WO2021261620A1 - 이형접합성 형질전환 동물 - Google Patents

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WO2021261620A1
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human
gene
race
humanized immunoglobulin
immunoglobulin
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오창규
오경석
박순익
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a transgenic animal having a genome including a humanized immunoglobulin locus for securing diversity in an antibody repertoire, and a method for producing the same. More particularly, the present invention relates to a transgenic non-human-animal having two alleles for a humanized immunoglobulin gene and a method for preparing the same, wherein the two alleles are hetero-alleles. ) is characterized as
  • Antibodies are proteins produced by B cells, and it is essential to secure various antibodies to protect the body from numerous pathogens exposed throughout life.
  • VDJ somatic hypermutation
  • SHM somatic hypermutation
  • class switching When the V, D, and J segments are recombined one by one at the DNA level through the above mechanism, somatic mutation occurs by activation-induced cytidine (AID) deaminase.
  • AID activation-induced cytidine
  • the antibody repertoire which is the totality of such various antibodies, theoretically has more than 109 diversity.
  • the pathogen in the antibody repertoire that is, a very small part of B cells with high antigen specificity, are amplified to produce antibodies to defend the body from pathogens. Therefore, the increase in the diversity of the antibody repertoire expands the candidate group of antigen-specific B cells (or antibodies) and at the same time enables the production and selection of B cells (or antibodies) with high specificity, so that in the development of antibody-producing transgenic animals Efforts are needed to increase antibody repertoire diversity.
  • One object of the present invention is to provide a transgenic animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin locus.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a transgenic animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin locus.
  • the present invention provides a transgenic animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin locus.
  • a transgenic animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin locus may be a transgenic non-human-animal having two alleles for a humanized immunoglobulin gene.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin gene may be different from each other, so that the transgenic non-human-animal may be heterozygous at the humanized immunoglobulin locus.
  • the non-human-animal may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the humanized immunoglobulin gene may include a partial region of a human immunoglobulin gene and a partial region of a non-human-animal immunoglobulin gene.
  • the humanized immunoglobulin gene may include a human immunoglobulin gene instead of a non-human-animal immunoglobulin gene.
  • the partial region of the human immunoglobulin gene may be a variable region of the human immunoglobulin gene.
  • the variable region may be a non-rearranged variable region.
  • the unrearranged variable region may include V, D and J segments, or V and J segments.
  • the partial region of the non-human-animal immunoglobulin gene may be a constant region of the non-human-animal immunoglobulin gene (endogenous immunoglobulin gene).
  • the constant region may include a C segment.
  • the two alleles of the humanized immunoglobulin gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous allele may be a first humanized immunoglobulin gene and a second humanized immunoglobulin gene.
  • the first humanized immunoglobulin gene may include a first unrearranged variable region of the first human immunoglobulin gene.
  • the second humanized immunoglobulin gene may comprise a second unrearranged variable region of a second human immunoglobulin gene.
  • first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may be hetero variable regions.
  • first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may have one or more of the following differences:
  • CNV copy number variation
  • the first human immunoglobulin gene may be derived from a first human subject
  • the second human immunoglobulin gene may be derived from a second human subject.
  • the first human entity and the second human entity may be different entities.
  • the first human immunoglobulin gene may be derived from an individual belonging to a first race
  • the second human immunoglobulin gene may be derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race may be different from each other.
  • the first race and the second race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or Negro, Negroid),
  • the race may be each selected from the group consisting of a Malay race, a Polynesian race, and an Australian race.
  • the transgenic animal having a genome comprising the humanized immunoglobulin locus may be a transgenic non-human animal having alleles from two different races for immunoglobulin.
  • the transgenic animal may be a transgenic non-human-animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin heavy chain gene loci (humanized IGH loci).
  • the transgenic non-human-animal may be a transgenic non-human-animal having two alleles for a humanized immunoglobulin heavy chain gene (humanized IGH).
  • the humanized immunoglobulin heavy chain gene may include a variable region of a human immunoglobulin heavy chain gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin heavy chain gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin heavy chain gene may include unrearranged V, D and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous allele may be a first humanized immunoglobulin heavy chain gene and a second humanized immunoglobulin heavy chain gene.
  • the first humanized immunoglobulin heavy chain gene may include a first unrearranged variable region of the first human immunoglobulin heavy chain gene.
  • the second humanized immunoglobulin heavy chain gene may comprise a second unrearranged variable region of a second human immunoglobulin heavy chain gene.
  • the first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may be hetero-variable regions.
  • the heterologous variable regions may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the first human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from a first human subject
  • the second human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from a second human subject. The first human subject and the second human subject may be different from each other.
  • the first human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from an individual belonging to a first race
  • the second human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race may be different from each other.
  • the first race and the second race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or Negro, Negroid),
  • the race may be each selected from the group consisting of a Malay race, a Polynesian race, and an Australian race.
  • the first race may be a Caucasian race
  • the second race may be a Negro race.
  • the transgenic non-human-animal may be a transgenic non-human-animal having two alleles from different races for the immunoglobulin heavy chain gene.
  • the non-human-animal may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the transgenic animal may be a transgenic non-human-animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin kappa gene loci (humanized IGK loci).
  • the transgenic non-human-animal may be a transgenic non-human-animal having two alleles for a humanized immunoglobulin kappa gene (humanized IGK).
  • the humanized immunoglobulin kappa gene may include a variable region of a human immunoglobulin kappa gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin kappa gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin kappa gene may include unrearranged V and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous allele may be a first humanized immunoglobulin kappa gene and a second humanized immunoglobulin kappa gene.
  • the first humanized immunoglobulin kappa gene may include a first unrearranged variable region of the first human immunoglobulin kappa gene.
  • the second humanized immunoglobulin kappa gene may comprise a second unrearranged variable region of a second human immunoglobulin kappa gene.
  • the first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may be hetero-variable regions.
  • the heterologous variable regions may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the first human immunoglobulin kappa gene may be derived from a first human subject
  • the second human immunoglobulin kappa gene may be derived from a second human subject. The first human subject and the second human subject may be different from each other.
  • the first human immunoglobulin kappa gene may be derived from an individual belonging to a first race
  • the second human immunoglobulin kappa gene may be derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race may be different from each other.
  • the first race and the second race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or Negro, Negroid),
  • the race may be each selected from the group consisting of a Malay race, a Polynesian race, and an Australian race.
  • the first race may be a Caucasian race
  • the second race may be a Mongolian race.
  • the transgenic non-human-animal may be a transgenic non-human-animal having two alleles from different races for the immunoglobulin kappa gene.
  • the non-human-animal may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the transgenic animal may be a transgenic non-human-animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin lambda gene loci (humanized IGL loci).
  • the transgenic non-human-animal may be a transgenic non-human-animal having two alleles for a humanized immunoglobulin lambda gene (humanized IGL).
  • the humanized immunoglobulin lambda gene may include a variable region of a human immunoglobulin lambda gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin lambda gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin lambda gene may include unrearranged V and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous allele may be a first humanized immunoglobulin lambda gene and a second humanized immunoglobulin lambda gene.
  • the first humanized immunoglobulin lambda gene may include a first unrearranged variable region of the first human immunoglobulin lambda gene.
  • the second humanized immunoglobulin lambda gene may comprise a second unrearranged variable region of a second human immunoglobulin lambda gene.
  • the first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may be hetero-variable regions.
  • the heterologous variable regions may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the first human immunoglobulin lambda gene may be derived from a first human subject
  • the second human immunoglobulin lambda gene may be derived from a second human subject. The first human subject and the second human subject may be different from each other.
  • the first human immunoglobulin lambda gene may be derived from an individual belonging to a first race
  • the second human immunoglobulin lambda gene may be derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race may be different from each other.
  • the first race and the second race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or Negro, Negroid),
  • the race may be each selected from the group consisting of a Malay race, a Polynesian race, and an Australian race.
  • the first race may be a Negro
  • the second race may be a Mongolian.
  • the transgenic non-human-animal may be a transgenic non-human-animal having two alleles from different races for the immunoglobulin lambda gene.
  • the non-human-animal may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the transgenic animal has a genome comprising a humanized immunoglobulin heavy chain gene loci (humanized IGH loci) and a humanized immunoglobulin kappa gene loci (humanized IGK loci).
  • a humanized immunoglobulin heavy chain gene loci humanized IGH loci
  • a humanized immunoglobulin kappa gene loci humanized IGK loci
  • the transgenic non-human-animal is a transgenic having two alleles for a humanized immunoglobulin heavy chain gene (humanized IGH) and a humanized immunoglobulin kappa gene (humanized IGK), respectively. It may be a non-human-animal.
  • the humanized immunoglobulin heavy chain gene may include a variable region of a human immunoglobulin heavy chain gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin heavy chain gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin heavy chain gene may include unrearranged V, D and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene may be a first humanized immunoglobulin heavy chain gene and a second humanized immunoglobulin heavy chain gene.
  • the first humanized immunoglobulin heavy chain gene may include a first unrearranged variable region of the first human immunoglobulin heavy chain gene.
  • the second humanized immunoglobulin heavy chain gene may comprise a second unrearranged variable region of a second human immunoglobulin heavy chain gene.
  • the first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may be heavy chain hetero-variable regions.
  • the heavy chain heterologous variable regions may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the first human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from a first human subject
  • the second human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from a second human subject.
  • the first human subject and the second human subject may be different from each other.
  • the first human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from an individual belonging to a first race
  • the second human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race may be different from each other.
  • the humanized immunoglobulin kappa gene may include a variable region of a human immunoglobulin kappa gene and a constant region of a mouse immunoglobulin kappa gene.
  • variable region of the human immunoglobulin kappa gene may include unrearranged V and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene may be hetero-alleles.
  • the hetero-alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene may be a third humanized immunoglobulin kappa gene and a fourth humanized immunoglobulin kappa gene.
  • the third humanized immunoglobulin kappa gene may include a third unrearranged variable region of the third human immunoglobulin kappa gene.
  • the fourth humanized immunoglobulin kappa gene may comprise a fourth unrearranged variable region of the fourth human immunoglobulin kappa gene.
  • the third unrearranged variable region and the fourth unrearranged variable region may be kappa hetero-variable regions.
  • the kappa heterotype variable region may have one or more of the following differences: i) a synonymous mutation or a nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the third human immunoglobulin kappa gene may be derived from a third human individual, and the fourth human immunoglobulin kappa gene may be derived from a fourth human individual.
  • the third human subject and the fourth human subject may be different from each other.
  • the third human immunoglobulin kappa gene may be derived from an individual belonging to a third race
  • the fourth human immunoglobulin kappa gene may be derived from an individual belonging to a fourth race.
  • the third race and the fourth race may be different from each other.
  • the third race may be the same as the first race.
  • the first race, the second race, the third race, and the fourth race may be different from each other.
  • the first race, the second race, the third race, and the fourth race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or It may be a race selected from the group consisting of Negro (Negroid)), Malay, Polynesian, and Australian race.
  • the transgenic non-human-animal has two alleles from different races for the immunoglobulin heavy chain gene and two alleles from different races for the immunoglobulin kappa gene.
  • transgenic non-human-animals may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the transgenic animal has a genome comprising a humanized immunoglobulin heavy chain gene loci (humanized IGH loci) and a humanized immunoglobulin lambda gene loci (humanized IGL loci) transgenic non-human-animals.
  • the transgenic non-human-animal is a transgenic having two alleles each for a humanized immunoglobulin heavy chain gene (humanized IGH) and a humanized immunoglobulin lambda gene (humanized IGL). It may be a non-human-animal.
  • the humanized immunoglobulin heavy chain gene may include a variable region of a human immunoglobulin heavy chain gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin heavy chain gene.
  • variable region of the human immunoglobulin heavy chain gene may include unrearranged V, D and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene may be a first humanized immunoglobulin heavy chain gene and a second humanized immunoglobulin heavy chain gene.
  • the first humanized immunoglobulin heavy chain gene may include a first unrearranged variable region of the first human immunoglobulin heavy chain gene.
  • the second humanized immunoglobulin heavy chain gene may comprise a second unrearranged variable region of a second human immunoglobulin heavy chain gene.
  • the first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may be heavy chain hetero-variable regions.
  • the heavy chain heterologous variable regions may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the first human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from a first human subject
  • the second human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from a second human subject.
  • the first human subject and the second human subject may be different from each other.
  • the first human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from an individual belonging to a first race
  • the second human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race may be different from each other.
  • the humanized immunoglobulin lambda gene may include a variable region of a human immunoglobulin lambda gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin lambda gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin lambda gene may include unrearranged V and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene may be hetero-alleles.
  • the hetero-alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene may be a third humanized immunoglobulin lambda gene and a fourth humanized immunoglobulin lambda gene.
  • the third humanized immunoglobulin lambda gene may include a third unrearranged variable region of the third human immunoglobulin lambda gene.
  • the fourth humanized immunoglobulin lambda gene may comprise a fourth unrearranged variable region of the fourth human immunoglobulin lambda gene.
  • the third unrearranged variable region and the fourth unrearranged variable region may be lambda hetero-variable regions.
  • the lambda heterozygous variable region may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the third human immunoglobulin lambda gene may be derived from a third human individual, and the fourth human immunoglobulin lambda gene may be derived from a fourth human individual. The third human subject and the fourth human subject may be different from each other.
  • the third human immunoglobulin lambda gene may be derived from an individual belonging to a third race
  • the fourth human immunoglobulin lambda gene may be derived from an individual belonging to a fourth race.
  • the third race and the fourth race may be different from each other.
  • the third race may be the same as the first race.
  • the first race, the second race, the third race, and the fourth race may be different from each other.
  • the first race, the second race, the third race, and the fourth race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or It may be a race selected from the group consisting of Negro (Negroid)), Malay, Polynesian, and Australian race.
  • the transgenic non-human-animal has two alleles from different races for the immunoglobulin heavy chain gene and two alleles from different races for the immunoglobulin lambda gene.
  • transgenic non-human-animals may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the transgenic animal has a genome comprising a humanized immunoglobulin kappa gene loci (humanized IGK loci) and a humanized immunoglobulin lambda gene loci (humanized IGL loci) transgenic non-human-animals.
  • the transgenic non-human-animal is a transgenic non-human having two alleles each for a humanized immunoglobulin kappa gene (humanized IGK) and a humanized immunoglobulin lambda gene (humanized IGL). -Can be an animal.
  • the humanized immunoglobulin kappa gene may include a variable region of a human immunoglobulin kappa gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin kappa gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin kappa gene may include unrearranged V and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene may be a first humanized immunoglobulin kappa gene and a second humanized immunoglobulin kappa gene.
  • the first humanized immunoglobulin kappa gene may include a first unrearranged variable region of the first human immunoglobulin kappa gene.
  • the second humanized immunoglobulin kappa gene may comprise a second unrearranged variable region of a second human immunoglobulin kappa gene.
  • the first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may be kappa hetero-variable regions.
  • the kappa heterotype variable region may have one or more of the following differences: i) a synonymous mutation or a nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the first human immunoglobulin kappa gene may be derived from a first human subject
  • the second human immunoglobulin kappa gene may be derived from a second human subject. The first human subject and the second human subject may be different from each other.
  • the first human immunoglobulin kappa gene may be derived from an individual belonging to a first race
  • the second human immunoglobulin kappa gene may be derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race may be different from each other.
  • the humanized immunoglobulin lambda gene may include a variable region of a human immunoglobulin lambda gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin lambda gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin lambda gene may include unrearranged V and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene may be hetero-alleles.
  • the hetero-alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene may be a third humanized immunoglobulin lambda gene and a fourth humanized immunoglobulin lambda gene.
  • the third humanized immunoglobulin lambda gene may include a third unrearranged variable region of the third human immunoglobulin lambda gene.
  • the fourth humanized immunoglobulin lambda gene may comprise a fourth unrearranged variable region of the fourth human immunoglobulin lambda gene.
  • the third unrearranged variable region and the fourth unrearranged variable region may be lambda hetero-variable regions.
  • the lambda heterozygous variable region may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the third human immunoglobulin lambda gene may be derived from a third human individual, and the fourth human immunoglobulin lambda gene may be derived from a fourth human individual. The third human subject and the fourth human subject may be different from each other.
  • the third human immunoglobulin lambda gene may be derived from an individual belonging to a third race
  • the fourth human immunoglobulin lambda gene may be derived from an individual belonging to a fourth race.
  • the third race and the fourth race may be different from each other.
  • the third race may be the same as the first race.
  • the first race, the second race, the third race, and the fourth race may be different from each other.
  • the first race, the second race, the third race, and the fourth race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or It may be a race selected from the group consisting of Negro (Negroid)), Malay, Polynesian, and Australian race.
  • the transgenic non-human-animal has two alleles from different races for the immunoglobulin kappa gene and two alleles from different races for the immunoglobulin lambda gene.
  • transgenic non-human-animals The non-human-animal may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the transgenic animal is a humanized immunoglobulin heavy chain gene loci (humanized IGH loci), a humanized immunoglobulin kappa gene loci (humanized IGK loci) and a humanized immunoglobulin lambda loci ( and a transgenic non-human-animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci).
  • the transgenic non-human-animal is a humanized immunoglobulin heavy chain gene (humanized IGH), a humanized immunoglobulin kappa gene (humanized IGK), and a humanized immunoglobulin lambda gene (humanized immunoglobulin lambda gene; humanized).
  • the humanized immunoglobulin heavy chain gene may include a variable region of a human immunoglobulin heavy chain gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin heavy chain gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin heavy chain gene may include unrearranged V, D and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene may be a first humanized immunoglobulin heavy chain gene and a second humanized immunoglobulin heavy chain gene.
  • the first humanized immunoglobulin heavy chain gene may include a first unrearranged variable region of the first human immunoglobulin heavy chain gene.
  • the second humanized immunoglobulin heavy chain gene may comprise a second unrearranged variable region of a second human immunoglobulin heavy chain gene.
  • the first unrearranged variable region and the second unrearranged variable region may be heavy chain hetero-variable regions.
  • the heavy chain heterologous variable regions may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the first human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from a first human subject
  • the second human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from a second human subject. The first human subject and the second human subject may be different from each other.
  • the first human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from an individual belonging to a first race
  • the second human immunoglobulin heavy chain gene may be derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race may be different from each other.
  • the humanized immunoglobulin kappa gene may include a variable region of a human immunoglobulin kappa gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin kappa gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin kappa gene may include unrearranged V and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene may be a third humanized immunoglobulin kappa gene and a fourth humanized immunoglobulin kappa gene.
  • the third humanized immunoglobulin kappa gene may include a third unrearranged variable region of the third human immunoglobulin kappa gene.
  • the fourth humanized immunoglobulin kappa gene may comprise a fourth unrearranged variable region of the fourth human immunoglobulin kappa gene.
  • the third unrearranged variable region and the fourth unrearranged variable region may be kappa hetero-variable regions.
  • the kappa heterotype variable region may have one or more of the following differences: i) a synonymous mutation or a nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the third human immunoglobulin kappa gene may be derived from a third human individual, and the fourth human immunoglobulin kappa gene may be derived from a fourth human individual. The third human subject and the fourth human subject may be different from each other.
  • the third human immunoglobulin kappa gene may be derived from an individual belonging to a third race
  • the fourth human immunoglobulin kappa gene may be derived from an individual belonging to a fourth race.
  • the third race and the fourth race may be different from each other.
  • the humanized immunoglobulin lambda gene may include a variable region of a human immunoglobulin lambda gene and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin lambda gene.
  • the variable region of the human immunoglobulin lambda gene may include unrearranged V and J segments.
  • the two alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene may be hetero-alleles.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene may be a fifth humanized immunoglobulin lambda gene and a sixth humanized immunoglobulin lambda gene.
  • the fifth humanized immunoglobulin lambda gene may include a fifth unrearranged variable region of the fifth human immunoglobulin lambda gene.
  • the sixth humanized immunoglobulin lambda gene may include a sixth unrearranged variable region of the sixth human immunoglobulin lambda gene.
  • the fifth unrearranged variable region and the sixth unrearranged variable region may be lambda hetero-variable regions.
  • the lambda heterozygous variable region may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the fifth human immunoglobulin lambda gene may be derived from a fifth human individual
  • the sixth human immunoglobulin lambda gene may be derived from a sixth human individual. The fifth human subject and the sixth human subject may be different from each other.
  • the fifth human immunoglobulin lambda gene may be derived from an individual belonging to a fifth race
  • the sixth human immunoglobulin lambda gene may be derived from an individual belonging to a sixth race.
  • the fifth race and the sixth race may be different from each other.
  • two or more of the first race, the second race, the third race, the fourth race, the fifth race, and the sixth race may be the same race.
  • the first race, the second race, the third race, the fourth race, the fifth race, and the sixth race may be different from each other.
  • the first race, the second race, the third race, the fourth race, the fifth race, and the sixth race are Caucasian (or Caucasian, Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or Negro, Negroid), Malay, Polynesian, or Australian race may be each selected from the group consisting of.
  • the transgenic non-human-animal comprises i) two alleles from different races for the immunoglobulin heavy chain gene; ii) two alleles from different races for the immunoglobulin kappa gene; and iii) a transgenic non-human-animal having two alleles from different races for the immunoglobulin lambda gene.
  • the non-human-animal may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the present invention provides a method for constructing a transgenic animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin locus.
  • the transgenic animal may be a transgenic non-human-animal having two alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • the two alleles may be hetero-alleles.
