WO2020240876A1 - エクソンヒト化マウス - Google Patents

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研一 山村
正花 李
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株式会社トランスジェニック
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the intron of the mouse gene remains a mouse, and a vector having a gene in which only exon is replaced with a human base sequence, an embryonic stem cell having the exon humanized gene (hereinafter referred to as "ES cell”), and the like. With respect to exon humanized mice established using.
  • a transgenic mouse was produced by injecting a foreign gene isolated by Gordon et al. In 1980 into a fertilized egg (Gordon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 7380-7384, 1980). .. Since then, in order to introduce and express the human gene in mice, the genomic gene of the isolated human gene (for example, Nagata et al. J. Biochem. 117: 169-175, 1995) and the mini gene (for example, one example). , Kiallan et al. J. Biol. Chem. 266: 23373-23379, 1991), artificial bacterial chromosome (for example, Nieelsen et al. J. Biol. Chem. 272: 29752-29758, 1997). Etc. are injected into fertilized mouse eggs to prepare transgenic mice, and there are many examples.
  • the transgenic mouse prepared by the above method can be used for pathological analysis as a human disease model, for example, it has a normal expression level and expression pattern for use in the development of a therapeutic method and verification of its effectiveness. From this point, there was a limit as a model because it was required.
  • An object of the present invention is to provide a mouse in which only exons are humanized among mouse genes. More specifically, in order to obtain a normal expression pattern from the viewpoint of gene expression level and tissue specificity of expression, the intron of the gene remains the mouse base sequence, and only the exon has the human base sequence. The purpose is to provide.
  • the present inventor took up the transthyretin (TTR) gene as a representative example, and as a result of diligent research, the intron of the mouse Trr gene remains the mouse base sequence, and only the exon portion is present. Succeeded in producing a mouse in which only exons of the Ttr gene were humanized through the production of chimeric mice by producing mouse ES cells substituted with a human nucleotide sequence.
  • TTR transthyretin
  • the present invention is as follows. (1) Among the fragments containing the n exons of the target gene composed of n exons contained in the mouse genome, the n exons were replaced with the exons of the corresponding human target gene. A donor vector containing a fragment. (2) The donor vector according to (1), wherein the target gene is a transthyretin gene. (3) A vector expressing a guide RNA for cleaving the genome immediately upstream of the first exon, the vector containing a target sequence for cleaving, tracrRNA, and a DNA encoding a DNA cleaving enzyme.
  • the intron portion is the base sequence of the mouse gene and the exon portion is the human.
  • Exon humanized ES cells substituted with the base sequence of the gene.
  • An exon humanized mouse produced using the ES cells according to (5).
  • B A step of producing a chimeric embryo from the ES cells obtained in the step (a) and transplanting the chimeric embryo into a foster parent to produce a chimeric mouse, and (c) the chimera obtained in the step (b).
  • the method comprising mating a male mouse with a female mouse among the mice to give birth to a baby mouse.
  • a method for producing a disease model mouse which comprises introducing a gene mutation involved in a disease into the exon of the exon humanized mouse according to (6).
  • An experimental animal for gene therapy which comprises the exon humanized mouse according to (6) or the disease model mouse prepared by the method according to (8).
  • an ES cell having a gene substituted with a mouse gene base sequence in the intron portion and a human gene base sequence in the exon portion is provided.
  • the ES cells of the present invention can establish exon humanized mice that express human TTR protein in a normal amount and with normal tissue specificity.
  • the exon humanized mouse of the present invention has a normal expression pattern both quantitatively and tissue-specifically, and is extremely useful for producing a human disease model mouse and observing the effects of drugs and gene therapy.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of preparation of a donor vector.
  • FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of pBSK-TTR-all-in-one donor vector.
  • FIG. 3 is a diagram of Ex1-gRNA.
  • FIG. 4 is a diagram showing an evaluation of the exon 1 gRNA.
  • FIG. 5 is a diagram of Ex4-gRNA.
  • FIG. 6 is a diagram showing an evaluation of the gRNA of exon 4.
  • FIG. 7 is a diagram showing primers for gene determination.
  • FIG. 8 is a diagram showing PCR analysis of F1 mice.
  • FIG. 9 is a diagram showing amplification of exons 1-2.
  • FIG. 10 is a diagram showing the base sequence of exon1.
  • FIG. 11 is a diagram showing the base sequence of exon 2.
  • FIG. 12 is a diagram showing the amplification of exon 3.
  • FIG. 13 is a diagram showing the base sequence of exon 3.
  • FIG. 14 is a diagram showing the amplification of exon 4.
  • FIG. 15 is a diagram showing the base sequence of exon 4.
  • FIG. 16 is a diagram showing Southern blot analysis on the 5'side.
  • FIG. 17 is a diagram showing Southern blot analysis on the 3'side.
  • FIG. 18 is a diagram showing an analysis of tissue specificity of expression.
  • FIG. 19 is a diagram showing the levels of human TTR and mouse TTR in blood.
  • FIG. 20 is a diagram showing a method for producing a mouse having a mutant allele.
  • FIG. 21 is a diagram showing the base sequences of crRNA, tracrRNA, and donor oligo.
  • FIG. 22 is a diagram showing pX330-ATG.
  • FIG. 23 is a diagram showing pX330-Met30.
  • the intron portion of a gene is a mouse base sequence
  • the exon portion is an ES cell substituted with a gene substituted with a human base sequence
  • a mouse showing a normal expression pattern of human protein from ES cells. was established.
  • the human gene injected into a fertilized egg is integrated into a random position on a chromosome, so that gene expression varies from individual to individual and rarely shows a normal expression pattern. is there.
  • a cDNA or minigene is inserted into a mouse gene, it causes a change in the genomic structure and rarely shows a normal expression pattern.
  • a humanized mouse in which a human protein shows a normal expression pattern, only an exon is established in a humanized mouse.
  • this exon humanized mouse we decided to construct a donor vector containing a gene having a mouse base sequence for intron and a human base sequence for exon, and to establish an ES cell in which it was replaced with the original mouse locus. Successful. A chimeric mouse was produced using the ES cells, and a reproductive chimeric mouse transmitted to the germ line was also successfully produced.
  • the mouse of the present invention is a mouse in which only the exon of the mouse target gene is replaced with the human exon.
  • the mouse of the present invention is a mouse that does not express mouse protein but only human protein.
  • the sequence involved in expression regulation remains a mouse-derived sequence, and a mouse transcription factor or the like normally binds to and functions. As a result, a normal expression level and a tissue-specific expression pattern can be obtained.
  • a guide RNA prepared based on the CRISPR / Cas9 method was used in normal ES cells, an intron was a mouse base sequence, and an exson was a donor vector having a human base sequence. Is introduced by electroporation, homologous recombination is performed, and the mouse endogenous gene is replaced with a donor vector, thereby producing ES cells in which exson is replaced with a human gene in the mouse genome.
  • the donor vector among the fragments containing the n exons of the target gene composed of n exons contained in the mouse genome, the n exons correspond to the exons of the corresponding human target gene. Each contains a substituted fragment. n represents the number of exons contained in the genome.
  • FIG. 1 shows a genome map containing exons that are targeted for humanization and introns that are not targets for humanization on the genome.
  • the mouse transthyretin gene is referred to as "Ttr gene”
  • TTR gene human transthyretin gene
  • the regions displayed as "pUC57-Donor-Ex1-Ex2", “pUC57-Donor-Ex3” and “pUC57-Donor-Ex4" are DNA-synthesized, and the other regions (intron regions) are cloned.
  • the restriction enzyme site for connecting can be freely selected.
  • the intron moiety can be easily cloned from the mouse genome by well known methods. Finally, these DNA fragments may be ligated.
  • Some large genes may have a number of exons that are difficult to fit in a single vector. In that case, it can be prepared by dividing into several donor vectors instead of one donor vector. That is, a total of n exons are divided into k (n 1 , n 2 , ... nk ) subclasses (k means the number of donor vectors), and the same as above is performed.
  • the guide RNA expression vector of the present invention is a vector expressing a guide RNA for cleaving the genome immediately upstream of the first exon, and the nth (fourth in the case of the mouse Ttr gene).
  • "Immediately upstream” means 1 to 20 bases upstream of the 5'end of the first exon
  • "immediately downstream” means 1 to 20 bases downstream of the 3'end of the nth exon. Means that.
  • n exons When n exons are divided into n 1 , n 2 , ... nk subclasses, they are defined in the same way as when they are not divided into subclasses. For example, in each subclass, 5 of the first exon '1-20 bases upstream of the end, or n 1, n 2, 3 of ⁇ ⁇ ⁇ n k-th exon' and 1-20 bases downstream end defining Will be done.
  • the CRISPR / Cas9 system is a defense mechanism by which bacteria and the like selectively destroy the DNA of invading viruses and plasmids. Expression of this mechanism basically requires a molecule called Cas9, which has crRNA, tracrRNA, and DNA double-strand break activity. There is a sequence in crRNA that binds complementarily to DNA such as a virus, and binds to tracrRNA in another part. The tracrRNA binds to Cas9, and as a result, carries Cas9 to the DNA site of the virus to which the crRNA is bound. Then, Cas9 destroys the virus by cleaving the viral DNA at that site (Jinek et al. Science 337: 816-821,1022).
  • the homepage where you can search which base sequence in the gene is the most easily destroyed is also open to the public.
  • CCTop-CRISPR / Cas9 target online predictor https://crispr.cos.uni-heidelberg.de
  • you search for the base sequence in the vicinity you want to destroy a candidate 20bp sequence is shown.
  • a place with a similar sequence, the so-called off target site is also displayed. From these, about 3 locations can be selected in order of priority, incorporated into pX330, and the efficiency of double-stranded DNA cleavage can be examined using cultured cells (Mashiko et al. Sci. Report 3: 3355, 2013). ..
  • a normal homologous recombination method or a CRISPR / Cas9 method can be used to replace the gene inherent in ES cells with an exon humanized gene.
  • a specific base sequence can be specifically cleaved, and a knockout mouse can be efficiently produced using this (Wang et al. Cell 153: 910-918, 2013).
  • a DNA repair system is induced in cells, homologous recombination occurs at a high rate, and knock-in is possible (Yang et al. Cell 154: 1370-1379, 2013).
  • ES cell culture medium examples include GMEM medium (Grasgow's Minimal Essential Medium), DMEM (Dalbeco's modified Eagle's medium), RPMI1640 medium and the like.
  • Culture media include KSR (Knockout Serum Replacement), fetal bovine serum (FBS), basic fibroblast growth factor (bFGF), ⁇ -mercaptoethanol, non-essential amino acids, glutamic acid, sodium pyruvate and antibiotics (eg penicillin). , Streptomycin, etc.) and can be added as appropriate.
  • KSR Kerat Serum Replacement
  • FBS fetal bovine serum
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • ⁇ -mercaptoethanol non-essential amino acids
  • glutamic acid sodium pyruvate
  • antibiotics eg penicillin).
  • the inner cell mass can be cultured under the condition of not containing a feeder in a medium conditioned with MEF.
  • ES cell marker genes include Oct3 / 4, alkaline phosphatase, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, and FGF4.
  • the presence of the marker gene or gene product may be detected by any method such as PCR or Western blotting.
  • Substitution of the mouse gene with the exon humanized gene can be performed according to the CRISPR / Cas9 method.
  • the above donor vector and guide RNA are introduced into ES cells by electroporation.
  • the donor vector and guide RNA are introduced into ES cells, the specific sequence contained in the guide RNA and the complementary sequence on the genome bind to each other, and Cas9 causes double-strand breaks in the DNA at that site.
  • a so-called homologous directed repair system is induced, homologous recombination occurs between the mouse base sequence contained in the donor vector and the homologous sequence on the mouse genome, and the exon humanized gene is inserted (Fig. 7). ..
