KR102234632B1 - 사람화된 ｉｌ-6 및 ｉｌ-6 수용체 - Google Patents

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안토니 티. 도레 제이알.
션 스티븐스
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

내인성 마우스 IL-6 및/또는 IL-6 수용체 유전자들이 대체된 마우스들, 및 당해 마우스들을 제조 및 사용하는 방법들이 기술되어 있다. 내인성 IL-6Rα 유전자좌에서, 마우스 엑토도메인을 암호화하는 서열의 사람 엑토도메인을 암호화하는 서열로의 대체를 포함하는 마우스가 제공된다. 내인성 마우스 IL-6 유전자좌에서, 마우스 IL-6을 암호화하는 서열이 사람 IL-6을 암호화하는 서열로 대체된 마우스들을 포함하는, 마우스 IL-6 조절 성분들의 제어 하의 사람 IL-6 유전자를 포함하는 마우스들이 또한 제공된다.

Description

사람화된 ＩＬ-6 및 ＩＬ-6 수용체{HUMANIZED IL-6 AND IL-6 RECEPTOR}
내인성 비-사람 동물 IL-6 및/또는 IL-6 수용체 유전자들이 대체된 비-사람 동물들이 제공된다. 비-사람 동물의 IL-6 및/또는 IL-6 수용체 유전자들은, 내인성 비-사람 유전자좌(loci)에서, 사람 서열을 포함하는 사람 IL-6 및/또는 사람화된 IL-6 수용체 유전자들로 대체된다. 사람 IL-6 및/또는 사람화된 IL-6 수용체 유전자들을 갖는 비-사람 동물들은 사람 IL-6에 대해 유전자전이된(transgenic) 비-사람 동물들의 특징인 하나 이상의 병리학들을 나타내지 않는다.
사람 IL-6 유전자에 대해 유전자전이된 마우스들은 당해 분야에 공지되어 있다. 그러나, 사람 IL-6 전이유전자의 마우스 게놈 내에의 무작위적 삽입은, 이러한 유전자전이 마우스들에서, 형질세포증가증 및 사구체신염을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 병리학들에 있어서 자체로 발현되는, 사람 IL-6 단백질의 불량하게 조절된 발현을 초래한다. 그 결과, 이들 마우스들은 제한된 유용성을 갖는다.
비-사람 동물들, 예를 들면, 마우스들 및 래트들, 발현된 사람 또는 사람화된 IL-6 및/또는 사람 또는 사람화된 IL-6 수용체가 요구되고 있다. 유전자전이된 hIL-6 마우스들에 의해 나타난 하나 이상의 병리학들을 나타내지 않는 이러한 사람화된 마우스들이 요구되고 있다.
요약
한 양상에서, 내인성 IL-6 및/또는 IL-6 수용체 유전자좌에서, 내인성 IL-6 및/또는 IL-6 수용체를 암호화하는 유전자의 사람 또는 사람화된 IL-6 및/또는 IL-6 수용체를 암호화하는 유전자로의 대체를 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물들이 제공된다. 내인성 뮤린 IL-6 유전자좌에서, 사람 IL-6 유전자에 의한 내인성 IL-6 유전자의 대체를 포함하고/하거나; 사람 IL-6 수용체 유전자[또는 이의 엑토도메인(ectodomain)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열]에 의한 내인성 IL-6 수용체 유전자(또는 이의 엑토도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)의 대체를 포함하는 뮤린 동물들이 제공된다.
한 양상에서, 내인성 뮤린 IL-6 유전자좌로부터의, 내인성 뮤린 프로모터 및/또는 내인성 뮤린 조절 성분들의 제어 하에 사람 IL-6 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 뮤린 동물들이 제공된다.
한 양상에서, 내인성 뮤린 IL-6 수용체 유전자좌로부터의, 내인성 뮤린 프로모터 및/또는 내인성 뮤린 조절 성분들의 제어 하에 사람 IL-6 수용체 유전자[또는 사람 엑토도메인 및 마우스 막관통(transmembrane) 및 세포내 도메인들을 암호화하는 유전자]를 발현하는 유전적으로 변형된 뮤린 동물들이 제공된다.
한 양상에서, 사람 IL-6 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 동물(예를 들면, 뮤린 동물, 예를 들면, 마우스 또는 래트)이 제공되며, 여기서, 비-사람 동물은 형질세포증가증, 사구체신염, 사구체경화증, 사구체간질-증식성 사구체신염, 장 림프종, 신장 림프종, 비장종대, 림프절 비대, 간 비대(liver enlargement), 골수 내의 거핵세포, 압축된(compacted) 비정상 혈장 세포, 혈장 세포들의 폐 또는 간 또는 신장 내에의 침윤, 신장 내의 혈관 간막 세포 증식, IL-6의 뇌 과발현, 백질 내의 분기된 미세아교세포, 뇌 내의 반응성 성상세포증, 신부전, 비장 내의 증가된 거핵세포, 근육 소모[예를 들면, 비복근 소모(gastrocnemius muscle wasting)], 증가된 근육 카텝신 B 및 B+L(예를 들면, 대략 20배 및 6배), 및 이들의 조합으로부터 선택된 병리학을 나타내지 않는다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 정상의 B 세포 집단을 포함한다. 한 실시형태에서, 정상의 B 세포 집단은 수 및 면역표현형에 있어서 야생형 동물, 예를 들면, 야생형 마우스와 거의 동일하다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 뮤린(예를 들면, 마우스 또는 래트)이며 사람 IL-6(hIL-6)을 혈청 중에서 약 800pg/mL 이하, 약 700, 600, 500, 400, 300, 또는 200pg/mL 이하의 수준으로 발현한다. 구체적인 실시형태에서, 뮤린 동물은 hIL-6을 혈청 중에서 약 50 내지 약 200pg/mL 이하의 수준으로, 다른 실시형태에서는 약 75 내지 125pg/mL로, 다른 실시형태에서는 약 100pg/mL로 발현한다.
한 양상에서, hIL-6 및/또는 hIL-6R을 발현하는 비-사람 동물이 제공되며, 여기서, 당해 비-사람 동물은 내인성 비-사람 IL-6 유전자좌 및/또는 내인성 비-사람 hIL-6R 유전자좌로부터 hIL-6 및/또는 hIL-6R을 발현한다. 구체적인 실시형태에서, 비-사람 동물은 뮤린(예를 들면, 마우스 래트)이다.
한 양상에서, 내인성 마우스 IL-6 유전자좌로부터 hIL-6을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 여기서, 내인성 마우스 IL-6 유전자는 hIL-6 유전자로 대체되어 있다.
한 실시형태에서, 마우스는 세포의 표면 상에 사람 엑토도메인을 포함하는 IL-6 수용체(IL-6R)를 발현하는 세포를 포함한다. 한 실시형태에서, 세포는 림프구이다. 한 실시형태에서, 림프구는 B 세포이다.
한 실시형태에서, 내인성 마우스 IL-6 유전자좌에서, 엑손 1 내지 5 및 3' 비번역 서열을 포함하는 약 6.8kb가 결실되어 있고, 사람 IL-6 유전자의 엑손 1 내지 5를 포함하는 약 4.8kb의 사람 IL-6 유전자 서열로 대체되어 있다. 구체적인 실시형태에서, 사람 IL-6 유전자는 사람 BAC CTD-2369M23의 사람 IL-6 유전자의 엑손 1 내지 5를 포함한다.
한 양상에서, 사람 IL-6 유전자로부터 IL-6을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 여기서, 마우스는 사람 IL-6을 마우스의 혈청 중에서 발현한다.
한 실시형태에서, 마우스 혈청은 약 25 내지 약 300pg/mL, 50 내지 약 250pg/mL, 75 내지 약 200pg/mL, 또는 100 내지 약 150pg/mL의 사람 IL-6의 혈청 농도를 나타낸다. 구체적인 실시형태에서, 마우스의 혈청 중의 사람 IL-6의 수준은 약 100pg/mL이다.
한 실시형태에서, 마우스의 골수에서 팬(pan) B 세포-특이적 마커의 수준은 야생형 마우스의 수준과 거의 동일하다. 한 실시형태에서, 비장 중의 팬 B 세포-특이적인 마커의 수준은 야생형 마우스의 수준과 거의 동일하다. 한 실시형태에서, 팬 B 세포-특이적 마커는 B220, CD19, CD20, CD22, CD79a, CD79b, L26, 및 Pax-5(BSAP)로부터 선택된다.
한 양상에서, hIL6을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 여기서, 당해 마우스는 형질세포증가증, 비장종대, 림프절 비대, 압축된 비정상 혈장 세포, 및 이들의 조합으로부터 선택된 특징을 나타내지 않는다.
한 실시형태에서, 마우스는 야생형 마우스와 거의 중량(체중 당)이 동일한 비장을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스의 림프절들은 야생형 마우스와 중량(체중 당)이 거의 동일하다. 한 실시형태에서, 마우스의 혈장 세포들은 사람 IL-6을 과발현하는 마우스들의 형질세포증가증 특성을 나타내지 않는다.
한 실시형태에서, 마우스는 사구체신염을 나타내지 않는다.
한 실시형태에서, 마우스는 야생형 마우스와 비교가능한 혈관 간막 세포 수준을 나타낸다.
한 양상에서, 내인성 마우스 IL-6 유전자좌로부터 hIL6을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 여기서, 내인성 마우스 IL-6 유전자는 hIL-6 유전자로 대체되어 있고, 여기서, 마우스는 형태학적으로 검출가능한 신경병리, 반응성 성상세포증, 및 이들의 조합으로부터 선택된 특징을 나타내지 않는다. 한 실시형태에서, 마우스는 야생형 마우스 뇌와는 형태학적으로 구별되는 뇌를 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 야생형 마우스의 반응성 성상세포증의 수준보다 더 높지 않은 수준의 반응성 성상세포증을 나타내는 뇌 조직을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스는 뉴런들에서 사람 IL-6을 발현하지 않는다. 한 실시형태에서, 마우스는, 야생형 마우스에서 활성화된 성상세포증 수준들과 비교가능한 활성화된 별아교세포 수준들을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스는 마우스의 백질 중에서 분기된 미세아교 세포들을 포함하며, 여기서, 상기 분기된 미세아교 세포들은 야생형 마우스내에서 분기된 미세아교 세포들의 양과 동등한 양으로 존재한다.
한 실시형태에서, 마우스는 반응성 성상세포증을 나타내지 않는다. 한 실시형태에서, 마우스의 백질은 야생형 마우스의 백질과는 형태학적으로 구별되지 않는다. 한 실시형태에서, 마우스의 백질은 반응성 별아교세포들의 조직화학적 염색과 관련하여 야생형 마우스 백질과 조직학적으로 구별되지 않는다.
한 실시형태에서, 마우스는, 야생형 마우스 뇌와는 형태학적으로 구별되지 않는 뇌를 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는, 야생형 마우스의 반응성 성상세포증의 수준보다 더 높지 않은 수준의 반응성 성상세포증을 나타내는 뇌 조직을 포함한다.
한 양상에서, 내인성 마우스 IL-6 유전자좌로부터 hIL6을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 여기서, 내인성 마우스 IL-6 유전자는 hIL-6 유전자로 대체되어 있고, 여기서, 마우스는 약 50% 이상까지 단축된 수명, 신부전, 고감마글로불린혈증, 비장 내의 증가된 거핵세포, 골수 내의 증가된 거핵세포, 비장의 형질세포증가증, 흉선의 형질세포증가증, 림프절들의 형질세포증가증, 사구체신염, 사구체경화증, 및 이들의 조합 중에서 선택된 특징을 나타내지 않는다.
한 실시형태에서, 마우스들은 20주를 초과하는 수명을 갖는다. 한 실시형태에서, 마우스들은 30주, 40주, 또는 50주를 초과하는 수명을 갖는다. 한 실시형태에서, 마우스들은 동일한 스트레인의 야생형 마우스의 수명과 거의 동일한 수명을 나타낸다.
한 실시형태에서, 마우스들은 야생형 마우스의 대략 비장 거핵세포 수준 이하인 비장 내의 거핵세포의 수준을 나타낸다.
한 실시형태에서, 마우스들은 비정상적이고 빈틈없이 배열된 형질세포양 세포들이 필수적으로 없는 림프구 기관들을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스들은 야생형 마우스들에서 감마 글로불린 혈청 수준들과 동등한 감마 글로불린 혈청 수준들을 나타낸다. 한 실시형태에서, 마우스들의 혈청 중 α1- 및 β-글로불린의 수준들은 동일한 스트레인의 야생형 마우스들의 α1- 및 β-글로불린의 수준들과 동등하다.
