JP7436406B2 - 細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物 - Google Patents

細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物 Download PDF

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Description

優先権
本出願は、２０１２年１１月１日出願の米国仮出願第６１／７２１，３０２号、２０１３年３月１４日出願の米国仮出願第６１／７８５，４０４号、および２０１３年７月３日出願の米国仮出願第６１／８４２，８７４号に対する優先権を主張するものであり、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願は、２０１２年５月７日出願の米国出願第１３／４６５，４９０号、２０１２年１２月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６７９６６号、および２０１３年６月２８日出願の米国出願第１３／９３１，２５１号に関連し、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、一つには、タンパク質をコードする核酸と、タンパク質をコードする核酸を含む治療薬と、核酸を使用し、細胞を誘導してタンパク質を発現させるための方法と、細胞の遺伝子導入、遺伝子編集、およびリプログラミングのための方法、キット、およびデバイスと、これらの方法、キット、およびデバイスを使用して生成される細胞、生物、ならびに治療薬と、に関する。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（Ａ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｒｅａｄａｂｌｅ ｆｏｒｍａｔ ｃｏｐｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ）（ファイル名：ＦＡＢＩ＿００５＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１３年１０月３０日、ファイルサイズ：２５５ＫＢ）。
合成ＲＮＡおよびＲＮＡ治療薬
リボ核酸（ＲＮＡ）は、原核細胞および真核細胞の両方において偏在し、ここで、メッセンジャーＲＮＡの形態で遺伝情報をコードし、トランスファーＲＮＡの形態でアミノ酸を結合および輸送し、リボソームＲＮＡの形態でアミノ酸をタンパク質に構築し、そして、ミクロＲＮＡおよび長い非コードＲＮＡの形態での遺伝子発現調節を含む、多数の他の機能を実施する。ＲＮＡは、直接化学合成および生体外転写を含む方法によって合成的に生成され得、治療用途のために患者に投与され得る。
細胞リプログラミングおよび細胞療法
細胞は、特異的な細胞外の合図への曝露、および／または特異タンパク質、ミクロＲＮＡなどの異所性発現によってリプログラムされ得る。いくつかのリプログラミング方法が以前に説明されているが、異所性発現に依存するほとんどのものは、外来ＤＮＡの導入を必要とし、これは変異の危険性を有し得る。リプログラミングタンパク質の直接送達に基づく、ＤＮＡを含まないリプログラミング方法が報告されている。しかしながら、これらの方法は商業用途には非効率的かつ不確か過ぎる。さらに、ＲＮＡベースのリプログラミング方法が説明されている（例えば、Ａｎｇｅｌ．ＭＩＴ Ｔｈｅｓｉｓ．２００８．１－５６、Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２０１０．５，１０７、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１０．７，６１８－６３０、Ａｎｇｅｌ．ＭＩＴ Ｔｈｅｓｉｓ．２０１１．１－８９、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１２．１５１，５４７－５５８を参照のこと（これら全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる））。しかしながら、既存のＲＮＡベースのリプログラミング方法は、成熟細胞に実施される際に緩慢、不確か、かつ非効率的であり、多くの遺伝子導入を必要とし（著しい出費およびエラーの機会をもたらす）、限定数の細胞型しかリプログラムすることができず、限定数の細胞型にしか細胞をリプログラムすることができず、免疫抑制剤の使用を必要とし、血液由来ＨＳＡおよびヒト線維芽細胞フィーダーを含む複数のヒト由来成分の使用を必要とする。以前に開示されたＲＮＡベースのリプログラミング方法の多くの欠点は、それらを研究および治療用途の両方にとって望ましくないものにする。
遺伝子編集
いくつかの自然発生タンパク質は、特異的ＤＮＡ配列を認識することができるＤＮＡ結合ドメイン、例えば、亜鉛フィンガー（ＺＦ）および転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含有する。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのこれらのＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインのうちの１つ以上を含有する融合タンパク質を使用して、細胞中のＤＮＡの所望の領域内に二本鎖切断を作ることができる（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／００６４６２０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０２３９３１５号、米国特許第８，４７０，９７３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２１７１１９号、米国特許第８，４２０，７８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０３０１０７３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１４５９４０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号、および米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号を参照のこと（これら全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる））。しかしながら、細胞を遺伝子編集するための現在の方法は非効率的であり、制御されていない変異誘発の危険性を有し、これはそれらを研究および治療用途の両方にとって望ましくないものにする。体細胞のＤＮＡを含まない遺伝子編集のための方法も、体細胞の同時または順次の遺伝子編集およびリプログラミングのための方法も、以前に調査されていない。さらに、患者内の（すなわち、生体内の）細胞を直接的に遺伝子編集するための方法は以前に調査されておらず、かかる方法の開発は、ＦｏｋＩ開裂ドメインの無向二量体形成、およびＤＮＡ結合ドメインの乏しい特異性、ならびに他の要因にある程度起因する、乏しいＤＮＡ結合ドメインの結合、過剰なオフターゲット効果にある程度起因する、許容可能な標的の欠如、非効率的な送達、遺伝子編集タンパク質／タンパク質（複数）の非効率的な発現、発現された遺伝子編集タンパク質／タンパク質（複数）による非効率的な遺伝子編集によって制限されてきた。最後に、抗菌、抗ウイルス、および抗癌治療における遺伝子編集の使用は、以前に調査されていない。
したがって、細胞中のタンパク質の発現のための改善された組成物および方法の必要性が残る。
本発明は、一つには、細胞を誘導してタンパク質を発現させるための組成物、方法、物品、およびデバイスと、これらの組成物、方法、物品、およびデバイスを生成するための方法、物品、およびデバイスと、これらの組成物、方法、物品、およびデバイスを使用して生成される細胞、生物、ならびに治療薬を含む組成物および物品と、を提供する。以前に報告された方法とは異なり、本発明の特定の実施形態は、外来ＤＮＡ、または同種もしくは動物由来の材料に細胞を曝露することを含まず、これは本発明の方法に従って生成される生成物を治療用途に有用にする。
いくつかの態様において、低い毒性および高い翻訳効率を有する合成ＲＮＡ分子を提供する。一態様において、細胞の高効率の遺伝子導入、リプログラミング、および遺伝子編集のための細胞培養培地を提供する。他の態様は、リプログラミングタンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子を生成するための方法に関する。さらなる態様は、遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子を生成するための方法に関する。
一態様において、本発明は、改変ヌクレアーゼ開裂ドメインを含む高効率遺伝子編集タンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、改変ヌクレアーゼ開裂ドメインを含む高忠実度遺伝子編集タンパク質を提供する。他の態様は、改変ＤＮＡ結合ドメインを含む高効率遺伝子編集タンパク質に関する。さらなる態様は、改変ＤＮＡ結合ドメインを含む高忠実度遺伝子編集タンパク質に関する。さらなる態様は、改変反復配列を含む遺伝子編集タンパク質に関する。いくつかの態様は、細胞に遺伝子編集タンパク質を遺伝子導入すること、または細胞を誘導して遺伝子編集タンパク質を発現させることによって、細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法に関する。他の態様は、生体外の培養液中に存在する細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法に関する。さらなる態様は、生体内に存在する細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法に関する。
いくつかの態様において、本発明は、癌を治療するための方法であって、患者に、遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。一態様において、該遺伝子編集タンパク質は、癌関連遺伝子のＤＮＡ配列を変更することができる。別の態様において、該癌関連遺伝子は、ＢＩＲＣ５遺伝子である。さらに他の態様は、核酸および／または細胞を含む治療薬、ならびに、例えば、１型糖尿病、虚血性および拡張型心筋症を含む心臓疾患、黄斑変性症、パーキンソン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、地中海貧血症、ファンコニ貧血、重症複合免疫不全症、遺伝性感覚性ニューロパチー、色素性乾皮症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、癌、ならびに肝炎およびＨＩＶ／ＡＩＤＳを含む感染性疾患の治療のために、核酸および／または細胞を含む治療薬を使用する方法に関する。いくつかの態様において、本核酸は合成ＲＮＡを含む。他の態様において、本核酸はウイルスを使用して細胞に送達される。いくつかの態様において、該ウイルスは複製可能ウイルスである。他の態様において、該ウイルスは複製不全ウイルスである。
本発明の詳細を、以下の付随する説明に記載する。本明細書で説明されるものと同様または等価である方法および材料を本発明の実践または試験において使用することができるが、例示的方法および材料をこれから説明する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈が別段に明記しない限り、単数形は複数形も含む。別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。
指示されるタンパク質をコードし、変性ホルムアルデヒド－アガロースゲル上で分離されたアデノシン、５０％のグアノシン、５０％の７－デアザグアノシン、７０％のウリジン、３０％の５－メチルウリジン、および５－メチルシチジンを含有するＲＮＡを表す図である。 指示されるタンパク質をコードし、変性ホルムアルデヒド－アガロースゲル上で分離されたアデノシン、５０％のグアノシン、５０％の７－デアザグアノシン、５０％のウリジン、５０％の５－メチルウリジン、および５－メチルシチジンを含有するＲＮＡを表す図である。 リプログラミングタンパク質をコードするＲＮＡの５回の遺伝子導入によりリプログラムされた、初代ヒト新生児線維芽細胞を表す図である。細胞を固定し、Ｏｃｔ４タンパク質を染色した。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色した。 初代ヒト成熟線維芽細胞を表す図である。 リプログラミングタンパク質をコードするＲＮＡの７回の遺伝子導入によりリプログラムされた、図３Ａに示す初代ヒト成熟線維芽細胞を表す図である。矢印は、リプログラムされた細胞のコロニーを示す。 リプログラムされた初代ヒト成熟線維芽細胞の大きなコロニーを表す図である。 ヒトＣＣＲ５遺伝子を標的にするＴＡＬＥＮペアの位置を表す図である。単線はＴＡＬＥＮ結合部位を示す。二重線はΔ３２変異の位置を示す。 変性ホルムアルデヒド－アガロースゲル上で分離された、図４ＡのＴＡＬＥＮペアをコードする合成ＲＮＡを表す図である。 ヒト皮膚線維芽細胞（ＧＭ００６０９）に対する図４ＢのＲＮＡの機能性を試験するＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。ＲＮＡを遺伝子導入された細胞から産生された試料中の、７６０ｂｐおよび２００ｂｐのバンドの出現は、成功裏の遺伝子編集を示す。各レーン下の割合は、遺伝子編集の効率（編集された対立遺伝子の割合）を示す。 図４Ｃの「陰性」および「ＴＡＬＥＮ」レーンの線形状グラフを表す図である。数字は、総統合強度と比較した３つのバンドの統合強度を示す。 ＲＮＡを２回遺伝子導入された細胞から産生された試料（「２×」と表示されるレーン）も含む、図４Ｃに示すように実施されたＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。 合成ＲＮＡを使用する初代ヒト細胞（ＧＭ００６０９）の同時遺伝子編集およびリプログラミングを表す図である。画像は、リプログラムされた細胞の代表的なコロニーを示す。 図４Ｆに示すように産生された、遺伝子編集かつリプログラムされた細胞中のＣＣＲ５遺伝子の直接配列決定の結果を表す図である。試験した９つの線のうちの４つは、ＴＡＬＥＮ結合部位の間に欠失を含み、これは効率的な遺伝子編集を示す。 標準ヌクレオチド（「Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ」）または非標準ヌクレオチド（「Ａ、７ｄＧ、５ｍＵ、５ｍＣ」）のいずれかを含有する、ヒトＭＹＣ遺伝子を標的にするＲＮＡを使用したことを除いては図４Ｃに示すように実施されたＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。４７０ｂｐおよび５００ｂｐにおける暗色のバンドは高効率遺伝子編集を示す。 標準ヌクレオチド（「Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ」）または非標準ヌクレオチド（「Ａ、７ｄＧ、５ｍＵ、５ｍＣ」）のいずれかを含有する、ヒトＢＩＲＣ５遺伝子を標的にするＲＮＡを使用したことを除いては図４Ｃに示すように実施されたＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。７１０ｂｐにおける暗色のバンドは高効率遺伝子編集を示す。 ヒトＢＩＲＣ５遺伝子を標的にするＲＮＡ（ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ）を遺伝子導入されたＨｅＬａ細胞（子宮頸癌）を表す図である。細胞は、単一のＲＮＡ（「２×サバイビンＬ」）または等量のＲＮＡペアの各メンバー（「サバイビンＬ＋Ｒ」）のいずれかを遺伝子導入され、それぞれの場合において同一の総量のＲＮＡが送達された。右のパネルに示すように、ＲＮＡペアを遺伝子導入された細胞は拡大され、断片化核および際立って低減した増殖を示し、これは、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅの強力な抗癌活性を実証する。 図７Ａに示すようにヒトＢＩＲＣ５遺伝子を標的にするＲＮＡを遺伝子導入されたＨｅＬａ細胞を表す図である。細胞をその後固定し、サバイビンタンパク質を染色した。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色した。ＲｉｂｏＳｌｉｃｅを遺伝子導入された大きな断片化細胞核を矢印で示す。 合成ＲＮＡを使用してリプログラムされた初代ヒト成熟線維芽細胞を表す図である。矢印は、リプログラミングを示唆する形態を示す細胞の緻密なコロニーを示す。 変性ホルムアルデヒド－アガロースゲル上で分離された、指示される遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡを表す図である。 ヒト皮膚線維芽細胞に対する図９のＲＮＡの有効性を試験するＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。細胞は、遺伝子導入のおよそ４８時間後に溶解された。成功裏の遺伝子編集からもたらされる消化生成物に対応するバンドをアスタリスクで示す。レーン表示は「Ｘ．Ｙ」形態のものであり、ＸはそれからＤＮＡが増幅されたエクソンを意味し、Ｙは遺伝子編集タンパク質ペアを意味する。例えば、「１．１」は、開始コドンに最も近いエクソン１の領域を標的にする遺伝子編集タンパク質ペアを意味する。「Ｘ．Ｎ」は、非遺伝子導入細胞を意味する。 ヒト皮膚線維芽細胞に対する図９のＲＮＡの毒性を試験するＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。細胞は、遺伝子導入の１１日後に溶解された。レーンおよびバンドを図１０Ａに示すように表示する。アスタリスクで示すバンドの出現は、遺伝子導入された細胞が高生存率を保持したことを示す。 生体内の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡの安全性を試験するように設計された研究の結果を表す図である。このグラフは、未処置の１グループ、媒体のみの１グループ、腫瘍内注入を介してＲｉｂｏＳｌｉｃｅで処置した１グループ、および静脈内注入を介してＲｉｂｏＳｌｉｃｅで処置した１グループを含む、マウスの４つのグループ（各グループにつき１０匹の動物）の平均体重を示す。処置したグループの全てに対して、動物は、１日おきに、１日目から９日目まで、５回の投与を与えられた。動物を１７日目まで観察した。４つのグループの平均体重の間に統計的に著しい差がないことは、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅの生体内の安全性を実証する。 様々な３６アミノ酸長の反復配列を含む遺伝子編集タンパク質の有効性を試験するＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。ヒト皮膚線維芽細胞は、指示される反復配列を含有する遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡの遺伝子導入のおよそ４８時間後に溶解された。成功裏の遺伝子編集からもたらされる消化生成物に対応するバンドをアスタリスクで示す。レーン表示は、反復配列のＣ末端におけるアミノ酸を意味する。「陰性」は、非遺伝子導入細胞を意味する。 １つおきの反復配列が３６アミノ酸長である遺伝子編集タンパク質の有効性を試験するＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。ヒト皮膚線維芽細胞は、指示される反復配列を含有する遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡの遺伝子導入のおよそ４８時間後に溶解された。成功裏の遺伝子編集からもたらされる消化生成物に対応するバンドをアスタリスクで示す。レーン表示は、反復配列のＣ末端におけるアミノ酸を意味する。「陰性」は、非遺伝子導入細胞を意味する。 生体内の遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を有するＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶ複製不全ウイルスの安全性および効力を試験するように設計された研究の結果を表す図である。このグラフは、未処置の１グループ（処置なしの対照、「ＮＴＣ」、ｎ＝６）、腫瘍内注入を介してＧＦＰをコードするＡＡＶで処置した１グループ（「ＧＦＰ」、ｎ＝２）、および腫瘍内注入を介してＢＩＲＣ５遺伝子を標的にする遺伝子編集タンパク質をコードするＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶで処置した１グループ（「ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ」、ｎ＝２）を含む、ヒト神経膠腫細胞を含む皮下腫瘍を有するマウスの３つのグループの平均体重を示す。動物は、ＧＦＰグループについては１日目に、そしてＲｉｂｏＳｌｉｃｅグループについては１日目および１５日目に投薬された。動物を２５日目まで観察した。３つのグループの平均体重の間に統計的に著しい差がないことは、生体内のＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶの安全性を実証する。 図１３Ａに示す研究における動物の正規化された腫瘍体積を表す図である。ＮＴＣおよびＧＦＰグループの両方と比較して、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶで処置したグループの正規化された腫瘍体積のより緩徐な増加は、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶの生体内の効力を実証する。 図１２Ｂに示すように遺伝子編集タンパク質の有効性を試験するＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を表す図である。「ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ」は、１つおきの反復配列が３６アミノ酸長である遺伝子編集タンパク質を意味する。「野生型」は、非遺伝子導入細胞を意味する。 指示されるタンパク質をコードし、変性ホルムアルデヒド－アガロースゲル上で分離されたアデノシン、５０％のグアノシン、５０％の７－デアザグアノシン、６０％のウリジン、４０％の５－メチルウリジン、および５－メチルシチジンを含有するＲＮＡを表す図である。 ＡＰＰ遺伝子内への修復鋳型の統合を試験するアッセイの結果を表す図である。ＲＮＡおよび修復鋳型を遺伝子導入された細胞から産生される試料中の、５６２ｂｐおよび３８５ｂｐのバンドの出現は、ＰｓｔＩ制限部位の成功裏の統合を示す。「－」は、未消化の試料を意味し、「＋」は、ＰｓｔＩ制限ヌクレアーゼで処置された試料を意味する。
定義
「分子」は、分子実体（分子、イオン、複合体など）を意味する。
「ＲＮＡ分子」は、ＲＮＡを含む分子を意味する。
「合成ＲＮＡ分子」は、生物工学を使用して細胞の外で生成されるか、または細胞の中で生成されるＲＮＡ分子を意味し、非限定例を挙げると、生体外転写反応において生成されるＲＮＡ分子、直接化学合成によって生成されるＲＮＡ分子、または遺伝子改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で生成されるＲＮＡ分子である。
「遺伝子導入」は、細胞を分子と接触させることを意味し、この分子は細胞によって内部移行される。
「遺伝子導入すると」は、遺伝子導入の間またはその後を意味する。
「遺伝子導入試薬」は、分子と会合し、細胞への分子の送達、および／または細胞による分子の内部移行を促進する物質または物質の混合物を意味し、非限定例を挙げると、陽イオン性脂質、荷電ポリマー、または細胞透過性ペプチドである。
「試薬ベースの遺伝子導入」は、遺伝子導入試薬を使用する遺伝子導入を意味する。
「細胞培養培地」は、細胞培養に使用することができる培地を意味し、非限定例を挙げると、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＤＭＥＭ＋１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である。
「複合体形成培地」は、それに対して遺伝子導入試薬および遺伝子導入される分子が添加され、その中で遺伝子導入試薬が遺伝子導入される分子と会合する、培地を意味する。
「遺伝子導入培地」は、遺伝子導入に使用することができる培地を意味し、非限定例を挙げると、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２である。
「組換えタンパク質」は、動物またはヒトの中で生成されないタンパク質もしくはペプチドを意味する。非限定例としては、細菌中で生成されるヒトトランスフェリン、マウス細胞の生体外培養において生成されるヒトフィブロネクチン、およびイネ中で生成されるヒト血清アルブミンが挙げられる。
「脂質担体」は、水溶液中の脂質または脂質溶解性分子の溶解性を増加させることができる物質を意味し、非限定例を挙げると、ヒト血清アルブミンまたはメチル－ベータ－シクロデキストリンである。
「Ｏｃｔ４タンパク質」は、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその自然もしくは改変変異体、ファミリーメンバー、相同分子種、断片、もしくは融合構築物を意味し、非限定例を挙げると、ヒトＯｃｔ４タンパク質（配列番号８）、マウスＯｃｔ４タンパク質、Ｏｃｔ１タンパク質、ＰＯＵ５Ｆ１偽遺伝子２でコードされるタンパク質、Ｏｃｔ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、またはＯｃｔ４－ＧＦＰ融合タンパク質である。Ｏｃｔ４タンパク質は、いくつかの実施形態において、配列番号８との少なくとも７０％の同一性、または他の実施形態において、配列番号８との少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｏｃｔ４タンパク質は、配列番号８に対して１～２０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（集団的に）を有するアミノ酸配列を含む。または他の実施形態において、Ｏｃｔ４タンパク質は、配列番号８に対して１～１５または１～１０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（集団的に）を有するアミノ酸配列を含む。
「Ｓｏｘ２タンパク質」は、ＳＯＸ２遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその自然もしくは改変変異体、ファミリーメンバー、相同分子種、断片、もしくは融合構築物を意味し、非限定例を挙げると、ヒトＳｏｘ２タンパク質（配列番号９）、マウスＳｏｘ２タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、またはＳｏｘ２－ＧＦＰ融合タンパク質である。Ｓｏｘ２タンパク質は、いくつかの実施形態において、配列番号９との少なくとも７０％の同一性、または他の実施形態において、配列番号９との少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｓｏｘ２タンパク質は、配列番号９に対して１～２０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（集団的に）を有するアミノ酸配列を含む。また
は他の実施形態において、Ｓｏｘ２タンパク質は、配列番号９に対して１～１５または１～１０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（集団的に）を有するアミノ酸配列を含む。
「Ｋｌｆ４タンパク質」は、ＫＬＦ４遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその自然もしくは改変変異体、ファミリーメンバー、相同分子種、断片、もしくは融合構築物を意味し、非限定例を挙げると、ヒトＫｌｆ４タンパク質（配列番号１０）、マウスＫｌｆ４タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、またはＫｌｆ４－ＧＦＰ融合タンパク質である。Ｋｌｆ４タンパク質は、いくつかの実施形態において、配列番号１０との少なくとも７０％の同一性、または他の実施形態において、配列番号１０との少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号１０に対して１～２０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（集団的に）を有するアミノ酸配列を含む。または他の実施形態において、Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号１０に対して１～１５または１～１０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（集団的に）を有するアミノ酸配列を含む。
「ｃ－Ｍｙｃタンパク質」は、ＭＹＣ遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその自然もしくは改変変異体、ファミリーメンバー、相同分子種、断片、もしくは融合構築物を意味し、非限定例を挙げると、ヒトｃ－Ｍｙｃタンパク質（配列番号１１）、マウスｃ－Ｍｙｃタンパク質、ｌ－Ｍｙｃタンパク質、ｃ－Ｍｙｃ（Ｔ５８Ａ）タンパク質、ｃ－Ｍｙｃタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、またはｃ－Ｍｙｃ－ＧＦＰ融合タンパク質である。ｃ－Ｍｙｃタンパク質は、いくつかの実施形態において、配列番号１１との少なくとも７０％の同一性、または他の実施形態において、配列番号１１との少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｃ－Ｍｙｃタンパク質は、配列番号１１に対して１～２０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（集団的に）を有するアミノ酸を含む。または他の実施形態において、ｃ－Ｍｙｃタンパク質は、配列番号１１に対して１～１５または１～１０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（集団的に）を有するアミノ酸配列を含む。
「リプログラミング」は、細胞の表現型における変化を引き起こすことを意味し、非限定例を挙げると、β細胞前駆体を成熟β細胞に分化させること、線維芽細胞を多能性幹細胞に脱分化させること、ケラチノサイトを心筋幹細胞に分化形質転換させること、またはニューロン軸索を成長させることである。
「リプログラミング因子」は、細胞が分子と接触されるとき、および／または細胞が分子を発現するとき、単独または他の分子との組み合わせのいずれかで、リプログラミングを引き起こすことができる分子を意味し、非限定例を挙げると、Ｏｃｔ４タンパク質である。
「フィーダー」は、培地を条件付けるか、あるいは培養液中の他の細胞の成長を支持することができる細胞を意味する。
「条件付け」は、１つ以上のフィーダーを培地と接触させることを意味する。
「脂肪酸」は、少なくとも２個の炭素原子の脂肪族鎖を含む分子を意味し、非限定例を挙げると、リノール酸、α－リノレン酸、オクタン酸、ロイコトリエン、プロスタグランジン、コレステロール、グルココルチコイド、レゾルビン、プロテクチン、トロンボキサン、リポキシン、マレシン、スフィンゴ脂質、トリプトファン、Ｎ－アセチルトリプトファン、またはこれらの塩、メチルエステル、もしくは誘導体である。
「短鎖脂肪酸」は、２～３０個の炭素原子の脂肪族鎖を含む脂肪酸を意味する。
「アルブミン」は、水中で高度に溶解性であるタンパク質を意味し、非限定例を挙げると、ヒト血清アルブミンである。
「会合分子」は、別の分子に非共有結合される分子を意味する。
「アルブミンの会合分子成分」は、アルブミンポリペプチドに結合される１つ以上の分子を意味し、非限定例を挙げると、アルブミンポリペプチドに結合される脂質、ホルモン、コレステロール、カルシウムイオンなどである。
「処置済アルブミン」は、アルブミンの会合分子成分を低減、除去、置換、あるいは不活性化するように処置されるアルブミンを意味し、非限定例を挙げると、昇温でインキュベートされるヒト血清アルブミン、ナトリウムオクタノエートと接触されるヒト血清アルブミン、または多孔質材料と接触されるヒト血清アルブミンである。
「イオン交換樹脂」は、イオンを含有する溶液と接触されるとき、そのイオンのうちの１つ以上を１つ以上の異なるイオンで置換することができる材料を意味し、非限定例を挙げると、１つ以上のカルシウムイオンを１つ以上のナトリウムイオンで置換することができる材料である。
「生殖細胞」は、精細胞または卵細胞を意味する。
「多能性幹細胞」は、生体内で３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）全ての細胞に分化することができる細胞を意味する。
「体細胞」は、多能性幹細胞または生殖細胞ではない細胞を意味し、非限定例を挙げると、皮膚細胞である。
「グルコース反応性インスリン生成細胞」は、グルコースの特定の濃度に曝露されると、その細胞が異なる濃度のグルコースに曝露されるときにその細胞が生成および／または分泌することができるインスリンの量とは異なる（それ未満またはそれを超える）量のインスリンを生成および／または分泌することができる細胞を意味し、非限定例を挙げると、β細胞である。
「造血細胞」は、血球細胞または血球細胞に分化することができる細胞を意味し、非限定例を挙げると、造血幹細胞または白血球細胞である。
「心臓細胞」は、心臓の細胞または心臓の細胞に分化することができる細胞を意味し、非限定例を挙げると、心筋幹細胞または心筋細胞である。
「網膜細胞」は、網膜の細胞または網膜の細胞に分化することができる細胞を意味し、非限定例を挙げると、網膜色素上皮細胞である。
「皮膚細胞」は、皮膚中に通常見られる細胞を意味し、非限定例を挙げると、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、脂肪性幹細胞、または血球細胞である。
「Ｗｎｔシグナル伝達刺激剤」は、タンパク質のＷｎｔファミリーの１つ以上のメンバーの生物学的機能のうちの１つ以上を実施することができる分子を意味し、非限定例を挙げると、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、または２－アミノ－４－［３，４
－（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジンである。
「ＩＬ－６シグナル伝達刺激剤」は、ＩＬ－６タンパク質の生物学的機能のうちの１つ以上を実施することができる分子を意味し、非限定例を挙げると、ＩＬ－６タンパク質またはＩＬ－６受容体（別称、溶解性ＩＬ－６受容体、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６Ｒアルファなど）である。
「ＴＧＦ－βシグナル伝達刺激剤」は、タンパク質のＴＧＦ－βスーパーファミリーの１つ以上のメンバーの生物学的機能のうちの１つ以上を実施することができる分子を意味し、非限定例を挙げると、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、ＢＭＰ－４、またはＮｏｄａｌである。
「免疫抑制剤」は、免疫系の１つ以上の態様を抑制することができ、哺乳動物の中に通常は存在しない物質を意味し、非限定例を挙げると、Ｂ１８Ｒまたはデキサメタゾンである。
「一本鎖切断」は、ヌクレオチドを結合する共有結合のうちの１つ以上が一本鎖または二本鎖のうちの１つにおいて切断されている、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの領域を意味する。
「二本鎖切断」は、ヌクレオチドを結合する共有結合のうちの１つ以上が二本鎖のそれぞれにおいて切断されている、二本鎖ＤＮＡの領域を意味する。
「ヌクレオチド」は、ヌクレオチドまたはその断片もしくは誘導体を意味し、非限定例を挙げると、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド－トリフォスフェートなどである。
「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドまたはその断片もしくは誘導体を意味し、非限定例を挙げると、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド－トリフォスフェートなどである。
「遺伝子編集」は、細胞のＤＮＡ配列を変更することを意味し、非限定例を挙げると、細胞に、その細胞のＤＮＡにおける変異を引き起こすタンパク質を遺伝子導入することによるものである。
「遺伝子編集タンパク質」は、単独または１つ以上の他の分子との組み合わせのいずれかで、細胞のＤＮＡ配列を変更することができるタンパク質を意味し、非限定例を挙げると、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化された等間隔の単鎖回文反復配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、またはこれらの自然もしくは改変変異体、ファミリーメンバー、相同分子種、断片、もしくは融合構築物である。
「修復鋳型」は、遺伝子編集タンパク質の標的部位の１０ｋｂ以内にある配列との少なくとも約７０％の相同性を有する領域を含有する核酸を意味する。
「反復配列」は、少なくとも約１０％以内の相同性で、タンパク質中の１つ以上のコピー内に存在するアミノ酸配列を意味し、非限定例を挙げると、転写活性化因子様エフェクターのモノマー反復である。
「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ分子に結合することができる分子の領域を意味し、非限定例を挙げると、１つ以上の亜鉛フィンガーを含むタンパク質ドメイン、１つ以上の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター反復配列を含むタンパク質ドメイン、またはＤＮＡ分子に結合することができる小分子の結合ポケットである。
「結合部位」は、遺伝子編集タンパク質、ＤＮＡ結合性タンパク質、ＤＮＡ結合ドメイン、またはこれらの生物活性断片もしくは変異体によって認識されることができる核酸配列、または、それに対して遺伝子編集タンパク質、ＤＮＡ結合性タンパク質、ＤＮＡ結合ドメイン、またはこれらの生物活性断片もしくは変異体が高親和性を有する核酸配列を意味し、非限定例を挙げると、ヒトＢＩＲＣ５遺伝子のエクソン１中のＤＮＡの約２０個の塩基ペア配列である。
「標的」は、結合部位を含有する核酸を意味する。
他の定義は、米国出願第１３／４６５，４９０号、米国仮出願第６１／６６４，４９４号、米国仮出願第６１／７２１，３０２号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／６７９６６号、米国仮出願第６１／７８５，４０４号、および米国仮出願第６１／８４２，８７４号に記載されており、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
５－メチルシチジン脱メチル化経路の非標準ヌクレオチドメンバーは、合成ＲＮＡ内に組み込まれると、合成ＲＮＡがタンパク質に翻訳され得る効率を上昇させ、合成ＲＮＡの毒性を低下させ得ることが、今回発見された。これらの非標準ヌクレオチドとしては、例えば、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、および５－カルボキシシチジン（別称「シチジン－５－カルボン酸」）が挙げられる。したがって、特定の実施形態は核酸を対象とする。一実施形態において、本核酸は合成ＲＮＡ分子である。別の実施形態において、本核酸は１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。一実施形態において、本核酸は、５－メチルシチジン脱メチル化経路の１つ以上の非標準ヌクレオチドメンバーを含む。別の実施形態において、本核酸は、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、および５－カルボキシシチジンまたはこれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含む。さらなる実施形態において、本核酸は、プソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ－アセチルシチジン、および７－デアザグアノシンまたはこれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含む。
５－メチルシチジン脱メチル化経路