  • the endogenous mouse gene can be replaced with an exon humanized gene.
  • FIG. 7 shows a diagram of the replacement allele.
  • the numbers 1 to 4 in the figure of "Ttr wild allele” represent exons 1 to 4 of the mouse transthyretin gene, and the numbers 1 to 4 in the figure of "Humanized allele” are human. Represents exons 1-4.
  • genes other than the Ttr gene as in the case of transthyretin. That is, a gene having a human base sequence for the exon portion and a mouse base sequence for the intron portion may be prepared, and this gene and guide RNA may be introduced into ES cells by the CRISPR / Cas9 method.
  • Chimeric mice can be prepared by standard methods. First, the established ES cells are aggregated with 8-cell stage embryos or injected into the scutellum method. The embryo thus produced is called a chimeric embryo, and a chimeric mouse is produced by transplanting this chimeric embryo into the endometrium of a pseudopregnant foster mother and giving birth. For example, in the production of a chimeric embryo, first, a female mouse that has been overovulated with a hormone agent is mated with a male mouse. Then, after a predetermined number of days, the early embryos are collected from the oviduct or the uterus. ES cells are aggregated or injected into the collected embryos to prepare chimeric embryos.
  • the "embryo” means an individual in the stage from fertilization to birth in ontogeny, and includes 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, mulberry stage embryo, blastocyst, and the like. To do. Early developmental embryos can be recovered from the oviduct or uterus 2.5 days after fertilization when 8-cell stage embryos are used, and 3.5 days after fertilization when blastocysts are used.
  • a method for producing an aggregate using ES cells and embryos a known method such as a microinjection method or an agglutination method can be used.
  • “Aggregate” means an aggregate formed by gathering ES cells and embryos in the same space, the form in which ES cells are injected into the embryo, the embryos are separated into individual cells, and aggregated together with the ES cells. It means any of the forms.
  • ES cells are injected into the collected embryos to prepare a cell aggregate.
  • ES cells may be sprinkled on normal embryos from which the zona pellucida has been removed to aggregate them.
  • a pseudo-pregnant female mouse to be a foster parent can be obtained by mating a female mouse with a normal cycle with a male mouse castrated by vas deferens ligation or the like.
  • a chimeric mouse can be produced by transplanting a chimeric embryo prepared by the above method into the uterus and then giving birth to the produced pseudo-pregnant mouse.
  • mice derived from ES cell transplanted embryos are selected. After the selected male chimeric mice have matured, the mice are mated with female mice of the inbred strain. Then, it can be confirmed that the ES cells have been introduced into the germline of the chimeric mouse by the appearance of the coat color of the mouse derived from the ES cells in the born offspring mouse.
  • exon humanized mice can be identified by PCR analysis using the sequences of human exon and mouse intron as primers in the subsequent generations.
  • Exxon Humanized Mouse Exxon humanization can be confirmed by measuring transthyretin in serum separately from mouse transthyretin by ELISA or Western blotting. Even when other genes are humanized, the expressed proteins of the other genes can be confirmed by ELISA or Western blotting.
  • Donor vector A donor vector in which the coding region sequence was replaced from mouse to human for each of the four exons was prepared by the following method (Fig. 1). Since Exon 1 and Exon 2 are in the vicinity, they were synthesized as one donor DNA (pUC57-DonorEx1-Ex2). This is the mouse base sequence from AvrII site to just before ATG, exon 1 starting from ATG is the human base sequence, intron 1 is the mouse base sequence, exon 2 is the human base sequence, and intron 2 is from the splice donor to SacI. It contains the mouse base sequence up to the site.
  • Exon 3 donor DNA (pUC57-Donor-Ex3) is the mouse base sequence from the XbaI site of mouse intron 2 to the splice acceptor, exon 3 is the human base sequence, and intron 3 is the mouse base from splice donor to BclI. Synthesized as an sequence.
  • the donor DNA of Exon 4 (pUC57-Donorr-Ex4) is from the SspI site of intron 3 to the splice acceptor from the mouse base sequence, exon 4 is the human base sequence, and from behind the stop codon of the 3'non-coding region. Up to EcoRI site was synthesized as a mouse base sequence.
  • 5'homology arm (2.8 kb), intron 2 (3.4 kb), intron 3 (3.5 kb), and 3'homology arm (2.9 kb) are C57BL / 6 strains of ES cell RENKA strains.
  • the DNA fragment was amplified using the genomic DNA of.
  • a donor vector (pBSK-TTR-all-in-one donor vector) was prepared by connecting the above seven DNA fragments (SEQ ID NO: 1).
  • Table 1 shows the relationship between the sequences constituting the donor vector (pBSK-TTR-all-in-one donor vector) and the SEQ ID NOs in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the prepared donor vector In order to confirm the structure of the prepared donor vector, it was digested with a restriction enzyme and the electrophoresis pattern was analyzed. The observed DNA cleavage pattern was consistent with what was expected from the vector design (Fig. 2). Moreover, when the nucleotide sequence of the entire DNA amplified by each PCR was determined and compared with the genomic nucleotide sequence of C57BL / 6J mouse registered in NCBJ, it was exactly the same. It was proved that the above method can produce a gene in which only exons are humanized.
  • RNA-Cas9 expression vector pX330-Ex1-gRNA1, pX330-Ex1-gRNA2, pX330-Ex4-gRNA1, pX330-Ex4-gRNA2
  • pX330-Ex1-gRNA2 a guide RNA-Cas9 expression vector targeting the corresponding region.
  • the Cas9 protein derived from gRNA cleaves the target sequence and the resulting terminal is repaired by homology-directed repair, the base sequence of DasherGXXFP is reconstructed into DasherGFP, and the expressed protein fluoresces. It was pX330-Ex1-gRNA2 that was judged to have a higher proportion of fluorescent cells and a higher Cas9 cleavage activity (Fig. 4).
  • Exxon 4 was also searched by the same method, and the following two candidate sequences were selected (Fig. 5).
  • the target sequence of Cas9 is shown in SEQ ID NOs: 19 and 20 (FIG. 5).
  • the efficiency of the guide RNA into which these two sequences were inserted was evaluated by the same method. The results are shown in FIG. It was pX330-Ex4-gRNA2 that was judged to have a higher proportion of fluorescent cells and a higher Cas9 cleavage activity (Fig. 6).
  • ES cells were established using a donor vector and guide RNA (pX330-Ex1-gRNA2 and pX330-Ex4-gRNA2) in order to establish exon humanized mice.
  • the donor DNA, vector (pBSK-TTR-all-in-one donor vector) and puro expression vector were co-introduced into ES cells (C57BL / 6N strain-derived RENKA strain) by electroporation.
  • 10 clones were obtained in which all 4 exons were replaced with the human TTR gene exons (Table 2).
  • Table 2 the DNA fragments expected by restriction enzyme cleavage were detected in only 3 clones (a6221, a6226, a6232), and other than that, unexpected mutations and deletions occurred.
  • a6221 is an allele in which all exons are replaced with the human TTR gene, an allele in which only exon 1, exon 2, and exon 4 are replaced with the human TTR gene, and all exons are replaced with the human TTR gene.
  • alleles that have a sequence in which only one base of exon 2 is not humanized, and all exons are replaced with the human TTR gene but there are also alleles that have a mutation of one base in intron 1, so-called mosaic. there were.
  • a6226 was an allele in which all exons were replaced with the human TTR gene, and all exons were replaced with the human TTR gene, but the allele had a mutation of 1 base in intron 2, and it was also a mosaic. .. a6232 was only an allele in which all exons were replaced with the human TTR gene. In addition, no wild-type allele was found in these ES cell clones. As a result, it was clarified that all exons of a6221, a6226, and a6232 have alleles in which exons of the human TTR gene are replaced.
  • mice were prepared by the aggregation method. Birth was confirmed on the expected delivery date of the receiving female mice transplanted with these chimeric embryos, and cesarean section was performed on pregnant mice that did not give birth. The obtained chimera mice were bred until weaning, and the chimera rate was determined by the coat color at the time of weaning. The chimera rate was determined by visually determining the coat color rate of the entire body. Five 100% chimeric mice were obtained from ES cells derived from a6221, but the chimeric rate was low in other mice (Table 3).
  • F1 offspring were produced by mating a 100% chimeric mouse obtained from the above a6211 with a wild-type mouse. As a result, ES-derived individuals were obtained from all chimeras. After DNA extraction from the body tissue of F1 offspring, humanized exons were detected under PCR conditions using a primer (Fig. 7) specific for humanized alleles. As a result, it was confirmed that exon was humanized in all individuals of exon1, exon2, and exon4, and exon was humanized in 16 animals ( ⁇ 8, ⁇ 8) in exon3. (Fig. 8). Next, 16 individuals in which all exons were humanized (No.
  • Mouse sequences were digested (659 bp, 437 bp) by treating these PCR products with EcoRI (lower right of FIG. 12), and humanized sequences (1096 bp) that were not cleaved with EcoRI were purified and then directed sequenced. As a result, it was confirmed that all exons did not differ from the assumed sequence in the 16 humanized individuals (Fig. 13).
  • FIG. 13 the base sequence of mouse exon 3 is shown in SEQ ID NO: 32, and the base sequence of human exon 3 is shown in SEQ ID NO: 33.
  • DNA region of 1543 bp containing exon 4 was amplified by the primers (below) shown on FIG. 14 and under the PCR conditions shown on the left of FIG. 14 (right of FIG. 14).
  • Mouse sequences were digested (863 bp, 680 bp) by treating these PCR products with MscI (bottom right of FIG. 14), and humanized sequences (1543 bp) that were not cleaved with MscI were purified and then directed sequenced. As a result, it was confirmed that all exons did not differ from the assumed sequence in 16 humanized individuals (Fig. 15).
  • the base sequence of mouse exon 4 is shown in SEQ ID NO: 37
  • the base sequence of human exon 4 is shown in SEQ ID NO: 38.
  • tissue characteristics of the expression of the exon humanized gene were analyzed by the Northern blot method using RNA extracted from each organ / tissue.
  • tissue characteristics of the expression of the exon humanized gene were analyzed by the Northern blot method using RNA extracted from each organ / tissue.
  • wild-type mice Ttr +/+
  • TTR gene exon humanized mice Ttr hTTRexon / hTTRexon
  • brain, eyeball, heart, lung, liver, kidney, spleen, and skeletal muscle were removed from 12-week-old mice. It was extracted and adjusted to 2 ⁇ g or 10 ⁇ g of total RNA.
  • An equal amount of NorthernMax®-Gly Sample Loading Dye was added thereto, mixed, and electrophoresed on a 1% formalin-modified gel.
  • those using 2 ⁇ g of RNA were used for the beta-actin probe, and those using 10 ⁇ g of RNA were used for the Ttr probe.
  • Ttr probe was designed for 5'UTR, which is a sequence common to both (Fig. 18, upper left).
  • the probes for detecting the Ttr gene are primers Ttr-5'UTR-F1 (5'-CTA ATC TCC CTA GGC AAG GTT CAT A-3' (SEQ ID NO: 39)) and Ttr-5'UTR-R2 (5).
  • PCR was performed using the cDNA of wild-type mice as a template, and the amplified 196 bp fragment was purified and prepared. Later, the probe was labeled according to the protocol attached to the kit using the ArkPhos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare), which was labeled as a membrane in which 10 ⁇ g of RNA extracted from the liver of wild-type mice was blotted after electrophoresis.
  • ArkPhos Direct Labeling and Detection System GE Healthcare
  • the Ttr probe was used for 18 hours of hybridization at 55 ° C., and as a result, specific signals were detected in the brain, eyes, and liver of Ttr hTTRexon / hTTRexon and Ttr +/ + (in FIG. 18).