한 양상에서, 사람 IL-6을 내인성 마우스 IL-6 유전자좌로부터 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 여기서, 내인성 마우스 IL-6 유전자는 hIL-6 유전자로 대체되고, 여기서, 마우스는 동일한 스트레인의 야생형 마우스와 비교하여 근육 소모, 증가된 카텝신 B 수준, 동일한 스트레인의 야생형 마우스와 비교하여 증가된 카텝신 A+B 수준, 동일한 스트레인의 야생형 마우스와 비교하여 증가된 간 중량, 및 이들의 조합으로부터 선택된 특징을 나타내지 않는다.
한 실시형태에서, 마우스의 간의 중량은 12주째에 약 800 내지 900mg이다.
한 실시형태에서, 마우스는 이의 전체 수명을 통해 야생형 마우스에서 관찰된 대략적인 수준 이하인 카텝신 B 수준을 나타낸다. 한 실시형태에서, 마우스는 이의 수명을 통해서 야생형 마우스에서 관찰된 대략적인 수준 이하인 카텝신 A+B 수준을 나타낸다.
한 실시형태에서, 성체로서 마우스는 동일한 스트레인의 야생형 마우스의 체중의 약 10% 이내인 비복근 근육 중량을 나타낸다. 한 실시형태에서, 성체로서의 마우스는 야생형 마우스의 비복근 근육 중량과 거의 동일한 비복근 근육 중량을 나타낸다.
한 양상에서, 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공되며, 여기서, 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 전체 또는 부분적으로 내인성 마우스 IL-6 단백질을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 대체한다.
한 양상에서, 마우스 IL-6Rα 엑토도메인의 내인성 마우스 IL-6 수용체 유전자좌에서, 사람 IL-6Rα의 엑토도메인 서열이 교체되어 키메라 사람/마우스 IL-6Rα 유전자를 형성하는 마우스가 제공된다.
한 실시형태에서, 키메라 IL-6Rα 유전자는 내인성 마우스 IL-6Rα 유전자좌에서 마우스 프로모터 및/또는 마우스 조절 성분들의 제어 하에 있다.
한 실시형태에서, 약 35.4kb의 마우스 IL-6Rα 엑토도메인을 암호화하는 서열은 약 45.5kb의 사람 IL-6R 엑토도메인을 암호화하는 서열로 대체된다.
한 실시형태에서, 사람 IL-6R 엑토도메인을 암호화하는 서열은 엑손 1 내지 엑손 8내에 첫번째 (ATG) 코돈을 포함한다.
한 실시형태에서, 대체된 마우스 IL-6Rα 서열은 엑손 1 내지 엑손 8을 포함하는 인접한 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 엑손 1 내지 엑손 8 및 인트론 8의 일부가 결실되어 있다.
한 양상에서, 내인성 마우스 IL-6 유전자좌에서, IL-6을 암호화하는 마우스 유전자가 사람 IL-6을 암호화하는 사람 유전자로 대체되는 것을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 여기서, 사람 IL-6을 암호화하는 사람 유전자는 내인성 마우스 IL-6 유전자좌에서 내인성 마우스 조절 성분들의 제어 하에 있다.
한 실시형태에서, 사람 IL-6을 암호화하는 사람 유전자는 BAC ID CTD-2369M23의 사람 IL-6 유전자이다.
한 실시형태에서, 마우스는 마우스 IL-6Rα를 발현한다. 한 실시형태에서, 마우스는 사람 IL-6Rα를 발현한다. 한 실시형태에서, 사람화된 IL-6Rα는 사람 엑토도메인을 발현한다. 한 실시형태에서, 사람화된 IL-6Rα은 마우스 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 마우스 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 엑토도메인의 사람화를 포함하지만 막관통 및/또는 세포질성 도메인을 포함하지 않는 사람화된 IL-6Rα를 발현한다.
한 실시형태에서, 마우스는 형질세포증가증, 사구체경화증, 사구체신염, 신부전, 고감마글로불린혈증, 비장 내의 증가된 거핵세포, 골수 내의 증가된 거핵세포, 비장 비대, 림프절 비대, 압축된 비정상 혈장 세포, 및 이들의 조합으로부터 선택된 특징을 나타내지 않는다.
한 양상에서,내인성 마우스 IL-6Rα 유전자의 사람화를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 여기서, 사람화는, 내인성 마우스 IL-6Rα 유전자좌에서, 마우스 IL-6Rα 엑토도메인을 암호화하는 서열의 사람 IL-6Rα 엑토도메인을 암호화하는 서열로의 대체를 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스 엑손 1 내지 엑손 8을 포함하는 인접한 마우스 서열은 사람 IL-6Rα 엑토도메인을 암호화하는 사람 IL-6Rα 서열의 인접한 게놈성 단편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 엑토도메인을 암호화하는 사람 IL-6Rα 서열의 인접한 게놈성 단편은 BAC CTD-2192J23으로부터 기원한다.
한 실시형태에서, 마우스는 사람화된 IL-6 유전자를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 내인성 마우스 IL-6 유전자좌에서, 마우스 IL-6 유전자의 사람 IL-6 유전자로의 대체를 포함한다. 한 실시형태에서, 사람화된 IL-6 유전자는 내인성 마우스 조절 성분들의 제어 하에 있다.
한 양상에서, 마우스 IL-6을 암호화하는 마우스 유전자 서열을 사람 IL-6을 암호화하는 사람 유전자로 대체함을 포함함으로써, 사람화된 마우스를 제조하는 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 대체는 내인성 마우스 IL-6 유전자좌에서 일어나며, 사람 IL-6을 암호화하는 사람 유전자는 내인성 마우스 조절 서열들에 작동적으로 연결된다.
한 양상에서, 마우스 IL-6Rα의 엑토도메인 서열들을 암호화하는 마우스 엑손들을 사람 IL-6Rα의 엑토도메인 서열들을 암호화하는 사람 게놈성 단편으로 대체함으로써, 사람화된 IL-6Rα 유전자를 형성시킴을 포함하는, 사람화된 마우스를 제조하는 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 대체는 내인성 마우스 IL-6Rα 유전자좌에서 일어나며, 사람화된 IL-6Rα 유전자는 내인성 마우스 조절 서열들에 작동적으로 연결된다.
한 양상에서, 마우스 엑토도메인을 암호화하는 서열의 사람 엑토도메인 서열로의 대체를 포함하는 사람화된 IL-6Rα 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 여기서, 사람화된 IL-6Rα 유전자는 마우스 막관통 서열 및 마우스 세포질 서열을 포함하고; 여기서, 마우스는 사람 IL-6을 암호화하는 유전자를 추가로 포함하며, 여기서, 사람 IL-6을 암호화하는 유전자는 내인성 마우스 IL-6 조절 성분들의 제어 하에 있다.
한 실시형태에서, 마우스는 완전한 마우스 IL-6Rα를 발현할 수 없으며 마우스 IL-6을 발현할 수 없다.
각종 양상들에서, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 마우스들은 이들의 생식선내에 유전적 변형들을 포함한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스로부터의 조직, 세포, 또는 막 단편이 제공된다.
한 실시형태에서, 조직 또는 세포는 사람 IL-6 단백질을 발현하나, 마우스 IL-6 단백질은 발현하지 않는 마우스로부터 기원한다. 한 실시형태에서, 조직 또는 세포는 사람화된 IL-6Rα 단백질을 발현하지만, 마우스 IL-6Rα 단백질을 발현하지 않는 마우스로부터 기원한다. 한 실시형태에서, 사람화된 IL-6Rα 단백질은 사람 엑토도메인 및 마우스 막관통 도메인 및 마우스 세포질성 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 조직 또는 세포는 사람 IL-6, 사람화된 IL-6Rα를 발현하지만, 마우스 IL-6을 발현하지 않고 마우스 엑토도메인을 포함하는 IL-6Rα는 발현하지 않는 마우스로부터 기원한다.
한 양상에서, 사람화된 IL-6Rα(사람 엑토도메인 및 마우스 막관통 및 마우스 세포질 도메인) 및 사람 IL-6을 지닌 마우스 세포의 생체외 복합체가 제공된다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 마우스 배아가 제공된다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 공여체 세포를 포함하는 마우스 숙주 배아가 제공된다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 다능성 또는 전분화(totipotent) 비-사람 동물 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 세포는 뮤린 세포이다. 한 실시형태에서, 세포는 ES 세포이다.
한 양상에서, 마우스 난(mouse egg)이 제공되며, 여기서, 마우스 난은 자궁외 마우스 염색체를 포함하고, 여기서, 자궁외 마우스 염색체는 본원에 기술된 바와 같은 유전적 변형을 포함한다.
한 양상에서, 유전적으로 변형되어 사람 IL-6 유전자 또는 사람 또는 사람화된 IL-6Rα 유전자를 포함하는 마우스, 배아, 난, 또는 세포는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola 중에서 선택된 C57BL 스트레인의 것인 마우스의 것이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들면, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 스트레인으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 129 스트레인이다[참조: 예를 들면, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for Strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, 또한, 참조: Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines]. 구체적인 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 전술한 129 스트레인과 전술한 C57BL/6 스트레인의 혼합물이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 마우스는 전술한 129 스트레인들의 혼합물, 또는 전술한 BL/6 스트레인들의 혼합물이다. 구체적인 실시형태에서, 혼합물의 129 스트레인은 129S6(129/SvEvTac) 스트레인이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 스트레인, 예를 들면, BALB/c 스트레인이다. 여전히 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 스트레인과 다른 전술한 스트레인의 혼합물이다. 한 실시형태에서, 마우스는 스위스(Swiss) 또는 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스이다.
본원에 기술된 양상들 및 실시형태들 각각은 실시형태 또는 양상의 내용으로부터 명쾌하게 또는 명확하게 배제시키지 않는 한, 함께 사용될 수 있다.
도 1은 사람(상단) 및 마우스(하단) IL-6 게놈 유전자좌들의 크지 않은, 도해를 제공한다. 엑손 I, 엑손 II, 엑손 III, 엑손 IV, 및 엑손 V(사람 및 마우스 둘 다)는 밀폐된 상자들로 도면 우측에 대해 나타낸다. 선택된 추정된 조절 영역들은 개방된 상자들로 도면의 좌측에 나타낸다.
도 2는 야생형 마우스들, 사람화된 엑토도메인 IL-6R 마우스들, 및 사람화된 IL-6 및 IL-6R 유전자들을 지닌 마우스들에서 테레빈유(turpentine)의 존재 또는 부재하에서 급성 상 반응(mSAA 수준)을 나타낸다.
도 3은 항-마우스 IL-6R 항체(좌측)의 부재 또는 존재하에서 야생형 마우스들에서 테레빈유-의존성 급성 상 반응(SAA); 및 항-사람 IL-6R 항체(우측)의 부재 또는 존재하에서 사람화된 IL-6/IL-6R 마우스들에서 테레빈유-의존성 급성 상 반응을 나타낸다.
도 4는 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 비장 B 세포들; 팬(pan) B 세포 마커에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 5는 야생형 사람화된 IL-6 마우스들의 비장 T 세포들; T 헬퍼 세포들 및 세포독성 T 세포들에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 6은 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 비장 세포들; Ly6G/C(Gr1)에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 7은 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 비장 세포들; NK 세포들 및 과립구들(Ly6Ghi+/CD11bhi+)에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 8은 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 혈액 B 세포들; 팬 B 세포 마커에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 9는 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 혈액 T 세포들; T 헬퍼 세포들 및 세포독성 T 세포들에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 10은 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 혈액 골수 세포들; Gr1+ 세포들에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 11은 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 혈액 골수 세포들; CD11b 대 Ly6G/C(Gr1)에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 12는 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 혈액 골수 세포들; DX5 대 CD11b 세포들에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 13은 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들의 골수 IgM/CD24/B220에 대한 FACS 분석을 나타낸다. 상단: 골수에 있어서 정상적인 진행(progression). 하단: 야생형, hIL-6 이형접합체들, 및 hIL-6 동형접합체들에 대한 FACS 분석(IgM 염색).
도 14는 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들에 대한 골수 IgM/CD24/B220의 FACS 분석을 나타낸다. 상단: 골수에 있어서 정상적인 진행. 하단: 야생형, hIL-6 이형접합체들, 및 hIL-6 동형접합체들에 대한 FACS 분석 (CD24 염색).
도 15는 야생형 및 사람화된 IL-6 마우스들에 대한 골수 CD43 및 B220의 FACS 분석을 나타낸다. 상단: 골수에 있어서 정상적인 진행. 하단: 야생형, hIL-6 이형접합체들, 및 hIL-6 동형접합체들에 대한 FACS 분석(CD43 염색).
