WO2012115454A2 - 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법 - Google Patents

뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention provides a reporter construct and method for identifying, selecting, or enriching a cell in which a specific nucleotide sequence is cleaved in a cell by a specific nuclease or in which the nucleotide sequence is modified by the cleavage, and a host comprising the reporter construct.
  • Cell and a monitoring system of nuclease activity.
  • TAL-effector nucleases are endogenous in cells and organisms. Gene mutations, insertion of target genes, and chromosomal rearrangements can lead to a powerful and versatile tool in genetic engineering, which can be useful in research, biotechnology, and medicine.
  • Such artificial nucleases recognize specific target nucleotide sequences in cells and cause DNA double strand breaks (DSBs). Induced intracellular DSB can be repaired by two intrinsic DNA repair mechanisms of cells, distinguished by homologous recombination (HR) and nonhomologous end joining (NHEJ), wherein target specific mutations and Genetic modifications will occur.
  • HR homologous recombination
  • NHEJ nonhomologous end joining
  • DSBs induced by nucleases can be restored to NHEJ mechanisms superior to HR. Mutations by HR are caused by the exact copy of the sequence in the HR donor DNA, but mutations by NHEJ occur randomly. Because NHEJ is an error-prone repair mechanism, small insertion / deletion (indel mutations) can occur at the site where the DSB occurs, which can lead to frame-shift mutations. Cause genetic variation.
  • zinc-finger nucleases and TAL-effector nucleases are very useful tools for designing genetic modifications in eukaryotic cells and organisms, they are generally mutations that are induced by artificial nucleases and have genetic modifications. Phenotypic differentiation between cells and wild-type cells is very difficult, and there are many limitations in separating only mutant cells.
  • transgenic cells which can be usefully used for mass production of human useful proteins and treatment of intractable diseases.
  • transgenic animals such as pigs or cows
  • the method of directly injecting ZFN mRNA into fertilized eggs in the pronuclear stage is extremely inefficient due to the mosaic phenomenon that occurs during fertilization. Therefore, a replication technique by nuclear transfer, which mainly provides transformed cells produced by ZFN to a donor nucleus, is used. In this case, mass production of transformed cells is required.
  • a plasmid containing ZFN DNA is introduced into the cells, and efficient screening of transformed cells whose genes are mutated by the operation of ZFN is required.
  • the inventors have prepared a reporter construct comprising a target sequence and a reporter gene recognized by a particular nuclease, introducing it into a cell capable of expressing the nuclease, and then expressing it with a cell expressing the reporter gene.
  • the nuclease cleaves a specific nucleotide sequence in the cell in the population of cells expressing the reporter gene compared to the population of cells which do not express the reporter gene.
  • the method has been completed to significantly enrich the cells in which the nucleotide sequence has been modified by the nuclease of the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a reporter construct for identifying, selecting, or enriching a cell in which a specific nucleotide sequence is cleaved in a cell by a specific nuclease or in which the nucleotide sequence is modified by the cleavage.
  • Still another object of the present invention is to provide a reporter construct comprising a first reporter gene, a target sequence recognized by the nuclease, a second reporter gene, and a third reporter gene.
  • Still another object of the present invention is to provide a host cell comprising the reporter construct.
  • Another object of the present invention is to provide a system for monitoring nuclease activity.
  • the reporter system of the present invention and a method for concentrating cells that are genomically modified by nucleases using the same, can obtain a cell population in which a high percentage of cells mutated by nucleases can be obtained, and the mutant cells in a living state. As the population can be obtained, it can be usefully used in the field of gene or cell therapy.
  • ZFN zinc finger nuclease
  • FIG. 3 is a schematic of the structure of the reporter construct and a method of enriching gene-modified cells using the reporter construct.
  • (a) shows the structure of the reporter construct, wherein the reporter construct was composed of the mRFP gene, the target sequence of the artificial nuclease, and the eGFP gene.
  • (b) is a diagram of a method of classifying and analyzing cells using flow cytometry, on day 3 or 4 after transfection of cells with reporter plasmids and plasmids encoding nucleases.
  • FIG 4 is a schematic of the structure of the SSA reporter and the method of concentrating the genetically modified cells using the reporter system.
  • the nuclease target site is inserted between N-GFP and C-GFP, and the dark portion is a partially cloned portion.
  • (b) illustrates the structure of the HR reporter and a method for amplifying gene-modified cells using the reporter system. Nuclease target sites were inserted inside the eGFP to form inactivated recombinant recipients. The truncated inactivated eGFP gene was used as the HR provider. DSBs generated by nucleases are repaired by HR, allowing the eGFP gene to function.
  • FIG. 5 shows the expression pattern of RFP and GFP using fluorescence microscopy after co-transfection of the plasmid encoding the reporter plasmid and ZFN pair into HEK293 cells. Expression measurements were taken on day 1, day 2 and day 3 after co-transfection and the scale bar was 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 shows that surrogate reporters can significantly enrich TP53 gene-mutated cells.
  • (a) is the result of flow cytometry performed 3 days after co-transfection of TP53 -target ZFN and reporter to HEK293 cells.
  • (b) shows ZFN-induced mutations detected by T7E1 assay. The arrow is sensitive to mismatches indicating the location of the DNA band cleaved by T7E1. The numbers in the bottom of the gel represent the frequency of mutations measured on the basis of band intensity.
  • (c) shows the ZFN-induced mutation rate measured by fPCR. Arrows indicate amplified DNA peaks, corresponding to small base insertions, and peaks marked higher correspond to amplified products of the wild type. Mutations were calculated by measuring the peak area.
  • (d) shows the sequence of the TP53 gene which is the target of ZFN. ZFN recognition sites are underlined. The dash indicates a deleted base and the small bold indicates the inserted base. The number of mutations is indicated in parentheses, and the mutation frequency was calculated by dividing the number of mutated copies by the total number of copies (WT: wild type sequence).
  • FIG. 7 shows significant enrichment of CCR5 gene-modified cells by ZFN-224 using a surrogate reporter.
  • (a) shows the flow cytometry results of the transfected cells
  • (b) is the result of performing the T7E1 assay using genomic DNA isolated from cells classified as flow cytometry. Arrows indicate the expected positions of the DNA bands cleaved by T7E1.
  • (c) shows the result of performing fPCR to determine the efficiency of indel mutation formation in the CCR5 gene. Arrows indicate amplified DNA peaks corresponding to small insertions.
  • FIG. 9 shows significant enrichment of CCR5 gene-modified cells by TALEN, using a surrogate reporter.
  • (a) shows the result of flow cytometry of the transfected HEK293 cells
  • (b) shows the result of T7E1 assay using genomic DNA isolated from cells classified as flow cytometry. Arrows indicate amplicons cleaved by T7E1 and relative band density indicates TALEN activity.
  • Figure 10 shows the remarkable enrichment of mouse cells modified with Thumpd3 gene using surrogate reporters.
  • Mouse fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells were co-transfected with a plasmid encoding a reporter plasmid and a ZFN pair targeting the Thumpd3 gene, followed by analysis.
  • (a) shows the flow cytometry results of the transfected cells
  • (b) is the result of performing the T7E1 assay using genomic DNA isolated from cells classified as flow cytometry. Arrows indicate amplicons cleaved by T7E1 and relative band density indicates the activity of ZFN.
  • FIG. 11 shows the results of replication analysis of single cells and cell populations (colonies).
  • (a) co-transfected a reporter plasmid and a plasmid encoding a ZFN pair targeting a Thumpd3 gene to mouse fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells, and then sorted the cells by flow cytometry, Single cells were isolated using pipettes and transferred to PCR tubes. The PCR products of 21 unclassified cells and 10 sorted cells were cloned and sequenced.
  • 1a and 1b show the DNA sequences obtained from the allele mutations in a single clone.
  • (b) shows the results of analysis of the replication population of cells.
  • Figure 13 shows that the concentration of cells with modified genes was increased when co-transfection and cell sorting process was repeated. After co-transfection of the reporter plasmid and the plasmid encoding ZFN into the cells, the cell sorting was performed twice by flow cytometry, confirming that the CCR5 gene significantly increased the concentration of modified mutant cells.
  • FIG. 14 depicts a method for enriching target gene-modified cells using magnetic-activated cell sorting (MACS).
  • (a) shows the structure of a reporter consisting of mRFP gene, target sequence of artificial nuclease, 2A-peptide sequence and mouse MHC class I molecule H-2K k gene.
  • (b) 3 or 4 days after transfection with a reporter plasmid and a plasmid encoding a nuclease, the cells are labeled with H-2K k -specific magnetic beads and magnetically separated on a MACS column It is shown.
  • Figure 15 shows the results of sorting and enriching CCR5 gene-modified cells by ZFN-224 using the reporter and MACS. After transfecting the cells with the reporter plasmid and the plasmid encoding the ZFN, the process of sorting the self-bead selected cells by MACS was repeated twice, showing the results of the T7E1 analysis.
  • FIG. 16 shows the DNA sequence of A TALEN dual frame reporter constructs. Underlined and bolded portions are target sequences recognized by nucleases.
  • Figure 17 shows the DNA sequence of the B TALEN dual frame reporter construct. Underlined and bolded portions are target sequences recognized by nucleases.
  • FIG. 18 shows the structure of the dual frame NHEJ reporter construct and a schematic diagram of the operation of the construct.
  • 19 is a result of measuring whether the prime change in two cases can be detected using a dual frame NHEJ reporter component and a single frame reporter component.
  • Figure 20 shows the structure of the reporter constructs for the selection of hygromycin and a schematic of the action of the reporter constructs.
  • Figure 21 shows the overall schematic for the development of the transformed cell line using the hygromycin reporter screening method.
  • Figure 22 shows the degree of RFP and GFP expression of cells in the non-hygromycin treated group, and the hygromycin treated group before the hygromycin treatment.
  • Figure 23 shows the results of analysis of the percentage of transformed cells in the cells selected by treatment with hygromycin by the T7E1 method.
  • Figure 24 shows the nucleotide sequence of the reporter structure containing mRFP-GFP-H2KK.
  • the target sequence of CMAH-ZFN is located after the mRFP gene, and the eGFP gene, 2A peptide, and H2KK gene are located out of frame.
  • the mRFP-eGFP fusion protein and the H2KK protein were separately expressed by 2A-peptide (see the target sequence of CMAH-ZFN and the sequence of 2A-peptide).
  • CMAH-ZFN is located behind the mRFP gene and 2A peptide, HTP gene, and eGFP gene are located out of frame. 2A-peptide was used to separately express mRFP protein and HTP-eGFP protein. (The target sequence of CMAH-ZFN and the sequence of 2A-peptide are shown in the figure.)
  • a method of selecting or enriching a cell in which a specific nucleotide sequence is cleaved in a cell by a specific nuclease or in which the nucleotide sequence is modified by the cleavage is provided.
  • a reporter construct comprising a reporter gene and a target sequence recognized by the nuclease, wherein the reporter construct is dependent on whether the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct.
  • a second aspect of the present invention is a reporter construct for identifying, selecting or enriching a cell in which a specific nucleotide sequence is cleaved in a cell by a specific nuclease or in which the nucleotide sequence is modified by the cleavage.
  • a third aspect of the invention is a reporter construct comprising a first reporter gene, a target sequence recognized by the nuclease, a second reporter gene, and a third reporter gene,
  • the first reporter gene is expressed regardless of whether the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct
  • the reporter construct is determined whether the expression of the second reporter gene, the third reporter gene, or both is determined depending on whether the nuclease expressed in the cell binds to the target sequence and cleaves the reporter construct.
  • a fourth aspect of the invention relates to a host cell comprising the reporter construct.
  • a fifth aspect of the invention relates to a reporter construct; Host cell; A system for monitoring nuclease activity, comprising constructs expressing nucleases,
  • the reporter construct, the nuclease expression construct or both relates to a system that is introduced into the host cell or is provided separately from the cell.
  • Nucleases capable of cleaving nucleotides of endogenous genes in cells and organisms can be useful for designing genetic modifications, but systems that amplify and isolate only cells whose genes have been modified by nucleases can be used. It did not exist, and there was a limit to its use.
  • the present invention provides a method for selecting or enriching a cell in which a specific nucleotide sequence in a cell is cleaved by a specific nuclease or in which the nucleotide sequence is modified by the cleavage.
  • the specific nucleotide sequence in the cell may be an endogenous nucleotide sequence present on the genome.
  • Specific nucleases can cleave specific nucleotide sequences by binding to endogenous target sequences present on the genome.
  • the mutations include, but are not limited to, local mutations, as well as mutations such as chromosomal rearrangements such as deletions, insertions, inversions, duplications, translocations, and the like. It doesn't happen.
  • preparing a reporter construct comprising a target sequence recognized by the nuclease and a reporter gene, wherein the reporter construct is dependent on whether the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct.
  • a first step of determining whether the reporter gene is expressed Introducing the reporter construct into a candidate cell, wherein some or all of the candidate cells express the nuclease before or after introduction of the reporter construct; And a third step of classifying a cell expressing the reporter gene or a cell not expressing the reporter gene from the candidate cell resulting from the second step.
  • the method of the present invention is characterized by using a reporter construct.
  • the reporter construct may include a target sequence recognized by a nuclease and a reporter gene, and may be designed to determine whether the reporter gene is expressed depending on whether the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct. have.
  • the reporter construct is that the target sequence recognized by the nuclease is inserted in the middle or in front of the reporter gene, nuclease expressed in the cell is bound to the target sequence reporter construct
  • cleavage of the reporter gene can be designed to determine whether or not.
  • the reporter gene is not expressed unless the nuclease binds to the target sequence to cleave the reporter construct, but when the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct, the cleaved DNA is present in the cell or in vivo. It may be recovered by homologous recombination (HR) or single strand annealing (SSA) mechanism or NHEJ to allow the reporter gene to be expressed.
  • HR homologous recombination
  • SSA single strand annealing
  • the reporter construct of the present invention may be designed such that when a specific target sequence is cleaved by nucleases, the reporter gene is expressed by homologous recombination or single stranded polymerization.
  • the reporter construct according to one embodiment of the present invention is a target sequence recognized by a specific nuclease between GFP such that the C-terminal region of GFP is outside the translation frame of the N-terminal region of GFP.
  • a double strand break DSB
  • the DSB of the gene may be recovered by a single strand polymerization system to express GFP.
  • the reporter construct of the present invention may be designed such that when specific target sequences are cleaved by nucleases, small size insertion / deletion occurs by NHEJ mechanisms to generate frame shift mutations of the reporter construct.
  • Reporter constructs by homologous recombination or single-stranded polymerization mechanisms can express reporter proteins when nucleases act regardless of frame shift, but they have the problem that spontaneous mutations occur even without nucleases. That is, even without the activity of nucleases, reporter genes are expressed in about 1-5% of cells, and thus, cells that are genetically modified by nucleases cannot be accurately selected.
  • the reporter construct according to an embodiment of the present invention is a reporter construct that can be used for the NHEJ mechanism, and the reporter is expressed only in cells of 1% or less or 0.1% or less without nuclease, so that the gene is modified by nuclease. Accumulated cells can be accurately selected and concentrated.
  • the reporter construct may include a first reporter gene, a target sequence recognized by the nuclease, and a second reporter gene, which is expressed in the cell It may be designed to determine whether the second reporter gene is expressed depending on whether clease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct.
  • a stop codon may be inserted upstream of the second reporter gene. More specifically, a target sequence recognized by the nuclease is inserted between the first reporter gene and the second reporter gene, and the second reporter gene is out of frame of the translation of the first reporter gene. Reporter constructs designed to exist may be used.
  • Nonhomologous end joining (NHEJ) mechanisms can result in small insertion / deletion (indel mutations) resulting in frame-shift mutations, in which the first reporter gene and the second reporter gene are in the same frame. (in frame) can be placed. That is, both the first reporter gene and the second reporter gene may be expressed.
  • NHEJ Nonhomologous end joining
  • the reporter construct comprises a first reporter gene, a target sequence recognized by the nuclease, a second reporter gene, and a third reporter gene, in sequence 1
  • the reporter gene is expressed regardless of whether the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct, and depending on whether the nuclease expressed in the cell binds to the target sequence and cleaves the reporter construct It may be designed to determine whether the second reporter gene, the third reporter gene or both are expressed.
  • the second reporter gene and the third reporter gene are out of frame with the translation of the first reporter gene, so that the nuclease binds to a specific target sequence and cleaves the reporter construct so that a frame shift mutation occurs. It is preferred to be designed to be expressed.
  • the second reporter gene and the third reporter gene may be linked to each other in a wrong translation frame.
  • an amino acid codon frame change occurs to express the second reporter gene or the third reporter gene. Therefore, mutant cells generated by all two frame shifts generated by nuclease cleavage of the target site can be selected at a time. That is, frame shift mutated cells can be selected according to fluctuations in one unit of amino acid sequence and two units of amino acid sequence by nuclease activity. It is also possible to select frame shift mutated cells resulting from variations in the three unit amino acid sequence due to the introduction of one or two or more reporter constructs into the cell.
  • the reporter construct when the reporter construct includes only the first reporter gene and the second reporter gene in which the amino acid codon frame is not matched, selection is possible only for cells in which one frame shift mutation occurs, but the first reporter gene and A reporter construct prepared by placing a second reporter gene and a third reporter gene that did not fit the amino acid codon frame in different frames was able to select cells in which all two frame shift mutations occurred.
  • the second reporter gene and the third reporter gene in the reporter construct may be connected to the same translation frame.
  • the second reporter gene and the third reporter gene may be the same kind of reporter genes, or may be different kinds of reporter genes.
  • the expression of the reporter gene becomes stronger as the nuclease cleaves the target sequence, thereby causing the nuclease to be expressed.
  • Cells in which the gene has been modified can be selected or concentrated more accurately.
  • the second reporter gene and the third reporter gene are in the same frame and different reporter genes, the second reporter gene is expressed by MACS, drug selection, and then, the second reporter gene is used to confirm that the mutated cells are properly concentrated. Expression of the reporter gene can be used.
  • a reporter construct comprising: a first reporter gene encoding a red fluorescent protein (RFP), which is expressed regardless of the activity of a nuclease; Target sequences recognized by the nuclease; A second reporter gene of an antibiotic resistance gene (HPT) and a third reporter gene encoding a green fluorescent protein (GFP), which was constructed such that the first reporter gene and the translation frame did not fit, were prepared.
  • the reporter construct only expressed red fluorescent protein in the absence of ZFN and did not express HPT-GFP fusion protein.
  • expression of the reporter gene may reflect the activity of the nuclease, in which a particular nuclease can bind to an endogenous target sequence present on its genome and cleave a specific nucleotide sequence.
  • the method of the present invention is characterized in that it comprises the step of introducing the reporter construct to the candidate cells, and sorting cells expressing and non-expressing the reporter gene.
  • the candidate cells may express the nuclease before or after introduction of the reporter construct.
  • the nuclease expressed in the second step also includes a case where the nuclease is directly injected into the cell.
  • the nuclease may be one expressed from an exogenous nuclease gene or an endogenous nuclease gene of the candidate cell.
  • nuclease may be introduced from the outside through transformation, electorporation, virus delivery, or may be expressed in a state in which a gene specifying the same is inserted into an intracellular genome.
  • the reporter construct may be introduced into one or more than two cells.
  • the classification method can be used without limitation, if it can classify cells expressing the reporter gene and cells not expressing.
  • cells can be sorted using Fluorescence-activated cell sorting (FACS), or magnetic-activated cell sorting (MACS).
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • MCS magnetic-activated cell sorting
  • an antibiotic resistance gene can be used as a reporter and antibiotic treatment can be used to select cells that survive and enrich the endogenous gene.
  • a reporter construct that includes a first reporter gene, a target sequence recognized by a specific nuclease, and a second reporter gene
  • cells and both expressing the first reporter gene and the second reporter gene may be used.
  • the cells expressing only one reporter gene, the first reporter gene, and the second reporter gene can be classified into cells that do not express both.
  • a reporter construct that includes a first reporter gene, a target sequence recognized by a specific nuclease, a second reporter gene, and a third reporter
  • the first reporter gene the second reporter gene
  • cells expressing only the third reporter gene cells expressing only the first reporter gene, cells expressing only the first and second reporter genes, and cells expressing only the first and third reporter genes.
  • a cell population that expresses a reporter gene when using a reporter construct including two reporter genes, a first reporter gene and a second reporter gene Cell population in which all are expressed, it was confirmed that a specific nuclease cleaved a specific nucleotide sequence or the cleavage significantly increased the proportion of cells in which the nucleotide sequence was modified.
  • the second to third steps may be performed two or more times, and in one embodiment of the present invention, when the second to third steps are performed two times, one time is performed. It was confirmed that the number of genetically modified cells in the cell population increased significantly.
  • the present invention also includes a method of confirming the activity of a specific nuclease by performing the first to third steps.
  • a nuclease When a nuclease is expressed in a candidate cell into which the reporter construct is introduced to cut a target sequence included in the reporter gene, the reporter gene may be expressed. Therefore, whether or not the expression of the reporter gene, it can be confirmed whether the nuclease has the activity of cleaving the sequence of a specific nucleotide.
  • the present invention provides a reporter construct for identifying, selecting, or enriching a cell in which a particular nucleotide sequence in a cell is cleaved by a specific nuclease or in which the nucleotide sequence has been modified by the cleavage.
