KR20200067921A - 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질을 인코드하는 핵산, 단백질을 인코드하는 핵산이 포함된 치료제, 핵산을 이용하여 단백질이 발현되도록 세포를 유도하는 방법들, 세포를 트랜스펙션시키는 방법, 키트 및 장치, 유전자 에디팅을 위한 방법, 키트 및 장치, 세포의 재프로그래밍을 위한 방법, 키트 및 장치, 그리고 이들 방법, 키트 및 장치를 이용하여 만들어진 세포들, 유기체들, 그리고 치료제들에 일부 관련된다. 합성 RNA 분자들을 이용하여 단백질을 발현시키기 위하여 세포들을 유도하는 방법 및 산물과 마찬가지로, 세포의 DNA 서열을 변경시키는 방법 및 산물들이 설명된다. 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산이 포함된 치료제 또는 설명된다.

Description

세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들{METHODS AND PRODUCTS FOR EXPRESSING PROTEINS IN CELLS}
우선권
본 출원은 2012년 11월 1일자로 제출된 U.S. 가출원 번호. 61/721,302, 2013년 3월 14일자로 제출된 U.S. 가출원 번호. 61/785,404, 그리고 2013년 7월 3일자로 제출된 U.S. 가출원 번호. 61/842,874를 우선권으로 주장하며, 이의 내용은 이들 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 본 출원은 2012년 5월 7일자로 제출된 U.S. 출원 번호. 13/465,490, 2012년 12월 5일자로 제출된 국제 출원 번호. PCT/US2012/067966, 그리고 2013년 6월 28일자로 제출된 U.S. 출원 번호. 13/931,251에 관련되며, 이의 내용은 이들 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 단백질을 인코드하는 핵산, 단백질을 인코드하는 핵산이 포함된 치료제, 핵산을 이용하여 단백질이 발현되도록 세포를 유도하는 방법들, 세포를 트랜스펙션시키는 방법, 키트 및 장치, 유전자 에디팅을 위한 방법, 키트 및 장치, 세포의 재프로그래밍을 위한 방법, 키트 및 장치, 그리고 이들 방법, 키트 및 장치를 이용하여 만들어진 세포들, 유기체들, 그리고 치료제들에 일부 관련된다.
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배경기술
합성 RNA 및 RNA 치료제들(Synthetic RNA and RNA Therapeutics)
리보핵산 (RNA)은 원핵 세포 및 진핵 세포들 모두에 편재되어 있으며, 이때 이 리보핵산은 메신져 RNA 형태로 유전 정보를 인코드하고, 전달 RNA의 형태로 아미노산에 결합하여 아미노산을 운반하고, 리보좀 RNA 형태로 아미노산을 단백질로 어셈블리하고, 그리고 microRNA 및 긴 넌-코딩 RNA형태로 유전자 발현 조절을 포함하는 다수의 많은 기능을 실행한다. RNA는 직접적 화학 합성 및 시험관 전사가 포함된 방법들에 의해 합성에 의해 만들어질 수 있으며, 그리고 환자들에게 치료요법적 용도로 투여될 수 있다.
세포 재프로그래밍 및 세포-기반 치료법(Cell Reprogramming and Cell-Based Therapies)
세포들은 특이적 세포외 신호에 노출 및/또는 특이적 단백질의 이소성(ectopic) 발현, microRNAs 등에 의해 재프로그램될 수 있다. 몇 가지 재프로그래밍 방법들이 기존에 설명되었지만, 이소성 발현에 의지하는 대부분은 외생성 DNA의 도입을 필요로 하는데, 이때 이 DNA는 돌연변이 위험을 가지고 있을 수 있다. 재프로그래밍 단백질의 직접적인 전달에 기초한 DNA-없는(free) 재프로그래밍에 대해 보고된 바 있다. 그러나, 이들 방법은 상업적으로 이용하기에는 너무 비효율적이며, 신뢰성이 없다. 또한, RNA-기반 재프로그래밍 방법들이 설명되었다 (이를 테면, Angel. MIT Thesis. 2008. 1-56; Angel et al. PLoS ONE. 2010. 5,107; Warren et al. Cell Stem Cell. 2010. 7,618-630; Angel. MIT Thesis. 2011. 1-89; 그리고 Lee et al. Cell. 2012. 151,547-558; 이들 모든 내용은 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 그러나, 기존의 RNA-기반 재프로그래밍 방법들을 성인 세포에서 실행할 경우, 느리고 신뢰성이 없으며, 비효율적이며, 많은 트랜스펙션(transfections)이 요구되며(상당한 비용과 오류의 발생 가능성이 있다), 한정된 수의 세포 유형 만을 재프로그램할 수 있고, 세포를 제한된 수의 세포 유형으로만 재프로그램할 수 있고, 면역억제제(immunosuppressants)의 사용을 필요로 하고, 그리고 혈액-유도된 HSA 및 인간 섬유아세포 피더(feeders)가 포함된 많은 인간-유도된 성분들의 사용을 필요로 한다. 기존에 공개된 RNA-기반 재프로그래밍 방법들의 많은 단점들로 인하여 연구 및 치료요법적 용도로 바람직하지 않다.
유전자 에티딩(Editing)
자연적으로 생성되는 몇 가지 단백질은 특이적 DNA 서열들, 예를 들면, 아연 핑거 (ZFs) 및 전사 활성물질-유사 효과물질 (TALEs)을 인지할 수 있는 DNA-결합 도메인들을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 이들 DNA-결합 도메인들과 FokI 엔도뉴클레아제의 절단 도메인이 포함된 융합 단백질은 세포 안에서 DNA의 원하는 영역내에 이중-가닥 브레이크(break)를 만드는데 이용될 수 있다 (이를 테면, US 특허 출원 공개 번호 US 2012/0064620, US 특허 출원 공개 번호 US 2011/0239315, US 특허 번호 8,470,973, US 특허 출원 공개 번호 US 2013/0217119, US 특허 번호 8,420,782, US 특허 출원 공개 번호 US 2011/0301073, US 특허 출원 공개 번호 US 2011/0145940, US 특허 번호 8,450,471, US 특허 번호 8,440,431, US 특허 번호 8,440,432, 그리고 US 특허 출원 공개 번호 2013/0122581 참고, 이들 모든 내용은 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 그러나, 세포에서 유전자 에디팅을 위한 현행 방법은 비효율적이며, 통제안된 돌연변이생성의 위험을 가지고 있어, 연구 및 치료요법적 용도 모두에 바람직하지 못하다. 체세포의 DNA-없는 유전자 에디팅 방법은 기존에 연구된 적이 없으며, 체세포의 동시 또는 순차적 유전자 에디팅 및 재프로그래밍을 위한 방법들은 없었다. 또한, 환자들에서 (가령, 생체내) 직접적으로 유전자 에디팅을 위한 방법들은 기존에 연구된 적이 없으며, 이러한 방법들의 개발은 수용가능한 표적들의 부재, 유전자-에디팅 단백질/단백질들의 비효율적인 운반, 비효율적인 발현, 발현된 유전자-에디팅 단백질/단백질들에 의한 비효율적인 유전자 에디팅, DNA-결합 도메인들의 일부 빈약한 결합으로 인하여, 과도한 부정확한(비적중) 효과, FokI 절단 도메인의 비-지향적 이량체화로 인하여 그리고 DNA-결합 도메인들의 빈약한 특이성으로 인하여, 그리고 다른 인자들에 의해 제한되어 왔었다. 끝으로, 항균, 항바이러스 그리고 항암 치료에서 유전자 에디팅의 사용은 기존에 연구된 적은 없었다.
따라서, 세포 안에서 단백질의 발현을 위한 개선된 조성물들과 방법들이 여전히 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 단백질을 발현시키기 위하여 세포를 유도하는 조성물, 방법들, 물품들(article) 및 장치, 이들 조성물들, 방법들, 물품들 및 장치들을 만드는 방법들, 물품들, 및 장치들, 이들 조성물들, 방법들, 물품들, 그리고 장치들을 이용하여 만들어진 세포들, 유기체들, 그리고 치료제가 포함된 조성물 및 물품들을 일부 제공한다. 기존에 보고된 방법들과는 달리, 본 발명의 특정 구체예들은 세포들을 외생성 DNA 또는 동종이계(allogeneic) 또는 동물-유도된 재료에 노출시키는 것을 포함하지 않으며, 이것은 치료요법적 용도에 유용한 본 발명의 방법에 따라 생성된 산물들을 만든다.
일부 측면들에 있어서, 낮은 독성 및 높은 해독(translation) 효율을 가진 합성 RNA 분자들이 제공된다. 한 측면에 있어서, 세포의 고-효율 트랜스펙션, 재프로그래밍, 그리고 유전자 에디팅을 위한 세포-배양 배지가 제공된다. 다른 측면들은 재프로그래밍 단백질이 인코딩된 합성 RNA 분자들을 생산하는 방법들과 관련된다. 여전히 다른 측면들은 재프로그래밍 단백질이 인코딩된 합성 RNA 분자들을 생산하는 방법들과 관련된다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 조작된(engineered) 뉴클라아제 절단 도메인들이 포함된 고-효율 유전자 에디팅 단백질들을 제공한다. 또다른 측면에 있어서, 본 발명은 조작된 뉴클라아제 절단 도메인들이 포함된 높은-충실성(fidelity) 유전자 에디팅 단백질들을 제공한다. 다른 측면들은 조작된 DNA-결합 도메인들이 포함된 고-효율 유전자-에디팅 단백질에 관계된다. 여전히 추가 측면들은 조작된 DNA-결합 도메인들이 포함된 높은 정확도 유전자-에디팅 단백질에 관련된다. 여전히 추가 측면들은 조작된 반복 서열들이 포함된 유전자-에디팅 단백질들에 관련된다. 일부 측면들은 유전자-에디팅 단백질을 세포에 트랜스펙션시킴으로써 또는 유전자-에디팅 단백질이 발현되도록 세포를 유도함으로써, 세포의 DNA 서열을 변경시키는 방법들에 관련된다. 다른 측면들은 시험관 배양에 존재하는 세포의 DNA 서열을 변경시키는 방법들에 관련된다. 여전히 추가 측면들은 생체내에 존재하는 세포의 DNA 서열을 변경시키는 방법들에 관련된다.
일부 측면들에 있어서, 본 발명은 환자에게 치료요법적으로 유효량의 유전자-에디팅 단백질 또는 유전자-에디팅 단백질이 인코딩된 핵산을 투여하는 것이 포함된 암을 치료하는 방법들을 제공한다. 한 측면에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 암 연합된 유전자의 DNA 서열을 변경시킬 수 있다. 또다른 측면에 있어서, 상기 암-연합된 유전자는 BIRC5 유전자다. 여전히 일부 측면들은 예를 들면, 유형 1 당뇨병, 허혈 및 확장심근병이 포함된 심장 질환, 황반 변성, 파킨슨 질환, 낭성섬유증, 겸상 적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 판코니 빈혈, 중증 복합형 면역부전증, 유전성 감각신경병증, 색소성 건피증, 헌팅턴 질환, 근이영양증, 근위축성 측색 경화증, 알츠하이머 질환, 암, 그리고 간염 및 HIV/AIDS가 포함된 감염성 질환의 치료를 위한 핵산 및/또는 세포들이 포함된 치료제와 핵산 및/또는 세포가 포함된 치료제를 이용한 방법들에 관련된다. 일부 측면들에 있어서, 상기 핵산은 합성 RNA를 포함한다. 다른 측면에 있어서, 바이러스를 이용하여 상기 핵산은 세포들에게 전달된다. 일부 측면들에 있어서, 상기 바이러스는 복제-기능이 있는(competent) 바이러스다. 다른 측면에 있어서, 상기 바이러스는 복제-불능(incompetent) 바이러스다.