  • the transgenic animal may be an animal other than a human, such as a mouse, a rat, a rabbit, a goat, a monkey, a cow, a pig, a camel, and a chicken.
  • a transgenic animal can be prepared using two or more transgenic animal cells having different alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • the transgenic animal cells may be non-human mammalian cells or avian cells.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • two or more transgenic animal cells having different alleles for the humanized immunoglobulin gene can be prepared using a known method such as a cloning method using a vector and a method using a chromosome exchange. have.
  • the method can produce a transgenic animal using two or more transgenic animal cells having different alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • the method may use a somatic cell nuclear transfer (SCNT) method.
  • SCNT somatic cell nuclear transfer
  • the method can produce a transgenic animal using embryos of two or more transgenic animals having different alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • the method can be produced by implanting the embryos of the two or more animals in the womb of a surrogate mother, respectively, to produce a transgenic animal, and crossing the produced transgenic animal.
  • the method can produce a transgenic animal using embryonic stem cells of two or more transgenic animals having different alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • the method can produce a transgenic animal by transplanting the embryonic stem cells into the blastocyst to produce a chimeric blastocyst, and implanting the chimeric blastocyst into the uterus of a surrogate mother.
  • the present invention provides a method for producing an antibody using a transgenic animal having a genome comprising a humanized immunoglobulin locus.
  • the method may include injecting an antigen into the transgenic animal. Through the antigen injection, the transgenic animal can produce an antibody specific for the antigen.
  • the antigen-specific antibody may be produced by recombination (rearrangement) of the humanized immunoglobulin gene at the humanized immunoglobulin locus.
  • the transgenic animal may be a non-human-animal.
  • the non-human-animal may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • the antibody production method may include injecting an antigen into a heterozygous transgenic animal.
  • the heterozygous transgenic animal may be a heterozygous transgenic animal having a hetero-allele for an immunoglobulin gene.
  • the immunoglobulin may be a humanized immunoglobulin gene
  • the heterozygous transgenic animal may be a heterozygous transgenic animal having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal may have a genome comprising a humanized immunoglobulin locus having a heterozygous allele for a humanized immunoglobulin gene.
  • the humanized immunoglobulin gene may be a humanized immunoglobulin heavy chain gene, a humanized immunoglobulin kappa gene, and/or a humanized immunoglobulin lambda gene.
  • the heterozygous transgenic animal can produce an antibody specific for the antigen.
  • the antigen-specific antibody may be produced by recombination (rearrangement) of any one of the heterologous alleles.
  • the method for producing an antibody may include injecting an antigen into a heterozygous transgenic animal.
  • the heterozygous transgenic animal may be a heterozygous transgenic animal having a hetero-allele for an immunoglobulin gene.
  • the immunoglobulin may be a humanized immunoglobulin gene
  • the heterozygous transgenic animal may be a heterozygous transgenic animal having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal may have a genome comprising a humanized immunoglobulin locus having a heterozygous allele for a humanized immunoglobulin gene.
  • the humanized immunoglobulin gene may be a humanized immunoglobulin heavy chain gene, a humanized immunoglobulin kappa gene, and/or a humanized immunoglobulin lambda gene.
  • the heterozygous alleles may have one or more of the following differences: i) Synonymous mutation or nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • the heterozygous transgenic animal can produce an antibody specific for the antigen.
  • the antigen-specific antibody may be produced by recombination (rearrangement) of any one of the heterologous alleles.
  • the present invention relates to a heterozygous transgenic animal having a hetero-allele for an immunoglobulin gene. More specifically, the immunoglobulin gene is a humanized immunoglobulin gene, and the heterozygous transgenic animal is a heterozygous transgenic animal having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal can be used for human antibody production. In particular, the heterozygous transgenic animal can be used to secure the diversity of the antibody repertoire (antibody repertoire).
  • first allele an individual-derived humanized immunoglobulin gene belonging to a first race and a humanized immunoglobulin gene (second allele) derived from an individual belonging to a second race as heterozygous alleles.
  • second allele a humanized immunoglobulin gene derived from an individual belonging to a second race as heterozygous alleles.
  • It can be: i) a synonymous mutation or a nonsynonymous mutation by SNP; ii) allelic variation to the V segment; iii) copy number variation (CNV) of the segment; iv) copy number variation (CNV) of the open reading frame (ORF); and v) nucleic acid deletions, insertions or duplications of 8-75 Kb in length.
  • “Homologous chromosome” means a pair of chromosomes having the same shape and size in the nucleus of a cell. Genes related to the same trait exist at the same position on both chromosomes, and this relationship is called an allele.
  • an “allele or allele” is the smallest unit for expressing a specific trait within a genome having the same location on homologous chromosomes, that is, a gene locus.
  • One pair of alleles exists for each gene in the autosome of diploid organisms with a genome of 2n like humans, and each allele is derived from one maternal line and one from the paternal line.
  • a homoallele homo-allele
  • hetero-allele hetero-allele
  • the allele of immunoglobulin is an allele that exists in the germline, and is included in an unrearranged variable region.
  • the rearranged variable region ie, V, D, J or V, J
  • V, J includes a recombined variable region, it is referred to as a recombination allele.
  • locus locus
  • a “gene locus or locus” means a specific fixed location within a chromosome in which a specific gene is located. For haploid cells, there is one locus for a particular gene. In diploid cells, there are two loci for a particular gene. In this case, the two loci may each contain the same allele for a specific gene, that is, a homozygous allele. Alternatively, the two loci may each contain different alleles for a particular gene, ie, heterozygous alleles.
  • locus or locus refers to a region in which a specific gene is normally transcribed. That is, it refers to a region in a chromosome that includes all elements necessary for the normal expression of a specific gene, such as exons, introns, promoters, enhancers, and locus control regions (LCR).
  • immunoglobulin heavy chain locus immunoglobulin heavy chain locus (immunoglobulin heavy locus (loci); IGH) refers to the site in which the gene for the immunoglobulin heavy chain in the chromosome is located, and all elements necessary for the normal expression of the immunoglobulin heavy chain gene ( It means a region including a promoter, an enhancer, a variable region gene, a constant region gene, etc.).
  • Immunoglobulin heavy locus IGH locus (loci)
  • immunoglobulin heavy locus (IGH locus (loci)) is located in which the immunoglobulin heavy chain gene, including V (variable), D (diversity), J (joining) and C (constant) segments, is located It refers to a fixed location within a chromosome.
  • immunoglobulin heavy chain locus (immunoglobulin heavy locus; IGH locus (loci)) is an immunoglobulin heavy chain gene comprising V (variable), D (diversity), J (joining) and C (constant) segments. It means a region that normally transcribes.
  • the immunoglobulin heavy chain locus includes the recombined V-D-J region due to recombination of the segments during B cell development.
  • the segments contained in the immunoglobulin heavy chain locus in the genome of the B cells during each developmental process may be subject to recombination.
  • the germline immunoglobulin heavy chain locus comprises all of the unrecombined V, D, J and C segments, wherein the unrecombined V, D and J segments are defined as “unrearranged variable regions”. (unrearranged variable region)”.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin heavy chain locus comprises multiple V segments, multiple D segments and multiple J segments.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin heavy chain locus comprises 38-46 V segments, 23 D segments, and 6 J segments.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin heavy chain locus contains 109 V segments, 19 D segments and 4 J segments.
  • each segment may have different alleles (segments) for each individual.
  • Information on alleles of some segments is compiled in the ImMunoGeneTics information system database (IMGT).
  • the V segment of the immunoglobulin heavy chain locus is referred to as IGHV, the D segment as IGHD, and the J segment as IGHJ.
  • the C segment of the constant region of the immunoglobulin heavy chain locus is also referred to as IGHC.
  • Immunoglobulin lambda locus IGL locus (loci)
  • immunoglobulin lambda locus (IGL locus (loci)) is a fixed in the chromosome in which the immunoglobulin lambda gene comprising V (variable), J (joining) and C (constant) segments is located. means location.
  • the “immunoglobulin lambda locus (IGL locus (loci))” refers to the normal transcription of an immunoglobulin lambda gene including V (variable), J (joining) and C (constant) segments. means area.
  • the immunoglobulin lambda locus includes the recombined V-J region due to recombination during the development of B cells.
  • the segments contained in the immunoglobulin lambda locus in the genome of B cells during each developmental process may be subject to recombination.
  • the germline immunoglobulin lambda locus contains all V, J, and C segments in an unrecombined state, where the unrecombined V and J segments are referred to as “unrearranged variable regions”. )” is called.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin lambda locus comprises multiple V segments and multiple J segments.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin lambda locus comprises 33 V segments and 5 J segments.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin lambda locus contains 3 to 8 V segments and 4 J segments. In this case, each segment may have different alleles (segments) for each individual. Information on alleles of some segments is compiled in the ImMunoGeneTics information system database (IMGT).
  • IMGT ImMunoGeneTics information system database
  • the V segment of the immunoglobulin lambda locus is referred to as IGLV and the J segment as IGLJ.
  • the C segment of the constant region of the immunoglobulin lambda locus is also referred to as IGLC.
  • Immunoglobulin kappa locus (IGK locus (loci))
  • Immunoglobulin kappa locus (IGK locus (loci)) is a fixed in the chromosome in which the immunoglobulin kappa gene comprising V (variable), J (joining) and C (constant) segments is located. means location.
  • the “immunoglobulin kappa locus (IGK locus (loci))” refers to the normal transcription of an immunoglobulin kappa gene including V (variable), J (joining) and C (constant) segments. means area.
  • the immunoglobulin kappa locus includes the recombined V-J region due to recombination during the development of B cells.
  • the segments contained in the immunoglobulin kappa locus in the genome of B cells during each developmental process may be subject to recombination.
  • the germline immunoglobulin kappa locus contains all V, J, and C segments in an unrecombined state, wherein the unrecombined V and J segments are "unrearranged variable regions”. )” is called.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin kappa locus comprises multiple V segments and multiple J segments.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin kappa locus comprises 34 to 48 V segments and 5 J segments.
  • the unrearranged variable region of the immunoglobulin kappa locus contains 91 V segments and 4 J segments. In this case, each segment may have different alleles (segments) for each individual. Information on alleles of some segments is compiled in the ImMunoGeneTics information system database (IMGT).
  • IMGT ImMunoGeneTics information system database
  • the V segment of the immunoglobulin kappa locus is referred to as IGKV, and the J segment is referred to as IGKJ.
  • the C segment of the constant region of the immunoglobulin kappa locus is also referred to as IGKC.
  • “Humanized or humanized” is a term meaning that all or part of an object is human or of human origin, and when the term is used in conjunction with a gene, i.e., a humanized gene is a non-human-animal It refers to a condition in which all or part of a nucleic acid sequence of a specific gene is replaced with a nucleic acid sequence of a human gene or has the same nucleic acid sequence as a human gene.
  • the mouse humanized immunoglobulin gene may be a mouse immunoglobulin gene, ie, a gene comprising the variable region of a human immunoglobulin gene instead of the variable region of an endogenous immunoglobulin gene.
  • the mouse humanized immunoglobulin gene may be a mouse immunoglobulin gene, ie, a gene including the constant region of a human immunoglobulin gene instead of the constant region of an endogenous immunoglobulin gene.
  • the mouse humanized immunoglobulin gene may include a mouse immunoglobulin gene, that is, a human immunoglobulin gene instead of an endogenous immunoglobulin gene.
  • the mouse humanized immunoglobulin gene comprises a portion of the variable region of a human immunoglobulin gene (V segment) instead of a portion (e.g., V segment) of a mouse immunoglobulin gene, i.e., an endogenous immunoglobulin gene, and may be a gene.
  • a humanized locus refers to a state having all or part of the nucleic acid sequence of a human gene within a specific locus of a non-human-animal.
  • the rat humanized immunoglobulin locus may be a rat immunoglobulin locus, ie, a locus that contains the variable region of a human immunoglobulin gene instead of the variable region of an endogenous immunoglobulin gene within an endogenous immunoglobulin locus.
  • the rat humanized immunoglobulin locus may be a rat immunoglobulin locus, ie, a locus comprising the constant region of a human immunoglobulin gene instead of the constant region of an endogenous immunoglobulin gene within the endogenous immunoglobulin locus.
  • the rat humanized immunoglobulin locus may be a rat immunoglobulin locus, ie, a locus containing a human immunoglobulin gene instead of an endogenous immunoglobulin gene in the endogenous immunoglobulin locus.
  • the rat humanized immunoglobulin locus may be a rat immunoglobulin locus, i.e., a portion of the variable region of a human immunoglobulin gene (J segment) instead of a portion of the variable region of an endogenous immunoglobulin gene within the endogenous immunoglobulin locus (eg, J segment).
  • segment may be a locus containing
  • Race is a concept that arbitrarily divides and categorizes a population group recognized as having differences in physical, social, and cultural characteristics among humans, and can be classified in various ways depending on the classification method. In general, a method of classifying white people, black people, and yellow people based on morphological criteria such as skin color is most widely used.
  • race is geographically and morphologically based on Caucasian race (or Caucasian, Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or Negro, Negroid), They were divided into Malay and Polynesian (Polynesian, or Australian race).
  • the Caucasian race (or Caucasoid race) is a Caucasian, distributed throughout Europe, North Africa, the Arabian Peninsula, Afghanistan, Northern India, South America, and North America, with white skin, some brown, broad forehead, It has features such as a high nose, blue-brown or black eyes, and a lot of body hair, but the morphological features are not limited thereto.
  • Mongolians are yellow people distributed in Asia (East Asia, South Asia, West Asia, Asia Minor, Central Asia), Mongolia, Siberia, Indochina, Hungary, and Finland, and their skin is mainly yellow, Some are light brown, and have characteristics such as a broad forehead, a low nose, black straight hair, and little body hair, but the morphological characteristics are not limited thereto.
  • Black (or Negro, Negroid) is a black person distributed in Africa, North America, etc., whose skin is coppery or dark brown, has thick lips, a low nose, dark eyes, little body hair, and a high head, but has the characteristics of Enemy characteristics are not limited thereto. Black people can be divided into the Congoid race (blacks from the South Pacific, such as Australians) and the Capoid race (black natives from southern Africa).
  • the Malay race is distributed in Indonesia, the Philippines, New Guinea, and Melanesia, and the skin is brown and has characteristics similar to those of the Mongolians, but the morphological characteristics are not limited thereto.
  • Polynesian (or Australoid race) is a race distributed in the Pacific Islands such as Hawaii, Western Samoa, New Zealand, and Easter Island. Morphological characteristics are not limited thereto.
  • One aspect disclosed by the present specification relates to a heterozygous transgenic animal having a hetero-allele for an immunoglobulin gene.
  • the immunoglobulin gene is a humanized immunoglobulin gene
  • the heterozygous transgenic animal is a heterozygous transgenic animal having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal has a genome comprising a humanized immunoglobulin locus having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal can be used for human antibody production.
  • the heterozygous transgenic animal can be used to secure the diversity of the antibody repertoire (antibody repertoire).
  • each clone can produce antibodies that specifically recognize different antigens.
  • mechanisms of antibody diversity are the V, D and J segments in immunoglobulin heavy chain genes; and various recombinations (or rearrangements) of the V and J segments in the light chain gene. Also included are pairings of various combinations of rearranged heavy and light chains. Other mechanisms include somatic mutation, removal or insertion of nucleotides at the segment junction during segment assembly, and the like.
  • the antibody repertoire is the entire set of antibodies produced by these various mechanisms, generally referring to the entire set of antibodies produced by an individual. Therefore, securing the diversity of the antibody repertoire may be to increase the diversity of antibodies that specifically recognize an antigen.
  • securing the diversity of the antibody repertoire may be securing an antibody with increased specificity for an antigen.
  • the diversity of the antibody repertoire can be secured by allelic exclusion and diversification of immunoglobulin alleles (eg, using differences in alleles between individuals and races, etc.). To this end, it is necessary to develop a transgenic animal heterozygous for the immunoglobulin gene rather than a transgenic animal homozygous for the immunoglobulin gene.
  • transgenic animals currently used to produce human antibodies are homozygous transgenic animals having a homo-allele for the immunoglobulin gene. That is, transgenic animals in which a pair of alleles for an immunoglobulin gene have the same allele are being used for human antibody research and production.
  • immunoglobulins in a number of patents including US8,502,018, US9,371,553, US9,379,699, US9,447,177, US10,064,398, US9,504,236, US9,783,593, US9,445,581, US9,938,357 and US9,788,534 It discloses the production of a transgenic mouse homozygous for a gene and a method for producing a human antibody using the same.
  • Allelic exclusion refers to a phenomenon in which only one of the two alleles of a diploid is exclusively expressed and functions normally while the other allele is not expressed.
  • the phenomenon of allele exclusion can cause only one allele to work in two ways. The first is a method of regulating transcription of only one of the two alleles by chromatin remodeling. The second method is to produce a protein in which both alleles are transcribed, but only mRNA derived from one allele functions normally.
  • the most well-known phenomenon of allele exclusion is a process in which B cells (B lymphocytes) express only one type of B cell receptor (BCR).
  • immunoglobulin genes are rearranged by randomly selecting one of the two alleles during the course of B cell development.
  • the substantially expressed genotype is one of the alleles, and when rearrangement of one allele normally proceeds, rearrangement of the other allele does not proceed. Alternatively, when rearrangement of one allele does not proceed normally, rearrangement of the other allele will proceed. This allele exclusion of immunoglobulin genes ensures that one B cell has specificity for only one antigen.
  • This allele exclusion of the immunoglobulin gene is important in securing the diversity of the antibody repertoire.
  • recombination of V, D, and J segments or V and J segments of an immunoglobulin gene occurs during the allele exclusion process, and the diversity of the antibody repertoire is secured by various recombination accordingly.
  • germline gene diversity either homozygous or heterozygous
  • a difference may occur in the diversity of the B cell repertoire formed by the allele exclusion phenomenon.
  • B cell repertoire diversity refers to multiple V, D and/or J segments contained in unrearranged variable regions before the immunoglobulin genes are rearranged during B cell development. Due to the diversity of More specifically, B-cell repertoire diversity is generally due to the diversity of alleles inherited from paternal and maternal lines. Germline gene diversity arises from the diversity of alleles inherited from paternal and maternal lines, ie, differences in some V, D and/or J segments. This germline genetic diversity plays an important role in the diversity of the B cell repertoire. For example, germline gene diversity may increase the number of cases of rearrangement of V, D and/or J segments during B cell development.
  • the immunoglobulin gene is rearranged by randomly selecting one of the two alleles during the development of B cells according to the allele exclusion phenomenon.
  • the substantially expressed genotype is one of the alleles, and when rearrangement of one allele normally proceeds, rearrangement of the other allele does not proceed. Alternatively, when rearrangement of one allele does not proceed normally, rearrangement of the other allele will proceed. Therefore, there may be differences in the diversity of the B cell repertoire formed depending on the presence or absence of alleles of homozygous or heterozygous alleles. In particular, when the allele is a heterozygous allele, the B-cell repertoire diversity may increase compared to the homozygous allele.
  • transgenic animals for antibody production are homozygous transgenic animals having a homo-allele with respect to an immunoglobulin gene, and the diversity of antibody repertoire is limited.
  • Transgenic animals carrying heterozygous alleles for immunoglobulin genes may have increased germline diversity. This is due to differences in heterozygous alleles. In addition, these heterozygous allele differences can affect the diversity of the antibody repertoire.
  • alleles of the immunoglobulin gene in mammals are inherited from the paternal line and the maternal line, respectively, and are heterozygous alleles.
  • the differences between the two alleles range from single-nucleotide polymorphism (SNP) to deletion, insertion, or duplication of some regions of the gene (Chimge, NO et al. (2005) “Determination of gene”). organization in the human IGHV region on single chromosomes.” Genes Immun. 6, 186-193; Li, H. et al. (2002) “Genetic diversity of the human immunoglobulin heavy chain VH region.” Immunol. Rev. 190, 53 -68; Kidd, MJ et al.
  • the allele of the immunoglobulin gene of an individual belonging to a Caucasian race is the immunity of an individual belonging to a black (or Negro, Negroid) individual. It was confirmed that there was a significant difference from the allele of the globulin gene (Scheepers, C. et al. (2015) “Ability to develop broadly neutralizing HIV-1 antibodies is not restricted by the germline IG gene repertoire.” J. Immunol. 194, 4371-4378; and Wang, Y. et al. (2011) “Genomic screening by 454 pyrosequencing identifies a new human IGHV gene and sixteen other new IGHV allelic variants.” Immunogenetics 63, 259-265).
  • heterologous alleles makes it possible to obtain diversity in the antibody repertoire.
  • the diversity of the antibody repertoire may vary with differences in heterologous alleles. Greater differences between heterozygous alleles may increase the diversity of the antibody repertoire generated.
  • two alleles from different individuals human individuals
  • a human antibody can be produced using a transgenic animal having a first humanized humanized immunoglobulin gene (first allele) and a second humanized humanized immunoglobulin gene (second allele) as heterozygous alleles. have.
  • first human entity and the second human entity may be different entities.
  • the first allele and the second allele show a difference in an unrearranged variable region.
  • unrearranged variable regions between heterozygous alleles may have the following differences (Watson CT et al. (2017) “The individual and population genetics of antibody immunity.” Trends Immunol. 38 (7), 459-470):
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • CNV copy number variation
  • two alleles from different races may be used in transgenic animals for antibody production.