  • the expression pattern of the mouse endogenous Ttr gene was the same for the exson humanized gene.
  • Hybridization was performed using beta-actin as an internal control as a probe.
  • the position of the beta-actin probe is shown in the upper right of FIG.
  • Primers 5'-GGT CAG AAG GAC TCC TAT GTG GG-3'(SEQ ID NO: 41) and 5'-ATG AGG TAG TCT GTC AGG TC-3' (SEQ ID NO: 42) are used as templates for mouse liver cDNA. Amplified by PCR, this fragment was cloned into pBluescriptSK.
  • the probe DNA excised from the plasmid with a restriction enzyme was labeled with the same procedure as for Ttr probe preparation, and hybridization was performed at 55 ° C. for 18 hours. As a result, similar patterns were detected in exon humanized mice and wild-type mice (Fig. 18, bottom).
  • the TTR protein is produced in the liver and secreted into the blood. Therefore, the expression level can be accurately analyzed by measuring the TTR in blood.
  • the ELISA (Enzyme-Linked Immuno Solvent Assay) method or the Western blotting method is used, but in the case of human TTR, it was measured by a commercially available ELISA measurement kit.
  • TTR measurement ELISA kit Human Prealbumin (Transthyretin, TTR) ELISA kit, manufacturer / model number: AssayPro / EP3010 / 1
  • Measurements were made using sera of 5 males and 5 females of Ttr hTTRexon / hTTRexon mice.
  • the measured concentration of each sample was determined from the calibration curve (31.25,7.81, 1.95, 0.49, 0.12, 0 ng / ml) obtained using the standard product attached to the kit.
  • the serum concentration of each sample was calculated by correcting the measured concentration and the dilution ratio. As a result, it was 152.42 ⁇ 8.97 ⁇ g / ml in females of Ttr hTTRexon / hTTRexon and 185.72 ⁇ 14.79 ⁇ g / ml in males (Fig. 19, left).
  • Mouse TTR was measured by Western blotting. Using the sera of 12-week-old wild-type mouse Ttr +/ + , mouse TTR concentration was measured by Western blot analysis. An anti-TTR antibody (Proteintech, 11891-1-AP) was used as a mouse TTR detection antibody, and a recombinant mouse TTR (mTTR: LifeSpan BioSciences, LS-G12719) was used for preparing a calibration curve. As a result, it was 137.93 ⁇ 4.37 ⁇ g / ml for females with Ttr +/+ and 136.27 ⁇ 4.59 ⁇ g / ml for males (Fig. 19, right). From the above, it was found that the amount of human TTR of Ttr hTTRexon / hTTRexon was almost the same as the amount of mouse TTR.
  • crRNA, tracrRNA, and ssDNA are shown in FIG. 21 (SEQ ID NOS: 43 to 47).
  • homologous recombination occurs between the donor oligo and the human TTR gene on the genome, and the 30th GTG is replaced with ATG.
  • it becomes a two-cell stage embryo, it is transplanted into the oviduct of the foster parent to obtain a baby.
  • Genotyping of born mice is performed to select Tr hV30exon / hM30exon mice that have both wild-type and mutant exons heterozygously.
  • Ttr hV30exon / hM30exon only by crossing Ttr hM30exon / hM30exon and Ttr hV30exon / hM30exon Ttr hV30exon / hM30exon mice obtained by increased production above from mice, since not half thereof only Ttr hV30exon / hM30exon mice, efficiency bad. Therefore, first, a large number of Ttr hM30exon / hM30exon are obtained by mating the Ttr hV30exon / hM30exon mice.
  • Ttr hV30exon / hV30exon results in all genotypes of Ttr hV30exon / hM30exon .
  • Ttr hV30exon / hM30exon mice have the same genotype as human patients and can be used in the gene therapy experiments described below.
  • TCCACTCATTCTTGGCAGG A (TG G) including ATG (SEQ ID NO: 48: rightmost).
  • TGG is the PAM sequence.
  • the underline is ATG), which is the best sequence.
  • This cleavage activity can be evaluated by the method of Mashiko et al. (Mashiko et al. Sci. Rep. 3: 3355, 2013).
  • a gene fragment of about 0.5 kb-1.0 kb containing the target sequence near the center is introduced into the multicloning site of the plasmid pCAG-EGxxFP (obtained from addgene).
  • pCAG-EGxxFP is an N-terminal side and C-terminal side sequence having an overlapping sequence of about 500 bp for the EGFP gene, and has a structure that sandwiches the target sequence (0.5-1.0 kb).
  • the pCAG-EGxxFP into which the target sequence has been introduced and the pX330 into which the guide RNA sequence has been introduced are co-introduced into HEK293 cells.
  • GRNA and CAS9 are expressed in HEK293 cells and bind to the target sequence introduced into pCAG-EGxxFP, resulting in double-strand breaks.
  • the overlapping portion of the N-terminal EGFP and the C-terminal EGFP sequence undergoes gene homologous recombination or single-strand annealing, and recombination occurs as a complete EGFP sequence so that EGFP is expressed and emits green fluorescence.
  • the cleavage activity for each target sequence can be relatively evaluated, and the most efficient target sequence can be determined.
  • the above sequence was incorporated into pX330 to prepare pX330-ATG (FIG. 22).
  • the target sequence of Cas9 is shown in SEQ ID NO: 49, and the sequence in which the “cacc” sequence is added to the 5'side of the target sequence and the “caaa” sequence is added to the 3'side is shown in SEQ ID NO: 50.
  • pX330-ATG Delivery of pX330-ATG to the liver From the tail vein of Ttr hV30eon / hM30exon around 6 weeks of age, 2 ml of a solution containing 50 ⁇ g of pX330-ATG (1/10 of the body weight of a mouse as 20 g) was injected within 5-7 seconds. (Hydrodynamic method: Lewis et al. Nat. Genet. 32: 107-108, 2002). In this way, pX330-ATG can be introduced into up to 80% of hepatocytes.
  • TTR gene disruption The degree of TTR gene disruption in the liver can be evaluated by the following method.
  • Liver DNA analysis A partial hepatectomy is performed around 8 weeks of age. DNA is extracted, the nucleotide sequence near ATG is analyzed, and the remaining wild-type TTR, mutant TTR, and frequency of insertion or deletion mutation are analyzed.
  • Blood TTR concentration Human TTR in serum is measured by ELISA at the time points of 3 months, 6 months, 12 months, 18 months, and 24 months. It is possible to estimate how much the TTR gene has been disrupted by measuring the blood concentration. Collate with DNA analysis data.
  • Non-fibrillar TTR deposit (non-fibrillar TTR deposit) is observed from about 1 month of age at the earliest prior to amyloid deposition, and amyloid deposition is as early as 1 year after birth. Later. Therefore, an autopsy was performed at the ages of 3 months, 6 months, 12 months, 18 months, and 24 months (targeting 10 animals in each group), and the digestive tract, kidneys, heart, sciatic nerve, and spleen were removed. After fixing, a tissue section is prepared. The sections are used for immunostaining with anti-TTR antibody and antiserum amyloid A (SAA) antibody.
  • SAA antiserum amyloid A
  • amyloid deposition associated with inflammation and the like can be analyzed, and a differential diagnosis can be made.
  • red staining will be performed in the future to analyze amyloid deposits.
  • Ttr hV30exon / hM30exon mice Destruction of only the human mutant TTR gene (TTRMet30) Using Ttr hV30exon / hM30exon mice, it is possible to carry out an experiment in which only the mutant gene is disrupted.
  • the CRISPR / Cas9 method is used to disrupt the TTR gene in the liver of Ttr hV30exon / hM30exon .
  • the target sequence was searched using a site on the net called CCTop (https://crispr.cos.uni-heidelberg.de).
  • TCCACTCATTCTTGGCAGG A (TG G) including ATG (SEQ ID NO: 48: rightmost).
  • TGG is the PAM sequence.
  • the underline is ATG), which is the best sequence (Fig. 23).
  • the target sequence of Cas9 is shown in SEQ ID NO: 51, and the sequence in which the “ccc” sequence is added to the 5'side of the target sequence and the “caaa” sequence is added to the 3'side is shown in SEQ ID NO: 52.
  • This cleavage activity can be evaluated by the method of Mashiko et al. Already described (Mashiko et al. Sci. Rep. 3: 3355, 2013).
  • pX330-MET30 Delivery of pX330-MET30 to the liver From the tail vein of Ttr hV30eon / hM30exon around 6 weeks of age, 2 ml of a solution containing 50 ug of pX330-ATG (1/10 of the body weight of a mouse as 20 g) was injected within 5-7 seconds. (Hydrodynamic method: Lewin et al. Nat. Genet. 32: 107-108, 2002). In this way, pS330-ATG can be introduced into up to 80% of hepatocytes.
  • TTR gene disruption The degree of TTR gene disruption in the liver can be evaluated by the following method.
  • Liver DNA analysis A partial hepatectomy is performed around 8 weeks of age. DNA is extracted, the nucleotide sequence near the 30th ATG is analyzed, and the remaining wild-type TTR, mutant TTR, and frequency of insertion or deletion mutation are analyzed.
  • Blood TTR concentration Human TTR in serum is measured by ELISA at the time points of 3 months, 6 months, 12 months, 18 months, and 24 months. It is possible to estimate how much the TTR gene has been disrupted by measuring the blood concentration. Collate with DNA analysis data.
  • Non-fibrillar TTR deposit (non-fibrillar TTR deposit) is observed from about 1 month of age at the earliest prior to amyloid deposition, and amyloid deposition is as early as 1 year after birth. Later. Therefore, an autopsy was performed at the ages of 3 months, 6 months, 12 months, 18 months, and 24 months (targeting 10 animals in each group), and the digestive tract, kidneys, heart, sciatic nerve, and spleen were removed. After fixing, a tissue section is prepared. The sections are used for immunostaining with anti-TTR antibody and antiserum amyloid A (SAA) antibody.
  • SAA antiserum amyloid A
  • amyloid deposition associated with inflammation and the like can be analyzed, and a differential diagnosis can be made.
  • red staining will be performed in the future to analyze amyloid deposits.
  • the present invention provides an ES cell into which an exon-humanized TTR gene of the Ttr gene has been humanized and an exon-humanized mouse derived from the ES cell. Mutations in the human TTR gene cause familial amyloid neuropathy, a dominant genetic disease.
  • a mutation can be introduced into the human TTR gene to prepare a human disease model mouse. Using this mouse, a so-called gene therapy experiment in which the human TTR gene is disrupted in the liver becomes possible, and a non-clinical study for examining the therapeutic effect can be carried out.