본 발명의 상세한 내용은 하기 수반되는 설명에서 제시된다. 본 명세서에서 설명된 것과 유사한 또는 대등한 방법들과 재료들이 본 발명의 실시 또는 테스트에 이용될 수 있지만, 예시적인 방법들과 재료들은 지금 설명된다. 본 발명의 다른 특징들, 목적들 및 장점들은 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수는 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적 숙련자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 1a는 아데노신, 50% 구아노신, 50% 7-데자구아노신, 70% 우리딘, 30% 5-메틸우리딘, 및 5-메틸시티딘이 포함된, 표시된 단백질을 인코드하는 RNA를 나타내는데, 변성 포름알데히드-아가로즈 겔상에서 해리된 것이다.
도 1b는 아데노신, 50% 구아노신, 50% 7-데자구아노신, 50% 우리딘, 50% 5-메틸우리딘, 그리고 5-메틸시티딘이 포함된, 표시된 단백질을 인코드하는 RNA를 나타내는데, 변성 포름알데히드-아가로즈 겔상에서 해리된 것이다.
도 2는 재프로그래밍 단백질이 인코드된 RNA로 5회 트랜스펙션에 의해 재프로그램된 1차 인간 신생 섬유아세포들을 나타낸다. 세포들은 고정되며, Oct4 단백질에 대하여 착색되었다. 핵은 Hoechst 33342로 반대착색되었다(counterstained).
도 3a는 1차 인간 성인 섬유아세포들을 나타낸다.
도 3b는 재프로그래밍 단백질이 인코드된 RNA로 7회 트랜스펙션에 의해 재프로그램된 도 3a에서 보여준 1차 인간 성인 섬유아세포들을 나타낸다. 화살표는 재프로그램된 세포들의 콜로니를 나타낸다.
도 3c는 재프로그램된 1차 인간 성인 섬유아세포들의 큰 콜로니를 나타낸다.
도 4a는 인간 CCR5 유전자를 표적으로 하는 TALEN 쌍의 위치를 나타낸다. 단일-선은 TALEN 결합 부위를 나타낸다. 이중선은 Δ32 돌연변이의 위치를 나타낸다.
도 4b는 변성 포름알데히드-아가로즈 겔 상에서 해리된 도 4a의 TALEN 쌍을 인코드하는 합성 RNA를 나타낸다.
도 4c는 인간 피부 섬유아세포들 (GM00609)에서 도 4b의 RNA의 기능을 테스트하는 SURVEYOR 분석 결과를 나타낸다. RNA로 트랜스펙션된 세포로부터 생성된 시료내 760bp와 200bp 밴드의 출현은 유전자 에디팅이 성공적임을 나타낸다. 각 라인의 아래 백분율은 유전자 에디팅의 효율 (에디트된 대립형질의 비율)을 나타낸다.
도 4d는 도 4c의 ＂Neg＂ 및 ＂TALENs＂ 라인의 라인-프로파일 그래프를 나타낸다. 숫자는 전체 통합(integrated) 강도와 비교하여 3개 밴드의 통합 강도를 나타낸다.
도 4e는 도 4c와 같이 실행된 SURVEYOR 분석 결과를 나타내는데, RNA로 2회 트렌스펙된 (＂2x＂로 표시된 라인) 세포들로부터 생성된 시료가 또한 포함된다.
도 4f는 합성 RNA를 이용하여 1차 인간 세포들 (GM00609)의 동시 유전자 에디팅 및 재프로그래밍을 나타낸다. 영상은 재프로그램된 세포들의 대표적 콜로니를 나타낸다.
도 4g는 도 4f와 같이 생성된 유전자-에디트된, 재프로그램된 세포들에서 CCR5 유전자의 직접적 서열화 결과를 나타낸다. 테스트된 9개 라인중 4개는 TALEN 결합 부위 사이에 결손을 포함하는데, 이는 효과적인 유전자 에디팅을 나타낸다.
도 5는 도 4c와 같이 실행된 SURVEYOR 분석 결과를 나타내는데, 단 차이는 인간 MYC 유전자를 표적으로 하는 RNA를 이용하는데, 정규(canonical) 뉴클레오티드 (＂A,G,U,C＂) 또는 비-정규(non-canonical) 뉴클레오티드 (＂A,7dG,5mU,5mC＂)가 포함된다. 470bp 및 500bp에서 짙은 밴드는 고-효율 유전자 에디팅을 나타낸다.
도 6은 도 4c와 같이 실행된 SURVEYOR 분석 결과를 나타내는데, 단 차이는 인간 BIRC5 유전자를 표적으로 하는 RNA를 이용하는데, 정규 뉴클레오티드 (＂A,G,U,C＂) 또는 비-정규 뉴클레오티드 (＂A,7dG,5mU,5mC＂)가 포함된다. 710bp에서 짙은 밴드는 고-효율 유전자 에디팅을 나타낸다.
도 7a는 인간 BIRC5 유전자를 표적으로 하는 RNA (RiboSlice)로 트랜스펙션된 HeLa 세포들(경부 암종)을 나타낸다. 세포들은 단일 RNA (＂2x 설바이빈(Survivin) L＂) 또는 동량의 RNA 쌍의 각 구성부 (＂설바이빈(Survivin) L + R＂)로 트랜스펙션되었으며, 각 경우에 전달된 RNA 총량은 동일하다. 우측 패널에서 나타낸 것과 같이 RNA 쌍으로 트랜스펙션된 세포들이 확대되었으며, 분절화된(fragmented) 핵을 나타내며, 상당히 감소된 증식을 나타내고, 이는 RiboSlice의 잠재적인 항-암 활성을 설명한다.
도 7b는 도 7a에서와 같이 인간 BIRC5 유전자를 표적으로 하는 RNA로 트랜스펙션된 HeLa 세포들을 나타낸다. 세포들은 후속적으로 고정되며, 설바이빈(survivin) 단백질에 대해 착색되었다. 핵은 Hoechst 33342로 반대착색되었다. RiboSlice로 트랜스펙션된 세포들의 크고, 분절화된 핵은 화살표로 표시된다.
도 8은 합성 RNA를 이용하여 재프로그램된 1차 인간 성인 섬유아세포들을 나타낸다. 재프로그래밍을 나타내는 형태를 보이는 세포들의 치밀한 콜로니를 화살표로 나타낸다 .
도 9는 변성 포름알데히드-아가로즈 겔 상에서 해리된 도 4a의 TALEN 쌍을 인코드하는 합성 RNA를 나타낸다.
도 10a는 인간 피부 섬유아세포들에서 도 9의 RNA의 효과를 테스트하는 SURVEYOR 분석 결과를 나타낸다. 세포는 트랜스펙션 후 대략적으로 48h에 용해되었다. 성공적인 유전자 에디팅으로 인하여 절단 산물에 상응하는 밴드는 별표로 나타낸다. 라인은 ＂X.Y＂의 형태로 라벨되는데, 여기에서 X는 증폭된 DNA의 엑손을 나타내며, Y는 상기 유전자-에디팅 단백질 쌍을 나타낸다. 예를 들면, ＂1.1＂은 시작 코든에 가장 근접한 엑손 1의 영역을 표적으로 하는 상기 유전자-에디팅 단백질 쌍을 지칭한다. ＂X.N＂은 트랜스펙션안된 세포들을 나타낸다.
도 10b는 인간 피부 섬유아세포들에서 도 9의 RNA의 독성을 테스트하는 SURVEYOR 분석 결과를 나타낸다. 세포는 트랜스펙션 후 11일에 용해되었다. 도 10a와 같이 라인과 밴드들은 라벨된다. 별표가 있는 밴드의 출현은 트랜스펙션된 세포들이 높은 생존력을 유지하였다는 것이 설명된다.
도 11은 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 RNA의 생체내 안전성을 테스트하기 위하여 기획된 연구 결과를 나타낸다. 그래프는 처리안된 하나의 집단, 비이클만으로 처리된 하나의 집단, 종양내 주사를 통하여 RiboSlice로 처리된 하나의 집단, 그리고 정맥내 주사를 통하여 RiboSlice로 처리된 하나의 집단의 4개 집단 마우스(각 집단에는 10마리 동물)의 평균 체중을 나타낸다. 모든 처리 집단의 경우, 1일차에서 9일차 시점까지 하루걸러 한번씩 5회 투여분량이 동물들에게 제공되었다. 동물은 17일차까지 추적된다. 4개 집단의 평균 체중 사이의 통계학적으로 유의적인 차이가 없다는 사실은 RiboSlice의 생체내 안전성을 설명한다.
도 12a는 다양한 36개의 아미노산의 긴 반복 서열들이 포함된 유전자-에디팅 단백질의 효과를 테스트하는 SURVEYOR 분석 결과를 나타낸다. 인간 피부 섬유아세포들은 표시된 반복 서열이 포함된 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 RNA로 트랜스펙션 후 대략적으로 48h에 용해되었다. 성공적인 유전자 에디팅으로 인하여 절단 산물에 상응하는 밴드는 별표로 나타낸다. 라인의 라벨은 반복 서열의 C-말단에서 아미노산을 나타낸다. ＂Neg.＂는 트랜스펙션안된 세포들을 나타낸다.
도 12b는 유전자-에디팅 단백질의 효과를 테스트하는 SURVEYOR 분석 결과를 나타내는데, 이때 모든 다른 반복 서열은 길이가 36개 아미노산이다. 인간 피부 섬유아세포들은 표시된 반복 서열이 포함된 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 RNA로 트랜스펙션 후 대략적으로 48h에 용해되었다. 성공적인 유전자 에디팅으로 인하여 절단 산물에 상응하는 밴드는 별표로 나타낸다. 라인의 라벨은 반복 서열들의 C-말단에서 아미노산을 나타낸다. ＂Neg.＂는 트랜스펙션안된 세포들을 나타낸다.
도 13a는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 나르는 RiboSlice AAV 복제-불능 바이러스의 생체내 안전성 및 효과를 테스트하기 위하여 기획된 연구 결과를 나타낸다. 이 그래프는 인간 신경아교종 세포들이 포함된 피부 종양을 가지는 3개 집단 마우스의 평균 체중을 나타내는데, 이때 3개 집단은 처리안된 하나의 집단 (처리없는 대조군, ＂NTC＂, n = 6), 종양내 주사를 통하여 GFP를 인코드하는 AAV로 처리된 하나의 집단 (＂GFP＂, n=2), 그리고 BIRC5 유전자를 표적으로 하는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 RiboSlice AAV (＂RiboSlice＂, n=2)로 종양내 주사를 통하여 처리된 하나의 집단을 포함한다. GFP 집단의 경우 1일차 시점에 동물에게 투여되었으며, 그리고 RiboSlice 집단의 경우는 1일차와 15일차에 투여되었다. 동물은 25일차까지 추적된다. 집단의 평균 체중 사이의 통계학적으로 유의적인 차이가 없다는 사실은 RiboSlice AVV의 생체내 안전성을 설명한다.