  • a transgenic animal having as heterologous alleles a humanized immunoglobulin gene (first allele) derived from an individual belonging to a first race and a humanized immunoglobulin gene (second allele) derived from an individual belonging to a second race is used to human antibodies can be produced.
  • first allele and the second allele show a difference in an unrearranged variable region.
  • unrearranged variable regions between heterozygous alleles may have the following differences (Watson CT et al. (2017) “The individual and population genetics of antibody immunity.” Trends Immunol. 38 (7), 459-470):
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • CNV copy number variation
  • the difference between the heterozygous alleles as described above can increase the diversity of the antibody repertoire by securing germline gene diversity.
  • a single nucleotide polymorphism is a genetic change or mutation that shows a difference in one nucleotide sequence in a DNA nucleotide sequence, and usually appears one in every 1,000 nucleotide sequences in the genome, resulting in genetic diversity.
  • Synonymous mutation by SNP refers to a mutation in which the SNP is present in the genome, but there is no change in the amino acids expressed by the SNP.
  • synonymous mutations when a point mutation occurs in the genome, that is, DNA, there is a mutation in the transcribed RNA sequence, but there is no mutation in the translated amino acid.
  • nonsynonymous mutations by SNPs include SNPs by substitution, insertion, or deletion of one nucleotide in the genome, and the codon sequence is changed or frame-shift mutations occur by these SNPs to modify the expressed amino acids. say mutations.
  • nonsynonymous mutation when one nucleotide is substituted, inserted or deleted in the genome, that is, in the DNA sequence, the reading frame of the codon sequence is changed accordingly, and the expressed protein or amino acid is modified.
  • allelic mutation of the V segment refers to the inclusion of one or more polymorphism mutations in some of the V segments present in the variable region of an immunoglobulin.
  • segment V1-69 of the V segments in the variable region of an immunoglobulin heavy chain gene is IGHV1-69*01, IGHV1-69*02, IGHV1-69*03, IGHV1-69*04, IGHV1-69*05 , IGHV1-69*06, IGHV1-69*07, IGHV1-69*08, IGHV1-69*09, IGHV1-69*10, IGHV1-69*11, IGHV1-69*12 and IGHV1-69*13, etc. Alleles are present.
  • Segment copy number variation refers to deletion or repetition (duplication) of some of the V, J, and/or D segments constituting the variable region of an immunoglobulin.
  • D1-14 segments among the D segments may overlap within the variable region of the immunoglobulin heavy chain gene, and in this case, the immunoglobulin heavy chain gene may be said to have a segment copy number variation.
  • the V2-28 segment among the V segments in the variable region of the immunoglobulin kappa gene may be deleted. In this case, the immunoglobulin kappa gene may be said to have a segment copy number variation.
  • ORF open reading frame
  • Immunoglobulin genes can be modified by deletion, insertion or duplication of large nucleic acid segments.
  • a region of an immunoglobulin gene may be deleted or duplicated.
  • a region may be inserted into the immunoglobulin gene.
  • the one region may be a large nucleic acid sequence of at least 8 to 75 kb in length. Mutations created by deletion, insertion, or duplication of such large nucleic acid fragments may result in copy number variations of certain segments.
  • the heterozygous transgenic animal disclosed herein may have a genome including a hetero-allele for the humanized immunoglobulin heavy chain gene in order to secure diversity in the antibody repertoire.
  • the heterozygous allele may be two alleles from different individuals. In this case, the different individuals may be individuals belonging to different races.
  • the heterologous allele may be a humanized immunoglobulin heavy chain gene from an individual belonging to a first race (first allele) and a humanized immunoglobulin heavy chain gene from an individual belonging to a second race (second allele).
  • the first race and the second race are different from each other, and the first race and the second race are Caucasian (or Caucasian, Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (Or Negro (Negroid)), Malay race (Malay), Polynesian (Polynesian), may be a race selected from the group consisting of Australian race (Australoid race), respectively.
  • the first allele and the second allele may have a difference in one or more of the following:
  • CNV copy number variation
  • the heterozygous transgenic animal disclosed herein may have a genome including a hetero-allele for the humanized immunoglobulin kappa gene in order to secure diversity in the antibody repertoire.
  • the heterozygous allele may be two alleles from different individuals. In this case, the different individuals may be different human subjects. In this case, the different individuals may be individuals belonging to different races.
  • the heterozygous allele may be a humanized immunoglobulin kappa gene (first allele) derived from an individual belonging to a first race and a humanized immunoglobulin kappa gene (second allele) derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race are different from each other, and the first race and the second race are Caucasian (or Caucasian, Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (Or Negro (Negroid)), Malay race (Malay), Polynesian (Polynesian), may be a race selected from the group consisting of Australian race (Australoid race), respectively.
  • the first allele and the second allele may have a difference in one or more of the following:
  • CNV copy number variation
  • the heterozygous transgenic animal disclosed herein may have a genome including a hetero-allele for the humanized immunoglobulin lambda gene in order to secure diversity in the antibody repertoire.
  • the heterozygous allele may be two alleles from different individuals. In this case, the different individuals may be different human subjects. In this case, the different individuals may be individuals belonging to different races.
  • the heterozygous allele may be a humanized immunoglobulin lambda gene (first allele) derived from an individual belonging to a first race and a humanized immunoglobulin lambda gene (second allele) derived from an individual belonging to a second race.
  • the first race and the second race are different from each other, and the first race and the second race are Caucasian (or Caucasian, Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (Or Negro (Negroid)), Malay race (Malay), Polynesian (Polynesian), may be a race selected from the group consisting of Australian race (Australoid race), respectively.
  • the first allele and the second allele may have a difference in one or more of the following:
  • CNV copy number variation
  • Hetero-allelic immunoglobulin heavy IGH
  • Hetero-allelic immunoglobulin Kappa IGK
  • Hetero-allelic immunoglobulin Lambda IGL
  • the heterozygous transgenic animal disclosed herein contains a hetero-allele for each of the humanized immunoglobulin heavy chain gene and the humanized immunoglobulin kappa gene in order to secure diversity of the antibody repertoire. It may have a genome comprising
  • the heterozygous allele may be two alleles from different individuals. In this case, the different individuals may be different human subjects. In this case, the different individuals may be individuals belonging to different races.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene include a humanized immunoglobulin heavy chain gene (first allele heavy chain gene) from an individual belonging to a first race and a humanized immunoglobulin heavy chain gene derived from an individual belonging to a second race (second allele) 2 allele heavy chain gene).
  • first race and the second race are different from each other.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene are a humanized immunoglobulin kappa gene (first allele kappa gene) derived from an individual belonging to a third race and a humanized immunoglobulin kappa gene derived from an individual belonging to a fourth race (a second allele kappa gene) ) can be
  • the third race and the fourth race are different from each other.
  • the first race may be the same as the third race or the fourth race.
  • Said first race, second race, third race and fourth race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), Black (or Negro) Negro, Negroid)), Malay, Polynesian, and Australian race may be each selected from the group consisting of races.
  • the first allele heavy chain gene and the second allele heavy chain gene; and the first allelic kappa gene and the second allelic kappa gene may each have a difference of one or more of the following:
  • CNV copy number variation
  • the heterozygous transgenic animal disclosed herein has a hetero-allele for each of the humanized immunoglobulin heavy chain gene and the humanized immunoglobulin lambda gene in order to secure diversity of the antibody repertoire. It may have a genome comprising
  • the heterozygous allele may be two alleles from different individuals. In this case, the different individuals may be different human subjects. In this case, the different individuals may be individuals belonging to different races.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene include a humanized immunoglobulin heavy chain gene (first allele heavy chain gene) from an individual belonging to a first race and a humanized immunoglobulin heavy chain gene derived from an individual belonging to a second race (second allele) 2 allele heavy chain gene).
  • the first race and the second race are different from each other.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene include a humanized immunoglobulin lambda gene (first allele lambda gene) derived from an individual belonging to a third race and a humanized immunoglobulin lambda gene (second allele lambda gene) derived from an individual belonging to a fourth race.
  • the third race and the fourth race are different from each other.
  • the first race may be the same as the third race or the fourth race.
  • Said first race, second race, third race and fourth race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), Black (or Negro) Negro, Negroid)), Malay, Polynesian, and Australian race may be each selected from the group consisting of races.
  • the first allele heavy chain gene and the second allele heavy chain gene; and the first allele lambda gene and the second allele lambda gene may each have a difference of one or more of:
  • CNV copy number variation
  • the heterozygous transgenic animal disclosed herein has a hetero-allele for each of the humanized immunoglobulin kappa gene and the humanized immunoglobulin lambda gene in order to secure diversity in the antibody repertoire.
  • the heterozygous allele may be two alleles from different individuals.
  • the different individuals may be different human subjects.
  • the different individuals may be individuals belonging to different races.
  • the heterozygous allele for the humanized immunoglobulin kappa gene is a humanized immunoglobulin kappa gene (first allele kappa gene) derived from an individual belonging to a first race and a humanized immunoglobulin kappa gene derived from an individual belonging to a second race (third race). 2 allele kappa gene).
  • first race and the second race are different from each other.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene include a humanized immunoglobulin lambda gene (first allele lambda gene) derived from an individual belonging to a third race and a humanized immunoglobulin lambda gene (second allele lambda gene) derived from an individual belonging to a fourth race. ) can be The third race and the fourth race are different from each other. In this case, the first race may be the same as the third race or the fourth race.
  • Said first race, second race, third race and fourth race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), Black (or Negro) Negro, Negroid)), Malay, Polynesian, and Australian race may be each selected from the group consisting of races.
  • the first allele kappa gene and the second allele kappa gene; and the first allele lambda gene and the second allele lambda gene may each have a difference of one or more of:
  • CNV copy number variation
  • the heterozygous transgenic animal disclosed herein is heterozygous for each of the humanized immunoglobulin heavy chain gene, the humanized immunoglobulin kappa gene and the humanized immunoglobulin lambda gene in order to secure diversity of the antibody repertoire. It may have a genome comprising a hetero-allele.
  • the heterozygous allele may be two alleles from different individuals. In this case, the different individuals may be different human subjects. In this case, the different individuals may be individuals belonging to different races.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin heavy chain gene include a humanized immunoglobulin heavy chain gene (first allele heavy chain gene) from an individual belonging to a first race and a humanized immunoglobulin heavy chain gene derived from an individual belonging to a second race (second allele) 2 allele heavy chain gene).
  • first race and the second race are different from each other.
  • the heterologous alleles for the humanized immunoglobulin kappa gene are a humanized immunoglobulin kappa gene (first allele kappa gene) derived from an individual belonging to a third race and a humanized immunoglobulin kappa gene derived from an individual belonging to a fourth race (a second allele kappa gene) ) can be The third race and the fourth race are different from each other.
  • the heterozygous alleles for the humanized immunoglobulin lambda gene include a humanized immunoglobulin lambda gene (first allele lambda gene) derived from an individual belonging to race 5 and a humanized immunoglobulin lambda gene (second allele lambda gene) derived from an individual belonging to race 6 ) can be
  • the fifth race and the sixth race are different from each other.
  • two or more races selected from the first race, the second race, the third race, the fourth race, the fifth race, and the sixth race may be the same race.
  • the first race, second race, third race, fourth race, fifth race, and sixth race are Caucasian (or Caucasian, Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race) )), black (or Negro, Negroid), Malay, Polynesian, and Australian race may be each selected from the group consisting of races.
  • the first allele heavy chain gene and the second allele heavy chain gene; a first allele kappa gene and a second allele kappa gene; and the first allele lambda gene and the second allele lambda gene may each have a difference of one or more of:
  • CNV copy number variation
  • the transgenic animal may be a non-human-animal
  • the non-human-animal may be a mammal other than a human or a bird (aves).
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • Germline genetic diversity according to heterozygous alleles increases the diversity of the B cell repertoire.
  • Immunoglobulin genes are usually expressed by randomly selecting one of the two alleles (Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, (2013) Kuby Immunology (7th edition), Chapter7, WH Freeman & Company) ). That is, recombination of V, D, J or V, J segments in one allele (eg, first allele) randomly selected from two alleles (first allele and second allele) of an immunoglobulin gene When (or rearrangement) occurs and a VDJ combination or VJ combination is normally formed, the second allele is not expressed and only the recombined first allele is expressed.
  • VDJ combination or VJ combination if a normal VDJ combination or VJ combination is not formed in the first allele, recombination (or rearrangement) of the V, D, J or V, J segments occurs in the second allele.
  • a normal VDJ combination or VJ combination is formed in the second allele, the first allele is not expressed and only the normally recombined second allele is expressed.
  • immunoglobulin heavy chain, kappa and lambda genes are common to immunoglobulin heavy chain, kappa and lambda genes.
  • recombination (or rearrangement) of V, D, J or V, J segments is known to occur in the order of immunoglobulin heavy chain gene, kappa gene, and lambda gene.
  • the single allele expression characteristic according to recombination (rearrangement) of these immunoglobulin genes can increase the diversity of recombination when heterozygous alleles are used, compared to when homozygous alleles are used.
  • the diversity of the antibody repertoire may be increased by heterologous alleles, since the number of recombinations caused by two different alleles is much higher than the number of recombinations caused by the same two alleles.
  • nucleotide deletions or insertions at the segment junction that occur during recombination (or rearrangement) of V, D, J or V, J segments are generated.
  • Such nucleotide removals or insertions result in junctional diversity (Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, (2013) Kuby Immunology (7th edition), Chapter7, W. H. Freeman & Company).
  • junctional diversity can increase the diversity of the antibody repertoire along with recombination (rearrangement) of immunoglobulin genes.
  • the diversity of the antibody repertoire can be increased when using heterozygous alleles compared to homozygous alleles.
  • Another aspect disclosed by the present specification relates to a method for producing a heterozygous transgenic animal having a hetero-allele for an immunoglobulin gene.
  • the immunoglobulin gene is a humanized immunoglobulin gene
  • the heterozygous transgenic animal is a heterozygous transgenic animal having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal has a genome comprising a humanized immunoglobulin locus having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal can be used for human antibody production.
  • the heterozygous transgenic animal can be used to secure the diversity of the antibody repertoire (antibody repertoire).
  • the heterozygous transgenic animal may be prepared using cells of two or more transgenic animals having different alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • two or more transgenic animal cells having different alleles for the humanized immunoglobulin gene can be prepared using a known method such as a cloning method using a vector and a method using a chromosome exchange.
  • a known method such as a cloning method using a vector and a method using a chromosome exchange.
  • a cloning method using the vector reference may be made to US Patents US 6,586,251, US 6,596,541, US 7,105,348, and US Patent Publication US 2004-0018626 A1, but is not limited thereto.
  • the method using the chromosome exchange may refer to PCT application patent PCT/KR2019/015351 and Korean patent application KR 10-2019-0042840, but is not limited thereto.
  • the heterozygous transgenic animal may be a non-human-animal other than a human.
  • the non-human-animal may be a mammal other than a human or an aves.
  • the mammal may be rodents, ungulates, or non-human primates.
  • the rodent may be a mouse, a rat, etc.
  • the ungulate may be a rabbit, a goat, a cow, a pig, a camel, etc.
  • the primate other than a human may be a chimpanzee, a monkey, etc.
  • the bird may be a chicken, a quail, etc. , but not limited thereto.
  • two or more transgenic animal cells having different alleles for the humanized immunoglobulin gene may be prepared using a chromosome exchange (or replacement, substitution) technique.
  • the two or more transgenic animal cells may be a first transgenic animal cell and a second transgenic animal cell.
  • the first transgenic animal cell may be prepared by the following method:
  • the human cell derived from an individual belonging to the first race is a cell engineered to include recombinant elements (eg, loxp, FRT, attP, attB, ITR, etc.) at both ends of the variable region of a human immunoglobulin locus
  • the non-human -The animal cell may be a cell engineered to include a recombinant element (eg, loxp, FRT, attP, attB, ITR, etc.) at both ends of the variable region of a non-human-animal immunoglobulin locus.
  • the recombinant elements at both ends of the variable region of the human immunoglobulin locus and the recombinant elements at both ends of the variable region of the non-human-animal immunoglobulin locus may be paired with each other.
  • both ends of the variable region of the human immunoglobulin locus may include Lox66 and Loxm2/71 as recombinant elements, respectively, and both ends of the variable region of the non-human-animal immunoglobulin locus are recombinant elements, respectively, Loxm2 May contain /66 and Lox71.
  • the Lox66 may pair with Lox71
  • the Loxm2/71 may pair with Loxm2/66.
  • step b)
  • the microcells may be prepared by a known method using human cells derived from an individual belonging to the first race. This is described in the documents “Thorfinn Ege et al 1974” and “Thorfinn Ege et al 1977”, which can be referred to.
  • the fusion non-human-animal cell may be prepared by contacting and fusing the microcell prepared in step b) with the non-human-animal cell. This is described in “Fournier RE et al 1977”; McNeill CA et al 1980”; and “Tomizuka et al., Nature Genetics, 16: 133 (1997)”, which may be referred to.
  • the fusion non-human-animal cell may include a chromosome having a human immunoglobulin locus of a human cell derived from an individual belonging to a first race and a chromosome having a non-human-animal immunoglobulin locus.
  • step d)
  • a first transgenic animal cell having a humanized immunoglobulin locus may be prepared by treating the fusion non-human-animal cell prepared in step c) with a recombinant enzyme.
  • the recombinant enzyme may be Cre recombinase.
  • the Cre recombinase is a recombinant element (eg, Lox66 and Loxm2/71) at both ends of the variable region of the human immunoglobulin locus and a recombinant element (eg, at both ends of the variable region of the non-human-animal immunoglobulin locus)
  • Loxm2/66 and Lox71 can be recognized.
  • Cre recombinase can induce recombination by recognizing pairings of recombination elements (eg, Lox66 and Lox71 pairing, Loxm2/71 and Loxm2/66 pairing).
  • Such recombination may produce a humanized immunoglobulin locus, wherein the humanized immunoglobulin locus may include a variable region of a human immunoglobulin gene from an individual belonging to a first race and a constant region of a non-human-animal immunoglobulin gene. have.
  • the second transgenic animal cell may be prepared by the same method as the above-described method for preparing the first transgenic animal cell. However, it may be prepared by using individual-derived human cells belonging to the second race instead of the individual-derived human cells belonging to the first race.
  • the first race and the second race may be different races.
  • the first race and the second race are Caucasian (or Caucasoid race), Mongolian (or Mongolian, Mongoloid race), black (or Negro, Negroid),
  • the race may be each selected from the group consisting of a Malay race, a Polynesian race, and an Australian race.
  • the first race may be a Caucasian race
  • the second race may be a black race
  • the individual-derived human cells belonging to the first race may be BJ cells (ATCC® CRL-2522TM, ethnicity is white), which are individual-derived human fibroblasts belonging to the Caucasian race
  • the individual-derived human cell belonging to the subject may be a WS1 cell (ATCC® CRL-1502TM, ethnicity is black), which is a human fibroblast derived from an individual belonging to a black race.
  • the heterozygous transgenic animal may be prepared through somatic cell nuclear transfer (SCNT) using two or more transgenic animal cells having different alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • the transgenic animal cells are two or more transgenic animal cells having humanized immunoglobulin genes derived from different individuals, a first transgenic animal cell having humanized immunoglobulin genes derived from a first subject and a second transgenic animal cell derived from a second subject. a second transgenic animal cell having a humanized immunoglobulin gene.
  • the humanized immunoglobulin gene of the first transgenic animal cell and the humanized immunoglobulin gene of the second transgenic animal cell may have one or more of the following differences:
  • CNV copy number variation
  • donor nuclei are obtained from the first transgenic animal cells and the second transgenic animal cells, respectively, and the donor nuclei are respectively transplanted into denucleated oocytes to produce cloned eggs, and the cloned eggs are
  • the SCNT may be one using a known method.
  • the produced offspring can be crossed with each other to obtain a heterozygous transgenic animal.
  • the heterozygous transgenic animal may be prepared using two or more transgenic animal cells having different alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • the transgenic animal cells may be transgenic embryos.
  • the transgenic embryo embryo (embryo) is two or more transgenic embryos having humanized immunoglobulin genes derived from different individuals, a first transgenic embryo having humanized immunoglobulin genes derived from a first individual and a first transgenic embryo having humanized immunoglobulin genes derived from a second individual and a second transformed embryo having a humanized immunoglobulin gene.
  • the humanized immunoglobulin gene of the first transgenic embryo and the humanized immunoglobulin gene of the second transgenic embryo may have one or more of the following differences:
  • CNV copy number variation
  • the heterozygous transgenic animal is obtained by implanting the first transgenic embryo and the second transgenic embryo into the uterus of a surrogate mother, generating live offspring from each embryo, and crossing the produced offspring with each other, a known method may have been used.
  • the heterozygous transgenic animal may be prepared by blastocyst injection using two or more transgenic animal cells having different alleles for the humanized immunoglobulin gene.
  • the transgenic animal cells may be transgenic embryonic stem cells (ES cells).
  • the transformed embryonic stem cells are two or more transformed embryonic stem cells having humanized immunoglobulin genes derived from different individuals, a first transformed embryonic stem cell having a humanized immunoglobulin gene derived from a first individual and a second It may include a second transformed embryonic stem cell having an individual-derived humanized immunoglobulin gene.
  • the humanized immunoglobulin gene of the first transformed embryonic stem cell and the humanized immunoglobulin gene of the second transformed embryonic stem cell may have one or more of the following differences:
  • CNV copy number variation
  • the heterozygous transgenic animal is prepared by transplanting the first transformed embryonic stem cell and the second transformed embryonic stem cell into a blastocyst, respectively, to produce a chimeric blastocyst, and the chimeric blastocyst is a surrogate mother. It is obtained by implanting in the uterus of , generating individual offspring, and crossing the produced offspring with each other, and may be obtained by using a known method.