  • the construct comprises a first reporter gene, a target sequence recognized by the nuclease, and a second reporter gene, wherein the nuclease binds to the target sequence to cleave the reporter construct 2 Reporter gene expression is characterized in that it is determined.
  • the first reporter gene, the target sequence recognized by the nuclease, and the second reporter gene may be included sequentially.
  • the reporter construct is characterized in that when a specific nuclease cleaves a specific nucleotide sequence contained in the reporter construct, the truncated DNA is homologous recombination (HR) or nonhomologous end junction (HHR) that is likely to cause frame-shift mutation.
  • HR homologous recombination
  • HHR nonhomologous end junction
  • NHEJ Nonhomologous end joining
  • the construct may include a first reporter gene, a target sequence recognized by the nuclease, a second reporter gene, and a third reporter gene, wherein the first reporter gene includes the nuclease on the target sequence.
  • the construct may sequentially include a first reporter gene, a target sequence recognized by the nuclease, a second reporter gene, and a third reporter gene.
  • the second reporter gene and the third reporter gene are connected to the frame of the first reporter gene, and the second reporter gene and the third reporter gene are not matched to each other. It may be connected to.
  • Expression of the reporter gene reflects the activity of a nuclease that allows a specific nuclease to bind to its target sequence and cleave a specific nucleotide sequence, wherein the reporter construct has the activity of the nuclease resulting in cleavage of a specific nucleotide sequence in the cell or Or for identifying, selecting, or concentrating cells in which the nucleotide sequence has been modified by the cleavage.
  • the reporter construct may be a vector, preferably a plasmid.
  • the present invention provides a reporter construct for identifying, selecting, or enriching a cell in which a specific nucleotide sequence is cleaved in a cell by the specific nuclease of the present invention or in which the nucleotide sequence is modified by the cleavage.
  • a host cell comprising two or more.
  • the host cell may be used as a cell that reflects whether a specific nuclease has an activity of binding to a target sequence and cleaving a specific nucleotide.
  • the present invention provides a reporter construct for identifying, selecting, or enriching a cell in which a specific nucleotide sequence is cleaved in a cell by the specific nuclease of the present invention or in which the nucleotide sequence is modified by the cleavage. Or two or more; Host cell; Provided are systems for monitoring nuclease activity, including constructs that express nucleases.
  • the reporter construct, the nuclease expression construct or both may be introduced into the host cell or provided separately from the cell.
  • the nuclease may be one expressed from an exogenous nuclease gene or an endogenous nuclease gene of an exogenous host cell.
  • the nuclease may be introduced from the outside through transformation, electorporation, virus delivery, or may be expressed in a state in which a gene designating the same is inserted into an intracellular genome.
  • nucleases and reporter constructs may be introduced into the cell simultaneously or sequentially.
  • cutting may be disruption of the covalent backbone of a DNA molecule. Cleavage can be initiated in a variety of ways, including but not limited to enzymatic or chemical hydrolysis of phosphodiester bonds. Single stranded and double stranded cuts are possible, and double stranded cuts can occur as a result of two separate single stranded cuts.
  • Binding can be a sequence-specific, non-covalent interaction between macromolecules (eg, between a protein and a nucleic acid). If the interaction is entirely sequence-specific, not all components of the binding interaction need to be sequence specific (eg, contact with phosphate residues in the DNA backbone). Such interactions may generally be characterized by dissociation constants (Kd) of 10 ⁇ 6 M ⁇ 1 or less.
  • target site or “target sequence” can be a nucleic acid sequence that defines the portion of the nucleic acid to which the binding molecule is bound, provided that sufficient conditions exist for the binding to be present. It can be used interchangeably with “recognition site” or “recognition sequence”.
  • the "gene” is a molecular unit that can be inherited in a living organism, which generally includes DNA, RNA or even proteins encoded by them.
  • An “episome” can be any structure that includes a nucleic acid that is replicating, a nucleoprotein complex, or a nucleic acid that is not part of the chromosomal karyotype of a cell. Examples of episomes include plasmids and certain viral genomes.
  • exogenous molecule is a molecule that is not normally present in a cell but can be introduced into the cell by one or more genetic, biochemical or other methods. "Normal presence in a cell" is determined by the particular stage of development and environmental conditions of the cell. Thus, for example, molecules that exist only during embryonic development of muscle become exogenous molecules for adult muscle cells.
  • An exogenous molecule is a small molecule produced by a combinatorial chemical process or any comprising protein, nucleic acid, carbohydrate, lipid, glycoprotein, lipid protein, polysaccharide, any modified derivative of the molecules, or one or more of the molecules. It may be a macromolecule such as a complex of.
  • an “endogenous” or “endogenous” molecule is one that normally exists within a particular cell at a particular stage of development under certain environmental conditions.
  • endogenous nucleic acids may include genomic or naturally-occurring episome nucleic acids of mitochondria, chloroplasts or other organs. Additional endogenous molecules may include proteins such as, for example, transcription factors and enzymes.
  • a “vector” can be a nucleic acid molecule capable of carrying other nucleic acid to which it is linked.
  • examples of such vectors include, but are not limited to, plasmids, cosmids, bacteriophage, and viral vectors.
  • plasmid refers to a circular double stranded DNA loop that can additionally connect DNA fragments therein.
  • the vector of the present invention can direct the expression of a gene encoding a protein of interest linked operably, such a vector is referred to as an "expression vector.”
  • expression vectors can be prepared in a variety of ways, including secretion signal sequences in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers.
  • the expression vector is in the form of a plasmid.
  • plasmid and vector are terms that mean plasmid, which are interchangeable with each other, and are most commonly used in the form of a vector.
  • operable linkage and “operably linked or operatively linked” are compatible for juxtaposition of two or more components (sequence elements), wherein the components are functional in the component, wherein the components are in one of the components. Functions exerted are arranged in a state that allows the possibility of adjusting at least one of the components.
  • recombinant refers to a cell, nucleic acid, protein or vector modified by introduction of heterologous nucleic acid or protein, or alteration of a natural nucleic acid or protein, or a cell derived from a cell so modified.
  • Zinc finger nuclease means a fusion protein comprising a zinc finger domain and a nucleotide cleavage domain, and may include both known or commercially available zinc finger nucleases.
  • zinc finger nuclease and “ZFN” may be used interchangeably.
  • reporter gene is a gene that produces a protein product that is easily measured in analytical methods commonly used in the art, and the type of gene is not limited as long as the gene can easily measure the position or expression in a cell, animal or plant. .
  • the method of identifying or enriching a cell in which a specific nucleotide sequence in a cell is cleaved by the specific nuclease of the present invention or in which the nucleotide sequence has been modified by the cleavage, and a system for monitoring nuclease activity are determined by a specific nuclease It is characterized by using a reporter construct comprising a target sequence recognized and a reporter gene.
  • the reporter construct may be designed such that expression of the reporter gene is determined depending on whether a specific nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct.
  • the reporter construct may include a reporter gene that is not expressed because the translation frame does not fit.
  • the target sequence recognized by the nuclease is inserted in the middle or in front of the reporter gene, when the nuclease expressed in the cell binds to the target sequence to cleave the reporter construct It may be designed to determine whether the reporter gene is expressed.
  • a first reporter gene, a target sequence recognized by the nuclease, and a second reporter gene are sequentially included, wherein the nuclease expressed in the cell binds to the target sequence and cleaves the reporter construct.
  • it may be designed to determine whether the second reporter gene is expressed.
  • a stop codon may be inserted upstream of the second reporter gene.
  • a first reporter gene a target sequence recognized by the nuclease, a second reporter gene, and a third reporter gene, wherein the first reporter gene is linked to the target sequence by the nuclease.
  • Expression of the second reporter gene, the third reporter gene, or both is expressed regardless of whether the reporter construct is cleaved and whether or not the nuclease expressed in the cell binds to the target sequence and cleaves the reporter construct. Can be determined.
  • the second reporter gene and the third reporter gene may be ones in which a translation frame is not matched with the first reporter gene, and the second reporter gene and the third reporter gene are connected to each other so that a translation frame does not match each other, or the same frame. It may be connected to.
  • One or more target sites of the nuclease (s) to be screened can be inserted into the reporter construct by any suitable method, including commercial cloning systems such as PCR or TOPO and / or Gateway cloning systems.
  • the 5 'region of the reporter gene can be operably linked to a constitutive or inducible promoter.
  • the reporter gene included in the reporter construct may be a gene encoding a color protein.
  • the color protein may be a fluorescent protein or a light emitting protein, but is not limited thereto.
  • the fluorescent protein is Green Fluorescent Protein (GFP), Red Fluorescent Protein (RFP), Yellow Fluorescent Protein (YFP), Cyan Fluorescent Protein (CFP), and Orange Fluorescent protein (Orange Fluorescent Protein, OFP) may be any one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the green fluorescent protein may be enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) or Emerald GFP.
  • the yellow fluorescent protein may be any one protein selected from the group consisting of Venus, mCitrine, YPet, and eYFP.
  • the cyan fluorescent protein may be any one protein selected from the group consisting of CyPet, mCFPm, and Cerulean.
  • the orange fluorescent protein may be mOrange or mKO protein.
  • the red fluorescent protein may be any one selected from the group consisting of monomeric red fluorescent protein (mRFP), mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, and DsRed.
  • the light emitting protein may be any one selected from the group consisting of luminescent firefly luciferase, Renilla luciferase, and Gaussia luciferase.
  • the luminescent protein of the present invention is not limited thereto.
  • the reporter gene of the present invention is a beta-galactosidase ( ⁇ -galactosidase), beta-lactamase ( ⁇ -lactamase), TEV-protease (TEV-protease), and dihydrofolate reductase (Dihydrofolate reductase) It may be a gene encoding any one protein selected from the group consisting of.
  • reporter gene of the present invention may be a selection marker or a surface marker gene.
  • reporter gene of the present invention may be an antibiotic resistance gene.
  • the reporter constructs of the present invention comprise reporter genes that are not expressed due to mismatched translation frames.
  • a target sequence recognized by a particular nuclease is inserted between GFP such that the C-terminal portion of GFP is outside the translation frame of the N-terminal portion of GFP.
  • the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct, a double strand break (DSB) is induced, but the DSB of the gene may be recovered by a single strand polymerization system to express GFP.
  • DSB double strand break
  • a reporter construct sequentially comprising a first reporter gene encoding a red fluorescent protein, a target sequence recognized by a specific nuclease, and a second reporter gene encoding a green fluorescent protein was used.
  • the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct to induce DSB, it is repaired by NHEJ, which frequently causes frame shift mutations, increasing the probability of expression of both red and green fluorescent proteins.
  • the reporter gene When the reporter gene is used as a gene encoding a fluorescent protein, it is preferable that the first reporter gene and the second reporter gene can be easily distinguished from the expression of the reporter gene by using a gene expressing different fluorescent colors.
  • an MHC class I molecule that is a first reporter gene encoding a fluorescent protein, a target sequence recognized by a specific nuclease, and a surface marker of a gene and a cell encoding a 2A-peptide Reporter constructs consisting of the H-2K k gene were used.
  • the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct to induce DSB, it is repaired by NHEJ, which frequently causes frame shift mutations, resulting in expression of fluorescent proteins as well as 2A-peptide and H-2K k . .
  • an agent encoding a green fluorescent protein encoding a red fluorescent protein, a target sequence recognized by a specific nuclease, and a translation frame mismatched with the first reporter gene A reporter construct consisting of two reporter genes and a third reporter gene was used.
  • the reporter construct may be repaired by NHEJ, which frequently causes frame shift mutations, to express a second fluorescent protein or a third fluorescent protein when the nuclease binds to the target sequence and cleaves the reporter construct to induce DSB.
  • the reporter gene encoding a red fluorescent protein (RFP), which is expressed regardless of the activity of the nuclease; Target sequences recognized by the nuclease; A second reporter gene of an antibiotic resistance gene (HPT) and a third reporter gene encoding a green fluorescent protein (GFP), which was constructed such that the first reporter gene and the translation frame did not fit, were prepared.
  • RFP red fluorescent protein
  • HPT antibiotic resistance gene
  • GFP green fluorescent protein
  • FACS fluorescent active cell sorting
  • MACS relates to a method of classifying cells using magnetic nanoparticles coated with antibodies to specific antigens on the cell surface.
  • a construct using a construct in which a mRFP gene, a target sequence recognized by a specific nuclease, a 2A-peptide sequence and a mouse MHC class I molecule H-2K k gene is used as a reporter construct
  • the cells were labeled with H-2K k -specific magnetic beads and magnetically separated on a MACS column to sort a cell population with a high proportion of cells in which a specific nucleotide sequence was modified by the nuclease.
  • the MACS method does not classify cells using a laser, the cells are not damaged in the process of classifying the cells, so that the mutated cells in which the target gene is modified can be more efficiently sorted and concentrated.
  • the nuclease is a target specific nuclease
  • the target specific nuclease may be a nuclease capable of recognizing and cleaving a specific position of DNA on the genome.
  • the nuclease may include a nuclease fused with a domain that recognizes a specific target sequence on the genome and a cleavage domain.
  • meganuclease a plant pathogenic gene that is a domain that recognizes a specific target sequence on the genome.
  • a fusion protein fused with a TAL activator-like effector domain and a cleavage domain derived therefrom, or zinc-finger nuclease may be included without limitation.
  • the nuclease may be a meganuclease.
  • Naturally-occurring meganucleases recognize 15-40 base pair cleavage sites, which are generally classified into four families: LAGLIDADG family, GIY-YIG family, His-Cyst box family, and HNH family.
  • Exemplary meganucleases include I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI , I-TevI, I-TevII and I-TevIII.
  • the nuclease may be zinc-finger nuclease (ZFN).
  • ZFNs include zinc-finger proteins engineered to bind selected genes and target sites within the cleavage domain or cleavage half-domain.
  • the zinc-finger binding domain can be engineered to bind to the selected sequence.
  • Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan et al, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol.
  • Manipulation methods include, but are not limited to, rational design and various types of selection. Rational design includes, for example, the use of a database comprising triple (or quadruple) nucleotide sequences, and individual zinc finger amino acid sequences, wherein each triple or quadruple nucleotide sequence is composed of a zinc finger that binds to a particular triple or quadruple sequence. Is associated with one or more sequences.
  • fusion proteins and polynucleotides encoding them are known to those skilled in the art and are described in detail in US Patent Application Publications 2005/0064474 and 2006/0188987, which are incorporated by reference in their entirety.
  • zinc finger domains and / or multi-finger zinc finger proteins may be linked together by a linker comprising any suitable linker sequence, eg, a linker of 5 or more amino acids in length. have. Examples of linker sequences of six or more amino acids in length are described in US Pat. No. 6,479,626; 6,903,185; See 7,153,949.
  • the proteins described herein can include any combination of linkers that are appropriate between each zinc finger of the protein.
  • nucleases such as ZFNs and / or meganucleases include nucleases (cleaving domains, cleavage half-domains).
  • cleavage domains are heterologous to DNA binding domains, such as, for example, zinc finger DNA binding domains and cleavage domains from one nuclease or cleavage domains from nucleases different from meganuclease DNA binding domains.
  • Heterologous cleavage domains can be obtained from any endonuclease or exonuclease.
  • Exemplary endonucleases from which a cleavage domain can be derived include, but are not limited to, restriction endonucleases and meganucleases.
  • cleaved half-domains can be derived from any nuclease or portion thereof that requires dimerization for cleavage activity, as shown above. If the fusion protein comprises a cleavage half-domain, two fusion proteins are generally required for cleavage. Alternatively, a single protein comprising two truncated half-domains may be used. Two cleaved half-domains may be derived from the same endonuclease (or functional fragments thereof), or each cleaved half-domain may be from a different endonuclease (or functional fragments thereof). have.
  • the target sites of the two fusion proteins are positioned so that the cleavage-half domains are spatially oriented relative to each other by the binding of the two fusion proteins and their respective target sites, thereby resulting in a truncated half-domain, for example, It is preferably arranged in a relationship that allows formation of a functional cleavage domain by sieving.
  • the neighboring edges of the target site are separated by 5-8 nucleotides or 15-18 nucleotides.
  • any integer nucleotide or nucleotide pair may be interposed between two target sites (eg, 2-50 nucleotide pairs or more).
  • the cleavage site lies between the target sites.
  • Restriction endonucleases are present in many species and can sequence-specifically bind to DNA (at the target site), thereby cleaving the DNA at or near the binding site.
  • Some restriction enzymes eg, Type IIS
  • the Type IIS enzyme FokI catalyzes double strand cleavage of DNA at 9 nucleotides from the recognition site on one strand and 13 nucleotides from the recognition site on the other strand.
  • the fusion protein comprises a cleavage domain (or cleavage half-domain) from at least one Type IIS restriction enzyme and one or more zinc-finger binding domains (may or may not be engineered).
  • one of the nucleases shown in Table 3 may be used.
  • the nuclease used in the present invention may be already expressed by the nuclease before introducing the reporter construct into the cell, or the nuclease may be expressed after introducing the reporter construct into the cell.
  • the nuclease may be expressed from an endogenous nuclease gene of a cell, or may be expressed from a foreign nuclease gene of a cell.
  • the nuclease expression construct can be introduced into the cell, the timing of the introduction of the nuclease can be introduced before or after introduction of the reporter construct, or simultaneously with the reporter construct. May be introduced into the cell.
  • nucleases used in the present invention can be readily designed using methods known in the art.
  • an inducible promoter such as a galactokinase promoter that is activated (de-suppressed) in the presence of raffinose and / or galactose and inhibited in the presence of glucose.
  • the galactokinase promoter is induced and the nuclease (s) are expressed when the carbon source is changed continuously (eg from glucose to raffinose and back to galactose).
  • inducible promoters include, but are not limited to, CUPl, METl 5, PHO 5, and tet-reactive promoters.
  • the cell type can be a cell line or a natural (eg, isolated) cell, for example a primary cell.
  • Cell lines can be obtained, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC) or by methods known in the art.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • cells can be isolated by methods known in the art. Examples of cell types include, but are not limited to, cells that will or will have disease, such as cancerous cells, transformed cells, etiologically infected cells, fully differentiated cells, partially differentiated cells, immortalized cells, and the like. It doesn't work.
  • prokaryotic e.g.
  • eukaryotic e.g. yeast, plants, fungi, fish and mammalian cells such as cats, dogs, murines, cattle, pigs and humans
  • eukaryotic cells e.g. yeast, plants, fungi, fish and mammalian cells such as cats, dogs, murines, cattle, pigs and humans
  • eukaryotic cells being preferred.
  • Suitable mammalian cell lines include CHO (Chinese hamster ovary) cells, HEP-G2 cells, BaF-3 cells, Schneider cells, COS cells (monkey kidney cells expressing SV40 T-antigen), HEK cells, CV-1 cells, HuTu80 Myeloma cells such as cells, NTERA2 cells, NB4 cells, HL-60 cells and HeLa cells, 293 cells (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol.
  • eukaryotic cells include, for example, insects (eg, sp. Frugiperda), yeast, including yeast cells (eg, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, K. lactis, H. polymorpha), and plant cells ( Fleer R. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 486 496).
  • the cells of the present invention may be induced pluripotent stem cells. That is, the method and reporter system of the present invention can be used to prepare induced pluripotent stem cells in which specific nucleotide sequences recognized by nucleases are modified and used as patient-specific cell therapy.
  • the cells of the present invention may be cells of specific tissues of an animal.
  • the methods and reporter systems of the present invention can be used to produce transformed cells in which a particular nucleotide sequence that is recognized by nucleases is modified in large quantities.
  • the present invention uses a reporter construct in which the expression of a reporter gene is determined depending on whether a specific nuclease binds to a specific target sequence and cleaves the reporter construct.
  • the cleavage can identify or enrich cells in which the nucleotide sequence has been modified.
  • the modified nucleotide sequence of the cell to be identified or enriched may be an endogenous nucleotide sequence present on the genome.
  • the mutation is not only a local mutation, but also a mutation such as a chromosomal rearrangement such as deletion, insertion, inversion, duplication, translocation. It includes, but is not limited to.
  • the method comprises preparing a reporter construct comprising a target sequence and a reporter gene recognized by a specific nuclease, and introducing the same into a candidate cell. Before or after introducing the reporter construct into the cell, some or all of the cells may express the nuclease.
  • Reporter constructs or nuclease expression constructs can be introduced into cells in order to express in the cell nucleases expressed from the reporter construct or the exogenous nuclease gene.
  • Introduction methods can be carried out using methods known in the art.
  • foreign DNA may be introduced into the cell by transfection or transduction.
  • Transfections include sugars such as calcium phosphate-DNA co-precipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroshock, microinjection, liposome fusion, lipofectamine and protoplast fusion. It can be carried out by various methods known in the art.
  • the nuclease After introducing the reporter construct into the cell, the nuclease binds to the target sequence of the reporter construct and cleaves the reporter construct, thereby sorting the cells after the necessary recovery period before the cell mechanism to repair the induced DSB.
  • the cell classification is classified into cells expressing a reporter gene and cells not expressing.
  • the population of cells expressing the reporter gene has a high proportion of cells in which the endogenous specific nucleotide sequence present on the genome within the cell by a specific nuclease or in which the nucleotide sequence is modified by the cleavage is used.
  • nucleases can enrich cells in which the endogenous nucleotide sequences present on the genome have been modified.