IL-6 및 IL-6R
IL-6 수용체(IL-6R)은 B 세포들을 유도하여 면역글로불린을 합성하는데 관여하는 B 세포 자극 인자(BSF-2, 또는 B 세포 자극 인자 2; 또한, BCDF, 또는 B 세포 분화 인자)에 대한 수용체로서 오랫 동안 특성화되었다[참조: Yamasaki et al. (1988) Cloning and Expression of the Human Interleukin-6(BSF-2/IFNβ 2) Receptor, Science 241:825-828]. IL-6은 사람 섬유모세포들을 dsRNA 폴리(I)폴리(C)로 처리하여 항-바이러스 반응을 유도시킴으로써, 인터페론-β로 명명된 바이러스-유도된 단백질에 대한 조사 동안 이의 발견의 결과로서 인터페론-β2로 최초로 기술되었다[참조: Weissenbach et al. (1980) Two interferon mRNAs in human fibroblasts: In vitro translation and Escherichia coli cloning studies, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77(12):7152-7156; Keller et al. (1996) Molecular and Cellular Biology of Interleukin-6 and Its Receptor, Frontiers in Bioscience 1:d340-357].
사람 cDNA는 19-머(mer) 시그날 서열, 및 타이로신 키나제 도메인을 결여하고 있는 약 82개 아미노산들의 세포질성 도메인을 갖는 468 아미노산 단백질을 암호화한다(상기 참조). 단백질의 N-말단(엑토도메인)은 약 90개 아미노산들의 Ig 상과(superfamily) 도메인, Ig 상과 도메인과 막 사이의 250-아미노산 도메인, 약 28개 아미노산들의 막관통 폭(span)을 갖는다(상기 참조). 수용체의 엑토도메인은 이의 리간드 IL-6에 결합하며, 이는 막안에서 gp130과의 연합을 개시(trigger)하며 이는 시그날 형질도입을 수행하는 복합체이고; 세포질성 도메인은 시그날을 형질유도(transduce)하지 않는 것으로 일컬어진다[참조: Taga et al. (1989) Interleukin-6 Triggers the Association of Its Receptor with a Possible Signal Transducer, gp130, Cell 58:573-581]. 실제로, 세포질 도메인을 결여하고 있는 IL-6R의 가용성 형태는 세포의 표면상에서 IL-6과 연합하고 gp130과 결합할 수 있으며 시그날을 효과적으로 형질유도한다(Id.).
단백질 수준에서 hIL-6R 및 mIL-6R의 상동성은 단지 약 54%이고; 막관통 도메인은 약 79%의 상동성을 가지는 반면, 세포질 도메인은 약 54%의 상동성을 갖는다[참조: Sugito et al. (1990)].
IL-6R에 대한 천연 리간드, IL-6은 HTLV-1-형질전환된 T 세포들의 배향물들로부터 최초로 분리되었다[참조: Hirano et al. (1985) Purification to homogeneity and characterization of human B cell differentiation factor (BCDF or BSFp-2), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5490-5494]. IL-6 유전자에 대한 사람 cDNA는, 비록 재조합체 사람 IL-6이 검출가능한 IFN 활성을 나타내지 않음이 입증되어 왔다고 해도, 적어도 2회, BSF-2로서 1회[참조: Hirano et al. (1086) Complementary DNA fro a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin, Nature 324:73-76] 및 IFNβ 2로서 1회[참조: Zilberstein et al. (1986) Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines, EMBO 5:2529-2537] 클로닝되었다.
사람 IL-6은, 사람 및 마우스유전자들의 게놈성 조직화가 근본적으로 동일하고, 사람 및 마우스 유전자들의 프로모터 영역들이 고도로 보존된 400-bp 신장(stretch)을 공유한다고 해도, 마우스 IL-6과 단지 약 42%의 상동성을 나타내는 184-아미노산 단백질이다.[참조: Tanabe et al. (1988) Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene: High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol. 141(11):3875-3881].
사람 IL-6 유전자는 약 5kb[참조: Yasukawa et al. (1987) Structure and expression of human B cell stimulatory factor-2 (BSC-2/IL-6) gene, EMBO J. 6(10):2939-2945]인 반면, 마우스 IL-6 유전자는 약 7kb이다[참조: Tanabe et al. (1988) Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene: High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol. 141(11):3875-3881]. 마우스 및 사람 IL-6 유전자들은 조절에 중요한 고도로 보존된 5'-플랭킹 서열(flanking sequence)을 공유하는 것으로 일컬어진다. 사람 및 마우스 IL-6 게놈성 유전자좌들의 개략적인 도해는 도 1에 나타낸다(크기로 나타내지 않음). 엑손 I, 엑손 II, 엑손 III, 엑손 IV, 및 엑손 V(사람 및 마우스 둘 다에서)는 도의 우측에 밀폐된 상자들로 나타낸다. 선택된 추정의 조절 영역들은 도의 좌측에 개방된 상자들로 나타낸다. 사람들에 대한 추정의 조절 영역들은 좌측으로부터 우측으로 -557 내지 -552로의 글루코코르티코이드 성분; -472 내지 -468로의 IFN 인핸서(enhancer) 코어 서열; -466 내지 -461로의 글루코코르티코이드 성분; -395 내지 -334로의 AT가 풍부한 영역, -383 내지 -277로의 콘센수스(consensus) AP-1 결합 부위; -253 내지 -248로의 IFN 인핸서 코어 서열; -205 내지 -192로의 GGAAA를 함유하는 모티프(motif); IFN 인해서 코어 서열, cAMP-반응 성분, GGAAA 모티프, CCAAT 박스, 및 GC가 풍부한 영역을 함유하는 -169 내지 -82로의 c-fos SRE 상동성 서열; 및 -61 내지 -55로의 AP-1 결합 부위; 및 -34 내지 -30으로의 CCAAT 박스이다. 마우스에 대한 추정된 조절 영역들은 좌측으로부터 우측으로 -553 내지 -536으로의 GC가 풍부한 영역, -521 내지 -516으로의 및 -500 내지 -495로의 글루코코르티코이드 성분; -447 내지 -396으로의 Z-DNA 신장; -277 내지 -288로의 IFN 인핸서 코어 서열과 오우버랩된 AP-1 결합 부위, -210 내지 -195로의 IFN 인핸서 코어 서열과 오우버랩된 GGAAA 모티프; cAMP 반응 성분을 함유하는 -171 내지 -82로의 c-fos SRE 상동성 영역, IFN 인핸서 코어 서열과 오우버랩된 GGAAA 모티프, 및 GC가 풍부한 영역; 및 -61 내지 -55로의 AP-1 결합 부위이다. 마우스 코돈들 I 내지 V는, 길이가 각각 19, 185, 114, 150, 및 165이다. 마우스 인트론 길이들은 I-II, 162 bp; II-III, 1253 bp; III-IV, 2981 bp; IV-V, 1281 bp이다. 사람 코돈들 I 내지 V는, 길이가 19, 191, 114, 147, 및 165이다. 사람 인트론 길이들은 I-II, 154; II-III, 1047; III-IV, 706; IV-V, 1737이다. 게놈성 구조화 데이터는 문헌[참조: Tanabe et al. (1988), and Yasukawa et al. (1987) Structure and expression of human B cell stimulatory factor-2 (BSF-2/IL-6) gene, EMBO J. 9(10):2939-2945]로부터 기원한다.
마우스 및 사람 IL-6 유전자들이 이들의 5'-플랭킹 서열의 유사성을 기준으로 유사하게 조절되는 것으로 여겨짐을 충분히 추정할 수 있다. 다양한 세포 유형들은 IL-1, TNF, PDGF, IFNβ, 혈청, 폴리(I)폴리(C), 및 사이클로헥시미드에 대한 반응시 향상된 IL-6 발현을 나타낸다[참조: Tanabe et al. (1988)]. 사람들에서 IL-6은 급성상 반응, 조혈, B 세포 분화, T 세포 활성화, 각종 세포 유형들(예를 들면, 간세포들, 섬유모세포들, 내피 세포들, 뉴런들, 뇌하수체 세포들, 림프종들, 흑색종들, 유방 암종들, NK 세포들, 대식세포들, 파골세포들 등)들의 성장 및/또는 분화 및/또는 활성화를 매개한다(참조: 예를 들면, Heinrich et al. (1990), Kishimoto et al. (1989), and Keller et al. (1996); Sugita et al. (1990) Functional Murine Interleukin Receptor with Intracisternal A Particle Gene Product at its Cytoplasmic Domain, J. Exp. Med. 171:2001-2009].
그러나, 실제로, 사람 IL-6에 대해 유전자삽입성인 마우스들은 실질적으로 약화된 병리학들의 집합을 나타내며, 이는 IL-6 유전자의 유의적인 다면 발현을 반영한다. 사람 IL-6 유전자 및 μ 인핸서(Eμ)를 함유하는 6.6-kb 단편을 포함하는 유전자삽입 마우스들은 고 농도들의 hIL-6 및 극도로 높은 IgG1 수준들(야생형 마우스들보다 120- 내지 400-배)을 생산하며, 이는 형질세포증가증, 사구체간질-증식성 사구체신염, 및 고 골수 거핵세포 수준들이 동반된 IL-6 조절저하(deregulation)를 반영한다[참조: Suematsu et al. (1989) IgG1 plasmacytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:7547-7551]. IL-6 및/또는 IL-6R의 비정상적인 조절은 흑색종들, 플라즈마세포종, 류마티스 관절염, 캐슬맨병(Castleman's disease), 혈관 간막 증식 사구체신염, 심장 점액종, 원형질 세포 종양형성(plams cell neoplasias), 건선, 및 다른 질환들과 관련되어 있다[참조: Kishimoto, T. (1989) The Biology of Interleukin-6, Blood 74(1):1-10; Sugita et al. (1990); 또한, Hirano et al. (1990) Biological and clinical aspects of interleukin 6, Immunology Today 11(12):443-449)]. IL-6은 또한 췌장 및/또는 자가분비 메카니즘에 의해 전립샘 암 환자들의 안드로겐 결핍 치료 동안 전립선내 안드로겐들의 수준들을 유지하는데 관여하여, 잠재적으로 거세-내성 전립샘 종양 성장(castration-resistant prostate tumor growth)을 제공한다[참조: Chun et al. (2009) Interleukin-6 Regulates Androgen Synthesis in Prostate Cancer Cells, Clin. Cancer Res. 15:4815-4822].
사람 단백질은 212 아미노산 단백질로서, 28 아미노산 시그날 서열의 절단 후에는 성숙한 형태의 184 아미노산 단백질로서 암호화된다. 이는 2개의 N-글리코실화 및 2개의 O-글리코실화 부위들을 함유하며, 사람 IL-6은 일부 세포들에서 포스포릴화된다. 마우스 단백질은 211 아미노산 단백질로서, 23 아미노산 시그날 서열의 절단 후에는 성숙한 형태의 187 아미노산 단백질로서 암호화된다. O-글리코실화 부위들이 존재하지만, N-글리코실화 부위들은 존재하지 않는다(IL-6에 대한 참조, 예를 들면, Heinrich et al. (1990) Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265:621-636.)
IL-6 기능은 다면발현성이다. IL-6 수용체는 활성화된 B 세포들에서 발견되지만 휴지기 B 세포들에서는 발견되지 않는 것으로 일컬어진다. 대조적으로, IL-6R은 휴지기 T 세포들에서 발견되며 IL-2의 존재하에 T 세포들의 세포독성 T 림프구들로의 분화를 포함하는 T 세포 분화, 활성화 및 증식을 촉진하는 것으로 일컬어진다.
사람화된 IL-6/IL-6R 엑토도메인 마우스들 및 IL-6-매개된 급성상 반응
사람들에서, IL-6은 급성 상 반응을 유도한다. 사람 간세포들을 사용한 조기 연구들은, IL-6이 예를 들면, C-반응성 단백질(CRP) 및 혈청 아밀로이드 A(SAA)와 같은 급성 상 단백질들을 투여량-의존적이고 시간-의존적인 방식으로 유도함을 확립하였다[참조: Heinrich et al. (1990) Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265:621-636]. 따라서, 사람화된 IL-6 및 IL-6R 유전자들을 포함하는 비-사람 동물들, 예를 들어, 마우스들 또는 래트들은 사람 IL-6에 의해 매개된 급성 상 반응을 측정하기에 유용한 시스템들이다. 이러한 동물들은 또한, 물질이 본원에 기술된 바와 같은 사람화된 IL-6/IL-6R 동물을 기질에 노출시키고 하나 이상의 급성 상 반응 단백질들(또는 RNA들)의 수준을 측정함으로써 IL-6-매개된 급성 상 반응을 유도하는지를 측정하는데 유용하다. 한 실시형태에서, 사람화된 동물은 사람 IL-6R의 길항제의 존재하에 물질에 노출되며, 하나 이상의 급성 상 반응 단백질들(또는 RNA들)의 수준이 측정되고, 여기서, 사람 IL-6R 길항제의 존재하에 급성 상 반응 단백질(또는 RNA)의 수준에 있어서의 감소는 사람 IL-6R-매개된 급성 상 반응을 나타낸다.