도 13b는 도 13a에서 나타낸 연구에서 동물의 표준화된 종양 용적을 나타낸다. NTC 및 GFP 집단 모두와 비교하였을 때, RiboSlice AAV로 처리된 집단에서 표준화된 종양 용적의 느린 증가는 RiboSlice AAV의 생체내 효과를 설명한다.
도 14는 도 12b에서와 같이 유전자-에디팅 단백질의 효과를 테스트하는 SURVEYOR 분석 결과를 나타낸다. ＂RiboSlice＂는 유전자-에디팅 단백질을 말하며, 이때 모든 다른 반복 서열의 길이는 36개 아미노산이다. ＂w.t.＂는 트랜스펙션안된 세포들을 말한다.
도 15는 아데노신, 50% 구아노신, 50% 7-데자구아노신, 60% 우리딘, 40% 5-메틸우리딘, 그리고 5-메틸시티딘이 포함된, 표시된 단백질을 인코드하는 RNA를 나타내는데, 변성 포름알데히드-아가로즈 겔상에서 해리된 것이다.
도 16은 APP 유전자로 복구 주형(repair template)의 통합을 테스트하는 분석 결과를 나타낸다. RNA와 복구 주형으로 트랜스펙션된 세포들로부터 생성된 시료내 562bp와 385bp 밴드의 출현은 PstI 제한 부위(restriction site)의 성공적인 통합을 나타낸다. ＂-＂ 는 절단안된 시료를 나타내며, ＂+＂는 PstI 제한 뉴클라아제로 처리된 시료를 나타낸다.
정의
＂분자＂란 분자 본질(entity)(분자, 이온, 복합체 등)을 의미한다.
＂RNA 분자＂는 RNA를 포함하는 분자를 말한다.
＂합성 RNA 분자＂는 생물공학을 이용하여 세포 외부에서 생성된 또는 세포 안에서 생성된 RNA 분자를 말하는데, 비-제한적 예로써, 시험관-전사 반응에서 생성된 RNA 분자, 직접적 화학 합성에 의해 생성된 RNA 분자 또는 유전적으로-조작된 대장균(E.coli) 세포에서 생산된 RNA 분자들이 있다.
＂트랜스펙션＂이란 세포에 분자를 접촉시킨다는 의미이며, 이때 이 분자는 이 세포에 의해 내화된다.
＂트랜스펙션 당시＂란 트랜스펙션하는 동안 또는 그 이후를 말한다.
＂트랜스펙션 시약＂이란 분자와 연합되어 분자를 세포로 전달을 용이하게 하거나 또는 이 세포에 의해 분자가 내화되게 하는 물질 또는 물질의 혼합물을 말하는데, 비-제한적 예로써, 양이온 지질, 하전된 폴리머 또는 세포-침투 펩티드가 있다.
＂시약-기반 트랜스펙션＂란 트랜스펙션 시약을 이용한 트랜스펙션을 말한다.
＂세포-배양 배지＂란 세포 배양에 이용될 수 있는 배지를 말하며, 비-제한적 예로써, Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM) 또는 DMEM + 10% 태아 소 혈청(FBS)이 있다.
＂복합(complexation) 배지＂란 트랜스펙션 시약과 트랜스펙션되는 분자가 첨가된 배지를 말하며, 이때 트랜스펙션 시약은 트랜스펙션되는 분자에 연합된다.
＂트랜스펙션 배지＂란 트랜스펙션에 이용되는 배지를 말하며, 비-제한적 예로써, Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM) 또는 DMEM/F12가 있다.
＂재조합 단백질＂이란 동물 또는 인간에서 생산되지 않는 단백질 또는 펩티드를 말한다. 비-제한적 예로는 박테리아에서 생산되는 인간 트란스페린(transferrin), 마우스 세포들의 시험관 배양에서 생성되는 인간 피브로넥틴(fibronectin), 그리고 식물의 쌀에서 생산되는 인간 혈청 알부민이 포함된다.
＂지질 운반체＂란 수성 용액에서 지질 또는 지질-가용성 분자의 용해도를 증가시킬 수 있는 물질을 말하며, 비-제한적 예로써, 인간 혈청 알부민 또는 메틸-베타-시클로덱스트린이 있다.
＂Oct4 단백질＂이란 POU5F1 유전자에 의해 인코드된 단백질, 또는 천연 또는 조작된 변종, 패밀리-멤버, 상동분자종(orthologue), 이의 단편 또는 융합 구조물을 말하며, 비-제한적 예로써, 인간 Oct4 단백질 (서열 번호: 8), 마우스 Oct4 단백질, Oct1 단백질, POU5F1 슈도유전자 2에 의해 인코드된 단백질, Oct4 단백질의 DNA-결합 도메인 또는 Oct4-GFP 융합 단백질이 있다. 일부 구체예들에 있어서 Oct4 단백질은 서열 번호: 8과 최소한 70% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함하며, 또는 다른 구체예들에 있어서, 서열 번호: 8과 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Oct4 단백질은 서열 번호: 8에 대하여 1 내지 20개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환 (집합적으로)을 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 또는 다른 구체예들에 있어서, Oct4 단백질은 서열 번호: 8에 대하여 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환 (집합적으로)을 보유한 아미노산 서열을 포함한다.
＂Sox2 단백질＂이란 SOX2 유전자에 의해 인코드된 단백질, 또는 천연 또는 조작된 변종, 패밀리-멤버, 상동분자종, 이의 단편 또는 융합 구조물을 의미하며, 비-제한적 예로써, 인간 Sox2 단백질 (서열 번호: 9), 마우스 Sox2 단백질, Sox2 단백질의 DNA-결합 도메인 또는 Sox2-GFP 융합 단백질이 있다. 일부 구체예들에 있어서 Sox2 단백질은 서열 번호: 9와 최소한 70% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함하며, 또는 다른 구체예들에 있어서, 서열 번호: 9와 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Sox2 단백질은 서열 번호: 9에 대하여 1 내지 20개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환 (집합적으로)을 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 또는 다른 구체예들에 있어서, Sox2 단백질은 서열 번호: 9에 대하여 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환 (집합적으로)을 보유한 아미노산 서열을 포함한다.
＂Klf4 단백질＂은 KLF4 유전자에 의해 인코드된 단백질, 또는 천연 또는 조작된 변종, 패밀리-멤버, 상동분자종, 이의 단편 또는 융합 구조물을 말하며, 비-제한적 예로써, 인간 Klf4 단백질 (서열 번호: 10), 마우스 Klf4 단백질, Klf4 단백질의 DNA-결합 도메인 또는 Klf4-GFP 융합 단백질이 있다. 일부 구체예들에 있어서 Klf4 단백질은 서열 번호: 10과 최소한 70% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함하며, 또는 다른 구체예들에 있어서, 서열 번호: 10과 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Klf4 단백질은 서열 번호: 10에 대하여 1 내지 20개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환 (집합적으로)을 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 또는 다른 구체예들에 있어서, Klf4 단백질은 서열 번호: 10에 대하여 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환 (집합적으로)을 보유한 아미노산 서열을 포함한다.
＂c-Myc 단백질＂이란 MYC 유전자에 의해 인코드되는 단백질, 또는 천연 또는 조작된 변종, 패밀리-멤버, 상동분자종, 이의 단편 또는 융합 구조물을 말하며, 비-제한적 예로써, 인간 c-Myc 단백질 (서열 번호: 11), 마우스 c-Myc 단백질, l-Myc 단백질, c-Myc (T58A) 단백질, c-Myc 단백질의 DNA-결합 도메인또는 c-Myc-GFP 융합 단백질이 있다. 일부 구체예들에 있어서 c-Myc 단백질은 서열 번호: 11과 최소한 70% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함하며, 또는 다른 구체예들에 있어서, 서열 번호: 11과 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, c-Myc 단백질은 서열 번호: 11에 대하여 1 내지 20개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환 (집합적으로)을 보유한 아미노산 서열을 포함한다. 또는 다른 구체예들에 있어서, c-Myc 단백질은 서열 번호: 11에 대하여 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결손, 또는 치환 (집합적으로)을 보유한 아미노산 서열을 포함한다.
＂재프로그래밍＂이란 세포의 표현형의 변화를 야기시킨다는 의미로써, 비-제한적 예로써, β-세포 선조세포가 성숙한 β-세포로 분화되도록 하고, 섬유아세포가 다능성 줄기 세포로 탈분화되도록 하고, 각질세포가 심장 줄기 세포로 전이분화되도록 하거나 또는 뉴우런의 엑손이 정상되도록 하는 것을 말한다.
＂재프로그래밍 인자＂란 세포가 분자와 접촉될 때 및/또는 세포가 분자를 발현시킬 때, 분자가 단독으로 또는 다른 분자들과 복합되어, 비-제한적 예로써, Oct4 단백질의 재프로그래밍을 야기시키는 분자를 말한다.
＂피더(feeder)＂란 조건 배지에 이용되는 세포 또는 배양에서 다른 세포들의 성장을 지원하는 세포를 의미한다.
＂조건화(conditioning)＂란 하나 또는 그 이상의 피더를 배지에 접촉시키는 것을 말한다.
＂지방산＂이란 최소한 2개 탄소의 지방족 쇄를 포함하는 분자를 말하며, 비-제한적 예로써, 리놀레산, α-리놀렌산, 옥탄산, 류코트리엔, 프로스타글란딘, 콜레스테롤, 글루코코르티코이드, 레졸빈, 프로텍틴, 트롬복산, 리포신(lipoxin), 마레신(maresin), 스핑고리피드, 트립토판, N-아세틸 트립토판 또는 이의 염, 메틸 에스테르 또는 유도체가 있다.
＂단쇄(short-chain) 지방산＂은 2개 내지 30개 탄소 원자 사이의 지방쇄가 포함된 지방산을 말한다.
＂알부민＂이란 물에 상당히 잘 용해되는 단백질, 비-제한적 예로써, 인간 혈청 알부민을 말한다.
＂연합된(associated) 분자＂란 또다른 분자에 비-공유적으로 결합된 분자를 말한다.
＂알부민의 연합된-분자-성분＂이란 알부민 폴리펩티드에 결합된 하나 또는 그 이상의 분자들, 비-제한적 예로써, 알부민 폴리펩티드에 결합된 지질, 호르몬, 콜레스테롤, 칼슘 이온을 의미한다.
＂처리된(treated) 알부민＂이란 알부민의 연합된 분자 성분을 감소, 제거, 대체 또는 그렇지 않으면 비활성화시키기 위하여 처리된 알부민을 말하는데, 비-제한적 예로써, 상승된 온도에서 항온처리된 인간 혈청 알부민, 옥타노에이트 나트륨과 접촉된 인간 혈청 알부민 또는 다공성 물질과 접촉된 인간 혈청 알부문이 있다.
＂이온-교환 수지＂는 이온이 포함된 용액과 접촉되었을 때 하나 또는 그 이상의 이온을 하나 또는 그 이상의 상이한 이온으로 대체시킬 수 있는 물질을 의미하며, 비-제한적 예로써, 하나 또는 그 이상의 칼슘 이온을 하나 또는 그 이상의 나트륨 이온으로 대체시킬 수 있는 물질을 말한다.
＂생식 세포(germ cell)＂란 정자 세포 또는 난 세포를 말한다.