  • a polynucleotide encoding a small amount of red fluorescent protein (mRFP), a recognition site of the ZFN, and an anti-fluorinated green fluorescent protein After transfecting human embryonic kidney cells with reporter vectors sequentially comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of (eGFP), RFP + GFP + cell populations were sorted by flow cytometry and the mutation rate of the cell populations was measured. .
  • the mutation rate by nuclease in the RFP + GFP + cell population classified by flow cytometry was increased about 20-fold, compared to the RFP - GFP - cell population and RFP + GFP - cell population.
  • the present invention can increase the proportion of cells whose genome has been modified by nucleases in a population containing the same number of cells, ie, significantly enrich the cells mutated by nucleases.
  • the flow cytometry is used to classify the RFP + GFP + cell population and determine the mutation rate. Mutation rate was increased by about 11 times compared to RFP - GFP - cell population, RFP + GFP - cell population, and fPCR analysis confirmed that it was increased by about 38 times.
  • the reporter system of the present invention and a method for concentrating genome modified cells by nucleases using the same have the following advantages.
  • the reporter system of the present invention can reflect their activity without affecting the activity of the nuclease, and thus can be used in combination with other methods that can enhance the activity of the nuclease.
  • the introduction and sorting of cells into additional cells can be performed repeatedly to further enrich the mutant cell population.
  • Dual allele knockout cells can be obtained by repeating the above procedure.
  • gene-modified cells sorted by flow cytometry or separated by fluorescence microscopy are living and suitable for performing experiments such as somatic cell nuclear transfer or production of induced pluripotent stem cells.
  • the reporter construct is delivered in the form of an episomal plasmid that disappears with the nuclease plasmid after 1 or 2 weeks as the cells divide in the medium, so that the entire genome is not compromised except for the nuclease target sequence. May be left unattended.
  • Plasmids encoding zinc-finger nucleases used in the present invention, are described in previous studies (Kim et al., Genome Res 19 (7), 1279, 2009). It was constructed as. Plasmids encoding ZFN pairs targeting TP53 include polynucleotides of the sharkey RR FokI domain (TP53-L) represented by SEQ ID NO: 1 and polynucleotides of the sharkey DAS FokI domain (TP53-R) represented by SEQ ID NO: 3. Included.
  • DNA recognition helices of the sharkey RR FokI domain (TP53-L) encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 and the sharkey DAS FokI domain (TP53-R) encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3 are shown in FIG. It is underlined in the sequence described.
  • ZFN used in the present invention has the characteristic of targeting a site in exon 5.
  • the nuclease domain of ZFN used mandatory heterodimers (KK / EL (Miller et al., 2007) or sharkey DAS / RR (Guo et al., 2010)).
  • Plasmids encoding TAL effectors (TALEs) targeting the human CCR5 gene were used in a manner similar to that described in the previous art (Kim et al., Genome Res 19 (7), 1279, 2009). It was prepared by.
  • TAL-effector nucleases comprising amino acids represented by SEQ ID NOs: 48 and 49
  • plasmids encoding TALENs comprising amino acids of SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51
  • the mRFP gene was amplified from pcDNA3-mRFP using primers having the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 described in Table 1 below, and the amplified product was cloned into the Nhe I site of pEGFP-N1 (Clontech).
  • the eGFP gene was amplified using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, and cloned into Bam HI and No tI sites of the plasmid to prepare pRGS.
  • the mRFP gene was amplified from pcDNA3-mRFP using primers having the sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6, and the amplified gene product was introduced into the NheI and EcoRI sites of pEGFP-N1 (Clontech). Cloned. 2A-peptide and eGFP genes were amplified from pEGFP-N1 with E2A inserted using primers having the sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10 and cloned using BamHI and NotI sites. The NheI site of the plasmid was removed by introducing a silencing mutation and a new NheI site was added after 2A-petide.
  • Mouse MHC class I molecule H-2K k genes are then amplified from pMACSK k .II (miltenyi biotech) using primers having the sequences of SEQ ID NOS: 10 and 11 using the NheI and NotI in the plasmid cloning into place by replacing instead eGFP Proceeded.
  • the target sequences recognized by ZFN were annealed in vitro by synthesized oligonucleotides (Bioneer, Daejon, South Korea) and inserted using EcoRI and BamHI sites of the plasmid.
  • Oligonucleotides comprising the target sequence of the nuclease were synthesized in vitro (Bioneer, Daejon, South Korea) and annealed. The sequence of the target site was as described in Table 3 below.
  • the polymerized oligonucleotides were bound in vectors (pRGS) cleaved with Eco R1 and Bam H1.
  • the sequence of the reporter construct comprising the TP53 target sequence among the reporter constructs is shown in SEQ ID NO: 29 and FIG. 2.
  • the target sequence of ZFN is underlined in the sequence described in FIG. 2.
  • sequence of the double frame reporter construct comprising the target sequence of TALEN is described in FIGS. 16 (SEQ ID NO: 52) and 17 (SEQ ID NO: 53), and the sequence of the double frame reporter construct comprising the target sequence of CMAH-ZFN 24 (SEQ ID NO: 54) and 25 (SEQ ID NO: 55).
  • HEK293T Human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells were treated with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Invitrogen) supplemented with 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, and 10% fetal calf serum (FBS). Incubated).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS fetal calf serum
  • iPS Mouse induced pluripotent stem cell lines established by Andras Nagy and Knut Woltje were obtained from Andras Nagy (Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada), which was 10% on gelatinized culture dishes without feeder cells.
  • Fetal bovine serum 0.1 mM non-essential amino acid (Invitrogen), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2000 U / mL leukemia inhibitory factor (LIF), 100 units / ml penicillin, and Culture was performed in Glasgow modified Eagle medium (Sigma) to which 100 g / ml streptomycin was added. Cells were cultured without LIF for 3 weeks to obtain fibroblasts derived from mouse iPS cells.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • HEK293 cells were transfected using Fugene 6 or Fugene HD (Roche), and transfection of fibroblasts derived from mouse iPS cells was performed using Magnetofection (Chemicell).
  • the weight ratio of ZFN-encoding plasmid encoding another ZFN: reporter was 1: 1: 2
  • the weight ratio of DNA was 1: 1: 1.
  • flow cytometry was performed on the transfected cells after 3 days.
  • Cells transfected with TEN were incubated for 3 days at 30 ° C. (cold shock) until flow cytometry and then cultured for one day at 37 ° C.
  • T7E1 assay was performed by a known method.
  • genomic DNA was isolated using the DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions.
  • DNA sites comprising the recognition sites of artificial nucleases were PCR amplified using the primers described in Table 4 below.
  • Heating was applied to modify the amplicons obtained through the PCR and polymerized in the form of heteroduplex DNA.
  • the heterologous double-stranded DNA was treated by 5 units of T7 endonuclease 1 (New England Biolabs) at 37 ° C. for 15 minutes and analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • Genomic DNA (100 ng per reaction) was PCR amplified using phusion polymerase (Fynnzymes) and 5'-FAM labeled primers.
  • the sequences of the primers used are shown in Table 5 below.
  • CCR5 (ZFN-224) F 5'-TGCACAGGGTGGAACAAGATGG-3 '(SEQ ID NO: 42) R 5'-FAM-GAGCCCAGAAGGGGACAGTAAGAAGG-3 '(SEQ ID NO: 43) CCR5 (Z891) F 5'-FAM-GAATAATTGCAGTAGCTCTAACAGG-3 '(SEQ ID NO: 44) R 5'-CTCTTGCTGGAAAATAGAACAGC-3 '(SEQ ID NO: 45) TP53 F 5'-GCAGGAGGTGCTTACGCATGTTTGT-3 '(SEQ ID NO: 46) R 5'-FAM-GCTGCTCACCATCGCTATCTGAGC-3 '(SEQ ID NO: 47)
  • Amplified PCR products were analyzed using an ABI 3730xl DNA analyzer. The position and size of the peaks indicate the length and relative amount of the PCR product.
  • Attached cells were trypsinized and resuspended with 2% FBS in PBS. Single cell suspensions were analyzed and sorted using FACSAria II (BD Biosciences, San Jose, Calif.) Or FACSVantage SE (BD Biosciences). To collect cells containing nuclease-induced mutations, cells with strong GFP signals were sorted. Untransfected cells and cells transfected with reporter alone were used as controls.
  • Magnetic-activated cell sorting magnetic activated cell sorting, MACS
  • HEK293 cells were cotransfected with 2 ug of reporter plasmid and 2 ug of ZFN-224 (targeting CCR5 gene).
  • the reporter plasmid is a reporter plasmid that encodes a fusion protein of a monomeric red fluorescent protein (mRFP) -enhanced green fluorescent protein (eGFP) into a DNA that encodes mRFP and eGFP.
  • mRFP monomeric red fluorescent protein
  • eGFP enhanced green fluorescent protein
  • An artificial nuclease target sequence was inserted between the sequences to allow the eGFP sequence to fuse out of the frame of the mRFP sequence. Stop codons were inserted upstream of the eGFP sequence (see Figure 3 (a)).
  • the reporter plasmid was transfected into HEK293 cells, and the cells were sorted by flow cytometry.
  • mRFP was expressed by the CMV promoter
  • functional eGFP was not expressed because it is out of frame when the artificial nuclease has no activity.
  • NHEJ DNA damage is repaired by NHEJ, which causes frame shift mutations, which allow eGFP to be present in frame with mRFP, thus functioning.
  • Expression of mRFP-eGFP fusion proteins Using the above principle, the cells whose genome was modified by artificial nuclease could be concentrated and sorted (see FIG. 3 (b)).
  • nuclease target sequence could be inserted into a coding site of a surrogate such as an eGFP gene.
  • nuclease target sequence could be inserted such that the C-terminal region of the eGFP is outside the frame of the N-terminal region of the eGFP.
  • the surrogate gene became inactive and the cell transfected with the surrogate gene was GFP-.
  • the artificial nuclease binds to the target sequence and cleaves DNA, DSB occurs, which is repaired by NHEJ, which frequently causes frame shift mutations, resulting in some of the cells appearing as GFP +.
  • the reporter constructs in this system encode inactive, partially replicated, and mutated reporter genes (FIG. 4A). Target sequences were inserted between replicated regions. When site-specific nucleases bind to the target sequence and cleave the DNA, the DNA is repaired by the SSA mechanism (various HR), resulting in a functional reporter gene. Similarly, a reporter system may be used that can be recovered by HR.
  • the system includes an inactivated reporter gene, which consists of the target sequence of the nuclease and a homologous DNA provider capable of encoding a truncated and inactive reporter (FIG. 4B). If an artificial nuclease binds to a target sequence and cleaves DNA, a DSB occurs and HR repairs it, thereby making the reporter gene active.
  • Reporter plasmids containing plasmids encoding ZFN pairs targeting the human TP53 gene and nuclease target sequences were transfected into HEK293 cells.
  • HEK293 cells transfected with reporter plasmid alone or ZFN plasmid alone were used.
  • the RFP + GFP + cell populations were classified by flow cytometry, and genomic DNA was isolated and analyzed to assess the extent of mutations induced by nucleases.
  • T7 endonuclease I (T7E1) analysis of the genomic DNA revealed a 37% frequency of mutation of the TP53 gene in RFP + GFP + cells, indicating that the cells were unsorted. It was 13 times higher than that (FIG. 6b).
  • the frequency of mutation of unclassified cells, ie, RFP - GFP - cells, RFP + GFP - cells, and cells transfected with ZFN plasmid alone, ranged from about 2.8-4.8%. From the above results, it can be seen that using the reporter system of the present invention, it is possible to significantly increase the concentration of gene-mutated cells.
  • fPCR fluorescence polymerase chain reaction
  • the surrogate reporter of the present invention proved to be a reliable system capable of monitoring the activity of ZFN in viable cells by enabling significant enrichment of cells with modified target genes.
  • reporter system of the present invention can also be used for enriching cells genetically modified by other ZFNs, ZFN-224 and Z891, zinc finger nucleases each having a different target sequence in the human CCR5 gene Used.
  • FIG. 7A Flow cytometry was performed 72 hours after ZFN-224 transfection, resulting in 23% of cells becoming RFP + GFP + (FIG. 7A).
  • T7E1 analysis revealed a mutation rate of 69% in sorted RFP + GFP + cells and 12-16% in unclassified cells, ie RFP - GFP - and RFP + GFP - cells. That is, the mutation rate of sorted RFP + GFP + cells was increased by about 5.8-fold compared to unclassified cells (FIG. 7B).
  • the Z891 induced mutations were significantly enriched in RFP + GFP + cells compared to unclassified cells.
  • the mutation rate of sorted RFP + GFP + cells was increased about 11 times compared to unclassified cells (RFP - GFP - cells, RFP + GFP - cells) (FIG. 8B), and fPCR analysis
  • the mutation rate of sorted RFP + GFP + cells was increased about 38-fold compared to unclassified cells (FIG. 8C).
  • Reporter plasmids and plasmids encoding TALEN pairs targeting the CCR5 gene were cotransfected into HEK293 cells. Cells were incubated at 37 ° C. for one day and then at 30 ° C. for three days. Flow cytometry was performed on the cultured cells. As a result, the activity of TALEN could not be confirmed in the unclassified cells, but the mutation of the gene was clearly observed in the RFP + GFP + cells. This resulted in a 8.6-fold increase in the concentration of mutated cells compared to unclassified cells (FIG. 9).
  • RFP dim means that the fluorescent color is dark
  • midium means that the brightness of the fluorescent color is normal
  • bright means that the fluorescent color is bright.
  • T7E1 analysis confirmed that genome-modified cells were concentrated in the following order: RFP bright (10% mutation), RFP medium (6.3%), and RFP dim (1.2%) (FIG. 12). From this, it can be seen that high transfection efficiency leads to high mutation frequency.
  • Reporter plasmids and plasmids encoding Z891 were co-transfected into HEK2993 cells and 3 days later RFP + GFP + cells were sorted using flow cytometry (first sorting) and analyzed for T7E1. After 24 hours of incubation, the cells were further co-formed and sorted using a reporter plasmid and Z891 plasmid. Sorted RFP + GFP + cells were analyzed for T7E1 (second class). These two co-transfection and sorting steps resulted in a 60-fold increase in enrichment of mutant cells, which means that cell populations containing nearly half of CCR5 allele-modified cells can be isolated (FIG. 13). ).
  • magnetic-activated cell sorting was used in addition to flow cytometry, which is a method of sorting cells having fluorescence activity.
  • the reporter gene consisted of the mRFP gene, target sequence of artificial nuclease, 2A-peptide sequence and mouse MHC class I molecule H-2K k gene (FIG. 14A).
  • mRFP is expressed by the CMV promoter
  • H-2K k is not expressed because it exists outside the frame when the artificial nuclease has no activity.
  • DSB is generated in the target sequence by artificial nucleases
  • the DNA damage is repaired by NHEJ, but this results in a frame shift mutation.
  • Such mutations may allow 2A-peptide and H-2K k to be present in frame with mRFP, leading to expression of functional H-2K k protein.
  • cells can be labeled with H-2K k -specific magnetic beads and magnetically separated on a MACS column (FIG. 14B). ).
  • HEK293 cells were cotransfected with a plasmid encoding 2 ug of reporter plasmid and 2 ug of ZFN-224 (targeting the CCR5 gene).
  • the reporter plasmid consisted of the mRFP gene, the target sequence of ZFN-224, the 2A-peptide sequence and the mouse MHC class I molecule H-2K k gene.
  • MACSelect K k MACSelect K k
  • T7E1 analysis was performed using genomic DNA isolated from magnetic bead-selected cells.
  • the cells not classified as MACS showed a mutation rate of 18%, whereas the first classified cells had a mutation rate of 67%, and the second classified cells showed a mutation rate of 77% (FIG. 15). That is, the cells classified as MACS showed a mutation rate of about 4.5 times higher than that of the cells not classified. Since the MACS method does not classify cells using a laser, the cells are not damaged during the cell sorting process, and thus, mutant cells modified with the target genes can be more efficiently sorted and concentrated.
  • Double frame NHEJ reporter constructs were used to allow nucleases to cleave specific nucleotide sequences in cells to enrich the genetically modified cells with higher efficiency.
  • the CMV promoter was used for intracellular expression, and the mRFP reporter gene (first reporter gene), a control reporter gene for determining gene injection efficiency (a first reporter gene), a target sequence recognized by a nuclease, and the mRFP reporter gene were Two frame eGFP reporter genes (second reporter gene and third reporter gene) of different frames were arranged in a row so that the red fluorescent protein encoding and the amino acid codon frame did not match and a double frame NHEJ reporter construct was prepared.
  • mRFP When the reporter construct was transfected into the cell and the reporter construct was introduced into the cell, mRFP was expressed regardless of the activity of the artificial nuclease.
  • the second reporter gene and the third reporter gene were not expressed because they exist out of frame when the artificial nuclease does not have activity.
  • DSB is generated in the target sequence by artificial nucleases, DNA damage is repaired by NHEJ, but this causes a frame shift mutation, which causes the second reporter gene or the third reporter gene to be the first reporter.
  • the genes could be present in frame with the gene to induce the expression of the functional mRFP-eGFP fusion protein (FIG. 18).
  • the first reporter construct including the first reporter gene (mRFP) and the second reporter gene (eGFP) whose amino acid codon frame does not fit, the first reporter gene (mRFP) and the first reporter construct in a different frame
  • a second reporter construct comprising a first reporter gene and a second reporter gene (eGFP) that does not match the amino acid codon frame, and a second reporter gene of a different frame, wherein the first reporter gene (mRFP) and the amino acid codon frame do not match
  • a third reporter construct containing (eGFP) and a third reporter gene (eGFP) was introduced into the cells, respectively, and nucleases were introduced into the cells.
  • the cells were classified into cells expressing both mRFP and eGFP by flow cytometry, and their frame shift mutations were identified.
  • codon frames generated by nuclease operation were used. Only one case of migration could be identified, whereas a third reporter construct was used to select and concentrate cells that had undergone all two frame shift mutations (FIG. 19).
  • NHEJ mediation in all cases caused by artificial nuclease cleavage of the target site by arranging the second reporter gene and the third reporter gene in which the first reporter gene and the amino acid codon frame are not matched in different frames.
  • Cells that have undergone frame shift mutations can be sorted and cells genetically modified by artificial nucleases can be enriched.
  • the reporter construct includes only the first reporter gene and the second reporter gene in which the amino acid codon frame does not fit, only the cells having one frame shift mutation were selected, but the reporter constructs used in this example were Cells in which all frame shift mutations have been selected can be selected.
  • the reporter construct used a CMV promoter for intracellular expression, and a hygromycin phosphotransferase designed to be expressed when ZFNs function properly, a target gene that can act by combining ZPN and RFP genes to determine gene injection efficiency.
  • Hygromycin phosphotransferase, HPT-eGFP HPT-eGFP
  • a pair of ZFNs capable of knocking out the porcine CMAH gene (36 ug) and the reporter construct (9 ug) for hygromycin screening were injected into porcine ear tissue cells via electrical stimulation and then 1 X 10 6 cells were transferred to 100 mm. Each dish was aliquoted and cultured. On day 2 after ZFN and reporter construct injection, the cell number was 3 ⁇ 10 5 cells per plate and treated with hygromycin B at a concentration of 300 ug / ml for 48 hours, resulting in the removal of hygromycin B on day 4 Replaced with. At this time, the number of cells survived by the hygromycin treatment was 1.5 X 10 4 cells. Initial colonies were formed on day 7, complete colonies were formed on day 18, and colonies formed on day 22 were transferred to a new 96-well culture dish to make transgenic cell lines modified with nucleases (FIG. 21).
  • the ratio of cells in which genetic mutations were selected in the cells selected by treatment with hygromycin B (300 ug / ml) for 2 to 2 days after introduction of ZFN and reporter into cells was analyzed by T7E1 assay method. A higher percentage of transformed cells were identified in the treatment (12.1%) compared to the untreated control (3.1%) (FIG. 23).

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Abstract

본 발명은 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 선별 또는 농축시키기 위한 리포터 구성물 및 방법, 상기 리포터 구성물을 포함하는 숙주세포, 및 뉴클레아제 활성의 모티터링 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 리포터 시스템은 간단하면서 비침습적이고, 유전자 변형된 세포들의 효율적인 농축을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 유전자 치료 및 유전공학 뿐만 아니라 기초 연구에서 뉴클레아제의 적용을 촉진시킬 것이다.

Description

뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법
본 발명은 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시키기 위한 리포터 구성물 및 방법, 상기 리포터 구성물을 포함하는 숙주세포, 및 뉴클레아제 활성의 모티터링 시스템에 관한 것이다.
메가뉴클레아제(meganuclease), 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nucleases, ZFNs) 및 TAL-이펙터 뉴클레아제(TAL-effector nucleases, TALENs)와 같은 인공 뉴클레아제는 세포 및 생물 내에서 내생 유전자의 변이, 타겟 유전자의 삽입, 및 염색체 재배열을 일으킬 수 있는 바, 유전 공학에서 강력하고 다재다능한 도구로서, 연구, 생명공학, 및 의약 분야에서 유용히 사용될 수 있다.