  • Another aspect disclosed by the present specification relates to a method for producing an antibody using a heterozygous transgenic animal having a hetero-allele for an immunoglobulin gene.
  • the method may include injecting an antigen into the heterozygous transgenic animal.
  • the immunoglobulin gene may be a humanized immunoglobulin gene
  • the heterozygous transgenic animal may be a heterozygous transgenic animal having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal may have a genome comprising a humanized immunoglobulin locus having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the humanized immunoglobulin gene may be a humanized immunoglobulin heavy chain gene, a humanized immunoglobulin kappa gene, and/or a humanized immunoglobulin lambda gene.
  • allelic genes may have differences in one or more of the following:
  • CNV copy number variation
  • the heterozygous transgenic animal can produce an antibody specific for the antigen.
  • the antigen-specific antibody may be produced by recombination (rearrangement) of any one of the heterologous alleles.
  • Another aspect disclosed by the present specification relates to a method of increasing antibody diversity using a heterozygous transgenic animal having a hetero-allele for an immunoglobulin gene.
  • the method may include injecting an antigen into the heterozygous transgenic animal.
  • the immunoglobulin gene may be a humanized immunoglobulin gene
  • the heterozygous transgenic animal may be a heterozygous transgenic animal having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the heterozygous transgenic animal may have a genome comprising a humanized immunoglobulin locus having a heterozygous allele for the humanized immunoglobulin gene.
  • the humanized immunoglobulin gene may be a humanized immunoglobulin heavy chain gene, a humanized immunoglobulin kappa gene, and/or a humanized immunoglobulin lambda gene.
  • allelic genes may have differences in one or more of the following:
  • CNV copy number variation
  • the method can obtain an antibody population or a B cell population specific for the antigen from the heterozygous transgenic animal through the antigen injection.
  • the antigen-specific antibody population or B cell population may be an antibody population or B cell population produced by recombination (rearrangement) of any one of the heterologous alleles.
  • Example 1 Method for producing heterozygous transgenic mice using chromosome exchange
  • This embodiment relates to a method for producing a heterozygous transgenic mouse having a genome comprising a humanized immunoglobulin locus, wherein the mouse immunoglobulin gene is humanized, and different heterozygous alleles for the humanized immunoglobulin gene
  • Eggplant relates to a transgenic mouse.
  • the following description is an overall example of the production of a humanized heterozygous transgenic mouse in which the variable region of the immunoglobulin heavy chain locus of a mouse is substituted (or replaced) with the variable region of a human immunoglobulin gene derived from an individual belonging to a different race. , but is not limited thereto.
  • Preparation of the desired heterozygous transgenic mouse can be produced by carrying out various modifications based on the Examples described below, and can also be produced by carrying out various methods in addition to the Examples described below.
  • Example 1-1 Method for producing a homozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a black (negro) race
  • This example relates to the production of a humanized homozygous transgenic mouse in which the variable region of an immunoglobulin heavy chain locus of a mouse is substituted (or replaced) with a variable region of a human immunoglobulin gene derived from an individual belonging to a black (negro) race.
  • a homozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a black (negro) race was prepared using a chromosome exchange technology (e.g., AiCE technology (refer to PCT application patent PCT/KR2019/015351)) do.
  • a vector is designed to insert loxp into both ends of each variable region.
  • the inserted loxp is used for recombination between two chromosomes (a mouse chromosome in which a mouse immunoglobulin gene is located and a human chromosome in which a human immunoglobulin gene is located).
  • Two vectors are designed to insert loxp at both ends of the variable region of the mouse immunoglobulin gene.
  • the first vector is a first homology arm, piggyBac terminal repeat (PB-TR), a promoter, loxm2/66 (first RRS), bla used to be inserted into the 5' end of the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus.
  • PB-TR piggyBac terminal repeat
  • first RRS first RRS
  • bla used to be inserted into the 5' end of the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus.
  • a blasticidin resistant gene, a promoter, FRT and a second homology arm used to insert at the 5' end of the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus.
  • the second vector is a third homology arm used for insertion at the 3' end of the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus, an inverted zeocin resistant gene, FRT, lox71 (second RRS), promoter, neomycin resistance gene (NeoR), piggyBac terminal repeat (PB-TR), and a fourth homology arm used for insertion at the 3' end of the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus.
  • two vectors (the third vector and the fourth vector) for inserting loxp into both ends of the variable region of the human immunoglobulin gene are designed.
  • the third vector comprises a fifth homology arm, a promoter, a blasticidin resistant gene, lox66 (third RRS) used to be inserted into the 5' end of the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus, a promoter, FRT, piggyBac terminal repeat (PB-TR) and a sixth homology arm used for insertion at the 5' end of the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus.
  • lox66 third RRS
  • PB-TR piggyBac terminal repeat
  • the fourth vector is a seventh homology arm, piggyBac terminal repeat (PB-TR), which is used to be inserted at the 3' end of the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus, an inverted zeocin resistant gene (zeocin resistant). gene), FRT, inverted puro ⁇ TK gene, loxm2/71 (4th RRS), promoter, neomycin resistance gene (NeoR) and inserted into the 3' end of the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus an eighth homology arm used to become
  • PB-TR piggyBac terminal repeat
  • the vector design can be designed in various ways according to the insertion position and the type of loxp, and the design can be changed to include various elements for the selection process.
  • loxp-inserted mouse cells and human cells derived from an individual belonging to a black race are prepared.
  • the introduction of the vector can be performed sequentially or randomly, when there are several vectors, and can be introduced simultaneously.
  • the selection process of cells into which the vector has been introduced can be variously modified depending on the elements inserted into the vector.
  • the mouse embryonic stem cell (mESC) used was a basal culture medium 2i, which was in N2B27 medium without FBS, MEK inhibitor PD0325901 (1 ⁇ M) and GSK3 inhibitor CHIR99021 (3 ⁇ M) (both from Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and 1,000 U/ml LIF (Milliphore, Billerica, MA, USA) are added as a basal culture medium (2i medium), and the mESCs are 5% CO 2 , 95% wet at 37 ° C. Cultivate for propagation and maintenance in an incubator. Transient transfection was performed using a lipofectamine 3000 or Nepa21 (NEPAGENE Co., Ltd., Chiba, Japan) electroporator.
  • transient transfection For transient transfection, prepare 1 ⁇ 10 6 cells in FBS and antibiotic-free medium. After adding 10 ⁇ g of the first vector, mix with lipofectamin 3000 reagent, let stand at room temperature for 5 minutes, and then transfect. Alternatively, 10 ⁇ g of the first vector is added and transfection is performed at 125V, 5ms, 2 pulses. Transfected mESCs are cultured for 24 to 48 hours in an incubator maintained in a 95% wet state at 5% CO 2 , 37°C.
  • the transfected mESCs are treated with blasticidin to confirm the insertion of the first vector by whether the cells are viable. After blasticidin treatment, viable mESCs are obtained, and a second vector is transfected into the obtained mESCs in the same manner as the first vector.
  • the transfected mESCs are cultured for 24 to 48 hours in an incubator maintained in a 95% wet state at 5% CO 2 , 37°C.
  • the transfected mESCs were treated with G418 (Life technologies, NY, USA), and the insertion of the second vector was determined by the survival of the mESCs. check Obtain viable mESCs after G418 treatment.
  • mESC obtained after G418 treatment is treated with a recombinase flippase (FLP).
  • FLP recombinase flippase
  • the FRT-FLP recombination-induced cells are treated with zeocin, and the insertion of the first vector and the second vector in the same chromosome is checked based on whether the mESC survives.
  • surviving mESCs are obtained.
  • the obtained mESCs were mESCs comprising chromosomes in which loxm2/66 (first RRS) and lox71 (second RRS) were respectively inserted at both ends of the variable region of a mouse immunoglobulin heavy chain locus. This selection process is to exclude the case where only one of the first vector and the second vector is inserted into the two alleles, since somatic cells generally have two alleles.
  • the human fibrobast used, WS1 cell contains 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA) containing Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM; ATCC® 30-2003TM) medium and 5% CO 2 , Incubated for growth and maintenance in an incubator maintained in a 95% wet state at 37°C. Transient transfection was performed using a lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) or Nepa21 (NEPAGENE Co., Ltd., Chiba, Japan) electroporator.
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin-streptomycin Corning, Mannasas, VA, USA
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • CO 2 Eagle's Minimum Essential Medium
  • transient transfection For transient transfection, prepare 1 ⁇ 10 6 cells in FBS and antibiotic-free medium. After adding 10 ⁇ g of the third vector, mix with lipofectamin 3000 reagent, let stand at room temperature for 5 minutes, and then transfect. Alternatively, 10 ⁇ g of the third vector is added and transfected at 150V, 7.5ms, 2 pulses. Transfected WS1 cells are cultured for 24 hours to 48 hours in an incubator maintained in a 95% wet state at 5% CO 2 , 37°C.
  • the transfected WS1 cells are treated with blasticidin to confirm the insertion of the third vector by whether the WS1 cells are alive or not. .
  • blasticidin treatment After blasticidin treatment, a viable WS1 cell was obtained, and the obtained WS1 cell was transfected with the fourth vector in the same manner as the third vector.
  • the transfected cells are cultured for 24 hours to 48 hours in an incubator maintained in a 95% wet state at 5% CO 2 , 37°C.
  • the transfected WS1 cells were treated with G418 (Life technologies, NY, USA) to determine the survival of the WS1 cells. Confirm the insertion of After G418 treatment, a viable WS1 cell is obtained.
  • the WS1 cell obtained after G418 treatment is treated with a recombinase flippase (FLP).
  • FLP recombinase flippase
  • recombination is induced by FRT present in the two vectors and FLP treated, so that the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus is inverted.
  • zeocin is treated to FRT-FLP recombination-induced WS1 cells, and the insertion of the third vector and the fourth vector in the same chromosome is checked by whether the WS1 cell survives.
  • the obtained WS1 cell is a WS1 cell comprising chromosomes in which lox66 (third RRS) and loxm2/71 (fourth RRS) are respectively inserted at both ends of the variable region of a human immunoglobulin heavy chain locus. This selection process is intended to exclude the case where only one of the third vector and the fourth vector is inserted into the two alleles, since somatic cells generally have two alleles.
  • micronuclei proceeds using colcemid (Life technologies, Grand island, NY, USA).
  • the selected WS1 cells (cells containing chromosomes in which lox66 (3rd RRS) and loxm2/71 (4th RRS) are respectively inserted into both ends of the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus) were 1 ⁇ 10 6 cells After culturing and preparing as much as possible, the next day, after exchanging the medium with EMEM containing 20% FBS, treatment with colcemid 0.1 ⁇ g/ml, 5% CO 2 , Incubate for 48 hours in an incubator maintained in 95% wet condition at 37°C. .
  • Micronucleation-induced WS1 cells were detached using tryLE (Life technologies, Grand island, NY, USA), washed with serum-free EMEM, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes (LABOGENE CO., Ltd, KOREA) . After centrifugation, the cells were suspended in pre-warmed serum-free EMEM: percoll ((Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) (1:1 (v:v)), and cytochalsin B (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) so that the final concentration is 10 ⁇ g/ml.
  • loxm2/66 (1st RRS) and lox71 (2nd RRS) contain chromosomes inserted at both ends of the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus, respectively) cells
  • loxm2/66 (1st RRS) and lox71 (2nd RRS) contain chromosomes inserted at both ends of the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus, respectively) cells
  • the mESCs are treated with TryLE and centrifuged. Wash the centrifuged mESCs with 1XDPBS and count the number of cells using a hemacytometer.
  • the fusion of human microcells and mESCs is performed by the suspension method using HVJ-E protein (Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan). Use so that the ratio of human microcells to mESC is 1:4.
  • Each prepared human microcells and mESCs are washed with 500 ⁇ l of cold 1X cell fusion buffer. Centrifuge the human microcells and mESCs in the buffer at 300g at 4°C for 5 minutes. 25 ⁇ l of 1X cell fusion buffer per mESC 2 ⁇ 10 5 cells is added, and the same volume of 1X cell fusion buffer is added to human microcells. Mix mESC and human microcells, add 5 to 10 ⁇ l of HVJ-E protein, and leave on ice for 5 minutes. Leave the mixture in a 37°C water bath for 15 minutes. At this time, tap every 5 minutes.
  • centrifugation is performed at 300 g for 5 minutes to remove the remaining HVJ-E protein.
  • the confluent cells are cultured for 48 hours in a culture medium of mESC and 5% CO 2 , in an incubator maintained in a 95% wet state at 37°C.
  • the prepared fusion cell is a human chromosome (a chromosome containing the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus into which lox66 (3rd RRS) and loxm2/71 (4th RRS) are inserted) and a mouse chromosome (loxm2/66 (1st RRS) ) and a chromosome containing the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus into which lox71 (2nd RRS) was inserted).
  • the prepared fusion cell is treated with a recombinant enzyme to induce exchange (or replacement) of the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus with the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus.
  • the humanized immunoglobulin heavy chain locus is a locus comprising a variable region derived from a human immunoglobulin heavy chain gene and a constant region of a mouse immunoglobulin heavy chain gene.
  • Opti-MEM medium without FBS and antibiotics to 1 ⁇ 10 6 cell fusion cells (mESCs).
  • 10 ⁇ g of pCMV-Cre (System Biosciences, LLC, Palo Alto, CA, USA) vector is added and transfected at 125V, 5ms, 2 pulses.
  • Add 300 ⁇ l of 2i medium mix well with confluent cells, transfer to a 100 mm dish, and incubate for 48 hours in an incubator maintained in 95% wet condition at 5% CO 2 and 37°C.
  • the Cre recombinase-treated fusion cells were treated with antibiotics (Puromycin, G418 and neomycin).
  • the fusion cells treated with Cre recombinase are human chromosomes (chromosomes containing the variable region of the human immunoglobulin heavy chain locus into which lox66 (3rd RRS) and loxm2/71 (4th RRS) are inserted) by Cre recombinase and mouse Recombination is induced between chromosomes (chromosomes containing the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus into which loxm2/66 (first RRS) and lox71 (second RRS) are inserted).
  • the pairing of the RRS is recognized by Cre recombinase and recombination is induced.
  • the first recombinant chromosome (a mouse chromosome having a humanized immunoglobulin locus) in which the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus of the mouse chromosome is replaced with the variable region of the human immunoglobulin heavy chain gene and the human immunoglobulin heavy chain locus of the human chromosome
  • a second recombinant chromosome is generated in which the variable region is replaced with the variable region of a mouse immunoglobulin heavy chain gene.
  • a mouse gene eg, the constant region of the mouse immunoglobulin heavy chain locus is a mouse gene.
  • the second recombinant chromosome has human genes except for the variable region of the mouse immunoglobulin heavy chain gene (eg, the constant region of the human immunoglobulin heavy chain locus is a human gene).
  • mESCs Surviving cells
  • antibiotics Puromycin, G418 and neomycin.
  • the obtained cells are mESCs comprising a first recombinant chromosome and a second recombinant chromosome.
  • the obtained first and second recombinant chromosomes were treated with piggyBac transposase in mESCs containing the RRS, puro ⁇ TK gene, and neomycin resistance gene (NeoR) contained in the first and second recombinant chromosomes. ), a zeocin resistant gene and FRT.
  • cells containing recombinant chromosomes from which RRS, puro ⁇ TK gene, neomycin resistance gene (NeoR), zeocin resistant gene and FRT have been removed are selected by treatment with Fialuridine (FIAU).
  • FIAU Fialuridine
  • the recombinant chromosome may be variously recombined according to the position, direction, and pairing of the RRS.
  • the above description can be produced by changing the design of the vector.
  • Homozygous transgenic mice are prepared using mESCs having humanized immunoglobulin loci derived from a black race.
  • the mESC having the humanized immunoglobulin locus obtained above is transplanted into the blastocyst through blastocyst injection to prepare a chimeric blastocyst.
  • the prepared chimeric blastocyst is implanted in the uterus of a surrogate mother to give birth to a mouse baby.
  • the produced mouse litter is a chimeric transgenic mouse, and a homozygous transgenic mouse is prepared by crossing the chimeric transgenic mouse.
  • the variable region of the immunoglobulin heavy chain locus is humanized on the genome (variable region substitution (or replacement) of a humanized immunoglobulin gene derived from a black race).
  • the homozygous transgenic mouse can be produced by various methods other than blastocyst injection.
  • Example 1-2 Method for producing a homozygous transgenic mouse having humanized immunoglobulin genes derived from a Mongolian (Mongoloid race) race
  • This Example relates to the production of a humanized homozygous transgenic mouse in which the variable region of the immunoglobulin heavy chain locus of the mouse is substituted (or replaced) with the variable region of a human immunoglobulin gene derived from an individual belonging to the Mongolian race.
  • a homozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a Mongolian race is prepared using a chromosome exchange technology (eg, AiCE technology (see PCT application patent PCT/KR2019/015351)).
  • OUMS-36 cells are Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Corning, Mannasas, VA, USA) medium and 5% CO 2 , and cultured for growth and maintenance in an incubator maintained in a 95% wet state at 37°C.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Examples 1-3 Method for producing a heterozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a black (negro) race and a humanized immunoglobulin gene derived from a Mongolian (Mongoloid race) race
  • This example relates to the production of a heterozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a black (negro) race and a humanized immunoglobulin gene derived from a Mongolian (Mongoloid race) race.
  • mice Heterozygosity through crossbreeding of a previously prepared black (negro) race-derived humanized immunoglobulin gene with a homozygous transgenic mouse having a Mongolian (Mongoloid race) race-derived humanized immunoglobulin gene.
  • Transgenic mice are prepared.
  • the produced heterozygous transgenic mice have different heterozygous alleles at the humanized immunoglobulin locus, i.e., a humanized immunoglobulin gene derived from a black (negro) race and a humanized immunoglobulin gene derived from a Mongolian (Mongoloid race) race. transgenic mice.
  • Examples 1-4 Method for producing a homozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from Caucasian (Caucasus) race
  • This example relates to the production of a humanized homozygous transgenic mouse in which the variable region of the immunoglobulin heavy chain locus of the mouse is substituted (or replaced) with the variable region of a human immunoglobulin gene derived from an individual belonging to the Caucasian race.
  • a homozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a Caucasian race is prepared using a chromosome exchange technology (eg, AiCE technology (refer to PCT application patent PCT/KR2019/015351)).
  • BJ cells are Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA) (ATCC® 30-2003).
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin-streptomycin Corning, Mannasas, VA, USA
  • TM 5% CO 2
  • Examples 1-5 Method for producing a heterozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a black (negro) race and a humanized immunoglobulin gene derived from a Caucasian (Caucasus) race
  • This example relates to the production of a heterozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a black (negro) race and a humanized immunoglobulin gene derived from a Caucasian (Caucasus) race.
  • Heterozygous traits through crossing of a homozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a black (negro) race and a homozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a Caucasian (Caucasus) race Transition mice are prepared.
  • the produced heterozygous transgenic mice have different heterozygous alleles at the humanized immunoglobulin locus, i.e., a humanized immunoglobulin gene from a black (negro) race and a humanized immunoglobulin gene from a Caucasian (Caucasus) race. It's a switch mouse.
  • Example 1-6 Method for producing a heterozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a Mongolian (Mongoloid race) race and a humanized immunoglobulin gene derived from a Caucasian (Caucasus) race
  • This example relates to the production of a heterozygous transgenic mouse having a humanized immunoglobulin gene derived from a Mongolian (Mongoloid race) race and a humanized immunoglobulin gene derived from a Caucasian (Caucasus) race.
  • Eggplant is a transgenic mouse.
  • heterozygous transgenic mice having humanized immunoglobulin genes derived from different races can be produced.
  • Example 1-1 Using the 'method for producing a transgenic mouse homozygous having humanized immunoglobulin genes derived from a black (negro) race', it is possible to manufacture transgenic mice homozygous having humanized immunoglobulin genes derived from various races. This may vary depending on the human cells used in the experiment.
  • the human cells used in the experiment were Caucasian (or Caucasian, Caucasoid race), Mongol (or Mongolian, Mongoloid race), Black (or Negro, Negroid), and Malay.
  • a heterozygous transgenic mouse is prepared by crossing the homozygous transgenic mice having humanized immunoglobulin genes derived from different races prepared above.
  • the mice thus prepared were a heterozygous transgenic mouse derived from a Caucasian x Mongolian race (a heterozygous transgenic mouse having a Caucasian-derived humanized immunoglobulin gene and a Mongolian-derived humanized immunoglobulin gene), a Caucasian x Nigro Race-derived heterozygous transgenic mouse, Caucasian x Malay-derived heterozygous transgenic mouse, Caucasian x Polynesian-derived heterozygous transgenic mouse, Mongolian x Nigro-derived heterozygous transgenic mouse, Mongolian Heterozygous transgenic mouse derived from a race x Malay race, a heterozygous transgenic mouse derived from a Mongolian race x Polynesian race, a heterozygous transgenic mouse derived from a Negro race x Malay race, a heterozy

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Abstract

본 발명은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위한 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물 및 이의 제조 방법에 관한 것이며, 이때, 상기 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-allele)인 것을 특징으로 한다.

