PT1802193E

PT1802193E - Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética

Info

Publication number: PT1802193E
Application number: PT58074808T
Authority: PT
Inventors: William Poueymirou; Thomas M Dechiara; Wojtek Auerbach; David Frendewey; David M Valenzuela
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2014-06-23
Also published as: HK1200269A1; US20080078001A1; AU2005295269A1; CY1120496T1; US20160316729A1; PL1802193T3; EP1802193A1; US7659442B2; SI1802193T1; JP5252922B2; DK1802193T3; EP2767161B1; AU2005295269B2; DK2767161T3; US7294754B2; ES2667169T3; CA2583750A1; US20170295762A1; WO2006044962A1; JP2008516633A

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA GERAR UM MURGANHO HOMOZIGÓTICO PARA UMA MODIFICAÇÃO GENÉTICA"

Domínio da Invenção A invenção diz respeito a métodos melhorados para gerar um murganho homozigótico ou heterozigótico em relação a uma modificação genética. Mais especificamente, a invenção presente diz respeito a métodos para aumentar a eficiência quando se geram murganhos capazes de transmitir uma modificação pretendida à sua prole subsequente, para se gerarem murganhos com uma contribuição elevada de material genético proveniente das células de doadores, e para aumentar a eficiência e diminuir o período de tempo necessário para se gerarem murganhos homozigóticos ou heterozigóticos portadores da modificação genética pretendida.

Descrição do Estado da Técnica Relacionado São conhecidos na técnica métodos para modificar células eucariotas doadoras. Veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.586.251. Também são conhecidos na técnica métodos para gerar animais transgénicos. Um método proposto para melhorar a eficiência da geração de animais capazes de 2 transmitir uma modificação pretendida nas células TT2 ES está descrito em Yagi et ai. (1993) Analytical Biochemistry 214: 70-76.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção diz exclusivamente respeito à modificação genética de murganhos. A invenção baseia-se em parte na consciencialização de que a introdução de uma célula modificada num embrião em estado precoce como hospedeiro aumenta substancialmente o material genético e a contribuição celular das células de doadores para o embrião hospedeiro, de tal forma que o animal produzido tem uma maior fracção de células provenientes do doador e portanto apresenta uma maior probabilidade de transmitir a modificação através da sua linha germinal. Além disto, os métodos da invenção permitem utilizar uma gama de células de doadores mais alargada do que era prático com os métodos da técnica anterior. Os métodos da invenção em apreço diminuem portanto o número de animais e de ciclos reprodutivos necessários para se gerar um animal homozigótico relativamente a uma modificação. A invenção presente proporciona um método para gerar um embrião de murganho que inclua células que são homozigóticas relativamente a uma modificação genética, incluindo: 3 (a) introduzirem-se células de doadores de murganho num embrião de murganho hospedeiro anterior à mórula, em que as células de doadores sejam células ES ou semelhantes a ES provenientes de um murganho endogâmico, e sejam homozigóticas em relação à modificação genética; e (b) fazer-se uma cultura do embrião hospedeiro desde um estado anterior à mórula da (a) , até ao estado de blastocisto, em que pelo menos 90 % das células de um murganho que se desenvolva a partir do blastocisto sejam derivadas das células de doadores. O método acima da invenção pode também incluir introduzir-se o embrião de (b) numa mãe adoptiva murina para levar a cabo a gestação. A invenção presente também proporciona um método para gerar um embrião de murganho que inclui células que são heterozigóticas para uma modificação genética, incluindo:

(a) introduzir células de doadores de murganho num embrião de murganho hospedeiro num estado pré-mórula, em que as células de doadores de murganho sejam células ES ou semelhantes a ES 4 de um murganho endogâmico; e que sejam heterozigóticas em relação à modificação genética; e (b) levar-se uma cultura do embrião hospedeiro no estado pré-mórula de (a) até ao estado de blastocisto, em que pelo menos 90 % das células de um murganho que se desenvolva a partir do blastocisto sejam derivadas das células de doadores. O método acima da invenção também pode incluir a gestação do embrião de (b) numa mãe adoptiva murina. A invenção presente também proporciona um embrião murino no estado pré-mórula que inclui células de doadores introduzidas sob a zona pelúcida, em que as células introduzidas incluam células ES ou semelhantes a ES provenientes de um murganho endogâmico, que sejam heterozigóticas ou homozigóticas em relação a uma modificação genética.

Os métodos acima, da invenção, também podem incluir uma gestação do embrião de murganhos geneticamente modificado para gerar um murganho geneticamente modificado. Quando as células do doador forem homozigóticas para a modificação genética, pelo menos 90 % das células de murganho geneticamente modificado são homozigóticas para a 5 modificação genética. Quando as células do doador forem heterozigóticas para a modificação genética, pelo menos 90 % das células de murganho geneticamente modificado são heterozigóticas para a modificação genética.

Descreve-se também neste documento um método para gerar um mamífero não humano modificado, que inclui: (a) introduzir-se uma célula doadora eucariótica num embrião num estado precoce; e (b) introduzir-se o embrião da (a) num murganho mãe para gestação, em que se gera um mamífero não humano modificado. O embrião num estado precoce utilizado nos métodos da invenção é um embrião no estado de pré-mórula. Numa concretização mais específica, o embrião num estado precoce é um embrião com 8 células. O embrião num estado precoce pode ser derivado de qualquer estirpe. Numa concretização, utiliza-se um embrião endogâmico, por exemplo C57BL/6, como embrião hospedeiro. Noutra concretização utiliza-se um embrião exogâmico, por exemplo Swiss Webster, como embrião hospedeiro. A célula doadora de murganho é uma célula germinal. Mais especificamente, a célula estaminal é uma célula estaminal de embrião (ES) ou uma célula do tipo de uma célula ES. Podem utilizar-se células ES de qualquer linha aceitável de células ES no método da invenção. Numa concretização, a linha de células ES é derivada de uma estirpe endogâmica, por exemplo, 129, C57BL/6, ou BalbC. 6