特定の実施形態はタンパク質を対象とする。他の実施形態は、タンパク質をコードする核酸を対象とする。一実施形態において、該タンパク質は対象のタンパク質である。別の実施形態において、該タンパク質は、リプログラミングタンパク質および遺伝子編集タンパク質から選択される。一実施形態において、本核酸はプラスミドである。別の実施形態において、本核酸はウイルスまたはウイルスベクター中に存在する。さらなる実施形態において、該ウイルスまたはウイルスベクターは、複製不全である。さらなる実施形態において、該ウイルスまたはウイルスベクターは、複製可能である。一実施形態において、該ウイルスまたはウイルスベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはこれらの自然もしくは改変変異体、および改変ウイルスのうちの少なくとも１つを含む。
非標準ヌクレオチドの特定の組み合わせが、合成ＲＮＡがタンパク質に翻訳され得る効率を上昇させ、合成ＲＮＡの毒性を低下させるに当たって特に有効である場合があることも発見されており、例えば、その組み合わせは、５－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン、５－メチルウリジンおよび７－デアザグアノシン、５－メチルシチジンおよび７－デアザグアノシン、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、および７－デアザグアノシン、ならびに５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、および７－デアザグアノシンである。したがって、特定の実施形態は、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、および７－デアザグアノシン、またはこれらの１つ以上の誘導体のうちの少なくとも２つを含む核酸を対象とする。他の実施形態は、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、および７－デアザグアノシン、またはこれらの１つ以上の誘導体のうちの少なくとも３つを含む核酸を対象とする。他の実施形態は、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、および７－デアザグアノシン、またはこれらの１つ以上の誘導体のうちの全てを含む核酸を対象とする。一実施形態において、本核酸は、１つ以上の５－メチルウリジン残基、１つ以上の５－メチルシチジン残基、および１つ以上の７－デアザグアノシン残基、または１つ以上の５－メチルウリジン残基、１つ以上の５－ヒドロキシメチルシチジン残基、および１つ以上の７－デアザグアノシン残基を含む。
特定の非標準ヌクレオチドの特定の画分およびこれらの組み合わせを含有する合成ＲＮＡ分子は、特に高い翻訳効率ならびに低い毒性を示し得ることがさらに発見された。したがって、特定の実施形態は、１つ以上のウリジン残基、１つ以上のシチジン残基、および１つ以上のグアノシン残基のうちの少なくとも１つを含み、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む核酸を対象とする。一実施形態において、ウリジン残基の約２０％～約８０％は５－メチルウリジン残基である。別の実施形態において、ウリジン残基の約３０％～約５０％は５－メチルウリジン残基である。さらなる実施形態において、ウリジン残基の約４０％は５－メチルウリジン残基である。一実施形態において、シチジン残基の約６０％～約８０％は５－メチルシチジン残基である。別の実施形態において、シチジン残基の約８０％～約１００％は５－メチルシチジン残基である。さらなる実施形態において、シチジン残基の約１００％は５－メチルシチジン残基である。さらなる実施形態において、シチジン残基の約２０％～約１００％は５－ヒドロキシメチルシチジン残基である。一実施形態において、グアノシン残基の約２０％～約８０％は７－デアザグアノシン残基である。別の実施形態において、グアノシン残基の約４０％～約６０％は７－デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態において、グアノシン残基の約５０％は７－デアザグアノシン残基である。一実施形態において、シチジン残基の約２０％～約８０％、または約３０％～約６０％、または約４０％はＮ４－メチルシチジンおよび／またはＮ４－アセチルシチジン残基である。別の実施形態において、各シチジン残基は５－メチルシチジン残基である。さらなる実施形態において、シチジン残基の約１００％は、５－メチルシチジン残基、および／または５－ヒドロキシメチルシチジン残基、および／またはＮ４－メチルシ
チジン残基、および／またはＮ４－アセチルシチジン残基、および／またはこれらの１つ以上の誘導体である。さらなる実施形態において、ウリジン残基の約４０％は５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約２０％～約１００％はＮ４－メチルシチジンおよび／またはＮ４－アセチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は７－デアザグアノシン残基である。一実施形態において、ウリジン残基の約４０％は５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％は５－メチルシチジン残基である。別の実施形態において、ウリジン残基の約４０％は５－メチルウリジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は７－デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態において、シチジン残基の約１００％は５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は７－デアザグアノシン残基である。一実施形態において、ウリジン残基の約４０％は５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％は５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は７－デアザグアノシン残基である。別の実施形態において、ウリジン残基の約４０％は５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約２０％～約１００％は５－ヒドロキシメチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は７－デアザグアノシン残基である。いくつかの実施形態において、シチジン残基の１００％未満は５－メチルシチジン残基である。他の実施形態において、シチジン残基の１００％未満は５－ヒドロキシメチルシチジン残基である。一実施形態において、合成ＲＮＡ分子内の各ウリジン残基は、プソイドウリジン残基または５－メチルプソイドウリジン残基である。別の実施形態において、ウリジン残基の約１００％はプソイドウリジン残基および／または５－メチルプソイドウリジン残基である。さらなる実施形態において、ウリジン残基の約１００％はプソイドウリジン残基および／または５－メチルプソイドウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％は５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は７－デアザグアノシン残基である。
５－メチルウリジンの代わりに、またはそれと組み合わせて使用することができる他の非標準ヌクレオチドは、プソイドウリジンおよび５－メチルプソイドウリジン（別称「１－メチルプソイドウリジン」、別称「Ｎ１－メチルプソイドウリジン」）またはこれらの１つ以上の誘導体を含むがこれらに限定されない。５－メチルシチジンおよび／または５－ヒドロキシメチルシチジンの代わりに、またはそれと組み合わせて使用することができる他の非標準ヌクレオチドは、プソイドイソシチジン、５－メチルプソイドイソシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－カルボキシシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、またはこれらの１つ以上の誘導体を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態において、例えば、単一の遺伝子導入のみを実施するとき、または遺伝子導入されている細胞が、特に遺伝子導入関連毒性もしくは自然免疫シグナル伝達に対して感受性でないとき、非標準ヌクレオチドの画分は低減され得る。非標準ヌクレオチドの画分を低減することにより核酸のコストを低減することができるため、非標準ヌクレオチドの画分を低減することは、ある程度有益であり得る。特定の状況において、例えば、核酸の最小の免疫原性が所望されるとき、非標準ヌクレオチドの画分は増加され得る。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの酵素は、標準および非標準ヌクレオチドの両方を含有する生体外転写反応において、標準ヌクレオチドを優先的に組み込むことができる。結果として、非標準ヌクレオチドの特定の画分を含有する生体外転写反応は、非標準ヌクレオチドが反応中に存在した画分と異なる、しばしばそれよりも低い、非標準ヌクレオチド画分を含有するＲＮＡをもたらすことができる。したがって、特定の実施形態において、ヌクレオチド組み込み画分（例えば、「５０％の５－メチルウリジン」）への参照は、ヌクレオチドの規定の画分を含有する核酸、およびヌクレオチド（またはヌクレオチド誘導体、例えば、ヌクレオチド－トリフォスフェート）の規定の画分を含有する反応物中に合成される核酸の両方を意味し得る（ただし、かかる反応は、非標準ヌクレオチドが反応物中に存在した画分と異なるヌクレオチドの画分を含有する核酸をもたらし得る）。さらに、
異なるヌクレオチド配列は、代替のコドンを利用することによって同一のタンパク質をコードすることができる。したがって、特定の実施形態において、ヌクレオチド組み込み画分への参照は、ヌクレオチドの規定の画分を含有する核酸、および同一のタンパク質を異なる核酸としてコードする核酸の両方を意味し得、該異なる核酸は、ヌクレオチドの規定の画分を含有する。
細胞のＤＮＡ配列は、細胞を遺伝子編集タンパク質と接触させること、または細胞を誘導して遺伝子編集タンパク質を発現させることによって変更することができる。しかしながら、以前に開示された遺伝子編集タンパク質には、低い結合効率および過剰なオフターゲット活性という弱点があり、これは、細胞のＤＮＡ中に望ましくない変異を導入し、患者の細胞への望ましくない変異の導入が癌の発達につながり得る治療用途において、その使用を大幅に制限し得る。ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼ開裂ドメイン（配列番号１）を含む遺伝子編集タンパク質が、高レベルのオンターゲット活性を維持しながら、以前に開示された遺伝子編集タンパク質よりも実質的に低いオフターゲット活性を示し得ることが、今回発見された。遺伝子編集タンパク質：ＳｔｓＩ－ＨＡ（配列番号２）、ＳｔｓＩ－ＨＡ２（配列番号３）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ（配列番号４）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２（配列番号５）、ＳｔｓＩ－ＨＦ（配列番号６）、およびＳｔｓＩ－ＵＨＦ（配列番号７）のヌクレアーゼドメインとして使用される際に、高いオンターゲット活性、低いオフターゲット活性、小さなサイズ、溶解性、ならびに他の望ましい特性を示すことができる、他の新型の改変タンパク質も発見された。ＳｔｓＩ－ＨＦ（高忠実度）およびＳｔｓＩ－ＵＨＦ（超高忠実度）は、１４１および１５２位置におけるＣ末端領域内の特異アミノ酸置換にある程度起因して、野生型ＳｔｓＩおよび野生型ＦｏｋＩの両方よりも低いオフターゲット活性を示し得る一方、ＳｔｓＩ－ＨＡ、ＳｔｓＩ－ＨＡ２（高活性）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ、およびＳｔｓＩ－ＵＨＡ２（超高活性）は、３４および６１位置におけるＮ末端領域内の特異アミノ酸置換にある程度起因して、野生型ＳｔｓＩおよび野生型ＦｏｋＩの両方よりも高いオンターゲット活性を示し得る。したがって、特定の実施形態は、ヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を対象とする。一実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（配列番号５３）の開裂ドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼ（配列番号１）、ＳｔｓＩ－ＨＡ（配列番号２）、ＳｔｓＩ－ＨＡ２（配列番号３）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ（配列番号４）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２（配列番号５）、ＳｔｓＩ－ＨＦ（配列番号６）、およびＳｔｓＩ－ＵＨＦ（配列番号７）の開裂ドメイン、またはこれらの生物活性断片もしくは変異体のうちの１つ以上を含む。
特定の新型の反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含む改変遺伝子編集タンパク質が、高レベルのオンターゲット活性を維持しながら、以前に開示された遺伝子編集タンパク質よりも低いオフターゲット活性を示し得ることも、今回発見された。これらの改変遺伝子編集タンパク質の特定のものは、例えば、反復配列を接続するリンカー領域の向上した可動性を含む、以前に開示された遺伝子編集タンパク質に勝るいくつかの利点を提供することができ、これは、向上した結合効率をもたらし得る。したがって、特定の実施形態は、複数の反復配列を含むタンパク質を対象とする。一実施形態において、反復配列のうちの少なくとも１つは、アミノ酸配列：ＧａｂＧを含有し、「ａ」および「ｂ」はそれぞれ任意のアミノ酸を表す。一実施形態において、該タンパク質は遺伝子編集タンパク質である。別の実施形態において、反復配列のうちの１つ以上は、ＤＮＡ結合ドメイン内に存在する。さらなる実施形態において、「ａ」および「ｂ」はそれぞれ、ＨおよびＧグループから独立して選択される。さらなる実施形態において、「ａ」および「ｂ」は、それぞれＨおよびＧである。一実施形態において、アミノ酸配列は、反復配列のＣ末端の約５つのアミノ酸内に存在する。別の実施形態において、アミノ酸配列は、反復配列のＣ末端において存在する。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＧａｂＧ中の１つ以上のＧは、Ｇ以外の１つ以上のアミノ酸、例えばＡ、Ｈ、またはＧＧで置換される。一実施形態において、反復配列は、約３２～約４０のアミノ酸、または約３３～約３９のアミノ酸、また
は約３４～３８のアミノ酸、または約３５～約３７のアミノ酸、または約３６のアミノ酸、または約３２を上回るアミノ酸、または約３３を上回るアミノ酸、または約３４を上回るアミノ酸、または約３５を上回るアミノ酸の長さを有する。他の実施形態は、１つ以上の転写活性化因子様エフェクタードメインを含むタンパク質を対象とする。一実施形態において、転写活性化因子様エフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、反復配列を含む。他の実施形態は、転写活性化因子様エフェクタードメインの反復配列のうちの少なくとも２つの間に、１つ以上のアミノ酸を挿入することによって産生される、複数の反復配列を含むタンパク質を対象とする。一実施形態において、１つ以上のアミノ酸は、少なくとも１つの反復配列のＣ末端から約１または約２または約３または約４または約５のアミノ酸に挿入される。さらに他の実施形態は、複数の反復配列を含むタンパク質を対象とし、およそ１つおきの反復配列は、その反復配列の直前または直後の反復配列と異なる長さを有する。一実施形態において、１つおきの反復配列は約３６アミノ酸長である。別の実施形態において、１つおきの反復配列は３６アミノ酸長である。さらに他の実施形態は、複数の反復配列を含むタンパク質を対象とし、該複数の反復配列は、それぞれ少なくとも３６アミノ酸長である少なくとも２つの反復配列を含み、少なくとも３６アミノ酸長である該反復配列のうちの少なくとも２つは、３６未満のアミノ酸長である少なくとも１つの反復配列によって分離されている。いくつかの実施形態は、例えば、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、および配列番号６０から選択される１つ以上の配列を含むタンパク質を対象とする。
他の実施形態は、ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質を対象とする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、複数の反復配列を含む。一実施形態において、該複数の反復配列は、標的ＤＮＡ分子内の結合部位の高特異性認識を可能にする。別の実施形態において、反復配列のうちの少なくとも２つは、互いに対して少なくとも約５０％、約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９８％、または約９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、反復配列のうちの少なくとも１つは、標的ＤＮＡ分子内の結合部位に結合することができる１つ以上の領域を含む。さらなる実施形態において、結合部位は、約１～約５塩基長の定義された配列を含む。一実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガーを含む。別の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含む。さらなる実施形態において、該複数の反復配列は、ＴＡＬＥに対して少なくとも約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９８％、または約９９％の相同性を有する少なくとも１つの反復配列を含む。さらなる実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、クラスター化された等間隔の単鎖回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質を含む。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、核局在化配列を含む。別の実施形態において、核局在化配列は、アミノ酸配列：ＰＫＫＫＲＫＶを含む。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含む。別の実施形態において、ミトコンドリア局在化配列は、アミノ酸配列：ＬＧＲＶＩＰＲＫＩＡＳＲＡＳＬＭを含む。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質はリンカーを含む。別の実施形態において、リンカーは、ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに接続させる。さらなる実施形態において、リンカーは、約１～約１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは、約１、約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０アミノ酸長である。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、標的ＤＮＡ分子内にニックまたは二本鎖切断を生み出すことができる。
特定の実施形態は、細胞のゲノムを変性するための方法であって、該細胞中に核酸分子を導入することであって、３６アミノ酸長の１つ以上の反復単位およびエンドヌクレアーゼドメインを含む、人工転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター反復ドメインを含む、非自然発生融合タンパク質をコードする核酸分子を導入することを含み、該反復ドメイン
が、所定のヌクレオチド配列の認識のために改変され、該融合タンパク質が、該所定のヌクレオチド配列を認識する、方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は真核細胞である。別の実施形態において、該細胞は動物細胞である。さらなる実施形態において、該細胞は哺乳類細胞である。さらなる実施形態において、該細胞はヒト細胞である。一実施形態において、該細胞は植物細胞である。別の実施形態において、該細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、該細胞の核酸内にエンドヌクレアーゼ的開裂を導入し、それによって該細胞のゲノムが変性される。
他の実施形態は、非自然発生融合タンパク質をコードする核酸分子であって、３６アミノ酸長の１つ以上の反復単位および制限エンドヌクレアーゼ活性を含む、人工転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター反復ドメインを含み、該反復ドメインが、所定のヌクレオチド配列の認識のために改変され、該融合タンパク質が、該所定のヌクレオチド配列を認識する、核酸分子を対象とする。一実施形態において、反復単位は、約７つ以下のアミノ酸によって異なる。別の実施形態において、反復単位のそれぞれは、アミノ酸配列：ＬＴＰＸＱＶＶＡＩＡＳを含有し、ＸはＥまたはＱのいずれかであり得、アミノ酸配列：ＬＴＰＸＱＶＶＡＩＡＳは、アデニン、シトシン、グアニン、またはチミンのうちの１つの認識を判定する、１つまたは２つのいずれかのアミノ酸による、カルボキシル末端の後に続く。一実施形態において、本核酸は、約１．５～約２８．５の反復単位をコードする。別の実施形態において、本核酸は、約１１．５、約１４．５、約１７．５、または約１８．５の反復単位をコードする。さらなる実施形態において、該所定のヌクレオチド配列は、プロモーター領域である。いくつかの実施形態は、核酸分子または配列を含むベクターを対象とする。一実施形態において、該ベクターはウイルスベクターである。別の実施形態において、該ウイルスベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはこれらの自然もしくは改変変異体、および改変ウイルスのうちの１つ以上を含む。
特定の実施形態は、非自然発生融合タンパク質をコードする核酸分子であって、所定のヌクレオチド配列を認識する第１の領域と、エンドヌクレアーゼ活性を有する第２の領域と、を含み、該第１の領域は、７つ以下のアミノ酸によって互いと異なる、約３６アミノ酸長の１つ以上の反復単位を含む人工ＴＡＬエフェクター反復ドメインを含有し、該反復ドメインは、該所定のヌクレオチド配列の認識のために改変される、核酸分子を対象とする。一実施形態において、該第１の領域は、アミノ酸配列：ＬＴＰＸＱＶＶＡＩＡＳを含有し、ＸはＥまたはＱのいずれかであり得る。別の実施形態において、コードされる非自然発生融合タンパク質のアミノ酸配列ＬＴＰＸＱＶＶＡＩＡＳの直後に、ＨＤ、ＮＧ、ＮＳ、ＮＩ、ＮＮ、およびＮから選択されるアミノ酸配列が続く。さらなる実施形態において、該融合タンパク質は制限エンドヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０から選択される１つ以上の配列を含むタンパク質をコードする核酸分子を対象とする。
一実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＨＧを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＮ、Ｈ、またはＩであり、「ｙ」は任意のアミノ酸またはアミノ酸の不在であり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧである。別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＨＧを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＮ、Ｈ、またはＩであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、およびＧから選択され、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬ
ＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＨＧを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＮ、Ｈ、およびＩ以外の任意のアミノ酸であり、「ｙ」は任意のアミノ酸またはアミノ酸の不在であり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗＩｙｚＨＧを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｙ」はＧ以外の任意のアミノ酸であり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗＩＡｚＨＧを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＨＧを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＳ、Ｔ、またはＱであり、「ｙ」は任意のアミノ酸またはアミノ酸の不在であり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＨＧを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＳ、Ｔ、またはＱであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、およびＧから選択され、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＳ、Ｔ、またはＱである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙを含み、「ｖ」はＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＳ、Ｔ、またはＱであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、およびＧから選択される。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧを含み、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＮ、Ｈ、またはＩであり、「ｙ」は任意のアミノ酸またはアミノ酸の不在であり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧを含み、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＮ、Ｈ、またはＩであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、およびＧから選択され、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧであり、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＮ、Ｈ、およびＩ以外の任意のアミノ酸であり、「ｙ」は任意のアミノ酸またはアミノ酸の不在であり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩ
ＡｗＩｙｚＧＨＧＧであり、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｙ」はＧ以外の任意のアミノ酸であり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗＩＡｚＧＨＧＧを含み、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧを含み、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＳ、Ｔ、またはＱであり、「ｙ」は任意のアミノ酸またはアミノ酸の不在であり、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧを含み、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＳ、Ｔ、またはＱであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、およびＧから選択され、「ｚ」はＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘを含み、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＳ、Ｔ、またはＱである。さらに別の実施形態において、反復配列は、ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙを含み、「ｖ」はＱ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＳ、Ｔ、またはＱであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、およびＧから選択される。
Ｎ末端において短縮される断片、Ｃ末端において短縮される断片、内部欠失を有する断片、ならびにＮ末端、Ｃ末端、および／または内部欠失を組み合わせる断片を含む、エンドヌクレアーゼ開裂ドメインの特定の断片は、完全なエンドヌクレアーゼ開裂ドメインの触媒活性の一部または全体を維持することができる。断片が完全なドメインの触媒活性の一部または全体を維持することができるかの判定は、例えば、本発明の方法に従う断片を含有する遺伝子編集タンパク質を合成すること、細胞を誘導して本発明の方法に従う遺伝子編集タンパク質を発現させること、および遺伝子編集の効率を測定することによって達成することができる。このように、遺伝子編集効率の測定を使用して、任意の特異的断片が完全なエンドヌクレアーゼ開裂ドメインの触媒活性の一部または全体を維持することができるかを確認することができる。したがって、特定の実施形態は、エンドヌクレアーゼ開裂ドメインの生物活性断片を対象とする。一実施形態において、エンドヌクレアーゼ開裂ドメインは、ＦｏｋＩ、ＳｔｓＩ、ＳｔｓＩ－ＨＡ、ＳｔｓＩ－ＨＡ２、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２、ＳｔｓＩ－ＨＦ、およびＳｔｓＩ－ＵＨＦ、またはこれらの自然もしくは改変変異体または生物活性断片から選択される。
Ｎ末端において短縮される断片、Ｃ末端において短縮される断片、内部欠失を有する断片、ならびにＮ末端、Ｃ末端、および／または内部欠失を組み合わせる断片を含む、ＤＮＡ結合ドメインまたは反復配列の特定の断片は、完全なＤＮＡ結合ドメインまたは反復配列の結合活性の一部または全体を維持することができる。完全な反復配列の結合活性の一部または全体を維持することができるＤＮＡ結合ドメインまたは反復配列の断片の例としては、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）ＴＡＬＥ様タンパク質（ＲＴＬ）が挙げられる。断片が完全なＤＮＡ結合ドメインまたは反復配列の結合活性の一部または全体を維持することができるかの判定は、例えば、本発明の方法に従う断片を含有する遺伝子編集タンパク質を合成すること、細胞を誘導して本発明の方法に従う遺
伝子編集タンパク質を発現させること、および遺伝子編集の効率を測定することによって達成することができる。このように、遺伝子編集効率の測定を使用して、任意の特異的断片が完全なＤＮＡ結合ドメインまたは反復配列の結合活性の一部または全体を維持することができるかを確認することができる。したがって、特定の実施形態は、ＤＮＡ結合ドメインまたは反復配列の生物活性断片を対象とする。一実施形態において、該断片は、標的ＤＮＡ分子内の結合部位の高特異性認識を可能にする。別の実施形態において、該断片は、青枯病菌ＴＡＬＥ様タンパク質またはその生物活性断片をコードする配列を含む。
特定の実施形態は、核酸を含む細胞のＤＮＡ配列を変更するための組成物を対象とし、本核酸は遺伝子編集タンパク質をコードする。他の実施形態は、核酸混合物を含む細胞のＤＮＡ配列を変更するための組成物を対象とし、該核酸混合物は、第１の遺伝子編集タンパク質をコードする第１の核酸と、第２の遺伝子編集タンパク質をコードする第２の核酸と、を含む。一実施形態において、第１の遺伝子編集タンパク質の結合部位、および第２の遺伝子編集タンパク質の結合部位は、同一の標的ＤＮＡ分子内に存在する。別の実施形態において、第１の遺伝子編集タンパク質の結合部位、および第２の遺伝子編集タンパク質の結合部位は、約５０個未満の塩基、約４０個未満の塩基、または約３０個未満の塩基もしくは約２０個未満の塩基、または約１０個未満の塩基、または約１０個～約２５個の塩基、または約１５個の塩基によって分離される。一実施形態において、第１の遺伝子編集タンパク質のヌクレアーゼドメイン、および第２の遺伝子編集タンパク質のヌクレアーゼドメインは、二量体を形成することができる。別の実施形態において、該二量体は、標的ＤＮＡ分子内にニックまたは二本鎖切断を生み出すことができる。一実施形態において、本組成物は治療用組成物である。別の実施形態において、本組成物は修復鋳型を含む。さらなる実施形態において、該修復鋳型は一本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＤＮＡ分子である。
他の実施形態は、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸を合成するための製造物品を対象とする。一実施形態において、本物品は核酸である。別の実施形態において、該タンパク質はＤＮＡ結合ドメインを含む。さらなる実施形態において、本核酸はＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、該タンパク質はヌクレアーゼドメインを含む。別の実施形態において、本核酸はヌクレアーゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、該タンパク質は、複数の反復配列を含む。別の実施形態において、本核酸は複数の反復配列をコードする。さらなる実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ、ＳｔｓＩｍＳｔｓＩ－ＨＡ、ＳｔｓＩ－ＨＡ２、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２、ＳｔｓＩ－ＨＦ、およびＳｔｓＩ－ＵＨＦ、またはこれらの自然もしくは改変変異体または生物活性断片から選択される。一実施形態において、本核酸はＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。別の実施形態において、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターである。さらなる実施形態において、本核酸はウイルスプロモーターを含む。一実施形態において、本核酸は非翻訳領域を含む。別の実施形態において、本核酸は生体外転写鋳型である。
特定の実施形態は、細胞を誘導してタンパク質を発現させるための方法を対象とする。他の実施形態は、細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法であって、該細胞に遺伝子編集タンパク質を遺伝子導入すること、または該細胞を誘導して遺伝子編集タンパク質を発現させることを含む、方法を対象とする。さらに他の実施形態は、細胞中の対象のタンパク質の発現を低減するための方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は、誘導されて遺伝子編集タンパク質を発現し、該遺伝子編集タンパク質は、標的ＤＮＡ分子内にニックまたは二本鎖切断を作ることができる。別の実施形態において、ニックまたは二本鎖切断は、遺伝子の不活性化をもたらす。さらに他の実施形態は、タンパク質の不活性、活性低下、またはドミナントネガティブ型を産生するための方法を対象とする。一実施形態に
おいて、該タンパク質はサバイビンである。さらに他の実施形態は、細胞中の１つ以上の変異を修復するための方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は、修復鋳型と接触される。別の実施形態において、該修復鋳型はＤＮＡ分子である。さらなる実施形態において、該修復鋳型は、遺伝子編集タンパク質の結合部位を含有しない。さらなる実施形態において、該修復鋳型は、遺伝子編集タンパク質の結合部位を含むＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする。
他の実施形態は、患者を治療するための方法であって、患者に、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸の治療有効量を投与することを含む、方法を対象とする。一実施形態において、該治療は、１つ以上の患者の症状の寛解をもたらす。特定の実施形態は、患者を治療するための方法であって、ａ．該患者から細胞を除去することと、ｂ．該細胞に遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を遺伝子導入することによって、該細胞を誘導して遺伝子編集タンパク質を発現させることと、ｃ．該細胞をリプログラミングすることと、ｅ．該細胞を該患者に導入することと、を含む、方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は、より分化されていない状態にリプログラムされる。別の実施形態において、該細胞は、該細胞に、１つ以上のリプログラミングタンパク質をコードする１つ以上の合成ＲＮＡ分子を遺伝子導入することによって、リプログラムされる。さらなる実施形態において、該細胞は分化される。さらなる実施形態において、該細胞は、皮膚細胞、グルコース反応性インスリン生成細胞、造血細胞、心臓細胞、網膜細胞、腎細胞、神経系細胞、間質細胞、脂肪細胞、骨細胞、筋細胞、卵母細胞、および精細胞のうちの１つに分化される。他の実施形態は、患者を治療するための方法であって、ａ．該患者から造血細胞または幹細胞を除去することと、ｂ．該細胞に遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を遺伝子導入することによって、該細胞を誘導して遺伝子編集タンパク質を発現させることと、ｃ．該細胞を該患者に導入することと、を含む、方法を対象とする。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、塩基性線維芽細胞成長因子、および形質転換成長因子ベータから本質的に成る、またはこれらを含む細胞培養培地は、生体外のヒト多能性幹細胞を含む多能性幹細胞を維持するのに十分であることが、今回発見された。したがって、特定の実施形態は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、塩基性線維芽細胞成長因子、および形質転換成長因子ベータから本質的に成る、またはこれらを含む細胞培養培地を対象とする。一実施形態において、アスコルビン酸は、約５０μｇ／ｍＬで存在する。別の実施形態において、インスリンは、約１０μｇ／ｍＬで存在する。さらなる実施形態において、トランスフェリンは、約５．５μｇ／ｍＬで存在する。さらなる実施形態において、亜セレン酸ナトリウムは、約６．７ｎｇ／ｍＬで存在する。さらなる実施形態において、エタノールアミンは、約２μｇ／ｍＬで存在する。さらなる実施形態において、塩基性線維芽細胞成長因子は、約２０ｎｇ／ｍＬで存在する。さらなる実施形態において、形質転換成長因子ベータは、約２ｎｇ／ｍＬで存在する。一実施形態において、アスコルビン酸は、アスコルビン酸－２－フォスフェートである。別の実施形態において、形質転換成長因子ベータは、形質転換成長因子ベータ１または形質転換成長因子ベータ３である。一実施形態において、細胞培養培地は、多能性幹細胞の培養のために使用される。別の実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。さらなる実施形態において、細胞培養培地は、リプログラミングの間またはその後の細胞の培養のために使用される。一実施形態において、細胞培養培地は、動物由来成分を含有しない。別の実施形態において、細胞培養培地は、製造規格に従って製造される。さらなる実施形態において、該製造規格はＧＭＰである。一実施形態において、該細胞は、細胞接着分子と接触される。別の実施形態において、細胞接着分子は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンまたはこれらの生物活性断片から選択される。さらなる実施形態において、該細胞は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンと接触される。さらなる実施形態において、細胞接着分子は組換え体である。
特定の状況において、例えば、治療薬を生成する際、一つには、ウイルスおよび／または他の動物由来の病原体による汚染の危険性を低減するために、動物由来成分を非動物由来成分で置換することが有益な場合がある。遺伝子導入効率を低下させるか、または遺伝子導入関連の毒性を上昇させることなく、半合成の植物由来コレステロールを含む合成コレステロールを遺伝子導入培地中の動物由来コレステロールと置換できることが、今回発見された。したがって、特定の実施形態は、合成または半合成コレステロールを含有する遺伝子導入培地を対象とする。一実施形態において、半合成コレステロールは植物由来である。別の実施形態において、遺伝子導入培地は、動物由来コレステロールを含有しない。さらなる実施形態において、遺伝子導入培地は、リプログラミング培地である。他の実施形態は、複合体形成培地を対象とする。一実施形態において、複合体形成培地は、約７超、または約７．２超、または約７．４超、または約７．６超、または約７．８超、または約８．０超、または約８．２超、または約８．４超、または約８．６超、または約８．８超、または約９．０超のｐＨを有する。別の実施形態において、複合体形成培地は、トランスフェリンを含む。さらなる実施形態において、複合体形成培地は、ＤＭＥＭを含む。さらなる実施形態において、複合体形成培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。さらに他の実施形態は、核酸遺伝子導入試薬の複合体を形成するための方法を対象とする。一実施形態において、遺伝子導入試薬は、複合体形成培地でインキュベートされる。別の実施形態において、インキュベーションは、混合ステップの前に発生する。さらなる実施形態において、インキュベーションステップは、約５秒～約５分、または約１０秒～約２分、または約１５秒～約１分、または約３０秒～約４５秒である。一実施形態において、遺伝子導入試薬は、表１から選択される。別の実施形態において、遺伝子導入試薬は、脂質または脂質様物質（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）である。さらなる実施形態において、遺伝子導入試薬は、陽イオンを含む。さらなる実施形態において、該陽イオンは、多価陽イオンである。さらなる実施形態において、遺伝子導入試薬は、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（別称ＭＶＬ５）またはその誘導体である。
特定の実施形態は、細胞を核酸と接触させることによって、細胞を誘導してタンパク質を発現させるための方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は哺乳類細胞である。別の実施形態において、該細胞は、ヒト細胞またはげっ歯類細胞である。他の実施形態は、本発明の方法のうちの１つ以上を使用して生成される細胞を対象とする。一実施形態において、該細胞は、患者内に存在する。別の実施形態において、該細胞は、患者から単離される。他の実施形態は、本発明の方法のうちの１つ以上を使用して生成される細胞を含むスクリーニングライブラリを対象とする。一実施形態において、スクリーニングライブラリは、心毒性スクリーニング、神経毒性スクリーニング、および肝毒性スクリーニングを含む毒性スクリーニング、効力スクリーニング、高処理スクリーニング、高含量スクリーニング、ならびに他のスクリーニングのうちの少なくとも１つのために使用される。
他の実施形態は、核酸を含有するキットを対象とする。一実施形態において、本キットは、送達試薬（別称「遺伝子導入試薬」）を含有する。別の実施形態において、本キットは、リプログラミングキットである。さらなる実施形態において、本キットは、遺伝子編集キットである。他の実施形態は、核酸を生成するためのキットを対象とする。一実施形態において、本キットは、プソイドウリジン－トリフォスフェート、５－メチルウリジントリフォスフェート、５－メチルシチジントリフォスフェート、５－ヒドロキシメチルシチジントリフォスフェート、Ｎ４－メチルシチジントリフォスフェート、Ｎ４－アセチルシチジントリフォスフェート、および７－デアザグアノシントリフォスフェート、またはこれらの１つ以上の誘導体のうちの少なくとも２つを含有する。他の実施形態は、核酸を含む治療薬を対象とする。一実施形態において、該治療薬は、医薬組成物である。別の実
施形態において、該医薬組成物は配合される。さらなる実施形態において、該配合物は、リポソームの水性懸濁液を含む。リポソーム成分の例は表１に記載され、制限ではなく、例として提示されるものである。一実施形態において、リポソームは、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。別の実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ２０００である。さらなる実施形態において、リポソームは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－フォスフォエタノールアミン（ＤＳＰＥ）またはその誘導体を含む。一実施形態において、該治療薬は、１つ以上のリガンドを含む。別の実施形態において、該治療薬は、アンドロゲン、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、細胞透過性ペプチド、ＣＸＣＲ、エストロゲン、上皮成長因子、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、葉酸、インスリン、インスリン様成長因子Ｉ、インターロイキン－１３、インテグリン、プロゲステロン、間質由来因子１、トロンビン、ビタミンＤ、およびトランスフェリン、またはこれらの生物活性断片もしくは変異体のうちの少なくとも１つを含む。さらに他の実施形態は、本発明の方法のうちの１つ以上を使用して産生される細胞を含む治療薬を対象とする。一実施形態において、該治療薬は、１型糖尿病、虚血性および拡張型心筋症を含む心臓疾患、黄斑変性症、パーキンソン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、地中海貧血症、ファンコニ貧血、重症複合免疫不全症、遺伝性感覚性ニューロパチー、色素性乾皮症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、癌、ならびに肝炎およびＨＩＶ／ＡＩＤＳを含む感染性疾患のうちの少なくとも１つの治療のために、患者に投与される。

