RU2751240C2 - Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 - Google Patents
Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2751240C2 RU2751240C2 RU2017129763A RU2017129763A RU2751240C2 RU 2751240 C2 RU2751240 C2 RU 2751240C2 RU 2017129763 A RU2017129763 A RU 2017129763A RU 2017129763 A RU2017129763 A RU 2017129763A RU 2751240 C2 RU2751240 C2 RU 2751240C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mouse
- human
- animal
- gene
- humanized
- Prior art date
Links
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 title description 51
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 title description 46
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 238
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 147
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 133
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 37
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 31
- 101000599053 Mus musculus Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 29
- 101000599048 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 26
- 101100286713 Homo sapiens IL6 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 14
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 12
- 101100452395 Mus musculus Il6ra gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 abstract description 126
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 abstract description 118
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 157
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 121
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 48
- 101001076414 Mus musculus Interleukin-6 Proteins 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 29
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 26
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 25
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 21
- 230000004658 acute-phase response Effects 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 101100286719 Mus musculus Il6 gene Proteins 0.000 description 16
- 206010035485 plasmacytosis Diseases 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 13
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 12
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 11
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 101150047862 hil-6 gene Proteins 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 9
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 9
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 9
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 9
- 101150101999 IL6 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 8
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 8
- 108010042685 trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 8
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 7
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 7
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 7
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 6
- 102100027584 Protein c-Fos Human genes 0.000 description 6
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 6
- 241000779819 Syncarpia glomulifera Species 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 6
- 239000001739 pinus spp. Substances 0.000 description 6
- 229940036248 turpentine Drugs 0.000 description 6
- 101100338243 Caenorhabditis elegans hil-6 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 5
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 208000019758 Hypergammaglobulinemia Diseases 0.000 description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 5
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 5
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 5
- 206010061989 glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 5
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 201000008265 mesangial proliferative glomerulonephritis Diseases 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 4
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 4
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 4
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 4
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 4
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 3
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 3
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 3
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000003584 mesangial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 2
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 2
- 210000003967 CLP Anatomy 0.000 description 2
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 2
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 101150084279 TM gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 206010047295 Ventricular hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- 210000001056 activated astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007342 reactive astrogliosis Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 101100069853 Caenorhabditis elegans hil-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005024 Castleman disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016989 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010000063 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006197 Cytokine Receptor gp130 Proteins 0.000 description 1
- 102000005754 Cytokine Receptor gp130 Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101100452394 Homo sapiens IL6R gene Proteins 0.000 description 1
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004509 Intracisternal A-Particle Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 101100351020 Mus musculus Pax5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010073599 Myeloma cast nephropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010051081 Nodular regenerative hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 101150012195 PREB gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037504 Paired box protein Pax-5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149067 Paired box protein Pax-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108010072819 STAT Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000007078 STAT Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 101100351021 Xenopus laevis pax5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091027569 Z-DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 210000004667 early pro-b cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940116886 human interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000014 large pre-b cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002202 late pro-b cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000009091 myxoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036178 pleiotropy Effects 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 210000000345 small pre-b cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5412—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетически модифицированному животному семейства мышиных, которое экспрессирует гуманизированный белок IL-6Rα, а также к способу его получения. Также раскрыта выделенная эмбриональная стволовая клетка животного семейства мышиных для получения животного семейства мышиных, которое экспрессирует гуманизированный белок IL-6Rα. Изобретение позволяет эффективно получать отличных от человека животных, у которых не выявляют одной или более патологий, характерных для отличных от человека животных, трансгенных по IL-6 человека. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр., 15 ил.
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Предоставлены отличные от человека животные с заменой эндогенных генов IL-6 и/или рецептора IL-6 отличного от человека животного. Гены IL-6 и/или рецептора IL-6 отличного от человека животного в эндогенных не принадлежащих человеку локусах заменены генами IL-6 человека и/или генами гуманизированного рецептора IL-6, содержащими последовательность человека. Отличные от человека животные, несущие гены IL-6 человека и/или гуманизированного рецептора IL-6, где у отличных от человека животных не выявляют ни одной или более патологий, характерных для отличных от человека животных, трансгенных по IL-6 человека.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
В данной области известны мыши, трансгенные по гену IL-6 человека. Однако случайная вставка трансгена IL-6 человека в геном мыши приводит к плохорегулируемой экспрессии белка IL-6 человека, которая проявляет себя во множестве патологий у таких трансгенных мышей, включая в качестве неограничивающих примеров, плазмацитоз и гломерулонефрит. В результате эти мыши имеют ограниченную применимость.
Существует необходимость в экспрессии у отличных от человека животных, например, у мышей и крыс, IL-6 человека или гуманизированного IL-6 и/или рецептора IL-6 человека или гуманизированного рецептора IL-6. Существует необходимость в таких гуманизированных мышах, у которых не выявлено ни одной или более патологий, демонстрируемых трансгенными по hIL-6 мышами.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Согласно одному из аспектов предоставлены генетически модифицированные отличные от человека животные, у которых проведена замена эндогенных локусов генов IL-6 и/или рецептора IL-6, кодирующих эндогенные IL-6 и/или рецептор IL-6 на гены, кодирующие IL-6 человека или гуманизированный IL-6 и/или рецептор IL-6. Предоставлены животные семейства мышиных, у которых проведена замена эндогенного гена IL-6 в эндогенном локусе IL-6 мыши, на ген IL-6 человека; и/или у которых проведена замена эндогенного гена рецептора IL-6 (или нуклеотидной последовательности, кодирующей его внеклеточный домен) на ген рецептора IL-6 человека (или нуклеотидную последовательность, кодирующую его внеклеточный домен).
Согласно одному из аспектов предоставлены генетически модифицированные животные семейства мышиных, которые экспрессируют ген IL-6 человека под контролем эндогенного промотора мыши и/или эндогенных регуляторных элементов мыши с эндогенного локуса IL-6 мыши.
Согласно одному из аспектов предоставлены генетически модифицированные животные семейства мышиных, которые экспрессируют ген рецептора IL-6 человека (или ген, кодирующий внеклеточный домен человека и трансмембранный и внутриклеточный домены мыши) под контролем эндогенного промотора мыши и/или эндогенных регуляторных элементов мыши с эндогенного локуса рецептора IL-6 мыши.
Согласно одному из аспектов предоставлены генетически модифицированные животные (например, животные семейства мышиных, например, мышь или крыса), которые экспрессируют белок IL-6 человека, где у отличного от человека животного не выявляют патологии, выбранной из плазмацитоза, гломерулонефрита, гломерулосклероза, мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, лимфомы кишечника, лимфомы почка, спленомегалии, увеличения лимфоузлов, увеличения печени, мегакариоцитов в костном мозге, уплотненных аномальных плазматических клеток, инфильтрации плазматических клеток в легкие, или печень, или почки, мезангиальной клеточной пролиферации в почки, церебральной сверхэкспрессии IL-6, ветвящихся микроглиальных клеток в белом веществе мозга, реактивных астроцитов в головном мозге, почечной недостаточности, повышенного количества мегакариоцитов в селезенке, мышечной атрофии (например, атрофии икроножной мышцы), повышенного количества мышечных катепсинов В и B+L (например, приблизительно в 20 раз и в 6 раз) и их сочетания.
Согласно одному из вариантов осуществления отличное от человека животное несет нормальную популяцию В-клеток. Согласно одному из вариантов осуществления нормальная популяция В-клеток по количеству и антигенному фенотипу приблизительно соответствует животному дикого типа, например, мыши дикого типа.
Согласно одному из вариантов осуществления отличное от человека животное является представителем семейства мышиные (например, мышью или крысой) и экспрессирует IL-6 человека (hIL-6) в сыворотке на уровне приблизительно ниже 800 пг/мл, приблизительно ниже 700, 600, 500, 400, 300 или 200 пг/мл. В конкретном варианте осуществления животное семейства мышиных экспрессирует hIL-6 в сыворотке на уровне приблизительно от 50 до приблизительно не более 200 пг/мл, согласно другому варианту осуществления приблизительно 75-125 пг/мл, согласно другому варианту осуществления приблизительно 100 пг/мл.
Согласно одному из аспектов предоставлено отличное от человека животное, которое экспрессирует hIL-6 и/или ML-6R, где отличное от человека животное экспрессирует hIL-6 и/или hIL-6R с эндогенного не принадлежащего человеку локуса IL-6 и/или эндогенного не принадлежащего человеку локуса hIL-6R. В конкретном варианте осуществления отличное от человека животное является представителем семейства мышиных (например, мышью или крысой).
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует hIL-6 с эндогенного локуса IL-6 мыши, где эндогенный ген IL-6 мыши заменен геном hIL-6.
Согласно одному из вариантов осуществления мышь несет клетку, которая экспрессируют рецептор IL-6 (IL-6R), который на поверхности клетки содержит внеклеточный домен человека. Согласно одному из вариантов осуществления клетка представляет собой лимфоцит. Согласно одному из вариантов осуществления лимфоцит представляет собой В-клетку.
Согласно одному из вариантов осуществления приблизительно 6, 8 т.п.н. в эндогенном локусе IL-6 мыши, включая экзоны с 1 по 5 и а 3'-нетранслируемую последовательность, удалены и замещены последовательностью гена IL-6 человека длиной приблизительно 4,8 т.п.н., содержащей экзоны с 1 по 5 гена IL-6 человека. В конкретном варианте осуществления ген IL-6 человека содержит экзоны с 1 по 5 гена IL-6 человека ВАС человека CTD-2369M23.
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует IL-6 с гена IL-6 человека, где мышь экспрессирует IL-6 человека в сыворотке.
Согласно одному из вариантов осуществления сыворотка у мышей выявляют сывороточную концентрацию IL-6 человека приблизительно от 25 до приблизительно 300 пг/мл, от 50 до приблизительно 250 пг/мл, от 75 до приблизительно 200 пг/мл или от 100 до приблизительно 150 пг/мл. В конкретном варианте осуществления уровень IL-6 человека в сыворотке мыши составляет приблизительно 100 пг/мл.
Согласно одному из вариантов осуществления уровень общего специфичного для В-клеток маркера в костном мозге мыши является приблизительно таким же, как уровень специфичного для В-клеток маркера в костном мозге мыши дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления уровень общего специфичного для В-клеток маркера в селезенке является приблизительно таким же, как уровень специфичного для В-клеток маркера в селезенке мыши дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления общий специфичный для В-клеток маркер выбран из В220, CD19, CD20, CD22, CD79a, CD79b, L26 и Рах-5 (BSAP).
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует hIL6, где у мыши не выявляют свойства, выбранного из плазмацитоза, спленомегалии, увеличения лимфоузлов, уплотненных аномальных плазматических клеток и их сочетания.
Согласно одному из вариантов осуществления мышь обладает селезенкой, масса которой составляет приблизительно такую же массу (от массы тела), что и у мыши дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления масса лимфоузлов мыши составляет приблизительно такую же массу (от массы тела), что и у мыши дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления плазматические клетки мыши не демонстрируют характеристик плазмацитоза, характерных для мышей со сверхэкспрессией IL-6 человека.
Согласно одному из вариантов осуществления у мыши не выявляют гломерулонефрита.
Согласно одному из вариантов осуществления у мыши определяют уровень мезангиальных клеток, сравнимый с мышью дикого типа.
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует hIL6 с эндогенного локуса IL-6 мыши, где эндогенный ген IL-6 мыши заменен геном hIL-6, где у мыши не выявляют свойства, выбранного из морфологически детектируемой нейропатологии, реактивных астроцитов и их сочетания. Согласно одному из вариантов осуществления мышь обладает головным мозгом, который морфологически неотличим от головного мозга мыши дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления мышь обладает тканью головного мозга, которая демонстрирует уровень реактивных астроцитов, не выше чем уровень реактивных астроцитов мыши дикого типа.
Согласно одному из вариантов осуществления мышь не экспрессирует IL-6 человека в нейронах. Согласно одному из вариантов осуществления у мыши присутствуют уровни активированных астроцитов, сравнимые с уровнями активированных астроцитов у мыши дикого типа.
Согласно одному из вариантов осуществления мышь обладает ветвящимися микроглиальными клетками в белом веществе, где ветвящиеся микроглиальные клетки присутствуют в количестве, эквивалентном количеству ветвящихся микроглиальных клеток у мыши дикого типа.
Согласно одному из вариантов осуществления у мыши не выявляют реактивного астроцитоза. Согласно одному из вариантов осуществления белое вещество мыши морфологически неотличимо от белого вещества мыши дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления белое вещество мыши гистологически неотличима от белого вещества мыши дикого типа в отношении гистохимического окрашивания реактивных астроцитов.
Согласно одному из вариантов осуществления мышь обладает головным мозгом, который морфологически неотличим от головного мозга мыши дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления мышь обладает тканью головного мозга, которая демонстрирует уровень реактивных астроцитов не выше, чем уровень реактивных астроцитов у мыши дикого типа.
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует hIL6 с эндогенного локуса IL-6 мыши, где эндогенный ген IL-6 мыши заменен геном hIL-6, где у мыши не выявляют свойства, выбранного из продолжительности жизни, укороченной приблизительно на 50% или более, почечной недостаточности, гипергаммаглобулинемии, повышенного количества мегакариоцитов в селезенке, повышенного количества мегакариоцитов в костном мозге, плазмацитоза селезенки, плазмацитоза тимуса, плазмацитоза лимфоузлов, гломерулонефрита, гломерулосклероза и их сочетания.
Согласно одному из вариантов осуществления продолжительность жизни мышей превосходит 20 недель. Согласно одному из вариантов осуществления продолжительность жизни мышей превосходит 30 недель, 40 недель или 50 недель. Согласно одному из вариантов осуществления мыши демонстрируют продолжительность жизни приблизительно равную продолжительности жизни мышей дикого типа той же линии.
Согласно одному из вариантов осуществления у мышей определяют уровень мегакариоцитов в селезенке, который приблизительно не превышает уровень мегакариоцитов в селезенки у мышей дикого типа.