Noutra concretização, a linha de células ES é derivada de uma estirpe híbrida, por exemplo, C57BL/6 x 129. Numa concretização específica, a linha de células é uma célula ES de murganho. Os métodos descritos neste documento podem ser levados a cabo com células derivadas de outros mamíferos não humanos, por exemplo, uma célula ES de rato ou uma célula semelhante a uma célula ES. Numa concretização, a célula ES ou do tipo das ES é uma célula que inclui uma modificação genética. Numa concretização mais específica, a modificação pode ter origem espontânea, pode ser aleatória, ou pode resultar de uma manipulação experimental, por exemplo pela introdução de um ácido nucleico externo. Pode introduzir-se um ácido nucleico externo por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga.

Descreve-se adicionalmente neste documento um método para gerar um mamífero não humano homozigótico para uma modificação genética, que inclui: (a) introduzir uma célula eucariótica de um doador fêmea num embrião hospedeiro num estado precoce, em que a célula eucariótica doadora seja heterozigótica para a modificação genética; (b) manter o embrião de (a) em cultura para desenvolvimento adicional; (c) introduzir o embrião de (b) numa mãe adoptiva apropriada para gestação, gerando deste modo um animal modificado fêmea; (a') introduzir uma célula eucariótica de um doador macho num embrião de estado precoce, em que a célula eucariótica do doador seja heterozigótica para a modificação genética; (b') manter o 7 embrião de (a') em cultura para desenvolvimento adicional; (c') introduzir o embrião de (b') numa mãe adoptiva para gestação, obtendo-se um mamífero macho modificado; e (d) reproduzir o mamífero macho e o mamífero fêmea sexualmente maduros de (c e c'), obtendo-se um mamífero não humano heterozigótico para a modificação genética.

Numa concretização, a célula eucariótica fêmea do doador no passo (a) é derivada da mesma linha de células da célula eucariótica macho do doador no passo (a'). Numa concretização mais específica, célula eucariótica fêmea do doador no passo (a) é uma célula XO e o mamífero fêmea modificado do passo (c) é um murganho XO. A célula doadora eucariótica masculina ou feminina é uma célula estaminal, preferivelmente uma célula ES heterozigótica ou uma célula semelhante a uma destas. Numa concretização, a célula ES heterozigótica é gerada (i) obtendo um fragmento genómico grande clonado contendo uma sequência de ADN com interesse; (ii) utilizando recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico grande clonado de (i) para criar um grande vector alvejante para utilização nas células eucarióticas doadoras (LTVEC, vector alvejante grande); (iii) introduzir o LTVEC de (ii) nas células eucarióticas doadoras para modificar um gene endógeno ou um local do cromossoma nas células de doadores eucarióticas; e (iv) utilizar um ensaio quantitativo para detectar a modificação de alelos nas células eucarióticas doadoras de 8 (iii) para identificar quais as células eucarióticas doadoras nas quais o gene endógeno ou o local do cromossoma foram geneticamente modificados.

Em diversas concretizações, as condições de cultura do passo (b) e/ou (b') permitem ao embrião desenvolver-se até a um estado posterior à mórula ou mais. Numa concretização, as condições de cultura do passo (b) e/ou (b') são proporcionadas por um meio de cultura acondicionado com um factor de crescimento. Numa concretização preferida, o factor de crescimento é uma proteína da família Wnt. Numa concretização, a proteína Wnt é adicionada directamente ao meio de cultura. Noutra concretização, produz-se a proteína Wnt numa célula L de murganho. Noutra concretização ainda, o meio de cultura contém também um factor de inibição da leucemia (LIF).

Numa concretização específica, um embrião no estado de blastocisto de (b) e/ou de (b') é introduzido numa mãe adoptiva para gestação e desenvolvimento ulterior.

Pode introduzir-se a célula eucariótica doadora num embrião em estado precoce por um método qualquer conhecido na técnica. Numa concretização, introduz-se a célula eucariótica doadora sob a zona pelúcida do embrião de estado precoce. Inclui-se em outras metodologias a remoção da membrana da zona pelúcida. Numa concretização mais específica, pode introduzir-se a célula doadora eucariótica sob a zona pelúcida por injecção ou por outros 9 métodos que criam uma abertura na zona pelúcida. Numa concretização especifica, cria-se uma abertura na zona pelúcida com um laser. Numa concretização, o laser inclui um laser infravermelho de Díodo no Estado Sólido. Noutra concretização, a célula eucariótica doadora é introduzida no embrião hospedeiro por métodos de fusão celular.

Numa concretização, obtém-se no passo (d) um murganho modificado incluindo mais do que 90 % de células derivadas da célula doadora. Numa concretização preferida, o murganho modificado inclui mais do que 95 % de células provenientes da célula doadora. Mais preferivelmente, o murganho modificado contém 100 % de células derivadas do doador.

Descreve-se também neste documento um método para criar um embrião não humano homozigótico para uma modificação genética, incluindo: (a) introduzir uma célula eucariótica doadora feminina num embrião hospedeiro num estado precoce, em que a célula eucariótica doadora feminina seja homozigótica para a modificação genética; (b) manter o embrião de (a) em cultura para mais desenvolvimento; (c) introduzir o embrião de (b) numa mãe adoptiva para gestação, gerando-se um mamífero fêmea modificado; (a') introduzir uma célula eucariótica masculina doadora num embrião hospedeiro num estado precoce, em que a uma célula eucariótica masculina doadora seja homozigótica para a modificação genética; (b') manter o embrião de (a') em cultura para mais desenvolvimento; 10 (c') introduzir o embrião de (b) numa mãe adoptiva para gestação, gerando-se um mamífero macho modificado; e (d) reproduzir o mamífero macho e o mamífero fêmea sexualmente maduros de (c e c'), obtendo-se um mamífero não humano homozigótico para a modificação genética. A especificação presente também diz respeito a um método de gerar um mamífero não humano homozigótico em relação a uma modificação genética, que inclui: (a) introduzir uma célula eucariótica doadora num embrião em estado precoce, em que a célula eucariótica doadora seja homozigótica para a modificação genética; (b) manter o embrião de (a) em cultura para ele se desenvolver; (c) introduzir o embrião de (b) numa mãe adoptiva, para gestação, em que se gera um mamífero não humano homozigótico para a modificação genética.