사람 IL-6은 사람 IL-6R 및 마우스 IL-6R 둘 다에 결합할 수 있으며; 마우스 IL-6은 마우스 IL-6R에 결합하지만 사람 IL-6R에는 결합하지 않는다(hIL-6R에 대한 mIL-6의 결합은 검출가능하지 않은 반면, hIL-6은 mIL-6R에 결합하는 것을 mIL-6와 경쟁한다; 참조: Coulie et al. (1989) High- and low-affinity receptors for murine interleukin 6. Distinct distribution on B and T cells, Eur. J. Immunol. 19:2107-211); 또한 참조: 예를 들면, Peters et al. (1996) The Function of the Soluble Interleukin 6 (IL-6) Receptor In Vivo: Sensitization of Human Soluble IL-6 Receptor Transgenic Mice Towards IL-6 and Prolongation of the Plasma Half-life of IL-6, J. Exp. Med. 183:1399-1406]. 따라서, 마우스(예를 들면, 외인성 이식편)에서 hIL-6R을 지닌 사람 세포들은 내인성 mIL-6에 의존하여 IL-6 혈액 세포 또는 림프구 발달(예를 들면, 조혈, B 세포 활성화, T 세포 활성화 등)의 역활을 포함하나, 이에 한정되지 않는 IL-6-매개된 기능들을 수행할 수 없다.
야생형 마우스 IL-6 유전자 및 사람 IL-6R 유전자(그러나 마우스 IL-6R 유전자는 아님)을 포함하는 혼합된 생체내 시스템에서, 급성 상 반응 유도인자는 급성 상 반응을 나타낼 수 있는 급성 상 단백질들의 검출가능한 수준들을 유도하는 것으로 예측되지 않는다. 그러나, 사람화된 IL-6 유전자, 및 사람화된 엑토도메인 서열을 포함하는 IL-6R 유전자를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 사람화된 마우스는 급성 상 반응 유도인자와 반응하여 혈청 중에서 급성 상 반응 단백질들을 나타낼 것이다. 급성 상 유도인자 테레빈유의 존재 또는 부재하에서 급성 상 단백질들에 대해 시험된 IL-6/IL-6R에 대한 마우스 야생형은 급성상 단백질들에서 테레빈유-의존성 증가를 나타내었다. 사람화된 IL-6 유전자를 지니지만, IL-6R을 지니지 않은 마우스들은 테레빈유의 존재하에서 급성 상 반응을 나타내지 않았다. 그러나, 사람 IL-6 유전자, 및 사람화된 엑토도메인을 지닌 IL-6R 유전자 둘 다를 지닌 마우스들은 강력한 급성상 반응을 나타내었다(도 2). IL-6-매개된 급성상 반응은, 충분히 높은 항체 투여량에서 적절한 항-IL-6R 항체의 급성상 반응을 제거하는 능력에 의해 입증되는 바와 같이, 야생형 마우스들(도 3의 상단) 및 사람화된 IL-6/IL-6R 엑토도메인 마우스들(도 3의 하단) 둘 다에서 IL-6 의존성이었다. 따라서, IL-6 및 IL-6R의 이중 사람화는 혈청 급성상 단백질들과 관련하여 야생형 IL-6-매개된 급성상 반응을 반복(recapitulating)한다.
유전적으로 변형된 마우스들
내인성 마우스 유전자좌로부터 사람 IL-6 및/또는 사람화된 IL-6 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 마우스들이 제공되며, 여기서, 내인성 마우스 IL-6 유전자 및/또는 내인성 마우스 IL-6 수용체 유전자는 사람 IL-6 유전자 및/또는, 사람 IL-6 수용체의 엑토도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 사람 서열로 대체되어 있다. 유전적으로 변형된 마우스들은 마우스 프로모터들 및/또는 마우스 조절 성분들의 제어 하에 있는 사람화된 내인성 유전자좌들로부터 사람 IL-6 및/또는, 사람화된 IL-6 수용체를 발현한다. 내인성 마우스 유전자좌들에서 대체(들)은 당해 분야에 공지된 IL-6 유전자삽입 마우스들에서 관찰된 실질적인 병리학들의 집합을 생성하지 않는 방식으로 사람 IL-6 및 사람화된 IL-6 수용체를 발현하는 비-사람 동물들을 제공한다.
사람 IL-6을 발현하는 유전자삽입 마우스들는 당해 분야에 공지되어 있다. 그러나, 이들은 일반적으로 이들의 유용성을 심각하게 제한하는 유의적인 병리학들로 고생한다. 본원에 기술된 바와 같은 사람화된 마우스들은 내인성 마우스 IL-6 및 IL-6Rα 유전자좌들에서 내인성 마우스 조절 성분들의 제어 하에 사람 IL-6 및/또는 사람화된 IL-6 수용체를 발현한다. 대조적으로, 이들 마우스들은 당해 분야에 공지된 유전자삽입 마우스들과 상이한 이들 유전자들과 관련하여 발현 패턴들을 나타낸다.
내인성 비-사람 유전자좌에서 및 내인성 프로모터들 및/또는 조절 성분들의 제어 하에, 비-사람 동물에서 비-사람 유전자들의 상동성 유전자 또는 이종상동성 유전자 또는 사람 서열들로의 대체는, 전형적인 녹아웃(knockout)-플러스-전이유전자 동물과는 실질적으로 상이할 수 있는 품질들과 특징들을 지닌 비-사람 동물을 생성할 수 있다. 전형적인 녹아웃-플러스-전이유전자 동물에서, 내인성 유전자좌는 제거되거나 손상되고 완전한 사람 전이유전자가 동물의 게놈내로 삽입되어 아마도 게놈내에 무작위로 통합된다. 전형적으로, 통합된 전이유전자의 위치는 알려져 있지 않으며; 사람 단백질의 발현은 사람 유전자의 전사 및/또는 단백질 검정 및/또는 기능성 검정으로 측정된다. 상부 및/또는 하부 사람 서열들의 사람 전이유전자내 봉입(inclusion)은, 동물의 게놈에서 전이유전자가 감겨지는 위치에 상관없이 전이유전자의 발현 및/또는 조절을 위한 적합한 지지체를 제공하기에 충분한 것으로 외관상으로 추정된다. 그러나, 많은 경우들에서 사람 조절 성분들을 갖는 전이유전자는 비생리학적으로 또는 달리는 만족스럽지 않은 방식으로 발현하며, 동물에게 실제적으로 유해할 수 있다. 대조적으로, 본 발명자들은, 내인성 조절 성분들의 제어 하에 내인성 유전자좌에서 사람 서열로의 대체는 대체된 유전자와 관련하여 이의 생리학이 의미있고 적절하며 사람화된 동물의 병리학의 상황에 있는 유용한 사람화된 동물을 생성하는 생리학적으로 적절한 발현 패턴, 및 수준을 제공한다.
MHC 제I 부류 프로모터 H2, 및 695-bp 마우스 IL-6 유전자의 발현을 구동하는β-글로빈 인트론을 가진 작제물을 주사한 수정된 마우스 난들(eggs)은 마우스 IL-6을 비교적 높은 수준들(야생형 마우스들과 비교하여)로 구성적으로 발현하는 마우스들을 생산한다[참조: Woodrofe et al. (1992) Long-Term Consequences of Interleukin-6 Overexpression in Transgenic Mice, DNA and Cell Biology 11(8):587-592]. 그러나 이들 마우스는 창자들, 림프절들 및 또한 신장, 및 비장 아밀로이드 침착물들과 관련된 림프종들로 진행되는 경향이 있다. 이들은 또한 비정상적인 B 세포 성숙을 나타내므로(참조: Woodrofe et al., Id.), B 세포 기능의 연구들이 철충된다. 대조적으로, 마우스 IL-6 유전자좌에서, 마우스 IL-6 유전자의 사람 IL-6 유전자로의 대체를 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 마우스들은 이들 림프종들로 진행되는 경향이 없으므로 마우스들은 명백하게 정상인 B 세포 집단들을 나타낸다.
IgM 인핸서와 커플링된 hIL-6 유전자를 함유하는 사람 DNA의 6.6-kb(BamHI-Pvu II 단편) 길이의 무작위적인 삽입으로 인하여 hIL-6에 대해 유전자삽입성인 마우스들(C57BL/6)가 보고되어 왔다[참조: Suematsu et al. (1989) IgG1 plasmocytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7547-7551]. 마우스들은 혈청 중에 hIL-6을 800pg/mL 내지 20,000pg/mL로 발현하며, 여기서, 야생형 마우스들은 약 100pg/mL 만의 IL-6을 전형적으로 발현한다. 마우스들은 혈청 Ig에 있어서 증가(야생형 마우스들에 비해 120 내지 400-배) 및 이들이 나이들어감에 따라 알부민에 있어서의 감소를 나타낸다. 마우스들은 대량의 형질세포증가증으로 고생하며, 비장종대 및 림프절 비대를 나타내며, 골수 내의 혈장 세포 및 증가된 거핵세포를 나타낸다. 검사 시, 확장된 것으로 여겨지는 것은 다량의 압축된 비정상 혈장 세포 대신 림프절들이다. 비장 및 흉선 둘 다는 혈장 세포들의 대량의 증식을 나타내며, 이는 또한 폐, 간, 및 신장의 일부들을 침투한다. 이들 마우스들에서 신장은 또한 사구체간질-증식성 사구체신염이 전형적인 IL-6-자극된 혈관사이 세포 증식을 나타낸다. 유사하게, 게놈내로 무작위적으로 삽입된 마우스 H-2Ld 프로모터에 의해 구동된 트리밍된(trimmed) hIL-6 cDNA에 대해 유전자삽입성인 마우스(BALB/c)는 심각한 형질세포증가증을 나타낸다[참조: Suematsu et al. (1992) Generation of plasmacytomas with the chromosomal translocation t(12;15) in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:232-235]. hIL-6을 과발현하는 C57BL/6 마우스들이 이식가능한 형질세포종들로 진행하지 않는다고 해도(이들은 형질세포증가증을 나타내지 않음), BALB/c 마우스들내로 역-교차된(back-crossed) 유전자삽입 BL/6 마우스들은 진행된는 것으로 일컬어진다.
아교세포섬유 산성 단백질(GFAP) 유전자 프로모터에 의해 구동된 hIL-6 cDNA의 무작위적인 유전자삽입과정(transgenesis)은 마우스 중추 신경계내에서 hIL-6 과발현을 초래하며, 이는 또한 유의적인 병리학들을 일으키는 것으로 일컬어진다[참조: Campbell et al. (1993) Neurologic disease induced in transgenic mice by cerebral overexpression of interleukin 6, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10061-10065]. 이들 마우스들은 외관상으로 CNS-허용 전사 유전자좌에서 IL-6 삽입유전자의 무작위적인 통합의 결과로서 조절 손실로 인하여 CNS에서 IL-6 발현으로부터 생성되는 강력한 신경병리학 및 빈응성 성상세포증을 나타낸다. 비록 β-글로불린 3'-UTR에 연결되고, 수정된 마우스 난들(F1 C57BL/6 x BALB/c)내로 미세주사된 뉴런-특이적인 에놀라제 프로모터에 의해 구동된 hIL-6 cDNA의 발현이 정상적인 수명을 지니고 뉴런들에서 hIL-6을 발현하지만 다른 곳에서는 발현하지 않는 명백한 신경학적 결손들이 없는 마우스들 생산하였지만[참조: Fattor et al. (1994) IL-6 Expression in Neurons of Transgenic Mice Causes Reactive Astrocytosis and Increase in Ramified Microglial Cells But No Neuronal Damage, Eur. J. Neuroscience 7:2441-2449], 마우스들은 뇌 전체에서 증가된 공정들로 활성화되고 확장된 별아교세포들을 높은 수준들(야생형보다 20- 내지 30-배 더 높은), 및 또한 백색질에서 분기된 미세아교 세포들에 있어 10- 내지 15배 증가를 나타내었다. 따라서, IL-6의 뇌 발현은 반응성 성상세포증 내지 노골적이고 심각한 신경병리학 범위의 상태들을 초래하는 것으로 일컬어진다.
