RS55949B1 - Humanizovani il-6 i il-6 receptor - Google Patents

Humanizovani il-6 i il-6 receptor

Info

Publication number
RS55949B1
RS55949B1 RS20170430A RSP20170430A RS55949B1 RS 55949 B1 RS55949 B1 RS 55949B1 RS 20170430 A RS20170430 A RS 20170430A RS P20170430 A RSP20170430 A RS P20170430A RS 55949 B1 RS55949 B1 RS 55949B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
human
gene
humanized
mice
Prior art date
Application number
RS20170430A
Other languages
English (en)
Inventor
Li-Hsien Wang
Anthony T Dare
Sean Stevens
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharmaeuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaeuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaeuticals Inc
Publication of RS55949B1 publication Critical patent/RS55949B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na oblast genetski modifikovanih mišjih životinja.
STANJE TEHNIKE
[0002] Miševi koji su transgenični za neki humani IL-6 gen poznati su u tehnici. Međutim, nasumično ubacivanje nekog humanog IL-6 transgena u mišji genom kao rezultat daje slabo regulisanu ekspresiju humanog IL-6 proteina, što se manifestuje različitim patologijama u takvih transgeničnih miševa, uključujući, ali bez ograničenja, plazmacitozu i glomerulonefritis. Kao rezultat navedenoga, ovi miševi su ograničene korisnosti.
[0003] Postoji potreba za ne-humane životinje, npr. miševe i pacove koji vrše ekspresiju humanog ili humanizovanog IL-6 i/ili humanog ili humanizovanog IL-6 receptora. Postoji potreba za takvim humanizovanim miševima koji ne pokazuju jednu ili više patoloških pojava kakve pokazuju transgenični hIL-6 miševi.
REZIME
[0004] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje genetski modifikovanu mišju životinju koja obuhvata zamenu na endogenom mišjem IL-6 lokusu mišjeg gena koji kodira IL-6 sa humanim genom koji kodira humani IL-6, pri čemu je humani gen koji kodira humani IL-6 pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata na endogenom mišjem IL-6 lokusu. U jednoj realizaciji, date su genetski modifikovane mišje životinje koje ispoljavaju humani IL-6 gen pod kontrolom endogenog mišjeg promotora i/ili endogenih mišjih regulatornih elemenata, od endogenog mišjeg IL-6 lokusa.
[0005] U jednoj realizaciji, humani gen koji kodira humani IL-6 sadrži eksone 1 do 5 humanog IL-6 gena koji su nađeni u CTD-2369M23 bakterijskom veštačkom hromosomu.
[0006] U jednoj realizaciji, mišja životinja vrši ekspresiju humanizovanog IL-6R α gde je endogeni mišji IL-6R α gen zamenjen s humanom sekvencom koja uključuje sekvencu koja kodira ektodomen humanog IL-6R α.
[0007] U još jednoj realizaciji, mišja životinja ne pokazuje osobinu koja je odabrana između sledećih: plazmacitoza, glomeruloskleroza glomerulonefritisa, ottkazivanje bubrega, hipergamaglobulinemija, povišeni megakariociti u slezeni, povišeni megakariociti u koštanoj srži, splenomegalija, povećanje limfnog čvora, nagomilane abonormalne ćelije u plazmi, te kombinacija navedenog. U takvim realizacijama, humanizovani IL-6R α može uključiti mišje transmembranske i intracelularne domene.
[0008] U drugom aspektu, ovaj pronalazak daje genetski modifikovanu mišju životinju, koja uključuje humanizaciju endogenog mišjeg IL-6R α gena, pri čemu ova humanizacija uključuje zamenu mišje IL6R α ektodomena-kodirajuće sekvence s humanom IL-6R α ektodomena-kodirajućem sekvencom na endogenom mišjem IL-6R α lokusu, i pri čemu je humanizovani IL-6R α gen pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata.
[0009] U jednoj realizaciji drugog aspekta ovog pronalaska, genetski modifikovana mišja životinja još uključuje humanizovani IL-6 gen koji uključuje zamenu na endogenom mišjem IL-6 lokusu mišjeg gena, koji kodira IL-6, s humanim genom koji kodira humani IL-6.
[0010] U trećem aspektu, ovaj pronalazak daje metodu da se dobije humanizovana mišja životinja, naznačena time što uključuje zamenu mišje genske sekvence koja kodira mišji IL-6 s humanim genom koji kodira humani IL-6 tako da je humani IL-6 gen pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata.
[0011] U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak daje metodu za pravljenje humanizovane mišje životinje, koja uključuje zamenu svih mišjih eksona koji kodiraju ektodomena sekvence mišjeg IL-6R α sa humanim genomskim fragmentom koji kodira humani IL-6R α ektodomen da se formira humanizovani IL-6R α gen, pri čemu je humanizovani IL-6R α gene pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata.
[0012] U petom aspektu, ovaj pronalazak daje genetski modifikovanu mišju životinju, koja poseduje humanizovani IL-6Rα gen koji uključuje zamenu mišje ektodomena-kodirajuće sekvence s humanom ektodomena sekvencom, pri čemu humanizovani IL-6R α gen uključuje mišju transmembransku sekvencu i sekvencu intracelularnog domena; gde mišja životinja nadalje sadrži gen koji kodira humani IL-6, pri čemu su geni koji kodiraju humani IL-6 i humanizovani IL-6R α pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata.
OPIS
[0013] Ovde su opisane genetski modifikovane životinje glodavci koje vrše ekspresiju humanog IL-6 receptorskog gena (ili gena koji kodira humanu ektodomenu ili mišju transmembransku ili intracelularnu domenu) pod kontrolom endogenog mišjeg promotora i/ili endogenih mišjih regulatornih elemenata, s endogenog mišjeg IL-6 receptorskog lokusa.
[0014] Ovde je takođe opisana genetski modifikovana životinja (npr. neka životinja koja je generalno glodavac, npr. miš ili pacov) koja vrši ekspresiju humanog IL-6 proteina, gde ne-humana životinja ne pokazuje patologiju koja je odabrana između sledećeg: plazmacitoza, glomerulonefritis, glomeruloskleroza, mezangio-proliferativni glomerulonefritis, intestinalni limfom, bubrežni limfom, splenomegalija, povećanje limfnog čvora, povećanje jetre, megakariociti u koštanoj srži, nagomilane abnormalne ćelije u plazmi, infiltracija ćelija plazme u pluća ili jetru ili bubreg, proliferacija mezangijalnih ćelija u bubregu, cerebralna preekspresija IL-6, razgranate mikroglija-ćelije u beloj supstanci, reaktivna astrocitoza u mozgu, otkazivanje bubrega, povišeni megakariociti u slezeni, propadanje mišića (npr., propadanje gastroknemičkog mišića), povišeni mišićni katepsini B i B+L (npr. oko 20-struko i 6-struko), te neka kombinacija navedenog.
[0015] Ovde je opisana i određena ne-humana životinja koja sadrži normalnu populaciju B ćelija. Ova normalna populacija B ćelija može da bude jednaka brojem i imunofenotipom kao životinja divljeg tipa, npr. miš divljeg tipa.
[0016] Takođe je ovde opisana ne-humana životinja glodar (npr. neki miš ili pacov) koji vrši ekspresiju humanog IL-6 (hIL-6) u serumu uz nivo ispod oko 800 pg/mL, ispod oko 700, 600, 500, 400, 300 ili 200 pg/mL. Ova mišja životinja može da vrši ekspresiju hIL-6 u serumu uz nivo od oko 50 do oko ne više od 200 pg/mL, oko 75-125 pg/mL, ili oko 100 pg/mL. Ova mišja životinja može da vrši ekspresiju hIL-6 u serumu uz nivo od oko 50 do oko ne više od 200 pg/mL, oko 75-125 pg/mL, ili oko 100 pg/mL.
[0017] Takođe je ovde opisana ne-humana životinja koja vrši ekspresiju hIL-6 i/ili hIL-6R, gde nehumana životinja vrši ekspresiju hIL-6 i/ili hIL-6R iz endogenog ne-humanog IL-6 lokusa i/ili endogenog ne-humanog hIL-6R lokusa. Takođe je ovde opisan genetski modifikovan miš koji vrši ekspresiju hIL-6 iz endogenog mišjeg IL-6 lokusa, gde je endogeni mišji IL-6 gen zamenjen s nekim hIL-6 genom.
[0018] Ovde je takođe opisan miš koji ima ćeliju koja vrši ekspresiju IL-6 receptora (IL-6R) koji sadrži humani ektodomenu na površini ćelije. Ćelija može da bude limfocit, na primer neka B ćelija.
[0019] Takođe su ovde opisane genetski modifikovane mišje životinje kod kojih, oko 6.8 kb na endogenom mišjem IL-6 lokusu, uključujući eksone 1 do 5 i neku 3' netranslatiranu sekvencu, se briše i zameni s oko 4.8 kb humanom IL-6 genskom sekvencom koja sadrži eksone 1 do 5 humanog IL-6 gena. Humani IL-6 gen može da sadrži eksone 1 do 5 humanog IL-6 gena humanog BAC CTD-2369M23.
[0020] Ovde je takođe opisan genetski modifikovan miš koji vrši ekspresiju IL-6 iz humanog IL-6 gena, gde miš vrši ekspresiju humanog IL-6 u njegovu serumu. Ovaj mišji serum može da vrši ekspresiju koncentracije u serumu humanog IL-6 od oko 25 do oko 300 pg/mL, od 50 do oko 250 pg/mL, od 75 do oko 200 pg/mL, ili od 100 do oko 150 pg/mL. Nivo humanog IL-6 u serumu miša može biti oko 100 pg/mL Nivo specifičnog markera pan B ćelija u koštanoj srži miša mogu biti približno jednaki onima za miša divljeg tipa. Nivo specifičnog markera pan B ćelija u slezeni može da bude približno jednak onom u miša divljeg tipa. Specifični markeri pan B ćelija mogu biti odabrani između B220, CD19, CD20, CD22, CD79a, CD79b, L26 i Pax-5 (BSAP).
[0021] Ovde je, takođe, opisan i genetski modifikovan miš koji vrši ekspresiju hIL6, pri čemu miš ne pokazuje osobinu koja je odabrana između sledećeg: plazmacitoza, splenomegalija, povećanje limfnog čvora, nagomilane abnormalne ćelije u plazmi, te neka kombinacija navedenog. Miš može da uključuje slezenu koje je približno istte težine (u odnosu na telesnu težinu) kao u miša divljeg tipa. Limfni čvorovi ovog miša mogu da budu približno jednake težine (u odnosu na telesnu težinu) kao u miša divljeg tipa. Ćelije plazme ovog miša ne moraju da pokazuju plazmacitoru plazmacitozu koja je karakteristična za miševe koji vrše preekspresiju prekomernu ekspresiju humanog IL-6. Miš ne mora da pokazuje glomerulonefritis. Miš može da ispolji nivo mezangijalnih ćelija koji može da se poredi s onim u miša divljeg tipa.
[0022] Ovde je takođe opisan genetski modiikovan miš koji vrši eskpresiju hIL6 iz endogenog mišjeg IL-6 lokusa, gde je endogeni mišji IL-6 gen zamenjen s nekim hIL-6 genom, pri čemu miš ne pokazuje neku osobinu koja je odabrana između sledećeg: morfološki detektibilna neuropatologija, reaktivna astrocitoza, te neka kombinacija navedenog. Miš može da obuhvati mozak koji morfološki ne može da se razlikuje od mozga miša divljeg tipa. Miš može da uključuje moždano tkivo koje pokazuje nivo reaktivne astrocitoze koji nije veći od onoga u miša divljeg tipa. Miš koji ne mora da vrši ekspresiju humanog IL-6 u neuronima. Miš može da uključuje nivoe aktiviranih astrocita koji mogu da se porede s onima u miša divljeg tipa.
[0023] Miš može da obuhvata razgranate mikroglija-ćelije u beloj moždanoj supstanci, gde se razgranate mikroglija-ćelije nalaze u ekvivalentnoj količini s količinom razgranatih mikroglija-ćelija u miša divljeg tipa.
[0024] Miš koji ne pokazuje reaktivnu astrocitorzu. Bela supstanca navedenog miša morfološki ne mora da se razlikuje od bele supstance miša divljeg tipa. Na primer, ova bela supstanca navedenog miša ne mora da se histološki razlikuje od bele supstance miša divljeg tipa u odnosu na histohemijsko bojenje reaktivnih astrocita.
[0025] Ovaj miš može da ima mozak koji momorfološki ne može da se razlikuje od mozga miša divljeg tipa. Miš kao što je opisano može da uključuje moždano tkivo koje pokazuje nivo reaktivne astrocitoze koja nije viša od one u miša divljeg tipa.
[0026] Ovde je, takođe, opisan i genetski modifikovan miš koji vrši ekspresiju hIL6 iz endogenog mišjeg IL-6 lokusa, gde je endogeni mišji IL-6 gen zamenjen s nekim hIL-6 genom, a miš ne pokazuje neku osobinu koja je odabrana između sledećeg: životni vek koji je skraćen za 50% ili više, otkazivanje bubrega, hipergamaglobulinemija, povišeni megakariociti u slezeni, povišeni megakariociti u koštanoj srži, plazmacitoza slezene, plazmacitoza timusa, plazmacitoza limfnih čvorova, glomerulonefritis, glomeruloskleroza, te neka kombinacija navedenog.