Numa concretização, o método para se gerar a célula doadora eucariótica homozigótica para a modificação genética inclui uma transformação de um gene, alvejando ambos os alelos do mesmo gene, ou alvejando quer um gene ligado a X ou ligado a Y numa célula ES masculina.

Descreve-se adicionalmente neste documento um método para gerar um embrião não humano homozigótico para uma modificação genética, incluindo: (a) introduzir-se uma célula doadora eucariótica num embrião em estado precoce, em que a célula doadora eucariótica seja homozigótica para a modificação genética; e (b) fazer-se a cultura do embrião 11 de estado precoce do passo (a) , gerando-se um embrião nao humano homozigótico para a modificação genética.

Também se descreve neste documento um método para aumentar a contribuição relativa do material genético de uma célula doadora eucariótica num embrião hospedeiro não humano, incluindo: (a) introduzir-se uma célula doadora eucariótica num embrião num estado precoce; e (b) fazer-se a cultura do embrião em estado precoce do passo (a) em condições que permitam ao embrião desenvolver-se até um estado posterior ao de mórula ou ainda mais.

Numa concretização, as condições de cultura do passo (b) permitem ao embrião desenvolver-se a um blastocisto. Noutra concretização, as condições de cultura do passo (b) permitem ao embrião desenvolver-se a uma gástrula ou mais além. Em diversas concretizações, as condições de cultura do passo (b) permitem ao embrião desenvolver-se a um estado após a mórula ou mais além. Numa concretização, as condições de cultura do passo (b) são proporcionadas num meio de cultura acondicionado com um factor de crescimento. Numa concretização preferida, o factor de crescimento é uma proteína da família Wnt. Numa concretização a proteína Wnt é adicionada directamente ao meio de cultura. Noutra concretização, a proteína Wnt é produzida em células L. Noutra concretização ainda, o meio de cultura também inclui um factor de inibição da leucemia (LIF) . 12

Descreve-se também neste documento um método para gerar um mamífero não humano possuindo uma contribuição relativa aumentada de material genético de uma célula eucariótica doadora a um embrião hospedeiro, que inclui: (a) introduzir-se uma célula doadora eucariótica num embrião num estado precoce; e (b) fazer-se a cultura do embrião em estado precoce do passo (a) em condições que permitam ao embrião desenvolver-se até um estado posterior ao de mórula ou mais; e (c) introduzir-se o embrião de (b) numa mãe adoptiva para gestação, gerando-se um mamífero não humano com uma fracção maior de células derivadas da célula eucariótica doadora.

Também se descreve neste documento um método de gerar um mamífero não humano capaz de transmitir uma modificação genética, que inclui: (a) introduzir-se uma célula doadora eucariótica num embrião num estado precoce; e (b) fazer-se a cultura do embrião em estado precoce do passo (a) em condições que permitam ao embrião desenvolver-se até um estado posterior ao de mórula ou mais; e (c) introduzir-se o embrião de (b) numa mãe adoptiva para gestação, gerando-se um mamífero não humano capaz de transmitir a modificação genética.

Descreve-se adicionalmente neste documento um murganho geneticamente modificado gerado por um método da invenção. Numa concretização preferida, 90 % ou mais das células do murganho são derivadas da célula doadora; mais preferivelmente, 95 % ou mais das células do murganho são 13 células derivadas da célula doadora; ainda mais preferivelmente, 99 % ou mais das células do murganho são derivadas da célula doadora. Numa concretização, 100 % das células do murganho são células derivadas da célula doadora.

Também se descreve neste documento um embrião de murganho geneticamente modificado gerado por um método da invenção. Numa concretização preferida, 90 % ou mais das células do embrião são células derivadas das células de doadores; mais preferivelmente, 95 % ou mais das células são células derivadas das células de doadores; ainda mais preferivelmente, 99 % ou mais das células são células derivadas das células de doadores. Numa concretização, 100 % das células são células derivadas das células de doadores.

Também se descreve neste documento um meio de cultura para manter e/ou para fazer crescer um embrião de um estado precoce, em que o meio de cultura inclua um factor de crescimento.

Numa concretização, o factor de crescimento é uma proteína da família Wnt. A família das proteínas Wnt é seleccionada de entre o conjunto de Wntl, Wnt3 a, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt4, Wnt5a, Wnt6, Wnt7a, Wnt8a, Wnt9a, Wnt9b, WntlOa, WntlOb, Wntll, e Wntl6. Numa concretização preferida, a proteína Wnt é uma Wnt3a. Numa concretização, a proteína Wnt é uma proteína recombinante. Noutra 14 concretização, o meio de cultura é acondicionado com uma célula L de murganho produzindo Wnt.

Numa concretização, o meio de cultura também inclui um agente de manutenção. Numa concretização, o agente de manutenção é um factor de inibição da leucemia (LIF) .

