JP2013535202A - トランスジェニック動物および使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞および非ヒト哺乳類を含み、前記導入された領域は、ヒトＶ_Ｈコード配列、および非ヒト哺乳類の内在性ゲノムに基づいた非コードＶ_Ｈ配列を含む。

Description

本発明は、トランスジェニック脊椎動物に関し、より具体的にはヒト治療法を開発するためのトランスジェニック脊椎動物に関する。

ヒト免疫グロブリンおよびマウス免疫グロブリンをコード化している遺伝子は、徹底的に特性化されている。非特許文献１は、Ｖ_Ｈ,Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｈ遺伝子セグ
メントを含むヒトＩ_ｇＶ_Ｈ遺伝子座について記述している。非特許文献２は、免疫グロブリン重鎖遺伝子の多様性セグメントについて記述している。非特許文献３は、マウス重鎖可変領域について記述している。トランスジェニック動物、たとえば変更された免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス等の産生により、様々な調査研究および開発応用、たとえば、創薬および様々な生体系の基礎研究で、そのようなトランスジェニック動物を使用することが可能になった。ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスの産生は、特許文献１および特許文献２に記述されている。特許文献２は、組込まれたヒト免疫グロブリン「ミニ」遺伝子座を有するトランスジェニックマウスについて記述している。特許文献１は、トランスジェニック動物の産生に使用するための免疫グロブリン優性制御領域を含むベクターについて記述している。

創薬目的で、部分的ヒト抗体または完全ヒト抗体を作り出すために、内在性マウス免疫グロブリン領域を、ヒト免疫グロブリン配列と置換するための数多くの方法が開発されている。そのようなマウスの例としては、たとえば、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０に記述されているもの等が挙げられる。

国際公開第９０／１００７７号 国際公開第９０／０４０３６号 米国特許第７，１４５，０５６号明細書 米国特許第７，０６４，２４４号明細書 米国特許第７，０４１，８７１号明細書 米国特許第６，６７３，９８６号明細書 米国特許第６，５９６，５４１号明細書 米国特許第６，５７０，０６１号明細書 米国特許第６，１６２，９６３号明細書 米国特許第６，１３０，３６４号明細書 米国特許第６，０９１，００１号明細書 米国特許第６，０２３，０１０号明細書 米国特許第５，５９３，５９８号明細書 米国特許第５，８７７，３９７号明細書 米国特許第５，８７４，２９９号明細書 米国特許第５，８１４，３１８号明細書 米国特許第５，７８９，６５０号明細書 米国特許第５，６６１，０１６号明細書 米国特許第５，６１２，２０５号明細書 米国特許第５，５９１，６６９号明細書

バーマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら、（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：７２７−７３８ サカノ（Ｓａｋａｎｏ）ら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：５６２−５６５ ブランケンシュタイン（Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ）およびクルウィンケル（Ｋｒｕｗｉｎｋｅｌ）、（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３５１−１３５７

完全にヒト化された免疫グロブリンマウスの多くは、低効率Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えのため、通常の率より抗体産生が低く、また部分的遺伝子補体が原因で抗体産生が制限される。マウスコード配列がヒト配列と「交換」されている他のマウスの産生は、シンテニーのヒト対応物と個々のマウスエクソンとを置換するその手法のため、非常に時間がかかり且つ高価である。

前述により、ヒト抗体を効率よく産生する能率的且つ対費用効果の高い方法が必要なことは明白である。より具体的には、ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物、および抗原に適切に応答する能力を有するトランスジェニック動物が当該技術分野で必要である。

前述の目的に従って、ヒトＶ領域を有する抗体を生産できるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
この概要は、下記「発明の詳細な説明」でさらに後述する概念の一部を簡略化された形で紹介するために提供する。この概要は、請求する主題の重要な特徴または必須の特徴を確認することを意図するものではなく、また請求された主題の範囲を制限するために用いられることを意図するものでもない。請求する主題の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付図面に図示されたり、別記の特許請求の範囲に明記されたりしている態様を含む、「発明の詳細な説明」から明白になるであろう。

本発明は、非ヒト脊椎動物細胞、および導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物を含み、導入された領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座コード配列、および非ヒト脊椎動物の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列を含む。好ましくは、本発明のトランスジェニック細胞およびトランスジェニック動物は、内在性免疫グロブリン領域の一部または全部が除去されているゲノムを有する。

最低でも、非ヒト脊椎動物におけるヒトモノクローナル抗体の産生には、宿主が、ヒト重鎖免疫グロブリン蛋白質を発現する少なくとも１つの遺伝子座およびヒト軽鎖免疫グロブリン蛋白質を発現する１つの遺伝子座を有することが必要である。

幾つかの態様で、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ヒトＶ_Ｈコード配列および非ヒト脊椎動物の内在性Ｖ_Ｈ領域に基づいた非コードＶ_Ｈ配列を含む。これらの態様で、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列ならびに非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子配列およびＪ遺伝子配列をさらに含む。

他の態様で、免疫グロブリン領域は、ヒトＶ_Ｌコード配列および非ヒト脊椎動物の内在性Ｖ_Ｌ領域に基づいた非コードＶ_Ｌ配列を含む導入領域を含む。より好ましくは、導入されたヒトＶ_Ｌコード配列を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＪ遺伝子コード配列および非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＪ遺伝子配列をさらに含む。

ある特定の態様で、脊椎動物は哺乳類であり、好ましくは哺乳類は、齧歯類、たとえば、マウスまたはラットである。他の態様で、脊椎動物は鳥類、たとえば、ニワトリである。

具体的な一態様で、本発明は部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法を提供し、該方法は：ａ）非ヒト脊椎動物細胞内に２以上のリコンビナーゼ標的部位を導入し、細胞のゲノム上流における少なくとも１つの部位と、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むゲノム領域の下流の少なくとも１つの部位を統合するステップ；およびｂ）ヒト免疫グロブリン可変領域コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を、リコンビナーゼ仲介交換によって、非ヒト脊椎動物宿主細胞内に導入するステップを含む。

この方法の具体的な態様で、導入される部分的ヒト免疫グロブリン領域はヒトＶ_Ｈ遺伝子コード領域を含み、ｉ）ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列ならびにｉｉ）非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列をさらに含む。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、好ましくは、内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性Ｄ遺伝子領域およびＪ遺伝子領域の下流に導入されるリコンビナーゼ標的部位を使用して宿主細胞内に導入される。

他の態様で、Ｖ_Ｈ遺伝子コード領域は、（少なくとも部分的に）他のソースに由来する−たとえば、それらは合理的に設計されたまたは別の方法で設計された配列、ヒト配列と他の設計された配列の組合せである配列、あるいは非ヒト霊長類等の、他種由来の配列であってもよい。

さらに別の具体的な態様で、導入される部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＶ_Ｌ遺伝子コード領域を含み、ｉ）ヒトＪ遺伝子コード配列およびｉｉ）非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＪ遺伝子配列を、さらに含む。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、好ましくは、内在性Ｖ_Ｌ免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性Ｊ領域の下流に導入されるリコンビナーゼ標的部位を使用して宿主細胞内に導入される。

好ましくは、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、単一の核酸として合成され、単一の核酸領域として非ヒト脊椎動物宿主細胞内に導入される。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、２つ以上の連続したセグメントで合成することも可能であり、これらの不連続のセグメントで脊椎動物宿主細胞に導入してもよい。部分的ヒト核酸は、組換え方法を使用して産生することもでき、非ヒト脊椎動物宿主細胞への導入前に単離することもできる。

別の好ましい態様で、本方法は、ステップｂ）の前に、２つの導入されたリコンビナーゼ部位に挟まれたゲノム領域の欠失をさらに提供する。
別の態様で、本発明は部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法を提供し、該方法は：ａ）少なくとも１つの組換え部位が内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上流に導入され、且つ少なくとも１つの組換え部位が内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の下流に導入される、互いに組換えができない２つ以上の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップ；ｂ）ｉ）ヒ
ト免疫グロブリン可変領域コード配列とｉｉ）内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列を有する部分的ヒト免疫グロブリン領域とを含むベクターを、宿主細胞に提供するステップあって、上記部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ａ）の宿主細胞の内在性可変免疫グロブリン領域の両側に位置するものと同一の２つの部位特異的組換え部位に挟まれているステップ；ｃ）ステップｂ）のベクター、および２つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入するステップ；ｄ）ａ）の細胞のゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、部分的ヒト免疫グロブリン領域遺伝子座で置換されるステップ；を含む。この方法の具体的な態様で、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子コード配列を含み、またｉ）ヒト遺伝子コード配列ＤおよびＪ遺伝子コード配列ならびにｉｉ）非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列をさらに含む。リコンビナーゼ標的部位は、内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子の上流ならびに内在性Ｄ遺伝子配列およびＪ遺伝子配列の下流に導入される。

この方法の別の具体的な態様で、本方法は、ステップｃ）の前に、２つの導入リコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域の欠失をさらに提供する。
本発明は、トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞を産生するためのまた別の方法を提供し、該方法は：ａ）互いに組換えができず、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン領域の一部の両側に位置する、２組の部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞を提供するステップ；ｂ）第１組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入により、そのゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上記一部を欠失させるステップであって、ゲノムにおけるそのような欠失が、第２組の部位特異的組換え部位を保持するステップ；ｃ）ヒトコード配列と、第２組の部位特異的組換え部位に挟まれた内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むベクターを提供するステップ；ｄ）ステップｃ）のベクターおよび第２組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入するステップ；およびｅ）細胞のゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座で置換されるステップ；を含む。

好ましくは、上記各方法で使用するための非ヒト哺乳類細胞は哺乳類細胞であり、より好ましくは哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞である。他の態様で、細胞は鳥類細胞、好ましくは鳥類始原生殖細胞であってもよい。

いったん、細胞が内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の置換を受けると、導入された部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含む細胞が選択され、好ましくは単離される。本発明の好ましい態様で、細胞は非ヒト哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞であり、単離されたＥＳ細胞は、次に、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類を作り出すために利用される。他の態様で、細胞は始原生殖細胞であり、この単離された生殖細胞は、次に、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を発現するトランスジェニック非ヒト鳥を作り出すために利用される。

具体的な態様で、本発明は、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト哺乳類細胞を産生する方法を提供し、該方法は：ａ）互いに組換えができず、免疫グロブリン領域の一部の両側に位置する２つの部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞を提供するステップ；ｂ）ヒト免疫グロブリン可変領域コード配列、および内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列を含む、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、上記部分的ヒト領域は、ＥＳ細胞において免疫グロブリン領域の上記一部の両側に位置するものと同一の２つの部位特異的
組換え部位で挟まれているステップ；ｃ）免疫グロブリン領域の内在性部分を、ＥＳ細胞における部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する結果となる組換え事象を促進する適切な条件下で、ＥＳ細胞およびベクターを、２つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させるステップ；を含む。

別の態様で、本発明は、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類を産生する方法を提供し、該方法は：ａ）互いに組換えができない１つまたは複数の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップ；ｂ）ｉ）ヒト可変コード配列およびｉｉ）内在性可変領域に基づいた非コード配列を有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、上記部分的ヒト領域は、ａ）の宿主細胞のゲノムに導入されるものと同じ部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；ｃ）ステップｂ）のベクター、および１組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを、細胞に導入するステップ；ｄ）ａ）の細胞のゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域が部分的ヒト免疫グロブリン領域で置換されるステップ；ｅ）部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ；およびｆ）その細胞を、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すために利用するステップ；を含む。

具体的な態様で、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＶ_Ｈコード領域、ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列、および非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列を含む。また、部位特異的組換え部位を、内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性Ｄ遺伝子領域およびＪ遺伝子領域の下流に導入する。

本発明は、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト動物を産生する別の方法を提供し、該方法は：ａ）互いに組換えができず、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の一部の両側に位置する、２組の部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞を提供するステップ；ｂ）第１組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入によって宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上記一部を欠失させるステップであって、ゲノムにおけるそのような欠失が、第２組の部位特異的組換え部位を保持するステップ；ｃ）ヒトコード配列、および内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列を含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むベクターを提供するステップであって、これらのコード配列および非コード配列が第２組の部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；ｄ）ステップｃ）のベクター、および第２組の部位特異的組換え部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入するステップ；ｅ）細胞のゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン可変領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン可変領域との置換を生じさせるステップ；ｆ）部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含む細胞を選択するステップ；およびｇ）その細胞を、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含むトランスジェニック動物を作り出すために利用するステップ；を含む。

本発明は、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生するまた別の方法を提供し、該方法はａ）互いに組換えることができず、免疫グロブリン領域の一部の両側に位置する、２つの部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞を提供するステップ；ｂ）ヒト可変コード配列、および内在性可変遺伝子領域に基づいた非コード配列を含む、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、上記部分的ヒト領域は、ＥＳ細胞における免疫グロブリン領域のその部分の両側に位置するものと同一の２つの部位特異的組換え部位で
挟まれているステップ；ｃ）ＥＳ細胞において、免疫グロブリン領域の内在性部分を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する結果となる組換え事象を促進する適切な条件下で、上記ＥＳ細胞および上記ベクターを、２つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させるステップ；ｄ）核酸の置換された部分を含むＥＳ細胞を選択し、上記胚性幹細胞を使用するステップ；およびｅ）その細胞を、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むトランスジェニック動物を作り出すために利用して、ヘテロ接合部分的ヒト動物を産生するステップ；を含む。

本発明の具体的な態様で、トランスジェニック非ヒト脊椎動物は哺乳類であり、好ましくは哺乳類は、齧歯類、たとえば、マウスまたはラットである。他の態様で、トランスジェニック非ヒト脊椎動物は鳥類、たとえば、ニワトリである。

