TW202110323A - 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途 - Google Patents

具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202110323A
TW202110323A TW109118837A TW109118837A TW202110323A TW 202110323 A TW202110323 A TW 202110323A TW 109118837 A TW109118837 A TW 109118837A TW 109118837 A TW109118837 A TW 109118837A TW 202110323 A TW202110323 A TW 202110323A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
human
light chain
rodent
chain variable
genetically modified
Prior art date
Application number
TW109118837A
Other languages
English (en)
Inventor
安德魯 墨菲
林恩 麥克唐納德
郭春光
約翰 麥克懷特爾
約翰娜 漢森
羅伯特 巴伯
Original Assignee
美商再生元醫藥公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商再生元醫藥公司 filed Critical 美商再生元醫藥公司
Publication of TW202110323A publication Critical patent/TW202110323A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文尤其提供經基因修飾之非人類動物，其生殖系基因組包括經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至非人類Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。所有經基因修飾之非人類動物的B細胞所表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。此類動物、來自此類動物之組織及來自此類動物之細胞，係代表一種產生抗體，例如雙特異性抗體之有效平臺。

Description

具有表現自κ基因座的有限λ輕鏈組庫的非人類動物及其用途
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2019年6月5日申請之美國臨時申請案第62/857,712號的優先權，該臨時申請案以引用之方式併入本文中。序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式電子提交且以引用之方式整體併入本文中。ASCII拷貝於2020年5月20日建立，名稱為2010794-2060_SL.txt，且大小為47,576位元組。
人類抗體係增長最迅速之治療劑類別。在當前用於產生其之技術當中，整體或部分地經編碼人類抗體之遺傳物質進行工程改造的基因工程動物(例如嚙齒類動物)，其發展已徹底革新治療各種疾病之人類治療性單株抗體領域。然而，目前仍然需要發展較佳之產生人類單株抗體的活體內系統，其使人類抗體組庫在宿主基因工程動物中最大化。
本文提供經基因修飾之嚙齒類動物。在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物為大鼠或小鼠。在一些實施例中，所有內源序列為大鼠或小鼠序列。舉例而言，在一些實施例中，經基因修飾之嚙齒類動物為大鼠，且所有內源序列為大鼠序列。在一些實施例中，經基因修飾之嚙齒類動物為小鼠，且所有內源序列為小鼠序列。
在一些實施例中，本文提供如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物的繁殖群，其包含第一經基因修飾之嚙齒類動物、第二經基因修飾之嚙齒類動物及第三經基因修飾之嚙齒類動物，其中該第一、第二及第三經基因修飾之嚙齒類動物各為如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物。在一些實施例中，第三經基因修飾之嚙齒類動物為第一經基因修飾之嚙齒類動物及第二經基因修飾之嚙齒類動物的後代。
如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，係具有包含有限人類λ輕鏈可變區組庫(repertoire)之生殖系基因組。在一些實施例中，有限人類λ輕鏈可變區組庫可包含一或兩個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，有限人類λ輕鏈可變區組庫可包含兩個未重排人類Vλ基因區段及四個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，有限人類λ輕鏈可變區組庫可包含兩個未重排人類Vλ基因區段及五個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，有限人類λ輕鏈可變區組庫可包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，包括包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區。
在一些實施例中，所有由如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞所表現之免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自有限人類λ輕鏈可變區組庫。在一些實施例中，由如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞表現之所有免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。在一些實施例中，由本文提供之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞表現之所有免疫球蛋白輕鏈，均包括自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式表現的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域。在一些實施例中，由經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的所有重鏈，均包括人類免疫球蛋白重鏈可變域及嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定域。
在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，包括包含有限人類λ輕鏈可變區組庫的經工程改造之內源嚙齒類動物免疫球蛋白輕鏈基因座。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，包括包含有限人類λ輕鏈可變區組庫的經工程改造之內源嚙齒類動物免疫球蛋白λ輕鏈基因座。在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，包括包含有限人類λ輕鏈可變區組庫的經工程改造之內源嚙齒類動物免疫球蛋白κ輕鏈基因座。在一些實施例中，經基因修飾之嚙齒類動物的生殖系基因組，其經工程改造之內源免疫球蛋白輕鏈基因座(例如經工程改造之內源免疫球蛋白λ或κ輕鏈基因座)係為同型合子。在一些實施例中，經基因修飾之嚙齒類動物的生殖系基因組，其經工程改造之內源免疫球蛋白輕鏈基因座(例如經工程改造之內源免疫球蛋白λ或κ輕鏈基因座)係為異型合子。
在一些實施例中，經基因修飾之嚙齒類動物的生殖系基因組，包括包含兩個對偶基因的經工程改造之內源免疫球蛋白κ基因座。在一些實施例中，第一對偶基因包含有限人類λ輕鏈可變區組庫，且第二對偶基因包含有限人類κ輕鏈可變區組庫。在一些實施例中，如本文所述的經基因修飾之嚙齒類動物的生殖系基因組及因此嚙齒類動物細胞及嚙齒類動物組織，係包括第一經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，如本文所述的經基因修飾之嚙齒類動物及因此嚙齒類動物細胞或嚙齒類動物組織，係包括第二經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cκ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區包含人類Vκ基因區段及人類Jκ基因區段。在一些實施例中，此類非人類動物或非人類組織可自第一經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因表現λ輕鏈及自第二經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因表現κ輕鏈。在一些實施例中，單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區包含Vκ3-20或Vκ1-39，且單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含Vλ1-51或Vλ2-14。在一個實施例中，單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區為Vκ3-20/Jκ1，且單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區為Vλ1-51/Jλ2或Vλ2-14/Jλ2。
在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，係包含可操作地連接至輕鏈恆定區基因區段之有限人類λ輕鏈可變區組庫。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，係包含可操作地連接至Cκ基因區段之有限人類λ輕鏈可變區組庫。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，係包含可操作地連接至Cλ基因區段之有限人類λ輕鏈可變區組庫。
在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，係包括經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。
在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ1-51或Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，人類Jλ基因區段為Jλ2。
在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物在經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座處缺乏嚙齒類動物Cκ基因。
在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有包含經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座的生殖系基因組。在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座包含一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。在一些實施例中，一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段可操作地連接至一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因。
在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有包含經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座的生殖系基因組，該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座包含可操作地連接至一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有其經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座為同型合子的生殖系基因組。
在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物係具有生殖系基因組，其包含一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段代替一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段、一或多個內源JH 基因區段或其組合。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有生殖系基因組，其包含分別替代一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段及一或多個內源JH 基因區段的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段的。
在一些實施例中，一或多個未重排人類VH 基因區段包含VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2、VH 6-1或其任何組合。在一些實施例中，一或多個未重排人類DH 基因區段包含DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26、DH 7-27或其任何組合。在一些實施例中，一或多個未重排人類JH 基因區段包含JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5、JH 6或其任何組合。
在一些實施例中，(i)一或多個未重排人類VH 基因區段包含VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2、VH 6-1或其任何組合，(ii)一或多個未重排人類DH 基因區段包含DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26、DH 7-27或其任何組合，以及(iii)一或多個未重排人類JH 基因區段包含JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5、JH 6或其任何組合。
在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有生殖系基因組，其包含一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因。在一些實施例中，一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因為一或多個內源嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因。
在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有生殖系基因組，其包含缺乏功能性內源嚙齒類動物Adam6基因之經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有生殖系基因組，其包含編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物，係表現一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有生殖系基因組，其包含編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，該一或多個核苷酸序列係包含在與經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座相同的染色體上。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有生殖系基因組，其包含經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座包含編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有生殖系基因組，該生殖系基因組係包含代替(in place of)人類Adam6偽基因的編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。在一些實施例中，如本文所提供之經基因修飾之嚙齒類動物係具有生殖系基因組，其包含替代人類Adam6偽基因的編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。
在一些實施例中，如所提供之經基因修飾之嚙齒類動物具有生殖系基因組，其包含一或多個人類VH 基因區段，該一或多個人類VH 基因區段係包含第一及第二人類VH 基因區段；及一或多個核苷酸序列，該一或多個核苷酸序列係編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段，且介於第一人類VH 基因區段與第二人類VH 基因區段之間。在一些實施例中，第一人類VH 基因區段為VH 1-2且第二人類VH 基因區段為VH 6-1。
在一些實施例中，編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係介於人類VH 基因區段與人類DH 基因區段之間。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與小鼠Cλ1至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與小鼠Cλ2至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與小鼠Cλ3基因至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因為或包含小鼠Cλ基因。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因為或包含小鼠Cλ1基因。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與大鼠Cλ1至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與大鼠Cλ2至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與大鼠Cλ3至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與大鼠Cλ4基因至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因為或包含大鼠Cλ基因。
在一些實施例中，單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係代替一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段或其任何組合。在一些實施例中，單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係替代一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段或其任何組合。
在一些實施例中，本文提供之經基因修飾之小鼠包含功能性內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。在一些實施例中，本文提供之經基因修飾之小鼠包含未活化的內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。在一些實施例中，內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座係藉由內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座的全部或一部分缺失或顛倒，而使其不活化。在一些實施例中，內源Vλ基因區段、內源Jλ基因區段及內源Cλ基因係整體或部分缺失。
在一些實施例中，本文提供之經基因修飾之小鼠表現內源免疫球蛋白κ輕鏈可變域係不可偵測。
本文提供包含如本文所述之基因修飾的嚙齒類動物胚胎。在一些實施例中，嚙齒類動物胚胎具有包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座的基因組，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段的單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，嚙齒類動物胚胎之基因組其經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座係為同型合子。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ1-51或Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段為Jλ2。
在一些實施例中，係提供一種嚙齒類動物胚胎，其基因組包含經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座包含可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。在一些實施例中，嚙齒類動物胚胎之基因組其經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座係為同型合子。
本文提供本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞。在一些實施例中，本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞係包含經工程改造之內源κ輕鏈基因座的單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
在一些實施例中，本文提供如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞，其包含經工程改造之內源κ輕鏈基因座的單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。在一些實施例中，如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞包含重排人類免疫球蛋白重鏈可變區，該重排人類免疫球蛋白重鏈可變區係源自於經工程改造之內源重鏈基因座中一或多個未重排人類VH 基因區段之人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段之人類DH 基因區段，及一或多個未重排人類JH 基因區段之人類JH 基因區段。
本文提供由如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞產生的融合瘤。
本文提供來自單個如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞群體。在一些實施例中，所有由B細胞群體表現之抗體，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，其係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。在一些實施例中，由B細胞群體所表現之抗體係包括複數個人類免疫球蛋白重鏈可變域，其係表現自至少兩個不同的重排人類免疫球蛋白重鏈可變區或其體細胞超突變型式。
本文提供幹細胞，諸如包含如本文所述之基因修飾的胚胎幹(ES)細胞。在一些實施例中，幹細胞(例如ES細胞)包括經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區。在一些實施例中，幹細胞(例如ES細胞)之基因組其經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座係為同型合子。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ1-51或Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段為Jλ2。
在一些實施例中，幹細胞(例如ES細胞)包括經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，其包含可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。
本文提供一種表現抗體之哺乳動物細胞。在一些實施例中，由哺乳動物細胞表現之抗體係包括包含人類免疫球蛋白重鏈可變域之重鏈及包含人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之輕鏈，其中人類免疫球蛋白重鏈可變域、人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域或兩者係自本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物鑑定、分離或與其一致。
在一些實施例中，藉由包括以下步驟之方法來製備抗體：(a)將本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；(b)維持經基因修飾之嚙齒類動物處於足以使經基因修飾之嚙齒類動物對感興趣的抗原產生免疫反應的條件下；以及(c)自經基因修飾之嚙齒類動物回收以下物質：(i)結合感興趣的抗原之抗體，(ii)編碼結合感興趣的抗原之抗體之人類輕鏈可變域、人類重鏈可變域、輕鏈或重鏈的核苷酸，或(iii)表現結合感興趣的抗原之抗體的細胞，其中(c)之抗體包括人類重鏈可變域及人類λ輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。
在一些實施例中，製造抗體之方法包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於抗原；(b)允許經基因修飾之嚙齒類動物對抗原顯現免疫反應；以及(c)自經基因修飾之嚙齒類動物分離出對該抗原具特異性之抗體、表現對該抗原具特異性之抗體的B細胞，或編碼對該抗原具特異性之抗體之一或多個核苷酸序列。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。
在一些實施例中，製造抗體之方法包括以下步驟：(a)在哺乳動物細胞中表現該抗體，其包含兩個人類免疫球蛋白λ輕鏈及兩個人類免疫球蛋白重鏈，其中各人類免疫球蛋白λ輕鏈係包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域且各人類免疫球蛋白重鏈係包括人類免疫球蛋白重鏈可變域，其中該等人類免疫球蛋白重鏈可變域中之至少一者、該等λ輕鏈可變域中之至少一者或其組合的胺基酸序列，係自如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物所鑑定或分離出者；以及(b)獲得該抗體。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。
在一些實施例中，係提供一種製造雙特異性抗體之方法，其包括：(a)使如本文所述之第一經基因修飾之嚙齒類動物與第一抗原之第一抗原决定基接觸；(b)使如本文所述之第二經基因修飾之嚙齒類動物與第二抗原之第二抗原决定基接觸；(c)自第一經基因修飾之嚙齒類動物分離出B細胞，該B細胞表現對第一抗原之第一抗原决定基具特異性之第一抗體，並確定第一抗體之第一人類免疫球蛋白重鏈可變域；(d)自第二經基因修飾之嚙齒類動物分離出B細胞，該B細胞表現對第二抗原之第二抗原决定基具特異性之第二抗體，並確定第二抗體之第二人類免疫球蛋白重鏈可變域；(e)將編碼第一人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列可操作地連接至編碼第一人類免疫球蛋白恆定域之核苷酸序列，以產生編碼第一人類重鏈之第一核苷酸序列；(f)將編碼第二人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列可操作地連接至編碼第二人類免疫球蛋白恆定域之核苷酸序列，以產生編碼第二人類重鏈之第二核苷酸序列；(g)在哺乳動物細胞中表現以下物質：(i)第一核苷酸序列；(ii)第二核苷酸序列；及(iii)第三核苷酸序列，其包含可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
在一些實施例中，本文提供一種製造雙特異性抗體之方法，該方法包括(a)在哺乳動物細胞中表現：(i)第一核苷酸序列，其包含可操作地連接至第一人類免疫球蛋白恆定區之第一人類免疫球蛋白重鏈可變區；(ii)第二核苷酸序列，其包含可操作地連接至第二人類免疫球蛋白恆定區之第二人類免疫球蛋白重鏈可變區；及(iii)第三核苷酸序列，其包含可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區之人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區。在一些實施例中，第一人類免疫球蛋白重鏈可變區編碼自如本文所述之第一經基因修飾之嚙齒類動物中的第一抗體所鑑定出、分離出或與其一致的第一人類重鏈可變域，該第一經基因修飾之嚙齒類動物係已被第一抗原之第一抗原决定基免疫接種，其中第一抗體特異性結合第一抗原之第一抗原决定基。在一些實施例中，第二人類免疫球蛋白重鏈可變區編碼自如本文所述之第二經基因修飾之嚙齒類動物中的第二抗體所鑑定出、分離出或與其一致的第二人類重鏈可變域，該第二經基因修飾之嚙齒類動物係已被第二抗原之第二抗原决定基免疫接種，其中第二抗體特異性結合第二抗原之第二抗原决定基。在一些實施例中，第三核苷酸之人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區為單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
在一些實施例中，第一經基因修飾之嚙齒類動物及第二經基因修飾之嚙齒類動物，係相同的經基因修飾之嚙齒類動物。在一些實施例中，第一經基因修飾之嚙齒類動物及第二經基因修飾之嚙齒類動物，係為相異的經基因修飾之嚙齒類動物。
在一些實施例中，第一抗原及第二抗原係為相同的抗原，且第一抗原决定基及第二抗原决定基係為不同的抗原决定基。在一些實施例中，第一抗原及第二抗原係為不同的抗原。
在一些實施例中，製造人類免疫球蛋白重鏈之方法包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；(b)獲得抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列，該抗體係特異性結合抗原且由經基因修飾之嚙齒類動物所產生；以及(c)將人類免疫球蛋白重鏈可變域序列可操作地連接至人類免疫球蛋白重鏈恆定域序列，以形成人類免疫球蛋白重鏈。在一些實施例中，係提供藉由此段落之方法所產生的人類免疫球蛋白重鏈。
在一些實施例中，製備人類免疫球蛋白重鏈可變域之方法包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；及(b)獲得抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列，該抗體特異性結合抗原且由經基因修飾之嚙齒類動物所產生。在一些實施例中，係提供藉由此段落之方法所產生的人類免疫球蛋白重鏈可變域。
在一些實施例中，製造一系列人類免疫球蛋白重鏈可變域之方法，包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原，及(b)自經基因修飾之嚙齒類動物分離出該系列人類免疫球蛋白重鏈可變域。在一些實施例中，一系列人類免疫球蛋白重鏈可變域各結合於自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式表現之人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，其中人類λ輕鏈可變域與該系列中之人類免疫球蛋白重鏈可變域中的任一者配對者，係結合抗原。
在一些實施例中，製備人類免疫球蛋白λ輕鏈之方法，包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；(b)獲得抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列，該抗體係特異性結合抗原且由經基因修飾之嚙齒類動物所產生；以及(c)將人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定域序列，以形成人類免疫球蛋白λ輕鏈。在一些實施例中，係提供由此段落之方法所產生的人類免疫球蛋白λ輕鏈。
在一些實施例中，用於產生人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之方法，包括以下步驟：(a)將本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；及(b)獲得抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列，該抗體係特異性結合抗原且由經基因修飾之嚙齒類動物產生之。在一些實施例中，係提供由此段落之方法所產生的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域。
在一些實施例中，製造編碼人類免疫球蛋白重鏈之核苷酸序列之方法包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；(b)獲得人類免疫球蛋白重鏈可變區，該人類免疫球蛋白重鏈可變區係編碼特異性結合抗原且由經基因修飾之嚙齒類動物產生之抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列；以及(c)將人類免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至人類免疫球蛋白重鏈恆定區序列，以形成編碼人類免疫球蛋白重鏈之核苷酸序列。在一些實施例中，係提供藉由此段落之方法所產生的編碼人類免疫球蛋白重鏈之核苷酸序列。
在一些實施例中，製造包含人類免疫球蛋白重鏈可變區之核苷酸序列之方法，包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；及(b)獲得人類免疫球蛋白重鏈可變區，該人類免疫球蛋白重鏈可變區係編碼特異性結合抗原且由經基因修飾之嚙齒類動物產生之抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列。在一些實施例中，係提供藉由此段落之方法所產生的包含人類免疫球蛋白重鏈可變區之核苷酸序列。
在一些實施例中，製造編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈之核苷酸序列之方法包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；(b)獲得人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係編碼特異性結合抗原且由經基因修飾之嚙齒類動物產生之抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列；及(c)將人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區序列，以形成編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈之核苷酸序列。在一些實施例中，係提供由此段落之方法所產生的編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈之核苷酸序列。
在一些實施例中，製造包含人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區之核苷酸序列之方法包括以下步驟：(a)將如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；及(b)獲得人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係編碼特異性結合抗原且由經基因修飾之嚙齒類動物產生之抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列。在一些實施例中，係提供藉由此段落之方法所產生的包含人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區之核苷酸序列。
在一些實施例中，提供一種靶向載體。在一些實施例中，靶向載體包含(i)5'同源臂，其包含與內源嚙齒類動物κ輕鏈基因座中之5'目標序列相對應之核苷酸序列；(ii)單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包含Vλ基因區段及Jλ基因區段；(iii)嚙齒類動物Cλ基因區段；及(iv) 3'同源臂，其包含與內源嚙齒類動物κ輕鏈基因座中之3'目標序列相對應之核苷酸序列。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ1-51或Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，人類Jλ基因區段為Jλ2。
在一些實施例中，製造本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的方法包括以下步驟：(a)將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中；及(b)使用步驟(a)中所產生之嚙齒類動物ES細胞來產生嚙齒類動物。
在一些實施例中，製備本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的方法包括以下步驟：(a)將可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段；及(b)使用步驟(a)中所產生之嚙齒類動物ES細胞來產生嚙齒類動物。在一些實施例中，嚙齒類動物ES細胞之基因組包含在經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座處可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。在一些實施例中，嚙齒類動物ES細胞之基因組進一步包含一或多個核苷酸序列，其編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。
在一些實施例中，製造經基因修飾之嚙齒類動物ES細胞的方法包括以下步驟：將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。在一些實施例中，製造經基因修飾之嚙齒類動物ES細胞的方法包括以下步驟：將可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，嚙齒類動物ES細之基因組胞包含在經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座處可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。在一些實施例中，嚙齒類動物ES細胞之基因組進一步包含一或多個核苷酸序列，其編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之。
在一些實施例中，製造如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的方法包括以下步驟：(a)對嚙齒類動物之生殖系基因組中之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座進行工程改造，以包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段的單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段，使得所有由經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的免疫球蛋白λ輕鏈均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。在一些實施例中，一種方法進一步包括以下步驟：(b)對嚙齒類動物之生殖系基因組中之內源免疫球蛋白重鏈基因座進行工程改造，以包含可操作地連接至一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，使得所有由經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的重鏈，均包括人類免疫球蛋白重鏈可變域及嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定域。在一些實施例中，步驟(b)包括對內源免疫球蛋白重鏈基因座進行工程改造以進一步包含一或多個核苷酸序列，該一或多個核苷酸序列係編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。在一些實施例中，步驟(a)及/或步驟(b)係在嚙齒類動物ES細胞中進行。
在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ1-51或Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，人類Jλ基因區段為Jλ2。
在一些實施例中，內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座缺乏嚙齒類動物Cκ基因。
在一些實施例中，一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，係代替一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段、一或多個內源JH 基因區段或其組合。在一些實施例中，一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，係分別替代一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段及一或多個內源JH 基因區段。
在一些實施例中，一或多個未重排人類VH 基因區段包含VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2、VH 6-1或其任何組合。在一些實施例中，一或多個未重排人類DH 基因區段包含DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26、DH 7-27或其任何組合。在一些實施例中，一或多個未重排人類JH 基因區段包含JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5、JH 6或其任何組合。
在一些實施例中，一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因係為一或多個內源嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因。
在一些實施例中，內源免疫球蛋白重鏈基因座缺乏功能性內源嚙齒類動物Adam6基因。在一些實施例中，經基因修飾之嚙齒類動物之生殖系基因組包含一或多個核苷酸序列，其係編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。在一些實施例中，一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段，係由經基因修飾之嚙齒類動物所表現。在一些實施例中，編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列包括在與經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座相同的染色體上。在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座包含一或多個核苷酸序列，其係編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。在一些實施例中，編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係代替人類Adam6偽基因。在一些實施例中，編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係替代人類Adam6偽基因。
在一些實施例中，一或多個人類VH 基因區段包含第一及第二人類VH 基因區段，且編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係介於第一人類VH 基因區段與第二人類VH 基因區段之間。在一些實施例中，第一人類VH 基因區段為VH 1-2且第二人類VH 基因區段為VH 6-1。
在一些實施例中，編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係介於人類VH 基因區段與人類DH 基因區段之間。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與小鼠Cλ1至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與小鼠Cλ2至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與小鼠Cλ3基因至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因為或包含小鼠Cλ基因。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因為或包含小鼠Cλ1基因。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與大鼠Cλ1至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與大鼠Cλ2至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與大鼠Cλ3至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因具有與大鼠Cλ4基因至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因為或包含大鼠Cλ基因。
在一些實施例中，單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，係代替一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段或其任何組合。在一些實施例中，單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，係替代一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段或其任何組合。在一些實施例中，本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物的生殖系基因組進一步包含未活化的內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。在一些實施例中，內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座係藉由缺失或顛倒內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座的全部或一部分使其不活化。在一些實施例中，內源Vλ基因區段、內源Jλ基因區段及內源Cλ基因係整體或部分缺失。
於為為序列表中所選序列之簡要描述
在如本文所述之非人類動物之一些實施例中可利用的各種人類Vλ及Jλ基因區段之代表性核苷酸及胺基酸序列可得自the International Immunogenetics Information System website、www.imgt.org或LeFranc, M-P., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001年5月23日(本文稱為「LeFranc 2001」)。
以下為在如本文所述之非人類動物之一些實施例中可利用的各種小鼠、大鼠或人類λ恆定區或域之代表性核苷酸及胺基酸序列。表 5 ：某些小鼠 Cλ 基因區段之核苷酸序列
基因區段 SEQ ID NO 序列
Cλ1 1 GCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGATTTCTACCCAGGTGTGGTGACAGTGGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGTATGGAGACAACCCAGCCTTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTGACCCTGACAGCAAGAGCATGGGAAAGGCATAGCAGTTACAGCTGCCAGGTCACTCATGAAGGTCACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCC
Cλ2 2 GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACTCTCACCGTGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAGGAAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCCAACTTTTCCCCGAGTGGTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACCAAAGAGGGCAACAAGTTCATGGCCAGCAGCTTCCTACATTTGACATCGGACCAGTGGAGATCTCACAACAGTTTTACCTGTCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTCTC
Cλ3 3 GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACCATGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAGGAAAACAAAGCCACACTCGTGTGTCTGATTTCCAATTTTTCCCCAAGTGGTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACCAAAGAGGACAACAAGTACATGGCCAGCAGCTTCTTACATTTGACATCGGACCAGTGGAGATCTCACAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTCTC
表 6 ：某些小鼠 Cλ 基因區段之胺基酸序列
基因區段 SEQ ID NO 序列
Cλ1 4 GQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS
Cλ2 5 GQPKSTPTLTVFPPSSEELKENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEGNKFMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTHEGDTVEKSLSPAECL
Cλ3 6 GQPKSTPTLTMFPPSPEELQENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEDNKYMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTHEGDTVEKSLSPAECL
表 7 ：某些大鼠 Cλ 基因區段之核苷酸序列
基因區段 SEQ ID NO 序列
Cλ1 7 GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTGTC
Cλ2 8 ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGTGGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTCAAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGGAGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC
Cλ3 9 GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAAAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAGTGTGTC
Cλ4 10 ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGTGGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTCAAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGGAGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC
表 8 ：某些大鼠 Cλ 基因區段之胺基酸序列
基因區段 SEQ ID NO 序列
Cλ1 11 GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQGNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV
Cλ2 12 DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKATLVCMVTDFYPGVMTVVWKADGTPITQGVETTQPFKQNNKYMATSYLLLTAKAWETHSNYSCQVTHEENTVEKSLSRAECS
Cλ3 13 GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQGNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV
Cλ4 14 DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKATLVCMVTDFYPGVMTVVWKADGTPITQGVETTQPFKQNNKYMATSYLLLTAKAWETHSNYSCQVTHEENTVEKSLSRAECS
表 9 ：某些人類 Cλ 基因區段之核苷酸序列
基因區段 SEQ ID NO 序列
Cλ1 15 CCCAAGGCCAACCCCACGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCTTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACGACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG
Cλ2 16 GTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
Cλ3 17 CCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTTGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGGGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTTGCCCCTACGGAATGTTCATAG
Cλ6 18 GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCATCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGCCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGAAAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAACACGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGTTCATAG
Cλ7 19 GTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT
表 10 ：某些人類 Cλ 基因區段之胺基酸序列
基因區段 SEQ ID NO 序列
Cλ1 20 PKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Cλ2 21 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Cλ3 22 PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Cλ6 23 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS
Cλ7 24 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
以下為在如本文所述之非人類動物之一些實施例中可利用的小鼠、大鼠或人類κ恆定區或域之代表性核苷酸及胺基酸序列。
小鼠 Cκ 之核苷酸序列 (SEQ ID NO: 25) ( 如圖 7 中再現 ) ：
GGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG agacaaaggtcctgagacgccaccaccagctccccagctccatcctatcttcccttctaaggtcttggaggcttccccacaagcgacctaccactgttgcggtgctccaaacctcctccccacctccttctcctcctcctccctttccttggcttttatcatgctaatatttgcagaaaatattcaataaagtgagtctttgcacttga
關於SEQ ID NO: 25，以下適用： -     編碼序列由粗體字母表示；且 -     3'未轉譯區未加粗。