상기와 같은 인공 뉴클레아제는 세포 내에서 특이적인 표적 염기 서열을 인식하여 DNA 이중가닥 손상(DNA double strand breaks, DSBs)을 일으킨다. 유발된 세포 내 DSB는 상동 재조합(homologous recombination, HR)과 비상동 말단 접합(nonhomologous end joining, NHEJ)으로 구별되는 세포의 두 가지 내재적 DNA 수선 기작에 의해 복구될 수 있는데, 이때 표적 특이적인 돌연변이 및 유전자 변형이 일어나게 된다. 진핵세포 및 생물체 내에서 상동의 DNA 제공자가 부재할 때는, 뉴클레아제에 의해 유도된 DSB는 HR에 비해 월등하게 NHEJ 기전으로 복구될 수 있다. HR에 의한 변이는 HR 제공자 DNA에 있는 서열이 정확히 복사되어 일어나지만, NHEJ에 의한 변이는 무작위로 일어나게 된다. NHEJ은 오류 발생이 쉬운(error-prone) 수리 기전이기 때문에 DSB가 일어난 부위에서 작은 크기의 삽입/결실(insertion/deletion: indel 돌연변이)이 일어날 수 있으며, 이는 프레임-이동(frame-shift) 돌연변이를 유발하여 유전자 변이를 일으킨다.
한편, 징크-핑거 뉴클레아제와 TAL-이펙터 뉴클레아제는 진핵세포 및 생물체 내 유전자 변형을 설계하는데 매우 유용한 도구임에도 불구하고, 일반적으로 인공 뉴클레아제에 의해 유도되어 유전적인 변형을 가지고 있는 돌연변이 세포와 야생형 세포를 표현형적으로 구분하기는 매우 어려우므로, 돌연변이 세포만을 분리하는데 제약이 많다.
즉, 유전자 치료 및 기초 연구에서 뉴클레아제를 사용하기 어려운 점 중 하나가 유전자-변형된 세포를 농축 또는 선택하는 시스템의 부족이다. 예를 들어서, 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)를 인코드하는 인간 케모카인 수용체 5(human chemokine receptor 5, CCR5) 유전자의 특정 부위를 변이시킬 수 있는 ZFN의 치료 효험은 ZFN에 의해 유도된 CCR5-녹아웃(knockout) 세포 수에 의존하게 된다. 그러나 이러한 ZFN에 의해 돌연변이를 갖는 세포는 매우 극소수이며, 손상되지 않은 CCR5 유전자의 한 카피(copy)라도 가지고 있는 나머지 세포들은 HIV 복제를 위한 숙주세포로 작용할 것이다. 더욱이, 매우 극소수의 세포들만이 뉴클레아제에 의해 변형되기 때문에, 유전자-변이된 세포를 얻기 위해서는 수많은 클론을 스크리닝해야 하는 번거로운 작업이 필요할 수 있다. 또한, HIV 감염에 대한 면역성 때문에 CCR5-녹아웃 세포가 in vivo에서 선별적으로 증폭될 수 있다고 하더라도, 이식 전에 돌연변이 세포를 농축시키는 것은 이들의 잠재적인 치료 효험을 높일 수 있을 것이다.
아울러, 인공뉴클레아제의 유전체 편집 기술을 통해, 인체 유용 단백질의 대량 생산 및 난치병 치료에 유용하게 활용될 수 있는, 유전자가 변이된 형질전환 세포의 생산이 가능하다. 다만, 돼지나 소같은 대동물의 형질전환 동물을 생산함에 있어서, ZFN mRNA를 전핵단계의 수정란내에 직접 주입하는 방법은 수정란의 발생과정에서 발생하는 모자이크 현상으로 인해 형질전환 효율이 극히 미비하다. 따라서 주로 ZFN에 의해 생산된 형질전환 세포를 공여핵에 제공하는 핵이식에 의한 복제 기법이 이용되게 되는데, 이때 형질전환된 세포의 대량 생산이 요구된다. 형질전환된 세포의 대량 생산을 위해서는 ZFN DNA가 포함된 플라스미드를 세포내에 도입하여 ZFN의 작동에 의해 유전자가 변이된 형질전환 세포의 효율적인 선별법이 필요하다.
따라서, 인공 뉴클레아제에 의해 표적 유전자가 변이된 세포들을 높은 비율로 농축하거나 분리할 수 있는 방법이 확립된다면, 이를 인공 뉴클레아제를 적용할 수 있는 여러 분야에서 널리 사용할 수 있을 것이다.
본 발명자들은, 특정 뉴클레아제 의해 인식되는 표적 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 구성물을 제조하고, 이를 상기 뉴클레아제를 발현할 수 있는 세포에 도입시킨 후, 리포터 유전자를 발현하는 세포와 발현하지 않는 세포를 분류하였을 때, 리포터 유전자를 발현하지 않는 세포들의 집단에 비하여 리포터 유전자를 발현하는 세포들의 집단에서 상기 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되고, 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포들이 높은 비율로 검출됨을 확인함으로써, 본 발명의 상기 뉴클레아제에 의해 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 현저히 농축(enrichment)시킬 수 있는 방법을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 선별 또는 농축시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시키기 위한 리포터 구성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터 유전자가 포함된 리포터 구성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 리포터 구성물을 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뉴클레아제 활성의 모니터링 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 리포터 시스템 및 이를 이용한 뉴클레아제에 의해 유전체 변형된 세포를 농축시키는 방법은, 뉴클레아제에 의해 돌연변이된 세포가 높은 비율로 존재하는 세포 집단을 얻을 수 있고, 살아 있는 상태의 돌연변이 세포 집단을 얻을 수 있으므로, 유전자 또는 세포 치료 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 TP53 유전자를 표적으로 하는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 쌍의 코딩 서열을 나타낸 것이다. ZFN 쌍 각 도메인의 DNA 인식 헬리스는 밑줄로 표기하였다. 기존 공지된 ZFN은 TP53 유전자의 엑손 7을 표적으로 하나, 본 발명에서 사용한 ZFN은 TP53 유전자의 엑손 5를 표적으로 한다.
도 2는 TP53 리포터 구성물의 서열을 나타낸 것이다. ZFN의 인식부위는 밑줄로 표기하였다.
도 3은 리포터 구성물의 구조 및 상기 리포터 구성물을 이용하여 유전자-변형된 세포들을 농축시키는 방법을 도식화한 것이다. (a)는 리포터 구성물의 구조를 나타낸 것으로서, 상기 리포터 구성물은 mRFP 유전자, 인공 뉴클레아제의 표적 서열 및 eGFP 유전자로 구성되었다. (b)는 세포에 리포터 플라스미드 및 뉴클레아제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염시킨 후 3일 또는 4일 째에, 유세포 분석법을 사용하여 세포들을 분류하고 분석하는 방법을 도식화한 것이다.
도 4에서 (a)는 SSA 리포터의 구조 및 상기 리포터 시스템을 이용하여 유전자-변형된 세포들을 농축시키는 방법을 도식화한 것이다. N-GFP와 C-GFP 사이에 뉴클레아제 표적 부위를 삽입한 것이며, 진한 부분이 부분적으로 복제된 부분이다. (b)는 HR 리포터의 구조 및 상기 리포터 시스템을 이용하여 유전자-변형된 세포들을 증폭시키는 방법을 도식화한 것이다. 뉴클레아제 표적 부위가 eGFP 내부에 삽입되어, 불활성된 재조합 수용자를 형성시켰다. 끝이 잘린 불활성화된 eGFP 유전자는 HR 제공자로 사용하였다. 뉴클레아제에 의해 발생한 DSB는 HR에 의해 복구되어, eGFP 유전자가 기능하도록 한다.
도 5는 리포터 플라스미드 및 ZFN 쌍을 인코딩하는 플라스미드를 HEK293 세포에 공동 형질감염시킨 후, 형광 현미경을 사용하여 RFP 및 GFP의 발현 양상을 나타낸 것이다. 발현 측정은 공동 형질감염 후 1일, 2일, 3일 째에 수행한 것이며, scale bar는 100μm이다.
도 6은 대리 리포터가 TP53 유전자-변이된 세포들을 현저히 농축시킬 수 있음을 나타낸 것이다. (a)는 TP53-표적 ZFN 및 리포터를 HEK293 세포에 공동 형질감염시킨 후, 3일 후에 수행한 유세포 분석 결과이다. (b)는 T7E1 분석법에 의해 탐지된 ZFN-유도 돌연변이를 나타낸 것이다. 화살표는 불일치에 민감함 T7E1에 의해 절단된 DNA 밴드의 위치를 나타낸 것이다. 겔 밑의 부분의 숫자는 밴드 강도를 바탕으로 측정된 돌연변이 빈도를 나타낸 것이다. (c)는 fPCR에 의해 측정된 ZFN-유도 돌연변이율을 나타낸 것이다. 화살표는 작은 염기 삽입에 대응되는, 증폭된 DNA 피크를 나타내는 것이며, 높게 표시된 피크는 야생형의 증폭된 산물과 대응하는 것이다. 돌연변이는 피크 면적을 측정하여 계산하였다. (d)는 ZFN의 표적이 되는 TP53 유전자의 서열을 나타낸 것이다. ZFN 인식 부위는 밑줄로 표시하였다. 줄표(Dash)는 삭제된 염기를 의미하며, 작은 볼드체는 삽입된 염기를 나타낸다. 돌연변이 발생회수는 괄호안에 표시하였으며, 돌연변이 빈도수는 돌연변이된 복제수를 총 복제된 수로 나누어 계산하였다(WT: 야생형 서열).
도 7은 대리 리포터를 사용하여, ZFN-224에 의해 CCR5 유전자-변형된 세포들의 현저한 농축을 나타낸 것이다. (a)는 형질감염된 세포들의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이며, (b)는 유세포 분석법으로 분류된 세포들로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 T7E1 분석법을 수행한 결과이다. 화살표는 T7E1에 의해 절단된 DNA 밴드의 예상되는 위치를 의미한다. (c)는 CCR5 유전자에서 인델(indel) 돌연변이 형성의 효율을 결정하기 위해 fPCR를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 화살표는 작은 삽입에 대응하는 증폭된 DNA 피크를 나타낸다.
도 8은 대리 리포터를 사용하여, Z891에 의해 CCR5 유전자-변형된 세포들의 현저한 농축을 나타낸 것이다. (a)는 형질감염된 세포들의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이며, (b)는 유세포 분석법으로 분류된 세포들로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 T7E1 분석법을 수행한 결과이며, (c)는 fPCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 대리 리포터를 사용하여, TALEN에 의해 CCR5 유전자-변형된 세포들의 현저한 농축을 나타낸 것이다. (a)는 형질감염된 HEK293 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이며, (b)는 유세포 분석법으로 분류된 세포들로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 T7E1 분석법을 수행한 결과이다. 화살표는 T7E1에 의해 절단된 앰플리콘(amplicon)을 나타내며, 상대적인 밴드 밀도는 TALEN 활성을 나타낸다.
도 10은 대리 리포터를 사용하여, Thumpd3 유전자가 변형된 마우스 세포의 현저한 농축을 나타낸 것이다. 유도 만능 줄기세포로부터 유래된 마우스 섬유아세포를 리포터 플라스미드 및 Thumpd3 유전자를 표적으로 하는 ZFN 쌍을 인코딩하는 플라스미드로 공동 형질감염시킨 후, 분석한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 형질감염된 세포의 유세포 분석 결과를 나타내며, (b)는 유세포 분석법으로 분류된 세포들로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 T7E1 분석법을 수행한 결과이다. 화살표는 T7E1에 의해 절단된 앰플리콘(amplicon)을 나타내며, 상대적인 밴드 밀도는 ZFN의 활성을 나타낸다.
도 11은 단일 세포 및 세포 집단(콜로니)의 복제 분석 결과를 나타낸 것이다. (a)는 리포터 플라스미드 및 Thumpd3 유전자를 표적으로 하는 ZFN 쌍을 코딩하는 플라스미드를 유도 만능 줄기세포로부터 유래된 마우스 섬유아세포에 공동 형질감염시킨 후, 유세포 분석법으로 세포들을 분류하고, 현미경 관찰 하에 마우스(mouth) 피펫을 사용하여 단일 세포를 분리하고, PCR 튜브에 옮겼다. 21개의 분류되지 않은 세포 및 10개의 분류된 세포의 PCR 산물을 복제하고 서열분석한 결과를 나타낸 것이다. 1a 및 1b는 단일 클론 내의 쌍대립 돌연변이로부터 얻은 DNA 서열을 나타낸 것이다. (b)는 세포의 복제 집단의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 분류된 세포에서 돌연변이율 및 뉴클레아제 레벨을 나타낸 것이다. (a)는 유세포 분석법으로 RFPdim, RFPmedium, 및 RFPbright 세포들, RFP-GFP+ 및 RFP+GFP+ 세포들로 분류한 결과를 나타낸 것이며, (b)는 분류된 세포들의 T7E1 분석 결과를 나타낸 것이다. 화살표로 표시된 밴드는 T7E1으로 절단된 앰플리콘을 나타낸 것이고, 상대적 밴드 밀도는 ZFN 활성을 나타내는 것이다. (c)는 HA로 태그된 ZFN의 단백질 레벨을 웨스턴 블롯팅 결과로 나타낸 것이다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용하였다.
도 13은 공동 형질감염 및 세포 분류 과정을 반복 수행하였을 때, 변형된 유전자를 가지는 세포의 농축이 증가되었음을 나타내는 것이다. 리포터 플라스미드 및 ZFN을 인코딩하는 플라스미드를 세포에 공동 형질감염 시킨 후, 유세포 분석으로 세포를 분류하는 과정을 2번로 수행하였을 때, CCR5 유전자가 변형된 돌연변이 세포들의 농축을 현저히 증가시킴을 확인한 것이다.
도 14는 자성-활성된 세포 분류법(MACS)를 이용하여 표적 유전자-변형된 세포를 농축시키는 방법을 도식화한 것이다. (a)는 mRFP 유전자, 인공 뉴클레아제의 표적 서열, 2A-펩타이드 서열 및 마우스 MHC 클래스 I 분자 H-2Kk 유전자로 구성된 리포터의 구조를 나타낸 것이다. (b)는 리포터 플라스미드 및 뉴클레아제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염시킨 후 3일 또는 4일 째에, 세포들을 H-2Kk-특이적 자기 비드로 표지하고, MACS 컬럼 상에서 자기력으로 분리하는 방법을 나타낸 것이다.
도 15는 리포터 및 MACS를 사용하여 ZFN-224에 의한 CCR5 유전자-변형된 세포들을 분류하고, 농축시킨 결과를 나타낸 것이다. 리포터 플라스미드 및 ZFN을 인코딩하는 플라스미드를 세포에 공동 형질감염시킨 후, MACS로 자기적-비드 선택된 세포들을 분류하는 과정을 2번 반복적으로 수행하여, T7E1 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 A TALEN 이중 프레임 리포터 구성물의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 밑줄 및 볼드체로 표시한 부분은 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열이다.
도 17은 B TALEN 이중 프레임 리포터 구성물의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 밑줄 및 볼드체로 표시한 부분은 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열이다.
도 18은 이중 프레임 NHEJ 리포터 구성물의 구조 및 구성물의 작용 모식도를 나타낸 것이다.
도 19는 이중 프레임 NHEJ 리포터 구성물과 단일 프레임 리포터 구성물을 사용하여 2가지 경우의 프라임 변화의 탐지 가능 여부를 측정한 결과이다.
도 20은 하이그로마이신 선별을 위한 리포터 구성물의 구조 및 리포터 구성물의 작용 모식도를 나타낸 것이다.
도 21은 하이그로마이신 리포터 선별법을 이용하여 형질전환 세포주 개발을 위한 전체 모식도를 나타낸 것이다.
도 22는 하이그로마이신 처리전, 하이그로마이신 비처리군, 및 하이그로마이신 처리군에서 세포의 RFP 및 GFP 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 23은 하이그로마이신을 처리하여 선별된 세포에서 형질전환된 세포 비율을 T7E1 방법으로 분석한 결과이다.
도 24는 mRFP-GFP-H2KK을 포함하는 리포터 구조물의 염기서열을 나타낸 것이다. mRFP 유전자 뒤에 CMAH-ZFN의 표적서열이 위치하고, 프레임 밖(out of frame)으로 eGFP 유전자, 2A peptide, H2KK 유전자가 위치하도록 고안하였다. 2A-peptide에 의해 mRFP-eGFP fusion 단백질과 H2KK 단백질이 따로 발현될 수 있도록 하였다(CMAH-ZFN의 표적서열 및 2A-peptide의 서열은 도안 표시참조.).
도 25는 mRFP-HTP-GFP을 포함하는 리포터 구조물의의 염기서열을 나타낸 것이다. mRFP 유전자 뒤에 CMAH-ZFN의 표적서열이 위치하고 프레임 밖(out of frame)으로 2A peptide, HTP 유전자, eGFP 유전자가 위치하도록 고안하였다. 2A-peptide에 의해 mRFP 단백질과 HTP-eGFP 단백질이 따로 발현될 수 있도록 하였다. (CMAH-ZFN의 표적서열 및 2A-peptide의 서열은 도안 표시참조).
본 발명의 제1 양태는 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 선별 또는 농축시키는 방법으로서,
상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 구성물을 준비하는 단계로서, 상기 리포터 구성물은 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 것인 제1단계; 상기 리포터 구성물을 후보 세포에 도입시키는 단계로서, 상기 후보 세포 중 일부 또는 전부는 상기 리포터 구성물의 도입 전 또는 후에 상기 뉴클레아제를 발현하는 것인 제2단계; 및 제2단계의 결과물인 후보 세포로부터 리포터 유전자를 발현하는 세포 또는 리포터 유전자를 발현하지 않는 세포를 분류하는 제3단계;를 포함하는 것이 특징인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2 양태는 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별 또는 농축시키기 위한 리포터 구성물로서,
제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제2 리포터 유전자가 포함되어 있고, 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 상기 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 것인 리포터 구성물에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양태는 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터 유전자가 포함된 리포터 구성물로서,
상기 제1 리포터 유전자는 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부와 상관없이 발현되고,
상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자, 제3 리포터 유전자 또는 둘다의 발현 여부가 결정되는 것인 리포터 구성물에 관한 것이다.
본 발명의 제4 양태는 상기 리포터 구성물을 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는 상기 리포터 구성물; 숙주 세포; 뉴클레아제를 발현하는 구성물을 포함하는 뉴클레아제 활성의 모니터링 시스템으로서,
상기 리포터 구성물, 상기 뉴클레아제 발현 구성물 또는 둘다는 상기 숙주 세포 내에 도입되어 있거나 세포 외에 별도로 구비되어 있는 것인 시스템에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
세포 및 생물체 내에서 내생적 유전자의 뉴클레오티드를 절단할 수 있는 뉴클레아제(nuclease)는 유전자 변형을 설계하는데 유용히 사용될 수 있으나, 뉴클레아제에 의해 유전자가 변형된 세포들만을 증폭하고 분리하는 시스템이 존재하지 않아, 사용에 제한이 있었다.
이에 하나의 양태로서, 본 발명은 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 선별 또는 농축시키는 방법을 제공한다.
상기 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열은 게놈(genome) 상에 존재하는 내생적 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 특정 뉴클레아제는 게놈 상에 존재하는 내생적 표적 서열에 결합하여 상기 특정 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있다.
또한, 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된, 돌연변이된 세포를 확인 또는 농축시키는 방법에서, 상기 돌연변이는 국지적 돌연변이 뿐만 아니라, 결실, 삽입, 역위, 중복, 전좌와 같은 염색체 재배열과 같은 돌연변이도 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 구성물을 준비하는 단계로서, 상기 리포터 구성물은 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는 여부에 따라 상기 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 것인 제1단계; 상기 리포터 구성물을 후보 세포에 도입시키는 단계로서, 상기 후보 세포 중 일부 또는 전부는 상기 리포터 구성물의 도입 전 또는 후에 상기 뉴클레아제를 발현하는 것인 제2단계; 및 제2단계의 결과물인 후보 세포로부터 리포터 유전자를 발현하는 세포 또는 리포터 유전자를 발현하지 않는 세포를 분류하는 제3단계;를 포함한다.
본 발명의 상기 방법은 리포터 구성물을 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 리포터 구성물은 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열 및 리포터 유전자를 포함하며, 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는 여부에 따라 상기 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되도록 설계될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 상기 리포터 구성물은 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열이 리포터 유전자의 중간이나 앞에 삽입되어 있는 것으로, 상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는 경우 상기 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되도록 설계될 수 있다. 일례로, 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하지 않으면 리포터 유전자가 발현되지 않으나, 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하면 절단된 DNA는 세포 또는 생체 내 존재하는 상동 재조합(homologous recombination, HR) 또는 단일 가닥 중합(single strand annealing, SSA) 기작 또는 NHEJ로 복구되어 리포터 유전자가 발현되게 할 수 있다.
상기 본 발명의 리포터 구성물은, 뉴클레아제에 의해 특정 표적 서열이 절단되면, 상동 재조합 또는 단일 가닥 중합 기작에 의해 리포터 유전자가 발현되게 설계될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 리포터 구성물은 GFP의 C-말단 부위가 GFP의 N-말단 부위의 번역 프레임 밖에 존재하도록, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열을 GFP 사이에 삽입된 것이다. 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하게 되면, DSB(double strand break)가 유도되나, 단일 가닥 중합 시스템에 의해 유전자의 DSB가 복구되어 GFP가 발현될 수 있다.
상기 본 발명의 리포터 구성물은, 뉴클레아제에 의해 특정 표적 서열이 절단되면, NHEJ 기작에 의해 작은 크기의 삽입/결실이 일어나 리포터 구성물의 프레임 이동 돌연변이가 발생되게 설계될 수 있다.