  • SEQ ID NO: 1 Synthetic DNA SEQ ID NO: 2: Synthetic DNA SEQ ID NO: 12-24: Synthetic DNA SEQ ID NO: 29-31: Synthetic DNA SEQ ID NOs: 34-36: Synthetic DNA SEQ ID NOs: 39-44: Synthetic DNA SEQ ID NO: 45: Synthetic DNA / RNA SEQ ID NO: 46: Synthetic RNA SEQ ID NOs: 47-52: Synthetic DNA

Abstract

マウス遺伝子のエクソン塩基配列だけが、ヒトエクソンの塩基配列に置換されたエクソンヒト化遺伝子を持つドナーベクター、マウス内在性遺伝子をそのドナーベクターで置換したES細胞、並びに当該ES細胞を用いて作出されたマウス。

Description

エクソンヒト化マウス
　本発明は、マウス遺伝子のイントロンはマウスのままで、エクソンだけをヒトの塩基配列に置き換えた遺伝子を有するベクター、そのエクソンヒト化遺伝子を持つ胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」という）及びそれを用いて樹立されたエクソンヒト化マウスに関する。
　１９８０年にＧｏｒｄｏｎらにより単離した外来遺伝子を受精卵へ注入することにより、トランスジェニックマウスが作製された（Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７７：７３８０−７３８４，１９８０）。以来、ヒト遺伝子をマウスに導入し発現させるため、単離したヒト遺伝子のゲノム遺伝子（一例を挙げると、Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１６９−１７５，１９９５）、ミニ遺伝子（一例を挙げると、Ｋｈｉａｌｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３３７３−２３３７９，１９９１）、人工細菌染色体（一例を挙げると、Ｎｉｅｅｌｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９７５２−２９７５８，１９９７）．等をマウス受精卵に注入してトランスジェニックマウスを作製する方法が用いられ多くの実施例がある。
　１９８９年には、マウスＥＳ細胞を用いた相同組換え法により、特定の遺伝子を狙って破壊できる方法が開発された（Ｚｉｊｌｓｔｒａ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８，１９８９：Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：７９９−８０３，１９８９）。この相同組換え法を利用して、マウス遺伝子座にヒト遺伝子のｃＤＮＡ（Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅ　Ｃｅｌｌｓ　１３：１２５７−１２６８，２００８：Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：３９５−４０８，２０１７）やミニ遺伝子（Ｌｅｗｉｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ　３１：２１４−２２６，２０１２）等をノックインし、発現を起こす方法が知られている。しかし、導入されたヒト遺伝子の発現量は、必ずしも正常ではなく、高値であったり、低値であったり、また、発現の組織特異性も異なるなど、多くの欠点があった。
　上記から、上記の方法で作製したトランスジェニックマウスは、例えばヒト疾患モデルとして病態解析には使用できるものの、治療法の開発と有効性の検証に使用するには、正常な発現量と発現パターンが求められるため、この点からはモデルとしての限界があった。
Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７７：７３８０−７３８４，１９８０ Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１６９−１１７５，１９９５ Ｋｈｉｌｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３３７３−２３３７９，１９９１ Ｎｉｅｌｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９７５２−２９７５８，１９９７ Ｚｉｊｌｓｔｒａ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８，１９８９ Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：７９９−８０３，１９８９ Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅ　Ｃｅｌｌｓ　１３：１２５７−１２６８，２００８ Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：３９５−４０８，２０１７ Ｌｅｗｉｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ　３１：２１４−２２６，２０１２
　本発明は、マウス遺伝子の中でエクソンだけがヒト化されたマウスを提供することを目的とする。より詳細には、遺伝子発現量、発現の組織特異性から見て正常の発現パターンを得るため、遺伝子のイントロンはマウスの塩基配列のままで、エクソンだけがヒトの塩基配列を持つエクソンヒト化マウスを提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するためトランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ：ＴＴＲ）遺伝子を代表例として取り上げ、鋭意研究を行った結果、マウスＴｔｒ遺伝子のうちイントロンはマウスの塩基配列ままで、エクソン部分だけがヒトの塩基配列で置換したマウスＥＳ細胞を作製し、キメラマウス作製を通して、Ｔｔｒ遺伝子のエクソンだけがヒト化されたマウスを作出することに成功した。
　このマウスにおけるエクソンヒト化Ｔｔｒ遺伝子の発現の組織特異性を解析したところ、マウスＴｔｒ遺伝子の発現パターンと同じであること、また、血中のＴＴＲ量も、野生型マウスのマウスＴＴＲのレベルと同じであることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）マウスのゲノムに含まれるｎ個のエクソンにより構成される標的遺伝子の当該ｎ個のエクソンを含む断片のうち、前記ｎ個のエクソンが、対応するヒト標的遺伝子のエクソンにそれぞれ置換された断片を含む、ドナーベクター。
（２）標的遺伝子がトランスサイレチン遺伝子である、（１）に記載のドナーベクター。
（３）第１番目のエクソンの直ぐ上流でゲノムを切断するためのガイドＲＮＡを発現するベクターであって、切断の標的配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＤＮＡ切断酵素をコードするＤＮＡを含む前記ベクター。
（４）第ｎ番目のエクソンの直ぐ下流でゲノムを切断するためのガイドＲＮＡを発現するベクターであって、切断の標的配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＤＮＡ切断酵素をコードするＤＮＡを含む前記ベクター。
（５）（１）又は（２）に記載のドナーベクター、並びに（３）及び（４）に記載のベクターをＥＳ細胞に導入することにより、イントロン部分はマウス遺伝子の塩基配列、エクソン部分はヒト遺伝子の塩基配列で置換された、エクソンヒト化ＥＳ細胞。
（６）（５）に記載のＥＳ細胞を用いて作出されたエクソンヒト化マウス。
（７）マウス遺伝子のエクソンをヒト遺伝子のエクソンで置換したエクソンヒト化マウスの作製方法であって、以下の工程：
（ａ）（１）又は（２）に記載のドナーベクター、並びに（３）及び（４）に記載のベクターをＥＳ細胞に導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＥＳ細胞からキメラ胚を作出し、当該キメラ胚を仮親に移植することによりキメラマウスを作出する工程、並びに
（ｃ）工程（ｂ）で得られたキメラマウスのうち雄マウスを雌マウスと交配し、子マウスを出産させる工程
を含む、前記方法。
（８）（６）に記載のエクソンヒト化マウスのエクソンに、疾患に関与する遺伝子変異を導入することを特徴とする、疾患モデルマウスを作製する方法。
（９）（６）に記載のエクソンヒト化マウス、又は（８）に記載の方法により作製された疾患モデルマウスを含む、遺伝子治療用実験動物。
　本発明により、イントロン部分はマウス遺伝子の塩基配列で、エクソン部分はヒト遺伝子の塩基配列で置換された遺伝子を持つＥＳ細胞が提供される。本発明のＥＳ細胞は、ヒトＴＴＲタンパクを正常な量、正常な組織特異性で発現するエクソンヒト化マウスを樹立させることができる。本発明のエクソンヒト化マウスは、発現パターンが、量的にも、組織特異的にも正常であり、ヒト疾患モデルマウス作製や薬剤及び遺伝子治療の効果をみる上で極めて有用である。
図１は、ドナーベクターの作製の概略を示す図である。 図２は、ｐＢＳＫ−ＴＴＲ−ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ　ｄｏｎｏｒ　ｖｅｃｔｏｒの制限酵素地図を示す図である。 図３は、Ｅｘ１−ｇＲＮＡの図である。 図４は、エクソン１のｇＲＮＡの評価を示す図である。 図５は、Ｅｘ４−ｇＲＮＡの図である。 図６は、エクソン４のｇＲＮＡの評価を示す図である。 図７は、遺伝子判定用プライマーを示す図である。 図８は、Ｆ１マウスのＰＣＲ解析を示す図である。 図９は、エクソン１−２の増幅を示す図である。 図１０は、エクソン１の塩基配列を示す図である。 図１１は、エクソン２の塩基配列を示す図である。 図１２は、エクソン３の増幅を示す図である。 図１３は、エクソン３の塩基配列を示す図である。 図１４は、エクソン４の増幅を示す図である。 図１５はエクソン４の塩基配列を示す図である。 図１６は、５’側のサザンブロット解析を示す図である。 図１７は、３’側のサザンブロット解析を示す図である。 図１８は、発現の組織特異性の解析を示す図である。 図１９は、血中のヒトＴＴＲ及びマウスＴＴＲのレベルを示す図である。 図２０は、変異型アレルを持つマウスの作製法を示す図である。 図２１は、ｃｒＲＮＡ，ｔｒａｃｒＲＮＡ，ドナーオリゴの塩基配列を示す図である。 図２２は、ｐＸ３３０−ＡＴＧを示す図である。 図２３は、ｐＸ３３０−Ｍｅｔ３０を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
　本発明は、遺伝子のイントロン部分はマウスの塩基配列で、エクソン部分はヒトの塩基配列で置換した遺伝子で置換されたＥＳ細胞であり、ＥＳ細胞から、ヒトタンパクが正常の発現パターンを示すマウスを確立したというものである。
　一般に、ヒト遺伝子を導入したトランスジェニックマウスでは、受精卵に注入したヒト遺伝子は、ランダムな染色体上の位置に組み込まれるため、遺伝子発現は個体ごとに異なり、正常な発現パターンを示すことは稀である。また、マウス遺伝子の中に、ｃＤＮＡやミニ遺伝子を挿入しても、ゲノム構造の変化をもたらし、正常な発現パターンを示すことは稀である。
　そこで本発明においては、ヒトタンパクが正常な発現パターンを示すマウスを樹立するため、エクソンのみがヒト化されたマウスを樹立する。このエクソンヒト化マウスを樹立するため、イントロンはマウスの塩基配列、エクソンはヒト塩基配列をもつ遺伝子を含むドナーベクターを構築し、それを本来のマウス遺伝子座で置換したＥＳ細胞を樹立することに成功した。そのＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製し、生殖系列に伝わる生殖キメラマウスの作製にも成功した。
　本発明のマウスは、マウスの標的遺伝子のエクソンだけが、ヒトエクソンに置換されたマウスである。
　本発明の好ましい態様では、本発明のマウスは、マウスのタンパクは発現せず、ヒトタンパクだけが発現するマウスである。この態様では、イントロンだけは、マウスの塩基配列を持つため、発現調節に関与する配列はマウス由来配列のままであり、マウスの転写因子等が正常に結合し機能する。その結果、正常な発現量、組織特異的発現パターンを得ることができる。
２．ドナーベクターの作製
　本発明のマウス作製においては、まず正常のＥＳ細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法に基づいて作製したガイドＲＮＡと、イントロンはマウスの塩基配列、エクソンはヒトの塩基配列を持つドナーベクターとを電気穿孔法で導入し、相同組換えを起こしてマウス内在性遺伝子がドナーベクターで置換されることにより、マウスゲノムのうちエクソンがヒト遺伝子に置換されたＥＳ細胞を作出する。
　本発明において、ドナーベクターは、マウスのゲノムに含まれるｎ個のエクソンにより構成される標的遺伝子の当該ｎ個のエクソンを含む断片のうち、前記ｎ個のエクソンが対応のヒト標的遺伝子のエクソンにそれぞれ置換された断片を含む。ｎは、ゲノムに含まれるエクソンの数を表す。