Согласно одному из вариантов осуществления мыши обладают лимфоидными органами, которые по существу не содержат аномальных и плотно расположенных плазмацитоидных клеток.
Согласно одному из вариантов осуществления у мышей определяют уровни гамма-глобулинов в сыворотке, эквивалентные уровням гамма-глобулинов в сыворотке у мышей дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления уровни α1- и β-глобулинов в сыворотке мышей эквивалентны уровням α1- и β-глобулинов в сыворотке мышей дикого типа той же линии.
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует IL-6 человека с эндогенного локуса IL-6 мыши, где эндогенный ген IL-6 мыши заменен геном hIL-6, где у мыши не выявляют свойства, выбранного из мышечной атрофии, повышенного уровень катепсина В по сравнению с мышью дикого типа той же линии, повышенного уровня катепсинов А+В по сравнению с мышью дикого типа той же линии, увеличенной массы печени по сравнению с мышью дикого типа той же линии и их сочетания.
Согласно одному из вариантов осуществления масса печени мыши на 12 неделе составляет приблизительно 800-900 мг.
Согласно одному из вариантов осуществления у мыши на всем протяжении ее жизни выявляют уровень катепсина В, который приблизительно не превышает уровня, наблюдаемого у мышей дикого типа. Согласно одному из вариантов осуществления у мыши на всем протяжении ее жизни выявляют уровень катепсинов А+В, который приблизительно не превышает уровня, наблюдаемого у мышей дикого типа.
Согласно одному из вариантов осуществления у мыши во взрослом возрасте определяют массу икроножной мышцы, которая находится в пределах приблизительно 10% от массы у мыши дикого типа той же линии. Согласно одному из вариантов осуществления у мыши во взрослом возрасте определяют массу икроножной мышцы, которая приблизительно является такой же, как масса икроножной мышцы мыши дикого типа.
Согласно одному из аспектов предоставлена мышь, которая несет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок IL-6 человека, где нуклеотидная последовательность, кодирующая белок IL-6 человека, полностью или частично замещает эндогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенный белок IL-6 мыши.
Согласно одному из аспектов предоставлена мышь, которая несет замену в эндогенном локусе рецептора IL-6 мыши внеклеточного домена IL-6Rα мыши на последовательность внеклеточного домена IL-6Rα человека с формированием химерного гена IL-6Rα человека/мыши.
Согласно одному из вариантов осуществления химерный ген IL-6Rα находится под контролем промотора мыши и/или регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-6Rα мыши.
Согласно одному из вариантов осуществления последовательность длиной приблизительно 35,4 т.п.н., кодирующая внеклеточный домен IL-6Rα мыши, замещена последовательностью длиной приблизительно 45,5 т.п.н., кодирующей внеклеточный домен IL-6R человека.
Согласно одному из вариантов осуществления последовательность, кодирующая внеклеточный домен IL-6R человека, содержит первый (ATG) кодон от экзона 1 до экзона 8.
Согласно одному из вариантов осуществления замещаемая последовательность IL-6Rα мыши содержит непрерывную последовательность, которая содержит экзоны с 1 по 8. В конкретном варианте осуществления удалены экзоны с 1 по 8 и часть интрона 8.
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, несущая замену в эндогенном локусе IL-6 мыши гена мыши, кодирующего IL-6 на ген человека, кодирующий IL-6 человека, где ген человека, кодирующий IL-6 человека, находится под контролем эндогенных регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-6 мыши.
Согласно одному из вариантов осуществления ген человека, кодирующий IL-6 человека представляет собой ген IL-6 человека ВАС ID CTD-2369M23.
Согласно одному из вариантов осуществления мышь экспрессирует IL-6Rα мыши. Согласно одному из вариантов осуществления мышь экспрессирует IL-6Rα человека. Согласно одному из вариантов осуществления гуманизированный IL-6Rα содержит внеклеточный домен человека. Согласно одному из вариантов осуществления гуманизированный IL-6Rα содержит трансмембранный домен мыши и цитоплазматический домен мыши. Согласно одному из вариантов осуществления мышь экспрессирует гуманизированный IL-6Rα, который включает гуманизирование внеклеточного домена, но не трансмембранного и/или цитозольного домена.
Согласно одному из вариантов осуществления у мыши не выявляют свойства, выбранного из плазмацитоза, гломерулосклероза, гломерулонефрита, почечной недостаточности, гипергаммаглобулинемии, повышенного количество мегакариоцитов в селезенке, повышенного количества мегакариоцитов в костном мозге, спленомегалии, увеличение лимфоузлов, уплотненных аномальных плазматических клеток и их сочетания.
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, несущая гуманизированный эндогенный ген IL-6Rα мыши, где гуманизирование включает замену последовательности, кодирующей внеклеточный домен IL-6Rα мыши, на последовательность, кодирующую внеклеточный домен IL-6Rα человека, в эндогенном локусе IL-6Rα мыши.
Согласно одному из вариантов осуществления непрерывная последовательность мыши, содержащая экзоны с 1 по 8 мыши, замещена непрерывным геномным фрагментом последовательности IL-6Rα человека, кодирующей внеклеточный домен IL-6Rα человека. Согласно одному из вариантов осуществления непрерывный геномный фрагмент последовательности IL-6Rα человека, кодирующей внеклеточный домен, происходит из ВАС CTD-2192J23.
Согласно одному из вариантов осуществления мышь дополнительно несет гуманизированный ген IL-6. Согласно одному из вариантов осуществления у мыши в эндогенном локусе IL-6 мыши присутствует замена гена IL-6 мыши на ген IL-6 человека. Согласно одному из вариантов осуществления гуманизированный ген IL-6 находится под контролем эндогенных регуляторных элементов мыши.
Согласно одному из аспектов предоставлен способ получения гуманизированной мыши, включающий замену последовательности гена мыши, кодирующей IL-6 мыши на ген человека, кодирующий IL-6 человека.
Согласно одному из вариантов осуществления замену проводят в эндогенном локусе IL-6 мыши, и ген человека, кодирующий IL-6 человека, функционально связан с эндогенными регуляторными последовательностями мыши.
Согласно одному из аспектов предоставлен способ получения гуманизированной мыши, включающий замену экзонов мыши, кодирующих последовательности внеклеточного домена мыши IL-6Rα геномным фрагментом человека, кодирующим последовательности внеклеточного домена IL-6Rα человека с получением гуманизированного гена IL-6Rα.
Согласно одному из вариантов осуществления замену проводят в эндогенном локусе IL-6Rα мыши, и гуманизированный ген IL-6Rα функционально связан с эндогенными регуляторными последовательностями мыши.
Согласно одному из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, несущая гуманизированный ген IL-6Rα, содержащий замену последовательности, кодирующей внеклеточный домен мыши, последовательностью внеклеточного домена человека, где гуманизированный ген IL-6Rα содержит трансмембранную последовательность мыши и цитоплазматическую последовательность мыши; где мышь дополнительно несет ген, кодирующий IL-6 человека, где ген, кодирующий IL-6 человека, находится под контролем эндогенных регуляторных элементов IL-6 мыши.
Согласно одному из вариантов осуществления мышь не способна к экспрессии полностью принадлежащий мыши IL-6Rα и не способна к экспрессии IL-6 мыши.
В различных аспектах генетически модифицированная мыши, описываемая в настоящем документе, несет генетические модификации в зародышевой линии.
Согласно одному из аспектов предоставлены ткань, клетка или фрагмент мембраны мыши, как описано в настоящем документе.
Согласно одному из вариантов осуществления ткань или клетка получены у мыши, которая экспрессирует белок IL-6 человека, но не экспрессирует белок IL-6 мыши. Согласно одному из вариантов осуществления ткань или клетка получены у мыши, которая экспрессирует гуманизированный белок IL-6Rα, но не белок IL-6Rα мыши. Согласно одному из вариантов осуществления гуманизированный белок IL-6Rα содержит внеклеточный домен человека и трансмембранный домен мыши и цитозольный домен мыши. Согласно одному из вариантов осуществления ткань или клетка получены у мыши, которая экспрессирует IL-6 человека, гуманизированный IL-6Rα и не экспрессирует IL-6 мыши и не экспрессирует IL-6Rα, который содержит внеклеточный домен мыши.
Согласно одному из аспектов предоставлен комплекс клетки мыши ex vivo, несущей гуманизированный IL-6Rα (внеклеточный домен человека и трансмембранный домен мыши и цитоплазматический домен мыши) и IL-6 человека.
Согласно одному из аспектов предоставлен эмбрион мыши, несущий генетическую модификацию, как описано в настоящем документе.
Согласно одному из аспектов предоставлен эмбрион мыши-хозяина, который содержит донорскую клетку, несущую генетическую модификацию, как описано в настоящем документе.
Согласно одному из аспектов предоставлена плюрипотентная или тотипотентная клетка отличного от человека животного, несущая генетическую модификацию, как описано в настоящем документе. Согласно одному из вариантов осуществления клетка представляет собой клетку мыши. Согласно одному из вариантов осуществления клетка представляет собой ES клетку.
Согласно одному из аспектов предоставлена яйцеклетка мыши, где яйцеклетка мыши несет эктопическую хромосому мыши, где эктопическая хромосома мыши содержит генетическую модификацию, как описано в настоящем документе.
Согласно одному из аспектов мышь, эмбрион, яйцеклетка или клетка, которая генетически модифицированы, чтобы нести ген IL-6 человека или ген IL-6α человека или гуманизированный ген IL-6Rα человека принадлежат мышам линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. Согласно другому варианту осуществления мышь принадлежит линии 129, выбранной из группы, состоящей из линий, представляющих собой 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, также см., Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой метиса указанной выше линии 129 и указанной выше линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь представляет собой метиса указанных выше линий 129 или метиса указанных выше линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 для метиса представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). Согласно другому варианту осуществления мышь принадлежит линии BALB, например, линии BALB/c. В еще одном варианте осуществления мышь представляет собой метиса линии BALB и другой указанной выше линии. Согласно одному из вариантов осуществления мышь представляет собой мышь Swiss или Swiss Webster.
Каждый из аспектов и вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе, можно использовать вместе, если недвусмысленно или явно не исключено из контекста варианта осуществления или аспекта.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 предоставлена иллюстрация без соблюдения масштаба геномных локусов IL-6 человека (вверху) и мыши (внизу). Экзоны I, II, III, IV и V (у человека и мышь) указаны закрытыми рамками в правой части фигуры. Выбранные предполагаемые регуляторные области указаны открытыми рамками в левой части фигуры.
На фиг. 2 представлен ответ острой фазы (уровень mSAA) в присутствии или отсутствие скипидара у мышей дикого типа, мышей с гуманизированным внеклеточным доменом IL-6R и мышей с гуманизированными генами IL-6 и IL-6R.
На фиг. 3 представлен зависимый от скипидара ответ острой фазы (SAA) у мышей дикого типа в отсутствии или присутствии антитела к IL-6R мыши (слева); и зависимый от скипидара ответ острой фазы у мышей с гуманизированными IL-6/IL-6R в отсутствие или присутствии антитела к IL-6R человека (справа).
На фиг. 4 представлен анализ FACS для В-клеток селезенки мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; общий маркер В-клеток.
На фиг. 5 представлен анализ FACS для Т-клеток селезенки мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; Т-клетки хелперы и цитотоксические Т-клетки.
На фиг. 6 представлен анализ FACS для клеток селезенки мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; Ly6G/C(Gr1).
На фиг. 7 представлен анализ FACS для клеток селезенки мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; NK клетки и гранулоциты (Ly6Ghi+/CD11bhi+).
На фиг. 8 представлен анализ FACS В-клеток крови мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; общий маркер В-клеток.
На фиг. 9 представлен анализ FACS Т-клеток крови мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; Т-клетки хелперы и цитотоксические Т-клетки.
На фиг. 10 представлен анализ FACS для миелоидных клеток крови мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; клетки Gr1+.
На фиг. 11 представлен анализ FACS для миелоидных клеток крови мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; CD11b в сравнении с. Ly6G/C(Gr1).
На фиг. 12 представлен анализ FACS для миелоидных клеток крови мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6; клетки, несущие DX5, в сравнении с клетками, несущими CD11b.
На фиг. 13 представлен анализ FACS костного мозга IgM/CD24/B220 для мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6. Вверху: нормальное развитие в костном мозге. Внизу: анализ FACS для дикого типа, гетерозигот hIL-6 и гомозигот hIL-6 (окрашивание IgM).
На фиг. 14 представлен анализ FACS костного мозга IgM/CD24/B220 для мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6. Вверху: нормальное развитие в костном мозге. Внизу: анализ FACS для дикого типа, гетерозигот hIL-6 и гомозигот hIL-6 (окрашивание CD24).
На фиг. 15 представлен анализ FACS костного мозга CD43 и В220 для мышей с IL-6 дикого типа и гуманизированным IL-6. Вверху: нормальное развитие в костном мозге. Внизу: анализ FACS для дикого типа, гетерозигот hIL-6 и гомозигот hIL-6 (окрашивание CD43).
Подробное раскрытие настоящего изобретения
IL-6 и IL-6R
Рецептор IL-6 (IL-6R) давно охарактеризован, как рецептор для стимулирующего В-клетки фактора (BSF-2 или фактор стимуляции В-клеток 2; также, BCDF или фактор дифференцировки В-клеток), ответственного за индукцию синтеза иммуноглобулина В-клетками (Yamasaki et al. (1988) Cloning and Expression of the Human Interleukin-6(BSF-2/IFNβ 2) Receptor, Science 241:825-828). IL-6 впервые описан как интерферон-β2 как результат его открытия при поиске индуцируемого вирусами белка, названного интерферон-β, при обработке фибробластов человека дцРНК поли(I)поли(С) с индукцией противовирусного ответа (Weissenbach et al. (1980) Two interferon mRNAs in human fibroblasts: In vitro translation and Escherichia coli cloning studies, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77(12):7152-7156; Keller et al. (1996) Molecular and Cellular Biology of Interleukin-6 and Its Receptor, Frontiers in Bioscience 1:d340-357).