Description

이형접합성 형질전환 동물
본 발명은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위한 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물 및 이의 제조 방법에 관한 것이며, 이때, 상기 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-allele)인 것을 특징으로 한다.
우리 몸이 외부 병원균에 노출되었을 때 일어나는 반응 기작 중 하나는 해당 병원균에 특이적인 항체(antibody)의 생산이다. 항체는 B 세포가 만들어내는 단백질로써 일생 동안 노출되는 수많은 병원균으로부터 몸을 방어하기 위해 다양한 항체를 확보하는 것은 필수적이다. 다양성을 확보하는 기작으로써, VDJ 재조합 (recombination), somatic hypermutation (SHM), class switching이 있다. 상기 기작을 통해 V, D, J 세그먼트들이 하나씩 DNA 수준에서 재조합 되면 activation-induced cytidine (AID) deaminase에 의해 somatic mutation이 발생한다. 이렇게 결정된 항체의 가변 영역(variable region)은 다시 면역글로불린(immunoglobulin) M, D, A, G 또는 E 클래스의 불변 영역과 재조합 된다. 이와 같은 다양한 항체의 총체인 항체 레퍼토리는 이론적으로 109 이상의 다양성을 가진다. 우리의 몸이 병원균에 노출이 되면 항체 레퍼토리 중 해당 병원균, 즉, 항원에 높은 특이성을 가지는 극히 일부분의 B 세포가 증폭되어 항체를 생산하여 병원균으로부터 몸을 방어한다. 따라서, 항체 레퍼토리의 다양성 증가는 항원 특이적 B 세포(또는 항체)의 후보군을 확장함과 동시에 높은 특이성을 가지는 B 세포(또는 항체) 생산 및 선별을 가능하게 하므로, 항체생산 형질전환 동물의 개발에서 항체 레퍼토리 다양성을 증가시키기 위한 노력이 필요하다.
본 발명의 일 목적은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 제공한다.
인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 서로 다를 수 있으며, 이로 인해, 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 유전자좌에서 이형접합성(heterozygous)일 수 있다.
상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 유전자의 일부 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 일부 영역을 포함할 수 있다. 또는 상기 인간화 면역글로불린 유전자는 비인간-동물 면역글로불린 유전자 대신 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
이때, 상기 인간 면역글로불린 유전자의 일부 영역은 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역일 수 있다. 상기 가변 영역은 재배열 되지 않은 가변 영역일 수 있다. 이때, 재배열 되지 않은 가변 영역은 V, D 및 J 세그먼트, 또는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다.
이때, 상기 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 일부 영역은 비인간-동물 면역글로불린 유전자(내인성 면역글로불린 유전자)의 불변 영역일 수 있다. 상기 불변 영역은 C 세그먼트를 포함할 수 있다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자의 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-allele)일 수 있다.
이때, 상기 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 유전자일 수 있다.
이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 유전자는 제1 인간 면역글로불린 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 유전자는 제2 인간 면역글로불린 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변영역(hetero variable region)일 수 있다.
이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 이 경우, 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다른 개체일 수 있다.
이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 이 경우, 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물은 면역글로불린에대해 서로 다른 두 개의 인종 유래의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다.
일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(humanized immunoglobulin heavy chain gene loci; humanized IGH loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(humanized immunoglobulin heavy chain gene; humanized IGH)에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V, D 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변 영역(hetero-variable region)일 수 있다. 이때, 상기 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 인종은 코카서스 인종일 수 있으며, 상기 제2 인종은 니그로일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
다른 일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 카파 유전자좌(humanized immunoglobulin kappa gene loci; humanized IGK loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 카파 유전자(humanized immunoglobulin kappa gene; humanized IGK)에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 카파 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 카파 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변 영역(hetero-variable region)일 수 있다. 이때, 상기 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 인종은 코카서스 인종일 수 있으며, 상기 제2 인종은 몽골인일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 카파 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
또 다른 일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 람다 유전자좌(humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 람다 유전자(humanized immunoglobulin lambda gene; humanized IGL)에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 람다 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 람다 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제1 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제2 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변 영역(hetero-variable region)일 수 있다. 이때, 상기 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 인종은 니그로일 수 있으며, 상기 제2 인종은 몽골인일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 람다 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(humanized immunoglobulin heavy chain gene loci; humanized IGH loci) 및 인간화 면역글로불린 카파 유전자좌(humanized immunoglobulin kappa gene loci; humanized IGK loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(humanized immunoglobulin heavy chain gene; humanized IGH) 및 인간화 면역글로불린 카파 유전자(humanized immunoglobulin kappa gene; humanized IGK)에 대해 각각 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V, D 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 중쇄 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 중쇄 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 및 마우스 면역글로불린 카파 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-alleles)는 제3 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 제4 인간화 면역글로불린 카파 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제3 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제3 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제4 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제4 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 재배열되지 않은 가변 영역과 제4 재배열되지 않은 가변 영역은 카파 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 카파 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인간 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인간 개체와 제4 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제3 인종은 제1 인종과 동일할 수 있다. 또는 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지고, 면역글로불린 카파 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
다른 일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(humanized immunoglobulin heavy chain gene loci; humanized IGH loci) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자좌(humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(humanized immunoglobulin heavy chain gene; humanized IGH) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자(humanized immunoglobulin lambda gene; humanized IGL)에 대해 각각 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V, D 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 중쇄 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 중쇄 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 람다 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-alleles)는 제3 인간화 면역글로불린 람다 유전자 및 제4 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제3 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제3 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제4 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제4 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 재배열되지 않은 가변 영역과 제4 재배열되지 않은 가변 영역은 람다 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 람다 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인간 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인간 개체와 제4 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제3 인종은 제1 인종과 동일할 수 있다. 또는 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지고, 면역글로불린 람다 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
또 다른 일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 카파 유전자좌(humanized immunoglobulin kappa gene loci; humanized IGK loci) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자좌(humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물는 인간화 면역글로불린 카파 유전자(humanized immunoglobulin kappa gene; humanized IGK) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자(humanized immunoglobulin lambda gene; humanized IGL)에 대해 각각 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 카파 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 카파 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 카파 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 카파 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 람다 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-alleles)는 제3 인간화 면역글로불린 람다 유전자 및 제4 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제3 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제3 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제4 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제4 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 재배열되지 않은 가변 영역과 제4 재배열되지 않은 가변 영역은 람다 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 람다 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인간 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인간 개체와 제4 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제3 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제4 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제3 인종은 제1 인종과 동일할 수 있다. 또는 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 면역글로불린 카파 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지고, 면역글로불린 람다 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로, 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(humanized immunoglobulin heavy chain gene loci; humanized IGH loci), 인간화 면역글로불린 카파 유전자좌(humanized immunoglobulin kappa gene loci; humanized IGK loci) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자좌(humanized immunoglobulin lambda gene loci; humanized IGL loci)를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 형질전환 비인간-동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(humanized immunoglobulin heavy chain gene; humanized IGH), 인간화 면역글로불린 카파 유전자(humanized immunoglobulin kappa gene; humanized IGK) 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자(humanized immunoglobulin lambda gene; humanized IGL)에 대해 각각 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V, D 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제1 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제2 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 중쇄 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 중쇄 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 카파 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제3 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 제4 인간화 면역글로불린 카파 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제3 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제3 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제4 인간화 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자의 제4 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 재배열되지 않은 가변 영역과 제4 재배열되지 않은 가변 영역은 카파 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 카파 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인간 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인간 개체와 제4 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제3 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제4 인간 면역글로불린 카파 유전자는 제4 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다를 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 람다 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 면역글로불린 람다 유전자의 가변 영역은 재배열 되지 않는 V 및 J 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-alleles)일 수 있다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 이형 대립 유전자는 제5 인간화 면역글로불린 람다 유전자 및 제6 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 제5 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제5 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제5 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 제6 인간화 면역글로불린 람다 유전자는 제6 인간 면역글로불린 람다 유전자의 제6 재배열되지 않은 가변 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제5 재배열되지 않은 가변 영역과 제6 재배열되지 않은 가변 영역은 람다 이형 가변 영역(hetero-variable regions)일 수 있다. 이때, 상기 람다 이형 가변 영역 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 이때, 상기 제5 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제5 인간 개체 유래이며, 상기 제6 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제6 인간 개체 유래일 수 있다. 상기 제5 인간 개체와 제6 인간 개체는 서로 다를 수 있다. 또는, 상기 제5 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제5 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제6 인간 면역글로불린 람다 유전자는 제6 인종에 속한 개체 유래일 수 있다. 상기 제5 인종과 제6 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종 중 둘 이상은 동일한 인종일 수 있다. 또는 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종은 서로 다를 수 있다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 비인간-동물은 i) 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles); ii) 면역글로불린 카파 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles); 및 iii) 면역글로불린 람다 유전자에 대해 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 제작하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 가지는 형질전환 비인간-동물일 수 있다. 이때, 상기 두 개의 대립 유전자는 이형 대립 유전자(hetero-allele)일 수 있다. 상기 형질전환 동물은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 원숭이, 소, 돼지, 낙타 및 닭 등 인간을 제외한 동물일 수 있다.
상기 방법은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용하여 형질전환 동물을 제작할 수 있다.
상기 형질전환 동물 세포는 인간을 제외한 포유동물 세포 또는 조류 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포는 벡터를 이용한 클로닝(cloning) 방법 및 염색체 교환(chromosome exchange)을 이용한 방법 등의 공지의 방법을 이용해 제작될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용해 형질전환 동물을 제작할 수 있다. 이때, 상기 방법은 체세포 핵 이식(Somatic cell nuclear transfer; SCNT) 방법을 이용할 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 방법은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 배아를 이용해 형질전환 동물을 제작할 수 있다. 이때, 상기 방법은 상기 둘 이상의 동물 배아를 각각 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 생산하고, 생산된 형질전환 동물을 교배하여 제작할 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 방법은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 배아 줄기세포를 이용해 형질전환 동물을 제작할 수 있다. 이때, 상기 방법은 상기 배아 줄기세포를 포배에 이식하여 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 제작하고, 상기 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 생산할 수 있다.
본 발명은 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 동물을 이용한 항체 생산 방법을 제공한다. 이때, 상기 방법은 상기 형질전환 동물에 항원을 주입하는 것을 포함할 수 있다. 상기 항원 주입을 통해, 상기 형질전환 동물은 상기 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체는 인간화 면역글로불린 유전자좌에서 인간화 면역글로불린 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산될 수 있다. 상기 형질전환 동물은 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로서, 상기 항체 생산 방법은 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물에 항원을 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물일 수 있다. 상기 면역글로불린은 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물일 수 있다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및/또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 상기 항원 주입을 통해, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체는 상기 이형 대립 유전자 중 임의의 하나의 대립 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산될 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 항체 생산 방법은 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물에 항원을 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물일 수 있다. 상기 면역글로불린은 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물일 수 있다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및/또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다. 이때, 상기 이형 대립 유전자 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication). 상기 항원 주입을 통해, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체는 상기 이형 대립 유전자 중 임의의 하나의 대립 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산될 수 있다.
본 발명은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물이다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간항체 생산에 이용될 수 있다. 특히, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 항체 레퍼토리(antibody repertoire)의 다양성 확보를 위해 이용될 수 있다.
도 1은 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제2 대립 유전자)를 이형 대립 유전자로 가지는 이형접합성 형질전환 동물의 게놈 중 인간화 면역글로불린 유전자를 포함하는 상동 염색체를 도식화한 그림이다. 이때, 제1 대립 유전자(first allele) 및 제2 대립 유전자(second allele)는 이형 대립 유전자(heteroalleles)로, 두 대립 유전자는 서로 다른 인종 유래이고, 두 대립 유전자 사이에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다: i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation); ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation); iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV); iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및 v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
용어 정의
본 명세서에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
상동 염색체(homologous chromosomes)
“상동 염색체”는 세포의 핵 내에 존재하는 모양과 크기가 같은 한 쌍의 염색체를 의미한다. 두 염색체의 같은 위치에는 같은 형질에 관한 유전자가 존재하며, 이 관계를 대립 유전자(allele)라 한다.
대립 유전자(allele)
“대립 유전자 또는 대립인자”는 상동 염색체에서 같은 위치에 있으며, 즉, 유전자 자리(gene locus)가 같은 유전체 내에서 특정 형질을 표현하기 위한 최소의 단위이다. 대립 유전자는 인간과 같이 2n의 유전체를 보유한 이배체 생물의 상염색체(autosome)에는 각 유전자마다 한 쌍씩 존재하며 각 대립 유전자는 모계와 부계에서 하나씩 유래한다. 한 쌍의 두 대립 유전자가 서로 동일한 경우를 동형 대립 유전자(homoallele; homo-allele)라고 하며, 서로 다른 경우를 이형 대립 유전자(heteroallele; hetero-allele)라 한다.
본 명세서에서, 면역글로불린의 대립 유전자는 생식계에 존재하는 대립 유전자로, 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)에 포함한다. 재배열된 가변영역, 즉, V, D, J 또는 V, J가 재조합된 가변영역을 포함하는 경우, 재조합 대립 유전자로 지칭한다.
유전자 자리(gene locus(loci))
“유전자 자리 또는 유전자좌”는 특정 유전자가 위치하는 염색체 내 고정된 특정 위치를 의미한다. 반수체 세포의 경우, 특정 유전자에 대해 하나의 유전자 자리를 가진다. 이배체 세포의 경우, 특정 유전자에 대해 두 개의 유전자 자리를 가진다. 이때, 두 개의 유전자 자리는 특정 유전자에 대한 동일한 대립 유전자, 즉, 동형접합성 대립 유전자를 각각 포함할 수 있다. 또는 두 개의 유전자 자리는 특정 유전자에 대한 서로 다른 대립 유전자, 즉, 이형접합성 대립 유전자를 각각 포함할 수 있다.
또한, “유전자 자리 또는 유전자좌”는 특정 유전자를 정상적으로 전사하는 일 영역을 의미한다. 즉, 엑손, 인트론, 프로모터, 인핸서, 유전자좌 제어 영역(locus control regions; LCR) 등 특정 유전자가 정상적으로 발현되기 위해 필요한 모든 요소를 포함하는 염색체 내 일 영역을 의미한다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 유전자좌(immunoglobulin heavy locus(loci); IGH)는 염색체 내 면역글로불린 중쇄에 대한 유전자가 위치하는 자리를 의미하며, 또한, 면역글로불린 중쇄 유전자가 정상적으로 발현되기 위해 필요한 모든 요소(프로모터, 인핸서, variable region gene, constant region gene 등)을 포함하는 일 영역을 의미한다.
면역글로불린 중쇄 유전자좌(immunoglobulin heavy locus; IGH locus(loci))
“면역글로불린 중쇄 유전자좌(immunoglobulin heavy locus; IGH locus(loci))”는 V(variable), D(diversity), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자가 위치하는 염색체 내 고정된 위치를 의미한다. 또한, “면역글로불린 중쇄 유전자좌(immunoglobulin heavy locus; IGH locus(loci))”는 V(variable), D(diversity), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자를 정상적으로 전사하는 일 영역을 의미한다. 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 B 세포가 발달하면서 상기 세그먼트들의 재조합이 발생하여 재조합된 V-D-J 영역을 포함하게 된다. B 세포가 발달함에 따라, 각 발달 과정 중에 있는 B 세포의 게놈 내 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 포함된 세그먼트는 재조합에 달라질 수 있다. 이에 반해, 생식계(germline) 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 재조합되지 않은 상태의 V, D, J 및 C 세그먼트를 전체를 포함하며, 이때, 재조합되지 않은 V, D 및 J 세그먼트는 “재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)”으로 불린다. 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 다수의 V 세그먼트, 다수의 D 세그먼트 및 다수의 J 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 인간의 경우, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 38 내지 46개의 V 세그먼트, 23개의 D 세그먼트 및 6개의 J 세그먼트를 포함한다. 마우스의 경우, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 109개의 V 세그먼트, 19개의 D 세그먼트 및 4개의 J 세그먼트를 포함한다. 이때, 각 세그먼트는 개체 별 서로 다른 대립 유전자(세그먼트)를 가질 수 있다. 일부 세그먼트의 대립 유전자에 대한 정보는 IMGT(ImMunoGeneTics information system database)에 정리되어 있다.
본 명세서에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 V 세그먼트는 IGHV로, D 세그먼트는 IGHD로, J 세그먼트는 IGHJ로 지칭하였다. 또한, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 불변 영역(constant region)의 C 세그먼트는 IGHC로 지칭한다.
면역글로불린 람다 유전자좌(immunoglobulin lambda locus; IGL locus(loci))
“면역글로불린 람다 유전자좌(immunoglobulin lambda locus; IGL locus(loci))”는 V(variable), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 람단 유전자가 위치하는 염색체 내 고정된 위치를 의미한다. 또한, “면역글로불린 람다 유전자좌(immunoglobulin lambda locus; IGL locus(loci))”는 V(variable), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 람단 유전자를 정상적으로 전사하는 일 영역을 의미한다. 상기 면역글로불린 람다 유전자좌는 B 세포가 발달하면서 재조합이 발생하여 재조합된 V-J 영역을 포함하게 된다. B 세포가 발달함에 따라, 각 발달 과정 중에 있는 B 세포의 게놈 내 면역글로불린 람다 유전자좌에 포함된 세그먼트는 재조합에 달라질 수 있다. 이에 반해, 생식계(germline) 면역글로불린 람다 유전자좌는 재조합되지 않은 상태의 V, J 및 C 세그먼트를 전체를 포함하며, 이때, 재조합되지 않은 V 및 J 세그먼트는 “재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)”으로 불린다. 면역글로불린 람다 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 다수의 V 세그먼트 및 다수의 J 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 인간의 경우, 면역글로불린 람다 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 33개의 V 세그먼트 및 5개의 J 세그먼트를 포함한다. 마우스의 경우, 면역글로불린 람다 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 3 내지 8개의 V 세그먼트 및 4개의 J 세그먼트를 포함한다. 이때, 각 세그먼트는 개체 별 서로 다른 대립 유전자(세그먼트)를 가질 수 있다. 일부 세그먼트의 대립 유전자에 대한 정보는 IMGT(ImMunoGeneTics information system database)에 정리되어 있다.
본 명세서에서, 면역글로불린 람다 유전자좌의 V 세그먼트는 IGLV로, J 세그먼트는 IGLJ로 지칭하였다. 또한, 면역글로불린 람다 유전자좌의 불변 영역(constant region)의 C 세그먼트는 IGLC로 지칭한다.
면역글로불린 카파 유전자좌(immunoglobulin kappa locus; IGK locus(loci))
“면역글로불린 카파 유전자좌(immunoglobulin kappa locus; IGK locus(loci))”는 V(variable), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 카파 유전자가 위치하는 염색체 내 고정된 위치를 의미한다. 또한, “면역글로불린 카파 유전자좌(immunoglobulin kappa locus; IGK locus(loci))”는 V(variable), J(joining) 및 C(constant) 세그먼트(segments)를 포함하는 면역글로불린 카파 유전자를 정상적으로 전사하는 일 영역을 의미한다. 상기 면역글로불린 카파 유전자좌는 B 세포가 발달하면서 재조합이 발생하여 재조합된 V-J 영역을 포함하게 된다. B 세포가 발달함에 따라, 각 발달 과정 중에 있는 B 세포의 게놈 내 면역글로불린 카파 유전자좌에 포함된 세그먼트는 재조합에 달라질 수 있다. 이에 반해, 생식계(germline) 면역글로불린 카파 유전자좌는 재조합되지 않은 상태의 V, J 및 C 세그먼트를 전체를 포함하며, 이때, 재조합되지 않은 V 및 J 세그먼트는 “재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)”으로 불린다. 면역글로불린 카파 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 다수의 V 세그먼트 및 다수의 J 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 인간의 경우, 면역글로불린 카파 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 34 내지 48개의 V 세그먼트 및 5개의 J 세그먼트를 포함한다. 마우스의 경우, 면역글로불린 카파 유전자좌의 재배열되지 않은 가변 영역은 91개의 V 세그먼트 및 4개의 J 세그먼트를 포함한다. 이때, 각 세그먼트는 개체 별 서로 다른 대립 유전자(세그먼트)를 가질 수 있다. 일부 세그먼트의 대립 유전자에 대한 정보는 IMGT(ImMunoGeneTics information system database)에 정리되어 있다.
본 명세서에서, 면역글로불린 카파 유전자좌의 V 세그먼트는 IGKV로, J 세그먼트는 IGKJ로 지칭하였다. 또한, 면역글로불린 카파 유전자좌의 불변 영역(constant region)의 C 세그먼트는 IGKC로 지칭한다.
인간화된 또는 인간화(humanized 또는 humanization)
“인간화된 또는 인간화(humanized 또는 humanization)”는 대상의 전체 또는 일부가 인간의 것 또는 인간 유래인 것을 의미하는 용어로, 상기 용어를 유전자와 함께 사용하는 경우, 즉, 인간화 유전자는 비인간-동물의 특정 유전자의 전체 또는 일부 핵산 서열이 인간 유전자의 핵산 서열로 교체되거나 인간 유전자와 동일한 핵산 서열을 갖는 상태를 말한다. 예를 들어, 마우스의 인간화 면역글로불린 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자, 즉, 내인성(endogenous) 면역글로불린 유전자의 가변 영역 대신 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역을 포함하고 있는 유전자일 수 있다. 또는, 마우스의 인간화 면역글로불린 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자의 불변 영역 대신 인간 면역글로불린 유전자의 불변 영역을 포함하고 있는 유전자일 수 있다. 또는, 마우스의 인간화 면역글로불린 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자 대신 인간 면역글로불린 유전자를 포함하고 있는 것일 수 있다. 또는, 마우스의 인간화 면역글로불린 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자의 가변 영역 중 일부(예를 들어, V 세그먼트) 대신 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역 중 일부(V 세그먼트)를 포함하고 있는 유전자일 수 있다.
