MX2014004900A - Interleucina 6 y receptor de interleucina 6, humanizados. - Google Patents

Interleucina 6 y receptor de interleucina 6, humanizados.

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Abstract

Se proporcionan ratones que comprenden una sustitución de los genes para IL-6 y/o receptor de IL-6 de ratón endógenos y se describen métodos para producir y utilizar a estos ratones. Se proporcionan ratones que comprenden una sustitución en el locus IL-6Ra endógeno de la secuencia que codifica para el ectodominio de ratón con una secuencia que codifica para el ectodominio humano. También se proporcionan ratones que comprenden un gen para IL-6 humana bajo el control de los elementos reguladores de IL-6 de ratón, que incluye a ratones que tienen una sustitución de la secuencia que codifica para IL-6 de ratón con una secuencia que codifica para IL-6 de humano en un locus IL-6 de ratón endógeno.

Description

INTERLEUCINA 6 Y RECEPTOR DE INTERLEUCINA 6, HUMANIZADOS CAMPO DE LA INVENCION Se proporcionan animales no humanos que tienen una sustitución de los genes para IL-6 y/o receptor de IL-6 del animal no humano endógeno. Los genes para IL-6 y/o receptor de IL-6 del animal no humano están sustituidos, en los loci no humanos endógenos, con genes para IL-6 humana y/o receptor de IL-6 humanizado que comprende secuencias humanas. Los animales no humanos que tienen genes para IL-6 humana y/o receptor de IL-6 humanizado en donde los animales no humanos no presentan una o más de las patologías que son características de animales no humanos transgénicos para IL-6 humana .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se conocen en el arte ratones transgénicos para el gen para IL-6 humana. No obstante, la inserción aleatoria del transgen para IL-6 humana en el genoma de ratón resulta en expresión poco regulada de la proteína IL-6 humana, lo que se manifiesta en si mismo en una diversidad de patologías en estos ratones transgénicos que incluyen pero que no se limitan a plasmacitosis y glomerulonefritis . Como un resultado estos ratones presentan utilidad limitada.
Existe la necesidad de animales no humanos, por ejemplo ratones y ratas que expresen IL-6 humana o humanizada REF. NO: 247501 y/o receptor de IL-6 humana o humanizado. Existe la necesidad de tales ratones humanizados que no presenten una o más de las patologías exhibidas por ratones hIL-6 transgénicos .
SUMARIO DE LA INVENCION En un aspecto, se proporcionan animales no humanos modificados genéticamente que comprenden una sustitución en el locus de IL-6 y/o receptor de IL-6 endógeno de un gen que codifica para IL-6 y/o receptor de IL-6 endógeno con un gen que codifica para IL-6 y/o receptor de IL-6 no humanizado. Se proporcionan animales murinos que comprenden una sustitución de un gen para IL-6 endógeno, en un locus de IL-6 murina endógena, con un gen para IL-6 humana; y/o que comprende una sustitución de un gen para receptor de IL-6 endógeno (o secuencia nucleotídica que codifica para un ectodomin o del mismo) con un gen para receptor de IL-6 humana (o secuencia nucleotídica que codifica para un ectodominio del mismo) .
En un aspecto, los animales murinos modificados genéticamente se proporcionan que expresan un gen IL-6 humana bajo el control del promotor murino endógeno y/o elementos reguladores murinos endógenos, a partir de un locus IL-6 endógeno .
En un aspecto, los animales murinos modificados genéticamente se proporcionan que expresan un gen receptor de IL-6 humana (o un gen que codifica para un ectodominio humano y dominios transmembranal e intracelular de ratón) bajo el control del promotor murino endógeno y/o elementos reguladores murinos endógenos a partir de un locus de receptor IL-6 murino endógeno.
En un aspecto, se proporciona un animal modificado genéticamente (por ejemplo un animal murino, por ejemplo un ratón o una rata) que expresan la proteína IL-6 humana, en donde el animal no humano no presenta una patología que se selecciona de plasmacitosis , glomerulonefritis , glomeruloesclerosis , glomerulonefritis mesangioproliferativa, linfoma intestinal, linfoma renal, esplenomegalia, agrandamiento de nodulos linfáticos, agrandamiento del hígado, megacariocitos en médula ósea, células plasmáticas anormales compactadas, infiltración de células plasmáticas en pulmón o hígado o riñon, proliferación de células del mensangio en riñon, sobreexpresión cerebral de IL-6, células de microglia ramificadas en materia blanca, astrocitosis reactiva en cerebro, fallo de riñon, megacariocitos elevados en bazo, agotamiento muscular (por ejemplo, agotamiento de músculo gastrocnemio) , catepsinas B y B+L elevadas en músculo (por ejemplo, de aproximadamente 20 veces y 6 veces) y combinaciones de los mismos.
En una modalidad, el animal no humano comprende una población de linfocitos B normales. En una modalidad, la población de linfocitos B normales es aproximadamente el mismo en número e inmunofenotipo que un animal natural, por ejemplo un ratón natural.
En una modalidad, el animal no humano es murino (por ejemplo, un ratón o rata) y expresa IL-6 humana (hIL-6) en suero en un nivel inferior a aproximadamente 800 pg/ml, inferior a aproximadamente 700, 600, 500, 400, 300 ó 200 pg/ml. En una modalidad específica, el animal murino expresa hIL-6 en suero a un nivel de aproximadamente 50 a aproximadamente no más de 200 pg/ml, en otra modalidad, aproximadamente 75-125 pg/ml, en otra modalidad, en aproximadamente 100 pg/ml.
En un aspecto, se proporciona un animal no humano que expresa hIL-6 y/o hIL-6R, en donde el animal no humano que expresa hIL-6 y/o hIL-6R de un locus IL-6 no humano endógeno y/o un locus hIL-6R no humano endógeno. En una modalidad específica, el animal no humano es murino (por ejemplo, ratón o rata) .
En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente que expresa hIL-6 a partir de un locus de IL-6 de ratón endógeno, en donde el gen para IL-6 de ratón endógeno ha sido sustituido con un gel para hIL-6.
En una modalidad, el ratón comprende una célula que expresa un receptor de IL-6 (IL-6R) que comprende un ectodominio humano sobre la superficie de la célula. En una modalidad, la célula es un linfocito. En una modalidad, el linfocito es un linfocito B.
En una modalidad aproximadamente 6.8 kb en el locus de IL-6 de ratón endógeno, que incluye los exones 1 a 5 y una secuencia no traducida 31 se suprimen y se sustituyen con aproximadamente 4.8 kb de la secuencia del gen para IL-6 humana que comprende los exones 1 a 5 del gen para IL-6 humana. En una modalidad específica, el gen para IL-6 humana comprende exones 1 a 5 del gen para IL-6 humana de BAC humana CTD-2369M23.
En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente que expresa IL-6 a partir de un gen para IL-6 humana, en donde el ratón expresa IL-6 humana en su suero.
En una modalidad, el suero de ratón presenta una concentración en suero de IL-6 humana de aproximadamente 25 a aproximadamente 300 pg/ml, 50 a aproximadamente 250 pg/ml, 75 a aproximadamente 200 pg/ml o 100 a aproximadamente 150 pg/ml. En una modalidad específica, el nivel de IL-6 humana en el suero del ratón es de aproximadamente 100 pg/ml.
En una modalidad, el nivel de un marcador específico para linfocitos B pan en médula ósea de ratón es de aproximadamente el mismo que el de un ratón natural. En una modalidad, el nivel de marcador específico de linfocitos B pan en bazo es aproximadamente el mismo que el de un ratón natural. En una modalidad, el marcador específico para linfocitos B pan se selecciona de B220, CD19, CD20, CD22, CD79a, CD79b, L26 y Pax-5 (BSAP) .
En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente que expresa hIL6 en donde el ratón no presenta un rasgo que se seleccione de plasmacitosis , esplenomegalia, agrandamiento de nodulos linfáticos, células plasmáticas anormales compactadas y una combinación de los mismos.
En una modalidad, el ratón comprende un bazo que es aproximadamente del mismo peso (por peso corporal) que un ratón natural. En una modalidad, los nodulos linfáticos del ratón son aproximadamente del mismo peso (por peso corporal) que un ratón natural. En una modalidad, las células plasmáticas del ratón no presentan plasmacitosis característica de ratones que sobreexpresan IL-6 humana.
En una modalidad, el ratón no presenta glomerulonefritis .
En una modalidad, el ratón presenta un nivel de células de mesangio comparable con un ratón natural.
En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente que expresa hIL6 a partir de un locus IL-6 de ratón endógeno, en donde el gen para IL-6 de ratón endógeno ha sido sustituido con un gen para hIL-6, en donde el ratón no presenta un rasgo que se selecciona de una neuropatología detectable morfológicamente, una astrocitosis reactiva y una combinación de las mismas. En una modalidad, el ratón comprende un cerebro que es morfológicamente distinto de un cerebro de ratón natural. En una modalidad, el ratón comprende tejido de cerebro que presenta un nivel de astrocitosis reactiva que no es mayor que la de un ratón natural .
En una modalidad, el ratón no expresa IL-6 humana en neuronas. En una modalidad, el ratón comprende niveles de astrocitos activados que son comparables con niveles de astrocito activados en un ratón natural.
En una modalidad, el ratón comprende células de microglia ramificadas en su materia blanca, en donde las células de microglia ramificadas están presentes en una cantidad equivalente a una cantidad de células de microglia ramificadas en un ratón natural.
En una modalidad, el ratón no presenta una astrocitosis reactiva. En una modalidad, la materia blanca del ratón es morfológicamente distinta de la materia blanca de un ratón natural. En una modalidad, la materia blanca del ratón es histológicamente indistinta de la materia blanca de un ratón natural con respecto a la tinción histoquímica de astrocitos reactivos.
En una modalidad, el ratón comprende un cerebro que es morfológicamente indistinto de un cerebro de ratón natural. En una modalidad, el ratón comprende tejido del cerebro que presenta un nivel de astrocitosis reactiva que no es mayor que la de un ratón natural.
En una modalidad, se proporciona un ratón modificado genéticamente que expresa hIL-6 a partir de un locus de IL-6 de ratón endógeno en donde el gen para IL-6 de ratón endógeno ha sido sustituido con un gen para hIL-6, en donde el ratón no presenta un rasgo que se selecciona de duración de vida acortado en aproximadamente 50% o más, fallo cardiaco, hipergamaglobulinemia, megacariocitos elevados en bazo, megacariocitos elevados en médula ósea, plasmacitosis del bazo, plasmacitosis del timo, plasmacitosis de nodulos linfáticos, glomerulonefritis , glomeruloesclerosis y una combinación de los mismos.