кДНК человека кодирует белок из 468 аминокислот, содержащий 19-членную сигнальную последовательность и цитоплазматический домен приблизительно из 82 аминокислот, в котором отсутствует тирозинкиназный домен (см., там же). N-концевой (внеклеточный) домен белка содержит домен Ig суперсемейства приблизительно из 90 аминокислот, домен из 250 аминокислот между доменом Ig суперсемейства и мембраной, трансмембранный участок приблизительно из 28 аминокислот (см., там же). Внеклеточный домен рецептора связывается с его лигандом IL-6, который инициирует ассоциацию с gp130 в мембране, и образуется комплекс, который передает сигнал; цитоплазматический домен по опубликованным данным не передает сигнал (Taga et al. (1989) Interleukin-6 Triggers the Association of Its Receptor with a Possible Signal Transducer, gp130, Cell 58:573-581)). Фактически, растворимая форма IL-6R с отсутствием цитоплазматического домена может ассоциировать с IL-6 и связывать gp130 на поверхности клетки и эффективно передавать сигнал (там же).
Гомология hIL-6R и mIL-6R на уровне белка составляет приблизительно только 54%; гомология трансмембранных доменов составляет приблизительно 79%, тогда как гомология цитоплазматических доменов составляет приблизительно 54% (Sugito et al. (1990)).
Природный лиганд IL-6R, IL-6, впервые выделен из культур трансформированных HTLV-1 Т-клеток (см., Hirano et al. (1985) Purification to homogeneity and characterization of human В cell differentiation factor (BCDF or BSFp-2), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5490-5494). кДНК для гена IL-6 человека клонировали по меньшей мере дважды, один раз как BSF-2 (см., Hirano et al. (1086) Complementary DNA fro a novel human interleukin (BSF-2) that induces В lymphocytes to produce immunoglobulin, Nature 324:73-76) и один раз как IFNβ 2 (см., Zilberstein et al. (1986) Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines, EMBO 5:2529-2537), хотя с тех пор показано, что у рекомбинантного IL-6 человека не выявляют детектируемой активности IFN.
IL-6 человека представляет собой белок из 184 аминокислот, у которого выявлено только приблизительно 42% гомологии с IL-6 мыши, хотя геномная организация генов человека и мыши в основном является сходной, и промоторные области генов человека и мыши содержат участок в 400 п.н., который является высококонсервативным (см., Tanabe et al. (1988) Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene: High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol. 141(11):3875-3881).
Ген IL-6 человека приблизительно состоит из 5 т.п.н. (Yasukawa et al. (1987) Structure and expression of human В cell stimulatory factor-2 (BSC-2/IL-6) gene, EMBO J. 6(10):2939-2945), тогда как ген IL-6 мыши состоит приблизительно из 7 т.п.н. (Tanabe et al. (1988) Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene: High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol. 141(11):3875-3881). Гены IL-6 мыши и человека по опубликованным данным содержат высококонсервативную 5'-фланкирующую последовательность, важную для регуляции. На фиг. 1 представлена схематическая диаграмма геномные локусы IL-6 человека и мыши (без соблюдения масштаба). Экзоны I, II, III, IV и V (у человека и мыши) указаны закрытыми рамками в правой части фигуры. Выбранные предполагаемые регуляторные области указаны открытыми рамки в левой части фигуры. Предполагаемые регуляторные области у людей представляют собой, слева направо, глюкокортикоидный элемент от -557 до -552; коровую последовательность IFN-энхансера от -472 до -468; глюкокортикоидный элемент от -466 до -461; АТ-богатую область от -395 до -334, консенсусный участок связывания АР-1 от -383 до -277; коровую последовательность IFN-энхансера от -253 до -248; содержащий GGAAA мотив от -205 до -192; последовательность, гомологичную SRE c-fos от -169 до -82, содержащую коровую последовательность IFN-энхансера, элемент ответа на цАМФ, мотив GGAAA, участок ССААТ и GC-богатую область; и участок связывания АР-1 от -61 до -55; и участок ССААТ от -34 до -30. Предполагаемые регуляторные области у мыши представляют собой, слева направо, GC-богатую область от -553 до -536, глюкокортикоидный элемент от -521 до -516 и от -500 до -495; участок Z-ДНК от -447 до -396; участок связывания АР-1, перекрывающий коровую последовательность IFN-энхансера от -277 до -288, мотив GGAAA, перекрывающий коровую последовательность IFN-энхансера от -210 до -195; область гомологии с SRE c-fos от -171 до -82, содержащий элемент ответа на цАМФ, мотив GGAAA, перекрывающий коровую последовательность IFN-энхансера, и GC-богатую область; и, участок связывания АР-1 от -61 до -55. Длина кодонов мыши I-V составляют 19, 185, 114, 150 и 165, соответственно. Длины интронов мыши составляют: I-II, 162 п.н.; II-III, 1253 п.н.; III-IV, 2981 п.н.; IV-V, 1281 п.н. Длина кодонов человека I-V составляет 19, 191, 114, 147 и 165. Длины интронов человека составляют I-II, 154; II-III, 1047; III-IV, 706; IV-V, 1737. Данные по организации генома взяты из Tanabe et al. (1988) и Yasukawa et al. (1987) Structure and expression of human В cell stimulatory factor-2 (BSF-2/IL-6) gene, EMBO J. 9(10):2939-2945.
На основе сходства 5'-фланкирующей последовательности генов IL-6 мыши и человека можно обоснованно полагать, что гены IL-6 мыши и человека, по-видимому, регулируются сходным образом. У множества типов клеток в ответ на IL-1, TNF, PDGF, IFNβ, сыворотку, поли(I)поли(С) и циклогексимид увеличивается экспрессия IL-6 (см., Tanabe et al. (1988). IL-6 у людей опосредует ответ острой фазы, гемопоэз, В-клеточную дифференцировку, активацию Т-клеток, рост, и/или дифференцировку, и/или активацию множества типов клеток (например, гепатоцитов, фибробластов, эндотелиальных клеток, нейронов, клеток гипофиза, лимфом, миелом, карцином молочной железы, NK клеток, макрофагов, остеокластов и т.д.) (рассмотрено, например, в Heinrich et al. (1990), Kishimoto et al. (1989) и Keller et al. (1996); Sugita et al. (1990) Functional Murine Interleukin Receptor with Intracisternal A Particle Gene Product at its Cytoplasmic Domain, J. Exp.Med. 171:2001-2009).
Однако, на практике, у мышей, трансгенных по IL-6 человека, выявляют множество существенных и инвалидизирующих патологий, отражающих значительную плейотропию гена IL-6. Трансгенные мыши, несущие фрагмент 6,6 т.п.н., содержащий ген IL-6 человека и энхансер μ (Еμ), продуцируют высокие концентрации hIL-6 и экстремально высокие уровни IgG1 (в 120-400 раз выше, чем у мышей дикого типа), отражая нарушение регуляции IL-6, которое сопровождается плазмацитозом, мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом и высокими уровнями мегакариоцитов в костном мозге (Suematsu et al. (1989) IgG1 plasmacytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:7547-7551). Нарушенная регуляция IL-6 и/или IL-6R ассоциирована с миеломами, плазмацитомами, ревматоидным артритом, болезнью Кастлемана, мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом, миксомой сердца, неоплазиями плазматических клеток, псориазом и другими нарушениями (см., Kishimoto, Т. (1989) The Biology of Interleukin-6, Blood 74(1):1-10; Sugita et al. (1990); also, Hirano et al. (1990) Biological and clinical aspects of interleukin 6, Immunology Today 11(12):443-449)). IL-6 также участвует в поддержание уровней внутрипростатических андрогенов при лечении пациентов с раком предстательной железы посредством депривации андрогенов по паракринному и/или аутокринному механизмам, потенциально приводя к устойчивому к кастрации росту опухолей предстательной железы (Chun et al. (2009) Interleukin-6 Regulates Androgen Synthesis in Prostate Cancer Cells, Clin. Cancer Res. 15:4815-4822).
Белок человека закодирован как белок из 212 аминокислот, в зрелой форме, после отщепления сигнальной последовательности из 28 аминокислот, белок из 184 аминокислот. Он содержит два участка N-гликозилирования и два участка О-гликозилирования, и IL-6 человека в некоторых клетках фосфорилирован. Белок мыши закодирован как белок из 211 аминокислот, в зрелой форме, после отщепления сигнальной последовательности из 23 аминокислот, белок из 187 аминокислот. О-участки гликозилирования присутствуют, а участки N-гликозилирования - нет. (См. обзоры об IL-6, например, Heinrich et al. (1990) Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265:621-636).
IL-6 обладает плейотропным действием. Рецептор IL-6 выявлен на активированных В-клетках, но по опубликованным данным не на покоящихся В-клетках. В отличие от этого, IL-6R выявлен на покоящихся Т-клетках и по опубликованным данным может стимулировать дифференцировку, активацию и пролиферацию Т-клеток, включая дифференцировку Т-клеток в цитотоксические Т-лимфоциты в присутствии IL-2.
Мыши с гуманизированными IL-6/внеклеточным доменом IL-6R и опосредуемый IL-6 ответ острой фазы
У людей IL-6 индуцирует ответ острой фазы. Ранние исследования с гепатоцитами человека установили, что IL-6 индуцирует белки острой фазы, например, такие как С-реактивный белок (CRP) и сывороточный амилоид A (SAA) зависимым от дозы и времени образом (рассмотрено в Heinrich et al. (1990) Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265:621-636). Таким образом, отличные от человека животные, например, мыши или крысы, содержащие гуманизированные гены IL-6 и IL-6R, являются подходящими системами для измерения ответа острой фазы, опосредуемого IL-6 человека. Такие животные также подходят для определения индукции веществом опосредуемого IL-6 ответа острой фазы, посредством воздействия веществом на животное с гуманизированными IL-6/IL-6R, как описано в настоящем документе, и измерения уровня одного или более белков (или РНК) ответа острой фазы. Согласно одному из вариантов осуществления на гуманизированное животное воздействуют веществом в присутствии антагониста IL-6R человека и измеряют уровень одного или более белков (или РНК) ответа острой фазы, где снижение уровня белка (или РНК) ответа острой фазы в присутствии антагониста IL-6R человека указывает на опосредуемый IL-6R человека ответ острой фазы.
IL-6 человека может связывать IL-6R человека и IL-6R мыши; IL-6 мыши связывается с IL-6R мыши, но не с IL-6R человека (отсутствие связывания mIL-6 с hIL-6R можно выявлять, тогда как hIL-6 может конкурировать с mIL-6 за связывание с mIL-6R; Coulie et al. (1989) High- and low-affinity receptors for murine interleukin 6. Distinct distribution on В and T cells, Eur. J. Immunol. 19:2107-211); также см., например, Peters et al. (1996) The Function of the Soluble Interleukin 6 (IL-6) Receptor In Vivo: Sensitization of Human Soluble IL-6 Receptor Transgenic Mice Towards IL-6 and Prolongation of the Plasma Half-life of IL-6, J. Exp. Med. 183:1399-1406). Таким образом, клетки человека, несущие hIL-6R, у мыши (например, в ксеногенном трансплантате), не могут зависеть от эндогенного mIL-6 для осуществления опосредуемых IL-6 функций, включая в качестве неограничивающих примеров роль IL-6 в развитии клеток крови или лимфоцитов (например, гемопоэз, активация В-клеток, активация Т-клеток и т.д.).
В смешанной системе in vivo, содержащей ген IL-6 мыши дикого типа и ген IL-6R человека (но не ген IL-6R мыши), не ожидается, что индуктор ответа острой фазы будет индуцировать детектируемые уровни белков острой фазы, которые будут указывать на ответ острой фазы. Однако гуманизированная мышь, как описано в настоящем документе, несущая гуманизированный ген IL-6 и ген IL-6R, содержащий гуманизированную последовательность внеклеточного домена, будет отвечать на индуктор ответа острой фазы и демонстрировать белки ответа острой фазы в сыворотке. Мыши дикого типа по IL-6/IL-6R, тестируемые на белки острой фазы в присутствии или отсутствие индуктора острой фазы, скипидара, демонстрировали зависимое от скипидара увеличение уровня белков острой фазы. У мышей с гуманизированным геном IL-6, но не с IL-6R, не выявляли ответа острой фазы в присутствии скипидара. Но у мышей, несущих ген IL-6 человека и ген IL-6R с гуманизированным внеклеточным доменом, выявляли сильный ответ острой фазы (фиг. 2). Опосредуемый IL-6 ответ острой фазы зависел от IL-6 у мышей дикого типа (фиг. 3, вверху) и у мышей с гуманизированными IL-6/внеклеточным доменом IL-6R (фиг. 3, внизу), о чем свидетельствует способность соответствующего антитела к IL-6R при достаточно высокой дозе антитела устранять ответ острой фазы. Таким образом, двойное гуманизирование IL-6 и IL-6R воспроизводит опосредуем IL-6 дикого типа ответ острой фазы в отношении сывороточных белков острой фазы.
Генетически модифицированные мыши
Предоставлены генетически модифицированные мыши, которые экспрессируют IL-6 человека и/или гуманизированный рецептор IL-6 с эндогенных локусов мыши, где эндогенный ген IL-6 мыши и/или эндогенный ген рецептора IL-6 мыши заменены на ген IL-6 человека и/или последовательность человека, содержащую последовательность, кодирующую внеклеточный домен рецептора IL-6 человека. Генетически модифицированные мыши экспрессируют IL-6 человека и/или гуманизированный рецептор IL-6 с гуманизированных эндогенных локусов, которые находятся под контролем промоторов мыши и/или регуляторных элементов мыши. Замена(ы) эндогенных локусов мыши позволяет получать отличных от человека животных, которые экспрессируют IL-6 человека и гуманизированный рецептор IL-6 таким образом, что это не приводит к множеству существенных патологий, наблюдаемых у трансгенных по IL-6 мышей, известных в данной области.