β-글로빈 3'-UTR 및 마우스 MT-1 프로모터에 연결된 639-bp hIL-6 cDNA의 C57BL/6x"DBAII" 마우스들의 F1 교차의 수정된 난들내로의 미세주사는, hIL-6 유전자가 신부전으로 일찍 죽는 약하고 병들은 마우스를 무작위적으로 통합하여 생산하였다[참조: Fattori et al. (1994) Blood, Development of Progressive Kidney Damage and Myeloma Kidney in Interleukin-6 Transgenic Mice, Blood 63(9):2570-2579]. 유전자삽입 마우스들은 12 내지 20주째에 죽었고 혈장 중에서 상승된 수준들의 α1 및 β-글로불린들, 고감마글로불린혈증, 비장(야생형보다 3배 더 높음) 및 골수 내의 증가된 거핵세포, 비정상적이고 압축되게 배열된 형질세포종(plasmocytoid) 세포들, 및 사구체신염을 특징으로 하는 림프 기관들(비장, 흉선, 및 림프절들)의 형질세포증가증, 및 다발골수종과 유사한 사구체경화증을 초래하는 사구체신염을 나타내었다.
C57BL/6J 마우스의 수정된 난들내로 H-2Ld-구동된 hIL-6 cDNA의 미세주사는, IL-6 길항제로 처리함으로써 완화되었던 차이인, 체중이 일치하는 대조군들과 비교하여 유전자삽입 마우스들에서 유의적으로 낮은 비복근 근육 중량에 의해 부분적으로 특징화되는, 마우스들에서 IL-6-의존성 근육 소모를 유발하였다[참조: Tsujinaka et al. (1996) Interleukin 6 Receptor Antibody Inhibits Muscle Atrophy and Modulates Proteolytic Systems in Interleukin 6 Transgenic Mice, J. Clin. Invest. 97(1):244-249]. 12주째에, 이들 마우스들은 600,000pg/mL 이상의 혈청 hIL-6 수준들을 나타내었다. 유전자삽입 마우스들은 또한 약 862mg이었던 대조군 간들과 비교하여 간들이 약 1,242mg으로 칭량되었다. IL-6 길항제로 처리된 유전자삽입 마우스들은, 간들이 약 888mg으로 칭량되었다. 근육 카텝신들 B 및 B+L은 대조군들에서보다 유전자삽입 마우스들에서 유의적으로 더 높았으며(20-배 및 6.2-배), 이는 IL-6 길항제로 처리한 유전자삽입 마우스들에서 제거된 현상이었다. 카텝신 B 및 L mRNA들은 야생형 마우스들과 비교하여 각각 약 277% 및 257%인 것으로 추정되었으며; 당해 차이는 IL-6 길항제 처리로 유의적으로 감소하였다.
마우스 MHC 부류 I H-2Ld 프로모터에 의해 구동된 hIL-6R 미니유전자 및 닭 β-액틴 프로모터, 및 gp130 유전자에 의해 구동된 hIL-6R 미니유전자를 포함하는 마우스들은 hIL-6 유전자삽입 마우스들의 전형적인 병리학들(예를 들면, 고감마글로불린혈증, 비장종대, 혈관 간막 증식사구체신염, 폐 림프구 침윤) 및 또한 심실 비대를 나타내었다[참조: Hirota et al. (1995) Continuous activation of gp130, a signal-transducing receptor component for interleukin 6-related cytokines, causes myocardial hypertrophy in mice, Proc. Natl Acad. Sci. USA 92:4862-4866]. 심실 비대는 gp130의 연속된 활성화에 의해 매개되는 것으로 여겨진다(Id.). IL-6의 역활은 사이토킨 수용체 복합체를 강화시키고, IL-6 시그날을 형질도입시키는데 관여하는 시그날 형질도입 성분인, gp130의 이합체화를 유도하는데 도움을 주는 것으로 일컬어진다[참조: Paonessa et al. (1995) Two distinct and independent sites on IL-6 trigger gp130 dimer formation and signalling, EMBO J. 14(9):1942-1951]. 활성화된 복합체는 2개의 IL-6으로 구성된 6합체인 것으로 여겨지며, 각각의 IL-6은 하나의 IL-6Rα 및 2개의 gp130(각각의 IL-6은 2개의 독립적인 gp130-결합 부위들을 함유한다)에 결합하여 2:2:2의 화학량론을 나타내며, 여기서, gp130의 이합체화는 JAK-Tyk 타이로신 키나제들의 활성화, gp130 및 STAT 계열 전사 인자들 및 다른 세포내 기질들의 포스포릴화를 유발하며[참조: Id.; Stahl, N. (1994) Association and Activation of Jak-Tyk Kinases by CNTF-LIF-OSM-IL-6β Receptor Components, Science 263:92-95], 이는 사이토킨 수용체 복합체 형성의 일반적인 모델과 일치한다[참조: Stahl, N. and Yancopoulos, G. (1993) The Alphas, Betas, and Kinases of Cytokine Receptor Complexes, Cell 74:587-590; Davis et al. (1993) LIFRb and gp130 as Heterodimerizing Signal Transducers of the Tripartite CNTF Receptor, Science 260:1805-1808; Murakami et al. (1993) IL-6-Induced Homodimerization of gp130 and Associated Activation of a Tyrosine Kinase, Science 260 1808-1810].
래트 PEP 카복실라제 프로모터에 의해 구동된 사람 sIL-6R 및 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터에 의해 구동된 사람 IL-6에 대해 유전자삽입성인 마우스들은 사람 IL-6 단독 또는 사람 sIL-6R 단독에 대해 유전자삽입성인 마우스들보다 현저히 더 작은 것으로 일컬어지며[참조: Peters et al. (1997) Extramedullary Expansion of Hematopoietic Progenitor Cells in Interleukin(IL-)-6-sIL-6R Double Transgenic Mice, J. Exp. Med. 185(4):755-766], 이는 감소된 체지방 및 감소된 체중(20 내지 25g 대 40g)을 반영한다. 이중 유전자삽입 마우스들은 단일의 유전자삽입 마우스들에 대해 정상의 기관 체중들로 일컬어지는 것과 비교하여 비장(5-배) 및 간(2-배) 비대를 또한 나타내며, 이는 외관상으로는 비장 및 간의 조혈 세포들의 골수외 증식에 기인하나 골수에 기인하지는 않으며, 비장 및 모든 실질 기관 내의 혈장세포 침윤물 내의 증가된 거핵세포에 기인한다(Id.). 이중 유전자삽입들은 또한 과립구들, 대식구들, 후대 세포들, 및 B 세포들에서 단일의 유전자삽입들과 비교하여 약 200- 내지 약 300-배의 증가된 간들을 나타내고; 대조적으로, IL-6 단일의 유전자삽입 마우스들은 대식구들(15-배) 및 B 세포들(45-배)에 있어서 보다 적은 증가들을 나타내었다(Id.). 이러한 놀라운 발견들은 아마도 gp130 시그날 형질도입을 활성화시킴에 의한 조혈 후대 세포들의 성장 및 분화의 자극에 기인한다.
또한, 이중 유전자삽입(마우스 메탈로티오닌 프로모터-유도된 hIL-6/래트 PEP 카복시키나제 프로모터-구동된 hIL-6R) 마우스들은, IL-6이 간세포 증식 및 병원성 간세포 형질전환에 관여함을 강력하게 제안하는 지속된 간세포 증식을 지닌 사람 결절성의 재생성 비대와 동일한 것으로 일컬어지는 간세포 비대를 나타낸다[참조: Maione et al. (1998) Coexrpession of IL-6 and soluble IL-6R causes nodular regenerative hyperplasia and adenomas of the liver, EMBO J. 17(19):5588-5597]. 간세포 비대는 단일의 유전자삽입 hIL-6 마우스들에서 관찰되지 않고 hIL-6은 mIL-6R에 결합할 수 있는 것으로 일컬어지므로, 당해 발견은, 이중 유전자삽입이 가용성 IL-6R(본원에서, 가용성 hIL-6R)에 대해 복합체화된 hIL-6의 보다 높은 수준들을 생성할 수 있으며, 당해 복합체는 IL-6 단독보다 더 강력한 억제제인 것으로 고려될 때까지 역설적인 것으로 나타날 수 있다(Id.).
사람 IL-6에 대해 유전자삽입성인 마우스들과는 대조적으로, 내인성 마우스 IL-6 유전자좌에서 대체를 포함함으로써, 마우스 조절 성분들을 보유하지만 IL-6-암호화 서열의 사람화를 포함하는 사람화된 IL-6 마우스들은 선행 기술의 마우스들의 심각한 병리학들을 나타내지 않는다. hIL-6에 대해 이형접합체 또는 동형접합체인 유전적으로 변형된 마우스들은 전체적으로 정상이다.
실시예들에 기술된 바와 같은 사람화된 IL-6 유전자(MAID 760)를 갖는 마우스들은 면역표현형이었으며 팬 B 세포 마커(CD445R(B220))를 사용한 비장 B 세포들의 FACS 분석들[림프구-관문화됨(lymphocyte-gated)]에서 정상의 B 세포 수들을 갖는 것으로 밝혀졌다(도4). 비장의 경우, 야생형 마우스들은 63%의 B 세포들을 나타내었고; hIL-6 이형접합체 마우스들은 63%의 B 세포들을 나타내었으며; 내인성 마우스 유전자좌에서 hIL-6에 대해 동형접합체인 마우스들은 63%의 B 세포들을 나타내었다. TNP-KLH으로 면역화시킨 동형의 hIL-6 마우스들에 대한 B 세포 수들은 또한 정상이었다(야생형의 경우 65%, 및 hIL-6 동형접합체들의 경우 61%).
비장 T 세포들은 또한 야생형과 동일하였다(도5). T 헬퍼/T 세포독성에 대한 비장 T 세포들의 퍼센트들은 야생형의 경우 20%/40%(1.4:1의 비)이었고; hIL-6 이형접합체들의 경우 23%/14%(1.6:1의 비)이었으며; hIL-6 동형접합체들의 경우 21%/15%(1.4:1의 비)(마커들은 CD8a-APC; CD4-FITC이었다)이었다. TNP-KLH로 면역화시킨 동형접합성 hIL-6 마우스들은 야생형 마우스들과 유사한 비장 T 세포 수들을 나타내었는데, 즉, T 헬퍼/T 세포독성은 야생형의 경우 21%/19%(또한 1.1:1의 비)와 비교하여 22%/20%(1.1:1의 비)이었다.
사람화된 IL-6 마우스들은 또한 FACS 분석에서 거의 정상 수준들의 비장 NK 세포들(CD11b 및 DX5)을 나타내었다(도 7). hIL-6 이형접합체들은 2.2% NK 세포들을 나타내었고, hIL-6 동형접합체들은 1.8%의 NK 세포들을 나타낸 반면, 야생형 마우스들은 2.4%의 NK 세포들을 나타내었다. TNP-KLH를 사용한 면역화 후에, 동형접합체들은 1.6%의 비장 NK 세포들을 나타낸 반면, 야생형 마우스들은 2.1%의 비장 NK 세포들을 나타내었다.
사람화된 IL-6 마우스들은 또한 정상 수준들의 비장 Ly6G/C(Gr1) 세포들을 나타내었다(도 6). hIL-6 이형접합체들은 7.0%의 GR1+ 세포들(1.3%의 Gr1hi)을 나타내었고; 동형접합체들은 6.8%의 Gr1+ 세포들(0.9% Gr1hi)을 나타낸 반면, 야생형 마우스들은 8.0%의 Gr1+ 세포들(1.8%Gr1hi)을 나타내었다. 면역화된 IL-6 동형접합체들(TNP-KLH로 면역화됨)은 11%의 Gr1+ 세포들(4.0% Gr1hi)을 나타낸 반면, 야생형 마우스들은 10%의 Gr1+ 세포들(3.0% Gr1hi)을 나타내었다.
사람화된 IL-6 마우스들은 또한 FACS 분석에서 정상 혈액 B 및 T 세포 수들을 나타내었다(도 8 및 도 9). 팬 B 세포 마커(CD445R(B220))를 사용한 FACs는, 동형접합성 hIL-6 마우스들이 야생형 53%와 비교하여 52%의 B 세포를 나타내었고; 이형접합체들은 38%(29% 및 47%의 2개의 상이한 염색들의 평균)를 나타내었다. TNP-KLH로 면역화시킨 동형접합성 hIL-6 마우스들은 유사한 B 세포 수들(야생형 마우스들의 경우 45%와 비교하여, 43%)을 제공하였다.
사람화된 IL-6 마우스들은 CD8a 및 CD4 염색에 의해 측정된 것으로 FACS 분석에서 정상의 혈액 T 세포 수들을 나타내었다. 이형접합성 hIL-6 마우스들은 39%/26%(1.5:1의 비)의 T 헬퍼/T 세포독성 수들을 나타내었고; 동형접합성 hIL-6 마우스들은 24%/20%(1.2:1의 비)의 Th/Tc 수들을 나타낸 반면, 야생형 마우스들은 26%/20%(1.3:1의 비)의 Th/Tc 수들을 나타내었다. TNP-KLH로 면역화된 동형접합성 hIL-6 마우스들은 29%/21%(1.4:1의 비)의 Th/Tc 수들을 가진 반면, 야생형 면역화된 마우스들은 28%/23%(1.2:1)의 Th/Tc 수들을 가졌다.