本発明の目的は、ヒト可変領域コード配列、および内在性宿主ゲノムに基づいた非コード配列を有する、導入された免疫グロブリン可変領域遺伝子座を発現する非ヒト脊椎動物細胞および非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供することである。

さらに、本発明の目的は、ヒトＶ_Ｈ配列を有する部分的ヒト抗体を発現できるトランスジェニック動物由来のＢ細胞（そのようなＢ細胞は、特定の抗原に特異的なモノクローナル抗体のソースを提供するために不死化されている）を提供することである。

また別の目的は、診断的使用および治療的使用のための抗体の産生および／または最適化で使用するために、Ｂ細胞からクローン化されたヒト可変領域を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト可変領域配列を有する部分的ヒトモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞を提供することである。

これらの態様および他の態様、目的および特徴を、さらに詳細に後述する。

本発明の好ましい実施態様の１つの代表的な方法を説明するフローチャート。 相同ターゲティングベクターによる、非ヒト哺乳類細胞のゲノム内への第１組の部位特異的組換え部位の導入を図示する概略図。 相同ターゲティングベクターによる、非ヒト哺乳類細胞のゲノム内への第１組の部位特異的組換え部位の導入を図示する別の概略図。 相同ターゲティングベクターによる、非ヒト哺乳類細胞のゲノム内への第２組の部位特異的組換え部位の導入を図示する概略図。 宿主細胞の内在性免疫グロブリン領域の欠失を図示する概略図。 部位特異的ターゲティングベクターによる、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入を図示する概略図。 部位特異的ターゲティングベクターを使用した、追加的マウス配列を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入を図示する概略図。 マウス重鎖領域への、追加的マウス配列を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入を図示する概略図。 マウスκ領域への、追加的マウス配列を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入を図示する概略図。 マウスλ領域への、追加的マウス配列を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入を図示する概略図。 部位特異的ターゲティングベクターによる、ヒトＶ_Ｈミニ遺伝子を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入を図示する概略図。

定義
本明細書で使用される用語は、当業者により理解される平易で通常の意味を有することを意図する。以下の定義は、読者が本発明を理解するのに役立つことを意図するが、特に指示がない限り、そのような用語の意味を変更したり制限したりすることを意図しない。

本明細書で使用される「部分的ヒト」は、ヒトおよび非ヒト哺乳類の両者由来の配列を有する核酸、またはヒトおよび非ヒト哺乳類の両者由来の配列を有する核酸を含む動物を指す。本発明の部分的ヒト配列との関連で、部分的ヒト核酸は、ヒト免疫グロブリンコード領域の配列および非ヒト哺乳類の内在性免疫グロブリン領域の非コード配列に基づいた配列を有する。用語「基づいた」は、非ヒト哺乳類由来の内在性非コード配列に関連して使用されるとき、非コード配列に対応する配列を指し、宿主哺乳類、たとえば、ＥＳ細胞に由来する哺乳類の、内在性遺伝子座の非コード配列と比較的高度の相同性を共有する。好ましくは、非コード配列は、非コード配列を含む部分的ヒト分子が導入されようとしている非ヒト脊椎動物宿主細胞の内在性遺伝子座に存在する対応する非コード配列と少なくとも８０％、より好ましくは９０％相同性を共有する。

用語「相同ターゲティングベクター」は、ターゲティング配列、部位特異的組換え部位、および任意選択的に選択可能なマーカー遺伝子をコード化する核酸を含み、宿主細胞において、相同性仲介組換えを使用して免疫グロブリン領域を改変するために使用される、ベクターを指す。たとえば、本発明で相同ターゲティングベクターを使用して、部位特異的組換え部位を宿主細胞ゲノムの特定の領域に導入することができる。

本明細書で使用される用語「免疫グロブリン可変領域」は、抗体分子の可変領域の全部または一部あるいは抗体分子の発現を制御する制御ヌクレオチド配列の全部または一部をコード化するヌクレオチド配列を指す。重鎖に関する免疫グロブリン領域は、イントロンを含む、Ｖ領域，Ｄ領域，Ｊ領域，およびスイッチ領域の全部または一部を含んでもよいが、それらに限定されない。軽鎖に関する免疫グロブリン領域は、軽鎖定常領域遺伝子に付随するまたは隣接する、Ｖ領域およびＪ領域、それらの上流フランキング配列、イントロン、を含むがそれらに限定されない。

「部位特異的組換え」は、以下の３事象のいずれかを含む２つの互換性のある組換え部位間の組換えプロセスを指す：ａ）組換え部位で挟まれた、予め選択された核酸の欠失；ｂ）組換え部位に挟まれた、予め選択された核酸のヌクレオチド配列の反転、およびｃ）異なる核酸分子上に位置する組換え部位に最も近い核酸領域の相互交換。核酸分子の一方または両方が環状であれば、この核酸セグメントの相互交換は、結果的に組み込み事象を生じることを理解すべきである。

用語「ターゲティング配列」は、細胞のゲノムにおいて改変すべき免疫グロブリン領域である領域の側方に位置するかまたは隣接して存在するＤＮＡ配列に相同な配列を指す。フランキング配列または隣接配列は、その遺伝子座自身の中であってもよく、あるいは宿主細胞のゲノムにおけるコード配列の上流または下流であってもよい。細胞ゲノムに挿入される配列（組換え部位の配列等）がベクターのターゲティング配列に挟まれるように、形質移入するために使用される組換えＤＮＡベクターに該ターゲティング配列が挿入される。

本明細書で使用される用語「部位特異的ターゲティングベクター」は、部位特異的組換え部位、部分的ヒト核酸、および任意選択的に選択可能なマーカー遺伝子をコード化している核酸を含み、リコンビナーゼ仲介部位特異的組換えを使用して、宿主における内在性免疫グロブリン領域を改変するために使用されるベクターを指す。ターゲティングベクタ
ーの組換え部位は、宿主細胞のゲノム配列に挿入された（たとえば、相同ターゲティングベクターにより）もう１つの対応する組換え部位との部位特異的組換えに適する。当該組換え部位は、改変すべき免疫グロブリン領域に隣接して挿入される。免疫グロブリン領域における組換え部位への部分的ヒト配列の組み込みは、導入された部分的ヒト領域によって内在性領域の置換を生じさせる結果となる。

用語「導入遺伝子」は、細胞、特に脊椎動物宿主動物の細胞の、ゲノム内に人工的に挿入された、または挿入されようとしている遺伝物質を記述するために、本明細書では使用される。本明細書で使用される用語「導入遺伝子」は、部分的ヒト核酸、たとえば、発現構築物および／またはターゲティングベクターの形の、部分的ヒト核酸を指す。

「トランスジェニック動物」により、染色体外要素として存在する外因性核酸配列を細胞の一部に有するか、または生殖細胞系ＤＮＡに安定的に（すなわち、その細胞の大部分または全部のゲノム配列に）組み込まれた、非ヒト動物、通常は哺乳類を意味する。本発明では、当該技術分野で周知の方法に従って、遺伝子操作により、そうしたトランスジェニック動物の生殖細胞系に部分的ヒト核酸が導入される。当該生殖細胞系としては、たとえば、宿主動物の胚または胚性幹細胞がある。

「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、および、あらゆるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み、自己複製してもしなくてもよく、細胞を形質転換または形質移入することができる。

発明の詳細な説明
本明細書に記載の技法の実行は、他に指示がない限り、当該技術分野で実行する者の技術の範囲内である、有機化学，高分子技術，分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学，生化学、およびシーケンシング技術の、従来の技法および記述を使用することが可能である。このような従来の技法は、ポリマーアレイ合成，ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、ならびに標識を使用したハイブリダイゼーションの検出を含む。好適な技法の具体的な実例は、本明細書の実施例を参照することによって得ることができる。しかし、他の同等の従来の手順も、もちろん、使用することができる。そのような従来の技法および記述は、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら編（１９９９），Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）；ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ），ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ），ステファンズ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）編（２００７），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；ディーフェンバハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ），ドヴェクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）編（２００３），ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；バウテル（Ｂｏｗｔｅｌｌ）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（２００３），ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ；マウント（Ｍｏｕｎｔ）（２００４），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（２００６），Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；および、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全てコールド・スプリング・ハーバー・研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）刊）；ストライラー（Ｓｔｒｙｅｒ），Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）社，ニューヨーク，ニューヨーク州；ゲイト（Ｇａｉｔ），”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”１９８４，ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ），ロ
ンドン；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびコックス（Ｃｏｘ）（２０００），レーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
第３版，Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）社，ニューヨーク，ニューヨーク州；およびバーグ（Ｂｅｒｇ）ら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５版，Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）社，ニューヨーク，ニューヨーク州等の標準的な実験マニュアルで見ることができ、その全てを、全目的のために、参照により全体として本明細書に援用する。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、前後関係が他に明らかに指示しない限り、複数形指示対象を含むことに留意されたい。したがって、たとえば、「ａ ｌｏｃｕｓ（遺伝子座）」への言及は、１つまたは複数の遺伝子座を指し、また「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ（方法）」への言及は、当業者に周知の同等の諸ステップおよび諸方法等々への言及を含む。

他に規定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の全ての出版物は、今記述した発明に関連して使用される可能性がある装置、製剤および方法論を記述および開示するために、参照により組み込まれる。

値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間に入る各値、および何か他の規定値または規定範囲内に入る値は、本発明の中に包含されると理解される。こうしたより小さい範囲の上限および下限は、そのより小さい範囲に独立に含まれ、またその規定された範囲で明確に除外されたあらゆる制限を受けて、本発明の中にも包含される。規定された範囲が限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界の両方ともを除外する範囲も本発明に含まれる。

以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細を述べる。しかし、本発明がこれらの具体的な詳細の１つまたは複数がなくても実行可能なことは、当業者に明白になるであろう。他の場合には、本発明を分かりにくくすることを避けるために、周知の特徴および当業者に周知の手順は記述されていない。

発明全般
体液性免疫系において、多様な抗体レパートリーは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えと呼ばれるプロセスで、ＩｇＨ鎖（Ｉｇｈ）とＩｇＬ鎖（Ｉｇｌ）遺伝子座の組合せ多様性および結合多様性によって生み出される。Ｂ細胞の発生において、生じる最初の組換え事象は、重鎖遺伝子座のＤ遺伝子セグメント１つとＪ遺伝子セグメント１つとの間であり、これらの２つの遺伝子の間のＤＮＡが欠失する。このＤ−Ｊ組換えに続いて、新たに形成されたＤＪ複合体の上流の領域由来のＶ遺伝子１つを結合し、再構成されたＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子を形成する。つぎに、新しいＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子のＶセグメントとＤセグメントの間の他の遺伝子全てを、個々のＢ細胞ゲノムから欠失させる。この再構成された遺伝子は、最終的にＢ細胞表面上にＩｇＨポリペプチドとして発現し、これがＩｇＬと結合してＢ細胞受容体を形成する。ネズミおよびヒトのＩｇ遺伝子座は、極めて複雑であり、ほぼ２Ｍｂの領域に及び、幾つかの定常領域遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびより多数の可変遺伝子を含む。

本発明は、ヒト可変領域のコード領域、および脊椎動物宿主ゲノム由来の非コード配列、たとえば、宿主哺乳類がマウスであるときにはマウスゲノムの非コード配列を含む、導入された部分的ヒト核酸を含む非ヒト脊椎動物細胞を提供する。この部分的ヒト核酸は、トランスジェニック動物が、制御配列ならびに効率的な抗体産生および抗原認識を促進す
るのに役立つある特定の宿主ゲノムにおける介在配列内で見られる他の要素を保持しながら、ヒトＶ_Ｈ領域を含む重鎖レパートリーを産生することを可能にする。本発明は、Ｖ_Ｈ遺伝子座由来のヒトコード配列と非ヒト非コード配列の両者を含む、合成または組換えで産生される部分的ヒト領域の使用を含む。

本発明の方法は、操作されたゲノム内の２組以上の部位特異的組換え部位を利用できるため、本組換えステップは、部分的ヒト遺伝子座に多数の挿入を行うことが可能である。
本発明の好ましい態様で、宿主脊椎動物細胞に挿入されるこの部分的ヒト領域は、既知のヒトＶ_Ｈ遺伝子の全部または相当数を含む。しかし、場合によっては、そのようなＶ_Ｈ遺伝子のサブセットを使用することが望ましいこともあり、特殊な場合には、僅か１つのヒトＶ_Ｈコード配列が本発明の細胞および動物で使用されることさえある。

本発明の好ましい態様は、非ヒト哺乳類および哺乳類細胞を含み、この非ヒト哺乳類および哺乳類細胞は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子を含み、Ｄ遺伝子ヒトコード領域およびＪ遺伝子ヒトコード領域ならびに非ヒト哺乳類宿主の内在性ゲノムに基づいたｐｒｅ−ＤＪ配列をさらに含む、部分的ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む。ある態様で、導入される部分的ヒト領域は、１つ以上の完全に組換えられたＶ（Ｄ）Ｊセグメントを含むことができる。

本発明の具体的な態様で、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、非ヒト哺乳類宿主遺伝子座における介在配列に基づいた介在配列が付いた多数のヒトＶ_Ｈ遺伝子、およびヒトＤ遺伝子およびＪ遺伝子のヒトコード領域を含む導入された核酸を含む。特に好ましい態様で、部分的ヒト核酸は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子、非ヒト哺乳類宿主のゲノム（たとえば、マウスゲノム）に基づいたｐｒｅ−Ｄ領域、ならびにヒトＤエクソンおよびＪエクソンを含む。