En una modalidad, el ratón tiene una duración de vida que excede de 20 semanas. En una modalidad, el ratón tiene una duración de vida que excede de 30 semanas, 40 semanas o 50 semanas. En una modalidad, el ratón presenta una duración de vida aproximadamente igual a la de un ratón natural de la misma cepa.
En una modalidad, el ratón presenta un nivel de megacariocitos en bazo que es no mayor de aproximadamente el nivel de megacariocitos esplénicos de un ratón natural .
En una modalidad, los ratones comprenden órganos linfoides que carecen esencialmente de células plasmacitoides arregladas de manera compacta .
En una modalidad, los ratones presentan niveles séricos de gamma globulina equivalentes a niveles séricos de gamma globulina en ratones naturales. En una modalidad, los niveles de al- y ß-globulina en suero de ratones son equivalentes a los niveles en suero de OÍI- y ß-globulina de ratones naturales de la misma cepa.
En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente que expresa IL-6 humana a partir de un locus de IL-6 de ratón endógeno, en donde el gen para IL-6 de ratón endógeno ha sido sustituido con un gen para hIL-6, en donde el ratón no presenta un rasgo que se selecciona de agotamiento muscular, un nivel elevado de catepsina B en comparación con un ratón natural de la misma cepa, un nivel elevado de catepsina A+B en comparación con un ratón natural de la misma cepa, un peso de hígado aumentado en comparación con un ratón natural de la misma cepa y una combinación de los mismos.
En una modalidad, el peso del hígado del ratón es de aproximadamente 800-900 mg a las 12 semanas.
En una modalidad, el ratón presenta un nivel de catepsina B durante la duración de su vida que es no mayor de aproximadamente el nivel observado en un ratón natural . En una modalidad, el ratón presenta un nivel de catepsina A+B durante la duración de su vida que es no mayor de aproximadamente el nivel observado en un ratón natural .
En una modalidad, el ratón, como un adulto, presenta un peso de músculo gastrocnemio que está dentro de aproximadamente 10% del peso de un ratón natural de la misma cepa. En una modalidad, el ratón, como un adulto, presenta un peso de músculo grasatrocnemio que es aproximadamente el mismo que el de un ratón natural.
En un aspecto se proporciona un ratón que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína IL-6 humana, en donde la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína IL-6 humana sustituye en su totalidad o en parte a una secuencia nucleotídica endógena que codifica para una proteína IL-6 de ratón endógena.
En un aspecto se proporciona un ratón que comprende una sustitución en un locus de receptor IL-6 de ratón endógeno o un ectodominio IL-6Ro¡ de ratón con una secuencia de ectodominio de un IL-6ROÍ humano para formar un gen para IL-6Ra humano/de ratón quimérico.
En una modalidad, el gen para IL-6ROÍ quimérico está bajo el control de un promotor de ratón y/o segmentos reguladores de ratón en el locus para IL-6Ra de ratón endógeno .
En una modalidad, aproximadamente el 35.4 kb de la secuencia que codifica para el ectodominio de IL-6Ra de ratón está sustituido con aproximadamente 45.5 kb de la secuencia que codifica para el ectodominio IL-6R humano.
En una modalidad, la secuencia que codifica para el ectodominio IL-6R humano abarca el primer codón (ATG) en el exon 1 al exon 8.
En una modalidad, la secuencia de IL-6Ra de ratón que es sustituida incluye una secuencia contigua que abarca los exones 1 a 8. En una modalidad específica se suprimen los exones 1 a 8 y una porción del intrón 8.
En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente que comprende una sustitución en el locus para I L-6 de ratón endógeno de un gen para ratón que codifica para I L-6 con un gen humano que codifica para IL-6 humana, en donde el gen humano que codifica para I L-6 humana se encuentra bajo el control de elementos reguladores de ratón endógeno en el locus I L-6 de ratón endógeno.
En una modalidad, el gen humano que codifica para IL-6 humana es un gen para IL-6 humana de BAC ID CTD-2369 23.
En una modalidad, el ratón expresa IL-6Ra de ratón. En una modalidad, el ratón expresa I L-6ROÍ humano. En una modalidad, el IL-6Ra humanizado comprende un ectodominio humano. En una modalidad, el I L-6Ra humanizado comprende un dominio t ansmembranal de ratón y un dominio citoplásmico de ratón. En una modalidad, el ratón expresa un IL-6Ra humanizado que comprende una humanización del ectodominio pero no un dominio transmembranal y/o citosólico.
En una modalidad, el ratón no presenta un rasgo que se seleccione de plasmacitosis , glomeruloesclerosis , glomerulonefritis , fallo renal, hipergammaglobulinemia, megacariocitos elevados en bazo, megacariocitos elevados en médula ósea, esplenomegalia, agrandamiento de nodulo linfático, células plasmáticas anormales compactadas y una combinación de los mismos.
En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente que comprende una humanización de un gen para IL-6R de ratón endógeno, en donde la humanización comprende una sustitución de la secuencia que codifica para el ectodominio IL-6Ro¡ de ratón con una secuencia que codifica para el ectodominio IL-6Ra humano en el locus IL-6R de ratón endógeno .
En una modalidad, una secuencia de ratón contigua que comprende los exones de ratón 1 a 8 es sustituida con un fragmento genómico contiguo de la secuencia para IL-6R humano que codifica para un ectodominio IL-6ROÍ humano. En una modalidad, el fragmento genómico continuo de la secuencia de IL-6Ro¡ humana que codifica para el ectodominio es de BAC CTD-2192J23.
En una modalidad, el ratón comprende además un gen para IL-6 humanizado. En una modalidad, el ratón comprende una sustitución en un locus para IL-6 de ratón endógeno de un gen para IL-6 de ratón con un gen para IL-6 humana. En una modalidad, el gen para IL-6 humanizado está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos.
En un aspecto, se proporciona un método para producir un ratón humanizado, que comprende sustituir una secuencia de gen de ratón que codifica para IL-6 de ratón con un gen humano que codifica para IL-6 humana.
En una modalidad, la sustitución es en un locus para I L-6 de ratón endógeno y el gen humano que codifica para I L-6 humana está unido operablemente a secuencias reguladoras de ratón endógenas .
En un aspecto se proporciona un método para producir un ratón inmunizado que comprende sustituir exones de ratón que codifican para secuencias de ectodominio de I L-6ROÍ de ratón con un fragmento genómico humano que codifica para secuencias de ectodominio de I L-6Ra humano para formar el gen para I L-6ROÍ humanizado.
En una modalidad, la sustitución es en un locus para I L-6Ra de ratón endógeno y el gen para IL-6Ro¡ humanizado está unido operablemente a las secuencias reguladoras de ratón endógeno.
En un aspecto se proporciona un ratón modificado genéticamente que comprende un gen para I L-6R humanizado que comprende una sustitución de la secuencia que codifica para el ectodominio de ratón con una secuencia de ectodominio humana, en donde el gen para IL-6ROÍ humanizado comprende una secuencia transmembranal de ratón y una secuencia citoplásmica de ratón; en donde el ratón comprende adicionalmente un gen que codifica para IL-6 humana, en donde el gen que codifica para IL-6 humana está bajo el control de los elementos reguladores de IL-6 de ratón endógeno.
En una modalidad, el ratón es incapaz de expresar I L-6Ra humano completo e incapaz de expresar IL-6 de ratón.
En diversos aspectos, los ratones modificados genéticamente que aquí se describen comprenden las modificaciones genéticas en su línea germinal.
En un aspecto se proporciona un tejido, célula o fragmento de membrana de un ratón como se describe en la presente .
En una modalidad, el tejido o célula es de un ratón que expresa una proteína I L-6 humana pero que no expresa una proteína IL-6 de ratón. En una modalidad, el tejido o célula es de un ratón que expresa una proteína IL-6Ra humanizada pero que no una proteína IL-6Ra de ratón. En una modalidad, la proteína I L-6ROÍ humanizada comprende un ectodominio humano y un dominio transmembranal de ratón y un dominio citosólico de ratón. En una modalidad, el tejido o célula es de un ratón que expresa una I L-6 humana, I L-6Ra humanizado y que no expresa un IL-6 de ratón y que no expresa un IL-6Ra que comprende un ectodominio de ratón.
En un aspecto, se proporciona un complejo ex vivo de una célula de ratón que presenta IL-6Ra humanizado (ectodominio humano y transmembrana de ratón y dominio citoplásmico de ratón) y una I L-6 humana.
En un aspecto, se proporciona un embrión de ratón que comprende una modificación genética como se describe en la presente.
En un aspecto se proporciona un embrión hospedador de ratón que comprende una célula donadora que comprende una modificación genética como se describe en la presente.
En un aspecto se proporciona una célula animal no humana pluripotente o totipotente que comprende una modificación genética como se describe en la presente. En una modalidad, la célula es una célula murina . En una modalidad, la célula es una célula ES.
En un aspecto, se proporciona un óvulo de ratón en donde el óvulo de ratón comprende un cromosoma de ratón ectópico, en donde el cromosoma de ratón ectópico comprende una modificación genética como se describe en la presente.
En un aspecto, el ratón, embrión, óvulo o célula que ha sido modificada genéticamente para comprender un gen para IL-6 humana o un gen para IL-6Ra humano o humanizado es de un ratón que es de la cepa C57BL que se selecciona de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/lOScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En otra modalidad, el ratón es una cepa 129 que se selecciona del grupo que consiste de una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129Sl/Svlm) , 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac) , 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10: 836, véase también, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6 -Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines) . En una modalidad específica, el ratón modificado genéticamente es una mezcla de la cepa 129 mencionada antes y la cepa C57BL/6 mencionada antes. En otra modalidad específica el ratón es una mezcla de las cepas 129 mencionadas antes o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas antes. En una modalidad específica, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac) . En otra modalidad, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. En otra modalidad adicional el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otro cepa mencionada antes. En una modalidad, el ratón es un ratón Swiss o Swiss Webster.
Cada uno de los aspectos y modalidades que aquí se describen son capaces de ser utilizadas juntas, a menos que se excluyan de manera explícita o clara del contexto de la modalidad o aspecto.
DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 proporciona una ilustración, no a escala, de los loci genómicos de IL-6 humana (arriba) y de ratón (abajo) . Los exones I, II, III, IV y V (tanto de humano como de ratón) están indicados por rectángulos cerrados a la derecha en la figura. Las regiones reguladoras putativas seleccionadas están indicadas por rectángulos abiertos a la izquierda en la figura.
