exemplo, The Jackson Laboratory. As cepas de camundongo que carregam segmentos de gene de cadeia leve X de humano no locus k endógeno e uma eliminação do locus X endógeno de cadeia leve são selecionadas pela presença das cadeias leves X exclusivas reversas-quiméricas (humano-camundongo), e ausência de cadeias leves X endógenas de camundongo.

[000716] Os camundongos que carregam um locus não rearranjado de cadeia leve X de humano também são cruzados com camundongos que contêm uma substituição do locus de gene de cadeia pesada variável endógeno de camundongo pelo locus de gene variável de cadeia pesada de humano (ver U.S. 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, o camundongo geneticamente modificado por VELOCIMMUNE®). O camundongo VELOCIMMUNE® inclui, em parte, um genoma compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada de humano operavelmente ligadas aos loci endógenos de região constante de camundongo, de maneira tal que o camundongo produza anticorpos compreendendo uma região variável de cadeia pesada de humano e uma região constante de cadeia pesada de camundongo em resposta ao estímulo antigênico. O DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada dos anticorpos pode ser isolado e operavelmente ligado as DNA que codifica as regiões constantes de cadeia pesada de humano. O DNA pode então ser expresso em uma célula capaz de expressar a cadeia pesada completamente humana do anticorpo. Mediante um esquema de cruzamento adequado, os camundongos que carregam uma substituição do locus endógeno de cadeia pesada de camundongo pelo locus de cadeia pesada de humano e um locus não rearranjado de cadeia leve X de humano no locus K endógeno de cadeia leve é obtido. Anticorpos contendo regiões variáveis de cadeia pesada mutadas de maneira somática de humano e regiões variáveis de cadeia leve X de humano podem ser isolaados mediante imunização com um antígeno de interesse. Exemplo 16. Geração de anticorpos de camundongos que expressam cadeia pesadas de humano e cadeias leves k de humano

[000717] Após cruzamento de camundongos que contêm o locus X não rearranjado de cadeia leve de humano em várias cepas desejadas contendo modificações e eliminações de outros loci endógenos de Ig (da maneira descrita anteriormente), os camundongos selecionados são imunizados com um antígeno de interesse.

[000718] Em geral, um camundongo VELOCIMMUNE® contendo uma das únicas regiões rearranjadas de cadeia leve da linhagem germinativa de humano é desafiada com um antígeno, e células linfáticas (tais como células B) são recuperadas do soro dos animais. As células linfáticas podem ser fundidas a uma linhagem de célula de mieloma para preparar linhagens de célula imortal de hibridoma, e tais linhagens de célula de hibridoma são selecionadas e classificadas para identificar linhagens de célula de hibridoma que produzem anticorpos contendo cadeia pesada de humano e cadeia leve X de humano, que são específicas para o antígeno usado para imunização. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e das cadeias leves X pode ser isolado e ligado às regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e cadeia leve. Em virtude de a presença dos segmentos de gene adicionais IIVA. comparado ao locus X endógeno de camundongo, a diversidade do repertório da cadeia leve é muito aumentado e confere maior diversidade no repertório específico para antígeno mediante imunização. As sequências de anticorpo clonadas resultantes podem ser produzidas subsequentemente em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifca os quiméricos de anticorpo específicos de antígeno ou os domínios variáveis de cadeia leve e pesada pode ser isolado diretamente dos linfócitos específicos de antígeno (por exemplo, células B).

[000719] Inicialmente, os anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados com uma região variável de humano e uma região constante de camundongo. Da maneira descrita anteriormente, os anticorpos são caracterizados e selecionados por características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante desejada de humano para gerar o anticorpo completamente humano, contendo uma cadeia pesada de humano mutada de maneira somática e uma cadeia leve X de humano derivada de um locus X de cadeia leve não rearranjado de humano da invenção. As regiões constantes de humano adequadas incluem, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 tipo selvagem ou modificada. Exemplo 17. Cruzamento de camundongos ADAM6 e camundongos variáveis k de humano

[000720] Qualquer dos camundongos aqui descritos que compreende uma modificação de um gene de ADAM6 endógeno ou ortólogo ou homólogo deste, e compreende adicionalmente um gene que confere função de ADAM6 nos camundongo, é cruzado com um camundongo que compreende uma modificação que compreende um segmento variável X de humano (por exemplo, um segmento V e um J) operavelmente ligado a um gene constante X ou K de humano ou camundongo. O camundongo que compreende o segmento variável X de humano pode apresentar o segmento variável presente em um locus modificado endógeno X ou K, ou em um transgene. Os camundongos são cruzados e a progênie é adicionalmente intercruzada, se necessário, e progênie é selecionada por camundongos férteis que exibem a função de ADAM6 e que também expressam a sequência X de humano no contexto de uma região constante X ou k de humano ou camundongo, o que no caso pode ser.

[000721] Um camundongo que compreende um locus humanizado variável de cadeia pesada (segmentos V, D, e J de humano que substituem todos ou substancialmente todos os segmentos V, D, e J de camundongo) que compreendem adicionalmente uma sequência ectópica de ADAM6 (ou uma sequência de um ortólogo ou homólogo de ADAM6 que confere função de ADAM6 nos camundongo) é cruzado com um camundongo que compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos V e J de cadeia leve por segmento de cadeia leve X V e J de humano no locus X de camundongo e/ou no locus k de camundongo. Progênie é então cruzada adicionalmente se necessário, e os camundongos que expressam um anticorpo compreendendo um VH de humano fundido a uma sequência constante de cadeia pesada, e um cognato de X VL de humano fundido a uma sequência constante X ou uma k de cadeia leve são identificados.