小鼠 Cκ 之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 26) ：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
大鼠 Cκ 之核苷酸序列 (SEQ ID NO: 27) ( 如圖 8 中再現 ) ：
GGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCTATCTTCCCACCATCCACGGAACAGTTAGCAACTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCCTCATGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCAAGTGGAAGATTGATGGCACTGAACGACGAGATGGTGTCCTGGACAGTGTTACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACGTACAGCATGAGCAGCACCCTCTCGTTGACCAAGGCTGACTATGAAAGTCATAACCTCTATACCTGTGAGGTTGTTCATAAGACATCATCCTCACCCGTCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG ACCCAAAGGTCCTGAGGTGCCACCTGCTCCCCAGCTCCTTCCAATCTTCCCTCCTAAGGTCTTGGAGACTTCCCCACAAGCGACCTACCACTGTTGCGGTGCTCCAAACCTCCTCCCCACCTCATCCTCCTTCCTTTCCTTGGCTTTGATCATGCTAATATTTGGGGAATATTAAATAAAGTGAATCTTTGCACTTGA
關於SEQ ID NO: 27，以下適用： -     編碼序列由粗體字母表示；且 -     3'未轉譯區未加粗。
大鼠 Cκ 之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 28) ：
ADAAPTVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKIDGTERRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLTKADYESHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC
人類 Cκ 之核苷酸序列 (SEQ ID NO: 29) ：
GAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
人類 Cκ 之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 30) ：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
經工程改造之 Vλ1-51/Jλ2 載體之核苷酸序列 (SEQ ID NO: 31) ( 如圖 1A 中示意性示出及圖 9A 至 9C 中再現 ) ：
GGCGCGCC acctgcagtgtacacctgaggtgacatggttctgaacatcactttccccattgaaggcccgagtgacctatcacttgcttctcaaaattcaggaactaggtgactctaggagagtgcacaggaagctttctgcatattctttcaagagatttcgaggtcactgactcttttttcaagacttaaacacaaaatccacatccatcattcttgcgtaaagagaccattcttttttttttgagatggagtctcgctctgttgcccaagctggagtgcagtggcatgatctcggctcactgcaagctctgtcttctgggttcatgcccttctcctgcctcagcctcccaagtagctgggactacaggcacccgccgccatgcccggctaattttttgtattttttagtggagatggggtttcaacatgttggccagaatggtcttgatctcttgacctcgtgatccacccgccttggcctcccaaagtgctgggattacaggtgtgagccactgcacccggcccaagatggggtttcatcatgttgacctggctggtctcaaactcccaacctcaagtgatccactcacttcagcctcccaaagtgctgggatgacaggcgtgagccacagtgcccggcctagtacattgtttaaatggtgcatgtaaaacctcatggtactacaactgcctggtgacagactcaccagagtaaataactatcctgctgttctccaaccacatgggattccccaaacaaagatttgttgagtccaagatgcatcatgccagaactcttgcagtcatacacataatttgtttcattttaataaatacggttatcttttttcttcagtttattgtttttaatgtatcatcttctaggtttcattacacatcaaagatgaataatttctctcatctttaggacatgctgaaaacactcattagtgattttgaacagtattatttcctaaacatcctagttggaatggttgatcctaaaagctaccatgtgtcaggctcacctgagtgcagactgtggtctaaacaagctaaagttttaattcttccatcttcaaatacggagcatatttgcttgttttgctctttagcaaaacactgcaaagtcattcgccaggatctcctgcagactggcattcagtgatggagaacagactcctaggtgagatccctggtcacaggatccagatgactatgactgcaagtctggaaaagaagagacagaacaaagatttaccagcataaccctctgagaatgtgccccagccatcctggagggaagagctccctattgacccagcactgcagaatccacagaggaaggacagctctggccaccagggagcagccacacgacaagagaggacccggtgtccccacaggtgaggaaatgagtccatggggctggtcagtgctctcgatttcattctgccataacaggactttgtgtagtcaccacctgagtcctatacagtgaacagccaaggagacatggacagattcacccctgaggaacccagtagaatgtgaagtctgccctgaggtcacgaagaaaagactcggggggctgcctggcctggccctgatggagggggccatggacagaacaacggggaggcaggggtgtctctgagaggctctggtcaccttgtcatacaatggtggtgtacaatgtcgcaccatggacactagggggcgcctgcgcaccattcctgagaagactgggtgtgatgagagcaggaccagcgccacctgtcctgcttggtgccctatgcttagggctcacagatgtcaactctccaccccctgggaccacacagccccacccctggcactctctgacatcctcaggcagaggagcttgacccagggcccagggtgggatcagaaagctggagggtctgatttgcatggatggaccctccttctctcagagtataaagaggggcagggagagacttggggaagctctgcttcagctg TGAGCGCAGAAGGCAGGACTCGGGACAATCTTCATC ATG ACCTGCTCCCCTCTCCTCCTCACCCTTCTCATTCACTGCACAGgtgcccagacacagggtcaggggaggggtccaggaagcccatgaggccctgctttctccttctctctctagaccaagaatcaccgtgtctgtgtctctcctgcttccagGGTCCTGGGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCT GTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG gtaagtaatttttcactattgtcttctgaaatttgggtctgatggccagtattgacttttagaggcttaaataggagtttggtaaagattggtaaatgagggcatttaagatttgccatgggttgcaaaagttaaactcagcttcaaaaatggatttggagaaaaaaagattaaattgctctaaactgaatgacacaaagtaaaaaaaaaaagtgtaactaaaaaggaacccttgtatttctaaggagcaaaagtaaatttatttttgttcactcttgccaaatattgtattggttgttgctgattatgcatgatacagaaaagtggaaaaatacattttttagtctttctcccttttgtttgataaattattttgtcagacaacaataaaaatcaatagcacgccctaagaTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGAT
關於SEQ ID NO: 31，以下適用： -     限制酶位點序列-AscI (序列5'末端)及PI-SceI (序列3'末端)以大寫斜體字母表示； -     Vλ1-51啟動子序列由小寫字母(非粗體)表示； -     Vλ1-51 5' UTR序列由大寫、斜體且粗體字母表示； -     重排之Vλ1-51/Jλ2序列，其包括： ○      Vλ1-51外顯子1序列由大寫字母(非粗體)表示，其中Vλ1-51外顯子1起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線； ○      Vλ1-51內含子1序列由小寫粗體字母表示； ○      Vλ1-51外顯子2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃實線)字母表示，且 ○      Jλ2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃虛線))字母表示；且 -     人類Jκ5-Cκ內含子序列由小寫斜體字母表示。
包括 Vλ1-51 內含子 之 重排之 Vλ1-51/Jλ2 可變區 的 核苷酸序列 (SEQ ID NO: 32) ( 如圖 10 中再現 ) ：
ATG ACCTGCTCCCCTCTCCTCCTCACCCTTCTCATTCACTGCACAGgtgcccagacacagggtcaggggaggggtccaggaagcccatgaggccctgctttctccttctctctctagaccaagaatcaccgtgtctgtgtctctcctgcttccagGGTCCTGGGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCT GTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG
關於SEQ ID NO: 32，以下適用： -     Vλ1-51外顯子1序列由大寫字母表示，其中Vλ1-51外顯子1起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線； -     Vλ1-51內含子1序列由小寫粗體字母表示； -     Vλ1-51外顯子2序列由大寫粗體且加下劃線(下劃實線)字母表示；且 -     Jλ2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃虛線)字母表示。
無 Vλ1-51 內含子 之 重排之 Vλ1-51/Jλ2 可變區 的 核苷酸序列 (SEQ ID NO: 33) ( 如圖中再現 11) ：
ATG ACCTGCTCCCCTCTCCTCCTCACCCTTCTCATTCACTGCACAGGGTCCTGGGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG
關於SEQ ID NO: 33，以下適用： -     Vλ1-51編碼序列由大寫字母表示，其中Vλ1-51起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線；且 -     Jλ2序列由大寫字母及下劃虛線表示。
包括信號肽之重排之 Vλ1-51/Jλ2 可變域的胺基酸序列 (SEQ ID NO: 34) ( 如圖 12 中再現 ) ：
MTCSPLLLTLLIHCTGSWA QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAVVFGGGTKLTVL
關於SEQ ID NO: 34，斜體粗體字指示信號肽之序列。
無信號肽之重排之 Vλ1-51/Jλ2 可變域的胺基酸序列 (SEQ ID NO: 35) ：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAVVFGGGTKLTVL
經工程改造之 Vλ2-14/Jλ2 載體之核苷酸序列 (SEQ ID NO: 36) ( 如圖 2A 中示意性示出及圖 13A 至 13C 中再現 ) ：
GGCGCGCC acctgcagtgtacacctgaggtgacatggttctgaacatcactttccccattgaaggcccgagtgacctatcacttgcttctcaaaattcaggaactaggtgactctaggagagtgcacaggaagctttctgcatattctttcaagagatttcgaggtcactgactcttttttcaagacttaaacacaaaatccacatccatcattcttgcgtaaagagaccattcttttttttttgagatggagtctcgctctgttgcccaagctggagtgcagtggcatgatctcggctcactgcaagctctgtcttctgggttcatgcccttctcctgcctcagcctcccaagtagctgggactacaggcacccgccgccatgcccggctaattttttgtattttttagtggagatggggtttcaacatgttggccagaatggtcttgatctcttgacctcgtgatccacccgccttggcctcccaaagtgctgggattacaggtgtgagccactgcacccggcccaagatggggtttcatcatgttgacctggctggtctcaaactcccaacctcaagtgatccactcacttcagcctcccaaagtgctgggatgacaggcgtgagccacagtgcccggcctagtacattgtttaaatggtgcatgtaaaacctcatggtactacaactgcctggtgacagactcaccagagtaaataactatcctgctgttctccaaccacatgggattccccaaacaaagatttgttgagtccaagatgcatcatgccagaactcttgcagtcatacacataatttgtttcattttaataaatacggttatcttttttcttcagtttattgtttttaatgtatcatcttctaggtttcattacacatcaaagatgaataatttctctcatctttaggacatgctgaaaacactcattagtgattttgaacagtattatttcctaaacatcctagttggaatggttgatcctaaaagctaccatgtgtcaggctcacctgagtgcagactgtggtctaaacaagctaaagttttaattcttccatcttcaaatacggagcatatttgcttgttttgctctttagcaaaacactgcaaagtcattcgccaggatctcctgcagactggcattcagtgatggagaacagactcctaggtgagatccctggtcacaggatccagatgactatgactgcaagtctggaaaagaagagacagaacaaagatttaccagcataaccctctgagaatgtgccccagccatcctggagggaagagctccctattgacccagcactgcagaatccacagaggaaggacagctctggccaccagggagcagccacacgacaagagaggacccggtgtccccacaggtgaggaaatgagtccatggggctggtcagtgctctcgatttcattctgccataacaggactttgtgtagtcaccacctgagtcctatacagtgaacagccaaggagacatggacagattcacccctgaggaacccagtagaatgtgaagtctgccctgaggtcacgaagaaaagactcggggggctgcctggcctggccctgatggagggggccatggacagaacaacggggaggcaggggtgtctctgagaggctctggtcaccttgtcatacaatggtggtgtacaatgtcgcaccatggacactagggggcgcctgcgcaccattcctgagaagactgggtgtgatgagagcaggaccagcgccacctgtcctgcttggtgccctatgcttagggctcacagatgtcaactctccaccccctgggaccacacagccccacccctggcactctctgacatcctcaggcagaggagcttgacccagggcccagggtgggatcagaaagctggagggtctgatttgcatggatggaccctccttctctcagagtataaagaggggcagggagagacttggggaagctctgcttcagctg TGAGCGCAGAAGGCAGGACTCGGGACAATCTTCATC ATG GCCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAGGGCACAGgtgacgcctccagggaaggggcttcagggacctctgggctgatccttggtctcctgctcctcaggctcaccggggcccagcactgactcactggcatgtgtttctccctctttccagGGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTCTC GTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG gtaagtaatttttcactattgtcttctgaaatttgggtctgatggccagtattgacttttagaggcttaaataggagtttggtaaagattggtaaatgagggcatttaagatttgccatgggttgcaaaagttaaactcagcttcaaaaatggatttggagaaaaaaagattaaattgctctaaactgaatgacacaaagtaaaaaaaaaaagtgtaactaaaaaggaacccttgtatttctaaggagcaaaagtaaatttatttttgttcactcttgccaaatattgtattggttgttgctgattatgcatgatacagaaaagtggaaaaatacattttttagtctttctcccttttgtttgataaattattttgtcagacaacaataaaaatcaatagcacgccctaagaTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGAT
關於SEQ ID NO: 36，以下適用： -     限制酶位點序列-AscI (序列5'末端)及PI-SceI (序列3'末端)以大寫斜體字母表示； -     Vλ1-51啟動子序列由小寫字母(非粗體)表示； -     Vλ1-51 5' UTR序列由大寫、斜體且粗體字母表示； -     重排之Vλ2-14/Jλ2序列，其包括： ○      Vλ2-14外顯子1序列由大寫字母(非粗體)表示，其中Vλ2-14外顯子1起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線； ○      Vλ2-14內含子1序列由小寫粗體字母表示； ○      Vλ2-14外顯子2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃實線)字母表示，且 ○      Jλ2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃虛線))字母表示；且 ○      人類Jκ5-Cκ內含子序列由小寫斜體字母表示。
包括 Vλ2-14 內含子之重排之 Vλ2-14/Jλ2 可變區的核苷酸序列 (SEQ ID NO: 37) ( 如圖 14 中再現 ) ： ATG GCCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAGGGCACAGgtgacgcctccagggaaggggcttcagggacctctgggctgatccttggtctcctgctcctcaggctcaccggggcccagcactgactcactggcatgtgtttctccctctttccagGGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTCTC GTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG
關於SEQ ID NO: 37，以下適用： -     Vλ2-14外顯子1序列由大寫字母表示，其中Vλ2-14外顯子1起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線； -     Vλ2-14內含子1序列由小寫粗體字母表示； -     Vλ1-51外顯子2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃實線)字母表示；且 -     Jλ2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃虛線)字母表示。
無 Vλ2-14 內含子之重排之 Vλ2-14/Jλ2 可變區的核苷酸序列 (SEQ ID NO: 38) ( 如圖 15 中再現 ) ：
ATG GCCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAGGGCACAGGGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTCTCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG
關於SEQ ID NO: 38，以下適用： -     Vλ2-14序列由大寫字母表示，其中Vλ2-14起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線；且 -     Jλ2序列由大寫字母及下劃虛線表示。
包括信號肽之重排之 Vλ2-14/Jλ2 可變域的胺基酸序列 (SEQ ID NO: 39) ( 如圖 16 中再現 ) ：
MAWALLLLTLLTQGTGSWA QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLVVFGGGTKLTVL
關於SEQ ID NO: 39，斜體粗體字指示信號肽之序列。
無信號肽之重排之 Vλ2-14/Jλ2 可變域的胺基酸序列 (SEQ ID NO: 40) ：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLVVFGGGTKLTVL定義
本發明之範疇由隨附申請專利範圍界定，且不受本文所述之某些實施例限制。所屬領域之技術人員閱讀本說明書時，將清楚可等同於此類描述實施例或在申請專利範圍範疇內之各種修改。一般而言，除非另外清楚指示，否則本文中使用之術語係根據其在所屬領域中所瞭解之含義。以下提供某些術語之明確定義；所屬領域之技術人員自上下文將清楚本說明書通篇中特定情况下此等及其他術語之含義。本說明書通篇闡述以下及其他術語之額外定義。本說明書內引用之專利及非專利文獻參考文獻或其相關部分以引用之方式整體併入本文中。
申請專利範圍中修飾申請專利範圍要素之諸如「第一」、「第二」、「第三」等順序術語的使用本身不暗示一種申請專利範圍要素優於另一要素的任何優先權、優先或順序，或進行方法動作之暫時順序，而僅僅用作區分具有某一名稱之一種申請專利範圍要素與具有相同名稱(若未使用順序術語)之另一要素以區分權該等申請專利範圍要素。
應瞭解除非相反地清楚指示，否則如本文所用之冠詞「一種(a/an)」包括複數個指示物。除非相反地指示或另外自上下文顯而易見，否則若超過一個或所有群組成員存在於、用於或以其他方式與給定產物或方法有關，則在群組之一或多個成員之間包括「或」的申請專利範圍或描述視為符合。在一些實施例中，群組正好一個成員存在於、用於或以其他方式與給定產物或方法有關。在一些實施例中，超過一個或所有群組成員存在於、用於或以其他方式與給定產物或方法有關。應瞭解，除非另外指示，或除非所屬領域之一般技術人員顯而易見將出現矛盾或不一致，否則本發明涵蓋一或多個限制、要素、條款、描述性術語等自一或多個所列出之申請專利範圍引入依附於同一基礎申請專利範圍(或相關之任何其他申請專利範圍)之另一申請專利範圍中的所有變體、組合及變換。在要素呈清單呈現(例如馬庫西式群組(Markush group)或類似格式)之情况下，應瞭解亦揭示該等要素之各子群組，且可自該群組移除任何要素。應瞭解，一般而言，在實施例或態樣稱為「包含」具體要素、特徵等的情况下，某些實施例或態樣「由」此類要素、特徵等「組成」或「基本上由其組成」。為求簡單，彼等實施例不會在每種情况下特定明確地闡述於本文中。亦應瞭解，任何實施例或態樣均可明確地自申請專利範圍排除掉，不管本說明書中是否叙述該特定排除。
投與 ：如本文所用，包括向個體或系統(例如向細胞、器官、組織、生物體或其相關組分或組分集合)投與組成物(例如抗原或抗體)。熟練技術人員將瞭解投與途徑可視例如組成物正投與之個體或系統、組成物之性質、投與目的等變化。舉例而言，在某些實施例中，向動物個體(例如向人類或嚙齒類動物)投與可經支氣管(包括藉由支氣管滴注)、經頰、經腸、皮間(interdermal)、動脉內、皮內、胃內、髓內、肌肉內、鼻內、腹膜內、鞘內、靜脉內、心室內、經粘膜、經鼻、經口、經直腸、皮下、舌下、表面、經氣管(包括藉由氣管內滴注)、經皮、經陰道及/或經玻璃體。在一些實施例中，投與可涉及間歇給藥。在一些實施例中，投與可涉及連續給藥(例如灌注)至少所選時段。
抗原結合蛋白： 如本文所用，係指特異性結合於至少一種感興趣的抗原之任何蛋白質或多肽。抗原結合蛋白包括(但不限於)抗體、重鏈、輕鏈(例如λ或κ輕鏈)、重鏈可變域、輕鏈可變域(例如λ或κ輕鏈可變域)及單鏈可變片段(ScFv)。在一些實施例中，抗原結合蛋白可為多特異性的且特異性地結合於兩種或更多種抗原决定基或抗原。
大約 ：在應用於一或多個感興趣值時，包括與所述參考值類似之值。在某些實施例中，除非另有說明或另外自上下文顯而易見，否則術語「大約」或「約」係指在所述參考值±10% (大於或小於)內的值的範圍(此類數值超過可能值的100%除外)。
生物活性 ：如本文所用，係指在生物系統中、在活體外或活體內(例如在生物體中)具有活性之任何藥劑的特徵。舉例而言，在存在於生物體中時在該生物體內具有生物效應之藥劑視為生物活性的。在特定實施例中，在蛋白質或多肽為生物活性的情况下，共享蛋白質或多肽之至少一種生物活性的該蛋白質或多肽之一部分通常稱為「生物活性」部分。
可比 ：如本文所用，係指兩種或更多種藥劑、實體、情形、條件集合等彼此可能不一致，但足够相似，從而允許之間進行比較，以便基於觀察到之差異或相似性，可合理地得出結論。所屬領域之一般技術人員將理解在上下文中在兩種或更多種此類藥劑、實體、情形、條件集合等的任何給定情况下何種一致性程度視為可比。
保守 ：如本文所用，係指當描述保守胺基酸取代時，包括胺基酸殘基經側鏈R基團具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)之另一胺基酸殘基取代的情况。一般而言，保守胺基酸取代基本上不會改變蛋白質之所關注功能性，例如受體結合於配位體之能力。側鏈具有類似化學特性之胺基酸之組的實例包括：脂族側鏈，諸如甘胺酸(Gly、G)、丙胺酸(Ala、A)、纈胺酸(Val、V)、白胺酸(Leu、L)及異白胺酸(Ile、I)；脂族-羥基側鏈，諸如絲胺酸(Ser、S)及蘇胺酸(Thr、T)；含醯胺之側鏈，諸如天門冬醯胺(Asn、N)及麩醯胺酸(Gln、Q)；芳族側鏈，諸如苯丙胺酸(Phe、F)、酪胺酸(Tyr、Y)及色胺酸(Trp、W)；鹼性側鏈，諸如離胺酸(Lys、K)、精胺酸(Arg、R)及組胺酸(His、H)；酸性側鏈，諸如天門冬胺酸(Asp、D)及麩胺酸(Glu、E)；及含硫側鏈，諸如半胱胺酸(Cys、C)及甲硫胺酸(Met、M)。保守胺基酸取代組包括例如纈胺酸/白胺酸/異白胺酸(Val/Leu/Ile、V/L/I)、苯丙胺酸/酪胺酸(Phe/Tyr、F/Y)、離胺酸/精胺酸(Lys/Arg、K/R)、丙胺酸/纈胺酸(Ala/Val、A/V)、麩胺酸/天門冬胺酸(Glu/Asp、E/D)及天門冬醯胺/麩醯胺酸(Asn/Gln、N/Q)。在一些實施例中，保守胺基酸取代可為蛋白質中之任何天然殘基經丙胺酸取代，如例如丙胺酸掃描誘變中所使用。在一些實施例中，進行在以下中揭示之PAM250對數似然矩陣中具有正值的保守性取代：Gonnet, G.H.等人, 1992, Science 256:1443-1445，其以引用之方式整體併入本文中。在一些實施例中，取代為中度保守取代，其中該取代在PAM250對數似然矩陣中具有非負值。
對照 ：如本文所用，係指所屬領域中瞭解之「對照」之含義，作為結果進行比較之標準。通常，藉由分離變數以得出關於此類變數之結論，在實驗中使用對照來加强完整性。在一些實施例中，對照為與測試反應或分析同時進行之反應或分析以提供比較對象。「對照」亦包括「對照動物」。「對照動物」可具有如本文所述之修飾，與本文所述不同之修飾或無修飾(亦即野生型動物)。在一個實驗中，施加「測試」參數(例如測試之變數)。在第二實驗中，不施加「對照」測試之變數。在一些實施例中，對照為歷史對照(亦即先前進行之測試或分析，或先前已知之量或結果)。在一些實施例中，對照為或包含印刷或以其他方式保存之記錄。對照可為陽性對照或陰性對照。
破壞 ：如本文所用，係指與DNA分子(例如與內源同源序列，諸如基因或基因座)之同源重組事件的結果。在一些實施例中，破壞可實現或表示插入、缺失、取代、替換、錯義突變或DNA序列之框移或其任何組合。插入可包括插入整個基因或基因片段，例如外顯子，可為除內源序列以外之來源(例如異源序列)。在一些實施例中，破壞可增加基因或基因產物(例如由基因編碼之多肽)之表現及/或活性。在一些實施例中，破壞可减少基因或基因產物之表現及/或活性。在一些實施例中，破壞可改變基因或編碼之基因產物(例如編碼之多肽)的序列。在一些實施例中，破壞可截短基因或編碼之基因產物(例如編碼之多肽)或將其片段化。在一些實施例中，破壞可延長基因或編碼之基因產物。在一些此類實施例中，破壞可實現融合多肽之組裝。在一些實施例中，破壞可减少基因或基因產物之水準，而非活性。在一些實施例中，破壞可影響基因或基因產物之活性，而非水準。在一些實施例中，破壞可對基因或基因產物之水準無顯著作用。在一些實施例中，破壞可對基因或基因產物之活性無顯著作用。在一些實施例中，破壞可對基因或基因產物之水準或活性無顯著作用。
測定、量測、評估、評定、分析 (assaying) 及分析 (analyzing) ：在本文中可互換使用，係指任何量測形式，且包括確定要素是否存在。此等術語包括定量和/或定性測定。分析可為相對或絕對的。「分析存在 」可為確定存在之某物的量，及/或確定其是否存在。
內源啟動子 ：如本文所用，係指例如在野生型生物體中與內源基因天然締合之啟動子。
工程改造 ：如本文所用，一般係指人為操縱之態樣。舉例而言，在一些實施例中，當在自然界中不以某一順序連接在一起之兩種或更多種序列經人為操縱而在經工程改造之多核苷酸中彼此直接連接時，多核苷酸可視為「經工程改造 」。在一些實施例中，經工程改造之多核苷酸可包含調控序列，發現該調控序列在自然界中與第一編碼序列操作性締合，但不與第二編碼序列操作性締合，人為連接，以便其與第二編碼序列可操作地締合。可替代地或另外，在一些實施例中，各編碼在自然界中彼此不連接之多肽元件或域之第一及第二核酸序列在單個經工程改造之多核苷酸中可彼此連接。同等地，在一些實施例中，若細胞或生物體經操縱以致於其遺傳資訊改變(例如引入先前不存在之新遺傳物質，或先前存在之遺傳物質已改變或移除)，則其視為「經工程改造 」。作為慣例且所屬領域之技術人員所瞭解，經工程改造之多核苷酸或細胞的後代通常仍然稱為「經工程改造 」，即使實際操縱在先前實體上進行。此外，如所屬領域之技術人員所瞭解，可利用可實現如本文所述之「工程改造 」的多種方法。舉例而言，在一些實施例中，「工程改造 」可涉及經由使用經程式化以進行分析或比較或以其他方式分析、推薦及/或選擇序列、改變等)之計算機系統選擇或設計(例如核酸序列、多肽序列、細胞、組織及/或生物體)。可替代地或另外，在一些實施例中，「工程改造 」可涉及使用活體外化學合成方法及/或重組核酸技術，諸如核酸擴增(例如經由聚合酶鏈反應)雜交、突變、轉型、轉染等及/或多種控制配對方法中之任一種。如所屬領域之技術人員將瞭解，多種已確立之此類技術(例如重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型(例如電穿孔、脂質體轉染等))為所屬領域中所熟知且描述於本說明書通篇引用及/或論述之各種通用及更特定參考文獻中。參見例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989及Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 第5版, By Old, R.W.及S.B. Primrose編輯, Blackwell Science, Inc., 1994，以引用之方式整體併入本文中。
功能 ：如本文所用，係指展現具體特性(例如形成編碼序列之一部分)及/或活性的實體形式或片段(例如基因或基因區段)。舉例而言，在免疫球蛋白之上下文中，可變區藉由獨特的基因區段(亦即V、D及/或J)編碼，該等基因區段經組裝(或重組)以形成功能編碼序列。當存在於基因組中時，雖然發生變異，但基因區段組織成簇。「功能 」基因區段為在已分離(亦即選殖)對應基因組DNA之表現之序列(亦即可變區)中表示且藉由序列所鑑定的基因區段。一些免疫球蛋白基因區段序列含有開放閱讀框架且雖然未在表現之組庫中表示，但視為功能的，而其他免疫球蛋白基因區段序列含有引起終止密碼子及/或截短庫列之突變(例如點突變、插入、缺失等)，隨後使得此類基因區段序列不能進行與未突變序列相關之特性及/或活性。此類序列在表現之序列中未表示，因此，分類為偽基因。
基因 ：如本文所用，係指染色體中編碼產物(例如RNA產物及/或多肽產物)之DNA序列。在一些實施例中，基因包括編碼序列(亦即編碼特定產物之序列)。在一些實施例中，基因包括非編碼序列。在一些特定實施例中，基因可包括編碼(例如外顯子)與非編碼(例如內含子)序列。在一些實施例中，基因可包括一或多個調控序列(例如啟動子、强化子等)及/或內含子序列，該等序列例如可控制或影響基因表現之一或多個態樣(例如細胞類型特異性表現、誘導型表現等)。為求清楚，注意，在用於本文中時，術語「基因 」一般係指編碼多肽或其片段之核酸部分；所屬領域之一般技術人員將自上下文清楚，該術語可視情况涵蓋調控序列。此定義不意欲排除術語「基因」應用於非蛋白質編碼之表現單元，而是闡明在大多數情况下，如本文中所用之術語係指編碼多肽之核酸。
經基因修飾之非人類動物或經基因工程改造之非人類動物 ：在本文中可互換使用且係指任何非天然存在之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，其中整體或部分地，該非人類動物之一或多個細胞含有異源核酸及/或編碼所關注多肽之基因。舉例而言，在一些實施例中，「經基因修飾之非人類動物 」或「經基因工程改造之非人類動物 」係指含有如本文所述之轉殖基因或轉殖基因構築體之非人類動物。在一些實施例中，異源核酸及/或基因直接或間接地藉由引入前驅細胞中、藉助於故意遺傳操縱，諸如藉由顯微注射或藉由感染重組病毒來引入細胞中。術語遺傳操縱不包括經典繁殖技術，而是針對引入重組DNA分子。此分子可整合在染色體內。短語「經基因修飾之非人類動物 」或「經基因工程改造之非人類動物 」係指其異源核酸及/或基因為異型合子或同型合子的動物，及/或具有異源核酸及/或基因之單個或多個複本的動物。
生殖系組態 ：如本文所用，係指如在野生型動物(例如小鼠、大鼠或人類)之內源生殖系基因組中發現的序列排列(例如基因區段)。免疫球蛋白基因區段之生殖系組態之實例可見於例如LeFranc, M-P., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001年5月23日 (本文中稱為「LeFranc 2001」)： 人類重鏈可變區基因區段及人類重鏈恆定區基因之一種示例性組態可見於LeFranc 2001第47頁； 人類λ輕鏈可變區基因區段及人類λ輕鏈恆定區基因之一種示例性組態可見於LeFranc 2001第61頁； 人類κ輕鏈可變區基因區段及人類κ輕鏈恆定區基因之一種示例性組態可見於LeFranc 2001第53頁； 小鼠重鏈可變區基因區段及小鼠重鏈恆定區基因之一種示例性組態可見於Lucas, J.等人, Chapter 1: The Structure and Regulation of the Immunoglobulin Loci, Molecular Biology of B Cells, 第2版, Academic Press, 2015 (Lucas)； 小鼠λ輕鏈可變區基因區段及小鼠λ輕鏈恆定區基因之一種示例性組態可見於LeFranc, M-P等人, Chapter 4: Immunoglobulin Lambda (IGL) Genes of Human and Mouse, Molecular Biology of B Cells, 第1版, Academic Press, 2004 (LeFranc 2004)； 小鼠κ輕鏈可變區基因區段及小鼠κ輕鏈恆定區基因之一種示例性組態可見於Christele, M-J等人, Nomenclature and Overview of the Mouse (Mus musculus and Mus sp.) Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes, Exp Clin Immunogenet 2001, 18:255-279 (Christele)； LeFranc 2001、Lucas、LeFranc 2004及Christele之各引述部分以引用的方式併入本文中。
生殖系基因組 ：如本文所用，係指在動物形成中使用之生殖細胞(例如配子，例如精子或卵)中發現的基因組。生殖系基因組為動物中細胞之基因組DNA之來源。因而，在生殖系基因組中具有修飾之動物(例如小鼠或大鼠)視為在其所有細胞之基因組DNA中均具有修飾。
生殖系序列 ：如本文所用，係指如在野生型動物(例如小鼠、大鼠或人類)之內源生殖系基因組中發現的DNA序列，或由如在動物(例如小鼠、大鼠或人類)之內源生殖系基因組中發現之DNA序列編碼的RNA或胺基酸序列。免疫球蛋白基因區段之代表性生殖系序列可見於例如LeFranc 2001： 在如本文所述之一些實施例中可利用的人類VH 基因區段之代表性生殖系核苷酸序列及人類VH 基因區段之代表性生殖系胺基酸序列可見於LeFranc 2001第107-234頁； 在如本文所述之一些實施例中可利用的人類D基因區段之代表性生殖系核苷酸序列及人類D基因區段之代表性生殖系胺基酸序列可見於LeFranc 2001第98-100頁； 在如本文所述之一些實施例中可利用的人類JH 基因區段之代表性生殖系核苷酸序列及人類JH 基因區段之代表性生殖系胺基酸序列可見於LeFranc 2001第104頁； 在如本文所述之非人類動物之一些實施例中可利用的人類Vλ基因區段之代表性生殖系核苷酸序列及人類Vλ基因區段之代表性生殖系胺基酸序列可見於LeFranc 2001第350-428頁；且 在如本文所述之非人類動物之一些實施例中可利用的人類Jλ基因區段之代表性生殖系核苷酸序列及人類Jλ基因區段之代表性生殖系胺基酸序列可見於LeFranc 2001第346頁。 LeFranc 2001之各引述部分以引用的方式併入本文中。
異源 ：如本文所用，係指來自不同來源之劑或實體。舉例而言，當提及特定細胞或生物體中存在之多肽、基因或基因產物時使用時，該術語闡明相關多肽、基因或基因產物：1)經人為工程改造；2)人為(例如經由基因工程改造)引入細胞或生物體中(或其前驅細胞)；及/或3)並非相關細胞或生物體(例如相關細胞類型或生物體類型)天然產生或其中不存在。「異源 」亦包括特定天然細胞或生物體中通常存在，但已例如藉由突變或置於非天然相關及在一些實施例中非內源調控元件(例如啟動子)的控制下而改變或修飾的多肽、基因或基因產物。
宿主細胞 ：如本文所用，係指已引入核酸或蛋白質之細胞。熟練人員在閱讀本文後將瞭解，此類術語不僅指特定個體細胞，亦用於指此類細胞之後代。因為在後續世代中由於突變或者環境影響而可能存在某些修飾，所以此類後代事實上可不與母細胞一致，但仍然包括在短語「宿主細胞 」範圍內。在一些實施例中，宿主細胞為或包含原核或真核細胞。一般而言，宿主細胞為適合於接受及/或產生異源核酸或蛋白質之任何細胞，不管細胞表示之生命界如何。示例性細胞包括原核生物及真核生物之細胞(單細胞或多細胞)、細菌細胞(例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬(Bacillus spp. )、鏈黴菌屬(Streptomyces spp. )等菌株)、分枝桿菌屬(mycobacteria )細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )、巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris )、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica )等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如SF-9、SF-21、桿狀病毒感染之昆蟲細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni )等)、非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物，諸如雜交瘤或四體瘤。在一些實施例中，細胞為人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施例中，細胞為真核的且選自以下細胞：中國倉鼠卵巢(CHO) (例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS (例如COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431 (表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli細胞、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞及源自於前述細胞之細胞株。在一些實施例中，細胞包含一或多個病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞(例如PER.C6®細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為或包含分離之細胞。在一些實施例中，宿主細胞為組織之部分。在一些實施例中，宿主細胞為生物體之部分。
一致性 ：如本文中結合序列比較所用，係指如藉由所屬領域中已知之可用於量測核苷酸及/或胺基酸序列一致性之許多不同演算法確定的一致性。在一些實施例中，如本文所述之一致性係使用ClustalW v. 1.83 (緩慢)比對採用10.0之開放間隙罰分、0.1之延伸間隙罰分及使用Gonnet相似矩陣(MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)確定。
代替 ：如本文所用，係指一種位置取代，其中第一核酸序列位於染色體中第二核酸序列之位置上(例如其中第二核酸序列先前(例如最初)位於染色體中，例如第二核酸序列之內源基因座上)。短語「代替」不要求自例如基因座或染色體移除第二核酸序列。在一些實施例中，第二核酸序列及第一核酸序列彼此可比，因為例如第一及第二序列彼此同源，含有對應元件(例如蛋白質編碼元件、調控元件等)及/或具有類似或一致序列。在一些實施例中，第一及/或第二核酸序列包括啟動子、强化子、剪接供體位點、剪接受體位點、內含子、外顯子、未轉譯區(UTR)中之一或多個； 在一些實施例中，第一及/或第二核酸序列包括一或多個編碼序列。在一些實施例中，第一核酸序列為第二核酸序列之同源物或變異體(例如突變體)。在一些實施例中，第一核酸序列為第二序列之直系同源物或同源物。在一些實施例中，第一核酸序列為或包含人類核酸序列。在一些實施例中，包括在第一核酸序列為或包含人類核酸序列下，第二核酸序列為或包含嚙齒類動物序列(例如小鼠或大鼠序列)。在一些實施例中，包括在第一核酸序列為或包含人類核酸序列下，第二核酸序列為或包含人類序列。在一些實施例中，第一核酸序列為第二序列之變異體或突變體(亦即與第二序列相比含有一或多個序列差異，例如取代之序列)。如此置放之核酸序列可包括作為用於獲得如此置放之序列的源核酸序列之部分的一或多個調控序列(例如啟動子、强化子、5'-或3'-未轉譯區等)。舉例而言，在多個實施例中，第一核酸序列為內源序列經異源序列取代，由此自如此置放之該核酸序列(包含異源序列)產生基因產物，但不表現內源序列；第一核酸序列具有核酸序列編碼具有與由內源序列編碼之多肽類似功能之多肽的內源基因組序列(例如內源基因組序列編碼非人類可變區多肽整體或部分，且DNA片段編碼一或多個人類可變區多肽整體或部分)。在多個實施例中，人類免疫球蛋白基因區段或其片段代替內源非人類免疫球蛋白基因區段或片段。
活體外 ：如本文所用，係指在人造環境種，例如在試管或反應容器中、在細胞培養物中等發生，而非在多細胞生物體內發生之事件。
活體內 ：如本文所用，係指在多細胞生物體，諸如人類及/或非人類動物內發生之事件。在基於細胞之系統的背景下，該術語可用於指在活細胞內發生之事件(與例如活體外系統相對比)。
經分離 ：如本文所用，係指已(1)與在最初產生時所關聯之至少一些組分分離(無論在自然界中及/或在實驗背景下)及/或(2)人為設計、產生、製備及/或製造之物質及/或實體。經分離之物質及/或實體可與約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%的其最初相關聯之其他組分分離。在一些實施例中，經分離之劑與10%至100%、15%至100%、20%至100%、25%至100%、30%至100%、35%至100%、40%至100%、45%至100%、50%至100%、55%至100%、60%至100%、65%至100%、70%至100%、75%至100%、80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%、96%至100%、97%至100%、98%至100%或99%至100%的其最初相關聯之其他組分分離。在一些實施例中，經分離之劑與10%至100%、10%至99%、10%至98%、10%至97%、10%至96%、10%至95%、10%至90%、10%至85%、10%至80%、10%至75%、10%至70%、10%至65%、10%至60%、10%至55%、10%至50%、10%至45%、10%至40%、10%至35%、10%至30%、10%至25%、10%至20%或10%至15%的其最初相關聯之其他組分分離。在一些實施例中，經分離之劑與11%至99%、12%至98%、13%至97%、14%至96%、15%至95%、20%至90%、25%至85%、30%至80%、35%至75%、40%至70%、45%至65%、50%至60%或55%至60%的其最初相關聯之其他組分分離。在一些實施例中，經分離之劑為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%純。在一些實施例中，經分離之劑為80%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至99%、96%至99%、97%至99%或98%至99%純。在一些實施例中，經分離之劑為80%至99%、80%至98%、80%至97%、80%至96%、80%至95%、80%至90%或80%至85%純。在一些實施例中，經分離之劑為85%至98%、90%至97%或95%至96%純。在一些實施例中，若物質基本上不含其他組分，則其「純的 」。在一些實施例中，如所屬領域之技術人員所瞭解，物質在與諸如一或多種載劑或賦形劑(例如緩衝劑、溶劑、水等)之某些其他組分組合之後仍可視為「經分離 」或甚至「純的 」；在此類實施例中，物質之分離或純度百分比係在不包括此類載劑或賦形劑下計算。僅舉一例，在一些實施例中，在如下情形時，自然界中存在之諸如多肽或多核苷酸之生物聚合物視為「經分離 」：a)其來源或起源不與在自然界中在天然狀態下伴隨的一些或所有組分相關聯；b)其基本上不含來自與在自然界中產生其之物種相同之物種的其他多肽或核酸；或c)由並非在自然界中產生其之物種的細胞或其他表現系統表現或以其他方式與來自該細胞或其他表現系統之組分相關聯。因此，舉例而言，在一些實施例中，化學上合成或在與在自然界中產生其之細胞不同之細胞系統中合成的多肽視為「經分離 」之多肽。可替代地或另外，在一些實施例中，在已與以下之其他組分分離之程度上，已經受一或多種純化技術之多肽可視為「經分離 」之多肽：a)在自然界中相關聯之組分；及/或b)最初產生時所關聯之組分。
基因座 ：如本文所用，係指基因、DNA序列、多肽編碼序列之定位，或在生物體之基因組之染色體上的位置。舉例而言，「免疫球蛋白基因座 」可指免疫球蛋白基因區段(例如V、D、J或C)、免疫球蛋白基因區段DNA序列、免疫球蛋白基因區段編碼序列之定位，或確定為存在此類序列之生物體之基因組的染色體上的免疫球蛋白基因區段位置。「免疫球蛋白基因座 」可包含免疫球蛋白基因區段之調控元件，包括(但不限於)强化子、啟動子、5'及/或3'調控序列或區域、或其組合。「免疫球蛋白基因座 」可包含基因間DNA，例如通常存在於或出現在野生型基因座中之基因區段之間的DNA。所屬領域之一般技術人員將瞭解，在一些實施例中，染色體可含有數百或甚至數千基因且證明當在不同物種之間比較時類似遺傳基因座之物理共定位。此類遺傳基因座可稱作共享同線性(synteny)。
天然出現 ：如本文所用，在提及生物要素(例如核酸序列)時，意謂可在細胞或生物體(例如動物)中在規定背景及/或位置中在缺乏工程改造(例如基因工程改造)下找到該生物要素。換言之，在規定背景及/或位置中天然出現之序列不在由工程改造(例如基因工程改造)產生之規定背景及/或位置中。舉例而言，天然出現在內源人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座中人類Jκ1基因區段相鄰處之序列為可在人類中內源人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座中人類Jλ1基因區段相鄰處找到的序列，缺乏基因工程改造。在一些實施例中，可自在細胞或生物體中天然出現之處獲得、得到及/或分離序列。在一些實施例中，細胞或生物體不為天然出現在細胞或生物體中之序列的直接來源。舉例而言，可鑑別細胞或生物體中之對應序列，接著藉由所屬領域中已知之機制產生或複製。
非人類動物 ：如本文所用，係指非人類之任何脊椎動物生物體。在一些實施例中，非人類動物為圓口類動物、多骨魚、軟骨魚(例如鯊魚或鰩)、兩栖動物、爬行動物、哺乳動物及禽類。在一些實施例中，非人類動物為哺乳動物。在一些實施例中，非人類哺乳動物為靈長類動物、山羊、綿羊、猪、犬、母牛或嚙齒類動物。在一些實施例中，非人類動物為嚙齒類動物，諸如大鼠或小鼠。
核酸 ：如本文所用，係指併入或可併入寡核苷酸鏈中之任何化合物及/或物質。在一些實施例中，「核酸 」為經由磷酸二酯鍵併入或可併入寡核苷酸鏈中之化合物及/或物質。如自上下文顯而易見，在一些實施例中，「核酸 」係指個別核酸殘基(例如核苷酸及/或核苷)；在一些實施例中，「核酸 」係指包含個別核酸殘基之寡核苷酸鏈。在一些實施例中，「核酸 」為或包含RNA；在一些實施例中，「核酸 」為或包含DNA。在一些實施例中，「核酸 」為、包含一或多種天然核酸殘基或由其組成。在一些實施例中，「核酸 」為、包含一或多種天然核酸類似物或由其組成。在一些實施例中，核酸類似物與「核酸 」之不同之處在於其不利用磷酸二酯主鏈。舉例而言，在一些實施例中，「核酸 」為、包含一或多種「肽核酸 」或由其組成，「肽核酸 」為所屬領域中已知且在主鏈中肽鍵代替磷酸二酯鍵。可替代地或另外，在一些實施例中，「核酸 」具有一或多個硫代磷酸酯鍵及/或5'-N-胺基磷酸酯鍵，而非磷酸二酯鍵。在一些實施例中，「核酸 」為以下、包含以下或由以下組成：一或多個天然核苷(例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)。在一些實施例中，「核酸 」為以下、包含以下或由以下組成：一或多個核苷類似物(例如2-胺基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、插入碱基及其組合)。在一些實施例中，與天然核酸中之糖比較，「核酸 」包含一或多個經修飾之糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己糖)。在一些實施例中，「核酸 」具有編碼諸如RNA或多肽之功能基因產物之核苷酸序列。在一些實施例中，「核酸 」包括一或多個內含子。在一些實施例中，「核酸 」包括一或多個外顯子。在一些實施例中，「核酸 」藉由以下中之一或多者來製備：自天然來源分離、藉由基於互補模板(活體內或活體外)聚合而酶促合成、在重組細胞或系統中重現及化學合成。在一些實施例中，「核酸 」為至少例如但不限於3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、20個、225個、250個、275個、300個、325個、350個、375個、400個、425個、450個、475個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個或更多個殘基長。在一些實施例中，「核酸 」為單股；在一些實施例中，「核酸 」為雙股。在一些實施例中，「核酸 」具有包含至少一個編碼多肽或與編碼多肽之序列互補之元件的核苷酸序列。在一些實施例中，「核酸 」具有酶活性。
可操作地連接 ：如本文所用，係指組分的並置，其中所述組分處於允許其以所欲方式發揮作用之關係中(例如當組分存在於適當組織、細胞類型、細胞活動等中)時。舉例而言，若在B細胞發育中之適當時間，VH 、D及JH 基因區段可剪接至重鏈恆定區，不管此類剪接是否存在於例如免疫系統外之細胞(例如生殖細胞)中，則一或多個VH 基因區段、一或多個D基因區段及一或多個JH 基因區段「可操作地連接」至重鏈恆定區。「可操作地連接 」至編碼序列之控制序列以使編碼序列在與控制序列相容之條件下表現的方式連結。「可操作地連接 」之序列包括與所關注基因相連之表現控制序列及反式作用或隔開一定距離控制所關注基因(或所關注序列)之表現控制序列兩者。術語「表現控制序列 」包括影響其所連結之編碼序列之表現及加工所必需的多核苷酸序列。「表現控制序列 」包括：適當轉錄起始、終止、啟動子及强化子序列；高效RNA加工信號，諸如剪接及多腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA之序列；增强轉譯效率(亦即科扎克共有序列(Kozak consensus sequence))之序列；增强多肽穩定性之序列；及需要時，增强多肽分泌之序列。此類控制序列之性質視宿主生物體而不同。舉例而言，在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列，而在真核生物中，此類控制序列通常包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列 」意欲包括存在對於表現及加工而言不可或缺之組分，且亦可包括存在有利之額外組分，例如前導序列及融合搭配物序列。
多肽 ：如本文所用，係指胺基酸之任何聚合鏈。在一些實施例中，多肽具有在自然界中存在之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有在自然界中不存在之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有含有在在自然界中彼此分開存在之部分的胺基酸序列(亦即來自兩種或更多種不同生物體，例如人類及非人類部分)。在一些實施例中，多肽具有經工程改造之胺基酸序列，因為其經由人為作用設計及/或產生。在一些實施例中，多肽具有由在自然界中不存在之序列(例如因為經由人為作用設計及/或產生以編碼該多肽而經工程改造之序列)編碼之胺基酸序列。
重排 ：如本文所用，描述DNA序列包括兩個或更多個接合(直接或間接)在一起之免疫球蛋白基因區段，以便接合在一起之基因區段具有編碼免疫球蛋白之可變區之DNA序列。重排DNA序列之兩個或更多個免疫球蛋白基因區段不再與發揮功能之重組信號序列(RSS)相關聯，因而無法經歷進一步重排。所屬領域之技術人員將認識到，雖然重排之DNA序列的兩個或更多個免疫球蛋白基因區段不能進一步重排，但其並不意謂同一基因座內之其他免疫球蛋白基因區段無法進行例如第二次重排。所屬領域之技術人員將瞭解，重排之基因區段(例如在重排之免疫球蛋白可變區中)可經由天然VDJ重組過程接合在一起。所屬領域之技術人員亦將瞭解，重排之基因區段(例如在重排之免疫球蛋白可變區中)可經工程改造以例如藉由使用標準重組技術接合該等基因區段而接合在一起。重排之免疫球蛋白可變區通常包括兩個或更多個接合之免疫球蛋白基因區段。舉例而言，重排之免疫球蛋白λ輕鏈可變區可包括與Jλ基因區段接合之Vλ基因區段。重排之免疫球蛋白重鏈可變區可包括接合之VH 基因區段、D基因區段、JH 基因區段。所屬領域之技術人員亦將瞭解，一般在重排之免疫球蛋白可變區中的免疫球蛋白基因區段之間移除所有或基本上所有基因間序列。所屬領域之技術人員將進一步瞭解，重排之序列可尤其在基因區段中包括內含子。