特定の実施形態は、キャップ０、キャップ１、キャップ２、およびキャップ３、またはこれらの誘導体から選択される５′キャップ構造を含む核酸を対象とする。一実施形態において、本核酸は１つ以上のＵＴＲを含む。別の実施形態において、該１つ以上のＵＴＲは、本核酸の安定性を上昇させる。さらなる実施形態において、該１つ以上のＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビン５′－ＵＴＲを含む。さらなる実施形態において、該１つ以上のＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビン３′－ＵＴＲを含む。さらなる実施形態において、合成ＲＮＡ分子は、アルファグロビンまたはベータグロビン５′－ＵＴＲ、およびアルファグロビンまたはベータグロビン３′－ＵＴＲを含む。一実施形態において、該５′－ＵＴＲは、コザック（Ｋｏｚａｋ）共通配列と実質的に同様であるコザック配列を含む。別の実施形態において、本核酸は、３′ポリ（Ａ）尾部を含む
。さらなる実施形態において、該３′ポリ（Ａ）尾部は、約２０ｎｔ～約２５０ｎｔ、または約１２０ｎｔ～約１５０ｎｔの長さである。さらなる実施形態において、該３′ポリ（Ａ）尾部は、約２０ｎｔ、または約３０ｎｔ、または約４０ｎｔ、または約５０ｎｔ、または約６０ｎｔ、または約７０ｎｔ、または約８０ｎｔ、または約９０ｎｔ、または約１００ｎｔ、または約１１０ｎｔ、または約１２０ｎｔ、または約１３０ｎｔ、または約１４０ｎｔ、または約１５０ｎｔ、または約１６０ｎｔ、または約１７０ｎｔ、または約１８０ｎｔ、または約１９０ｎｔ、または約２００ｎｔ、または約２１０ｎｔ、または約２２０ｎｔ、または約２３０ｎｔ、または約２４０ｎｔ、または約２５０ｎｔの長さである。
他の実施形態は、細胞をリプログラミングするための方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は、該細胞を１つ以上の核酸と接触させることによってリプログラムされる。一実施形態において、該細胞は、Ｏｃｔ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、ｃ－Ｍｙｃタンパク質、Ｌｉｎ２８タンパク質、またはこれらの生物活性断片、変異体、もしくは誘導体のうちの少なくとも１つをコードする複数の核酸と接触される。別の実施形態において、該細胞は、Ｏｃｔ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、およびｃ－Ｍｙｃタンパク質、またはこれらの１つ以上の生物活性断片、変異体、もしくは誘導体を含む複数のタンパク質をコードする複数の核酸と接触される。さらに他の実施形態は、細胞を遺伝子編集するための方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は、該細胞を１つ以上の核酸と接触させることによって遺伝子編集される。
動物モデルは、生物学的過程の効果を研究するために日常的に使用される。特定の状況において、例えば、ヒト疾患を研究する際、変性ゲノムを含有する動物モデルが有益である場合があり、これは、一つには、かかる動物モデルはヒト疾患の表現型をより綿密に模倣し得るからである。したがって、特定の実施形態は、１つ以上の遺伝子変異（別称「変異」、別称「遺伝子編集」）を含有する生物を作製するための方法を対象とする。一実施形態において、該１つ以上の遺伝子変異は、細胞に、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする１つ以上の核酸を遺伝子導入することによって産生される。別の実施形態において、該１つ以上の核酸は、合成ＲＮＡ分子を含む。一実施形態において、該１つ以上の遺伝子編集タンパク質は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、クラスター化された等間隔の単鎖回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびニッカーゼ、またはこれらの生物活性断片もしくは変異体のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態において、該細胞は多能性細胞である。別の実施形態において、該細胞は胚性幹細胞である。さらなる実施形態において、該細胞は胚である。さらなる実施形態において、該細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、および細菌細胞のメンバーである。一実施形態において、該細胞はげっ歯類細胞である。別の実施形態において、該細胞はヒト細胞である。特定の実施形態において、該細胞は、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする１つ以上の核酸、および１つ以上の修復鋳型をコードする１つ以上の核酸を遺伝子導入される。一実施形態において、該細胞は、胚盤胞内に導入される。別の実施形態において、該細胞は、偽妊娠の雌中に導入される。さらなる実施形態において、その子孫中の遺伝子変異の存在または不在が判定される。さらなる実施形態において、該判定は、直接配列決定によるものである。一実施形態において、該生物は、家畜、例えば、ブタ、ウシなどである。別の実施形態において、該生物は、ペット、例えば、イヌ、ネコ、魚などである。
特定の状況において、例えば、核酸配列の付加によって標的細胞のゲノムを変更する際、一つには、ランダム挿入に関連する危険性を低減するために、安全港（ｓａｆｅ－ｈａｒｂｏｒ）位置内に該核酸配列を挿入することが好都合である場合がある。したがって、特定の実施形態は、安全港位置内に核酸配列を挿入するための方法を対象とする。一実施
形態において、該細胞はヒト細胞であり、該安全港位置はＡＡＶＳ１遺伝子座である。別の実施形態において、該細胞はげっ歯類細胞であり、該安全港位置はＲｏｓａ２６遺伝子座である。一実施形態において、該細胞は、１つ以上の修復鋳型をコードする１つ以上の核酸にさらと接触される。他の実施形態は、細胞のＤＮＡ配列を変更するためのキットを対象とする。一実施形態において、該細胞はヒト細胞であり、標的ＤＮＡ分子は、ＡＡＶＳ１遺伝子座をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、該細胞はげっ歯類細胞であり、標的ＤＮＡ分子は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座をコードするヌクレオチド配列を含む。他の実施形態は、レポーター細胞を産生するための方法であって、該細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする１つ以上の核酸、および１つ以上の修復鋳型をコードする１つ以上の核酸と接触させることによる方法を対象とする。一実施形態において、該１つ以上の修復鋳型は、ＤＮＡを含む。別の実施形態において、該１つ以上の修復鋳型は、１つ以上の蛍光タンパク質をコードする。さらなる実施形態において、該１つ以上の修復鋳型は、遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部をコードする。
特定の状況において、例えば、遺伝子編集された細胞のライブラリを産生する際、一つには、細胞の特徴決定のコストを低減するために、遺伝子編集の効率を上昇させることが有益な場合がある。細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡに繰り返し接触させることによって、遺伝子編集効率を上昇させられることが、今回発見された。したがって、特定の実施形態は、細胞を遺伝子編集するための方法であって、該細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする１つ以上の核酸に繰り返し接触させることによる方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は、連続５日間に少なくとも２回接触される。別の実施形態において、該細胞は、約２４時間～約４８時間の間隔で２回接触される。
癌において、悪性細胞の生存および増殖は、患者内に一般的には存在しない特異遺伝子異常の存在にある程度起因し得る。遺伝子編集タンパク質を使用して、生存および増殖関連経路を標的にし得ること、ならびに、このように使用されると、遺伝子編集タンパク質および遺伝子編集タンパク質をコードする核酸は、強力な抗癌治療薬を構成し得ることが、今回発見された。したがって、特定の実施形態は、抗癌治療薬を対象とする。一実施形態において、該治療薬は、細胞の生存を阻害する、および／または細胞の増殖を防止、緩徐化、あるいは制限する治療用組成物である。別の実施形態において、該細胞は癌細胞である。さらなる実施形態において、該治療薬は、１つ以上の遺伝子編集タンパク質または１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を含む。さらなる実施形態において、該１つ以上の遺伝子編集タンパク質は、細胞の生存および／または増殖を促進する１つ以上の配列を標的にする。かかる配列は、例えばＢＩＲＣ５などの、アポトーシス（ＩＡＰ）ファミリーの阻害剤の遺伝子を含む、アポトーシス関連遺伝子（例えば、表２、および米国仮出願第６１／７２１，３０２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表２を参照のこと）と、例えば遺伝子テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）およびテロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＥＲＣ）などの、テロメア維持に関連する配列と、例えば遺伝子ＶＥＧＦなどの、血管新生に影響する配列と、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＭＹＣファミリー、ＲＡＳファミリー、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＫＮ３、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＡＰＣ、ＲＢ１、ＶＥＧＦファミリー、ＴＮＦ、およびリボヌクレオチド還元酵素ファミリーの遺伝子を含む、他の癌関連遺伝子と、を含むがこれらに限定されない。ＢＩＲＣ５に対する遺伝子編集タンパク質標的配列の例は、表３、および米国仮出願第６１／７２１，３０２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表３に記載されており、制限ではなく、例として提示されるものである。一実施形態において、該１つ以上の配列のうちの少なくとも１つは、悪性細胞および非悪性細胞の両方の中に存在する。別の実施形態において、該１つ以上の配列のうちの少なくとも１つは、悪性細胞中で濃縮される。さらなる実施形態において、該１つ以上の配列のうちの少なくとも１つは、非悪性細
胞中で濃縮される。一実施形態において、該治療用組成物は、１つ以上の修復鋳型をコードする核酸をさらに含む。別の実施形態において、該１つ以上の遺伝子編集タンパク質は、該細胞を誘導してタンパク質の不活性またはドミナントネガティブ型を発現させる。さらなる実施形態において、該タンパク質はＩＡＰファミリーのメンバーである。さらなる実施形態において、該タンパク質はサバイビンである。