実施例の部分でさらに詳述する、代表的な実施態様では、マウスの内在性ＶＨ免疫グロブリン遺伝子座全体（Ｊ５５８遺伝子座を含む）を欠失させ、マウスのＪ５５８ＶＨ領域遺伝子座のＶＨエクソンを、４４のヒトＶ_Ｈ遺伝子を含む核酸と置換し、その結果として、マウスの非コード配列に対応する非コード領域と入り混ざっている。完全な、導入された免疫グロブリンＶ_Ｈ領域は、Ｖ_Ｈ遺伝子の他にもヒトＤエクソンおよびＪエクソンをさらに含む。この態様で、１０Ｋｂのｐｒｅ−Ｄ領域はマウス配列を含むが、Ｄ領域およびＪ領域はヒトコード配列を含む。好ましくは、Ｄ領域およびＪ領域は、ヒトＤ遺伝子およびヒトＪ遺伝子を含むヒトＤＪコード領域として提供される。

本発明の方法は、相同的組換えと部位特異的組換えとの組合せを利用して、本発明の細胞および動物を作り出す。相同ターゲティングベクターを先ず使用して、部位特異的組換え部位を、宿主哺乳類ゲノムの、内在性免疫グロブリン遺伝子座における所望の位置に導入する。インビボでの、関連ターゲティング配列とゲノムＤＮＡとの相同的組換えによるゲノム配列への部位特異的組換え部位の挿入は、好ましくは形質移入細胞により発現される抗体分子のアミノ酸配列を改変しない。この手法は、組換え部位、および任意選択的に、選択可能なマーカー遺伝子等の追加的配列の挿入後に、所望の抗体を産生する免疫グロブリン遺伝子の適切な転写および翻訳を維持する。しかし、場合によっては、挿入によって抗体分子のアミノ酸配列が変更されるが、抗体は依然として所望の目的のために十分な機能性を保持するように、リコンビナーゼ部位および他の配列を、免疫グロブリン遺伝子座配列に挿入できることもあり、本発明は、そのような挿入も含むことを想定する。

相同的組換えの代表的な方法論は、米国特許第６，６８９，６１０号明細書；米国特許第６，２０４，０６１号明細書；米国特許第５，６３１，１５３号明細書；米国特許第５，６２７，０５９号明細書；米国特許第５，４８７，９９２号明細書；および米国特許第５，４６４，７６４号明細書に記述されており、それぞれを参照により全体として援用する。

本発明の具体的な態様で、相同ターゲティングベクターを利用して、部位特異的組換え部位および選択マーカーを導入する他に、内在性ゲノム内のある特定の配列を置換することができる。たとえば、Ｖ_Ｈ遺伝子領域の３’要素を導入するために使用される相同ターゲティングを使用して、マウスｐｒｅ−Ｄ配列およびＤＪ配列を、ヒトの同等物と置換することが可能である。

部位特異的組換え
部位特異的組換えは、リコンビナーゼ認識に必要な、短い特異的なＤＮＡ配列だけが組換えの起こる部位である点で、一般的な相同的組換えと異なる。部位特異的組換えは、部位を認識して、このような部位における組換えを触媒するための専用のリコンビナーゼを必要とする。多数のバクテリオファージおよび酵母由来の部位特異的組換えシステム（それぞれ、リコンビナーゼおよび特異的な同種部位を含む）は、真核細胞でＤＮＡ組み込みのために働くため、本発明での使用に適しており、これらの中にはバクテリオファージＰ１ Ｃｒｅ／ｌｏｘ、酵母ＦＬＰ−ＦＲＴシステム、および部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーのＤｒｅシステムなどが含まれる。そのようなシステムおよび使用方法は、たとえば、米国特許第７，４２２，８８９号明細書；米国特許第７，１１２，７１５明細書；米国特許第６，９５６，１４６明細書；米国特許第６，７７４，２７９明細書；米国特許第５，６７７，１７７明細書；米国特許第５，８８５，８３６明細書；米国特許第５，６５４，１８２明細書；および米国特許第４，９５９，３１７号明細書に記述されており、そのようなリコンビナーゼの使用方法を教示するために、参照により本明細書に援用する。リコンビナーゼ仲介カセット交換（ＲＭＣＥ）手順は、野生型と変異型ｌｏｘＰ（またはＦＲＴ等）部位の組合せを負の選択と一緒に使用することによって容易になる。しかし、非変異部位のみを使用するときおよび／または上記選択を欠く場合も生じる。しかし、挿入反応よりむしろ削除が好ましく、また（正の選択を組み入れなければ）適切に変異した細胞のリッチ化がないため、効率は非常に低い。

チロシンファミリーの他のシステム、たとえばバクテリオファージλＩｎｔインテグラーゼ、ＨＫ２０２２インテグラーゼ等、およびさらに別のセリンファミリーのリコンビナーゼに属するシステム、たとえばバクテリオファージｐｈｉＣ３１、Ｒ４Ｔｐ９０１インテグラーゼ等は、それぞれの組換え部位を使用して、哺乳類細胞で働くことが知られており（トルンシュ（Ｔｒｏｎｃｈｅ），Ｆ．ら．２００２）、また本発明での使用にも適する。

本発明の方法は、好ましくは、同一リコンビナーゼであるが、部位間の組換えを促進しない部位特異的組換え部位を利用する。たとえば、ＬｏｘＰ部位および変異型ＬｏｘＰ部位を宿主のゲノムに組み入れることができるが、宿主へのＣｒｅの導入によって、それら２部位が容易に組換わることはなく、むしろ、ＬｏｘＰ部位は、別のＬｏｘＰ部位と組換わり、変異型部位は、別の同様の変異型ＬｏｘＰ部位と組み換わる。そのような変異型組換え部位の例としては、逆方向反復の組合せを含むもの、または変異体スペーサ配列を有する組換え部位を含むものなどがある。たとえば、２クラスの変異型リコンビナーゼ部位を、安定したＣｒｅ−ｌｏｘＰ組込み組換えの操作に利用できる。両者とも、８ｂｐスペーサ領域内または１３−ｂｐ逆方向反復内で、Ｃｒｅ認識配列における配列変異体を利用する。ｌｏｘ５１１（ホエス（Ｈｏｅｓｓ）ＲＨら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８６，１４：２２８７−２３００）、ｌｏｘ５１７１およびｌｏｘ２２７２（リー（Ｌｅｅ）Ｇおよびサイトー（Ｓａｉｔｏ）Ｉ，Ｇｅｎｅ １９９８，２１６：５５−６５）、ｍ２、ｍ３、ｍ７、およびｍ１１（ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ＳＪら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２，３０：３０６７−３０７７）等のスペーサ変異体は、それら自身とは容易に組換わるが、野生型部位との組換え率は著しく減る。このクラスの変異体は、非相互作用型Ｃｒｅ−Ｌｏｘ組換え部位および非相互作用型ＦＬＰ組換
え部位を使用するリコンビナーゼ仲介カセット交換（ＲＭＣＥ）によるＤＮＡ挿入に利用されてきた（バエル（Ｂａｅｒ）Ａおよびボーデ（Ｂｏｄｅ）Ｊ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００１，１２：４７３−４８０；アルベルト（Ａｌｂｅｒｔ）Ｈら，Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９５，７：６４９−６５９；セイブラー（Ｓｅｉｂｌｅｒ）Ｊおよびボーデ（Ｂｏｄｅ）Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，３６：１７４０−１７４７；シュレーク（Ｓｃｈｌａｋｅ）Ｔおよびボーデ（Ｂｏｄｅ）Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９４，３３：１２７４６−１２７５１）。

逆方向反復変異体は、第２クラスの変異型リコンビナーゼ部位を表す。たとえば、ＬｏｘＰ部位は、変更された塩基を、左逆方向反復（ＬＥ変異体）または右逆方向反復（ＲＥ変異体）で含むことができる。ＬＥ変異体であるｌｏｘ７１は、左逆方向反復の５’末端に、野生型配列からＴＡＣＣＧに変化している５ｂｐを有する（アラキ（Ａｒａｋｉ）Ｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９７，２５：８６８−８７２）。同様に、ＲＥ変異体であるｌｏｘ６６は、ＣＧＧＴＡに変化した５つの３’末端塩基を有する。逆方向反復変異体は、プラスミド挿入物を染色体ＤＮＡに組み込むために使用される。「ターゲット」染色体ｌｏｘＰ部位として設計されたＬＥ変異体を含む上記染色体ＤＮＡに、「ドナー」ＲＥ変異体が組換わる。組換え後、ｌｏｘＰ部位は、挿入されたセグメントを挟んで、シス（ｃｉｓ）に配置される。組換えのメカニズムは、組換え後、一方のｌｏｘＰ部位は二重変異体（ＬＥ逆方向反復変異およびＲＥ逆方向反復変異の両者を含む）であり、他方は野生型であるというものである（リー（Ｌｅｅ）Ｌおよびサドースキー（Ｓａｄｏｗｓｋｉ）ＰＤ，Ｐｒｏｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００５，８０：１−４２；リー（Ｌｅｅ）Ｌおよびサドースキー（Ｓａｄｏｗｓｋｉ）ＰＤ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００３，３２６：３９７−４１２）。二重変異体は、野生型部位と十分に異なるため、Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識されず、また挿入されたセグメントは削除されない。

ある態様では、コード核酸領域または制御配列と対照的に、部位特異的組換え部位をイントロンに導入することができる。これによって、部位特異的組換え部位を動物細胞のゲノムに挿入する際に、適当な抗体発現に必要な制御配列またはコード領域を不注意に破壊することを回避することが可能である。

部位特異的組換え部位の導入は、従来の相同的組換え技法によって達成することが可能である。そのような技法は、たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（２００１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ第３版（コールド・スプリング・ハーバー・研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））およびナギー（Ｎａｇｙ），Ａ．（２００３）．（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，第３版（コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），ニューヨーク州：コールド・スプリング・ハーバー・研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））等の参考文献に記述されている。Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ，Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，Ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ，ＤＮＡ
ｒｅｐａｉｒ，Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ，Ｍｅｉｏｓｉｓ，Ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ，Ｖ（Ｄ）Ｊ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、フレドリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃ）Ｐ．ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），アグネス（Ａｇｎｅｓ）Ｆ．バンドーム（Ｖａｎｄｏｍｅ），およびジョン・マクブリュースター（Ｊｏｈｎ ＭｃＢｒｅｗｓｔｅｒ）（ペーバーバック−２００９年１２月２３日）。

ゲノムへの特異的組換えは、当該技術分野で周知の通り、正の選択または負の選択用に設計されたベクターを使用して容易にすることができる。置換反応を受けた細胞の同定を容易にするために、好適な遺伝子マーカーシステムを使用することが可能であり、また、たとえば選択培地の使用によって、細胞を選択することが可能である。しかし、ゲノム配列が、置換区間の２つの終点にまたは隣接して外来核酸配列を実質的に含まないことを確実にするために、置換された核酸を含む細胞の選択後にマーカーシステム／遺伝子を除去できることが望ましい。

本発明の方法の好ましい一態様では、内在性免疫グロブリンの全部または一部の置換が起こった細胞を、毒素または薬物に暴露して、負の選択をする。たとえば、ガンシクロビル等のヌクレオシド類縁体の好適な使用により、ＨＳＶ−ＴＫの発現を保持する細胞を選択することができる。本発明の別の態様では、組換え事象の後で、または組換え事象の結果として、細胞から任意選択的に除去され得るマーカー遺伝子を使用して、内在性免疫グロブリン領域の欠失を含む細胞について、正の選択をすることが可能である。使用可能な正の選択システムは、ＨＰＲＴ等の、組換え事象によって接合されるマーカー遺伝子の２つの非機能部分の使用に基づく。これらの２つの部分は、置換反応がうまく実行されたとき、機能的会合をもたらし、機能的に再構成されたマーカー遺伝子は、さらなる部位特異的組換え部位（置換反応に使用された部位特異的組換え部位と異なる）により両側が挟まれている。これにより、好適な部位特異的リコンビナーゼを使用してマーカー遺伝子がゲノムから削除されることができる。

リコンビナーゼは、精製蛋白質、または、リコンビナーゼ活性を提供するために細胞内で一時的に発現される構築物として提供することが可能である。あるいは、マーカー遺伝子および関連した組換え部位を欠く子孫を生み出すために、その細胞を使用して、前記リコンビナーゼを発現する動物と交配することが可能な、トランスジェニック動物を産生することが可能である。

トランスジェニック動物の産生
具体的な態様で、本発明は、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すための方法を提供する。

一態様で、内在性免疫グロブリン遺伝子の置換のために利用される宿主細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞であり、次にこれを利用して、トランスジェニック哺乳類を作り出すことができる。したがって、一態様によれば、本発明の方法は、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む胚性幹細胞を単離すること、および前記ＥＳ細胞を使用して部分的に置換された免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を産生することをさらに含む。

別の実施例で、トランスジェニック動物は鳥類であり、動物は始原生殖細胞を使用して生み出される。したがって、別の態様によれば、本発明の方法は、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む始原生殖細胞を単離することおよび部分的に置換された免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を産生するために前記生殖細胞を使用することをさらに含む。そのようなトランスジェニック鳥類を生み出す方法は、たとえば、米国特許第７，３２３，６１８号明細書および米国特許第７，１４５，０５７号明細書（参照により本明細書に援用する）に開示されている。

以下の実施例は、本発明をどのように作製して使用するかについて完全な開示および説明を当業者に提供するために提示するものであって、発明者が自身の発明と考えるものの範囲を制限する意図もなく、また以下の実験が、実施した実験の全てである、または実施
した実験のみであることを表したり暗に示したりする意図もない。概括的に説明された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、具体的な実施態様に示された本発明に多くの変形および／または改変を行えることは、当業者に十分理解されるであろう。したがって、本実施態様は、あらゆる点で例証として考えるべきであり、制限として考えるべきではない。