또한, 상기 용어를 유전자좌와 함께 사용하는 경우, 즉, 인간화 유전자좌는 비인간-동물의 특정 유전자 자리 내에 인간 유전자의 전체 또는 일부 핵산 서열을 갖는 상태를 말한다. 예를 들어, 래트의 인간화 면역글로불린 유전자좌는 래트 면역글로불린 유전자좌, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자좌 내에 내인성 면역글로불린 유전자의 가변 영역 대신 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역을 포함하고 있는 유전자 자리일 수 있다. 또는, 래트의 인간화 면역글로불린 유전자좌는 래트 면역글로불린 유전자좌, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자좌 내에 내인성 면역글로불린 유전자의 불변 영역 대신 인간 면역글로불린 유전자의 불변 영역을 포함하고 있는 유전자 자리일 수 있다. 또는, 래트의 인간화 면역글로불린 유전자좌는 래트 면역글로불린 유전자좌, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자좌 내에 내인성 면역글로불린 유전자 대신 인간 면역글로불린 유전자를 포함하고 있는 유전자 자리일 수 있다. 또는, 래트의 인간화 면역글로불린 유전자좌는 래트 면역글로불린 유전자좌, 즉, 내인성 면역글로불린 유전자좌 내에 내인성 면역글로불린 유전자의 가변 영역 중 일부(예를 들어, J 세그먼트) 대신 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역 중 일부(J 세그먼트)를 포함하고 있는 유전자 자리일 수 있다.
인종(race)
“인종(race)”은 인간 가운데 신체적, 사회적, 문화적 특성을 들어, 차이가 있다고 인식되는 인구집단을 임의로 나누어 분류하는 개념으로, 그 분류 방법에 따라 다양하게 구분될 수 있다. 일반적으로, 피부 색 등의 형태적 기준으로 백인, 흑인, 황인으로 구분하는 방식이 가장 널리 이용된다. 본 명세서에서는 인종을 지리적 및 형태적 기준으로 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인((Polynesian, 또는 오스트레인리아 인종(Australoid race))으로 구분하였다.
코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race))은 유럽 전역, 북아프리카, 아라비아 반도, 아프가니스탄, 북부 인도, 남아메리카, 북아메리카 등에 분포하는 백인으로, 피부는 흰색이나, 일부는 갈색이며, 넓은 이마, 높은 코, 청갈색이나 검은 눈, 많은 체모 등의 특징을 가지나, 형태적 특징은 이에 제한되지 않는다.
몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race))은 아시아(동아시아, 남아시아, 서아시아, 소아시아, 중앙아시아), 몽골, 동시베리아, 인도차이나, 헝가리, 핀란드 등에 분포하는 황인으로, 피부는 주로 황색이나, 일부는 담갈색이며, 넓은 이마, 낮은 코, 흑색 직상모(直上毛), 적은 체모 등의 특징을 가지나, 형태적 특징은 이에 제한되지 않는다.
흑인(또는 니그로(Negro, Negroid))은 아프리카, 북아메리카 등에 분포하는 흑인으로, 피부는 구리빛이나 흑갈색이며, 입술이 두껍고, 낮은 코, 검은 눈, 적은 체모, 고수 머리 등의 특징을 가지나, 형태적 특징은 이에 제한되지 않는다. 흑인은 Congoid race(오스트렐리안 등 남태평양상 흑인) 및 Capoid race(아프리카 남부지역 토종 흑인)으로 구분될 수 있다.
말레이 인종(Malay)은 인도네시아, 필리핀, 뉴기니, 멜라네시아 등에 분포하며, 피부는 갈색이며 몽골인과 유사한 특징으로 가지나, 형태적 특징은 이에 제한되지 않는다.
폴리네시아인((Polynesian, 또는 오스트레인리아 인종(Australoid race))은 하와이, 서사모아, 뉴질랜드, 이스터 섬 등 태평양 도서에 분포하는 인종으로, 피부는 다갈색이며, 큰 신체 및 큰 두개골 등의 특징을 가지나, 형태적 특징은 이에 제한 되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 태양은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물이다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가진다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간항체 생산에 이용될 수 있다. 특히, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 항체 레퍼토리(antibody repertoire)의 다양성 확보를 위해 이용될 수 있다.
항체 레퍼토리(antibody repertoire)
하나의 개체에서 B 세포 라이브러리는 약 109 개를 이루며, 각 클론은 서로 다른 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 생산할 수 있다. 항체 다양성의 메커니즘 중에는 면역글로불린 중쇄 유전자에서 V, D 및 J 세그먼트; 및 경쇄 유전자에서 V와 J 세그먼트의 다양한 재조합(또는 재배열)이 포함된다. 또한, 재배열된 중쇄 및 경쇄의 다양한 조합의 페어링도 포함된다. 다른 메커니즘으로는 체세포 돌연변이(somatic mutation), 세그먼트 조합시 세그먼트 접합부(junction)에서의 뉴클레오타이드 제거 또는 삽입 등이 있다. 항체 레퍼토리는 이러한 다양한 메커니즘에 의해 생성되는 항체 전체 세트로, 일반적으로 한 개체에서 생산되는 항체의 전체 세트를 말한다. 따라서, 항체 레퍼토리의 다양성을 확보하는 것은 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 다양성을 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 항체 레퍼토리의 다양성을 확보하는 것은 항원에 대한 특이성을 증가시킨 항체를 확보하는 것일 수 있다. 이러한 항체 레퍼토리의 다양성은 대립 유전자 배제 현상(allelic exclusion) 및 면역글로불린 대립 유전자의 다양화(예를 들어, 개체간, 인종간의 대립 유전자의 차이 등 이용)에 의해 확보될 수 있다. 이를 위해, 면역글로불린 유전자에 대해 동형접합성 형질전환 동물이 아닌 이형접합성 형질전환 동물의 개발이 필요하다.
Homo-allelic immunoglobulin
현재 인간항체를 생산하기 위해 이용되는 형질전환 동물은 대부분 면역글로불린 유전자에 대해 동형 대립 유전자(homo-allele)를 가지는 동형접합성(homozygous) 형질전환 동물이다. 즉, 면역글로불린 유전자에 대한 한 쌍의 대립 유전자가 동일한 대립 유전자를 가지는 형질전환 동물이 인간항체 연구 및 생산을 위해 이용되고 있다. 이와 관련하여 US8,502,018, US9,371,553, US9,379,699, US9,447,177, US10,064,398, US9,504,236, US9,783,593, US9,445,581, US9,938,357 및 US9,788,534 등의 다수의 특허에서 면역글로불린 유전자에 대해 동형접합성(homozygous) 형질전환 마우스의 생산 및 이를 이용한 인간항체 생산 방법에 대해 개시하고 있다. 하지만 이러한 동형접합성 형질전환 마우스의 경우, 면역글로불린 유전자가 동형 대립 유전자로 존재하므로, 이형 대립 유전자에 비해 상대적으로 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)이 낮고, 이로 인해 대립 유전자 배제 현상에 따른 대립 유전자로부터 재조합(재배열)되어 생성될 수 있는 B세포 레퍼토리 다양성(B cell repertoire diversity)이 제한적이다.
면역글로불린 유전자의 대립 유전자 배제(allelic exclusion) 현상
대립 유전자 배제(allelic exclusion)은 이배체(diploid)의 두 대립 유전자 중에서 하나만 배타적으로 발현되어 정상적으로 기능하고 다른 대립 유전자는 발현하지 않는 현상을 말한다. 대립유전자 배제 현상은 두 가지 방식으로 하나의 대립유전자만 작동하도록 할 수 있다. 첫째는 염색질의 재구성(chromatin remodeling)에 의해 두 대립유전자 중 하나만 전사가 일어나도록 조절하는 방법이다. 둘째는 두 대립유전자가 모두 전사되지만 한 대립유전자에서 유래한 mRNA만 정상적으로 기능하는 단백질을 생산하는 방법이다. 가장 잘 알려진 대립 유전자 배제 현상은 B세포(B cell, B lymphocyte)가 한 종류의 B세포 수용체(B cell receptor, BCR)만을 발현하는 과정이다.
일반적으로 면역글로불린 유전자는 B 세포의 발달 과정 중에 두 개의 대립 유전자 중 하나의 대립 유전자가 임의로 선택되어 재배열된다. 실질적으로 발현되는 유전형은 대립 유전자 중 하나로, 하나의 대립 유전자의 재배열이 정상적으로 진행된 경우, 나머지 대립 유전자의 재배열은 진행되지 않는다. 또는 하나의 대립 유전자의 재배열 정상적으로 진행되지 않을 경우, 나머지 대립 유전자의 재배열이 진행되게 된다. 이러한 면역글로불린 유전자의 대립 유전자 배제 현상은 하나의 B 세포가 하나의 항원에 대해서만 특이성을 가지도록 보장한다.
이러한 면역글로불린 유전자의 대립 유전자 배제 현상은 항체 레퍼토리의 다양성을 확보에 있어중요하다. 이는 대립 유전자 배제 과정 중 면역글로불린 유전자의 V, D 및 J 세그먼트 또는 V와 J 세그먼트의 재조합이 발생하고, 이에 따른 다양한 재조합에 의해 항체 레퍼토리의 다양성이 확보된다. 특히, 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)에 따라(동형 대립 유전자 또는 이형 대립 유전자 유무에 따라) 대립 유전자 배제 현상에 의해 형성되는 B 세포 레퍼토리의 다양성에 차이가 발생할 수 있다.
B 세포 레퍼토리 다양성(B cell repertoire diversity) 및 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)
B세포 레퍼토리 다양성(B cell repertoire diversity)은 B 세포의 발달 과정을 통해 면역글로불린 유전자가 재배열 되기 전에 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)에 포함된 다수의 V, D 및/또는 J 세그먼트의 다양성에 기인한다. 보다 구체적으로, B세포 레퍼토리 다양성은 일반적으로 부계 및 모계에서 유전된 대립 유전자의 다양성에 기인한다. 생식계 유전자 다양성 (germline gene diversity)은 부계 및 모계에서 유전된 대립 유전자의 다양성, 즉, 일부 V, D 및/또는 J 세그먼트의 차이에 따라 다양성이 발생한다. 이러한 생식계 유전자 다양성은 B 세포 레퍼토리의 다양성에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)은 B 세포의 발달 과정 중 V, D 및/또는 J 세그먼트의 재배열의 경우의 수를 증가시킬 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 면역글로불린 유전자는 대립 유전자 배제 현상에 따라 B 세포의 발달 과정 중에 두 개의 대립 유전자 중 하나의 대립 유전자가 임의로 선택되어 재배열된다. 실질적으로 발현되는 유전형은 대립 유전자 중 하나로, 하나의 대립 유전자의 재배열이 정상적으로 진행된 경우, 나머지 대립 유전자의 재배열은 진행되지 않는다. 또는 하나의 대립 유전자의 재배열 정상적으로 진행되지 않을 경우, 나머지 대립 유전자의 재배열이 진행되게 된다. 따라서, 대립 유전자가 동형 대립 유전자 또는 이형 대립 유전자 유무에 따라 형성되는 B세포 레퍼토리의 다양성에 차이가 발생할 수 있다. 특히, 대립 유전자가 이형 대립 유전자인 경우, 동형 대립 유전자에 비해 B세포 레퍼토리 다양성이 증가할 수 있다. 이는 이형 대립 유전자의 경우, 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)에 포함된 다수의 V, D 및/또는 J 세그먼트의 다양성이 존재하여 생식계 유전자 다양성을 증가시키기 때문이다. 따라서, 형질전환 동물을 이용한 인간항체 생산시 B세포 레퍼토리의 다양성 확보를 위해 생식계 유전자 다양성을 증가시킬 필요가 있고, 이를 위해 이형 대립 유전자가 유용하게 이용될 수 있다.
Hetero-allelic immunoglobulin
기존 항체 생산용 형질전환 동물은 면역글로불린 유전자에 대해 동형 대립 유전자(homo-allele)를 가지는 동형접합성(homozygous) 형질전환 동물로, 항체 레퍼토리의 다양성이 제한적이다. 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물의 개발이 필요하다. 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 형질전환 동물은 생식계 다양성이 증가할 수 있다. 이는 이형 대립 유전자의 차이에 기인한다. 또한, 이러한 이형 대립 유전자의 차이는 항체 레퍼토리의 다양성에 영향을 줄 수 있다.
- 이형 대립 유전자 간의 차이
일반적으로 포유동물이 가지는 면역글로불린 유전자의 대립 유전자는 각각 부계 및 모계에서 유전된 것으로 이형 대립 유전자이다. 두 대립 유전자의 차이는 단일염기 다형성(single-nucleotide polymorphism; SNP)에서부터 유전자의 일부 영역의 삭제, 삽입 또는 중복(duplication)에 이르기까지 다양하다(Chimge, N. O. et al. (2005) “Determination of gene organization in the human IGHV region on single chromosomes.” Genes Immun. 6, 186-193; Li, H. et al. (2002) “Genetic diversity of the human immunoglobulin heavy chain VH region.” Immunol. Rev. 190, 53-68; Kidd, M.J. et al. (2012) “The inference of phased haplotypes for the immunoglobulin H chain V region gene loci by analysis of VDJ gene rearrangements.” J. Immunol. 188, 1333-1340; 및 Watson, C.T. et al. (2013) “Complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy-chain variable, diversity, and joining genes and characterization of allelic and copy-number variation.” Am. J.Hum.Genet. 92, 530-546).
이러한 차이는 일 개체 내의 두 대립 유전자에서뿐만 아니라 개체 간에서도 보여지며, 개체간의 연관성 또는 관련성에 따라서 그 차이가 더욱 다양할 수 있다(Watson, C.T. et al. (2014) “Sequencing of the human IG light chain loci from a hydatidiform mole BAC library reveals locus-specific signatures of genetic diversity.” Genes Immun. 16, 24-23; Pallares, N. et al. (1999) “The human immunoglobulin heavy variable genes.” Exp. Clin. Immunogenet. 16, 36-60; Lefranc, M.-P. et al. (2014) “IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® 25 years on.” Nucleic Acids Res. 43, D413-D422; Pallares, N. et al. (1998) “The human immunoglobulin lambda variable (IGLV) genes and joining (IGLJ) segments.” Exp. Clin. Immunogenet. 15, 8-18; 및 Barbie, V. and Lefranc, M.P. (1998) “The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGKJ) segments.” Exp. Clin. Immunogenet. 15, 171-183).
예를 들어, 서로 다른 두 개체는 항체 레퍼토리의 다양성에 현저한 차이를 보이며, 이는 개체간의 V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation) 및 V 세그먼트 내에 다형성(polymorphism) 등의 차이에 의한 결과이다(Boyd, S.D. et al. (2010) “Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements.” J. Immunol. 184, 6986-6992).
또 다른 예를 들면, 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race))에 속하는 일 개체가 가지는 면역글로불린 유전자의 대립 유전자는 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid))에 속하는 일 개체가 가지는 면역글로불린 유전자의 대립 유전자와 현저한 차이가 존재함이 확인되었다(Scheepers, C. et al. (2015) “Ability to develop broadly neutralizing HIV-1 antibodies is not restricted by the germline IG gene repertoire.” J. Immunol. 194, 4371-4378; 및 Wang, Y. et al. (2011) “Genomic screening by 454 pyrosequencing identifies a new human IGHV gene and sixteen other new IGHV allelic variants.” Immunogenetics 63, 259-265). 특히, 인종 간의 유전자의 차이는 이미 다수의 논문에서 다양성이 존재함이 보고된 바 있다 (Mallick, Swapan, et al. (2016) "The Simons genome diversity project: 300 genomes from 142 diverse populations." Nature 538, 201-206). 따라서, 서로 다른 인종 유래의 대립 유전자를 이용하는 경우, 대립 유전자의 다양성에 의해 B 세포 레퍼토리 다양성이 증가할 수 있으며, 다양한 신규 항체 도출할 수 있을 것이다.
- 서로 다른 개체 또는 사로 다른 인종 유래 이형 대립 유전자
이형 대립 유전자의 이용은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 가능하게 한다. 특히, 이형 대립 유전자의 차이에 따라, 항체 레퍼토리의 다양성은 달라질 수 있다. 이형 대립 유전자 간의 차이가 클수록 생성되는 항체 레퍼토리의 다양성은 증가할 수 있다. 이를 위해, 서로 다른 개체(인간 개체) 유래의 두 개의 대립 유전자가 항체 생산용 형질전환 동물에 이용될 수 있다. 구체적으로, 제1 인간 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인간 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제2 대립 유전자)를 이형 대립 유전자로 가지는 형질전환 동물을 이용해 인간항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다른 개체일 수 있다. 이 경우, 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)의 차이를 보인다. 이때, 이형 대립 유전자 간의 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)은 다음과 같은 차이를 가질 수 있다(Watson CT et al. (2017) “The individual and population genetics of antibody immunity.” Trends Immunol. 38(7), 459-470):
i) 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및/또는
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
또는, 서로 다른 인종 유래의 두 개의 대립 유전자가 항체 생산용 형질전환 동물에 이용될 수 있다. 구체적으로, 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 유전자(제2 대립 유전자)를 이형 대립 유전자로 가지는 형질전환 동물을 이용해 인간항체를 생산할 수 있다. 이 경우, 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)의 차이를 보인다. 이때, 이형 대립 유전자 간의 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region)은 다음과 같은 차이를 가질 수 있다(Watson CT et al. (2017) “The individual and population genetics of antibody immunity.” Trends Immunol. 38(7), 459-470):
i) 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및/또는
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기와 같은 이형 대립 유전자간의 차이는 생식계 유전자 다양성(germline gene diversity)을 확보하여 항체 레퍼토리의 다양성을 증가시킬 수 있다.
i) 단일염기 다형성(SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation)
단일염기 다형성(SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이로, 보통 게놈에서 1000개의 염기서열 마다 1개 꼴로 나타나며, 이로 인해 유전적 다양성이 나타난다. SNP에 의한 동의 돌연변이는 게놈 내에 SNP가 존재하나 이에 의해 발현되는 아미노산에는 변화가 없는 돌연변이를 말한다. 동의 돌연변이의 경우, 게놈 내, 즉, DNA에 점 돌연변이(point mutation)이 발생하면, 이에 따라 전사된 RNA 서열에서도 변이가 존재하지만, 번역된 아미노산은 변이가 없다. 이에 반해, SNP에 의한 비동의 돌연변이는 게놈 내에 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입 또는 삭제에 의한 SNP가 존재하며, 이러한 SNP에 의해 코돈 서열이 변경 되거나 프레임-쉬프트 돌연변이가 발생하여 발현되는 아미노산에 변형되는 돌연변이를 말한다. 비동의 돌연변이의 경우, 게놈 내, 즉, DNA 서열 내에 하나의 뉴클레오타이드가 치환, 삽입 또는 삭제되어 발생하면, 이에 따라 코돈 서열의 리딩 프레임(reading frame)이 변경되어 발현되는 단백질 또는 아미노산이 변형된다.
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation)
V 세그먼트의 대립 유전자 변이는 면역글로불린의 가변 영역에 존재하는 V 세그먼트들 중 일부 세그먼트에 하나 이상의 다형성(polymorphism) 변이를 포함하는 것을 말한다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 내에 V 세그먼트들 중 V1-69 세그먼트는 IGHV1-69*01, IGHV1-69*02, IGHV1-69*03, IGHV1-69*04, IGHV1-69*05, IGHV1-69*06, IGHV1-69*07, IGHV1-69*08, IGHV1-69*09, IGHV1-69*10, IGHV1-69*11, IGHV1-69*12 및 IGHV1-69*13 등의 대립 유전자가 존재한다.
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV)
세그먼트의 복제수 변이는 면역글로불린의 가변 영역을 구성하는 V, J 및/또는 D 세그먼트들 중 일부 세그먼트가 삭제되거나 반복(중복)되는 것을 말한다. 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역 내에 D 세그먼트 중 D1-14 세그먼트가 중복되어 존재할 수 있으며, 이 경우, 면역글로불린 중쇄 유전자는 세그먼트의 복제수 변이를 가진다고 할 수 있다. 다른 예를 들면, 면역글로불린 카파 유전자의 가변 영역 내에 V 세그먼트 중 V2-28 세그먼트가 삭제된 상태일 수 있으며, 이 경우, 면역글로불린 카파 유전자는 세그먼트의 복제수 변이를 가진다고 할 수 있다.
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV)
오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)은 mRNA로 전사되어 단백질로 번역될 가능성이 있는 염기서열을 의미한다. ORF의 복제수 변이는 면역글로불린 유전자 내에 일부 ORF가 삭제되거나 반복(중복)되는 것을 말한다.
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication)
면역글로불린 유전자는 큰 핵산 절편의 삭제, 삽입 또는 중복에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 유전자의 일 영역이 삭제 또는 중복될 수 있다. 또는, 면역글로불린 유전자에 일 영역이 삽입될 수 있다. 이때, 상기 일 영역은 적어도 8 내지 75 kb 길이의 큰 핵산 서열일 수 있다. 이러한 큰 핵산 절편의 삭제, 삽입 또는 중복에 의해 생성된 변이는 특정 세그먼트의 복제수 변이를 야기할 수 있다.