상동 재조합 또는 단일 가닥 중합 기작에 의한 리포터 구성물은 프레임의 이동과 상관없이 뉴클레아제가 작용하면 리포터 단백질이 발현될 수 있지만, 이들은 뉴클레아제가 없어도 자발적인 변이가 일어나게 되는 문제점이 있다. 즉, 뉴클레아제의 활성이 없어도 약 1-5% 세포에서 리포터 유전자가 발현되어 정확히 뉴클레아제에 의해 유전자가 변형된 세포를 정확히 선별할 수 없다.
그러나 본 발명의 일 구현예에 따른 리포터 구성물은 NHEJ 기작에 사용할 수 있는 리포터 구성물로서, 뉴클레아제 없이는 1% 이하 또는 0.1% 이하의 세포에서만 리포터가 발현되는 바, 뉴클레아제에 의해 유전자가 변형된 세포를 정확히 선별하고 농축시킬 수 있다.
본 발명의 리포터 구성물의 구체적인 일 구현예로서, 상기 리포터 구성물은 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제2 리포터 유전자가 순차적으로 포함되어 있되, 상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되도록 설계될 수 있다. 또한, 상기 제2 리포터 유전자의 업스트림(upstream)에 정지 코돈이 삽입될 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자 사이에 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열을 삽입하고, 제2 리포터 유전자가 제1 리포터 유전자의 번역 프레임(frame) 밖(out of frame)에 존재하도록 설계된 리포터 구성물을 사용할 수 있다. 이 경우, 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하지 않으면 제1 리포터 유전자만 발현되나, 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하게 되면, 절단된 DNA는 비상동 말단 접합(nonhomologous end joining, NHEJ) 기작에 의해 작은 크기의 삽입/결실(insertion/deletion: indel 돌연변이)이 일어나 프레임-이동 돌연변이가 일어날 수 있고, 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자가 같은 프레임 내(in frame)에 위치하게 될 수 있다. 즉, 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자 모두가 발현될 수 있다.
또 다른 리포터 구성물의 구체적인 일 구현예로서, 상기 리포터 구성물은 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터 유전자가 순차적으로 포함되어 있되, 상기 제1 리포터 유전자는 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부와 상관없이 발현되고, 상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자, 제3 리포터 유전자 또는 둘다의 발현 여부가 결정되도록 설계될 수 있다.
상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 제1 리포터 유전자와 번역 프레임이 맞지 않게 연결(out of frame)됨으로써, 뉴클레아제가 특정 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하여 프레임 이동 돌연변이가 일어나는 경우에만 발현되도록 설계되는 것이 바람직하다.
상기 리포터 구성물에서 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 서로 번역 프레임이 맞지 않게 연결될 수 있다. 이 경우, 제1 리포터 유전자와 제2 리포터 유전자 사이에 삽입된 뉴클레아제 표적 서열이 뉴클레아제에 의해 절단이 되면, 아미노산 코돈 프레임 변화가 일어나 제2 리포터 유전자가 발현되거나 제3 리포터 유전자가 발현되므로, 뉴클레아제가 표적 부위를 절단함으로써 발생하는 2가지의 모든 프레임 이동에 의해 발생한 돌연변이 세포를 한번에 선별할 수 있다. 즉, 뉴클레아제 활성에 의한 1개 단위의 아미노산 서열 및 2개 단위의 아미노산 서열의 변동동에 따른 프레임 이동 돌연변이된 세포를 선별할 수 있다. 또한, 1개 또는 2개 이상의 리포터 구성물을 세포에 도입시킴으로 인해서 3개 단위의 아미노산 서열의 변동으로 인해 발생하는 프레임 이동 돌연변이된 세포도 선별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 리포터 구성물에 제1 리포터 유전자와 아미노산 코돈 프레임이 맞지 않은 제2 리포터 유전자만 포함하는 경우, 한가지의 프레임 이동 돌연변이가 일어난 세포에 대해서만 선별이 가능하였으나, 제1 리포터 유전자와 아미노산 코돈 프레임이 맞지 않은 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자를 서로 다른 프레임에 배치하여 제조한 리포터 구성물은 2가지의 모든 프레임 이동 돌연변이가 일어난 세포를 선별할 수 있었다.
또한, 상기 리포터 구성물에서 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 서로 같은 번역 프레임으로 연결된 것일 수 있다.
상기 리포터 구성물에서 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 서로 같은 종류의 리포터 유전자일 수 있으며, 서로 다른 종류의 리포터 유전자일 수 있다.
제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자가 같은 프레임(in frame)에 있으면서 서로 같은 종류의 리포터 유전자일 경우, 뉴클레아제가 표적 서열을 절단함에 따라 리포터 유전자의 발현이 더 강하게 나타나게 되어 뉴클레아제에 의해 유전자가 변형된 세포를 보다 정확하게 선별 또는 농축할 수 있다.
제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자가 같은 프레임에 있으면서 서로 다른 종류의 리포터 유전자일 경우, 제2 리포터 유전자의 발현으로 MACS, drug selection 을 한 후에, 돌연변이된 세포가 제대로 농축되었는지 확인하기 위해 제2리포터 유전자의 발현을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 리포터 구성물의 한 양태로서, 뉴클레아제의 활성과 상관없이 발현되는, 적색 형광 단백질(RFP)을 코딩하는 제1 리포터 유전자; 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적서열; 제1 리포터 유전자와 번역 프레임이 맞지 않도록 구성된, 항생제 저항성 유전자(HPT)의 제2 리포터 유전자 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 제3 리포터 유전자를 포함하는 제조하였다. 상기 리포터 구성물은 ZFN이 없는 상태에서는 적색 형광 단백질만 발현되고 HPT-GFP 융합단백질은 발현되지 않았다. ZFN과 리포터를 함께 세포에 도입하면 ZFN이 리포터 내의 표적 서열에 정상적으로 작동했을 때, NHEJ에 의한 작은 삽입/결실이 무작위로 일어나게 되어 일부 리포터에서 HPT 유전자의 프레임이 RFP 유전자와 일치하게 되어 HPT 효소가 발현될 수 있다. 이러한 변이를 가지고 있는 리포터를 포함하는 세포는 하이그로마이신 B에 내성을 갖게 되어, 항생제를 처리함으로 인해서 뉴클레아제에 의해 유전자가 변형된 세포를 쉽게 선별할 수 있다. 또한 HPT 유전자에 GFP 유전자가 연결되어 있어 형광을 관찰함으로써 ZFN의 활성 여부를 손쉽게 확인할 수 있다. 즉, MACS, drug selection 을 한 후에, 돌연변이된 세포가 제대로 농축되었는지 간접적으로 형광 단백질의 발현을 이용해 확인할 수 특징이 있다.
따라서, 리포터 유전자의 발현은 특정 뉴클레아제가 이의 게놈 상 존재하는 내재성 표적 서열에 결합하여 특정 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있는 뉴클레아제의 활성을 반영할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 방법은, 상기 리포터 구성물을 후보 세포에 도입시키고, 리포터 유전자를 발현하는 세포와 발현하지 않는 세포를 분류하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 리포터 구성물을 후보 세포에 도입시킬 때, 상기 후보 세포 중 일부 또는 전부는 상기 리포터 구성물의 도입 전 또는 후에 상기 뉴클레아제를 발현할 수 있다. 또한, 제2단계에서 발현되는 뉴클레아제는 세포 내로 뉴클레아제를 직접 주입한 경우도 포함한다. 상기 뉴클레아제는 상기 후보 세포의 외래성 뉴클레아제 유전자 또는 내재성 뉴클레아제 유전자로부터 발현되는 것일 수 있다.
또한, 상기 뉴클레아제는 형질전환, electorporation, virus delivery를 통해 외부에서 도입할 수도 있고 이를 지정하는 유전자를 세포 내 유전체에 삽입한 상태에서 발현되도록 할 수도 있다.
상기 리포터 구성물은 1개 또는 2개 이상 세포 내에 도입시킬 수 있다.
상기 분류 방법은 리포터 유전자를 발현하는 세포와 발현하지 않는 세포를 분류할 수 있다면, 그 종류에 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 형광 활성 세포 분류법(Fluorescence-activated cell sorting, FACS), 또는 자성 활성 세포 분류법(Magnetic-activated cell sorting, MACS)을 사용하여 세포를 분류할 수 있다. 또 다른 예로서 항생제 저항성 유전자를 리포터로 사용하고 항생제를 처리하여 살아남는 세포를 골라냄으로서 내재 유전자(endogenous gene)에 돌연변이가 일어난 세포를 농축할 수 있다.
제1 리포터 유전자, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제2 리포터 유전자가 순차적으로 포함되어 있는 리포터 구성물을 사용하는 경우에는 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자를 모두 발현하는 세포와 제1 리포터 유전자만 발현하는 세포, 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자 모두 발현하지 않는 세포로 분류할 수 있다.
또한, 제1 리포터 유전자, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터가 순차적으로 포함되어 있는 리포터 구성물을 사용하는 경우에는 제1 리포터 유전자, 제2리포터 유전자, 및 제3리포터 유전자를 모두 발현하는 세포와 제1 리포터 유전자만 발현하는 세포, 제1 및 제2리포터 유전자만 발현하는 세포, 제1 및 제3리포터 유전자만 발현하는 세포로 분류할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 리포터 유전자를 발현하지 않은 세포 집단에 비하여, 리포터 유전자를 발현하는 세포 집단(리포터 유전자가 2개 포함되는 리포터 구성물을 사용하는 경우, 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자가 모두 발현되는 세포 집단)에서, 특정 뉴클레아제에 의해 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포의 비율이 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 상기 방법에서, 제2 내지 제3단계를 2회 이상 수행할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에서는 상기 제2 내지 제3단계를 2회 수행하였을 때, 1회 수행한 경우보다 세포 집단에서 유전자 변형된 세포들의 수가 현저히 증가됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 방법을 사용하면, 높은 비율로 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제1 내지 제3단계를 수행하여, 특정 뉴클레아제의 활성을 확인하는 방법도 포함된다. 상기 리포터 구성물이 도입된 후보 세포에서 뉴클레아제가 발현하여 상기 리포터 유전자 내에 포함된 표적 서열을 절단하게 되면, 리포터 유전자가 발현될 수 있다. 따라서, 리포터 유전자의 발현 여부를 통하여, 뉴클레아제가 특정 뉴클레오티드의 서열을 절단하는 활성을 가지는지 여부를 확인할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시키기 위한 리포터 구성물을 제공한다.
상기 구성물은 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제2 리포터 유전자가 포함되어 있고, 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 상기 리포터 구성물을 절단하는 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 것을 특징으로 한다.
상기 구성물에서 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제2 리포터 유전자는 순차적으로 포함될 수 있다.
상기 리포터 구성물은 특정 뉴클레아제가 상기 리포터 구성물에 포함된 특정 뉴클레오티드 서열을 절단하게 되면, 절단된 DNA는, 프레임-이동 돌연변이를 일으킬 확률이 높은 상동 재조합(homologous recombination, HR) 또는 비상동 말단 접합(nonhomologous end joining, NHEJ) 기작으로 복구될 수 있으므로, 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자 모두가 발현되게 할 수 있다.
또한, 상기 구성물은 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터 유전자가 포함되어 있되, 상기 제1 리포터 유전자는 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부와 상관없이 발현되고, 상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자, 제3 리포터 유전자 또는 둘다의 발현 여부가 결정되도록 설계될 수 있다.
상기 구성물은 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터 유전자가 순차적으로 포함될 수 있다.
상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 제1 리포터 유전자와 프레임이 맞지 않게 연결되는 것이 바람직하며, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 서로 프레임이 맞지 않게 연결된 것일 수 있으며, 서로 같은 프레임으로 연결된 것일 수 있다.
리포터 유전자의 발현은 특정 뉴클레아제가 이의 표적 서열에 결합하여 특정 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있는 뉴클레아제의 활성을 반영하며, 상기 리포터 구성물은 뉴클레아제가 활성을 가져 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시키기 위해 사용될 수 있다.
상기 리포터 구성물은 벡터일 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시키기 위한 리포터 구성물 하나 또는 둘 이상을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
상기 숙주세포는 특정 뉴클레아제가 표적 서열에 결합하여 특정 뉴클레오티드를 절단하는 활성을 가지는 지가 반영된 세포로 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시키기 위한 리포터 구성물 하나 또는 둘 이상; 숙주 세포; 뉴클레아제를 발현하는 구성물을 포함하는 뉴클레아제 활성의 모니터링 시스템을 제공한다.
상기 시스템에서, 상기 리포터 구성물, 상기 뉴클레아제 발현 구성물 또는 둘다는 상기 숙주 세포 내에 도입되어 있거나 세포 외에 별도로 구비되어 있을 수 있다. 또한, 상기 뉴클레아제는 외래성 숙주 세포의 외래성 뉴클레아제 유전자 또는 내재성 뉴클레아제 유전자로부터 발현되는 것일 수 있다. 상기 뉴클레아제는 형질전환, electorporation, virus delivery를 통해 외부에서 도입할 수도 있고 이를 지정하는 유전자를 세포 내 유전체에 삽입한 상태에서 발현되도록 할 수도 있다.
또한, 뉴클레아제와 리포터 구성물을 동시에 세포에 도입할 수도 있고 순차적으로 도입할 수도 있다.
용어 정의
본 발명에서 용어, "절단"은 DNA 분자의 공유 골격의 파괴일 수 있다. 절단은 다양한 방법으로 개시될 수 있는데, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 단일가닥 절단 및 이중가닥 절단이 가능하며, 이중가닥 절단은 2개의 별개 단일가닥 절단의 결과로 일어날 수 있다.
"결합"은 거대분자(예, 단백질과 핵산 사이) 사이에 서열-특이적, 비-공유 상호작용일 수 있다. 상호작용이 전체적으로 서열-특이적인 경우, 결합 상호작용의 모든 성분들이 서열 특이적일 필요는 없다(예를 들면, DNA 백본에서 인산염 잔기와의 접촉). 이와 같은 상호작용은 일반적으로 10-6M-1 또는 이하의 해리 상수(Kd)를 특징으로 할 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합이 존재할 수 있는 충분한 조건이 제공되는 경우 결합 분자가 결합되는 핵산의 부분을 한정하는 핵산 서열일 수 있다. 이는 "인식 부위" 또는 "인식 서열"과 호환하며 사용할 수 있다.
본 발명에서 "유전자"는 일반적으로 사용하는 생물체에서 유전될 수 있는 분자 단위로서, DNA, RNA 또는 이들이 코딩하는 단백질까지 포함한다.
"에피솜(episome)"은 복제 중인 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 여타의 구조일 수 있다. 에피솜의 예는 플라스미드 및 어떤 바이러스 게놈을 포함한다.
"외래성(exogenous)"분자는 세포에 정상적으로 존재하지는 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자일 수 있다. "세포에서 정상적인 존재"란 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건들에 의해 결정된다. 따라서, 예를 들면 근육의 배아 발생 동안에만 존재하는 분자는 성인 근육 세포에 대해서는 외생 분자가 된다. 외생 분자는 조합 화학 과정에 의해서 생성되는 소분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지질 단백질, 폴리사카라이드, 상기 분자들의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자들의 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체와 같은 거대분자일 수 있다.
대조적으로, "내생" 또는 "내재성" 분자는 특정 환경 조건하에서 특정 발달 단계의 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들면, 내생 핵산은 미토콘드리온, 엽록체 또는 다른 기관의 게놈 또는 자연-발생 에피좀 핵산을 포함 할 수 있다. 추가의 내생 분자는, 예를 들면 전사 인자 및 효소와 같은 단백질을 포함할 수 있다.
"벡터" 란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자일 수 있다. 상기 벡터의 예로 플라스미드, 코즈미드, 박테리오파아지 및 바이러스 벡터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다.
본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 한다. 적절한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 분비 시그널 서열 등을 목적에 따라 포함하여 다양하게 제조될 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다. 본 발명에서 "플라스미드" 와 "벡터"는 플라스미드를 뜻하는 용어로서 서로 바꾸어쓸 수 있는 용어이고, 벡터 형태로 가장 일반적으로 사용된다.
상기 "작동가능한 연결" 및 "작동 가능하게 연결된 또는 작동적 연결된"은 2개 이상의 성분(서열 요소)들의 병치에 대해 호환되며, 성분들은 성분의 기능이 정상적이고, 이때 성분들이 성분들 중 하나에서 발휘되는 기능을 성분 중 최소 하나가 조절할 가능성을 허용하는 상태로 배열된다.
상기 "재조합"은, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되거나, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래된 것을 말한다.
"징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease)"란 징크 핑거 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합단백질을 의미하며, 공지의 또는 상용의 징크 핑거 뉴클레아제 모두를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "징크 핑거 뉴클레아제" 와 "ZFN"은 혼용될 수 있다.
"리포터 유전자" 는 당업계에서 일반적으로 사용하는 분석방법에서 쉽게 측정되는 단백질 산물을 생산하는 유전자로서, 세포, 동물 또는 식물에서 위치나 발현 정도를 쉽게 측정할 수 있는 유전자이면 그 종류는 제한되지 않는다.
리포터 구성물
본 발명의 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인 또는 농축시키는 방법 및 뉴클레아제 활성의 모니터링 시스템은 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 구성물을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 리포터 구성물은 특정 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되도록 설계될 수 있다. 예를 들어서, 상기 리포터 구성물은 번역 프레임(frame)이 맞지 않아 발현되지 않는 리포터 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열이 리포터 유전자의 중간이나 앞에 삽입되어 있는 것으로, 상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는 경우 상기 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되도록 설계될 수 있다.
또는, 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제2 리포터 유전자가 순차적으로 포함되어 있되, 상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되도록 설계될 수 있다. 또한, 상기 제2 리포터 유전자의 업스트림(upstream)에 정지 코돈이 삽입될 수 있다.
또는 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터 유전자가 순차적으로 포함되어 있되, 상기 제1 리포터 유전자는 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부와 상관없이 발현되고, 상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자, 제3 리포터 유전자 또는 둘다의 발현 여부가 결정될 수 있다.
상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 제1 리포터 유전자와 번역 프레임이 맞지 않게 연결된 것일 수 있으며, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 서로 번역 프레임이 맞지 않게 연결된 것이거나, 서로 같은 프레임으로 연결된 것일 수 있다.
스크리닝될 뉴클레아제(들)의 하나 이상의 표적 부위는 PCR 또는 TOPO 및/또는 Gateway 클로닝 시스템과 같은 시판되는 클로닝 시스템을 비롯한 임의의 적절한 방법에 의해 리포터 구성물 내로 삽입될 수 있다.
상기 리포터 구성물에서, 리포터 유전자의 5' 영역은 구성성 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
상기 리포터 구성물에 포함되는 리포터 유전자는 발색 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 발색 단백질은 형광 단백질 또는 발광 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 황색 형광 단백질(Yellow Fluorescent Protein, YFP), 청록 형광 단백질(Cyan Fluorescent Protein, CFP), 및 주황 형광단백질(Orange Fluorescent Protein, OFP)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 녹색 형광 단백질은 향상된 녹색 형광 단백질(enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP) 또는 에메랄드(Emerald) GFP일 수 있다. 상기 황색 형광 단백질은 비너스(Venus), mCitrine, YPet, 및 eYFP로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질일 수 있다. 상기 청록 형광 단백질은 CyPet, mCFPm, 및 Cerulean으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질일 수 있다. 상기 주황 형광 단백질은 mOrange 또는 mKO 단백질일 수 있다. 상기 적색 형광 단백질은 단량의 적색 형광 단백질(monomeric red fluorescent protein, mRFP), mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, 및 DsRed로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질일 수 있다. 또한, 상기 발광 단백질은 발광 반딧불이 루시퍼라아제(Firefly luciferase), 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 및 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 그러나, 본 발명의 발광 단백질이 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 리포터 유전자는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase), 베타-락타마아제(β-lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 및 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
또한, 본 발명의 리포터 유전자는 선택마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene)일 수 있다.
또한, 본 발명의 리포터 유전자는 항생제 저항성 유전자일 수 있다.
본 발명의 리포터 구성물은 번역 프레임이 맞지 않아 발현되지 않는 리포터 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서는, GFP의 C-말단 부위가 GFP의 N-말단 부위의 번역 프레임 밖에 존재하도록, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열을 GFP 사이에 삽입하였다. 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하게 되면, DSB(double strand break)가 유도되나, 단일 가닥 중합 시스템에 의해 유전자의 DSB가 복구되어 GFP가 발현될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서는, 적색 형광 단백질을 코딩하는 제1 리포터 유전자, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 제2 리포터 유전자를 순차적으로 포함된 리포터 구성물을 사용하였다. 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하여 DSB를 유도하면, 프레임 이동 돌연변이를 자주 일으키는 NHEJ에 의해 복구되어, 적색 형광 단백질과 녹색 형광 단백질이 모두 발현될 확률이 높아지게 된다.
상기 리포터 유전자를 형광 단백질을 코딩하는 유전자로 사용할 경우, 제1 리포터 유전자와 제2 리포터 유전자는 다른 형광색을 발현하는 유전자를 사용하여, 리포터 유전자의 발현여부를 용이하게 구별할 수 있는 것이 바람직하다.