＂다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell)＂란 생체내에서 세 가지 모든 생식 층 (내배엽, 중배엽 그리고 외배엽)의 세포로 분화될 수 있는 세포를 말한다.
＂체세포(somatic cell)＂란 다능성 줄기 세포 또는 생식 세포가 아닌 세포, 비-제한적 예로써, 피부 세포를 말한다.
＂포도당-반응성 인슐린-생산 세포＂란 특정 농도의 포도당에 노출될 때, 인슐린을 생산 및/또는 분비할 수 있는 세포를 말하며, 이때 생산되는 인슐인의 양은 상이한 농도의 포도당에 노출되었을 때 세포 비-제한적 예로써, β-세포가 생산 및/또는 분비하는 인슐린의 양과는 상이하다(더 적거나 또는 더 많다).
＂조혈(hematopoietic) 세포＂란 혈액 세포 또는 혈액 세포로 분화될 수 있는 세포, 비-제한적 예로써, 조혈 줄기 세포 또는 백혈구 세포를 말한다.
＂심장 세포＂는 심장 세포 또는 심장 세포로 분화될 수 있는 세포, 비-제한적 예로써, 심장 줄기 세포 또는 심근세포를 말한다.
＂망막 세포＂는 망막 세포 또는 망막 세포로 분화될 수 있는 세포, 비-제한적 예로써, 망악 색소침착된 상피 세포를 말한다.
＂피부 세포＂는 피부에서 정상적으로 발견되는 세포를 말하는데, 비-제한적 예로써, 섬유아세포, 각질세포, 멜라닌세포, 지방세포, 간엽(mesenchymal) 줄기 세포, 지방 줄기 세포 또는 혈액 세포를 말한다.
＂Wnt 신호생성 항진제(signaling agonist)＂란 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질 패밀리 구성원, 비-제한적 예로써, Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a 또는 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘의 생물학적 기능중 하나 이상을 실행시킬 수 있는 분자를 말한다.
＂IL-6 신호생성 항진제＂란 IL-6 단백질, 비-제한적 예로써, IL-6 단백질 또는 IL-6 수용체 (가용성 IL-6 수용체, IL-6R, IL-6R 알파, 등으로도 알려짐)의 생물학적 기능중 하나 이상을 실행시킬 수 있는 분자를 말한다.
＂TGF-β 신호생성 항진제＂란 TGF-β 단백질의 슈퍼패밀리(superfamily)의 하나 또는 그 이상의 구성원, 비-제한적 예로써, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈(Activin) A, BMP-4 또는 Nodal의 생물학적 기능중 하나 이상을 실행시킬 수 있는 분자를 말한다.
＂면역억제제(immunosuppressant)＂란 면역계의 하나 또는 그 이상의 측면을 억제하고, 포유류에서 정상적으로 존재하지 않는 물질, 비-제한적 예로써, B18R 또는 덱사메타손을 말한다.
＂단일-가닥 브레이크＂란 뉴클레오티드를 연계시키는 하나 또는 그 이상의 공유 결합이 한 가닥 또는 두 가닥중 하나에서 파괴되어 있는, 단일-가닥으로 된 또는 이중-가닥으로 된 DNA의 영역을 말한다.
＂이중-가닥 브레이크＂란 뉴클레오티드를 연계시키는 하나 또는 그 이상의 공유 결합이 두 가닥 각각에서 파괴되어 있는, 이중-가닥으로 된 DNA의 영역을 말한다.
＂뉴클레오티드＂란 뉴클레오티드 또는 이의 단편 또는 유도체, 비-제한적 예로써, 핵염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드-삼인산염, 등을 의미한다.
＂뉴클레오시드＂란 뉴클레오티드 또는 이의 단편 또는 유도체, 비-제한적 예로써, 핵염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드-삼인산염, 등을 의미한다.
＂유전자 에디팅＂이란 비-제한적 예로써, 세포의 DNA에서 돌연변이를 야기시키는 단백질로 세포를 트렌스펙션시켜, DNA 서열을 변경시키는 것을 말한다.
＂유전자-에디팅 단백질＂이란 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들과 복합되어, 세포의 DNA 서열을 변경시키는 단백질을 말하는데, 비-제한적 예로써, 뉴클라아제, 전사 활성물질-유사 효과물질 뉴클라아제 (TALEN), 아연-핑거 뉴클라아제, 메가뉴클라아제, 니카제(nickase), 군집화된 규칙적으로 공간을 두고 있는 짧은 팔린드롬 반복부 (CRISPR)-연합된 단백질 또는 천연 또는 조작된 변종, 패밀리-멤버, 상동분자종, 이의 단편 또는 융합 구조물이 있다.
＂복구 주형(repair template)＂이란 유전자-에디팅 단백질의 표적 부위 10kb내에 있는 서열과 최소한 약 70% 상동성 영역이 포함된 핵산을 말한다.
＂반복 서열＂이란 단백질 안에 최소한 약 10% 상동성 범위내에서 하나 이상의 사본으로 존재하는 아미노산 서열을 말하는데, 비-제한적 예로써, 전사 활성물질-유사 효과물질(transcription activator-like effector)의 모노머 반복이 있다.
＂DNA-결합 도메인＂이란 DNA 분자에 결합할 수 있는 분자의 영역을 말하는데, 비-제한적 예로써, 하나 또는 그 이상의 아연 핑거가 포함된 단백질 도메인, 하나 또는 그 이상의 전사 활성물질-유사 (TAL) 효과물질 반복 서열들이 포함된 단백질 도메인 또는 DNA 분자에 결합할 수 있는 소 분자의 결합 포켓이 있다.
＂결합 부위＂란 유전자-에디팅 단백질, DNA-결합 단백질, DNA-결합 도메인 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 변종에 의해 인지될 수 있는 핵산 서열, 또는 유전자-에디팅 단백질, DNA-결합 단백질, DNA-결합 도메인 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 변종이 높은 친화성을 가진 핵산 서열을 말하며, 비-제한적 예로써, 인간 BIRC5 유전자의 엑손 1에 있는 약 20개 염기 쌍 서열이 있다.
＂표적＂이란 결합 부위가 포함된 핵산을 말한다.
다른 정의는 U.S. 출원 번호. 13/465,490, U.S. 가출원 번호. 61/664,494, U.S. 가출원 번호. 61/721,302, 국제 출원 번호. PCT/US12/67966, U.S. 가출원 번호. 61/785,404, 및 U.S. 가출원 번호. 61/842,874에서 제시되며, 이의 내용은 이들 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
5-메틸시티딘 탈-메틸화 경로의 비-정규 뉴클레오티드 구성원들이 합성 RNA에 통합될 때, 이들 구성원은 합성 RNA가 단백질로 해독될 수 있는 효율을 증가시킬 수 있고, 합성 RNA의 독성을 감소시킬 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 이들 비-정규 뉴클레오티드는 예를 들면: 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 5-포르밀시티딘, 그리고 5-카르복시시티딘 (＂시티딘-5-카르복실산＂로도 알려짐)을 포함한다. 따라서, 특정 구체예들은 핵산에 관한것이다. 한 구체예에 있어서, 이 핵산은 합성 RNA 분자다. 또다른 구체예에 있어서, 이 핵산은 하나 또는 그 이상의 비-정규 뉴클레오티드를 포함한다. 한 구체예에 있어서, 이 핵산은 5-메틸시티딘 탈-메틸화 경로의 하나 또는 그 이상의 비-정규 뉴클레오티드를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 이 핵산은 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 5-포르밀시티딘, 그리고 5-카르복시시티딘 또는 유도체중 최소한 하나를 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 이 핵산은 슈도우리딘, 5-메틸슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, N4-메틸시티딘, N4-아세틸시티딘, 및 7-데자구아노신 또는 이의 유도체 중 최소한 하나를 포함한다.
5-메틸시티딘 탈-메틸화 경로
Figure pat00001
특정 구체예들은 단백질에 관한 것이다. 다른 구체예들은 단백질을 인코드하는 핵산에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 이 단백질이 관심 단백질이다. 또다른 구체예에 있어서, 이 단백질은 재프로그래밍 단백질과 유전자-에디팅 단백질로부터 선택된다. 한 구체예에 있어서, 이 핵산은 플라스미드다. 또다른 구체예에 있어서, 이 핵산은 바이러스 또는 바이러스성 벡터에 존재한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 바이러스 또는 바이러스성 벡터는 복제 불능(incompetent)이다. 추가 구체예에 있어서, 상기 바이러스 또는 바이러스성 벡터는 복제 가능(competent)하다. 한 구체예에 있어서, 상기 바이러스 또는 바이러스성 벡터는 다음중 최소한 하나를 포함한다: 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-연합된 바이러스 또는 이의 천연 또는 조작된 변종, 그리고 조작된 바이러스.
비-정규 뉴클레오티드의 특정 조합, 예를 들면, 5-메틸우리딘과 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘과 7-데자구아노신, 5-메틸시티딘과 7-데자구아노신, 5-메틸우리딘, 5-메틸시티딘과 7-데자구아노신, 그리고 5-메틸우리딘, 5-히드록시메틸시티딘과 7-데자구아노신의 조합은 특히 합성 RNA가 단백질로 해독되는 효율의 증가, 그리고 합성 RNA의 독성의 감소에 특히 효과적일 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 따라서 특정 구체예들은 5-메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 그리고 7-데자구아노신 또는 하나 또는 그 이상의 이들 유도체중 최소한 2개를 포함하는 핵산에 관한 것이다. 다른 구체예들은 5-메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 그리고 7-데자구아노신 또는 하나 또는 그 이상의 이들 유도체중 최소한 3개가 포함된 핵산에 관한 것이다. 다른 구체예들은 5-메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 그리고 7-데자구아노신 또는 하나 또는 그 이상의 이들 유도체가 모두 포함된 핵산에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 이 핵산은 하나 또는 그 이상의 5-메틸우리딘 잔기들(residues), 하나 또는 그 이상의 5-메틸시티딘 잔기들, 그리고 하나 또는 그 이상의 7-데자구아노신 잔기들 또는 하나 또는 그 이상의 5-메틸우리딘 잔기들, 하나 또는 그 이상의 5-히드록시메틸시티딘 잔기들, 그리고 하나 또는 그 이상의 7-데자구아노신 잔기들을 포함한다.