[0027] Miševi mogu da imaju životni vek dulji od 20 sedmica, na primer ovi miševi mogu da imaju životni vek dulji 30 sedmica, 40 sedmica ili 50 sedmica. Miševi koju su ovde opisani mogu da imaju životni vek koji je približno jednak onom u miša divljeg tipa iste loze.
[0028] Ovi miševi mogu pokazati nivo megakariocita u slezeni koji nije viši od približno onoga nivoa megakariocita u miša divljeg tipa. Ovi miševi mogu obuhvatiti limfoidne organe koji su suštinski izbegli abnormalne i nagomilane plazmacitoidne ćelije.
[0029] Ovi miševi mogu pokazati nivoe gama globulina u serumu ekvivalentnima nivoima gama globulina u serumu miševa divljeg tipa. Nivoi α1- i δ-globulina u serumu miševa mogu da budu ekvivalentni nivoima α1- i δ-globulina u serumu miševa divljeg tipa iste loze.
[0030] Ovde je, takođe, opisan i genetski modifikovan miš koji vrši ekspresiju humanog IL-6 iz endogenog mišjeg IL-6 lokusa, gde je endogeni mišji IL-6 gen zamenjen s nekim hIL-6 genom, gde miš ne pokazuje jedno od sledećih osobina: propadanje mišića, povećan nivo katepsina B u poređenju s mišem divljeg tipa iste loze, povećani nivo katepsina A+B u poređenju s mišem divljeg tipa iste loze, povećana težina jetre u poređenju s mišem divljeg tipa iste loze, te neka kombinacija navedenoga.
[0031] Težina jetre miša može da bude oko 800-900 mg sa 12 sedmica.
[0032] Ovaj miš može pokazati nivo katepsina B tokom njegova života koji nije veći od onoga koji može da se uoči u miša divljeg tipa. Miš može pokazati nivo katepsina A+B tokom njegova života koji nije veći od nivoa koji može da se uoči kod miša divljeg tipa.
[0033] Ovaj miš može da, kao odrasli, pokazuje težinu gastroknemičkog mišića koja je unutar oko 10% težine miša divljeg tipa iste loze. Ovaj miš, kao odrasli, može da pokazuje težinu gastroknemičkog mišića koja je aproksimativo jednaka onoj za miša divljeg tipa.
[0034] Takođe je opisan miš koji sadrži neku nukleotidnu sekvencu koja kodira humani IL-6 protein, gde nukleotidna sekvenca koja kodira humani IL-6 protein zamenjuje u celosti ili delimično neku endogenu sekvencu koja kodira i endogeni mišji IL-6 protein.
[0035] Takođe je ovde opisan miš koji uključuje zamenu na endogenom mišjem IL-6 receptorskom lokusu mišje IL-6R α ektodome sa sekvencom ektodomena humanog IL-6R α da se formira himerni humani/mišji IL- 6R α gen.
[0036] Ovaj himerni IL-6R α gen koji je pod kontrolom mišjeg promotora i/ili mišjih regulatornih elemenata na endogenom mišjem IL-6R α lokusu.
[0037] Oko 35,4 kb mišje IL-6R α ektodomena-kodirajuće sekvence može biti zamenjeno sa oko 45,5 kb humane IL-6R ektodomena-kodirajuće sekvence. Ova humana IL-6R ektodomena-kodirajuća sekvenca koja obuhvata prvi (ATG) kodon u eksonu 1 do eksona 8
[0038] Ova mišja IL-6R α sekvenca koja se zameni može da obuhvati dodirnu sekvencu koja obuhvata eksone 1 do 8, na primer, eksoni 1 do 8 i deo introna 8 mogu biti obrisani.
[0039] Ovde je, takođe, opisan i genetski modifikovan miš koji obuhvata zamenu na endogenom mišjem IL-6 lokusu mišjeg gena koji kodira IL-6 s humanim genom koji kodira humani IL-6, gde je humani gen koji kodira humani IL-6 pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata na endogenom mišjem IL-6 lokusu.
[0040] Ovde je opisan humani gen koji kodira human IL-6 može biti humani IL-6 gen od BAC ID CTD-2369M23.
[0041] Ovaj miš može da vrši ekspresiju mišjeg IL-6R α. Ovaj miš može da vrši eksresiju humanog IL-6R α. Humanizovani IL-6R α može sadržati humanu ektodomenu. Humanizovani IL-6R α može da sadrži mišji transmembransku domenu i mišji citoplazmatsku domenu. Taj miš može da vrši ekspresiju humanizovanog IL-6R α što uključuje humanizaciju ektodomene ali ne i transmembransku i/ili citosolnu domenu.
[0042] Ovaj miš ne mora da pokazuje jednu od sledećih osobina: plazmocitoza, glomeruloskleroza, glomerulonefritis, otkazivanje bubrega, hipergamaglobulinemija, povišeni megakariociti u slezeni, povišeni megakariociti u koštanoj srži, splenomegalija, povećanje limfnog čvora, kompaktirane abonormalne plazma ćelije, te neka kombinacija navedenoga.
[0043] Takođe je ovde opisan genetski modifikovan miš što uključuje humanizaciju endogenog mišjeg IL-6R α gena, a humanizacija obuhvata zamenu mišje IL-6R α ektodomena-kodirajuće sekvence s humanom IL-6R α α ektodomena-kodirajućom sekvencom na endogenom mišjem IL-6R α lokusu.
[0044] Susedna mišja sekvenca koja uključuje mišje eksone 1 do 8 može da bude zamenjena sa susednim genomskim fragmentom humane IL-6R α sekvence koja kodira humani IL-6R α ektodomenu. Ovaj susedni genomski fragment humane IL-6R α sekvence koja kodira ektodomenu može da bude iz BAC CTD-2192J23.
[0045] Ovaj miš može još da uključuje humanizovani IL-6 gen. Ovaj miš može da uključuje zamenu na endogenom mišjem IL-6 lokusu nekog mišjeg IL-6 gena s humanim IL-6 genom. Takođe je opisan humanizovani IL-6 gen pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata
[0046] Takođe je ovde opisana metoda da se dobije humanizovani miš, koja uključuje zamenu neke mišje genske sekvence koja kodira mišji mouse IL-6 s humanim genom koji kodira humani IL-6.
[0047] Ova zamena može da bude na endogenom mišjem IL-6 lokusu, te humani gen koji kodira humani IL-6 može da bude operativno vezan za endogene mišje regulatorne sekvence.
[0048] Takođe je ovde opisana i metoda za dobijanje humanizovanog miša koja uključuje zamenu mišjih eksona koji kodiraju ektodomena sekvence mišjeg IL-6R α s humanim genomskim fragmentom koji kodira ektodomena sekvence humanog IL-6R α da se formira humanizovani IL-6R α gen.
[0049] Kao što je ovde opisano, zamena može da bude na endogenom mišjem IL-6R α lokusu, te humanizovani IL-6R α gen može da bude operativno vezan za endogene mišje regulatorne sekvence.
[0050] Ovde je opisan genetski modifikovan miš, koji sadrži humanizovani IL-6R α gen koji uključuje zamenu mišje ektodomena-kodirajuće sekvence s humanom ektodomena sekvencom, gde humanizovani IL-6R α gen uključuje mišju transmembransku sekvencu i mišju citoplazmatsku sekvencu; pri čemu miš nadalje uključuje neki gen koji kodira humani IL-6, gde je gen koji kodira humani IL-6 pod kontrolom endogenih mišjih IL-6 regulatornih elemenata.
[0051] Kao što je ovde opisano, miš možda ne može da vrši ekspresiju celovitog mišjeg IL-6R α i ne može da vrši ekspresiju mišjeg IL-6.
[0052] Ovde su opisani genetski modifikovani miševi koji sadrže genetske modifikacije u svojoj ćelijskoj liniji.
[0053] Kao što je ovde opisano, definisano je i dobijanje tkiva, ćelije ili membranskog fragmenta miša.
[0054] Ovo tkivo ili ćelija može pripadati mišu koji vrši ekspresiju humanog IL-6 proteina, ali ne vrši ekspresiju mišjeg IL-6 proteina. Ovo tkivo ili ćelija mogu pripadati mišu koji vrši ekspresiju humanizovanog IL-6Rα proteina, ali ne i mišjeg IL-6Rα proteina. Ovaj humanizovani IL-6Rα protein može uključiti humanu ektodomenu i mišju transmembransku domenu i mišju citosolnu domenu. Ovo tkivo ili ćelija mogu pripadati mišu koji vrši ekspresiju humanog IL-6, humanizovanog IL-6R α, a ne vrši ekspresiju mišjeg IL-6 i ne vrši ekspresiju IL-6R α što obuhvata mišju ektodomenu
[0055] Ovde je takođe opisann ex vivo kompleks mišje ćelije koja nosi neki humanizovani IL-6R α (humana ektodomena i mišja transmembranska i mišja citoplazmatska domena) i humani IL-6.
[0056] Takođe je opisan mišji embrion koji obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano.
[0057] Takođe je opisan mišji domaćinski embrion koji uključuje donorsku ćeliju koja uključuje neku genetsku modifikaciju kako je ovde opisano.
[0058] Takođe je ovde opisana i neka pluripotentna ili totipotentna ne-humana životinjska ćelija koja uključuje genetsku modifikaciju kao što je ovde opisano. Ova ćelija može da bude ćelija glodara. Ova ćelija može biti ES ćelija.
[0059] Takođe je ovde opisano mišje jaje, pri čemu mišje jaje sadrži ektopični mišji hromosom, pri čemu ektopični mišji hromosom sadrži neku genetsku modifikaciju kao što je ovde opisano.
[0060] Ovaj miš, embrion, jaje ili ćelija je genetski modifikovan da uključi humani IL-6 gen ili humani ili humanizovani IL-6R α gen a koji pripada mišu koji je C57BL loze koja je odabrana iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, te C57BL/OIa. U drugoj realizaciji, ovaj miš koji je 129 loze koja je odabrana iz grupe koji sačinjavaju loze koje su 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr. 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (vidi, npr., Festing i saradnici (1999): Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, vidi takođe, Auerbach i saradnici (2000): Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). Ovaj genetski modifikovan miš može biti mešavina gore navedene 129 loze i gore navedene C57BL/6 loze. Ovaj miš može biti mešavina gore pomenute 129 loze, ili je mešavina gore pomenutih BL/6 loza. Ova 129 loza ove mešavine može biti 129S6 (129/SvEvTac) loza. Ovaj miš može biti BALB loze, npr. BALB/c loze. Ovaj miš može biti mešavina neke BALB loze i druge, gore pomenute loze. Ovaj miš može biti miš koji je poznat kao švajcarski (Swiss) ili švajcarski Webster (Swiss Webster) miš.
[0061] Svaki od ovih aspekata i ovde opisane realizacije mogu da se koriste zajedno, sve dok to nije eksplicitno isključeno ili jasno iz konteksta same realizacije ili aspekta.
KRATAK OPIS SLIKA
[0062]
SL. 1 je samo ilustracija, koja nije u srazmeri, humanih (gore) i mišjih (dole) IL-6 genomskih lokusa. Eksoni I, II, III, IV i V (i humani i mišji) obeleženi su tamnijim pravougaonicima desno na slici. Odabrani regioni za koje se smatra da su regulatorni obeleženi su svetlijim pravougaonicima levo na slici.
SL. 2 prikazuje odgovor u akutnoj fazi (mSAA nivo) uz prisustvo ili odsustvo terpentina u miševima divljeg tipa, humanizovanim ektodomena IL-6R miševima, te miševima s humanizovanim IL-6 i IL-6R genima.
SL. 3 prikazuje terpentin-ovisni odgovor u akutnoj fazi (SAA) u miševa divljeg tipa uz odsustvo ili prisustvo anti-mišjeg IL-6R antitela (levo); te terpentin-ovisni odgovor u akutnoj fazi u humanizovanih IL-6/IL-6R miševa uz odsustvo ili prisustvo anti-humanog IL-6R antitela (desno).
SL. 4 prikazuje FACS analizu B ćelija slezene u miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; marker pan B ćelije.
SL. 5 prikazuje FACS analizu T ćelija slezene miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; T helper ćelije i citotoksične T ćelije
SL. 6 prikazuje FACS analizu ćelija slezene miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; Ly6G/C(Gr1).
SL. 7 prikazuje FACS analizu ćelija slezene miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; NK ćelije i granulocita (Ly6G<hi+>/CD11b<hi+>).
SL. 8 prikazuje FACS analizu B ćelija krvi miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; marker pan B ćelija.
SL. 9 prikazuje FACS analizu T ćelija krvi miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; T helper ćelije i citotoksične T ćelije.
SL.10 prikazuje FACS analizu mijeloidnih ćelija krvi miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; Gr1<+>ćelije.
SL.11 prikazuje FACS analizu mijeloidnih ćelija krvi miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; CD11b vs.Ly6G/C(Gr1).
SL.12 prikazuje FACS analizu mijeloidnih ćelija krvi miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-6 miševa; DX5 vs.CD11b ćelija.
SL.13 prikazuje FACS analizu koštane srži IgM/CD24/B220 za miševe divljeg tipa i humanizovane IL-6 miševe. Gore: normalna progresija u koštanoj srži. Dole: FACS analiza za divlji tip, hIL-6 heterozigote, te hIL-6 homozigote (IgM bojenje).
SL.14 prikazuje FACS analizu koštane srži IgM/CD24/B220 za miševe divljeg tipa i humanizovane IL-6 miševe. Gore: normalna progresija u koštanoj srži. Dole: FACS analiza za divlji tip, hIL-6 heterozigote, te hIL-6 homozigote (CD24 bojenje).