아울러, 본 발명의 또 다른 구현예에서는, 형광 단백질을 코딩하는 제1 리포터 유전자, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 2A-펩타이드를 코딩하는 유전자 및 세포의 표면 마커인 MHC 클래스 I 분자 H-2Kk 유전자로 구성된 리포터 구성물을 사용하였다. 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하여 DSB를 유도하면, 프레임 이동 돌연변이를 자주 일으키는 NHEJ에 의해 복구되어, 형광 단백질 뿐만 아니라, 2A-펩타이드 및 H-2Kk 도 함께 발현되게 된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 적색 형광 단백질을 코딩하는 제1 리포터 유전자, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제1 리포터 유전자와 번역 프레임이 맞지 않게 연결된, 녹색 형광 단백질을 코딩하는 제2 리포터 유전자 및 제3리포터 유전자로 구성된 리포터 구성물을 사용하였다. 상기 리포터 구성물은 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하여 DSB를 유도하면, 프레임 이동 돌연변이를 자주 일으키는 NHEJ에 의해 복구되어 제2형광 단백질 또는 제3형광 단백질을 발현할 수 있다.
또 다른 구현예에서는 뉴클레아제의 활성과 상관없이 발현되는, 적색 형광 단백질(RFP)을 코딩하는 제1 리포터 유전자; 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적서열; 제1 리포터 유전자와 번역 프레임이 맞지 않도록 구성된, 항생제 저항성 유전자(HPT)의 제2 리포터 유전자 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 제3 리포터 유전자를 포함하는 제조하였다. ZFN과 리포터를 함께 세포에 도입하면 ZFN이 리포터 내의 표적 염기서열에 정상적으로 작동했을 때 일부 리포터에서 HPT 유전자의 프레임이 RFP 유전자와 일치하게 되어 HPT 효소가 발현될 수 있고, 이러한 변이를 가지고 있는 리포터를 포함하는 세포는 하이그로마이신 B에 내성을 갖게 되어, 항생제를 처리함으로 인해서 뉴클레아제에 의해 유전자가 변형된 세포를 쉽게 선별할 수 있다.
상기 리포터 유전자의 발현 여부는 시판되는 다양한 검출 시스템을 이용하여 확인할 수 있다.
예를 들어서, 리포터 유전자로서, 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 사용한 경우, 리포터 유전자를 발현하는 세포 또는 리포터 유전자를 발현하지 않는 세포의 검출 및 분류는 형광 활성 세포 분류(FACS) 시스템을 사용하여 수행할 수 있다. FACS는 유세포 분석법을 수행하여 세포를 분류하는 것으로서, 유액 상태의 입자나 세포가 일정 감지지역(sensing point)을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여 한 세포가 갖는 여러 특징(세포의 크기, 세포 내부 조성정도, 세포기능 인지등)을 동시에 측정하고 경우에 따라 특정한 세포들만을 선택하여 분류(sorting)할 수 있는 방법이다. 본 발명의 일 구현예에서는 형광 단백질을 발현하는 세포를 유세포 분석법으로 분류하여, 특정 뉴클레아제에 의해 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포들의 비율이 높은 세포 집단을 분류하였다.
또한, 제2 리포터 유전자로서, 세포 표면에 발현하는 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 사용한 경우, 제2 리포터 유전자를 발현하는 세포 또는 제2 리포터 유전자를 발현하지 않는 세포의 검출 및 분류는 자성 활성 세포 분류 시스템을 사용하여 수행할 수 있다. MACS는 세포 표면의 특정 항원에 대한 항체로 코팅된 자기 나노파티클을 사용하여, 세포를 분류하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서는, 리포터 구성물로서 mRFP 유전자, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 2A-펩타이드 서열 및 마우스 MHC 클래스 I 분자 H-2Kk 유전자가 순차적으로 연결된 구성물을 사용한 경우, 세포들을 H-2Kk-특이적 자기 비드로 표지하고, MACS 컬럼 상에서 자기력으로 분리하여, 상기 뉴클레아제에 의해 특정 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포들의 비율이 높은 세포 집단을 분류하였다. 특히, MACS 방법은 레이저를 사용하여 세포를 분류하는 것이 아니기 때문에, 세포를 분류하는 과정에서 세포에 손상을 입히지 않게 되어, 표적 유전자가 변형된 돌연변이 세포를 보다 효율적으로 분류하고 농축시킬 수 있다.
뉴클레아제
본 발명에서 설명된 방법, 시스템, 및 리포터 구성물은 뉴클레아제 종류에 제한없이 광범위하게 적용될 수 있다. 바람직하게는 상기 뉴클레아제는 표적 특이적 뉴클레아제이며, 표적 특이적 뉴클레아제란, 게놈상의 DNA의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제일 수 있다. 상기 뉴클레아제는 게놈상의 특정 표적 서열를 인식하는 도메인과 절단하는 도메인이 융합된 뉴클레아제가 포함될 수 있으며, 그 예로 메가뉴클레아제(meganuclease), 게놈상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인인 식물 병원성 유전자에서 유래한 TAL 작동자(transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 융합 단백질, 또는 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease)가 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 메가뉴클레아제일 수 있다. 자연-발생 메가뉴클레아제는 15-40개 염기쌍 절단 부위를 인식하는데, 이는 통상 4개의 패밀리로 분류된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리, 및 HNH 패밀리. 예시적인 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다.
이들의 인식하는 표적 서열은 공지되어 있다.
자연-발생 메가뉴클레아제, 주로 LAGLIDADG 패밀리로부터 유래하는 DNA 결합 도메인을 이용하여 식물, 효모, 초파리(Drosophila), 포유동물 세포 및 마우스에서 위치-특이적 게놈 변형이 촉진되었으나, 이런 접근법은 메가뉴클레아제 표적 서열이 보존된 상동성 유전자의 변형(Monet et al. (1999) Biochem. Biophysics. Res. Common. 255: 88-93)으로, 표적 서열이 도입되는 사전-조작된 게놈의 변형에는 한계가 있었다. 따라서, 의학적으로나 생명공학적으로 관련된 부위에서 신규한 결합 특이성을 나타내도록 메가뉴클레아제를 조작하려는 시도가 있었다. 또한, 메가뉴클레아제로부터 유래하는 자연-발생된 또는 조작된 DNA 결합 도메인이 이종성 뉴클레아제(예, FokI)로부터 유래하는 절단 도메인에 작동 가능하게 연결되었다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)일 수 있다. ZFN은 선택된 유전자 및 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인 내의 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크-핑거 단백질을 포함한다. 징크-핑거 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416을 참고한다. 자연 발생된 징크 핑거 단백질과 비교하여, 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중(또는 사중) 뉴클레오티드 서열, 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 이용을 포함하며, 이때 각 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 서열과 연합된다.
표적 서열의 선택, 융합 단백질(및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구성은 당업자에 공지되어 있으며, 전문이 참고자료로 첨부되는 미국특허출원 공개 2005/0064474 및 2006/0188987에 상세하게 설명된다. 또한, 이러한 참고문헌 및 다른 문헌에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질들이 임의의 적절한 링커 서열, 예를 들면 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 6개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예는 미국특허 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949을 참고한다. 여기 설명된 단백질들은 단백질의 각 징크 핑거 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또한, ZFN 및/또는 메가뉴클레아제와 같은 뉴클레아제는 뉴클레아제(절단 도메인, 절단 하프-도메인)를 포함한다. 상기 주지된 대로, 예를 들면 징크 핑거 DNA 결합 도메인과 한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인 또는 메가뉴클레아제 DNA 결합 도메인과 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인과 같이, 절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제나 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래할 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
유사하게, 절단 하프-도메인은, 상기 제시된 바와 같이, 절단 활성을 위하여 이량체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 그것의 일부로부터 유래될 수 있다. 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함하는 경우, 일반적으로 2개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안으로, 2개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수도 있다. 2개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있고, 또는 각 절단 하프-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제(또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있다. 또한, 2개의 융합 단백질의 표적 부위는, 2개의 융합 단백질과 그것의 각 표적 부위의 결합에 의해 절단-하프 도메인들이 서로에 대해 공간적으로 배향되어 위치됨으로써, 절단 하프-도메인이, 예를 들어 이량체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있도록 하는 관계로 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 일 구현예에서, 5-8개 뉴클레오티드 또는 15-18개 뉴클레오티드에 의해 표적 부위의 이웃 가장자리가 분리된다. 그러나, 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다(예, 2 내지 50개 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 놓인다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하며, DNA에 서열-특이적으로 결합하여(표적 부위에서), 바로 결합 부위나 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 어떤 제한 효소(예, Type IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며, 분리가능한 결합과 절단가능한 도메인을 가진다. 예를 들면, Type IIS 효소 FokI은 한 가닥 상의 인식 부위로부터 9개 뉴클레오티드에서 그리고 나머지 한 가닥 상의 인식 부위로부터 13개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중가닥 절단을 촉매한다. 따라서, 한 구현예에서, 융합 단백질은 최소 1개의 Type IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)과 하나 이상의 아연-핑거 결합 도메인(조작될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는)을 포함한다.
또한, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일 구현예에서는, 표 3에 기재된 것 중의 하나의 뉴클레아제를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용한 뉴클레아제는 리포터 구성물을 세포에 도입하기 전에 이미 뉴클레아제가 이미 발현하고 있을 수도 있으며, 리포터 구성물을 세포에 도입한 후에 뉴클레아제가 발현할 수도 있다. 또한, 상기 뉴클레아제는 세포의 내재성 뉴클레아제 유전자로부터 발현될 수도 있으며, 세포의 외래성 뉴클레아제 유전자로부터 발현되는 것일 수 있다. 외래성 뉴클레아제 유전자로부터 발현되기 위해서, 뉴클레아제 발현 구성물을 세포에 도입시킬 수 있는데, 뉴클레아제의 도입 시기는 리포터 구성물의 도입 전, 도입 후에 상관 없이 도입될 수 있으며, 또는 리포터 구성물과 동시에 세포에 도입될 수 있다.
본 발명에서 사용한 뉴클레아제의 발현 구성물은 당 분야에 공지된 방법들을 이용하여 쉽게 설계될 수 있다. 예를 들어서, 뉴클레아제의 발현은 라피노오스 및/또는 갈락토오스의 존재하에 활성화(탈-억제)되고, 글루코오스 존재하에 억제되는 갈락토키나제 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 제어를 받는다. 특히, 탄소 공급원을 연속하여 변화시킬 때(예를 들면, 글루코오스에서 라피노오스로, 다시 갈락토오스로) 갈락토키나제 프로모터가 유도되고 뉴클레아제(들)가 발현된다. 유도성 프로모터의 다른 예로서, CUPl, METl 5, PHO 5, 및 tet-반응성 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
숙주세포
뉴클레아제(들)에 의한 표적 서열의 절단시 기능성 리포터를 재구성하는 임의의 숙주 세포가 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 세포 타입은 세포주 또는 자연적(예, 분리된) 세포, 예를 들면, 1차 세포일 수 있다. 세포주는, 예를 들면 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 입수되거나, 또는 당 분야에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 유사하게, 당 분야에 공지된 방법들에 의해 세포가 분리될 수 있다. 세포 타입의 예로서는, 암성 세포, 형질전환된 세포, 병인학적으로 감염된 세포, 완전히 분화된 세포, 부분적으로 분화된 세포, 불사화된 세포 등과 같은, 병을 가지거나 가지게 될 세포를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 원핵(예, 박테리아) 또는 진핵(예, 효모, 식물, 곰팡이, 어류 및 고양이, 개, 뮤린, 소, 돼지 및 인간과 같은 포유동물 세포) 세포가 이용될 수 있으며, 진핵 세포가 바람직하다. 적절한 포유동물 세포주는 CHO(중국 햄스터 난소) 세포, HEP-G2 세포, BaF-3 세포, Schneider 세포, COS 세포(SV40 T-항원을 발현하는 원숭이 신장 세포), HEK 세포, CV-1 세포, HuTu80 세포, NTERA2 세포, NB4 세포, HL-60 세포 및 HeLa 세포, 293 세포(Graham et al.(1977) J. Gen. Virol. 36:59), SP2 또는 NS0와 같은 골수종 세포(예, Galfre and Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73(B):3 46 참고)를 포함한다. 다른 진핵 세포는, 예를 들면 곤충(예, sp. frugiperda), 효모를 비롯한 곰팡이 세포(예, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, K. lactis, H. polymorpha), 및 식물 세포(Fleer R. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:486 496)를 포함한다.
또한, 배양된 세포(시험관내), 이식편 및 1차 배양물(시험관내 및 생체외), 및 생체내 세포일 수 있다.
또한, 본 발명의 세포는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)일 수 있다. 즉, 본 발명의 방법 및 리포터 시스템을 사용하여, 뉴클레아제에 의해 인식되는 특정 뉴클레오티드 서열이 변형된 유도 만능 줄기세포를 제조하고, 이를 환자 맞춤형 세포 치료제로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포는 동물의 특정 조직의 세포일 수 있다. 본 발명의 방법 및 리포터 시스템을 사용하여 뉴클레아제에 의해 인식되는 특정 뉴클레오티드 서열이 변형된 형질전환된 세포를 대량으로 생산할 수 있다.
뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포의 농축
본 발명은 특정 뉴클레아제가 특정 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는 여부에 따라 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 리포터 구성물을 사용하여, 상기 뉴클레아제에 의해 세포 내 상기 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인 또는 농축시킬 수 있다.
상기 확인 또는 농축하고자 하는 세포의 변형된 뉴클레오티드 서열은 게놈 상에 존재하는 내생적 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
또한, 상기 뉴클레아제에 의해 뉴클레오티드 서열이 변형된, 돌연변이된 세포를 확인 또는 농축시키는 방법에서, 상기 돌연변이는 국지적 돌연변이 뿐만 아니라, 결실, 삽입, 역위, 중복, 전좌와 같은 염색체 재배열과 같은 돌연변이도 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서는, 특정 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 구성물을 준비하고, 이를 후보 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 리포터 구성물을 세포에 도입하기 전 또는 후에, 세포 중 일부 또는 전부는 상기 뉴클레아제를 발현할 수 있다.
리포터 구성물 또는 외래성 뉴클레아제 유전자로부터 발현되는 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키기 위하여, 리포터 구성물 또는 뉴클레아제 발현 구성물을 세포 내에 도입시킬 수 있다. 도입 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 구성물을 세포 내로 도입하기 위하여, 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의하여 외래 DNA를 세포로 유입시킬 수 있다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 리포터 구성물을 세포 내로 도입시킨 후, 뉴클레아제가 상기 리포터 구성물의 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하고, 이로 인해 유도된 DSB를 복구하기 위하여 세포 기전에 필요한 회복 기간 후에 세포를 분류한다.
상기 세포 분류는 리포터 유전자를 발현하는 세포와 발현하지 않는 세포로 분류한다. 리포터 유전자를 발현하는 세포들의 집단은 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 게놈 상에 존재하는 내생적 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포의 비율이 높아, 본 발명을 사용하면, 뉴클레아제에 의해 게놈 상에 존재하는 내생적 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 농축시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 P53 유전자를 표적으로 하는 ZFN쌍을 인코딩하는 플라스미드 및 리포터 벡터로서, 단량의 적색 형광 단백질(mRFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 ZFN의 인식 부위, 및 항샹된 녹색 형광 단백질(eGFP)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 포함하는 리포터 벡터를 인간 배아 신장 세포에 형질감염시킨 후, 유세포 분석법으로 RFP+ GFP+ 세포 집단을 분류하고, 상기 세포 집단의 돌연변이율을 측정하였다. 그 결과, 유세포 분석법으로 분류된 RFP+ GFP+ 세포 집단에서의 뉴클레아제에 의한 돌연변이율이 RFP- GFP- 세포 집단 및 RFP+ GFP- 세포 집단에 비하여, 약 20배 정도 증가되어 나타났다. 요컨대, 본 발명은 동일한 수의 세포가 포함된 집단에서 뉴클레아제에 의해 유전체가 변형된 세포의 비율을 증가, 즉, 뉴클레아제에 의해 돌연변이된 세포를 현저히 농축시킬 수 있다.
또 다른 구현예로서, CCR5 유전자를 표적으로 하는 ZFN 쌍을 인코딩하는 플라스미드 및 상기 리포터 벡터를 세포에 형질감염시킨 후, 유세포 분석법으로 로 RFP+ GFP+ 세포 집단을 분류하고, 돌연변이율을 측정한 결과, RFP- GFP- 세포 집단, RFP+ GFP- 세포 집단에 비하여 돌연변이율이 약 11배 증가되었으며, fPCR 분석 결과, 약 38배 증가되었음을 확인하였다.
또한, 징크 핑거 뉴클레아제 뿐만 아니라, TALE 뉴클레아제를 적용한 결과에서도, 유세포 분석법으로 분류된 2개의 형광 단백질이 모두 발현되는 세포 집단에서 돌연변이율이 현저히 높음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 리포터 시스템 및 이를 이용한 뉴클레아제에 의해 유전체 변형된 세포를 농축시키는 방법은 하기와 같은 장점을 가진다.
첫번째로, 본 발명의 리포터 시스템은 뉴클레아제의 활성에 영향을 미치지 않으면서, 이들의 활성을 반영할 수 있으므로, 뉴클레아제의 활성을 증진시킬 수 있는 다른 방법과 병용하여 사용할 수 있다.
둘째로, 본 리포터 시스템은 비침습적이기 때문에, 돌연변이 세포 집단을 더 농축시키기 위하여, 추가적인 세포 내로 도입 및 세포 분류를 반복적으로 수행할 수 있다. 쌍대립 유전자 녹아웃 세포들은 상기 과정을 반복하여 수득할 수 있다. 더욱이, 유세포 분석법으로 분류되거나 형광 현미경으로 분리한 유전자-변형된 세포들은 살아있는 상태이며, 체세포 핵 이식 또는 유도 만능 줄기세포의 제조와 같은 실험을 수행하는데 적합하다.
셋째로, 본 리포터 구성물은, 배지에서 세포가 분열하면서 1주 또는 2주 후에 뉴클레아제 플라스미드와 함께 사라지는 에피솜 플라스미드 형태로 전달되기 때문에, 뉴클레아제 표적 서열을 제외하고는 게놈 전체가 손상되지 않은 상태로 남아 있을 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
<실험방법>
ZFNs 및 TALENs을 인코딩하는 플라스미드의 제조
본 발명에서 사용한, 징크-핑거 뉴클레아제(zinc finger nucleases, ZFN)를 인코드(encode)하는 플라스미드는 종전의 연구(Kim et al., Genome Res 19(7), 1279, 2009)에서 기재된 방법으로 작제하였다. TP53을 표적으로 하는 ZFN 쌍을 인코드하는 플라스미드에는 서열번호 1로 표시한 sharkey RR FokI 도메인(TP53-L)의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3으로 표시한 sharkey DAS FokI 도메인(TP53-R)의 폴리뉴클레오티드를 포함시켰다. 서열번호 1로 표시한 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 sharkey RR FokI 도메인(TP53-L) 및 서열번호 3으로 표시한 폴리뉴클오티드가 코딩하는 sharkey DAS FokI 도메인(TP53-R)의 DNA 인식 헬리스는 도 1에 기재된 서열에서 밑줄로 표시하였다. 본 발명에서 사용한 ZFN은 엑손(exon) 5 내 부위를 표적으로 하는 특징을 가지고 있다. 또한, 본 발명에서, ZFN의 뉴클레아제 도메인은 의무적 이형이량체(heterodimers)를 사용하였다(KK/EL(Miller et al., 2007) 또는 sharkey DAS/RR(Guo et al., 2010)).
인간 CCR5 유전자를 표적으로 하는 TAL 작동자(Tal effectors, TALEs)를 인코드하는 플라스미드는 종전의 기술(Kim et al., Genome Res 19(7), 1279, 2009)에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여 준비하였다.
또한, 서열번호 48 및 49로 표시한 아미노산을 포함하는 TAL-이펙터 뉴클레아제(TAL-effector nucleases, TALENs), 서열번호 50 및 서열번호 51의 아미노산을 포함하는 TALEN을 인코딩하는 플라스미드를 당업계에 공지된 방법으로 제조하였다.
pRGS 벡터의 제작
mRFP 유전자는 하기 표 1에 기재된 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열을 가지는 프라이머를 사용하여, pcDNA3-mRFP로부터 증폭시켰으며, 증폭된 산물은 pEGFP-N1 (Clontech)의 NheI 부위 내로 클로닝하였다. 또한, eGFP 유전자는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 사용하여 증폭시켰으며, 상기 플라스미드의 BamHI 및 NotI 부위 내로 클로닝하여 pRGS를 제조하였다.
표 1
mRFP F 5'-GCGGCTAGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACGTCATC-3' (서열번호 5)
mRFP R 5'-GCGGCTAGCGAATTCGGCGCCGGTGGAGTGGCGGCCC-3' (서열번호 6)
eGFP F 5'-GCGGGATCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' (서열번호 7)
eGFP R 5'-GTCGCGGCCGCTTTACTTGTAC-3' (서열번호 8)
또 다른 리포터 플라스미드를 제조하기 위하여, mRFP 유전자는 상기 서열번호 5 및 6의 서열을 가지는 프라이머를 사용하여 pcDNA3-mRFP 로부터 증폭하였고, 증폭된 유전자 산물은 pEGFP-N1(Clontech)의 NheI와 EcoRI 부위 안으로 클로닝하였다. 2A-peptide 및 eGFP 유전자는 하기 서열번호 9 및 10의 서열을 가지는 프라이머를 사용하여 E2A가 삽입되어 있는 pEGFP-N1으로부터 증폭하여 BamHI과 NotI 부위를 이용하여 클로닝하였다. 이 플라스미드의 NheI 자리는 silencing mutation 을 도입하여 없애고, 2A-petide 뒤에 새로운 NheI 자리를 넣어주었다. 마우스 MHC 클래스 I 분자 H-2Kk 유전자는 서열번호 10 및 11의 서열을 가지는 프라이머를 이용하여 pMACSKk.II(miltenyi biotech)로부터 증폭한 뒤 상기 플라스미드의 NheI과 NotI 자리를 이용해 eGFP 대신 교체해 넣는 클로닝을 진행하였다. ZFN이 인식할 수 있는 표적 염기서열은 합성한 oligonucleotides(Bioneer, Daejon, South Korea) 를 in vitro 에서 어닐링(annealing) 시킨 다음 상기 플라즈미드의 EcoRI과 BamHI 자리를 이용하여 삽입하여 넣었다.