Outros objectos e vantagens tornar-se-ão aparentes revendo a descrição pormenorizada que se segue.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

Antes de descrever os métodos, construções e murganhos transgénicos da invenção presente, deve entender-se que esta invenção não se limita aos métodos, construções e animais transgénicos, nem às condições experimentais, que se descrevem, porque todos estes podem variar. Deve também entender-se que a terminologia utilizada neste documento tem o objectivo de descrever apenas concretizações especificas, e não pretende ser limitativa, uma vez que o âmbito da invenção presente apenas será limitado pelas reivindicações apensas.

Tal como se utilizam nesta especificação e nas reivindicações apensas, as formas de singular "um", "uma", "o" e "a" incluem significados plurais a não ser aonde o contexto indique claramente o contrário, por exemplo, "uma célula" inclui uma série de células. Deste modo, por 15 exemplo, uma referência a "um método" inclui um ou mais métodos, e/ou passos do tipo descrito neste documento e/ou que se tornem aparentes às pessoas entendidas na técnica quando lerem esta patente. A não ser aonde se definir algo em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm os mesmos significados que são habitualmente entendidos por indivíduos com conhecimentos médios da técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática da invenção presente ou para a testar, descrevem-se em seguida os métodos, construções e materiais preferidos.

Definições 0 termo "célula embriónica semelhante a uma célula estaminal (ES)" inclui uma célula que, quando introduzida num embrião, pode contribuir para qualquer dos tecidos do embrião em desenvolvimento.

Os termos "contribuição aumentada", "maior percentagem relativa" e outros semelhantes, incluem uma contribuição melhorada do material genético de um doador que seja uma célula eucariótica doadora, para um organismo que resulte do desenvolvimento ulterior de um embrião em estado precoce modificado, hospedeiro. 0 método da invenção proporciona maneiras de aumentar a probabilidade de as 16 células introduzidas no embrião hospedeiro contribuírem para todos os tecidos, incluindo tecidos da linha germinal, do animal gerado. A expressão "anulação de gene", tal como se utiliza neste documento, significa uma modificação genética resultante da ruptura da informação genética codificada num local de um cromossoma. Por "criação de gene" tal como se utiliza neste documento, significa uma modificação genética resultante da substituição da informação genética codificada num local de um cromossoma por uma sequência de ASDN diferente ou a inserção de uma informação genética externa num local de um cromossoma. Por "animal anulado", tal como se utiliza neste documento, significa-se um animal no qual uma parte significativa das células do animal são portadoras de um gene anulado. Por "animal criado", tal como se utiliza neste documento, significa-se um animal no qual uma parte significativa das células do animal são portadoras de um gene criado.

Descrição Geral

Uma das componentes pretendidas num estudo com animais transgénicos é gerar-se um animal transgénico geneticamente modificado, capaz de transmitir a modificação genética à sua prole, isto é, um animal transgénico que inclua a modificação genética na sua linha germinal. Os métodos actuais de criar um tal animal transgénico capaz de transmitir tendem a ser não eficientes em termos da 17 quantidade de meios e do período necessário. Por exemplo, para gerar um animal transgénico geneticamente modificado capaz de transmitir a modificação genética à sua prole, injecta-se uma célula ES modificada heterozigótica para uma modificação genética pretendida num embrião hospedeiro em blastocisto, e implanta-se o embrião receptor numa mãe adoptiva para gestação e nascimento da prole transgénica. A prole transgénica resultante é quimérica, porque parte dos tecidos nesta prole é derivada das células ES injectadas, enquanto outros tecidos da prole são derivados das células do embrião hospedeiro. Por causa desta natureza quimérica, as células ES injectadas incluindo a modificação genética pode ou não formar tecidos da linha germinal na prole, e ser capaz de transmitir a modificação genética à geração seguinte. Para determinar se uma quimera é capaz de transmitir a modificação genética, tem que se reproduzir a quimera com outro animal que não seja portador da mesma modificação genética para se estabelecer se a modificação pretendida é transmitida à prole resultante (Fl). A detecção da modificação genética pretendida na prole Fl resultante do cruzamento entre a quimera e o outro animal estabelece que a quimera é portadora da modificação genética pretendida na sua linha germinal e é capaz de transmitir a modificação à sua prole (transmissão pela linha germinal) . Tipicamente, cerca de 50 % das quimeras exibirão transmissão pela linha germinal. A cor do pelo é o marcador mais habitualmente utilizado da extensão da contribuição das células ES para a quimera e da transmissão do conteúdo genético das células ES para a prole Fl. 18 A necessidade corrente de gerar uma geração Fl para se determinar se a quimera é capaz de transmitir a informação genética não é eficiente e é cara em termos do tempo e das despesas com os cruzamentos e a manutenção da prole Fl. Um método de melhorar a eficiência do processo para gerar animais transgénicos é proporcionado pela invenção em apreço que permite a introdução de células em embriões pré-mórula gerando animais com um aumento da contribuição do material genético proveniente das células exógenas, em relação aos resultados obtidos quando as células de doadores são introduzidas em embriões em estádios posteriores, por exemplo, blastocistos. Consequentemente, uma muito maior percentagem dos animais FO são transmissores pela linha germinal. Na maior parte dos casos, os animais FO são transmissores pela linha germinal a 100 % e portanto estes animais FO conseguem transmitir materiais celulares das células ES a todas a sua prole. A introdução de células de doadores em embriões hospedeiros num estado precoce, por exemplo, embriões com 8 células, proporciona diversas vantagens importantes em relação aos métodos actuais, os quais ensinam a utilização de embriões de um estado mais avançado, por exemplo, de blastocistos. Tal como se demonstra no Exemplo 1 adiante, o número de embriões de um estado precoce obtidos a partir de uma mãe doadora (por exemplo, um murganho fêmea BL/6) é maior do que o número de embriões que se conseguem obter 19 para um estado mais avançado. Portanto são necessários menos murganhos fêmea em estado de gravidez como doadores, diminuindo o custo de se obterem e manterem murganhos fêmea em estado de gravidez.