他の実施形態は、癌を治療するための方法であって、患者に、遺伝子編集タンパク質または１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする核酸の治療有効量を投与することを含む、方法を対象とする。一実施形態において、該治療は、患者内の癌細胞の成長の低減または停止をもたらす。別の実施形態において、該治療は、癌の進行の遅延または緩解をもたらす。一実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、ＢＩＲＣ５遺伝子を含む。別の実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から選択される配列を含む。さらなる実施形態において、複数の隣接する結合部位は、表３、表４、米国仮出願第６１／７２１，３０２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表３、米国仮出願第６１／７８５，４０４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表１、または米国仮出願第６１／８４２，８７４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表１に記載される１つ以上の配列に対して、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％相同性である。特定の状況において、短縮されたＮ末端ドメインを有する遺伝子編集タンパク質を使用して、結合部位配列上の第１の塩基Ｔ制限を排除することができる。いくつかの実施形態において、癌は神経膠腫である。一実施形態において、患者は、手術および／もしくは放射線療法を以前に経験している、ならびに／または、手術および／もしくは放射線療法を同時に経験する。別の実施形態において、該投与は、くも膜下腔内注入、頭蓋内注入、静脈内注入、灌流、皮下注入、腹腔内注入、門脈内注入、および局所送達のうちの１つ以上による。