Hetero-allelic immunoglobulin heavy (IGH)
일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제2 대립 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르며, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) IGHV 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
Hetero-allelic immunoglobulin Kappa (IGK)
일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제2 대립 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르며, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) IGKV 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
Hetero-allelic immunoglobulin Lambda (IGL)
일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제1 대립 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제2 대립 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르며, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 유전자와 제2 대립 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) IGLV 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
Hetero-allelic immunoglobulin heavy (IGH), Hetero-allelic immunoglobulin Kappa (IGK) and/or Hetero-allelic immunoglobulin Lambda (IGL)
일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 인간화 면역글로불린 카파 유전자 각각에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제1 대립 중쇄 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제2 대립 중쇄 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제1 대립 카파 유전자) 및 제4 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제2 대립 카파 유전자)일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다르다. 이때, 상기 제1 인종은 상기 제3 인종 또는 제4 인종과 동일할 수 있다. 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 중쇄 유전자와 제2 대립 중쇄 유전자; 및 제1 대립 카파 유전자와 제2 대립 카파 유전자는 각각 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
다른 일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자 각각에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제1 대립 중쇄 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제2 대립 중쇄 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제1 대립 람다 유전자) 및 제4 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제2 대립 람다 유전자)일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다르다. 이때, 상기 제1 인종은 상기 제3 인종 또는 제4 인종과 동일할 수 있다. 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 중쇄 유전자와 제2 대립 중쇄 유전자; 및 제1 대립 람다 유전자와 제2 대립 람다 유전자는 각각 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
또 다른 일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자 각각에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제1 대립 카파 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제2 대립 카파 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제1 대립 람다 유전자) 및 제4 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제2 대립 람다 유전자)일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다르다. 이때, 상기 제1 인종은 상기 제3 인종 또는 제4 인종과 동일할 수 있다. 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종 및 제4 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 카파 유전자와 제2 대립 카파 유전자; 및 제1 대립 람다 유전자와 제2 대립 람다 유전자는 각각 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
또 다른 일 구체예로, 본 명세서에서 개시하는 이형접합형(heterozygous) 형질전환 동물은 항체 레퍼토리의 다양성 확보를 위해서 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및 인간화 면역글로불린 람다 유전자 각각에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상기 이형 대립 유전자는 서로 다른 개체 유래의 두 개의 대립 유전자일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인간 개체일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 개체는 서로 다른 인종에 속한 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제1 대립 중쇄 유전자) 및 제2 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자(제2 대립 중쇄 유전자)일 수 있다. 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 카파 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제3 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제1 대립 카파 유전자) 및 제4 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 카파 유전자(제2 대립 카파 유전자)일 수 있다. 상기 제3 인종과 제4 인종은 서로 다르다. 상기 인간화 면역글로불린 람다 유전자에 대한 이형 대립 유전자는 제5 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제1 대립 람다 유전자) 및 제6 인종에 속한 개체 유래 인간화 면역글로불린 람다 유전자(제2 대립 람다 유전자)일 수 있다. 상기 제5 인종과 제6 인종은 서로 다르다. 이때, 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종 중 선택된 둘 이상의 인종은 동일한 인종일 수 있다. 상기 제1 인종, 제2 인종, 제3 인종, 제4 인종, 제5 인종 및 제6 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다. 상기 제1 대립 중쇄 유전자와 제2 대립 중쇄 유전자; 제1 대립 카파 유전자와 제2 대립 카파 유전자; 및 제1 대립 람다 유전자와 제2 대립 람다 유전자는 각각 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
이때, 상기 형질전환 동물은 비인간-동물로, 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
- 서로 다른 개체(또는 인종) 유래 이형 대립 유전자에 의한 항체 레퍼토리 다양성 증가
이형 대립 유전자에 따른 생식계 유전자 다양성은 B세포 레퍼토리의 다양성을 증가시킨다. 면역글로불린 유전자는 일반적으로 두 대립 유전자 중 하나의 대립 유전자가 임의로 선택되어 발현된다 (Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, (2013) Kuby Immunology (7th edition), Chapter7, W. H. Freeman & Company). 즉, 면역글로불린 유전자의 두 대립 유전자(제1 대립 유전자 및 제2 대립 유전자) 중 임의로 선택된 하나의 대립 유전자(예를 들어, 제1 대립 유전자)에서 V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)이 발생하여 정상적으로 VDJ 조합 또는 VJ 조합이 형성되면, 제2 대립 유전자는 발현되지 않고 재조합된 제1 대립 유전자만 발현한다. 그러나 제1 대립 유전자에서 정상적인 VDJ 조합 또는 VJ 조합이 형성되지 않으면, 제2 대립 유전자에서 V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)이 발생한다. 제2 대립 유전자에 정상적인 VDJ 조합 또는 VJ 조합이 형성되면, 제1 대립 유전자는 발현되지 않고 정상적으로 재조합된 제2 대립 유전자만 발현한다. 이러한 특성을 면역글로불린 중쇄, 카파 및 람다 유전자에서 공통되게 나타난다. 일반적으로 V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)은 면역글로불린 중쇄 유전자, 카파 유전자, 람다 유전자 순으로 발생하는 것으로 알려져 있다.
이러한 면역글로불린 유전자의 재조합(재배열)에 따른 단일 대립 유전자 발현 특징은 이형 대립 유전자를 이용하는 경우, 동형 대립 유전자를 이용하는 경우와 비교하여 재조합의 다양성을 증가시킬 수 있다. 다시 말해, 동일한 두 개의 대립 유전자에 의해 발생할 수 있는 재조합의 수에 비해 서로 다른 두 개의 대립 유전자에 의해 발생하는 재조합의 수가 훨씬 많으므로, 이형 대립 유전자에 의해 항체 레퍼토리의 다양성이 증가할 수 있다.
또한, V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)시 발생하는 세그먼트 접합부(junction)에서의 일부 뉴클레오타이드 제거 또는 삽입 등이 생성된다. 이러한 뉴클레오타이드 제거 또는 삽입은 접합부 다양성(Junctional diversity)을 발생시킨다 (Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, (2013) Kuby Immunology (7th edition), Chapter7, W. H. Freeman & Company). 이러한 접합부 다양성(Junctional diversity)은 면역글로불린 유전자의 재조합(재배열)과 더불어 항체 레퍼토리의 다양성을 증가시킬 수 있다.
이 밖에도 Somatic hypermutation 및 class switching에 의해 항체 레퍼토리의 다양성을 증가시킬 수 있다 (Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, (2013) Kuby Immunology (7th edition), Chapter12, W. H. Freeman & Company).
따라서, 항체 레퍼토리의 다양성은 이형 대립 유전자를 이용하는 경우 동형 대립 유전자에 비해 증가할 수 있다. 이는 이형 대립 유전자에 의한 V, D 또는 J 세그먼트의 다양성 증가; V, D, J 또는 V, J 세그먼트의 재조합(또는 재배열)의 수 증가; 세그먼트 다양성 및 재조합 증가에 따른 접합부 다양성 증가; 및 증가된 VDJ 조합 또는 VJ 조합에서 Somatic hypermutation 및/또는 class switching에 의한 다양성 증가에 의한 것이다.
본 명세서에 의해 개시되는 다른 일 태양은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물의 제조 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물이다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가진다. 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간항체 생산에 이용될 수 있다. 특히, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 항체 레퍼토리(antibody repertoire)의 다양성 확보를 위해 이용될 수 있다.
상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용해 제조될 수 있다.
이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포는 벡터를 이용한 클로닝(cloning) 방법 및 염색체 교환(chromosome exchange)을 이용한 방법 등의 공지의 방법을 이용해 제작될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터를 이용한 클로닝(cloning) 방법은 미국등록특허 US 6,586,251, US 6,596,541, US 7,105,348, 및 미국공개특허 US 2004-0018626 A1 등을 참고할 수 있으며, 다만 이에 제한된 것은 아니다. 예를 들어, 상기 염색체 교환을 이용한 방법은 PCT 출원특허 PCT/KR2019/015351 및 한국 출원특허 KR 10-2019-0042840 등을 참고할 수 있으며, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간을 제외한 비인간-동물일 수 있다. 상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)일 수 있다. 이때, 상기 설치류는 마우스, 래트 등일 수 있으며, 상기 유제류는 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타 등일 수 있고, 상기 인간을 제외한 영장류는 침팬지, 원숭이 등일 수 있으며, 상기 조류는 닭, 메추리 등일 수 있으나, 다만 이에 제한된 것은 아니다.
일 구체예로서, 상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포는 염색체 교환(또는 교체, 치환) 기술을 이용해 제조될 수 있다. 이때, 상기 둘 이상의 형질전환 동물 세포는 제1 형질전환 동물 세포 및 제2 형질전환 동물세포 일 수 있다.
상기 제1 형질전환 동물 세포는 다음의 방법으로 제조될 수 있다:
a) 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포 및 비인간-동물 세포 준비;
b) 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포를 이용한 마이크로세포 제조;
c) 상기 마이크로세포와 상기 비인간-동물 세포를 이용한 융합 비인간-동물 세포 제조; 및
d) 재조합효소 처리를 통해 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제1 형질전환 동물 세포 제조.
a) 단계에서,
상기 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포는 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소(예를 들어, loxp, FRT, attP, attB, ITR 등)가 포함되도록 조작된 세포이며, 상기 비인간-동물 세포는 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소(예를 들어, loxp, FRT, attP, attB, ITR 등)가 포함되도록 조작된 세포일 수 있다.
이때, 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소와 상기 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소는 서로 페어링할 수 있다.
예를 들어, 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단은 재조합 요소로 각각 Lox66과 Loxm2/71을 포함할 수 있고, 상기 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단은 재조합 요소로 각각 Loxm2/66과 Lox71을 포함할 수 있다. 이때, 상기 Lox66은 Lox71과 페어링할 수 있고, 상기 Loxm2/71은 Loxm2/66과 페어링할 수 있다.
b) 단계에서,
상기 마이크로세포는 상기 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포를 이용해 공지의 방법을 통해 제조될 수 있다. 이는 문헌 “Thorfinn Ege et al 1974” 및 “Thorfinn Ege et al 1977”에 기재되어 있으며, 이를 참조할 수 있다.
c) 단계에서,
상기 융합 비인간-동물 세포는 b) 단계에서 제조된 마이크로세포와 상기 비인간-동물 세포를 접촉하여 융합시킴으로 제조될 수 있다. 이는 문헌 “Fournier RE et al 1977”; McNeill CA et al 1980”; 및 “Tomizuka et al., Nature Genetics, 16: 133 (1997)”에 기재되어 있으며, 이를 참조할 수 있다.
상기 융합 비인간-동물 세포는 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포의 인간 면역글로불린 유전자좌를 가지는 염색체 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌를 가지는 염색체를 포함할 수 있다.
d) 단계에서,
c) 단계에서 제조된 상기 융합 비인간-동물 세포에 재조합 효소를 처리하여 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 제1 형질전환 동물 세포를 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 효소는 Cre recombinase일 수 있다. 이때, 상기 Cre recombinase는 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소(예를 들어, Lox66과 Loxm2/71)와 상기 비인간-동물 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 재조합 요소(예를 들어, Loxm2/66과 Lox71)를 인지할 수 있다. 특히, Cre recombinase는 재조합 요소의 페어링(예를 들어, Lox66와 Lox71의 페어링, Loxm2/71과 Loxm2/66의 페어링)을 인지하여 재조합을 유도할 수 있다. 이러한 재조합을 통해 인간화 면역글로불린 유전자좌가 생성될 수 있으며, 이때, 상기 인간화 면역글로불린 유전자좌는 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 불변 영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제2 형질전환 동물 세포는 상기에 기술한 제1 형질전환 동물 세포의 제조 방법과 동일한 방법으로 제조될 수 있다. 다만, 상기 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포 대신에 제2 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포를 이용하여 제조될 수 있다. 이때, 제1 인종과 제2 인종은 서로 다른 인종일 수 있다. 이때, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종일 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 인종이 코카시아 인종일 수 있고, 상기 제2 인종은 흑인 인종일 수 있다. 이때 a 단계에서, 상기 제1 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포는 코카시아 인종에 속하는 개체 유래 인간 fibroblast인 BJ cell (ATCC® CRL-2522™, ethnicity는 white임)일 수 있고, 상기 제2 인종에 속하는 개체 유래 인간 세포는 흑인 인종에 속하는 개체 유래 인간 fibroblast인 WS1 cell (ATCC® CRL-1502™, ethnicity는 black임)일 수 있다.
체세포 핵 이식(Somatic cell nuclear transfer; SCNT)
일 구체예로서, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용한 체세포 핵 이식(SCNT)를 통해 제조될 수 있다. 이때, 상기 형질전환 동물 세포는 서로 다른 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포로, 제1 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제1 형질전환 동물 세포 및 제2 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제2 형질전환 동물 세포를 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 형질전환 동물 세포의 인간화 면역글로불린 유전자와 제2 형질전환 동물 세포의 인간화 면역글로불린 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 체세포 핵 이식은 상기 제1 형질전환 동물 세포 및 상기 제2 형질전환 동물 세포로부터 각각 공여 핵을 수득하고, 탈핵 난자에 상기 공여 핵을 각각 이식하여 각각의 복제란을 제작하고, 상기 복제란을 대리모의 자궁에 이식하여 각각의 산자를 발생시키는 것으로, 상기 SCNT는 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다. 상기 생산된 산자들은 서로 교배하여 이형접합성 형질전환 동물을 수득할 수 있다.
배아(embryo)로부터 발생
일 구체예로서, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용해 제조될 수 있다. 이때, 상기 형질전환 동물 세포는 형질전환 배아(embryo)일 수 있다. 이때, 상기 형질전환 배아(embryo)는 서로 다른 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 배아로, 제1 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제1 형질전환 배아 및 제2 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제2 형질전환 배아를 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 형질전환 배아의 인간화 면역글로불린 유전자와 제2 형질전환 배아의 인간화 면역글로불린 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 제1 형질전환 배아 및 제2 형질전환 배아를 각각 대리모의 자궁에 착상시켜 각각의 배아로부터 산자를 발생시키고, 생산된 산자들을 서로 교배하여 수득된 것으로, 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
배반포 주입 (Blastocyst Injection)
일 구체예로서, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 대립 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 동물 세포를 이용한 배반포 주입 (Blastocyst Injection)을 통해 제조될 수 있다. 이때, 상기 형질전환 동물 세포는 형질전환 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)일 수 있다. 이때, 상기 형질전환 배아 줄기세포는 서로 다른 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 둘 이상의 형질전환 배아 줄기세포로, 제1 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제1 형질전환 배아 줄기세포 및 제2 개체 유래의 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 제2 형질전환 배아 줄기세포를 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 형질전환 배아 줄기세포의 인간화 면역글로불린 유전자와 제2 형질전환 배아 줄기세포의 인간화 면역글로불린 유전자는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 제1 형질전환 배아 줄기세포 및 제2 형질전환 배아 줄기세포를 각각 포배에 이식하여 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 제작하고, 상기 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 대리모의 자궁에 착상시켜 각각의 산자를 발생시키고, 생산된 산자들을 서로 교배하여 수득된 것으로, 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 또 다른 일 태양은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물을 이용한 항체 생산 방법에 관한 것이다. 이때, 상기 방법은 이형접합성 형질전환 동물에 항원을 주입하는 것을 포함할 수 있다.
상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물일 수 있다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가질 수 있다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및/또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다.
상기 대립 이형 유전자 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 항원 주입을 통해, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 상기 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체는 상기 이형 대립 유전자 중 임의의 하나의 대립 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 또 다른 일 태양은 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자(hetero-allele)를 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 동물을 이용한 항체 다양성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이때, 상기 방법은 이형접합성 형질전환 동물에 항원을 주입하는 것을 포함할 수 있다.
상기 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 유전자로, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 동물일 수 있다. 이때, 상기 이형접합성 형질전환 동물은 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 이형 대립 유전자를 가지는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가질 수 있다.
상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자, 인간화 면역글로불린 카파 유전자 및/또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자일 수 있다.
상기 대립 이형 유전자 간에는 다음 중 하나 이상의 차이를 가질 수 있다:
i) SNP에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
상기 방법은 상기 항원 주입을 통해 상기 이형접합성 형질전환 동물로부터 상기 항원에 특이적인 항체 집단 또는 B세포 집단을 수득할 수 있다. 이때, 상기 항원에 특이적인 항체 집단 또는 B세포 집단은 상기 이형 대립 유전자 중 임의의 하나의 대립 유전자의 재조합(재배열)에 의해 생산된 항체 집단 또는 B세포 집단일 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1. 염색체 교환을 이용한 이형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 마우스의 제조 방법에 관한 것으로, 마우스의 면역글로불린 유전자가 인간화되고, 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 서로 다른 이형 대립 유전자를 가지는 형질전환 마우스에 관한 것이다. 하기의 설명은 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 서로 다른 인종에 속한 개체 유래의 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체)되어 인간화된 이형접합성 형질전환 마우스 제조에 대한 전반적인 실시예로, 이형접합성 형질전환 마우스 제조의 일 예일뿐, 이에 제한되지 않는다. 목적하는 이형접합성 형질전환 마우스의 제조는 하기에 기재된 실시예를 기초로 하여 다양하게 변경하여 실시함으로 생산할 수 있으며, 또한, 하기에 기재된 실시예 외에도 다양한 방법을 통하여 실시함으로써 생산할 수 있다.
실시예 1-1. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 흑인(니그로, negro) 인종에 속한 개체 유래의 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체)되어 인간화된 동형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다. 해당 실시예는 염색체 교환 기술(예를 들어, AiCE 기술(PCT 출원특허 PCT/KR2019/015351 참고))을 이용하여 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다.
1. 벡터 설계
마우스 면역글로불린 유전자의 가변 영역을 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체) 하기 위해, 각각의 가변 영역 양 말단에 loxp 삽입을 위해 벡터를 설계한다. 이때, 삽입된 loxp는 두 염색체(마우스 면역글로불린 유전자가 위치한 마우스 염색체 및 인간 면역글로불린 유전자가 위치한 인간 염색체) 사이의 재조합에 이용된다.
마우스 면역글로불린 유전자의 가변 영역 양 말단에 loxp를 삽입하기 위해 두 개의 벡터(제1 벡터 및 제2 벡터)를 설계한다.
상기 제1 벡터는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제1 상동성 암, piggyBac terminal repeat(PB-TR), 프로모터, loxm2/66(제1 RRS), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 프로모터, FRT 및 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제2 상동성 암을 포함한다.
상기 제2 벡터는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제3 상동성 암, 역위된(inverted) 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene), FRT, lox71(제2 RRS), 프로모터, neomycin 저항성 유전자(NeoR), piggyBac terminal repeat(PB-TR) 및 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제4 상동성 암을 포함한다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역 양 말단에 loxp를 삽입하기 위한 두 개의 벡터(제3 벡터 및 제4 벡터)를 설계한다.
상기 제3 벡터는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제5 상동성 암, 프로모터, 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), lox66(제3 RRS), 프로모터, FRT, piggyBac terminal repeat(PB-TR) 및 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제6 상동성 암을 포함한다.
상기 제4 벡터는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제 7 상동성 암, piggyBac terminal repeat(PB-TR), 역위된(inverted) 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene), FRT, 역위된(inverted) 퓨로ΔTK 유전자(puroΔTK gene), loxm2/71(제4 RRS), 프로모터, neomycin 저항성 유전자(NeoR) 및 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입되기 위해 사용되는 제 8 상동성 암을 포함한다.
이때, 상기 벡터 설계는 삽입 위치 및 loxp 종류에 따라 다양하게 설계될 수 있으며, 선별 과정을 위해서 다양한 요소를 추가 포함하도록 설계 변경이 가능하다.
2. Loxp가 삽입된 세포 제조
상기 벡터를 이용해 loxp가 삽입된 마우스 세포 및 흑인 인종에 속한 개체 유래의 인간 세포를 제조한다. 이때, 상기 벡터의 도입은 벡터가 여러 개일 경우, 순차적으로 또는 무작위적으로 수행 가능하며, 또한 동시에 도입 가능하다. 상기 벡터가 도입된 세포의 선별 과정은 벡터에 삽입된 요소에 따라 다양하게 변형 가능하다.
2-1. Loxp가 삽입된 마우스 세포 제조
사용되는 mouse embryonic stem cell(mESC)은 기본 배양액 2i 배지를 사용하였는데, 이 배양액은 FBS가 없는 N2B27배지에 MEK inhibitor PD0325901 (1 μM) and GSK3 inhibitor CHIR99021 (3 μM) (both from Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1,000 U/ml LIF (Milliphore, Billerica, MA, USA)을 첨가한 기본 배양액(2i 배지)이며, 상기 mESC는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 증식 및 유지를 위해 배양한다. Transient transfection은 lipofectamine 3000 또는 Nepa21(NEPAGENE Co., Ltd., Chiba, Japan) electroporator을 사용하여 수행한다. Transient transfection을 위해 1×106 cells을 FBS와 항생제가 들어가지 않은 배지에 준비한다. 여기에 제1 벡터 10μg을 첨가한 후 lipofectamin 3000 reagent를 섞고 상온에서 5분간 정치 시킨 후 transfection 한다. 또는 제1 벡터 10μg을 첨가하고 125V, 5ms, 2 pulse 로 transfection 한다. Transfection된 mESC는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양한다.