　図１上パネルは、ゲノム上にヒト化の標的となるエクソン、及びヒト化の標的とはならないイントロンを含むゲノム地図を示す。図１はトランスサイレチン遺伝子のエクソンを例示しており、エクソンの数は４（エクソン数：ｎ＝４）である（図１において数字１~４で示されたボックス）。以下、このトランスサイレチン遺伝子を例に本発明を説明する。なお、マウスのトランスサイレチン遺伝子を「Ｔｔｒ遺伝子」、ヒトのトランスサイレチン遺伝子を「ＴＴＲ遺伝子」と表記する。
　エクソンだけがヒトの塩基配列で、イントロンはマウスの塩基配列である遺伝子を作製するには、いくつかの方法がある。
　例えば、ヒトのエクソンとマウスのイントロンをそれぞれクローニングし、最後につなぎ合わせる方法がある。しかし、つなぐための制限酵素部位が必ずしも一致せず、操作が困難である。
　効率の良い方法として、図１に示すように、ヒトエクソンとその上流及び下流のマウスのイントロン部分を一括してＤＮＡ合成し、これをベクターに挿入する方法である。すなわち、図１において、「ｐＵＣ５７−Ｄｏｎｏｒ−Ｅｘ１−Ｅｘ２」、「ｐＵＣ５７−Ｄｏｎｏｒ−Ｅｘ３」及び「ｐＵＣ５７−Ｄｏｎｏｒ−Ｅｘ４」と表示された領域はＤＮＡ合成し、他の領域（イントロン領域）はクローニングする。この方法によれば、つなぐための制限酵素部位を自由に選択できる。イントロン部分は、周知の方法でマウスゲノムから容易にクローニングできる。最後に、これらのＤＮＡ断片を連結すれば良い。
　サイズの大きな遺伝子の中には、１つのベクターに収めることが困難な数のエクソンを有する場合がある。その場合は、一つのドナーベクターではなく、いくつかのドナーベクターに分割して作製することもできる。すなわち、全部でｎ個のエクソンをｋ個（ｎ１、ｎ２、・・・ｎｋ個）のサブクラス（ｋは、ドナーベクターの数を意味する。）に分けて、上記と同様にして、それぞれのサブクラスのエクソンごとにドナーベクターを作製すればよい。例えば、１０個のエクソン（ｎ＝１０）がある場合は、例えば４個（ｎ１＝４）、３個（ｎ２＝３）、３個（ｎ３＝３）のエクソンを有する３つのサブクラス（ｋ＝３）のエクソンごとにドナーベクターを作製する。
３．ガイドＲＮＡの作製
　本発明のガイドＲＮＡを発現ベクターは、第１番目のエクソンの直ぐ上流でゲノムを切断するためのガイドＲＮＡを発現するベクター、及び第ｎ番目（マウスＴｔｒ遺伝子の場合は第４番目）のエクソンの直ぐ下流でゲノムを切断するためのガイドＲＮＡを発現するベクターであり、それぞれのベクターは、切断の標的配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＤＮＡ切断酵素をコードするＤＮＡを含む。「直ぐ上流」とは、第１番目のエクソンの５’末端の１~２０塩基上流のことを意味し、「直ぐ下流」とは、第ｎ番目のエクソンの３’末端の１~２０塩基下流のことを意味する。ｎ個のエクソンをｎ１、ｎ２、・・・ｎｋ個のサブクラスに分割した場合は、サブクラスに分割しない場合と同様に定義される。例えば、それぞれのサブクラスにおいて、第１番目のエクソンの５’末端の１~２０塩基上流、あるいはｎ１、ｎ２、・・・ｎｋ番目のエクソンの３’末端の１~２０塩基下流と定義される。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、細菌等が、侵入してきたウイルスやプラスミドのＤＮＡを選択的に破壊する防御機構である。この機構の発現には、基本的には、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡそしてＤＮＡ２本鎖切断活性のあるＣａｓ９という分子が必要である。ｃｒＲＮＡの中にウイルス等のＤＮＡと相補的に結合する配列があり、別の部分でｔｒａｃｒＲＮＡと結合する。ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓ９と結合しており、結果的にｃｒＲＮＡが結合したウイルスのＤＮＡ部位にＣａｓ９を運んでくる。そして、Ｃａｓ９はその部位でウイルスＤＮＡを切断することにより、ウイルスを破壊する（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３７：８１６−８２１，２０１２）。この３つを発現させれば、哺乳類細胞でも特定の配列部分でＤＮＡを切断できること、すなわち遺伝子を破壊できることが明らかとなった（Ｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１−２３０８，２０１３）。さらに、これら３つを一つのベクターで発現させることのできるベクター（例：ｐＸ３３０）も開発されている（Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４：５４００，２０１４）。
　遺伝子の中のどの塩基配列が、最も破壊しやすいかを検索できるホームページも公開されている。現在では、例えばＣＣＴｏｐ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｔａｒｇｅｔ　ｏｎｌｉｎｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ）を使い、破壊したい付近の塩基配列を検索すれば、候補となる２０ｂｐの配列を示し、同時に似たような配列のある場所、いわゆるｏｆｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｉｔｅも表示される。この中から、優先順に３ヶ所程度を選択し、ｐＸ３３０に組み込み、培養細胞を使用して、２本鎖ＤＮＡ切断の効率を調べることができる（Ｍａｓｈｉｋｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔ　３：３３５５，２０１３）。
４．ノックインＥＳ細胞の単離
　エクソンヒト化マウスを樹立するには、成体になったマウスではなく、ＥＳ細胞の段階で内在遺伝子をエクソンヒト化遺伝子で置換する必要がある。
　そこで本発明においては、ＥＳ細胞に内在する遺伝子をエクソンヒト化遺伝子で置き換えるため、通常の相同組換え法又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法では、特定の塩基配列を特異的に切断することができ、これを利用して効率的にノックアウトマウスが作製できる（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ　１５３：９１０−９１８，２０１３）。この時、細胞内ではＤＮＡ修復系が誘導され、相同組換えも高率に起こり、ノックインも可能であることが示されている（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ　１５４：１３７０−１３７９，２０１３）。
　ＥＳ細胞の培養培地としては、例えばＧＭＥＭ培地（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ１６４０培地培地などが挙げられる。培養培地には、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、グルタミン酸、ピルビン酸ナトリウム及び抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン等）などから選択し、適宜添加することができる。
　ＥＳ細胞を所定期間培養後、ＥＤＴＡ又はコラゲナーゼＩＶを含む培地でインキュベートすることによりＥＳ細胞を回収する。回収されたＥＳ細胞は、必要によりフィーダー細胞の存在又は非存在下で培養することにより複数回継代することもできる。なお、フィーダー不含条件での内部細胞塊の培養は、ＭＥＦで馴化された培地中で行なうことができる。
　培養されたＥＳ細胞は、一般にそれらのマーカー遺伝子を用いて同定することができる。ＥＳ細胞のマーカー遺伝子としては、例えばＯｃｔ３／４、アルカリ性ホスファターゼ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４などが挙げられる。マーカー遺伝子又は遺伝子産物の存在は、ＰＣＲやウエスタンブロッティング等の任意の手法により検出すればよい。
　マウス遺伝子から上記エクソンヒト化遺伝子への置換は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法に準じて行うことができる。まず、上記のドナーベクターとガイドＲＮＡをＥＳ細胞に電気穿孔法で導入する。
　ドナーベクターとガイドＲＮＡをＥＳ細胞に導入すると、ガイドＲＮＡの中に含まれる特異的な配列とゲノム上の相補的な配列が結合し、その部位でＣａｓ９によりＤＮＡの２本鎖切断が起こる。その結果、いわゆるｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｒｅｐａｉｒの系が誘導され、ドナーベクターに含まれるマウスの塩基配列とマウスゲノム上の相同配列の間で相同組換えが起こり、エクソンヒト化遺伝子が挿入される（図７）。
　この方法によれば、内在性マウス遺伝子をエクソンヒト化遺伝子で置換することができる。図７に置換アレルの図を示す。
　ここで、図７において、「Ｔｔｒ　ｗｉｌｄ　ａｌｌｅｌｅ」の図の１~４の数字は、マウストランスサイレチン遺伝子のエクソン１~４を表し、「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ａｌｌｅｌｅ」の図の１~４の数字はヒトのエクソン１~４を表す。
　Ｔｔｒ遺伝子以外の他の遺伝子の場合も、上記トランスサイレチンの場合と同様である。すなわち、エクソン部分はヒトの塩基配列、イントロン部分はマウスの塩基配列をもつ遺伝子を作製し、この遺伝子とガイドＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方によりＥＳ細胞に導入すればよい。
　例えばＲｂｐ４遺伝子のエクソンだけがヒト化されたマウスを作製する場合は、４つのエクソンはヒトの塩基配列、イントロンはマウスの塩基配列となるエクソンヒト化Ｒｂｐ４ｈＲＢＰ４ｅｘｏｎ遺伝子を作製し、この遺伝子をガイドＲＮＡとともにＥＳ細胞に導入すれば、Ｒｂｐ４ｈＲＢＰ４ｅｘｏｎマウスを作製できる。
５．キメラマウス作製
　キメラマウスの作製は、標準的な方法で行うことができる。
　まず、上記樹立されたＥＳ細胞を、８細胞期胚と凝集させるか、あるいは胚盤法に注入する。このようにして作製された胚をキメラ胚というが、このキメラ胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラマウスを作製する。
　例えば、キメラ胚の作製は、まず、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、所定日数後に卵管又は子宮から初期発生胚を回収する。回収した胚に、ＥＳ細胞を凝集または注入し、キメラ胚を作製する。
　ここで、「胚」とは、個体発生における受精から出生までの段階の個体を意味し、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞などを包含する。８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目にそれぞれ卵管又は子宮から初期発生胚を回収することができる。
　ＥＳ細胞と胚を用いて集合体を作製する方法として、マイクロインジェクション法、凝集法などの公知手法を用いることができる。「集合体」とは、ＥＳ細胞及び胚が同一空間内に集まって形成する集合体を意味し、ＥＳ細胞が胚に注入された形態、胚を個々の細胞にばらして、ＥＳ細胞とともに凝集する形態のいずれをも意味する。
　マイクロインジェクション法を採用する場合は、回収した胚に、ＥＳ細胞を注入して細胞の集合体を作製する。また、凝集法を採用する場合は、ＥＳ細胞を、透明帯を除去した正常胚にふりかけて凝集させればよい。
　一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作製したキメラ胚を子宮内に移植し、その後出産させることによりキメラマウスを作製することができる。
６．エクソンヒト化マウスの作製
　このようなキメラマウスの中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスを選択する。選択した雄のキメラマウスが成熟した後、このマウスを近交系マウス系統の雌マウスと交配させる。そして、誕生した子マウスに、ＥＳ細胞に由来するマウスの被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。
　誕生した子マウスがエクソンヒト化遺伝子を持つかどうか、正常な配列を持つかどうかは、ＤＮＡを制限酵素で切断し目的のサイズのＤＮＡ断片が検出されるかどうか、及びＤＮＡの塩基配列を解析することにより同定できる。一旦正常な配列を持つことが確認できれば、それ以降の世代では、ヒトエクソンとマウスイントロンの配列をプライマーとした、ＰＣＲ解析によりエクソンヒト化マウスを同定できる。
７．エクソンヒト化マウスの評価
　エクソンがヒト化されたことは、血清中のトランスサイレチンをＥＬＩＳＡやウエスタンブロット法により、マウストランスサイレチンとは区別して測定することにより確認することができる。他の遺伝子をヒト化した場合も当該他の遺伝子の発現タンパクをＥＬＩＳＡやウエスタンブロット法により確認することができる。