重組 ：如本文所用，係指由使來自多種來源(例如生物體、組織、細胞、基因組或基因組部分)之遺傳物質彙集在一起的基因重組之實驗室方法(例如選殖)形成之分子(例如DNA、RNA或多肽)。在一些實施例中，藉由重組方式設計、工程改造、製備、表現、建立或分離重組多肽，該等方式諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之多肽、自重組之組合人類多肽文庫分離的多肽(Hoogenboom, H. R., 1997, TIB Tech. 15:62-70；Azzazy, H.及W.E. Highsmith, 2002, Clin. Biochem. 35:425-45；Gavilondo, J. V.及J.W. Larrick, 2002, BioTechniques 29:128-45；Hoogenboom H.及P. Chames, 2000, Immunol. Today 21:371-8，以引用之方式整體併入本文中)、自已經基因工程改造以包括人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor, L. D.等人, 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95；Kellermann, S-A.及L.L. Green, 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-7；Little, M.等人, 2000, Immunol. Today 21:364-70；Osborn, M.J.等人, 2013, J. Immunol. 190:1481-90；Lee, E-C.等人, 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63；Macdonald, L.E.等人, 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52；Murphy, A.J.等人, 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8，各以引用之方式整體併入本文中)或藉由涉及將所選序列元件剪接至彼此之任何其他方式製備、表現、建立或分離的多肽。在一些實施例中，在自然界中發現一或多個此類所需序列元件。在一些實施例中，一或多個此類所需序列元件係電腦模擬設計。在一些實施例中，一或多個此類所選序列元件由例如來自天然或合成(例如人造)來源之已知序列元件之誘變(例如活體內或活體外)產生。舉例而言，在一些實施例中，重組多肽由在所關注源生物體(例如人類、小鼠等)之基因組中發現之序列構成。在一些實施例中，重組多肽具有由誘變(例如活體外或活體內，例如在非人類動物中)產生之胺基酸序列，使得該等重組多肽之胺基酸序列為雖然來源於多肽序列及與多肽序列有關，但可不天然存在於活體內非人類動物之基因組內的序列。
參考 ：如本文所用，係指所關注之劑、動物、群、個體、群體、樣品、序列或值進行比較之標準或對照劑、動物、群、個體、群體、樣品、序列或值。在一些實施例中，基本上與所關注之劑、動物、群、個體、群體、樣品、序列或值之測試或測定同時測試及/或確定參考劑、動物、群、個體、群體、樣品、序列或值。在一些實施例中，參考劑、動物、群、個體、群體、樣品、序列或值為歷史參考，視情况收錄在有形媒體中。在一些實施例中，參考可指對照。「參考 」亦包括「參考動物 」。「參考動物 」可具有如本文所述之修飾、與本文所述不同之修飾或無修飾(亦即野生型動物)。通常，如所屬領域之技術人員將瞭解，參考劑、動物、群、個體、群體、樣品、序列或值係在與用於測定或表徵所關注之劑、動物(例如哺乳動物)、群、個體、群體、樣品、序列或值之條件相當的條件下測定或表徵。
替代 ：如本文所用，係指在宿主基因座中(例如基因組中)發現之「經替代之 」核酸序列(例如基因)自該基因座移除且不同的「替代 」核酸位於其地方之過程。在一些實施例中，經替代之核酸序列及替代核酸序列彼此可比，因為例如其彼此同源，含有對應元件(例如蛋白質編碼元件、調控元件等)及/或具有類似或一致序列。在一些實施例中，經替代之核酸序列包括啟動子、强化子、剪接供體位點、剪接受體位點、內含子、外顯子、未轉譯區(UTR)中之一或多個；在一些實施例中，替代核酸序列包括一或多個編碼序列。在一些實施例中，替代核酸序列為經替代之核酸序列之同源物或變異體(例如突變體)。在一些實施例中，替代核酸序列為經替代之序列之直系同源物或同源物。在一些實施例中，替代核酸序列為或包含人類核酸序列。在一些實施例中，包括在替代核酸序列為或包含人類核酸序列下，經替代之核酸序列為或包含嚙齒類動物序列(例如小鼠或大鼠序列)。在一些實施例中，包括在替代核酸序列為或包含人類核酸序列下，經替代之核酸序列為或包含人類序列。在一些實施例中，替代核酸序列為經替代之序列之變異體或突變體(亦即與經替代之序列相比，含有一或多個序列差異，例如取代之序列)。因此經代替之核酸序列可包括作為用於獲得因此經代替之序列的源核酸序列之部分的一或多個調控序列(例如啟動子、强化子、5'-或3'-未轉譯區等)。舉例而言，在多個實施例中，替代係內源序列經異源序列取代，自因此經代替之核酸序列產生基因產物(包含異源序列)，但不表現內源序列；替代係內源基因組序列經編碼與由內源序列編碼之多肽具有類似功能之多肽的核酸序列(例如內源基因組序列編碼非人類可變區多肽整體或部分，且DNA片段編碼一或多種人類可變區多肽整體或部分)替代。在多個實施例中，內源非人類免疫球蛋白基因區段或其片段經人類免疫球蛋白基因區段或其片段替代。
基本上 ：如本文所用，係指展現全部或靠近全部程度之所關注之特徵或特性的定性條件。生物領域中之一般技術人員將瞭解，生物及化學現象很少(若有過)完成及/或進行完整或實現或避免絕對結果。因此，術語「基本上 」在本文中用於記錄在許多生物及化學現象中固有之潜在完整缺乏。
基本類似性 ：如本文所用，係指胺基酸或核酸序列之間的比較。如所屬領域之一般技術人員將瞭解，若兩個序列在對應位置中含有類似殘基(例如胺基酸或核苷酸)，則其一般視為「基本上類似 」。如所屬領域中所瞭解，雖然類似殘基可為一致殘基(亦參見以下 基本一致性 )，但類似殘基亦可為具有適當可比之結構及/或功能特徵的不一致殘基。舉例而言，如所屬領域之一般技術人員所熟知，某些胺基酸通常分類為「疏水性 」或「親水性 」胺基酸，及/或具有「極性 」或「非極性 」側鏈。一種胺基酸經另一相同類型取代常可視為「保守 」取代。典型胺基酸分類概述於下表中。
丙胺酸 Ala A 非極性 中性 1.8
精胺酸 Arg R 極性 正 -4.5
天門冬醯胺 Asn N 極性 中性 -3.5
天門冬胺酸 Asp D 極性 負 -3.5
半胱胺酸 Cys C 非極性 中性 2.5
麩胺酸 Glu E 極性 負 -3.5
麩醯胺酸 Gln Q 極性 中性 -3.5
甘胺酸 Gly G 非極性 中性 -0.4
組胺酸 His H 極性 正 -3.2
異白胺酸 Ile I 非極性 中性 4.5
白胺酸 Leu L 非極性 中性 3.8
離胺酸 Lys K 極性 正 -3.9
甲硫胺酸 Met M 非極性 中性 1.9
苯丙胺酸 Phe F 非極性 中性 2.8
脯胺酸 Pro P 非極性 中性 -1.6
絲胺酸 Ser S 極性 中性 -0.8
蘇胺酸 Thr T 極性 中性 -0.7
色胺酸 Trp W 非極性 中性 -0.9
酪胺酸 Tyr Y 極性 中性 -1.3
纈胺酸 Val V 非極性 中性 4.2
不明確胺基酸 3字母 1字母
天門冬醯胺或天門冬胺酸 Asx B
麩醯胺酸或麩胺酸 Glx Z
白胺酸或異白胺酸 Xle J
未指定或不明胺基酸 Xaa X
如所屬領域中所熟知，可使用多種演算法中之任一種比較胺基酸或核酸序列，該等演算法包括可用於商業計算機程式中之演算法，諸如用於核苷酸序列之BLASTN、及用於胺基酸序列之BLASTP、間隙BLAST及PSI-BLAST。示例性此類程式描述於Altschul, S. F.等人, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10；Altschul, S.F.等人, 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80；Altschul, S.F.等人, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402；Baxevanis, A.D.及B.F.F. Ouellette (編輯) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998；及Misener等人(編輯) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 第132卷, Humana Press, 1998，以引用之方式整體併入本文中。除鑑別類似序列外，以上提及之程式通常指示相似度。在一些實施例中，若在殘基相關延伸段上兩個序列之對應殘基之至少、例如但不限於80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相似(例如一致或包括保守取代)，則該兩個序列視為基本上類似。在一些實施例中，相關延伸段為完整序列(例如基因序列、基因區段、編碼結構域之序列、多肽或結構域)。在一些實施例中，相關延伸段為至少9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或更多個殘基。在一些實施例中，相關延伸段為至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個或更多個殘基。在一些實施例中，相關延伸段包括沿著完整序列之相連殘基。在一些實施例中，相關延伸段包括沿著完整序列之不相連殘基，例如藉由多肽或其部分之折疊構形而彙集在一起之非相連殘基。
基本一致性 ：如本文所用，係指胺基酸或核酸序列之間的比較。如所屬領域之一般技術人員將瞭解，若兩個序列在對應位置中含有類一致殘基(例如胺基酸或核苷酸)，則其一般視為「基本上一致 」。如所屬領域中所熟知，可使用多種演算法中之任一種比較胺基酸或核酸序列，該等演算法包括可用於商業計算機程式中之演算法，諸如用於核苷酸序列之BLASTN、及用於胺基酸序列之BLASTP、間隙BLAST及PSI-BLAST。示例性此類程式描述於Altschul, S. F.等人, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10；Altschul, S.F.等人, 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80；Altschul, S.F.等人, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402；Baxevanis, A.D.及B.F.F. Ouellette (編輯) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998；及Misener等人(編輯) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 第132卷, Humana Press, 1998，各以引用之方式整體併入本文中。除鑑別一致序列外，以上提及之程式通常指示一致性程度。在一些實施例中，若在殘基相關延伸段上兩個序列之對應殘基之至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致，則該兩個序列視為基本上一致。在一些實施例中，殘基相關延伸段為完整序列。在一些實施例中，殘基相關延伸段為例如但不限於至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個或更多個殘基。
靶向構築體或靶向載體 ：如本文所用，係指包含靶向區域之多核苷酸分子。靶向區域包含與目標細胞、組織或動物中之序列一致或基本上一致且提供靶向構築體經由同源重組整合至該細胞、組織或動物之基因組內部之位置中的序列。本文亦包括及描述使用位點特異性重組酶識別位點(例如lox P或Frt位點)靶向之靶向區域。在一些實施例中，如本文所述之靶向構築體進一步包含特別關注之核酸序列或基因、可選標記物、控制及/或調控序列及允許經由外源添加幫助或促進此類序列重組之蛋白質而介導之重組的其他核酸序列。在一些實施例中，如本文所述之靶向構築體進一步包含所關注基因整體或部分，其中所關注基因為編碼具有與由內源序列編碼之蛋白質類似之功能的多肽整體或部分之異源基因。在一些實施例中，如本文所述之靶向構築體進一步包含所關注人類化基因整體或部分，其中所關注人類化基因編碼具有與由內源序列編碼之多肽類似之功能的多肽整體或部分。在一些實施例中，靶向構築體(或靶向載體)可包含經人為操縱之核酸序列。舉例而言，在一些實施例中，靶向構築體(或靶向載體)可經構築以含有經工程改造之或重組多核苷酸，該經工程改造之或重組多核苷酸含有兩個或更多個在自然界中不以該順序連接在一起但經人為操縱而在該經工程改造之或重組多核苷酸中直接彼此連接的序列。
轉殖基因或轉殖基因構築體 ：如本文所用，係指已諸如藉由本文所述之方法人為引入細胞中之核酸序列(編碼例如所關注多肽整體或部分)。轉殖基因對於引入其之經基因工程改造之動物或細胞而言可部分或完全異源，亦即外來的。轉殖基因可包括一或多個轉錄調控序列及表現所選核酸序列所必需之任何其他核酸，諸如內含子或啟動子。
未重排 ：如本文所用，描述DNA序列包括兩個或更多個尚未經歷重組事件或以其他方式接合，因此在之間包括基因間序列的免疫球蛋白基因區段。所屬領域之技術人員將瞭解，未重排之V基因區段及J基因區段可與完整重組信號序列(RSS)締合。未重排之D基因區段可側接兩個完整重組信號序列(RSS)。所屬領域之技術人員將進一步瞭解，未重排之基因區段可尤其包括內含子。
載體 ：如本文所用，係指能够輸送所相關聯之另一核酸的核酸分子。在一些實施例中，載體能够在諸如真核及/或原核細胞之宿主細胞中在染色體外複製及/或表現其所連接之核酸。能够指導可操作地連接之基因之表現的載體在本文中稱為「表現載體 」。
野生型 ：如本文所用，係指具有如在自然界中在「正常」(與突變、患病、改變、工程改造等相對比)狀態或背景下發現之結構及/或活性的實體。所屬領域之一般技術人員將瞭解，野生型基因及多肽常以多種不同形式(例如對偶基因)存在。
本文洞察到非人類動物中之內源抗體形成機制，包括免疫球蛋白鏈配對及親和力成熟，可用於產生抗原特異性的高親和力抗體，包括外源人類免疫球蛋白序列。此類動物可產生正常及穩固之免疫反應，該免疫反應可用於製造例如人類抗體治療劑。本文認識到，經基因修飾之非人類動物提供一個產生包括人類可變域，包括人類重鏈、κ輕鏈及λ輕鏈域之抗體的有效且高效之平臺。本文進一步認識到，經基因修飾之非人類動物能够成功地利用人類重鏈、κ輕鏈及λ輕鏈可變區基因區段來產生親和力成熟之人類重鏈、κ輕鏈及λ輕鏈可變域。
本文認識到非人類動物中包括人類λ輕鏈可變域之抗體的產生先前面臨挑戰，因為某些非人類動物中λ輕鏈之表現低。舉例而言，小鼠利用κ輕鏈顯著超過λ輕鏈(亦即，約95:5之κ:λ比率)。本文進一步認識到藉由限制非人類動物之輕鏈可變區組庫產生包括通用輕鏈(例如能够結合於複數個重鏈之輕鏈)之抗體可為挑戰性的，因為其消除一些對於高親和力抗體產生而言最强大之多樣性產生機制，例如組合多樣性、連接多樣性及第二次重排。其亦顯著地使另外由「混合及匹配」重鏈及輕鏈配對所引起的多樣性產生作用最小。鑑於此等認識，在所屬領域中仍然需要用於在非人類動物中自有限人類輕鏈可變區產生人類λ可變區之平臺及方法。
本文洞察到在κ輕鏈基因座處包括有限人類λ輕鏈可變區組庫之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)能够有效產生高親和力抗原特異性抗體。此結果係不可預期的，因為非人類動物中之有限人類λ輕鏈可變區組庫迫使非人類動物利用λ輕鏈可變區序列。λ輕鏈可變區序列之使用與某些非人類動物之自然偏好相反。如上所提及，非人類動物中使用有限人類λ輕鏈可變區組庫亦消除產生高親和力抗原特異性抗體之許多天然機制。
本文提供表現人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域的經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，其中非人類動物具有有限人類λ輕鏈可變區組庫(包含一或兩個人類Vλ基因區段)。在一些實施例中，本文提供表現人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域及人類免疫球蛋白重鏈可變域的經基因修飾之非人類動物，其中非人類動物具有有限人類λ輕鏈可變組庫。本文亦提供一種生物系統，其用於產生自有限人類λ輕鏈可變區組庫表現之人類λ輕鏈可變域，與親和力成熟之人類重鏈可變域之多種組庫締合。提供用於製造包含人類免疫球蛋白可變域之抗原結合蛋白(例如抗體、重鏈、輕鏈(例如λ輕鏈)、重鏈可變域、輕鏈可變域(例如λ輕鏈可變域)、單鏈可變片段(ScFv))的方法。在一些實施例中，方法包括利用感興趣的抗原對本文所述之非人類動物進行免疫接種。在一些實施例中，方法包括在抗原結合蛋白(例如特異性結合感興趣的抗原之結合蛋白)中採用本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之免疫球蛋白可變區基因序列。方法包括製造適用於製造多特異性抗原結合蛋白之人類免疫球蛋白重鏈及/或λ輕鏈可變域的方法。
提供經基因工程改造之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，其自人類λ輕鏈可變區基因區段之有限組庫表現人類λ輕鏈可變域之有限組庫。在一些實施例中，本文所述之非人類動物經基因工程改造以包括單一重排人類λ輕鏈可變區序列(Vλ/Jλ序列)。在一些實施例中，本文所述之非人類動物經基因工程改造以包括僅僅一或兩個人類未重排之λ輕鏈可變區基因區段。在一些實施例中，本文所述之非人類動物經基因工程改造以包括僅僅一或兩個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段。在某些實施例中，本文所述之非人類動物包括四個或五個未重排人類Jλ基因區段。由本文所述之非人類動物表現的重排人類λ輕鏈可變域能够與由此類非人類動物表現的複數個親和力成熟之人類重鏈配對，其中該複數個重鏈可變區能够特異性結合不同抗原决定基。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物表現且選擇源自於未重排人類重鏈可變區基因區段之組庫的合適親和力成熟之人類免疫球蛋白重鏈可變域，其中該親和力成熟之人類重鏈可變域與源自於非人類動物之有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區基因組庫之人類λ輕鏈可變域締合且一起表現。本文洞察到在多特異性抗體、尤其雙特異性抗體之產生中，可利用人類λ輕鏈可變域及人類重鏈可變域(與編碼人類λ輕鏈可變區及人類重鏈可變區一起)。 非人類動物中之抗體組庫
免疫球蛋白(亦稱為抗體)係大的(約150 kD) Y形糖蛋白，由宿主免疫系統之B細胞產生，用於中和病原體(例如病毒、細菌等)。各免疫球蛋白(Ig)由兩條相同的重鏈及兩條相同的輕鏈構成，各具有兩個結構組分：可變域及恆定域。在由不同B細胞所產生之抗體其重鏈及輕鏈可變區為不同的，但由單個B細胞或B細胞殖株所產生之所有抗體者係為相同。各抗體之重鏈及輕鏈可變區共同構成抗原結合區(或抗原結合位點)。免疫球蛋白可以不同的型式（稱為同型體或類別）存在，其係基於所含有之重鏈恆定區(或域)。在相同的同型體之所有抗體中重鏈恆定區均為一致，在不同的同型體之抗體中係為不同。下表概述小鼠及人類中之九種抗體同型體。
小鼠   人類
IgM   IgM
IgD   IgD
IgG1   IgG1
IgG2a   IgG2
IgG2b   IgG3
IgG2c   IgG4
IgG3   IgE
IgE   IgA1
IgA   IgA2
已在其他物種中鑑定出額外的同型體。由於不同同型體中有不同的結構特性，同型體賦予抗體專門生物特性，且在動物體內不同位置(細胞、組織等)被發現。最初，B細胞產生具有相同抗原結合區之IgM及IgD。活化後，藉由稱為類別轉換之方法，B細胞係轉換成不同同型體，該方法涉及改變由B細胞產生之抗體的恆定區，而可變區係維持相同，藉此保存原始抗體之抗原特異性(B細胞)。
兩個獨立基因座(Igκ及Igλ)含有在重排後編碼抗體輕鏈且展現對偶基因及同型排斥之基因區段。κ+ 與λ+ B細胞之表現比率在物種當中有所變化。舉例而言，人類顯示約60:40之比率(κ:λ)。在小鼠及大鼠中，觀察到95:5之比率(κ:λ)。有趣地，在貓中觀察到之κ:λ比率(5:95)與小鼠及大鼠中相反。已進行若干項研究以解釋在此等觀察到之比率背後之可能原因，且已提出基因座之複雜性(亦即基因區段、尤其V基因區段之數目)及基因區段重排效率為基本原因。人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座延伸超過1,000 kb且含有大約70個Vλ基因區段(29至33個功能性)及七個Jλ-Cλ基因區段對(四至五個功能性)，組織成三簇(參見例如美國專利第9,006,511號之圖1，其以引用之方式整體併入本文中)。在表現之抗體組庫中大部分觀察到之Vλ區域由最近端之簇(稱為A簇)內所含之基因區段編碼。小鼠免疫球蛋白λ輕鏈基因座明顯不同於人類基因座，且視品系而定，僅僅含有幾個Vλ及Jλ基因區段，組織成兩個不同之基因簇(參見例如美國專利第9,006,511號之圖2，其以引用之方式整體併入本文中)。
用於治療各種人類疾病之治療性抗體的發展，基本上以建立經工程改造之非人類動物品系、尤其經工程改造之嚙齒類動物品系為主題，該等品系在其與人類免疫球蛋白基因相對應之基因組中具有變化量之遺傳物質(例如Brüggemann, M.等人, 2015, Arch. Immunol. Ther. Exp. 63:101-8中所評述，其以引用之方式整體併入本文中)。建立此類經基因工程改造之嚙齒類動物的初始工作集中在整合可獨立支撑基因區段重組及產生完整人類之重鏈及/或輕鏈的人類免疫球蛋白基因座部分，同時使內源免疫球蛋白基因座不活化(參見例如Brüggemann, M.等人, 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86:67-09-13；Brüggemann, M.等人, 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-6；Taylor, L.D.等人, 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295；Davies, N.P.等人, 1993, Biotechnol. 11:911-4；Green, L.L.等人, 1994, Nat. Genet. 7:13-21；Lonberg, N.等人, 1994, Nature 368:856-9；Taylor, L.D.等人, 1994, Int. Immunol. 6:579-91；Wagner, S.D.等人, 1994, Eur. J. Immunol. 24:2672-81；Fishwild, D.M.等人, 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-51；Wagner, S.D.等人, 1996, Genomics 35:405-14；Mendez, M.J.等人, 1997, Nat. Genet. 15:146-56；Green, L.L.等人, 1998, J. Exp. Med. 188:483-95；Xian, J.等人, 1998, Transgenics 2:333-43；Little, M.等人, 2000, Immunol. Today 21:364-70；Kellermann, S.A.及L.L. Green, 2002, Cur. Opin. Biotechnol. 13:593-7，各以引用之方式整體併入本文中)。詳言之，一些工作包括整合人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(參見例如美國專利申請公開案第2002/0088016 A1號、第2003/0217373 A1號及第2011/0236378 A1號；美國專利第6,998,514號及第7,435,871號；Nicholson, I.C.等人, 1999, J. Immunol. 163:6898-906；Popov, A.V等人, 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19，各以引用之方式整體併入本文中)。此類工作集中在隨機整合含有人類Vλ、Jλ及Cλ序列之酵母人造染色體，藉此建立表現完整人類免疫球蛋白λ輕鏈(亦即人類Vλ及Cλ域)之小鼠品系。更多近來之工作已採用類似策略，使用亦含有人類Vλ、Jλ及Cλ序列之構築體(Osborn, M.J.等人, 2013, J. Immunol. 190:1481-90；Lee, E-C.等人, 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63，各以引用之方式整體併入本文中)。
其他工作包括人類Vλ及Jλ基因區段特異性插入內源嚙齒類動物免疫球蛋白輕鏈基因座(κ及λ)中，以使得該等人類Vλ及Jλ基因區段可操作地連接至內源免疫球蛋白輕鏈恆定區基因(參見例如美國專利第9,006,511號、第9,012,717號、第9,029,628號、第9,035,128號、第9,066,502號、第9,150,662號及第9,163,092號；均以引用的方式整體併入本文中)。在此類動物之一些實施例中，來自A簇及B簇之所有人類Vλ基因區段及一或四個人類Jλ基因區段插入內源免疫球蛋白κ及免疫球蛋白λ輕鏈基因座中。若干不同之人類Vλ及Jλ基因區段顯示在均經工程改造之嚙齒類動物免疫球蛋白輕鏈基因座處適當重排以形成在嚙齒類動物抗體組庫中表現之功能性輕鏈，在內源Cκ及Cλ區域情况下該輕鏈包括人類Vλ域(參見例如美國專利第9,006,511號之表7及圖11至13，其以引用之方式整體併入本文中)。詳言之，具有含人類Vλ及Jλ基因區段之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的小鼠顯示脾臟腔室中約1:1之人類λ與內源λ比率(如藉由IgCκ與IgCλ比率所量測)(參見例如美國專利第9,006,511號之表4，其以引用之方式整體併入本文中)。實際上，兩種經工程改造之小鼠品系(亦即經工程改造之免疫球蛋白κ或經工程改造之免疫球蛋白λ輕鏈基因座)均顯示人類Vλ域可自嚙齒類動物中之內源免疫球蛋白輕鏈基因座表現，其通常在輕鏈表現上展現極大偏好(參見上文)。本文認識到可產生交替的經工程改造之免疫球蛋白輕鏈基因座結構以最大化人類λ輕鏈可變域自有限人類λ輕鏈可變區組庫之表現。此類交替的經工程改造之免疫球蛋白輕鏈基因座結構提供由其設計產生獨特抗體組庫之能力。
本文提供一種非人類動物，其生殖系基因組含有經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區。單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，所有由經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞所表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，其係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其可操作地連接至非人類或人類免疫球蛋白λ或免疫球蛋白κ輕鏈恆定區基因。在一些實施例中，此類輕鏈之表現可藉由將該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區插入內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)中來實現。在一些實施例中，所提供之非人類動物經工程改造以使得內源免疫球蛋白λ輕鏈可變區之表現不活化(例如藉由基因缺失)。在一些實施例中，所提供之非人類動物經工程改造，以使得內源免疫球蛋白κ輕鏈可變區之表現不活化(例如藉由插入、替代或取代)。 通用輕鏈
多個問題已阻礙先前製造有用之多特異性抗原結合蛋白（例如雙特異性抗體）之工作，該等問題常共享一共同範例：活體外選擇或操縱序列，以合理地進行工程改造，或經由試誤法(trial-and-error)對適用於雜二聚體雙特異性人類免疫球蛋白配對之格式進行工程改造。不幸地，若非全部，至少大多數活體外工程改造方法提供的主要是適合(若有)於個別分子之暫行解決方案（ad hoc fixes）。
已研發出採用複雜生物體選擇能够產生人類治療劑之適當配對的活體內方法(參見例如美國專利第10,143,186號，其以引用之方式整體併入)。然而，尚未產生能够產生穩固免疫反應，包括產生充足效價水準之具有人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之高親和力通用λ輕鏈的先前非人類動物。一般來說，天然非人類序列常常並非人類治療性序列之優良來源。至少出於此原因，產生與通用人類輕鏈配對之非人類免疫球蛋白重鏈可變域具有有限的實用性。更多活體外工程改造工作將花費在試誤法中，以試圖將非人類重鏈可變序列人類化，同時開始保持抗原决定基特異性及親和力以及與共同人類輕鏈偶合之能力，其結果不確定。在此類方法結束時，最終產物可維持一些特異性及親和力，且與通用輕鏈締合，但在人類中之免疫原性最終將可能保持極度風險。
因此，適合製造人類治療劑之非人類動物會包括適當大的人類重鏈可變區基因區段組庫來代替內源非人類重鏈可變區基因區段。人類重鏈可變區基因區段應能够重排，並剪接至內源非人類重鏈恆定區，以形成反向嵌合重鏈(亦即包含人類可變域及非人類恆定域之重鏈)。重鏈基因座應能够進行類別轉換及體細胞超突變，以使得適當大的重鏈可變域組庫可用於非人類動物，來選擇可與由有限人類λ輕鏈可變區組庫編碼之人類λ輕鏈可變域締合的重鏈可變域組庫。
為複數個重鏈選擇通用輕鏈之非人類動物具有實用性。在多個實施例中，在僅可表現通用輕鏈之非人類動物中所表現之抗體，將具有可與其相同或基本上相同之輕鏈進行締合且共同表現的重鏈。此特別可用於製造雙特異性抗體。舉例而言，此類非人類動物可用第一免疫原進行免疫接種，以產生表現特異性地結合第一抗原决定基之抗體的B細胞。非人類動物(或包括與重鏈及λ輕鏈基因座相同基因修飾之非人類動物)可用第二免疫原進行免疫接種，以產生表現特異性地結合第二抗原决定基之抗體的B細胞。可自B細胞選殖重鏈可變區，且與相同重鏈恆定區及相同輕鏈一起表現，且在細胞中表現以製造雙特異性抗體，其中已藉由非人類動物選擇雙特異性抗體之輕鏈組分以與輕鏈組分締合且一起表現。已研發出表現通用κ輕鏈之非人類動物(參見例如美國專利第10,143,186號，其以引用之方式整體併入)。然而，仍然需要發展能够表現通用λ輕鏈，包括人類λ輕鏈可變域之非人類動物。
本文提供經工程改造之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，用於產生免疫球蛋白λ輕鏈，該免疫球蛋白λ輕鏈將適合與更為不同家族配對之重鏈，包括其可變區背離生殖系序列者，例如親和力成熟或進行體細胞超突變之可變區。在多個實施例中，如本文所述之非人類動物經工程改造以表現及將人類λ輕鏈可變域與包含體細胞突變之人類重鏈可變域配對，因此能够提供一種獲得適用作人類治療劑之高親和力結合蛋白(例如抗體)的途徑。
經由在生物體內進行長期及複雜的抗體選擇過程，如本文所述之經基因工程改造之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)在一系列不同人類重鏈可變域與有限數目之輕鏈選項配對上進行生物學上適當的選擇。為實現此目標，非人類動物係經工程改造以呈現有限數目之人類λ輕鏈可變域選項以及多種人類重鏈可變域選項。在用免疫原激發後，本文所述之非人類動物可最大化其組庫中解决方案之數目，以針對免疫原形成抗體，基本上或僅受其組庫中數目或輕鏈選項限制。在多個實施例中，此方式包括允許非人類動物實現輕鏈可變域之合適及相容之體細胞突變，儘管如此，其仍與相對大量之人類重鏈可變域，尤其包括體細胞超突變之人類重鏈可變域相容。
為實現有限人類λ輕鏈選項組庫，如本文所述之非人類動物可經工程改造，以使其不能或基本上不能製造或重排天然非人類λ及/或κ輕鏈可變域。在一些實施例中，此可例如藉由非人類動物之λ及/或κ輕鏈可變區基因區段缺失來實現。在一些實施例中，內源非人類基因座可接著用適當的所選擇之外源人類λ輕鏈可變區序列來修飾，該外源人類λ輕鏈可變區序列係可操作地連接至內源非人類輕鏈恆定域。在一些實施例中，外源人類可變區基因區段係未重排(例如兩個Vλ基因區段及一或多個Jλ基因區段)，且可經重排及剪接至內源非人類輕鏈恆定區基因，以形成重排之反向嵌合輕鏈基因(人類可變、非人類恆定)。在一些實施例中，外源人類可變基因區段係經重排(例如一個Vλ基因區段及一個Jλ基因區段)且可剪接至內源非人類輕鏈恆定區基因，以形成包含人類可變區及非人類恆定區之反向嵌合輕鏈基因。在一些實施例中，外源人類可變基因區段係經重排(例如一個Vλ基因區段及一個Jλ基因區段)且可剪接至外源人類輕鏈恆定區基因，以形成包含人類可變區及人類恆定區之人類化輕鏈基因。在多個實施例中，輕鏈可變區能够進行體細胞超突變。在多個實施例中，適當强化子係保留在非人類動物中。據報導，强化子會最大化輕鏈可變區獲得體細胞突變之能力。舉例而言，在用人類λ可變區基因區段替代內源非人類動物κ可變區基因區段來修飾非人類動物之κ基因座中，非人類κ內含子强化子及非人類κ 3'强化子其功能係被維持，或未破壞。雖然本文涵蓋移除或破壞强化子之實施例，但預計此類實施例將减少或消除體細胞超突變。在此類實施例中，輕鏈可變區之體細胞超突變相對於例如包含一或多個內源非人類强化子之輕鏈可變區係為减少。
本文提供一種經基因工程改造之非人類動物，其表現有限反向嵌合(人類可變、非人類恆定)輕鏈組庫，其係與多種反向嵌合(人類可變、非人類恆定)重鏈締合。在多個實施例中，內源非人類κ輕鏈可變區基因區段係經缺失，且經單個(或兩個)人類λ輕鏈可變區基因區段所替代，其可操作地連接至內源非人類κ恆定區基因。在一些實施例中，非人類κ內含子强化子及非人類κ 3' 强化子係被維持。不限於任一理論，强化子可尤其最大化人類λ輕鏈可變區基因區段之體細胞超突變。在多個實施例中，非人類動物亦包含非功能性λ輕鏈基因座或其缺失，或使基因座不能製造λ輕鏈之缺失。
本文提供一種經基因工程改造之非人類動物，在多個實施例中，其包含輕鏈可變區基因座，該輕鏈可變區基因座缺乏內源非人類輕鏈可變基因區段且包含人類可變基因區段，在一些實施例中係為重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，可操作地連接至非人類Cλ基因區段，其中基因座能够進行體細胞超突變，且其中基因座表現包含連接至非人類Cλ基因區段之人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區的輕鏈。因此，在多個實施例中，基因座係包含與正常或野生型水準之體細胞超突變相關的非人類κ 3'强化子。
在多個實施例中，經基因工程改造之非人類動物在用感興趣的抗原進行免疫接種時，係產生B細胞，其展現多種人類免疫球蛋白重鏈可變區的重排，該人類免疫球蛋白重鏈可變區係與一個或與兩個重排之輕鏈一起表現及發揮功能。在一些實施例中，人類λ輕鏈可變區包含體細胞超突變。在一些實施例中，人類λ輕鏈可變區各包含1至5個體細胞超突變。在多個實施例中，由本文所述之非人類動物表現的輕鏈能够與包括在非人類動物中表現之人類免疫球蛋白重鏈可變區的任何重鏈締合，且一起表現。 本文所提供之非人類動物、細胞及組織
本文提供表現(例如其B細胞表現)抗體之非人類動物，該抗體含有在非人類動物之生殖系基因組中之內源非人類λ輕鏈基因座處非人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區序列的位置中，係包括源自於以下之人類λ輕鏈可變域之輕鏈：(i)一或兩個未重排之Vλ基因區段及一或多個未重排之Jλ基因區段，或(ii)單一重排人類λ輕鏈可變區。應瞭解，在本文所述之各種實施例中，經基因修飾之非人類動物為嚙齒類動物，諸如大鼠或小鼠，且本文所述之非人類元件(强化子、恆定區等)為嚙齒類動物，諸如大鼠或小鼠元件。本文所述之非人類動物之合適實例包括但不限於嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠，尤其小鼠。
本文提供改良之活體內系統，用於鑑別及發展新抗原結合蛋白、抗體、抗體組分(例如抗原結合部分及/或包括其之組成物或格式)，及/或可用於例如治療多種影響人類之疾病的基於抗體之治療劑。此外，本文涵蓋以下認知：具有經工程改造之免疫球蛋白基因座，諸如包括有限λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，係適用的。在一些實施例中，本文所述之非人類動物係提供改良之活體內系統，用於發展投與人類之抗體及/或基於抗體之治療劑。在一些實施例中，本文所述之非人類動物係提供改良之活體內系統，用於發展含有其特徵在於與從含有人類Vλ區序列之已存在之活體內系統所獲得的抗體及/或基於抗體之治療劑相比，係具有改善及/或不同效能(例如抗原特異性抗體組庫之表現及/或表示)之人類λ輕鏈可變域的抗體及/或基於抗體之治療劑。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有經工程改造以包括有限人類λ輕鏈可變區組庫之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座。在一些實施例中，有限人類λ輕鏈可變區組庫之序列可操作地連接至非人類輕鏈恆定區。在一些實施例中，非人類輕鏈恆定區為嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)輕鏈恆定區。在一些實施例中，非人類輕鏈恆定區為κ或λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，有限人類λ輕鏈可變區組庫之序列可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ。在一些實施例中，有限人類λ輕鏈可變區組庫之序列可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ (例如Cλ1)。在一些實施例中，非人類λ輕鏈恆定區(例如小鼠Cλ，例如小鼠Cλ1)係代替內源非人類Cκ。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括兩個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，一或多個未重排人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，一或多個未重排人類Jλ基因區段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，一或多個未重排人類Jλ基因區段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段，係可操作地連接至非人類輕鏈恆定區。在一些實施例中，非人類輕鏈恆定區為嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)輕鏈恆定區。在一些實施例中，非人類輕鏈恆定區為κ或λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段，係可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段，係可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ (例如Cλ1)。在一些實施例中，非人類λ輕鏈恆定區(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠，諸如小鼠Cλ，例如小鼠Cλ1)係代替內源非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ之兩個未重排人類Vλ基因區段及四個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，四個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ之兩個未重排人類Vλ基因區段及五個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，五個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ (例如Cλ1)之兩個未重排人類Vλ基因區段及四個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，四個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ (例如Cλ1)之兩個未重排人類Vλ基因區段及五個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，兩個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，五個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括一個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，一或多個未重排人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，一或多個未重排人類Jλ基因區段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，一或多個未重排人類Jλ基因區段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段可操作地連接至非人類輕鏈恆定區。在一些實施例中，非人類輕鏈恆定區為嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)輕鏈恆定區。在一些實施例中，非人類輕鏈恆定區為κ或λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段及一或多個未重排人類Jλ基因區段可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ (例如Cλ1)。在一些實施例中，非人類λ輕鏈恆定區(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠，諸如小鼠Cλ，例如小鼠Cλ1)係代替內源非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ之一個未重排人類Vλ基因區段及四個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，四個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段為Vλ1-51，且四個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段為Vλ2-14，且四個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ之一個未重排人類Vλ基因區段及五個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，五個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段為Vλ1-51，且五個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段為Vλ2-14，且五個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ之一個未重排人類Vλ基因區段及四個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，四個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段為Vλ1-51，且四個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段為Vλ2-14，且四個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ之一個未重排人類Vλ基因區段及五個未重排人類Jλ基因區段。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，五個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段為Vλ1-51，且五個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，一個未重排人類Vλ基因區段為Vλ2-14，且五個未重排人類Jλ基因區段為Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類λ輕鏈可變區(V/J)。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Vλ基因區段為Vλ1-51。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Vλ基因區段為Vλ2-14。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Jλ基因區段為Jλ1。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Jλ基因區段為Jλ2。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區之人類Jλ基因區段為Jλ3。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區可操作地連接至非人類輕鏈恆定區。在一些實施例中，非人類輕鏈恆定區為嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)輕鏈恆定區。在一些實施例中，非人類輕鏈恆定區為κ或λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ。在一些實施例中，單一重排人類λ輕鏈可變區可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ (例如Cλ1)。在一些實施例中，非人類λ輕鏈恆定區(例如小鼠Cλ，例如小鼠Cλ1)來代替內源非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其係經工程改造以包括可操作地連接至小鼠Cκ之單一重排人類λ輕鏈可變區，其中單一重排人類λ輕鏈可變區包括人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ1-51且人類Jλ基因區段為Jλ2。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ2-14且人類Jλ基因區段為Jλ2。
本文尤其提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其具有內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，係經工程改造以包括可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ之單一重排人類λ輕鏈可變區，其中單一重排人類λ輕鏈可變區包括人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ1-51且人類Jλ基因區段為Jλ2。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ2-14且人類Jλ基因區段為Jλ2。
本文尤其提供一種小鼠、小鼠細胞或小鼠組織，其具有經工程改造以包括可操作地連接至小鼠Cλ之單一重排人類λ輕鏈可變區的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其中單一重排人類λ輕鏈可變區包括人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，人類Vλ基因區段包含Vλ1-51。在一些實施例中，人類Vλ基因區段包含Vλ2-14。在一些實施例中，人類Jλ基因區段包含Jλ2。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ1-51且人類Jλ基因區段為Jλ2。在一些實施例中，人類Vλ基因區段為Vλ2-14且人類Jλ基因區段為Jλ2。
本文尤其提供一種經基因修飾之小鼠、小鼠細胞或小鼠組織，其生殖系基因組包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至小鼠Cλ1基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ1-51基因區段及人類Jλ2基因區段，其中所有由該經基因修飾之小鼠之B細胞所表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
本文尤其提供一種經基因修飾之小鼠、小鼠細胞或小鼠組織，其生殖系基因組係包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至小鼠Cλ1基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ2-14基因區段及人類Jλ2基因區段，其中所有由該經基因修飾之小鼠之B細胞所表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
在一些實施例中，本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)其特徵在於，自該非人類動物中之生殖系基因組中的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座表現抗體，該抗體含有(1)人類Vλ域及(2)非人類Cλ域。在一些實施例中，本文所提供之非人類動物其特徵在於，與一或多個參考經工程改造之非人類動物相比，自經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座（其包括有限人類λ輕鏈可變區組庫）而來的人類Vλ區使用率提高(例如但不限於約2倍)。
在一些實施例中，本文提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其生殖系基因組包括包含以下之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座：(a)單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，及(b) Cλ基因，其中(a)可操作地連接至(b)，且其中非人類動物在內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座處缺乏非人類動物Cκ基因。
在一些實施例中，提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其基因組包括包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區及Cλ基因插入的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區可操作地連接至該Cλ基因，且該Cλ基因插入在內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座處非人類Cκ基因之位置中。在非人類動物、非人類細胞或非人類組織之許多實施例中，插入在內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座處非人類Cκ基因之位置中的Cλ基因為非人類或人類Cλ基因。在一些實施例中，非人類Cλ基因為或包含選自由以下組成之群組的哺乳動物Cλ基因：靈長類動物、山羊、綿羊、猪、犬、母牛或嚙齒類動物(例如大鼠或小鼠) Cλ基因。
在一些實施例中，非人類Cλ基因為或包含嚙齒類動物Cλ基因。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因為或包含小鼠Cλ基因。在一些實施例中，小鼠Cλ基因包含與選自由小鼠Cλ1、小鼠Cλ2及小鼠Cλ3組成之群組的小鼠Cλ基因為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在一些實施例中，小鼠Cλ基因包含與選自由小鼠Cλ1、小鼠Cλ2及小鼠Cλ3組成之群組的小鼠Cλ基因為基本上一致或一致之序列。在一些實施例中，小鼠Cλ1基因為或包含SEQ ID NO:1。在某些實施例中，小鼠Cλ2基因為或包含SEQ ID NO:2。在某些實施例中，小鼠Cλ3基因為或包含SEQ ID NO:3。在某些實施例中，小鼠Cλ基因包含與小鼠Cλ1基因一致之序列。
在一些實施例中，小鼠Cλ基因包含與選自由小鼠Cλ1、小鼠Cλ2及小鼠Cλ3組成之群組的小鼠Cλ基因為80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%或98%至100%一致之序列。在一些實施例中，小鼠Cλ基因包含與選自由小鼠Cλ1、小鼠Cλ2及小鼠Cλ3組成之群組的小鼠Cλ基因為80%至98%、80%至95%、80%至90%或80%至85%一致之序列。在一些實施例中，小鼠Cλ基因包含與選自由小鼠Cλ1、小鼠Cλ2及小鼠Cλ3組成之群組的小鼠Cλ基因為85%至98%、90%至95%或88%至93%一致之序列。
在一些實施例中，嚙齒類動物Cλ基因為或包含大鼠Cλ基因。在一些實施例中，大鼠Cλ基因包含與選自由大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3及大鼠Cλ4基因組成之群組的大鼠Cλ基因為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在一些實施例中，大鼠Cλ基因包含與選自由大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3及大鼠Cλ4基因組成之群組的大鼠Cλ基因為基本上一致或一致之序列。在某些實施例中，大鼠Cλ基因為或包含SEQ ID NO:7。在某些實施例中，大鼠Cλ2基因為或包含SEQ ID NO:8。在某些實施例中，大鼠Cλ3基因為或包含SEQ ID NO:9。在某些實施例中，大鼠Cλ4基因為或包含SEQ ID NO:10。
在一些實施例中，大鼠Cλ基因包含與選自由大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3及大鼠Cλ4基因組成之群組的大鼠Cλ基因為80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%或98%至100%一致之序列。在一些實施例中，大鼠Cλ基因包含與選自由大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3及大鼠Cλ4基因組成之群組的大鼠Cλ基因為80%至98%、80%至95%、80%至90%或80%至85%一致之序列。在一些實施例中，大鼠Cλ基因包含與選自由大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3及大鼠Cλ4基因組成之群組的大鼠Cλ基因85%至98%、90%至95%或88%至93%一致之序列。
在一些實施例中，人類Cλ基因包含與選自由人類Cλ1、人類Cλ2、人類Cλ3、人類Cλ6及人類Cλ7基因組成之群組的人類Cλ基因為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在一些實施例中，人類Cλ基因包含與選自由人類Cλ1、人類Cλ2、人類Cλ3、人類Cλ6及人類Cλ7基因組成之群組的人類Cλ基因為基本上一致或一致之序列。在一些實施例中，人類Cλ基因包含與選自由人類Cλ1、人類Cλ2、人類Cλ3、人類Cλ6及人類Cλ7基因組成之群組的人類Cλ基因為一致之序列。在某些實施例中，人類Cλ1基因為或包含SEQ ID NO:15。在某些實施例中，人類Cλ2基因為或包含SEQ ID NO:16。在某些實施例中，人類Cλ3基因為或包含SEQ ID NO:17。在某些實施例中，人類Cλ6基因為或包含SEQ ID NO:18。在某些實施例中，人類Cλ7基因為或包含SEQ ID NO:18。在某些實施例中，人類Cλ基因為或包含人類Cλ2基因。
在一些實施例中，人類Cλ基因包含與選自由人類Cλ1、人類Cλ2、人類Cλ3、人類Cλ6及人類Cλ7基因組成之群組的人類Cλ基因為80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%或98%至100%一致之序列。在一些實施例中，人類Cλ基因包含與選自由人類Cλ1、人類Cλ2、人類Cλ3、人類Cλ6及人類Cλ7基因組成之群組的人類Cλ基因為80%至98%、80%至95%、80%至90%或80%至85%一致之序列。在一些實施例中，人類Cλ基因包含與選自由人類Cλ1、人類Cλ2、人類Cλ3、人類Cλ6及人類Cλ7基因組成之群組的人類Cλ基因為85%至98%、90%至95%或88%至93%一致之序列。
在所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織的一些實施例中，該非人類動物、非人類細胞或非人類組織之生殖系基因組進一步包含內源免疫球蛋白重鏈基因座，其係經修飾以包含一或多個人類VH 基因區段、一或多個人類DH 基因區段及一或多個人類JH 基因區段，該人類VH 、DH 及JH 基因區段在內源免疫球蛋白重鏈基因座處可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區(參見例如Macdonald, L.E.等人, 「Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes,」 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 111(14):5147-5152 (2014年4月8日)；美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號及第8,791,323號，各以引用之方式整體併入本文中)。
在一些實施例中，一或多個人類VH 基因區段、一或多個人類DH 基因區段及一或多個人類JH 基因區段之插入，係整體或部分地代替或替代非人類VH 、DH 及JH 基因區段(例如在位置上以人類VH 、DH 及JH 基因區段之編碼序列，來替代或取代非人類VH 、DH 及JH 基因區段之編碼序列)。在一些實施例中，非人類免疫球蛋白重鏈恆定區為或包含內源非人類免疫球蛋白重鏈恆定區。在許多實施例中，非人類免疫球蛋白重鏈恆定區(例如內源)包括一或多個非人類免疫球蛋白重鏈恆定區基因或基因區段(例如IgM、IgD、IgG、IgE、IgA等)。在某些實施例中，插入包括天然出現在人類VH 、DH 及JH 基因區段之間的人類非編碼DNA以及其組合。在某些實施例中，如本文所述之免疫球蛋白重鏈基因座包含人類VH 基因區段VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2、VH 6-1或其任何組合，人類DH 基因區段DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26、DH 7-27或其任何組合，以及人類JH 基因區段JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5、JH 6或其任何組合之插入。在某些實施例中，插入包括天然出現在內源重鏈基因座中人類VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2或VH 6-1相鄰處之人類非編碼DNA，天然出現在人類DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26或DH 7-27相鄰處之人類非編碼DNA，以及天然出現在內源重鏈基因座中人類JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5或JH 6相鄰處之人類非編碼DNA。