특정 비-정규 뉴클레오티드 및 이의 조합들의 특정 분획들이 포함된 합성 RNA 분자들은 특히 높은 해독 효율과 낮은 독성을 나타낼 수 있는 것으로 추가 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 하나 또는 그 이상의 우리딘 잔기들, 하나 또는 그 이상의 시티딘 잔기들, 그리고 하나 또는 그 이상의 구아노신 잔기들중 최소한 하나가 포함된 핵산, 그리고 하나 또는 그 이상의 비-정규 뉴클레오티드가 포함된 핵산에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 우리딜 잔기의 약 20% 내지 약 80%는 5-메틸우리딘 잔기들이다. 또다른 구체예에 있어서, 우리딜 잔기의 약 30% 내지 약 50%는 5-메틸우리딘 잔기들이다. 추가 구체예에 있어서, 우리딜 잔기의 약 40%는 5-메틸우리딘 잔기들이다. 한 구체예에 있어서, 시티딘 잔기들의 약 60% 내지 약 80%는 5-메틸시티딘 잔기들이다. 또다른 구체예에 있어서, 시티딘 잔기들의 약 80% 내지 약 100%는 5-메틸시티딘 잔기들이다. 추가 구체예에 있어서, 시티딘 잔기들의 약 100%는 5-메틸시티딘 잔기들이다. 추가 구체예에 있어서, 시티딘 잔기들의 약 20% 내지 약 100%는 5-히드록시메틸시티딘 잔기들이다. 한 구체예에 있어서, 구아노신 잔기들의 약 20% 내지 약 80%는 7-데자구아노신 잔기들이다. 또다른 구체예에 있어서, 구아노신 잔기들의 약 40% 내지 약 60%는 7-데자구아노신 잔기들이다. 추가 구체예에 있어서, 구아노신 잔기들의 약 50%는 7-데자구아노신 잔기들이다. 한 구체예에 있어서, 시티딘 잔기들의 약 20% 내지 약 80% 또는 약 30% 내지 약 60% 또는 약 40%는 N4-메틸시티딘 및/또는 N4-아세틸시티딘 잔기들이다. 또다른 구체예에 있어서, 각 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘 잔기다. 추가 구체예에 있어서, 시티딘 잔기들의 약 100%는 5-메틸시티딘 잔기들 및/또는 5-히드록시메틸시티딘 잔기들 및/또는 N4-메틸시티딘 잔기들 및/또는 N4-아세틸시티딘 잔기들 및/또는 하나 또는 그 이상의 이들 유도체다. 추가 구체예에 있어서, 우리딘 잔기들의 약 40%는 5-메틸우리딘 잔기들이며, 시티딘 잔기들의 약 20% 내지 약 100%는 N4-메틸시티딘 및/또는 N4-아세틸시티딘 잔기들이며, 그리고 구아노신 잔기들의 약 50%는 7-데자구아노신 잔기들이다. 한 구체예에 있어서, 우리딜 잔기의 약 40%는 5-메틸우리딘 잔기들이며, 그리고 시티딘 잔기들의 약 100%는 5-메틸시티딘 잔기들이다. 또다른 구체예에 있어서, 우리딘 잔기들의 약 40%는 5-메틸우리딘 잔기들이며, 그리고 구아노신 잔기들의 약 50%는 7-데자구아노신 잔기들이다. 추가 구체예에 있어서, 시티딘 잔기들의 약 100%는 5-메틸시티딘 잔기들이며, 그리고 구아노신 잔기들의 약 50%는 7-데자구아노신 잔기들이다. 한 구체예에 있어서, 우리딘 잔기들의 약 40%는 5-메틸우리딘 잔기들이며, 시티딘 잔기들의 약 100%는 5-메틸시티딘 잔기들이며, 그리고 구아노신 잔기들의 약 50%는 7-데자구아노신 잔기들이다. 또다른 구체예에 있어서, 우리딘 잔기들의 약 40%는 5-메틸우리딘 잔기들이며, 시티딘 잔기들의 약 20% 내지 약 100%는 5-히드록시메틸시티딘 잔기들이며, 그리고 구아노신 잔기들의 약 50%는 7-데자구아노신 잔기들이다. 일부 구체예들에 있어서, 시티딘 잔기들의 100% 미만은 5-메틸시티딘 잔기들이다. 다른 구체예들에 있어서, 시티딘 잔기들의 100% 미만은 5-히드록시메틸시티딘 잔기들이다. 한 구체예에 있어서, 합성 RNA 분자에서 각 우리딘 잔기는 슈도우리딘 잔기 또는 5-메틸슈도우리딘 잔기다. 또다른 구체예에 있어서, 우리딘 잔기들의 약 100%는 슈도우리딘 잔기들 및/또는 5-메틸슈도우리딘 잔기들이다. 추가 구체예에 있어서, 우리딘 잔기들의 약 100%는 슈도우리딘 잔기들 및/또는 5-메틸슈도우리딘 잔기들이며, 시티딘 잔기들의 약 100%는 5-메틸시티딘 잔기들이며, 그리고 구아노신 잔기들의 약 50%는 7-데자구아노신 잔기들이다.
5-메틸우리딘을 대신하여 또는 이와 조합에 이용될 수 있다는 다른 비-정규 뉴클레오티드는 슈도우리딘과 5-메틸슈도우리딘 (별칭으로 ＂1-메틸슈도우리딘＂, 별칭으로 ＂N1-메틸슈도우리딘＂) 또는 하나 또는 그 이상의 이들 유도체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 5-메틸시티딘 및/또는 5-히드록시메틸시티딘을 대신하여 또는 이와 조합에 이용될 수 있다는 다른 비-정규 뉴클레오티드는 슈도이소시티딘, 5-메틸슈도이소시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 5-포르밀시티딘, 5-카르복시시티딘, N4-메틸시티딘, N4-아세틸시티딘 또는 하나 또는 그 이상의 이들 유도체가 이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에 있어서, 예를 들면, 한 번의 트랜스펙션만 실행될 때 또는 트랜스펙션되는 세포가 트랜스펙션-연합된 독성 또는 선천적-면역 신호생성에 특별히 민감하지 않을 때,비-정규 뉴클레오티드의 분획이 감소될 수 있다. 비-정규 뉴클레오티드의 분획 감소는 비-정규 뉴클레오티드의 분획 감소가 핵산 비용을 감소시킬 수 있기 때문에 부분적으로 유익할 수 있다. 특정 상황에 있어서, 예를 들면, 이 핵산의 최소 면역원성이 바람직할 경우, 비-정규 뉴클레오티드의 분획이 증가될 수 있다.
T7 RNA 중합효소와 같은 효소들은 정규 뉴클레오티드와 비-정규 뉴클레오티드 모두가 포함된 시험관-전사 반응에서 정규 뉴클레오티드에 선호적으로 혼입될 수 있다. 그 결과, 비-정규 뉴클레오티드의 특정 분획이 포함된 시험관-전사 반응은 반응에서 비-정규 뉴클레오티드가 존재하는 분획보다 대개 더 낮은, 상이한 비-정규 뉴클레오티드가 포함된 RNA를 생산할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들에 있어서, 비록 이러한 반응이 반응에서 비-정규 뉴클레오티드가 존재하는 분획과 상이한 비-정규 뉴클레오티드가 포함된 핵산을 생산할 수 있지만, 뉴클레오티드 혼입 분획 (예를 들면, ＂50% 5-메틸우리딘＂)에 대한 언급은 뉴클레오티드의 언급된 분획이 포함된 핵산과, 뉴클레오티드의 언급된 분획이 포함된 반응에서 합성된 핵산 (또는 뉴클레오티드 유도체, 예를 들면, 뉴클레오티드-삼인산염)을 모두 지칭할 수 있다. 또한, 상이한 뉴클레오티드 서열들은 대체(alternative) 코돈을 이용하여 동일한 단백질을 인코드할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들에 있어서, 뉴클레오티드 혼입 분획에 대한 언급은 뉴클레오티드의 언급된 분획이 포함된 핵산과, 상이한 핵산으로써 동일한 단백질을 인코드하는 핵산을 모두 지칭할 수 있으며, 이때 상이한 핵산은 뉴클레오티드의 언급된 분획을 포함한다.
세포의 DNA 서열은 세포에 유전자-에디팅 단백질을 접촉시킴으로써 또는 이 세포가 유전자-에디팅 단백질을 발현시키도록 유도함으로써, 변경될 수 있다. 그러나, 기존의 공개된 유전자-에디팅 단백질은 낮은 결합 효율과 과도한 비적중 활성으로 곤란을 겪었으며, 이러한 것들은 세포의 DNA에 바람직하지 못한 돌연변이를 도입시킬 수 있고, 이때 환자의 세포에서 바람직하지 못한 돌연변이는 암의 발달로 이어질 수 있어, 치료용도에서 이들의 이용이 심각하게 제한된다. StsI 엔도뉴클레아제 절단 도메인 (서열 번호: 1)을 포함하는 유전자-에디팅 단백질은 적중(on-target) 활성이 높으면서도, 기존의 공개된 유전자-에디팅 단백질보다 실질적으로 더 낮은 비적중 활성을 나타낼 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 다른 신규한 조작된 단백질은 유전자-에디팅 단백질: StsI-HA (서열 번호: 2), StsI-HA2 (서열 번호: 3), StsI-UHA (서열 번호: 4), StsI-UHA2 (서열 번호: 5), StsI-HF (서열 번호: 6), 그리고 StsI-UHF (서열 번호: 7)로 이용될 때 높은 적중 활성, 낮은 비적중 활성, 작은 크기, 용해도 및 다른 바람직한 특징들을 나타낼 수 있는 것으로 밝혀졌다. StsI-HA, StsI-HA2 (높은 활성), StsI-UHA, 그리고 StsI-UHA2 (상당히-높은 활성)는 위치 34와 61에서 N-말단 영역내 특이적 아미노산 치환에 의해 부분적으로 기인하여 야생형 StsI 및 야생형 FokI 둘 모두보다 더 높은 적중 활성을 나타낼 수 있으며, 한편 StsI-HF (높은 충실성)와 StsI-UHF (상당히-높은 충실성)는 위치 141과 152에서 C-말단 영역내 특이적 아미노산 치환에 의해 부분적으로 기인하여 야생형 StsI 및 야생형 FokI 둘 모두보다 더 낮은 비적중 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 뉴클라아제 도메인이 포함된 단백질에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 뉴클라아제 도메인은 FokI 엔도뉴클레아제의 절단 도메인 (서열 번호: 53), StsI 엔도뉴클레아제의 절단 도메인(서열 번호: 1), StsI-HA (서열 번호: 2), StsI-HA2 (서열 번호: 3), StsI-UHA (서열 번호: 4), StsI-UHA2 (서열 번호: 5), StsI-HF (서열 번호: 6), 그리고 StsI-UHF (서열 번호: 7) 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변종중 하나 또는 그 이상을 포함한다.