８．エクソンヒト化マウスを用いた変異エクソンヒト化マウスの作製
　単一の遺伝子異常により発症するヒトの遺伝性疾患は多数存在する。例えば、ＴＴＲ遺伝子の点突然変異によって優性遺伝病である家族性アミロイドポリニューロパチーが発症する。野生型のヒトＴＴＲエクソンを持つマウス（野生型エクソンヒト化マウス）の受精卵に、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９、それにドナーオリゴを注入することにより、３０番目のバリンをコードするＧＴＧを、ＡＴＧの配列に置換することができる（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ　１５４：１３７０−１３７９，２０１３）。このように、ヒト野生型のエクソン配列を用いてマウス遺伝子のエクソンを置換して、野生型エクソンヒト化マウスを作製すれば、そのマウスが有するヒトエクソンを変異させることにより、変異型のエクソンを持つマウス、すなわちヒト患者と同じ変異遺伝子を持つ疾患モデルマウスを作製できる。
９．野生型エクソンヒト化および変異エクソンヒト化マウスを用いた遺伝子治療実験
　野生型エクソンヒト化および変異エクソンヒト化マウスを交配すれば、野生型と変異型の遺伝子を持つヘテロマウスが得られる。このマウスの遺伝子型はヒト患者と同じである。このエクソンヒト化ヘテロマウスを用いれば、治療法の検証に使用できる。特に、近年注目されている肝臓で発現する遺伝子の異常による遺伝性疾患の遺伝子治療実験を行うことができる。
　従来は、マウス遺伝子に変異を起こし、それをモデルとして治療実験が行われている（Ｙｉｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：５５１−５５３，２０１４；Ｐａｎｋｏｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．７：１２６４２，２０１６；Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３４：３３４−３３８，２０１６；Ｙｉｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：３２８−３３３，２０１６；Ｊａｒｒｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ　Ｒｅｐ．７：４４６２４，２０１７；Ｖｉｌｌｉｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｍｅｄ．２４：１５１９−１５２５，２０１８）。しかし、ヒトの遺伝子とは塩基配列が同じではなく、実際にヒトで行う際には、参考とはなっても、必ずしも正確に治療効果を予測できるわけではない。エクソンヒト化マウスでは、エクソンがヒトと同じ配列であり、治療効果を確実に予測できるため、その有用性は高い。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、これらの実験等に関して、動物実験委員会、第２種組換えＤＮＡ実験安全委員会に申請し、すべて認可された。
ドナーベクター
　４つの各ｅｘｏｎに対してコーディング領域の配列をマウスからヒトに置換したドナーベクターを、以下の方法で作製した（図１）。
　Ｅｘｏｎ　１とＥｘｏｎ　２は近傍にあるため、１つのドナーＤＮＡ（ｐＵＣ５７−ＤｏｎｏｒＥｘ１−Ｅｘ２）として合成した。これは、ＡｖｒＩＩ　ｓｉｔｅからＡＴＧの直前まではマウスの塩基配列、ＡＴＧから始まるｅｘｏｎ　１はヒトの塩基配列、ｉｎｔｒｏｎ　１はマウスの塩基配列、ｅｘｏｎ　２はヒトの塩基配列、ｉｎｔｒｏｎ　２はスプライスドナーからＳａｃＩ　ｓｉｔｅまでマウスの塩基配列を含んでいる。Ｅｘｏｎ　３のドナーＤＮＡ（ｐＵＣ５７−Ｄｏｎｏｒ−Ｅｘ３）は、マウスｉｎｔｒｏｎ　２のＸｂａＩ　ｓｉｔｅからスプライスアクセプターまでをマウスの塩基配列、ｅｘｏｎ　３はヒトの塩基配列、ｉｎｔｒｏｎ　３はスプライスドナーからＢｃｌＩまでマウスの塩基配列として合成した。Ｅｘｏｎ　４のドナーＤＮＡ（ｐＵＣ５７−Ｄｏｎｏｒｒ−Ｅｘ４）は、ｉｎｔｒｏｎ　３のＳｓｐＩ　ｓｉｔｅからスプライスアクセプターまでをマウスの塩基配列、ｅｘｏｎ　４はヒトの塩基配列、３’ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎの終止コドンの後ろからＥｃｏＲＩ　ｓｉｔｅまでがマウスの塩基配列として合成した。これ以外に、５’ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ａｒｍ（２．８ｋｂ）、ｉｎｔｒｏｎ　２（３．４ｋｂ）、ｉｎｔｒｏｎ　３（３．５ｋｂ）、３’ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ａｒｍ（２．９ｋｂ）は、Ｃ５７ＢＬ／６系統のＥＳ細胞ＲＥＮＫＡ株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片を増幅した。上記７つのＤＮＡ断片をつなぎ、ドナーベクター（ｐＢＳＫ−ＴＴＲ−ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ　ｄｏｎｏｒ　ｖｅｃｔｏｒ）を作製した（配列番号１）
　配列番号１に示す塩基配列において、ドナーベクター（ｐＢＳＫ−ＴＴＲ−ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ　ｄｏｎｏｒ　ｖｅｃｔｏｒ）を構成する配列と配列番号との関係を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　作製したドナーベクターの構造を確認するため、制限酵素で消化し、電気泳動パターンを解析した。観察されたＤＮＡ切断パターンは、ベクターのデザインから予想されたものと一致した（図２）。また、各ＰＣＲで増幅したＤＮＡ全域の塩基配列を決定して、ＮＣＢＪに
登録されているＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのゲノム塩基配列と比較したところ、全く同じであった。上記の方法で、エクソンだけをヒト化した遺伝子を作製できることが証明された。
ガイドＲＮＡ
　ガイドＲＮＡの作製に必要な塩基配列等は、すでに詳細に報告されている（Ｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１−２３０８，２０１３）。また、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９を一つのベクターで発現させることのできるベクター（例：ｐＸ３３０）も開発され（Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４：５４００，２０１４）、Ａｄｄｇｅｎｅ等から入手できる。
　上記の論文等に基づき、エクソン１を効率よく破壊できる２０ｂｐの塩基配列を、検索ソフト（Ｃｒｉｓｐｒ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｏｏｌ）で解析した。ガイドＲＮＡを選定するにあたり、Ｓｃｏｒｅが高いもののなかから、ヒト化した後のコーディング領域がｇＲＮＡで切断されないように、ミスマッチが多いものを選定した。その結果、以下に示す２つの候補配列を選択した（図３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　この２つの配列を挿入したガイドＲＮＡの効率を評価するために、Ｍａｓｈｉｋｏらの手法を利用した（Ｍａｓｈｉｋｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：３３５５，２０１３）。まず、ＣＭＶ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流にあるＤａｓｈｅｒＧＦＰ遺伝子（ＤＮＡ２．０　ｌｎｃ．）の５’側と３’側配列の間に、Ｃａｓ９のターゲット配列（配列番号１５、１６）を含むＴｔｒゲノム約５００ｂｐの各断片を挿入し、蛍光を発しないＤａｓｈｅｒＧＸＸＦＰ発現ベクター（ｐＤＧＸＸＦＰ−ｅｘ１、ｐＤＧＸＸＦＰ−ｅｘ４）を構築した。これらを、対応する領域をターゲットとするガイドＲＮＡ−Ｃａｓ９発現ベクター（ｐＸ３３０−Ｅｘ１−ｇＲＮＡ１，ｐＸ３３０−Ｅｘ１−ｇＲＮＡ２，ｐＸ３３０−Ｅｘ４−ｇＲＮＡ１，ｐＸ３３０−Ｅｘ４−ｇＲＮＡ２）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。ｇＲＮＡにより導かれたＣａｓ９タンパク質がターゲット配列を切断し、生じた末端がｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｒｅｐａｉｒにより修復されると、ＤａｓｈｅｒＧＸＸＦＰの塩基配列がＤａｓｈｅｒＧＦＰに再構築され、発現したタンパク質が蛍光を発する。蛍光を発する細胞数の割合がより高く、Ｃａｓ９の切断活性が高いと判断されたものは、ｐＸ３３０−Ｅｘ１−ｇＲＮＡ２であった（図４）。
　エクソン４についても、同様の方法で検索し、以下に示す２つの候補配列を選定した（図５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　なお、Ｃａｓ９の標的配列を配列番号１９、２０に示す（図５）。
　この２つの配列を挿入したガイドＲＮＡの効率を同様の方法で評価した。結果を図６に示す。蛍光を発する細胞数の割合がより高く、Ｃａｓ９の切断活性が高いと判断されたものは、ｐＸ３３０−Ｅｘ４−ｇＲＮＡ２であった（図６）。
ＥＳ細胞の樹立
　本実施例では、エクソンヒト化マウスの確立のため、ドナーベクターとガイドＲＮＡ（ｐＸ３３０−Ｅｘ１−ｇＲＮＡ２とｐＸ３３０−Ｅｘ４−ｇＲＮＡ２）を用い、ＥＳ細胞の樹立を行った。ドナーＤＮＡ、ベクター（ｐＢＳＫ−ＴＴＲ−ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ　ｄｏｎｏｒ　ｖｅｃｔｏｒ）とｐｕｒｏ発現ベクターを電気穿孔法によりＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　系統由来　ＲＥＮＫＡ株）へ共導入した。その結果、４つのエクソン全てがヒトＴＴＲ遺伝子エクソンに置換されたクローンが１０クローン得られた（表２）。しかし、制限酵素切断で想定されるＤＮＡ断片のみが検出されたのは３クローン（ａ６２２１，ａ６２２６，ａ６２３２）のみであり、それ以外は想定外の変異や欠失が起こっていた。
　上記の３クローンについて塩基配列を解析した。解析の結果、ａ６２２１は、全てのエクソンがヒトＴＴＲ遺伝子に置換されたアレルの他、ｅｘｏｎ　１，ｅｘｏｎ　２，ｅｘｏｎ　４のみがヒトＴＴＲ遺伝子に置換されたアレル、全てのエクソンがヒトＴＴＲ遺伝子に置換されているが、ｅｘｏｎ　２の１塩基だけヒト化していない配列をもつアレル、全てのエクソンがヒトＴＴＲ遺伝子に置換されているが、ｉｎｔｒｏｎ　１に１塩基の変異をもつアレルもあり、いわゆるモザイクであった。
　ａ６２２６は、全てのエクソンがヒトＴＴＲ遺伝子に置換されたアレルの他、全てのエクソンがヒトＴＴＲ遺伝子に置換されているが、ｉｎｔｒｏｎ　２に１塩基の変異をもつアレルであり、やはりモザイクであった。
　ａ６２３２は、全てのエクソンがヒトＴＴＲ遺伝子に置換されたアレルのみであった。
　また、これらＥＳ細胞クローンからは、野生型のアレルは認められなかった。
以上の結果、ａ６２２１，ａ６２２６，ａ６２３２は、全てのエクソンがヒトＴＴＲ遺伝子のエクソンに置換されたアレルを持つことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
マウス系統（ＴｔｒｈＴＴＲｅｘｏｎ）の樹立
　上記の相同組換えＥＳ細胞クローン（ａ６２２１，ａ６２２６，ａ６２３２）と、ＩＣＲ系統の８細胞期胚を用い、アグリゲーション法でキメラ胚を作製した。これらのキメラ胚を移植した受容雌マウスの出産予定日に、出産を確認し、出産していない妊娠マウスについては帝王切開した。得られたキメラマウスは離乳まで飼育し、離乳時に毛色によりキメラ率を判定した。なお、キメラ率は、体全体の毛色率を目視によって判定した。ａ６２２１由来のＥＳ細胞からは、１００％キメラマウスが５匹得られたが、それ以外はキメラ率が低かった（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　上記のａ６２１１から得られた１００％キメラマウスと野生型マウスとの交配でＦ１産子を作製した。その結果、全てのキメラからＥＳ由来の個体が得られた。Ｆ１産子の体組織よりＤＮＡ抽出後、ヒト化アレルに特異的なｐｒｉｍｅｒ（図７）を用いたＰＣＲ条件により、ヒト化されたｅｘｏｎを検出した。その結果、ｅｘｏｎ１、ｅｘｏｎ２、ｅｘｏｎ４については、全ての個体についてｅｘｏｎがヒト化されており、ｅｘｏｎ３では、１６匹（♂８匹、♀８匹）についてｅｘｏｎがヒト化されていることが確認された（図８）。次に、全てのｅｘｏｎがヒト化された１６個体（Ｎｏ．Ｆ１−１，Ｆ１−３，Ｆ１−５，ＦＩ−６，Ｆ１−７，Ｆ１−８，Ｆ１−９，Ｆ１−１２，Ｆ１−１４，Ｆ１−１５，Ｆ１−１９，Ｆ１−２０，ＦＩ−２５，Ｆ１−２８，Ｆ１−３０，Ｆ１−３３）の各ｅｘｏｎについて、ヒト化された配列に想定外の変異がないことを確認するため、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅにより塩基配列を解析した。