SL.15 prikazuje FACS analizu koštane srži CD43 i B220 za miševe divljeg tipa i humanizovane IL-6 miševe. Gore: normalna progresija u koštanoj srži. Dole: FACS analiza za divlji tip, hIL-6 heterozigote, te hIL-6 homozigote (CD43 bojenje).
DETALJI PRONALASKA
IL-6 i IL-6R
[0063] IL-6 receptor (IL-6R) dugo je bio karakterizovan kao receptor za stimulativni faktor B ćelije (BSF-2, ili stimulativni faktor 2 B ćelije; takođe, BCDF ili diferencijacijski faktor B ćelije) koji je odgovoran za indukovanje B ćelija da sintetišu imunoglobulin (Yamasaki i saradnici (1988): Cloning and Expression of the Human Interleukin-6(BSF-2/IFNβ 2) Receptor, Science 241:825-828). IL-6 bio je prvo opisan kao interferon-β2 kao rezultat njegova pronalaska tokom potrage za virusno-indukovanim proteinom koji je nazvan interferon-β, tretiranjem humanih fibroblasta s dsRNA poli(I)poli(C) da se indukuje anti-virusni odgovor (Weissenbach i saradnici (1980): Two interferon mRNAs in human fibroblasts: In vitro translation and Escherichia coli cloning studies, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77(12):7152-7156; Keller i saradnici (1996): Molecular and Cellular Biology of Interleukin-6 and Its Receptor, Frontiers in Bioscience 1:d340-357.
[0064] Humana cDNA kodira protein s 468 aminokiselina koji ima 19-mernu signalnu sekvencu i citoplazmatsku domenu od oko 82 aminokiselina kojoj nedostaje tirozin kinaza domena (vidi, Id.). N-terminalni (ektodomena) protein ima Ig superfamilija domenu od oko 90 aminokiselina, 250-aminokiselinsku domenu između Ig superfamilija domene i membrane, te transmembranski raspon od oko 28 aminokiselina (vidi, Id.). Ektodomena receptora veže njegov ligand IL-6, koji pokreće asocijaciju s gp130 u membrani i to je kompleks koji provodi prevođenje signala; citoplazmatska domena navodno ne prevodi signal (Taga i saradnici (1989): Interleukin-6 Triggers the Association of Its Receptor with a Possible Signal Transducer, gp130, Cell 58:573-581). Stvarno, rastvorljiva forma IL-6R kojoj nedostaje citoplazmatska domena može da se poveže s IL-6 i veže gp130 na površini ćelije te efikasno prevede signal (Id.).
[0065] Homologija hIL-6R i mIL-6R na nivou proteina je samo oko 54%; transmembranska domena ima homologiju od oko 79%, dok citoplazmatska domena ima homologiju od oko 54% (Sugito i saradnici (1990)).
[0066] Prirodni ligand za IL-6R, IL-6, bio je prvo izolovan iz kultura HTLV-1-transformisanih T ćelija (vidi, Hirano i saradnici (1985): Purification to homogeneity and characterization of human B cell differentiation factor (BCDF or BSFp-2), Natl. Acad. Sci. USA 82:5490-5494). Humana cDNA za IL-6 gen klonirana je bar dva puta, jednom kao BSF-2 (vidi, Hirano i saradnici (1086): Complementary DNA fro a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin, Nature 324:73-76) te jednom kao IFN δ 2 (vidi, Zilberstein i saradnici (1986): Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines, EMBO 5:2529-2537), mada se od tada pokazalo da rekombinantni humani IL-6 ne pokazuje IFN aktivnost koja može da se detektuje. [0067] Humani IL-6 je protein s 184 aminokiseline koji pokazuje samo oko 42% homologije s mišjim IL-6, mada je genomska organizacija humanih i mišjih gena u osnovi jednaka, te promotorski regioni humanih i mišjih gena dele 400-bp raspon koji je jako sačuvan (vidi, Tanabe i saradnici (1988): Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene: High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Im- munol.141(11):3875-3881).
[0068] Humani IL-6 gen je oko 5 kb (Yasukawa i saradnici (1987): Structure and expression of human B cell stimulatory factor-2 (BSC-2/IL-6) gene, EMBO J. 6(10):2939-2945), dok je mišji IL-6 gen oko 7 kb (Tanabe i saradnici (1988): Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene: High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol. 141(11):3875-3881). Mišji i humani IL-6 geni navodno dele jako sačuvanu 5'-bočnu sekvencu koja je značajna za regulisanje. Šematski dijagram humanog i mišjeg IL-6 genomskog lokusa prikazan je na sl. 1 (nije u srazmeri). Eksoni I, II, III, IV i V (i humani i mišji) naznačeni su kao tamniji pravougaonici desno na slici. Odabrani regioni za koje se smatra da su regulatorni su naznačeni svetlijim pravougaonicima levo na slici. Podrazumevani regulatorni regioni za čoveka su, s leva na desno, glukokortikoidni element od -557 do -552; jezgro sekvence IFN pojačivača od -472 do -468; glukokortikoidni element od -466 do -461; AT-bogati region od -395 do - 334, konsensus AP-1 vezujuće mesto od -383 do -277; jezgo sekvence IFN pojačivača od -253 do -248; motiv koji sadrži GGAAA od -205 do -192; c-fos SRE homologijska sekvenca od -169 do -82 koja sadrži jezgo sekvence IFN pojačivača, element cAMP-odgovora, GGAAA motiv , CCAAT kutija, te GC-bogati region; i AP-1 vezujuće mesto od -61 do -55; te CCAAT polje od -61 do -55; i CCAAT polje od -34 to -30. -34 do -30. Opšte uzeti regulatorni regioni za miš su, s leva na desno, GC bogati region od - 553 do -536, glukokortikoidni element od -521 do -516 i od -500 do -495; Z-DNA raspon od -447 do -396; AP-1 vezujuće mesto koje se preklapa s jzgrom sekvence IFN pojačivača od -277 do -288, GGAAA motiv koji se preklapa s jezgrom IFN pojačivača od -210 do -195; c-fos SRE homologni region od -171 do -82 koji sadrži neki element cAMP odgovora, cAMP odgovora, GGAAA motiv koji se preklapa s jezgrom sekvence IFN pojačivača, GC-bogati region; te, neko AP-1 vezujuće mesto od -61 do -55. Mišji kodoni I-V imaju duljine 19, 185, 114, 150, odnosno 165. Duljine mišjeg introna su: I-II, 162 bp; II-III, 1253 bp; III-IV, 2981 bp; IV-V, 1281 bp. Humani kodoni I-V imaju dužine 19, 191, 114, 147, i 165. Duljine humanog introna su I-II , 154; II-III, 1047; III-IV, 706; IV-V, 1737. Podaci o organizaciji genoma su od Tanabe i saradnici (1988), i Yasukawa i saradnici (1987) Structure and expression of human B cell stimulatory factor-2 (BSF-2/IL-6) gene, EMBO J.9(10):2939-2945.
[0069] Razumno je pretpostaviti da mišji i humani IL-6 geni budu slično regulisani obzirom na sličnost njihovih 5'-bočnih sekvenci. Različiti tipovi ćelija pokazuju pojačanu IL-6 ekspresiju kao odgovor na IL-1, TNF, PDGF, IFN δ, serum, poli(I)poli(C), te cikloheksimid (vidi, Tanabe i saradnici (1988). IL-6 u čoveka upravlja odgovorom u akutnoj fazi, hematopoezom, diferencijacijom B ćelija, aktivacijom T ćelija, rastom i/ili diferencijacijom i/ili aktivacijom različitih tipova ćelija (npr. hepatociti, fibroblasti, endotelne ćelije, neuroni, ćelije hipofize, limfomi, mijelomi, karcinomi dojke, NK ćelije, makrofagi, osteoklasti, itd.) (revijski prikazano u, npr., Heinrich i saradnici (1990), Kishimoto i saradnici (1989), te Keller i saradnici (1996); Sugita i saradnici (1990): Functional Murine Interleukin Receptor with Intracisternal A Particle Gene Product at its Cytoplasmic Domain, J. Exp. Med.171:2001-2009).
[0070] U praksi, međutim, miševi transgenični za humani IL-6 pokazuju ceo niz značajnih i iscrpljujućih patologija, što reflektuje značajnu pleitropiju IL-6 gena. Transgenični miševi koji poseduju 6.6-kb fragment koji sadrži IL-6 gen i µ pojačivač (Eµ) proizvode visoke koncentracije hIL-6 i ekstremno visoke nivoe IgG1 (120- do 400-struko u odnosu na miševe divljeg tipa), što se reflektuje IL-6 deregulacijom koja je popraćena plazmacitozom, mezangio-proliferativnim glomerulonefritisom, te visokim nivoom megakariocita u koštanoj srži (Suematsu i saradnici (1989): IgG1 plasmacytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:7547-7551). Aberantno regulisanje IL-6 i/ili IL-6R povezano je s mijelomima, plastocitomima, reumatoidnim artritisom, Castleman-ovom bolešću, mezangijalnim proliferativnim glomerulonefritisom, srčanim miksomom, neoplazijama plama ćelija, psorijazom, i drugim poremećajima (vidi, Kishimoto, T. (1989): The Biology of Interleukin-6, Blood 74(1):1-10; Sugita i saradnici (1990); takođe, Hirano i saradnici (1990): Biological and clinical aspects of interleukin 6, Immunology Today 11(12):443-449)). IL-6 takođe učestvuje u zadržavanju nivoa intraprostatičkih androgena tokom terapije obaranja androgena u bolesnika koji imaju karcinom prostate pomoću nekog parakrinog i/ili autokrinog mehanizma, što potencijalno može da dovede do kastracijarezistentnog rasta tumora prostate (Chun i saradnici (2009): Interleukin-6 Regulates Androgen Synthesis in Prostate Cancer Cells, Clin. Cancer Res.15:4815-4822).
[0071] Humani protein je kodiran kao protein s 212 aminokiselina, u zreloj formi 184 aminokiselinski protein sledi cepanje 28 aminokiselinske signalne sekvence. On sadrži dva mesta za N-glikozilaciju i dva mesta za O-glikozilaciju, te je humani IL-6 fosofriliran u nekim ćelijama. Mišji protein je kodiran kao protein s 211 aminokiselina, u zreloj formi 187 aminokiselinski protein sledi cepanje 23 aminokiselinske signalne sekvence. Postoje mesta O-glikozilacije, ali ne i mesta N-glikozilacije (vidi revijske prikaze o IL-6, npr., Heinrich i saradnici (1990): Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J.265:621-636.).
[0072] IL-6 funkcija je pleiotropna. IL-6 receptor nađen je na aktiviranim B ćelijama ali navodno ne i na mirujućim B ćelijama. Nasuprot tome, IL-6R je nađen na mirujućim T ćelijama i navodno promoviše diferencijaciju, aktivaciju i proliferaciju T ćelija, uključujući diferencijaciju T ćelija u citotoksične T limfocite uz prisustvo IL-2.
Humanizovani IL-6/IL-6R ektodomena miševi i IL-6-upravljani odgovor u akutnoj fazi
[0073] U čoveka, IL-6 izaziva odgovor u akutnoj fazi. Rana ispitivanja s humanim hepatocitima su ustanovili da IL-6 indukuje proteine akutne faze kao što su, npr., C-reaktivni protein (CRP) i serumski amiloid A (SAA) na način koji ovisi o dozi i o vremenu (revijski prikaz u Heinrich i saradnici (1990): Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265:621-636.). Ne-humane životinje, npr. miševi i pacovi, koje sadrže humanizovane IL-6 i IL-6R gene su dakle korisni sistemi za merenje odgovora u akutnoj fazi kojima upravlja humani IL-6. Takve životinje su dakle korisne za određivanje da li supstanca indukuje neki IL-6-upravljani odgovor u akutnoj fazi, ekspozicijom neke humanizovane IL-6/IL-6R životinje kao što je ovde opisano prema supstanci, te merenjem nivoa jednog ili više proteina (ili RNA-ova) pri odgovoru u akutnoj fazi. U jednoj realizaciji, humanizovana životinja izložena je supstanci uz prisustvo nekog antagonista humanog IL-6R, pa je meren nivo jednog ili više proteina (ili RNA-ova) pri odgovoru na u akutnoj fazi, pri čemu smanjenje nivoa proteina pri odgovoru u akutnoj fazi (ili RNA) uz prisustvo humanog IL-6R antagonista ukazuje na humani IL-6R-upravljani odgovor u akutnoj fazi.
[0074] Humani IL-6 može da veže i humani IL-6R i mišji IL-6R; mišji IL-6 veže mišji IL-6R ali ne humani IL-6R (nema vezanja mIL-6 za hIL-6 koje je detektovano, dok hIL-6 može da se takmiči s mIL-6 za vezanje s mIL-6; Coulie i saradnici (1989): High-and low-affinity receptors for murine interleukin 6. Distinct distribution on B and T cells, Eur. J. Immunol.19:2107-211); vidi takođe, npr., Peters i saradnici (1996): The Function of the Soluble Interleukin 6 (IL-6) Receptor In Vivo: Sensitization of Human Soluble IL-6 Receptor Transgenic Mice Towards IL-6 and Prolongation of the Plasma Half-life of IL-6, J. Exp. Med. 183:1399-1406). Dakle, humane ćelije koje nose hIL-6R u nekom mišu (npr. u nekom ksenogeničnom transplantatu) ne mogu da se oslone na endogeni mIL-6 da bi mogle da se izvrše funkcije kojima upravlja IL-6, uključujući, ali bez ograničenja ulogu IL-6 krvnih ćelija ili razvoj limfocita (npr. hematopoeza, aktivacija B ćelija, aktivacija T ćelija, itd.).