사람화된 IL-6 마우스들은 또한 Ly6G/C(Gr1) 및 CD11b, 및 또한 CD11b 및 DX5로 염색한 나이브(naive) 및 면역화된 마우스 혈액의 FACS 분석으로 측정된 것으로서 야생형 마우스들과 유사한 혈액 중 골수성 세포 수들을 나타내었다(도 10, 도 11, 및 도 12). 이형접합성 hIL-6 마우스들은 10.8%의 %Gr+ 세포들을 나타내었고, 동형접합체들의 경우 6.9%를 나타낸 반면, 야생형 마우스들은 9.7%를 나타내었다. 면역화된 hIL-6 동형접합체들은 43%/34%의 M1(101-104의 Ly6G/C(Gr)) / M2(약 102-103의 Ly6G/C(Gr)염색) 수들을 나타낸 반면, 야생형 마우스들은 45%/38%의 수들을 나타내었다. 면역화된 동형접합성 hIL-6 마우스들에 대한 CD11b(수직 축) 대 Ly6G/C(평행 축)의 FACS 플롯들은 16%/8%/3%의 사분면들(상부 좌측/상부 우측/하부 우측)에서의 세포 퍼센트를 나타내었으며, 이는 면역화된 야생형 사분면 수들과 동일하였다.
동형접합성 TNP-KLH-면역화되고 사람화된 IL-6 마우스들은 면역화된 야생형 마우스들과 유사한 CD11b 대 DX5(NK) 염색 FACS 플롯들을 나타내었다. 사분면 분석 혈액 FACS 플롯들(CD11b 수직 축, DX5(NK) 수평 축)은 hIL-6 동형접합체들의 경우 9.5%/17%/10% 및 야생형 마우스들의 경우 6.5%/17.3%/14%의 상부 좌측/상부 우측/하부 우축 수들을 나타내었다.
사람화된 IL-6 마우스들은 야생형 마우스들에서 관측된 것과 필수적으로 동일한 동형 반응을 나타내었다. 조기 및 최종의 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE, 및 IgM 수준들은 야생형 마우스들에서 관찰된 바와 거의 동일하였다. 하나의 실험에서, 최종의 IgM은 사람화된 마우스들에서 약간 더 높았으며; 최종의 IgG3은 또한 사람화된 마우스들에서 상승되었다.
나이브 hIL-6 마우스들에서 B 세포 발달은 골수 IgM/CD24/B220 염색의 FACS 분석을 기준으로 한 야생형 마우스들에서의 발달과는 필수적으로 구별되지 않았다(도 13). 면역 마우스들의 면역표현형은, B 세포 발달 진행에 있어서 각종 세포 유형들에 대한 마커 집단들은 hIL-6 마우스들에서 필수적으로 정상이었다. 조혈 줄기 세포들로부터의 세포들, 일반적인 림프구 후대세포들, 프로(Pro)B 세포들, 프레(Pre)B 세포들, 및 미성숙 및 성숙한 B 세포들의 진행은 hIL-6 마우스들에서 정상이다(도 14 및 도 15).
실시예
실시예 1: 내인성 마우스 IL-6 유전자의 hIL-6 유전자로의 대체
사람 IL-6 유전자의 엑손 1 내지 엑손 4를 함유하는 4.8-kb 사람 IL-6 유전자는 6.8kb의 뮤린 IL-6 유전자 유전자좌를 대체하였다.
단일의 표적화 단계에서 마우스를 사람 IL-6 유전자로 대체하기 위한 표적화 작제물(targeting construct)을 VELOCIGENE® 유전자 조작 기술을 사용하여 작제하였다[참조: Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659]. 마우스 및 사람 IL-6 DNA를 세균 인공 염색체(BAC) RPCI-23 클론 368C3, 및 BAC CTD 클론 2369M23으로부터 각각 입수하였다. 요약하면, 3' 하부 서열의 16개 뉴클레오타이드들을 지닌 엑손 1 내지 엑손 5 내의 ATG로부터 연장된 4.8kb 사람 IL-6 서열을 플랭킹(flanking)하는 마우스 IL-6 상부 및 하부 동족체 아암(homology arm)들을 함유하는 갭 복구 클로닝에 의해 생성된 NotI 선형화된 표적화 작제물[게놈 좌표들(genomic coordinates): NCBIh37.1: ch7:22,766,882 내지 22,771,637] 및 플록스트(floxed) neo 선택 카세트를 F1H4 마우스 배아 줄기(ES) 세포들(C57BL/6 x 129 F1 하이브리드) 내로 전기천공(electroporation)시켰다. 정확하게 표적화된 ES 세포들(MAID 790)을 일시적인 Cre-발현 벡터와 함께 추가로 전기천공시켜 약물 선택 카세트를 제거하였다. 약물 카세트(MAID 1428)가 없는 표적화된 ES 세포 클론들을 8-세포 단계 마우스 배아 내로 VELOCIMOUSE® 방법(참조: 미국 특허 제7,294,754호, 제7,576,259호, 제7,659,442호, 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99]에 의해 도입시켰다. 사람화된 IL-6 유전자를 지닌 VELOCIMOUSE®(공여체 ES 세포로부터 완전히 유도된 F0 마우스들)는 대립형질 검정의 변형을 사용한 마우스 대립형질의 손실 및 사람 대립형질의 획득에 대한 유전형(genotyping)으로 확인하였다[참조: Valenzuela et al. (2003)].
정확하게 표적화된 ES 세포 클론들을 천연의-대립형질의 손실(loss-of-native-allele)(LONA) 검정(참조: Valenzuela et al. 2003)으로 확인하였으며, 여기서, 천연의 비변형 Il6 유전자의 다수의 카피들을, 결실에 대해 표적화된 마우스 Il6 유전자 내의 서열들에 대해 특이적인 2개의 TaqManTM 정량적인 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)으로 측정하였다. qPCR 검정들은 하기 프라이머-프로브 세트들(5'으로부터 3'으로 작성됨): 상부 전방 프라이머, TTGCCGGTTT TCCCTTTTCT C (서열번호 1); 상부 역방 프라이머, AGGGAAGGCC GTGGTTGTC (서열번호 2); 상부 프로브, FAM-CCAGCATCAG TCCCAAGAAG GCAACT-BHQ (서열번호 3); 하부 전방 프라이머, TCAGAGTGTG GGCGAACAAA G (서열번호 4); 하부 역방 프라이머, GTGGCAAAAG CAGCCTTAGC (서열번호 5); 하부 프로브, FAM-TCATTCCAGG CCCTTCTTAT TGCATCTG-BHQ (서열번호 6)을 포함하였으며; 여기서, FAM은 5-카복시플루오레세인 형광성 프로브를 말하고 BHQ는 블랙 홀 퀀쳐 유형((black hole quencher type)[제조원: 바이오서치 테크놀로지스(Biosearch Technologies)]의 형광성 퀀쳐를 말한다. 표적화 벡터를 취하여 이들의 게놈들 내에 혼입시킨 ES 세포 클론들로부터 정제된 DNA를 TaqManTM 유전자 발현 마스터 믹스(Master Mix)[제조원: 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]와 제조업자의 제안들에 따라 384-웰 PCR 플레이트(MicroAmpTM Optical 384-웰 반응 플레이트, 제조원: 라이프 테크놀로지스) 중에서 합하고, PCR들의 과정 동안 형광성 데이터를 수집하여, 축적된 형광성이 미리-설정된 역치(pre-set threshold)에 도달하는 분획 PCR 주기인, 역치 주기(threshold cycle: Ct)를 측정하는 어플라이드 바이오시스템스 프리즘 7900HT 중에서 순환시켰다. 상부 및 하부 Il6-특이적 qPCR들 및 비-표적화된 참조 유전자들에 대한 2개의 qPCR들을 각각의 DNA 샘플에 대해 이동시켰다. 각각의 Il6-특이적 qPCR과 각각의 참조 유전자 qPCR 사이에서 Ct 값들(ΔCt)의 차이를 계산한 후, 검정된 모든 샘플들에 대한 각각의 ΔCt와 ΔCt 중간값 사이의 차이를 계산하여 각각의 샘플에 대한 ΔΔCt 값들을 수득하였다. 각각의 샘플에서 Il6 유전자의 카피 수는 다음 식으로부터 계산하였다: 카피 수 = 2·2-ΔΔCt. 이의 천연 카피들 중 하나를 상실한, 정확하게 표적화된 클론은 하나와 동등한 Il6 유전자 카피 수를 가질 것이다. 사람 IL6 유전자 서열이, 사람화된 대립형질 내의 결실된 마우스 Il6 유전자 서열을 대체하였음의 확인은 하기 프라이머-프로브 세트들(5'으로부터 3'으로 작성됨)를 포함하는 TaqManTM qPCR 검정으로 확인하였다: 사람 전방 프라이머, CCCCACTCCACTGGAATTTG (서열번호 7); 사람 역방 프라이머, GTTCAACCACAGCCAGGAAAG (서열번호 8); 및 사람 프로브, FAM-AGCTACAACTCATTGGCATCCTGGCAA-BHQ (서열번호 9).
동일한 LONA 검정을 사용하여 표적화된 ES 세포들로부터 유도된 마우스들에 대한 테일 생검들(biopsies)로부터 정제된 DNA를 검정하여 이들의 Il6 표현형들을 측정하고 사람화된 Il6 대립형질이 생식선을 통해 전달되었는지를 확인하였다. 대체에 대해 이형접합성인 2마리의 새끼를 교배하여, 내인성 마우스 IL-6 유전자를 사람 IL-6 유전자로 대체하기 위해 동형접합성인 마우스를 생성시켰다. 대체에 대해 동형접합성인 새끼들은 표현형을 위해 사용하였다.
뮤린 유전자좌, 및 hIL-6 유전자를 함유하는 서열의 상부 연결부는 5'-AATTAGAGAG TTGACTCCTA ATAAATATGA GACTGGGGAT GTCTGTAGCT CATTCTGCTC TGGAGCCCAC CAAGAACGAT AGTCAATTCC AGAAACCGCT ATGAACTCCT TCTCCACAAG TAAGTGCAGG AAATCCTTAG CCCTGGAACT GCCAGCGGCG GTCGAGCCCT GTGTGAGGGA GGGGTGTGTG GCCCAGG (서열번호 10) 내에 존재하도록 설계되며, 여기서, 사람 유전자의 첫번째 뉴클레오타이드 이전의 마지막 마우스 뉴클레오타이드는 CCGCT에서 "T"이고, 사람 서열의 첫번째 뉴클레오타이드는 ATGAA에서 "A"이다. hIL-6 유전자 및 뮤린 유전자좌를 함유하는 서열의 하부 연결부를 5'-TTTTAAAGAA ATATTTATAT TGTATTTATA TAATGTATAA ATGGTTTTTA TACCAATAAA TGGCATTTTA AAAAATTCAG CAACTTTGAG TGTGTCACGC TCCCGGGCTC GATAACTATA ACGGTCCTAA GGTAGCGACT CGAGATAACT T-3'(서열번호 11) 내에 존재하도록 설계하며, 여기서, 사람 서열의 마지막 뉴클레오타이드는 TCACG에서 마지막 "G"이고 마우스 서열의 첫번째 뉴클레오타이드는 CTCCC에서 첫번째 "C"이며; 하부 연결부 영역은 또한 플록스트 유비퀴틴 프로모터-유도된 네오 카세트(neo cassette)의 제거를 위해 3' 말단(이의 개시부를 나타냄)에서 loxP 부위를 함유하였다. 마우스 IL-6 유전자좌를 갖는 네오 카세트의 연결부는 5'-TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCCT AAGTTACATC CAAACATCCT CCCCCAAATC AATAATTAAG CACTTTTTAT GACATGTAAA GTTAAATAAG AAGTGAAAGC TGCAGATGGT GAGTGAGA (서열번호 12) 내에 존재하도록 설계하며, 여기서, AGCTC의 마지막 "C"는 네오 카세트의 마지막 뉴클레오타이드이고; 카세트를 따르는 마우스 게놈의 첫번째 뉴클레오타이드는 CTAAG의 첫번째 "C"이다.