在一些實施例中，本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織在其基因組(例如其生殖系基因組)中包括Adam6基因，該Adam6基因編碼ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段(參見例如美國專利第8,642,835號及第8,697,940號，各以引用之方式整體併入本文中)。在一些實施例中，本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，在其基因組(例如其生殖系基因組)中包括嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠) Adam6基因，其編碼嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠) ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段(參見例如美國專利第8,642,835號及第8,697,940號，各以引用之方式整體併入本文中)。在一些實施例中，ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段係表現自Adam6基因。在一些實施例中，如本文所述之經基因修飾之非人類動物中的Adam6基因，並非源自於該特定非人類動物(例如包括自另一品系小鼠獲得之大鼠Adam6基因或小鼠Adam6基因的小鼠)。在一些實施例中，本文所述之非人類動物包括異位（ectopic）Adam6基因。如本文所用，「異位」Adam6基因係指處於與Adam6基因出現在野生型非人類動物中不同的背景下的Adam6基因。舉例而言，Adam6基因可位於不同染色體上，位於不同基因座上，或位於不同序列相鄰處。一種示例性異位Adam6基因為位於人類免疫球蛋白序列(例如人類重鏈可變區基因區段)內之小鼠Adam6基因。在一些實施例中，本文所述之非人類動物包括插入或經整合之Adam6基因。
在一些實施例中，本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織包括在其基因組(例如其生殖系基因組)中插入有一或多個核苷酸序列，該一或多個核苷酸序列係編碼一或多種非人類Adam6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。
在一些實施例中，本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織在其基因組(例如其生殖系基因組)中包括一或多個核苷酸序列，其編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。在一些實施例中，本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，在其基因組(例如其生殖系基因組)中包括小鼠Adam6a基因及/或小鼠Adam6b基因。在一些實施例中，本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織包括一或多個核苷酸序列，其係編碼小鼠ADAM6a、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段，及/或小鼠ADAM6b、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。
在一些實施例中，編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係插入及/或位於與內源免疫球蛋白重鏈基因座相同之染色體上。在一些實施例中，編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係插入及/或位於使編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列與人類免疫球蛋白重鏈可變區基因區段相連的位置中。在一些實施例中，編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係插入及/或位於使編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列與人類免疫球蛋白重鏈可變區基因區段相鄰的位置中。在一些實施例中，編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係插入及/或位於使編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列位於人類免疫球蛋白重鏈可變區基因區段之間的位置中。在一些實施例中，編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係插入及/或位於第一與第二人類VH 基因區段之間。在一些實施例中，第一人類VH 基因區段為人類VH 1-2且第二人類VH 基因區段為人類VH 6-1。在一些實施例中，編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係插入及/或位於人類Adam6偽基因之位置處。在一些實施例中，編碼一或多種非人類ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係插入人類VH 基因區段與人類DH 基因區段之間。
在一些實施例中，本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，係包括使ADAM6活性恢復或增强之Adam6基因。在一些實施例中，Adam6基因使ADAM6活性恢復至包括有功能性內源Adam6基因之可比非人類動物的水準。在一些實施例中，Adam6基因使ADAM6活性增强至不包括功能性Adam6基因之可比非人類動物之ADAM6活性的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的水準。
在一些實施例中，本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，係包括當在雄性非人類動物中表現時恢復或增强生育力之Adam6基因。在一些實施例中，Adam6基因使雄性非人類動物中之生育力恢復至包括有功能性內源Adam6基因之可比非人類動物的水準。在一些實施例中，Adam6基因使雄性非人類動物之生育力恢復，以使得藉由該雄性非人類動物交配所產生之幼崽數目為由不包括功能性Adam6基因之可比雄性非人類動物的可比交配所產生之幼崽數目的至少70%、至少80%、至少90%、至少95%。在一些實施例中，Adam6基因增强雄性非人類動物之生育力，以使得藉由該雄性非人類動物交配所產生之幼崽數目，係為不包括功能性Adam6基因之可比雄性非人類動物的可比交配所產生之幼崽數目的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
在一些實施例中，如本文所述之非人類免疫球蛋白重鏈基因座缺乏至少一個內源非人類Adam6基因。在一些實施例中，至少一個內源非人類Adam6基因之缺乏，係降低缺乏內源非人類Adam6基因之雄性嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)其ADAM6活性及/或生育力。在一些實施例中，如本文所述之非人類免疫球蛋白重鏈基因座，係包括至少一個內源非人類Adam6基因之破壞。在一些實施例中，至少一個內源非人類Adam6基因之破壞，係降低缺乏內源非人類Adam6基因之雄性嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)其ADAM6活性及/或生育力。
在如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織的一些實施例中，非人類動物、非人類細胞或非人類組織的如本文所述之經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座（其包含人類重鏈可變區基因區段），係為同型合子或異型合子。
在如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織的一些實施例中，非人類動物、非人類細胞或非人類組織的如本文所述之經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座（其包含人類輕鏈可變基因區段(人類可變λ輕鏈基因區段)），係為同型合子或異型合子。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，係包含第一經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因，該第一經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因係包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，非人類動物、非人類細胞或非人類組織係包含第二經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因，該第二經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因係包含可操作地連接至嚙齒類動物Cκ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區包含人類Vκ基因區段及人類Jκ基因區段。在一些實施例中，此類非人類動物或非人類組織可自第一經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因表現λ輕鏈，並自第二經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因表現κ輕鏈。在一些實施例中，單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區包含Vκ3-20或Vκ1-39，且單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含Vλ1-51或Vλ2-14。在一個實施例中，單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區為Vκ3-20/Jκ1或Vκ1-39/Jκ5，且單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區為Vλ1-51/Jλ2或Vλ2-14/Jλ2。
在所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織的一些實施例中，內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座係整體或部分缺失。在所提供之非人類動物、非人類細胞或非人類組織的一些實施例中，內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座係功能沉默的，或在其他方面無功能的(例如藉由基因靶向)。在所提供之非人類動物、非人類細胞或非人類組織的某些實施例中，非人類動物、非人類細胞或非人類組織的功能沉默或在其他方面無功能的如本文所述之內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座，係為同型合子。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織其內源免疫球蛋白λ輕鏈之表現係不可偵測。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，其內源免疫球蛋白κ輕鏈之表現係不可偵測。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，其內源免疫球蛋白λ輕鏈或內源免疫球蛋白κ輕鏈之表現係不可偵測。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，其內源免疫球蛋白重鏈之表現係不可偵測。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，其內源免疫球蛋白λ輕鏈、內源免疫球蛋白κ輕鏈及內源免疫球蛋白重鏈之表現係不可偵測。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織具有基因組，其進一步包含編碼外源末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)之核酸序列，該核酸序列係可操作地連接至轉錄控制元件。(參見例如WO 2017/210586及美國公開案第2017/0347633號，各以引用之方式整體併入本文中)。
在一些實施例中，轉錄控制元件包括RAG1轉錄控制元件、RAG2轉錄控制元件、免疫球蛋白重鏈轉錄控制元件、免疫球蛋白κ輕鏈轉錄控制元件、免疫球蛋白λ輕鏈轉錄控制元件或其任何組合。
在一些實施例中，編碼外源TdT之核酸序列係位於免疫球蛋白κ輕鏈基因座、免疫球蛋白λ輕鏈基因座、免疫球蛋白重鏈基因座、RAG1基因座或RAG2基因座處。
在一些實施例中，TdT為人類TdT。在一些實施例中，TdT為TdT之短同功型(TdTS)。
在一些實施例中，單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係以維持靠近插入點之非人類免疫球蛋白κ輕鏈强化子區域(或强化子序列)(例如非人類免疫球蛋白κ內含子强化子及/或非人類免疫球蛋白κ 3'强化子)之完整性的方式，來引入內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。因此，此類非人類動物具有可操作地連接至人類及非人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(例如人類Vλ及Jλ基因區段，及非人類Cλ或Cκ)，或可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(例如人類Vλ及Jλ基因區段，及人類Cλ或Cκ)之野生型免疫球蛋白κ輕鏈强化子區域(或强化子序列)。
在一些實施例中，如本文所述的經一或多個人類免疫球蛋白λ輕鏈序列所改變、置換、破壞、缺失、替代或工程改造的非人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座，係為鼠類免疫球蛋白κ輕鏈基因座。在一些實施例中，如本文所述之一或多個人類免疫球蛋白λ輕鏈序列，係插入該非人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座之兩個複本中的非人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座之一個複本(亦即對偶基因)中，而產生關於人類免疫球蛋白κ輕鏈序列為異型合子之非人類動物。在一些實施例中，提供一種如本文所述之包括一或多個人類免疫球蛋白λ輕鏈序列其免疫球蛋白κ輕鏈基因座為同型合子的非人類動物。
在一些實施例中，內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座之一或多個內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(或其部分)係未缺失。在一些實施例中，內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座之一或多個內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(或其部分)係為缺失。在一些實施例中，內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座之一或多個內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(例如V、J及/或C或其任何組合)，係經改變、置換、破壞、缺失或替代，以使得該非人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座為功能上沉默。在一些實施例中，內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座之一或多個內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(例如V、J及/或C或其任何組合)，係經靶向載體所改變、置換、破壞、缺失或替代，以使得該非人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座為功能不活化(亦即不能產生在如本文所述之非人類動物之抗體組庫中表現及/或可偵測的抗體之功能性輕鏈)。關於內源非人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座不活化之指導，係於例如美國專利第9,006,511號(參見例如圖2)中所提供，該專利以引用之方式整體併入本文中。
經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座或轉殖基因(例如包括如本文所述之有限人類λ輕鏈可變區組庫)或其表現產物，可使用多種方法偵測，包括例如PCR、南方墨點法、限制性片段長度多樣性(RFLP)、對偶基因得失分析、西方墨點法、FACS分析等。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織關於如本文所述之經工程改造其免疫球蛋白κ輕鏈基因座為異型合子。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織關於如本文所述之經工程改造其免疫球蛋白κ輕鏈基因座為半合子。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織含有如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座或轉殖基因的一或多個複本。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織含有如圖式中所描繪之經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座。
本文認知到，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，在抗體選擇及產生機制(例如重組及體細胞超突變)中會利用其基因組中所包括之人類重鏈及λ輕鏈可變區基因區段。因而，在多個實施例中，由本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織所產生的人類免疫球蛋白人類重鏈及λ輕鏈可變域，係分別由其基因組中所包括之人類重鏈及λ輕鏈可變區基因區段或其體細胞超突變變異體來編碼。
在一些實施例中，本文提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，其基因組包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其中該非人類動物包括B細胞，該B細胞包含經體細胞超突變之人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列。在一些實施例中，本文之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之B細胞中存在的人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈，係具有1個、2個、3個、4個、5個或更多個體細胞超突變。所屬領域之技術人員知道用於鑑別成熟抗體序列中之源基因區段之方法。舉例而言，多種工具可用於幫助此項分析，諸如DNAPLOT、IMGT/V-QUEST、JOINSOLVER、SoDA及Ab-origin。
本文尤其提供來自本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠、小鼠)之細胞及組織。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之脾臟細胞(及/或其他淋巴組織)。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之B細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之祖B細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之前B細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之未成熟B細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之成熟未處理B細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之活化B細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之記憶B細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之B組庫淋巴球。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之血漿或血漿細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之幹細胞。在一些實施例中，幹細胞為胚胎幹細胞。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物之生殖細胞。在一些實施例中，生殖細胞為卵母細胞。在一些實施例中，生殖細胞為精子細胞。在一些實施例中，來自如本文所述之非人類動物之精子細胞係表現一或多種ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。在一些實施例中，來自如本文所述之非人類動物之任何細胞或組織係為可分離。在一些實施例中，本文提供來自如本文所述之非人類動物的經分離之細胞及/或經分離之組織。在一些實施例中，本文提供一種融合瘤，其中該融合瘤係利用如本文所述之非人類動物之B細胞來製造。在一些實施例中，融合瘤係利用非人類動物之B細胞來製造，該非人類動物已被感興趣的抗原免疫接種。在一些實施例中，融合瘤係用非人類動物之B細胞來製造，該B細胞表現結合(例如特異性結合)於感興趣的抗原上之抗原决定基之抗體。
如本文所述之任何非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)可經一或多種感興趣的抗原免疫接種，其條件及時間足以使非人類動物顯現對該一或多種感興趣的抗原之免疫反應。所屬領域之技術人員知道對非人類動物進行免疫接種之方法。對非人類動物進行免疫接種之一種示例性非限制性方法，係可見於美國專利第7,582, 298號，該專利以引用之方式整體併入本文中。
本文尤其提供經免疫接種之如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，及自其分離之細胞及組織。在一些實施例中，本文所述之非人類動物對用包括一或多個抗原决定基之抗原進行之免疫接種起反應，而產生B細胞群體。在一些實施例中，非人類動物產生B細胞群體，該B細胞群體係表現結合(例如特異性結合)於感興趣的抗原之一或多個抗原决定基之抗體。在一些實施例中，由對抗原起反應而產生之B細胞群體所表現的抗體，係包括重鏈及/或λ輕鏈，該重鏈具有由人類重鏈可變區序列所編碼之人類重鏈可變域，該輕鏈具有由如本文所述之人類λ輕鏈可變區序列所編碼之人類λ輕鏈可變域。在一些實施例中，由對抗原起反應而產生之B細胞群體所表現的抗體，係包括(i)具有由人類重鏈可變區序列所編碼之人類重鏈可變域的重鏈，及(ii)具有由如本文所述之人類λ輕鏈可變區序列所編碼之人類λ輕鏈可變域的λ輕鏈。
在一些實施例中，非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)係產生B細胞群體，該B細胞群體表現結合於感興趣的抗原之一或多個抗原决定基之抗體，其中由對抗原起反應而產生之B細胞群體所表現之抗體，係包括：(i)具有由人類重鏈可變區序列編碼之人類重鏈可變域的重鏈，及(ii)具有由如本文所述之人類λ輕鏈可變區序列編碼之人類λ輕鏈可變域的λ輕鏈。在一些實施例中，如本文所述之人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列係經體細胞超突變。在一些實施例中，對抗原起反應而產生之B細胞群體中之B細胞，至少有約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%係包括經體細胞超突變之人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列。 特定示例性實施例 - 免疫球蛋白 κ 輕鏈基因座
在一些實施例中，本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區且插入在非人類或人類Cλ基因區段上游，並可操作地連接至非人類或人類Cλ基因區段，該非人類或人類Cλ基因區段插入在非人類Cκ基因之位置中。如本文所述，此類經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座進一步包括非人類免疫球蛋白κ輕鏈强化子區域(或强化子序列)。在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括在人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座之A簇中出現的人類Vλ基因區段。在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括在人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座之B簇中出現的人類Vλ基因區段。在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括在人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座之C簇中出現的人類Vλ基因區段。在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括選自由以下組成之群組之人類Vλ基因區段：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，經工程改造之κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括選自由以下組成之群組之人類Vλ基因區段：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，經工程改造之κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括選自由以下組成之群組的人類Vλ基因區段：Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1。在一些實施例中，經工程改造之κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括選自由以下組成之群組的人類Vλ基因區段：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。在一些實施例中，經工程改造之κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括選自由以下組成之群組的人類Vλ基因區段的：Vλ1-51、Vλ1-40及Vλ2-14。在一些實施例中，經工程改造之κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括選自Vλ1-51或Vλ2-14之人類Vλ基因區段。在一些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括選自由以下組成之群組之人類Jλ基因區段：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。在一些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括選自由以下組成之群組之人類Jλ基因區段：Jλ1、Jλ2、Jλ3及Jλ7。在一些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)包含單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包括人類Jλ2基因區段。
本文認知到，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)在抗體選擇及產生機制(例如重組及體細胞超突變)中會利用其基因組中所包括之人類λ輕鏈可變區基因區段。因而，在多個實施例中，由本文所述之非人類動物所產生的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，係由其基因組中所包括之人類λ輕鏈可變區基因區段或其體細胞超突變變異體來編碼。
在一些實施例中，本文提供一種非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，其基因組包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其中非人類動物包括B細胞，其包含經體細胞超突變之人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列。在一些實施例中，本文之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之B細胞中存在的人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列，係具有1個、2個、3個、4個、5個或更多個體細胞超突變。所屬領域之技術人員知道用於鑑別成熟抗體序列中之源基因區段的方法。舉例而言，多種工具可用於幫助此項分析，諸如DNAPLOT、IMGT/V-QUEST、JOINSOLVER、SoDA及Ab-origin。
在許多實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)，係含有在野生型免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)中出現之非人類免疫球蛋白κ輕鏈强化子區域(或强化子序列)。在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)含有在不同物種(例如不同嚙齒類動物物種)之野生型免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)中出現的非人類免疫球蛋白κ輕鏈强化子區域(或强化子序列)。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)在其生殖系基因組中包含可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白κ輕鏈强化子(亦即强化子序列或强化子區域)之有限人類λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)。在某些實施例中，該有限人類λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)可操作地連接至鼠類免疫球蛋白κ輕鏈內含子强化子區域(Igκ Ei或Eiκ)。在某些實施例中，該有限人類λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)可操作地連接至鼠類免疫球蛋白κ輕鏈3'强化子區域(Igκ 3'E或3'Eκ)。在某些實施例中，該有限人類λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)可操作地連接至鼠類Eiκ且可操作地連接至鼠類3'Eκ。
在一些實施例中，經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)之非人類Cλ基因為嚙齒類動物Cλ基因，諸如小鼠Cλ基因或大鼠Cλ基因。在某些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)之非人類Cλ基因為或包含來自包括129品系、BALB/c品系、C57BL/6品系、混合129xC57BL/6品系或其組合之遺傳背景的小鼠Cλ基因。
在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的非人類Cλ基因包含與SEQ ID NO:1 (小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:2 (小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:3 (小鼠Cλ3)為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的非人類Cλ基因包含與SEQ ID NO:1 (小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:2 (小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:3 (小鼠Cλ3)為基本上一致或一致之序列。在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的非人類Cλ基因為或包含小鼠Cλ1基因之序列。
在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)處的序列所編碼的非人類Cλ域，係包含與SEQ ID NO:4 (小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:5 (小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:6 (小鼠Cλ3)為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)處的序列所編碼的非人類Cλ域，係包含與SEQ ID NO:4 (小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:5 (小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:6 (小鼠Cλ3)為基本上一致或一致之序列。在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)處的序列所編碼的非人類Cλ基因，係為或包含小鼠Cλ1域多肽。
在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的非人類Cλ基因，係包含與SEQ ID NO:7 (大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:8 (大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:9 (大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:10 (大鼠Cλ4)為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在某些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的非人類Cλ基因，係包含與SEQ ID NO:7 (大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:8 (大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:9 (大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:10 (大鼠Cλ4)為基本上一致或一致之序列。在某些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的非人類Cλ基因，係為或包含大鼠Cλ1基因之序列。
在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)處的序列所編碼的非人類Cλ域，係包含與SEQ ID NO:11 (大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:12 (大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:13 (大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:14 (大鼠Cλ4)為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)處的序列所編碼的非人類Cλ域，係包含與SEQ ID NO:11 (大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:12 (大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:13 (大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:14 (大鼠Cλ4)基本上一致或一致之序列。在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)處的序列所編碼的非人類Cλ域，係為或包含大鼠Cλ1域多肽。
在一些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的人類Cλ基因，係包括人類Cλ基因，諸如人類Cλ1基因、人類Cλ2基因、人類Cλ3基因、人類Cλ6基因或人類Cλ7基因。在某些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的人類Cλ基因，係為或包含人類Cλ2基因。
在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的人類Cλ基因，係包含與SEQ ID NO:15 (人類Cλ1)、SEQ ID NO:16 (人類Cλ2)、SEQ ID NO:17 (人類Cλ3)、SEQ ID NO:18 (人類Cλ6)或SEQ ID NO:19 (人類Cλ7)為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的人類Cλ基因，係包含與SEQ ID NO:15 (人類Cλ1)、SEQ ID NO:16 (人類Cλ2)、SEQ ID NO:17 (人類Cλ3)、SEQ ID NO:18 (人類Cλ6)或SEQ ID NO:19 (人類Cλ7)為基本上一致或一致之序列。在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的人類Cλ基因，係為或包含人類Cλ2基因之序列。
在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的序列所編碼的人類Cλ域，係包含與SEQ ID NO:20 (人類Cλ1)、SEQ ID NO:21 (人類Cλ2)、SEQ ID NO:22 (人類Cλ3)、SEQ ID NO:23 (人類Cλ6)或SEQ ID NO:24 (人類Cλ7)為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致之序列。在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的序列所編碼的人類Cλ域，係包含與SEQ ID NO:20 (人類Cλ1)、SEQ ID NO:21 (人類Cλ2)、SEQ ID NO:22 (人類Cλ3)、SEQ ID NO:23 (人類Cλ6)或SEQ ID NO:24 (人類Cλ7)為基本上一致或一致之序列。在一些實施例中，由位於如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(或對偶基因)的序列所編碼的人類Cλ域，係為或包含人類Cλ2域多肽。 特定示例性實施例 – 免疫球蛋白重鏈基因座
在一些實施例中，本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)包含如本文所述之包括有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，且進一步包含經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座(或對偶基因)，其特徵在於存在複數個人類VH 、DH 及JH 基因區段，其係以生殖系組態排列且可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)免疫球蛋白重鏈恆定區基因、强化子及調控區域。在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座(或對偶基因)包含可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區之一或多個人類VH 基因區段、一或多個人類DH 基因區段及一或多個人類JH 基因區段。在某些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座(或對偶基因)包含至少人類VH 基因區段VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2、VH 6-1或其任何組合。在某些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座(或對偶基因)包含至少人類DH 基因區段DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26、DH 7-27或其任何組合。在某些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座(或對偶基因)包含至少人類JH 基因區段JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5、JH 6或其任何組合。
本文認識到，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)在抗體選擇及產生機制(例如重組及體細胞超突變)中，會利用其基因組中所包含之人類重鏈可變區基因區段。因而，在多個實施例中，由本文所述之非人類動物產生的人類免疫球蛋白重鏈可變域，係由其基因組中所包括之人類重鏈可變區基因區段或其體細胞超突變變異體來編碼。
在一些實施例中，非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)包括B細胞，其包含經體細胞超突變之人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列。在一些實施例中，本文之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之B細胞中存在的人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列，係具有1個、2個、3個、4個、5個或更多個體細胞超突變。所屬領域之技術人員知道用於鑑別成熟抗體序列中之源基因區段的方法。舉例而言，多種工具可用於幫助此項分析，諸如DNAPLOT、IMGT/V-QUEST、JOINSOLVER、SoDA及Ab-origin。
在一些實施例中，非人類免疫球蛋白重鏈恆定區包括一或多個非人類免疫球蛋白重鏈恆定區基因，諸如免疫球蛋白M (IgM)、免疫球蛋白D (IgD)、免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白E (IgE)及免疫球蛋白A (IgA)。在某些實施例中，非人類免疫球蛋白重鏈恆定區包括嚙齒類動物IgM、嚙齒類動物IgD、嚙齒類動物IgG3、嚙齒類動物IgG1、嚙齒類動物IgG2b、嚙齒類動物IgG2a、嚙齒類動物IgE及嚙齒類動物IgA的恆定區基因。在一些實施例中，該等人類VH 、DH 及JH 基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白重鏈强化子(亦即强化子序列或强化子區域)。在一些實施例中，該等人類VH 、DH 及JH 基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白重鏈調控區域(或調控序列)。在一些實施例中，該等人類VH 、DH 及JH 基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白重鏈强化子(或强化子序列)及一或多個非人類免疫球蛋白重鏈調控區域(或調控序列)。
在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座不含內源Adam6基因。在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座在與在相同物種之野生型非人類動物之生殖系基因組中所發現相同的生殖系基因組位置中不含內源Adam6基因(或編碼Adam6之序列)。在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座不含人類Adam6偽基因。在一些實施例中，如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座包含至少一個核苷酸序列的插入，該至少一個核苷酸序列係編碼一或多種非人類(例如嚙齒類動物) Adam6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。在一些實施例中，該插入可在如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座外部(例如但不限於在最5' VH 基因區段上游)，在經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座內或在非人類動物(例如但不限於隨機引入之非人類編碼Adam6之序列)、細胞或組織之生殖系基因組中的其他地方。
在多個實施例中，本文所提供之如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)抗體分子中之內源非人類VH 區域的整體或部分其表現係不可偵測。在多個實施例中，本文所提供之如本文所述之非人類動物不含(或缺乏，或含有缺失) 一或多個核苷酸序列，該一或多個核苷酸序列係編碼抗體分子中之內源非人類VH 區域(例如VH 、DH 及/或JH )之整體或部分。在多個實施例中，本文所提供之如本文所述之非人類動物具有包括內源非人類VH 、DH 及JH 基因區段整體或部分缺失的生殖系基因組。在多個實施例中，所提供之非人類動物有生殖力。
關於建立具有此類經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座(或對偶基因)之靶向載體、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及動物的指導，可見於以下文獻：Macdonald (2014)；美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號及第8,791,323號，各以引用之方式整體併入本文中。所屬領域之技術人員知道所屬領域中已知的多種技術，其係實現此類基因工程改造及/或操縱非人類(例如哺乳動物)基因組或以其他方式製備、提供或製造此類序列，以供引入非人類動物之生殖系基因組。 特定示例性實施例 - 免疫球蛋白基因座之組合
在一些實施例中，如本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)在其生殖系基因組中包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包括如本文所述之有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)，且進一步包含一或多個額外免疫球蛋白基因座，其包括人類免疫球蛋白基因區段或其他人類或人類化基因(例如編碼TdT之人類基因)(例如經由雜交繁殖或多個基因靶向策略)。此類非人類動物可如上所述或使用所屬領域中已知之方法製備，以視非人類動物之預期用途而定，實現期望之經工程改造之基因型。在其他免疫球蛋白基因座處之額外人類免疫球蛋白基因區段或其他人類或人類化基因(例如編碼TdT之人類基因)，可經由進一步改變具有如上所述之基因修飾之細胞(例如胚胎幹細胞)的基因組或經由所屬領域中已知之繁殖技術利用其他期望之經基因修飾之品系來引入。
在一些實施例中，如本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)在其生殖系基因組中包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包括如本文所述之有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)，且在其生殖系基因組中進一步包含經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，其包括可操作地連接至一或多個非人類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因之一或多個人類VH 基因區段、一或多個人類D基因區段及一或多個人類JH 基因區段。在一些實施例中，非人類動物的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座（其包括如本文所述之有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)）係為異型合子或同型合子。在一些實施例中，非人類動物其如本文所述之經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座為異型合子或同型合子的。在一些實施例中，非人類動物的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座（其包括如本文所述之有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)）為同型合子，且其如本文所述之經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座為同型合子。
在一些實施例中，如本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)在其生殖系基因組中，係包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座（其包括如本文所述之有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)）、包含可操作地連接至一或多個非人類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因之一或多個人類VH 基因區段、一或多個人類D基因區段及一或多個人類JH 基因區段的經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，且進一步包含功能不活化(例如整體或部分缺失，或以其他方式引起無功能)之內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。在一些實施例中，非人類動物的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座（其包括如本文所述之有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區譜(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)）為異型合子或同型合子。在一些實施例中，非人類動物其如本文所述之經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，係為異型合子或同型合子。在一些實施例中，非人類動物其功能不活化(例如整體或部分缺失，或以其他方式引起無功能)之內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座，係為異型合子或同型合子。在一些實施例中，非人類動物的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座（其包括如本文所述之有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)），係為同型合子，其如本文所述之經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座係為同型合子，且其功能不活化(例如整體或部分缺失，或以其他方式引起無功能)之內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座係為同型合子。
在一些實施例中，經基因修飾之非人類動物（其為嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)）之生殖系基因組包括經工程改造之內源免疫球蛋白κ基因座，其包含兩個對偶基因之。在一些實施例中，第一對偶基因包含有限人類λ輕鏈可變區組庫，且第二對偶基因包含有限人類κ輕鏈可變區組庫。在一些實施例中，如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)、嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)細胞或嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)組織的生殖系基因組，係包含第一經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因，其包含可操作地連接至嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠) Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。在一些實施例中，如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)及因此嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)細胞或嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)組織，係包含第二經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因，其包含可操作地連接至嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠) Cκ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區包含人類Vκ基因區段及人類Jκ基因區段。在一些實施例中，此類嚙齒類動物(例如小鼠或大鼠)組織可自第一經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因表現λ輕鏈，且自第二經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座對偶基因表現κ輕鏈。在一些實施例中，單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區包含Vκ3-20或Vκ1-39，且單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含Vλ1-51或Vλ2-14。在一個實施例中，單一重排人類免疫球蛋白κ輕鏈可變區為Vκ3-20/Jκ1，且單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區為Vλ1-51/Jλ2或Vλ2-14/Jλ2。
在一些實施例中，本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)具有包含以下之生殖系基因組：(a)同型合子或異型合子之免疫球蛋白重鏈基因座，其包含可操作地連接至一或多個內源非人類免疫球蛋白重鏈恆定區之人類VH 、DH 及JH 基因區段，以使得該非人類動物表現包含與非人類CH 域序列融合之人類VH 域序列之免疫球蛋白重鏈；(b)免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物)免疫球蛋白Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈，以使得該非人類動物表現包含與非人類Cλ域序列融合之人類Vλ域序列之免疫球蛋白輕鏈。
在一些實施例中，本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)具有包含以下之生殖系基因組：(a)同型合子或異型合子之免疫球蛋白重鏈基因座，其包含可操作地連接至一或多個內源非人類免疫球蛋白重鏈恆定區之人類VH 、DH 及JH 基因區段，以使得該非人類動物表現包含與非人類CH 域序列融合之人類VH 域序列之免疫球蛋白重鏈；(b)免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物)免疫球蛋白Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈，以使得該非人類動物表現包含與非人類Cλ域序列融合之人類Vλ域序列之免疫球蛋白輕鏈；及(c)同型合子或異型合子之功能不活化或整體或部分缺失的內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。
舉例而言，如本文所述，包含如本文所述之經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座的非人類動物，係可進一步包含(例如經由雜交繁殖或多個基因靶向策略)一或多個修飾，該一或多個修飾係如下列所述者：如美國專利第8,642,835號、第8,697,940號、第9,006,511號、第9,035,128號、第9,066,502號、第9,150,662號及第9,163,092號；渠等各自之全文係以引用之方式併入。 核酸構築體
通常，含有人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(例如單一重排人類λ輕鏈可變區，或一或兩個未重排之Vλ基因區段與至少一個未重排之Jλ基因區段)或其部分之多核苷酸分子與載體、較佳DNA載體連接(例如插入其中)，以在宿主細胞中複製出該多核苷酸分子。
人類免疫球蛋白λ輕鏈序列可直接自已知序列或來源(例如文庫)選殖，或自基於可自GenBank或其他公共可用數據庫(例如IMGT)獲得之公開序列，電腦模擬設計之生殖系序列合成。可替代地，細菌人工染色體(BAC)文庫可提供所關注免疫球蛋白DNA序列(例如人類Vλ及Jλ序列及其組合)。BAC文庫可含有100至150 kb之插入尺寸，且能够具有大至300 kb之插入物(Shizuya等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797；Swiatek等人, 1993, Genes and Development 7:2071-2084；Kim等人, 1996, Genomics 34 213-218；以引用之方式整體併入本文中)。舉例而言，目前已有具有164至196 kb平均尺寸之插入物的人類BAC文庫(Osoegawa, K.等人, 2001, Genome Res. 11(3):483-96；Osoegawa, K.等人, 1998, Genomics 52:1-8, 論文編號GE985423，各以引用之方式整體併入本文中)。人類及非人類動物基因組BAC文庫已被構築出來且可購得(例如ThermoFisher)。基因組BAC文庫亦可用作免疫球蛋白DNA序列以及轉錄控制區之來源。