[0075] IU nekom mešovitom in vivo sistemu koji se sastoji od mišjeg (divlji tip) IL-6 gena i humanog IL-6R gena (ali bez mišjeg IL-6R gena), od pokretača odgovora u akutnoj fazi se ne očekuje da indukuje detektibilne nivoe proteina u akutnoj fazi koji bi ukazivali na odgovor u akutnoj fazi. Međutim, humanizovani miš kao što je ovde opisano, koji sadrži humanizovani IL-6 gen i IL-6R gen koji sadrži humanizovanu ektodomena sekvencu, će da odgovori na pokretača odgovora u akutnoj fazi i pokaže proteine u serumu kao odgovor na akutnu fazu. Miševi divljeg tipa za IL-6/IL-6R koji su testirani na proteine akutne faze uz prisustvo ili odsustvo terpentinskog pokretača akutne faze su pokazali terpention-ovisno povećanje proteina u akutnoj fazi. Miševi s humanizovanim IL-6 genom, ali ne IL-6R, nisu pokazali odgovor u akutnoj fazi uz prisustvo terpentina. Ali miševi koji nose i humani IL-6 gen i IL-6R gen s humanizovanom ektodomenom pokazali su jak odgovor u akutnoj fazi (sl. 2). IL-6-upravljani odgovor u akutnoj fazi bio je ovisan o IL-6 i u miševa divljeg tipa (sl. 3, 3, gore) i u humanizovanih IL-6/IL-6R ektodomena miševa (slika 3, dole), što je dokazano sposobnošću odgovarajućeg anti-IL-6R antitela da poništi odgovor u akutnoj fazi uz dovoljno visoku dozu antitela. Dakle, dvostruka humanizacija IL-6 i IL-6R predstavlja rekapitulaciju za divlji tip IL-6-upravljani odgovor u akutnoj fazi u odnosu na serumske proteine akutne faze
Genetski modifikovani miševi
[0076] Definisani su genetski modifikovani miševi koji vrše ekspresiju humanog IL-6 i/ili humanizovanog IL-6 receptora s endogenih mišjih lokusa, gde je endogeni mišji IL-6 gen i/ili endogeni mišji IL-6 receptorski gen zamenjen s humanim IL-6 genom i/ili humanom sekvencom što uključuje sekvencu koja kodira ektodomenu humanog IL-6 receptora. Genetski modifikovani miševi vrše ekspresiju humanog IL-6 i/ili humanizovanog IL-6 receptora s humanizovanih endogenih lokusa koji su pod kontrolom mišjih promotora i/ili mišjih regulatornih elemenata. Zamena(e) na endogenim mišjim lokusima daje(u) nehumane životinje koje vrše ekspresiju humanog IL-6 i humanizovanog IL-6 receptora na način koji ne rezultira panoplijom značajnih patoloških pojava koje su uočene u IL-6 transgeničnih miševa poznatih u tehnici.
[0077] Transgenični miševi koji vrše ekspresiju humanog IL-6 su poznati u tehnici. Međutim, oni generalno pate od značajnih patoloških pojava koje u velikoj meri ograničuju njihovu korisnost. Humanizovani miševi kao što je ovde opisano vrše ekspresiju nekog humanog IL-6 i/ili humanizovanog IL-6 receptora pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata na endogenim mišjim IL-6 i IL-6R α lokusima. Ovi miševi, nasuprot tome, pokazuju slike ekspresije u odnosu na ove gene koje se razlikuju od transgeničnih miševa poznatih u tehnici.
[0078] Zamena ne-humanih gena u nekoj ne-humanoj životinji s homolognim ili ortolognim humanim genima ili humanim sekvencama, na endogenim ne-humanim lokusima i pod kontrolom endogenih promotora i/ili regulatornih elemenata, može da rezultira u ne-humanih životinja kvalitetom i karakteristikama koje mogu da se suštinski razlikuju od tipične nokaut-plus-transgenične životinje. U tipičnoj nokaut-plus-transgeničnoj životinji, neki endogeni lokus se uklanja ili ošteti te se celoviti humani transgen ubacuje u životinjski genom i verovatno integriše nasumično u genom. Tipično, lokacija integrisanog transgena je nepoznata; za ekspresiju humanog proteina koja se meri transkripcijom humanog gena i/ili analize proteina i/ili funkcionalne analize. Uključivanje u humani transgen uzvodnih i/ili „nizvodnih“ humanih sekvenci se očito pretpostavlja da je dovoljno da obezbedi podesnu podršku za ekspresiju i/ili regulaciju transgena bez obzira gde se u životinjskom genomu smesti transgen. Ali u mnogim slučajevima transgeničnost s humanim regulatornim elementima ima ekspresiju na način koji je nefiziološki ili na drugi način nezadovoljavajući, te može stvarno da bude štetna za životinju. Nasuprot tome, pronalazači su pokazali da zamena s humanom sekvencom na endogenom lokusu pod kontrolom endogenih regulatornih elemenata omogućuje fiziološki odgovarajuću sliku ekspresije i nivo koji rezultira korisnom humanizovanom životinjom čija je fiziologija u odnosu na zamenjeni gen smislena i odgovarajuća i dopuna je fiziologiji humanizovane životinje.
[0079] Oplođena mišja jaja injicirana su s nekim konstruktom koji poseduje MHC klasa I promotor H2 i β-globin intron pokretač ekspresije 695-bp mišjeg IL-6 gena što proizvodi miševe koji bazično vrše ekspresiju mišjeg IL-6 uz relativno visoki nivo (u poređenju s miševima divljeg tipa) (vidi, Woodrofe i saradnici (1992): Long-Term Consequences of Interleukin-6 Overexpression in Transgenic Mice, DNA and Cell Biology 11 (8):587-592). Ali ovi miševi su skloni da razviju limfome koji su povezani s crevima, limfnim čvorovima, te bubrezima, kao i s amiloidnim nakupinama u slezeni. Oni takođe pokazuju abnormalnu maturaciju B ćelija (vidi, Woodrofe i saradnici, Id.), pa je time ispitivanje funkcije B ćelija ugroženo. Nasuprot tome, miševi kao što je ovde opisano koji uključuju zamenu mišjeg IL-6 gena s humanim IL-6 genom na mišjem IL-6 lokusu nisu skloni tome da razviju ove limfome, te miševi pokazuju približno normalne populacije B ćelija.
[0080] Miševi (C57BL/6) koji su transgenični za hIL-6 zbog nasumičnog ubacivanja 6.6-kb (BamHI-Pvu II fragment) duljine humane DNA koja sadrži hIL-6 gen koji je povezan s IgM pojačivačem su poznati u literaturi (vidi, Suematsu i saradnici (1989): (1989) IgG1 plasmocytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7547-7551). Miševi vrše ekspresiju hIL-6 između 800 pg/mL i 20.000 pg/mL u serumu, pri čemu miševi divljeg tipa tipično vrše ekspresiju oko 100 pg/mL IL-6. Miševi pokazuju povećanje Ig u serumu (120 do 400-struko u odnosu na miševe divljeg tipa ) te smanjenje albumina sa starenjem. Miševi koji boluju od masivne plazmacitoze, pokazuju splenomegaliju i povećanje limfnog čvora, te pokazuju ćelije plazme i povišene megakariocite u koštanoj srži. Posle pregleda, čini se da su povećani limfni čvorovi zapravo nagomilana masa abnormalnih ćelija u plazmi. I slezena i timus pokazuju masivnu proliferaciju ćelija plazme, s infiltracijom u delove pluća, jetre i bubrega Bubrezi u ovih miševa takođe pokazuju IL-6-stimulisanu proliferaciju mezangijalnih ćelija koja je tipična za mezangioproliferativni glomerulonefritis. Slično, miševi (BALB/c) koji su transgenični za potkresanu hIL-6 cDNA pokrenutu pomoću H-2L<d>promotora nasumično ubačenog u genom pokazuju tešku plazmacitozu (vidi, Suematsu i saradnici (1992): Generation of plasmacytomas with the chromosomal translocation t(12;15) in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:232-235). Mada C57BL/6 miševi s preekspresijom hIL-6 ne razvijaju transplantirajuće plazmacitome (oni pokazuju plazmacitozu), transgenični BL/6 miševi koji su povratno ukršteni u BALB/c miševe prema izvorima ih razvijaju.
[0081] Nasumična transgeneza hIL-6 cDNA pokrenuta pomoću glijalnog fibrilarnog kiselog proteinskog (GFAP) genskog promotora navodno rezultira preekspresijom hIL-6 u mišjem centralnom nervnom sistemu, što takođe dovodi do značajnih patoloških pojava (vidi, Campbell i saradnici (1993): Neurologic disease induced in transgenic mice by cerebral overexpression of interleukin 6, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10061-10065). Ovi miševi pokazuju ekstenzivnu neuropatologiju i reaktivnu astrocitozu što je rezultat IL-6 ekspresije u CNS zbog gubitka kontrole kao posledica nasumične integracije IL-6 transgena na očigledno CNS-permisivnom transkripcijskom lokusu. Mada ekspresija hIL-6 cDNA koja je vezana za δ-globin 3'-UTR i pokrenuta pomoću neke neuron-specifične enolaza promotora mikroinjiciranog u oplođena mišja jajašca (F1 C57BL/6 × BALB/c) daje miševe s normalnim životnim vekom i bez očitih neuroloških defekata s ekspresijom hIL-6 u neuronima, ali nigde drugde (vidi, Fattor i saradnici (1994): IL-6 Expression in Neurons of Transgenic Mice Causes Reactive Astrocytosis and Increase in Ramified Microglial Cells But No Neuronal Damage, Eur. J. Neuroscience 7:2441-2449), miševi su pokazali visoke nivoe (20- do 30-struko veće nego u divljeg tipa) aktiviranih i povećanih astrocita s intenzivnijim procesima u celom mozgu, kao i 10- do 15-struko povećanje u razgranatim ćelijama mikroglija u beloj moždanoj supstanci. Dakle, moždana ekspresija IL-6 prema navodima dovodi do stanja u rasponu od reaktivne astrocitoze do jasne i duboke neuropatologije.
[0082] Mikroinjekcija u oplođena jajašca F1 ukrštenih C57BL/6x”DBAII” miševa 639-bp hIL-6 cDNA koja je povezana za δ-globin 3'-UTR i miševa MT-1 promotora navodno daje transgeničnog miša u kojem hIL-6 gen koji je nasumično integrisan rezultira oslabljenim i bolesnim mišem koji umire mlad zbog otkazivanja bubrega (vidi Fattori i saradnici (1994): Blood, Development of Progressive Kidney Damage and Myeloma Kidney in Interleukin-6 Transgenic Mice, Blood 63(9):2570-2579. Transgenični miševi žrtvovani su posle 12-20 sedmica i pokazali su povišene nivoe α1 i δ-globulina u plazmi, hipergamaglobulinemiju, povišene megakariocite u slezeni (3-struko veće nego u divljeg tipa ) i koštanoj srži, plazmacitozu limfoidnih organa (slezena, timus, te limfni čvorovi) koja je karakterizovana abnormalnom i kompaktno nagomilanim plazmocitoidnim ćelijama, te glomerulonefritis koji vodi do glomeruloskleroze koja je slična multiplom mijelomu.
[0083] Mikroinjekcija u oplođena jajašca C57BL/6J miševa H-2L<d>-pokrenutih hIL-6 cDNA izazvala je IL-6-ovisno propadanje mišića u miševa, koje je karakterizovano delimično značajno nižom težinom gastroknemičkog mišića u transgeničnih miševa u poređenju s težinski odgovarajućim kontrolama, a razlika se mogla ukloniti pomoću tretmana s nekim IL-6 antagonistom (vidi, Tsujinaka i saradnici (1996): Interleukin 6 Receptor Antibody Inhibits Muscle Atrophy and Modulates Proteolytic Systems in Interleukin 6 Transgenic Mice, J. Clin. Invest. 97(1):244-249). Posle 12 sedmica ovi miševi pokazali su serumske hIL-6 nivoe koji su bili veći od 600,000 pg/mL. Trangenični miševi takođe su imali jetru koja je težila oko 1,242 mg, u poređenju s kontrolnom jetrom koja je bila oko 862 mg. Transgenični miševi koji su tretirani s IL-6 antagonistom imali su jetru koja je težila oko 888 mg. Mišićni katepsini B i B+L bili su značajno povišeni (20-struko i 6.2-struko) u transgeničnih miševa nego u kontrola, a ovaj fenomen je bio eliminisan kada su transgenični miševi bili tretirani s nekim IL-6 antagonistom. Katepsin B i L mRNA-ovi su procenjeni na oko 277%, odnosno 257%, u poređenju s miševima divljeg tipa; pri čemu se razlika značajno smanjuje s tretmanom IL-6 antagonistom.