Além disto, tal como se demonstra adiante, podem introduzir-se células de doadores num número menor de embriões em estado precoce do que em embriões em estado mais avançado para se gerar o mesmo número de animais quiméricos, diminuindo o tempo e o custo de introduzir células de doador em embriões, por exemplo, quando a introdução for por microinjecção, diminui-se fortemente o período de tempo passado a fazer microinjecções. A invenção em apreço também permite a cultura do embrião hospedeiro contendo células de doadores até a estados após a mórula, por exemplo, ao estado de blastocisto o ao estado de gástrula, antes de os introduzir numa mãe adoptiva para gestação. Uma vez que as condições das culturas in vitro são mais favoráveis para as células de doadores do que para o embrião hospedeiro, o embrião resultante terá um conteúdo maior em células derivadas das doadoras, em comparação com o método no qual se introduz um embrião hospedeiro em estado de mórula numa mãe adoptiva para gestação.

Uma melhoria importante proporcionada pela invenção em apreço é que o número de animais gerados que é capaz de transmitir ADN de doador aumenta substancialmente 20 quando se utilizam embriões hospedeiros em estado precoce, de tal modo que se elimina por completo uma geração de cruzamentos. Isto representa uma melhoria prática significativa com implicações comerciais importantes.

Um método conhecido na técnica que permite eliminar uma geração de cruzamentos emprega embriões tetraplóides como receptores das células modificadas do doador. Uma vez que as células tetraplóides do embrião receptor são incapazes de contribuir para os tecidos do animal em desenvolvimento, os animais que nascem são completamente derivados das células modificadas do doador. Caso os animais resultantes não possuam uma modificação genética que afecte a fertilidade, eles serão capazes de transmitir a modificação genética pretendida a toda a sua prole, por cruzamento. Este processo é laborioso e não eficiente, produzindo uma pequena fracção de animais nados vivos apenas a partir de linhas de células ES híbridas. As injecções das células sob a zona pelúcida dos embriões diplóides num estado anterior à mórula resulta numa sobrevivência maior e na geração de um número elevado de animais vivos completamente ou quase completamente derivados de células ES. Podem obter-se por este método tanto machos como fêmeas. O método da invenção pode ser aplicado para introduzir células ES endogâmicas em embriões hospedeiros exogâmicos, por microinjecção. 21

No decurso das descrições de exemplos de concretização que se seguem e são incluídos para ilustrar a invenção, não se pretendendo que sejam limitativos, tornar-se-ão aparentes outras características da invenção.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem foram incluídos para proporcionar a indivíduos com conhecimentos médios da técnica exemplos de como levar a cabo e utilizar os métodos, composições e animais da invenção, e não se pretende que constituam limitações do âmbito da invenção. Fizeram-se esforços para se assegurar precisão no tocante aos números que se utilizaram (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas devem esperar-se alguns desvios, tal como os especialistas da técnica sabem. A não ser aonde se indicar algo em contrário, as partes são partes em peso, a massa molecular é a massa molecular média, a temperatura é em graus Centígrados, e a pressão é a pressão atmosférica ou semelhante.

Exemplo 1. Geração de Animais Transmitindo a Linha germinal

Obtiveram-se embriões de murganho para serem injectados a partir de cruzamentos naturais em que a manhã seguinte em que se colocou um tampão nas fêmeas foi designada como 0,5 dias p.c. (após o coito). Recolheram-se os ovidutos de fêmeas com tampão aos 2,5 dias p.c. e 22 lavaram-se em corrente de meio Dulbecco para se obterem os embriões com 8 células. Mantiveram-se os embriões neste meio para cultura (37°C numa incubadora sob 5 % de C02) e para os processos de microinjecção.

Levou-se a cabo a injecção nos embriões com 8 células utilizando as técnicas habituais de microinjecção, excepto que antes de se introduzirem as células ES, se gerou um abertura na zona pelúcida do embrião com 8 células utilizando um sistema laser XY Clone, de acordo com as especificações do fabricante. A agulha de injecção é inserida através da referida abertura e depositam-se 6 a 10 células ES no espaço perivitelino.

Transferiram-se os embriões injectados para uma placa de cultura KSOM+AA e a cultura prosseguiu de um dia para o outro até ao estado de blastocisto. Transferiram-se os embriões sobreviventes como blastocistos para fêmeas adoptivas na tarde do dia seguinte (3,5 dias p.c.).

Exemplo 2. Geração de Murganho Anulado DLL4 Homozigótico.

Microinjectaram-se células ES homólogas anuladas DLL4 num embrião de murganho com 8 células, tal como se descreveu acima. Fez-se a cultura dos embriões microinjectados até ao estado de blastocisto e transferiram-se para fêmeas adoptivas para gestação. Todos os embriões anulados DLL4 morreram durante a gestação. A 23 causa da morte era idêntica à observada para embriões produzidos através do cruzamento convencional de murganhos heterozigóticos. A observação do fenótipo nulo DLL4 na geração FO evitou as duas gerações de cruzamento que normalmente seriam necessárias para gerar os murganhos anulados DLL4.

Exemplo 3. Geração de Murganhos FO Machos Altamente e Completamente Derivados de Células ES, com Modificações Genéticas

Microinjectaram-se células ES masculinas geneticamente modificadas F1 H4 em embriões C57BU6, quer com 8 células, quer no estado de blastocistos. Transferiram-se os embriões blastocisto microinjectados para uma fêmea adoptiva para gestação logo a seguir à injecção. Os embriões com 8 células permaneceram em cultura em meio de cultura KSOM+AA até ao estado de blastocistos, e foram então transferidos para uma mãe adoptiva para gestação. As percentagens de contribuição da linha de células ES foram estimadas através da cor da pelagem dos murganhos macho FO. Resumem-se os resultados na Tabela 1. Tal como se mostra, quando se microinjectaram células ES geneticamente modificadas em embriões com 8 células, todos os murganhos FO derivam de células ES. Por outro lado, quando se microinjectaram células ES geneticamente modificadas em embriões no estado de blastocistos, nenhum dos murganhos machos FO derivava completamente de células ES, e só cerca de metade dos murganhos FO machos (2 de 4 e 24 4 de 7, respectivamente para 494B-F5 e para 1218X-E2) apresentam mais do que 90 % de células derivadas de ES.