Трансгенные мыши, экспрессирующие IL-6 человека, известны в данной области. Однако, как правило, они страдают значительными патологиями, которые сильно ограничивают их пользу. Гуманизированные мыши, как описано в настоящем документе, экспрессируют IL-6 человека и/или гуманизированный рецептор IL-6 под контролем эндогенных регуляторных элементов мыши в эндогенных локусах IL-6 и IL-6Rα мыши. У этих мышей, наоборот, определяют профили экспрессии эти генов, которые отличаются от профилей экспрессии трансгенных мышей, известных в данной области.
Замена не принадлежащих человеку генов у отличного от человека животного гомологичными или ортологичными генами человека или последовательностями человека в эндогенном не принадлежащем человеку локусе и под контролем эндогенных промоторов и/или регуляторных элементов может позволять получать отличного от человека животного с качествами и характеристиками, которые могут значительно отличаться от типичного нокаутного и трансгенного животного. У типичного нокаутного и трансгенного животного эндогенный локус удален или поврежден и в геном животного встроен и предположительно случайно интегрирован полностью человеческий трансген. Как правило, положение интегрированного трансгена неизвестно; экспрессию белка человека определяют посредством транскрипции гена человека, и/или анализа белка, и/или функционального анализа. Очевидно, полагают, что включение в трансген человека последовательностей человека выше и/или ниже по ходу транскрипции является достаточным для обеспечения подходящей поддержки для экспрессии и/или регуляции трансгена в любом месте встраивания трансгена в геном животного. Но во многих случаях трансген с регуляторными элементами человека экспрессируется таким образом, который не является нефизиологическим или иным образом неудовлетворительным и фактически может быть вредным для животного. В отличие от этого, авторы изобретения демонстрируют, что замена последовательностью человека в эндогенном локусе под контролем эндогенных регуляторных элементов обеспечивает физиологически соответствующие профиль экспрессии и уровень, позволяющие получить в результате подходящее гуманизированное животное, физиология которого в отношении замещенного гена является полноценной и допустимой и подходящей для физиологии гуманизированного животного.
Оплодотворенные яйцеклетки мыши с инъецированной конструкцией, содержащей промотор МНС класса I Н2 и интрон β-глобина, направляющие экспрессию 695 п.н. гена IL-6 мыши по опубликованным данным приводят к получению мышей, которые конститутивно экспрессируют IL-6 мыши на относительно высоких уровнях (по сравнению с мышами дикого типа) (см., Woodrofe et al. (1992) Long-Term Consequences of Interleukin-6 Overexpression in Transgenic Mice, DNA and Cell Biology 11(8):587-592). Ho эти мыши подвержены развитию лимфомы, ассоциированной с кишечником, лимфоузлами и почками, а также отложению амилоида в почках. У них также выявляют аномальное созревание В-клеток (см., Woodrofe et al., там же), таким образом, исследования функции В-клеток нарушено. В отличие от этого, мыши, как описано в настоящем документе, несущие замену гена IL-6 мыши на ген IL-6 человека в локусе IL-6 мыши не подвержены развитию этих лимфом, и у мышей определяют очевидные нормальные популяции В-клеток.
В литературе описаны мыши (C57BL/6), трансгенные по hIL-6 после случайной вставки участка ДНК человека длиной 6,6 т.п.н. (фрагмент BamHI-Pvu II), содержащего ген hIL-6 в сочетании с энхансером IgM (см., Suematsu et al. (1989) IgGl plasmocytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7547-7551). Мыши экспрессируют hIL-6 в сыворотке на уровне от 800 пг/мл до 20000 пг/мл, тогда как мыши дикого типа, как правило, экспрессируют только приблизительно 100 пг/мл IL-6. У мышей выявляют возрастание Ig в сыворотке (в 120-400 раз по сравнению с мышами дикого типа) и снижение альбумина по мере их взросления. Мыши страдают от тяжелого плазмацитоза, у них выявляют спленомегалию и увеличение лимфоузлов, а также у них выявляют плазматические клетки и увеличенное количество мегакариоцитов в костном мозге. При исследовании того, что выглядит увеличенными лимфоузлами, вместо этого в них сосредоточены уплотненные аномальные плазматические клетки. В селезенке и тимусе выявляют массовую пролиферацию плазматических клеток, которые также инфильтрируют части легких, печени и почек. В почках у этих мышей также выявляют стимулируемую IL-6 пролиферацию мезангиальных клеток, типичную для мезангиального пролиферативного гломерулонефрита. Подобным образом, у мышей (BALB/c), трансгенных по укороченной кДНК hIL-6 под контролем промотора H-2Ld мыши, случайно встроенной в геном, выявляют тяжелый плазмацитоз (см., Suematsu et al. (1992) Generation of plasmacytomas with the chromosomal translocation t(12; 15) in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:232-235). Хотя у мышей C57BL/6 со сверхэкспрессией hIL-6 не развиваются трансплантационные плазмацитомы (у них выявляют плазмацитоз), у трансгенных мышей BL/6, подвергаемых обратному скрещиванию с мышами BALB/c, они, по опубликованным данным, развиваются.
Случайный трансгенез кДНК hIL-6 под контролем промотора гена глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) по опубликованным данным приводит к сверхэкспрессии hIL-6 в центральной нервной системе мышей, что также приводит к значительным патологиям (см., Campbell et al. (1993) Neurologic disease induced in transgenic mice by cerebral overexpression of interleukin 6, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10061-10065). У этих мышей выявляют обширную нейропатологию и реактивные астроциты, являющиеся результатом экспрессии IL-6 в ЦНС вследствие потери контроля в результате случайной интеграции трансгена IL-6 в очевидный пермиссивный для ЦНС транскрипционный локус. Хотя экспрессия кДНК hIL-6, сцепленной с 3'-UTR β-глобина и находящейся под контролем промотора нейронспецифической енолазы, микроинъецированной в оплодотворенные яйцеклетки мыши (F1 C57BL/6 х BALB/c), приводила получению мышей с нормальной продолжительностью жизни и без видимых неврологических деффектов, у которых hIL-6 экспрессировался в нейронах, но больше нигде (см., Fattor et al. (1994) IL-6 Expression in Neurons of Transgenic Mice Causes Reactive Astrocytosis and Increase in Ramified Microglial Cells But No Neuronal Damage, Eur. J. Neuroscience 7:2441-2449), у мышей выявляли высокие уровни (в 20-30 раз выше, чем у дикого типа) активированных и увеличенных астроцитов с увеличенными отростками во всем головном мозге, а также возрастание в 10-15 раз ветвящихся микроглиальных клеток в белом веществе. Таким образом, по опубликованным данным экспрессия IL-6 в головном мозге приводит к состояниям, которые находятся в диапазоне от реактивных астроцитов до явной и глубокой нейропатологии.
Микроинъекция в оплодотворенные яйцеклетки потомства F1 после скрещивания мышей C57BL/6x"DBAII" 639 п.н. кДНК hIL-6, сцепленной с 3'-UTR β-глобина и промотором МТ-1 мыши по опубликованным данным приводила к трансгенной мыши, у которой случайно встроенный ген hIL-6 приводил к получению ослабленной и подверженной заболеваниям мыши, которая погибала в молодом возрасте от почечной недостаточности (см. Fattori et al. (1994) Blood, Development of Progressive Kidney Damage and Myeloma Kidney in Interleukin-6 Transgenic Mice, Blood 63(9):2570-2579). Трансгенные мыши погибали через 12-20 недель, и у них выявляли повышенные уровни α1- и β-глобулинов в плазме, гипергаммаглобулинемию, повышенное количество мегакариоцитов в селезенке (в 3 раза выше, чем у дикого типа) и костном мозге, плазмацитоз лимфоидных органов (селезенка, тимус и лимфоузлы), характеризуемый аномальными и плотно расположенными плазмацитоидными клетками, и гломерулонефрит, приводящий к гломерулосклерозу, сходному со множественной миеломой.
Микроинъекция в оплодотворенные яйцеклетки мыши C57BL/6J кДНК hIL-6 под контролем H-2Ld приводила к зависимой от IL-6 мышечной атрофии у мышей, частично характеризуемой значительно меньшей массой икроножной мышцы у трансгенных мышей по сравнению с совпадающим по массе контролем, различие, которое снижалось при обработке антагонистом IL-6 (см., Tsujinaka et al. (1996) Interleukin 6 Receptor Antibody Inhibits Muscle Atrophy and Modulates Proteolytic Systems in Interleukin 6 Transgenic Mice, J. Clin. Invest. 97(1):244-249). Ha 12 неделе у этих мышей выявляли уровни hIL-6 в сыворотке более 600000 пг/мл. У трансгенных мышей также выявляли печень с массой приблизительно 1,242 мг в сравнении с контрольной печенью с массой приблизительно 862 мг. У трансгенных мышей, обработанных антагонистом IL-6, масса печени составляла приблизительно 888 мг. У трансгенных мышей были значительно повышены уровни мышечных катепсинов В и B+L (в 20 раз и в 6,2 раз) по сравнению с контролем, признак, который исчезал у трансгенных мыши при обработке антагонистом IL-6. Определяли, что мРНК катепсинов по сравнению с мышами дикого типа В и L составляла приблизительно 277% и 257%, соответственно; различие значительно уменьшалось при обработке антагонистом IL-6.
У мышей, несущих миниген hIL-6 под контролем промотора H-2Ld МНС класса I мыши и миниген hIL-6R под контролем промотора β-актина курицы, и ген gp130, выявляли патологии, типичные для мышей, трансгенных по hIL-6 (например, гипергаммаглобулинемию, спленомегалию, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, лимфоидная инфильтрация легких), а также гипертрофию желудочков (Hirota et al. (1995) Continuous activation of gp130, a signal-transducing receptor component for interleukin 6-related cytokines, causes myocardial hypertrophy in mice, Proc. Natl Acad. Sci. USA 92:4862-4866). Полагают, что гипертрофия желудочка опосредована непрерывной активацией gp130 (там же). Роль IL-6 по опубликованным данным состоит в помощи стабилизации комплекса цитокинового рецептора и индукции димеризации gp130, который представляет собой передающий сигнал компонент, ответственный за передачу сигнала IL-6 (Paonessa et al. (1995) Two distinct and independent sites on IL-6 trigger gp130 dimer formation and signalling, EMBO J. 14(9): 1942-1951). Полагают, что активированный комплекс представляет собой гексамер, состоящий из двух два IL-6, где каждый IL-6 связан с одним IL-6Rα, и двух gp130 (каждый IL-6 содержит два независимых участка связывания gp130) демонстрируя стехиометрию 2:2:2, где димеризация gp130 вызывает активацию тирозинкиназы JAK-Tyk, фосфорилирование gp130 и семейства факторов транскрипции STAT и других внутриклеточных субстратов (там же.; Stahl, N. (1994) Association and Activation of Jak-Tyk Kinases by CNTF-LIF-OSM-IL-6 β Receptor Components, Science 263:92-95), в соответствии с общей моделью формирования комплекса цитокиновых рецепторов (см., Stahl, N. and Yancopoulos, G. (1993) The Alphas, Betas, and Kinases of Cytokine Receptor Complexes, Cell 74:587-590; Davis et al. (1993) LIFRβ and gp130 as Heterodimerizing Signal Transducers of the Tripartite CNTF Receptor, Science 260:1805-1808; Murakami et al. (1993) IL-6-Induced Homodimerization of gp130 and Associated Activation of a Tyrosine Kinase, Science 2601808-1810).
Мыши, трансгенные по sIL-6R человека под управлением промотора PEP крысы и IL-6 человека под управлением промотора металлотионеина-1 мыши, по опубликованным данным были заметно меньше, чем мыши, трансгенные только по IL-6 человека или только sIL-6R человека (Peters et al. (1997) Extramedullary Expansion of Hematopoietic Progenitor Cells in Interleukin(IL-)-6-sIL-6R Double Transgenic Mice, J. Exp. Med. 185(4):755-766), что отражалось в сниженной жировой ткани и сниженной массе (20-25 г в отличие от 40 г). По опубликованным данным у двойных трансгенных мышей также выявляли увеличение селезенки (в 5 раз) и печени (в 2 раза) по сравнению с по опубликованным данным для нормальных масс органов у мышей с одним трансгеном, по-видимому вследствие экстрамедуллярной пролиферации гемопоэтических клеток в селезенке и печени, но не в костном мозге, а также повышенного количества мегакариоцитов в селезенке и инфильтратов плазматических клеток во всех паренхиматозных органах (там же). У двойных трансгенных животных также выявляли печень с увеличенным в количестве приблизительно от 200 до приблизительно 300 раз уровнем гранулоцитов, макрофагов, клеток-предшественников и В-клеток по сравнению с животными с одним трансгеном; в отличие от этого у мышей с одним трансгеном IL-6 выявляли меньшее количество макрофагов (в 15 раз) и В-клеток (в 45 раз) (там же). Необычные результаты получены предположительно вследствие стимуляции роста и дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников при активации сигнала gp130 (там же).
Кроме того, у двойных трансгенных мышей (hIL-6 под управлением промотора металлотионеина мыши/hIL-6R под управлением промотора PEP карбоксикиназы крысы) выявляют гиперплазию клеток печени, которая по опубликованным данным идентична узелковой регенеративной гиперплазии человека с длительной пролиферацией гепатоцитов, что дает веские основания полагать, что IL-6 ответственен за пролиферацию гепатоцитов и патогенную трансформацию клеток печени (Maione et al. (1998) Coexrpession of IL-6 and soluble IL-6R causes nodular regenerative hyperplasia and adenomas of the liver, EMBO J. 17(19):5588-5597). Так как гиперплазию клеток печени по опубликованным данным не наблюдали у мышей с одним трансгеном hIL-6 и hIL-6 может связывать mIL-6R, результат может выглядеть парадоксальным, пока не предположить, что два трансгена могут приводить к более высоким уровням hIL-6 в комплексе с растворимым IL-6R (в настоящем документе, растворимым hIL-6R), где этот комплекс является более мощным ингибитором, чем IL-6 отдельно (там же).