まず、エクソン１、エクソン２を含む２．９ｋｂｐのＤＮＡ領域を図９上に示したプライマーを用い、図９左に示したＰＣＲ条件により増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　いずれも２．９ｋｂのバンドが検出された（図９右）。これらのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで処理することでマウス配列を消化（１．８ｋｂｐ，１．１ｋｂｐ）し（図９右下）、ＢａｍＨＩで切断されなかったヒト化配列（２．９ｋｂｐ）を精製した後、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅした。その結果、ヒト化された１６個体について、エクソン１（図１０）及びエクソン２（図１１）とも想定された配列と相違ないことが確認された。図１０において、マウスエクソン１の塩基配列を配列番号２５、ヒトエクソン１の塩基配列を配列番号２６に示す。図１１において、マウスエクソン２の塩基配列を配列番号２７、ヒトエクソン２の塩基配列を配列番号２８に示す。
　なお、ＥＳ細胞クローン（ａ６２２１）で確認されたｉｎｔｒｏｎ　１の変異は認められなかった。よってこの変異は、ＰＣＲ増福時のエラーと考えられる。同様に、エクソン３を含む１０９６ｂｐのＤＮＡ領域を、図１２上に示したプライマー（下記）を用い、図１２左に示したＰＣＲ条件により増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
これらのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで処理することでマウス配列を消化（６５９ｂｐ，４３７ｂｐ）し（図１２右下）、ＥｃｏＲＩで切断されなかったヒト化配列（１０９６ｂｐ）を精製した後、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅした。その結果、全てのｅｘｏｎがヒト化された１６個体について、想定された配列と相違ないことが確認された（図１３）。図１３において、マウスエクソン３の塩基配列を配列番号３２、ヒトエクソン３の塩基配列を配列番号３３に示す。
さらに、エクソン４を含む１５４３ｂｐのＤＮＡ領域を、図１４上に示したプライマー（下記）を用い、図１４左に示したＰＣＲ条件により増幅した（図１４右）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
これらのＰＣＲ産物をＭｓｃＩで処理することでマウス配列を消化（８６３ｂｐ，６８０ｂｐ）し（図１４右下）、ＭｓｃＩで切断されなかったヒト化配列（１５４３ｂｐ）を精製した後、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅした。その結果、全てのｅｘｏｎがヒト化された１６個体について、想定された配列と相違ないことが確認された（図１５）。図１５において、マウスエクソン４の塩基配列を配列番号３７、ヒトエクソン４の塩基配列を配列番号３８に示す。
　また、配列決定だけでは解析できない大きなゲノムの以上の有無を解析するため、全てのｅｘｏｎがヒト化された１６個体について、サザン・ハイブリダイゼーションにより解析した。この解析によって、いずれの制限酵素においても、５’側（図１６）及び３’側（図１７）とも、想定されるＤＮＡ断片のみ（５’ｐｒｏｂｅは１１．４ｋｂ，３’側は８．６ｋｂ）が検出された。以上の結果、１６匹（♂８匹、♀８匹）のＦ１マウスが、ヘテロ接合体マウスであると判定した。表４に解析結果をまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
エクソンヒト化マウス（ＴｔｒｈＴＴＲｅｘｏｎ）の評価
　エクソンヒト化遺伝子の発現は、以下の事項を単独で又は適宜組み合わせて検査することで確認することができる。
　エクソンヒト化遺伝子の発現の組織特性は、各臓器・組織から抽出したＲＮＡを用いてのノザンブロット法により解析した。野生型マウス（Ｔｔｒ＋／＋）およびＴＴＲ遺伝子エクソンヒト化マウス（ＴｔｒｈＴＴＲｅｘｏｎ／ｈＴＴＲｅｘｏｎ）について、生後１２週齢マウスから脳、眼球、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋を摘出・ＲＮＡ抽出し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを２μｇあるいは１０μｇとなるように調製した。そこに等量のＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ（登録商標）−Ｇｌｙ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．，＃ＡＭ８５５１）を加え混合し、１％ホルマリン変性ゲルにて電気泳動を行った。泳動後、２０×ＳＳＣを使用しキャピラリー法にてナイロンメンブレンにブロッティングした。ブロッティング後、メンブレンを風乾しＵＶクロスリンカーにてメンブレン上にＲＮＡを固定した。このメンブレンのうち、２μｇのＲＮＡを使用したものをｂｅｔａ−ａｃｔｉｎプローブ、１０μｇのＲＮＡを使用したものをＴｔｒプローブに使用することとした。
　野生型マウスのマウスＴｔｒとＴＴＲ遺伝子エクソンヒト化マウスのヒトＴＴＲをノザンブロットで検出するため、双方に共通する配列である５’ＵＴＲにＴｔｒプローブを設計した（図１８左上）。Ｔｔｒ遺伝子を検出するためのプローブは、プライマーＴｔｒ−５’ＵＴＲ−Ｆ１（５’−ＣＴＡ　ＡＴＣ　ＴＣＣ　ＣＴＡ　ＧＧＣ　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＣＡＴ　Ａ−３’（配列番号３９））およびＴｔｒ−５’ＵＴＲ−Ｒ２（５’−ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＴＣＣ　ＴＧＴ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　ＧＴＧ　Ｇ−３’（配列番号４０）を使用し、野生型マウスのｃＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行い、増幅した１９６ｂｐのフラグメントを精製して調製した。フラグメント精製後、ＡｌｋＰｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いキットに付属するプロトコルに従いプローブのラベルを行った。これを野生型マウスの肝臓から抽出した１０μｇのＲＮＡを電気泳動後にブロッティングしたメンブレンとラベルしたＴｔｒプローブを用いて、５５℃で１８時間ハイブリダイゼーションを行なった。その結果、ＴｔｒｈＴＴＲｅｘｏｎ／ｈＴＴＲｅｘｏｎおよびＴｔｒ＋／＋の脳、眼、肝臓において、特異的なシグナルが検出された（図１８中）。エクソンヒト化遺伝子もマウス内在性Ｔｔｒ遺伝子の発現パターンは同じであった。
　インターナルコントロールとしてｂｅｔａ−ａｃｔｉｎをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎプローブの位置を、図１８右上に示した。プライマー５’−ＧＧＴ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣ　ＴＣＣ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＧ−３’（配列番号４１）および５’−ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＴＡＧ　ＴＣＴ　ＧＴＣ　ＡＧＧ　ＴＣ−３’（配列番号４２）を使用し、マウス肝臓ｃＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲにより増幅し、このフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫにクローニングした。プラスミドから制限酵素で切り出したプローブＤＮＡを、Ｔｔｒプローブ調製と同様の手順でプローブをラベルし、５５°Ｃで１８時間ハイブリダイゼーションを行った。その結果、エクソンヒト化マウス及び野生型マウスにおいて同様のパターンで検出された（図１８下）。
　ＴＴＲタンパクは、肝臓で生産され血液中に分泌される。そのため、血中のＴＴＲを測定することで、発現量を正確に解析できる。ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法あるいはウエスタンブロット法が用いられるが、ヒトＴＴＲの場合は市販のＥＬＩＳＡ測定キットにより測定した。
　ＥＬＩＳＡによるヒトＴＴＲの濃度測定は、下記のＴＴＲ測定ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ，ＴＴＲ）ＥＬＳＩＡ　ｋｉｔ、メーカー・型番：ＡｓｓａｙＰｒｏ・ＥＰ３０１０・１）を用いて、ヒトＴＴＲ濃度を、生後１２週齢のＴｔｒｈＴＴＲｅｘｏｎ／ｈＴＴＲｅｘｏｎマウスの雌雄各５匹の血清を用いて測定した。
各検体の測定濃度は、キット付属標準品を用いて得られた検量線（３１．２５，７．８１，１．９５，０．４９，０．１２，０ｎｇ／ｍｌ）から決定した。各検体の血清濃度は測定濃度と希釈倍率より補正し算出した。その結果、ＴｔｒｈＴＴＲｅｘｏｎ／ｈＴＴＲｅｘｏｎの雌では１５２．４２±８．９７μｇ／ｍｌ、雄では１８５．７２±１４．７９μｇ／ｍｌであった（図１９左）。
　マウスのＴＴＲは、ウエスタンブロット法で測定した。生後１２週齢の野生型マウスＴｔｒ＋／＋の血清を用い、ウエスタンブロット解析によるマウスＴＴＲ濃度測定を行った。マウスＴＴＲ検出抗体として、抗ＴＴＲ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，１１８９１−１−ＡＰ）を用い、検量線作成については、リコンビナントマウスＴＴＲ（ｍＴＴＲ：ＬｉｆｅＳｐａｎ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＳ−Ｇ１２７１９）を用いた。その結果、Ｔｔｒ＋／＋の雌では１３７．９３±４．３７μｇ／ｍｌ、雄では１３６．２７±４．５９μｇ／ｍｌであった（図１９右）。
　以上から、ＴｔｒｈＴＴＲｅｘｏｎ／ｈＴＴＲｅｘｏｎのヒトＴＴＲ量と、のマウスＴＴＲ量はほぼ同じであることが分かった。
野生型エクソンヒト化ヘテロマウス（Ｔｔｒ＋／ｈＶ３０ｅｘｏｎ）からのホモマウス（ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＶ３０ｅｘｏｎ）の作製
　樹立済みの野生型エクソンヒト化ヘテロマウス（Ｔｔｒ＋／ｈＶ３０ｅｘｏｎ）を交配し野生型エクソンヒト化ホモマウス（ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＶ３０ｅｘｏｎ）を多数得ることができる。
　ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＶ３０ｅｘｏｎのからの変異型エクソンヒト化ヘテロマウス（ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎ）の作製
　メスのＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＶ３０ｅｘｏｎの過剰排卵により得られた卵子と、オスのＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＶ３０ｅｘｏの精子を用いての体外受精により、多数のＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＶ３０ｅｘｏｎの受精卵を得る。受精卵に、ｃｒＲＮＡ，ｔｒａｃｒＲＮＡ，Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ，ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を、すでに確立されている電気穿孔法にて導入する（図２０）。ｃｒＲＮＡ，ｔｒａｃｒＲＮＡ，ｓｓＤＮＡの配列は図２１に示した（配列番号４３~４７）。注入後の受精卵において、ドナーオリゴとゲノム上のヒトＴＴＲ遺伝子との間で相同組換えが起こり、３０番目のＧＴＧがＡＴＧに置換される。２細胞期胚になったところで仮親の卵管に移植し、産子を得る。生まれたマウスのジェノタイピングを行い、野生型と変異型のエクソンをヘテロで持つＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスを選別する。
　ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスからのＴｔｒｈＭ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎおよびＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎの増産