可替代地，可自酵母人工染色體(YAC)分離、選殖及/或轉移免疫球蛋白DNA序列。舉例而言，已確定人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座之核苷酸序列(參見例如Dunham, I.等人, 1999, Nature 402:489-95，其以引用之方式整體併入本文中)。此外，YAC先前已用以組裝人類免疫球蛋白λ輕鏈基因座轉殖基因(參見例如Popov, A.V.等人, 1996, Gene 177:195-201；Popov, A.V.等人, 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19，各以引用之方式整體併入本文中)。可對整個免疫球蛋白λ輕鏈基因座(人類或非人類)進行選殖且含於若干YAC內。不管所包括之序列如何，若採用多個YAC且含有重疊相似區，則其可在酵母宿主菌株內重組，產生表示整個基因座或基因座之期望部分(例如靶向載體所靶向之區域)的單個構築體。YAC臂可另外藉由修整（retrofitting）以哺乳動物選擇卡匣來修飾，以幫助藉由所屬領域中已知及/或本文所述之方法將構築體引入胚胎幹細胞或胚胎中。
構築如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的人類免疫球蛋白λ輕鏈基因區段之DNA及胺基酸序列，可自公開資料庫(例如GenBank、IMGT等)及/或公開抗體序列獲得。
在某些實施例中，含有人類免疫球蛋白λ輕鏈基因區段(例如單一重排人類λ輕鏈可變區，或一或兩個未重排之Vλ基因區段與至少一個未重排之Jλ基因區段)的核酸構築體，係可操作地連接至人類或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)免疫球蛋白λ或免疫球蛋白κ輕鏈恆定區(分別Cλ或Cκ)基因。在某些實施例中，含有人類免疫球蛋白λ輕鏈基因區段(例如單一重排人類λ輕鏈可變區，或一或兩個未重排之Vλ基因區段與至少一個未重排之Jλ基因區段)的核酸構築體，係可操作地連接至一或多個非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)免疫球蛋白κ或免疫球蛋白λ輕鏈强化子區域(或强化子序列)。在一些實施例中，含有人類免疫球蛋白λ輕鏈基因區段(例如單一重排人類λ輕鏈可變區，或一或兩個未重排之Vλ基因區段與至少一個未重排之Jλ基因區段)的核酸構築體，係可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)或人類Cλ區域基因及非人類免疫球蛋白κ輕鏈强化子區域(或强化子序列)。
在一些實施例中，含有未重排人類Vλ及Jλ序列之核酸構築體進一步包含來源於人類及/或鼠類之基因間DNA。在一些實施例中，基因間DNA為或包含非編碼鼠類免疫球蛋白κ輕鏈序列、非編碼人類免疫球蛋白κ輕鏈序列、非編碼鼠類免疫球蛋白λ輕鏈序列、非編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈序列或其組合。
可使用所屬領域中已知之方法來製備核酸構築體。舉例而言，核酸構築體可製備為大質體之一部分。此類製備允許以如所屬領域中已知之高效方式來選殖及選擇正確構築。如本文所述之含有人類免疫球蛋白λ輕鏈序列整體或部分之核酸構築體，可位於質體上限制位點之間，以便其可自剩餘質體序列分離出來，而以併入期望之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)中。
所屬領域中已知各種製備核酸構築體(例如質體)及宿主生物體轉型之方法。關於適用於原核及真核細胞之其他表現系統以及通用重組程序，參見Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 第5版, 由Old, R.W.及S.B. Primrose編輯, Blackwell Science, Inc., 1994及Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Sambrook, J.等人編輯, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989，各以引用之方式整體併入本文中。 靶向載體
可使用靶向載體來將核酸構築體引入標靶基因組的基因座中。靶向載體可包含核酸構築體及側接該核酸構築體之同源臂；所屬領域之技術人員將清楚一般適用於靶向載體之設計、結構及/或使用的多種選項及特徵。舉例而言，靶向載體可呈線性形式或呈圓形形式，且其可為單股或雙股。靶向載體可為去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。為便於提及，同源臂在本文中稱為5'及3' (亦即上游及下游)同源臂。此術語係指在靶向載體內同源臂相對核酸構築體之位置。5'及3'同源臂與靶向基因座內之區域對應或另一靶向載體內之區域對應，在本文中分別稱為「5'目標序列」及「3'目標序列」。在一些實施例中，同源臂亦可充當5'或3'目標序列。
在一些實施例中，本文所述之方法採用兩種、三種或更多種能够彼此重組之靶向載體。在多個實施例中，靶向載體為大靶向載體(large targeting vectors，LTVEC)，如本文中其他地方描述。在一些實施例中，第一、第二及第三靶向載體各包含5'及3'同源臂。第一靶向載體之3'同源臂包含與第二靶向載體之5'同源臂重疊的序列(亦即重疊序列)，此允許第一及第二LTVEC之間同源重組。
在雙重靶向法之情况下，第一靶向載體之5'同源臂及第二靶向載體之3'同源臂可類似於標靶基因組基因座內之對應區段(亦即目標序列)，此可促進第一及第二靶向載體與對應基因組區段之同源重組且修飾標靶基因組的基因座。
在三重靶向法之情况下，第二靶向載體之3'同源臂可包含與第三靶向載體之5'同源臂重疊之序列(亦即重疊序列)，此可允許第二與第三LTVEC之間同源重組。第一靶向載體之5'同源臂及第三靶向載體之3'同源臂類似於標靶基因組基因座內之對應區段(亦即目標序列)，此可促進第一及第三靶向載體與對應基因組區段之同源重組且修飾標靶基因組的基因座。
當兩個區域享有彼此足够程度之序列一致性，以便其可充當同源重組反應之受質時，同源臂與目標序列或兩個同源臂係為「相對應」或彼此「對應」。給定目標序列與基於靶向載體之對應同源臂(亦即重疊序列)之間或兩個同源臂之間的序列一致性，可為允許同源重組發生之任何程度之序列一致性。僅舉一例，靶向載體(或其片段)之同源臂與另一靶向載體之目標序列或標靶基因組基因座(或其片段)之目標序列共享的序列一致性的量，可為例如但不限於至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，以使得序列進行同源重組。
此外，同源臂與對應目標序列之間的類似性(例如一致性)對應區域可具有足够促進標靶基因組基因座處同源重組的任何長度。舉例而言，給定同源臂及/或對應目標序列所包含的類似性對應區域可例如為但不限於約5至10 kb、5至15 kb、5至20 kb、5至25 kb、5至30 kb、5至35 kb、5至40 kb、5至45 kb、5至50 kb、5至55 kb、5至60 kb、5至65 kb、5至70 kb、5至75 kb、5至80 kb、5至85 kb、5至90 kb、5至95 kb、5至100 kb、100至200 kb或200至300 kb長(諸如本文中其他地方描述)，以便同源臂具有足够類似性，從而與細胞之標靶基因組基因座內或另一靶向載體內的對應目標序列進行同源重組。在一些實施例中，給定同源臂及/或對應目標序列所包含的類似性對應區域例如為但不限於約10至100 kb、15至100 kb、20至100 kb、25至100 kb、30至100 kb、35至100 kb、40至100 kb、45至100 kb、50至100 kb、55至100 kb、60至100 kb、65至100 kb、70至100 kb、75至100 kb、80至100 kb、85至100 kb、90至100 kb或95至100 kb長(諸如本文中其他地方描述)，以便同源臂具有足够類似性，從而與細胞之標靶基因組基因座內或另一靶向載體內的對應目標序列進行同源重組。
第一靶向載體之3'同源臂與第二靶向載體之5'同源臂或第二靶向載體之3'同源臂與第三靶向載體之5'同源臂的重疊序列可具有足够促進該等靶向載體之間同源重組的任何長度。舉例而言，同源臂之給定重疊序列包含的對應重疊區可為約1至5 kb、5至10 kb、5至15 kb、5至20 kb、5至25 kb、5至30 kb、5至35 kb、5至40 kb、5至45 kb、5至50 kb、5至55 kb、5至60 kb、5至65 kb、5至70 kb、5至75 kb、5至80 kb、5至85 kb、5至90 kb、5至95 kb、5至100 kb、100至200 kb或200至300 kb長，以便同源臂之重疊序列具有足够類似性，從而與另一靶向載體內的對應重疊序列進行同源重組。在一些實施例中，同源臂之給定重疊序列包含的重疊區為約1至100 kb、5至100 kb、10至100 kb、15至100 kb、20至100 kb、25至100 kb、30至100 kb、35至100 kb、40至100 kb、45至100 kb、50至100 kb、55至100 kb、60至100 kb、65至100 kb、70至100 kb、75至100 kb、80至100 kb、85至100 kb、90至100 kb或95至100 kb長，以便同源臂之重疊序列具有足够類似性，從而與另一靶向載體內的對應重疊序列進行同源重組。在一些實施例中，重疊序列為1至5 kb (包括端點)。在一些實施例中，重疊序列為約1 kb至約70 kb (包括端點)。在一些實施例中，重疊序列為約10 kb至約70 kb (包括端點)。在一些實施例中，重疊序列為約10 kb至約50 kb (包括端點)。在一些實施例中，重疊序列為至少10 kb。在一些實施例中，重疊序列為至少20 kb。舉例而言，重疊序列可為約1 kb至約5 kb (包括端點)、約5 kb至約10 kb (包括端點)、約10 kb至約15 kb (包括端點)、約15 kb至約20 kb (包括端點)、約20 kb至約25 kb (包括端點)、約25 kb至約30 kb (包括端點)、約30 kb至約35 kb (包括端點)、約35 kb至約40 kb (包括端點)、約40 kb至約45 kb (包括端點)、約45 kb至約50 kb (包括端點)、約50 kb至約60 kb (包括端點)、約60 kb至約70 kb (包括端點)、約70 kb至約80 kb (包括端點)、約80 kb至約90 kb (包括端點)、約90 kb至約100 kb (包括端點)、約100 kb至約120 kb (包括端點)、約120 kb至約140 kb (包括端點)、約140 kb至約160 kb (包括端點)、約160 kb至約180 kb (包括端點)、約180 kb至約200 kb (包括端點)、約200 kb至約220 kb (包括端點)、約220 kb至約240 kb (包括端點)、約240 kb至約260 kb (包括端點)、約260 kb至約280 kb (包括端點)、或約280 kb至約300 kb (包括端點)。僅舉一例，重疊序列可為約20 kb至約60 kb (包括端點)。可替代地，重疊序列可為至少1 kb、至少5 kb、至少10 kb、至少15 kb、至少20 kb、至少25 kb、至少30 kb、至少35 kb、至少40 kb、至少45 kb、至少50 kb、至少60 kb、至少70 kb、至少80 kb、至少90 kb、至少100 kb、至少120 kb、至少140 kb、至少160 kb、至少180 kb、至少200 kb、至少220 kb、至少240 kb、至少260 kb、至少280 kb或至少300 kb。在一些實施例中，重疊序列可為至多400 kb、至多350 kb、至多300 kb、至多280 kb、至多260 kb、至多240 kb、至多220 kb、至多200 kb、至多180 kb、至多160 kb、至多140 kb、至多120 kb、至多100 kb、至多90 kb、至多80 kb、至多70 kb、至多60 kb或至多50 kb。
在一些實施例中，同源臂可與細胞天然之基因座(例如靶向基因座)對應，或可替代地，其可與整合至細胞基因組中的DNA之異源或外源區段之區域，包括例如轉殖基因、表現卡匣或DNA之異源或外源區域對應。在一些實施例中，同源臂可在一些實施例中與細胞中靶向載體上之區域對應。在一些實施例中，靶向載體之同源臂可與酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)、人類人工染色體之區域或適當宿主細胞中含有之任何其他經工程改造之區域對應。更進一步，靶向載體之同源臂可對應於或源自於BAC文庫、黏粒文庫或P1噬菌體文庫。在某些實施例中，靶向載體之同源臂與對原核生物、酵母、禽類(例如雞)、非人類哺乳動物、嚙齒類動物、人類、大鼠、小鼠、倉鼠兔、猪、牛、鹿、綿羊、山羊、貓、犬、雪貂、靈長類動物(例如狨、恆河猴)、家養哺乳動物、農業哺乳動物或所關注其他生物體而言為天然、異源或外源的基因座對應。在一些實施例中，同源臂與使用習知方法，展示有限可靶向性，或在缺乏核酸酶劑(例如Cas蛋白質)誘發之切口或雙股斷裂下展示在標靶位點相對低水準之成功整合及/或顯著水準之脫靶整合的細胞基因座對應。在一些實施例中，同源臂經設計以包括經工程改造之DNA。
在一些實施例中，靶向載體之5'及3'同源臂與靶向基因組對應。可替代地，同源臂與相關基因組對應。舉例而言，靶向基因組為第一品系之小鼠基因組，且靶向臂與第二品系之小鼠基因組對應，其中第一品系與第二品系不同。在某些實施例中，同源臂與相同動物之基因組對應，或來自於相同品系之基因組，例如靶向基因組為第一品系之小鼠基因組，且靶向臂與來自相同小鼠或來自相同品系之小鼠基因組對應。
靶向載體之同源臂可具有足够促進與對應目標序列之同源重組事件的任何長度，包括例如1至5 kb (包括端點)、5至10 kb (包括端點)、5至15 kb (包括端點)、5至20 kb (包括端點)、5至25 kb (包括端點)、5至30 kb (包括端點)、5至35 kb (包括端點)、5至40 kb (包括端點)、5至45 kb (包括端點)、5至50 kb (包括端點)、5至55 kb (包括端點)、5至60 kb (包括端點)、5至65 kb (包括端點)、5至70 kb (包括端點)、5至75 kb (包括端點)、5至80 kb (包括端點)、5至85 kb (包括端點)、5至90 kb (包括端點)、5至95 kb (包括端點)、5至100 kb (包括端點)、100至200 kb (包括端點)或200至300 kb (包括端點)長。在一些實施例中，靶向載體之同源臂具有足够促進與對應目標序列之同源重組事件的長度，其為1-100 kb (包括端點)、5至100 kb (包括端點)、10至100 kb (包括端點)、15至100 kb (包括端點)、20至100 kb (包括端點)、25至100 kb (包括端點)、30至100 kb (包括端點)、35至100 kb (包括端點)、40至100 kb (包括端點)、45至100 kb (包括端點)、50至100 kb (包括端點)、55至100 kb (包括端點)、60至100 kb (包括端點)、65至100 kb (包括端點)、70至100 kb (包括端點)、75至100 kb (包括端點)、80至100 kb (包括端點)、85至100 kb (包括端點)、90至100 kb (包括端點),或95至100 kb (包括端點)長。如本文所述，大靶向載體可採用更大長度之靶向臂。
核酸酶劑(例如CRISPR/Cas系統)可與靶向載體組合使用，來促進標靶基因座之修飾(例如免疫球蛋白κ輕鏈基因座之修飾，或先前經修飾或經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座之修飾)。此類核酸酶劑可促進靶向載體與標靶基因座之間的同源重組。當核酸酶劑與靶向載體組合使用時，靶向載體可包含與位置足够接近核酸酶裂解位點以便促進目標序列與同源臂之間的同源重組事件在核酸酶裂解位點處切口或雙股斷裂後發生之5'及3'目標序列相對應的5'及3'同源臂。術語「核酸酶裂解位點」包括由核酸酶劑建立切口或雙股斷裂之DNA序列(例如Cas9裂解位點)。若距離達到促進5'及3'目標序列與同源臂之間的同源重組事件在識別位點處切口或雙股斷裂後發生，則與靶向載體之5'及3'同源臂對應之靶向基因座內之目標序列「位置足够接近」核酸酶裂解位點。因此，在某些實施例中，與靶向載體之5'及/或3'同源臂相對應之目標序列在給定識別位點之至少一個核苷酸內，或在給定識別位點之至少10個核苷酸至約14 kb內。在一些實施例中，核酸酶裂解位點緊鄰目標序列中之至少一者或兩者。
與靶向載體之同源臂對應之目標序列與核酸酶裂解位點的空間關係可變化。舉例而言，目標序列可位於核酸酶裂解位點之5'，目標序列可位於識別位點之3'，或目標序列可側接核酸酶裂解位點。
與僅使用靶向載體相比，靶向載體(包括例如大靶向載體)與核酸酶劑之組合使用可增加靶向效率。舉例而言，當靶向載體聯合核酸酶劑使用時，與僅僅使用靶向載體相比，靶向載體之靶向效率可增加至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍或在由此等整數形成之範圍內，諸如2至10倍。
一些靶向載體為「大靶向載體」或「LTVEC」，其包括靶向載體，其係包含與比意欲在細胞中進行同源重組之其他途徑通常所用之核酸序列大的核酸序列對應且源自於該等核酸序列之同源臂。LTVEC可為例如至少10 kb長，或5'同源臂與3'同源臂總計可達例如至少10 kb。LTVEC亦包括包含比意欲在細胞中進行同源重組之其他途徑通常所用之核酸構築體大的核酸構築體之靶向載體。舉例而言，LTVEC使得因尺寸限制而無法為傳統基於質體之靶向載體所容納的大基因座之修飾成為可能。舉例而言，靶向基因座可為(亦即5'及3'同源臂可對應於)使用習用方法無法靶向或在缺乏由核酸酶劑(例如Cas蛋白)誘發之切口或雙股斷裂下，靶向不正確或效率顯著低的細胞基因座。
在一些實施例中，本文所述之方法可採用兩種或三種LTVEC，其以三路或四路重組事件能够彼此重組及與標靶基因組基因座重組。此類方法使得使用單個LTVEC所無法實現之大基因座的修飾成為可能。
LTVEC之實例包括源自於細菌人工染色體(BAC)、人類人工染色體或酵母人工染色體(YAC)之載體。LTVEC可呈線性形式或呈圓形形式。LTVEC及其製造方法之實例，係描述於例如Macdonald (2014)之美國專利第6,586,251號、第6,596,541號及第7,105,348號；及國際專利申請公開案第WO 2002/036789號，各以引用之方式整體併入本文中。 製造本文所提供之非人類動物之方法
本文提供用於製造非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之組成物及方法，其生殖系基因組包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座包括一或多個人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(例如人類Vλ及Jλ基因區段)代替非人類免疫球蛋白κ輕鏈序列。本文包括提供包含人類Vλ及Jλ區段之特定多型體形式(例如特定V及/或J對偶基因或變異體)的人類免疫球蛋白λ輕鏈編碼序列，包括用於製造表現如下抗體之非人類動物之組成物及方法，該抗體包含含有人類可變區及非人類或人類恆定區之免疫球蛋白λ輕鏈，該免疫球蛋白λ輕鏈係組裝自免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該免疫球蛋白κ輕鏈基因座含有可操作地連接至非人類或人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區基因之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，該非人類或人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區基因位於在野生型非人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座中正常出現之非人類免疫球蛋白κ輕鏈恆定區基因的位置中。在一些實施例中，本文亦提供用於製造在內源免疫球蛋白κ强化子及/或內源免疫球蛋白κ調控序列控制下表現此類抗體之非人類動物的組成物及方法。在一些實施例中，本文亦提供用於製造在異源免疫球蛋白κ强化子及/或異源免疫球蛋白κ調控序列控制下表現此類抗體之非人類動物的組成物及方法。
本文所述之方法包括在非人類或人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區基因(例如嚙齒類動物，例如鼠類，諸如大鼠或小鼠)或人類Cλ區域基因)上游，插入編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，該非人類或人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區基因位於在野生型非人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座中正常出現之非人類免疫球蛋白κ輕鏈恆定區基因的位置中，以便表現抗體，該抗體之特徵在於存在含有人類λ輕鏈可變域及非人類Cλ域(例如嚙齒類動物(例如鼠類，諸如大鼠或小鼠) Cλ域)之輕鏈，或存在含有人類λ輕鏈可變及人類Cλ域之輕鏈，且在B細胞表面上及非人類動物血清中表現。
在一些實施例中，方法包括將含有單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區之遺傳物質插入非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(例如野生型、經修飾或經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座)中。在一些實施例中，方法包括將含有單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區之遺傳物質插入非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之經修飾或工程改造之品系的免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。
在一些實施例中，方法包括在單個ES細胞殖株中多次插入。在一些實施例中，方法包括在連續ES細胞殖株中進行依次插入。在一些實施例中，方法包括在經工程改造之ES細胞殖株中進行單次插入。
在一些實施例中，方法包括在非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ1基因(或人類Cλ2基因)上游之DNA插入，以使得該(等) DNA插入可操作地連接至該非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ1基因(或人類Cλ2基因)，該(等) DNA插入包含選自由以下組成之群組的一或兩個人類Vλ基因區段：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1，及選自由以下組成之群組的一或多個人類Jλ基因區段：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7，且該非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ1基因(或人類Cλ2基因)位於內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座之非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ基因的位置中。在一些實施例中，方法包括在非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ1基因(或人類Cλ2基因)上游之DNA插入，以使得該(等) DNA插入可操作地連接至該非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ1基因(或人類Cλ2基因)，該(等) DNA插入包含單一重排人類λ輕鏈可變區，該單一重排人類λ輕鏈可變區包括選自由以下組成之群組的人類Vλ基因區段：Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3及Vλ3-1，及選自由以下組成之群組的人類Jλ基因區段：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7，且該非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ1基因(或人類Cλ2基因)位於內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座之非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cκ基因的位置中。
適當時，編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(亦即含有人類Vλ及Jλ基因區段之序列)可單獨進行修飾，以包括針對在非人類動物中表現進行最佳化之密碼子(例如參見美國專利第5,670,356號及第5,874,304號，各以引用之方式併入本文中)。密碼子最佳化之序列為經工程改造之序列，且較佳編碼由未密碼子最佳化之親本多核苷酸編碼之一致多肽(或具有與全長多肽基本上相同活性的全長多肽之生物活性片段)。在一些實施例中，編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之人類免疫球蛋白λ輕鏈序列可單獨包括改變序列以針對具體細胞類型(例如嚙齒類動物細胞，例如大鼠或小鼠細胞)最佳化密碼子。舉例而言，有待插入如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之基因組中的各核苷酸序列之密碼子可針對在非人類動物之細胞中表現進行最佳化。此類序列可稱為密碼子最佳化序列。
編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之核苷酸序列的插入採用如本文所述之非人類動物之生殖系基因組的最小修飾，且引起包含具有人類Vλ域之輕鏈之抗體的表現，該等人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域自內源經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座表現。產生經工程改造之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之方法包括敲除及敲入，係所屬領域中已知(參見例如Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner編輯, Oxford University Press, Inc., 2000；以引用之方式整體併入本文中)。舉例而言，經基因工程改造之嚙齒類動物之產生可視情况涉及一或多個內源嚙齒類動物基因(或基因區段)之遺傳基因座的破壞及一或多個異源基因(或基因區段或核苷酸序列)引入嚙齒類動物基因組中，在一些實施例中，在與內源嚙齒類動物基因(或基因區段)相同位置上。在一些實施例中，編碼人類Vλ域之核苷酸序列引入在嚙齒類動物生殖系基因組中隨機插入之經工程改造之輕鏈轉殖基因的非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)或人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區基因上游。在一些實施例中，編碼人類Vλ域之核苷酸序列引入在嚙齒類動物生殖系基因組中內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座之非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)或人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區基因上游；在某些實施例中，內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座經改變、修飾或工程改造以含有可操作地連接至小鼠Cλ1基因或可操作地連接至人類Cλ2基因之人類免疫球蛋白λ基因區段(例如人類V及J)。
用於構築如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座其示例性方法的示意圖(不按比例)，係提供於圖1至6中。詳言之，圖1至6係闡述用於構築經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座之示例性策略，其特徵在於插入含有單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區之核苷酸序列，以及相應的靶向載體。靶向載體可被線性化且電穿孔至嚙齒類動物胚胎幹細胞(ES)中，以建立其生殖系基因組包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座之嚙齒類動物。如以下實例部分中所述，靶向載體之電穿孔中所採用之嚙齒類動物ES細胞，係含有如先前在美國專利第10,143,186號中所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座；以引用之方式整體併入本文中。使用所屬領域已知之篩選方法來確認陽性嚙齒類動物ES細胞殖株。任何剩餘選擇卡匣可如所期望經由重組酶介導之缺失而缺失。
可替代地，人類Cλ基因可代替小鼠Cλ基因用於靶向載體中。除編碼人類Cλ基因(例如Cλ2)之序列可經工程改造至靶向載體中外，靶向載體可以與上述類似之方式(或以下實例中)構築。使用此類方法允許發展人類抗體治療劑，因為編碼輕鏈可變及恆定區之DNA可一起分離，藉此消除連接至人類輕鏈恆定區，以製備完整人類抗體之任何後續選殖步驟。
用於構築如本文所述之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的靶向載體，可併入非人類細胞(例如嚙齒類動物(例如大鼠或小鼠)胚胎幹細胞)之生殖系基因組中。在一些實施例中，如本文所述之靶向載體係併入非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞之生殖系基因組中的野生型免疫球蛋白κ輕鏈基因座中，該生殖系基因組進一步含有與一或多個免疫球蛋白重鏈恆定區基因可操作地連接之人類VH 、DH 及JH 基因組DNA (例如含有複數個人類VH 、DH 及JH 基因區段)(例如參見Macdonald (2014)，美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號及第8,791,323號，各以引用之方式整體併入本文中)。在一些實施例中，如本文所述之靶向載體，係併入非人類細胞之生殖系基因組中經修飾或經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座中，該生殖系基因組進一步含有與一或多個免疫球蛋白重鏈恆定區基因可操作地連接之人類VH 、DH 及JH 基因組DNA (例如含有複數個人類VH 、DH 及JH 基因區段)(例如參見Macdonald (2014)，美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號、第8,791,323號、第9,006,511號、第9,012,717號、第9,029,628號、第9,035,128號、第9,066,502號、第9,150,662號及第9,163,092號，各以引用之方式整體併入本文中)。
靶向載體係藉由電穿孔引入非人類(例如嚙齒類動物，例如小鼠或大鼠)胚胎幹細胞中，讓靶向載體中所含序列使非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)能够表現具有包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域及非人類或人類輕鏈恆定(Cλ或Cκ)域之輕鏈，且該等輕鏈係表現自經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座。如本文所述，產生經基因工程改造之非人類動物，其中已在非人類動物之生殖系基因組中建立經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座(例如內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其含有可操作地連接至在內源嚙齒類動物Cκ基因位置處之嚙齒類動物或人類Cλ基因之人類免疫球蛋白λ輕鏈序列(亦即重排人類λ輕鏈可變區))。抗體在非人類動物B細胞表面上及該非人類動物血清中表現，該等抗體之特徵在於輕鏈具有人類Vλ域及非人類或人類Cλ域。當靶向載體未靶向如本文所述之非人類動物之生殖系基因組中的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座時，經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈轉殖基因較佳係插入除內源非人類動物免疫球蛋白κ輕鏈基因座外之位置處(例如隨機插入之轉殖基因)。
如上所述在非人類動物中建立經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，係提供一種經工程改造之非人類動物品系，該品系產生抗體，該抗體包括自此類經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座所表現的免疫球蛋白λ輕鏈，該經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座具有人類Vλ域及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)或人類Cλ域的。利用存在包括可操作地連接至免疫球蛋白重鏈恆定區基因之複數個人類VH 、DH 及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座，建立經工程改造之非人類動物品系，其產生抗體及抗體組分，以發展人類基於抗體之治療劑。因此，本文實現單個經工程改造之非人類動物品系，其能够提供替代性的活體內系統，以採用人類Vλ域來發展新的基於抗體之藥物，以治療人類疾病。
在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，係包括將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)胚胎幹(ES)細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物的方法，係包括將非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) Cλ基因區段引入非人類ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，係包括使用如上所述之非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) ES細胞產生非人類動物。
在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，係包括將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入非人類ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物的方法，係包括將非人類Cλ基因區段引入非人類ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。
在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，係包括以下步驟：(a)將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入非人類ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中；以及(b)將非人類Cλ基因區段引入非人類ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。
在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，係包括以下步驟：(a)將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入非人類胚胎幹(ES)細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中；(b)將非人類Cλ基因區段引入非人類ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中；以及(c)使用步驟(a)及(b)中所產生之非人類ES細胞來產生非人類動物。
在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，係包括將可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，引入非人類ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座中。
在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，進一步包括以下步驟：(d)將可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因之一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，引入非人類ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座中。
在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，係包括對非人類動物之生殖系基因組中的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座進行工程改造，以包含可操作地連接至非人類Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段，使得所有由經基因修飾之非人類動物之B細胞所表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，其係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
在一些實施例中，製造經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)的方法，係包括對非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之生殖系基因組中的內源免疫球蛋白重鏈基因座進行工程改造，以包含可操作地連接至一或多個非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，使得所有由經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之B細胞表現的重鏈，均包括人類免疫球蛋白重鏈可變域及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)免疫球蛋白重鏈恆定域。
在製造非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之方法的一些實施例中，DNA片段引入非人類胚胎幹細胞中，其生殖系基因組係包含一或多個經工程改造之免疫球蛋白基因座(例如免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白κ輕鏈、免疫球蛋白λ輕鏈及其組合)。在某些實施例中，經工程改造之免疫球蛋白基因座為內源經工程改造之免疫球蛋白基因座。
在製造非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之方法的一些實施例中，DNA片段包含經工程改造之序列，其包括免疫球蛋白λ輕鏈序列及/或免疫球蛋白κ輕鏈序列。在製造非人類動物之方法的一些實施例中，DNA片段包含經工程改造之序列，其包括免疫球蛋白λ輕鏈序列及/或免疫球蛋白κ輕鏈序列及非免疫球蛋白序列(例如重組信號序列、抗性基因及其組合)。
在製造非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之方法的一些實施例中，DNA片段引入非人類胚胎幹細胞中，其基因組包括包含一或多個人類VH 基因區段、一或多個人類DH 基因區段及一或多個人類JH 基因區段之插入之內源免疫球蛋白重鏈基因座，該人類VH 、DH 及JH 基因區段可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區。在一些實施例中，ES細胞進一步包含核苷酸序列，其編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段。
在製造非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之方法的一些實施例中，DNA片段引入非人類胚胎幹細胞中，其生殖系基因組包括包含單一重排人類λ輕鏈可變區之插入的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該人類Vλ及Jλ基因區段可操作地連接至非人類免疫球蛋白κ或λ輕鏈恆定區基因。
在製造非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之方法的一些實施例中，對非人類動物之生殖系基因組進行修飾以便其包括包含有限人類λ輕鏈可變區組庫(例如單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區)之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，係在非人類胚胎幹細胞中進行，其基因組包括包含一或多個人類VH 基因區段、一或多個人類DH 基因區段及一或多個人類JH 基因區段之插入的內源免疫球蛋白重鏈基因座，該人類VH 、DH 及JH 基因區段可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區。
在製造非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之方法的一些實施例中，對非人類動物之生殖系基因組進行修飾以便其包括包含有限人類λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，係在非人類胚胎幹細胞中進行，其生殖系基因組包括包含一或多個人類Vλ及一或多個人類Jλ基因區段之插入的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該人類Vλ及Jλ基因區段可操作地連接至非人類免疫球蛋白κ輕鏈恆定區基因。在製造非人類動物之方法的一些實施例中，對非人類動物之生殖系基因組進行修飾以便其包含包括有限人類λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，係在非人類胚胎幹細胞中進行，其生殖系基因組包括包含一或多個人類Vλ及一或多個人類Jλ基因區段之插入的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，且人類免疫球蛋白κ輕鏈序列位於、置於或定位在該一或多個人類Vλ基因區段與該一或多個人類Jλ基因區段之間，該人類Vλ及Jλ基因區段可操作地連接至非人類免疫球蛋白κ輕鏈恆定區基因。
在製造非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之方法的一些實施例中，一或多個人類VH 基因區段、一或多個人類DH 基因區段及一或多個人類JH 基因區段之插入，係包括內源人類免疫球蛋白基因座中天然出現在人類VH 基因區段相鄰處之人類非編碼DNA、天然出現在人類DH 基因區段相鄰處之人類非編碼DNA及天然出現在人類JH 基因區段相鄰處之人類非編碼DNA。
在一些實施例中，本文提供自如本文所述之方法所製造、產生、產生、獲得或可獲得之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之基因組，係進一步包含如以下中所述之一或多個人類免疫球蛋白重鏈可變區：Macdonald (2014)，美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號及第8,791,323號，各以引用之方式整體併入本文中。可替代地，如本文所述的包括有限人類λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座可經工程改造至不同的經修飾品系之胚胎幹細胞中，諸如VELOCIMMUNE®品系(參見例如Macdonald (2014)，美國專利第6,596,541號及/或第8,642,835號；以引用之方式整體併入本文中)。包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的同型合子，隨後可藉由繁殖來實現。可替代地，在隨機插入之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈轉殖基因(如上述)的狀况下，可尤其基於人類Vλ域自轉殖基因之表現來選擇非人類動物品系。在一些實施例中，VELOCIMMUNE®小鼠可為VELOCIMMUNE® 1 (VI-1)小鼠，其包括十八個人類VH 基因區段、所有人類DH 基因區段及所有人類JH 基因區段。VI-1小鼠亦可包括十六個人類Vκ基因區段及所有人類Jκ基因區段。在一些實施例中，VELOCIMMUNE®小鼠可為VELOCIMMUNE® 2 (VI-2)小鼠，其包括三十九個人類VH 基因區段、所有人類DH 基因區段及所有人類JH 基因區段。VI-2小鼠亦可包括人類三十個Vκ基因區段及所有人類Jκ基因區段。在一些實施例中，VELOCIMMUNE®小鼠可為VELOCIMMUNE® 3 (VI-3)小鼠，其包括八十個人類VH 基因區段、所有人類DH 基因區段及所有人類JH 基因區段。VI-3小鼠亦可包括人類四十個Vκ基因區段及所有人類Jκ基因區段。
可替代地，及/或另外，在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之生殖系基因組，係進一步包含缺失、不活化、功能沉默或在其他方面無功能之內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。使用本文所述之方法及/或所屬領域已知之方法，可實現使基因或遺傳基因座缺失或無功能之基因修飾。
經基因工程改造之創始非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，可基於以下方式來鑑別：其生殖系基因組中存在如本文所述的包括有限人類λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，及/或非人類動物之組織或細胞中表現具有人類λ輕鏈可變域及非人類或人類Cλ或Cκ域之抗體。接著，經基因工程改造之創始非人類動物可用於繁殖額外非人類動物，其携帶經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座係包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫，藉此建立一群非人類動物，其各携帶一或多個複本，該（等）複本係包括有限人類λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座。此外，經基因工程改造之非人類動物（其携帶包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座），可進一步繁殖成其他經基因工程改造之非人類動物，其携帶其他所期望的轉殖基因(例如人類免疫球蛋白基因)或經工程改造之免疫球蛋白基因座。
本文亦可產生經基因工程改造之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，其含有允許轉殖基因或整合序列之調控、指導、誘導性及/或細胞類型特異性表現的選定系統。舉例而言，如本文所述之非人類動物可經工程改造以含有編碼抗體人類λ輕鏈可變域之一或多個序列，其係以條件性表現(例如Rajewski, K.等人, 1996, J. Clin. Invest. 98(3):600-3中評述，以引用之方式整體併入本文中)。示例性系統包括噬菌體P1之Cre/lox P重組酶系統(參見例如Lakso, M.等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6232-6，以引用之方式整體併入本文中)及釀酒酵母(S. cerevisiae)之FLP/Frt重組酶系統(O’Gorman, S.等人, 1991, Science 251:1351-5，以引用之方式整體併入本文中)。可經由構築「雙重」基因工程來改造動物，例如藉由使兩種基因工程改造動物交配，來提供此類動物，一種動物含有包含選定修飾之轉殖基因(例如如本文所述的包括有限人類λ輕鏈可變區組庫之經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座)，而另一種動物含有編碼重組酶(例如Cre重組酶)之轉殖基因。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，可如上所述或使用所屬領域中已知之方法製備，以包含額外人類、人類化或以其他方式進行工程改造之基因，通常視非人類動物之預期用途而定。此類人類、人類化或以其他方式進行工程改造之基因的遺傳物質，可經由進一步改變具有如上所述之基因修飾之細胞(例如胚胎幹細胞)的基因組來引入，或經由所屬領域中已知之繁殖技術以其他期望之經基因修飾或工程改造之品系來引入。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物係經製備以進一步包含人類重鏈基因區段(參見例如Murphy, A.J.等人, (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-5158；Macdonald (2014), 美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號及第8,791,323號；美國專利第8,791,323號；及美國專利申請公開案第2013/0096287 A1號；各以引用之方式整體併入本文中)。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)可藉由將本文所述之靶向載體引入來自經修飾或工程改造之品系之細胞中來製備。舉例而言，如本文所述之靶向載體可引入VELOCIMMUNE®小鼠中。VELOCIMMUNE®小鼠表現具有完整人類可變域及小鼠恆定域之抗體。在另一實例中，如本文所述之靶向載體可引入如美國專利第9,006,511號、第9,012,717號、第9,029,628號、第9,035,128號、第9,066,502號、第9,150,662號及第9,163,092號(以引用之方式整體併入本文中)中之任一個中所述的經工程改造之小鼠中。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物經製備以進一步包含人類免疫球蛋白基因(可變及/或恆定區基因)。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物係包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫及來自異源物種(例如人類)之遺傳物質，其中遺傳物質編碼一或多個人類重鏈可變區整體或部分。
舉例而言，如本文所述，包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)（其包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫），可進一步包含(例如經由雜交繁殖或多個基因靶向策略)一或多個修飾，如以下中所述：Murphy, A.J.等人, (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8；Macdonald (2014)；美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號及第8,791,323號；均引用的方式整體併入本文中。在一些實施例中，包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的非人類動物（其包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫），係與包含人類化免疫球蛋白重鏈可變區基因座之非人類動物雜交(參見例如Macdonald (2014)，美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號及/或第8,791,323號；以引用之方式整體併入本文中)。在一些實施例中，包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的非人類動物（其包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫），係與包含人類化免疫球蛋白重鏈可變區基因座(參見例如Macdonald (2014)，美國專利第6,596,541號、第8,642,835號、第8,697,940號及/或第8,791,323號；以引用之方式併入本文中)及未活化的內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座(參見例如美國專利第9,006,511號、第9,012,717號、第9,029,628號、第9,035,128號、第9,066,502號、第9,150,662號及第9,163,092號，以引用之方式整體併入本文中)之非人類動物雜交。
雖然描述在小鼠(亦即，帶有經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的小鼠，其特徵為存在與小鼠或人類Cλ或Cκ基因可操作地連接之有限人類λ輕鏈可變區組庫，以便表現含有人類λ輕鏈可變域及小鼠或人類Cλ或Cκ域之抗體)中構築經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座的實施例，係經本文廣泛論述，本文亦提供其他包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座之非人類動物。此類非人類動物包括可經基因修飾，以表現如本文所述之抗體的彼等動物中之任一者，包括例如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、犬、雪貂、靈長類動物(例如絨猴、恆河猴)等。舉例而言，對於那些合適的可遺傳修飾的ES細胞不容易獲得的非人類動物，係採用其他方法來製造包含基因修飾之非人類動物。此類方法包括例如修飾非ES細胞基因組(例如纖維母細胞或誘導之多潜能性幹細胞)及採用體細胞核轉移(SCNT)，以將經基因修飾之基因組轉移至適合細胞，例如去核卵母細胞，及在非人類動物中在合適條件下孕育經修飾之細胞(例如經修飾之卵母細胞)，以形成胚胎。
修飾非人類動物之生殖系基因組(例如猪、母牛、嚙齒類動物、雞等基因組)之方法，係包括例如採用鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應物核酸酶(TALEN)或Cas蛋白(亦即CRISPR/Cas系統)來包括如本文所述的經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座（其包括有限人類λ輕鏈可變區組庫）。關於修飾非人類動物之生殖系基因組之方法，其指導可見於例如美國專利第9,738,897號及美國專利申請公開案第US 2016/0145646號(2016年5月26日公開)及第US 2016/0177339號(2016年6月23日公開)中；各以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物為哺乳動物。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物為小型哺乳動物，例如跳鼠科(Dipodoidea)或鼠總科(Muroidea)。在一些實施例中，如本文所述之經基因修飾之動物為嚙齒類動物。在一些實施例中，如本文所述之嚙齒類動物係選自小鼠、大鼠及倉鼠。在一些實施例中，如本文所述之嚙齒類動物係選自鼠總科。在一些實施例中，如本文所述之經基因修飾之動物係來自選自以下之科：麗倉鼠科(Calomyscidae) (例如小鼠樣倉鼠)、倉鼠科(Cricetidae) (例如倉鼠、新世界大鼠及小鼠、野鼠)、鼠科(Muridae) (真正小鼠及大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛鼠)、馬島鼠科(Nesomyidae) (攀鼠、岩鼠、白尾鼠、馬達加斯加大鼠(Malagasy rat)及小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae) (例如多刺睡鼠)及鼹形鼠科(Spalacidae) (例如莫爾鼠(mole rate)、竹鼠及鼢鼠)。在某些實施例中，如本文所述之經基因修飾之嚙齒類動物係選自真正小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠及冠毛鼠。在某些實施例中，如本文所述之經基因修飾之小鼠係來自鼠科成員。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物為嚙齒類動物。在某些實施例中，如本文所述之嚙齒類動物係選自小鼠及大鼠。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物為小鼠。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物為嚙齒類動物，其為選自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr，及C57BL/Ola之C57BL品系之小鼠。在某些實施例中，如本文所述之小鼠為選自由以下組成之群組的129-品系：品系129P1、129P2、129P3、129X1、129S1 (例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6 (129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2 (參見例如Festing等人, 1999, Mammalian Genome 10:836；Auerbach, W.等人, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032，各以引用之方式整體併入本文中)。在某些實施例中，如本文所述之經基因修飾之小鼠為前述129品系與前述C57BL/6品系之混合物。在某些實施例中，如本文所述之小鼠為前述129品系之混合物，或前述BL/6品系之混合物。在某些實施例中，如本文所述之混合物之129品系為129S6 (129/SvEvTac)品系。在一些實施例中，如本文所述之小鼠為BALB品系，例如BALB/c品系。在一些實施例中，如本文所述之小鼠為BALB品系與另一前述品系之混合物。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物為大鼠。在某些實施例中，如本文所述之大鼠係選自威斯塔鼠(Wistar rat)、LEA品系、斯普雷格多利品系(Sprague Dawley strain)、費雪品系(Fischer strain)、F344、F6及黑刺豚鼠(Dark Agouti)。在某些實施例中，如本文所述之大鼠品系為兩種或更多種選自由以下組成之群組之品系的混合物：威斯塔鼠、LEA、斯普雷格多利、費雪、F344、F6及黑刺豚鼠。