特定の実施形態は、癌を治療するための方法であって、ａ．１つ以上の癌性細胞を含有する生検試料を、患者から除去することと、ｂ．該１つ以上の癌性細胞中の、癌関連遺伝子マーカーの配列を判定することと、ｃ．該患者に、遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸の治療有効量を投与することと、を含み、該標的ＤＮＡ分子の配列が、該癌関連遺伝子マーカーの配列に対して少なくとも約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９８％、または約９９％相同性である、方法を対象とする。一実施形態において、本方法は、該１つ以上の癌性細胞中の１つ以上の癌関連遺伝子マーカーの配列を、１つ以上の非癌性細胞中の同一の癌関連遺伝子マーカーの配列と比較することと、該１つ以上の癌性細胞および該１つ以上の非癌性細胞中で異なる配列を有する癌関連遺伝子マーカーを選択することと、をさらに含み、該標的ＤＮＡ分子または結合部位の配列が、該選択された癌関連遺伝子マーカーの配列に対して少なくとも約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９８％、または約９９％相同性である。
多くの癌細胞は、ヒトにおいてはＢＩＲＣ５遺伝子によってコードされる、アポトーシス（ＩＡＰ）タンパク質ファミリーの阻害剤のメンバーである、サバイビンを発現する。ＲＮＡ干渉を使用してサバイビンｍＲＮＡを含む特定のｍＲＮＡ分子の発現を低減し、特定の癌細胞の成長を一時的に阻害することができる。しかしながら、ＲＮＡ干渉を使用してサバイビンｍＲＮＡの発現を低減する以前の方法は、一時的な効果をもたらし、動物モデルにおける平均の死亡までの時間（ＴＴＤ）の短い増加しかもたらさない。細胞を誘導して、ＢＩＲＣ５遺伝子を標的にする１つ以上の遺伝子編集タンパク質を発現させることは、ＢＩＲＣ５遺伝子の破壊をもたらし得、細胞を誘導して、サバイビンタンパク質の非機能性変異体を発現および／または分泌させ得、細胞を誘導して、サバイビンタンパク質のドミナントネガティブ型変異体を発現および／または分泌させ得、該細胞および付近の細胞中の１つ以上のアポトーシス経路の活性化を引き起こし得、該細胞および付近の細胞の成長を緩徐化または停止させ得、該細胞および付近の細胞の死亡をもたらし得、癌の進行を阻害し得、癌患者の緩解をもたらし得ることが、今回発見された。したがって、特定の実施形態は、ＢＩＲＣ５遺伝子を標的にする遺伝子編集タンパク質を対象とする。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、ＢＩＲＣ５遺伝子内の１つ以上の領域に結合する。別の実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から選択される配列の１つ以上の領域に結合する。さらなる実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７から選択される１つ以上の配列に結合する。さらなる実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、配列番号３４をコードする１つ以上の核酸配列、またはその生物活性断片、変異体、もしくは類似体に結合する。さらなる実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、表３、表４、米国仮出願第６１／７２１，３０２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表３、米国仮出願第６１／７８５，４０４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表１、もしくは米国仮出願第６１／８４２，８７４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表１から選択される１つ以上の配列、または、表３、表４、米国仮出願第６１／７２１，３０２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表３、米国仮出願第６１／７８５，４０４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表１、もしくは米国仮出願第６１／８４２，８７４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表１から選択される１つ以上の配列に対して少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または約９９％相同性である１つ以上の配列に結合する。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、該細胞のＤＮＡ内に１つ以上のニックまたは二本鎖切断を作る。別の実施形態において、該１つ以上のニックまたは二本鎖切断は、ＢＩＲＣ５遺伝子内に作られる。さらなる実施形態において、該１つ以上のニックまたは二本鎖切断は、ＢＩＲＣ５遺伝子の１つ以上のエクソン内に作られる。さらなる実施形態において、該１つ以上のニックまたは二本鎖切断は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から選択される配列内に作られる。さらなる実施形態において、該１つ以上のニックまたは二本鎖切断は、アポトーシスドメイン（別称「ＩＡＰ」、「ＩＡＰドメイン」、「ＩＡＰ反復」、「アポトーシスタンパク質反復のバキュロウイルス阻害剤」、「ＢＩＲ」など）の阻害剤をコードする配列内に作られる。さらなる実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、表５、米国仮出願第６１／７８５，４０４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表２、もしくは米国仮出願第６１／８４２，８７４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表２から選択される１つ以上の配列、または、表５、米国仮出願第６１／７８５，４０４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表２、もしくは米国仮出願第６１／８４２，８７４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表２から選択される１つ以上の配列に対して少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％相同性である１つ以上の配列に結合する。さらに別の実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、表２、表５、表６、表７、米国仮出願第６１／７２１，３０２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表４、米国仮出願第６１／７８５，４０４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表２、または米国仮出願第６１／８４２，８７４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表２から選択される１つ以上の遺伝子をコードする配列に結合する。













いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、癌中で過剰発現される遺伝子を含む。癌中で過剰発現される遺伝子例としては、ＡＢＬ１、ＢＩＲＣ５、ＢＬＫ、ＢＴＫ、ＣＤＫファミリーメンバー、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＡＳ、ＦＧＲ、ＦＬＴ４、ＦＲＫ、ＦＹＮ、ＨＣＫ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰＡ４、ＫＤＲ、ＫＩＦ１１、ＫＩＦ１１、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＩＦ２１Ａ、ＫＩＦ２５、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＡＰＫ１、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＭＹＨ１、ＭＹＯ１Ｇ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＫＮ３、ＰＬＫ１、ＲＡＦ１、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＳＲＣ、ＴＮＦ、ＴＰＭ２、ＴＹＲＯ３、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＹＥＳ１、およびＺＡＰ７０が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、ＡＢＬ１、ＢＩＲＣ５、ＢＬＫ、ＢＴＫ、ＣＤＫファミリーメンバー、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＡＳ、ＦＧＲ、ＦＬＴ４、ＦＲＫ、ＦＹＮ、ＨＣＫ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰＡ４、ＫＤＲ、ＫＩＦ１１、ＫＩＦ１１、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＩＦ２１Ａ、ＫＩＦ２５、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＡＰＫ１、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＭＹＨ１、ＭＹＯ１Ｇ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＫＮ３、ＰＬＫ１、ＲＡＦ１、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＳＲＣ、ＴＮＦ、ＴＰＭ２、ＴＹＲＯ３、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＹＥＳ１、およびＺＡＰ７０、またはこれらの断片もしくは変異体から選択される遺伝子を含む。他の実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、癌中で変異される遺伝子を含む。癌中で変異される遺伝子例としては、ＡＩＭ１、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＡＳ、ＦＺＤファミリーメンバー、ＨＮＦ１Ａ、ＨＯＰＸ、ＫＬＦ６、ＭＥＮ１、ＭＬＨ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＲＢ１、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＳＴファミリーメンバー、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＶＢＰ１、ＶＨＬ、Ｗｎｔファミリーメンバー、ＢＲＡＦ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＭＡＤ４、およびＹＰＥＬ３が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、ＡＩＭ１、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＡＳ、ＦＺＤファミリーメンバー、ＨＮＦ１Ａ、ＨＯＰＸ、ＫＬＦ６、ＭＥＮ１、ＭＬＨ１、ＮＴＲＫ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＲＢ１、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＳＴファミリーメンバー、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＶＢＰ１、ＶＨＬ、Ｗｎｔファミリーメンバー、ＢＲＡＦ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＭＡＤ４、およびＹＰＥＬ３、またはこれらの断片もしくは変異体から選択される遺伝子を含む。一実施形態において、本方法は、患者に、修復鋳型の治療有効量を投与することをさらに含む。
特定の遺伝子内の変異は、細胞が癌性になる可能性を増加させ得る。しかしながら、特定の状況において、例えば、癌関連遺伝子の非変異形態が有益である場合、非癌性細胞中の癌関連遺伝子を不活性化させることは有害であり得る。遺伝子編集タンパク質を使用して、遺伝子の部分的または完全な変異形態を特異的に不活性化できることが、今回発見された。癌関連変異の例としては、ＡＬＫ（Ｆ１１７４、Ｒ１２７５）、ＡＰＣ（Ｒ８７６、Ｑ１３７８、Ｒ１４５０）、ＢＲＡＦ （Ｖ６００）、ＣＤＫＮ２Ａ（Ｒ５８、Ｒ８０、Ｈ８３、Ｄ８４、Ｅ８８、Ｄ１０８Ｇ、Ｗ１１０、Ｐ１１４）、ＣＴＮＮＢ１（Ｄ３２、Ｓ３３、Ｇ３４、Ｓ３７、Ｔ４１、またはＳ４５）、ＥＧＦＲ（Ｇ７１９、Ｔ７９０、Ｌ８５８）、ＥＺＨ２（Ｙ６４６）、ＦＧＦＲ３（Ｓ２４９、Ｙ３７３）、ＦＬＴ３（Ｄ８３５）、ＧＮＡＳ（Ｒ２０１）、ＨＲＡＳ（Ｇ１２、Ｇ１３、Ｑ６１）、ＩＤＨ１（Ｒ１３２）、ＪＡＫ２（Ｖ６１７）、ＫＩＴ（Ｄ８１６）、ＫＲＡＳ（Ｇ１２、Ｇ１３）、ＮＲＡＳ（Ｇ１２、Ｇ１３、Ｑ６１）、ＰＤＧＦＲＡ（Ｄ８４２）、ＰＩＫ３ＣＡ（Ｅ５４２、Ｅ５４５、Ｈ１０４７）、ＰＴＥＮ（Ｒ１３０）、およびＴＰ５３（Ｒ１７５、Ｈ１７９、Ｇ２４５、Ｒ２４８、Ｒ２４９、Ｒ２７３、Ｗ２８２）が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、特定の実施形態は、疾患に関連する変異に結合する遺伝子編集タンパク質を対象とする。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、変異を含有しないＤＮＡよりも高い親和性を有する、特異的変異を含有するＤＮＡに結合する。別の実施形態において、該疾患は癌である。
レビー小体を伴うアルツハイマー病、パーキンソン病、および認知症を含む神経変性疾患は、中枢神経系および／または末梢神経系の細胞の機能の進行性消失および／または死亡を特徴とする。疾患の進行には、タンパク質α－シヌクレイン（コードされた、ヒト内の、ＳＮＣＡ遺伝子による）を含み得るタンパク質に富んだプラークの蓄積が同伴し得る。結果として、研究者は、例えば、プラークに結合し、免疫系による破壊のためにそれにタグをつける抗体の手段によって、これらのプラークを解体することができる治療薬を開発しようとしてきた。しかしながら、多くの場合、プラークの解体は、疾患の患者症状もしくは進行に対して、ほとんどまたは全く効果を有さない。神経変性疾患関連プラークを標的にする既存の療法の失敗は、プラーク形成の初期段階の間に発生する細胞への損傷を修復する能力が神経系にないことにある程度起因することが、今回発見された。細胞を誘導して、ＳＮＣＡ遺伝子を標的にする１つ以上の遺伝子編集タンパク質を発現させることは、ＳＮＣＡ遺伝子の破壊をもたらし得、細胞を誘導して、α－シヌクレインタンパク質の耐プラーク性変異体を発現させ得、神経変性疾患関連プラークの成長を緩徐化または停止させ得、神経変性疾患関連プラークの損傷効果から該細胞および付近の細胞を保護し得、レビー小体を伴うアルツハイマー病、パーキンソン病、および認知症を含む神経変性疾患の進行を緩徐化および／または停止させ得、レビー小体を伴うアルツハイマー病、パーキンソン病、および認知症を含む神経変性疾患を有する患者における症状の低減および／または機能の増加をもたらし得ることが、今回発見された。他の神経変性疾患としては、例えば、失明を含む視力損失、難聴を含む聴力損失、平衡障害、味覚および／または嗅覚損失、ならびに他の感覚障害が挙げられる。したがって、特定の実施形態は、ＳＮＣＡ遺伝子を標的にする遺伝子編集タンパク質を対象とする。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、ＳＮＣＡ遺伝子内の１つ以上の領域に結合する。別の実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、配列番号５１をコードする１つ以上の核酸配列、またはその生物活性断片、変異体、もしくは類似体に結合する。他の実施形態は、神経変性疾患を治療するための方法であって、患者に、遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸の治療有効量を投与することであって、該遺伝子編集タンパク質は、疾患に関連するプラークを形成するタンパク質をコードするヌクレオチド配列に結合することができる、投与することと、結果として該患者の疾患に関連するプラークの低減、および／または該疾患の進行の遅延または停止をもたらすことと、を含む、方法を対象とする。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＳＮＣＡ遺伝子を含む。別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、α－シヌクレインをコードする。さらなる実施形態において、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、および認知症から選択される。
特定の実施形態は、病原性毒物を識別するための方法であって、細胞に、遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を遺伝子導入して、該細胞のＤＮＡ配列を変更することであって、該変更されたＤＮＡ配列が疾患に対する感受性を与える、変更することと、該細胞を、疑わしい病原性毒物と接触させることと、該細胞が該疾患に関連する表現型を示す程度を査定することと、を含む、方法を対象とする。一実施形態において、該疾患は、神経変性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、生殖器疾患、または癌である。他の実施形態は、治療用物質の安全性を査定するための方法であって、細胞に、遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を遺伝子導入して、該細胞のＤＮＡ配列を変更することであって、該変更されたＤＮＡ配列が該治療用物質の１つ以上の毒性効果に対する感受性を与える、変更することと、該細胞に対する該治療用物質の１つ以上の毒性効果を測定することと、を含む、方法を対象とする。さらに他の実施形態は、治療用物質の有効性を査定するための方法であって、細胞に、遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を遺伝子導入して、該細胞のＤＮＡ配列を変更することであって、該変更されたＤＮＡ配列が、該細胞に１つ以上の疾患に関連する表現型を示させる、変更することと、該細胞を、該治療用物質と接触させることと、該１つ以上の疾患に関連する表現型が低減される程度を測定することと、を含む、方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、該患者は、プロテオパチー（ｐｒｏｔｅｏｐａｔｈｙ）と診断される。プロテオパチーおよびプロテオパチー関連遺伝子の例は表６に提示され、制限ではなく、例として含まれるものである。一実施形態において、プロテオパチーは、ＡＡ（続発性）アミロイド症、アレキサンダー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、大動脈内アミロイド症、ＡｐｏＡＩアミロイド症、ＡｐｏＡＩＩアミロイド症、ＡｐｏＡＩＶアミロイド症、ビブリノゲンアミロイド症、心臓性心房性アミロイド症、皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症、脳β－アミロイド血管症、透析アミロイド症、家族性アミロイド心筋症、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性アミロイド症（フィンランド型）、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、前頭側頭葉変性症、遺伝性脳アミロイド血管症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、ハンチントン病、封入体筋炎／筋症、リゾチームアミロイド症、甲状腺髄様癌、歯原性（Ｐｉｎｄｂｏｒｇ）腫瘍アミロイド、パーキンソン病、下垂体プロラクチノーマ、プリオン病、肺胞タンパク症、緑内障における網膜神経節細胞変性、ロドプシン変異を伴う網膜色素変性症、老人性全身性アミロイド症、セルピノパチー（ｓｅｒｐｉｎｏｐａｔｈｙ）、シヌクレイン病、タウオパチー、ＩＩ型糖尿病、パンチドランカー（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ）（慢性外傷性脳症）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、神経節細胞腫、神経節膠腫、ハラーホルデン－スパッツ症候群、鉛脳症、リポフスチン沈着症、Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ病、髄膜血管腫症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、タングル優性認知症、および結節性硬化症から選択される。別の実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＡ４、ＡＰＰ、Ｂ２Ｍ、ＣＡＬＣＡ、ＣＳＴ３、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＧ、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ、ＧＳＮ、ＨＴＴ、ＩＡＰＰ、ＩＴＭ２Ｂ、ＬＹＺ、ＭＡＰＴ、ＭＦＧＥ８、ＮＯＴＣＨ３、ＮＰＰＡ、ＯＤＡＭ、ＰＲＬ、ＰＲＮＰ、ＲＨＯ、ＳＡＡファミリーメンバー、ＳＥＲＰＩＮファミリーメンバー、ＳＦＴＰＣ、ＳＮＣＡ、ＳＯＤファミリーメンバー、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＧＦＢＩ、およびＴＲＲ、またはこれらの断片もしくは変異体から選択される遺伝子を含む。さらなる実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、表６から選択される遺伝子またはその断片をコードし、該患者は、表６に記載される対応する疾患と診断される。

タウオパチーの例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病が挙げられるがこれらに限定されない。タウオパチーの他の例としては、パンチドランカー（慢性外傷性脳症）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、神経節細胞腫、神経節膠腫、ハラーホルデン－スパッツ症候群、鉛脳症、リポフスチン沈着症、Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ病、髄膜血管腫症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、タングル優性認知症、および結節性硬化症が挙げられる。いくつかの実施形態において、該患者は、タウオパチーと診断される。一実施形態において、タウオパチーは、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病から選択される。別の実施形態において、タウオパチーは、パンチドランカー（慢性外傷性脳症）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、神経節細胞腫、神経節膠腫、ハラーホルデン－スパッツ症候群、鉛脳症、リポフスチン沈着症、Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ病、髄膜血管腫症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、タングル優性認知症、および結節性硬化症から選択される。
ループス、多発性硬化（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および移植片拒絶を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患は、非感染性かつ非癌性の同質遺伝子的細胞および／または組織を攻撃する免疫系の１つ以上の要素によって、ある程度引き起こされる症状を特徴とする。したがって、特定の実施形態は、自己免疫疾患を治療するための方法を対象とする。一実施形態において、自己免疫疾患は、ループス、多発性硬化（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および移植片拒絶から選択される。別の実施形態において、標的ＤＮＡ分子は、宿主免疫系によって認識され得るポリペプチド配列をコードする。
感染病原体は、宿主生物中に存在しない核酸配列を含有し得る。遺伝子編集タンパク質を使用して、感染病原体および／または感染症の効果の全体または一部を排除、低減、あるいは変更し得ること、ならびに、このように使用されると、遺伝子編集タンパク質および遺伝子編集タンパク質をコードする核酸は、強力な抗感染症治療薬を構成し得ることが、今回発見された。このように治療され得る感染病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、酵母、および寄生体が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、特定の実施形態は、細胞を誘導して、１つ以上の感染病原体関連配列を標的にする遺伝子編集タンパク質を発現させるための方法を対象とする。一実施形態において、該細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、および寄生細胞のうちの１つである。別の実施形態において、該細胞は哺乳類細胞である。さらなる実施形態において、該細胞はヒト細胞である。他の実施形態は、１つ以上の感染病原体関連配列を標的にする１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を含む、治療用組成物を対象とする。特定の実施形態は、細胞を誘導して、感染症への感受性または抵抗性に関連する１つ以上の配列を標的にする遺伝子編集タンパク質を発現させるための方法を対象とする。他の実施形態は、感染症への感受性または抵抗性に関連する１つ以上の配列を標的にする１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を含む、治療用組成物を対象とする。一実施形態において、該細胞は、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする核酸、および１つ以上の修復鋳型をコードする核酸を遺伝子導入される。別の実施形態において、該修復鋳型は、抵抗性遺伝子またはその生物活性断片もしくは変異体を含有する。さらなる実施形態において、該修復鋳型は、ＲＮＡｉ配列を含有する。さらなる実施形態において、該ＲＮＡｉ配列は、ｓｈＲＮＡである。他の実施形態は、感染性疾患を治療するための方法であって、患者に、遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸の治療有効量を投与することを含み、該遺伝子編集タンパク質が、該感染病原体内に存在する１つ以上のヌクレオチド配列に結合することができる、方法を対象とする。
ＤＮＡ修復経路の１つ以上の構成要素の発現および／または機能を変更することによって、非相同末端結合現象の相同組換え現象に対する比率を変更できることが、今回発見された。ＤＮＡ修復経路の構成要素をコードする遺伝子の非限定例としては、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＢＬＭ、ＣｔＩＰ、ＤＮＡ－ＰＫ、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＥＸＯｌ、ＦＥＮ１、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＬＩＧＩＩＩ、ＬＩＧＩＶ、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ１、ＰＡＲＰ１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５４Ｂ、ＸＬＦ、ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ３、およびＸＲＣＣ４が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、特定の実施形態は、ＤＮＡ修復経路の１つ以上の構成要素の発現および／または機能を変更するための方法を対象とする。特定の実施形態において、該発現および／または機能は増加される。他の実施形態において、該発現および／または機能は減少される。ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）は、非相同末端結合ＤＮＡ修復経路の構成要素である。ＤＮＡ－ＰＫの発現を変更することによって、相同組換えを介する修復が増加され得ることが、今回発見された。一実施形態において、細胞は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触される。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の例としては、化合物４０１（２－（４－モルフォリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，１－ａ］イソキノリン－４－オン）、ＤＭＮＢ、ＩＣ８７３６１、ＬＹ２９４００２、ＮＵ７０２６、ＮＵ７４４１、ＯＫ－１０３５、ＰＩ １０３ヒドロクロライド、バニリン、およびワートマニンが挙げられるがこれらに限定されない。
遺伝子変異は、例えば、終止コドンを導入すること、および／または読み取り枠を破壊することによって、タンパク質生成物の長さに影響し得る。デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィーを含む特定の疾患は、短縮および／またはフレームシフト型タンパク質の生成によって引き起こされ得る。遺伝子編集タンパク質を使用して、１つ以上の短縮および／またはフレームシフト型タンパク質の生成に関連する疾患を治療できることが、今回発見された。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、疾患の要因となる変異を含有するエクソンの約１ｋｂ、または約０．５ｋｂ、または約０．１ｋｂ内に二本鎖切断を作る。別の実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、１つ以上の野生型配列を含むＤＮＡ配列と同時発現する。特定の実施形態において、該ＤＮＡは一本鎖である。他の実施形態において、該ＤＮＡは二本鎖である。短縮タンパク質の発現によって引き起こされる疾患は、エクソンスキッピングによって治療され得る。遺伝子編集タンパク質を使用して、エクソンスキッピングを誘導できることが、今回発見された。一実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、スキップされるエクソンの約１ｋｂ、または約０．５ｋｂ、または約０．１ｋｂ内に二本鎖切断を作る。別の実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、スキップされるエクソンのイントロン上流の約１ｋｂ、または約０．５ｋｂ、または約０．１ｋｂ内に二本鎖切断を作る。別の実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、スキップされるエクソンのイントロン上流のスプライス受容部位の約１ｋｂ、または約０．５ｋｂ、または約０．１ｋｂ内に二本鎖切断を作る。
核酸を含有するリポソーム配合物を含む核酸は、生体内に送達されると、肝臓および／または脾臓内に蓄積し得る。遺伝子編集タンパク質をコードする核酸は、肝臓および脾臓内の遺伝子発現を調節し得ること、ならびに、このように使用される核酸は、肝臓および脾臓疾患の治療のための強力な治療薬を構成し得ることが、今回発見された。したがって、特定の実施形態は、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を患者に送達することによって、肝臓および／または脾臓疾患を治療するための方法を対象とする。他の実施形態は、肝臓および／または脾臓疾患の治療のための、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を含む、治療用組成物を対象とする。治療され得る肝臓および／または脾臓の疾患ならびに条件としては、肝炎、アルコール誘発性肝疾患、薬剤誘発性肝疾患、エプスタインバーウイルス感染症、アデノウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、トキソプラズマ症、ロッキー山紅斑熱、非アルコール性脂肪性肝疾患、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、ジルベール病、ならびに肝臓および／または脾臓の癌が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法を使用して遺伝子編集タンパク質によって標的にされ得る配列（遺伝子、遺伝子ファミリー、および座位を含む）の他の例は、表７に記載され、制限ではなく、例として提示されるものである。