실시예 2: 나이브 및 면역화된 hIL-6 마우스들의 면역표현형: B 세포들
hIL-6 유전자 대체에 대해 동형접합성인 마우스들을 B 세포들(DC445R(B220))에 대해 분석하였다. 나이브 및 면역화된(TNP-KLH) hIL-6 마우스들의 비장 세포 제제들로부터의 림프구-게이트화된 분획들을 염색하고 유동 세포분석기를 사용하여 면역표현형화하였다. FACS 분석은, CD45R(B220)-FITC 염색에 의해 측정된 것으로서 비장 세포 제제의 B 세포들의 퍼센트가 나이브 야생형, hIL-6 이형접합체들, 및 hIL-6 동형접합체들로부터의 제제들에 대해 거의 동일(세포들 중 약 63%)하였음을 나타내었다. 면역화된 마우스들의 경우, B 세포들은 야생형 마우스들에서 비장 세포 제제의 총 세포들의 약 65%, 및 hIL-6 동형접합체들에서 총 세포들의 약 61%로 계산되었다. hIL-6 마우스들(나이브 및 면역화된 마우스 둘 다)의 비장들은 야생형 마우스들에서의 비장 B 세포 집단과 거의 동일한 크기의 B 세포들의 집단을 함유한다.
야생형, hIL-6 이형접합체들, 및 hIL-6 동형접합체들의 골수를 B 세포 마커들(CD45R(B220)-APC, CD24(HSA)-PE, 또는 염료 및/또는 IgM(IgM-FITC)에 접합된 CD43으로 염색하였다. 정상 마우스들의 골수내 B 세포 발달이 줄기 세포들로부터 조기 프로-B 세포들 내지 후기 프로(pro)-B 세포들에 이어, 거대한 프레-B 세포들 내지 작은 프레-B 세포들에 이어 미성숙 B 세포들로 및 최종적으로, 성숙한 B 세포들로 진행되면서 표면 마커들에 반영될 것이다. 일반적인 림프구 후대세포 프로-B 세포들은 CD45R을 발현할 것이며, 이후 단계들은 미성숙 B 세포들로서 및 후에 성숙한 B 세포들로서 IgM을 발현할 것이다. 따라서, CD45R-염색된 및 항-IgM-염색된 B 세포들은 B 세포 발달의 특징적인 패턴을 나타내어야 한다. hIL-6 이형접합체들 및 동형접합체들의 골수는 CD45R(B220) 및 IgM, 또는 CD45R(B220) 단독에 대해 양성으로 염색된 B 세포들의 집단들을 나타내는, CD45R(B220)-APC의 패턴 및 야생형 골수로부터 필수적으로 구별가능하지 않은 항-IgM-FITC 염색을 나타내었다. FACS 염색에 의해 나타난 hIL-6 마우스들의 골수 내 B 세포 소-집단들은 야생형 마우스에서의 것들과 유사하였다(표 1; 또한 도 13 참조).
나이브 마우스의 골수 내의 B 세포
야생형 마우스
(%) 		hIL-6 마우스
이형접합체(%) 동형접합체(%)
CLP-ProB 40 29 32
프레B-미성숙 B 12.3 19.3 15.3
성숙 B 6.4 6.5 6.7
CD24에 대한 염색(참조: 도 14)은 표 2에 나타낸 (정상) 패턴을 나타내었으며, 이는 골수 내에서의 정상적인 발달을 나타낸다.
나이브 마우스의 골수 내의 B 세포
야생형 마우스
(%) 		hIL-6 마우스
이형접합체
(%) 		동형접합체
(%)
발달중인 HSC-CLP 46.6 46 43
성숙한 CLP/조기 프로B 10.2 9.0 10.1
말기 프로B, 프레B, 미성숙 B 7.2 11.6 10.7
성숙 B 14.1 14.9 17
CD43에 대한 염색(참조: 도 15)은 표 3에 나타낸 (정상) 패턴을 나타내었으며, 이는 골수 중에서 정상적인 발달을 나타낸다.
나이브 마우스의 골수 내의 B 세포
야생형 마우스
(%) 		hIL-6 마우스
이형접합체
(%) 		동형접합체
(%)
프레Bll-미성숙 B 세포들 28.4 21.4 21.2
성숙 B 세포들 8.1 11.5 8.0
프로B-프레Bl 3.4 4.3 4.7
따라서, 나이브 hIL-6 마우스들의 면역표현형은, 이러한 마우스에서 B 세포 발달이 필수적으로 정상임을 나타내었다.
실시예 3: 내인성 마우스 IL-6Rα 엑토도메인 유전자 서열의 hIL-6Rα 엑토도메인 유전자 서열로의 대체
사람 IL-6Rα 유전자의 엑손 1 내지 엑손 8을 함유하는 45kb 사람 IL-6Rα 유전자는 35.4kb의 뮤린 IL-6Rα 유전자 유전자좌를 대체하였다. 마우스 엑손 9 및 엑손 10을 보유하였으며; 엑손 1 내지 엑손 8 만이 사람화되었다. 전체적으로, 35,384 nt의 마우스 서열이 45,047nt의 사람 서열로 대체되었다.
단일 표적화 단계에서 마우스를 사람 IL-6Rα 유전자로 대체하기 위한 표적화 작제물을 VELOCIGENE® 유전자 조작 기술을 사용하여 작제하였다[참조: Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659]. 마우스 및 사람 IL-6Rα DNA를 세균 인공 염색체(BAC) RPCI-23 클론 125J8, 및 BAC CTD 클론 2192J23 각각으로부터 수득하였다. 요약하면, 3' 하부 서열의 69개 뉴클레오타이드들을 지닌 엑손 1 내지 엑손 8 내의 ATG로부터 연장되는 45kb 사람 IL-6Rα 서열을 플랭킹하는 마우스 IL-6Rα 상부 및 하부 동족체 아암들을 함유하는 갭 복구 클로닝에 의해 생성된 NotI 선형화된 표적화 작제물, 및 플록스트 neo 선택 카세트를 F1H4 마우스 배아 줄기(ES) 세포들(C57BL/6 x 129 F1 하이브리드)내로 전기천공시켰다. 정확하게 표적화된 ES 세포들(MAID 794)을 일시적인 크레-발현(Cre-expressing) 벡터와 함께 추가로 전기천공시켜 약물 선택 카세트를 제거하였다. 약물 카세트(MAID 1442)가 없는 표적화된 ES 세포 클론들을 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아내로 도입시켰다[참조: 미국 특허 제7,294,754호, 제7,576,259호, 제7,659,442호, 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99]. 사람화된 IL-6Rα 유전자를 지닌 VELOCIMOUSE® (공여체 ES 세포로부터 완전하게 기원한 F0 마우스들)을 대립형질 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립형질의 손실 및 사람 대립형질의 획득에 대해 유전형으로 확인하였다(참조: Valenzuela et al. 2003).
정확하게 표적화된 ES 세포 클론들을 천연의-대립형질의 손실(LONA) 검정(참조: Valenzuela et al. 2003)에 의해 확인하였으며, 여기서, 천연의 비변형 Il6 유전자의 다수의 카피들이 결실에 대해 표적화된 마우스 Il6 유전자 내의 서열들에 대해 특이적인 2개의 TaqManTM 정량적인 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)에 의해 측정되었다. qPCR 검정들은 하기 프라이머-프로브 세트들(5'으로부터 3'으로 작성됨)을 포함하였다: 상부 전방 프라이머, GCCCTAGCAT GCAGAATGC (서열번호 13); 상부 역방 프라이머, AAGAGGTCCC ACATCCTTTG C (서열번호 14); 상부 프로브, CCCACATCCA TCCCAATCCT GTGAG (서열번호 15); 하부 전방 프라이머, GAGCTTGCCC CCAGAAAGG (서열번호 16); 하부 역방 프라이머, CGGCCACATC TCTGGAAGAC (서열번호 17); 하부 프로브, CATGCACTGC CCCAAGTCTG GTTTCAGT (서열번호 18). 표적화 벡터를 취하고 이들의 게놈들내에 혼입된 ES 세포 클론들로부터 정제된 DNA를 TaqManTM 유전자 발현 마스터 믹스(제조원: 라이프 테크놀로지스)와 제조업자의 제안들에 따라 384-웰 PCR 플레이트(MicroAmpTM Optical 384-Well Reaction Plate, 제조원: 라이프 테크놀로지스) 중에서 합하고, PCR들의 과정 동안 형광성 데이터를 수집하여, 축적된 형광성이 전-세트 역치에 도달하는 분획 PCR 주기인, 역치 주기(Ct)를 측정하는, 어플라이드 바이오시스템스 프리즘(Applied Biosystems Prism) 7900HT 중에서 순환시켰다. 상부 및 하부 IL-6Rα-특이적 qPCR들 및 비-표적화된 참조 유전자들에 대한 2개의 qPCR들을 각각의 DNA 샘플에 대해 수행하였다. 각각의 IL-6Rα-특이적 qPCR과 각각의 참조 유전자 qPCR 사이의 Ct 값들(ΔCt)에 있어서의 차이들을 계산한 후, 모든 샘플들에 대한 각각의 ΔCt와 ΔCt 중간값(median) 사이의 차이를 계산하여 각각의 샘플에 대한 ΔΔCt 값들을 수득하였다. 각각의 샘플에서 Il6 유전자의 카피 수를 다음 식으로부터 계산하였다: 카피 수 = 2·2-ΔΔCt. 이의 천연의 카피들 중 하나를 손실한 정확하게 표적화된 클론은 하나와 동일한 IL-6Rα 유전자 카피 수를 가질 것이다. 사람 IL-6Rα 유전자 서열이, 사람화된 대립형질 내의 결실된 마우스 IL-6Rα 유전자 서열로 대체되었음의 확인은 하기 프라이머-프로브 세트들(5'으로부터 3'으로 작성됨)을 포함하는 TaqManTM qPCR 검정에 의해 확인하였다: 사람 전방 프라이머, GGAGAGGGCA GAGGCACTTA C (서열번호 19); the 사람 역방 프라이머, GGCCAGAGCC CAAGAAAAG (서열번호 20); 및 사람 프로브, CCCGTTGACT GTAATCTGCC CCTGG (서열번호 21).
동일한 LONA 검정을 사용하여 표적화된 ES 세포들로부터 유도된 마우스들에 대한 테일 생검들로부터 정제된 DNA를 검정함으로써 이들의 IL-6Rα 유전자형들을 측정하고 사람화된 IL-6Rα 대립형질이 생식선을 통해 이전되었는지를 확인하였다. 대체에 대해 이형접합성인 새끼들을 교배하여 내인성 마우스 IL-6Rα 유전자의 사람 IL-6Rα(엑토도메인) 유전자에 의한 대체에 대해 동형접합성인 마우스를 생성하였다. 당해 대체에 대해 동형접합성인 새끼들을 표현형에 사용한다.