표 2
2A-peptide F 5'-GGCGGATCCTCAATGTACTAACTACGCTTTGTTG-3' (서열번호 9)
2A-peptide R 5'-GGGCGCGGCCGCCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3' (서열번호 10)
H-2Kk F 5'-GGCGCTAGCATGGCACCCTGCATGCTGCTCCTGCTGTTGGCCGCGG-3' (서열번호 11)
H-2Kk R 5'-GCCGCGGCCGCTTACCCTCCTTTTCCACCTGTGTT-3' (서열번호 12)
리포터(Reporters) 구조물의 제조
뉴클레아제의 표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 in vitro에서 합성하고(Bioneer, Daejon, South Korea), 중합(annealing)하였다. 표적 부위의 서열은 하기 표 3에 기재된 바와 같았다.
표 3
인공 뉴클레아제 (Programmable nuclease) 표적 서열(Target sequence) 서열번호
ZFN-224_L 5'-GATGAGGATGAC-3' 13
ZFN-224_R 5'-AAACTGCAAAAG-3' 14
Z891_L 5'-ATAGATGATGGG-3' 15
Z891_R 5'-GTCGGGGAGAAG-3' 16
TP53_L 5'-GGCGCGGACGCG-3' 17
TP53_R 5'-CATCTACAAGCA-3' 18
TALEN_L 5'-TGCATCAACCCCATCATC-3' 19
TALEN_R 5'-TAGTTTCTGAACTTCTCCCC-3' 20
Thumpd3_L 5'-CGAGCACGCCGC-3' 21
Thumpd3_R 5'-GGAGACCGGAAG-3' 22
CMAH-ZFN_L 5'-AAGCAGGACCGA-3' 23
CMAH-ZFN_R 5'-CGAGGATGGTGG-3' 24
NFKB2a-L 5'-TCGGGGGTGGCTCCCACATG-3' 25
NFKB2a-R 5'-TAGCCCCCGGCTGCACCCCC-3' 26
NFKB2b-L 5'-TCGACTACGGCGTCACCGCG-3' 27
NFKB2b-R 5'-TGGCGCTGTCCCGCCAGCAG-3' 28
중합된 올리고뉴클레오티드는 EcoR1 및 BamH1로 절단시킨 벡터(pRGS) 내에 결합시켰다. 상기 리포터 구조물 중에서 TP53 표적 서열을 포함하는 리포터 구조물의 서열은 서열번호 29 및 도 2에 기재하였다. 특히, ZFN의 표적 서열은 도 2에 기재된 서열에서 밑줄로 표시하였다.
또한, TALEN의 표적 서열을 포함하는 이중 프레임 리포터 구조물의 서열은 도 16(서열번호 52) 및 17(서열번호 53)에 기재하였으며, CMAH-ZFN의 표적 서열을 포함하는 이중 프레임 리포터 구조물의 서열은 도 24(서열번호 54) 및 25(서열번호 55)에 기재하였다.
세포 배양
인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포를 100 units/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 및 10% 우태아 혈청(FBS)이 첨가된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium; DMEM, Invitrogen) 내에서 배양시켰다. Andras Nagy 및 Knut Woltje에 의해 확립된 마우스 유도 다분화능 줄기세포주(iPS)는 Andras Nagy (Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada)로부터 얻었으며, 이를 피더 세포(feeder cell) 없는 젤라틴화된 배양 디쉬 상에서 10% 우태아혈청, 0.1 mM 비필수 아미노산(Invitrogen), 1 mM 소디움 피루베이트, 0.1mM 2-머캅토에탄올, 2000 U/mL의 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF), 100 units/ml 페니실린, 및 100 g/ml 스트렙토마이신이 첨가된 글래스고 수정 이글 배지(Glasgow modified Eagle medium (Sigma))에서 배양시켰다. 마우스 iPS 세포 유래의 섬유아세포를 얻기 위해서 세포를 3주 동안 LIF 없는 상태로 배양시켰다.
형질감염(Transfection)
HEK293 세포는 Fugene 6 또는 Fugene HD (Roche)를 사용하여 형질감염되었으며, 마우스 iPS 세포로부터 유래된 섬유아세포의 형질감염은 Magnetofection (Chemicell)을 사용하여 수행되었다. ZFN와 관련된 실험에서는, ZFN을 인코딩하는 플라스미드: 다른 ZFN을 인코딩하는 플라스미드: 리포터의 중량비를 1:1:2로 하였고, TENs와 관련된 실험에서는 상기 DNA의 중량비를 1:1:1로 하였다. TENs와 관련된 실험을 제외하고는, 3일 후에 형질감염된 세포에 대해 유동세포 분석법(flow cytometry)을 수행하였다.
TEN으로 형질감염된 세포는 유동세포 분석법을 수행할때까지 30℃(저온 충격) 에서 3일 배앙한 후, 37℃에서 하루 배양하였다.
T7E1 분석
T7E1 분석(T7E1 assay)은 기존에 공지된 방법으로 수행하였다. 요약하면, 제조사의 지시에 따라 게놈 DNA를 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)를 이용하여 분리하였다.
인공 뉴클레아제의 인식 부위를 포함하는 DNA 부위는 하기 표 4에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다.
표 4
CCR5(ZFN-224) F 5'-GAGCCAAGCTCTCCATCTAGT-3' (서열번호 30)
R 5'-CTGTATGGAAAATGAGAGCTGC-3'(서열번호 31)
CCR5(Z891) F 5'-GAGCCAAGCTCTCCATCTAGT-3' (서열번호 32)
NF 5'-TTAAAGATAGTCATCTTGGGGC-3' (서열번호 33)
R 5'-TCACAAGCCCACAGATATTT-3'(서열번호 34)
TP53 F 5'-GCAGGAGGTGCTTACGCATGTTTGT-3' (서열번호 35)
R 5'-GCTGCTCACCATCGCTATCTGAGC-3' (서열번호 36)
CCR5(TALEN) F 5'-GAGCCAAGCTCTCCATCTAGT-3' (서열번호 37)
NF 5'-TTAAAGATAGTCATCTTGGGGC-3' (서열번호 38)
R 5'-TCACAAGCCCACAGATATTT-3' (서열번호 39)
Thumpd3 F 5'-CAACCGAGCATCCGCTCGCTAGG-3'(서열번호 40)
R 5'-GAAGGGGCTGGAGTGGTGTTACCG-3'(서열번호 41)
가열을 가해 상기 PCR을 통해 수득된 앰플리콘(amplicon)을 변형시켰으며, 이형이중가닥(heteroduplex) DNA 형태로 중합시켰다. 상기 이형이중가닥 DNA를 15분간 37℃에서 5 unit의 T7 엔도뉴클레아제 1 (New England Biolabs)을 처리하여, 아가로즈 겔 전기영동을 통하여 분석하였다.
fPCR(fluorescent PCR) 수행
퓨전 중합효소(phusion polymerase (Fynnzymes)) 및 5'-FAM 표지된 프라이머를 이용하여 게놈 DNA(반응 당 100ng)를 PCR 증폭시켰다. 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 5에 기재하였다.
표 5
CCR5 (ZFN-224) F 5'-TGCACAGGGTGGAACAAGATGG-3'(서열번호 42)
R 5'-FAM-GAGCCCAGAAGGGGACAGTAAGAAGG-3'(서열번호 43)
CCR5 (Z891) F 5'-FAM-GAATAATTGCAGTAGCTCTAACAGG-3'(서열번호 44)
R 5'-CTCTTGCTGGAAAATAGAACAGC-3'(서열번호 45)
TP53 F 5'-GCAGGAGGTGCTTACGCATGTTTGT-3' (서열번호 46)
R 5'-FAM-GCTGCTCACCATCGCTATCTGAGC-3' (서열번호 47)
증폭된 PCR 산물은 ABI 3730xl DNA 분석기를 사용하여 분석하였다. 피크의 위치와 크기는 PCR 산물의 길이와 상대적인 양을 나타내는 것이다.
단일 세포 및 세포 콜로니의 복제 분석
세포 분류 전 및 후에, 현미경 관찰 하에 단일 세포를 마우스 피펫(mouth pipette)으로 분리하고, PCR 튜브로 옮겼다. 그런 후, PCR 산물을 복제하고, 서열분석하였다. 세포의 복제 집단을 얻기 위하여, 분류된 세포 및 분류되지 않은 세포를 1,000 세포들/100 mm 디쉬의 밀도로 디쉬에 도말시켰으며, 2주 후에 세포 콜로니들을 손수 분리하였다.
유세포 분석법(Flow cytometry)
부착된 세포들을 트립신 처리하였으며, PBS 내 2% FBS로 재부유시켰다. 단일세포 부유물을 FACSAria II (BD Biosciences, San Jose, CA) 또는 FACSVantage SE (BD Biosciences)를 사용하여 분석하고 분류하였다. 뉴클레아제-유도된 돌연변이를 포함하는 세포를 모으기 위하여, 강한 GFP 신호를 가지는 세포를 분류하였다. 형질감염되지 않은 세포 및 리포터 단독으로 형질감염된 세포들을 대조군으로 사용하였다.
자성-활성된 세포 분류( magnetic -activated cell sorting, MACS )
HEK293 세포들을 2ug의 리포터 플라스미드 및 2ug의 ZFN-224(CCR5 유전자를 표적으로 함)를 인코딩하는 플라스미드로 공동 형질감염시켰다.
형질감염시킨 후 3일째에, MACSelect Kk (miltenyi Biotech)를 이용하여 세포들을 자기적으로 표지하고 분리하였으며, 게놈 DNA을 분리하였다(첫번째 분류). 자기적으로 표지된 분획의 순도를 높이기 위하여, 상기 세포들을 2번째 컬럼을 이용하여 분리하였다(두번째 분류).
실시예 1: 리포터 구성물의 제조 및 이를 이용하여 인공 뉴클레아제에 의해 유전체 변이된 세포의 분류
리포터 플라스미드는 단량의 적색 형광 단백질(monomeric red fluorescent protein, mRFP)-향상된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP)의 융합 단백질을 인코드(encode)하는 리포터 플라스미드에, mRFP 및 eGFP를 인코딩하는 DNA 서열 사이에 인공 뉴클레아제 표적 서열을 삽입하여, eGFP 서열이 mRFP 서열의 프레임 밖으로 융합되도록 하였다. 정지 코돈은 eGFP 서열의 업스트림에 삽입하였다(도 3(a) 참고).
상기 리포터 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시킨 후, 유세포 분석법으로 세포를 분류하였다. 그 결과, mRFP는 CMV 프로모터에 의해 발현되는 반면, 기능적 eGFP는 인공 뉴클레아제가 활성을 가지지 않을 때에는 프레임 밖에 존재하므로 발현되지 않았다. 인공 뉴클레아제에 의해 표적 서열에서 DSB가 발생하는 경우, DNA의 손상은 NHEJ에 의해 복구가 되나, 이는 프레임 이동 돌연변이를 일으키게 되고, 이러한 돌연변이는 eGFP가 mRFP와 함께 프레임 내에 존재할 수 있게 하여, 기능적인 mRFP-eGFP 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 상기의 원리를 이용하여 인공 뉴클레아제에 의해 유전체가 변형된 세포들을 농축시키고, 분류할 수 있었다(도 3(b) 참고).
또한, 뉴클레아제 표적 서열은, eGFP 유전자와 같은 대리 유전자의 코딩 부위내에 삽입할 수 있었다. 이 경우 eGFP의 C-말단 부위가 eGFP의 N-말단 부위의 프레임 밖에 존재하도록 뉴클레아제 표적 서열이 삽입될 수 있었다.
그 결과, 대리 유전자는 활성이 없어지고, 이 대리 유전자를 형질감염시킨 세포는 GFP-로 나타났다. 반면, 인공 뉴클레아제가 표적 서열에 결합하여 DNA를 절단하게 되면, DSB가 일어나고, 이는 프레임 이동 돌연변이를 자주 일으키는 NHEJ에 의해 복구되어, 세포의 일부가 GFP+로 나타났다.
또한, 본 발명에서는 다른 유형의 대리 유전자, 예를 들어, 단일 가닥 중합 시스템을 사용하였다. 이 시스템에서 리포터 구성물은 활성이 없고, 부분적으로 복제되고, 변이된 리포터 유전자를 인코드 하였다(도 4a). 표적 서열은 복제된 지역 사이에 삽입되었다. 부위-특이적인 뉴클레아제가 표적 서열에 결합하고, DNA을 절단하면, DNA는 SSA 메커니즘(다양한 HR)에 의해 복구되어, 기능적 리포터 유전자가 발생할 수 있다. 마찬가지로, HR에 의해 복구될 수 있는 리포터 시스템을 사용할 수도 있다. 이 시스템은 불활성화된 리포터 유전자를 포함하는데, 상기 유전자는 뉴클레아제의 표적 서열 및 끝이 잘리고 활성이 없는 리포터를 인코드할 수 있는 상동 DNA 제공자로 구성하였다(도 4b). 인공 뉴클레아제가 표적 서열에 결합하고, DNA를 절단한다면, DSB가 발생하고, 이를 HR이 복구함으로써, 리포터 유전자가 활성을 갖게 될 수 있다.
실시예 2: TP53 유전자를 표적으로 하는 ZFN에 의해 유전체 변이된 세포들의 농축 및 분류
인간 TP53 유전자를 표적으로 하는 ZFN 쌍을 인코딩하는 플라스미드 및 뉴클레아제 표적 서열을 포함하는 리포터 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 대조군으로서, 리포터 플라스미드 단독 또는 ZFN 플라스미드 단독을 형질감염시킨 HEK293 세포를 사용하였다.
형질감염시킨 후 24시간 후에, 대부분의 세포들은 RFP+ 로 된 반면, GFP+ 세포들은 거의 탐지되지 않았다. GFP+ 세포들의 수는 3일 후에 점점 증가되었으며, 이러한 GFP+ 세포들은 모두 RFP+ 형태였다(도 5). 형질감염시킨 후 72시간 째에 유세포 분석법(flow cytometry)을 수행한 결과, 약 16%의 세포가 RFP+ GFP- 였으며, 약 5%의 세포가 RFP+ GFP+ 였다(도 6a).
상기 RFP+ GFP+ 세포 집단들을 유세포 분석법으로 분류하였으며, 뉴클레아제에 의해 유도된 돌연변이의 정도를 평가하기 위하여 게놈(genomic) DNA를 분리하고 분석하였다.
상기 게놈 DNA를 대상으로 T7 엔도뉴클레아제(endonuclease) I (T7E1) 분석법을 수행한 결과, RFP+ GFP+ 세포들에서 TP53 유전자의 돌연변이 빈도가 37% 였으며, 이는 분류되지 않은(unsorted) 세포들에 비해 13배나 높은 수치였다(도 6b). 분류하지 않은 세포들, 즉, RFP- GFP- 세포들, RFP+ GFP- 세포들, 및 ZFN 플라스미드 단독으로 형질감염시킨 세포들의 돌연변이 빈도는 약 2.8~4.8% 범위로 나타났다. 상기 결과를 통해서, 본 발명의 리포터 시스템을 이용하면, 유전자-변이된 세포들의 농축을 유의적으로 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한, ZFN에 의해 유도된 인델(indel) 돌연변이를 정량하기 위하여 형광 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, fPCR) 분석을 수행하였으며, 그 결과, 분류되지 않은 세포들(RFP- GFP- 세포들, or RFP+ GFP- 세포들)에 비하여 분류된 RFP+ GFP+ 세포 집단(population)에서 인델 돌연변이가 약 29배 농축되었음을 확인하였다(도 6c). 이는 상기 살펴본 T7E1 분석 결과와 일치하는 것이었다. 다음으로, PCR 생산물을 복제하고, 표적 서열 주변의 DNA 서열을 확인한 결과, 돌연변이 빈도가 RFP+ GFP+ 세포들에서 20%, 분류되지 않은 세포들에서 1%로 나타났다. 이는 세포 분류로 인해 돌연변이를 약 20배 증가시킬 수 있음을 나타내는 것이다(도 6d).
상기 결과들을 종합해보면, 본 발명의 대리 리포터는 표적 유전자가 변형된 세포들의 유의적인 농축을 가능케 하여, 살아있는 세포에서 ZFN의 활성을 모니터할 수 있는 신뢰성 높은 시스템임이 입증되었다.
실시예 3: CCR5 유전자를 표적으로 하는 ZFN에 의해 유전체 변형된 세포들의 농축 및 분류
본 발명의 리포터 시스템이 다른 ZFN들에 의해 유전자-변형된 세포들을 농축 시키는데에도 사용가능한지 여부를 확인하기 위하여, 인간 CCR5 유전자에서 각각 다른 표적 서열을 가지고 있는 징크 핑거 뉴클레아제인 ZFN-224 및 Z891을 사용하였다.
ZFN-224를 형질감염시키고 72시간 후에 유세포 분석을 수행한 결과, 23%의 세포들이 RFP+ GFP+ 로 되었다(도 7a). 또한, T7E1 분석 결과, 분류된 RFP+ GFP+ 세포들에서 돌연변이율이 69%로 나타났으며, 분류되지 않은 세포들, 즉 RFP- GFP- 및 RFP+ GFP- 세포들에서는 12~16%로 나타났다. 즉, 분류된 RFP+ GFP+ 세포들의 돌연변이율은 분류되지 않은 세포들에 비하여 약 5.8배 증가되었다(도 7b).
또한, fPCR 분석 결과, 분류되지 않은 세포들(RFP- GFP- 세포들, 또는 RFP+ GFP- 세포들)에 비하여 분류된 RFP+ GFP+ 세포 집단(population)에서 돌연변이가 약 17배 농축되었음을 확인하였다(도 7c).
또한, Z891로 유도된 돌연변이가 분류되지 않은 세포들에 비해 RFP+ GFP+ 세포들에서 현저히 농축되었는지를 확인하였다. T7E1 분석 결과, 분류된 RFP+ GFP+ 세포들의 돌연변이율은 분류되지 않은 세포들(RFP- GFP- 세포들, RFP+ GFP- 세포들)에 비하여 약 11배 증가되었으며(도 8b), fPCR 분석 결과, 분류된 RFP+ GFP+ 세포들의 돌연변이율은 분류되지 않은 세포들에 비하여 약 38배 증가되었다(도 8c).
실시예 4: TALENs에 의해 유전체 변형이 유도된 세포들의 분류
본 발명의 리포터 시스템을 TALENs에도 적용할 수 있는지를 알아보았다. 리포터 플라스미드 및 CCR5 유전자를 표적으로 하는 TALEN 쌍을 인코딩하는 플라스미드를 HEK293 세포에 공동 형질감염시켰다. 세포를 하루 동안 37℃에서 배양시킨 후, 3일 동안 30℃에서 배양시켰다. 상기 배양된 세포들을 대상으로 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, 분류되지 않은 세포들에서는 TALEN의 활성을 확인할 수 없었으나, RFP+ GFP+ 세포들에서는 유전자의 변이를 확실하게 관찰할 수 있었다. 이는 분류되지 않은 세포들에 비해 돌연변이된 세포들의 농축률이 8.6 배 이상 증가된 결과였다(도 9).
실시예 5: Thumpd3 유전자가 변형된 마우스 세포들의 농축 및 분류
본 발명의 리포터 시스템을 다른 종으로부터 유래된 세포주에도 적용할 수 있는지를 실험하였다. 마우스 유전자인 Thumpd3을 표적으로 하는 ZFN 쌍을 인코딩하는 플라스미드, 및 본 발명의 리포터를 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)로부터 유래된 마우스 섬유아세포에 공동 형질감염시켰다.
분류되지 않은 세포들에서는 ZFN의 활성을 거의 관찰할 수 없었던 반면, RFP+ GFP+ 세포에서는 반 정도(46%)의 Thumpd3 대립 유전자가 변이된 것을 확인할 수 있었다. 즉, 유전자-변이된 세포의 농축이 92배 이상 증가되었다(도 10).
실시예 6: 단일 세포 및 세포 집단(콜로니)의 복제 분석
세포를 유세포 분석법으로 분류하기 전과 후로 나누어, 단일 세포들 및 복제 세포 집단들을 분석하였다. 세포를 분류하기 전에는 21개의 단일 마우스 섬유아 세포들 중 어느 하나의 세포도 Thumpd3 부위에 ZFN-유도 돌연변이를 포함하고 있지 않았다(도 11). 반면에, 10개의 RFP+ GFP+ 세포들 중에는 9개의 단일세포가 돌연변이를 가지고 있었고, 이들 중 4개의 세포들은 다른 쌍대립 돌연변이(biallelic mutations)를 포함하고 있었다. 또한, 세포 분류 후 Thumpd3-변이된 섬유아세포의 2개의 독립적 복제물을 분류할 수 있었다. 상기 결과들을 종합해보면, 상기의 복제 분석 결과는 본 발명의 리포터 시스템이 단일대립 유전자 및 쌍대립 유전자 돌연변이를 가지는 유전자-변이된 세포들을 효율적으로 농축시킬 수 있음을 뒷받침해주었다.