使用される用語および数（たとえば、ベクター、量、温度、等々）に関して正確さを確実にするために努力がなされてきたが、幾らかの実験誤差および偏差が占める。他に指定のない限り、部は重量基準による部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

実施例は、組換部位の両側に位置する５’ベクターおよび３’ベクターの両者によるターゲティングおよび合成ＤＮＡの導入を例示する。５’ベクターターゲティングが最初に起こった後に３’が続いてもよく、または３’ベクターターゲティングが最初に起こった後に５’ベクターが続いてもよいことは、明細書を読んだときに当業者に明白になるであろう。場合によっては、二重検出メカニズムを用いて、ターゲティングを同時に実行することもできる。

実施例１：マウスゲノムのＶ_Ｈ遺伝子座への、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入
哺乳類ゲノムの一部を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する代表的な方法を、図１〜６に図示する。図１は、本発明の方法のこの代表的な態様の様々なステップを図示するフローチャートを示す。この方法は、哺乳類ゲノムの内在性Ｖ_Ｈ領域の５’または３’のいずれにも導入することが可能な、第１の部位特異的組換え部位の、哺乳類ゲノムへの導入を提供する。次いで、哺乳類ゲノムへの第２の部位特異的組換え部位の導入（１０２）が続き、これが、第１の部位特異的組換え部位と共同して、内在性免疫グロブリン領域を挟む。挟まれた内在性領域が欠失され（１０４）、ヒト配列と非ヒト配列との両者を含む合成核酸が、リコンビナーゼ仲介交換によって導入される（１０６）。

マウスＥＳ細胞のゲノム遺伝子座への、部分的なヒトのマウス−ヒト免疫グロブリン領域の導入を説明する代表的な方法を、図２〜６により詳細に図示する。図２では、ピューロマイシンホスホトランスフェラーゼ−チミジンキナーゼ融合蛋白質（ｐｕｒｏΔＴＫ）（２０３）を含む、相同ターゲティングベクター（２０１）が提供される。上記ｐｕｒｏΔＴＫ（２０３）は、２つの異なるリコンビナーゼ認識部位、たとえば、ＦｌｐおよびＣｒｅ用の、ＦＲＴ（２０７）およびｌｏｘＰ（２０５）と、たとえばＦＲＴ（２０９）およびｌｏｘＰ（２１１）の改変部位（それぞれ、未改変部位（２０７および２０５）と組換えができない）で挟まれている。ターゲティングベクターは、以後のステップで、導入された構築物を発現する細胞の負の選択で使用するための、ヒトジフテリア毒素受容体（ｈＤＴＲ）ｃＤＮＡ（２１７）を含む。ターゲティングベクターは、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）（非表示）等の視覚的マーカーも、任意選択的に含む。領域（２１３）および（２１５）は、隣接領域２２３の、５’部分および３’部分と、それぞれ相同である。この隣接領域（２２３）は、マウス内在性Ｖ_Ｈ遺伝子を含むゲノム領域（２１９）の５’である。免疫グロブリン領域の内在性Ｖ_Ｈ遺伝子（２１９）、ｐｒｅ−Ｄ領域（２２１）、Ｊ遺伝子領域（２２５）および定常遺伝子領域（２２７）を含む免疫グロブリン領域（２２９）を有するマウスＥＳ細胞に、相同ターゲティングベクター（２０１）を導入する（２０２）。相同ターゲティングベクター（２０１）の部位特異的組換え部位およびｈＤＴＲ ｃＤＮＡ（２１７）は、マウス内在性Ｖ_Ｈ遺伝子領域のマウスゲノム５’に組込まれる（２０４）。

図３は、追加的な１組の部位特異的組換え部位、たとえば、Ｄｒｅリコンビナーゼと共に使用するためのＲｏｘ部位（３３１）および改変されたＲｏｘ部位（３３３）を加える
こと以外は、図２と同じ手法を効果的に図示する。図３では、ピューロマイシンホスホトランスフェラーゼ−チミジンキナーゼ融合蛋白質（３０３）を含む、相同ターゲティングベクター（３０１）が提供される。ピューロマイシンホスホトランスフェラーゼ−チミジンキナーゼ融合蛋白質（３０３）は、リコンビナーゼ認識部位ＦＲＴ（３０７）、ｌｏｘＰ（３０５）、およびＲｏｘ（３３１）、ならびに、その改変部位ＦＲＴ（３０９）、ｌｏｘＰ（３１１）およびＲｏｘ（３３３）（それぞれ、未改変部位部位(３０７)、(３０
５)および(３３１)と組換えができない）で挟まれている。ターゲティングベクターは、
ヒトジフテリア毒素受容体（ｈＤＴＲ）ｃＤＮＡ（３１７）も含む。領域（３１３）および（３１５）は、隣接領域（３２３）の５’部分および３’部分と、それぞれ相同である。この隣接領域（３２３）は、マウス内在性Ｖ_Ｈ遺伝子を含むゲノム領域（３１９）の５’である。相同ターゲティングベクター（３０１）を、免疫グロブリン領域の内在性Ｖ_Ｈ遺伝子（３１９）、ｐｒｅ−Ｄ領域（３２１）、Ｊ遺伝子領域（３２５）および定常遺伝子領域（３２７）を含む、マウス免疫グロブリン領域（３２９）に導入する（３０２）。相同ターゲティングベクター（３０１）の部位特異的組換え部位およびｈＤＴＲ ｃＤＮＡ（３１７）は、マウス内在性Ｖ_Ｈ遺伝子領域のマウスゲノム５’に組み込まれる（３０４）。

図４に図示する通り、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）ミニ遺伝子（４３５）およびネオマイシン耐性遺伝子（４３７）ならびにＦｌｐおよびＣｒｅのリコンビナーゼ認識部位ＦＲＴ（４０７）およびｌｏｘＰ（４０５）（第１の相同ターゲティングベクターから組込まれたＦＲＴ（４０７）部位およびｌｏｘＰ（４０５）部位と組換えができる）を含む、第２の相同ターゲティングベクター（４０１）が提供される。領域（４３１）および領域（４３３）は、内在性マウス遺伝子座における隣接領域（４４１）の、５’部分および３’部分と、それぞれ相同である。上記隣接領域（４４１）は、マウス内在性Ｖ_Ｈ、Ｄ遺伝子およびＪ遺伝子を含むゲノム領域の３’であるとともに、定常遺伝子領域の５’である。相同ターゲティングベクター（４０１）を、内在性Ｖ_Ｈ遺伝子（４１９）、ｐｒｅ−Ｄ領域（４２１）、Ｊ遺伝子領域（４２５）および定常遺伝子領域（４２７）を含む、改変されたマウス免疫グロブリン領域に導入する（４０２）。相同ターゲティングベクター（４０１）の部位特異的組換え部位およびＨＰＲＴミニ遺伝子（４３５）およびネオマイシン耐性遺伝子（４３７）は、マウス内在性Ｖ_Ｈ遺伝子領域のマウスゲノム５’に組込まれる（４０４）。

いったん、組換え部位が宿主哺乳類のゲノムに導入されると、次に、免疫グロブリンドメインの内在性領域は、ゲノムにおける部位特異的組換え部位に対応するリコンビナーゼの１つ（この実施例ではＦＬＰまたはＣｒｅのいずれかを）の導入により組換えを受ける。図５に図示する通り、ＦＬＰが導入される（５０２）と、部位特異的組換え部位（５０９，５１１，５０７および５０５）を含む領域とｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子（５０３）とが保持されるとともに、他の２つの組換え部位（５０７および５０５）の３’には、追加的ＦＬＰ組換え部位（５０７）が存在する。組換え部位の３’領域であって、ｈＤＴＲ(５１
７)、内在性免疫グロブリンドメイン（５１９，５２１，５２５）、第２の相同ターゲテ
ィングベクターを使用して導入されたＨＰＲＴ（５２７を含む）およびＮｅｏ５２９遺伝子を含む３’領域は欠失する。リコンビナーゼ−仲介欠失（５０４）にＣｒｅが使用されると、欠失の区域は同じであるが、唯一の部位特異的組換え部位（５０７）が、ｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子の３’に直接に残る。本手順は、その相同性よりも同一染色体上に起こった第２のターゲティングに依存する（すなわち、トランス（ｔｒａｎｓ）よりもシス（ｃｉｓ））。ターゲティングがトランスに起こる場合、細胞は、Ｃｒｅ組換え後、負の選択に感受性がない。

内在性免疫グロブリン領域の欠失に関する一次スクリーニングは、サザンブロットにより実行され、またはサザンおよび／またはロス・オブ・ネイティブ・アレル（ｌｏｓｓ−
ｏｆ−ｎａｔｉｖｅ−ａｌｌｅｌｅ）ｑＰＣＲスクリーンを用いた二次スクリーンで支持される一次ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）スクリーンを用いて、実行され得る。ＨＰＲＴは、ＨＰＲＴ−欠損ＥＳ細胞において（６−チオグアニン依存性の）負の選択を可能にする。欠失した免疫グロブリン領域を含むＥＳ細胞は、ｈＤＴＲ遺伝子を使用した負の選択で選択され得る。

図６は、改変されたマウスゲノムへの部分的ヒト配列の導入を図示する。哺乳類宿主ゲノムに導入すべき部分的ヒト免疫グロブリン領域（６１０）を含む部位特異的ターゲティングベクター（６２９）を、内在性免疫グロブリン領域が欠失したゲノム領域（６０１）に導入する（６０２）。上記ゲノム領域（６０１）は、部位特異的組換え部位（６０９，６１１，６０７および６０５）およびｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子（６０３）を含む。部位特異的ターゲティングベクターは、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含んでおり、この部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ｉ）４４のヒトＶ_Ｈコード領域およびマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むＶ_Ｈ領域（６１９）と、ｉｉ）マウス配列を含む１０ｋｂのｐｒｅ−ＤＪ領域（６２１）と、ｉｉｉ）ヒトＤ遺伝子コード領域およびＪ遺伝子コード領域ならびにマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むＤＪ領域（６２５）とを含んでいた。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、改変された内在性遺伝子座との組換えを可能にする組換え部位（６０９，６１１，６０５および６０７）で挟まれている。好適なリコンビナーゼが導入される（６０４）と同時に、部分的ヒト免疫グロブリン領域が、定常遺伝子領域（６２７）のゲノム上流に組込まれる。

部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入に関する一次スクリーニングは、サザンブロットにより実行され、またはサザンおよび／またはロス・オブ・ネイティブ・アレル（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｎａｔｉｖｅ−ａｌｌｅｌｅ）ｑＰＣＲスクリーンを用いた二次スクリーンで支持される一次ＰＣＲスクリーンを用いて、実行され得る。組換え事象の一部としてＨＰＲＴ遺伝子（６０５）が欠失することにより、（６−チオグアニン−依存性の）負の選択を使用して、組換え事象を受けなかった細胞の同定が可能になる。

実施例２：マウスゲノムへの部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入
ある特定の態様で、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、実施例１に記載の要素を含むが、追加的配列を含む。こうした追加的配列は、たとえば、追加的制御配列を導入するため、導入された免疫グロブリン領域内に所望の間隔を確保するため、置換された免疫グロブリン領域に隣接した他の配列と、あるコード配列が適正な近位であることを確実にするため、その他の理由のために、戦略的に加えられる配列である。図７は、図２〜５で産生されるとともに実施例１で上述された、改変されたマウスゲノムへの第２の代表的な部分的ヒト配列の導入を図示する。

哺乳類宿主ゲノムに導入されるべき部分的ヒト免疫グロブリン領域（７１０）を含む部位特異的ターゲティングベクター（７２９）が、欠失した内在性免疫グロブリン領域を含むゲノム領域（７０１）に導入される（７０２）。ゲノム領域（７０１）は、部位特異的組換え部位（７０９，７１１，７０７および７０５）およびｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子（７０３）を含む。部位特異的ターゲティングベクターは、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含んでおり、この部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ｉ）１〜４３のヒトＶ_Ｈコード領域およびマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むＶ_Ｈ領域（７１９）と、ｉｉ）マウス配列を含む１０ｋｂのｐｒｅ−ＤＪ領域（７２１）と、ｉｉｉ）ヒトＤコード領域およびＪコード領域、ならびにマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むＤＪ領域（７２５）と、ｉｖ）マウス非機能性Ｊ_Ｈ遺伝子領域とを含んでいた。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、改変された内在性遺伝子座との組換えを可能にする組換え部位（７０９，７１１，７０５および７０７）で挟まれている。好適なリコンビナーゼが導入される（７０４）と同時に、部分的ヒト免疫グロブリン領域が、定常遺伝子領域（７２７）のゲノ
ム上流に組込まれる。

実施例１に記載の通り、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入に関する一次スクリーニングは、サザンブロットにより実行され、またはサザンおよび／またはロス・オブ・ネイティブ・アレル（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｎａｔｉｖｅ−ａｌｌｅｌｅ）ｑＰＣＲスクリーンを用いた二次スクリーンで支持される一次ＰＣＲスクリーンを用いて、実行され得る。組換え事象の一部としてＨＰＲＴ遺伝子（７０５）が欠失することにより、（６−チオグアニン−依存性の）負の選択を使用して、組換え事象を受けなかった細胞の同定が可能になる。

実施例３：マウスゲノムの免疫グロブリン重鎖遺伝子座への、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入
哺乳類ゲノムの一部を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する方法が、図８に図示される。この方法は、哺乳類ゲノムへの第１の部位特異的組換え部位の導入に続いて、哺乳類ゲノムへの第２の部位特異的組換え部位の導入を使用した。２つの部位は、Ｖ_Ｈ領域遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ領域遺伝子セグメントおよびＪ_Ｈ領域遺伝子セグメントの集団全体を挟んでいた。本明細書に記載の、適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して、挟まれた内在性領域を欠失させた。