大鼠多能及/或全能細胞可來自任何大鼠品系，包括ACI大鼠品系(源自於八月(August)及哥本哈根(Copenhagen)品系之近交系)、黑刺豚(DA)大鼠品系、威斯塔大鼠品系、LEA大鼠品系、斯普雷格多利(SD)大鼠品系或費雪大鼠品系，諸如費雪F344或費雪F6。大鼠多潜能及/或全潜能細胞亦可自源自於上述兩種或更多種品系之混合物的品系獲得。舉例而言，大鼠多能及/或全能細胞可來自DA品系或ACI品系。ACI大鼠品系之特徵在於具有黑色環紋，具有白色腹部及足及RT1av1單倍型。此類品系可得自多種來源，包括Harlan Laboratories。來自ACI大鼠之大鼠ES細胞株之一實例為ACI.G1大鼠ES細胞。DA大鼠品系之特徵在於具有環紋皮毛及RT1av1單倍型。此類大鼠可得自多種來源，包括Charles River及Harlan Laboratories。來自DA大鼠之大鼠ES細胞株之實例為DA.2B大鼠ES細胞株及DA.2C大鼠ES細胞株。在一些實施例中，大鼠多能及/或全能細胞來自近交大鼠品系(參見例如美國專利申請公開案第2014-0235933 A1號，2014年8月21日公開，以引用之方式整體併入本文中)。關於使用如本文所述之方法及/或構築體在大鼠基因組中(例如在大鼠ES細胞中)製造修飾之指導，可見於例如美國專利申請公開案第2014-0310828號及第2017-0204430號；均以引用的方式整體併入本文中。 使用本文所提供之非人類動物、細胞或組織之方法
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，係可用作發展抗體之平臺。詳言之，如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織，係代表特別有利的平臺，以產生及鑑別人類重鏈可變域（其係與自有限人類λ輕鏈組庫所表現之人類λ輕鏈可變域配對），及包括此類人類重鏈可變域之抗體。此類人類重鏈可變域可用於例如產生雙特定抗原結合蛋白。
因此，本文提供如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，係可用於製造抗體之方法中。根據本文製造之抗體，可包括例如人類抗體、嵌合抗體、反向嵌合抗體、任何此類抗體之片段或其組合。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，可用於製造人類抗體(例如完整人類抗體)，該人類抗體包含可變域，該可變域係源自於由如本文所述之非人類動物之細胞的遺傳物質所編碼之核酸序列。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如經基因修飾之嚙齒類動物，例如經基因修飾之大鼠或小鼠)係經感興趣的抗原免疫接種，其條件及時間足以使非人類動物顯現對感興趣的抗原之免疫反應。抗體及/或抗體序列(亦即，編碼抗體一部分之序列，例如可變區序列)係自經免疫接種之非人類動物(或一或多個細胞，例如一或多個B細胞)分離出及/或鑑別出來，且使用量測例如親和力、特異性、抗原决定基定位、阻斷配位體-受體相互作用之能力、抑制受體活化等多種分析法來表徵。在多個實施例中，由如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織所產生之抗體係包含一或多個人類可變區，其係源自於自非人類動物、非人類細胞或非人類組織所分離之一或多個人類可變區核苷酸序列。在一些實施例中，抗藥物抗體(例如抗個體基因型抗體)可在如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織中激起。在多個實施例中，由如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織所產生之抗體，係為反向嵌合抗體，其包括人類輕鏈可變域及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)輕鏈恆定域及/或人類重鏈可變域及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)重鏈恆定域。
在多個實施例中，由非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織所產生之抗體，係包括具有人類可變域及非人類恆定域之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，由如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織產生之抗體係為反向嵌合抗體，其包括人類輕鏈可變域及非人類(例如嚙齒類動物)輕鏈恆定域。在一些實施例中，由如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織所產生之抗體係為反向嵌合抗體，其包括人類重鏈可變域及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)重鏈恆定域。
在一些實施例中，本文所提供之方法包括用感興趣的抗原對如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)進行免疫接種。在一些實施例中，本文所提供之方法包括自該非人類動物鑑別淋巴球(例如殖株選擇之淋巴球)，其中淋巴球表現結合(例如特異性結合)感興趣的抗原之抗體。在一些實施例中，淋巴球為B細胞。在一些實施例中，人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列係自淋巴球(例如B細胞)獲得及/或鑑別(例如基因分型，例如定序)。在一些實施例中，人類重鏈可變域及/或人類λ輕鏈可變域之胺基酸序列係自淋巴球(例如B細胞)獲得及/或鑑別(例如定序)。在一些實施例中，來自非人類動物之B細胞的人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列，係在宿主細胞中表現。在一些實施例中，來自非人類動物之B細胞人類重鏈可變區序列及/或人類λ輕鏈可變區序列之變異體，係在宿主細胞中表現。在一些實施例中，變異體包括一或多個突變。在一些實施例中，一或多個突變可改善包括變異體之抗體其藥物動力學及/或藥效學性質。在一些實施例中，一或多個突變可改善包括變異體之抗體其特異性、親和力及/或免疫原性。
在一些實施例中，製造人類抗體之方法包括自本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，來鑑別編碼人類免疫球蛋白重鏈可變域及/或人類免疫球蛋白輕鏈可變域之核苷酸序列；且(i)將編碼人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列，接合或連結至編碼人類免疫球蛋白重鏈恆定域之核苷酸序列，藉此形成編碼完整人類免疫球蛋白重鏈之人類免疫球蛋白重鏈序列，及/或(ii)將編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之核苷酸序列，接合或連結至編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定域之核苷酸序列，藉此形成編碼完整人類免疫球蛋白λ輕鏈之人類免疫球蛋白λ輕鏈序列。在某些實施例中，人類免疫球蛋白重鏈序列及人類免疫球蛋白λ輕鏈序列係在細胞(例如宿主細胞、哺乳動物細胞)中表現，以便表現完整人類免疫球蛋白重鏈及完整人類免疫球蛋白λ輕鏈且形成人類抗體。在一些實施例中，人類抗體自細胞或包括細胞之培養基分離。
在一些實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)可用於製造雙特異性抗體之方法，該方法包括：(a)使如本文所述之第一經基因修飾之非人類動物與第一抗原之第一抗原決定基接觸，該非人類動物包含可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)恆定區之單一重排人類Ig λ輕鏈可變區；(b)使第二經基因修飾之如本文所述之非人類動物與第二抗原之第二抗原決定基接觸，該非人類動物包含可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)恆定區之單一重排人類Ig λ輕鏈可變區(例如與第一非人類動物中存在相同之單一重排人類Ig λ輕鏈可變區)；(c)自第一經基因修飾之非人類動物分離出表現對第一抗原之第一抗原决定基具特異性之第一抗體的B細胞，並確定第一抗體之第一人類免疫球蛋白重鏈可變域；(d)自第二經基因修飾之非人類動物分離表現出對第二抗原之第二抗原决定基具特異性之第二抗體的B細胞，並確定第二抗體之第二人類免疫球蛋白重鏈可變域；(e)將編碼第一人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列可操作地連接至編碼第一人類免疫球蛋白恆定域之核苷酸序列，以產生編碼第一人類重鏈之第一核苷酸序列；(f)將編碼第二人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列可操作地連接至編碼第二人類免疫球蛋白恆定域之核苷酸序列，以產生編碼第二人類重鏈之第二核苷酸序列；(g)在哺乳動物細胞中表現：(i)第一核苷酸序列；(ii)第二核苷酸序列；及(iii)第三核苷酸序列，其包含可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
在一些實施例中，如本文所述之非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞可用於製造雙特異性抗體之方法，該方法包括：(a)在非人類細胞中表現：(i) 第一核苷酸序列，其包含可操作地連接至第一人類免疫球蛋白恆定區之第一人類免疫球蛋白重鏈可變區；(ii) 第二核苷酸序列，其包含可操作地連接至第二人類免疫球蛋白恆定區之第二人類免疫球蛋白重鏈可變區；及(iii) 第三核苷酸序列，其包含可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區之人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區的；其中第一人類免疫球蛋白重鏈可變區編碼第一人類重鏈可變域，該第一人類重鏈可變域係由第一經基因修飾之非人類動物中鑑別出來，該第一經基因修飾之非人類動物係經第一抗原之第一抗原决定基免疫接種，且第二人類免疫球蛋白重鏈可變區編碼第二人類重鏈可變域，該第二人類重鏈可變域係由第二經基因修飾之非人類動物中鑑別出來，該第二經基因修飾之非人類動物係經第二抗原之第二抗原决定基免疫接種，其中第一及第二經基因修飾之非人類動物各為如本文所述之經基因修飾的非人類動物，該等非人類動物包含可操作地連接至非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)恆定區之單一重排人類Ig λ輕鏈可變區；且其中第三核苷酸之人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區為單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。所鑑別之胺基酸或核酸係用於製造含有本文所鑑別之可變域之抗體或抗原結合蛋白。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，可用於鑑別核苷酸或核酸序列，其編碼由本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織所產生之人類可變域，例如作為針對抗原决定基或抗原之抗體的一部分。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，可用於鑑別人類可變域的胺基酸序列，該人類可變域係由本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織所產生，例如作為針對抗原决定基或抗原之抗體的一部分。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，係提供經改良之活體內系統及生物物質來源(例如細胞、核苷酸、多肽、蛋白質複合物)，以產生可用於多種分析法之人類抗體。在多個實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織，係用於發展靶向所關注多肽(例如跨膜或分泌多肽)及/或調節一或多種與該所關注多肽相關之活性及/或調節該所關注多肽與其他結合搭配物(例如配位體或受體多肽)之相互作用的治療劑。舉例而言，在多個實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織，係用於發展靶向一或多個受體多肽，調節受體多肽活性及/或調節受體多肽與其他結合搭配物之相互作用的治療劑。在多個實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織，係用於鑑別、篩選及/或發展結合一或多種所關注多肽之候選治療劑(例如抗體、scFv等)。在多個實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織，係用於篩選及發展阻斷一或多種所關注多肽之活性或阻斷一或多種所關注受體多肽之活性的候選治療劑(例如抗體、scFv等)。在多個實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織，係用於確定一或多種所關注多肽之拮抗劑及/或促效劑的結合概况。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織，係用於確定結合一或多種所關注多肽之一或多種候選治療性抗體的抗原决定基或抗原决定基。
在多個實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，係用於確定一或多種人類候選抗體之藥物動力學概况。在多個實施例中，一或多個如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織及一或多個對照或參考非人類動物、非人類細胞及非人類組織，係各暴露於各種劑量之一或多種人類候選抗體(例如0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/mg、7.5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg或50 mg/kg或更多)。候選治療性抗體可經由包括非經腸及非腸外之任何期望投與途徑給予如本文所述之非人類動物。非經腸途徑包括例如靜脉內、動脉內、門靜脉內、肌肉內、皮下、腹膜內、脊椎內、鞘內、腦室內、顱內、胸膜內或其他注射途徑。非腸外途徑包括例如經口、經鼻、經皮、經肺、經直腸、經頰、經陰道、經眼。投與亦可藉由連續輸注、局部投與、自植入物(凝膠、膜或其類似物)持續釋放及/或靜脉內注射。在多個時間點(例如0小時、6小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或長達30天或更多天)自非人類動物(人類化及對照)分離血液。可使用自如本文所述之非人類動物、非人類細胞及非人類組織獲得之樣品執行多種分析法，以確定所投與之候選治療性抗體之藥物動力學概况，包括但不限於總IgG、抗治療性抗體反應、凝集等。
在多個實施例中，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，係用於量測阻斷或調節所關注多肽之活性的治療作用及由於細胞改變，對基因表現之影響，或在受體多肽之情况下，在非人類動物、非人類細胞或非人類組織中細胞表面上受體多肽之密度。在多個實施例中，如本文所述之非人類動物 (或自其分離之細胞)、非人類細胞或非人類組織，係暴露於結合所關注多肽之候選治療劑，且在後續時間段之後，分析對與所關注多肽相關之特定細胞過程，例如配位體-受體相互作用或信號轉導之影響。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)係表現人類抗體可變區，因此，可產生細胞、細胞株及細胞培養物，作為結合及功能分析法中的人類抗體可變區之來源，例如分析拮抗劑或促效劑之結合或功能，尤其在拮抗劑或促效劑對所關注人類抗原具有特異性或對在配位體-受體相互作用(結合)中起作用之抗原决定基具有特異性。在多個實施例中，由候選治療性抗體或片段(例如Fab片段，由VH、VL、CH1及CL域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，包含兩個在鉸鏈區由二硫橋連接之Fab片段的二價片段；(iii) Fd片段，由VH及CH1域組成；(iv) Fv片段，由抗體單臂之VH及VL域組成；(v) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341 :544-546)，其包含單個可變域；及(vi)經分離之互補决定區(CDR))結合之抗原决定基，可使用自如本文所述之非人類動物所分離之細胞來確定。
來自本文所提供之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之細胞係可分離且臨時使用(used on an ad hoc basis)，或可維持培養許多世代。在多個實施例中，來自所提供之非人類動物之細胞永生化(例如經由使用病毒)且無限期維持培養(例如連續培養)。
在一些實施例中，非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞為非人類淋巴球。在一些實施例中，非人類細胞係選自B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球及T細胞。在一些實施例中，非人類細胞為未成熟B細胞、成熟未處理B細胞、活化B細胞、記憶B細胞及/或血漿細胞。
在一些實施例中，非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞為非人類胚胎幹(ES)細胞。在一些實施例中，非人類ES細胞為嚙齒類動物ES細胞。在某些實施例中，嚙齒類動物ES細胞為小鼠ES細胞且來自129品系、C57BL品系、BALB/c或其混合物。在某些實施例中，嚙齒類動物胚胎幹細胞為小鼠胚胎幹細胞且為129及C57BL品系之混合物。在某些實施例中，嚙齒類動物胚胎幹細胞為小鼠胚胎幹細胞且為129、C57BL及BALB/c品系之混合物。
在一些實施例中，本文提供如本文所述之非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠) ES細胞用於製造非人類動物的用途。在某些實施例中，非人類ES細胞為小鼠ES細胞且用於製造小鼠，該小鼠包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫。在某些實施例中，非人類ES細胞為大鼠ES細胞且用於製造大鼠，該大鼠包含經工程改造之免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包括如本文所述的有限人類λ輕鏈可變區組庫。
在一些實施例中，非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織係選自脂肪、膀胱、腦、乳房、骨髓、眼睛、心臟、腸、腎臟、肝臟、肺、淋巴結、肌肉、胰臟、血漿、血清、皮膚、脾臟、胃、胸腺、睾丸、卵子及其組合。
在一些實施例中，提供一種永生化細胞，其自如本文所述之經分離之非人類細胞或組織所製造、產生、產生或獲得。
在一些實施例中，提供非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)胚胎，其自如本文所述之非人類ES細胞所製造、產生、產生或獲得。在某些實施例中，非人類胚胎為嚙齒類動物胚胎；在一些實施例中，為小鼠胚胎；在一些實施例中，為大鼠胚胎。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)提供一種活體內系統，其用於產生結合所關注多肽之人類抗體可變區之變異體(例如人類Vλ域變異體)。此類變異體包括人類抗體可變區，其具有對常見抗原决定基的所需功能性、特異性、低交叉反應性，該常見抗原决定基係由兩種或更多種所關注多肽之變異體所共有。在一些實施例中，如本文所述之非人類動物係用於產生一群(panels)人類抗體可變區，該人類抗體可變區含有一系列變異體可變區，該等變異體可變區係針對所需或改善功能性進行篩選。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)提供一種活體內系統，其用於產生人類抗體可變區文庫(例如人類Vλ域文庫)。此類文庫提供重鏈及/或輕鏈可變區序列的一種來源，該重鏈及/或輕鏈可變區序列基於所需效應功能而可移植至不同Fc區上，其係用作進行可變區序列之親和力成熟的來源，該可變區序列之親和力成熟係利用所屬領域中已知之技術(例如定點誘變、易錯PCR等)，及/或用作抗體組分的來源，以產生基於抗體之治療性分子，諸如嵌合抗原受體(亦即使用抗體組分進行工程改造之分子，例如scFv)、多特異性結合劑(例如雙特異性結合劑)及融合蛋白(例如單域抗體、scFv等)。
在一些實施例中，提供一種在非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)動物中產生抗體之方法，該方法包括以下步驟：(a)用感興趣的抗原對如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)進行免疫接種；(b)將非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)維持在足以使非人類動物對感興趣的抗原產生免疫反應(例如表現抗體)之條件下；以及(c)自非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)或非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)之細胞(例如B細胞)回收結合感興趣的抗原之抗體。
在非人類動物中產生抗體之方法的一些實施例中，非人類細胞為B細胞。在非人類動物中產生抗體之方法的一些實施例中，非人類細胞為融合瘤。
在一些實施例中，提供藉由方法製備之抗體，該方法包括以下步驟：(a)提供如本文所述之非人類動物；(b)用感興趣的抗原對非人類動物進行免疫接種；(c)將非人類動物維持在足以使非人類動物對感興趣的抗原產生免疫反應之條件下；且(d)自非人類動物或非人類細胞回收結合感興趣的抗原之抗體，其中(d)之抗體包括人類VH 及Vλ域。
在藉由製備方法之抗體的一些實施例中，由重排人類重鏈可變區編碼之人類重鏈可變域包含人類VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2 VH 6-1，或其體細胞超突變變異體。
在藉由製備方法之抗體的一些實施例中，自如本文所述之包含有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫之非人類動物獲得的人類λ輕鏈可變域係由重排人類λ輕鏈可變區所編碼，該重排人類λ輕鏈可變區係包含人類Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3 Vλ3-1或其體細胞超突變變異體。
在一些實施例中，提供如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，用於製造及/或研發治療或診斷之藥物(例如抗體或其片段)。
在一些實施例中，提供如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織，用於製造治療、預防或改善疾病、病症或疾患之藥劑。
在一些實施例中，提供如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織的用途，其用於醫學上之製造及/或研發，諸如用作藥劑之藥物或疫苗。
在一些實施例中，提供如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)、非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)細胞或非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)組織的用途，其用於抗體或其片段之製造及/或研發。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)提供一種用於分析及測試藥物或疫苗之活體內系統。在多個實施例中，候選藥物或疫苗可遞送至一或多個如本文所述之非人類動物，接著監測該等非人類動物以確定對藥物或疫苗之一或多個免疫反應、藥物或疫苗之安全概况或對疾病或疾患及/或疾病或疾患之一或多個症狀的作用。確定安全概况之示例性方法包括量測毒性、最佳劑量濃度、抗體(亦即抗藥)反應、藥物或疫苗之功效及可能風險因子。在此類非人類動物中可改良及/或研發此類藥物或疫苗。
疫苗功效可用多種方式確定。簡言之，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)使用所屬領域已知之方法進行疫苗接種並接著用疫苗激發(challenge)，或向已感染之非人類動物投與疫苗。非人類動物對疫苗之反應可藉由對非人類動物(或自其分離之細胞)進行監測及/或進行一或多個分析來量測，以確定疫苗之功效。接著使用所屬領域中已知及/或本文所述之一或多個量度，將非人類動物對疫苗之反應與對照動物相比較。
疫苗功效可進一步藉由病毒中和分析來確定。簡言之，如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)進行免疫接種且在免疫接種後之多天來收集血清。將血清之連續稀釋液與病毒一起預先培育，在此期間對病毒具有特異性之血清中之抗體將結合於該病毒上。接著將病毒/血清混合物添加至容許細胞以藉由斑塊分析或微量中和分析來確定感染性。若血清中之抗體中和病毒，則其斑塊係少於或其相對熒光素酶單位係低於對照組。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)係產生人類抗體可變區，因此提供一種用於產生人類抗體的活體內系統該人類抗體係用於診斷應用(例如免疫學、血清學、微生物學、細胞病理學等)中。在多個實施例中，如本文所述之非人類動物可用於產生結合相關抗原位點之人類抗體可變區，以鑑別細胞變化，諸如指示病理學變化之特定細胞表面標記物的表現。此類抗體可結合於多種化學實體(例如放射性示蹤劑)且根據需要用於多種活體內及/或活體外分析中。
如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)提供一種改善之活體內系統，用於發展及選擇腫瘤學及/或感染性疾病所用之人類抗體。在多個實施例中，如本文所述之非人類動物及對照非人類動物(例如具有與本文所述不同之基因修飾或無基因修飾，亦即野生型)可植入腫瘤(或腫瘤細胞)或感染病毒(例如流感、HIV、HCV、HPV等)。在感染植入後，可向非人類動物投與候選治療劑。在投與候選治療劑之前可允許足够時間使腫瘤或病毒在非人類動物內之一或多個位置建立。可替代地及/或另外，可在此類非人類動物中監測免疫反應，以便表徵及選擇可發展成治療劑之潜在人類抗體。 結合超過一個抗原决定基之抗原結合蛋白
本文所述之組成物及方法可製造結合超過一個抗原决定基之結合蛋白，例如雙特異性抗體。本發明之優點包括能够選擇適當高結合力(例如親和力成熟)之重鏈免疫球蛋白鏈，各該重鏈免疫球蛋白鏈會與單個輕鏈締合。
雙特異性結合蛋白之合成及表現已成問題，此部分歸因於與鑑別可與兩條不同重鏈締合且一起表現之合適輕鏈有關的問題及部分歸因於分離問題。本文所述之方法及組成物允許經基因修飾之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)，經由其他天然方法來選擇包括人類λ輕鏈可變域之合適輕鏈，該人類λ輕鏈可變域可與超過一條重鏈締合且一起表現，包括進行體細胞超突變(例如親和力成熟)之重鏈。如本文所述之免疫接種小鼠其合適B細胞的人類Vλ及VH 序列，可被鑑別出來且在表現載體中與合適人類恆定區基因序列(例如人類IgG1)同框選殖，該如本文所述之免疫接種小鼠係表現親和力成熟之抗體，該抗體具有反向嵌合重鏈(亦即，人類可變域及非人類(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)恆定域)，。可製備兩種此類構築體，其中各構築體編碼結合不同抗原决定基之人類重鏈可變域。包括具有生殖系序列之基因區段的重排人類λ輕鏈可變區(例如人類Vλ1-51/Jλ2或人類Vλ2-14/Jλ2)或其體細胞超突變型式(例如如自B細胞鑑別)，可同框融合至合適人類恆定區基因(例如人類λ恆定基因)。此三種完整人類重鏈及輕鏈構築體可處於合適細胞中來表現。細胞將表現兩種主要種類：同二聚體重鏈與相同輕鏈，及雜二聚體重鏈與相同輕鏈。為便於分離此等主要種類，對重鏈之一進行修飾以省略結合蛋白A之决定子，使同二聚體結合蛋白與雜二聚體結合蛋白之親和力有差別。解决此問題之組成物及方法係描述於美國專利第8,586,713號、第9,309,326號及第9,982,013號中，各專利以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文提供一種如本文所述之抗原結合蛋白，其中人類Vλ及VH 序列源自於已用包含感興趣的抗原决定基之抗原或感興趣的抗原進行免疫接種的本文所述之小鼠。
在一些實施例中，本文提供一種抗原結合蛋白，其包含第一及第二多肽，第一多肽自N端至C端包含選擇性結合第一抗原决定基之第一抗原結合域，接著包含選自IgG1、IgG2及IgG4之人類IgG之第一CH 3域的恆定域；且第二多肽自N端至C端包含選擇性結合第二抗原决定基之第二抗原結合域，接著包含選自IgG1、IgG2及IgG4之人類IgG之第二CH 3域之恆定域 ，其中第二CH 3域包含减少或消除第二CH 3域與蛋白A之結合的修飾。
在一些實施例中，本文提供一種抗原結合蛋白，其包含第一重鏈及第二重鏈。在一些實施例中，第一重鏈自N端至C端包含選擇性結合第一抗原决定基之第一人類重鏈可變域(與人類λ輕鏈可變域)，接著包含選自IgG1、IgG2及IgG4之人類IgG之第一CH 3域的恆定域。在一些實施例中，第二重鏈自N端至C端包含選擇性結合第二抗原决定基(其可在與第一抗原决定基相同或不同之抗原上)之第二人類重鏈可變域(與相同人類λ輕鏈可變域)，接著包含選自IgG1、IgG2及IgG4之人類IgG之第二CH 3域的恆定域，其中第二CH 3域包含减少或消除第二CH 3域與蛋白A之結合的修飾。
在一些實施例中，CH 3域包含减少或消除CH 3域與蛋白A之結合的修飾。在一些實施例中，减少或消除CH 3域與蛋白A之結合的修飾包含H95R修飾(藉由IMGT外顯子編號；藉由EU編號為H435R)。在一些實施例中，减少或消除CH 3域與蛋白A之結合的修飾包含Y96F修飾(IMGT；藉由EU為Y436F)。在一些實施例中，减少或消除CH 3域與蛋白A之結合的修飾包含H95R修飾(藉由IMGT外顯子編號；藉由EU編號為H435R)及Y96F修飾(IMGT；藉由EU為Y436F)。
在一些實施例中，CH 3域為包含H95R修飾(藉由IMGT外顯子編號；藉由EU編號為H435R)、Y96F修飾(IMGT；藉由EU為Y436F)或兩者之IgG1域，且進一步包含D16E修飾、L18M修飾、N44S修飾、K52N修飾、V57M修飾、V82I修飾或其組合(IMGT；藉由EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、V422I或其組合)。
在一些實施例中，CH 3域為包含H95R修飾(藉由IMGT外顯子編號；藉由EU編號為H435R)、Y96F修飾(IMGT；藉由EU為Y436F)或兩者之IgG2域，且進一步包含N44S修飾、K52N修飾、V82I修飾或其組合(IMGT；藉由EU為N384S、K392N、V422I或其組合)。
在一些實施例中，CH 3域為包含H95R修飾(藉由IMGT外顯子編號；藉由EU編號為H435R)、Y96F修飾(IMGT；藉由EU為Y436F)或兩者之IgG4域，且進一步包含Q15R修飾、N44S修飾、K52N修飾、V57M修飾、R69K修飾、E79Q修飾及V82I修飾(IMGT；藉由EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、V422I或其組合)。
一種製造結合超過一個抗原决定基之抗原結合蛋白之方法，為用包含所關注第一抗原决定基之第一抗原對如本文所述之具有有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫之第一非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)進行免疫接種，其中該非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)包括可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區之一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類D基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。當進行免疫接種時，此類非人類動物會製造反向嵌合抗體，包含自有限人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區組庫所表現之人類λ輕鏈可變域(例如單個人類重排之λ輕鏈可變區)。可鑑別編碼結合感興趣的抗原决定基之人類免疫球蛋白重鏈可變域的B細胞。在一些實施例中，可提取編碼人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列(例如藉由PCR)，並與合適人類免疫球蛋白重鏈恆定域同框選殖至表現構築體中。在一些實施例中，可重複此過程，以鑑別結合第二抗原之第二抗原决定基之第二人類免疫球蛋白重鏈可變域，且可提取第二人類免疫球蛋白重鏈可變域，並與第二適合免疫球蛋白恆定區同框選殖至表現載體中。在一些實施例中，可提取編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之核苷酸序列(例如藉由PCR)，並與合適人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區同框選殖至表現構築體中。在一些實施例中，第一及第二免疫球蛋白人類重鏈恆定域可為相同或不同之同型體。在一些實施例中，免疫球蛋白人類重鏈恆定域之一(但另一者不是)可如本文或美國專利第8,586,713號、第9,309,326號及第9,982,013號中所述經修飾，各專利以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗原結合蛋白可在合適細胞中表現且基於其與同源二聚體抗原結合蛋白相比有差異之對蛋白A之親和力來分離，例如如美國專利第8,586,713號、第9,309,326號及第9,982,013號中所述，各專利以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，第一與第二抗原可為相同且第一與第二抗原决定基可為不同。在一些實施例中，第一與第二抗原不同。在一些實施例中，雙特異性抗原結合蛋白結合抗原之親和力比單特異性抗原結合蛋白結合相同抗原之親和力高。在一些實施例中，雙特異性抗原結合蛋白以不同親和力結合第一抗原决定基及第二抗原决定基。
在一些實施例中，本文提供一種製備雙特異性抗原結合蛋白之方法，該方法包括自如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)來鑑別第一親和力成熟之(例如包含一或多個體細胞超突變)人類重鏈可變域，其在內源κ輕鏈基因座處包括單個人類重排之λ輕鏈可變區，及可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區之一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。在一些實施例中，製備雙特異性抗原結合蛋白之方法，包括自如本文所述之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)來鑑別第二親和力成熟之(例如包含一或多個體細胞超突變)重鏈可變域，其在內源κ輕鏈基因座處包括單個人類重排之λ輕鏈可變區(例如與用於產生第一可變域之非人類動物中相同的單個人類重排之λ輕鏈可變區)，及可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區之一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。在一些實施例中，編碼第一親和力成熟之人類重鏈可變域之核苷酸序列係與缺乏蛋白A决定子修飾之人類重鏈恆定區同框選殖，以形成編碼完整人類重鏈之第一核苷酸序列，如美國專利第8,586,713號、第9,309,326號及第9,982,013號中所述，各專利以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，編碼第二親和力成熟之人類重鏈可變域之核苷酸序列係與包含蛋白A决定子之人類重鏈恆定區同框選殖，以形成第二完整人類重鏈，如美國專利第8,586,713號、第9,309,326號及第9,982,013號中所述，各專利以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，如此段中所述之編碼第一完整人類重鏈之核苷酸及如此段中所述之編碼第二完整人類重鏈之核苷酸，係被引入宿主細胞(例如哺乳動物細胞)中。在一些實施例中，如此段中所述之編碼第一完整人類重鏈之核苷酸係被包括在第一表現載體上。在一些實施例中，如此段中所述之編碼第二完整人類重鏈之核苷酸係被包括在第二表現載體上。在一些情况下，第一與第二表現載體為相同或不同。在一些實施例中，製造雙特異性抗體之方法包括在宿主細胞中表現如此段中所述之編碼第一完整人類重鏈之核苷酸、如此段中所述之編碼第二完整人類重鏈之核苷酸及編碼人類λ輕鏈包含人類λ輕鏈可變域之核苷酸，以便形成雙特異性抗體，其中人類λ輕鏈可變域具有由如本文所述之具有有限人類λ輕鏈可變區組庫之非人類動物產生的序列(例如單個人類重排之λ輕鏈可變區)。在其他實施例中，人類λ輕鏈可變域具有源自於與非人類動物中所存在相同之人類V/J重排(例如與非人類動物中所存在相同之單個人類重排之λ輕鏈可變區)的序列。在一些實施例中，製造雙特異性抗體之方法包括例如自宿主細胞或其培養基獲得雙特異性抗體。
在一些實施例中，宿主細胞可為原核生物及真核生物之細胞(單細胞或多細胞)、細菌細胞(例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬等菌株)、分枝桿菌屬細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴氏畢赤酵母、甲醇畢赤酵母等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如SF-9、SF-21、桿狀病毒感染之昆蟲細胞、粉紋夜蛾等)、非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物，諸如雜交瘤或四體瘤。在一些實施例中，細胞為人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施例中，細胞為真核的且選自以下細胞：CHO (例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS (例如COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431 (表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli細胞、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞及源自於前述細胞之細胞株。在一些實施例中，細胞包含一或多個病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞(例如PER.C6®細胞)。 醫藥組成物
在一些實施例中，可向個體(例如人類個體)投與由本文揭示之非人類動物產生或源自於由本文揭示之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)產生之抗體、核酸或其治療相關部分的抗原結合蛋白、編碼抗原結合蛋白之核酸或其治療相關部分。在一些實施例中，醫藥組成物包括由本文揭示之非人類動物之抗體。在一些實施例中，醫藥組成物可包括緩衝劑、稀釋劑、賦形劑或其任何組合。在一些實施例中，必要時，組成物亦可含有一或多種額外的治療活性物質。
雖然對本文提供之醫藥組成物之描述主要針對適合於倫理上投與人類之醫藥組成物，但熟練技術人員將瞭解，此類組成物通常適合於投與各種動物。為使組成物適合於投與多種動物而對適合於投與人類之醫藥組成物所進行之修改，係為習知，且具有通常知識的獸醫學藥理學家可利用常規實驗(若有)來設計及/或進行此類修改。
舉例而言，本文提供之醫藥組成物可呈無菌注射形式(例如適合於皮下注射或靜脉內輸注之形式)。舉例而言，在一些實施例中，醫藥組成物呈適合於注射之液體劑型來提供。在一些實施例中，醫藥組成物視情况在真空下呈粉劑(例如凍幹及/或殺菌)來提供，在注射之前可用水性稀釋劑(例如水、緩衝液、鹽溶液等)來復水（reconstitute）。在一些實施例中，醫藥組成物係在水、氯化鈉溶液、乙酸鈉溶液、苯甲醇溶液、磷酸鹽緩衝生理食鹽水等中稀釋及/或進行復水。在一些實施例中，粉劑應緩慢地與水性稀釋劑混合(例如不震蕩)。
本文所述之醫藥組成物之調配物可藉由藥理學領域中已知或此後開發之任何方法製備。一般而言，此類製備方法包括使活性成分與稀釋劑或另一賦形劑及/或一或多種其他輔助劑締合，接著必要及/或需要時，使產物成形及/或包裝成所需單劑量或多劑量單元的步驟。
在一些實施例中，包括由本文揭示之非人類動物(例如嚙齒類動物，例如大鼠或小鼠)產生之抗體的醫藥組成物可包括在用於儲存或投與之容器中，例如小瓶、注射器(例如IV注射器)或袋(例如IV袋)。根據本文之醫藥組成物可呈單個單位劑量及/或呈複數個單位劑量製備、包裝及/或整批出售。如本文所用，「單位劑量」為包含預先確定量之活性成分的醫藥組成物之離散量。活性成分之量一般等於將投與個體之活性成分之劑量，及/或此類劑量之合宜分數，例如此類劑量之一半或三分之一。
根據本文之醫藥組成物中活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分之相對量將視所治療之個體之身份、體型及/或狀態而變化，且進一步視投與組成物之途徑而變化。舉例而言，組成物可包含0.1%與100% (w/w)之間的活性成分。
醫藥組成物可另外包含醫藥學上可接受之賦形劑，如本文所用，醫藥學上可接受之賦形劑包括任何及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑及其類似物，如適合於期望特定劑型。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)揭示多種用於調配醫藥組成物之賦形劑及已知之用於製備其之技術。除非諸如藉由產生任何不合需要之生物效應或以有害方式另外與醫藥組成物之任何其他組分相互作用，使得任何習知賦形劑介質與物質或其衍生物不相容，否則其使用涵蓋在本文之範疇內。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純。在一些實施例中，賦形劑經批准用於人類及獸醫學用途。在一些實施例中，賦形劑經美國食品與藥物管理局(the United States Food and Drug Administration)批准。在一些實施例中，賦形劑為醫藥級。在一些實施例中，賦形劑滿足美國藥典(the United States Pharmacopoeia，USP)、歐洲藥典(the European Pharmacopoeia，EP)、英國藥典(the British Pharmacopoeia)及/或國際藥典(the International Pharmacopoeia)之標準。
在製造醫藥組成物中所用之醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑、分散及/或成粒劑、表面活性劑及/或乳化劑、崩解劑、粘合劑、防腐劑、緩衝劑、潤滑劑及/或油類。此類賦形劑可視情况包括在醫藥調配物中。根據調配師之判斷，諸如可可脂及栓劑蠟、著色劑、包覆劑、甜味劑、調味劑及/或芳香劑等的賦形劑可存在於組成物中。
在一些實施例中，所提供之醫藥組成物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑(例如防腐劑、惰性稀釋劑、分散劑、表面活性劑及/或乳化劑、緩衝劑等)。在一些實施例中，醫藥組成物包含一或多種防腐劑。在一些實施例中，醫藥組成物不含防腐劑。
在一些實施例中，醫藥組成物呈可冷藏及/或冷凍之形式提供。在一些實施例中，醫藥組成物呈不可冷藏及/或冷凍之形式提供。在一些實施例中，經復水之溶液及/或液體劑型可儲存達復原後某一段時間(例如2小時、12小時、24小時、2天、5天、7天、10天、2周、一個月、兩個月或更長時間)。在一些實施例中，抗體組成物儲存超過規定時間會引起抗體降解。
液體劑型及/或經復原之溶液在投與之前可包含顆粒物質及/或褪色。在一些實施例中，若褪色或混濁及/或若在過濾後仍然有顆粒物質，則不應使用溶液。
醫藥劑之調配及/或製造中的一般考慮可見於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005。 套組
本文進一步提供包裝或套組，其包含一或多個裝有至少如本文所述之非人類細胞、蛋白質(單一或複雜(例如抗體或其片段))、DNA片段、靶向載體或其任何組合的容器。套組可用於任何適用方法(例如研究法)中。視情况與此類容器相聯者可為一通告，該通告為管制醫藥或生物産品之製造、使用或銷售的政府機構所指定的形式，其反映(a)該機構批准用於投與人類的製造、使用或銷售，(b)使用說明，及/或(c)管理兩個或更多個實體及其組合之間的材料及/或生物産品(例如如本文所述之非人類動物或非人類細胞)之轉移的契約。
在一些實施例中，本文提供包含如本文所述之非人類細胞、非人類組織、永生化細胞、非人類ES細胞或非人類胚胎的套組。在一些實施例中，提供包含來自如本文所述之非人類動物、非人類細胞、非人類組織、永生化細胞、非人類ES細胞或非人類胚胎之胺基酸(例如抗體或其片段)的套組。在一些實施例中，提供包含來自如本文所述之非人類動物、非人類細胞、非人類組織、永生化細胞、非人類ES細胞或非人類胚胎之核酸(例如核酸編碼 抗體或其片段)的套組。在一些實施例中，本文提供包含自如本文所述之非人類動物、非人類細胞、非人類組織、永生化細胞、非人類ES細胞,或非人類胚胎鑑別之序列(胺基酸及/或核酸序列)的套組。
在一些實施例中，本文提供如本文所述之套組，其用於製造及/或研發用以治療或診斷之藥物(例如抗體或其片段)。
在一些實施例中，本文提供如本文所述之套組，其用於製造及/或研發用以治療、預防或改善疾病、病症或疾患之藥物(例如抗體或其片段)。
某些實施例的其他特徵將在下面對示例性實施例的描述過程中變得顯而易見，這些示例性實施例是為了說明而給出的，而不是為了限制其內容。。實例
本文提供以下實例，以便對熟練技術人員描述如何製造及使用本文所述之方法及組成物；且不意欲限制本文之範疇。除非另外指示，否則溫度係以攝氏度表示，且壓力處於或接近大氣壓。
一般而言，携帶重排人類λ輕鏈可變區之靶向載體，係使用VELOCIGENE®技術製造(參見例如美國專利第6,586,251號及Valenzuela等人(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6): 652-659，各以引用之方式併入本文中)。小鼠基因組細菌人工染色體(BAC)殖株係經修飾，以產生含有單一重排人類λ輕鏈可變區之基因組構築體。將該等構築體插入內源κ輕鏈基因座中，該內源κ輕鏈基因座係事先經修飾以使內源Vκ及Jκ基因區段缺失。實例 1- 產生包括有重排人類 Vλ1-51/Jλ2 及小鼠 Cκ 之靶向載體
重排人類Vλ1-51/Jλ2係使用所屬領域中公認之標準分子生物學技術來製造。重排人類Vλ1-51/Jλ2中所包括之人類Vλ1-51基因區段及人類Jλ2基因區段，分別具有人類Vλ1-51生殖系序列及人類Jλ2生殖系序列。
DNA片段係藉由DNA重新合成(Blue Heron Biotech)來製造。該片段含有AscI位點、2kb人類Vλ1-51啟動子區域、人類Vλ1-51 5'未轉譯區(UTR)、人類Vλ1-51基因區段之外顯子1之編碼序列(其包括編碼前導肽之序列)、人類Vλ1-51基因區段之內含子1、包括人類Vλ1-51基因區段及Jλ2基因區段之第二外顯子的重排人類Vλ1-51/Jλ2可變序列、人類Jκ5-Cκ內含子其初始的412 bp (包括Jκ5剪接供體位點(SD))，及PI-SceI位點 (SEQ ID NO: 31；亦參見圖1A及圖9A至C)。
將上述段落中所描述之片段連結至先前描述之靶向載體中，以產生圖1A中之靶向載體A。先前描述之靶向載體含有源自於BAC CT7-302g12之約23 kb 5'小鼠同源臂、Frt-Ub-Neo-Frt卡匣、AscI位點、重排人類Vκ3-20/Jκ1可變區、PI-SceI位點及源自於BAC CT7-254m04之約75 kb 3'小鼠同源臂(參見例如美國專利第9,334,334號之圖14B，及美國專利第10,143,186號之圖2，各以引用之方式併入本文中)。該等小鼠同源臂與Macdonald等人(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52先前描述之同源臂一致，該文獻以引用之方式併入本文中。5'臂在內源κ基因座上游含有約23 kb的基因組序列，且3'臂在小鼠κ基因座下游含有約2.4 kb的小鼠Jκ-Cκ內含子、小鼠Cκ外顯子及約72 kb的基因組序列。參見圖1A。
靶向載體A自5'至3'含有源自於BAC CT7-302g12之約23 kb的5'小鼠同源臂、Frt-Ub-Neo-Frt卡匣、AscI位點、2 kb人類Vλ1-51啟動子區域、人類Vλ1-51 5'未轉譯區(UTR)、人類Vλ1-51基因區段之外顯子1之編碼序列(其包括編碼前導肽之序列)、人類Vλ1-51基因區段之內含子1、包括人類Vλ1-51基因區段及Jλ2基因區段之第二外顯子的重排人類Vλ1-51/Jλ2可變序列、人類Jκ5-Cκ內含子其初始的412 bp (包括Jκ5剪接供體位點(SD))、PI-SceI位點及源自於BAC CT7-254m04之約75 kb 3'小鼠同源臂，該約75 kb 3'小鼠同源臂在小鼠κ基因座下游包括約2.4 kb的小鼠Jκ-Cκ 內含子、小鼠Cκ外顯子及約72 kb的基因組序列。實例 2- 產生包括有重排人類 Vλ1-51/Jλ2 及小鼠 Cκ 之 ES 細胞
如實例1中所述之靶向載體A，係經電穿孔而送至小鼠ES細胞中，在該等小鼠ES細胞中內源Vκ及Jκ基因區段已被重排人類Vκ3-20/Jκ1所替代，且其中免疫球蛋白重鏈基因座包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段。小鼠ES細胞之免疫球蛋白重鏈基因座亦包括功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因(參見美國專利第10,130,081號，其以引用之方式併入本文中)。選擇已進行同源重組之殖株，得到經修飾之ES細胞，以生成嵌合小鼠，該嵌合小鼠係自重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cκ來表現抗體。
陽性ES細胞殖株係藉由TAQMAN™篩選來確認，其係使用對插入內源κ基因座中之重排人類Vλ1-51/Jλ2具特異性的引子及探針來進行(參見上述Valenzuela等人，其為以引用之方式併入本文中)。圖3中帶圓圈的破折號來表示可用於偵測之多種探針的大約位置。分析中所用之引子及探針特別係列於下表A中。表 A - 對偶基因修飾分析上所用之引子及探針
名稱 正向引子 探針 反向引子
λ通用輕鏈引子及探針
hTU_1-51 GGGACGAGGCCGATTATTACTG (SEQ ID NO: 41) CGGAACATGGGATAGCAGCCTGA  (SEQ ID NO: 42) CCTCCGCCGAATACCACA  (SEQ ID NO: 43)
hTU2_1-51 GCATCACCGGACTCCAGACT  (SEQ ID NO: 44) CGAGGCCGATTATTACTGCGGAACA  (SEQ ID NO: 45) AGGACGGTCAGCTTGGTC  (SEQ ID NO: 46)
hTU_2-14 CAGGACTCGGGACAATCTTCATC  (SEQ ID NO: 47) ATGGCCTGGGCTCTGCTGCTC  (SEQ ID NO: 48) TGTGCCCTGAGTGAGGAG  (SEQ ID NO: 49)
hTU2_2-14 AGCGCAGAAGGCAGGACTC  (SEQ ID NO: 50) ACAATCTTCATCATGGCCTGGGCTC  (SEQ ID NO: 51) CGTCACCTGTGCCCTGAG  (SEQ ID NO: 52)
hTU3_1-51pro TGTTGCCCAAGCTGGAGTG  (SEQ ID NO: 53) TGGCATGATCTCGGCTCACTGC  (SEQ ID NO: 54) GAGGCTGAGGCAGGAGAA  (SEQ ID NO: 55)
mIgKC-4 GGCCACTCACAAGACATCAAC  (SEQ ID NO: 56) TCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACA  (SEQ ID NO: 57) CGTCTCAGGACCTTTGTCTCTAAC  (SEQ ID NO: 58)
mIgKLC1-2 TCCTTGTTACTTCATACCATCCTCT  (SEQ ID NO: 59) TTCCTTCCTCAGGCCAGCCC  (SEQ ID NO: 60) AGGGTGACTGATGGCGAAGACT  (SEQ ID NO: 61)
親本引子及探針
1635h2 TCCAGGCACCCTGTCTTTG  (SEQ ID NO: 62) AAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG  (SEQ ID NO: 63) AAGTAGCTGCTGCTAACACTCTGACT  (SEQ ID NO: 64)
ULCm1 AGGTGAGGGTACAGATAAGTGTTATGAG  (SEQ ID NO: 65) CCATTATGATGCTCCATGCCTCTCTGTTC  (SEQ ID NO: 66) TGACAAATGCCCTAATTATAGTGATCA  (SEQ ID NO: 67)
Neo GGTGGAGAGGCTATTCGGC  (SEQ ID NO: 68) TGGGCACAACAGACAATCGGCTG  (SEQ ID NO: 69) GAACACGGCGGCATCAG  (SEQ ID NO: 70)
Hyg TGCGGCCGATCTTAGCC  (SEQ ID NO: 71) ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC  (SEQ ID NO: 72) TTGACCGATTCCTTGCGG  (SEQ ID NO: 73)
將載有包括重排人類Vλ1-51/Jλ2的經工程改造之內源κ輕鏈基因座的ES細胞(參見圖3)，用表現FLP之構築體轉染，以移除由靶向構築體所引入之FRT化的新黴素卡匣。視情况，新黴素卡匣係藉由繁殖成表現FLP重組酶之小鼠來移除(例如US 6,774,279，其以全文引用之方式併入)。視情况，新黴素卡匣保留在小鼠中。實例 3 - 產生表現有源自於重排人類 Vλ1-51/Jλ2 及小鼠 Cκ 之輕鏈的小鼠
以上實例2所述之靶向ES細胞係用作供體ES細胞，且藉由VELOCIMOUSE®方法引入8細胞期之小鼠胚胎中(參見例如美國專利第7,294,754號及Poueymirou等人(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1): 91-99，各以引用的方式併入本文中)。藉由使用對偶基因修飾分析(上述Valenzuela等人，其以引用之方式併入本文中)進行基因分型，以鑑別載有經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括連接至小鼠Cκ之重排人類Vλ1-51/Jλ2）的VELOCIMOUSE®，該分析偵測重排人類Vλ1-51/Jλ2之存在。載有包括在一個基因座對偶基因處連接至小鼠Cκ之重排人類Vλ1-51/Jλ2的經工程改造之內源κ輕鏈基因座的小鼠，可載有包含在第二基因座對偶基因處連接至小鼠小鼠Cκ之重排人類Vκ3-20/Jκ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座，且含有包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座。
小鼠經繁殖為其經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cκ）為同型合子，且其經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座（包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段）為同型合子。在一種方法中，此可藉由首先將包含包括在一個輕鏈基因座對偶基因處連接至小鼠Cκ之重排人類Vλ1-51/Jλ2的經工程改造之內源κ輕鏈基因座、包含在第二輕鏈基因座對偶基因處連接至小鼠Cκ之重排人類Vκ3-20/Jκ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座及包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段(在兩個重鏈對偶基因處)的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠，繁殖成包含內源重鏈及輕鏈κ基因座敲除(KO)且視情况亦包含內源λ基因座KO之小鼠來實現，如下文進一步所述。可替代地，小鼠可繁殖成包含內源輕鏈κ基因座KO、視情况為內源λ基因座KO，且其經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座（包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段）為同型合子的小鼠。所得小鼠係繁殖成在免疫球蛋白基因座，例如經修飾及/或內源免疫球蛋白基因座（如人類化λ輕鏈及重鏈基因座）處為同型合子。