La figura 2 muestra la respuesta en fase aguda (nivel mSAA) en presencia o ausencia de turpentina en ratones naturales, ratones IL-6R de ectodominio humanizado y ratones con genes para IL-6 e IL-6R humanizados.
La figura 3 muestra la respuesta en fase aguda dependiente de turpentina (SAA) en ratones naturales, la ausencia o presencia de anticuerpo anti IL-6R de ratón (izquierda) y la respuesta en fase aguda dependiente de turpentina en ratones IL-6/IL-R humanizados en ausencia o presencia de anticuerpo anti-IL-6R humano (derecha) .
La figura 4 muestra el análisis por FACS para linfocitos B esplénicos de ratones naturales y humanizados en IL-6; marcador de linfocitos B pan.
La figura 5 muestra el análisis FACS para linfocitos T esplénicos de ratones naturales y humanizados para IL-6; linfocitos T cooperadores (helper) y linfocitos T citotóxicos .
La figura 6 muestra el análisis por FACS para células esplénicas de ratones naturales y humanizados para IL-6; Ly6G/C(Grl) .
La figura 7 muestra el análisis por FACS para células esplénicas de ratones naturales y humanizados para IL-6; células NK y granulocitos (Ly6Ghi+/CDllbhi+) .
La figura 8 muestra el análisis por FACS para linfocitos B sanguíneos de ratones naturales y humanizados para IL-6; marcador de linfocitos B pan.
La figura 9 muestra el análisis por FACS para linfocitos T en sangre de ratones naturales y humanizados en IL-6; linfocitos T cooperadores y linfocitos T citotóxicos.
La figura 10 muestra el análisis por FACS para células mieloides de sangre de ratones naturales y humanizados en IL-6; células Grl+.
La figura 11 muestra el análisis por FACS para células mieloides de sangre de ratones naturales y humanizados en IL-6; CDllb versus Ly6G/C(Grl).
La figura 12 muestra el análisis por FACS para células mieloides de sangre de ratones naturales y humanizados en IL-6; células DX5 versus CDllb.
La figura 13 muestra el análisis por FACS de médula ósea IgM/CD24/B220 para ratones naturales y humanizados en IL-6. Arriba: progreso normal en médula ósea; abajo: análisis FACS para naturales, heterocigotos hIL-6 y homocigotos hIL-6 (tinción de IgM) .
La figura 14 muestra el análisis por FACS de médula ósea IgM/CD24/B220 para ratones IL-6 naturales y humanizados.
Arriba: progreso normal en médula ósea; abajo: análisis FACS para naturales, heterocigotos hIL-6 y homocigotos hIL-6 (tinción CD24) .
La figura 15 muestra el análisis por FACS de médula ósea CD43 y B20 para ratones naturales y humanizados en IL-6. Arriba: progreso normal en médula ósea. Abajo: análisis FACS para naturales, heterocigotos hIL-6 y homocigotos hIL-6 (tinción CD43) .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION IL-6 e IL-6R El receptor de IL-6 (IL-6R) ha sido caracterizado durante mucho tiempo como un receptor para un factor estimulador de linfocitos B (BSF-2 o factor 2 estimulador de linfocitos B; también GCDF o factor de diferenciación de linfocitos B) responsable de inducir que los linfocitos B sinteticen inmunoglobulina (Yamasaki et al. (1988) Cloning and Expression of the Human interleukin-6 (BSF-2 ( IF 2) Receptor, Science 241:825-828). Se describe por primera vez a IL-6 como interferón- ß2 como resultado de su descubrimiento durante la búsqueda de una proteína inducida viralmente denominada interferón- ß , al tratar fibroblastos humanos con ARNds poli (I) poli (C) para inducir una respuesta antiviral (Weissenbach et al. (1980) Two interferon mRNAs in human fibroblasts: In vitro translation and Escherichia coli cloning studies, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77 ( 12 ) -7152-7156 ; Keller efc al. (1996) Molecular and Cellular Biology of interleukin-6 and Its Receptor, Frontiers in Biosciences l:d340-357) .
El ADNc humano codifica para una proteína de 468 aminoácidos que tiene una secuencia de señal de 19 unidades y un dominio citoplásmico de aproximadamente 82 aminoácidos que carece de un dominio tirosina cinasa (véase, Id.) . La parte N-terminal (ectodominio) de la proteína tiene una superfamilia Ig de aproximadamente 90 aminoácidos, un dominio de 250 aminoácidos entre el dominio de superfamilia Ig y la membrana, y una transmembrana que abarca aproximadamente 28 aminoácidos (véase, Id.). El ectodominio del receptor une su ligando IL-6 el cual activa la asociación con gpl30 en la membrana y es este complejo el que conduce la transducción de señal; el dominio citoplásmico se afirma que no transduce señal (Taga et al. (1989) Interleukin-6 Triggers the Association of Its Receptor with a Possible Signal Transducer, gpl30, Cell 58:572-581). En realidad, una forma soluble de IL-6R que carece de un dominio citoplásmico se puede asociar con IL-6 y unir gpl30 en la superficie de una célula y transducir efectivamente la señal (Id) .
La homología de hIL-6R y mIL-6R a nivel de proteína es de solo aproximadamente 54%; el dominio transmembranal tiene una homología de aproximadamente 79% mientras que el dominio citoplásmico tiene una homología de aproximadamente 54% (Sugito et al. (1990).
El ligando natural para IL-6R, IL-6, se aislo por primera vez a partir de cultivos de linfocitos T transformados con HTLV-1 (véase, Hirano et al. (1985) Purification to homogeneity and characterization of human B cell differentiation factor (BCDF o BSFp-2), Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82:5490-5494). Un ADNc humano para el gen de IL-6 se clonó por lo menos dos veces, una vez como BSF-2 (véase, Hirano et al. (1086) Complementary DNA fro a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin, Nature 324:73-76) y una vez como IFNP2 (véase, Zilberstein et al. (1986) Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2 , a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines, EMBO 5:2529-2537), aunque desde entonces se ha demostrado que IL-6 humana recombinante no presenta afinidad detectable por IFN.
La IL-6 humana es una proteína de 184 aminoácidos que presenta solo aproximadamente 42% de homología con IL-6 de ratón, aunque la organización genómica de los genes humano y de ratón es básicamente la misma y las regiones promotoras de los genes humano y de ratón comparten un tramo de 400 pares de bases que está altamente conservado (véase Tanabe et al. (1988) Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene:High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol . 141 (11) :3875-3881) .
El gen para IL-6 humana es de aproximadamente 5 kb (Yasuka a et al. (1987) Structure and expression of human B cell stimulatory factor-2 (BSC-2/IL-6) gene, EMBO J. 6 (10) : 2939-2945) , mientras que el gen para IL-6 de ratón es de aproximadamente 7 kb (Tanabe et al. (1988) Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene:High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol. 141 (11) : 3875-3881) . Los genes para IL-6 de ratón y humana se ha informado que comparten una secuencia flanqueante 5 ' altamente conservada importante para regulación. En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático de los loci genómicos IL-6 humanas y de ratón (no a escala) . Los exones I, II, III, IV y V (tanto en humano como en ratón) están indicados por rectángulos cerrados a la derecha de la figura. Las regiones reguladoras putativas seleccionadas están indicadas por rectángulos abiertos a la izquierda en la figura. Las regiones reguladoras putativas para humanos son, de izquierda a derecha, un elemento glucocorticoide de -557 a -552; una secuencia de núcleo mej orador de IFN de -472 a -468; un elemento glucocorticoide desde -466 a -461; una región rica en AT desde -395 a -334, un sitio de unión AP-1 de consenso de -383 a -277; una secuencia de núcleo mejorador de IFN de -253 a -248; un motivo que contiene GGAAA de -205 a -192; una secuencia de homología SRE de c-fos de -169 a -82 que contiene una secuencia de núcleo mejorador de IFN, un elemento de respuesta AMPc, un motivo GGAAA, un rectángulo CCAAT, y una región rica en GC; y un sitio de unión AP-1 desde -61 hasta -55; y un rectángulo CCAAT desde -34 hasta -30. Las regiones reguladoras putativas para ratón son, de izquierda a derecha una región rica en GC desde -553 hasta -536, un elemento glucocorticoide desde -521 hasta -516 y desde -500 hasta -495; un tramo de ADN-Z desde -447 a -396; un sitio de unión AP-1 que se superpone a una secuencia de núcleo mejorador de IFN de -277 a -288, un motivo GGAAA que se superpone a una secuencia de núcleo mejorador de IFN de -210 a -195; una región de homología SRE c-fos de -171 a -82 que contiene un elemento de respuesta AMPc; un motivo GGAAA que superpone una secuencia de núcleo mejorador de IFN y una región rica en GC; y un sitio de unión AP-1 de -61 a -55. Los codones de ratón I-V tienen longitudes de 19, 185, 114, 150 y 155, respectivamente. Las longitudes de intrón de ratón con I-II, 162 pb, II-III, 1253 pb; III-IV 2981 pb; IV-V, 1281 pb . Los codones I-V humanos tienen longitudes de 19, 191, 114, 147 y 165. Las longitudes de intrón humano son I-II, 154; II-III, 1047; III-IV, 706; IV-V, 1737. Los datos de organización genómica son de Tanabe et al. (1988) y Yasukawa et al. (1987) Structure and expressxon of human B cell stimulatory factor-2 (BSF-2/IL-6) gene, EMBO J. 9 (10) : 2939-2945.
Puede ser razonable suponer que los genes de IL-6 de ratón y humano parecen estar regulados de modo similar en base en la similitud de sus secuencias flanqueantes 5'. Una diversidad de tipos de célula presentan expresión aumentada de IL-6 en respuesta a IL-1, TNF, PDGF, ?? ß, suero, poli (I) poli (C) y cicloheximida (véase Tanabe et al. (1988)). IL-6 en humanos media la respuesta en fase aguda, hematopoyesis, diferenciación de linfocitos B, activación de linfocitos T, crecimiento y/o diferenciación y/o activación de una diversidad de tipos de células (por ejemplo, hepatocitos, fibroblastos, células endoteliales , neuronas, células de la hipófisis, linfomas, mielomas, carcinomas de mama, células K, macrófagos, osteoclastos, etc.) (revisado, por ejemplo, en Heinrich et al. (1990), Kishimoto et al. (1989), and Keller et al. (1996); Sugita et al. (1990) Functional Murine Interleukin Receptor with Intracisternal A Particle Gene Product at its Cytoplasmic Domain, J. Exp. Med. 171 :2001-2009) .