野生型マウス免疫グロブリン領域（８０１）における、Ｖ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ領域遺伝子セグメント集団の両側に部位特異的リコンビナーゼ部位を導入するために使用されたターゲティングベクター（８０３，８０５）は、リコンビナーゼにより効率よく認識されるままであるが、未改変部位と組換わらないように改変された追加的部位特異的リコンビナーゼ部位を含んでいた。この部位は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ領域遺伝子セグメント集団の欠失後、第２の部位特異的組換え事象に使用できるように、ターゲティングベクター中に配置された。第２の部位特異的組換え事象とは、非天然のＤＮＡ片が、改変されたＶ_Ｈ遺伝子座に移動するものである。部位特異的リコンビナーゼを使用してＤＮＡを遺伝子座に移動させる方法は、「リコンビナーゼ−仲介カセット交換」と呼ばれる。この実施例で、非天然ＤＮＡは、ヒト配列と非ヒト配列との両方を含む合成核酸であった。

略述したプロセスを達成するために、２つの遺伝子ターゲティングベクターが構築された。ベクターの一方（８０３）は、最遠位可変領域遺伝子セグメントの上流の遺伝子座の５’末端から取ったマウスゲノムＤＮＡを含んでいた。他方のベクター（８０５）は、Ｊ領域遺伝子セグメント近傍の遺伝子座内から取ったマウスゲノムＤＮＡを含んでいた。

５’ベクター（８０３）の重要な特徴は、５’から３’の順で、以下の通りであった：ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）サブユニットをコード化している遺伝子；重鎖遺伝子座における最遠位可変領域遺伝子セグメントの上流に位置する４．５ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ；Ｊ領域遺伝子セグメント（無能化）；Ｆｌｐリコンビナーゼ用のＦＲＴ認識配列；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモータを含むゲノムＤＮＡ片；翻訳開始配列（「Ｋｏｚａｋ」コンセンサス配列に組込まれたメチオニンコドン）；Ｃｒｅリコンビナーゼ用の、変異型ＬｏｘＰ認識配列（ｌｏｘ５１７１部位として知られる）；転写終結／ポリアデニル化配列；Ｃｒｅリコンビナーゼ用のｌｏｘＰ認識配列；ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質から成る融合蛋白質をコード化している遺伝子；該ベクター中の上記４．５Ｋｂ配列に近接して位置する３ＫｂのマウスゲノムＤＮＡであって、天然の相対配向で配置された３ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ。上記ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）サブユニットをコード化している遺伝子は、ポリオーマウイルス由来の２つの変異体転写エンハンサーに結合した改変された単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモータの転写制御下にある。また、上記ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質から成る融合蛋白質をコード化している遺伝子は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子由来のプ
ロモータの転写制御下にあり、チミジンキナーゼ（ｐｕ−ＴＫ）の切断型に融合している。

３’ベクター（８０５）の重要な特徴は、５’から３’の順で、以下の通りであった：ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）サブユニットをコード化している遺伝子；マウスＪ領域遺伝子セグメントを含む３．７ＫｂのマウスゲノムＤＮＡであって、重鎖可変領域遺伝子セグメントの最も近くに位置する当該領域の末端が、該ベクター中の上記ＤＴＡ遺伝子に最も近いように配置された３．７ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモータの転写制御下にあるヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をコード化しているミニ遺伝子；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子プロモータの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子；Ｃｒｅリコンビナーゼ用のｌｏｘＰ認識配列；および、ゲノムにおいて上記３．７Ｋｂフラグメントの直下に位置する２．１ＫｂのマウスゲノムＤＮＡであって、両フラグメントが、マウスゲノムにおけるのと等しい相対的配置で配置された２．１ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ。

広く使用される手順に従い、３’ベクター（８０５）を用いて、エレクトロポレーションにより、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃマウスに由来する）に形質移入した。エレクトロポレーションの前に、ＮｏｔＩ制限酵素を用いて、ベクターＤＮＡを直線化した。形質移入細胞をプレーティングし、≧２４時間後に、ネオマイシン類縁体Ｇ４１８を使用した薬物選択にかけた。１週間以上後、肉眼で見えるようになった後で、薬物耐性ＥＳ細胞のコロニーをプレートから物理的に採取した。採取したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレート上に再プレーティングして、数日間培養した。その後、細胞の一部を保存記録として冷凍し、残りを分析目的でＤＮＡの単離に使用できるように、細胞の各クローンを分割した。

広く使用される遺伝子−ターゲティングアッセイデザインを使用して、ＰＣＲによりＥＳ細胞クローン由来のＤＮＡをスクリーニングした。４つのアッセイを使用し、いずれの場合にも、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、３’ベクター（８０５）とゲノムＤＮＡとの間で共有される同一性の領域外に位置していたが、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の２つのアーム間の新規なＤＮＡ内（すなわち、ＨＰＲＴまたはｎｅｏ遺伝子要素）に位置していた。３’重鎖ターゲティングベクターとゲノムとの間で完全に論理的な相同的組換えを受けた形質移入細胞に由来する細胞のクローンに存在するだけであろうＤＮＡ片を検出するために、標準デザインに従って、これらのアッセイを設計した。

３’ベクター（８０５）を用いて、２つの別々の形質移入を実施した。先ず第一に、４つのＰＣＲアッセイを使用してスクリーニングしたほぼ３００クローンから、計２個の陽性クローンが得られた。第二に、スクリーニングしたやはりほぼ３００クローンから、計６個の陽性クローンが得られた。２つの形質移入による計６個のＰＣＲ陽性クローンを増殖のために選択し、続いてサザンブロットアッセイを使用してさらに分析した。

広く使用される手順に従って、選択された３つのプローブおよび複数の制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡを使用して、サザンブロットアッセイを実施する。３つのプローブおよび複数の制限酵素は、クローンにおける標的遺伝子座の構造が相同的組換えにより適切に改変されたと確認できるように選択される。プローブの１つは、３’重鎖ターゲティングベクターとゲノムＤＮＡとの間で共有される同一性の領域の片側に位置するＤＮＡ配列に位置し；第２のプローブは、同一性の領域外であるがその反対側に位置し；第３のプローブは、ベクターにおけるゲノム同一性の２つのアームの間の新規なＤＮＡ内（すなわち、ＨＰＲＴまたはｎｅｏ遺伝子要素）に位置する。

マウスＥＳ細胞で生じる、最も一般的に生じる染色体異常を識別するために設計されたイン・サイチュ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して、ＥＳ細胞のＰＣＲ−陽性クローン６個を、核型分析する。そのような異常のあるクローンは、さらなる使用から除外される。サザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断され、また核型分析に基づいて、検出可能な染色体異常を持たないと判断される、ＥＳ細胞クローンをさらなる使用のために選択する。

Ｇ４１８／ネオマイシン選択の代わりにピューロマイシン選択が使用されること以外は、３’ベクター（８０５）に使用されるものと本質的にデザインが同じである手順およびスクリーニングアッセイを使用し、５’ベクター（８０３）を用いて、許容できるクローンを改変する。ＰＣＲアッセイ、プローブおよび消化物は、５’ベクター（８０５）により改変しようとしているゲノム領域に適合するように調整される。

３’重鎖ベクターおよび５’重鎖ベクターの両者により予想される方法で変異されたＥＳ細胞のクローン、すなわち、両方の操作された変異を担持する二重標的細胞を、ベクターターゲティング後に単離する。クローンは、相同染色体ではなく、同一染色体上で遺伝子ターゲティングを受けていなければならない（すなわち、ターゲティングベクターによって作り出された操作された変異は、別の相同のＤＮＡ鎖上でのトランスではなく、同一ＤＮＡ鎖上のシスである必要がある）。変異のシス配列を有するクローンは、ゲノム同一性のアーム間の２つの遺伝子ターゲティングベクターに存在する新規なＤＮＡにハイブリダイズするプローブを使用した、中期スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）の蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション等の分析手順によって、トランス配列を有するものと区別される。二種類のクローンを、次の方法により互いに区別することもできる。すなわち、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するベクターを用いて形質移入し、次いで５’ベクター（８０３）によって導入されたチミジンキナーゼ遺伝子に対するガンシクロビル選択で生き残ったコロニー数を比較し、そしてクローン由来の細胞の幾つかを、ピューロマイシンまたはＧ４１８／ネオマイシンに対する抵抗性についてテストする「同胞選択（ｓｉｂｌｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」スクリーニング手順による。この種の実験で、変異のシス配列を有する細胞は、トランス配列を有する細胞よりもほぼ１０^３倍多いガンシクロビル耐性クローンが生じると予想される。結果として生じるシス由来のガンシクロビル耐性クローンの大部分は、Ｇ４１８／ネオマイシンの両薬物に感受性があることも予想される。これとは対照的に、トランス由来のガンシクロビル耐性クローンは、ピューロマイシンおよびＧ４１８／ネオマイシンの両者に対する抵抗性を保持する。操作された変異のシス配列を重鎖遺伝子座に有する細胞の二重標的クローンを、さらなる使用のために選択する。

上でまとめた分析実験と同様、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するベクターを用いて細胞の二重標的クローンを形質移入し、その後、形質移入細胞をガンシクロビル選択にかける。細胞のガンシクロビル耐性クローンを単離し、５’重鎖ターゲティングベクターおよび３’重鎖ターゲティングベクターにより作り出された２つの操作された変異間の予想される欠失の存在について、ＰＣＲおよびサザンブロットで分析した。これらのクローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２つのベクターにより重鎖遺伝子座に導入されたｌｏｘＰ部位間に組換え（８０２）を生じさせて、８０７に示す構築物を作り出す。ｌｏｘＰ部位は、同じ相対配向で２つのベクターに配置されているため、組換えは、２つのｌｏｘＰ部位の間のゲノム区間全体を含むＤＮＡの輪が削除される結果となる。この輪は複製開始点を含まず、したがって、有糸分裂中に複製されず、したがってクローン増殖を経るにつれて、細胞のクローンから失われる。結果として生じるクローンでは、元は２つのｌｏｘＰ部位の間にあったＤＮＡが欠失されている。

ＥＳ細胞クローンであって、それらの免疫グロブリン重鎖遺伝子座の２つの相同コピーの一方における配列が欠失されたＥＳ細胞クローンに、Ｖ、ＤおよびＪ領域遺伝子セグメ
ントを含む部分的ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むＤＮＡ片（８０９）と、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターとを用いて、再形質移入する（８０４）。このＤＮＡ片（８０９）の重要な特徴は以下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム（イニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありｌｏｘ５１７１部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している）；転写終結／ポリアデニル化配列；ＦＲＴ部位；４４のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウス非コード配列に組込まれたヒトコード配列から成る；マウス重鎖遺伝子座におけるＤ領域遺伝子セグメントの集団のすぐ上流由来の７．５ＫｂのゲノムＤＮＡ片；ヒトＤおよびＪ領域遺伝子セグメントを含む５８ＫｂのＤＮＡ片；ｌｏｘ５１７１部位と逆相対配向のｌｏｘＰ部位。

形質移入クローンをＧ４１８選択にかけ、リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法を受けた細胞のクローンをリッチ化する。リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法により、部分的ヒトドナーＤＮＡ（８０９）（配列番号１）が全体として、ｌｏｘＰ部位とｌｏｘ５１７１部位との間の欠失された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組込まれて、８１１に図示されたＤＮＡ領域が作り出される。５’ベクター（８０３）由来の残りの要素が、ＦＬＰ−仲介組換え（８０６）で除去されて、結果的に、８１３に示す最終的なヒト化遺伝子座が生じる。

Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞クローンをＰＣＲおよびサザンブロットで分析して、不必要な再構成または欠失がなく、予想されるリコンビナーゼ−仲介カセット交換方法を受けていたかどうかを決定する。予想されるゲノム構造を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。

マウス重鎖遺伝子座に部分的ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＮＡ（８１３）を担持するＥＳ細胞クローンを、ＤＢＡ／２系統由来のマウス胚盤胞に微量注入し、標準手順に従って部分的ＥＳ細胞由来のキメラマウスを作り出す。外皮へのＥＳ細胞由来分布が最高レベルである雄キメラマウスを、雌マウスと交尾させるために選択する。本明細書で最適な雌マウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃ系統のものであり、その生殖細胞系で発現されるＦｌｐリコンビナーゼをコード化している導入遺伝子をやはり担持している。これらの交尾による子孫を、部分的ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の存在、およびリコンビナーゼ−仲介カセット交換ステップで作り出されたＦＲＴに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子の喪失について、分析した。部分的ヒト遺伝子座を担持するマウスを使用して、マウスのコロニーを確立する。

実施例４：マウスゲノムの免疫グロブリンκ鎖遺伝子座への部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入
哺乳類ゲノムの一部を部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する別の方法を図９に図示する。この方法は、哺乳類ゲノムへの、第１の部位特異的組換え部位の導入を提供し、続いて第２の部位特異的組換え部位を哺乳類ゲノムに導入する。上記第１の部位特異的組換え部位の導入は、哺乳類ゲノムのＶ_Ｋ領域遺伝子セグメントおよびＪ_Ｋ領域遺伝子セグメントの主集団の５’または３’のいずれにも導入することが可能である。また、上記第２の部位特異的組換え部位は、第１の部位特異的組換え部位と共同して、Ｖ_ＫおよびＪ_Ｋ領域遺伝子セグメントの集団全体を挟むことが可能である。次いで、挟まれた内在性領域を欠失させ、適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して置換することができる。