對幼崽進行基因分型，並選擇其經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cκ）為異型合子或同型合子之幼崽，且評估及表徵來自重排人類Vλ1-51/Jλ2或其體細胞超突變變異體之人類λ輕鏈可變域的表現。在包含本文所述之經工程改造之輕鏈的小鼠中，使用FACS分析來偵測人類Vλ1-51/Jλ2之B細胞表面表現。實例 4 - 產生包括有重排人類 Vλ1-51/Jλ2 及小鼠 Cλ1 之靶向載體
為了以小鼠Cλ1替代靶向載體A中之小鼠Cκ，係進行額外選殖步驟(參見圖1B)。在活體外用兩種Cas9:gRNA複合物來切割靶向載體A：第一次切割在內含子κ强化子(Ei )上游，且第二次切割在Cκ下游。接著進行吉普森組裝(Gibson assembly)，以4.9 kb的合成片段來替代缺失區域，該片段含有與Cas9切割之靶向載體其3'末端的45bp重叠、Ei 、小鼠Cλ1、loxP-Ub-Hyg-loxP卡匣及與Cas9切割之靶向載體其5'末端的80bp重叠。合成片段係自PCT/US2018/063841其圖1A之質體pE的限制片段所獲得，該文獻以引用之方式併入本文中。圖1B中示出所得之靶向載體（靶向載體B）。
除其小鼠Cκ係用小鼠Cλ1替代且loxP-Ub-Hyg-loxP卡匣係插入其Cκ多聚A信號的下游之外，靶向載體B係與靶向載體A一致。實例 5 - 產生包括有重排人類 Vλ1-51/Jλ2 及小鼠 Cλ1 之 ES 細胞
如實例4中所述之靶向載體B係經電穿孔而送至小鼠ES細胞中，在該等細胞中內源Vκ及Jκ基因區段已用重排人類Vκ3-20/Jκ1來替代，且其中免疫球蛋白重鏈基因座係包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段。小鼠ES細胞之免疫球蛋白重鏈基因座亦包括功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因(參見美國專利第10,130,081號，其以引用之方式併入本文中)。選擇已進行同源重組之殖株，得到經修飾之ES細胞，用於產生嵌合小鼠，該嵌合小鼠自重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cλ1表現抗體。
陽性ES細胞殖株係藉由TAQMAN™篩選來確認，其係使用對插入內源κ基因座中之重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cλ1具特異性的引子及探針來進行(參見上述Valenzuela等人，其以引用之方式併入本文中)。圖4中藉由帶圓圈的破折號來表示用於偵測之多種探針的大約位置。分析中所用之引子及探針特別係列於上表A中。
將載有包括重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cλ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座的ES細胞(參見圖4)，用表現FLP及/或CRE之構築體來轉染，以移除FRT化的新黴素或Flox化的潮黴素卡匣。視情况，新黴素卡匣可藉由繁殖成表現有FLP重組酶之小鼠來移除(例如US 6,774,279，其以全文引用之方式併入)，及/或潮黴素卡匣可藉由繁殖成表現CRE重組酶之小鼠來移除。視情况，新黴素及/或潮黴素卡匣係保留在小鼠中。實例 6 - 產生表現有源自於重排人類 Vλ1-51/Jλ2 及小鼠 Cλ1 之輕鏈的小鼠
以上實例5中所述之靶向ES細胞係用作供體ES細胞，並藉由VELOCIMOUSE®方法引入8細胞期之小鼠胚胎中(參見例如美國專利第7,294,754號及Poueymirou等人(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1): 91-99，各以引用的方式併入本文中)。藉由對偶基因修飾分析進行基因分型，以鑑別載有經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cλ1）的VELOCIMOUSE®(參見上述Valenzuela等人，其以引用之方式併入本文中)，該分析偵測重排人類Vλ1-51/Jλ2或小鼠Cλ1之存在。載有包括在一個基因座對偶基因處連接至小鼠Cλ1之重排人類Vλ1-51/Jλ2的經工程改造之內源κ輕鏈基因座的小鼠，可載有包含在第二基因座對偶基因處連接至小鼠小鼠Cκ之重排人類Vκ3-20/Jκ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座，且含有包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座。
小鼠繁殖為其經修飾之κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cλ1）為同型合子，且其經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座（包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段）為同型合子。在一種方法中，此可藉由首先將包含包括在一個輕鏈基因座對偶基因處連接至小鼠Cλ1之重排人類Vλ1-51/Jλ2的經工程改造之內源κ輕鏈基因座、包含在第二輕鏈基因座對偶基因處連接至小鼠Cκ之重排人類Vκ3-20/Jκ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座、及包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因(在兩個重鏈對偶基因處)之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠，繁殖成包含內源重鏈及輕鏈κ基因座敲除(KO)且視情况亦包含內源λ基因座KO之小鼠來實現，如下文進一步所述。可替代地，小鼠可繁殖成包含內源輕鏈κ基因座KO、視情况內源λ基因座KO，且其經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座（包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段）為同型合子的小鼠。所得小鼠係繁殖成在免疫球蛋白基因座，例如經修飾及/或內源免疫球蛋白基因座（如人類化λ輕鏈及重鏈基因座）處為同型合子。
對幼崽進行基因分型，並選擇其經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ1-51/Jλ2及小鼠Cλ1的）為異型合子或同型合子的幼崽，評估且表徵其來自重排人類Vλ1-51/Jλ2或其體細胞超突變變異體的人類λ輕鏈可變域之表現。在包含本文所述之經工程改造之輕鏈的小鼠中，使用FACS分析來偵測人類Vλ1-51/Jλ2之B細胞表面表現。實例 7 - 產生包括有重排人類 Vλ2-14/Jλ2 及小鼠 Cκ 之靶向載體
重排人類Vλ2-14/Jλ2係使用所屬領域中所公認之標準分子生物學技術來製造。人類Vλ2-14基因區段及人類Jλ2基因區段中所包括之重排人類Vλ2-14/Jλ2，係分別具有人類Vλ2-14生殖系序列及人類Jλ2生殖系序列。
DNA片段係藉由DNA重新合成(de novo DNA synthesis，Blue Heron Biotech)來製造。該片段含有AscI位點、2 kb的人類Vλ1-51啟動子區域、人類Vλ1-51 5'未轉譯區(UTR)、人類Vλ2-14基因區段之外顯子1之編碼序列(其包括編碼前導肽之序列)、人類Vλ2-14基因區段之內含子1、包括人類Vλ2-14基因區段及Jλ2基因區段之第二外顯子的重排人類Vλ2-14/Jλ2可變序列、人類Jκ5-Cκ內含子其初始412 bp (包括Jκ5剪接供體位點(SD))，及PI-SceI位點(SEQ ID NO: 36；亦參見圖2A及圖13A-C)。
以上段落中所述之片段，係連結至先前描述之靶向載體中，以產生圖2A中之靶向載體C。先前描述之靶向載體係含有源自於BAC CT7-302g12之約23 kb的5'小鼠同源臂、Frt-Ub-Neo-Frt卡匣、AscI位點、重排人類Vκ3-20/Jκ1可變區、PI-SceI位點，及源自於BAC CT7-254m04之約75 kb的3'小鼠同源臂(參見例如美國專利第9,334,334號之圖14B，及美國專利第10,143,186號之圖2，各以引用之方式併入本文中)。該等小鼠同源臂係與Macdonald等人(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52先前描述之同源臂一致，該文獻以引用之方式併入本文中。5'臂在內源κ基因座上游含有約23 kb的基因組序列，且3'臂在小鼠κ基因座下游含有約2.4 kb的小鼠Jκ-Cκ 內含子、小鼠Cκ 外顯子及約72 kb的基因組序列。參見圖2A。
靶向載體C自5'至3'含有源自於BAC CT7-302g12之約23 kb的5'小鼠同源臂、Frt-Ub-Neo-Frt卡匣、AscI位點、2 kb人類Vλ1-51啟動子區域、人類Vλ1-51 5' UTR、Vλ2-14基因區段之外顯子1之編碼序列(其包括編碼前導肽之序列)、人類Vλ2-14基因區段之內含子1、包括人類Vλ2-14基因區段及 Jλ2基因區段之第二外顯子的重排人類Vλ2-14/Jλ2可變序列、人類Jκ5-Cκ內含子其初始412 bp(包括Jκ5剪接位點)、PI-SceI位點，及源自於BAC CT7-254m04之約75 kb的3'小鼠同源臂，該3'小鼠同源臂在小鼠κ基因座下游包括約2.4 kb的小鼠Jκ-Cκ 內含子、小鼠Cκ 外顯子，及約72 kb的基因組序列。實例 8 - 產生包括有重排人類 Vλ2-14/Jλ2 及小鼠 Cκ 之 ES 細胞
靶向載體C係經電穿孔而送至小鼠ES細胞中，在該等細胞中內源Vκ及Jκ基因區段已用重排人類Vκ3-20/Jκ1來替代，且其中免疫球蛋白重鏈基因座包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段。小鼠ES細胞之免疫球蛋白重鏈基因座亦包括功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因(參見美國專利第10,130,081號，其以引用之方式併入本文中)。選擇已進行同源重組之殖株，得到經修飾之ES細胞，用於產生嵌合小鼠，該嵌合小鼠係自重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cκ表現抗體。
陽性ES細胞殖株藉由TAQMAN™篩選來確認，其係使用對插入內源κ基因座中之重排人類Vλ2-14/Jλ2具特異性的引子及探針來進行(參見上述Valenzuela等人，其以引用之方式併入本文中)。圖5中藉由帶圓圈的破折號來表示用於偵測之多個探針之大約位置。分析中所用之引子及探針特別係列於上表A中。
將載有包括重排人類Vλ2-14/Jλ2的經工程改造之內源κ輕鏈基因座的ES細胞(參見圖5)，用表現FLP之構築體轉染，以移除由靶向構築體所引入之FRT化的新黴素卡匣。視情况，新黴素卡匣係藉由繁殖成表現FLP重組酶之小鼠來移除(例如US 6,774,279，其以全文引用之方式併入)。視情况，新黴素卡匣係保留在小鼠中。實例 9 - 產生表現有源自於重排人類 Vλ2-14/Jλ2 及小鼠 Cκ 之輕鏈的小鼠的
以上實例8中所述之靶向ES細胞係用作供體ES細胞，並藉由VELOCIMOUSE®方法來引入8細胞期之小鼠胚胎中(參見例如美國專利第7,294,754號及Poueymirou等人(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1): 91-99，各以引用的方式併入本文中)。藉由使用對偶基因修飾分析進行基因分型，來鑑別載有經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cκ）的VELOCIMOUSE® (上述Valenzuela等人，其以引用之方式併入本文中)，該分析偵測重排人類Vλ2-14/Jλ2之存在。載有包括在一個基因座對偶基因處連接至小鼠Cκ之重排人類Vλ2-14/Jλ2的經工程改造之內源κ輕鏈基因座的小鼠，可載有包含在第二基因座對偶基因處連接至小鼠小鼠Cκ之重排人類Vκ3-20/Jκ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座，且含有包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座。
小鼠繁殖為其經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cκ）為同型合子，且其經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座（包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段）為同型合子。在一種方法中，此可藉由首先將包含在一個輕鏈基因座對偶基因處包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cκ的經工程改造之內源κ輕鏈基因座、包含在第二輕鏈基因座對偶基因處連接至小鼠Cκ之重排人類Vκ3-20/Jκ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座、及包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因(在兩個重鏈對偶基因處)之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠，繁殖成包含內源重鏈及輕鏈κ基因座敲除(KO)且視情况亦包含內源λ基因座小鼠KO來實現，如下文進一步所述。可替代地，小鼠可經繁殖成包含內源輕鏈κ基因座KO、視情况內源λ基因座KO，且其經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座（包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段）為同型合子的小鼠。所得小鼠繁殖成在免疫球蛋白基因座，例如經修飾及/或內源免疫球蛋白基因座（如人類化λ輕鏈及重鏈基因座）處為同型合子。
對幼崽進行基因分型，並選擇其經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cκ）為異型合子或同型合子之幼崽，評估並表徵自重排人類Vλ2-14/Jλ2或其體細胞超突變變異體的人類λ輕鏈可變域之表現。在包含本文所述之經工程改造之輕鏈的小鼠中，使用FACS分析來偵測人類Vλ2-14/Jλ2之B細胞表面表現。實例 10 - 產生包括有重排人類 Vλ2-14/Jλ2 及小鼠 Cλ1 之靶向載體
為了以小鼠Cλ1替代靶向載體C中之小鼠Cκ，係進行額外選殖步驟(參見圖2B)。在活體外用兩種Cas9:gRNA複合物來切割靶向載體C：第一次切割在內含子κ强化子(Ei )上游，且第二次切割在Cκ下游。接著進行吉普森組裝，以4.9 kb的合成片段來替代缺失區域，該片段含有與Cas9切割之靶向載體其3'末端的45 bp重疊、Ei 、小鼠Cλ1、loxP-Ub-Hyg-loxP卡匣及與Cas9切割之靶向載體其5'末端的80 bp重疊。合成片段係自PCT/US2018/063841其圖1A之質體pE的限制片段所獲得，該文獻以引用之方式併入本文中。圖2B中示出所得靶向載體（靶向載體D）。
除其小鼠Cκ係用小鼠Cλ1來替代，且loxP-Ub-Hyg-loxP卡匣係插入Cκ多聚A信號下游之外，靶向載體D係與靶向載體C一致。實例 11 - 產生包括有重排人類 Vλ2-14/Jλ2 及小鼠 Cλ1 之 ES 細胞
靶向載體D經電穿孔而送至中小鼠ES細胞，在該等細胞中內源Vκ及Jκ基因區段已被重排人類Vκ3-20/Jκ1替代，且其中免疫球蛋白重鏈基因座包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段。小鼠ES細胞之免疫球蛋白重鏈基因座亦包括功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因(參見美國專利第10,130,081號，其以引用之方式併入本文中)。選擇已進行同源重組之殖株，得到經修飾之ES細胞，用於產生嵌合小鼠，該嵌合小鼠係自重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cλ1表現抗體。
陽性ES細胞殖株係藉由TAQMAN™來篩選及確認，其利用對插入內源κ基因座中之重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cλ1具有特異性之引子及探針來進行(參見上述Valenzuela等人，其以引用之方式併入本文中)。圖6中藉由帶圓圈的破折號來表示用於偵測之多個探針之大約位置。分析中所用之引子及探針特別係列於上表A中。
載有包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cλ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座的ES細胞(參見圖6)，係用表現FLP及/或CRE之構築體轉染，以移除FRT化的新黴素或Flox化的潮黴素卡匣。視情况，新黴素卡匣係藉由繁殖成表現FLP重組酶之小鼠來移除(例如US 6,774,279，其以全文引用之方式併入)，及/或潮黴素卡匣係藉由繁殖成表現CRE重組酶之小鼠來移除。視情况，新黴素及/或潮黴素卡匣係保留在小鼠中。實例 12 - 產生表現有源自於重排人類 Vλ2-14/Jλ2 及小鼠 Cλ1 輕鏈之小鼠
以上實例11中所述之靶向ES細胞係用作供體ES細胞，並藉由VELOCIMOUSE®方法引入8細胞期之小鼠胚胎中(參見例如美國專利第7,294,754號及Poueymirou等人(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1): 91-99，各以引用的方式併入本文中)。藉由使用對偶基因修飾分析進行基因分型，來鑑別載有經工程改造之內源κ輕鏈基因座（包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cλ1）的VELOCIMOUSE®(參見上述Valenzuela等人，其以引用之方式併入本文中)，該分析偵測重排人類Vλ2-14/Jλ2或小鼠Cλ1之存在。小鼠載有包括在一個基因座對偶基因處連接至小鼠Cλ1之重排人類Vλ2-14/Jλ2的經工程改造之內源κ輕鏈基因座，可載有包含在第二基因座對偶基因處連接至小鼠小鼠Cκ之重排人類Vκ3-20/Jκ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座，且含有包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座。
小鼠係繁殖成其包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cλ1的經修飾之κ輕鏈基因座為同型合子，且其包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座為同型合子。在一種方法中，此可藉由首先將包含在一個輕鏈基因座對偶基因處包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cλ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座、包含在第二輕鏈基因座對偶基因處連接至小鼠Cκ之重排人類Vκ3-20/Jκ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座、及包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因(在兩個重鏈對偶基因處)之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠，繁殖成包含內源重鏈及輕鏈κ基因座敲除(KO)且視情况亦包含內源λ基因座KO的小鼠來實現，如下文進一步所述。可替代地，小鼠可係繁殖成包含內源輕鏈κ基因座KO、視情况內源λ基因座KO，且其包含可操作地連接至小鼠重鏈恆定區基因及功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因之未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座係為同型合子的小鼠。所得小鼠係繁殖成在免疫球蛋白基因座，例如經修飾及/或內源免疫球蛋白基因座（如人類化λ輕鏈及重鏈基因座）處為同型合子。
對幼崽進行基因分型，並選擇其包括重排人類Vλ2-14/Jλ2及小鼠Cλ1的經工程改造之內源κ輕鏈基因座為異型合子或同型合子的幼崽，評估並表徵自重排人類Vλ2-14/Jλ2或其體細胞超突變變異體的人類λ輕鏈可變域之表現。在包含本文所述之經工程改造之輕鏈的小鼠中，使用FACS分析來偵測人類Vλ12-14/Jλ2之B細胞表面表現。實例 13 - 小鼠之繁殖
本實例描述若干經基因修飾之小鼠品系，其可繁殖成本文所述之經基因修飾之小鼠中的任一種，以建立具有多個經基因修飾之免疫球蛋白基因座的多個經基因修飾之小鼠品系。
設想許多不同的繁殖方案，其產生在本文所述之經工程改造之輕鏈及重鏈基因座處為同型合子的小鼠，以便小鼠表現具有重排人類Igλ可變域之輕鏈及具有重排人類重鏈可變域之重鏈。在一個此類方案中，以上實例3、6、9及12中所述之經基因修飾之小鼠，其重排人類Vλ1-51/Jλ2或重排人類Vλ2-14/Jλ2輕鏈在一個輕鏈基因座對偶基因上(在內源κ基因座處)及重排人類Vκ3-20/Jκ1在第二輕鏈基因座對偶基因處(在內源κ基因座處)為異型合子，且上述包含未重排人類VH 、D及JH 基因區段的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座為同型合子，其繁殖成其內源小鼠Igκ、Igλ及Ig重鏈基因座之缺失為同型合子的小鼠。表現重排之λ輕鏈可變域的所得後代，係彼此繁殖，獲得其重排人類Vλ1-51/Jλ2或重排人類Vλ2-14/Jλ2輕鏈為同型合子且其包含未重排人類VH 、D及JH 基因區段(且如上述亦包含功能性小鼠Adam6a及Adam6b基因)的經工程改造之免疫球蛋白重鏈基因座為同型合子的小鼠。藉由所屬領域中公認之標準技術，且可替代地係藉由商業育種公司，來進行繁殖。
內源 Igκ 敲除 (Igκ KO). 舉例而言，上述包含重排人類λ輕鏈可變區及人類重鏈可變區之小鼠，可繁殖成所有或一部分內源Igκ基因座缺失，使得內源Igκ輕鏈基因座不能表現內源Igκ輕鏈之小鼠。此類示例性小鼠係描述於Macdonald等人(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52中，其為以引用之方式併入本文中。
內源 Igλ 敲除 (Igλ KO). 為最佳化有限人類λ輕鏈可變區組庫之使用，上述包含重排人類λ輕鏈可變區及人類重鏈可變區之小鼠，係繁殖成所有或一部分內源Igλ輕鏈基因座缺失，使得內源Igλ輕鏈基因座不能表現內源λ輕鏈之小鼠(參見例如美國專利第9,066,502號之實例1，以引用之方式併入本文中)。以此方式，所獲得之後代將表現具有可變域的輕鏈（該可變域係表現自有限人類λ輕鏈可變區組庫），作為其唯一的λ輕鏈(例如如實例3、6、9及12中所述之重排人類Vλ/Jλ)。載有有限人類λ輕鏈可變區組庫及所有或一部分內源λ輕鏈基因座缺失的小鼠品系係經篩選，以確定是否存在有限人類λ輕鏈可變區組庫及是否不具有內源小鼠λ輕鏈。
內源 Ig 重鏈敲除 (IgH KO). 舉例而言，上述包含重排人類λ輕鏈可變區及未重排人類重鏈可變區的小鼠，可繁殖成所有或一部分內源Ig重鏈基因座缺乏，使得內源Ig重鏈基因座不能表現內源Ig重鏈之小鼠。此類示例性小鼠係描述於美國專利第10,457,960號之實例7中，其以引用之方式併入本文中。
因此，如上所述，如上述包含重排人類λ輕鏈可變區及人類重鏈可變區之小鼠，可繁殖成所有或一部分內源Igλ、Igκ及/或Ig重鏈基因座缺失之小鼠。後續之後代係繁殖成在免疫球蛋白基因座，例如經修飾及/或內源免疫球蛋白基因座（如人類化λ輕鏈及重鏈基因座）處為同型合子。實例 14 – 重鏈基因之使用及 λ 輕鏈的體細胞超突變頻率
經由所屬領域已知之若干方法可確定自本文所述的包含重排人類Vλ1-51/Jλ2或重排人類Vλ2-14/Jλ2輕鏈可變區且用人類重鏈可變區替代內源重鏈可變區的小鼠之重鏈基因使用。在一個此類方法中，使用次世代定序（Next Generation Sequencing）技術。
分析自小鼠所收穫之脾臟細胞或骨髓（該小鼠係包含上文所述的通用重排人類Vλ1-51/Jλ2或重排人類Vλ2-14/Jλ2輕鏈且用人類重鏈可變區替代內源重鏈可變區），以確定其抗體之重鏈可變區區段的使用。藉由用含有2.5%胎牛血清(FBS)之1x磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS，Gibco)來沖洗股骨，自股骨收集骨髓，且必要時對骨髓細胞利用FACS來分選不同的B細胞亞型。自小鼠脾臟製備單細胞懸浮液。將來自脾臟之紅血球及骨髓製劑用ACK溶解緩衝劑(Gibco)溶解。藉由使用抗CD19 (小鼠，B細胞標記物)磁性珠粒及MACS®管柱(Miltenyi Biotech)進行磁性細胞分選，自全部脾臟細胞正向富集脾臟B細胞。使用RNeasy Plus RNA分離套組(Qiagen)，根據製造商之說明書，自骨髓及純化之脾臟B細胞分離出總RNA。
使用SMARTer™ RACE cDNA擴增套組(Clontech)及IgM或IgG特異性因子進行逆轉錄，以產生含有IgM或IgG恆定區序列之人類重鏈的cDNA。在逆轉錄期間，作為模板轉換(TS)引子之反向補體之DNA序列係附接於新合成cDNA之3′末端。純化之cDNA係藉由兩輪半巢式PCR來擴增，以產生複數個cDNA，該等cDNA係編碼總IgM或IgG可變域補體，該總IgM或IgG可變域補體係由從其中獲得mRNA之細胞來表現；接著進行第三輪PCR，以附接定序引子及標誌。使用Pippin Prep (SAGE Science)對人類可變域cDNA進行尺寸選擇，且藉由qPCR使用KAPA文庫定量套組(KAPA Biosystems)來定量，然後將樣品裝載至MiSeq定序器(Illumina)上進行定序。
對於生物資訊學分析，根據品質、長度及與對應IgM或IgG恆定區基因引子之匹配，將原始Illumina序列進行多路分離（de-muliplexed）及過濾。使用定制內部管線，將重疊雙端讀段合併及分析。管線係使用本地安裝之IgBLAST (NCBI，v2.2.25+)，以比對重排之重鏈序列與人類生殖系重鏈V、D及J基因區段資料庫，且標示產生性接合及非產生性接合以及中止密碼子之存在。使用如國際免疫遺傳資訊系統(International Immunogenetics Information System，IMGT)中定義之邊界提取CDR3序列及預期未模板化核苷酸。
以上方法允許確定多種人類V、D及J區段使用率，以及本文所述之通用重排人類輕鏈小鼠中特定人類VDJ重排的頻率。
類似次世代定序技術可用來確定小鼠λ輕鏈中體細胞超突變之存在及頻率，該小鼠包含通用重排人類Vλ1-51/Jλ2或Vλ2-14/Jλ2輕鏈可變區。舉例而言，對於包含連接至小鼠Cλ (例如Cλ1)恆定區之通用重排人類Vλ1-51/Jλ2或Vλ2-14/Jλ2輕鏈可變區的小鼠，係使用免疫球蛋白Cλ (例如Cλ1)特定引子進行上述反向轉錄PCR，以產生含有免疫球蛋白λ恆定區(例如Cλ1)基因序列之cDNA，且進行生物資訊分析，以比對重排之輕鏈序列與人類生殖系 Vλ及Jλ基因區段資料庫。對於連接至小鼠Cκ恆定區之通用重排人類Vλ1-51/Jλ2或Vλ2-14/Jλ2輕鏈可變區，係改為使用小鼠Cκ特定引子。對λ輕鏈中體細胞超突變之存在及頻率進行定量。實例 15 - 自小鼠產生人類抗體
在包含有限人類λ輕鏈可變區組庫(例如如實例3、6、9及12中所述的重排人類Vλ/Jλ)之小鼠繁殖成含有其他內源Ig基因座之修飾及缺失(如例如實例13中所述)的各種期望品系後，所選小鼠可用感興趣的抗原進行免疫接種。
一般而言，包含有限人類λ輕鏈可變區組庫之小鼠(在其生殖系基因組中包含人類重鏈可變區基因區段且用經工程改造之Vλ1-51/Jλ2人類輕鏈區域或經工程改造之Vλ2-14/Jλ2人類輕鏈區域替代內源小鼠κ輕鏈基因座(如上述)，來移除或不移除內源λ基因座的小鼠)係用感興趣的抗原進行免疫接種。收集血液且藉由標準抗原特異性ELISA免疫分析來監測抗體免疫反應。
當在一種方法中實現期望免疫反應時，收取脾臟細胞(及/或其他淋巴組織)且與小鼠骨髓瘤細胞融合，以保存其活力且形成永生的雜交瘤細胞株。對產生之雜交瘤細胞株進行篩選(例如藉由ELISA分析)且進行選擇，以鑑別產生抗原特異性抗體之雜交瘤細胞株。根據需要，可進一步表徵雜交瘤的相對結合親和力及同型。使用此技術及上述免疫原，獲得若干種抗原特異性嵌合抗體(亦即，具有人類可變域及小鼠恆定域之抗體)。
可替代地，在另一方法中，可直接自抗原特異性B細胞分離出編碼抗原特異性嵌合抗體及/或其λ輕鏈及/或重鏈之可變域的DNA，該抗原特異性嵌合抗體及/或其λ輕鏈及/或重鏈之可變域係由本文中描述及/或例示之經工程改造之小鼠的B細胞所產生。舉例而言，可分離及表徵具有人類可變區及小鼠恆定區之高親和力嵌合抗體，且界定所關注特定抗體(及/或產生其之B細胞)。僅舉幾例，此類抗體及/或其可變及/或恆定區之評定特徵，可為或包括親和力、選擇性、抗原决定基之一致性等的一種或多種。在不與骨髓瘤細胞融合下，直接自抗原陽性B細胞(來自免疫接種小鼠)來分離抗原特異性抗體，係如例如美國專利第7,582,298號中所述，該專利特定地以引用之方式整體併入本文中。
可分離或以其他方式製備編碼重鏈及λ輕鏈之可變區的DNA，且可分別連接於人類重鏈(例如期望同型)及人類λ輕鏈恆定區，以製備完整人類抗體。分離之重鏈及λ輕鏈可變區可進行體細胞突變。此為抗原特異性組庫增添額外多樣性。完整人類抗體(及/或其重鏈或λ輕鏈)可在細胞、通常諸如CHO細胞之哺乳動物細胞中來產生。接著，可表徵完整人類抗體的相對結合親和力及/或感興趣的抗原之中和活性。實例 16 - 雙特異性 抗體之結合親和力
完整人類雙特異性抗體係使用所屬領域已知之標準重組DNA技術，自上述對感興趣的抗原具特異性之所選單特異性抗體的經選殖之人類重鏈可變區來加以構築。簡言之，在合適細胞株中，兩條人類重鏈係與，該兩條人類重鏈包含來自兩個所選之單特異性抗體的人類重鏈可變區，該兩個所選之單特異性抗體係自包含經工程改造之人類Vλ1-51/Jλ2輕鏈或經工程改造之人類Vλ2-14/Jλ2輕鏈區域之小鼠所獲得，該人類輕鏈係包含如小鼠中所存在之相同的λ可變區或其體細胞超突變型式；且獲得包含期望特徵(例如對兩種抗原具有期望之親和力)之雙特異性抗體。
在BIACORE™ 2000儀器(GE Healthcare)上使用即時表面電漿子共振生物感測器分析，來確定對感興趣的抗原具特異性之雙特異性或親本單特異性抗體與該抗原全部或部分結合。某些實施例 實施例1.           一種經基因修飾之嚙齒類動物，其生殖系基因組包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段， 其中由該經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的所有免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式表現。 實施例2.           實施例1之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的生殖系基因組，其該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座係為同型合子。 實施例3.           實施例1之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的該生殖系基因組，其該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座係為異型合子。 實施例4.           實施例1至3中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其生殖系基因組進一步包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，其包含可操作地連接至一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段， 其中由經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現之所有重鏈均包括人類免疫球蛋白重鏈可變域及嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定域。 實施例5.           實施例4之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的該生殖系基因組，其該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座係為同型合子。 實施例6.           實施例1至5中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物在該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座處缺乏嚙齒類動物Cκ基因。 實施例7.           實施例1至6中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。 實施例8.           實施例1至7中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。 實施例9.           實施例4至8中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，係代替一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段、一或多個內源JH 基因區段或其組合。 實施例10.       實施例4至9中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，係分別替代一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段及一或多個內源JH 基因區。 實施例11.       實施例9或10之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因為一或多個內源嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因。 實施例12.       實施例4至11中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中： (i) 該一或多個未重排人類VH 基因區段包含VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2、VH 6-1或其任何組合， (ii) 該一或多個未重排人類DH 基因區段包含DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26、DH 7-27或其任何組合，及 (iii) 該一或多個未重排人類JH 基因區段包含JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5、JH 6或其任何組合。 實施例13.       實施例4至12中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座缺乏功能性內源嚙齒類動物Adam6基因。 實施例14.       實施例4至13中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的該生殖系基因組係包含編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。 實施例15.       實施例14之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段係由該經基因修飾之嚙齒類動物所表現。 實施例16.       實施例14或15之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係包括在與該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座相同的染色體上。 實施例17.       實施例14至16中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座係包含該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。 實施例18.       實施例14至17中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係代替人類Adam6偽基因。 實施例19.       實施例14至18中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係替代人類Adam6偽基因。 實施例20.       實施例14至19中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該一或多個人類VH 基因區段包含第一及第二人類VH 基因區段，且該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係介於該第一人類VH 基因區段與該第二人類VH 基因區段之間。 實施例21.       實施例20之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該第一人類VH 基因區段為VH 1-2且該第二人類VH 基因區段為VH 6-1。 實施例22.       實施例14至17中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係介於人類VH 基因區段與人類DH 基因區段之間。 實施例23.       實施例1至22中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物Cλ基因具有與以下至少80%一致之序列：(i)小鼠Cλ1，(ii)小鼠Cλ2，或(iii)小鼠Cλ3基因。 實施例24.       實施例1至23中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物Cλ基因包含小鼠Cλ基因。 實施例25.       實施例1至中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物23，其中該嚙齒類動物Cλ基因包含小鼠Cλ1基因。 實施例26.       實施例1至22之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物Cλ基因具有與以下至少80%一致之序列：(i)大鼠Cλ1，(ii)大鼠Cλ2，(iii)大鼠Cλ3，或(iv)大鼠Cλ4基因。 實施例27.       實施例1至22中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物Cλ基因係包含大鼠Cλ基因。 實施例28.       實施例1至27中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，係代替一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段或其任何組合。 實施例29.       實施例1至28中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，係替代一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段或其任何組合。 實施例30.       實施例1至29中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其進一步包含未活化的內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。 實施例31.       實施例1至30中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該內源Vλ基因區段、該內源Jλ基因區段及該內源Cλ基因係整體或部分缺失。 實施例32.       實施例1至31中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物其內源免疫球蛋白κ輕鏈可變域的表現係無法偵測。 實施例33.       實施例1至32中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中所有由經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞所表現的免疫球蛋白輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。 實施例34.       實施例1至33中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物為大鼠或小鼠。 實施例35.       一種經基因修飾之嚙齒類動物之繁殖群，其包含第一經基因修飾之嚙齒類動物、第二經基因修飾之嚙齒類動物及第三經基因修飾之嚙齒類動物，其中該第三經基因修飾之嚙齒類動物為該第一經基因修飾之嚙齒類動物及該第二經基因修飾之嚙齒類動物的後代，且其中該第一、第二及第三經基因修飾之嚙齒類動物在其生殖系基因組中各包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段， 其中所有由該第一、第二及第三經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。 實施例36.       實施例35之繁殖群，其中該第一、第二及第三經基因修飾之嚙齒類動物之該等生殖系基因組，其該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座為同型合子。 實施例37.       實施例35或36之繁殖群，其中該第一、第二及第三經基因修飾之嚙齒類動物各者其該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中的該人類Vλ基因區段，係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。 實施例38.       實施例35至37中任一項之繁殖群，其中該第一、第二及第三經基因修飾之嚙齒類動物各者其該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中的該人類Jλ基因區段，係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。 實施例39.       實施例35至38中任一項之繁殖群，其中該第一、第二及第三經基因修飾之嚙齒類動物在其生殖系基因組中各包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，其包含可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段， 其中所有由經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的重鏈，均包括人類免疫球蛋白重鏈可變域及嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定域。 實施例40.       實施例39之繁殖群，其中該第一、第二及第三經基因修飾之嚙齒類動物的該等生殖系基因組，其該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座為同型合子。 實施例41.       一種嚙齒類動物胚胎，其基因組包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。 實施例42.       實施例41之嚙齒類動物胚胎，其中該嚙齒類動物胚胎之該基因組其經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座為同型合子。 實施例43.       實施例41或42之嚙齒類動物胚胎，其中該人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。 實施例44.       實施例44.   實施例41至43中任一項之嚙齒類動物胚胎，其中該人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。 實施例45.       實施例41至44中任一項之嚙齒類動物胚胎，其進一步包含經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座包含可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。 實施例46.       實施例之嚙齒類動物胚胎45，其中該嚙齒類動物胚胎之該基因組其該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座為同型合子。 實施例47.       一種實施例1至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞，其包含： 該經工程改造之內源κ輕鏈基因座的該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。 實施例48.       一種實施例4至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物的B細胞，其包含： 該經工程改造之內源κ輕鏈基因座的該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式；且 源自於該經工程改造之內源重鏈基因座中的該一或多個未重排人類VH 基因區段之人類VH 基因區段、該一或多個未重排人類DH 基因區段之人類DH 基因區段及該一或多個未重排人類JH 基因區段之人類JH 基因區段的重排人類免疫球蛋白重鏈可變區。 實施例49.       一種融合瘤，其由實施例47或48之B細胞所產生。 實施例50.       一種經基因修飾之單個嚙齒類動物之B細胞群體，該經基因修飾之單個嚙齒類動物在其生殖系基因組中包含： (a) 經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段的單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含可操作地連接至人類Jλ基因區段之人類Vλ基因區段，及 (b) 經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，其包含可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段， 其中所有由該B細胞群體表現之抗體均包括： (i) 自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式所表現的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，及 (ii) 自至少兩個不同的重排人類免疫球蛋白重鏈可變區或其體細胞超突變型式所表現的複數個人類免疫球蛋白重鏈可變域。 實施例51.       一種幹細胞，其包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段的單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。 實施例52.       實施例51之幹細胞，其中該幹細胞之該基因組其該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座為同型合子。 實施例53.       實施例51或52之幹細胞，其中該人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。 實施例54.       實施例51至53中任一項之幹細胞，其中該人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。 實施例55.       實施例51至54中任一項之幹細胞，其進一步包含經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座包含可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。 實施例56.       一種表現抗體之哺乳動物細胞，其中該抗體包括包含人類免疫球蛋白重鏈可變域之重鏈及包含人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之輕鏈，其中該人類免疫球蛋白重鏈可變域、該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，或兩者係自實施例4至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物所鑑別。 實施例57.       一種抗體，其藉由包括以下步驟之方法製備： (a) 將實施例1至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原； (b) 維持該經基因修飾之嚙齒類動物處於足以使該經基因修飾之嚙齒類動物對該感興趣的抗原產生免疫反應的條件下；且 (c) 自該經基因修飾之嚙齒類動物回收： (i) 結合該感興趣的抗原之抗體， (ii) 編碼結合該感興趣的抗原之抗體之人類輕鏈或重鏈可變域、輕鏈或重鏈的之核苷酸，或 (iii) 表現結合該感興趣的抗原之抗體之細胞， 其中(c)之抗體係包括人類重鏈可變域及人類λ輕鏈可變域。 實施例58.       一種製造抗體之方法，該方法包括： (a) 將實施例1至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於抗原； (b) 允許該經基因修飾之嚙齒類動物對抗原顯現免疫反應；且 (c) 自該經基因修飾之嚙齒類動物分離對該抗原具特異性之抗體、表現對該抗原具特異性之抗體的B細胞，或編碼對該抗原具特異性之抗體的一或多個核苷酸序列。 實施例59.       一種製造抗體之方法，該方法包括以下步驟： (a) 在哺乳動物細胞中表現包含兩個人類免疫球蛋白λ輕鏈及兩個人類免疫球蛋白重鏈之該抗體，其中各人類免疫球蛋白λ輕鏈包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域且各人類免疫球蛋白重鏈包括人類免疫球蛋白重鏈可變域，其中在實施例1至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物中鑑別該等人類免疫球蛋白重鏈可變域中之至少一者、該等λ輕鏈可變域中之至少一者或其組合的胺基酸序列；以及 (b) 獲得抗體。 實施例60.       實施例58或59之方法，其中該抗體係雙特異性抗體。 實施例61.       一種製造雙特異性抗體之方法，該方法包括： (a) 使根據實施例1至35中任一項之第一經基因修飾之嚙齒類動物與第一抗原之第一抗原决定基接觸， (b) 使根據實施例1至35中任一項之第二經基因修飾之嚙齒類動物與第二抗原之第二抗原决定基接觸， (c) 自該第一經基因修飾之嚙齒類動物分離表現對該第一抗原之該第一抗原决定基具特異性之第一抗體的B細胞，且確定該第一抗體之第一人類免疫球蛋白重鏈可變域； (d) 自該第二經基因修飾之嚙齒類動物分離表現對該第二抗原之該第二抗原决定基具特異性之第二抗體的B細胞，且確定該第二抗體之第二人類免疫球蛋白重鏈可變域； (e) 將編碼該第一人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列可操作地連接至編碼第一人類免疫球蛋白恆定域之核苷酸序列，以產生編碼第一人類重鏈之第一核苷酸序列； (f) 將編碼該第二人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列可操作地連接至編碼第二人類免疫球蛋白恆定域之核苷酸序列，以產生編碼第二人類重鏈之第二核苷酸序列； (g) 在哺乳動物細胞中表現： (i) 第一核苷酸序列； (ii) 第二核苷酸序列；及 (iii) 第三核苷酸序列，該第三核苷酸序列包含可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區的該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。 實施例62.       一種製造雙特異性抗體之方法，該方法包括： (a) 在哺乳動物細胞中表現： (i) 第一核苷酸序列，其包含可操作地連接至第一人類免疫球蛋白恆定區之第一人類免疫球蛋白重鏈可變區； (ii) 第二核苷酸序列，其包含可操作地連接至第二人類免疫球蛋白恆定區之第二人類免疫球蛋白重鏈可變區；及 (iii) 第三核苷酸序列，其包含可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區之人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區； 其中該第一人類免疫球蛋白重鏈可變區係編碼第一人類重鏈可變域，該第一人類重鏈可變域係鑑別自已經第一抗原之第一抗原决定基免疫所接種的第一經基因修飾之嚙齒類動物中的第一抗體，其中該第一抗體特異性结合該第一抗原之該第一抗原决定基；且 其中該第二人類免疫球蛋白重鏈可變區係編碼第二人類重鏈可變域，該第二人類重鏈可變域係鑑別自已經第二抗原之第二抗原决定基免疫所接種的第二經基因修飾之嚙齒類動物中的第二抗體，其中該第二抗體特異性结合該第二抗原之該第二抗原决定基； 其中該第一及第二經基因修飾之嚙齒類動物各為根據實施例4至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物；且 其中該第三核苷酸之該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區為該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。 實施例63.       實施例59或62之方法，其中該第一及第二經基因修飾之嚙齒類動物係相同的經基因修飾之嚙齒類動物。 實施例64.       實施例59或62之方法，其中該第一及第二經基因修飾之嚙齒類動物係不同的經基因修飾之嚙齒類動物。 實施例65.       實施例59至64中任一項之方法，其中該第一及第二抗原係為相同抗原，且該第一及第二抗原决定基係為不同抗原决定基。 實施例66.       實施例59至64中任一項之方法，其中該第一及第二抗原係為不同抗原。 實施例67.       一種製造人類免疫球蛋白重鏈之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將實施例4至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原； (b) 獲得特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物產生之抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列；以及 (c) 將該人類免疫球蛋白重鏈可變域序列可操作地連接至人類免疫球蛋白重鏈恆定域序列以形成人類免疫球蛋白重鏈。 實施例68.       一種人類免疫球蛋白重鏈，其由實施例67之方法所產生。 實施例69.       一種製造人類免疫球蛋白重鏈可變域之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將實施例4至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；及 (b) 獲得抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生。 實施例70.       一種人類免疫球蛋白重鏈可變域，其由實施例69之方法所產生。 實施例71.       一種製造一系列人類免疫球蛋白重鏈可變域之方法，其包含： (a) 將實施例4至35中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原，及 (b) 自該經基因修飾之嚙齒類動物分離出該系列人類免疫球蛋白重鏈可變域， 其中該系列人類免疫球蛋白重鏈可變域各結合於人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式表現，且 其中與該系列中之該等人類免疫球蛋白重鏈可變域中之任一者所配對的該人類λ輕鏈可變域，係結合該抗原。 實施例72.       一種製造人類免疫球蛋白λ輕鏈之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將實施例1至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原； (b) 獲得抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生；以及 (c) 將該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定域序列，以形成人類免疫球蛋白λ輕鏈。 實施例73.       一種人類免疫球蛋白λ輕鏈，其由實施例72之方法所產生。 實施例74.       一種用於產生人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將實施例1至35中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；及 (b) 獲得抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生。 實施例75.       一種人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，其由實施例74之方法所產生。 實施例76.       一種製造編碼人類免疫球蛋白重鏈之核苷酸序列之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將實施例4至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原； (b) 獲得人類免疫球蛋白重鏈可變區，該人類免疫球蛋白重鏈可變區係編碼抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生；以及 (c) 將該人類免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至人類免疫球蛋白重鏈恆定區序列，以形成編碼人類免疫球蛋白重鏈之核苷酸序列。 實施例77.       一種編碼人類免疫球蛋白重鏈之核苷酸序列，其由實施例76之方法所產生。 實施例78.       一種製造包含人類免疫球蛋白重鏈可變區之核苷酸序列之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將實施例4至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；及 (b) 獲得人類免疫球蛋白重鏈可變區，該人類免疫球蛋白重鏈可變區編碼抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生。 