No obstante, en la práctica, los ratones transgénicos para IL-6 humana presentan una gama de patologías sustanciales y debilitantes, que reflejan una pleiotropia significativa del gen IL-6. Los ratones transgénicos que comprenden un fragmento de 6.6 kb que contiene el gen IL-6 humana y un mejorador µ (?µ) producen altas concentraciones de hIL-6 y niveles extremadamente altos de IgGl (120- a 400 veces con respecto a los ratones naturales) , lo que refleja una pérdida de regulación de IL-6 que es acompañada por plasmacitosis , glomerulonefritis mesangioproliferativa y niveles de megacariocitos en médula ósea elevados (Suematsu et al. (1989) IgGl plasmacytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86:7547-7551). La regulación aberrante de IL-6 y/o IL-6R se asocia con mielomas, plastocitomas , artritis reumatoide, enfermedad de Castleman, glomerulonefritis proliferativa del mesangio, mixoma cardíaco, neoplasias de células plasmáticas, psoriasis y otros trastornos (véase Kishimoto, T. (1989) The Biology of interleukin-6 , Blood 74(1):1-10; Sugita et al. (1990); también, Hirano et al. (1990) Biological and clinical aspects of interleukin 6, Immunology Today 11 (12) :443-449) ) : También se ha implicado a IL-6 en niveles sostenidos de andrógenos intraprostáticos durante un tratamiento con supresión de andrógenos de pacientes con cáncer de próstata por un mecanismo paracrino y/o autocrino lo que proporciona potencialmente crecimiento de tumor de próstata resistente a la castración (Chun et al. (2009) Interleukin-6 Regulates Androgen Synthesis in Prostate Cáncer Cells, Clin. Cáncer Res. 15 =4815-4822) .
La proteína humana es codificada como una proteína de 212 aminoácidos, en forma madura una proteína de 184 aminoácidos posterior a la separación de una secuencia de señal de 28 aminoácidos. Contiene dos sitios de N-glucosilación y dos de O-glucosilación, y la IL-6 humana está fosforilada en algunas células. La proteína de ratón es codificada como una proteína de 211 aminoácidos, en forma madura una proteína de 187 aminoácidos después de separación de una secuencia de señal de 23 aminoácidos. Los sitios de O-glucosilación están presentes, pero no los sitios de N-glucosilación (Véanse revisiones respecto a IL-6, por ejemplo, Heinrich et al. (1990) Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265:621-636).
La función de IL-6 es pleiotrópica . El receptor de IL-6 se encuentra sobre linfocitos B activados pero se ha informado que no sobre linfocitos B en reposo. En contraste, IL-6R se encuentra en linfocitos T en reposo y se ha reportado que promueve la diferenciación, activación y proliferación de linfocitos T, que incluyen la diferenciación de linfocitos T en linfocitos T citotóxicos en presencia de IL-2.
Ratones con ectodominio IL-6/IL-6R humanizados y respuesta en fase aguda mediada por IL-6 En humanos, IL-6 induce respuesta en fase aguda. Los primeros estudios con hepatocitos humanos establecieron que IL-6 induce proteínas de fase aguda tales como, por ejemplo, proteína C reactiva (CRP, por sus siglas en inglés) y amiloide A sérico (SAA, por sus siglas en inglés) de una manera que depende de la dosis y que depende del tiempo (revisado en Heinrich et al. (1990) interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265:621-636). Los animales no humanos, por ejemplo ratones o ratas que comprenden genes para IL-6 e IL-6R humanizados por lo tanto son sistemas útiles para medir la respuesta en fase aguda mediada por IL-6 humana. Estos animales también son útiles para determinar si una sustancia induce una respuesta en fase aguda mediada por IL-6, al exponer un animal IL-6/IL-6R humanizado como se describe en la presente a la sustancia y al medir un nivel de una o más proteínas (o los ARN) de respuesta en fase aguda. En una modalidad, el animal humanizado se expone a la sustancia en presencia de un antagonista de un IL-6R humano, y se mide un nivel de una o más proteínas de respuesta en fase aguda (o los ARN) en donde una reducción en un nivel de una proteína de respuesta en fase aguda (o ARN) en la presencia del antagonista de IL-6R humano indica una respuesta en fase aguda mediada por IL-6R humano .
IL-6 humana se puede unir tanto a IL-6R humano como IL-6R de ratón; IL-6 de ratón se une a IL-6R de ratón pero no a IL-6R humano (no hay unión detectable de mIL-6 con hIL-6R, mientras que hIL-6 puede competir con mIL-6 por unión a mlL-6R; Coulie et al. (1989) High- and low-affinity receptors for murine interleukin 6. Distinct distributionon B and T cells.
Eur. J. Immunol . 19:2107-211); véase también, por ejemplo, Peters et al. (1996) The Function of the Soluble interleukin 6 (IL-6) Receptor In Vivo: Sensitization of Human Soluble IL-6 Receptor Transgenic ice Towards IL-6 and Prolongation of the Plasma Half-life of IL-6, J. Exp. Med. 183:1399-1406). De esta manera, las células humanas que presentan hIL-6R en un ratón (por ejemplo, en un transplante xenogeneico) no se pueden basar en mIL-6 endógeno para llevar a cabo funciones mediadas por IL-6, lo que incluye pero que no se limita al papel de células sanguíneas para IL-6 o desarrollo de linfocitos (por ejemplo, hematopoyesis, activación de linfocitos B, activación de linfocitos T, etc.).
En un sistema in vivo mixto que comprende el gen para IL-6 de ratón natural y un gen para IL-6R humano (pero no el gen IL-6R de ratón) , no se espera que un inductor de respuesta en fase aguda induzca niveles detectables de proteínas en fase aguda que puedan indicar una respuesta en fase aguda. No obstante, un ratón humanizado como se describe en la presente que comprende un gen IL-6 humanizado y un gen IL-6R que comprende una secuencia de ectodominio humanizado responderá a un inductor de respuesta en fase aguda y presentará proteínas de respuesta de fase aguda en suero. Los ratones naturales para IL-6/IL-6R probados para proteínas en fase aguda en presencia o ausencia de inductor de fase aguda turpentina muestran un incremento dependiente de turpentina en proteínas en fase aguda. Los ratones con el gen IL-6 humanizado pero no con IL-6R no muestran respuesta en fase aguda en presencia de turpentina. Pero ratones que presentan tanto el gen para IL-6 humana como el gen para IL-6R con un ectodominio humanizado presentan una respuesta en fase aguda fuerte (figura 2) . La respuesta en fase aguda mediada por IL-6 es dependiente de IL-6 tanto en ratones naturales (figura 3, arriba) como en ratones con ectodominio IL-6/IL-6R humanizado (figura 3, abajo) como se vuelve evidente por la capacidad del anticuerpo anti-IL-6R apropiado para suprimir la respuesta en fase aguda a una dosis de anticuerpo suficientemente alta. De esta manera, una humanización doble de IL-6 e IL-6R recapitula la respuesta en fase aguda mediada por IL-6 natural con respecto a las proteínas en fase aguda séricas .
Ratones Modificados Genéticamente Se proporcionan ratones modificados genéticamente que expresan una IL-6 humana y/o un receptor de IL-6 humanizado a partir de los loci de ratón endógenos, en donde el gen para IL-6 de ratón endógeno y/o el gen del receptor de IL-6 de ratón endógeno se han sustituido con una secuencia para el gen de IL-6 humana y/o una secuencia humana que comprende la secuencia que codifica para un ectodominio de un receptor IL-6 humana. Los ratones modificados genéticamente expresan IL-6 humana y/o el receptor de IL-6 humanizado a partir de los loci endógenos humanizados que están bajo el control de promotores de ratón y/o elementos reguladores de ratón. Una o varias sustituciones en los loci de ratón endógenos proporcionan animales no humanos que expresan IL-6 humana y el receptor de IL-6 humanizado de una manera que no resulta en la gama de patologías sustanciales observadas en ratones transgénicos a IL-6 que se conocen en el ámbito.
Los ratones transgénicos que expresan IL-6 humana se conocen en el ámbito. No obstante, generalmente adolecen de patologías significativas que limitan gravemente su utilidad. Los ratones humanizados como se describen en la presente expresan una IL-6 humana y/o receptor de IL-6 humanizado bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos en los loci para IL-6 e IL-6Ra de ratón endógenos. Estos ratones, en contraste, presenten patrones de expresión con respecto a estos genes que son diferentes de ratones transgénicos conocidos en el ámbito.
La sustitución de genes no humanos en un animal no humano con genes humanos homólogos u ortólogos o secuencias humanas en los locus no humanos endógenos y bajo el control de promotores endógenos y/o elementos reguladores puede resultar en un animal no humano con calidades y características que pueden ser sustancialmente diferentes de un animal con bloqueo de expresión-más-transgen típico. En un animal con bloqueo de expresión-más-transgen típico un locus endógeno se remueve o se daña y el transgen completamente humano se inserta en el genoma del animal y probablemente se integre de manera aleatoria en el genoma. Típicamente, la ubicación del transgen integrado no se conoce; la expresión de la proteína humana se mide por transcripción del gen humano y/o análisis de proteína y/o análisis funcional. La inclusión en el transgen humano de secuencias humanas dirección 5' y/o dirección 3' aparentemente se suponen que son suficientes para proporcionar soporte adecuado para expresión y/o regulación del transgen sin importar si en el genoma del animal el transgen se ha enrollado. Pero en muchos casos, el transgen con elementos reguladores humanos se expresa de una manera que es no fisiológica o que de otra manera no es satisfactoria y en realidad puede ser perjudicial para el animal. En contraste, los inventores demostraron que la sustitución con secuencia humana en el locus endógeno bajo el control de elementos reguladores endógenos proporciona un patrón de expresión fisiológicamente apropiado y un nivel que resulta en un animal humanizado útil cuya fisiología con respecto al gen sustituido tiene el significado y es apropiada y en contexto de la fisiología animal humanizada. Óvulos de ratón fertilizados inyectados con una construcción que tiene el promotor H2 de CPH clase I y un intrón de ß-globina impulsa la expresión de un gen para IL-6 de ratón de 695 pb se informa que produce ratones que expresan de manera constitutiva IL-6 de ratón a niveles relativamente altos (en comparación con un ratón natural) (véase Woodrofe et al. (1992) Long-Term Consequences of interleukin-6 Overexpression in Transgenic Mice, DNA nd Cell Biology 11 (8) : 587-592) . No obstante, estos ratones son susceptibles a desarrollar linfomas asociados con los intestinos, nodulos linfáticos y riñon así como depósitos amiloides esplénicos. También presentan maduración anormal de linfocitos B (véase, Woodrofe et al., Id.), de manera que los estudios de la función de linfocitos B está deteriorada. En contraste, ratones como se describen en la presente que comprenden una sustitución del gen para IL-6 de ratón con un gen para IL-6 humana en el locus de IL-6 de ratón no son susceptibles a desarrollar estos linfomas y los ratones aparentemente presentan poblaciones normales de linfocitos B.