В отличие от мышей, трансгенных по IL-6 человека, у мышей с гуманизированным IL-6, которые несут замену в эндогенном локусе IL-6 мыши, который сохраняет регуляторные элементы мыши, но в нем производят гуманизирование кодирующей IL-6 последовательности, не выявляют тяжелых патологий мышей, полученных на известном уровне техники. Генетически модифицированные мыши, которые были гетерозиготными или гомозиготными по hIL-6 росли нормально.
Мышей с гуманизированным геном IL-6 (MAID 760), как описано в примерах, подвергали иммунофенотипированию и при анализах FACS (с отбором лимфоцитов) В-клеток селезенки с использованием общего маркера В-клеток (CD445R(B220)) выявили у них нормальные количества В-клеток (фиг. 4). Для селезенки у мышей дикого типа выявляли 63% В-клеток; у гетерозиготных по hIL-6 мышей выявляли 63% В-клеток и у мышей гомозиготных по hIL-6 в эндогенном локусе мыши выявляли 63% В-клеток. Количества В-клеток у гомозиготных по hIL-6 мышей, иммунизированных TNP-KLH также было нормальным (65% для дикого типа и 61% для гомозигот по hIL-6).
Количество Т-клеток селезенки также являлось приблизительно таким же, как у дикого типа (фиг. 5). Процентное содержание Т-клеток селезенки для Т-хелперов/цитотоксических Т-клеток для дикого типа составляло 20%/40% (отношение 1,4:1); для гетерозигот по hIL-6 - 23%/14% (отношение 1,6:1); для гомозигот по hIL-6 - 21%/15% (отношение 1,4:1) (маркерами являлись CD8a-APC; CD4-FITC). У гомозиготных по hIL-6 мышей, иммунизированных TNP-KLH, выявляли сходные с мышами дикого типа количества Т-клеток селезенки, т.е., Т-хелперы/цитотоксические Т-клетки составляли 22%/20% (отношение 1,1:1) по сравнению с 21%/19% для дикого типа (отношение также составляло 1,1:1).
У мышей с гуманизированным IL-6 при анализе FACS (CD11b и DX5) также выявляли приблизительно нормальные уровни NK клеток селезенки (фиг. 7). У гетерозигот по hIL-6 выявляли 2,2% NK клеток, и у гомозигот по hIL-6 выявляли 1,8% NK клеток, тогда как у мышей дикого типа выявляли 2,4% NK клеток. После иммунизации TNP-KLH, у гомозигот выявляли 1,6% NK клеток селезенки, тогда как у мышей дикого типа выявляли 2,1% NK клеток селезенки.
У мышей с гуманизированным IL-6 также выявляли нормальные уровни клеток Ly6G/C(Gr1) селезенки (фиг. 6). У гетерозигот по hIL-6 выявляли 7,0% клеток GR1+ (1,3% Gr1hi); у гомозигот выявляли 6,8% клеток Gr1+ (0,9% Gr1hi), тогда как у мышей дикого типа выявляли 8,0% клеток Gr1+ (1,8% Gr1hi). У иммунизированных гомозигот по IL-6 (иммунизировали TNP-KLH) выявляли 11% клеток Gr1+ (4,0% Gr1hi), тогда как у мышей дикого типа выявляли 10% клеток Gr1+ (3,0% Gr1hi).
У мышей с гуманизированным IL-6 при анализе FACS также выявляли нормальные количества В- и Т-клеток в крови (фиг. 8 и фиг. 9). FACS с общим маркером В-клеток (CD445R(B220)) выявил, что у гомозиготных по hIL-6 мыши можно наблюдать 52% В-клеток по сравнению с 53% у дикого типа; у гетерозигот можно наблюдать 38% (среднее двух различных линий с 29% и 47%). Гомозиготные по hIL-6 мыши, иммунизированные TNP-KLH, давали сходные количества В-клеток (43% по сравнению с 45% для мышей дикого типа).
У мышей с гуманизированным IL-6 при анализе FACS выявляли нормальный кровь Т-клеток как измеряли при окрашивании CD8a и CD4. У гетерозиготных hIL-6 мышей выявляли количества Т-хелперов/цитотоксических Т-клеток 39%/26% (отношение 1,5:1); у гомозиготных по hIL-6 мышей выявляли количества Th/Tc 24%/20% (отношение 1,2:1), тогда как у мышей дикого типа выявляли количества Th/Tc 26%/20% (отношение 1,3:1). У гомозиготных по hIL-6 мышей, иммунизированных TNP-KLH, выявляли количества Th/Tc 29%/21% (отношение 1,4:1), тогда как у иммунизированных мышей дикого типа мыши выявляли количества Th/Tc 28%/23% (1,2:1).
У мышей с гуманизированным IL-6 также выявляли количества миелоидных клеток в крови, которые были сходны с количествами у мышей дикого типа как измеряли посредством анализа FACS в крови наивных и иммунизированных мышей с окраской Ly6G/C(Gr1) и CD11b, а также CD11b и DX5 (фиг. 10, фиг. 11 и фиг. 12). У гетерозиготных по hIL-3 мышей выявляли % Gr+ клеток 10,8%, у гомозигот - 6,9%, тогда как у мышей дикого типа выявляли 9,7%. У иммунизированных гомозигот по hIL-6 выявляли количества M1(Ly6G/C(Gr) 101-104)/M2(Ly6G/C(Gr) с окраской приблизительно 102-103) 43%/34%, тогда как у мышей дикого типа выявляли количества 45%/38%. Диаграммы FACS зависимости CD11b (вертикальная ось) от Ly6G/C (горизонтальная ось) для иммунизированных гомозиготных по hIL-6 мышей продемонстрировали процентное содержание клетка в квадрантах (в верхнем левом/верхнем правом/нижнем правом) 16%/8%/3%, что было идентично количествам в квадрантах у иммунизированных мышей дикого типа.
У гомозиготных мышей, иммунизированных TNP-KLH, с гуманизированным IL-6 получали диаграммы окрашивания FACS зависимости CD11b от DX5(NK), которые были сходны с диаграммами у иммунизированных мышей дикого типа. Анализ квадрантов диаграмм FACS крови (CD11b - вертикальная ось, DX5(NK) - горизонтальная ось) выявил количества в верхнем левом/верхнем правом/нижнем правом квадрантах 9,5%/17%/10% для гомозигот по hIL-6 и 6,5%/17,3%/14% для мышей дикого типа.
У мышей с гуманизированным IL-6 выявляли изотопический ответ, который по существу был таким же, как наблюдали у мышей дикого типа. Ранние и конечные уровни IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE и IgM являлись приблизительно такими же, как наблюдали у мышей дикого типа. В одном из экспериментов конечный уровень IgM был немного выше у гуманизированных мышей; у гуманизированных мышей также был повышен конечный уровень IgG3.
Развитие В-клеток у наивных по hIL-6 мышей на основе анализа FACS костного мозга с окрашиванием IgM/CD24/B220 по существу не отличалось от развития у мышей дикого типа (фиг. 13). Иммунофенотипирование иммунных мышей выявило, что группы маркеров различных типов клеток при прохождении развития В-клеток у мышей с hIL-6 были по существу нормальными. Развитие клеток из гемопоэтических стволовых клеток, общих предшетсвенников лимфоидных клеток, ProB клеток, PreB клеток и незрелых и зрелых В-клеток у мышей с hIL-6 было нормальным (фиг. 14 и фиг. 15)
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Замена эндогенного гена IL-6 мыши на ген hIL-6
Геном IL-6 человека длиной 4,8 т.п.н., содержащим экзоны с 1 по 4 гена IL-6 человека, заменяли 6,8 т.п.н. локуса гена IL-6 мышей.
Направленную конструкцию для замены гена IL-6 мыши на ген человека за один этап взаимодействия конструировали с использованием технологии генетической инженерии VELOCIGENE® (см., Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). ДНК IL-6 мыши и человека получали из клона 368С3 бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) RPCI-23 и из клона 2369М23 ВАС CTD, соответственно. В кратком изложении, линеаризованную NotI направленную конструкцию, полученную посредством клонирования с репарацией пробелов, содержащую участки гомологии выше и ниже IL-6 мыши, фланкирующие последовательность IL-6 человека длиной 4,8 т.п.н., содержащую участки от ATG в экзоне 1 до экзона 5 с 16 нуклеотидами расположенной ниже 3'-конца последовательности (геномные координаты: NCBIh37.1: от ch7:22.766.882 до 22.771.637) и селекционной кассетой пео, фланкированной LoxP, электропорировали в эмбриональные стволовые (ES) клетки мыши F1H4 (гибрид F1 C57BL/6 × 129). ES с корректной вставкой (MAID 790) дополнительно электропорировали транзиторным вектором, экспрессирующим Cre для удаления лекарственной селекционной кассеты. Клоны модифицированных ES клеток без кассеты лекарственного средства (MAID 1428) вводили в эмбрион мыши на стадии 8 клеток способом VELOCIMOUSE® (см., патенты США №№7294754, 7576259, 7659442 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (мыши F0 полностью происходящие из донорских ES клеток), несущих гуманизированный ген IL-6 идентифицировали посредством генотипирования на потерю аллеля мышей и получение аллеля человека с использованием анализа модификации аллелей (см., Valenzuela et al. (2003)).
Клоны клеток ES с корректной вставкой идентифицировали посредством анализа потери нативного аллеля (LONA) (Valenzuela et al. 2003), в котором количество копий нативного, немодифицированного гена Il6 определяли посредством двух реакций количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) TaqMan™, специфичных для последовательностей гена Il6 мыши, которые были предназначены для делеции. Анализы qPCR включали следующие наборы праймеров-зондов (записанных в направлении от 5' к 3'): расположенный выше по ходу транскрипции прямой праймер, TTGCCGGTTTTCCCTTTTCTC (SEQ ID NO: 1); расположенный выше по ходу транскрипции обратный праймер, AGGGAAGGCCGTGGTTGTC (SEQ ID NO: 2); расположенный выше по ходу транскрипции зонд, FAM-CCAGCATCAGTCCCAAGAAGGCAACT-BHQ (SEQ ID NO: 3); расположенный ниже по ходу транскрипции прямой праймер, TCAGAGTGTGGGCGAACAAAG (SEQ ID NO: 4); расположенный ниже по ходу транскрипции обратный праймер, GTGGCAAAAGCAGCCTTAGC (SEQ ID NO: 5); расположенный ниже по ходу транскрипции зонд, FAM-TCATTCCAGGCCCTTCTTATTGCATCTG-BHQ (SEQ ID NO: 6); где FAM относится к флуоресцентному зонду 5-карбоксифлуоресцеину, a BHQ относится к гасителю флуоресценции, принадлежащему к гасителям типа черной дыры (Biosearch Technologies). ДНК, выделенную из клонов ES клеток, захвативших направленный вектор и встроивших его в свой геном, комбинировали с основной смесью TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) в соответствии с рекомендациями производителя в 384-луночном планшете для ПЦР (384-луночный планшет для реакций MicroAmp™ Optical, Life Technologies) и проводили циклическую реакцию в Applied Biosystems Prism 7900НТ, собирающем данные флуоресценции в течение PCR и определяющем пороговый цикл (Ct), частичный цикл ПЦР, при котором накопленная флуоресценция достигает предустановленного порога. Для каждого образца ДНК проводили qPCR, специфичные для расположенных выше и расположенных ниже по ходу транскрипции Il6 участков, и две qPCR для не являющихся мишенью контрольных генов. Рассчитывали различия в значениях Ct (ΔCt) между каждой qPCR из специфичных для Il6 и каждой qPCR для контрольного гена, а затем для каждого образца рассчитывали различие между каждым ΔCt и средним ΔCt для всех анализируемых образцов с получением значений ΔΔCt для каждого образца. Количество копий гена Il6 в каждом образце рассчитывали по следующей формуле: количество копий =2×2-ΔΔCt. Клон с корректной вставкой с потерей одной из нативных копий содержит количество копий гена Il6, равное единице. Подтверждение того, что последовательность гена IL6 человека замещала удаленную последовательность гена Il6 мыши в гуманизированном аллеле проводили посредством анализа qPCR TaqMan™, включающего следующие наборы праймеров-зондов (записанных в направлении от 5' к 3'): прямой праймер для последовательности человека, CCCCACTCCACTGGAATTTG (SEQ ID NO: 7); обратный праймер для последовательности человека, GTTCAACCACAGCCAGGAAAG (SEQ ID NO: 8) и зонд для последовательности человека, FAM-AGCTACAACTCATTGGCATCCTGGCAA-BHQ (SEQ ID NO: 9).
Тот же анализ LONA использовали для анализа ДНК, выделенной из материала хвостовой биопсии у мышей, происходящих из модифицированных ES клеток для определения их генотипов Il6 и подтверждения того, что гуманизированный аллель Il6 передается через зародышевую линию. Размножали двоих детенышей, гетерозиготных по замене, для получения мышей, гомозиготных по замене эндогенного гена IL-6 мыши на ген IL-6 человека. Для фенотипирования используют детенышей, гомозиготных по замене.
Предусмотрено, что расположенное выше по ходу транскрипции соединения локуса мыши и последовательности, содержащей ген hIL-6, находится в пределах участка , где конечный нуклеотид мышь перед первым нуклеотидом гена человека представляет собой "Т" в CCGCT, а первый нуклеотид последовательности человека представляет собой первый "А" в ATGAA. Предусмотрено, что расположенное ниже по ходу транскрипции соединения последовательности, содержащей ген hIL-6 и локуса мыши, находится в пределах участка , где конечный нуклеотид последовательности человека представляет собой конечный "G" в TCACG, а первый нуклеотид последовательности мыши представляет собой первый "С" в СТССС; расположенная ниже по ходу транскрипции область соединения также находится в контакте с участком loxP на 3'-конце (начало которого показано) для удаления фланкированной LoxP кассеты neo под контролем промотора убиквитина. Предусмотрено, что соединение кассеты neo с локусом IL-6 мыши находится в пределах участка где конечный "С" AGCTC представляет собой конечный нуклеотид кассеты neo; первый нуклеотид генома мыши после кассеты представляет собой начальный "С" в CTAAG.