特定の実施形態は、本発明の治療用組成物のうちの１つ以上、および１つ以上のアジュバント療法を含む併用療法を対象とする。アジュバント療法の例は、表８、および米国仮出願第６１／７２１，３０２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の表５に記載されており、制限ではなく、例として提示されるものである。



医薬品は、送達試薬（別称「遺伝子導入試薬」）および／または賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される送達試薬、賦形剤、ならびにこれらの調製および使用方法（医薬品を調製し、患者（別称「被験体」）に投与するための方法を含む）は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００８／０２１３３７７号（この全体は参照により本明細書に組み込まれる）を含む多数の出版物に記載されている。
例えば、本組成物は、形態薬学的に許容される塩であり得る。かかる塩としては、例えば、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．６６，２－１９（１９７７）、およびＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に記載されているものが挙げられ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。薬学的に許容される塩の非限定例としては、スルフェート、シトレート、アセテート、オキサレート、クロライド、ブロミド、ヨウ化物、ニトレート、ビスルフェート、フォスフェート、酸性フォスフェート、イソニコチネート、ラクテート、サリシレート、クエン酸、タートレート、オレート、タンニン酸、パントテネート、ビタートレート、アスコルベート、スクシネート、マレート、ゲンチシネート、フマレート、グルコネート、グルカロネート、サッカレート、ギ酸、ベンゾエート、グルタメート、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、ｐ－トルエンスルホネート、カンフルスルホネート、パモエート、フェニルアセテート、トリフルオロアセテート、アクリレート、クロロベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、メチルベンゾエート、ｏ－アセトキシベンゾエート、ナフタレン－２－ベンゾエート、イソブチレート、フェニルブチレート、α－ヒドロキシブチレート、ブチン－１，４－ジカルボキシレート、ヘキシン－１，４－ジカルボキシレート、カプレート、カプリレート、シナメート、グリコレート、ヘプタノエート、馬尿酸塩、リンゴ酸、ヒドロキシマレート、マロネート、マンデレート、メシレート、ニコチネート、フタレート、テラフタレート、プロピオレート、プロピオネート、フェニルプロピオネート、セバケート、スベレート、ｐ－ブロモベンゼンスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、エチルスルホネート、２－ヒドロキシエチルスルホネート、メチルスルホネート、ナフタレン－１－スルホネート、ナフタレン－２－スルホネート、ナフタレン－１，５－スルホネート、キシレンスルホネート、タータレート（ｔａｒｔａｒａｔｅ）塩、例えばナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物と、例えばカルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物と、例えばアルミニウムおよび亜鉛などの他の金属の水酸化物と、アンモニア、および、例えば未置換またはヒドロキシ置換モノ－、ジ－、もしくはトリ－アルキルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどの有機アミンと、トリブチルアミンと、ピリジンと、Ｎ－メチル、Ｎ－エチルアミンと、ジエチルアミンと、トリエチルアミンと、例えばモノ－、ビス－、もしくはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、２－ヒドロキシ－ｔｅｒｔ－ブチルアミン、またはトリス－（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどのモノ－、ビス－、もしくはトリス－（２－ＯＨ－低級アルキルアミン）と、例えばＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ－（２－ヒドロキシエチル）アミンなどのＮ，Ｎ－ジ－低級アルキル－Ｎ－（ヒドロキシル－低級アルキル）－アミンと、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミンと、例えばアルギニン、リジン、および同類のものなどのアミノ酸と、が挙げられる。
本医薬組成物は、水および油（石油、動物、植物由来のもの、または、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、および同類のものなどの合成起源のものを含む）などの液体を含む賦形剤を含み得る。医薬品賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプン糊、滑石、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素、および同類のものであり得る。さらに、助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤を使用してもよい。一実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、被験体に投与されるとき無菌である。適切な医薬品賦形剤はまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセロールモノステアレート、滑石、ナトリウムクロライド、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、ならびに同類のものを含む。所望の場合、本明細書で説明される任意の薬剤は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。
様々な実施形態において、本明細書で説明される本組成物は、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの有効用量で投与され得る。何が有効用量と見なされるかの正確な判定は、サイズ、年齢、および疾患の種類を含む、各患者個人の要因に基づき得る。投薬量は、本開示および当技術分野における知識から、当業者によって容易に確認され得る。例えば、用量は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，６６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＰＤＲ Ｎｅｔｗｏｒｋ；２０１２ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２７，２０１１）を参照して判定され得、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の活性組成物は、伝統的な医薬品を含み得る。本発明に従うこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介してよい。これは、経口、経鼻、または頬側を含む。あるいは、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは静脈内注入によるもの、または癌組織中への直接注入によるものでもよい。本明細書において開示される薬剤は、カテーテル系によって投与されてもよい。かかる組成物は、本明細書で説明される通り、薬学的に許容される組成物として通常は投与される。
配合後、溶液は、投薬配合物と相溶性があるように、かつ治療的に有効であるような量で投与され得る。配合物は、例えば注入可能な溶液、薬物放出カプセル、ならびに同類のものなどの多様な投薬形態で容易に投与され得る。例えば、水溶液中の非経口投与のために、溶液は一般的に適切に緩衝され、希釈液は、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて、まず等張性にされる。かかる水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与のために使用可能である。好適には、特に本開示を踏まえて当業者に周知であるように、無菌の水性媒体が採用される。
例示的な被験体または患者は、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、家庭用哺乳類（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類）、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽鳥、アヒル、ガチョウなどの家庭用、野生、および狩猟用の鳥、ならびに同類のもの）を制限なく含む、任意の脊椎動物を意味する。いくつかの実施形態において、該被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、該被験体はヒトである。
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
実施例１ ＲＮＡ合成
ヒトタンパク質Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ－２（Ｔ５８Ａ）、およびＬｉｎ２８をコードするＲＮＡ、またはヒト遺伝子ＸＰＡ、ＣＣＲ５、ＴＥＲＴ、ＭＹＣ、およびＢＩＲＣ５を標的にし、かつ標準および非標準ヌクレオチドの様々な組み合わせを含むＴＡＬＥＮを、ｍＲＮＡキャップ２′－Ｏ－メチルトランスフェラーゼと共に、Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＫｉｔおよびＶａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍキット（全てＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．製）を使用して、製造者の指示、ならびに本発明者の以前に開示された発明（米国出願第１３／４６５，４９０号（現在は米国特許第８，４９７，１２４号）、米国仮出願第６１／６３７，５７０号、米国仮出願第６１／６６４，４９４号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／６７９６６号、米国仮出願第６１／７８５，４０４号、米国出願第１３／９３１，２５１号、および米国仮出願第６１／８４２，８７４号、これら全ての内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に従って、ＤＮＡ鋳型から合成した（表９、図１Ａ、図１Ｂ、および図１５）。このＲＮＡを次に、ヌクレアーゼを含まない水で、１００ｎｇ／μＬ～２００ｎｇ／μＬまで希釈した。特定の実験のために、１μＬ／１００μｇのＲＮＡの濃度でリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｅ・Ｉｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加した。ＲＮＡ溶液を４℃で保管した。リプログラミング実験のために、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ－２（Ｔ５８Ａ）、およびＬｉｎ２８をコードするＲＮＡを、３：１：１：１：１のモル比で混合した。