Los ratones (C57BL/6) transgénicos para hIL-6 debido a una inserción aleatoria de una longitud de 6.6 kb (fragmento BamHl-Pvu II) de ADN humano que contiene el gen para hIL-6 acoplado con un mej orador de IgM ha sido reportado (véase, Suematsu et al. (1989) IgGl plasmocytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc . Nati. Acd. Sci. USA 86:7547-7551). Los ratones que expresan hIL-6 entre 800 pg/ml y 20,000 pg/ml en suero, en donde los ratones naturales habitualmente expresan solo aproximadamente 100 pg/ml de IL-6. Los ratones que presentan un incremento en Ig sérica (120 a 400 veces sobre ratones naturales) y una disminución en albúmina conforme envejecen. Los ratones padecen de plasmacitosis masiva, presentan esplenomegalia y agrandamiento de nodulos linfáticos así como presentación de células plasmáticas y megacariocitos aumentados en médula ósea. Al realizar una inspección, lo que parecen ser nodulos linfáticos agrandados en realidad son masas de células plasmáticas anormales compactadas. Tanto el bazo como el timo presentan proliferación masiva de células plasmáticas lo cual también infiltra porciones del pulmón, hígado y riñon. Los ríñones en estos ratones también presentan proliferación de células de mesangio estimulada por IL-6 típica de glomerulonefritis proliferativa del mesangio. De manera similar, ratones transgénicos (BALB/c) para un ADNc para hIL-6 recortado activado por el promotor H-2Ld de ratón insertado aleatoriamente en el genoma presentan plasmacitosis grave (véase Suematsu et al. (1992) Generation of plasmacytomas with the chromosomal translocation t(12; 15) in interleukin 6 transgenic mice, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:232-235). Aunque los ratones C57BL/6 que sobreexpresan hIL-6 no desarrollan plasmacitomas transplantables (no presentan plasmacitosis) , los ratones transgénicos BL/6 retrocruzados en ratones BALB/c se ha reportado que si lo hacen .
La transgénesis aleatoria de ADNc para hIL-6 activada por el promotor del gen para proteína ácida fibrilar de la neuroglia (GFAP, por sus siglas en inglés) se ha informado que resulta en sobreexpresión de hIL-6 en el sistema nervioso central de ratón, lo que también lleva a patologías significativas (véase Campbell et al. (1993) Neurologic disease induced in transgenic mice by cerebral overexpression of interleukin 6, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 90:10061-10065). Estos ratones presentan neuropatología extensa y astrocitosis reactiva que resulta de la expresión de IL-6 en el SNC debido a pérdida de control como resultado de integración aleatoria de un transgen en un locus transcripcional aparentemente permisivo de SNC. Aunque la expresión de ADNc para hIL-6 unido a una 31 -UTR de ß-globina y activada por un promotor de enolasa específico de neurona microinyectado en óvulos de ratón fertilizados (Fl C57BL/6 x BALB/c) produce ratones con una duración de vida normal y sin defectos neurológicos aparentes que expresen hIL-6 en neuronas pero no en otra parte (véase Fattor et al. (1994) IL-6 Expression in Neurons of Transgenic Mice Causes Reactive Astrocytosis and Increase in Ramified Microglial Cells But No Neuronal Damage, Eur, J. Neuroscience 7:2441-2449), los ratones presentaron altos niveles (20 a 30 veces superiores en comparación con los naturales) de astrocitos activados y agrandados con procesos aumentados en todo el cerebro, así como un incremento de 10 a 15 veces en células de microglia ramificadas en la materia blanca. De esta manera, la expresión de IL-6 se ha informado que genera condiciones que varían de astrocitosis reactiva hasta neuropatología franca y profunda .
La microinyección en óvulos fertilizados de una cruza Fl de ratones C57BL/6x "DBAII " de ADN para hIL-6 de 639 pares de bases unido a 3 ' -UTR de ß-globina y un promotor MT-1 de ratón se ha reportado que produce un ratón transgénico en el cual el gen hIL-6 se integra aleatoriamente produciendo un ratón debilitado y enfermo que muere joven por falla renal (véase Fattori et al, (1984) Blood, Development of Progressive Kidney Damage and Myeloma Kidney in interleukin-6 Transgenic Mice, Blood 63 (9) : 2570-2579) . Los ratones transgénicos mueren a las 12-20 semanas y presentan niveles elevados de globulinas al y ß en plasma, hipergammaglobulinemia, megacariocitos elevados en bazo (3 veces mayores que los naturales) y médula ósea, plasmacitosis de órganos linfoides (bazo, timo y nodulos linfáticos) caracterizado por células plasmocitoides anormales y distribuidas de manera compacta y glomerulonef itis lo que genera glomeruloesclerosis similar a mieloma múltiple.
La microinyección en óvulos fertilizados de un ratón C57BL/6J de un ADNc para hIL-6 activado por H-2Ld provoca agotamiento muscular dependiente de IL-6 en ratones, caracterizado en parte por un peso significativamente menor del músculo gastrocnemio en ratones transgénicos en comparación con controles pareados en peso, una diferencia que disminuye por tratamiento con un antagonista de IL-6 (véase, Tsuj inaka et al (1996) interleukin 6 Receptor Antibody inhibits Muscle Atrophy and Modulates Proteolytic Systems in interleukin 6 Transgenic Mice, J. Clin. Invest . 97 (1) : 244-249) . A las 12 semanas, estos ratones muestran niveles de hIL-6 en suero de más de 600,000 pg/ml . Los ratones transgénicos también presentan hígados que pesan aproximadamente 1242 mg en comparación con hígados control que pesan aproximadamente 862 mg. Los ratones transgénicos tratados con antagonista de IL-6 presentan hígados que pesan aproximadamente 888 mg. Las catepsinas de músculo B y B+L son significativamente mayores (20 veces y 6.2 veces) en ratones transgénicos en comparación con los controles, un fenómeno que se elimina en ratones transgénicos tratados con un antagonista de IL-6. Los ARNm para catepsina B y L se calcula que son aproximadamente 277% y 257%, respectivamente, en comparación con ratones naturales; la diferencia se reduce de manera significativa con un tratamiento con antagonista de IL-6.
Ratones que comprenden un minigen para hIL-6 activado por un promotor H-2Ld de CPH clase I de ratón y un minigen para hIL-6R activado por un promotor ß-actina de pollo y un gen gpl30, presentan patologías típicas de ratones transgénicos para hIL-6 (por ejemplo, hipergammaglobulinemia, esplenomegalia, glomerulonefritis proliferativa del mesangio, infiltración linfoide pulmonar) así como hipertrofia ventricular (Hirota et al. (1995) Continuos activation of gpl30, a signal-transducing receptor component for interleukin 6-related cytokines, causes myocardial hypertrophy in-mice, Proc-Natl Acad. Sci. USA 92:4862-4866). Se considera que la hipertrofia ventricular es mediada por una activación continua de gpl30 (Id.) . El papel de IL-6 se ha reportado que ayuda en reforzar el complejo de receptor de citocina e induce dimerización de gpl30, el cual es el componente transductor de señal responsable para transducir la señal de IL-6 (Paonessa et al. (1995) Two distinct and independent sites on IL-6 trigger gpl30 dimer formation and signal, EMBO J. 14 (9) : 1942-1951) . El complejo activado se considera que es un hexámero constituido de dos IL-6, cada IL-6 unido a un IL-6R y dos gpl30 (cada IL-6 contiene dos sitios de unión gpl30 independientes) que presenta una estequiometría 2:2:2 en donde la dimerización de gpl30 provoca la activación de tirosina cinasas JAK-Tyk, fosforilación de gpl30 y factores de transcripción de la familia STAT y otros sustratos intracelulares (Id.; Stahl, N. (1994) Association and Activation of Jak-Tyk Kinases by CNTF- LIF-0SM-IL-6 ß Receptor Components, Science 263:92-95), consistentes con un modelo general de formación de complejo de receptor de citocina (véase Stahl N. and Yancopoulus, G. (1993) The Alphas, Betas, and Kinases of Cytokine Receptor Complexes, Cell 74:587-590; Davis et al. (1993) LIFR and gpl30 as Heteridimerizing Signal Transducers of the Tripartite CNFT Receptor, Science 260:1805-1808; Murakami et al. (1993) IL-6-induced Homodimerization of gpl30 and Associated Activation of a Tyrosine Kinase, Science 2601808-1810) .
Los ratones transgénicos para SIL-6R humano activados por un promotor de carboxicinasa PEP de rata e IL-6 humana activada por un promotor de metalotioneina-1 de ratón se ha reportado que son notablemente más pequeños que los ratones transgénicos para IL-6 humana solo o SIL-6R humano solo (Peters efc al. (1997) Extramedullary Expansión of Hematopoietic Progenitor Cells in Interleukin ( IL- ) 6 -SIL-6R Double Transgenic Mice, J. Ex . ed. 185 (4) : 755-766) , lo que se refleja en grasa corporal reducida y un peso reducido (20 a 25 g versus 40 g) . Los ratones transgénicos dobles se ha reportado que también presentan agrandamiento del bazo (5 veces) y del hígado (2 veces) en comparación con pesos de órganos que se han reportado normales para ratones transgénicos únicos, debido aparentemente a una proliferación extramedular de células hematopoyéticas de bazos e hígado pero no de médula ósea así como megacariocitos elevados en bazo e infiltrados plasmacelulares en todos los órganos del parenquima (Id.) . Los animales transgénicos dobles también presentan hígados con un incremento de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 veces en granulocitos , macrófagos, células progenitoras y linfocitos B en comparación con animales transgénicos únicos; en contraste, los animales transgénicos únicos IL-6 presentan incrementos menores en macrófagos (15 veces) y linfocitos B (45 veces) (Id.). Los hallazgos extraordinarios probablemente se deben a estimulación de crecimiento y diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas al activar la transducción de señal gpl30 (Id. ) .