[0084] Miševi koji sadrže hIL-6 minigen kojega pokreće mišji MHC klasa I H-2Ld promotor te hIL-6R minigen kojega pokreće pileći δ-aktin promotor, te gp130 gen, pokazuju patologije koje su tipične za hIL-6 transgenične miševe (npr. hipergamaglobulinemija, splenomegalija, mezangijalni proliferativni glomerulonefritis, plućna limfoidna infiltracija) kao i ventrikularnu hipertrofiju (Hirota i saradnici (1995): Continuous activation of gp130, a signal-transducing receptor component for interleukin 6-related cytokines, causes myocardial hypertrophy in mice, Proc. Natl Acad. Sci. USA 92:4862-4866). Ventrikularna hipertrofija veruje se da je upravljana pomoću kontinuirane aktivacije gp130 (Id.). Uloga IL-6 se navodno sastoji u tome da pomogne jačanju citokinskog receptorskog kompleksa i da izazove dimerizaciju gp130, koja je komponenta koja prevodi signal odgovorna za prevođenje IL-6 signala (Paonessa i saradnici (1995): Two distinct and independent sites on IL-6 trigger gp130 dimer formation and signalling, EMBO J.14(9):1942-1951). Za aktivirani kompleks veruje se da je heksamer sastavljen od dva IL-6, a svaki IL-6 vezan je za jedan IL-6Rα i dva gp130 (svaki IL-6 sadrži dva neovisna gp130-vezujuća mesta) pokazujući 2:2:2 stehiometriju, pri čemu dimerizacija gp130 uzrokuje aktivaciju JAK-Tyk tirozin kinaza, fosforilaciju gp130 i STAT familije transkripcijskih faktora i drugih intracelularnih supstrata (Id.; Stahl, N. (1994): Association and Activation of Jak-Tyk Kinases by CNTF-LIF-OSM-IL-6 β Receptor Components, Science 263:92-95), konzistentno s generalnim modelom nastajanja citokinskog receptorskog kompleksa (vidi, Stahl, N. i Yancopoulos, G. (1993): The Alphas, Betas, and Kinases of Cytokine Receptor Complexes, Cell 74:587-590; Davis i saradnici (1993): LIFER δ and gp130 as Heterodimerizing Signal Transducers of the Tripartite CNTF Receptor, Science 260:1805-1808; Murakami i saradnici (1993): IL-6-Induced Homodimerization of gp130 and Associated Activation of a Tyrosine Kinase, Science 2601808-1810).
[0085] Miševi koji su transgenični za humani sIL-6R pokrenuti pomoću PEP karboksikinaza promotor pacova i humanog IL-6 pokrenutog pomoću nekog mišjeg metalotionein-1 promotora su navodno značajno manji nego miševi transgenični samo za humani IL-6 ili samo za humani human sIL-6R (Peters i saradnici (1997): Extramedullary Expansion of Hematopoietic Progenitor Cells in Interleukin(IL-)-6-sIL-6R Double Transgenic Mice, J. Exp. Med. 185(4):755-766), što se reflektuje smanjenom telesnom masnoćom i smanjenom težinom (20-25 g vs. 40 g). Dvostruko transgenični miševi navodno takođe pokazuju povećanje slezene (5-struko) i jetre (2-struko) u poređenju s, prema izvorima, normalnom težinom organa za jednostruko transgenične miševe, očigledno zbog to ekstramedularne proliferacije hematopoetskih ćelija slezene i jetre ali ne i koštane srži, kao i zbog povišenih megakariocita u slezeni i plazmacelularnim infiltratima u svim parenhimskim organima (Id.). Dvostruko transgenični miševi takođe imaju jetru s povećanjem od oko 200- do oko 300-struko u granulocitima, makrofagima, progenitorskim ćelijama, te B ćelijama u poređenju s jednostruko transgeničnim; a nasuprot tome, IL-6 jednostruko transgenični miševi pokazali su manje povećanje makrofaga (15-struko) i B ćelija (45-struko) (Id.). Ovaj izvanredan nalaz pretpostavljamo da je zbog stimulacije rasta i diferenciranja hematopoetskih progenitorskih ćelija aktivacijom gp130 prevođenja signala (Id.).
[0086] Nadalje, dvostruko transgenični (mišji metalotionin promotor-pokrenuti hIL-6/pacov PEP karboksinaza promotor-pokrenuti hIL-6R) miševi pokazuju hepatocelularnu hiperplaziju koja je navodno identična humanoj nodularnoj regenerativnoj hiperplaziji sa zadržanom hepatocitnom proliferacijom koja jako sugeriše da je IL-6 odgovoran za hepatocitnu proliferaciju i patogenu hepatocelularnu transformaciju (Maione i saradnici (1998): Coexpression of IL-6 and soluble IL-6R causes nodular regenerative hyperplasia and adenomas of the liver, EMBO J. 17(19):5588-5597). Budući da hepatocelularna hiperplazija nije prema prikazima uočena u jednostruko transgeničnih hIL-6 miševa, i hIL-6 može vezati mIL-6R, ovaj nalaz može da izgleda paradosalno sve dok se ne uzme u obzir da dvostruka transgeničnost može da rezultira višim nivoima hIL-6 kompleksiranih za rastvorljivi IL-6R (ovde, rastvorljivi hIL-6R), a taj kompleks je mnogo jači inhibitor nego što je sam IL-6 (Id.).
[0087] Za razliku od miševa koji su transgeni za humani IL-6, humanizovani IL-6 miševi koji sadrže zamenu na endogenom mišjem IL-6 lokusu, što zadržava mišje regulatorne elemente ali uključuje humanizaciju IL-6-kodirajuće sekvence, ne pokazuju teže patologije u miševa prethodne tehnike. Genetski modifikovani miševi koji su heterozigotni i homozigotni za hIL-6 bili su krajnje normalni.
[0088] Miiševi s humanizovanim IL-6 genom (MAID 760), kao što je opisano u primerima, bili su imunofenotipizovani i nađeno je da imaju normalni broj B ćelija u FACS analizama („ lymphocyte-gated“) B ćelija slezene korištenjem markera pan B ćelija (CD445R(B220)) (sl.4). Za slezenu, miševi divljeg tipa pokazuju 63% B ćelija; hIL-6 heterozigotni miševi pokazuju 63% B ćelija; a miševi homozigotni za hIL-6 na endogenom mišjem lokusu pokazuju 63% B ćelija. Brojevi B ćelija za homozigotne hIL-6 miševe imunizovane s TNP-KLH bili su takođe normalni (65% za divlji tip, te 61 % za hIL-6 homozigote).
[0089] T ćelije slezene bile su takođe približno jednake onima za divlji tip (SL. 5). Procenti T ćelija slezene za Thelper/Tcitotoksični bili su, za divlji tip 20%/40% (razmera 1,4:1); za hIL-6 heterozigote 23%/14% (razmera 1,6:1); za hIL-6 homozigote 21 %/15% (razmera 1,4:1) (markeri su CD8a-APC; CD4-FITC). Homozigotni hIL-6 miševi imunizovani s TNP-KLH pokazali su slične brojeve T ćelija kao divlji miševi, tj. Thelper/Tcitotoksični bio je 22%/20% (razmera 1,1:1) u poređenju s 21 %/19% za divlji tip (takođe razmera 1,1:1).
[0090] Humanizovani IL-6 miševi su takođe pokazali normalne nivoe NK ćelija slezene prema FACS analizi (CD11b i DX5) (SL. 7). hIL-6 heterozigoti su pokazali 2,2% NK ćelija, hIL-6 homozigoti pokazali su 1,8% NK ćelija, dok su miševi divljeg tipa pokazali 2,4% NK ćelija. Posle imunizacije s TNP-KLH, homozigoti su pokazali 1,6% NK ćelija slezene, dok su miševi divljeg tipa pokazali 2,1 % NK ćelija slezene.
[0091] Humanizovani IL-6 miševi su takođe pokazali normalne nivoe Ly6G/C(Gr1) ćelija u slezeni (sl.
6). hIL-6 heterozigoti su pokazali 7,0% GR1<+>ćelija (1,3% Gr1<hi>); homozigoti su pokazali 6,8% Gr1<+>ćelija (0,9% Gr1<hi>), dok su miševi divljeg tipa pokazali 8,0% Gr1<+>ćelija (1,8%Gr1<hi>). Imunizovani IL-6 homozigoti (imunizovani s TNP-KLH) pokazali su 11% Gr1<+>ćelija (4,0% Gr1<hi>), dok su miševi divljeg tipa pokazali 10% Gr1<+>ćelija (3,0% Gr1<hi>).
[0092] HHumanizovani IL-6 miševi takođe su pokazali normalne brojeve krvnih B i T ćelija u FACS analizi (SL. 8 i SL. 9). FAC-ovi s markerima pan B ćelija (CD445R(B220)) pokazali su da homozigotni hIL-6 miševi pokazuju 52% B ćelija u poređenju s 53% divljeg tipa; heterozigoti pokazuju 38% (prosek dva različita bojenja od 29% i 47%). Homozigotni hIL-6 miševi imunizovani s TNP-KLH dali su slične brojeve B ćelija (43%, u poređenju s 45% za miševe divljeg tipa).
[0093] Humanizovani IL-6 miševi pokazali su normalne brojeve krvnih T ćelija u FACS analizi što je izmereno pomoću CD8a i CD4 bojenja. Heterozigotni hIL-6 miševi pokazali su brojeve Thelper/Tcitotoksični od 39%/26% (razmera 1,5:1); homozigotni hIL-6 miševi pokazali su Th/Tc brojeve od 24%/20% (razmera 1,2:1), dok su miševi divljeg tipa pokazali Th/Tc brojeve od 26%/20% (razmera 1,3:1). Homozigotni hIL-6 miševi imunizovani s TNP-KLH imali su Th/Tc brojeve od 29%/21% (razmera 1,4:1), dok su imunizovani miševi divljeg tipa imali Th/Tc brojeve od 28%/23% (1,2:1).
[0094] Humanizovani IL-6 miševi su takođe pokazali broj mijeloidnih ćelija u krvi koji je bio sličan onom u miševa divljeg tipa što je izmereno pomoću FACS analize bojenja krvi prirodnih i imunizovanih miševa s Ly6G/C(Gr1) i CD11b, kao i CD11 b i DX5 (SL.10, SL.11 i SL.12). Heterozigotni hIL-6 miševi pokazali su %Gr<+>ćelije od 10,8%, homozigotni 6,9%, dok su miševi divljeg tipa pokazali 9,7%. Imunizovani hIL-6 homozigoti pokazali su M1(Ly6G/C(Gr) od 101-104) / M2(Ly6G/C(Gr) bojenje od oko 102-103) brojeve od 43%/34%, dok su miševi divljeg tipa imali brojeve od 45%/38%. FACS dijagrami CD11b (vertikalna osa) vs. Ly6G/C (horizontalna osa) za imunizovane homozigotne hIL-6 miševe pokazali su procente ćelija u kvadrantima (gornji levi/gornji desni/donji desni) od 16%/8%/3%, što je bilo identično kvadrant brojevima za imunizovani divlji tip.
[0095] Homozigotni TNP-KLH-imunizovani humanizovani IL-6 miševi pokazali su CD11b vs. DX5(NK) bojenje FACS dijagrame koji su bili slični imunizovanim miševima divljeg tipa. Kvadrantna analiza krvi FACS dijagrama (CD11b vertikalna osa, DX5(NK) horizontalna osa) dala je za gornji levi/gornji desni/donji desni brojeve od 9,5%/17%/10% za hIL-6 homozigote i 6,5%/17,3%/14% za miševe divljeg tipa.
[0096] Humanizovani IL-6 miševi pokazali su određeni izotipski odgovor koji je bio suštinski jednak onome koje je uočen u miševa divljeg tipa. Rani i završni nivoi IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE i IgM bili su približno jednaki onima u miševa divljeg tipa. U jednom eksperimentu, završni IgM bio je nešto viši u humanizovanih miševa; završni IgG3 bio je takođe povišen u humanizovanih miševa.
[0097] Razvoj B ćelija u prirodnih hIL-6 miševa suštinski ne može da se razlikuje od razvoja u miševa divljeg tipa bazirano na FACS analizi koštane srži IgM/CD24/B220 bojenjem (sl. 13). Imunofenotipizacija imunih miševa je pokazala da su obeležene populacije za različite tipove ćelija u progresiji razvoja B ćelija zapravo normalne u hIL-6 miševa. Progresija ćelija iz hematopoetskih matičnih ćelija, zajednički limfoidni progenitori, ProB ćelije, PreB ćelije, te nesazrele i zrele B ćelije su normalne u hIL-6 miševa (SL.14 i SL.15)
PRIMERI
Primer 1: Zamena endogenog mišjeg IL-6 gena s hIL-6 genom
[0098] 4.8-kb humani IL-6 gen koji sadrži eksone 1 do 4 humanog IL-6 gena zamenio je 6.8 kb lokus mišjeg IL-6 gena.
[0099] Ciljani konstrukt za zamenu mišjeg s nekim humanim IL-6 genom u jednom ciljanom stepenu je konstruisan koristeći VELOCIGENE® tehnologiju genetskog inženjeringa (vidi, Valenzuela i saradnici (2003): High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). Mišji i humani IL-6 DNA dobijeni su iz bakterijskog veštačkog hromosoma (BAC) RPCI-23 klon 368C3, odnosno od BAC CTD klon 2369M23. Ukratko, neki Notl linearizovani ciljani konstrukt koji je generisan kloniranjem koje popravlja prazninu koja sadrži bočne krake mišje IL-6 „uzvodne“ i „nizvodne“ homologije 4.8 kb humane IL-6 sekvence koja se pruža od ATG od eksona 1 do eksona 5 sa 16 nukleotida 3' „nizvodne“ sekvence (genomske koordinate: NCBIh37.1: ch7:22,766,882 do 22,771,637) te floks neo selekcijske kasete, bio je elektroporiran u F1 H4 mišje embionske matične (ES) ćelije (C57BL/6 × 129 F1 hibrid). Korektno naciljane ES ćelije (MAID 790) bile su dalje elektroporirane s tranzijentnim Cre-ekspresijskim vektorom da se ukloni selekcijska kaseta leka. Klonovi ciljane ES ćelije bez kasete leka (MAID 1428) su uneseni u mišji embrion u stepenu 8-ćelija pomoću VELOCIMOUSE® metode (vidi, američki patent br 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, te Poueymirou i saradnici (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi koji su u celosti izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nose humanizovani IL-6 gen su identifikovani pomoću gentotipa na gubitak mišjeg alela i dobitak humanog alela pomoću modifikacije analize alela (vidi, Valenzuela i saradnici (2003)).