Tabela 1

Embrião j N°de N° de Murganhos Machos FOcom j I Descendentes j diversas Percentagens de contribuição | | de Células ES* j

Usaram-se mais linhas de células ES para testar o efeito do estado do embrião (8 células vs. blastocisto) sobre a contribuição das células ES nos murganhos machos F0 resultantes. Obtiveram-se resultadoss semelhantes que se resumem na Tabela 2 (* As percentagens de contribuição de células ES foram estimadas pela cor da pelagem dos murganhos F0).

Tabela 2

Embrião j N° de j N° de Murganhos Machos F0 com I Descendentes j Diversas Percentagens de | \ Contribuição de Células ES*

Linha de Células ES Estado | N° I Total j Machos I <50 % i 50 % a \ I | 80% I 90 % j >90 % 100% F1H4 Parental ¥ Células 11201 34 ] 30 [ 3 | 0 [ 0 To 27 F1H4 Parental Blastocisto 1125 j 24 j 20 | 5 | 1 | 2 I 12 0 25

Embrião j N°de j N° de Murganhos Machos FO com j | Descendentes j Diversas Percentagens de j i | Contribuição de Células ES* \ j Linha de j Estado | Células ES j N° | Total | Machos | <50 % 50 % a 80% l 90 | % >90% 100%| i 609B-G2 | 8 Células 50 I 17 [ 15 I 2 0 | o 0 .....13 | | 609B-G2 | Blastocisto 50 I 21 | 16 | 1 0 | 1 14 o | i 698B-A8 | 8 Células 25 I 5 j 4 I 1 0 | o 1 2 ! | 698B-A8 | Blastocisto 25 I 9 j 6 I 3 3 | o 0 0 j | 639C-A9 | 8 Células 37 112 f 11 | 1 0 | o 0....... .....10.....j | 639C-A9 | Blastocisto 25 I 7 I 7 | o 0 | o 7 0 i | 619A-A1 | 8 Células 25 I 12 | 11 | 1 0 | o 0 10 i | 619A-A1 | Blastocisto 25 I 7 I 6 I 0 0 I 0 6 0 j i 576A-E11 | 8 Células 25 I 12 | 10 I 1 0 | o 0 9 i ! 576A-E11 | Blastocisto 25 | 21 [ 16 | 2 1 | 1 12 0 i

Exemplo 4. Geração de Murganhos FO Fêmeas Altamente e Completamente Derivados de Células ES

Microinjectaram-se células ES XO Geneticamente Modificadas (clone 648B-H12), quer em embriões com 8 células, quer em blastocistos, C57BL/6. Transferiram-se os embriões blastocistos microinjectados para uma fêmea adoptiva para gestação logo a seguir à injecção. Os embriões no estado de 8 células continuaram em cultura em meio KSOM+AA até o estado de blastocisto e depois transferiram-se para uma fêmea adoptiva para gestação. Estimaram-se as percentagens da contribuição das células ES nos murganhos fêmea FO através da cor da sua pelagem. Tal como se mostra na Tabela 3, quando se microinjectaram células ES XO geneticamente modificadas em embriões com 8 células, todas as quimeras eram fêmeas. Quando se 26 microinjectaram células ES geneticamente modificadas em embriões no estado de blastocisto, só 7 murganhos FO de um total de 16 para a 648B-H12 e 11 de 16 para a 648C-H1 eram fêmeas (* Estimaram-se as percentagens de contribuição das células ES nos murganhos FO através da coloração da pelagem).

Exemplo 5. Geração de Murganhos FO Altamente e Completamente Derivados de Células ES Utilizando Embriões Hospedeiros Exogâmicos e Endogâmicos

Microinjectaram-se células ES masculinas endogâmicas não modificadas (C57BL/6) ou híbridas (F1 H4) em embriões Swiss Webster (SW), quer do estado de 8 células, quer do estado blastocisto. Transferiram-se os embriões blastocistos microinjectados para uma fêmea adoptiva para gestação logo a seguir à injecção. Os 27 embriões no estado de 8 células continuaram em cultura em meio KSOM+AA até o estado de blastocisto e depois transferiram-se para uma fêmea adoptiva para gestação. Resumem-se os resultados na Tabela 4 (* Estimaram-se as percentagens de contribuição das células ES através da cor da pelagem dos murganhos FO).

Tabela 4

Obtiveram-se resultados semelhantes quando se microinjectaram células ES masculinas endogâmicas 129 (CJ7) e de Balb/c, quer em embriões hospedeiros no estado de 8 células, quer no de blastocistos, endogâmicos C56BL/6. Resumem-se os resultados na Tabela 5 (* Estimaram-se as percentagens de contribuição das células ES através da cor da pelagem dos murganhos FO) .