Además, los ratones transgénicos dobles (ratón hIL-6 activado por promotor de metalotionina/hIL-6R activado por promotor de PEP carboxicinasa de rata) presenta una hiperplasia hepatocelular que se ha reportado que es idéntica a hiperplasia regenerativa nodular humana con proliferación sostenida de hepatocitos que sugiere fuertemente que IL-6 es responsable tanto de la proliferación de hepatocitos como de transformación hepatocelular patogénica (Maione et al. (1998) Coexpression of IL-6 and Soluble IL-6R causes nodular regenerative huperplasia and adenomas of the liver, EMBO J. 17 (19) : 5588-5597) . Debido a que la hiperplasia hepatocelular se reporta que no se observa en ratones hIL-6 transgénicos únicos y hIL-6 puede unir mIL-6R, el hallazgo puede padecer paradójico hasta que se considera que el animal transgénico doble puede resultar en niveles más altos de hIL-6 que forma complejos con IL-6R solubles (aquí, hIL-6R solubles) , complejo el cual es un inhibidor más potente que IL-6 solo (Id.) .
En contraste con ratones que son transgénicos para IL-6 humana, los ratones con IL-6 humanizada que comprenden una sustitución en un locus de IL-6 de ratón endógeno, los cuales retienen elementos reguladores de ratón pero que comprenden una humanización de la secuencia codificante para IL-6 no presentan patologías graves de los ratones de la técnica anterior. Los ratones modificados genéticamente que son heterocigotos u homocigotos para hIL-6 crecen de manera aproximadamente normal.
Los ratones con el gen para IL-6 humanizado (MAID 760) como se describen en los ejemplos son inmunofenotipificados y se encuentra que tienen números normales de linfocitos B en el análisis FACS (con compuerta para linfocitos) de linfocitos B de bazo utilizando un marcador de linfocitos B pan (CD445R (B220) ) (figura 4). Para el bazo, los ratones naturales presentan 63% de linfocitos B; los ratones heterocigotos hIL-6 presentan 63% de linfocitos B; y los ratones homocigotos para hIL-6 en el locus de ratón endógeno presentan 63% de linfocitos B. Los números de linfocitos B para ratones hIL-6 homocigotos inmunizados con TP-KLH también son normales (65% para normales y 61% para homocigotos hIL-6) .
Los linfocitos T esplenicos también son aproximadamente los mismos que los normales (figura 5) . Los porcentajes de linfocitos T esplenicos para linfocitos T cooperadores/T citotóxicos son, para normales, 20%/40% (relación de 1.4:1); para hIL-6 heterocigotos 23%/14% (relación de 1.6:1) para homocigotos de hIL-6 21%/15% (relación de 1.4:1) (los marcadores son CD8a-APC; CD4-FITC) . Los ratones hIL-6 homocigotos inmunizados con TNP-KLH presentan números de linfocitos T esplénicos similares que los ratones naturales, es decir, los linfocitos T cooperadores/T citotóxicos son 22%/20% (relación de 1.1:1) en comparación con 21%/19% para los normales (también una relación de 1.1:1).
Los ratones IL-6 humanizados también presentan niveles aproximadamente normales de células NK esplénicas, en un análisis FACS (CDllb y DX5) (figura 7) . Los heterocigotos hIL-6 presentan células NK 2.2% y los homocigotos hIL-6 presentan células NK 1.8% mientras que los ratones naturales presentan células NK 2.4%. Después de inmunización con TNP-KLH, los homocigotos presentan 1.6% de células NK esplénicas mientras que los ratones naturales presentan 2.1% de células NK esplénicas.
Los ratones IL-6 humanizados también presentan niveles normales de células esplénicas Ly6G/C(Grl) (figura 6). Los heterocigotos de hIL-6 presentan 7.0% de células Grl+ (1.3% Grlhl) ; los homocigotos presentan 6.8% de células Grl+ (0.9% Grl ) , mientras que los ratones naturales presentan 8.0% de células Grl+ (1.8% Grlhi) . Los homocigotos de IL-6 inmunizados (inmunizados con TNP-KLH) presentan 11% de células Grl+ (4.0 Grlhl) , mientras que los ratones naturales presentan 10% de células Grl+ (3.0% Grlhi) .
Los ratones IL-6 humanizados también presentan cantidades de linfocitos B y T en sangre normales, en análisis FACS (figura 8 y figura 9) . Los FAC con el marcador de linfocitos B pan (CD445R (B220 ) muestra que los ratones hIL-6 homocigotos presentan 52% de linfocitos B en comparación con los naturales, 53%; los heterocigotos presentan 38% (un promedio de dos tinciones diferentes de 29% y 47%) . Los ratones hIL-6 homocigotos inmunizados con TNP-KLH proporcionan números de linfocitos T similares (43%, en comparación con 45% para ratones naturales) .
Los ratones IL-6 humanizados presentan números de linfocitos T en sangre normal en análisis FACS medido por tinción CD8a y CD4. Los ratones hIL-6 heterocigotos presentan números de T cooperadores/T citotóxicos de 39%/26% (relación de 1.5:1); los ratones hIL-6 homocigotos presentan números Th/Tc de 24%/20% (relación de 1.2:1), mientras que los ratones naturales presentan números Th/Tc de 26%/20% (relación de 1.3:1). Los ratones hIL-6 homocigotos inmunizados con TNP-KLH presentan números Th/Tc de 29%/21% (relación de 1.4:1) mientras que los ratones inmunizados naturales presentan números Th/Tc de 28%/23% (1.2:1).
Los ratones IL-6 humanizados también presentan números de células mieloides en sangre que son similares a los ratones naturales, medidos por análisis FACS de sangre de ratones previamente no expuestos e inmunizados teñida con Ly6G/C(Grl) y CDllb, así como CDllb y DX5 (figura 10, figura 11 y figura 12) . Los ratones hIL-6 heterocigotos presentan % de células Gr+ de 10.8%, homocigotos de 6.9% mientras que los ratones naturales presentan 9.7%. Los homocigotos para hIL-6 inmunizados presentan MI (Ly6G/C (Gr) de ??^??4) /M2 (Ly6G/C (Gr) tinción de aproximadamente 102-103) números de 43%/34% mientras que los ratones naturales presentan números de 45%/38%. Las gráficas de FACS para Cllb (eje vertical) versus Ly6G/C (eje horizontal) para ratones hIL-6 homocigotos inmunizados muestra el porcentaje de células en cuadrantes (superior izquierdo/superior derecho/inferior derecho) de 16%/8%/3%, lo cual es idéntico a números de cuadrante naturales inmunizados.
Los ratones IL-6 humanizados, inmunizados con TNP-KLH homocigotos presentan gráficas FACS de tinción CDllb versus DX5 (NK) que son similares a ratones naturales. Las gráficas FACS de sangre del cuadrante de análisis (CDllb en el eje vertical, DX5 (NK) en el eje horizontal) muestra números de la parte superior izquierda/superior derecha/inferior derecha de 9.5%/l7%/l0% para homocigotos a hIL-6 y 6.5%/17.3%/14% para ratones naturales.
Los ratones IL-6 humanizados presentan una respuesta de isotipo que es esencialmente la misma que la observada en ratones naturales. Los niveles tempranos y finales de IgGl , IgG2a, IgG2b, IgG3 , IgA, IgE e IgM son aproximadamente los mismos a los observados en ratones naturales. En un experimento la IgM final es ligeramente más alta en ratones humanizados; la IgG3 final también está elevada en ratones humanizados.
El desarrollo de linfocitos B en ratones hIL-6 previamente no expuestos es esencialmente indiferenciable del desarrollo en ratones naturales en base en el análisis FACS de médula ósea con tinción IgM/CD24/B220 (figura 13) . La inmunofenotipifación de ratones inmunes mostró que las poblaciones de marcador para diversos tipos de células en el progreso de desarrollo de linfocitos B son esencialmente normales en ratones hIL-6. El progreso de células a partir de blastocitos hematopoyéticos, progenitores linfoides comunes, linfocitos pro B, linfocitos pre B y linfocitos B inmaduros y maduros es normal en ratones hIL-6 (figura 14 y figura 15) .
EJEMPLOS EJEMPLO 1; SUSTITUCIÓN DEL GEN IL-6 DE RATÓN ENDÓGENO CON EL GEN hIL-6 El gen IL-6 humana de 4.8 kb contiene exones 1 a 4 del gen para IL-6 humana sustituye a 6.8 kb del locus del gen IL-6 murino.
Una construcción dirigida para sustituir el ratón con el gen IL-6 humana en una etapa de direccionamiento única se construye utilizando tecnología de ingeniería genética VELOCIGENEMR (véase Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotech 21:652-659). El ADN para IL-6 de ratón y humano se obtiene del cromosoma artificial bacteriano (BAC, por sus siglas en inglés) RPCI-23 clon 368C3 y de BAC CTD clon 2369M23, respectivamente. Brevemente, una construcción dirigida no linealizada generada por clonación de reparación de separación que contiene IL-6 de ratón dirección 5' y dirección 3' de brazos de homología flanqueando una secuencia de IL-6 humana de 4.8 kb que se extiende desde ATG en el exon 1 al exon 5 con 16 nucleótidos de la secuencia dirección 3' 3' (coordenadas genómicas: NCBIh37.1: ch7 : 22 , 766 , 882 A 22,771,637) y un cásete de selección neo floxed se someten a electroporación en blastocitos (ES) embriónicos de ratón F1H4 (híbrido Fl, C57BL/6 x 129) . Las células ES dirigidas correctamente (MAID 790) se someten a electroporación adicional con un vector que expresa Cre transitorio para eliminar el cásete de selección de fármaco. Los clones de células ES dirigidas sin el cásete de fármaco (MAID 1428) se introducen en un embrión de ratón en etapa de 8 células por el método VELOCIMOUSEMR (véanse las patentes de US números 7,294,754, 7,576,259 y 7,659,442 y Poueymirou et al. (2007) FO generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25 (1) : 91-99) . VELOCIMICEMR (ratones FO completamente derivados de células ES donadoras) presentan el gen IL-6 humanizado y se identifican por determinación de genotipo para pérdida del alelo de ratón y ganancia del alelo humano utilizando una modificación del análisis de alelo (véase Valenzuela et al. (2003) ) .