Ｖ_ＫおよびＪ_Ｋ領域遺伝子セグメント集団（９０１）の両側の部位特異的リコンビナーゼ部位を導入するために使用されるターゲティングベクターは、追加的部位特異的リコンビナーゼ部位も含む。この追加的部位特異的リコンビナーゼ部位は、リコンビナーゼにより効率よく認識されるままであるが、未改変部位とは組換わらないように改変されている
。この部位は、Ｖ_ＫおよびＪ_Ｋ領域遺伝子セグメント集団の欠失後、第２の部位特異的組換え事象に使用できるように、ターゲティングベクター中に配置されている。これにより、第２の部位特異的組換え事象では、非天然のＤＮＡ片が、リコンビナーゼ−仲介カセット交換によって、改変されたＶ_Ｋ遺伝子座に移動される。この実施例で、非天然のＤＮＡは、ヒト配列と非ヒト配列との両方を含む合成核酸である。

略述した方法を達成するために、２つの遺伝子ターゲティングベクターを構築した。ベクターの一方（９０３）は、最遠位可変領域遺伝子セグメントの上流の、遺伝子座の５’末端から取ったマウスゲノムＤＮＡから成っていた。他方のベクター（９０５）は、Ｊ領域遺伝子セグメント近傍の遺伝子座内から取ったマウスゲノムＤＮＡから成っていた。

５’ベクター（９０３）の重要な特徴は、以下の通りであった：ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）サブユニットをコード化している遺伝子；κ鎖遺伝子座における最遠位可変領域遺伝子セグメントの上流に位置する６ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ；Ｆｌｐリコンビナーゼ用のＦＲＴ認識配列；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモータを含むゲノムＤＮＡ片；翻訳開始配列（「Ｋｏｚａｋ」コンセンサス配列に組込まれたメチオニンコドン）；Ｃｒｅリコンビナーゼ用の変異ｌｏｘＰ認識配列（ｌｏｘ５１７１部位として知られる）；転写終結／ポリアデニル化配列；Ｃｒｅリコンビナーゼ用のｌｏｘＰ認識配列；ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質から成る融合蛋白質をコード化している遺伝子；該ベクター中の上記６Ｋｂ配列の近傍に位置する２．５ＫｂのマウスゲノムＤＮＡであって、天然の相対配向で配置された２．５ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ。上記ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）サブユニットをコード化している遺伝子は、ポリオーマウイルス由来の２つの変異体転写エンハンサーに結合した改変された単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモータの転写制御下にある。また、上記ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質から成る融合蛋白質をコード化している遺伝子は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子由来のプロモータの転写制御下にある切断型チミジンキナーゼ（ｐｕ−ＴＫ）に融合している。

３’ベクター（９０５）の重要な特徴は、以下の通りであった：ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）サブユニットをコード化している遺伝子；κ遺伝子座Ｊ領域遺伝子セグメント付近から取られた６ＫｂのマウスゲノムＤＮＡであって、κ可変領域遺伝子セグメントに最も近くに位置する当該フラグメントの末端が、該ベクター中の上記ＤＴＡ遺伝子に最も近いように配置された６ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモータの転写制御下にあるヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をコード化しているミニ遺伝子；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子プロモータの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子；Ｃｒｅリコンビナーゼ用のｌｏｘＰ認識配列；ゲノムにおいて上記６Ｋｂフラグメントの直下流に位置する３．６ＫｂのマウスゲノムＤＮＡであって、これら２つのフラグメントが、マウスゲノムと同じ相対的配向で配置されていた３．６ＫｂのマウスゲノムＤＮＡ。上記ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）サブユニットをコード化している遺伝子は、ポリオーマウイルス由来の２つの変異体転写エンハンサーに結合した改変された単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモータの転写制御下にある。

広く使用される手順に従い、３’ベクター（９０５）を用いて、エレクトロポレーションにより、Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃマウス由来のマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に形質移入した。エレクトロポレーションの前に、ＮｏｔＩ制限酵素を用いて、ベクターＤＮＡを直線化した。形質移入細胞をプレーティングし、≧２４時間後に、ネオマイシン類縁体Ｇ４１８を使用した薬物選択にかけた。１週間以上後、肉眼で見えるようになった後で、薬物耐性ＥＳ細胞のコロニーをプレートから物理的に採取した。採取したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレート上に再プレーティングして、数日間培養した。その後、細胞の
一部を保存記録として冷凍し、残りを分析目的でＤＮＡの単離に使用できるように、細胞の各クローンを分割した。

広く使用される遺伝子−ターゲティングアッセイデザインを使用して、ＰＣＲで、ＥＳ細胞クローン由来のＤＮＡをスクリーニングした。４つのアッセイを使用し、いずれの場合にも、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、３’ベクター（９０５）とゲノムＤＮＡ（９０１）との間で共有される同一性の領域外に位置していたが、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の２つのアームの間の新規なＤＮＡ内（すなわち、ＨＰＲＴまたはｎｅｏ遺伝子要素）に位置していた。３’ベクター（９０５）とゲノムとの間で完全に論理的な相同的組換えを受けた形質移入細胞に由来する細胞のクローンに存在するだけであろうＤＮＡ片を検出するために、標準デザインに従って、これらのアッセイを設計した。

３’ベクター（９０５）を用いて１つの形質移入を実施し、４つのＰＣＲアッセイを使用してスクリーニングしたほぼ３００クローンから、計１７の陽性クローンが得られた。
形質移入による計６個のＰＣＲ陽性クローンを増殖のために選択し、続いてサザンブロットアッセイを使用してさらに分析した。広く使用される手順に従って、サザンブロットアッセイを実施した；その中には、３つのプローブおよび複数の制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡが含まれていた。３つのプローブおよび複数の制限酵素は、プローブと消化物との組合せによって、クローン中の標的遺伝子座の構造についての結論と、相同的組換えにより適切に改変されたかどうかの結論とを導くことが可能になるように選択された。プローブの１つは、３’κターゲティングベクターとゲノムＤＮＡとの間で共有される同一性の領域の片側に位置するＤＮＡ配列に位置し；第２のプローブも、その反対側であるが同一性の領域外に位置し；第３のプローブは、ベクターにおけるゲノム同一性の２つのアームの間の新規なＤＮＡ内（すなわち、ｎｅｏ遺伝子要素）に位置していた。外部プローブの１つおよびネオマイシンプローブによって検出するとき、κ遺伝子座の、正確に変異した（３’κターゲティングベクターとの相同的組換えによる）部分に対応する、ＤＮＡの予想されるＥｃｏ９１１−生成フラグメントの存在が、サザンブロットで確認された（データ非表示）。外部プローブは、変異体フラグメントを検出するとともに、相同染色体上に、免疫グロブリンκ遺伝子座の非変異体コピー由来の野生型フラグメントも検出した。

マウスＥＳ細胞で生じる、最も一般な染色体異常を識別するために設計されたイン・サイチュ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して、ＥＳ細胞のＰＣＲ−陽性クローン６個について、核型分析も行った。そのような異常のあるクローン１個を、さらなる使用から除外した。サザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断された、核型的に正常なクローン２個をさらなる使用のために選択した。

Ｇ４１８／ネオマイシン選択の代わりにピューロマイシン選択が使用されること以外は、３’ベクター（９０５）に使用されるものとデザインが本質的に同じである手順およびスクリーニングアッセイを使用し、５’ベクター（９０３）を用いて、２つのクローンを改変する。上記プロトコールは、５’ベクター（９０３）により改変されるゲノム領域に適合するように調整される。５’ベクター（９０３）形質移入実験の目的は、３’ベクター（９０５）および５’ベクター（９０３）の両者により予想される方法で変異されたＥＳ細胞のクローン、すなわち、両方の操作された変異を担持する二重標的細胞を単離することである。これらのクローンで、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２つのベクターによりκ遺伝子座に導入されたｌｏｘＰ部位間に組換え（９０２）を生じさせ、９０７に示す構築物を作り出す。

さらに、クローンは、相同染色体ではなく、同一染色体上で遺伝子ターゲティングを受
けていなければならない、すなわち、ターゲティングベクターによって作り出された操作された変異は、別の相同なＤＮＡ鎖上でのトランスではなく、同一ＤＮＡ鎖上でのシスでなければならない。変異のシス配列を有するクローンは、ゲノム同一性のアーム間の２つの遺伝子ターゲティングベクターに存在する新規なＤＮＡにハイブリダイズするプローブを使用した、中期スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）の蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション等の分析手順によって、トランス配列を有するのものと区別される。二種類のクローンを、次の方法によって互いに区別することもできる。すなわち、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するベクターを用いて形質移入し、５’ベクター（９０３）によって導入されたチミジンキナーゼ遺伝子に対するガンシクロビル選択で生き残ったコロニー数を比較し、そしてクローン由来の細胞の幾つかを、ピューロマイシンまたはＧ４１８／ネオマイシンに対する抵抗性についてテストする「同胞選択（ｓｉｂｌｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」スクリーニング手順による。

この種の実験で、変異のシス配列を有する細胞は、トランス配列を有する細胞よりもほぼ１０^３倍多いガンシクロビル耐性クローンが生じると予想される。結果として生じるシス由来のガンシクロビル耐性クローンの大部分はまた、Ｇ４１８／ネオマイシンの両薬物に感受性があると予想される。これとは対照的に、トランス由来のガンシクロビル耐性クローンとは、ピューロマイシンおよびＧ４１８／ネオマイシンの両者に対する抵抗性を保持するはずである。操作された変異のシス配列をκ鎖遺伝子座に有する細胞を、さらなる使用のために選択する。

上でまとめた分析実験と同様、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するベクターを用いて細胞の二重標的クローンを形質移入し、その後、形質移入細胞をガンシクロビル選択にかける。細胞のガンシクロビル耐性クローンを単離し、５’ベクター（９０３）および３’ベクター（９０５）により作り出された２つの操作された変異間の予想される欠失の存在について、ＰＣＲおよびサザンブロットで分析する。これらのクローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２つのベクターによりκ遺伝子座に導入されたｌｏｘＰ部位間に組換えを生じさせた。ｌｏｘＰ部位は、同じ相対配向で２つのベクターに配置されているため、組換えは、２つのｌｏｘＰ部位の間のゲノム区間全体を含むＤＮＡの輪が削除される結果となる。この輪は複製開始点を含まず、したがって、有糸分裂中に複製されず、したがってクローン増殖を経るにつれて、細胞のクローンから失われる。結果として生じるクローンでは、元は２つのｌｏｘＰ部位の間にあったＤＮＡが欠失されている。予想される欠失を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。

ＥＳ細胞クローンであって、それらの免疫グロブリンκ鎖遺伝子座の２つの相同コピーの一方における配列が欠失されたＥＳ細胞クローンに、Ｖ、ＤおよびＪ領域遺伝子セグメントを含む部分的ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座を含むＤＮＡ片（９０９）と、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターとを用いて、再形質移入する（９０４）。このＤＮＡ片（「Ｋ−Ｋ」と呼ばれる）（配列番号２）の重要な特徴は以下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム（イニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありｌｏｘ５１７１部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している）；転写終結／ポリアデニル化配列；ＦＲＴ部位；３９のヒトκ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウス非コード配列に組込まれたヒトコード配列から成る。；マウスκ鎖遺伝子座におけるＪκ領域遺伝子セグメントの集団のすぐ上流由来の１３．５ＫｂのゲノムＤＮＡ片；マウス非コードＤＮＡに組込まれた５つのヒトＪ領域遺伝子セグメントを含む２ＫｂのＤＮＡ片；ｌｏｘ５１７１部位と逆相対配向のｌｏｘＰ部位。

第２の独立した実験では、Ｋ−Ｋ ＤＮＡの代わりに部分的ヒトＤＮＡの代替片（９０９）を使用する。このＤＮＡ（「Ｌ−Ｋ」と呼ばれる）（配列番号３）の重要な特徴は以
下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム（イニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありｌｏｘ５１７１部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している）；転写終結／ポリアデニル化配列；ＦＲＴ部位；３８のヒトλ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウス非コード配列に組込まれたヒトコード配列から成る。；マウスκ鎖遺伝子座におけるＪ領域遺伝子セグメントの集団のすぐ上流由来の１３．５ＫｂのゲノムＤＮＡ片；マウス非コードＤＮＡに組込まれた５つのヒトＪλ領域遺伝子セグメントを含む２ＫｂのＤＮＡ片；ｌｏｘ５１７１部位と逆相対配向のｌｏｘＰ部位。

Ｋ−Ｋ（配列番号２）およびＬ−Ｋ（配列番号３）形質移入実験からの形質移入クローンをＧ４１８選択にかけ、リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法を受けていた細胞のクローンをリッチ化する。リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法により、部分的ヒトドナーＤＮＡが全体として、ｌｏｘＰ部位とｌｏｘ５１７１部位（それぞれ３’ベクター（９０５）および５’ベクター（９０３）によって配置された）との間の、欠失された免疫グロブリンκ鎖遺伝子座に組込まれる。Ｋ−Ｋ配列を使用して作り出されたＤＮＡ領域を図９の９１１に図示する。５’ベクター（９０３）由来の残りの要素を、ＦＬＰ−仲介組換え（９０６）で除去し、結果的に、９１３に示す最終的なヒト化遺伝子座を生じる。

Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞クローンをＰＣＲおよびサザンブロットで分析して、不必要な再構成または欠失がなく、予想されるリコンビナーゼ−仲介カセット交換プロセスを受けていたかどうかを決定する。予想されるゲノム構造を有するＫ−ＫクローンとＬ−Ｋクローンとの両者をさらなる使用のために選択する。