[0100] Korektno naciljani klonovi ES ćelija su identifikovani pomoću analize gubitka prirodnog alela (LONA) (Valenzuela i saradnici 2003) pri čemu je broj kopija prirodnog, nemodifikovanog 116 gena određen pomoću dve TaqMan™ kvantitativne polimeraza lančane reakcije (qPCR-ovi) specifične za sekvence u mišjem 116 genu koji je meta za brisanje. qPCR analize uključuju sledeće setove „prajmer“sonda (pisano od 5' prema 3'): „uzvodni“ usmereni početni oligonukleotid („prajmer“), TTGCCGGTTT TCCCTTTTCT C (sekv id br: 1); „uzvodni“ reverzni početni oligonukleotid („prajmer“), AGGGAAGGCC GTGGTTGTC (sekv id br: 2); „uzvodna“ sonda, FAM-CCAGCATCAG TCCCAAGAAG GCAACT-BHQ (sekv id br: 3); „nizvodni“ usmereni početni oligonukleotid („prajmer“), TCAGAGTGTG GGCGAACAAA G (sekv id br: 4); „nizvodni“ reverzni početni oligonukleotid („prajmer“), GTGGCAAAAG CAGCCTTAGC (sekv id br: 5); „nizvodna“ sonda, FAM-TCATTCCAGG CCCTTCTTAT TGCATCTG-BHQ (sekv id br: 6); gde se FAM odnosi na 5-karboksifluorescein fluorescentnu sondu i BHQ se odnosi na gasitelja fluorescence koji je tipa crne rupe (Biosearch Technologies). DNA koja je prečišćena iz klonova ES ćelija koje su uzete kao ciljani vektor i ugrađene u njihovim genomima su kombinovane sa smešom TaqMan™ Gene Expression Master (Life Technologies) prema sugestijama proizvođača na PCR ploči s 384 bunarića (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) te obrađena u uređaju Applied Biosystems Prism 7900HT, koji sakuplja podatke o fluorescenciji u vremenu dok traju PCR-ovi te određuje granicu ciklusa (Ct), frakcioni PCR ciklus u kojem akumulisana fluorescenca dostigne unapred određenu granicu. „Uzvodni“ i „nizvodni“ //6-specifični qPCR-ovi i dva qPCR-a za ne-ciljane referentne gene su analizirani za svaki DNA uzorak. Izračunate su razlike Ct vrednosti (ΔCt) između svakog //6-specifičnog qPCR i svakog referentnog gena qPCR, a zatim je izračunata razlika između između svakog ΔCt i srednja vrednost ΔCt za sve analizirane uzorke da se dobiju ΔΔCt vrednosti za svaki uzorak. Broj kopija //6 gena u svakom uzorku izračunata je iz sledeće formule: broj kopija = 2 • 2-<ΔΔCt>. Korektno naciljan klon, koji je izgubio jednu od svojih prirodnih kopija, će da ima 116 genski broj kopije jednak sa jedan. Potvrda da je humana IL6 genska sekvenca zamenila obrisanu mišju 116 gensku sekvencu u humanizovanom alelu potvrđena je pomoću TaqMan™ qPCR analize koja uključuje sledeće setove „prajmer“-sonda (pisano od 5' prema 3'): humani usmereni početni oligonukleotid („prajmer“), CCCCACTCCACTGGAATTTG (sekv id br: 7); humani reverzni početni oligonukleotid („prajmer“), GTTCAACCACAGCCAGGAAAG (sekv id br: 8); te humana sonda, FAM-AGCTACAACTCATTGGCATCCTGGCAA-BHQ (sekv id br: 9).
[0101] Ista LONA analiza je korištena za analizu DNA prečišćenu iz biopsija repa za miševe koji su izvedeni iz ciljanih ES ćelija da se odrede njihovi 116 genotipovi i da se potvrdi da je humanizovani 116 alel prenesen kroz ćelijsku liniju. Dva potomka koji su heterozigotni za zamenu su u stanju da generišu miša koji je homozigotni za zamenu endogenog mišjeg IL-6 gena s humanim IL-6 genom. Potomci koji su homozigotni za zamenu koriste se za fenotipizaciju.
[0102] Veza prema gore mišjeg lokusa („uzvodna“) i sekvence koja sadrži hIL-6 gen je formirana tako da bude unutar 5’-AATTAGAGAG TTGACTCCTA ATAAATATGA GACTGGGGAT GTCTGTAGCT CATTCTGCTC TGGAGCCCAC CAAGAACGAT AGTCAATTCC AGAAACCGCT ATGAACTCCT TCTCCACAAG TAAGTGCAGG AAATCCTTAG CCCTGGAACT GCCAGCGGCG GTCGAGCCCT GTGTGAGGGA GGGGTGTGTG GCCCAGG (sek id br:10), pri čemu je završni mišji nukleotid pre prvog nukleotida humanog gena “T” u CCGCT, te prvi nukleotid humane sekvence je prvi “A” u ATGAA. „Nizvodna“ veza sekvence koja sadrži hIL-6 gen i mišjeg lokusa je formirana tako da bude unutar 5’-TTTTAAAGAA ATATTTATAT TGTATTTATA TAATGTATAA ATGGTTTTTA TACCAATAAA TGGCATTTTA AAAAATTCAG CAACTTTGAG TGTGTCACGC TCCCGGGCTC GA- TAACTATA ACGGTCCTAA GGTAGCGACT CGAGATAACT T-3’ (sek id br:11), pri čemu je završni nukleotid humane sekvence sa završnim “G” u TCACG i prvi nukleotid mišje sekvence je prvi “C” u CTCCC; region nizvodnog spoja takođe sadrži IoxP mesto na 3' kraju (prikazan je njen početak ) za uklanjanje floks ubikvitin promotor-pokretačke neo kasete. Veza neo kasete sa mišjim IL-6 lokusom je formirana tako da bude unutar 5’-TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCCT AAGTTACATC CAAACATCCT CCCCCAAATC AATAATTAAG CACTTTTTAT GACATGTAAA GTTAAATAAG AAGTGAAAGC TGCAGATGGT GAGTGAGA (sek id br:12), gde je završni "C" od AGCTC završni nukleotid neo kasete; prvi nukleotid mišjeg genoma koji sledi posle kasete je početni "C" od CTAAG.
Primer 2: Imunofenotipizacija prirodnih i imunizovanih hIL-6 miševa: B ćelija
[0103] Mišji homozigoti za hIL-6 gensku zamenu analizirani su za B ćelije (DC445R(B220). Limfocitklasifikovane frakcije preparata ćelija slezine prirodnih i imunizovanih (TNP-KLH) hIL-6 miševa su obojeni i imunofenotipizovani pomoću protočne citometrije. FACS analiza je pokazala da je procenat B ćelija u preparatima ćelija slezene meren pomoću CD45R(B220)-FITC bojenja bio približno jednak (63% ćelija) za preparate prirodnog divljeg tipa, hIL-6 heterozigote, te hIL-6 homozigote. Za imunizovane miševe, izbrojane B ćelije bile su oko 65% celokupnih ćelija u preparatima ćelija slezene u miševa divljeg tipa, te oko 61 % celokupnih ćelija u hIL-6 homozigotima. Slezene hIL-6 miševa (i prirodnih i imunizovanih) sadrže sadrže određenu populaciju B ćelija koja je približno jednake veličine kao i populacija B ćelija slezene u miševa divljeg tipa.
[0104] Koštana srž divljeg tipa, hIL-6 heterozigoti, te hIL-6 homozigoti obojeni su s markerima B ćelija (CD45R(B220)-APC, CD24(HSA)-PE, ili CD43 konjugovan za boju i/ili IgM (IgM-FITC). Razvoj B ćelija u koštanoj srži normalnih miševa će da se reflektuje u površinskim markerima kao progres ćelija od matičnih ćelija do ranih pro-B ćelija do kasnih pro-B ćelija, do velikih pre-B ćelija, do malenih pre-B ćelija, do nesazrelih B ćelija te najzad, do zrelih B ćelija. Zajedničke limfocitne progenitor pro-B ćelije će da izvrše ekspresiju CD45R, te u kasnijim stepenima da izvrše ekspresiju IgM kao nesazrelih i posle kao zrelih B ćelija. Dakle, CD45R-obojene i anti-IgM-obojene B ćelije trebalo bi da pokažu sliku koja je karakteristična za razvoj B ćelija. Koštana srž hIL-6 heterozigota i homozigota prikazala je sliku CD45R(B220)-APC i anit-IgM-FITC bojenja koja se suštinski ne razlikuje od koštane srži divljeg tipa, pokazujući populacije B ćelija koje su obojene pozitivno za CD45R(B220) i IgM, ili samo CD45R(B220). Sub-populacije B ćelija u koštanoj srži hIL-6 miševa, kako ih pokazuje FACS bojenje, slične su onima u miševa divljeg tipa (Tabela 1; vidi takođe, SL.13).
[0105] Bojenje s CD43 (vidi SL.14 dalo je (normalnu) sliku koja je pokazana u Tabeli 2, što ukazuje na normalni razvoj u koštanoj srži.
[0106] Bojenje za CD43 (videti sl. 15) dalo je (normalan) obrazac koji je pokazan u Tabeli 3, što ukazuje na normalni razvoj u koštanoj srži.
[0107] Dakle, imunofenotipizacija prirodnih hIL-6 miševa je pokazala da je razvoj B ćelija u takvih miševa suštinski normalan.
Primer 3: Zamena endogene mišje IL-6R α ektodomena genske sekvence s hIL-6R α ektodomena genskom sekvencom
[0108] 45 kb humani IL-6R α gen koji sadrži eksone 1 do 8 humanog IL-6R α gena zamenio je 35.4 kb mišjeg IL-6R α genskog lokusa. Mišji eksoni 9 i 10 su zadržani; samo eksoni 1-8 su humanizovani. Ukupno, 35,384 nt mišje sekvence je zamenjeno s 45,047 nt humane sekvence.
[0109] Ciljani konstrukt za zamenu mišjeg s nekim humanim IL-6R α genom u jednom ciljanom stepenu je konstruisan koristeći VELOCIGENE® tehnologiju genetskog inženjeringa (vidi, Valenzuela i saradnici (2003): High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). Mišja humana IL-6R α DNA dobijene su iz bakterijskog veštačkog hromosoma (BAC) RPCI-23 klona 125J8, odnosno od BAC CTD klona 2192J23. Ukratko, neki Notl linearizovani ciljani konstrukt koji je dobijen obnavljanjem praznine kloniranjem koje uključuje mišje IL-6R α α „uzvodne“ i „nizvodne“ homološke bočne krakove 45 kb humane IL-6R α sekvence koja se pruža od ATG u eksonu 1 do eksona 8 sa 69 nukleotida 3' „nizvodne“ sekvence i floks neo selekcijske kasete, bio je elektroporiran u F1 H4 mišje embrionske matične (ES) ćelije (C57BL/6 × 129 F1 hibrid). Korektno naciljane ES ćelije (MAID 794) su posle izložene elektroporiranju s tranzijentnim Cre-ekspresija vektoru da se ukloni odabrana kaseta leka. Ciljani klonovi ES ćelije bez kasete leka (MAID 1442) uvedeni su u mišji embrion od 8 ćelija pomoću VELOCIMOUSE® metode (vidi, američki patent 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, te Poueymirou i saradnici (2007) F0 generacija miševa koja je u suštini u celosti izvedena iz donorskih gen-ciljanih ES ćelija omogućuje trenutačnu analizu fenotipa Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi koji su u celosti izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nose humanizovani IL-6R α gen su identifikovani pomoću genotipizacije za gubitak mišijeg alela i dobivanje humanog alela korištenjem modifikacije analize alela (vidi, Valenzuela i saradnici (2003)).