実施例２ 合成ＲＮＡを用いる細胞の遺伝子導入
６ウェルプレート内での遺伝子導入のために、２μｇのＲＮＡおよび６μＬの遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、複合体形成培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン）中で、まず別々に希釈して、それぞれ６０μＬの総体積にした。遺伝子導入試薬の製造者の指示に従って、希釈したＲＮＡおよび遺伝子導入試薬を、次に混合し、１５分かけて室温にてインキュベートした。次に、複合体を培養液中の細胞に添加した。３０μＬ～２４０μＬの複合体を、１ウェル当たり２ｍＬの遺伝子導入培地を既に含有した６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪し、この複合体をウェル全体に分布させた。細胞を、４時間から一晩かけて複合体と共にインキュベートし、培地を新鮮な遺伝子導入培地（２ｍＬ／ウェル）と交換した。２４ウェルおよび９６ウェルプレート内での遺伝子導入のために、体積を計った。あるいは、０．５μｇ～５μｇのＲＮＡ、およびＲＮＡ１μｇ当たり２～３μＬの遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、複合体形成培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン）中で、まず別々に希釈して、それぞれ５μＬ～１００μＬの総体積にした。希釈したＲＮＡおよび遺伝子導入試薬を、次に混合し、１０分かけて室温にてインキュベートした。次に、複合体を培養液中の細胞に添加した。１０μＬ～２００μＬの複合体を、１ウェル当たり２ｍＬの遺伝子導入培地を既に含有した６ウェルプレートの各ウェルに添加した。特定の実験において、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ、またはＤＭＥＭ＋５０％のＦＢＳを、遺伝子導入培地の代わりに使用した。プレートを穏やかに振盪し、この複合体をウェル全体に分布させた。細胞を、４時間から一晩かけて複合体と共にインキュベートした。特定の実験において、遺伝子導入の４時間または２４時間後に、培地を新鮮な遺伝子導入培地（２ｍＬ／ウェル）と交換した。
実施例３ 非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡの毒性およびそのタンパク質翻訳
初代ヒト線維芽細胞を、実施例１に従って合成したＲＮＡを使用して、実施例２に従って遺伝子導入した。細胞を固定し、遺伝子導入の２０～２４時間後に、Ｏｃｔ４に対する抗体を使用して染色した。固定化時の細胞密度を査定することによって、ＲＮＡの相対的な毒性を判定した。
実施例４ 遺伝子導入培地の配合
細胞培養培地を発達させ、核酸を用いる細胞の効率的な遺伝子導入および効率的なリプログラミングを支持した（「遺伝子導入培地」）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５ｍＭのＨＥＰＥＳ＋２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン＋５０μｇ／ｍＬのＬ－アスコルビン酸２－フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物＋４μｇ／ｍＬのコレステロール＋１μＭのヒドロコルチゾン＋２５μｇ／ｍＬのポリオキシエチレンソルビタンモノオレート＋２μｇ／ｍＬのＤ－アルファ－トコフェロールアセテート＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋５ｍｇ／ｍＬの処置済ヒト血清アルブミン。
この培地の変異体を発達させ、多能性幹細胞を含む多様な細胞型のしっかりした長期間培養を支持した（「維持培地」）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン＋５０μｇ／ｍＬのＬ－アスコルビン酸２－フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１。
遺伝子導入培地中で、処置済ヒト血清アルブミンを、３２ｍＭのナトリウムオクタノエートの添加によって処置し、続いて６０℃にて４時間かけて加熱し、続いてイオン交換樹脂（ＡＧ５０１－Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で６時間かけて室温にて処置し、続いてデキストランでコーティングした活性炭（Ｃ６２４１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．）で一晩かけて室温にて処置し、続いて遠心分離し、濾過し、ヌクレアーゼを含まない水で１０％の溶液に調節し、続いて培地のその他の成分に添加し、これを、別段の記載がない限り本明細書で説明される全ての実施例において、遺伝子導入培地として使用した。リプログラミング実験のために、別段の記載がない限り、ＤＭＥＭ＋１０％～２０％の血清中のコーティング無しのプレート、または遺伝子導入培地中のフィブロネクチンおよびビトロネクチンでコーティングしたプレートのいずれかの上に、細胞をプレーティングした。この遺伝子導入培地は、別段の記載がない限り、条件付けしなかった。遺伝子導入培地の配合は、培養される特異的な細胞型の必要性を満たすように調節され得ることが認識される。処置済ヒト血清アルブミンを、他の処置済アルブミン、例えば、処置済ウシ血清アルブミンと、培地の性能に悪影響を与えることなく交換できることが、さらに認識される。Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの代わりに、またはそれに加えて、他のグルタミン供給源、例えば、Ｌ－グルタミンを使用してもよいこと、ＨＥＰＥＳの代わりに、またはそれに加えて、他の緩衝系、例えば、フォスフェート、ビカーボネートなどを使用してもよいこと、亜セレン酸ナトリウムの代わりに、またはそれに加えて、他の形態のセレン、例えば、亜セレン酸を提供してもよいこと、Ｌ－アスコルビン酸２－フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物および／またはＤ－アルファ－トコフェロールアセテートの代わりに、またはそれに加えて、他の抗酸化剤、例えば、Ｌ－アスコルビン酸を使用してもよいこと、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートの代わりに、またはそれに加えて、他の界面活性剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８および／またはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７を使用してもよいこと、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の代わりに、またはそれに加えて、他の基本培地、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭなどを使用してもよいこと、ならびに、例えば、０日目～５日目はＴＧＦ－βを含まない培地を使用し、次に、５日目以降は２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βを含有する培地を使用することによって、培地の性能に悪影響を与えることなく、培養培地の成分を経時的に変更し得ることが、さらに認識される。他の成分、例えば、脂肪酸、リゾフォスファチジン酸、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシン－１－フォスフェート、他のスフィンゴ脂質、Ｙ－２７６３２およびチアゾビビンを含むＲＯＣＫ阻害剤、タンパク質のＴＧＦ－β／ＮＯＤＡＬファミリーのメンバー、ＩＬ－６、タンパク質のＷｎｔファミリーのメンバーなどを、適当な濃度で、培地の性能に悪影響を与えることなく添加できること、ならびに、特異的な細胞型の成長を促進または阻害することが知られる成分、および／もしくはタンパク質の刺激剤および／もしくは拮抗剤、または特異的な細胞型の成長を促進または阻害することが知られるその他の分子、例えば、スフィンゴシン－１－フォスフェートおよび多能性幹細胞を、適当な濃度で、これらの細胞型と共に使用される際に培地の性能に悪影響を与えることなく培地に添加できることが、さらに認識される。本発明は、精製化合物として添加される成分、詳細に明らかにされた混合物の部分として添加される成分、複合体または未決定の混合物、例えば、動物もしくは植物油の部分として添加される成分、および生物学的過程、例えば、条件付けによって添加される成分に、等しく関する。成分の濃度は、当業者にとって明白となる範囲内で、培地の性能に悪影響を与えることなく、記載される値から変動し得る。全てのタンパク質成分の組換え版、および、半合成植物由来コレステロール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を含む、全ての他の成分の非動物由来版を使用して、培地の無動物成分版を生成した。
実施例５ 非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡを使用するヒト線維芽細胞のリプログラミング
初代ヒト新生児線維芽細胞を、組換えヒトフィブロネクチンおよび組換えヒトビトロネクチン（それぞれＤＭＥＭ／Ｆ１２内で１μｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウェルの濃度まで希釈し、室温にて１時間かけてインキュベートした）でコーティングした６ウェルプレート内に、遺伝子導入培地中で１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、この細胞を、実施例２に示すように、Ａ、０．５の７ｄＧ、０．５の５ｍＵ、および５ｍＣを含有するＲＮＡ、ならびに、１日目に０．５μｇ／ウェル、２日目に０．５μｇ／ウェル、３日目に２μｇ／ウェル、４日目に２μｇ／ウェル、そして５日目に４μｇ／ウェルのＲＮＡ用量を使用して遺伝子導入した。リプログラミングと一致する形態を示す細胞の小さなコロニーが、早ければ５日目に目に見えるようになった。この培地を、６日目に維持培地と交換した。細胞を、Ｏｃｔ４に対する抗体を使用して染色した。リプログラミングと一致する形態を示す細胞のＯｃｔ４陽性コロニーは、ウェル全体で目に見えた。（図２）。
実施例６ フィーダーを含まない、継代を含まない、免疫抑制剤を含まない、条件付けを含まない、合成ＲＮＡを使用する初代成熟ヒト線維芽細胞のリプログラミング
６ウェルプレートのウェルを、組換えヒトフィブロネクチンと組換えヒトビトロネクチンの混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１ｍＬ／ウェル中１μｇ／ｍＬ）で、１時間かけて室温にてコーティングした。初代成熟ヒト線維芽細胞を、このコーティングしたウェル内に、遺伝子導入培地中で１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２、および５％のＯ２に維持した。翌日から、細胞に、実施例１に従って合成したＲＮＡを、実施例２に従い、５日間かけて遺伝子導入した。この５日間の各日に遺伝子導入したＲＮＡの総量は、それぞれ、０．５μｇ、０．５μｇ、２μｇ、２μｇ、および４μｇであった。４回目の遺伝子導入から、培地を１日に２回交換した。最終の遺伝子導入の翌日に、この培地を、１０μＭのＹ－２７６３２を補充した遺伝子導入培地と交換した。リプログラムした形態を有する細胞の緻密なコロニーは、４日目までには、それぞれの遺伝子導入したウェル内で目に見えた（図８）。
実施例７ 成熟ヒト皮膚生検組織由来の細胞の、効率的かつ急速な誘導およびリプログラミング
全層皮膚パンチ生検を、許可されたプロトコルに従って、健康な３１歳のボランティアに実施した。一時的に、２．５％のリドカインの局所適用によって、左上腕の皮膚の一部を麻酔した。この部分を７０％のイソプロパノールで消毒し、直径１．５ｍｍのパンチを使用して全層皮膚生検を実施した。この組織を、フォスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で濯ぎ、２５０μＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む１．５ｍＬのチューブ内に配置し、３７℃にて３０分かけてインキュベートした。この組織を次に、２５０μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２－ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含む１．５ｍＬのチューブに移し、３７℃にて２時間かけてインキュベートした。ピンセットを使用して表皮を除去し、この組織を機械的に解離した。細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２－ＣＴＳ中で２回濯いだ。同一のボランティアに静脈切開術も実施し、静脈血をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）内に採取した。製造者の指示に従って、血清を単離した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２－ＣＴＳ＋２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．）＋２０％のヒト血清を混合することによって、同質遺伝子プレーティング培地を調製した。皮膚組織試料由来の細胞を、同質遺伝子プレーティング培地中の、６ウェルプレートのフィブロネクチンでコーティングしたウェル内にプレーティングした。線維芽細胞形態を有する多くの細胞は、２日目までには付着して拡散し始めた（図３Ａ）。細胞を膨張させ、Ｓｙｎｔｈ－ａ－Ｆｒｅｅｚｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）内で凍結させた。
細胞を、６ウェルプレート内に、５，０００細胞／ウェルの密度で継代した。翌日、この培地を遺伝子導入培地と交換し、この細胞を、実施例２に示すように、Ａ、０．５の７ｄＧ、０．４の５ｍＵ、および５ｍＣを含有するＲＮＡ、ならびに、１日目に０．５μｇ／ウェル、２日目に０．５μｇ／ウェル、３日目に２μｇ／ウェル、４日目に２μｇ／ウェル、そして５日目に２μｇ／ウェルのＲＮＡ用量を使用して遺伝子導入した。６日目および７日目に、特定の細胞に追加の２μｇ／ウェルの遺伝子導入を与えた。さらに、４日目以降、特定のウェルに２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１を与えた。この培地を、６日目に維持培地と交換した。リプログラミングと一致する形態を示す細胞のコロニーが、５日目～１０日目に目に見えるようになった（図３Ｂ）。コロニーは急速に成長し、多くが胚性幹細胞コロニーのものと同様の形態を示した（図３Ｃ）。コロニーを採集し、組換えヒトフィブロネクチンおよび組換えヒトビトロネクチン（それぞれＤＭＥＭ／Ｆ１２内で１μｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウェルの濃度まで希釈し、室温にて１時間かけてインキュベートした）でコーティングしたウェル内にプレーティングした。細胞は急速に成長し、継代されて株を確立した。
実施例８ ＣＣＲ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅの合成
以下の配列、Ｌ１：ＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴ、Ｌ２：ＴＴＴＴＣＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣ、Ｒ１：ＴＧＡＣＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＣＴＧＧ、およびＲ２：ＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＡＴを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアを、実施例１に従って合成した（図４Ａおよび図４Ｂ）。これらのペアは、センス（Ｌ１およびＬ２）またはアンチセンス鎖（Ｒ１およびＲ２）上のヒトＣＣＲ５遺伝子内の２０－ｂｐ部位を標的にする。以下のペア：Ｌ１＆Ｒ１、Ｌ１＆Ｒ２、Ｌ２＆Ｒ１、およびＬ２＆Ｒ２を調製した。
実施例９ ミスマッチ検出ヌクレアーゼを使用するＣＣＲ５遺伝子編集効率の測定
初代ヒト線維芽細胞を、組換えヒトフィブロネクチンおよび組換えヒトビトロネクチン（それぞれＤＭＥＭ／Ｆ１２内で１μｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウェルの濃度まで希釈し、室温にて１時間かけてインキュベートした）でコーティングした６ウェルプレート内に、遺伝子導入培地中で１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、この細胞に、実施例８に従って合成したＲＮＡを、実施例２に示すように遺伝子導入した。遺伝子導入の２日後、ゲノムＤＮＡを単離および精製した。ＣＣＲ５遺伝子内の一領域を、プライマーＦ：ＡＧＣＴＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＡおよびＲ：ＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡを使用するＰＣＲによって増幅した。１５０ｎｇの増幅したＰＣＲ生成物を、１０ｍＭのトリス－Ｃｌ＋５０ｍＭのＫＣｌ＋１．５ｍＭのＭｇＣｌ２内で、１５０ｎｇの参照ＤＮＡと交雑した。交雑したＤＮＡを、ミスマッチ検出エンドヌクレアーゼ（ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．）で処置し、結果として生じる生成物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した（図４Ｃおよび図４Ｄ）。
実施例１０ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅの繰り返される遺伝子導入による高効率遺伝子編集
初代ヒト線維芽細胞を、実施例９に示すようにプレーティングした。翌日、この細胞に、実施例８に従って合成したＲＮＡを、実施例２に示すように遺伝子導入した。翌日、ウェルのうちの１つの中の細胞に、２度目の遺伝子導入をした。第２の遺伝子導入の２日後、遺伝子編集の効率を、実施例９に示すように測定した（図４Ｅ）。
実施例１１ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅを使用するＣＣＲ５の遺伝子編集、および、ヒト線維芽細胞の、ＤＮＡを含まない、フィーダーを含まない、免疫抑制剤を含まない、条件付けを含まないリプログラミング
初代ヒト線維芽細胞を、実施例９に示すようにプレーティングした。翌日、この細胞に、実施例８に従って合成したＲＮＡを、実施例２に示すように遺伝子導入した。およそ４８時間後、実施例１に従って合成したＲＮＡを使用して、実施例５に従い、この細胞をリプログラムした。リプログラミングの特徴を示す形態を有する細胞の大きなコロニーが、実施例５に示すように目に見えるようになった（図４Ｆ）。コロニーを採集し、株を確立した。細胞株に直接配列決定を受けさせ、成功裏の遺伝子編集を確認した（図４Ｇ）。
実施例１２ 遺伝子編集かつリプログラムされた細胞を含むＨＩＶ／ＡＩＤＳの個別化細胞置換療法
本発明者の以前に開示された発明（米国出願第１３／４６５，４９０号、米国仮出願第６１／６３７，５７０号、および米国仮出願第６１／６６４，４９４号）、ならびに／または実施例１１に従って、患者の皮膚細胞を遺伝子編集し、造血細胞中にリプログラムする。細胞を次に培養容器から酵素的に解離し、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＬｉｎまたはＣＤ３４＋／ＣＤ４９ｆ＋／Ｌｉｎ細胞を単離する。約１×１０３～約１×１０５の細胞を、患者の大静脈内に輸注する。造血細胞は髄腔に帰巣して生着する。
実施例１３ ＡＰＰ不活性化ラット胚性幹細胞の生成
ラット胚性幹細胞を、６ウェルプレート内に、ラット幹細胞培地中で１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。翌日、この細胞に、実施例１に従って合成した、以下の配列、Ｌ：ＴＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＴおよびＲ：ＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＴ（０．２５μｇのＬおよび０．２５μｇのＲ）を標的にする０．５μｇ／ウェルのＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、実施例２に示すように遺伝子導入した。
実施例１４ ＡＰＰ不活性化ラット胚性幹細胞を使用するＡＰＰ遺伝子欠損ラットの生成
ラット胚性幹細胞を、実施例１３に従って遺伝子編集し、ラット胚盤胞内に微量注入する。この微量注入された胚盤胞を、次に偽妊娠の雌ラットに移植する。
実施例１５ 遺伝子欠損ラットの産生のためのＡＰＰ不活性化胚の生成
以下の配列、Ｌ：ＴＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＴおよびＲ：ＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＴを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアを、実施例１に従って合成する。５μｇ／μＬの濃度のＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、１細胞期のラット胚の前核または細胞質内に注入する。この胚を、次に偽妊娠の雌ラットに移植する。
実施例１６ 非標準ヌクレオチドおよび修復鋳型をコードするＤＮＡを含有する合成ＲＮＡの細胞への遺伝子導入
６ウェルプレート内での遺伝子導入のために、ヒトＡＰＰ遺伝子のエクソン１６を標的にする遺伝子編集タンパク質をコードする１μｇのＲＮＡ、標的細胞中に存在しなかったＰｓｔＩ制限部位を含有する１μｇの一本鎖修復鋳型ＤＮＡ、および６μＬの遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、複合体形成培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で、まず別々に希釈して、１２０μＬの総体積にした。遺伝子導入試薬の製造者の指示に従って、希釈したＲＮＡ、修復鋳型、および遺伝子導入試薬を、次に混合し、１５分かけて室温にてインキュベートした。複合体を培養液中の細胞に添加した。およそ１２０μＬの複合体を、１ウェル当たり２ｍＬの遺伝子導入培地を既に含有した６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪し、この複合体をウェル全体に分布させた。細胞を、４時間から一晩かけて複合体と共にインキュベートし、培地を新鮮な遺伝子導入培地（２ｍＬ／ウェル）と交換した。翌日、この培地をＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳに変えた。遺伝子導入の２日後、ゲノムＤＮＡを単離および精製した。ＡＰＰ遺伝子内の一領域を、ＰＣＲによって増幅し、この増幅した生成物をＰｓｔＩで消化し、ゲル電気泳動によって分析した（図１６）。
実施例１７ 安全港位置におけるラット胚性幹細胞中への導入遺伝子の挿入
ラット胚性幹細胞を、６ウェルプレート内に、ラット幹細胞培地中で１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。翌日、この細胞に、実施例１に従って合成した、以下の配列、Ｌ：ＴＡＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＴＣＣＡおよびＲ：ＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅ、ならびに、ラットＲｏｓａ２６遺伝子座を包囲する領域に対して相同性である、およそ４００個の塩基をそれぞれ含有する２つの領域に隣接する、導入遺伝子を含有する修復鋳型を、実施例１３に示すように遺伝子導入した。
実施例１８ ヒト化ＬＲＲＫ２ラット
ラット胚性幹細胞を、実施例１３に示すように、プレーティングし、これに、実施例１に従って合成した、以下の配列、Ｌ：ＴＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＣＣＡＣおよびＲ：ＴＣＴＣＡＴＧＴＡＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを遺伝子導入する。遺伝子導入の２日後、この細胞を、実施例１７に従って遺伝子導入し、この導入遺伝子は、ヒトＬＲＲＫ２遺伝子、および随意にヒトＬＲＲＫ２プロモーター領域の一部または全体を含有する。
実施例１９ 安全港位置におけるヒト線維芽細胞中への導入遺伝子の挿入
初代ヒト線維芽細胞を、実施例９に示すようにプレーティングする。翌日、この細胞に、実施例１に従って合成した、以下の配列、Ｌ：ＴＴＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣおよびＲ：ＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅ、ならびに、ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座を包囲する領域に対して相同性である、およそ４００個の塩基をそれぞれ含有する２つの領域に隣接する、導入遺伝子を含有する修復鋳型を、実施例２に示すように遺伝子導入した。
実施例２０ 安全港位置へのＲＮＡｉ配列の挿入
初代ヒト線維芽細胞を、実施例１９に従って、プレーティングおよび遺伝子導入し、この導入遺伝子は、ＰｏｌＩＩＩプロモーターが先行する、ｓｈＲＮＡをコードする配列を含有する。
実施例２１ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅを使用するＭｙｃの遺伝子編集
初代ヒト線維芽細胞を、６ウェルプレート内に、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中で５０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。２日後、この培地を遺伝子導入培地に変えた。４時間後、この細胞に、実施例１に従って合成した、以下の配列、Ｌ：ＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＧＴおよびＲ：ＴＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧを標的にする１μｇ／ウェルのＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、実施例２に示すように遺伝子導入した。翌日、遺伝子編集効率を、以下のプライマー、Ｆ：ＴＡＡＣＴＣＡＡＧＡＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＣＴＴＴおよびＲ：ＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡを使用して、実施例９に示すように測定した（図５）。
実施例２２ Ｍｙｃを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを含む癌療法
ＨｅＬａ子宮頸癌細胞を、６ウェルプレート内に、葉酸を含まないＤＭＥＭ＋２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン＋１０％のＦＢＳ中で５０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、この培地を遺伝子導入培地に変えた。翌日、この細胞を、実施例２１に示すように遺伝子導入した。
実施例２３ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅを使用するＢＩＲＣ５の遺伝子編集
初代ヒト線維芽細胞を、６ウェルプレート内に、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中で５０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。２日後、この培地を遺伝子導入培地に変えた。４時間後、この細胞に、実施例１に従って合成した、以下の配列、Ｌ：ＴＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣおよびＲ：ＴＴＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧを標的にする１μｇ／ウェルのＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、実施例２に示すように遺伝子導入した。翌日、遺伝子編集効率を、以下のプライマー、Ｆ：ＧＣＧＣＣＡＴＴＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＴＴＧＡＡおよびＲ：ＴＧＧＧＡＧＴＴＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴを使用して、実施例９に示すように測定した（図６）。
実施例２４ ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを含む癌療法
ＨｅＬａ子宮頸癌細胞を、６ウェルプレート内に、葉酸を含まないＤＭＥＭ＋２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン＋１０％のＦＢＳ中で５０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、この培地を遺伝子導入培地に変えた。翌日、この細胞を、実施例２３に示すように遺伝子導入した（図７Ａおよび図７Ｂ）。
実施例２５ 癌細胞株の培養
ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳房）、ＨＣＴ １１６（結腸）、Ｕ８７ ＭＧ（神経膠腫）、およびＵ－２５１（神経膠腫）の癌細胞株を、培養液中で繁殖させた。細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳまたはＤＭＥＭ＋５０％のＦＢＳ中で培養し、３７℃、５％のＣＯ２、および周囲Ｏ２または５％のＯ２のいずれかに維持した。細胞は、全条件下で急速に成長し、ＨＢＳＳ中のトリプシンの溶液を使用して、２～５日おきに定期的に継代された。
実施例２６ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ遺伝子編集ＲＮＡ設計プロセスおよびアルゴリズム
ＢＩＲＣ５遺伝子の注釈付けしたＤＮＡ配列を、ｅＦｅｔｃｈユーティリティおよびｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、ＮＣＢＩから回収した。同一のｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用し、ＢＩＲＣ５遺伝子の４つのエクソンのそれぞれの中のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を識別した。このスクリプトは次に、以下の条件を満たす配列要素のために、これらの配列、および両側に隣接する４０個の塩基を検索した：（ｉ）１つの要素は主要鎖上に、その他は相補鎖上に存在する、（ｉｉ）各要素はＴで始まる、ならびに（ｉｉｉ）要素は１２個以上の塩基および２０個以下の塩基によって分離されている。次に、各要素に、Ｑｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ）を使用してそのヒトゲノム内の他の要素に結合する可能性を表すスコアを割り当てた。このスコアを、標的配列に対するマッチを除く９つの最低Ｅ値の逆数の合計として計算した。ペアのスコアを、個別の要素のスコアを加算することによって計算した。
実施例２７ 遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡ（ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ）の合成
遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡを、実施例２６に従って設計し、実施例１に従って合成した（表１０、図９）。このＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水で、２００ｎｇ／μＬ～５００ｎｇ／μＬまで希釈し、４℃で保管した。