Los clones de células ES dirigidos correctamente se identifican por un análisis de pérdida del alelo nativo (LONA, por sus siglas en inglés) (Valenzuela et al. (2003) en el cual el número de copias del gen 116 no modificado nativo se determina por dos reacciones en cadena de polimerasa cuantitativas (qPCR) TaqManMR específicas para secuencias en el gen 116 de ratón que son dirigidos por supresión. Los análisis qPCR comprenden los siguientes conjuntos de sonda cebadora (escrita 5' a 3'): cebador directo dirección 5', TTGCCGGTTT TCCCTTTTCT C (SEC ID NO : 1); cebador inverso dirección 5', AGGGAAGGCC GTGGTTGTC (SEC ID NO: 2); sonda dirección 5', FAM-CCAGCATCAG TCCCAAGAAG GCAACT-BHQ (SEC ID NO: 3); cebador directo dirección 3', TCAGAGTGTG GGCGAACAAA G (SEC ID NO: 4), cebador inverso dirección 3', GTGGCAAAAG CAGCCTTAGC (SEC ID NO : 5), sonda dirección 3', FAM- CATTCCAGG CCCTTCTTAT TGCATCTG-BHQ (SEC ID NO: 6); en la cual FAM se refiere a una sonda fluorescente de 5-carboxifluoresceína y BHQ se refiere a un extintor de fluorescencia del tipo de extintor de orificio negro (Biosearch Technologies) . El ADN purificado a partir de clones de células ES que han captado el vector dirigido y lo han incorporado en sus genomas se combinan con TaqManMR Gene Expression Master Mix (Life Technologies) de acuerdo con las sugerencias del fabricante en una placa de PCR de 384 pozos (MicroAmpMR Optical 384-Well Reaction Píate, Life Technologies) y se ciclan en un equipo Applied Biosystems Prism 7900HT, el cual recolecta datos de fluorescencia durante el curso de las PCR y determina un ciclo umbral (Ct) , el ciclo de PCR fraccionario en el cual la fluorescencia acumulada alcanza un umbral preestablecido. Las qPCR específicas para 116 dirección 5' y dirección 3' y dos qPCR para genes de referencia no dirigidos se corren para cada muestra de ADN. Se calculan las diferencias en los valores Ct (ACt) entre cada qPCR específica para IL6 y cada gen de referencia qPCR y después se calcula la diferencia entre cada ACt y la mediana de ACt para todas las muestras analizadas se calcula para obtener valores ñACt para cada muestra. El número de copia del gen IL6 en cada muestra se calcula para la siguiente fórmula: número de copias = 2 2"AACt. Un clon dirigido correctamente, que ha perdido una de sus copias nativas tendrá un número de copias de gen IL6 igual a uno. La confirmación de que la secuencia del gen IL6 humano sustituya la secuencia de gen IL6 de ratón suprimido en el alelo humanizado se confirma por un análisis qPCR TaqManMR que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos 5' a 3'): el cebador directo humano, CCCCACTCCACTGGAATTTG (SEC ID NO: 7); el cebador inverso humano, GTTCAACCACAGCCAGGAAAG (SEC ID NO: 8) ; y la sonda humana, FAM-AGCTACAACTCATTGGCATCCTGGCAA-BHQ (SEC ID NO: 9).
Se utiliza el mismo análisis LONA para analizar ADN purificado de biopsias de cola de ratones derivados de células ES dirigidas para determinar sus genotipos 116 y confirmar que el alelo 116 humanizado ha sido transmitido a través de la línea germinal. Dos bebés heterocigotos para la sustitución se crían para generar un ratón que es homocigoto para la sustitución del gen IL-6 de ratón endógeno por el gen IL6 humano. Los cachorros que son homocigotos para la sustitución se utilizan para determinación del fenotipo.
La unión dirección 5' del locus murino y la secuencia que contiene el gen hIL-6 se designa que está dentro de 51 -AATTAGAGAG TTGACTCCTA ATAAATATGA GACTGGGGAT GTCTGTAGCT CATTCTGCTC TGGAGCCCAC CAAGAACGAT AGTCAATTCC AGAAACCGCT ATGAACTCCT TCTCCACAAG TAAGTGCAGG AAATCCTTAG CCCTGGAACT GCCAGCGGCG GTCGAGCCCT GTGTGAGGGA GGGGTGTGTG GCCCAGG (SEC ID NO: 10), en donde el nucleótido de ratón final previo al primer nucleótido del gen humano es el "T" en CCGCT, y el primer nucleótido en la secuencia humana es la primera "A" en ATGAA. La unión dirección 3' de la secuencia que contiene el gen para hIL-6 y el locus murino se denomina que están dentro de 51 -TTTTAAAGAA ATATTTATAT TGTATTTATA TAATGTATAA ATGGTTTTTA TACCAATAAA TGGCATTTTA AAAAATTCAG CAACTTTGAG TGTGTCACGC TCCCGGGCTC GATAACTATA ACGGTCCTAA GGTAGCGACT CGAGATAACT T-3'(SEC ID NO: 11), en donde el nucleótido final de la secuencia humana está con el "G" final en TCACG y el primer nucleótido de la secuencia de ratón es la primera "C" en CTCCC; la región de unión dirección 3' también contiene un sitio loxP en el extremo 3 ' (el inicio de la cual se muestra) para remoción de un cásete neo impulsado por promotor de ubiquitina floxed. La unión del cásete neo con el locus IL-6 de ratón se denomina que está dentro de 5'-TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCCT AAGTTACATC CAAACATCCT CCCCCAAATC AATAATTAAG CACTTTTTAT GACATGTAAA GTTAAATAAG AAGTGAAAGC TGCAGATGGT GAGTGAGA (SEC ID NO: 12), en donde la "C" final de AGCTC es el nucleótido final del cásete neo; el primer nucleótido del genoma de ratón después del cásete es la "C" inicial de CTAAG.
EJEMPLO 2; INMUNOFENOTIPIFICACION DE RATONES hIL-6 PREVIAMENTE NO EXPUESTOS E INMUNIZADOS t LINFOCITOS B Los ratones homocigotos para la sustitución del gen hIL-6 se analizaron para linfocitos B (DC445R (B220) . Las fracciones de compuerta de linfocito para preparaciones de células de bazo de ratones hIL-6 previamente no expuestos e inmunizados (TNP-KLH) se tiñen y se inmunofenotipifican utilizando citometría de flujo. El análisis FACS muestra que el porcentaje de linfocitos B de la preparación de linfocitos de bazo medida por tinción CD45R (B220) -FITC es aproximadamente la misma (63% de células) para preparaciones naturales previamente no expuestos, heterocigotos hIL-6 y homocigotos hIL-6. Para ratones inmunizados, los linfocitos B constituyen aproximadamente 65% de las células totales de la preparación de células de bazo en ratones naturales y aproximadamente 61% de células totales en homocigotos hIL-6. Los bazos de ratones hIL-6 (tanto previamente no expuestos como inmunizados) contienen una población de linfocitos B que es aproximadamente del mismo tamaño que la población de linfocitos B esplénicos en ratones naturales.
La médula ósea de heterocigotos hIL-6 naturales y homocigotos hIL-6 se tiñe con marcadores de linfocitos B (CD45R (B220) -APC, CD24 (HSA) -PE o conjugados con CD43 a un colorante y/o IgM (IgM-FITC) . El desarrollo de linfocitos B en médula ósea de ratones normales se reflejará en marcadores de superficie conforme las células progresan de blastocitos a linfocitos pro-B tempranos, a linfocitos pro B tardíos, a linfocitos pre-B grandes, a linfocitos pre B pequeños, a linfocitos B inmaduros y, finalmente, a linfocitos B maduros. Los linfocitos comunes, linfocitos pro-B progenitores expresarán CD45R y en las etapas posteriores expresarán IgM como linfocitos B inmaduros y, posteriormente, maduros. Así, los linfocitos B teñidos con anti-Ig y teñidos con CD45R mostrarán un patrón característico de desarrollo de linfocitos B. La médula ósea de heterocigotos y homocigotos de hIL-6 muestra un patrón de CD45R (B220) -APC y tinción anti-igM-FITC que es esencialmente indiferenciable de médula ósea natural, que muestra poblaciones de linfocitos B que tiñen positivos para CD45R(B220) e IgM o para CD45R(B220) únicamente. Las subpoblaciones de linfocitos B en médula ósea de ratones hIL-6 muestran, por tinción por FACS, que son similares a la de los ratones naturales (tabla 1, véase también, figura 13) .
TABLA 1. LINFOCITOS B EN MÉDULA ÓSEA DE RATONES PREVIAMENTE NO EXPUESTOS La tinción para CD24 (véase la figura 14) muestra el patrón (normal) mostrado en la tabla 2, que indica un desarrollo normal en médula ósea.
TABLA 2. LINFOCITOS B EN MÉDULA ÓSEA DE RATONES PREVIAMENTE NO EXPUESTOS La tinción para CD43 (véase la figura 15) muestra el patrón (normal) mostrado en la tabla 3, que indica un desarrollo normal en médula ósea.
TABLA 3. LINFOCITOS B EN MÉDULA ÓSEA DE RATONES PREVIAMENTE NO EXPUESTOS De esta manera, la inmunofenotipificación de ratones hIL-6 previamente no expuestos muestra que el desarrollo de linfocitos B en estos ratones es esencialmente normal .
EJEMPLO 3: SUSTITUCIÓN DE LA SECUENCIA DE GEN DE ECTODOMINIO IL-6R0t DE RATÓN ENDÓGENO CON LA SECUENCIA DEL GEN DE ECTODOMINIO hIL-6Rot El gen para IL-6ROÍ humano de 45 kb que contiene dos exones 1 a 8 del gen para IL-6Ra humano sustituye 35.4 kb del locus del gen IL-6Ra murino. Los exones 9 y 10 de ratón se retienen; únicamente se humanizan los exones 1 a 8. En total se sustituyen 35,384 nucleótidos de la secuencia de ratón con 45,047 nucleótidos de la secuencia humana.
Una construcción de direccionamiento para sustituir el ratón con el gen IL-6Ra humano en una etapa de direccionamiento único se construye utilizando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENEMR (véase Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech 21 (6) : 652-659) . El ADN para IL-6Ra de ratón y de humano se obtiene del cromosoma artificial bacteriano (BAC) RPCI-23 clon nl25J8 y del BAC CTD clon 2192J23, respectivamente. Brevemente, una construcción de direccionamiento linealizada Notl generada por clonación de reparación de separación que contiene IL-6ROÍ de ratón dirección 5' y dirección 3' de brazos de homología flanqueando una secuencia de IL-6R humana de 45 kb que se extiende desde ATG en el exon 1 al exon 8 con 69 nucleótidos de la secuencia dirección 3' 3' y un cásete de selección neo floxed se someten a electroporación en blastocitos (ES) embriónicos de ratón F1H4 (híbrido Fl C57BL/6 x 129) . Las células ES dirigidas correctamente (MAID 794) se someten a electroporación adicionalmente con un vector que expresa Cre transitorio para eliminar el cásete de selección de fármaco .