Ｋ−Ｋ ＥＳ細胞クローンおよびＬ−Ｋ ＥＳ細胞クローンを、ＤＢＡ／２系統由来のマウス胚盤胞に微量注入し、標準手順に従って部分的ＥＳ細胞由来キメラマウスを作り出す。これらＫ−Ｋ ＥＳ細胞クローンおよびＬ−Ｋ ＥＳ細胞クローンは、マウスκ鎖遺伝子座に部分的ヒト免疫グロブリンＤＮＡをそれぞれ担持する。外皮へのＥＳ細胞由来分布が最高レベルである雄キメラマウスを、雌マウスと交尾させるために選択する。交尾で使用するのに最適な雌マウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃ系統のものであり、生殖細胞系で発現されるＦｌｐリコンビナーゼをコード化している導入遺伝子をやはり担持している。これらの交尾による子孫を、部分的ヒト免疫グロブリンκ鎖遺伝子座の存在、およびリコンビナーゼ−仲介カセット交換ステップで作り出されたＦＲＴに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子の喪失について、分析した。部分的ヒト遺伝子座を担持するマウスは、Ｋ−ＫマウスおよびＬ−Ｋマウスのコロニーを確立するために使用される。

実施例３に記載の通りに産生された、部分的にヒトの（すなわち、ヒト化された）重鎖遺伝子座を担持するマウスを、ヒト化κ鎖遺伝子座を担持するマウスと交配させることができる。次に、それらの子孫を、両方ともヒト化された遺伝子座（すなわち重鎖およびκについてヒト化された）についてホモ接合であるマウスを最終的に産生する計画で、一緒に育てることができる。そのようなマウスは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインから成る部分的ヒト重鎖を産生する。そのようなマウスはまた、そのκ遺伝子座由来のヒトκ可変ドメインおよびマウスκ定常ドメインから成る部分的ヒトκ蛋白質も産生する。これらのマウスから回収されるモノクローナル抗体は、ヒトκ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成る。

繁殖計画に対する変動（バリエーション）は、ヒト化重鎖遺伝子座についてはホモ接合であるが、κ遺伝子座では、一方の染色体上にＫ−Ｋヒト化遺伝子座を有し、他方の染色体上にＬ−Ｋヒト化遺伝子座を有するというようにヘテロ接合である、マウスを生み出すことを含む。そのようなマウスは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインから成る部分的ヒト重鎖を産生する。それらはまた、そのκ遺伝子座の一方に由来するヒトκ可変
ドメインおよびマウスκ定常ドメインから成る部分的ヒトκ蛋白質も産生する。それらは、他方のκ遺伝子座から、ヒトλ可変ドメインおよびマウスκ定常ドメインから成る部分的ヒトλ蛋白質を産生する。これらのマウスから回収されるモノクローナル抗体は、場合によってはヒトκ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成り、また他の場合ではヒトλ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成る。

実施例５：マウスゲノムの免疫グロブリンλ鎖遺伝子座への、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入
哺乳類ゲノムの一部を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する方法を、図１０に図示する。この方法は、Ｊ３、Ｃ３、Ｊ１およびＣ１遺伝子セグメントのすぐ近くの、Ｖ２遺伝子セグメントの上流とＶ１遺伝子セグメントの下流の両方の遺伝子座と同一性を共有するターゲティングベクター（１００３）を含む相同的組換え方法により、野生型マウス免疫グロブリンλ遺伝子座（１００１）からＤＮＡのほぼ１９４Ｋｂを欠失させる。本ベクターは、ＤＮＡの１９４Ｋｂを、後続の部位特異的組換えを可能にするように設計された要素と置換する。後続の部分特異的組換えでは、リコンビナーゼ−仲介カセット交換（１００２）により、非天然のＤＮＡ片が、改変されたＶ_Ｌ遺伝子座に移動される。この実施例で、非天然ＤＮＡは、ヒト配列と非ヒト配列との両方を含む合成核酸である。

１９４Ｋｂ欠失を達成するための遺伝子ターゲティングベクター（１００３）の重要な特徴は以下の通りである：ジフテリア毒素のＡサブユニットをコード化している遺伝子または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等の、負の選択遺伝子；λ遺伝子座におけるマウスＶ２可変領域遺伝子セグメントの５’由来の４ＫｂのゲノムＤＮＡ；ＦＲＴ部位；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモータを含むゲノムＤＮＡ片；翻訳開始配列（「Ｋｏｚａｋ」コンセンサス配列に組込まれたメチオニンコドン）；Ｃｒｅリコンビナーゼ用の、変異型ＬｏｘＰ認識配列（ｌｏｘ５１７１部位として知られる）；転写終結／ポリアデニル化配列；ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質をコード化しているオープンリーディングフレーム；このオープンリーディングフレームは、Ｐｏｌｒ２ａプロモータおよびその隣の翻訳開始配列に関してアンチセンス鎖上にある；このオープンリーディングフレームの後に、それ自身の転写終結／ポリアデニル化配列も続く；Ｃｒｅリコンビナーゼ用のｌｏｘＰ認識配列；翻訳開始配列（「Ｋｏｚａｋ」コンセンサス配列に組込まれたメチオニンコドン）であって、上記ピューロマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームと同じアンチセンス鎖上にある；ニワトリβアクチンプロモータおよびサイトメガロウイルス初期エンハンサー要素であって、上記ピューロマイシン耐性オープンリーディングフレームの転写を指令するように配置され、翻訳は、ｌｏｘＰ部位の下流の開始コドンで開始し、ｌｏｘＰ部位を遡ってピューロマイシンオープンリーディングフレームに続く（Ｐｏｌｒ２ａプロモータおよびその隣の翻訳開始配列に関して全てアンチセンス鎖上にある）；「Ｆ３」部位として知られるＦｌｐリコンビナーゼ用の変異した認識部位；Ｊ３、Ｃ３、Ｊ１およびＣ１遺伝子セグメントおよび周囲の配列を含む７．３ＫｂのゲノムＤＮＡ；ジフテリア毒素のＡサブユニットをコード化している遺伝子または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等の、第２の負の選択遺伝子。

広く使用される手順に従ってターゲティングベクター（１００３）を用いて、エレクトロポレーションにより、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃマウスに由来する）に形質移入する。結果として生じる構築物（１００５）は、天然のＤＮＡを、１９６Ｋｂ領域におけるターゲティングベクター（１００３）由来の配列と置換する。

エレクトロポレーションの前に、原核生物プラスミド配列または原核生物プラスミド配列と結合したポリリンカーのみで切断する希有切断制限酵素を用いて、ベクターＤＮＡを直線化する。形質移入細胞をプレーティングし、≧２４時間後に、ピューロマイシンを使用した薬物選択にかける。１週間以上後、肉眼で見えるようになった後で、薬物耐性ＥＳ
細胞のコロニーをプレートから物理的に採取する。採取したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレート上に再プレーティングして、数日間培養する。その後、細胞の一部を保存記録として冷凍し、残りを分析目的でＤＮＡの単離に使用できるように、細胞の各クローンを分割する。

広く使用される遺伝子−ターゲティングアッセイデザインを使用して、ＰＣＲによりＥＳ細胞クローン由来のＤＮＡをスクリーニングする。４つのアッセイを使用し、いずれの場合にも、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、ターゲティングベクターとゲノムＤＮＡとの間で共有される同一性の領域外に位置するが、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の２つのアームの間の新規なＤＮＡ内（たとえば、ピューロ遺伝子内）に位置する。標準デザインに従えば、これらのアッセイは、ターゲティングベクター（１００３）と天然のＤＮＡ（１００１）との間で完全に論理的な相同的組換えを受けた形質移入細胞に由来する細胞のクローンに存在するだけであろうＤＮＡ片を検出する。

形質移入（１００２）からのほぼ６個のＰＣＲ−陽性クローンを増殖のために選択し、続いてサザンブロットアッセイを使用してさらに分析する。サザンブロットは、３つのプローブおよび複数の制限酵素で消化されたクローンに由来するゲノムＤＮＡを含む。３つのプローブおよび複数の制限酵素は、ＤＮＡが相同的組換えによって適切に改変されていたかどうかを確認することが、プローブと消化物の組合せによって可能になるように選択される。

マウスＥＳ細胞で生じる、最も一般な染色体異常を識別するために設計されたイン・サイチュ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して、ＥＳ細胞のＰＣＲ−陽性クローン６個を、核型分析する。異常の証拠を示すクローンは、さらなる使用から除外される。サザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断された、核型的に正常なクローンをさらなる使用のために選択する。

免疫グロブリンλ鎖遺伝子座の２つの相同コピーの一方に欠失を有するＥＳ細胞クローンに、Ｖ、ＪおよびＣ領域遺伝子セグメントを含む部分的ヒト免疫グロブリンλ鎖遺伝子座を含むＤＮＡ片（１００７）（配列番号：４）と、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターとを用いて、再形質移入する（１００４）。このＤＮＡ片（１００７）の重要な特徴は以下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム（イニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありｌｏｘ５１７１部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している）；転写終結／ポリアデニル化配列；ＦＲＴ部位；３８のヒトλ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウスλ非コード配列に組込まれたヒトλコード配列から成る；Ｊ〜Ｃユニットのアレイであって、マウスλ遺伝子座由来の非コード配列内に組込まれたヒトＪλ領域遺伝子セグメントおよびマウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントから成る（ヒトＪ領域遺伝子セグメントは、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ６およびＪ７をコード化するものであるが、マウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントは、Ｃ１および／またはＣ２および／またはＣ３である）；「Ｆ３」部位として知られるＦｌｐリコンビナーゼ用の変異型認識部位；ハイグロマイシン耐性を与えるオープンリーディングフレーム；そのオープンリーディングフレームは、構築物において、情報をコードしている免疫グロブリン遺伝子セグメントに関してアンチセンス鎖上に位置する；ｌｏｘ５１７１部位と逆相対配向のｌｏｘＰ部位。

形質移入クローンをＧ４１８および／またはハイグロマイシン選択にかけ、リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法を受けていた細胞のクローンをリッチ化する。リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法により、部分的ヒトドナーＤＮＡが全体として、ｌｏｘＰ部位とｌｏｘ５１７１部位（遺伝子ターゲティングベクターによって配置された）との間の欠失させた免疫グロブリンλ鎖遺伝子座に組込まれる。ターゲティングベクター（１００３
）由来の残りの要素をＦＬＰ−仲介組換え（１００６）で除去し、結果的に、１０１１に示す最終的なヒト化遺伝子座が生じる。

Ｇ４１８／ハイグロマイシン耐性ＥＳ細胞クローンをＰＣＲおよびサザンブロットで分析して、不必要な再構成または欠失がなく、予想されるリコンビナーゼ−仲介カセット交換方法を受けていたかどうかを決定する。予想されるゲノム構造を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。

部分的ヒト免疫グロブリンＤＮＡ（１０１１）をマウスλ鎖遺伝子座に担持するＥＳ細胞クローンを、ＤＢＡ／２系統由来のマウス胚盤胞に微量注入し、標準手順に従って部分的ＥＳ細胞由来キメラマウスを作り出す。外皮へのＥＳ細胞由来分布が最高レベルである雄キメラマウスを、雌マウスと交尾させるために選択する。本明細書で最適な雌マウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃ系統のものであり、その生殖細胞系で発現されるＦｌｐリコンビナーゼをコード化している導入遺伝子を担持する。これらの交尾による子孫を、部分的ヒト免疫グロブリンλ鎖遺伝子座の存在、およびリコンビナーゼ−仲介カセット交換ステップで作り出されたＦＲＴに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子およびＦ３−に挟まれたハイグロマイシン耐性遺伝子の喪失について、分析した。部分的ヒト遺伝子座を担持するマウスを使用して、マウスのコロニーを確立する。

幾つかの態様で、ヒト化された重鎖およびκ遺伝子座を含むマウス（実施例３および実施例４に記載されている）は、ヒト化λ遺伝子座を担持するマウスに育てられる。この種の育種計画から生み出されるマウスは、ヒト化重鎖遺伝子座についてホモ接合であり、Ｋ−Ｋヒト化遺伝子座またはＬ−Ｋヒト化遺伝子座についてホモ接合であってもよい。あるいは、κ遺伝子座において、一方の染色体上にＫ−Ｋ遺伝子座を担持し、他方の染色体上にＬ−Ｋ遺伝子座を担持するヘテロ接合であってもよい。これらの各マウスは、ヒト化λ遺伝子座についてホモ接合になる。これらのマウスから回収されるモノクローナル抗体は、場合によってはヒトκ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成り、また場合によってはヒトλ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成る。λ可変ドメインは、ヒト化Ｌ−Ｋ遺伝子座またはヒト化λ遺伝子座のいずれかに由来する。

実施例６：マウスゲノムへの部分的ヒト免疫グロブリンミニ遺伝子への導入
ある特定の他の態様で、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、図１１に図示するもの等の、ヒト可変ドメインミニ遺伝子を含む。ここで、ヒトＶ_Ｈ遺伝子の全部または実質的に全部を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域の代わりに、マウス免疫グロブリン領域が、より少ないヒトＶ_Ｈ遺伝子（たとえば１〜４３のヒトＶ_Ｈ遺伝子）を含むミニ遺伝子（１１１９）と置換される。

哺乳類宿主ゲノムに導入すべき部分的ヒト免疫グロブリン領域（１１１０）を含む部位特異的ターゲティングベクター（１１２９）を、欠失された内在性免疫グロブリン領域を有するゲノム領域（１１０１）に導入する（１１０２）。ゲノム領域（１１０１）は、部位特異的組換え部位（１１０９，１１１１，１１０７および１１０５）およびｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子（１１０３）を含む。部位特異的ターゲティングベクターは、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含んでおり、この部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ｉ）全４４のヒトＶ_Ｈコード領域およびマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むＶ_Ｈ領域（１１１９）と、ｉｉ）マウス配列を含む１０ｋｂのｐｒｅ−ＤＪ領域（７２１）と、ｉｉｉ）ヒトＤコード領域およびＪコード領域ならびにマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むＤＪ領域（１１２５）と、ｉｖ）マウス非機能性Ｊ_Ｈ遺伝子領域とを含む。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、改変された内在性遺伝子座との組換えを可能にする、組換え部位（１１０９，１１１１，１１０５および１１０７）で挟まれている。好適なリコンビナーゼが導入されると同時に（１１０４）、部分的ヒト免疫グロブリン領域が、定常遺
伝子領域（１１２７）のゲノム上流に組込まれる。