뮤린 유전자좌의 상부 연결부 및 hIL-6Rα 유전자를 함유하는 서열을 5'-CGAGGGCGAC TGCTCTCGCT GCCCCAGTCT GCCGGCCGCC CGGCCCCGGC TGCGGAGCCG CTCTGCCGCC CGCCGTCCCG CGTAGAAGGA AGCATGCTGG CCGTCGGCTG CGCGCTGCTG GCTGCCCTGC TGGCCGCGCC GGGAGCGGCG CTGGCCCCAA GGCGCTGCCC TGCGCAGGGT AAGGGCTTCG G (서열번호 22) 내에 존재하도록 설계하며, 여기서, 사람 유전자의 첫번째 뉴클레오타이드 이전의 마지막 마우스 뉴클레오타이드는 GAAGC에서 "C"이고, 사람 서열의 첫번째 뉴클레오타이드는 ATGCT에서 첫번째 "A"이다. hIL-6 유전자를 함유하는 서열의 하부 연결부 및 뮤린 유전자좌가 5'-CAAGATTATT GGAGTCTGAA ATGGAATACC TGTTGAGGGA AATCTTTATT TTGGGAGCCC TTGATTTCAA TGCTTTTGAT TCCCTATCCC TGCAAGACCC GGGCTCGATA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGACTCGAG ATAACTTC-3'(서열번호 23) 내에 존재하도록 설계하며, 여기서, 사람 서열의 마지막 뉴클레오타이드는 CAAGA에서 마지막 "A"이고 마우스 서열의 첫번째 뉴클레오타이드는 CCCGG에서 첫번째 "C"이며; 하부 연결부 영역은 또한 플록스트 유비퀴틴 프로모터-유도된 neo 카세트의 제거를 위한 3' 말단에서 loxP 부위를 함유하였다. loxp 부위의 첫번째 뉴클레오타이드는 ATAAC에서 첫번째 "A"이다. neo 카세트와 마우스 IL-6Rα 유전자좌의 연결부를 5'-TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCTA CTCCATATGC TCACTTGCCG TTGTTTGCTA CGATACGGTG AGGCCCGTGC GAAGAGTGGC ACAGATCAGG AGGCTTATGT GGTCAGTCCA CAGTATGGC (서열번호 24) 내에 존재하도록 설계하며, 여기서, AGCTC의 마지막 "C"는 neo 카세트의 마지막 뉴클레오타이드이고; 카세트 하기 마우스 게놈의 첫번째 뉴클레오타이드는 TACTC의 머리글자 "T"이다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> HUMANIZED IL-6 AND IL-6 RECEPTOR <130> 1250A-WO <150> US 61/552,900 <151> 2011-10-28 <150> US 61/556,579 <151> 2011-11-07 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 ttgccggttt tcccttttct c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 agggaaggcc gtggttgtc 19 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 ccagcatcag tcccaagaag gcaact 26 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 tcagagtgtg ggcgaacaaa g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 gtggcaaaag cagccttagc 20 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 tcattccagg cccttcttat tgcatctg 28 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 ccccactcca ctggaatttg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 gttcaaccac agccaggaaa g 21 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 agctacaact cattggcatc ctggcaa 27 <210> 10 <211> 197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 aattagagag ttgactccta ataaatatga gactggggat gtctgtagct cattctgctc 60 tggagcccac caagaacgat agtcaattcc agaaaccgct atgaactcct tctccacaag 120 taagtgcagg aaatccttag ccctggaact gccagcggcg gtcgagccct gtgtgaggga 180 ggggtgtgtg gcccagg 197 <210> 11 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 ttttaaagaa atatttatat tgtatttata taatgtataa atggttttta taccaataaa 60 tggcatttta aaaaattcag caactttgag tgtgtcacgc tcccgggctc gataactata 120 acggtcctaa ggtagcgact cgagataact t 151 <210> 12 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 tatacgaagt tatcctaggt tggagctcct aagttacatc caaacatcct cccccaaatc 60 aataattaag cactttttat gacatgtaaa gttaaataag aagtgaaagc tgcagatggt 120 gagtgaga 128 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 gccctagcat gcagaatgc 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 aagaggtccc acatcctttg c 21 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 cccacatcca tcccaatcct gtgag 25 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 gagcttgccc ccagaaagg 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 cggccacatc tctggaagac 20 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 catgcactgc cccaagtctg gtttcagt 28 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 ggagagggca gaggcactta c 21 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 ggccagagcc caagaaaag 19 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 cccgttgact gtaatctgcc cctgg 25 <210> 22 <211> 191 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 cgagggcgac tgctctcgct gccccagtct gccggccgcc cggccccggc tgcggagccg 60 ctctgccgcc cgccgtcccg cgtagaagga agcatgctgg ccgtcggctg cgcgctgctg 120 gctgccctgc tggccgcgcc gggagcggcg ctggccccaa ggcgctgccc tgcgcagggt 180 aagggcttcg g 191 <210> 23 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 caagattatt ggagtctgaa atggaatacc tgttgaggga aatctttatt ttgggagccc 60 ttgatttcaa tgcttttgat tccctatccc tgcaagaccc gggctcgata actataacgg 120 tcctaaggta gcgactcgag ataacttc 148 <210> 24 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 tatacgaagt tatcctaggt tggagctcta ctccatatgc tcacttgccg ttgtttgcta 60 cgatacggtg aggcccgtgc gaagagtggc acagatcagg aggcttatgt ggtcagtcca 120 cagtatggc 129

Claims (24)

  1. 내인성 래트 IL-6 유전자좌(locus)에서 래트 IL-6 단백질을 암호화하는 래트 유전자를 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 사람 유전자로 대체한 것을 포함하는 유전적으로 변형된 래트로서, 여기서, 상기 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 사람 유전자는 상기 내인성 래트 IL-6 유전자좌에서 내인성 래트 조절 요소들의 제어 하에 있는, 유전적으로 변형된 래트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 사람 유전자가 CTD-2369M23 박테리아 인공 염색체에서 발견되는 사람 IL-6 유전자의 엑손 1 내지 엑손 5를 포함하는, 유전적으로 변형된 래트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 래트가 래트 IL-6Rα 단백질을 발현하는, 유전적으로 변형된 래트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 래트가, 내인성 래트 IL-6Rα 유전자좌에서 래트 IL-6Rα 유전자의 면역글로불린 슈퍼패밀리(superfamily) 도메인-암호화 서열을 사람 IL-6Rα 유전자의 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인-암호화 서열로 대체하여 사람화된 IL-6Rα 유전자를 형성한 것을 포함하고,
    여기서, 상기 래트는 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자로부터 사람화된 IL-6Rα 단백질을 발현하는, 유전적으로 변형된 래트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 래트가 형질세포증가증, 사구체경화증, 사구체신염, 신부전, 고감마글로불린혈증, 비장 내의 증가된 거핵세포, 골수 내의 증가된 거핵세포, 비장종대, 림프절 비대, 압축된 비정상 혈장 세포, 및 이들의 조합으로부터 선택된 특징을 나타내지 않는, 유전적으로 변형된 래트.
  6. 제4항에 있어서, 상기 사람화된 IL-6Rα 단백질이 사람 IL-6Rα 단백질의 엑토도메인(ectodomain)을 포함하는, 유전적으로 변형된 래트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 사람화된 IL-6Rα 단백질이 래트 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 래트 세포질 도메인을 포함하는, 유전적으로 변형된 래트.
  8. 내인성 래트 IL-6Rα 유전자좌에서 내인성 래트 IL-6Rα 유전자의 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인-암호화 서열을 사람 IL-6Rα 유전자의 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인-암호화 서열로 대체하여 사람화된 IL-6Rα 유전자를 형성한 것을 포함하는 유전적으로 변형된 래트로서, 여기서, 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자가 상기 내인성 래트 IL-6Rα 유전자좌에서 내인성 래트 조절 요소들의 제어 하에 있는, 유전적으로 변형된 래트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인을 암호화하는 사람 IL-6Rα 서열의 인접한 게놈 단편이 CTD-2192J23 박테리아 인공 염색체 유래인, 유전적으로 변형된 래트.
  10. 제8항에 있어서, 상기 사람 IL-6Rα 서열의 인접한 게놈 단편이 사람 IL-6Rα 단백질의 엑토도메인을 암호화하는, 유전적으로 변형된 래트.
  11. 제8항에 있어서, 내인성 래트 IL-6 유전자좌에서 래트 IL-6 단백질을 암호화하는 래트 유전자를 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 사람 유전자로 대체하여 사람화된 IL-6 유전자를 형성한 것을 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 래트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 사람화된 IL-6 유전자가 상기 내인성 래트 IL-6 유전자좌에서 내인성 래트 조절 요소들의 제어 하에 있는, 유전적으로 변형된 래트.
  13. 내인성 래트 IL-6 유전자좌에서 래트 IL-6 단백질을 암호화하는 래트 유전자 서열을 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 사람 유전자로 대체하는 것을 포함하여, 사람 IL-6 유전자가 상기 내인성 래트 IL-6 유전자좌에서 내인성 래트 조절 요소들의 제어 하에 있도록 하는, 사람화된 래트의 제조 방법.
  14. 내인성 래트 IL-6Rα 유전자좌에서 래트 IL-6Rα 단백질의 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인을 암호화하는 모든 내인성 래트 IL-6Rα 엑손들을 사람 IL-6Rα 단백질의 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인을 암호화하는 사람 게놈 단편으로 대체하여 사람화된 IL-6Rα 유전자를 형성하는 것을 포함하는 사람화된 래트의 제조 방법으로서, 여기서, 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자가 상기 내인성 래트 IL-6Rα 유전자좌에서 내인성 래트 조절 요소들의 제어 하에 있는, 사람화된 래트의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 사람 IL-6Rα 단백질의 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인을 암호화하는 사람 게놈 단편이 상기 사람 IL-6Rα 단백질의 엑토도메인을 암호화하는, 사람화된 래트의 제조 방법.
  16. 내인성 래트 IL-6Rα 유전자좌에서 내인성 래트 IL-6Rα 유전자의 래트 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인-암호화 서열을 사람 IL-6Rα 유전자의 사람 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인-암호화 서열로 대체하여 사람화된 IL-6Rα 유전자를 형성한 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 래트로서,
    여기서, 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자는 래트 막관통 서열 및 래트 세포질 서열을 포함하는 사람화된 IL-6Rα 단백질을 암호화하고;
    여기서, 상기 래트는 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 포함하고,
    여기서, 상기 사람 IL-6 단백질 및 상기 사람화된 IL-6Rα 단백질을 암호화하는 유전자들은 내인성 래트 조절 요소들의 제어 하에 있는, 유전적으로 변형된 래트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 래트가 래트 IL-6Rα 단백질을 발현하지 않고, 래트 IL-6 단백질을 발현하지 않는, 유전적으로 변형된 래트.
  18. 내인성 뮤린 IL-6 유전자좌에서 뮤린 IL-6 단백질을 암호화하는 뮤린 유전자를 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 사람 유전자로 대체한 것을 포함하는 뮤린 배아 줄기 (ES) 세포로서, 여기서, 상기 사람 IL-6 단백질을 암호화하는 사람 유전자는 상기 내인성 뮤린 IL-6 유전자좌에서 내인성 뮤린 조절 요소들의 제어 하에 있고, 상기 뮤린 ES 세포는 래트 ES 세포 또는 마우스 ES 세포인, 뮤린 ES 세포.
  19. 내인성 뮤린 IL-6Rα 유전자좌에서 내인성 뮤린 IL-6Rα 유전자의 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인-암호화 서열을 사람 IL-6Rα 유전자의 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인-암호화 서열로 대체하여 사람화된 IL-6Rα 유전자를 형성한 것을 포함하는 뮤린 ES 세포로서, 여기서, 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자가 상기 내인성 뮤린 IL-6Rα 유전자좌에서 내인성 뮤린 조절 요소들의 제어 하에 있고, 상기 뮤린 ES 세포는 래트 ES 세포 또는 마우스 ES 세포인, 뮤린 ES 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 사람 IL-6Rα 서열의 인접한 게놈 단편이 사람 IL-6Rα 단백질의 엑토도메인을 암호화하는, 뮤린 ES 세포.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 뮤린 ES 세포를 포함하는 뮤린 배아로서, 상기 뮤린 배아는 래트 배아 또는 마우스 배아인, 뮤린 배아.
  22. 물질이 사람 IL-6 매개된 급성 상 반응을 유도하는지를 결정하는데 유용한 동물 모델의 제조에서 사용하기 위한 유전적으로 변형된 뮤린 동물로서, 상기 유전적으로 변형된 뮤린 동물은 마우스 또는 래트이고,
    (i) 내인성 뮤린 IL-6Rα 유전자좌에서 사람화된 IL-6Rα 유전자; 및
    (ii) 내인성 뮤린 IL-6 유전자좌에서 사람화된 IL-6 유전자를 포함하고,
    여기서, 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자는 상기 내인성 뮤린 IL-6Rα 유전자좌에서 내인성 뮤린 조절 서열들의 제어 하에 있고, 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자는 사람 IL-6Rα 엑토도메인, 뮤린 IL-6Rα 막관통 도메인 및 뮤린 IL-6Rα 세포질 도메인을 포함하는 사람화된 IL-6Rα 단백질을 암호화하고,
    상기 사람화된 IL-6 유전자는 사람 IL-6 단백질을 암호화하고, 상기 내인성 뮤린 IL-6 유전자좌에서 내인성 뮤린 조절 서열들의 제어 하에 있는, 유전적으로 변형된 뮤린 동물.
  23. 화합물이 사람 IL-6Rα의 길항제인지를 결정하는데 유용한 동물 모델의 제조에서 사용하기 위한 유전적으로 변형된 뮤린 동물로서, 상기 유전적으로 변형된 뮤린 동물은 마우스 또는 래트이고,
    (i) 내인성 뮤린 IL-6Rα 유전자좌에서 사람화된 IL-6Rα 유전자; 및
    (ii) 내인성 뮤린 IL-6 유전자좌에서 사람화된 IL-6 유전자를 포함하고,
    여기서, 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자는 상기 내인성 뮤린 IL-6Rα 유전자좌에서 내인성 뮤린 조절 서열들의 제어 하에 있고, 상기 사람화된 IL-6Rα 유전자는 사람 IL-6Rα 엑토도메인, 뮤린 IL-6Rα 막관통 도메인 및 뮤린 IL-6Rα 세포질 도메인을 포함하는 사람화된 IL-6Rα 단백질을 암호화하고,
    상기 사람화된 IL-6 유전자는 사람 IL-6 단백질을 암호화하고, 상기 내인성 뮤린 IL-6 유전자좌에서 내인성 뮤린 조절 서열들의 제어 하에 있는, 유전적으로 변형된 뮤린 동물.
  24. 삭제
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