Los clones de células ES dirigidos sin el cásete de fármaco (RAID 1442) se introducen en un embrión de ratón en etapa de 8 células por medio del método VELOCIMOUSE (véanse las patentes US número 7,294,754; 7,576,259; 7,659,442 y Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentialy fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25 (1) : 91-99) . VELOCIMICEMR (ratones F0 completamente derivados de células ES donadoras) que presentan el gen IL-6R humanizado se identifican por determinación de genotipo para pérdida del alelo de ratón y ganancia del alelo humano utilizando una modificación del análisis de alelo (véase Valenzuela et al. (2003)).
Los clones de células ES dirigidos correctamente se identifican por un análisis de pérdida de alelo nativo (LONA, por sus siglas en inglés) (Valenzuela et al. 2003) en el cual el número de copias del gen IL6 no modificado nativo se determina por dos reacciones en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) TaqManMR específicas para secuencias en el gen IL6 de ratón que fueron dirigidos por supresión. Los análisis qPCR comprenden los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos 5' a 3') : cebador directo dirección 5', GCCCTAGCAT GCAGAATGC (SEC ID NO: 13); cebador inverso dirección 5', AAGAGGTCCC ACATCCTTTG C (SEC ID NO: 14); sonda dirección 5', CCCACATCCA TCCCAATCCT GTGAG (SEC ID NO: 15); cebador directo dirección 3', GAGCTTGCCC CCAGAAAGG (SEC ID NO: 16); cebador inverso dirección 3', CGGCCACATC TCTGGAAGAC (SEC ID NO: 17); sonda dirección 3', CATGCACTGC CCCAAGTCTG GTTTCAGT (SEC ID NO : 18) . El ADN purificado de los clones de células ES que ha captado el vector de direccionamiento y lo ha incorporado en sus genomas se combina con TaqManMR Gene Expression Master Mix (Life Technologies) de acuerdo con las sugerencias del fabricante en una placa de PCR de 384 pozos (MicroAmp" Optical 384-Well Reaction Píate, Life Technologies) y se cicla en un equipo Applied Biosystems Prism 7900HT, el cual recolecta datos de fluorescencia durante el curso de las PCR y determina un ciclo de umbral (Ct) , el ciclo de PCR fraccionario en el cual la fluorescencia acumulada alcanza un umbral preestablecido. Las qPCRs específicas para IL-6ROÍ dirección 5' y dirección 3' y dos qPCR para genes de referencia no dirigidos se corren para cada muestra de ADN. Las diferencias en los valores Ct (ACt) entre cada qPCR específica para IL-6A y cada qPCR de gen de referencia se calculan y se calcula la diferencia entre cada ACt y la mediana de ACt para todas las muestras analizadas, para obtener los valores AACt para cada muestra. Se calcula el número de copias del gen 116 en cada muestra a partir de la siguiente fórmula: número de copias = 2 . 2"AACt. Un clon dirigido correctamente, que haya perdido una de sus copias nativas tendrá un número de copias de genes IL-6Ra igual a uno. La confirmación de que la secuencia del gen IL-6R humano sustituye a la secuencia de gen IL-6Ra de ratón suprimida en el alelo humanizado se confirma por un análisis qPCR TaqManMR que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos 5' a 3') : el cebador directo humano, GGAGAGGGCA GAGGCACTTA C (SEC ID NO: 19); el cebador inverso humano, GGCCAGAGCC CAAGAAAAG (SEC ID NO: 20); y la sonda humana, CCCGTTGACT GTAATCTGCC CCTGG (SEC ID NO: 21) .
Se utilizó el mismo análisis LONA para analizar ADN purificado de biopsias de cola de ratones derivados de células ES dirigidas para determinar sus genotipos IL-6Ra y confirmar que el alelo IL-6Ra humanizado ha sido transmitido a través de la línea germinal. Cachorros heterocigotos para la sustitución se crían para generar un ratón que es homocigoto para la sustitución del gen IL-6Ra de ratón endógeno por el gen lL-6Ra humano (ectodominio) . Los cachorros que son homocigotos para la sustitución se utilizan para determinación del fenotipo.
La unión dirección 5' del locus murino y la secuencia que contiene el gen hIL-6Ra se denomina que está dentro de 5 ' -CGAGGGCGAC TGCTCTCGCT GCCCCAGTCT GCCGGCCGCC CGGCCCCGGC TGCGGAGCCG CTCTGCCGCC CGCCGTCCCG CGTAGAAGGA AGCATGCTGG CCGTCGGCTG CGCGCTGCTG GCTGCCCTGC TGGCCGCGCC GGGAGCGGCG CTGGCCCCAA GGCGCTGCCC TGCGCAGGGT AAGGGCTTCG G (SEC ID NO: 22), en donde el nucleótido de ratón final antes del primer nucleótido del gen humano es la "C" en GAAGC, y el primer nucleótido de la secuencia humana es la primera "A" en ATGCT. La unión dirección 3' de la secuencia que contiene el gen hIL-6 y el locus murino se diseñan para estar dentro de 51 -CAAGATTATT GGAGTCTGAA ATGGAATACC TGTTGAGGGA AATCTTTATT TTGGGAGCCC TTGATTTCAA TGCTTTTGAT TCCCTATCCC TGCAAGACCC GGGCTCGATA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGACTCGAG ATAACTTC-3 * (SEC ID NO: 23), en donde el nucleótido final de la secuencia humana está con la "A" final en CAAGA y el primer nucleótido de la secuencia de ratón está en la primera "C" en CCCGG; la región de unión dirección 3' también contiene un sitio loxP en el extremo 31 para remoción de un cásete neo activado por promotor de ubiquitina floxed. El primer nucleótido del sitio loxP es la primera "A" en ATAAC. La unión del cásete neo con el locus IL-6ROÍ de ratón se diseña para estar dentro de 5'-TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCTA CTCCATATGC TCACTTGCCG TTGTTTGCTA CGATACGGTG AGGCCCGTGC GAAGAGTGGC ACAGATCAGG AGGCTTATGT GGTCAGTCCA CAGTATGGC (SEC ID NO: 24), en donde la "C" final de AGCTC es el nucleótido final del cásete neo; el primer nucleótido del genoma de ratón posterior al cásete es la "T" inicial de TACTC.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un ratón modificado genéticamente caracterizado porque comprende una sustitución en el locus de IL-6 de ratón endógeno de un gen de ratón que codifica para IL-6 con un gen humano que codifica para IL-6 humano, en donde el gen humano que codifica para IL-6 humano está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos en el locus de IL-6 de ratón endógeno.
2. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen humano que codifica para IL-6 humano comprende exones 1 a 5 del gen de IL-6 humana del cromosoma artificial bacteriano CTD-2369M23.
3. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ratón expresa un IL-6Ra de ratón.
4. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ratón expresa un IL-6Ra humanizado de un locus de IL-6Ra de ratón endógeno que comprende una sustitución de una secuencia que codifica para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina de IL-6R de ratón con una secuencia que codifica para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina de IL-6ROÍ humano.
5. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ratón no presenta un rasgo que se selecciona de plasmacitosis , glomeruloesclerosis , glomerulonefritis , fallo renal, hipergammaglobulinemia, megacariocitos elevados en bazo, megacariocitos elevados en médula ósea, esplenomegalia, agrandamiento de nodulos linfáticos, células plasmáticas anormales compactadas y una combinación de los mismos.
6. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el IL-6ROÍ humanizado comprende un dominio de superfamilia de inmunoglobulina humana de un IL-6Ra humano.
7. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el IL-6ROÍ humanizado comprende un dominio transmembrana1 de ratón y un dominio citoplásmico de ratón.
8. Un ratón modificado genéticamente, caracterizado porque comprende una humanización de un gen IL-6ROÍ de ratón endógeno, en donde la humanización comprende una sustitución de una secuencia que codifica para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina IL-6Ra de ratón con una secuencia que codifica para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina IL-6Ra humana en el locus IL-6Rc< de ratón endógeno, y en donde el gen de gen IL-6ROÍ humanizado está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos.
9. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de ratón contigua comprende exones de ratón 1 a 8 que son sustituidos con un fragmento genómico contiguo de la secuencia IL-6Ra humana que codifica para el dominio de la superfamilia de inmunoglobulina IL-6Ra humana.
10. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el fragmento genómico contiguo de la secuencia de IL-6Ra humana que codifica para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina es a partir del cromosoma artificial bacteriano CTD-2192J23.
11. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además un gen IL-6 humanizado que comprende una sustitución en el locus IL-6 de ratón endógeno de un gen de ratón que codifica para IL-6 con un gen humano que codifica para IL-6 humana.
12. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el ratón comprende una sustitución en un locus de IL-6 de ratón endógeno de un gen IL-6 de ratón con un gen para IL-6 humana.
13. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el gen para IL-6 humanizado está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógeno .
14. Un método para producir un ratón humanizado caracterizado porque comprende sustituir una secuencia de gen de ratón que codifica para IL-6 de ratón con un gen humano que codifica para I L-6 humana de manera que el gen para I L-6 humano está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógeno .
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la sustitución es en un locus de IL-6 de ratón endógeno y el gen humano que codifica para I L-6 humana está unido operablemente a secuencias reguladoras de ratón endógenas.
16. Un método para producir un ratón humanizado caracterizado porque comprende sustituir todos los exones de ratón que codifican para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina de I L-6Ra de ratón con un fragmento genómico humano que codifica para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina de IL-6Ra humano para formar un gen de I L-6Ra humanizado, en donde el gen de I L-6Ra humanizado está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la sustitución es en un locus de I L-6Rcx de ratón endógeno y el gen de I L-6RCÍ humanizado está unido operablemente a secuencias reguladoras de ratón endógenas .
18. Un ratón modificado genéticamente caracterizado porque comprende un gen de IL-6ROÍ humanizado que comprende una sustitución de la secuencia que codifica para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina de ratón con una secuencia que codifica para el dominio de superfamilia de inmunoglobulina humana, en donde el gen IL-6Ro¡ humanizado es una secuencia transmembranal de ratón y una secuencia citoplásmica de ratón; en donde el ratón comprende además un gen que codifica para IL-6 humano, en donde los genes que codifican para IL-6 humano e IL-6Ra humanizado están bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos .
19. El ratón modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el ratón no expresa un IL-6R de ratón y no expresa un IL-6 de ratón.
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