　上記で得られたＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスを交配しただけでは、その１／２しかＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスにならないので、効率が悪い。そこで、まずはＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスの交配によりＴｔｒｈＭ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎを多数得る。その後、ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＶ３０ｅｘｏｎとＴｔｒｈＭ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎの卵子および精子を用いて体外受精を行うと、全てがＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎの遺伝子型となる。これによりＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスを増産できる。ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスは、ヒト患者と同じ遺伝子型であり、次に述べる遺伝子治療実験に用いることができる。
　ヒト野生型ＴＴＲ遺伝子（ＴＴＲＶａｌ３０）およびヒト変異型ＴＴＲ遺伝子（ＴＴＲＭｅｔ３０）の同時破壊
ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスを用いて、野生型と変異型の遺伝子の両方とも破壊する実験、および変異型遺伝子だけを破壊する実験が可能である。まず、前者について述べる。ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎの肝臓内のＴＴＲ遺伝子を破壊するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いる。遺伝子発現を完全に抑制するためには、翻訳開始コドンであるＡＴＧを破壊するのが一番確実である。このため、ＣＣＴｏｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ）というネット上のサイトを用い、ｔａｒｇｅｔ配列を検索した。ＰＡＭ配列の上流３ｂｐのところで２本鎖切断が起こると言われているので（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３７：８１６−８２１，２０１２）、ＡＴＧを含むＴＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡ（ＴＧＧ）（配列番号４８：右端のＴＧＧがＰＡＭ配列となる。下線がＡＴＧ）が一番良い配列であった。
　この切断活性をすでに述べたＭａｓｈｉｋｏらの方法で評価できる（Ｍａｓｈｉｋｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：３３５５，２０１３）。標的配列を中心付近に含む０．５ｋｂ−１．０ｋｂ程度の遺伝子断片をプラスミドｐＣＡＧ−ＥＧｘｘＦＰ（ａｄｄｇｅｎｅより入手）のマルチクローニングサイトに導入する。ｐＣＡＧ−ＥＧｘｘＦＰはＥＧＦＰ遺伝子について約５００ｂｐほどの重複配列を持ったＮ末端側とＣ末端側の配列であり、標的配列（０．５−１．０ｋｂ）を挟むような構造になっている。ターゲット配列を導入したｐＣＡＧ−ＥＧｘｘＦＰとガイドＲＮＡ配列を導入したｐＸ３３０をＨＥＫ２９３細胞に共導入する。ＨＥＫ２９３細胞内でｇＲＮＡとＣＡＳ９が発現し、ｐＣＡＧ−ＥＧｘｘＦＰに導入された標的配列に結合し二本鎖切断が起こる。するとＮ末側のＥＧＦＰとＣ末側のＥＧＦＰ配列の重複部分が遺伝子相同組換えやシングルストランドアニーリングを起こし、完全なＥＧＦＰ配列として組換えを起こし、ＥＧＦＰが発現し、緑色の蛍光を発するようになる。つまり、緑色蛍光を発する細胞数を比較することにより、各標的配列に対する切断活性を相対的に評価し、最も効率の高い標的配列を決定することができる。上記の配列をｐＸ３３０に組込み、ｐＸ３３０−ＡＴＧを作製した（図２２）。図２２において、Ｃａｓ９のターゲット配列を配列番号４９に示し、ターゲット配列の５’側に「ｃａｃｃ」、３’側に「ｃａａａ」配列を付加した配列を配列番号５０に示す。
　ｐＸ３３０−ＡＴＧの肝臓への配送
　６週齢前後のＴｔｒｈＶ３０ｅｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎ の尾静脈から、ｐＸ３３０−ＡＴＧを５０μｇ含む溶液２ｍｌ（マウス体重２０ｇとしてその１／１０量）を、５−７秒以内に注入する（ハイドロダイナミック法：Ｌｅｗｉｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２：１０７−１０８，２００２）。この方法で、最大８０％の肝細胞へｐＸ３３０−ＡＴＧを導入できる。
　ＴＴＲ遺伝子破壊の評価
　肝臓内のＴＴＲ遺伝子の破壊の程度を、以下の方法で評価できる。
（１）肝臓のＤＮＡ解析：８週齢ごろに、部分肝切除を行う。ＤＮＡを抽出し、ＡＴＧ付近の塩基配列を解析し、残存する野生型ＴＴＲ、変異型ＴＴＲ、挿入や欠失変異の頻度を解析する。
（２）血中ＴＴＲ濃度：３ヶ月齢、６ヶ月齢、１２ヶ月齢、１８ヶ月齢、２４ヶ月齢、の時点で、血清中のヒトＴＴＲをＥＬＩＳＡ法で測定する。血中濃度測定によっても、ＴＴＲ遺伝子がどの程度破壊されたかが推定できる。ＤＮＡの解析データと照合する。
（３）非線維性ＴＴＲ沈着の解析：アミロイド沈着に先行して早ければ１ヶ月齢頃から非線維性ＴＴＲの沈着（ｎｏｎ−ｆｉｂｒｉｌｌａｒ　ＴＴＲ　ｄｅｐｏｓｉｔ）が見られ、アミロイド沈着は、早くて生後１年後からである。そこで３ヶ月齢、６ヶ月齢、１２ヶ月齢、１８ヶ月齢、２４ヶ月齢（各群１０匹を目標とする）の時点で剖検を行い、消化管、腎臓、心臓、坐骨神経、脾臓を摘出し、固定したのち、組織切片を作製する。切片を用いて、抗ＴＴＲ抗体及び抗血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）抗体による免疫染色を行う。抗ＳＡＡ抗体を用いると、炎症等に伴うアミロイド沈着を解析でき、鑑別診断ができる。また、今後レッド染色を行い、アミロイド沈着も解析する。
（４）上記のデータを総合し、ＴＴＲ遺伝子の破壊の比率と血中ＴＴＲ濃度、非線維性ＴＴＲ量との相関を解析し、遺伝子破壊による治療の可能性を明らかにする。
　ヒト変異型ＴＴＲ遺伝子（ＴＴＲＭｅｔ３０）のみの破壊
　ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎマウスを用いて、変異型の遺伝子のみ破壊する実験が可能である。ＴｔｒｈＶ３０ｅｘｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎの肝臓内のＴＴＲ遺伝子を破壊するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いる。変異型のみを破壊するためには、３０番目のアミノ酸であるメチオニンをコードするＡＴＧを持つ遺伝子のみを破壊する。このため、ＣＣＴｏｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ）というネット上のサイトを用い、ｔａｒｇｅｔ配列を検索した。ＰＡＭ配列の上流３ｂｐのところで２本鎖切断が起こると言われているので（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３７：８１６−８２１，２０１２）、ＡＴＧを含むＴＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡ（ＴＧＧ）（配列番号４８：右端のＴＧＧがＰＡＭ配列となる。下線がＡＴＧ）が一番良い配列であった（図２３）。図２３において、Ｃａｓ９のターゲット配列を配列番号５１に示し、ターゲット配列の５’側に「ｃａｃｃ」、３’側に「ｃａａａ」配列を付加した配列を配列番号５２に示す。この切断活性をすでに述べたＭａｓｈｉｋｏらの方法で評価できる（Ｍａｓｈｉｋｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：３３５５，２０１３）。
　ｐＸ３３０−ＭＥＴ３０の肝臓への配送
　６週齢前後のＴｔｒｈＶ３０ｅｏｎ／ｈＭ３０ｅｘｏｎ の尾静脈から、ｐＸ３３０−ＡＴＧを５０ｕｇ含む溶液２ｍｌ（マウス体重２０ｇとしてその１／１０量）を、５−７秒以内に注入する（ハイドロダイナミック法：Ｌｅｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２：１０７−１０８，２００２）。この方法で、最大８０％の肝細胞へｐＳ３３０−ＡＴＧを導入できる。
　ＴＴＲ遺伝子破壊の評価
　肝臓内のＴＴＲ遺伝子の破壊の程度を、以下の方法で評価できる。
（１）肝臓のＤＮＡ解析：８週齢ごろに、部分肝切除を行う。ＤＮＡを抽出し、３０番目のＡＴＧ付近の塩基配列を解析し、残存する野生型ＴＴＲ、変異型ＴＴＲ、挿入や欠失変異の頻度を解析する。
（２）血中ＴＴＲ濃度：３ヶ月齢、６ヶ月齢、１２ヶ月齢、１８ヶ月齢、２４ヶ月齢、の時点で、血清中のヒトＴＴＲをＥＬＩＳＡ法で測定する。血中濃度測定によっても、ＴＴＲ遺伝子がどの程度破壊されたかが推定できる。ＤＮＡの解析データと照合する。
（３）非線維性ＴＴＲ沈着の解析：アミロイド沈着に先行して早ければ１ヶ月齢頃から非線維性ＴＴＲの沈着（ｎｏｎ−ｆｉｂｒｉｌｌａｒ　ＴＴＲ　ｄｅｐｏｓｉｔ）が見られ、アミロイド沈着は、早くて生後１年後からである。そこで３ヶ月齢、６ヶ月齢、１２ヶ月齢、１８ヶ月齢、２４ヶ月齢（各群１０匹を目標とする）の時点で剖検を行い、消化管、腎臓、心臓、坐骨神経、脾臓を摘出し、固定したのち、組織切片を作製する。切片を用いて、抗ＴＴＲ抗体及び抗血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）抗体による免疫染色を行う。抗ＳＡＡ抗体を用いると、炎症等に伴うアミロイド沈着を解析でき、鑑別診断ができる。また、今後レッド染色を行い、アミロイド沈着も解析する。
（４）上記のデータを総合し、ＴＴＲ遺伝子の破壊の比率と血中ＴＴＲ濃度、非線維性ＴＴＲ量との相関を解析し、遺伝子破壊による治療の可能性を明らかにする。
　本発明により、Ｔｔｒ遺伝子のエクソンをヒト化したエクソンヒト化ＴＴＲ遺伝子それが挿入されたＥＳ細胞とそのＥＳ由来のエクソンヒト化マウスが提供される。ヒトＴＴＲ遺伝子の変異により優性遺伝病である家族性アミロイドポニューロパチーが発症する。本発明のマウスを用いて、ヒトＴＴＲ遺伝子に変異を導入し、ヒト疾患モデルマウスを作製できる。このマウスを用いて、ヒトＴＴＲ遺伝子を肝臓内で破壊する、いわゆる遺伝子治療実験が可能となり、治療効果を調べる非臨床試験を実施することができる。
　配列番号１：合成ＤＮＡ
　配列番号２：合成ＤＮＡ
　配列番号１２~２４：合成ＤＮＡ
　配列番号２９~３１：合成ＤＮＡ
　配列番号３４~３６：合成ＤＮＡ
　配列番号３９~４４：合成ＤＮＡ
　配列番号４５：合成ＤＮＡ／ＲＮＡ
　配列番号４６：合成ＲＮＡ
　配列番号４７~５２：合成ＤＮＡ

Claims (9)

  1. マウスのゲノムに含まれるｎ個のエクソンにより構成される標的遺伝子の当該ｎ個のエクソンを含む断片のうち、前記ｎ個のエクソンが、対応するヒト標的遺伝子のエクソンにそれぞれ置換された断片を含む、ドナーベクター。
  2. 標的遺伝子がトランスサイレチン遺伝子である、請求項１に記載のドナーベクター。
  3. 第１番目のエクソンの直ぐ上流でゲノムを切断するためのガイドＲＮＡを発現するベクターであって、切断の標的配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＤＮＡ切断酵素をコードするＤＮＡを含む前記ベクター。
  4. 第ｎ番目のエクソンの直ぐ下流でゲノムを切断するためのガイドＲＮＡを発現するベクターであって、切断の標的配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＤＮＡ切断酵素をコードするＤＮＡを含む前記ベクター。
  5. 請求項１又は２に記載のドナーベクター、並びに請求項３及び４に記載のベクターをＥＳ細胞に導入することにより、イントロン部分はマウス遺伝子の塩基配列、エクソン部分はヒト遺伝子の塩基配列で置換された、エクソンヒト化ＥＳ細胞。
  6. 請求項５に記載のＥＳ細胞を用いて作出されたエクソンヒト化マウス。
  7. マウス遺伝子のエクソンをヒト遺伝子のエクソンで置換したエクソンヒト化マウスの作製方法であって、以下の工程：
    （ａ）請求項１又は２に記載のドナーベクター、並びに請求項３及び４に記載のベクターをＥＳ細胞に導入する工程、
    （ｂ）工程（ａ）で得られたＥＳ細胞からキメラ胚を作出し、当該キメラ胚を仮親に移植することによりキメラマウスを作出する工程、並びに
    （ｃ）工程（ｂ）で得られたキメラマウスのうち雄マウスを雌マウスと交配し、子マウスを出産させる工程
    を含む、前記方法。
  8. 請求項６に記載のエクソンヒト化マウスのエクソンに、疾患に関与する遺伝子変異を導入することを特徴とする、疾患モデルマウスを作製する方法。
  9. 請求項６に記載のエクソンヒト化マウス、又は請求項８に記載の方法により作製された疾患モデルマウスを含む、遺伝子治療用実験動物。
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