특정 신규한 반복 서열들이 포함된 DNA-결합 도메인들이 포함된 조작된 유전자-에디팅 단백질은 높은 수준의 적중 활성을 유지하면서, 기존의 공개된 유전자-에디팅 단백질보다 더 낮은 비적중 활성을 나타낼 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 이들 조작된 특정 유전자-에디팅 단백질은 기존의 공개된 유전자-에디팅 단백질보다 몇 가지 장점을 제공할 수 있는데, 예를 들면, 반복 서열들을 연결시키는 연결 영역의 유연성, 이는 결합 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 다수의 반복 서열들이 포함된 단백질에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 반복 서열들은 아미노산 서열: GabG을 포함하며, 여기에서 ＂a＂와 ＂b＂ 각각은 임의의 아미노산을 나타낸다. 한 구체예에 있어서, 이 단백질은 유전자-에디팅 단백질이다. 또다른 구체예에 있어서, 반복 서열들중 하나 또는 그 이상은 DNA-결합 도메인 안에 존재한다. 추가 구체예에 있어서, ＂a＂와 ＂b＂는 각각 독립적으로 H와 G 군에서 선택된다. 추가 구체예에 있어서, ＂a＂와 ＂b＂는 차례로 H와 G다. 한 구체예에 있어서, 이 아미노산 서열은 반복 서열의 C-말단의 약 5개 아미노산 이내에 존재한다. 또다른 구체예에 있어서, 이 아미노산 서열은 반복 서열의 C-말단에 존재한다. 일부 구체예들에 있어서, 아미노산 서열 GabG에서 하나 또는 그 이상의 G는 G 이외의 하나 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들면 A, H 또는 GG으로 대체된다. 한 구체예에 있어서, 이 반복 서열의 길이는 약 32개 내지 약 40개 아미노산 또는 약 33개 내지 약 39개 아미노산 또는 약 34개 내지 38개 아미노산 또는 약 35개 내지 약 37개 아미노산 또는 약 36개 아미노산 또는 약 32개 이상의 아미노산 또는 약 33개 이상의 아미노산 또는 약 34개 이상의 아미노산 또는 약 35개 이상의 아미노산이다. 다른 구체예들은 하나 또는 그 이상의 전사 활성물질-유사 효과물질 도메인들이 포함된 단백질에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 전사 활성물질-유사 효과물질 도메인들의 최소한 하나는 반복 서열을 포함한다. 다른 구체예들은 전사 활성물질-유사 효과물질 도메인의 반복 서열중 최소한 2개 사이에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 삽입시켜 생성된 다수의 반복 서열이 포함된 단백질에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산은 최소한 하나의 반복 서열의 C-말단으로부터 약 1개 또는 약 2개 또는 약 3개 또는 약 4개 또는 약 5개 아미노산이 삽입된다. 여전히 다른 구체예들은 다수의 반복 서열이 포함된 단백질에 관한 것이며, 이때 대략 모든 다른 반복 서열은 해당 반복 서열의 바로 전 또는 바로 그 다음의 반복 서열과 상이한 길이를 가진다. 한 구체예에 있어서, 모든 다른 반복 서열은 약 36개 아미노산 길이를 가진다. 또다른 구체예에 있어서, 모든 다른 반복 서열은 36개 아미노산 길이를 가진다. 여전히 다른 구체예들은 다수의 반복 서열들이 포함된 단백질에 관한 것이며, 이때 다수의 반복 서열들은 각각 최소한 36개 아미노산 길이를 가진 최소한 2개의 반복 서열을 포함하며, 그리고 최소한 36개 아미노산 길이를 가진 반복 서열의 최소한 2개는 길이가 36개 미만인 최소한 하나의 반복 서열에 의해 분리되어 있다. 일부 구체예들은 예를 들면, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 그리고 서열 번호: 60에서 선택된 하나 또는 그 이상의 서열을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
다른 구체예들은 DNA-결합 도메인이 포함된 단백질에 관한 것이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 DNA-결합 도메인은 다수의 반복 서열들을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 다수의 반복 서열들은 표적 DNA 분자내 결합 부위를 높은 특이성으로 인지할 수 있다. 또다른 구체예에 있어서, 반복 서열중 최소한 2개는 서로 최소한 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 상동성을 가진다. 추가 구체예에 있어서, 반복 서열중 최소한 하나는 표적 DNA 분자내 결합 부위에 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 영역을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 결합 부위는 약 1개 내지 약 5개 염기 길이의 특정된 서열을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 DNA-결합 도메인은 아연 핑거를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 DNA-결합 도메인은 전사 활성물질-유사 효과물질 (TALE)을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 다수의 반복 서열들은 TALE에 대해 최소한 약 50% 또는 약 60% 또는 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90% 또는 약 95% 또는 약 98%, 또는 약 99% 상동성을 가진 최소한 한개의 반복 서열을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 군집화된 규칙적으로 공간을 두고 있는 짧은 팔린드롬 반복 (CRISPR)-연합된 단백질을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 핵-국소화(nuclear-localization) 서열을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 핵-국소화 서열은 아미노산 서열: PKKKRKV을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 미토콘드리아-국소화(mitochondrial-localization) 서열을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 미토콘드리아-국소화 서열은 아미노산 서열: LGRVIPRKIASRASLM을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 링커(linker)를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 링커는 DNA-결합 도메인을 뉴클라아제 도메인에 연결시킨다. 추가 구체예에 있어서, 상기 링커는 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 길이를 가진다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 링커는 약 1개, 약 2개, 또는 약 3개, 또는 약 4개, 또는 약 5개, 또는 약 6개, 또는 약 7개, 또는 약 8개, 또는 약 9개, 또는 약 10개 아미노산 길이를 가진다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 표적 DNA 분자에서 닉(nick) 또는 이중-가닥 브레이크를 생성시킬 수 있다.
특정 구체예들은 세포의 게놈을 변형시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 하나 또는 그 이상의 반복 단위 36개 아미노산 길이의 인위적인 전사 활성물질-유사 (TAL) 효과물질 반복 도메인과 엔도뉴클레아제 도메인이 포함된 비-자연적으로 생성되는 융합 단백질이 인코딩된 핵산 분자를 세포 안으로 도입시키는 것을 포함하며, 이때 상기 반복 도메인은 사전결정된 뉴클레오티드 서열의 인지를 위하여 조작되며, 그리고 이때 상기 융합 단백질은 사전결정된 뉴클레오티드 서열을 인지한다. 한 구체예에 있어서, 이 세포는 진핵세포다. 또다른 구체예에 있어서, 이 세포는 동물 세포다. 추가 구체예에 있어서, 이 세포는 포유류 세포다. 추가 구체예에 있어서, 이 세포는 인간 세포다. 한 구체예에 있어서, 이 세포는 식물 세포다. 또다른 구체예에 있어서, 이 세포는 원핵 세포다. 일부 구체예들에 있어서, 이 융합 단백질은 세포의 핵산에서 엔도뉴클레오리틱 절단을 도입시키고, 이로 인하여 세포의 게놈이 변형된다.
다른 구체예들은 하나 또는 그 이상의 반복 단위 36개 아미노산 길이와 제한 엔도뉴클레아제 활성이 포함된 인위적인 전사 활성물질-유사 (TAL) 효과물질 반복 도메인이 포함된 비-자연적으로 생성되는 융합 단백질을 인코드하는 핵산 분자에 관계하는데, 이때 상기 반복 도메인은 사전결정된 뉴클레오티드 서열의 인지를 위하여 조작되며, 이 융합 단백질은 사전결정된 뉴클레오티드 서열을 인지한다. 한 구체예에 있어서, 상기 반복 단위는 단지 약 7개의 아미노산이 상이하다. 또다른 구체예에 있어서, 각 상기 반복 단위는 아미노산 서열: LTPXQVVAIAS을 포함하며 여기에서 X는 E 또는 Q일 수 있으며, 그리고 아미노산 서열: LTPXQVVAIAS는 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민 중 하나에 대한 인지를 결정하는 하나 또는 2개의 아미노산에 이어진다. 한 구체예에 있어서, 이 핵산은 약 1.5 내지 약 28.5개의 반복 단위를 인코드한다. 또다른 구체예에 있어서, 이 핵산은 약 11.5, 약 14.5, 약 17.5 또는 약 18.5개의 반복 단위를 인코드한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 사전결정된 뉴클레오티드 서열은 프로모터 영역이다. 일부 구체예들은 핵산 분자 또는 서열이 포함된 벡터에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 벡터는 바이러스성 벡터다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-연관된 바이러스 또는 이의 천연 또는 조작된 변종, 그리고 조작된 바이러스중 하나 또는 그 이상을 포함한다.
특정 구체예들은 사전결정된 뉴클레오티드 서열을 인지하는 제 1 영역과 엔도뉴클레아제 활성을 가진 제 2 영역이 포함된 비-자연적으로 생성되는 융합 단백질을 인코드하는 핵산 분자에 관계하는데, 이때 제 1 영역은 단지 7개 아미노산이 서로 상이한, 하나 또는 그 이상의 길이가 약 36개 아미노산의 반복 단위가 포함된 인위적인 TAL 효과물질 반복 도메인을 포함하고, 이때 상기 반복 도메인은 사전결정된 뉴클레오티드 서열의 인지를 위하여 조작된다. 한 구체예에 있어서, 제 1 영역은 아미노산 서열: LTPXQVVAIAS를 포함하고, 여기에서 X는 E 또는 Q일 수 있다. 또다른 구체예에 있어서, 인코드된 비-자연적으로 생성되는 융합 단백질의 아미노산 서열 LTPXQVVAIAS는 HD, NG, NS, NI, NN, 및 N에서 선택된 아미노산 서열 바로 다음에 이어진다. 추가 구체예에 있어서, 이 융합 단백질은 제한 엔도뉴클레아제 활성을 포함한다. 일부 구체예들은 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60에서 선택된 하나 또는 그 이상의 서열들을 포함하는 단백질을 인코드하는 핵산 분자에 관한 것이다.
한 구체예에 있어서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzHG을 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 N, H 또는 I이고, ＂y＂는 임의의 아미노산이거나 또는 아미노산이 아니며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQDHG, GGKQALETVQRLLPVLCQAHG, GKQALETVQRLLPVLCQDHG 또는 GKQALETVQRLLPVLCQAHG이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzHG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 N, H 또는 I이고, ＂y＂는 D, A, I, N, H, K, S, 및 G로부터 선택되며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQDHG, GGKQALETVQRLLPVLCQAHG, GKQALETVQRLLPVLCQDHG 또는 GKQALETVQRLLPVLCQAHG이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzHG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 N, H와 I이외의 임의의 아미노산이며, ＂y＂는 임의의 아미노산이거나 또는 아미노산이 아니며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQDHG, GGKQALETVQRLLPVLCQAHG, GKQALETVQRLLPVLCQDHG 또는 GKQALETVQRLLPVLCQAHG이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwIyzHG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂y＂는 G이외의 임의의 아미노산이며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQDHG, GGKQALETVQRLLPVLCQAHG, GKQALETVQRLLPVLCQDHG 또는 GKQALETVQRLLPVLCQAHG이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwIAzHG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQDHG, GGKQALETVQRLLPVLCQAHG, GKQALETVQRLLPVLCQDHG 또는 GKQALETVQRLLPVLCQAHG이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzHG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 S, T 또는 Q이며, ＂y＂는 임의의 아미노산이거나 또는 아미노산이 아니며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQDHG, GGKQALETVQRLLPVLCQAHG, GKQALETVQRLLPVLCQDHG 또는 GKQALETVQRLLPVLCQAHG이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzHG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 S, T 또는 Q이며, ＂y＂는 D, A, I, N, H, K, S, 및 G로부터 선택되며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQDHG, GGKQALETVQRLLPVLCQAHG, GKQALETVQRLLPVLCQDHG 또는 GKQALETVQRLLPVLCQAHG이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwx를 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, 그리고 ＂x＂는 S, T 또는 Q이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxy를 포함하며, 이때 ＂v＂는 D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 S, T 또는 Q이고, 그리고 ＂y＂는 D, A, I, N, H, K, S, 및 G로부터 선택된다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzGHGG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 N, H 또는 I이며, ＂y＂는 임의의 아미노산이거나 또는 아미노산이 아니며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD 또는 GKQALETVQRLLPVLCQA이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzGHGG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 N, H 또는 I이며, ＂y＂는 D, A, I, N, H, K, S, 및 G로부터 선택되며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD 또는 GKQALETVQRLLPVLCQA이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzGHGG를 포함하고, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이고, ＂x＂는 N, H 및 I이외의 임의의 아미노산이며, ＂y＂는 임의의 아미노산이거나 또는 아미노산이 아니며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD 또는 GKQALETVQRLLPVLCQA이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwIyzGHGG를 포함하며, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂y＂는 G이외의 임의의 아미노산이며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD 또는 GKQALETVQRLLPVLCQA이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwIAzGHGG를 포함하고, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이고, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD 또는 GKQALETVQRLLPVLCQA이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzGHGG를 포함하고, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 S, T 또는 Q이며, ＂y＂는 임의의 아미노산이거나 또는 아미노산이 아니며, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD 또는 GKQALETVQRLLPVLCQA이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxyzGHGG를 포함하고, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 S, T 또는 Q이고, ＂y＂는 D, A, I, N, H, K, S, 및 G로부터 선택되고, 그리고 ＂z＂는 GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD 또는 GKQALETVQRLLPVLCQA이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwx를 포함하고, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이며, ＂w＂는 S 또는 N이며, 그리고 ＂x＂는 S, T 또는 Q이다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 반복 서열은 LTPvQVVAIAwxy를 포함하며, 이때 ＂v＂는 Q, D 또는 E이고, ＂w＂는 S 또는 N이며, ＂x＂는 S, T 또는 Q이고, 그리고 ＂y＂는 D, A, I, N, H, K, S, 및 G로부터 선택된다.