実施例２８ ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅの活性分析
初代成熟ヒト線維芽細胞に、実施例２６に従って設計し、実施例２７に従って合成した、ＢＩＲＣ５を標的にする６つのＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアを、実施例２に従って遺伝子導入した。遺伝子導入の２日後、ゲノムＤＮＡを単離および精製した。遺伝子編集効率を測定するために、１５０ｎｇの増幅したＰＣＲ生成物を、１０ｍＭのトリス－Ｃｌ＋５０ｍＭのＫＣｌ＋１．５ｍＭのＭｇＣｌ２内で、１５０ｎｇの参照ＤＮＡと交雑した。交雑したＤＮＡを、ＳＵＲＶＥＹＯＲミスマッチ特異性エンドヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．）で処置し、結果として生じる生成物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した（図１０Ａ）。予期されたサイズのバンド（図１０Ａ中のアスタリスク）の出現に実証される通り、６つの試験したＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアの全てが、ＢＩＲＣ５遺伝子を効率的に編集した。
実施例２９ ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅの有糸分裂阻害分析
初代成熟ヒト線維芽細胞を、実施例２８に従って遺伝子編集し、次に培養液中で繁殖させた。１１日後、ゲノムＤＮＡを単離および精製し、遺伝子編集効率を、実施例２８に示すように測定した（図１０Ｂ）。増殖する細胞から単離したゲノムＤＮＡにおける、予期されたサイズのバンド（図１０Ｂ中のアスタリスク）の出現が示す通り、試験したＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアの全てが、線維芽細胞の増殖を阻害せず、これは、正常な線維芽細胞に対する、これらＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアの低い毒性を実証する。
実施例３０ ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅの抗癌活性分析 実施例２５に従って培養した、初代成熟ヒト線維芽細胞およびＨｅＬａ子宮頸癌細胞に、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアを、実施例２８に従って遺伝子導入した。線維芽細胞の増殖は、遺伝子導入試薬関連毒性が原因で一時的に緩徐化したが、遺伝子導入の２日以内に回復した。対照的に、ＨｅＬａ細胞の増殖は際立って緩徐化し、断片化核を有する多くの巨細胞が、遺伝子導入されたウェル内に観察された。２～３日後、多くの細胞はアポトーシスを示唆する形態を示し、これは、ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅの強力な抗癌活性を実証する。
実施例３１ 生体内のＲｉｂｏＳｌｉｃｅの安全性の研究
４０匹の雌のＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスに、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の、５×１０６のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞を皮下注入した。細胞注入体積は、０．２ｍＬ／マウスであった。研究開始時のマウスの年齢は、８～１２週であった。ペアマッチを行い、腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達したとき、動物をそれぞれ１０匹ずつ、４つのグループに分け、治療を開始した。初めの５日間は毎日、次に研究の終了まで隔週で、体重を測定した。治療は、媒体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と複合したＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－１．２から成った。各グループについて投与する溶液を調製するため、３０８μＬの複合体形成緩衝液（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、２つの無菌かつリボヌクレアーゼを含まない１．５ｍＬのチューブのそれぞれにピペットで入れた。２２μＬのＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－１．２（５００ｎｇ／μＬ）を、２つのチューブのうちの１つに添加し、チューブの内容物をピペット操作で混合した。２２μＬの媒体を、第２のチューブに添加した。第２のチューブの内容物を混合し、次に第１のチューブに移し、ピペット操作によって第１のチューブの内容物と混合し、複合体を形成した。複合体を、室温にて１０分かけてインキュベートした。インキュベーションの間、シリンジを装填した。動物に、６０μＬの総体積／動物中、１μｇのＲＮＡ／動物の総用量を、静脈内または腫瘍内注入した。注入を１日おきに実施し、合計５回の治療を与えた。用量は体重に対して調節されなかった。動物を１７日間観察した。平均体重の著しい低減は観察されず（図１１、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－１．２は「ＺＫ１」と表示される）、これは、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ遺伝子編集ＲＮＡの生体内の安全性を実証する。
実施例３２ 神経膠腫モデルにおけるＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅの抗癌活性分析
実施例２５に従って培養した、Ｕ－２５１神経膠腫細胞株に、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアを、実施例２８に従って遺伝子導入した。神経膠腫細胞は、ＨｅＬａ細胞と同様に治療に反応した：増殖は際立って緩徐化し、断片化核を有する多くの巨細胞が、遺伝子導入されたウェル内に観察された。２～３日後、多くの細胞はアポトーシスを示唆する形態を示し、これは、神経膠腫モデルにおけるＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅの強力な抗癌活性を実証する。
実施例３３ 細胞への核酸の送達のための試薬のスクリーニング
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、様々な商用の脂質系遺伝子導入試薬、ペプチド系遺伝子導入試薬（Ｎ－ＴＥＲ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．）、ならびにいくつかの脂質系およびステロール系送達試薬を含む送達試薬を、生体外の遺伝子導入効率および毒性についてスクリーニングした。送達試薬をＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－１．２と複合し、実施例２５に従って培養したＨｅＬａ細胞に、複合体を送達した。遺伝子導入の２４時間後に細胞密度を分析することによって、毒性を査定した。実施例３０で説明したように形態変化を分析することによって、遺伝子導入効率を査定した。試験した試薬は、広範囲の毒性および遺伝子導入効率を示した。より高い割合のエステル結合を含有する試薬は、より低い割合のエステル結合を含有する試薬、またはエステル結合を含有しない試薬よりも低い毒性を示した。
実施例３４ 高濃度リポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅ
１μｇのＲＮＡを５００ｎｇ／μＬで３μＬの複合体形成培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と、そして１μｇのＲＮＡ当たり２．５μＬの遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を２．５μＬの複合体形成培地と混合することによって、高濃度リポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅを調製した。希釈したＲＮＡおよび遺伝子導入試薬を、次に混合し、１０分かけて室温にてインキュベートし、高濃度リポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅを形成した。あるいは、ＤＯＳＰＡまたはＤＯＳＰＥＲを含有する遺伝子導入試薬が使用される。
実施例３５ 生体内ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ効力研究－皮下神経膠腫モデル
４０匹の雌のＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスに、１×１０７のＵ－２５１腫瘍細胞を皮下注入した。細胞注入体積は、０．２ｍＬ／マウスであった。研究開始時のマウスの年齢は、８～１２週であった。ペアマッチを行い、腫瘍が３５～５０ｍｍ３の平均サイズに達したとき、動物をそれぞれ１０匹ずつ、４つのグループに分け、治療を開始した。初めの５日間は毎日、次に研究の終了まで隔週で、体重を測定した。キャリパー測定を隔週で行い、腫瘍サイズを算出した。治療は、媒体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と複合したＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－２．１から成った。投与する溶液を調製するため、２９４μＬの複合体形成緩衝液（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、１９６μＬのＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－１．２（５００ｎｇ／μＬ）を含むチューブにピペットで入れ、チューブの内容物をピペット操作で混合した。２４５μＬの複合体形成緩衝液を、２４５μＬの媒体を含むチューブにピペットで入れた。第２のチューブの内容物を混合し、次に第１のチューブに移し、ピペット操作によって第１のチューブの内容物と混合し、複合体を形成した。複合体を、室温にて１０分かけてインキュベートした。インキュベーションの間、シリンジを装填した。動物に、２０μＬまたは５０μＬの総体積／動物のいずれかで、２μｇまたは５μｇのＲＮＡ／動物のいずれかの総容量を、腫瘍内注入した。注入を１日おきに実施し、合計５回の治療を与えた。用量は体重に対して調節されなかった。動物を２５日間観察した。
実施例３６ 高活性／高忠実度ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ生体外転写鋳型の合成
Ｔ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、５′非翻訳領域、強いコザック配列、ＴＡＬＥ Ｎ末端ドメイン、実施例２６に従って設計した１８の反復配列、ＴＡＬＥ Ｃ末端ドメイン、および、ＳｔｓＩ配列（配列番号１）、ＳｔｓＩ－ＨＡ配列（配列番号２）、ＳｔｓＩ－ＨＡ２配列（配列番号３）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ配列（配列番号４）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２配列（配列番号５）、ＳｔｓＩ－ＨＦ配列（配列番号６）、またはＳｔｓＩ－ＨＦ２配列（配列番号７）を含むヌクレアーゼドメインをコードする生体外転写鋳型を、標準のクローニングおよび分子生物学技術を使用して合成する、あるいは、例えば、遺伝子断片構築技術（例えば、ｇＢｌｏｃｋｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用する直接化学合成によって合成する。
実施例３７ 高活性／高忠実度ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ遺伝子編集ＲＮＡの合成
高活性ＲｉｂｏＳｌｉｃｅおよび高忠実度ＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、実施例３６に従って合成した生体外転写鋳型を使用して、実施例２７に従って合成する。
実施例３８ プロテオパチーの治療のためのＲｉｂｏＳｌｉｃｅをコードする複製不全ウイルスの産生
プラーク形成タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを含むヌクレオチド配列を、複製不全ウイルスゲノムを含む哺乳類発現ベクター内に組み込み、パッケージング細胞株に遺伝子導入し、複製不全ウイルスを生成する。培養液上清を採取し、０．４５μｍのフィルターを使用して濾過し、デブリを除去する。
実施例３９ 癌の治療のためのＲｉｂｏＳｌｉｃｅをコードする複製可能腫瘍退縮ウイルスの産生
ＢＩＲＣ５遺伝子を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを含むヌクレオチド配列を、複製可能ウイルスゲノムを含む哺乳類発現ベクター内に組み込み、パッケージング細胞株に遺伝子導入し、複製可能ウイルスを生成する。実施例３８に従って、培養液上清を採取および濾過する。
実施例４０ 生体内のＲｉｂｏＳｌｉｃｅの効力の研究－同所性神経膠腫モデル、投与のくも膜下腔内経路
４０匹の雌のＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスに、１×１０５のＵ－２５１腫瘍細胞を頭蓋内注入した。細胞注入体積は、０．０２ｍＬ／マウスである。研究開始時のマウスの年齢は、８～１２週である。１０日後、動物をそれぞれ１０匹ずつ、４つのグループに分け、治療を開始する。初めの５日間は毎日、次に研究の終了まで隔週で、体重を測定する。治療は、媒体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と複合したＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－２．１から成る。投与する溶液を調製するため、２９４μＬの複合体形成緩衝液（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、１９６μＬのＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－１．２（５００ｎｇ／μＬ）を含むチューブにピペットで入れ、チューブの内容物をピペット操作で混合する。２４５μＬの複合体形成緩衝液を、２４５μＬの媒体を含むチューブにピペットで入れる。第２のチューブの内容物を混合し、次に第１のチューブに移し、ピペット操作によって第１のチューブの内容物と混合し、複合体を形成する。複合体を、室温にて１０分かけてインキュベートする。インキュベーションの間、シリンジを装填する。動物に、１０～２０μＬの総体積／動物中、１～２μｇのＲＮＡ／動物の総容量を、くも膜下腔内注入する。注入を１日おきに実施し、合計５回の治療を与える。用量は体重に対して調節されていない。動物を６０日間観察する。
実施例４１ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅを用いる神経膠腫の治療－ＩＶ灌流
神経膠腫と診断された患者に、実施例３４に従って調製した１ｍｇの高濃度リポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＢＩＲＣ５－２．１を、１時間、１週間につき３回の、４週間にわたるＩＶ輸注によって投与する。５００ｍｍ３を上回る初期腫瘍体積に対して、外科的ならびに随意に放射線療法および／または化学療法によって腫瘍を減量し、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ治療を開始する。併用療法として標準投与計画を使用して、患者にＴＮＦ－αおよび／または５－ＦＵを随意に投与する。
実施例４２ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅを用いる神経膠腫の治療－複製可能腫瘍退縮ウイルス
患者に、実施例３９に従って調製した１ｍＬの複製ウイルス粒子（１０００ＣＦＵ／ｍＬ）を、くも膜下腔内または頭蓋内注入によって投与する。
実施例４３ ＳＮＣＡを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを用いるパーキンソン病の治療
パーキンソン病と診断された患者に、ＳＮＣＡ遺伝子を標的にする５０μｇのＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、くも膜下腔内または頭蓋内注入によって投与する。
実施例４４ ＡＰＰを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを用いるアルツハイマー病の治療
アルツハイマー病と診断された患者に、ＡＰＰ遺伝子を標的にする５０μｇのＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、くも膜下腔内または頭蓋内注入によって投与する。
実施例４５ ＩＡＰＰを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを用いるＩＩ型糖尿病の治療
ＩＩ型糖尿病と診断された患者に、ＩＡＰＰ遺伝子を標的にする５ｍｇのＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、静脈内、腹腔内、または門脈内注入によって投与する。
実施例４６ ｉＲｉｂｏＳｌｉｃｅ個別化癌療法
癌と診断された患者から生検試料を取る。この生検試料からゲノムＤＮＡを単離および精製し、ＤＮＡの配列（全ゲノム配列、エクソーム配列、または１つ以上の癌関連遺伝子の配列のいずれか）を判定する。患者の個別の癌配列を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅペア（ｉＲｉｂｏＳｌｉｃｅ）を、実施例２６に従って設計し、実施例２７に従って合成する。癌の位置および種類に適当な投与経路を使用して、患者に個別化ｉＲｉｂｏＳｌｉｃｅを投与する。
実施例４７ 遺伝的多様性／治療抵抗性癌のためのＲｉｂｏＳｌｉｃｅ混合物
遺伝的多様性および／または治療抵抗性癌と診断された患者に、１つ以上の癌関連遺伝子内の複数の癌関連遺伝子および／または多配列を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアの混合物を投与する。
実施例４８ ミトコンドリア病のためのＭｉｔｏ－ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ
ミトコンドリア病と診断された患者に、疾患に関連する配列を標的にし、ミトコンドリア局在化配列を含む、２ｍｇのＲｉｂｏＳｌｉｃｅを、筋肉内注入によって投与する。
実施例４９ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ点眼薬を用いる眼疾患の治療
角膜疾患または結膜疾患と診断された患者に、０．５％の等張液として配合したＲｉｂｏＳｌｉｃｅを投与する。
実施例５０ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ局所配合物を用いる皮膚疾患の治療
皮膚疾患と診断された患者に、ＲＮＡの分解を防止する１つ以上の安定剤を含有する１％の局所クリーム／軟膏として配合したＲｉｂｏＳｌｉｃｅを投与する。
実施例５１ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅエアロゾル配合物を用いる肺または呼吸器疾患の治療
肺または呼吸器疾患と診断された患者に、０．５％のエアロゾルスプレーとして配合したＲｉｂｏＳｌｉｃｅを投与する。
実施例５２ 感染病原体内に存在するＤＮＡ配列を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを用いる感染性疾患の治療
感染症の位置および種類に適当な投与経路、ならびに投与経路および感染症の重症度に適当な用量を使用して、感染性疾患と診断された患者に、患者が感染している特異的感染病原体内に存在する配列を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを投与する。
実施例５３ 生体外受精のための遺伝子編集されたヒト接合子
ヒト生殖細胞、接合子、または初期段階の胚盤胞に、疾患に関連する変異もしくは望ましくない体質に関連する変異をコードする遺伝子を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅを遺伝子導入する。ゲノムを特徴付け、細胞を生体外受精のために調製する。
実施例５４ 遺伝子編集タンパク質の活性、忠実度向上のための開裂ドメインスクリーン
それぞれが異なる開裂ドメインを含むＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアのパネルを、実施例２６に従って設計し、実施例２７に従って合成する。ＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアの活性を、実施例２８に示すように判定する。
実施例５５ パーキンソン病原性毒物のスクリーニングのための遺伝子編集された細胞 初代ヒト成熟線維芽細胞を、ＳＮＣＡを標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅ（表１１）および修復鋳型を使用して、実施例２８に従って遺伝子編集し、ＳＮＣＡ Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、およびＡ５３Ｔ変異を有する細胞を産生する。細胞をリプログラムし、ドーパミン作動性ニューロンに分化する。このニューロンを、高処理α－シヌクレイン凝集毒物スクリーニングアッセイにおいて使用し、パーキンソン病の要因となり得る毒物を識別する。

実施例５６ 癌原性毒物のスクリーニングのための遺伝子編集された細胞
初代ヒト成熟線維芽細胞を、ＴＰ５３を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅ（表１２）および修復鋳型を使用して、実施例２８に従って遺伝子編集し、ＴＰ５３ Ｐ４７Ｓ、Ｒ７２Ｐ、およびＶ２１７Ｍ変異を有する細胞を産生する。細胞をリプログラムし、肝細胞に分化する。この肝細胞を、高処理生体外形質転換毒物スクリーニングアッセイにおいて使用し、癌の要因となり得る毒物を識別する。

実施例５７ 改変遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡ（ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ）の設計および合成
実施例２６に従って設計した遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡを、実施例２７に従って合成した（表１３）。表１３に示す通り、各遺伝子編集タンパク質は、３５～３６アミノ酸長の反復配列を含む転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター反復ドメインを含むＤＮＡ結合ドメインを含んだ。３６アミノ酸長の反復配列に、配列識別番号が与えられている。鋳型名の表示「１８」は、１８番目の反復配列が３６アミノ酸長であったことを示す。鋳型名の表示「ＥＯ」は、１つおきの反復配列が３６アミノ酸長であったことを示す。表示「１８」または「ＥＯ」の後に続くアミノ酸は、３６アミノ酸長の反復配列（複数可）のＣ末端におけるアミノ酸を示す。表示「ＳｔｓＩ」は、ヌクレアーゼドメインがＳｔｓＩ開裂ドメインを含有したことを示す。「ＳｔｓＩ」の表示がない鋳型は、ＦｏｋＩ開裂ドメインを含有した。



実施例５８ ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅの活性分析
実施例５７に従って合成したＲｉｂｏＳｌｉｃｅ分子の活性を、実施例２８に従って分析した（図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１４）。１つ以上の３６アミノ酸長の反復配列を含有する遺伝子編集タンパク質を発現する細胞中で、高効率遺伝子編集を観察した。遺伝子編集効率は、アミノ酸配列：ＧＨＧＧを含有する１つ以上の反復配列を含有する遺伝子編集タンパク質を発現する細胞中で最高であった。
実施例５９ 生体内のＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶの安全性および効力の研究－皮下神経膠腫モデル、送達の腫瘍内経路
動物に、実施例３５に従って、Ｕ－２５１ヒト神経膠腫細胞を含む腫瘍を植え付けた。ＧＦＰ、ＢＩＲＣ５－２．１Ｌ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ、およびＢＩＲＣ５－２．１Ｒ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅをコードするＡＡＶ血清型２を、標準技術（ＡＡＶ－２ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に従って調製した。ウイルスストックを４℃（短期間）または－８０℃（長期間）で保管した。動物に、１日目に１６０μＬのＧＦＰ ＡＡＶか、または１日目および１５日目に８０μＬのＢＩＲＣ５－２．１Ｌ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶ＋８０μＬのＢＩＲＣ５－２．１Ｒ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶのいずれかの腫瘍内注入を与えた。動物を２５日間観察した。平均体重の著しい低減は観察されず（図１３Ａ）、これは、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶの生体内の安全性を実証する。腫瘍の成長は、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶグループ内で阻害され（図１３Ｂ）、これは、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶの生体内の効力を実証する。
実施例６０ ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶを用いる癌の治療
患者に、実施例５９に従って調製した１ｍＬのＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶウイルス粒子を、くも膜下腔内または頭蓋内注入によって投与する。投与を必要に応じて繰り返す。５００ｍｍ３を上回る初期腫瘍体積を有する患者に対して、外科的ならびに随意に放射線療法および／または化学療法によって腫瘍を減量し、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶ治療を開始する。併用療法として標準投与計画を使用して、患者にＴＮＦ－αおよび／または５－ＦＵを随意に投与する。
実施例６１ ｉＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶ個別化癌療法
癌と診断された患者から生検試料を取る。この生検試料からゲノムＤＮＡを単離および精製し、ＤＮＡの配列（全ゲノム配列、エクソーム配列、または１つ以上の癌関連遺伝子の配列のいずれか）を判定する。患者の個別の癌配列を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅペア（ｉＲｉｂｏＳｌｉｃｅ）を、実施例２６に従って設計し、実施例５９に従って合成する。癌の位置および種類に適当な投与経路を使用して、患者に個別化ｉＲｉｂｏＳｌｉｃｅ ＡＡＶを投与する。
実施例６２ リポソーム配合物および核酸のカプセル封入
以下の配合を使用してリポソームを調製する：３．２ｍｇ／ｍＬのＮ－（カルボニル－エトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－フォスフォエタノールアミン（ＭＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ）、９．６ｍｇ／ｍＬの完全水素化フォスファチジルコリン、３．２ｍｇ／ｍＬのコレステロール、２ｍｇ／ｍＬのアンモニウムスルフェート、および緩衝液としてのヒスチジン。水酸化ナトリウムを使用してｐＨを制御し、スクロースを使用して等張性を維持する。リポソームを形成するため、脂質を有機溶媒中で混合し、乾燥させ、撹拌を用いて水和し、８００ｎｍの平均細孔サイズを有するポリカーボネートフィルターを通す押出によってサイズ分類する。１μｇの核酸当たり１０μｇのリポソーム配合物を組み合わせ、室温にて５分かけてインキュベートすることによって、核酸をカプセル封入する。
実施例６３ 葉酸標的リポソーム配合物
０．２７ｍｇ／ｍＬの１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－フォスフォエタノールアミン－Ｎ－［葉酸（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＦＡ－ＭＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ）を脂質混合物に添加することを除いては実施例６２に従って、リポソームを調製する。
実施例６４ ＢＩＲＣ５を標的にするリポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅを含む癌療法
実施例２３に従って合成したＲｉｂｏＳｌｉｃｅペアをカプセル封入するリポソームを、実施例６２または実施例６３に従って調製する。このリポソームを、注入または静脈内輸注によって投与し、腫瘍反応およびインターフェロン血漿レベルを毎日監視する。
実施例６５ 癌関連遺伝子を標的にするリポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅを含む癌療法
実施例１に従って合成した癌関連遺伝子を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅをカプセル封入するリポソームを、実施例６２または実施例６３に従って調製する。このリポソームを、注入または静脈内輸注によって投与し、腫瘍反応およびインターフェロン血漿レベルを毎日監視する。
実施例６６ リポソームのタンパク質をコードするＲＮＡを含む療法
実施例１に従って合成した治療用タンパク質をコードする合成ＲＮＡをカプセル封入するリポソームを、実施例６２または実施例６３に従って調製する。このリポソームを、注入または静脈内輸注によって投与する。
実施例６７ ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅおよびＴＮＦ－αを含む併用癌療法
患者に、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）およびＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅをカプセル封入するリポソーム（実施例６４を参照のこと）を用いる分離式肢灌流（ＩＬＰ）を投与する。肢の加温に続いて、およそ５分にわたってリポソームを体外ＩＬＰ回路の動脈ライン中に注入し、灌流をさらに８５分間続行する。１～２日後、３～５分にわたってＴＮＦ－αを体外ＩＬＰ回路の動脈ライン中に注入するＩＬＰを繰り返し、灌流をさらに６０分間続行する。腫瘍反応およびインターフェロン血漿レベルを毎日監視する。
実施例６８ ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅおよびフルオロウラシル（５－ＦＵ）を含む併用癌療法
１日目、患者に、ＢＩＲＣ５を標的にするＲｉｂｏＳｌｉｃｅをカプセル封入するリポソーム（実施例６４を参照のこと）の６０分間の静脈内輸注を与え、続いて２日目および３日目に５－ＦＵの４６時間の静脈内輸注を与える。腫瘍反応およびインターフェロン血漿レベルを毎日監視する。
均等物
当業者であれば、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に具体的に記載される具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
参照による組み込み
本明細書において参照される全ての特許および出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (12)

  1. 遺伝子編集及び脱分化された細胞を作製するためのインビトロの方法であって、
    （ａ）分化細胞を培養することと、
    （ｂ）分化細胞を脱分化することができる二以上の合成ＲＮＡ分子で前記分化細胞をトランスフェクトすることと、
    を含み、
    前記二以上の合成ＲＮＡ分子が、
    （ｉ）Ｏｃｔ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、ｃ－Ｍｙｃタンパク質、及びＬｉｎ２８タンパク質から選択される一又は複数のリプログラミング因子をコードする少なくとも一つの合成ＲＮＡ分子と、
    （ｉｉ）前記細胞のＤＮＡに一本鎖切断又は二本鎖切断を生じさせる遺伝子編集タンパク質をコードする少なくとも一つの合成ＲＮＡ分子と、
    を含み、
    前記トランスフェクトによって、前記細胞において前記一又は複数のリプログラミング因子及び前記遺伝子編集タンパク質が発現し、遺伝子編集及び脱分化された細胞となり、
    ステップ（ｂ）が、フィーダー細胞を用いずに実施され、前記細胞を分化の程度が低い状態にリプログラミングすることを支持する成分を含む培地の存在下で生じ、前記培地が、アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び塩基性線維芽細胞増殖因子を含み、前記培地が条件付けされていない、
    方法。
  2. 前記分化細胞が、生検由来である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生検が、皮膚パンチ生検である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記分化細胞が、ヒト皮膚細胞である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ヒト皮膚細胞が、線維芽細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記分化細胞を細胞接着分子に接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記細胞接着分子が、フィブロネクチン及びビトロネクチンの一方又は両方である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記細胞接着分子が、組換え体である、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 前記二以上の合成ＲＮＡ分子が、少なくとも一つの非標準ヌクレオチドを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記少なくとも一つの非標準ヌクレオチドが、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルシチジン、５－メチルプソイドウリジン、５－メチルウリジン、７－デアザグアノシン、又はプソイドウリジンの一又は複数を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記培地が、免疫抑制剤を含まない、請求項１に記載の方法。
  12. 連続５日間に少なくとも２回、前記一又は複数のリプログラミング因子をコードする少なくとも一つの合成ＲＮＡ分子で前記分化細胞をトランスフェクトすることを繰り返し、より後の１回以上の遺伝子導入において遺伝子導入される前記一又は複数のリプログラミング因子をコードする少なくとも一つの合成ＲＮＡ分子の量が、より前の１回以上の遺伝子導入において遺伝子導入された量よりも大きい、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
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