Tabela 5

\ Embrião N°de N° de Murganhos machos F0 com j | C56B/6 Descendentes Diversas Percentagens de Contribuição j | de Células ES* j Células \ Estado !N° Total | Machos <90% | >90% | 100% ! ES | | ii $ S 28 | Embrião | C56B/6 N° de Descendentes N° de Murganhos machos F0 com Diversas Percentagens de Contribuição de Células ES* 129 I 8 Células! 57 (CJ7) ; I 8 I 8 3 | o | 5 129 \ Blastocisto 150 (CJ7) | I 18 l 14 4 | io | 0 Balb/c ! 8 Células 50 11 | 11 5 | o I 6 Balb/c ! Blastocisto ! 57 8 | 1 1 | o | 0

Exemplo 6. Os Murganhos FO Altamente ou Completamente Derivados de Células ES são Competentes para a Transmissão da Linha Germinal

Utilizaram-se murganhos machos FO derivados de F1H4 com mais do que 90 % das células derivadas das células ES (mais do que 90 % de contribuição de células ES) para testar a sua competência na transmissão da linha germinal. Utilizando células ES masculinas, cruzaram-se murganhos machos FO sexualmente maduros com fêmeas sexualmente maduras. Utilizou-se a cor da pelagem da descendência como marcador para avaliação da competência na transmissão da linha germinal. Resumem-se os resultados na Tabela 6. Quando se utilizaram como hospedeiros embriões no estado de 8 células, mais de 95 % (51 de 53) dos machos FO que havia sido gerados a partir de microinjecção no estado de 8 células exibiram 100 % de competência na transmissão da linha germinal. Quando se utilizaram como hospedeiros embriões no estado de blastocistos, só cerca de 64 % (57 de 89) dos machos FO exibiam 100 % de competência na transmissão da linha germinal. Além disto, cerca de 21 % 29 (19 em 89) dos machos FO gerados a partir de microinjecção em blastocisto não produziram nenhuma descendência em comparação com 4 % (2 em 53) dos machos FO gerados por microinjecção o estado de 8 células que não tiveram descendência (** Estimaram-se as percentagens de competência na transmissão da linha germinal através da cor da pelagem da descendência correspondente).

Tabela 6

Estado do Embrião Hospedeiro N° de FO Machos Gerados N° de Machos FO Mostrando Diversas Competências na Transmissão da Linha Germinal** N° de Machos FO Sem Descendentes 100% Parcial | Zero 8 Células 53 51 0 | o 2 Blastocisto 89 57 9 I 4 19

Exemplo 7. Efeito do Meio de Cultura Após a Microinjecção sobre a Qualidade dos Murganhos FO

Microinjectaram-se células ES modificadas masculinas C57BL/6 e Fl H4 nos embriões Swiss Webster (SW) no estado de 8 células. Submeteram-se os embriões microinjectados a cultura em diversos meios diferentes até ao estado de blastocistos que foram então transferidos para uma fêmea adoptiva para gestação. Utilizaram-se três meios de cultura diferentes: (1) KSOM, meio de cultura de embrião de murganho KSOM; (2) LIF, meio de cultura de células ES contendo LIF; (3) Wnt3, meio de cultura de células ES acondicionado com Wnt3. Resumem-se os resultados na Tabela 7. Produziu-se o meio Wnt3, meio acondicionado para células 30 ES, como se segue: (i) plaquearam-se células L de murganho num frasco T75 num meio feito a partir de DMEM com elevado teor em glucose, 10 % de FBS, e L-glutamina, e incubaram-se a 37°C, sob 5 % de CO2; (ii) quando a densidade celular atingiu 100 % de confluência, 10 % das células foram plaqueadas de novo noutro frasco T75; (iii) recolheu-se o meio de cultura até a densidade celular voltar a atingir a confluência (cerca de 3 dias depois do novo plantio); e por último, (iv) misturou-se o meio de cultura recolhido com igual volume de meio de cultura de células ES isento de LIF mas com substituição do soro (* Estimaram-se as percentagens de contribuição das células ES através da coloração da pelagem dos murganhos F0).

Tabela 7 ! Células ES Meio de Cultura N° de Embriões Transferidos N°de Descendentes N° de Murganhos Machos F0 \ com Diversas Percentagem j de Contribuição de Células \ ES* | Total | Machos <100% 100% j | F1H4 KSOM 140 55 j 45 37 8 i ] F1H4 LIF 40 8 S 8 3 5 i | F1H4 Wnt3 40 9 | 9 2 7 j C57BL/6.2 KSOM 75 16 l 16 10 6 I C57BL/6.2 LIF 38 10 | 10 5 5 I C57BL/6.2 Wnt3 38 11 | 11 0 11 |

Obtiveram-se resultados semelhantes quando se microinjectaram células masculinas modificadas F1 H4 em embriões ES com 8 células C57BL/6. 31

Exemplo δ. Geração de Animais Homozigóticos para uma Modificação Genética de células Heterozigóticas ES.