Пример 2: Иммунофенотипирование наивных и иммунизированных мышей с hIL-6: В-клетки
У мышей, гомозиготных по замене на ген hIL-6, анализировали В-клетки (DC445R(B220). Фракции, обогащенные лимфоцитами, из препаратов клеток селезенки наивных и иммунизированных (TNP-KLH) мышей с hIL-6, окрашивали и подвергали иммунофенотипированию с использованием проточной цитометрии. Анализ FACS продемонстрировал, что процентное содержание В-клеток в препаратах клеток селезенки, как измеряли посредством окрашивания CD45R(B220)-FITC, у препаратов, полученных у наивных мышей дикого типа, гетерозигот по hIL-6 и гомозигот по hIL-6 являлось приблизительно одинаковым (63% клеток). У иммунизированных мышей В-клетки составляли приблизительно 65% от всех клеток препарата клеток селезенки у мышей дикого типа, и приблизительно 61% от всех клеток у гомозигот hIL-6. Селезенка мышей с hIL-6 (наивных и иммунизированных) содержала популяцию В-клеток, которая являлась приблизительно такого же размера как популяция В-клеток селезенки у мышей дикого типа.
Костный мозг мышей дикого типа, гетерозигот по hIL-6 и гомозигот по hIL-6 окрашивали на В-клеточные маркеры (CD45R(B220)-APC, CD24(HSA)-PE, или CD43, конъюгированные с красителем и/или IgM (IgM-FITC). По мере развития клеток из стволовых клеток до ранних про-В-клеток до поздних про-В-клеток, до больших пре-В-клетки до малых пре-В-клетки до незрелых В-клетки и наконец, до зрелых В-клеток развитие В-клеток в костном мозге нормальных мышей отражается в поверхностных маркерах. Общие предшественники лимфоцитов про-В-клетки экспрессируют CD45R, а на поздних стадиях экспрессируют IgM, как незрелые и, позднее, как зрелые В-клетки. Таким образом, окрашивание В-клеток на CD45R и на IgM должно выявлять профиль, характерный для развития В-клеток. Костный мозг гетерозигот и гомозигот по hIL-6 демонстрировал профиль окрашивания CD45R(B220)-APC и антителами к IgM-FITC, который по существу был неотличим от костного мозга дикого типа, демонстрируя популяции В-клеток, которые положительно окрашивались на CD45R(B220) и IgM или только на CD45R(B220). Субпопуляции В-клеток в костном мозге мышей с hIL-6, выявленные посредством окрашивания FACS были сходными с субпопуляциями В-клеток у мышей дикого типа (таблица 1; также см., фиг. 13).
Окрашивание на CD24 (см. фиг. 14) выявило (нормальный) профиль, представленный в таблице 2, указывающий на нормальное развитие в костном мозге.
Окрашивание на CD43 (см. фиг. 15) выявило (нормальный) профиль, представленный в таблице 3, указывающий на нормальное развитие в костном мозге.
Таким образом, иммунофенотипирование наивных мышей с hIL-6 выявило, что развитие В-клеток у таких мышей по существу является нормальным.
Пример 3: Замена эндогенной генной последовательности внеклеточного домена IL-6Rα мыши на генную последовательность внеклеточного домена hIL-6Rα
Последовательностью гена IL-6Rα человека длиной 45 т.п.н., содержащей экзоны с 1 по 8 гена IL-6Rα человека, замещали локус гена IL-6Rα мыши длиной 35,4 т.п.н. Экзоны мыши 9 и 10 сохраняли; гуманизированными являлись только экзоны 1-8. Всего 35384 п.н. последовательности мыши заменили на 45047 п.н. последовательности человека.
Направленную конструкцию для замены гена IL-6Rα мыши на ген человека за один этап взаимодействия конструировали с использованием технологии генетической инженерии VELOCIGENE® (см., Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). ДНК IL-6 мыши и человека получали из клона 125J8 бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) RPCI-23 и из клона 2192J23 ВАС CTD, соответственно. В кратком изложении, линеаризованную NotI направленную конструкцию, полученную посредством клонирования с репарацией пробелов, содержащую участки гомологии выше и ниже IL-6Rα мыши, фланкирующие последовательность IL-6Rα человека длиной 45 т.п.н., содержащую участки от ATG в экзоне 1 до экзона 8 с 69 нуклеотидами расположенной ниже 3'-конца последовательности и селекционной кассетой neo, фланкированной LoxP, электропорировали в эмбриональные стволовые (ES) клетки мыши F1H4 (гибрид F1 C57BL/6 × 129). ES с корректной вставкой (MAID 794) дополнительно электропорировали транзиторным вектором, экспрессирующим Cre для удаления лекарственной селекционной кассеты. Клоны модифицированных ES клеток без кассеты лекарственного средства (MAID 1442) вводили в эмбрион мыши на стадии 8 клеток способом VELOCIMOUSE® (см., патенты США №№7294754, 7576259, 7659442 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (мыши F0 полностью происходящие из донорских ES клеток), несущих гуманизированный ген IL-6Rα идентифицировали посредством генотипирования на потерю аллеля мышей и получение аллеля человека с использованием анализа модификации аллелей (см., Valenzuela et al. (2003)).
Клоны клеток ES с корректной вставкой идентифицировали посредством анализа потери нативного аллеля (LONA) (Valenzuela et al. 2003), в котором количество копий нативного, немодифицированного гена IL-6Rα определяли посредством двух реакций количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) TaqMan™, специфичных для последовательностей гена IL-6Rα мыши, которые были предназначены для делеции. Анализы qPCR включали следующие наборы праймеров-зондов (записанных в направлении от 5' к 3'): расположенный выше по ходу транскрипции прямой праймер, GCCCTAGCATGCAGAATGC (SEQ ID NO: 13); расположенный выше по ходу транскрипции обратный праймер, AAGAGGTCCCACATCCTTTGC (SEQ ID NO: 14); расположенный выше по ходу транскрипции зонд, СССАСАТССАТСССААТССТ GTGAG (SEQ ID NO: 15); расположенный ниже по ходу транскрипции прямой праймер, GAGCTTGCCCCCAGAAAGG (SEQ ID NO: 16); расположенный ниже по ходу транскрипции обратный праймер, CGGCCACATCTCTGGAAGAC (SEQ ID NO: 17); расположенный ниже по ходу транскрипции зонд, CATGCACTGCCCCAAGTCTGGTTTCAGT (SEQ ID NO: 18). ДНК, выделенную из клонов ES клеток, захвативших направленный вектор и встроивших его в свой геном, комбинировали с основной смесью TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) в соответствии с рекомендациями производителя в 384-луночном планшете для ПЦР (384-луночный планшет для реакций MicroAmp™ Optical, Life Technologies) и проводили циклическую реакцию в Applied Biosystems Prism 7900НТ, собирающем данные флуоресценции в течение PCR и определяющем пороговый цикл (Ct), частичный цикл ПЦР, при котором накопленная флуоресценция достигает предустановленного порога. Для каждого образца ДНК проводили qPCR, специфичные для расположенных выше и расположенных ниже по ходу транскрипции IL-6Rα участков, и две qPCR для не являющихся мишенью контрольных генов. Рассчитывали различия в значениях Ct (ΔCt) между каждой qPCR из специфичных для IL-6Rα и каждой qPCR для контрольного гена, а затем для каждого образца рассчитывали различие между каждым ΔCt и средним ΔCt для всех анализируемых образцов с получением значений ΔΔCt для каждого образца. Количество копий гена IL-6Rα в каждом образце рассчитывали по следующей формуле: количество копий =2×2-ΔΔCt. Клон с корректной вставкой с потерей одной из нативных копий содержит количество копий гена IL-6Rα, равное единице. Подтверждение того, что последовательность гена IL-6Rα человека замещала удаленную последовательность гена IL-6Rα мыши в гуманизированном аллеле проводили посредством анализа qPCR TaqMan™, включающего следующие наборы праймеров-зондов (записанных в направлении от 5' к 3'): прямой праймер для последовательности человека, GGAGAGGGCAGAGGCACTTAC (SEQ ID NO: 19); обратный праймер для последовательности человека, GGCCAGAGCCCAAGAAAAG (SEQ ID NO: 20) и зонд для последовательности человека, CCCGTTGACTGTAATCTGCCCCTGG (SEQ ID NO: 21).
Тот же анализ LONA использовали для анализа ДНК, выделенной из материала хвостовой биопсии у мышей, происходящих из модифицированных ES клеток для определения их генотипов IL-6Rα и подтверждения того, что гуманизированный аллель IL-6Rα передается через зародышевую линию. Размножали детенышей, гетерозиготных по замене, для получения мышей, гомозиготных по замене эндогенного гена IL-6Rα мыши на ген (внеклеточный домен) IL-6Rα человека. Для фенотипирования используют детенышей, гомозиготных по замене.
Предусмотрено, что расположенное выше по ходу транскрипции соединения локуса мыши и последовательности, содержащей ген hIL-6Rα, находится в пределах участка где конечный нуклеотид мышь перед первым нуклеотидом гена человека представляет собой "С" в GAAGC, а первый нуклеотид последовательности человека представляет собой первый "А" в ATGCT. Предусмотрено, что расположенное ниже по ходу транскрипции соединения последовательности, содержащей ген hIL-6Rα и локуса мыши, находится в пределах участка где конечный нуклеотид последовательности человека представляет собой конечный "А" в CAAGA, а первый нуклеотид последовательности мыши представляет собой первый "С" в CCCGG; расположенная ниже по ходу транскрипции область соединения также находится в контакте с участком loxP на 3'-конце для удаления фланкированной LoxP кассеты neo под контролем промотора убиквитина. Первый нуклеотид участка loxp представляет собой первый "А" в АТААС. Предусмотрено, что соединение кассеты neo с локусом IL-6R"A мыши находится в пределах участка где конечный "С" AGCTC представляет собой конечный нуклеотид кассеты neo; первый нуклеотид генома мыши после кассеты представляет собой начальный "Т" в ТАСТС.
В частных воплощениях настоящее изобретение может относится к следующим вариантам осуществления:
Вариант 1. Генетически модифицированная мышь, несущая замену в эндогенном локусе IL-6 мыши гена мыши, кодирующего IL-6, на ген человека, кодирующий IL-6 человека, где ген человека, кодирующий IL-6 человека, находится под контролем эндогенных регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-6 мыши.
Вариант 2. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 1, где ген человека, кодирующий IL-6 человека, представляет собой ген IL-6 человека ВАС ID CTD-2369М23.
Вариант 3. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 1, где мышь экспрессирует IL-6Rα мыши.
Вариант 4. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 1, где мышь экспрессирует гуманизированный IL-6Rα.
Вариант 5. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 1, где мышь экспрессирует гуманизированный IL-6Rα.
Вариант 6. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 1, где у мыши не выявляют свойства, выбранного из плазмоцитоза, гломерулосклероза, гломерулонефрита, почечной недостаточности, гипергаммаглобулинемии, повышенного количества мегакариоцитов в селезенке, повышенного количества мегакариоцитов в костном мозге, спленомегалии, увеличения лимфоузлов, уплотненных аномальных плазматических клеток и их сочетания.
Вариант 7. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 4, где гуманизированный IL-6Rα содержит внеклеточный домен человека.
Вариант 8. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 7, где гуманизированный IL-6Rα содержит трансмембранный домен мыши и цитоплазматический домен мыши.
Вариант 9. Генетически модифицированная мышь, несущая в эндогенном локусе IL-6Rα мыши гуманизированный эндогенный ген IL-6Rα мыши, где гуманизирование включает замену последовательности, кодирующей внеклеточный домен IL-6Rα мыши, на последовательность, кодирующую внеклеточный домен IL-6Rα человека.
Вариант 10. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 9, где непрерывная последовательность мыши, содержащая экзоны мыши с 1 по 8 замещена непрерывным геномным фрагментом последовательности IL-6Rα человека, кодирующей внеклеточный домен IL-6Rα человека.
Вариант 11. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 10, где непрерывный геномный фрагмент последовательности IL-6Rα человека, кодирующий внеклеточный домен, происходит из ВАС CTD-2192J23.
Вариант 12. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 9, дополнительно несущая гуманизированный ген IL-6.
Вариант 13. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 12, где мышь несет замену в эндогенном локусе IL-6 мыши гена IL-6 мыши на ген IL-6 человека.
Вариант 14. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 12, где гуманизированный ген IL-6 находится под контролем эндогенных регуляторных элементов мыши.
Вариант 15. Способ получения гуманизированной мыши, включающий замену последовательности гена мыши, кодирующей IL-6 мыши, на ген человека, кодирующий IL-6 человека.
Вариант 16. Способ согласно варианту 15, где замену проводят в эндогенном локусе IL-6 мыши, и ген человека, кодирующий IL-6 человека, функционально связан с эндогенными регуляторными последовательностями мыши.
Вариант 17. Способ получения гуманизированной мыши, включающий замену экзонов мыши, кодирующих последовательности внеклеточного домена IL-6Rα мыши на геномный фрагмент человека, кодирующий последовательности внеклеточного домена IL-6Rα человека с получением гуманизированного гена IL-6Rα.
Вариант 18. Способ согласно варианту 17, где замену проводят в эндогенном локусе IL-6Rα мыши, и гуманизированный ген IL-6Rα функционально связан с эндогенными регуляторными последовательностями мыши.
Вариант 19. Генетически модифицированная мышь, несущая гуманизированный ген IL-6Rα, содержащий замену последовательности, кодирующей внеклеточный домен мыши, на последовательность внеклеточного домена человека, где гуманизированный ген IL-6Rα содержит трансмембранную последовательность мыши и цитоплазматическую последовательность мыши; где мышь дополнительно несет ген, кодирующий IL-6 человека, где ген, кодирующий IL-6 человека, находится под контролем эндогенных регуляторных элементов IL-6 мыши.
Вариант 20. Генетически модифицированная мышь согласно варианту 19, где мышь неспособна к экспрессии полностью мышиного IL-6Rα и неспособна к экспрессии IL-6 мыши.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>RegeneronPharmaceuticals, Inc.