실시예 7: 분류된 세포 및 분류되지 않은 세포에서 돌연변이율 비교
상기 결과들로부터 본 발명의 리포터 시스템으로 돌연변이된 세포를 농축하는데 있어서, 2가지 인자가 관여할 수 있음을 알 수 있었다. 하나는 공동 형질감염의 효과이며, 다른 하나는 대리 리포터의 효과였다. 이러한 2가지 인자들은 RFP+ GFP-세포들(공동 형질감염 효과)에서의 돌연변이율(또는 indel 돌연변이율(%))를 RFP+ GFP+ 세포들(공동 형질감염 효과, 대리리포터 효과를 모두 가짐)에서의 돌연변이율을 비교함으로써, 구별할 수 있다. 본 발명자들은 분류되지 않은 세포와 비교했을 때, RFP+ GFP- 세포들에서 돌연변이율이 조금 증가되는 것을 확인하였다(표 6). 반면에, RFP+ GFP+ 세포에서 돌연변이율이 훨씬 증가하였는 바, 이는 대리 유전자 인자가 돌연변이 세포를 농축하는데 있어서 가장 큰 영향을 미치는 것임을 알 수 있었다.
표 6
돌연변이율(%) 농축율(Fold enrichment)
표적 유전자(Target gene) 분류되지 않은 세포(Unsorted) 분류된 세포(Sorted) (RFP+ GFP-) 분류된 세포(Sorted)(RFP+ GFP+) 분류된 세포(Sorted) (RFP+ GFP-) 분류된 세포(Sorted) (RFP+ GFP+)
TP53 2.8 4.8 37 1.7 13
CCR5 (ZFN-224) 12 16 69 1.3 5.8
CCR5 (Z891) 0.8 3.0 8.7 3.8 11
CCR5 (TALEN) 0.5 1.5 4.3 3.0 8.6
Thumpd3 0.5 2.4 46 4.8 92
리포터에 의해 돌연변이 세포가 농축될 수 있는 잠재적인 작용 기전을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 RFPdim, RFPmedium, 및 RFPbright 세포들, RFP-GFP+ 및 RFP+GFP+ 세포들로 분류한 후, 돌연변이율과 뉴클레아제 레벨을 측정하였다. 상기 분류된 세포들에서 dim은 형광색이 어두운 것을 의미하며, midium은 형광색의 밝기가 보통인 것, bright는 형광색이 밝은 것을 의미한다. T7E1 분석을 통해 게놈-변형된 세포들이 하기의 순서로 농축되는 것을 확인하였다: RFPbright (10% 돌연변이), RFPmedium (6.3%), 및 RFPdim (1.2%)(도 12). 이로부터, 높은 형질감염 효율은 높은 돌연변이 빈도를 가져옴을 알 수 있었다. 그러나, RFPbright 세포 집단에서의 유전자-변이된 세포들의 농축(분류되지 않은 세포에 비해 7.7-배 농축됨)이 RFP+GFP+ 세포(44% 돌연변이되었으며, 이는 분류되지 않은 세포에 비해 34배 농축된 것임)에 미치지 못하였는데, 이는 본 리포터 시스템이 형질감염 효율만을 기초로 한 간단한 분류보다 더 유용적임을 의미한다.
더욱이, 웨스틴 블롯팅 결과, 뉴클레아제 레벨이 돌연변이 빈도와 일치되었는데, 이는 RFP+GFP+ 세포들에서 높은 돌연변이율이 부분적으로 높은 뉴클레아제 농도에 의해 매개 되는 것을 의미한다.
또한, 돌연변이 세포 집단을 더 농축시키기 위하여, 본 발명의 리포터 시스템을 이용하여 추가적인 형질감염 및 세포 분류를 반복적으로 수행할 수 있는지 확인해보았다. 리포터 플라스미드 및 Z891을 인코딩하는 플라스미드를 HEK2993 세포에 공동 형질감염시키고, 3일 후에 유세포 분석법을 이용하여 RFP+ GFP+ 세포를 분류하였으며(첫번째 분류), T7E1 분석하였다. 상기 세포들을 24시간 배양시킨 후, 리포터 플라스미드 및 Z891 플라스미드를 이용하여 공동형질하고 분류하는 단계를 추가적으로 수행하였다. 분류된 RFP+ GFP+ 세포를 T7E1 분석하였다(두번째 분류). 이러한 2번의 공동 형질감염 및 분류단계는 돌연변이 세포의 농축을 총 60배 정도 증가시켰으며, 이는 CCR5 대립 유전자-변형된 세포가 반 가까이 포함되어 있는 세포 집단을 분리할 수 있음을 의미한다(도 13).
실시예 8: 자성-활성된 세포 분류(MACS)를 이용한, 표적 유전자가 변형된 세포의 농축
표적 유전자가 변형된 세포를 분류하고 농축시키기 위하여, 형광에 활성을 가지는 세포를 분류하는 방법인 유세포 분석법 이외에 자성-활성된 세포 분류(magnetic-activated cell sorting)법을 사용하였다.
리포터 유전자는 mRFP 유전자, 인공 뉴클레아제의 표적 서열, 2A-펩타이드 서열 및 마우스 MHC 클래스 I 분자 H-2Kk 유전자로 구성하였다(도 14a). 상기 구조의 리포터 시스템에서는 mRFP는 CMV 프로모터에 의해 발현되는 반면, H-2Kk 는 인공 뉴클레아제가 활성을 가지지 않을 때에는 프레임 밖에 존재하므로 발현되지 않게 된다. 인공 뉴클레아제에 의해 표적 서열에서 DSB가 발생하는 경우, DNA의 손상은 NHEJ에 의해 복구가 되나, 이는 프레임 이동 돌연변이가 일어나게 된다. 이러한 돌연변이는 2A-펩타이드 및 H-2Kk 가 mRFP와 함께 프레임 내에 존재할 수 있게 하여, 기능적인 H-2Kk 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 리포터 플라스미드 및 뉴클레아제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염시킨 후 3일 또는 4일 째에, 세포들을 H-2Kk-특이적 자기 비드로 표지하고, MACS 컬럼 상에서 자기력으로 분리할 수 있다(도 14b).
상기의 실험 설계를 바탕으로, HEK293 세포들을 2ug의 리포터 플라스미드 및 2ug의 ZFN-224(CCR5 유전자를 표적으로 함)를 인코딩하는 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. 상기 리포터 플라스미드는 mRFP 유전자, ZFN-224의 표적 서열, 2A-펩타이드 서열 및 마우스 MHC 클래스 I 분자 H-2Kk 유전자로 구성하였다. 형질감염시킨 후 3일째에, MACSelect Kk (miltenyi Biotech)를 이용하여 세포들을 자기적으로 표지하고 분리하였으며, 게놈 DNA을 분리하였다(첫번째 분류). 자기적으로 표지된 분획의 순도를 높이기 위하여, 상기 세포들을 2번째 컬럼을 이용하여 분리하였다(두번째 분류). 자기적 비드-선택된 세포들로부터 분리된 게놈 DNA을 이용하여 T7E1 분석을 수행하였다. 그 결과, MACS로 분류되지 않은 세포는 18%의 돌연변이율을 나타낸 반면, 첫번째 분류된 세포는 67%의 돌연변이율, 두번째 분류된 세포에서는 77%의 돌연변이율이 나타났다(도 15). 즉, MACS로 분류된 세포는 분류되지 않은 세포에 비해 약 4.5 배 이상의 높은 돌연변이율이 나타났다. MACS 방법은 레이저를 사용하여 세포를 분류하는 것이 아니기 때문에, 세포를 분류하는 과정에서 세포에 손상을 입히지 않게 되어, 표적 유전자가 변형된 돌연변이 세포를 보다 효율적으로 분류하고 농축시킬 수 있었다.
실시예 9: 이중 프레임 NHEJ 리포터 구성물을 이용한 유전자가 변형된 세포들의 농축 및 분류
뉴클레아제가 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열를 절단하여 유전자가 변형된 세포들을 보다 높은 효율로 농축시키기 위하여, 이중 프레임(double frame) NHEJ 리포터 구성물을 사용하였다.
구체적으로, 세포내 발현을 위해 CMV 프로모터를 사용하였고, 유전자 주입 효율을 알기 위한 대조 리포터 유전자인 mRFP 리포터 유전자(제1 리포터 유전자), 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 상기 mRFP 리포터 유전자가 코딩하는 적색 형광 단백질과 아미노산 코돈 프레임이 맞지 않아 발현되지 않도록, 서로 다른 프레임의 eGFP 리포터 유전자 2개(제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자)를 연달아 배치하여, 이중 프레임 NHEJ 리포터 구성물을 제조하였다.
상기 리포터 구성물의 구체적인 구성은 도 18의 첫번째 그림과 같다.
상기 리포터 구성물을 세포에 형질감염시켜, 리포터 구성물이 세포에 도입되면, 인공 뉴클레아제의 활성에 상관없이 mRFP는 발현되었다. 반면, 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 인공 뉴클레아제가 활성을 가지지 않을 때에는 프레임 밖에 존재하므로 발현되지 않았다. 인공 뉴클레아제에 의해 표적 서열에서 DSB가 발생하는 경우, DNA의 손상은 NHEJ에 의해 복구가 되나, 이는 프레임 이동 돌연변이를 일으키게 되고, 이러한 돌연변이는 제2 리포터 유전자 또는 제3 리포터 유전자가 제1 리포터 유전자와 함께 프레임 내에 존재할 수 있게 하여 기능적인 mRFP-eGFP 융합 단백질의 발현을 유도하였다(도 18).
구체적으로, 제1 리포터 유전자(mRFP) 및 이와 아미노산 코돈 프레임이 맞지 않은 제2 리포터 유전자(eGFP)가 포함된 첫번째 리포터 구성물, 제1 리포터 유전자(mRFP) 및 상기 첫번째 리포터 구성물과는 다른 프레임으로 제1 리포터 유전자와 아미노산 코돈 프레임이 맞지 않은 제2 리포터 유전자(eGFP)가 포함된 두번째 리포터 구성물, 및 제1 리포터 유전자(mRFP) 및 이와 아미노산 코돈 프레임이 맞지 않으면서, 서로 다른 프레임의 제2 리포터 유전자(eGFP) 및 제3 리포터 유전자(eGFP)가 포함된 세번째 리포터 구성물을 각각 세포에 도입하고, 뉴클레아제를 세포에 도입시켰다. 상기 세포들을 대상으로 유세포 분석법으로 mRFP와 eGFP를 모두 발현하는 세포들을 분류하고, 이들의 프레임 이동 돌연변이를 확인한 결과, 첫번째 리포터 구성물 및 두번째 리포터 구성물을 사용한 경우는 뉴클레아제 작동에 의해 발생하는 코돈 프레임 이동의 일 경우만 확인할 수 있는 반면, 세번째 리포터 구성물을 사용한 경우는 2가지의 모든 프레임 이동 돌연변이가 일어난 세포를 선별하고 농축할 수 있었다(도 19).
본 실시예에서는 제1 리포터 유전자와 아미노산 코돈 프레임이 맞지 않은 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자를 서로 다른 프레임에 배치하게 함으로써, 인공 뉴클레아제가 표적 부위를 절단함으로써 발생하는, 모든 경우의 NHEJ 매개 프레임 이동 돌연변이가 일어난 세포를 분류할 수 있었고, 인공 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축할 수 있었다.
즉, 리포터 구성물에 제1 리포터 유전자와 아미노산 코돈 프레임이 맞지 않은 제2 리포터 유전자만 포함하는 경우, 한가지의 프레임 이동 돌연변이가 일어난 세포에 대해서만 선별이 가능하였으나, 본 실시예에서 사용한 리포터 구성물은 2가지의 모든 프레임 이동 돌연변이가 일어난 세포를 선별할 수 있다.
실시예 10: 하이그로마이신 리포터 구성물을 이용한 유전자가 변형된 세포들의 농축 및 분류
리포터 구성물은 세포내 발현을 위해 CMV 프로모터를 사용하였고, 유전자 주입 효율을 알기 위한 RFP 유전자와 ZFN이 결합하여 작용할 수 있는 표적 유전자, ZFN이 제대로 작동하였을 때 발현되도록 설계된 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(Hygromycin phosphotransferase, HPT-eGFP) 유전자로 구성하였다(도 20).
돼지 CMAH 유전자를 knock out 할 수 있는 ZFN 한쌍(36ug)과 하이그로마이신선별을 위한 상기 리포터 구성물 (9 ug)를 전기자극을 통해 돼지 귀조직 세포내로 주입한 후 1 X 106 개의 세포를 100 mm 배양접시에 각각 분주하여 배양하였다. ZFN 및 리포터 구성물 주입 후 2일째에 세포수는 배양접시 당 3 X 105 개였고 하이그로마이신 B를 300 ug/ml의 농도로 48시간 동안 처리하여, 4일째에 하이그로마이신 B가 제거된 새로운 배양액으로 교체해 주었다. 이때 하이그로마이신 처리에 의해 살아남은 세포수는 1.5 X 104 개 이었다. 7일째 초기콜로니 형성하였고, 18일에 완전한 콜로니를 형성하며, 22일에 형성된 콜로니를 새로운 96-well 배양접시로 옮겨 뉴클레아제에 의해 유전자가 변형된 형질전환 세포주를 만들었다(도 21).
ZFN과 리포터의 세포내 도입을 유도한 후 2일째 Hygromycin B 처리전과 4일째 비처리 또는 처리후의 세포내 RFP와 GFP의 발현 정도를 비교하였다. 처리전이나 비처리구에 비해 처리구에서 RFP 및 GFP를 발현하고 있는 세포의 비율이 높았다(표 7, 도 22 참조).
표 7
Hygromycin B 처리구 형광발현된 세포수
RFP / Total (%) GFP / Total (%) GFP / RFP (%)
처리전(2일째) 120/339 (35.4) 69/339 (20.0) 69/120 (57.5)
0 ug/ml 처리(4일째) 58/165 (35.2) 26/165 (15.8) 26/58 (44.8)
300 ug/ml 처리(4일째) 47/48 (97.9) 38/48 (79.2) 38/47 (80.9)
또한, ZFN과 리포터의 세포내 도입 후 2일째부터 2일 동안 하이그로마이신 B (300ug/ml)를 처리하여 선별된 세포에 있어 유전자 변이가 발생한 세포의 비율을 T7E1 assay 방법을 통해 분석하였다. 비처리된 대조구(3.1%)에 비해 처리구(12.1%)에서 높은 비율의 형질전환된 세포를 확인하였다(도 23).

Claims (28)

  1. 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 선별 또는 농축시키는 방법으로서,
    상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 구성물을 준비하는 단계로서, 상기 리포터 구성물은 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는 여부에 따라 상기 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 것인 제1단계;
    상기 리포터 구성물을 후보 세포에 도입시키는 단계로서, 상기 후보 세포 중 일부 또는 전부는 상기 리포터 구성물의 도입 전 또는 후에 상기 뉴클레아제를 발현하는 것인 제2단계; 및
    제2단계의 결과물인 후보 세포로부터 리포터 유전자를 발현하는 세포 또는 리포터 유전자를 발현하지 않는 세포를 분류하는 제3단계;
    를 포함하는 것이 특징인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열은 게놈 상에 존재하는 내재성 뉴클레오티드 서열인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 리포터 구성물은 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열이 리포터 유전자의 중간이나 앞에 삽입되어 있는 것으로, 상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 리포터 구성물은 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제2 리포터 유전자가 포함되어 있되,
    상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자는 제1 리포터 유전자와 번역 프레임이 맞지 않게 연결된 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자의 업스트림에 정지 코돈이 삽입된 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 제3단계의 세포 분류 단계는 제1 리포터 유전자 및 제2 리포터 유전자가 모두 발현되는 세포를 분류하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포터 구성물은 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터 유전자가 포함되어 있되,
    상기 제1 리포터 유전자는 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부와 상관없이 발현되고,
    상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자, 제3 리포터 유전자 또는 둘다의 발현 여부가 결정되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 제1 리포터 유전자와 번역 프레임이 맞지 않게 연결된 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 서로 번역 프레임이 맞지 않게 연결된 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자가 서로 같은 번역 프레임으로 연결된 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마아제(β-lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase), 루시퍼라제(luciferase), 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase), 선택마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene), 형광단백질, 및 항생제 저항성 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제2단계에서 발현되는 상기 뉴클레아제는 일시적으로 세포에서 발현되거나, 세포 내 게놈에 삽입된 상태에서 발현되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제3단계의 분류방법은 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 또는 MACS(Magnetic-activated cell sorting)로 세포를 분류하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제2단계 및 제3단계를 2회 이상 반복 수행하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 리포터 유전자를 발현하는 세포 또는 리포터 유전자를 발현하지 않는 세포를 분류하는 제3단계를 통해, 상기 뉴클레아제의 활성을 확인하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서, 제2 단계에서 리포터 구성물은 1개 또는 2개 이상 도입시키는 것이 특징인 방법.
  18. 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시키기 위한 리포터 구성물로서,
    제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 및 제2 리포터 유전자가 포함되어 있고,
    상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 상기 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자의 발현 여부가 결정되는 것인 리포터 구성물.
  19. 제1 리포터 유전자, 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 서열, 제2 리포터 유전자, 및 제3 리포터 유전자가 포함된 리포터 구성물로서,
    상기 제1 리포터 유전자는 상기 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부와 상관없이 발현되고,
    상기 세포에서 발현되는 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 결합하여 리포터 구성물을 절단하는지 여부에 따라 상기 제2 리포터 유전자, 제3 리포터 유전자 또는 둘다의 발현 여부가 결정되는 것인 리포터 구성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 리포터 구성물은 특정 뉴클레아제에 의해 세포 내 특정 뉴클레오티드 서열이 절단되거나 또는 상기 절단에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 변형된 세포를 확인, 선별, 또는 농축시키기 위한 것인 리포터 구성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 제1 리포터 유전자와 번역 프레임이 맞지 않게 연결된 것인 리포터 구성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 서로 번역 프레임이 맞지 않게 연결된 것인 리포터 구성물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자가 서로 같은 번역 프레임으로 연결된 것인 리포터 구성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자 및 제3 리포터 유전자는 서로 다른 종류의 리포터 유전자인 것인 리포터 구성물.
  25. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 특정 뉴클레아제 의해 표적 서열이 절단되면 리포터 구성물의 프레임 이동 돌연변이가 발생되는 것인 리포터 구성물.
  26. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마아제(β-lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase), 루시퍼라제(luciferase), 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase), 선택마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene), 형광단백질, 및 항생제 저항성 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것인 리포터 구성물.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 리포터 구성물 하나 또는 둘 이상을 포함하는 숙주세포.
  28. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 리포터 구성물 하나 또는 둘 이상; 숙주 세포; 뉴클레아제를 발현하는 구성물을 포함하는 뉴클레아제 활성의 모니터링 시스템으로서,
    상기 리포터 구성물, 상기 뉴클레아제 발현 구성물 또는 둘다는 상기 숙주 세포 내에 도입되어 있거나 세포 외에 별도로 구비되어 있는 것인 시스템.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018113985A (ja) * 2012-11-01 2018-07-26 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
MA37663B1 (fr) 2012-05-25 2019-12-31 Univ California Procédés et compositions permettant la modification de l'adn cible dirigée par l'arn et la modulation de la transcription dirigée par l'arn
EP3617309A3 (en) 2012-12-06 2020-05-06 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
RU2018122288A (ru) 2013-03-14 2019-03-06 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
WO2016132122A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 University Of Edinburgh Assay construct
CN108431226A (zh) * 2016-01-15 2018-08-21 阿斯利康(瑞典)有限公司 基因修饰测定
KR102264829B1 (ko) 2019-11-22 2021-06-14 한국원자력의학원 유전자 가위의 절단 효율을 평가할 수 있는 리포터 시스템

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050064474A1 (en) * 2003-08-08 2005-03-24 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20090111119A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-30 Yannick Doyon Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US20110014616A1 (en) * 2009-06-30 2011-01-20 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid screening of biologically active nucleases and isolation of nuclease-modified cells

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2839726B1 (fr) * 2002-05-17 2004-08-13 Commissariat Energie Atomique Methode de mesure du processus de recombinaison non-homolgue de l'adn dans des cellules de mammifere et ses applications

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050064474A1 (en) * 2003-08-08 2005-03-24 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20090111119A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-30 Yannick Doyon Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
KR20100087286A (ko) * 2007-09-27 2010-08-04 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 생물학적으로 활성인 뉴클레아제의 신속한 생체내 확인
US20110014616A1 (en) * 2009-06-30 2011-01-20 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid screening of biologically active nucleases and isolation of nuclease-modified cells

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018113985A (ja) * 2012-11-01 2018-07-26 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物
JP2021090435A (ja) * 2012-11-01 2021-06-17 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物
JP7436406B2 (ja) 2012-11-01 2024-02-21 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物
US12006508B2 (en) 2012-11-01 2024-06-11 Factor Bioscience Inc. Methods and products for expressing proteins in cells

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