[0110] Korektno naciljani klonovi ES ćelija su identifikovani pomoću analize gubitka prirodnog alela (LONA) (Valenzuela i saradnici 2003) pri čemu je broj kopija prirodnog, nemodifikovanog II6 gena određen pomoću dve TaqMan™ kvantitativne polimeraza lančane reakcije (qPCR-ovi) specifične za sekvence u mišjem II6 genu koji je meta za brisanje. qPCR analize uključuju sledeće setove „prajmer“-sonda (pisano od 5' prema 3'): „uzvodni“ usmereni početni oligonukleotid („prajmer”), GCCCTAGCAT GCAGAATGC (sekv id br:13); „uzvodni“ reverzni početni oligonukleotid („prajmer”), AAGAGGTCCC ACATCCTTTG C (sekv id br:14); „uzvodna“ sonda, CCCACATCCA TCCCAATCCT GTGAG (sekv id br:15); „nizvodni“ usmereni početni oligonukleotid („prajmer“), GAGCTTGCCC CCAGAAAGG (sekv id br:16); „nizvodni“ reverzni početni oligonukleotid („prajmer“), CGGCCACATC TCTGGAAGAC (sekv id br:17); „nizvodna“ sonda, CATGCACTGC CCCAAGTCTG GTTTCAGT (sekv id br:18). DNA koja je prečišćena iz klonova ES ćelija koje su uzete kao ciljani vektori i ugrađeni u njihovim genomima je kombinovana s TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) prema sugestijama proizvođača na PCR ploči s 384 bunarića (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) te obrađena u uređaju Applied Biosystems Prism 7900HT, koji sakuplja podatke o fluorescenciji u vremenu dok traju PCR-ovi te određuje granicu ciklusa (Ct), frakcioni PCR ciklus u kojem akumulirana fluorescenca dostigne unapred određenu granicu. „Uzvodni” i „nizvodni” IL-6R α-specifični qPCR-ovi i dva qPCR-a za ne-ciljane referentne gene uz izvršeni za svaki uzorak DNA. Izračunate su razlike Ct vrednosti (ΔCt) između svakog IL-6R α-specifičnog qPCR i svakog referentnog gena qPCR, a zatim je izračunata razlika između svakog ΔCt i srednja vrednost ΔCt za sve analizirane uzorke da se dobiju ΔΔCt vrednosti za svaki uzorak. Broj kopija II6 gena u svakom uzorku izračunat je prema sledećoj formuli: broj kopija = 2 • 2-ΔΔt. Korektno naciljan klon, koji je izgubio jednu od svojih prirodnih kopija, će da ima IL-6R α genski broj kopije jednak sa jedan. Potvrda da je humana IL-6R α genska sekvenca zamenila izbrisanu mišju IL-6R α gensku sekvencu u humanizovanom alelu potvrđena je pomoću TaqMan™ qPCR analize koja uključuje sledeće setove „prajmer“-sonda (pisano od 5' prema 3'): humani usmereni početni oligonukleotid („prajmer”), GGAGAGGGCA GAGGCACTTA C (sekv id br: 19); humani reverzni početni oligonukleotid („prajmer”), GGCCAGAGCC CAAGAAAAG (sekv id br: 20); te humana sonda, CCCGTTGACT GTAATCTGCC CCTGG (sekv id br: 21).
[0111] Ista LONA analiza je korištena za analizu DNA koja je prečišćena iz biopsija repa za miševe koji su izvedeni iz naciljanih ES ćelija da se odrede njihovi IL-6R α genotipovi i da se potvrdi da je humanizovani IL-6R α alel prenesen kroz ćelijsku liniju. Potomci koji su heterozigotni za zamenu su u stanju da generišu miša koji je homozigotni za zamenu endogenog mišjeg IL-6R α gena s humanim IL-6R α (ektodomena) genom. Potomci koji su homozigotni za zamenu koriste se za fenotipizaciju.
[0112] Veza prema gore mišjeg lokusa („uzvodna”) i sekvence koja sadrži hIL-6R α gen je formirana tako da bude unutar 5’-CGAGGGCGAC TGCTCTCGCT GCCCCAGTCT GCCGGCCGCC CGGCCCCGGC TGCGGAGCCG CTCT- GCCGCC CGCCGTCCCG CGTAGAAGGA AGCATGCTGG CCGTCGGCTG CGCGCTGCTG GCTGCCCTGC TGGCCGCGCC GGGAGCGGCG CTGGCCCCAA GGCGCTGCCC TGCGCAGGGT AAGGGCTTCG G (sek id br:22), pri čemu je završni mišji nukleotid prije prvog nukleotida humanog gena "C" u GAAGC, i prvi nukleotid humane sekvence je prvi "A" u ATGCT. Veza prema dole („nizvodna”) sekvence koja sadrži hIL-6 gen i mišjeg lokusa je formirana tako da bude unutar 5’-CAAGATTATT GGAGTCTGAA ATGGAATACC TGTT- GAGGGA AATCTTTATT TTGGGAGCCC TTGATTTCAA TGCTTTTGAT TCCCTATCCC TGCAAGACCC GGGCTC-GATA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGACTCGAG ATAACTTC-3’ (sekv.id br:23), gde je završni nukleotid humane sekvence sa završnim “A” u CAAGA i prvi nukleotid mišje sekvence je prvi “C” u CCCGG; vezna oblast prema dole („nizvodna”) takođe sadrži IoxP mesto na 3' kraju za uklanjanje floks ubikvitin promotor-pokretačke neo kasete. Prvi nukleotid Ioxp mesta je prvi “A” u ATAAC. Veza neo kasete s mišjim IL-6R α lokusom je formirana tako da bude unutar 5’-TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCTA CTC-CATATGC TCACTTGCCGTTGTTTGCTACGATACGGTGAGGCCCGTGCGAAGAGTGGCACAGATCAGGAGGCT-TATGT GGTCAGTCCA CAGTATGGC (sek id br:24), gde je završni "C" of AGCTC završni nukleotid neo kasete; prvi nukleotid mišjeg genoma posle kasete je početni "T" od TACTC.
LISTA SEKVENCI
[0113]
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> HUMANIZOVANI IL-6 I IL-6 RECEPTOR
<130> E1596.002(F).EPWD1
<140> Treba da bude dodeljen
<141> Podneto je sa ovim ovde
<150> 61/552,900
<151> 2011-10-28
<150> 61/556,579
<151> 2011-11-07
<160> 24
<170> FastSEQ za Windows verzija 4.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<223> Sintetička
<400> 1
ttgccggttt tcccttttct c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 2
agggaaggcc gtggttgtc 19
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 3
ccagcatcag tcccaagaag gcaact 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 4
tcagagtgtg ggcgaacaaa g 21 <212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 5
gtggcaaaag cagccttagc 20
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 6
tcattccagg cccttcttat tgcatctg 28
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 7
ccccactcca ctggaatttg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički gttcaaccac agccaggaaa g 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 9
agctacaact cattggcatc ctggcaa 27
<210> 10
<211> 197
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 10
<210> 11
<211> 151
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 11
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 12
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 13
gccctagcat gcagaatgc 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 14
aagaggtccc acatcctttg c 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
cccacatcca tcccaatcct gtgag 25
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 16
gagcttgccc ccagaaagg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 17
cggccacatc tctggaagac 20
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 18
catgcactgc cccaagtctg gtttcagt 28
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca <223> Sintetički
<400> 19
ggagagggca gaggcactta c 21 <210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 20
ggccagagcc caagaaaag 19
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 21
cccgttgact gtaatctgcc cctgg 25
<210> 22
<211> 191
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 22
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 23
<210> 24
<211> 129
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 24

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Genetski modifikovana mišja životinja, naznačena time što uključuje zamenu na endogenom mišjem IL-6 lokusu mišjeg gena koji kodira IL-6 s humanim genom koji kodira humani L-6, pri čemu je humani gen koji kodira humani IL-6 pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata na endogenom mišjem IL-6 lokusu.
2. Genetski modifikovana mišja životinja prema zahtevu 1, naznačena time što humani gen koji kodira humani IL-6 sadrži eksone 1 do 5 humanog IL-6 gena koji su nađeni u CTD-2369M23 bakterijskom veštačkom hromosomu.
3. Genetski modifikovana mišja životinja prema zahtevu 1, naznačena time što vrši ekspresiju humanizovanog IL-6R α gde je endogeni mišji IL-6R α gen zamenjen s humanom sekvencom koja uključuje sekvencu koja kodira ektodomenu humanog IL-6R α.
4. Genetski modifikovana mišja životinja prema zahtevu 1, naznačen time što mišja životinja ne pokazuje osobinu koja je odabrana između sledećih: plazmacitoza, glomeruloskleroza, glomerulonefritis, ottkazivanje bubrega, hipergamaglobulinemija, povišeni megakariociti u slezini, povišeni megakariociti u koštanoj srži, splenomegalija, povećanje limfnog čvora, nagomilane abnormalne ćelije u plazmi, te kombinacija navedenog
5. Genetski modifikovana mišja životinja prema zahtevu 3, naznačena time što humanizovani IL-6R α sadrži mišje transmembranske i intracelularne domene.
6. Genetski modifikovana mišja životinja, koja uključuje humanizaciju endogenog mišjeg IL-6R α gena, naznačena time što humanizacija uključuje zamenu mišje IL-6R α ektodomena-kodirajuće sekvence s humanom IL-6R α ektodomena-kodirajućem sekvencom na endogenom IL-6R α lokusu, i time što je humanizovani IL-6R α gen pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata.
7. Genetski modifikovana mišja životinja prema zahtevu 6, naznačena time što još uključuje humanizovani IL-6 gen koji uključuje zamenu na endogenom mišjem IL-6 lokusu mišjeg gena, koji kodira IL-6, s humanim genom koji kodira humani IL-6.
8. Metoda da se dobije humanizovana mišja životinja, naznačena time što uključuje zamenu mišje genske sekvence koja kodira mišji IL-6 s humanim genom koji kodira humani IL-6 tako da je humani IL-6 gen pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata.
9. Metoda da se dobije humanizovana mišja životinja, naznačena time što uključuje zamenu svih mišjih eksona koji kodiraju ektodomena sekvenci mišjeg IL-6R α s humanim genomskim fragmentom koji kodira humanu IL-6R α ektodomenu da se formira humanizovani IL-6R α gen, pri čemu je humanizovani IL-6R α gen pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata.
10. Genetski modifikovana mišja životinja, naznačena time što poseduje humanizovani IL-6R α gen koji uključuje zamenu mišje ektodomena-kodirajuće sekvence s humanom ektodomena sekvencom, pri čemu humanizovani IL-6R α gen uključuje mišju transmembransku sekvencu i sekvencu intracelularnog domena; gde mišja životinja nadalje sadrži gen koji kodira humani IL-6, pri čemu su geni koji kodiraju humani IL-6 i humanizovani IL-6R α pod kontrolom endogenih mišjih regulatornih elemenata.
RS20170430A 2011-10-28 2012-10-29 Humanizovani il-6 i il-6 receptor RS55949B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161552900P 2011-10-28 2011-10-28
US201161556579P 2011-11-07 2011-11-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55949B1 true RS55949B1 (sr) 2017-09-29

Family

ID=47295138

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20140677A RS53683B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-29 Humanizovani il-6 i il-6 receptor
RS20170430A RS55949B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-29 Humanizovani il-6 i il-6 receptor

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20140677A RS53683B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-29 Humanizovani il-6 i il-6 receptor

Country Status (27)

Country Link
US (10) US8878001B2 (sr)
EP (2) EP2663575B1 (sr)
JP (2) JP6120451B2 (sr)
KR (2) KR102084927B1 (sr)
CN (2) CN108866101A (sr)
AU (1) AU2015207889B2 (sr)
BR (1) BR112014008529A2 (sr)
CA (1) CA2853731C (sr)
CY (2) CY1116614T1 (sr)
DK (2) DK2663575T3 (sr)
ES (2) ES2525368T3 (sr)
HR (2) HRP20141192T1 (sr)
HU (1) HUE033400T2 (sr)
IL (4) IL231896B (sr)
IN (1) IN2014CN03920A (sr)
LT (1) LT2818478T (sr)
MX (1) MX358390B (sr)
MY (2) MY186903A (sr)
PL (2) PL2663575T3 (sr)
PT (2) PT2663575E (sr)
RS (2) RS53683B1 (sr)
RU (2) RU2634417C2 (sr)
SG (3) SG10202100485XA (sr)
SI (2) SI2818478T1 (sr)
SM (2) SMT201700222T1 (sr)
WO (1) WO2013063556A1 (sr)
ZA (1) ZA201402635B (sr)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES3010323T3 (en) 2009-10-06 2025-04-02 Regeneron Pharma Genetically modified mice and engraftment
KR102714361B1 (ko) 2011-02-15 2024-10-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ｍ－ｃｓｆ 마우스
PL2663575T3 (pl) 2011-10-28 2015-03-31 Regeneron Pharma Humanizowane IL-6 i receptor IL-6
US20130261016A1 (en) * 2012-03-28 2013-10-03 Meso Scale Technologies, Llc Diagnostic methods for inflammatory disorders
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
KR102473555B1 (ko) 2012-09-07 2022-12-05 예일 유니버시티 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법
WO2014042251A1 (ja) * 2012-09-13 2014-03-20 中外製薬株式会社 遺伝子ノックイン非ヒト動物
IL311744B2 (en) * 2012-11-05 2025-10-01 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of using them
LT2958938T (lt) 2013-02-20 2019-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, ekspresuojančios humanizuotus t ląstelių koreceptorius
EP2958937B1 (en) 2013-02-22 2018-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized major histocompatibility complex
GB2513884B (en) 2013-05-08 2015-06-17 Univ Bristol Method and apparatus for producing an acoustic field
PT4269430T (pt) * 2013-09-23 2025-08-06 Regeneron Pharma Animais não-humanos com um gene humanizado de proteína reguladora de sinal
EP3138397B1 (en) * 2013-10-15 2018-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized il-15 animals
MX356809B (es) 2013-11-19 2018-06-13 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen del factor activador de celulas b.