<120> ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ IL-6 И РЕЦЕПТОР IL-6
<130> 1250A-WO
<140>To be assigned
<141> Filed herwith
<150> 61/552,900
<151> 2011-10-28
<150> 61/556,579
<151> 2011-11-07
<160> 24
<170>FastSEQforWindowsVersion 4.0
<210> 1
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 1
ttgccggttttcccttttctc 21
<210> 2
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 2
agggaaggccgtggttgtc 19
<210> 3
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 3
ccagcatcagtcccaagaaggcaact 26
<210> 4
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 4
tcagagtgtgggcgaacaaag 21
<210> 5
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 5
gtggcaaaagcagccttagc 20
<210> 6
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 6
tcattccaggcccttcttattgcatctg 28
<210> 7
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 7
ccccactccactggaatttg 20
<210> 8
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 8
gttcaaccacagccaggaaag 21
<210> 9
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 9
agctacaactcattggcatcctggcaa 27
<210> 10
<211> 197
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 10
aattagagagttgactcctaataaatatgagactggggatgtctgtagctcattctgctc 60
tggagcccaccaagaacgatagtcaattccagaaaccgctatgaactccttctccacaag 120
taagtgcaggaaatccttagccctggaactgccagcggcggtcgagccctgtgtgaggga 180
ggggtgtgtggcccagg 197
<210> 11
<211> 151
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 11
ttttaaagaaatatttatattgtatttatataatgtataaatggtttttataccaataaa 60
tggcattttaaaaaattcagcaactttgagtgtgtcacgctcccgggctcgataactata 120
acggtcctaaggtagcgactcgagataactt 151
<210> 12
<211> 128
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 12
tatacgaagttatcctaggttggagctcctaagttacatccaaacatcctcccccaaatc 60
aataattaagcactttttatgacatgtaaagttaaataagaagtgaaagctgcagatggt 120
gagtgaga 128
<210> 13
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 13
gccctagcatgcagaatgc 19
<210> 14
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 14
aagaggtcccacatcctttgc 21
<210> 15
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 15
cccacatccatcccaatcctgtgag 25
<210> 16
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 16
gagcttgcccccagaaagg 19
<210> 17
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 17
cggccacatctctggaagac 20
<210> 18
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 18
catgcactgccccaagtctggtttcagt 28
<210> 19
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 19
ggagagggcagaggcacttac 21
<210> 20
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 20
ggccagagcccaagaaaag 19
<210> 21
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 21
cccgttgactgtaatctgcccctgg 25
<210> 22
<211> 191
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 22
cgagggcgactgctctcgctgccccagtctgccggccgcccggccccggctgcggagccg 60
ctctgccgcccgccgtcccgcgtagaaggaagcatgctggccgtcggctgcgcgctgctg 120
gctgccctgctggccgcgccgggagcggcgctggccccaaggcgctgccctgcgcagggt 180
aagggcttcgg 191
<210> 23
<211> 148
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 23
caagattattggagtctgaaatggaatacctgttgagggaaatctttattttgggagccc 60
ttgatttcaatgcttttgattccctatccctgcaagacccgggctcgataactataacgg 120
tcctaaggtagcgactcgagataacttc 148
<210> 24
<211> 129
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 24
tatacgaagttatcctaggttggagctctactccatatgctcacttgccgttgtttgcta 60
cgatacggtgaggcccgtgcgaagagtggcacagatcaggaggcttatgtggtcagtcca 120
cagtatggc 129
<---
Claims (14)
1. Генетически модифицированное животное семейства мышиных, которое экспрессирует гуманизированный белок IL-6Rα, несущее замену геномного фрагмента животного семейства мышиных, кодирующего внеклеточный домен IL-6Rα животного семейства мышиных в эндогенном локусе IL-6Rα животного семейства мышиных, на геномный фрагмент человека, кодирующий внеклеточный домен IL-6Rα человека, с получением гуманизированного гена IL-6Rα, который кодирует указанный гуманизированный белок IL-6Rα, где гуманизированный ген IL-6Rα находится под управлением эндогенных регуляторных элементов животного семейства мышиных в эндогенном локусе IL-6Rα животного семейства мышиных, при этом животное семейства мышиных представляет собой мышь или крысу.
2. Животное семейства мышиных по п. 1, где гуманизированный ген IL-6Rα содержит эндогенную последовательность трансмембранного домена IL-6Rα животного семейства мышиных и эндогенную последовательность цитоплазматического домена IL-6Rα животного семейства мышиных.
3. Животное семейства мышиных по п. 1, где животное семейства мышиных представляет собой мышь.
4. Животное семейства мышиных по п. 1, где животное семейства мышиных представляет собой крысу.
5. Животное семейства мышиных по п. 3, где непрерывная геномная последовательность мыши, содержащая экзоны с 1 по 8 IL-6Rα мыши, замещена непрерывным геномным фрагментом последовательности IL-6Rα человека, кодирующей внеклеточный домен IL-6Rα человека.
6. Животное семейства мышиных по п. 5, где непрерывный геномный фрагмент последовательности IL-6Rα человека, кодирующий внеклеточный домен IL-6Rα человека, происходит из бактериальной искусственной хромосомы CTD-2192J23.
7. Животное семейства мышиных по любому из пп. 1-6, дополнительно несущее замену гена IL-6R животного семейства мышиных в эндогенном локусе IL-6R животного семейства мышиных на ген IL-6 человека, с получением гуманизированного гена IL-6.
8. Животное семейства мышиных по п. 7, где гуманизированный ген IL-6 находится под управлением эндогенных регуляторных элементов животного семейства мышиных в эндогенном локусе IL-6 животного семейства мышиных.
9. Способ получения генетически модифицированного животного семейства мышиных, включающий замену геномного фрагмента животного семейства мышиных, кодирующего внеклеточный домен IL-6Rα животного семейства мышиных в эндогенном локусе IL-6Rα животного семейства мышиных, на геномный фрагмент человека, кодирующий внеклеточный домен IL-6Rα человека, с получением гуманизированного гена IL-6Rα, где гуманизированный ген IL-6Rα находится под управлением эндогенных регуляторных элементов животного семейства мышиных в эндогенном локусе IL-6Rα животного семейства мышиных, при этом указанное животное семейства мышиных представляет собой мышь или крысу.
10. Способ по п. 9, где животное семейства мышиных представляет собой мышь.
11. Способ по п. 9, где животное семейства мышиных представляет собой крысу.
12. Выделенная эмбриональная стволовая клетка животного семейства мышиных для получения животного семейства мышиных, которое экспрессирует гуманизированный белок IL-6Rα, содержащая замену последовательности, кодирующей внеклеточный домен IL-6Rα животного семейства мышиных, в эндогенном локусе IL-6Rα животного семейства мышиных, на последовательность, кодирующую внеклеточный домен IL-6Rα человека, с получением гуманизированного гена IL-6Rα, кодирующего указанный гуманизированный белок IL-6Rα, где гуманизированный ген IL-6Rα содержит эндогенную трансмембранную последовательность IL-6Rα животного семейства мышиных и эндогенную цитоплазматическую последовательность IL-6Rα животного семейства мышиных, и гуманизированный ген IL-6Rα находится под управлением эндогенных регуляторных элементов животного семейства мышиных в эндогенном локусе IL-6Rα животного семейства мышиных, при этом животное семейства мышиных представляет собой мышь или крысу.
13. Эмбриональная стволовая клетка по п. 12, где животное семейства мышиных представляет собой мышь.
14. Эмбриональная стволовая клетка по п. 12, где животное семейства мышиных представляет собой крысу.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161552900P | 2011-10-28 | 2011-10-28 | |
US61/552,900 | 2011-10-28 | ||
US201161556579P | 2011-11-07 | 2011-11-07 | |
US61/556,579 | 2011-11-07 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014121324A Division RU2634417C2 (ru) | 2011-10-28 | 2012-10-29 | Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2021118181A Division RU2021118181A (ru) | 2021-06-22 | Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017129763A RU2017129763A (ru) | 2019-02-05 |
RU2017129763A3 RU2017129763A3 (ru) | 2020-12-18 |
RU2751240C2 true RU2751240C2 (ru) | 2021-07-12 |
Family
ID=47295138
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014121324A RU2634417C2 (ru) | 2011-10-28 | 2012-10-29 | Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 |
RU2017129763A RU2751240C2 (ru) | 2011-10-28 | 2012-10-29 | Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014121324A RU2634417C2 (ru) | 2011-10-28 | 2012-10-29 | Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (9) | US8878001B2 (ru) |
EP (2) | EP2818478B1 (ru) |
JP (2) | JP6120451B2 (ru) |
KR (2) | KR102234632B1 (ru) |
CN (2) | CN104039821A (ru) |
AU (1) | AU2015207889B2 (ru) |
BR (1) | BR112014008529A2 (ru) |
CA (1) | CA2853731C (ru) |
CY (2) | CY1116614T1 (ru) |
DK (2) | DK2663575T3 (ru) |
ES (2) | ES2624605T3 (ru) |
HK (2) | HK1190408A1 (ru) |
HR (2) | HRP20141192T1 (ru) |
HU (1) | HUE033400T2 (ru) |
IL (4) | IL231896B (ru) |
IN (1) | IN2014CN03920A (ru) |
LT (1) | LT2818478T (ru) |
MX (1) | MX358390B (ru) |
MY (2) | MY172726A (ru) |
PL (2) | PL2818478T3 (ru) |
PT (2) | PT2663575E (ru) |
RS (2) | RS53683B1 (ru) |
RU (2) | RU2634417C2 (ru) |
SG (3) | SG11201400945UA (ru) |
SI (2) | SI2663575T1 (ru) |
SM (1) | SMT201400187B (ru) |
WO (1) | WO2013063556A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201402635B (ru) |
Families Citing this family (70)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5874881B2 (ja) | 2009-10-06 | 2016-03-02 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 遺伝子改変されたマウスおよび移植方法 |
MX350385B (es) | 2011-02-15 | 2017-09-04 | Regeneron Pharma | Ratones de m-csf humanizada. |
MY172726A (en) | 2011-10-28 | 2019-12-11 | Regeneron Pharma | Humanized il-6 and il-6 receptor |
US20130261016A1 (en) * | 2012-03-28 | 2013-10-03 | Meso Scale Technologies, Llc | Diagnostic methods for inflammatory disorders |
US8962913B2 (en) | 2012-06-18 | 2015-02-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized IL-7 rodents |
JP6283031B2 (ja) | 2012-09-07 | 2018-02-21 | イエール ユニバーシティ | 遺伝学的に修飾された非ヒト動物およびその使用法 |
JP6282591B2 (ja) * | 2012-09-13 | 2018-02-21 | 中外製薬株式会社 | 遺伝子ノックイン非ヒト動物 |
WO2014071397A2 (en) * | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Regeneron Pharmaceuticals | Genetically modified non-human animals and methods of use thereof |
PL2958937T3 (pl) | 2013-02-22 | 2019-01-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Myszy ekspresjonujące humanizowany główny układ zgodności tkankowej |
GB2513884B (en) | 2013-05-08 | 2015-06-17 | Univ Bristol | Method and apparatus for producing an acoustic field |
KR102407354B1 (ko) * | 2013-09-23 | 2022-06-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화된 신호-조절 단백질 유전자를 가지는 비-인간 동물 |
PL2908626T3 (pl) | 2013-10-15 | 2017-05-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Zwierzęta z humanizowaną |
AU2014353346B2 (en) * | 2013-11-19 | 2020-05-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized B-cell activating factor gene |
SG10201811701YA (en) | 2013-11-19 | 2019-01-30 | Regeneron Pharma | Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene |
US9612658B2 (en) | 2014-01-07 | 2017-04-04 | Ultrahaptics Ip Ltd | Method and apparatus for providing tactile sensations |
AU2015315834B2 (en) | 2014-01-31 | 2019-12-12 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Novel anti-BAFF antibodies |
PL3129400T3 (pl) | 2014-04-08 | 2020-09-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Zwierzęta inne niż człowiek mające humanizowane receptory fc-gamma |
EP3636073B1 (en) | 2014-05-05 | 2023-11-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized c5 and c3 animals |
NO2785538T3 (ru) | 2014-05-07 | 2018-08-04 | ||
FI3841877T3 (fi) | 2014-05-19 | 2023-12-01 | Regeneron Pharma | Ihmisen epo:a ilmentäviä geneettisesti muunneltuja hiiriä |
MX2016015609A (es) * | 2014-05-30 | 2017-08-02 | Regeneron Pharma | Animales con dipeptidil peptidasa iv (dpp4) humanizada. |
KR102482295B1 (ko) * | 2014-06-19 | 2022-12-30 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 프로그램화 세포 사멸 1 유전자를 가지는 비인간 동물 |
GB2530036A (en) | 2014-09-09 | 2016-03-16 | Ultrahaptics Ltd | Method and apparatus for modulating haptic feedback |
CN113016720B (zh) | 2014-11-24 | 2023-02-21 | 瑞泽恩制药公司 | 表达人源化cd3复合物的非人类动物 |
LT3086637T (lt) * | 2014-12-05 | 2019-04-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Gyvūnai, išskyrus žmogų, turintys humanizuota diferenciacijos klasterio 47 geną |
AU2016221497B2 (en) | 2015-02-20 | 2021-06-03 | Ultrahaptics Ip Limited | Algorithm improvements in a haptic system |