제1 벡터의 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입 여부를 확인하기 위해, transfection된 mESC에 블라스티사이딘을 처리하여 세포의 생존 여부로 제1 벡터의 삽입을 확인한다. 블라스티사이딘 처리 후 생존 mESC를 수득하고, 수득한 mESC에 제2 벡터를 제1 벡터와 동일한 방법으로 transfection 한다. transfection된 mESC는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양한다. 제2 벡터의 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입 여부를 확인하기 위해, transfection된 mESC에 G418(Life technologies, NY, USA)을 처리하여 mESC의 생존 여부로 제2 vector의 삽입을 확인한다. G418 처리 후 생존 mESC를 수득한다.
제1 벡터와 제2 벡터가 같은 염색체(마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 염색체)에 삽입되었는지를 확인하기 위해, G418 처리 후 수득한 mESC에 재조합효소인 flippase(FLP)를 처리한다. 제1 벡터 및 제2 벡터가 같은 염색체에 삽입된 경우, 두 벡터 내에 존재하는 FRT와 처리한 FLP에 의해 재조합이 유도되어 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 역위된다. 이를 확인하기 위해, FRT-FLP 재조합이 유도된 세포에 제오신을 처리하여 mESC의 생존 여부로 같은 염색체 내 제1 벡터 및 제2 벡터의 삽입을 확인한다. 제오신 처리 후 생존한 mESC를 수득한다. 수득한 mESC는 loxm2/66(제1 RRS) 및 lox71(제2 RRS)가 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 각각 삽입된 염색체를 포함하는 mESC이다. 이러한 선별 과정은 일반적으로 체세포는 두 개의 대립 유전자를 가지므로, 두 개의 대립 유전자에 상기 제1 벡터 및 제2 벡터 중 하나만 삽입되는 경우를 제외하기 위한 것이다.
2-2. Loxp가 삽입된 인간 세포 제조
사용되는 인간 fibrobast인 WS1 cell (ATCC® CRL-1502™, ethnicity는 black임)은 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA) 및 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA)를 포함하는 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM; ATCC® 30-2003™)배지 및 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 증식 및 유지를 위해 배양한다. Transient transfection은 lipofectamine 3000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 또는 Nepa21(NEPAGENE Co., Ltd., Chiba, Japan) electroporator을 사용하여 수행한다. Transient transfection을 위해 1×106 cells을 FBS와 항생제가 들어가지 않은 배지에 준비한다. 여기에 제3 벡터 10μg을 첨가한 후 lipofectamin 3000 reagent를 섞고 상온에서 5분간 정치 시킨 후 transfection 한다. 또는 제3 벡터 10μg을 첨가하고 150V, 7.5ms, 2 pulse로 transfection 한다. Transfection된 WS1 cell은 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양한다.
제3 벡터의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 5’ 말단에 삽입 여부를 확인하기 위해, transfection된 WS1 cell에 블라스티사이딘을 처리하여 WS1 cell의 생존 여부로 제3 벡터의 삽입을 확인한다. 블라스티사이딘 처리 후 생존 WS1 cell를 수득하고, 수득한 WS1 cell에 제4 벡터를 제3 벡터와 동일한 방법으로 transfection 한다. transfection된 세포는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양한다. 제4 벡터의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 3’ 말단에 삽입 여부를 확인하기 위해, transfection된 WS1 cell에 G418(Life technologies, NY, USA)을 처리하여 WS1 cell의 생존 여부로 제4 벡터의 삽입을 확인한다. G418 처리 후 생존 WS1 cell를 수득한다.
제3 벡터 및 제4 벡터가 같은 염색체(인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 염색체)에 삽입되었는지를 확인하기 위해, G418 처리 후 수득한 WS1 cell에 재조합효소인 flippase(FLP)를 처리한다. 제3 벡터 및 제4 벡터가 같은 염색체에 삽입된 경우, 두 벡터 내에 존재하는 FRT와 처리한 FLP에 의해 재조합이 유도되어 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 역위된다. 이를 확인하기 위해, FRT-FLP 재조합이 유도된 WS1 cell에 제오신을 처리하여 WS1 cell의 생존 여부로 같은 염색체 내 제3 벡터 및 제4 벡터의 삽입을 확인한다. 제오신 처리 후 생존한 WS1 cell를 수득한다. 수득한 WS1 cell은 lox66(제3 RRS) 및 loxm2/71(제4 RRS)가 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 각각 삽입된 염색체를 포함하는 WS1 cell이다. 이러한 선별 과정은 일반적으로 체세포는 두 개의 대립 유전자를 가지므로, 두 개의 대립 유전자에 상기 제3 벡터 및 제4 벡터 중 하나만 삽입되는 경우를 제외하기 위한 것이다.
3. Loxp가 삽입된 WS1 cell를 이용한 마이크로세포(microcell) 제조
Micronuclei의 형성은 colcemid(Life technologies, Grand island, NY, USA)를 사용하여 진행한다. 상기 선별된 WS1 cell (lox66(제3 RRS) 및 loxm2/71(제4 RRS)가 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 각각 삽입된 염색체를 포함하는 세포)를 1×106 cells가 되도록 배양하여 준비한 후, 다음날 20% FBS가 담긴 EMEM으로 배지를 교환한 후 colcemid 0.1μg/ml로 처리하고, 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간 동안 배양한다. Micronucleation이 유도된 WS1 cell를 tryLE(Life technologies, Grand island, NY, USA)을 사용하여 떼어준 후, Serum-free EMEM로 씻어준 후 1000rpm, 5분간 원심분리(LABOGENE CO., Ltd, KOREA) 한다. 원심분리가 끝난 세포는 미리 데워 둔 serum-free EMEM : percoll ((Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) (1:1 (v:v))에 부유하고, cytochalsin B(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 최종 농도가 10μg/ml이 되도록 처리한다. 16000g, 34℃ 내지 37℃에서 1시간 내지 1시간 30분 동안 원심분리(LABOGENE) 하여 whole cell과 microcell을 분리한다. 분리된 whole cell과 microcell을 50ml tube로 옮기고 serum-free EMEM을 넣어 준 후, 500g에서 10분간 원심분리 한다. 상등액은 조심스레 제거하고 tube표면에 붙은 pellet을 serum-free EMEM 10ml을 넣어주고 8μm filter(GE healthcare, CHICAGO, IL, USA)를 이용하여 8μm 이하 크기의 microcell을 분리한다. 분리한 microcell이 포함된 상등액은 다시 400g에서 10분간 원심분리 한다. 원심분리 된 microcell은 8μm filter 사용 방법과 동일한 방법으로 5μm filter를 사용한다. 최종 분리된 microcell은 Nicon eclipse TS100 광학 현미경(Nicon Instruments, Melville, NY, USA)을 통해 counting 한다. 이를 통해 WS1 cell로부터 마이크로세포를 수득한다.
4. 마이크로세포와 loxp가 삽입된 마우스 세포를 이용한 융합세포 제조
분리한 인간 마이크로세포와 recipient cell로 사용할 loxp가 삽입된 mESC(loxm2/66(제1 RRS) 및 lox71(제2 RRS)가 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 양 말단에 각각 삽입된 염색체를 포함하는 세포)를 준비한다. 상기 mESC에 TryLE를 처리하고 원심분리 한다. 원심분리 된 mESC를 1XDPBS로 Washing하여 주고 Hemacytometer를 사용하여 세포 수를 계산한다. 인간 마이크로세포와 mESC의 융합은 HVJ-E protein(Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하며, suspension method 방법으로 진행한다. 인간 마이크로세포와 mESC의 비율은 1:4가 되도록 사용한다. 각각 준비된 인간 마이크로세포와 mESC는 차가운 1X cell fusion buffer 500μl을 이용하여 washing 한다. Buffer에 담긴 인간 마이크로세포와 mESC를 300g로 5분간 4℃에서 원심분리 한다. mESC 2×105 cells 당 1X cell fusion buffer를 25μl씩 넣어주고, 인간 마이크로세포에도 동일한 volume의 1X cell fusion buffer를 넣어준다. mESC와 인간 마이크로세포를 섞어주고 HVJ-E protein을 5 내지 10μl을 넣어준 후 얼음에서 5분간 방치한다. Mixture를 37℃ water bath에서 15분간 방치한다. 이때 5분 간격으로 tapping 한다. 인간 마이크로세포와 mESC의 세포 융합이 끝난 후 300g에서 5분간 원심분리 하여 남아있는 HVJ-E protein을 제거한다. 융합세포는 mESC의 배양 배지 및 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간 동안 배양한다. 제조된 융합세포는 인간 염색체(lox66(제3 RRS) 및 loxm2/71(제4 RRS)가 삽입된 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 포함된 염색체) 및 마우스 염색체(loxm2/66(제1 RRS) 및 lox71(제2 RRS)가 삽입된 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 포함된 염색체)를 포함하는 mESC이다.
5. 염색체 교환에 의한 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 세포 제조
상기 제조된 융합세포에 재조합 효소를 처리하여 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역과 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 교환(또는 교체)을 유도하여 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 융합세포, 즉, mESC를 제조한다. 이때, 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 유래 가변 영역 및 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자의 불변 영역을 포한하는 유전자좌이다.
1×106 cells의 융합세포(mESC)에 FBS와 항생제가 들어가지 않은 opti-MEM배지 100μl를 첨가한다. 여기에 pCMV-Cre(System Biosciences, LLC, Palo Alto, CA, USA) 벡터 10μg을 첨가하여 125V, 5ms, 2 pulse로 transfection 한다. 2i배지 300μl 첨가하여 융합세포와 잘 섞고, 100mm dish로 이동시키고 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간동안 배양한다.
Cre 재조합효소가 처리된 융합세포에 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 염색체가 생성되었는지 확인하기 위해, Cre 재조합효소가 처리된 융합세포에 항생제(Puromycin, G418 및 네오마이신)를 처리한다. Cre 재조합효소가 처리된 융합세포는 Cre 재조합효소에 의해 인간 염색체(lox66(제3 RRS) 및 loxm2/71(제4 RRS)가 삽입된 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 포함된 염색체) 및 마우스 염색체(loxm2/66(제1 RRS) 및 lox71(제2 RRS)가 삽입된 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 포함된 염색체) 간의 재조합이 유도된다. 마우스 염색체 내에 제1 RRS와 인간 염색체 내에 제4 RRS가 서로 페어링하고, 마우스 염색체 내에 제2 RRS와 인간 염색체 내에 제3 RRS가 서로 페어링한다. 상기 RRS의 페어링을 Cre 재조합효소가 인지하여 재조합이 유도된다.
그 결과, 마우스 염색체의 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역으로 교체된 제1 재조합 염색체(인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 마우스 염색체) 및 인간 염색체의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역으로 교체된 제2 재조합 염색체가 생성된다. 상기 제1 재조합 염색체는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역을 제외한 나머지 부분은 마우스 유전자(예를 들어, 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 불변 영역은 마우스 유전자이다.)를 가진다. 상기 제2 재조합 염색체는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자의 가변 영역을 제외한 나머지 부분은 인간 유전자(예를 들어, 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 불변 영역은 인간 유전자이다.)를 가진다.
항생제(Puromycin, G418 및 네오마이신) 처리 후 생존한 세포(mESC)를 수득하였다. 수득한 세포는 제1 재조합 염색체 및 제2 재조합 염색체를 포함하는 mESC이다.
수득한 제1 재조합 염색체 및 제2 재조합 염색체를 포함하는 mESC에 piggyBac 트랜스포세이즈를 처리하여 제1 재조합 염색체 및 제2 재조합 염색체에 포함된 RRS, 퓨로ΔTK 유전자(puroΔTK gene), neomycin 저항성 유전자(NeoR), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 및 FRT를 제거한다. 이때, RRS, 퓨로ΔTK 유전자(puroΔTK gene), neomycin 저항성 유전자(NeoR), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 및 FRT가 제거된 재조합 염색체를 포함하는 세포는 Fialuridine (FIAU)를 처리하여 선별한다.
상기 재조합 염색체는 RRS의 위치, 방향, 페어링(pairing)에 따라 다양하게 재조합 될 수 있다. 목적하는 재조합 염색체의 생산을 위해서, 앞서 설명은 벡터의 설계를 변경함으로써 생산 가능하다.
6. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 mESC를 이용한 동형접합성 형질전환 마우스 제조
흑인 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 mESC를 이용해 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다.
상기에서 수득한 인간화 면역글로불린 유전자좌를 가지는 mESC는 배반포 주입(Blastocyst Injection)을 통해 포배에 이식하여 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 제작한다. 제작된 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)는 대리모의 자궁에 착상시켜 마우스 산자를 발생시킨다. 생산된 마우스 산자는 키메릭 형질전환 마우스이고, 키메릭 형질전환 마우스의 교배를 이용해 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 생산된 동형접합성 형질전환 마우스는 게놈 상에 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 인간화(흑인 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자의 가변 영역 치환(또는 교체))되어 있다. 이때, 상기 동형접합성 형질전환 마우스는 배반포 주입 외에도 다양한 방법으로 생산 가능하다.
실시예 1-2. 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 몽골인 인종에 속한 개체 유래의 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체)되어 인간화된 동형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다. 해당 실시예는 염색체 교환 기술(예를 들어, AiCE 기술(PCT 출원특허 PCT/KR2019/015351 참고))을 이용하여 몽골인 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다.
해당 방법은 앞서 기술한 ‘실시예 1-1. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법’과 동일하며, 다만, 실험에 사용된 인간세포는 몽골인 인종에 속하는 개체 유래의 인간 fibroblast인 OUMS-36 cell (JCRB1006.0, race는 Japanese임)이다. OUMS-36 cell은 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA) 및 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA)를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Corning, Mannasas, VA, USA)배지 및 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 증식 및 유지를 위해 배양한다.
실시예 1-3. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다.
앞서 제조된 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스와 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스의 교배를 통해 이형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 생산된 이형접합성 형질전환 마우스는 인간화 면역글로불린 유전자좌에 서로 다른 이형 대립 유전자, 즉, 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 형질전환 마우스이다.
실시예 1-4. 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역이 코카시아 인종에 속한 개체 유래의 인간 면역글로불린 유전자의 가변 영역으로 치환(또는 교체)되어 인간화된 동형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다. 해당 실시예는 염색체 교환 기술(예를 들어, AiCE 기술(PCT 출원특허 PCT/KR2019/015351 참고))을 이용하여 코카시아 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조한다.
해당 방법은 앞서 기술한 ‘실시예 1-1. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법’과 동일하며, 다만, 실험에 사용된 인간세포는 코카시아 인종에 속하는 개체 유래 인간 fibroblast인 BJ cell (ATCC® CRL-2522™, ethnicity는 white임)이다. BJ cell은 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA) 및 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA)를 포함하는 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC® 30-2003™) 배지 및 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 증식 및 유지를 위해 배양한다.
실시예 1-5. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다.
앞서 제조된 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스와 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스의 교배를 통해 이형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 생산된 이형접합성 형질전환 마우스는 인간화 면역글로불린 유전자좌에 서로 다른 이형 대립 유전자, 즉, 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 형질전환 마우스이다.
실시예 1-6. 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조 방법
본 실시예는 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스 제조에 관한 것이다.
앞서 제조된 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스와 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스의 교배를 통해 이형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 생산된 이형접합성 형질전환 마우스는 인간화 면역글로불린 유전자좌에 서로 다른 이형 대립 유전자, 즉, 몽골인(몽골리안, Mongoloid race) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 코카시아(코카서스, Caucasian) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 형질전환 마우스이다.
상기 실시예에 기술한 이형접합성 형질전환 동물 외에, 상기 실시예를 기초로 서로 다른 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스를 생산할 수 있다.
앞서 기술한 ‘실시예 1-1. 흑인(니그로, negro) 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스 제조 방법’을 이용하여 다양한 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조할 수 있다. 이는 실험에 사용된 인간세포에 따라 다양화할 수 있다. 실험에 사용된 인간세포는 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian) 또는 오스트레인리아 인종(Australoid race) 유래의 인간세포일 수 있으며, 이를 사용하여 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian) 또는 오스트레인리아 인종(Australoid race) 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 제조할 수 있다.
상기에서 제조된 서로 다른 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 동형접합성 형질전환 마우스를 교배하여 이형접합성 형질전환 마우스를 제조한다. 이렇게 제조된 마우스는 코카시아 인종×몽골인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스 (코카시아 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자 및 몽골인 인종 유래 인간화 면역글로불린 유전자를 가지는 이형접합성 형질전환 마우스), 코카시아 인종×니그로 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 코카시아 인종×말레이 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 코카시아 인종×폴리네시아인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 몽골인 인종×니그로 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 몽골인 인종×말레이 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 몽골인 인종×폴리네시아인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 니그로 인종×말레이 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스, 니그로 인종×리네시아인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스 또는 말레이 인종×폴리네시아인 인종 유래 이형접합성 형질전환 마우스일 수 있다. 또한, 기술한 인종 외에 다른 인종 유래 인간세포를 이용하는 경우에도 동일한 방법으로 이형접합성 형질전환 마우스를 제조할 수 있다.

Claims (18)

  1. 인간화 면역글로불린 유전자좌(humanized immunoglobulin loci)를 포함하는 게놈을 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물로,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자좌는 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 포함하며,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 유전자의 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region) 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 불변 영역(constant region)을 포함하며,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 서로 다른 이형 대립 유전자(hetero-alleles)로, 제1 인간화 면역글로불린 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 유전자를 포함하고,
    상기 제1 인간화 면역글로불린 유전자는 제1 인간 면역글로불린 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함하고, 상기 제2 인간화 면역글로불린 유전자는 제2 인간 면역글로불린 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함하며, 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변영역(hetero variable regions)이며,
    상기 제1 인간 면역글로불린 유전자는 제1 인종에 속한 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 유전자는 제2 인종에 속한 개체 유래이고,
    이때, 상기 제1 인종과 제2 인종은 서로 다르며, 상기 제1 인종 및 제2 인종은 코카시아 인종(또는 코카서스 인종(Caucasian, Caucasoid race)), 몽골인(또는 몽골리안(Mongolian, Mongoloid race)), 흑인(또는 니그로(Negro, Negroid)), 말레이 인종(Malay), 폴리네시아인(Polynesian), 오스트레인리아 인종(Australoid race)으로 구성된 군에서 각각 선택된 인종인,
    이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 재배열되지 않은 가변 영역은 하나 이상의 V 세그먼트, 하나 이상의 D 세그먼트 및 하나 이상의 J 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 카파 유전자 또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 재배열되지 않은 가변 영역은 하나 이상의 V 세그먼트 및 하나 이상의 J 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 이형 가변영역은 다음 중 하나 이상의 차이를 가지는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물:
    i) 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
    ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
    iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
    iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
    v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
  7. 제1항에 있어서,
    상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인간을 제외한 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 비인간-동물은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타, 침팬지, 원숭이, 닭 또는 메추리인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  10. 인간화 면역글로불린 유전자좌(humanized immunoglobulin loci)를 포함하는 게놈을 가지는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물로,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자좌는 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자(alleles)를 포함하며,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 유전자의 재배열되지 않은 가변 영역(unrearranged variable region) 및 비인간-동물 면역글로불린 유전자의 불변 영역(constant region)을 포함하며,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자는 서로 다른 이형 대립 유전자(hetero-alleles)로, 제1 인간화 면역글로불린 유전자 및 제2 인간화 면역글로불린 유전자를 포함하고,
    상기 제1 인간화 면역글로불린 유전자는 제1 인간 면역글로불린 유전자의 제1 재배열되지 않은 가변 영역을 포함하고, 상기 제2 인간화 면역글로불린 유전자는 제2 인간 면역글로불린 유전자의 제2 재배열되지 않은 가변 영역을 포함하며, 이때, 상기 제1 재배열되지 않은 가변 영역과 제2 재배열되지 않은 가변 영역은 이형 가변영역(hetero variable regions)이며,
    상기 제1 인간 면역글로불린 유전자는 제1 인간 개체 유래이며, 상기 제2 인간 면역글로불린 유전자는 제2 인간 개체 유래이고,
    이때, 상기 제1 인간 개체와 제2 인간 개체는 서로 다른 개체인,
    이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 재배열되지 않은 가변 영역은 하나 이상의 V 세그먼트, 하나 이상의 D 세그먼트 및 하나 이상의 J 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 인간화 면역글로불린 유전자는 인간화 면역글로불린 카파 유전자 또는 인간화 면역글로불린 람다 유전자인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 재배열되지 않은 가변 영역은 하나 이상의 V 세그먼트 및 하나 이상의 J 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 이형 가변영역은 다음 중 하나 이상의 차이를 가지는 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물:
    i) 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 동의 돌연변이(synonymous mutation) 또는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation);
    ii) V 세그먼트에 대한 대립 유전자 변이(allelic variation);
    iii) 세그먼트의 복제수 변이(copy number variation; CNV);
    iv) 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)의 복제수 변이(CNV); 및
    v) 8-75Kb 길이의 핵산 삭제, 삽입 또는 중복(duplication).
  16. 제10항에 있어서,
    상기 비인간-동물은 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(aves)인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 인간을 제외한 포유동물은 설치류(rodents), 유제류(ungulates) 또는 인간을 제외한 영장류(non-human primates)인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 비인간-동물은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 소, 돼지, 낙타, 침팬지, 원숭이, 닭 또는 메추리인 것을 특징으로 하는 이형접합성(heterozygous) 형질전환 비인간-동물.
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