實施例79.       一種包含人類免疫球蛋白重鏈可變區之核苷酸序列，其由實施例78之方法所產生。 實施例80.       一種製造編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈之核苷酸序列之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將實施例1至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原； (b) 獲得人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係編碼抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生；且 (c) 將該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區序列以形成編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈之核苷酸序列。 實施例81.       一種編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈之核苷酸序列，其由實施例80之方法所產生。 實施例82.       一種製造包含人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區之核苷酸序列之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將實施例1至34中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物暴露於感興趣的抗原；及 (b) 獲得人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係編碼抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生。 實施例83.       一種包含人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區之核苷酸序列，其由實施例82方法所產生。 實施例84.       一種靶向載體，其包含： (i) 5'同源臂，其包含與內源嚙齒類動物κ輕鏈基因座中之5'目標序列相對應的核苷酸序列； (ii) 單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包含Vλ基因區段及Jλ基因區段； (iii) 嚙齒類動物Cλ基因區段；及 (iv) 3'同源臂，其包含與內源嚙齒類動物κ輕鏈基因座中之3'目標序列相對應的核苷酸序列。 實施例85.       實施例84之靶向載體，其中該人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。 實施例86.       實施例84或85之靶向載體，其中該人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。 實施例87.       一種製造經基因修飾之嚙齒類動物之方法，其包括以下步驟： (a) 將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中；及 (b) 使用步驟(a)中所產生之該嚙齒類動物ES細胞來產生嚙齒類動物。 實施例88.       一種製造經基因修飾之嚙齒類動物之方法，其包括以下步驟： (a) 將可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段；及 (b) 使用步驟(a)中所產生之該嚙齒類動物ES細胞來產生嚙齒類動物。 實施例89.       實施例87或88之方法，其中該嚙齒類動物ES細胞之基因組在經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座處，係包含可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。 實施例90.       一種製造經基因修飾之嚙齒類動物ES細胞之方法，其包括以下步驟： 將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。 實施例91.       實一種製造經基因修飾之嚙齒類動物ES細胞之方法，其包括以下步驟： 將可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。 實施例92.       實施例90或91之方法，其中該嚙齒類動物ES細胞之基因組在經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座處包含： 可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段。 實施例93.       一種製造經基因修飾之嚙齒類動物之方法，其包括以下步驟： (a) 對嚙齒類動物之生殖系基因組中的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座進行工程改造以包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段， 使得所有由該經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。 實施例94.       實施例93之方法，其中該方法進一步包括以下步驟： (b) 對嚙齒類動物之生殖系基因組中的內源免疫球蛋白重鏈基因座進行工程改造，以包含可操作地連接至一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段， 使得所有由該經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的重鏈，均包括人類免疫球蛋白重鏈可變域及嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定域。 實施例95.       實施例93或94之方法，其中步驟(a)及/或步驟(b)係在嚙齒類動物ES細胞中進行。 實施例96.       實施例93至95中任一項之方法，其中該內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座缺乏嚙齒類動物Cκ基因。 實施例97.       實施例93至96中任一項之方法，其中該人類Vλ基因區段係選自由以下組成之群組：Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21及Vλ2-14。 實施例98.       實施例93至97中任一項之方法，其中該人類Jλ基因區段係選自由以下組成之群組：Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6及Jλ7。 實施例99.       實施例94至98中任一項之方法，其中該一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，係代替一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段、一或多個內源JH 基因區段或其組合。 實施例100.   實施例94至99中任一項之方法，其中該一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，係分別替代一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段及一或多個內源JH 基因區段。 實施例101.   實施例94至100中任一項之方法，其中該一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因為一或多個內源嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因。 實施例102.   實施例94至101中任一項之方法，其中： (i) 該一或多個未重排人類VH 基因區段包含VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2、VH 6-1或其任何組合， (ii) 該一或多個未重排人類DH 基因區段包含DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26、DH 7-27或其任何組合，及 (iii) 該一或多個未重排人類JH 基因區段包含JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5、JH 6或其任何組合。 實施例103.   實施例94至102中任一項之方法，其中該內源免疫球蛋白重鏈基因座係缺乏功能性內源嚙齒類動物Adam6基因。 實施例104.   實施例94至103中任一項之方法，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的生殖系基因組，係包含編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。 實施例105.   實施例104之方法，其中該一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段，係由該經基因修飾之嚙齒類動物所表現。 實施例106.   實施例104或105之方法，其中該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係包括在與該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座相同的染色體上。 實施例107.   實施例104至106中任一項之方法，其中該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，係包含該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。 實施例108.   實施例104至107中任一項之方法，其中該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係代替人類Adam6偽基因。 實施例109.   實施例104至108中任一項之方法，其中該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係替代人類Adam6偽基因。 實施例110.   實施例104至109中任一項之方法，其中該一或多個人類VH 基因區段係包含第一及第二人類VH 基因區段，且該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係介於該第一人類VH 基因區段與該第二人類VH 基因區段之間。 實施例111.   實施例110之方法，其中該第一人類VH 基因區段為VH 1-2，且該第二人類VH 基因區段為VH 6-1。 實施例112.   實施例104至111中任一項之方法，其中該編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列，係介於人類VH 基因區段與人類DH 基因區段之間。 實施例113.   實施例93至112中任一項之方法，其中該嚙齒類動物Cλ基因具有與以下至少80%一致之序列：(i)小鼠Cλ1，(ii)小鼠Cλ2，或(iii)小鼠Cλ3基因。 實施例114.   實施例93至113中任一項之方法，其中該嚙齒類動物Cλ基因包含小鼠Cλ基因。 實施例115.   實施例93至114中任一項之方法，其中該嚙齒類動物Cλ基因包含小鼠Cλ1基因。 實施例116.   實施例93至112中任一項之方法，其中該嚙齒類動物Cλ基因具有與以下至少80%一致之序列：(i)大鼠Cλ1，(ii)大鼠Cλ2, (iii)大鼠Cλ3,或(iv)大鼠Cλ4基因。 實施例117.   實施例93至112中任一項之方法，其中該嚙齒類動物Cλ基因包含大鼠Cλ基因。 實施例118.   實施例93至117中任一項之方法，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，係代替一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段或其任何組合。 實施例119.   實施例93至118中任一項之方法，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，係替代一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段，或其任何組合。 實施例120.   實施例93至119中任一項之方法，其中該嚙齒類動物之生殖系基因組進一步包含未活化的內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。 實施例121.   實施例93至120中任一項之方法，其中該內源Vλ基因區段、該內源Jλ基因區段及該內源Cλ基因，係整體或部分缺失。 實施例122.   實施例93至121中任一項之方法，其中該嚙齒類動物為大鼠或小鼠。等效物
所屬領域之技術人員應瞭解，所屬領域之技術人員容易想起對本文之多種改變、修改及改良。此類改變、修改及改良意欲為本文之一部分，且意欲在本發明之精神及範疇內。因此，以上描述及圖式僅作為示例，且本文中描述之任何發明由隨後申請專利範圍進一步詳細描述。
所屬領域之技術人員將瞭解典型標准偏差或誤差可歸因於在分析或如本文所述之其他方法中獲得的值。本文中提及之描述本發明背景及提供有關本發明實施之額外細節的公開案、網站及其他參考資料以引用之方式整體併入本文中。
無
由以下圖構成之本文中所包括之圖式，僅係出於說明之目的，且非限制性者。
圖 1A 及圖 1B 顯示構築用於產生根據本文之非人類動物之一實施例的靶向載體(實例1及4中描述)之策略之一例示性實施例(不按比例)的圖。除非圖中之標記另外表示(例如關於選擇卡匣、loxP位點等)，否則實心形狀及單線代表小鼠序列，且空心形狀及雙線代表人類序列。「FRT」指示Frt重組酶系統位點；「UB-NEO」指示具有UB啟動子之新黴素抗性基因；「enh」指示强化子；「Ei」指示內含子强化子；「3'E」指示3'强化子；「SPEC」指示壯觀黴素抗性基因；「SD」指示剪接供體位點；「CDS」指示編碼序列；「lox」指示lox2372位點；「loxP」指示lox P位點；及「UB-HYG」指示具有UB啟動子之潮黴素抗性基因。
圖 2A 及圖 2B 顯示構築用於產生根據本文之非人類動物之一實施例的靶向載體(實例7及10中描述)之策略之一例示性實施例(不按比例)的圖。除非圖中之標記另外表示(例如關於選擇卡匣、loxP位點等)，否則實心形狀及單線代表小鼠序列，且空心形狀及雙線代表人類序列。「FRT」指示Frt重組酶系統位點；「UB-NEO」指示具有UB啟動子之新黴素抗性基因；「enh」指示强化子；「Ei」指示內含子强化子；「3'E」指示3'强化子；「SPEC」指示壯觀黴素抗性基因；「SD」指示剪接供體位點；「CDS」指示編碼序列；「lox」指示lox2372位點；「loxP」指示lox P位點；及「UB-HYG」指示具有UB啟動子之潮黴素抗性基因。
圖 3 顯示靶向載體A (如實例1中所述)插入嚙齒類動物胚胎幹(ES)細胞殖株之經工程改造之Igκ輕鏈基因座(如實例2中所述)中的圖(不按比例)，該ES細胞殖株用於產生根據本文之嚙齒類動物之一實施例。圖中包括用於證實胚胎幹(ES)細胞殖株對某些示例性序列呈陽性之各種探針(藉由圓形破折號指示)的大致位置。除非圖中之標記另外表示(例如關於選擇卡匣、loxP位點等)，否則實心形狀及單線代表小鼠序列，且空心形狀及雙線代表人類序列。「FRT」指示Frt重組酶系統位點；「UB-NEO」指示具有UB啟動子之新黴素抗性基因；「Ei」指示內含子强化子；「3'E」指示3'强化子；及「SD」指示剪接供體位點。「Het」指示異型接合小鼠，「ho」指示同型接合小鼠。
圖 4 顯示靶向載體B (如實例4中所述)插入嚙齒類動物胚胎幹(ES)細胞殖株之經工程改造之Igκ輕鏈基因座(如實例5中所述)中的圖(不按比例)，該ES細胞殖株用於產生根據本文之嚙齒類動物之一實施例。圖中包括用於證實胚胎幹(ES)細胞殖株對某些示例性序列呈陽性之各種探針(藉由圓形破折號指示)的大致位置。除非圖中之標記另外表示(例如關於選擇卡匣、loxP位點等)，否則實心形狀及單線代表小鼠序列，且空心形狀及雙線代表人類序列。「FRT」指示Frt重組酶系統位點；「UB-NEO」指示具有UB啟動子之新黴素抗性基因；「Ei」指示內含子强化子；「3'E」指示3'强化子；「SD」指示剪接供體位點；「loxP」指示lox P位點；及「UB-HYG」指示具有UB啟動子之潮黴素抗性基因。「Het」指示異型接合小鼠，「ho」指示同型接合小鼠。
圖 5 顯示靶向載體C (如實例7中所述)插入嚙齒類動物胚胎幹(ES)細胞殖株之經工程改造之Igκ輕鏈基因座(如實例8中所述)中的圖(不按比例)，該ES細胞殖株用於產生根據本文之嚙齒類動物之一實施例。圖中包括用於證實胚胎幹(ES)細胞殖株對某些示例性序列呈陽性之各種探針(藉由圓形破折號指示)的大致位置。除非圖中之標記另外表示(例如關於選擇卡匣、loxP位點等)，否則實心形狀及單線代表小鼠序列，且空心形狀及雙線代表人類序列。「FRT」指示Frt重組酶系統位點；「UB-NEO」指示具有UB啟動子之新黴素抗性基因；「Ei」指示內含子强化子；「3'E」指示3'强化子；及「SD」指示剪接供體位點。「Het」指示異型接合小鼠，「ho」指示同型接合小鼠。
圖 6 顯示靶向載體D (如實例10中所述)插入嚙齒類動物胚胎幹(ES)細胞殖株之經工程改造之Igκ輕鏈基因座(如實例11中所述)中的圖(不按比例)，該ES細胞殖株用於產生根據本文之嚙齒類動物之一實施例。圖中包括用於證實胚胎幹(ES)細胞殖株對某些示例性序列呈陽性之各種探針(藉由圓形破折號指示)的大致位置。除非圖中之標記另外表示(例如關於選擇卡匣、loxP位點等)，否則實心形狀及單線代表小鼠序列，且空心形狀及雙線代表人類序列。「FRT」指示Frt重組酶系統位點；「UB-NEO」指示具有UB啟動子之新黴素抗性基因；「Ei」指示內含子强化子；「3'E」指示3'强化子；「SD」指示剪接供體位點；「loxP」指示lox P位點；及「UB-HYG」指示具有UB啟動子之潮黴素抗性基因。「Het」指示異型接合小鼠，「ho」指示同型接合小鼠。
圖 7 顯示小鼠Cκ之核苷酸序列(SEQ ID NO: 25)。編碼序列由粗體字母表示，且3'未轉譯區未加粗。
圖 8 顯示大鼠Cκ之核苷酸序列(SEQ ID NO: 27)。編碼序列由粗體字母表示，且3'未轉譯區未加粗。
圖 9A 至 -9C 顯示經工程改造之Vλ1-51/Jλ2載體(SEQ ID NO: 31)之核苷酸序列。限制酶位點序列-AscI (序列5'末端)及PI-SceI (序列3'末端)以大寫斜體字母表示；Vλ1-51啟動子序列由小寫字母(非粗體)表示；Vλ1 51 5' UTR序列由大寫、斜體且粗體字母表示；重排之Vλ1-51/Jλ2序列，其包括：Vλ1-51外顯子1序列由大寫字母(非粗體)表示，其中Vλ1-51外顯子1起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線；Vλ1-51內含子1序列由小寫粗體字母表示；Vλ1-51外顯子2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃實線)字母表示，且Jλ2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃虛線))字母表示；且人類Jκ5-Cκ內含子序列由小寫斜體字母表示。
圖 10 顯示包括Vλ1-51內含子之重排之Vλ1-51/Jλ2可變區的核苷酸序列(SEQ ID NO: 32)。Vλ1-51外顯子1序列由大寫字母表示，其中Vλ1-51外顯子1起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線；Vλ1-51內含子1序列由小寫粗體字母表示；Vλ1-51外顯子2序列由大寫粗體且加下劃線(下劃實線)字母表示；且Jλ2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃虛線)字母表示。
圖 11 顯示無Vλ1-51內含子之重排之Vλ1-51/Jλ2可變區的核苷酸序列(SEQ ID NO: 33)。Vλ1-51編碼序列由大寫字母表示，其中Vλ1-51起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線；且Jλ2序列由大寫字母及下劃虛線表示。
圖 12 顯示包括信號序列之重排之Vλ1-51/Jλ2可變區的核苷酸序列(SEQ ID NO: 34)。斜體粗體字指示信號肽之序列。
圖 13A-13C 顯示經工程改造之Vλ2-14/Jλ2載體之核苷酸序列(SEQ ID NO: 36)。限制酶位點序列-AscI (序列5'末端)及PI-SceI (序列3'末端)以大寫斜體字母表示；Vλ1-51啟動子序列由小寫字母(非粗體)表示；Vλ1 51 5' UTR序列由大寫、斜體且粗體字母表示；重排之Vλ2-14/Jλ2序列，其包括：Vλ2-14外顯子1序列由大寫字母(非粗體)表示，其中Vλ2-14外顯子1起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線；Vλ2-14內含子1序列由小寫粗體字母表示；Vλ2-14、外顯子2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃實線)字母表示，且Jλ2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃虛線))字母表示；且人類Jκ5-Cκ內含子序列由小寫斜體字母表示。
圖 14 顯示包括Vλ2-14內含子之重排之Vλ2-14/Jλ2可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO:37)。Vλ2-14外顯子1序列由大寫字母表示，其中Vλ2-14外顯子1起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線；Vλ2-14內含子1序列由小寫、粗體字母表示；Vλ1-51外顯子2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃實線)字母表示；且Jλ2序列由大寫、粗體且加下劃線(下劃虛線)字母表示。
圖 15 顯示無Vλ2-14內含子之重排之Vλ2-14/Jλ2可變區的核苷酸序列(SEQ ID NO: 38)。Vλ2-14序列由大寫字母表示，其中Vλ2-14起始密碼子進一步用斜體表示且加下劃線；且Jλ2序列由大寫字母及下劃虛線表示。
圖 16 顯示包括信號肽之重排之Vλ2-14/Jλ2可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 39)。斜體粗體字指示信號肽之序列。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034

Claims (52)

  1. 一種經基因修飾之嚙齒類動物，其生殖系基因組包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段， 其中由該經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的所有免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式表現。
  2. 如請求項1之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的該生殖系基因組，其該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座係為同型合子。
  3. 如請求項1之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的該生殖系基因組，其該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座係為異型合子。
  4. 如請求項1至3中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其生殖系基因組進一步包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，其包含可操作地連接至一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段， 其中所有由該經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞所表現的重鏈，均包括人類免疫球蛋白重鏈可變域及嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定域。
  5. 如請求項4之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的該生殖系基因組，其該經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座係為同型合子。
  6. 如請求項1至5中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物在該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座處缺乏嚙齒類動物Cκ基因。
  7. 如請求項1至6中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該人類Vλ基因區段包含Vλ1-51、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ1-40、Vλ3-21或Vλ2-14。
  8. 如請求項1至7中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該人類Vλ基因區段包含Vλ1-51。
  9. 如請求項1至7中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該人類Vλ基因區段包含Vλ2-14。
  10. 如請求項1至9中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該人類Jλ基因區段包含Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7。
  11. 如請求項1至10中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該人類Jλ基因區段包含Jλ2。
  12. 如請求項4至11中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，係代替一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段、一或多個內源JH 基因區段或其組合。
  13. 如請求項4至12中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段，係分別替代一或多個內源VH 基因區段、一或多個內源DH 基因區段及一或多個內源JH 基因區段。
  14. 如請求項12或13之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該一或多個嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因為一或多個內源嚙齒類動物免疫球蛋白重鏈恆定區基因。
  15. 如請求項4至14中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中： (i) 該一或多個未重排人類VH 基因區段包含VH 3-74、VH 3-73、VH 3-72、VH 2-70、VH 1-69、VH 3-66、VH 3-64、VH 4-61、VH 4-59、VH 1-58、VH 3-53、VH 5-51、VH 3-49、VH 3-48、VH 1-46、VH 1-45、VH 3-43、VH 4-39、VH 4-34、VH 3-33、VH 4-31、VH 3-30、VH 4-28、VH 2-26、VH 1-24、VH 3-23、VH 3-21、VH 3-20、VH 1-18、VH 3-15、VH 3-13、VH 3-11、VH 3-9、VH 1-8、VH 3-7、VH 2-5、VH 7-4-1、VH 4-4、VH 1-3、VH 1-2、VH 6-1或其任何組合， (ii) 該一或多個未重排人類DH 基因區段包含DH 1-1、DH 2-2、DH 3-3、DH 4-4、DH 5-5、DH 6-6、DH 1-7、DH 2-8、DH 3-9、DH 3-10、DH 5-12、DH 6-13、DH 2-15、DH 3-16、DH 4-17、DH 6-19、DH 1-20、DH 2-21、DH 3-22、DH 6-25、DH 1-26、DH 7-27或其任何組合，以及 (iii)  該一或多個未重排人類JH 基因區段包含JH 1、JH 2、JH 3、JH 4、JH 5、JH 6或其任何組合。
  16. 如請求項4至15中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經基因修飾之嚙齒類動物的該生殖系基因組，係包含編碼一或多種嚙齒類動物ADAM6多肽、其功能直系同源物、功能同源物或功能片段之一或多個核苷酸序列。
  17. 如請求項1至16中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物Cλ基因具有與以下至少80%一致之序列：(i)小鼠Cλ1，(ii)小鼠Cλ2，或(iii)小鼠Cλ3基因。
  18. 如請求項1至17中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物Cλ基因包含小鼠Cλ基因。
  19. 如請求項1至17中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物Cλ基因包含小鼠Cλ1基因。
  20. 如請求項1至19中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係代替一或多個嚙齒類動物Vκ基因區段、一或多個嚙齒類動物Jκ基因區段或其任何組合。
  21. 如請求項1至20中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其進一步包含未活化的內源免疫球蛋白λ輕鏈基因座。
  22. 如請求項1至21中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中所有由該經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞所表現的免疫球蛋白輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
  23. 如請求項1至22中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座進一步包含一或多個內源强化子，該一或多個內源强化子係位於其在該內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中之內源位置。
  24. 如請求項1至23中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物，其中該嚙齒類動物為大鼠或小鼠。
  25. 一種經基因修飾之小鼠，其生殖系基因組包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至小鼠Cλ1基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ1-51基因區段及人類Jλ2基因區段， 其中所有由該經基因修飾之小鼠之B細胞所表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
  26. 一種經基因修飾之小鼠，其生殖系基因組包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至小鼠Cλ1基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ2-14基因區段及人類Jλ2基因區段， 其中所有由該經基因修飾之小鼠之B細胞表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
  27. 一種嚙齒類動物胚胎，其基因組包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。
  28. 一種如請求項1至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠的B細胞，其包含： 該經工程改造之內源κ輕鏈基因座的該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
  29. 一種融合瘤，其由如請求項28之B細胞所產生。
  30. 一種單個經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞群體，其中該嚙齒類動物在其生殖系基因組中包含： (a) 經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含可操作地連接至人類Jλ基因區段之人類Vλ基因區段，及 (b) 經工程改造之內源免疫球蛋白重鏈基因座，其包含可操作地連接至一或多個內源免疫球蛋白重鏈恆定區基因的一或多個未重排人類VH 基因區段、一或多個未重排人類DH 基因區段及一或多個未重排人類JH 基因區段， 其中所有由該B細胞群體表現之抗體均包括： (i) 人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式，及 (ii) 複數個人類免疫球蛋白重鏈可變域，該複數個人類免疫球蛋白重鏈可變域係表現自至少兩個不同的重排人類免疫球蛋白重鏈可變區或其體細胞超突變型式。
  31. 一種胚胎幹細胞，其包含經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，該經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。
  32. 一種表現抗體之哺乳動物細胞，其中該抗體包括包含人類免疫球蛋白重鏈可變域之重鏈及包含人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之輕鏈，其中該人類免疫球蛋白重鏈可變域、該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域或兩者係自如請求項4至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠中所鑑定者。
  33. 一種製造抗體之方法，該方法包括： (a) 將如請求項1至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於抗原； (b) 允許該經基因修飾之嚙齒類動物對該抗原顯現免疫反應；以及 (c) 自該經基因修飾之嚙齒類動物分離出對該抗原具特異性之抗體、表現對該抗原具特異性之抗體的B細胞、或編碼對該抗原具特異性之抗體的一或多個核苷酸序列。
  34. 一種製造抗體之方法，該方法包括以下步驟： (a) 在哺乳動物細胞中表現包含兩個人類免疫球蛋白λ輕鏈及兩個人類免疫球蛋白重鏈之該抗體，其中各人類免疫球蛋白λ輕鏈包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域且各人類免疫球蛋白重鏈包括人類免疫球蛋白重鏈可變域，其中鑑該等人類免疫球蛋白重鏈可變域中之至少一者、該等λ輕鏈可變域中之至少一者或其組合的胺基酸序列，係如請求項4至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠中所鑑定者；以及 (b) 獲得該抗體。
  35. 一種製造雙特異性抗體之方法，該方法包括： (a) 將根據請求項4至26中任一項之第一經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠與第一抗原之第一抗原决定基接觸， (b) 將根據請求項4至26中任一項之第二經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠與第二抗原之第二抗原决定基接觸， (c) 自該第一經基因修飾之嚙齒類動物分離出B細胞，該B細胞係表現對該第一抗原之該第一抗原决定基具特異性之第一抗體，並確定該第一抗體之第一人類免疫球蛋白重鏈可變域； (d) 自該第二經基因修飾之嚙齒類動物分離出B細胞，該B細胞係表現對該第二抗原之該第二抗原决定基具特異性之第二抗體，並確定該第二抗體之第二人類免疫球蛋白重鏈可變域； (e) 將編碼該第一人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列可操作地連接至編碼第一人類免疫球蛋白恆定域之核苷酸序列，以產生編碼第一人類重鏈之第一核苷酸序列； (f) 將編碼該第二人類免疫球蛋白重鏈可變域之核苷酸序列可操作地連接至編碼第二人類免疫球蛋白恆定域之核苷酸序列，以產生編碼第二人類重鏈之第二核苷酸序列； (g) 在哺乳動物細胞中表現： (i) 該第一核苷酸序列； (ii) 該第二核苷酸序列；及 (iii) 第三核苷酸序列，其包含可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區之該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
  36. 一種製造雙特異性抗體之方法，該方法包括： (a) 在哺乳動物細胞中表現： (i) 第一核苷酸序列，其包含可操作地連接至第一人類免疫球蛋白恆定區之第一人類免疫球蛋白重鏈可變區； (ii) 第二核苷酸序列，其包含可操作地連接至第二人類免疫球蛋白恆定區之第二人類免疫球蛋白重鏈可變區；及 (iii) 第三核苷酸序列，其包含可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區之人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區； 其中該第一人類免疫球蛋白重鏈可變區編碼自第一經基因修飾之嚙齒類動物中之第一抗體所鑑定出的第一人類重鏈可變域，該第一經基因修飾之嚙齒類動物係已被第一抗原之第一抗原决定基免疫接種，其中該第一抗體係特異性結合該第一抗原之該第一抗原决定基；且 其中該第二人類免疫球蛋白重鏈可變區編碼自第二經基因修飾之嚙齒類動物中之第二抗體所鑑定出的第二人類重鏈可變域，該第二經基因修飾之嚙齒類動物係已被第二抗原之第二抗原决定基免疫接種，其中該第二抗體係特異性結合該第二抗原之該第二抗原决定基； 其中該第一及第二經基因修飾之嚙齒類動物各為根據請求項4至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠；且 其中該第三核苷酸之該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區為該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
  37. 一種製造人類免疫球蛋白重鏈之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將如請求項4至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原； (b) 獲得抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所所產生；以及 (c) 將該人類免疫球蛋白重鏈可變域序列可操作地連接至人類免疫球蛋白重鏈恆定域序列，以形成人類免疫球蛋白重鏈。
  38. 一種製造人類免疫球蛋白重鏈可變域之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將如請求項4至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原；及 (b) 獲得抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生。
  39. 一種製造一系列人類免疫球蛋白重鏈可變域之方法，其包括 (a) 將如請求項4至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原，及 (b) 自該經基因修飾之嚙齒類動物分離出該系列人類免疫球蛋白重鏈可變域， 其中該系列人類免疫球蛋白重鏈可變域各結合於人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式表現，且 其中與該系列中之該等人類免疫球蛋白重鏈可變域中之任一者配對的該人類λ輕鏈可變域係結合該抗原。
  40. 一種製造人類免疫球蛋白λ輕鏈之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將如請求項1至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原； (b) 獲得抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生；以及 (c) 將該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定域序列，以形成人類免疫球蛋白λ輕鏈。
  41. 一種產生人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將如請求項1至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原；及 (b) 獲得抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列，該抗體係特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生。
  42. 一種製造編碼人類免疫球蛋白重鏈之核苷酸序列之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將如請求項4至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原； (b) 獲得人類免疫球蛋白重鏈可變區，該人類免疫球蛋白重鏈可變區係編碼特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物產生之抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列；以及 (c) 將該人類免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至人類免疫球蛋白重鏈恆定區序列，以形成編碼人類免疫球蛋白重鏈之核苷酸序列。
  43. 一種製造包含人類免疫球蛋白重鏈可變區之核苷酸序列之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將如請求項4至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原；及 (b) 獲得人類免疫球蛋白重鏈可變區，該人類免疫球蛋白重鏈可變區係編碼特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生之抗體的人類免疫球蛋白重鏈可變域序列。
  44. 一種製造編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈之核苷酸序列之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將如請求項1至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原； (b) 獲得人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係編碼特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物產生之抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列；以及 (c) 將該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區可操作地連接至人類免疫球蛋白λ輕鏈恆定區序列，以形成編碼人類免疫球蛋白λ輕鏈之核苷酸序列。
  45. 一種製造包含人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區之核苷酸序列之方法，該方法包括以下步驟： (a) 將如請求項1至26中任一項之經基因修飾之嚙齒類動物或小鼠暴露於感興趣的抗原；及 (b) 獲得人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，該人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區係編碼特異性結合該抗原且由該經基因修飾之嚙齒類動物所產生之抗體的人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域序列。
  46. 一種靶向載體，其包含： (i) 5'同源臂，其包含與內源嚙齒類動物κ輕鏈基因座中之5'目標序列相對應的核苷酸序列； (ii) 單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其包含Vλ基因區段及Jλ基因區段； (iii) 嚙齒類動物Cλ基因區段；及 (iv) 3'同源臂，其包含與該內源嚙齒類動物κ輕鏈基因座中之3'目標序列相對應的核苷酸序列。
  47. 一種製造經基因修飾之嚙齒類動物之方法，其包括以下步驟： (a) 將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中；及 (b) 使用步驟(a)中所產生之該嚙齒類動物ES細胞，來產生嚙齒類動物。
  48. 一種製造經基因修飾之嚙齒類動物之方法，其包括以下步驟： (a) 將可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段；及 (b) 使用步驟(a)中所產生之嚙齒類動物ES細胞，來產生嚙齒類動物。
  49. 一種製造經基因修飾之嚙齒類動物ES細胞之方法，其包括以下步驟： 將包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中。
  50. 一種製造經基因修飾之嚙齒類動物ES細胞之方法，其包括以下步驟： 將可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區引入嚙齒類動物ES細胞之基因組中的經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座中，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。
  51. 一種製造經基因修飾之嚙齒類動物之方法，其包括以下步驟： (a) 對該嚙齒類動物之生殖系基因組中的內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座進行工程改造，以包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段， 使得所有由該經基因修飾之嚙齒類動物之B細胞表現的免疫球蛋白λ輕鏈，均包括人類免疫球蛋白λ輕鏈可變域，該類免疫球蛋白λ輕鏈可變域係表現自該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區或其體細胞超突變型式。
  52. 一種活體外產生重組嚙齒類動物細胞之方法，其包括對該重組嚙齒類動物細胞之基因組進行修飾，以包含： 經工程改造之內源免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其包含可操作地連接至嚙齒類動物Cλ基因區段之單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區，其中該單一重排人類免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含人類Vλ基因區段及人類Jλ基因區段。
TW109118837A 2019-06-05 2020-06-04 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途 TW202110323A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962857712P 2019-06-05 2019-06-05
US62/857,712 2019-06-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202110323A true TW202110323A (zh) 2021-03-16

Family

ID=71895172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109118837A TW202110323A (zh) 2019-06-05 2020-06-04 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20220330532A1 (zh)
EP (1) EP3979790A1 (zh)
JP (1) JP2022535418A (zh)
KR (1) KR20220016880A (zh)
CN (1) CN113874511A (zh)
AU (1) AU2020289554A1 (zh)
BR (1) BR112021023683A2 (zh)
CA (1) CA3136478A1 (zh)
IL (1) IL288516A (zh)
MA (1) MA56117A (zh)
MX (1) MX2021014893A (zh)
SG (1) SG11202111258TA (zh)
TW (1) TW202110323A (zh)
WO (1) WO2020247623A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3187680A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Yashu Liu Identification and production of antigen-specific antibodies
KR20230147048A (ko) 2020-12-16 2023-10-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 Fc 알파 수용체를 발현하는 마우스
WO2023179620A1 (en) * 2022-03-21 2023-09-28 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin and mhc loci

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2003047336A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Abgenix, Inc. TRANSGENIC ANIMALS BEARING HUMAN Igμ LIGHT CHAIN GENES
PT1802193E (pt) 2004-10-19 2014-06-23 Regeneron Pharma Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética
ES2398076T3 (es) 2006-06-02 2013-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos de alta afinidad contra el receptor de IL-6 humano
DK2346994T3 (da) 2008-09-30 2022-02-28 Ablexis Llc Knock-in-mus til fremstilling af kimære antistoffer
MX2011014008A (es) 2009-06-26 2012-06-01 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original.
ES2547142T5 (es) 2010-02-08 2021-12-09 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
PT3034608T (pt) 2010-06-22 2019-05-28 Regeneron Pharma Ratinhos expressando uma cadeia leve híbrida de imunoglobulina com uma região variável humana
KR101387377B1 (ko) 2011-02-25 2014-04-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ａｄａｍ６ 마우스
PL3572517T3 (pl) 2011-08-05 2021-10-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Myszy z humanizowanym uniwersalnym łańcuchem lekkim
US10246509B2 (en) 2011-10-17 2019-04-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Restricted immunoglobulin heavy chain mice
RU2664181C2 (ru) * 2011-12-20 2018-08-15 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Мыши с гуманизированной легкой цепью
EP2883449B1 (en) 2012-03-16 2018-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
ES2904803T3 (es) 2013-02-20 2022-04-06 Regeneron Pharma Modificación genética de ratas
PT2840892T (pt) * 2013-02-20 2018-07-20 Regeneron Pharma Animais não humanos com sequências da cadeia pesada da imunoglobulina modificada
SG11201506294TA (en) * 2013-03-13 2015-09-29 Regeneron Pharma Common light chain mouse
PT3456831T (pt) 2013-04-16 2021-09-10 Regeneron Pharma Modificação alvejada do genoma de rato
PT3155099T (pt) 2014-06-23 2018-04-20 Regeneron Pharma Montagem de dna mediada por nuclease
KR20230070319A (ko) 2014-11-21 2023-05-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
BR112017013104A2 (pt) 2014-12-19 2018-05-15 Regeneron Pharma métodos para modificar um locus genômico alvo em uma célula, para intensificar a recombinação homóloga em um locus genômico alvo em uma célula e para produzir uma geração f0 de um animal não humano.
CN116458475A (zh) 2016-06-03 2023-07-21 瑞泽恩制药公司 表达外源末端脱氧核苷酸转移酶的非人动物
GB201710984D0 (en) * 2017-07-07 2017-08-23 Kymab Ltd Cells, vertebrates, populations & methods

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021023683A2 (pt) 2022-02-01
CN113874511A (zh) 2021-12-31
EP3979790A1 (en) 2022-04-13
WO2020247623A1 (en) 2020-12-10
SG11202111258TA (en) 2021-11-29
KR20220016880A (ko) 2022-02-10
IL288516A (en) 2022-01-01
US20220330532A1 (en) 2022-10-20
MA56117A (fr) 2022-04-13
JP2022535418A (ja) 2022-08-08
AU2020289554A1 (en) 2021-11-18
MX2021014893A (es) 2022-03-11
CA3136478A1 (en) 2020-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7430636B2 (ja) 操作された免疫グロブリンラムダ軽鎖を有する非ヒト動物及びその使用
JP7386292B2 (ja) 操作されたイムノグロブリンラムダ軽鎖座位を有する非ヒト動物
TW202110323A (zh) 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途
JP2024019660A (ja) 免疫グロブリン重鎖コーディング配列におけるｄｈ－ｄｈ再構成が可能な非ヒト動物
RU2801802C2 (ru) Животные, отличные от человека, способные к dh-dh-перегруппировке сконструированных генных сегментов, и пути их применения
TWI840372B (zh) 可改造dh-dh重排之非人類動物及其用途
RU2778410C2 (ru) Животные, не являющиеся человеком, имеющие сконструированную легкую цепь лямбда иммуноглобулина, и их применение