EP3537265B1 (en) | 2015-02-20 | 2021-09-29 | Ultrahaptics Ip Ltd | Perceptions in a haptic system |
NZ736031A (en) | 2015-04-06 | 2022-07-29 | Regeneron Pharma | Humanized t cell mediated immune responses in non-human animals |
PT3282835T (pt) | 2015-04-13 | 2023-07-25 | Univ Yale | Ratinhos knockin de sirpa-il15 humanizadas e métodos de utilização dos mesmos |
US10818162B2 (en) | 2015-07-16 | 2020-10-27 | Ultrahaptics Ip Ltd | Calibration techniques in haptic systems |
JP6997708B2 (ja) | 2015-11-20 | 2022-02-04 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化されたlymphocyte-activation gene 3遺伝子を有する非ヒト動物 |
PL3386534T3 (pl) | 2015-12-08 | 2021-03-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Kompozycje i sposoby internalizacji enzymów |
US11189140B2 (en) | 2016-01-05 | 2021-11-30 | Ultrahaptics Ip Ltd | Calibration and detection techniques in haptic systems |
MA43962A (fr) | 2016-02-04 | 2018-12-12 | Regeneron Pharma | Animaux non humains possédant un gène angptl8 modifié |
DK3422845T3 (da) | 2016-02-29 | 2021-08-30 | Regeneron Pharma | Gnavere med et humaniseret tmprss-gen |
AU2017272337C1 (en) | 2016-06-03 | 2024-02-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase |
US10531212B2 (en) | 2016-06-17 | 2020-01-07 | Ultrahaptics Ip Ltd. | Acoustic transducers in haptic systems |
US10268275B2 (en) | 2016-08-03 | 2019-04-23 | Ultrahaptics Ip Ltd | Three-dimensional perceptions in haptic systems |
US10755538B2 (en) | 2016-08-09 | 2020-08-25 | Ultrahaptics ilP LTD | Metamaterials and acoustic lenses in haptic systems |
CN107815467B (zh) * | 2016-08-31 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
US10943578B2 (en) | 2016-12-13 | 2021-03-09 | Ultrahaptics Ip Ltd | Driving techniques for phased-array systems |
US10497358B2 (en) | 2016-12-23 | 2019-12-03 | Ultrahaptics Ip Ltd | Transducer driver |
CN108588126B (zh) | 2017-03-31 | 2020-04-10 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用 |
WO2018177441A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα |
US11531395B2 (en) | 2017-11-26 | 2022-12-20 | Ultrahaptics Ip Ltd | Haptic effects from focused acoustic fields |
EP4299732A3 (en) | 2017-11-30 | 2024-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rats comprising a humanized trkb locus |
US11360546B2 (en) | 2017-12-22 | 2022-06-14 | Ultrahaptics Ip Ltd | Tracking in haptic systems |
JP7483610B2 (ja) | 2017-12-22 | 2024-05-15 | ウルトラハプティクス アイピー リミテッド | 触覚システムにおける不要な応答の最小化 |
AU2019242586A1 (en) | 2018-03-26 | 2020-10-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized rodents for testing therapeutic agents |
US10911861B2 (en) | 2018-05-02 | 2021-02-02 | Ultrahaptics Ip Ltd | Blocking plate structure for improved acoustic transmission efficiency |
SG11202011284RA (en) * | 2018-07-16 | 2020-12-30 | Regeneron Pharma | Non-human animal models of ditra disease and uses thereof |
US11098951B2 (en) | 2018-09-09 | 2021-08-24 | Ultrahaptics Ip Ltd | Ultrasonic-assisted liquid manipulation |
US11378997B2 (en) | 2018-10-12 | 2022-07-05 | Ultrahaptics Ip Ltd | Variable phase and frequency pulse-width modulation technique |
WO2020141330A2 (en) | 2019-01-04 | 2020-07-09 | Ultrahaptics Ip Ltd | Mid-air haptic textures |
CN114164177A (zh) * | 2019-01-17 | 2022-03-11 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化转基因动物 |
CA3133360A1 (en) | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus |
US11842517B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-12-12 | Ultrahaptics Ip Ltd | Using iterative 3D-model fitting for domain adaptation of a hand-pose-estimation neural network |
WO2020240876A1 (ja) * | 2019-05-27 | 2020-12-03 | 株式会社トランスジェニック | エクソンヒト化マウス |
CN113874510A (zh) | 2019-06-04 | 2021-12-31 | 瑞泽恩制药公司 | 包括具有β滑移突变的人源化TTR基因座的非人动物和使用方法 |
KR20220017939A (ko) | 2019-06-07 | 2022-02-14 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 알부민 좌위를 포함하는 비-인간 동물 |
CA3154040A1 (en) | 2019-10-13 | 2021-04-22 | Benjamin John Oliver LONG | Dynamic capping with virtual microphones |
US11374586B2 (en) | 2019-10-13 | 2022-06-28 | Ultraleap Limited | Reducing harmonic distortion by dithering |
WO2021090028A1 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | Ultraleap Limited | Tracking techniques in haptics systems |
CN111304246B (zh) * | 2019-12-17 | 2021-05-04 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 一种人源化细胞因子动物模型、制备方法及应用 |
US11715453B2 (en) | 2019-12-25 | 2023-08-01 | Ultraleap Limited | Acoustic transducer structures |
CN115175559A (zh) * | 2020-01-28 | 2022-10-11 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化pnpla3基因座的非人动物及其使用方法 |
CA3167557A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Davor Frleta | Non-human animals having a humanized cxcl13 gene |
US11816267B2 (en) | 2020-06-23 | 2023-11-14 | Ultraleap Limited | Features of airborne ultrasonic fields |
US11886639B2 (en) | 2020-09-17 | 2024-01-30 | Ultraleap Limited | Ultrahapticons |
WO2024073679A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2003123598A (ru) * | 2002-07-25 | 2005-02-10 | Тайбэй-Ветеранз Дженерал Хоспитал (Cn) | Трансгенные животные, экспрессирующие белок, действующий в комплексе с рецептором андрогена |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996012025A1 (en) * | 1994-10-14 | 1996-04-25 | Basf Aktiengesellschaft | TRANSGENIC NONHUMAN ANIMAL HAVING FUNCTIONALLY DISRUPTED INTERLEUKIN-1β CONVERTING ENZYME GENE |
CZ298325B6 (cs) | 1994-10-21 | 2007-08-29 | Kishimoto@Tadamitsu | Farmaceutický prípravek pro prevenci nebo lécení plasmocytosy |
CN1560081A (zh) * | 2004-02-17 | 2005-01-05 | 大连帝恩生物工程有限公司 | 用能产生人IgGl重链-κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用 |
EP2767161B1 (en) | 2004-10-19 | 2018-02-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method for generating an non-human animal homozygous for a genetic modification |
US7759541B2 (en) | 2004-12-13 | 2010-07-20 | Iti Life Sciences | Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity |
GB2434578A (en) | 2006-01-26 | 2007-08-01 | Univ Basel | Transgenic animals |
ES2398076T3 (es) | 2006-06-02 | 2013-03-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anticuerpos de alta afinidad contra el receptor de IL-6 humano |
SG174053A1 (en) * | 2006-09-01 | 2011-09-29 | Therapeutic Human Polyclonals Inc | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals |
FR2942218A1 (fr) | 2009-02-13 | 2010-08-20 | Eurocave Sa | Appareil de service au verre d'un liquide, notamment de vin |
JP5874881B2 (ja) * | 2009-10-06 | 2016-03-02 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 遺伝子改変されたマウスおよび移植方法 |
CA2784953C (en) * | 2009-12-21 | 2018-05-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized fc.gamma.r mice |
MX350385B (es) | 2011-02-15 | 2017-09-04 | Regeneron Pharma | Ratones de m-csf humanizada. |
AU2012317395B2 (en) | 2011-09-30 | 2017-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen |
HUE035652T2 (en) | 2011-10-28 | 2018-05-28 | Regeneron Pharma | Genetically Modified Major Histocompatibility Complex Mice |
RS63220B1 (sr) | 2011-10-28 | 2022-06-30 | Regeneron Pharma | Genetski modifikovani miševi sa ekspresijom himernih molekula klase ii glavnog kompleksa histokompatibilnosti (mhc) |
MY172726A (en) | 2011-10-28 | 2019-12-11 | Regeneron Pharma | Humanized il-6 and il-6 receptor |
-
2012
- 2012-10-29 MY MYPI2014000768A patent/MY172726A/en unknown
- 2012-10-29 SG SG11201400945UA patent/SG11201400945UA/en unknown
- 2012-10-29 EP EP14177863.9A patent/EP2818478B1/en active Active
- 2012-10-29 CN CN201280065013.6A patent/CN104039821A/zh active Pending
- 2012-10-29 SI SI201230111T patent/SI2663575T1/sl unknown
- 2012-10-29 PL PL14177863T patent/PL2818478T3/pl unknown
- 2012-10-29 MY MYPI2017703646A patent/MY186903A/en unknown
- 2012-10-29 BR BR112014008529A patent/BR112014008529A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-10-29 KR KR1020207005686A patent/KR102234632B1/ko active IP Right Grant
- 2012-10-29 DK DK12795905.4T patent/DK2663575T3/en active
- 2012-10-29 PT PT127959054T patent/PT2663575E/pt unknown
- 2012-10-29 RS RS20140677A patent/RS53683B1/en unknown
- 2012-10-29 EP EP12795905.4A patent/EP2663575B1/en active Active
- 2012-10-29 SG SG10202100485XA patent/SG10202100485XA/en unknown
- 2012-10-29 IN IN3920CHN2014 patent/IN2014CN03920A/en unknown
- 2012-10-29 JP JP2014539105A patent/JP6120451B2/ja active Active
- 2012-10-29 PT PT141778639T patent/PT2818478T/pt unknown
- 2012-10-29 LT LTEP14177863.9T patent/LT2818478T/lt unknown
- 2012-10-29 DK DK14177863.9T patent/DK2818478T3/en active
- 2012-10-29 US US13/662,880 patent/US8878001B2/en active Active
- 2012-10-29 MX MX2014004900A patent/MX358390B/es active IP Right Grant
- 2012-10-29 CA CA2853731A patent/CA2853731C/en active Active
- 2012-10-29 WO PCT/US2012/062379 patent/WO2013063556A1/en active Application Filing
- 2012-10-29 RU RU2014121324A patent/RU2634417C2/ru active
- 2012-10-29 RU RU2017129763A patent/RU2751240C2/ru active
- 2012-10-29 PL PL12795905T patent/PL2663575T3/pl unknown
- 2012-10-29 SI SI201230941A patent/SI2818478T1/sl unknown
- 2012-10-29 ES ES14177863.9T patent/ES2624605T3/es active Active
- 2012-10-29 CN CN201810620759.8A patent/CN108866101A/zh active Pending
- 2012-10-29 RS RS20170430A patent/RS55949B1/sr unknown
- 2012-10-29 SG SG10201600965YA patent/SG10201600965YA/en unknown
- 2012-10-29 HU HUE14177863A patent/HUE033400T2/en unknown
- 2012-10-29 KR KR1020147014316A patent/KR102084927B1/ko active Application Filing
- 2012-10-29 ES ES12795905.4T patent/ES2525368T3/es active Active
-
2014
- 2014-04-03 IL IL231896A patent/IL231896B/en active IP Right Grant
- 2014-04-03 HK HK14103209.5A patent/HK1190408A1/xx unknown
- 2014-04-10 ZA ZA2014/02635A patent/ZA201402635B/en unknown
- 2014-09-19 US US14/490,875 patent/US9125386B2/en active Active
- 2014-09-19 US US14/490,877 patent/US9078418B2/en active Active
- 2014-12-10 HR HRP20141192AT patent/HRP20141192T1/hr unknown
- 2014-12-11 CY CY20141101035T patent/CY1116614T1/el unknown
- 2014-12-15 SM SM201400187T patent/SMT201400187B/xx unknown
-
2015
- 2015-06-09 HK HK15105472.9A patent/HK1205135A1/xx unknown
- 2015-06-10 US US14/735,710 patent/US9392777B2/en active Active
- 2015-07-30 AU AU2015207889A patent/AU2015207889B2/en active Active
-
2016
- 2016-01-18 IL IL243666A patent/IL243666B/en active IP Right Grant
- 2016-01-18 IL IL243665A patent/IL243665B/en active IP Right Grant
- 2016-06-09 US US15/177,582 patent/US9622460B2/en active Active
- 2016-11-14 US US15/350,739 patent/US10004211B2/en active Active
- 2016-11-18 JP JP2016224713A patent/JP2017035115A/ja active Pending
-
2017
- 2017-04-28 HR HRP20170656TT patent/HRP20170656T1/hr unknown
- 2017-04-28 CY CY20171100474T patent/CY1118952T1/el unknown
-
2018
- 2018-06-06 US US16/001,074 patent/US10433528B2/en active Active
-
2019
- 2019-01-28 IL IL264508A patent/IL264508B/en active IP Right Grant
- 2019-07-03 US US16/502,197 patent/US11102962B2/en active Active
-
2021
- 2021-07-26 US US17/385,039 patent/US20220053742A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2003123598A (ru) * | 2002-07-25 | 2005-02-10 | Тайбэй-Ветеранз Дженерал Хоспитал (Cn) | Трансгенные животные, экспрессирующие белок, действующий в комплексе с рецептором андрогена |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
GOYA S. et al., Sustained interleukin-6 signalling leads to the development of lymphoid organ-like structures in the lung, J Pathol., 2003, Vol.200, N.1, pp.82-87. * |
GOYA S. et al., Sustained interleukin-6 signalling leads to the development of lymphoid organ-like structures in the lung, J Pathol., 2003, Vol.200, N.1, pp.82-87. HIROTA H. et al., Continuous activation of gp130, a signal-transducing receptor component for interleukin 6-related cytokines, causes myocardial hypertrophy in mice, Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 23, Vol.92, N.11, pp.4862-4866. NAKA T. et al., The paradigm of IL-6: from basic science to medicine, Arthritis Res., 2002, 4, Suppl 3, p.S233-242. * |
HIROTA H. et al., Continuous activation of gp130, a signal-transducing receptor component for interleukin 6-related cytokines, causes myocardial hypertrophy in mice, Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 23, Vol.92, N.11, pp.4862-4866. * |
NAKA T. et al., The paradigm of IL-6: from basic science to medicine, Arthritis Res., 2002, 4, Suppl 3, p.S233-242. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2751240C2 (ru) | Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 | |
AU2012327206B2 (en) | Humanized IL-6 and IL-6 receptor | |
NZ623145B2 (en) | Humanized il-6 and il-6 receptor | |
NZ709432B2 (en) | Humanized il-6 and il-6 receptor |