Microinjectam-se células masculinas ES heterozigóticas para uma modificação genética pretendida num embrião de murganho com 8 células, tal como se descreveu no Exemplo 1. Microinjectam-se células femininas derivadas da mesma linha ES e heterozigóticas para a mesma modificação genética noutro embrião de murganho com 8 células, tal como se descreveu acima. Ambos os embriões são submetidos a cultura até ao estado de blastocistos, e são depois transferidos para fêmeas adoptivas para gestação. Cruzam-se os murganhos FO resultantes macho e fêmea, transmissores da linha germinal, para se obter uma prole homozigótica para a modificação genética pretendida. Geraram—se dois pares de murganhos. De um número total de 39 descendentes, 9 eram homozigóticos para a modificação genética.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um método para gerar um embrião de murganho contendo células gue sejam homozigóticas para uma modificação genética, incluindo: (a) introduzirem-se células de doadores de murganho num embrião de murganho hospedeiro anterior à mórula, em gue as células de doadores sejam células ES ou semelhantes a ES provenientes de um murganho endogâmico, e sejam homozigóticas em relação à modificação genética; e (b) fazer-se uma cultura do embrião hospedeiro desde um estado anterior à mórula da (a) , até ao estado de blastocisto, em que pelo menos 90 % das células de um murganho que se desenvolva a partir do blastocisto sejam derivadas das células de doadores.
2. O método da reivindicação 1, incluindo além disto introduzir-se o embrião de (b) numa mãe adoptiva murina para gestação.
3. O método da reivindicação 1 ou da 2, em que se geram células de doadores de murganho homozigóticas para 2 a modificação genética por um processo seleccionado de entre o conjunto constituido por transformação de genes, alvejamento de ambos os alelos do mesmo gene, e alvejamento de um gene ligado quer a X, quer a Y, nas células ES ou semelhantes a ES. 4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, no qual (i) pelo menos 95 % das células de um murganho que se desenvolve a partir do blastocisto são derivadas das células de doadores, ou (ii) pelo menos 99 % das células de um murganho que se desenvolve a partir do blastocisto são derivadas das células de doadores.
5. Um método para gerar um embrião de murganho que inclua células que sejam heterozigóticas para uma modificação genética, incluindo: (a) introduzir células de doadores de murganho num embrião de murganho hospedeiro num estado pré-mórula, em que as células de doadores de murganho sejam células ES ou semelhantes a ES de um murganho endogâmico; e que sejam heterozigóticas em relação à modificação genética; e (b) levar-se uma cultura do embrião hospedeiro no estado pré-mórula de (a) até ao estado de blastocisto 3 em que pelo menos 90 % das células de um murganho que se desenvolva a partir do blastocisto sejam derivadas das células de doadores.
6. O método da reivindicação 5, incluindo também a gestação do embrião de (b) numa mãe adoptiva murina.
7. O método de acordo com as reivindicações 5 ou 6, no qual (i) pelo menos 95 % das células de um murganho que se desenvolva a partir do blastocisto sejam derivadas das células de doadores, ou (ii) pelo menos 99 % das células de um murganho que se desenvolva a partir do blastocisto sejam derivadas das células de doadores.
8. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o embrião do murganho hospedeiro pré-mórula seja: (i) um embrião diplóide; e/ou (ii) de uma estirpe endogâmica ou de uma estirpe exogâmica.
9. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o embrião de murganho hospedeiro pré-mórula seja um embrião no estado de 8 células.
10. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o embrião de murganho hospedeiro pré-mórula inclua uma zona pelúcida, e no qual 4 se introduzam as células de doadores de murganho no embrião de murganho hospedeiro através de uma abertura na zona pelúcida; opcionalmente em que a abertura haja sido criada por um laser. 11. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual as células de doadores geneticamente modificadas são geradas por: (a) se obter um fragmento genómico grande clonado contendo uma sequência de ADN com interesse; (b) se utilizar a recombinação homóloga bacteriana para se modificar geneticamente o fragmento genómico grande de (a), para se criar um vector alvejante grande (LTVEC) para utilização nas células de doadores; (c) se introduzir o LTVEC de (b) nas células de doadores para se modificar o gene endógeno ou o local do cromossoma nas células; e (d) se utilizar um ensaio quantitativo para detectar a modificação do alelo nas células de doadores de (c), para se identificarem as células de doadores nas quais o gene endógeno ou o local do cromossoma tenham sido geneticamente modificados. 5 12 . 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual as células ES doadoras provenham de uma estirpe endogâmica de murganho seleccionada de entre o conjunto constituído por 129, C57BL/6, e BalbC. 13. 0 método de acordo com qualquer uma das revindicações anteriores, no qual o embrião de murganho hospedeiro inclua um embrião endogâmico da estirpe C57BL/6 ou um embrião exogâmico da estirpe Swiss Webster. 14. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual a cultura do passo (b) seja acondicionada por um factor de crescimento, opcionalmente uma proteína da família Wnt; preferivelmente Wnt3a. 15. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, incluindo além disso a gestação do embrião de murganho geneticamente modificado para gerar um murganho geneticamente modificado, em que (i) quando as células de doadores forem homozigóticas para a modificação genética, pelo menos 90 % das células no murganho geneticamente modificado sejam homozigóticas para a modificação genética; ou (ii) quando as células de doadores forem heterozigóticas para a modificação genética, pelo menos 90 % das células no murganho geneticamente modificado sejam heterozigóticas para a modificação genética. 6 16. 0 método de acordo com a reivindicação 15(i) no qual: (a) pelo menos 95 % das células no murganho geneticamente modificado sejam homozigóticas para a modificação genética; ou (b) pelo menos 99 % das células no murganho geneticamente modificado sejam homozigóticas para a modificação genética; ou o método de acordo com a reivindicação 15 (ii), no qual: (a) pelo menos 95 % das células no murganho geneticamente modificado sejam heterozigóticas para a modificação genética; ou (b) pelo menos 99 % das células no murganho geneticamente modificado sejam heterozigóticas para a modificação genética. 17. 0 método de acordo com a reivindicação 15 (i), no qual pelo menos 90 % das células germinais no das células murganho geneticamente modificado sejam homozigóticas para a modificação genética; ou o método de acordo com a reivindicação 15 (ii), no qual pelo menos 90 % 7 germinais no murganho geneticamente modificado sejam heterozigóticas para a modificação genética. 18. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, no qual as células de doadores sejam células XO femininas e o murganho geneticamente modificado seja um murganho XO.
19. Um embrião de murganho pré-mórula que inclua células de doador murganho introduzidas sob a zona pelúcida, em que as células do doador incluam células ES ou células semelhantes a células ES de um murganho endogâmico, que sejam heterozigóticas ou homozigóticas para uma modificação genética.
20. O embrião de murganho pré-mórula da reivindicação 19, em que o embrião pré-mórula seja um embrião no estado de 8 células.
21. O embrião de murganho pré-mórula da reivindicação 19, em que as referidas células ES de um doador provenham de uma estirpe de murganho seleccionada de entre o conjunto constituído por 129, C57BL/6, e BalbC. Lisboa, 5 de Junho de 2014.