N-말단에서 절두된 단편들, C-말단에서 절두된 단편들, 내부 결손을 보유한 단편들, 그리고 N-말단, C-말단, 및/또는 내부 결손이 복합된 단편들이 포함된 엔도뉴클레아제 절단 도메인의 특정 단편들은 온전한 엔도뉴클레아제 절단 도메인의 촉매 활성의 전부 또는 일부를 유지시킬 수 있다. 온전한 도메인의 촉매 활성의 일부 또는 전부를 유지시킬 수 있는지에 대한 결정은 예를 들면, 본 발명의 방법들에 따라 단편이 포함된 유전자-에디팅 단백질을 합성하고, 본 발명의 방법에 따라 상기 유전자-에디팅 단백질을 발현시킬 수 있도록 세포를 유도하고, 그리고 유전자 에디팅의 효율을 측정함으로써 실행될 수 있다. 이 방식에서, 유전자-에디팅 효율의 측정을 이용하여 온전한 엔도뉴클레아제 절단 도메인의 촉매 활성의 일부 또는 전부를 유지시킬 수 있는지를 확인할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 엔도뉴클레아제 절단 도메인의 생물학적 활성 단편에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 절단 도메인은 FokI, StsI, StsI-HA, StsI-HA2, StsI-UHA, StsI-UHA2, StsI-HF, 및 StsI-UHF 또는 천연 또는 조작된 이의 변종 또는 생물학적으로 활성 단편으로부터 선택된다.
N-말단에서 절두된 단편들, C-말단에서 절두된 단편들, 내부 결손을 보유한 단편들, 그리고 N-말단, C-말단, 및/또는 내부 결손이 복합된 단편들이 포함된, DNA-결합 도메인 또는 반복 서열의 특정 단편들은 온전한 DNA-결합 도메인 또는 반복 서열의 결합 활성의 일부 또는 전부를 유지시킬 수 있다. 온전한 반복 서열의 결합 활성의 일부 또는 전부를 유지시킬 수 있는 DNA-결합 도메인들 또는 반복 서열들 단편의 예로는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) TALE-유사 단백질 (RTLs)을 포함한다. 온전한 DNA-결합 도메인 또는 반복 서열의 결합 활성의 일부 또는 전부를 유지시킬 수 있는지에 대한 결정은 예를 들면, 본 발명의 방법들에 따라 단편이 포함된 유전자-에디팅 단백질을 합성하고, 본 발명의 방법에 따라 상기 유전자-에디팅 단백질을 발현시킬 수 있도록 세포를 유도하고, 그리고 유전자 에디팅의 효율을 측정함으로써 실행될 수 있다. 이 방식에서, 유전자-에디팅 효율의 측정을 이용하여 온전한 DNA-결합 도메인 또는 반복 서열의 결합 활성의 일부 또는 전부를 유지시킬 수 있는지를 확인할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 DNA-결합 도메인 또는 반복 서열의 생물학적으로 활성 단편에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 단편은 표적 DNA 분자내 결합 부위를 높은 특이성으로 인지할 수 있다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 단편은 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) TALE-유사 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 단편을 인코드하는 서열을 포함한다.
특정 구체예들은 핵산이 포함된 세포의 DNA 서열을 변경시키는 조성물에 관한 것이며, 이때 이 핵산은 유전자-에디팅 단백질을 인코드한다. 다른 구체예들은 핵산 혼합물이 포함된 세포의 DNA 서열을 변경시키는 조성물에 관한 것이며, 이때 상기 핵산 혼합물은 제 1 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 제 1 핵산과, 제 2 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 제 2 핵산을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 제 1 유전자-에디팅 단백질의 결합 부위와 제 2 유전자-에디팅 단백질의 결합 부위는 동일한 표적 DNA 분자에 존재한다. 또다른 구체예에 있어서, 제 1 유전자-에디팅 단백질의 결합 부위와 제 2 유전자-에디팅 단백질의 결합 부위는 약 50개 미만의 염기, 또는 약 40개 미만의 염기, 또는 약 30개 미만의 염기 또는 약 20개 미만의 염기, 또는 약 10개 미만의 염기, 또는 약 10개 내지 약 25개의 염기 또는 약 15개 염기에 의해 분리된다. 한 구체예에 있어서, 제 1 유전자-에디팅 단백질의 뉴클라아제 도메인과 제 2 유전자-에디팅 단백질의 뉴클라아제 도메인은 이합체(dimer)를 형성할 수 있다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 이합체는 표적 DNA 분자에서 닉 또는 이중-가닥 브레이크를 만들 수 있다. 한 구체예에 있어서, 상기 조성물은 치료요법적 조성물이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 복구 주형을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 복구 주형은 단일-가닥으로 된 DNA 분자 또는 이중-가닥으로 된 DNA 분자다.
다른 구체예들은 단백질 또는 단백질을 인코드하는 핵산을 합성하는 제조 물품에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 물품은 핵산이다. 또다른 구체예에 있어서, 이 단백질은 DNA-결합 도메인을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 이 핵산은 DNA-결합 도메인을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 이 단백질은 뉴클라아제 도메인을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 이 핵산은 뉴클라아제 도메인을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 이 단백질은 다수의 반복 서열들을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 이 핵산은 다수의 반복 서열들을 인코드한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 뉴클라아제 도메인은 FokI, StsI, StsI-HA, StsI-HA2, StsI-UHA, StsI-UHA2, StsI-HF, 및 StsI-UHF 또는 천연 또는 조작된 변종 또는 이의 생물학적으로 활성 단편에서 선택된다. 한 구체예에 있어서, 이 핵산은 RNA-중합효소 프로모터를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 RNA-중합효소 프로모터는 T7 프로모터 또는 SP6 프로모터다. 추가 구체예에 있어서, 이 핵산은 바이러스성 프로모터를 포함한다. 한 구체예에 있어서, 이 핵산은 해독안된 영역을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 이 핵산은 시험관-전사 주형이다.
특정 구체예들은 단백질을 발현시키기 위하여 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 다른 구체예들은 세포의 DNA 서열을 변경시키는 방법에 관한 것으로, 이 세포에 유전자-에디팅 단백질을 트랜스펙션시키거나 또는 유전자-에디팅 단백질을 발현시키도록 이 세포를 유도하는 것을 포함한다. 여전히 다른 구체예들은 세포내 관심 단백질의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 유전자-에디팅 단백질을 발현시키기 위하여 유도되고, 이때 상기 유전자-에디팅 단백질은 표적 DNA 분자에서 닉 또는 이중-가닥 브레이크를 만들 수 있다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 닉 또는 이중-가닥 브레이크로 인하여 유전자가 비활성화된다. 여전히 다른 구체예들은 단백질의 비활성, 감소된-활성 또는 우성-음성 형태를 만드는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 이 단백질은 설바이빈(survivin)이다. 여전히 다른 구체예들은 세포 안에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 복구시키는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 복구 주형과 접촉된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 복구 주형은 DNA 분자다. 추가 구체예에 있어서, 상기 복구 주형은 상기 유전자-에디팅 단백질의 결합 부위를 포함하지 않는다. 추가 구체예에 있어서, 상기 복구 주형은 상기 유전자-에디팅 단백질의 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열을 인코드한다.
다른 구체예들은 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 이 환자에게 치료요법적으로 유효량의 단백질 또는 단백질을 인코드하는 핵산을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료로 인하여 하나 또는 그 이상의 환자의 증상이 개선된다. 특정 구체예들은 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 다음을 포함한다: a. 환자로부터 세포를 제거하고, b. 유전자-에디팅 단백질이 인코드된 핵산을 상기 세포에 트랜스펙션시킴으로써, 상기 세포가 유전자-에디팅 단백질을 발현시키도록 유도되며, c. 세포는 재프로그래밍되고, 그리고 e. 상기 세포는 환자 안으로 도입된다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 덜 분화된 상태로 재프로그램된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 하나 또는 그 이상의 재프로그래밍 단백질을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 합성 RNA 분자들을 상기 세포에 트랜스펙션시킴으로써, 재프로그램된다. 추가 구체예에 있어서, 상기 세포는 분화된다. 추가 구체예에 있어서, 상기 세포는 다음중 하나로 분화된다: 피부 세포, 포도당-반응성 인슐린-생산 세포, 조혈 세포, 심장 세포, 망막 세포, 신장 세포, 신경 세포, 간질 세포, 지방 세포, 골 세포, 근 세포, 난모세포, 그리고 정자 세포. 다른 구체예들은 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 다음을 포함한다: a. 환자로부터 조혈 세포 또는 줄기 세포를 제거하고, b. 유전자-에디팅 단백질이 인코드된 핵산을 상기 세포에 트랜스펙션시킴으로써, 상기 세포가 유전자-에디팅 단백질을 발현시키도록 유도되며, 그리고 c. 상기 세포는 환자 안으로 도입된다.
DMEM/F12, 아스코르브산, 인슐린, 트란스페린, 셀레나이트 나트륨, 에탄올아민, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 그리고 형질변환 성장 인자-베타로 필수적으로 구성된 또는 이들을 포함하는 세포-배양 배지는 시험관에서 인간 다능성 줄기 세포들이 포함된 다능성 줄기 세포들을 유지시키는데 충분하다는 것이 현재 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 DMEM/F12, 아스코르브산, 인슐린, 트란스페린, 셀레나이트 나트륨, 에탄올아민, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 그리고 형질변환 성장 인자-베타로 필수적으로 구성되는 또는 이를 포함하는 세포-배양 배지에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 아스코르브산은 약 50μg/mL로 존재한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 인슐린은 약 10μg/mL로 존재한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 트란스페린은 약 5.5μg/mL로 존재한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 셀레나이트 나트륨은 약 6.7ng/mL로 존재한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 에탄올아민은 약 2μg/mL로 존재한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 염기성 섬유아세포 성장 인자는 약 20ng/mL로 존재한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 형질변환 성장 인자-베타는 약 2ng/mL로 존재한다. 한 구체예에 있어서, 상기 아스코르브산은 아스코르브산-2-인산염이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 형질변환 성장 인자-베타는 형질변환 성장 인자-베타 1 또는 형질변환 성장 인자-베타 3이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포-배양 배지는 다능성 줄기 세포들의 배양에 이용된다. 또다른 구체예에 있어서, 다능성 줄기 세포들은 인간 다능성 줄기 세포들이다. 추가 구체예에 있어서, 상기 세포-배양 배지는 재프로그래밍하는 동안 또는 그 이후 세포의 배양에 이용된다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포-배양 배지는 동물-유도된 성분들을 포함하지 않는다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포-배양 배지는 제조 표준에 따라 제조된다. 추가 구체예에 있어서, 상기 제조 표준은 GMP다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포들은 세포-에드헤신(adhesion) 분자와 접촉된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포-에드헤신 분자는 피브로넥틴 그리고 비트로넥틴 또는 이의 생물학적으로 활성 단편으로부터 선택된다. 추가 구체예에 있어서, 상기 세포들은 피브로넥틴과 비트로넥틴에 접촉된다. 추가 구체예에 있어서, 상기 세포-에드헤신 분자는 재조합된 것이다.