[000722] Os camundongos são expostos a um antígeno de interesse e permitidos para gerar uma resposta imune. Anticorpos específicos do antígeno de interesse são identificados, e as sequências VH de humano e sequências variáveis X de humano (incluindo sequências variáveis X de humano ligadas às regiões constantes k de camundongo) são identificadas e empregadas para produzir um anticorpo de humano modificando geneticamente as sequências de domínio variável em combinação com genes de região constante de humano.

[000723] Em um exemplo, um camundongo que é criado por cruzamento compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de cadeia pesada V, D, e J de camundongo por segmentos V, D, e J de humano no locus endógeno de cadeia pesada de camundongo, e compreende um alelo de cadeia leve que compreende uma substituição de todas ou substancialmente todas as sequências variáveis de cadeia leve X por uma ou mais sequências variáveis X de humano em um locus X endógeno de camundongo operavelmente ligado a uma sequência X constante, e compreende um alelo de cadeia leve que compreende uma substituição de todas ou substancialmente todas as sequências variáveis de cadeia leve K em um locus K endógeno com um ou mais sequências variáveis X de humano. O animal é exposto a um antígeno de interesse e monta uma resposta imune. Anticorpos que se ligam ao antígeno de interesse são identificados e compreendem domínios variáveis de cadeia pesada de humano cognatos com domínios variáveis X de humano, em uma região constante X de camundongo ou região constante k de camundongo são identificados. Sequências de ácido nucleico que codificam os domínios variáveis são empregadas para produzir um anticorpo completamente humano modificando geneticamente as sequências variáveis em combinação com sequência de humanos de região constante.

[000724] Camundongos da maneira descrita neste exemplo compreendem uma ou mais das regiões intergênicas Vk-Jk descritas no texto e nas FIGS. aqui.

Claims

1. Método EX VIVO para preparar um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (i) identificar a partir de um ou mais linfócitos B de um camundongo exposto ao antígeno de interesse uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve X de imunoglobulina humana de um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, e (ii) empregar a sequência de ácido nucleico de (a) com uma sequência de ácido nucleico da região constante de cadeia leve de imunoglobulina humana para preparar uma cadeia leve de imunoglobulina humana para o anticorpo que se liga ao antígeno de interesse; em que o camundongo compreende (iii) uma inserção de um ou mais segmentos de gene VX humano e um ou mais segmentos de gene JX humano a montante de um gene de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo, em que o um ou mais segmentos de gene VX humano e um ou mais segmentos de gene JX humano são operacionalmente ligados ao gene da região constante da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo, (iv) uma inserção de um ou mais segmentos de gene VH humano, um ou mais segmentos de gene DH humano e um ou mais segmentos de gene JH humano a montante de um gene de uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, em que o um ou mais segmentos de gene VH humano, um ou mais segmentos de gene DH humano e um ou mais segmentos de gene JH humano são operacionalmente ligados ao gene da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo; e (v) i) uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 ou um fragmento funcional da mesma, e em que o um ou mais linfócitos B expressam o anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, em que o anticorpo expresso que se liga ao antígeno de interesse inclui uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio variável de cadeia leve X de imunoglobulina humana e um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo, e compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana e um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo de (i) é CK de camundongo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo de (i) é um CX de camundongo.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o CX de camundongo é um CX2 de camundongo.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que CX de camundongo é pelo menos 90% idêntico ao CX2 de camundongo.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende uma inserção de pelo menos 12 segmentos de gene VX humano e pelo menos um segmento de gene JX humano a montante do gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende uma inserção de pelo menos 28 segmentos de gene VX humano e pelo menos um segmento de gene JX humano a montante do gene da região constante da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende uma inserção de pelo menos 40 segmentos de gene VX humano e pelo menos um segmento de gene JX humano a montante do gene da região constante da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de (iii) está presente no locus da cadeia pesada de imunoglobulina do camundongo.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de (iii) é posicionada dentro do locus da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina de humano.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de (iii) está posicionada entre dois segmentos de gene VH humano.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de (iii) está presente em uma posição diferente do locus da cadeia pesada de imunoglobulina do camundongo.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de (iii) está posicionada entre um segmento de gene VH humano e um segmento de gene DH humano.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o camundongo adicionalmente compreende uma região intergênica humana VK-JK a partir de um locus de cadeia leve K humana, em que a região intergênica humana VK-JK é contíngua com o um ou mais segmentos de gene Vk humano e um ou mais segmentos de gene Jk de humano.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região intergênica humana Vk-Jk é colocada entre um segmento de gene VK humano e um segmento de gene JK humano.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região intergênica humana Vk-Jk compreende SEQ ID NO: 158.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico da etapa (a) é isolada de um hibridoma preparada a partir do um ou mais linfócitos B.

18. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o Ck de camundongo é pelo menos 95% idêntico ao Ck2 de camundongo.

19. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o Ck de camundongo é pelo menos 97% idêntico ao Ck2 de camundongo.

20. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o Ck de camundongo é pelo menos 98% idêntico ao Ck2 de camundongo.