EP3071025B1 (en) * 2013-11-19 2018-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
US9612658B2 (en) 2014-01-07 2017-04-04 Ultrahaptics Ip Ltd Method and apparatus for providing tactile sensations
CA2934965A1 (en) 2014-01-31 2016-03-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel anti-baff antibodies
RU2700484C2 (ru) 2014-04-08 2019-09-17 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Не относящиеся к человеку животные, имеющие гуманизированные fc-гамма-рецепторы
MX2016014504A (es) 2014-05-05 2017-05-23 Regeneron Pharma Animales c5 y c3 humanizados.
NO2785538T3 (sr) * 2014-05-07 2018-08-04
KR20250096864A (ko) 2014-05-19 2025-06-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 epo를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물
US9497945B2 (en) 2014-05-30 2016-11-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized dipeptidyl peptidase IV (DPP4) animals
CN106604635B (zh) * 2014-06-19 2020-01-14 瑞泽恩制药公司 具有人源化程序性细胞死亡1基因的非人动物
GB2530036A (en) 2014-09-09 2016-03-16 Ultrahaptics Ltd Method and apparatus for modulating haptic feedback
DK3223605T3 (da) 2014-11-24 2020-11-16 Regeneron Pharma Ikke-humane dyr, der eksprimerer humaniseret cd3-kompleks
EP3086637B1 (en) * 2014-12-05 2019-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
MX2017007636A (es) 2014-12-09 2018-03-28 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciacion 274 humanizado.
KR102515997B1 (ko) 2015-02-20 2023-03-29 울트라햅틱스 아이피 엘티디 햅틱 시스템에서의 인식
ES2908299T3 (es) 2015-02-20 2022-04-28 Ultrahaptics Ip Ltd Mejoras del algoritmo en un sistema háptico
KR20240132525A (ko) 2015-04-06 2024-09-03 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 비인간 동물에서의 인간화 t 세포 매개 면역반응
CN107896479B (zh) 2015-04-13 2021-07-13 再生元制药公司 人源化SIRPα-IL15敲入小鼠及其使用方法
US10818162B2 (en) 2015-07-16 2020-10-27 Ultrahaptics Ip Ltd Calibration techniques in haptic systems
AU2016358101B2 (en) 2015-11-20 2022-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized Lymphocyte-activation gene 3
KR102851747B1 (ko) 2015-12-08 2025-08-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 효소 내재화 조성물 및 방법
US11189140B2 (en) 2016-01-05 2021-11-30 Ultrahaptics Ip Ltd Calibration and detection techniques in haptic systems
KR102487839B1 (ko) 2016-02-04 2023-01-12 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 조작된 angptl8 유전자를 갖는 비인간 동물
SG10202001578RA (en) 2016-02-29 2020-04-29 Regeneron Pharma Rodents having a humanized tmprss gene
CN109640644B (zh) 2016-06-03 2021-10-26 瑞泽恩制药公司 表达外源末端脱氧核苷酸转移酶的非人动物
US10531212B2 (en) 2016-06-17 2020-01-07 Ultrahaptics Ip Ltd. Acoustic transducers in haptic systems
US10268275B2 (en) 2016-08-03 2019-04-23 Ultrahaptics Ip Ltd Three-dimensional perceptions in haptic systems
US10755538B2 (en) 2016-08-09 2020-08-25 Ultrahaptics ilP LTD Metamaterials and acoustic lenses in haptic systems
CN107815467B (zh) * 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
US10943578B2 (en) 2016-12-13 2021-03-09 Ultrahaptics Ip Ltd Driving techniques for phased-array systems
US10497358B2 (en) 2016-12-23 2019-12-03 Ultrahaptics Ip Ltd Transducer driver
CN108467873B (zh) 2017-03-17 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用
WO2018177441A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Beijing Biocytogen Co., Ltd GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
CN108588126B (zh) 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
EP3585162B1 (en) 2017-09-29 2023-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents comprising a humanized ttr locus and methods of use
US11531395B2 (en) 2017-11-26 2022-12-20 Ultrahaptics Ip Ltd Haptic effects from focused acoustic fields
CA3076377A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized trkb locus
WO2019122912A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Ultrahaptics Limited Tracking in haptic systems
EP3729418B1 (en) 2017-12-22 2024-11-20 Ultrahaptics Ip Ltd Minimizing unwanted responses in haptic systems
CA3093850A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents for testing therapeutic agents
WO2019211616A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Ultrahaptics Limited Blocking plate structure for improved acoustic transmission efficiency
SMT202400300T1 (it) * 2018-07-16 2024-09-16 Regeneron Pharma Modelli di roditori della sindrome ditra e loro utilizzo
US11098951B2 (en) 2018-09-09 2021-08-24 Ultrahaptics Ip Ltd Ultrasonic-assisted liquid manipulation
US11378997B2 (en) 2018-10-12 2022-07-05 Ultrahaptics Ip Ltd Variable phase and frequency pulse-width modulation technique
WO2020125639A1 (en) * 2018-12-17 2020-06-25 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
US12373033B2 (en) 2019-01-04 2025-07-29 Ultrahaptics Ip Ltd Mid-air haptic textures
WO2020141330A2 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Ultrahaptics Ip Ltd Mid-air haptic textures
CN111218425B (zh) * 2019-01-17 2022-02-08 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化转基因动物
CN117178959A (zh) 2019-04-04 2023-12-08 瑞泽恩制药公司 包括人源化凝血因子12基因座的非人动物
US11842517B2 (en) 2019-04-12 2023-12-12 Ultrahaptics Ip Ltd Using iterative 3D-model fitting for domain adaptation of a hand-pose-estimation neural network
US20220340926A1 (en) * 2019-05-27 2022-10-27 Transgenic Inc. Exon-humanized mouse
AU2020286382A1 (en) 2019-06-04 2021-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
US11374586B2 (en) 2019-10-13 2022-06-28 Ultraleap Limited Reducing harmonic distortion by dithering
CA3154040A1 (en) 2019-10-13 2021-04-22 Benjamin John Oliver LONG Dynamic capping with virtual microphones
WO2021090028A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Ultraleap Limited Tracking techniques in haptics systems
CN111304246B (zh) * 2019-12-17 2021-05-04 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 一种人源化细胞因子动物模型、制备方法及应用
US11715453B2 (en) 2019-12-25 2023-08-01 Ultraleap Limited Acoustic transducer structures
WO2021154791A1 (en) * 2020-01-28 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
AU2021261267A1 (en) 2020-04-21 2022-09-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized Cxcl13 gene
US11816267B2 (en) 2020-06-23 2023-11-14 Ultraleap Limited Features of airborne ultrasonic fields
US11886639B2 (en) 2020-09-17 2024-01-30 Ultraleap Limited Ultrahapticons
CN118511853A (zh) 2021-03-31 2024-08-20 瑞泽恩制药公司 包含具有改善的tcrb组库多样性的人源化细胞免疫系统组分的基因修饰的小鼠
US20240224964A9 (en) 2022-09-29 2024-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes
WO2025212991A1 (en) 2024-04-05 2025-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent models of disease
WO2025250495A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Acceleration of human hepatocyte engraftment in humanized liver animals by supplementing paracrine ligands or agonists that activate human liver regeneration signals

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0786007A1 (en) * 1994-10-14 1997-07-30 Basf Aktiengesellschaft Transgenic nonhuman animal having functionally disrupted interleukin-1-beta converting enzyme gene
EP1884524A3 (en) 1994-10-21 2008-06-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for treatment of diseases caused by IL-6 production
US20030082721A1 (en) * 2001-01-17 2003-05-01 Tai-Jay Chang Transgenic animals expressing androgen receptor complex-associated protein
CN1560081A (zh) * 2004-02-17 2005-01-05 大连帝恩生物工程有限公司 用能产生人IgGl重链－κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用
PL2767161T3 (pl) 2004-10-19 2018-09-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposób wytwarzania zwierzęcia homozygotycznego pod względem modyfikacji genetycznej
US7759541B2 (en) * 2004-12-13 2010-07-20 Iti Life Sciences Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity
GB2434578A (en) 2006-01-26 2007-08-01 Univ Basel Transgenic animals
PL2374818T3 (pl) 2006-06-02 2013-05-31 Regeneron Pharma Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6
CA2661848C (en) * 2006-09-01 2015-02-03 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
FR2942218A1 (fr) 2009-02-13 2010-08-20 Eurocave Sa Appareil de service au verre d'un liquide, notamment de vin
ES3010323T3 (en) * 2009-10-06 2025-04-02 Regeneron Pharma Genetically modified mice and engraftment
JP5595517B2 (ja) * 2009-12-21 2014-09-24 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ＦｃγＲマウス
KR102714361B1 (ko) 2011-02-15 2024-10-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ｍ－ｃｓｆ 마우스
TWI681970B (zh) 2011-09-30 2020-01-11 日商中外製藥股份有限公司 包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及於pH中性之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域、且誘導對標的抗原的免疫反應之抗原結合分子
DK2770821T3 (da) 2011-10-28 2017-11-27 Regeneron Pharma Genetisk modificerede major histocompatibility-kompleks-mus
PL2663575T3 (pl) 2011-10-28 2015-03-31 Regeneron Pharma Humanizowane IL-6 i receptor IL-6
KR101926442B1 (ko) 2011-10-28 2018-12-12 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 키메라 주요 조직적합성 복합체 （ｍｈｃ） ｉｉ 분자들을 발현하는 유전자 변형된 마우스

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015207889A1 (en) 2015-08-20
RU2014121324A (ru) 2015-12-10
SI2663575T1 (sl) 2015-01-30
MX2014004900A (es) 2014-08-26
CY1118952T1 (el) 2018-01-10
KR102084927B1 (ko) 2020-03-06
US20150013022A1 (en) 2015-01-08
US20250287931A1 (en) 2025-09-18
US10433528B2 (en) 2019-10-08
LT2818478T (lt) 2017-06-12
ZA201402635B (en) 2015-09-30
MY186903A (en) 2021-08-26
DK2818478T3 (en) 2017-05-22
AU2015207889B2 (en) 2017-02-23
SG11201400945UA (en) 2014-04-28
US11102962B2 (en) 2021-08-31
KR20140091024A (ko) 2014-07-18
CY1116614T1 (el) 2017-03-15
EP2818478A1 (en) 2014-12-31
WO2013063556A8 (en) 2014-04-17
JP2014532416A (ja) 2014-12-08
US20200008407A1 (en) 2020-01-09
IL243665B (en) 2018-02-28
RU2017129763A3 (sr) 2020-12-18
HK1205135A1 (en) 2015-12-11
US10004211B2 (en) 2018-06-26
US9622460B2 (en) 2017-04-18
ES2624605T3 (es) 2017-07-17
CN104039821A (zh) 2014-09-10
SG10201600965YA (en) 2016-03-30
IL231896B (en) 2018-02-28
US20130117873A1 (en) 2013-05-09
SG10202100485XA (en) 2021-02-25
US20150272092A1 (en) 2015-10-01
NZ709432A (en) 2015-12-24
US20170055506A1 (en) 2017-03-02
US20160278352A1 (en) 2016-09-29
US9078418B2 (en) 2015-07-14
CA2853731C (en) 2021-05-18
US20150013023A1 (en) 2015-01-08
SMT201700222T1 (it) 2017-07-18
JP2017035115A (ja) 2017-02-16
IL243666B (en) 2019-02-28
EP2818478B1 (en) 2017-02-01
RU2017129763A (ru) 2019-02-05
PT2663575E (pt) 2014-12-05
IN2014CN03920A (sr) 2015-09-04
ES2525368T3 (es) 2014-12-23
BR112014008529A2 (pt) 2017-04-18
RU2751240C2 (ru) 2021-07-12
DK2663575T3 (en) 2014-12-15
PT2818478T (pt) 2017-05-12
US8878001B2 (en) 2014-11-04
EP2663575B1 (en) 2014-10-01
US20220053742A1 (en) 2022-02-24
IL243666A0 (en) 2016-03-31
US9125386B2 (en) 2015-09-08
KR102234632B1 (ko) 2021-04-02
KR20200024949A (ko) 2020-03-09
HK1190408A1 (en) 2014-07-04
WO2013063556A4 (en) 2013-06-20
RU2634417C2 (ru) 2017-10-26
IL243665A0 (en) 2016-03-31
US9392777B2 (en) 2016-07-19
EP2663575A1 (en) 2013-11-20
US12239111B2 (en) 2025-03-04
WO2013063556A1 (en) 2013-05-02
IL264508A (en) 2019-02-28
NZ623145A (en) 2015-09-25
SI2818478T1 (sl) 2017-07-31
PL2663575T3 (pl) 2015-03-31
US20180271071A1 (en) 2018-09-27
JP6120451B2 (ja) 2017-04-26
HRP20170656T1 (hr) 2017-06-30
HRP20141192T1 (hr) 2015-02-13
IL231896A0 (en) 2014-05-28
SMT201400187B (it) 2015-01-15
CN108866101A (zh) 2018-11-23
RS53683B1 (sr) 2015-04-30
IL264508B (en) 2019-12-31
MX358390B (es) 2018-08-17
CA2853731A1 (en) 2013-05-02
MY172726A (en) 2019-12-11
PL2818478T3 (pl) 2017-09-29
HUE033400T2 (en) 2017-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12239111B2 (en) Humanized IL-6 and IL-6 receptor
AU2012327206B2 (en) Humanized IL-6 and IL-6 receptor
HK1205135B (en) Humanized il-6 and il-6 receptor
HK1190408B (en) Humanized il-6 and il-6 receptor
NZ623145B2 (en) Humanized il-6 and il-6 receptor
NZ709432B2 (en) Humanized il-6 and il-6 receptor