実施例１に記載の通り、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座の導入に関する一次スクリーニングは、サザンブロットにより実行され、またはサザンおよび／またはロス・オブ・ネイティブ・アレル（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｎａｔｉｖｅ−ａｌｌｅｌｅ）ｑＰＣＲスクリーンを用いた二次スクリーンで支持される一次ＰＣＲスクリーンを用いて、実行され得る。組換え事象の一部としてＨＰＲＴ遺伝子（１１０５）が欠失することにより、（６−チオグアニン−依存性の）負の選択を使用して、組換え事象を受けなかった細胞の同定が可能となる。

前述は本発明の原理を説明するに過ぎない。本明細書に明確に記述されたり示されたりしていないが、本発明の原理を具現する様々なアレンジを当業者が考案できるであろうことは十分に理解でされるであろうし、またその精神および範囲内に含まれる。さらに、本明細書に列挙した全ての実施例および条件付きの用語は、主として読者が本発明の原理および技術を促進するために発明者が貢献する概念を理解するのに役立つことを意図するものであって、具体的に列挙された実施例および条件等に限定されるものではないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、および、実施態様ならびにその具体例を列挙する、本明細書の全ての論述は、その構造的同等物および機能的同等物の両者を含むことを意図する。加えて、このような同等物は、現在知られている同等物および将来開発される同等物の両者、すなわち、構造に関わらず、同一機能を実施する、開発されるあらゆる要素を含むものとする。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記述されている代表的な実施態様に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具現される。後続する特許請求の範囲において、用語「手段（ｍｅａｎｓ）」が使用されていない限り、そこに列挙されている特徴または要素はいずれも、米国特許法（３５．Ｕ．Ｓ．Ｃ．）第１１２条の第６パラグラフに従って、手段＋機能限定と解釈すべきではない。

Claims (57)

1. 非ヒト脊椎動物宿主において導入された免疫グロブリン領域を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳類であって、
   前記導入された領域がヒト免疫グロブリン可変領域コード配列および非ヒト脊椎動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳類。
2. 非ヒト脊椎動物宿主の免疫グロブリン可変領域遺伝子座における内在性可変遺伝子の一部または全部が除去される、
   請求項１に記載のトランスジェニック動物。
3. 導入される免疫グロブリン領域遺伝子座がヒトＶ_Ｈコード配列を含む、
   請求項１または２に記載のトランスジェニック動物。
4. トランスジェニック動物が、ヒトＤ配列およびＪコード配列ならびに前記非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ配列およびＪ配列をさらに含む、
   請求項３に記載のトランスジェニック動物。
5. 内在性Ｖ_Ｈ配列、Ｄ配列およびＪ配列の一部または全部が脊椎動物宿主ゲノムから欠失している、
   請求項４に記載のトランスジェニック動物。
6. 前記非ヒト脊椎動物宿主が齧歯類である、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
7. 前記非ヒト脊椎動物宿主がマウスである、
   請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
8. 前記非ヒト脊椎動物宿主がニワトリである、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
9. 部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む、非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって、
   ａ）２以上のリコンビナーゼ標的部位を非ヒト脊椎動物細胞内に導入し、前記細胞のゲノム上流における少なくとも１つの部位と、内在性免疫グロブリン可変遺伝子を含むゲノム領域の下流の少なくとも１つの部位とを統合するステップ；および
   ｂ）ヒトコード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を、リコンビナーゼ仲介交換により前記非ヒト脊椎動物宿主の細胞に導入するステップ；
   を含む、方法。
10. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が単一の核酸領域として導入される、
    請求項９に記載の方法。
11. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が、非ヒト宿主に導入される前に単一の核酸として合成される、
    請求項１０に記載の方法。
12. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が２以上の隣接核酸領域として導入される、
    請求項９に記載の方法。
13. 可変遺伝子領域がＶ_Ｈ遺伝子領域である、
    請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ｉ）ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列、およびｉｉ）非ヒト宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列をさらに含む、
    請求項１３に記載の方法。
15. リコンビナーゼ標的部位が、内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子の上流ならびに内在性Ｄ遺伝子配列およびＪ遺伝子配列の下流に導入される、
    請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. リコンビナーゼ部位が１つまたは複数の選択マーカーと共に導入される、
    請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記方法が、前記ステップｂ）に先立ち、２つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、
    請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記非ヒト脊椎動物細胞が哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞である、
    請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記非ヒト脊椎動物細胞が鳥類始原生殖細胞である、
    請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、
    請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって、
    ａ）互いに組換わることができない２つ以上の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップであって、少なくとも１つの組換え部位が内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン領域の上流に導入され、少なくとも１つの組換え部位が前記内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン領域の下流に導入されるステップ；
    ｂ）ｉ）ヒトＶ_Ｈコード配列と、ｉｉ）内在性Ｖ_Ｈ領域に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを、宿主細胞に提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ステップａ）の宿主細胞の前記内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン領域の両側に位置するものと同一の２つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；
    ｃ）前記ステップｂ）の前記ベクター、および２つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ；および
    ｄ）前記ステップａ）の前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ；
    を含む、方法。
22. 第１のリコンビナーゼ部位が内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子を含むゲノム領域の上流に導入され、第２のリコンビナーゼ部位が内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子を含むゲノム領域の下流に導入される、
    請求項２１に記載の方法。
23. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ｉ）ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列と、ｉｉ）非ヒト宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列とをさらに含む、
    請求項２１または２２に記載の方法。
24. 前記方法が、前記ステップｃ）に先立ち、２つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、
    請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞である、
    請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および、前記細胞を単離するステップをさらに提供する、
    請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって：
    ａ）互いに組換わることができない２つ以上の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップであって、少なくとも１つの組換え部位が内在性Ｖ_Ｌ免疫グロブリン領域の上流に導入され、少なくとも１つの組換え部位が前記内在性Ｖ_Ｌ免疫グロブリン領域の下流に導入されるステップ；
    ｂ）ｉ）ヒトＶ_Ｌコード配列と、ｉｉ）内在性Ｖ_Ｌ領域に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを、宿主細胞に提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ステップａ）の宿主細胞の内在性Ｖ_Ｌ免疫グロブリン領域の両側に位置するものと同一の２つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；
    ｃ）前記ステップｂ）の前記ベクターおよび２つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ；および
    ｄ）前記ステップａ）の前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性Ｖ_Ｌ免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ；
    を含む、方法。
28. 第１のリコンビナーゼ部位が内在性Ｖ_Ｌ免疫グロブリン遺伝子を含むゲノム領域の上流に導入され、第２のリコンビナーゼ部位が内在性Ｖ_Ｌ免疫グロブリン遺伝子を含むゲノム領域の下流に導入される、
    請求項２７に記載の方法。
29. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ｉ）ヒトＪ_Ｌ遺伝子コード配列、およびｉｉ）非ヒト宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＪ_Ｌ遺伝子配列をさらに含む、
    請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記方法が、前記ステップｃ）に先立ち、２つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、
    請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記細胞が哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞である、
    請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記細胞が鳥類始原生殖細胞である、
    請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、
    請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
34. トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって、
    ａ）互いに組換わることができない２組の部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞を提供するステップであって、前記２組の部位特異的組換え部位は、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン領域の一部の両側に位置するステップ；
    ｂ）第１組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入により、前記ゲノムの内在性免疫グロブリン領域の前記一部を欠失させるステップであって、前記ゲノムにおける前記欠失は、第２組の部位特異的組換え部位を保持するステップ；
    ｃ）ヒトコード配列と、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含むベクターを提供するステップであって、前記ヒトコード配列および非コード配列は、前記第２組の部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；
    ｄ）前記ステップｃ）の前記ベクターと、第２組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ；および
    ｅ）前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座と部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座との置換を生じさせるステップ；
    を含む、方法。
35. 部分的ヒト免疫グロブリン領域がＶ_Ｈコード領域を含み、ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列とをさらに含む、
    請求項３４に記載の方法。
36. 前記方法が、前記ステップｃ）に先立ち、２つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、
    請求項３４または３５に記載の方法。
37. 前記細胞が哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞である、
    請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記細胞が鳥類始原生殖細胞である、
    請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、
    請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
40. 部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって、
    ａ）互いに組換わることができない２つの部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップ；
    ｂ）ｉ）ヒトＶ_Ｈコード配列と、ｉｉ）内在性Ｖ_Ｈ領域に基づいた非コード配列とを有
    する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、部分的ヒト領域は、前記ステップａ）の宿主細胞の前記ゲノムにおけるものと同一の２つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；
    ｃ）前記ステップｂ）の前記ベクター、および２つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを、前記細胞に導入するステップ；
    ｄ）前記ステップａ）の前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ；
    を含む、方法。
41. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ｉ）ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列と、ｉｉ）非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列とをさらに含む、
    請求項４０の方法。
42. 前記方法が、前記ステップｃ）に先立ち、２つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、
    請求項４０または４１に記載の方法。
43. 前記細胞が哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞である、
    請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記細胞が鳥類始原生殖細胞である、
    請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、
    請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
46. 部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト哺乳類細胞を産生する方法であって、
    ａ）互いに組換わることができない２つの部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞を提供するステップであって、前記２つの部位特異的組換え部位は、前記免疫グロブリン領域の一部の両側にあるステップ；
    ｂ）ヒトＶ_Ｈコード配列と、内在性Ｖ_Ｈ領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ＥＳ細胞における免疫グロブリン領域の前記一部の両側に位置するものと同一の２つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；
    ｃ）前記ＥＳ細胞において、前記免疫グロブリン領域の内在性部分を部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する結果となる組換え事象を促進する適切な条件下で、前記ＥＳ細胞および前記ベクターを、２つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させるステップ；
    を含む、方法。
47. 前記部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ｉ）ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列と、ｉｉ）非ヒト宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列とをさらに含む、
    請求項４６に記載の方法。
48. 前記方法が、前記部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、
    請求項４６または４７に記載の方法。
49. 部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類を産生する方法であって、
    ａ）互いに組換わることができない１つまたは複数の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップ；
    ｂ）ｉ）ヒトＶ_Ｈコード配列と、ｉｉ）内在性Ｖ_Ｈ領域に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ステップａ）の宿主細胞の前記ゲノムに導入されるものと同じ部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；
    ｃ）前記ステップｂ）の前記ベクター、および１組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ；
    ｄ）前記ステップａ）の前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ；
    ｅ）部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ；および
    ｆ）前記細胞を利用して、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すこと；
    を含む、方法。
50. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列とをさらに含む、
    請求項４９に記載の方法。
51. 部位特異的組換え部位が内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子の上流、および内在性Ｄ遺伝子配列およびＪ遺伝子配列の下流に導入される、
    請求項４９または５０に記載の方法。
52. 部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類を産生する方法であって、
    ａ）互いに組換わることができない２つの部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞を提供するステップであって、前記２つの部位特異的組換え部位は、免疫グロブリン可変領域遺伝子座の一部の両側に位置するステップ；
    ｂ）ヒトコード配列と、内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ＥＳ細胞において内在性免疫グロブリン領域の前記一部の両側に位置するものと同一の２つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；
    ｃ）前記ＥＳ細胞において、前記免疫グロブリン領域の内在性部分を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する結果となる組換え事象を促進する適切な条件下で、前記ＥＳ細胞および前記ベクターを、２つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させるステップ；
    ｄ）核酸の置換された部分を含むＥＳ細胞を選択し、前記胚性幹細胞を使用するステップ；および
    ｅ）部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すために前記細胞を利用して、ヘテロ接合の部分的ヒト哺乳類を産生すること；
    を含む、方法。
53. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ヒトＶ_Ｈコード配列、ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列と、非ヒト哺乳類宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子
    およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列とを含む、
    請求項５２に記載の方法。
54. 部位特異的組換え部位が、内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性Ｄ遺伝子配列およびＪ遺伝子配列の下流に導入される、
    請求項５２または５３に記載の方法。
55. 部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を産生する方法であって、
    ａ）互いに組換わることができない２組の部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞を提供するステップであって、２組の部位特異的組換え部位は、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の一部の両側に位置するステップ；
    ｂ）第１組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入により、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の前記一部を欠失させるステップであって、前記ゲノムにおける前記欠失は、第２組の部位特異的組換え部位を保持するステップ；
    ｃ）ヒトコード配列と、内在性免疫グロブリン領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むベクターを提供するステップであって、前記コード配列および非コード配列は、前記第２組の部位特異的組換え部位で挟まれているステップ；
    ｄ）前記ステップｃ）の前記ベクター、および第２の部位特異的組換え部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ；
    ｅ）前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ；
    ｆ）部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ；および
    ｇ）前記細胞を利用して、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すステップ；
    を含む、方法。
56. 部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ヒトＶ_Ｈコード領域、ヒトＤ遺伝子コード配列およびＪ遺伝子コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードＤ遺伝子およびＪ遺伝子およびｐｒｅ−ＤＪ配列とを含む、
    請求項５５に記載の方法。
57. 部位特異的組換え部位が、内在性Ｖ_Ｈ免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性Ｄ遺伝子配列およびＪ遺伝子配列の下流に導入される、
    請求項５５または５６に記載の方法。

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