특정 상황에 있어서, 예를 들면, 치료제를 만들 때, 바이러스 및/또는 기타 동물-유래된 병원균의 오염 위험을 감소시키기 위하여 부분적으로 동물-유도된 성분들을 비-동물-유도된 성분들로 대체시키는 것이 유익할 수 있다. 반-합성 식물-유도된 콜레스테롤이 포함된 합성 콜로스테롤은 트랜스펙션 효율의 감소 또는 트랜스펙션-연관된 독성의 증가 없이, 트랜스펙션 배지에서 동물-유도된 콜레스테롤을 대체할 수 있다는 것이 최근 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 합성 또는 반-합성 콜레스테롤이 포함된 트랜스펙션 배지에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 반-합성 콜레스테롤은 식물-유도된 것이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 트랜스펙션 배지는 동물-유도된 콜레스테롤을 포함하지 않는다. 추가 구체예에 있어서, 상기 트랜스펙션 배지는 재프로그래밍 배지다. 다른 구체예들은 복합(complexation) 배지에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 복합 배지는 약 7 이상, 또는 약 7.2 이상, 또는 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상의 pH를 가진다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 복합 배지는 트란스페린을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 복합 배지는 DMEM을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 복합 배지는 DMEM/F12를 포함한다. 여전히 다른 구체예들은 핵산-트랜스펙션-시약 복합물(complexes)을 만드는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 트랜스펙션 시약은 복합 배지와 함께 항온처리된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 항온처리(incubation)는 혼합 단계에 앞서 실행된다. 추가 구체예에 있어서, 상기 항온처리 단계는 약 5 초 내지 약 5 분 사이 또는 약 10 초 내지 약 2 분 사이 또는 약 15 초 내지 약 1 분 사이 또는 약 30 초 내지 약 45 초 간이다. 한 구체예에 있어서, 상기 트랜스펙션 시약은 표 1에서 선택된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 트랜스펙션 시약은 지질 또는 리피도이드(lipidoid)다. 추가 구체예에 있어서, 상기 트랜스펙션 시약은 양이온을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 양이온은 다가(multivalent) 양이온이다. 추가 구체예에 있어서, 상기 트랜스펙션 시약은 N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자미드 (별칭으로 MVL5) 또는 이의 유도체다.
특정 구체예들은 세포에 핵산을 접촉시켜, 단백질을 발현시키도록 상기 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 인간 세포 또는 설치류 세포다. 다른 구체예들은 본 발명의 방법들중 하나 또는 그 이상을 이용하여 만든 세포에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 환자에서 존재한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 환자로부터 단리된다. 다른 구체예들은 본 발명의 방법들중 하나 또는 그 이상을 이용하여 생산된 세포가 포함된 스크리닝 라이브러리(library)에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 스크리닝 라이브러리는 심독성 스크리닝, 신경독성 스크리닝, 그리고 간독성 스크리닝이 포함된 독성 스크리닝, 효과 스크리닝, 높은-처리량 스크리닝, 높은-함량 스크리닝, 그리고 기타 스크리닝이 포함된 최소한 하나의 스크리닝에 이용된다.
다른 구체예들은 핵산이 포함된 키트에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 키트는 운반 시약 (별칭으로 ＂트랜스펙션 시약＂)을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 재프로그래밍 키트다. 추가 구체예에 있어서, 상기 키트는 유전자-에디팅 키트다. 다른 구체예들은 핵산을 생산하기 위한 키트에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 키트는 다음중 최소한 2개를 포함한다: 슈도우리딘-삼인산염, 5-메틸우리딘 삼인산염, 5-메틸시티딘 삼인산염, 5-히드록시메틸시티딘 삼인산염, N4-메틸시티딘 삼인산염, N4-아세틸시티딘 삼인산염, 그리고 7-데자구아노신 삼인산염 또는 하나 또는 그 이상의 이들 유도체. 다른 구체예들은 핵산이 포함된 치료제에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료제는 약학 조성물이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 약학 조성물은 제형화된다(formulated). 추가 구체예에 있어서, 상기 제형(formulation)은 리포좀의 수성 현탁액을 포함한다. 예시적인 리포좀 성분들은 표 1에서 제시되며, 이는 예시를 위하여 제공되는 것이며, 이에 한정시키고자 함은 아니다. 한 구체예에 있어서, 상기 리포좀은 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 쇄를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 PEG는 PEG2000이다. 추가 구체예에 있어서, 상기 리포좀은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE) 또는 이의 유도체를 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료제는 하나 또는 그 이상의 리간드를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 치료제는 안드로겐, CD30 (TNFRSF8), 세포-침투 펩티드, CXCR, 에스트로겐, 상피 성장 인자, EGFR, HER2, 엽산, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자-I, 인터루킨-13, 인테그린, 프로게스테론, 간질-유도된-인자-1, 트롬빈, 비타민 D, 그리고 트란스페린 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변종중 최소한 하나 이상을 포함한다. 여전히 다른 구체예들은 본 발명의 방법들중 하나 또는 그 이상을 이용하여 만든 세포가 포함된 치료제에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료제는 유형 1 당뇨병, 허혈 및 확장심근병이 포함된 심장 질환, 황반 변성, 파킨슨 질환, 낭성섬유증, 겸상 적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 판코니 빈혈, 중증 복합형 면역부전증, 유전성 감각신경병증, 색소성 건피증, 헌팅턴 질환, 근이영양증, 근위축성 측색 경화증, 알츠하이머 질환, 암, 그리고 간염 및 HIV/AIDS가 포함된 감염성 질환중 최소한 하나를 치료하기 위하여 환자에게 투여된다.
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특정 구체예들은 Cap 0, Cap 1, Cap 2, 그리고 Cap 3 또는 이의 유도체로부터 선택된 5＇ 캡(cap) 구조가 포함된 핵산에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 이 핵산은 하나 또는 그 이상의 UTRs을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 UTRs은 이 핵산의 안정성을 증가시킨다. 추가 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 UTRs은 알파-글로빈 또는 베타-글로빈 5＇-UTR을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 UTRs은 알파-글로빈 또는 베타-글로빈 3＇-UTR을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 합성 RNA 분자는 알파-글로빈 또는 베타-글로빈 5＇-UTR과 알파-글로빈 또는 베타-글로빈 3＇-UTR을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 5＇-UTR은 Kozak 콘센수스(consensus) 서열과 실질적으로 동일한 Kozak 서열을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 이 핵산은 3＇-폴리(A) 꼬리를 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 3＇-폴리(A) 꼬리의 길이는 약 20nt 내지 약 250nt 사이 또는 약 120nt 내지 약 150nt 사이가 된다. 추가 구체예에 있어서, 상기 3＇-폴리(A) 꼬리의 길이는 약 20nt, 또는 약 30nt, 또는 약 40nt, 또는 약 50nt, 또는 약 60nt, 또는 약 70nt, 또는 약 80nt, 또는 약 90nt, 또는 약 100nt, 또는 약 110nt, 또는 약 120nt, 또는 약 130nt, 또는 약 140nt, 또는 약 150nt, 또는 약 160nt, 또는 약 170nt, 또는 약 180nt, 또는 약 190nt, 또는 약 200nt, 또는 약 210nt, 또는 약 220nt, 또는 약 230nt, 또는 약 240nt, 또는 약 250nt이다.
다른 구체예들은 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 상기 세포에 하나 또는 그 이상의 핵산을 접촉시킴으로써 재프로그램된다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 Oct4 단백질, Sox2 단백질, Klf4 단백질, c-Myc 단백질, Lin28 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 변종 또는 유도체중 최소한 하나를 인코드하는 다수의 핵산에 접촉된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 Oct4 단백질, Sox2 단백질, Klf4 단백질, 그리고 c-Myc 단백질 또는 하나 또는 그 이상의 생물학적으로 활성 단편들, 이의 변종들 또는 유도체들을 포함하는 다수의 단백질을 인코드하는 다수의 핵산에 접촉된다. 여전히 다른 구체예들은 세포를 유전자 에디팅하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 상기 세포에 하나 또는 그 이상의 핵산을 접촉시킴으로써, 유전자-에디트된다.
동물 모델은 생물학적 공정의 효과를 연구하는데 관례적으로 이용된다. 특정 상황에 있어서, 예를 들면, 인간 질환을 연구할 때, 변형된 게놈이 포함된 동물 모델은 이러한 동물 모델이 인간 질환 표현형을 더욱 밀접하게 모방할 수 있기 때문에 일부 유익할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 하나 또는 그 이상의 유전적 변형 (별칭으로 ＂돌연변이＂, 별칭으로 ＂유전자 에디트＂)이 포함된 유기체를 만드는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 유전적 변형은 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 세포에 트랜스펙션시킴으로써 생성된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 핵산은 합성 RNA 분자를 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질은 아연 핑거 뉴클라아제, TALEN, 군집화된 규칙적으로 공간을 두고 있는 짧은 팔린드롬 반복 (CRISPR)-연관된 단백질, 뉴클라아제, 메가뉴클라아제, 그리고 니카아제(nickase) 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변종중 최소한 하나를 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 다능성 세포다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 배아 줄기 세포다. 추가 구체예에 있어서, 상기 세포는 배아(embryo)다. 추가 구체예에 있어서, 상기 세포는 동물 세포, 식물 세포, 효모 세포, 그리고 박테리아 세포의 구성원이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 설치류 세포다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 인간 세포다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 세포는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산과 하나 또는 그 이상의 복구 주형을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산으로 트랜스펙션된다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 낭포(blastocyst) 안으로 도입된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 상상임신 암컷에게 도입된다. 추가 구체예에 있어서, 자손에게 상기 유전적 변형의 존부가 결정된다. 추가 구체예에 있어서, 상기 결정은 직접적 서열화(sequencing)에 의해 이루어진다. 한 구체예에 있어서, 상기 유기체는 가축, 예를 들면, 돼지, 소 등이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 유기체는 애완동물, 예를 들면, 개, 고양이, 물고기 등이 된다.
특정 상황에 있어서, 예를 들면, 핵산 서열의 추가에 의해 표적 세포의 게놈이 변형될 때, 무작위 삽입과 연합된 위험을 일부 감소시키기 위하여, 상기 핵산 서열은 안전한-정박(harbor) 위치로 삽입시키는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 핵산 서열을 안전한-정박 위치에 삽입시키는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 인간 세포이며, 상기 안전한-정박 위치는 AAVS1 좌(locus)가 된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 설치류 세포이며, 상기 안전한-정박 위치는 Rosa26 좌가 된다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 하나 또는 그 이상의 복구 주형을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산에 추가 접촉된다. 다른 구체예들은 세포의 DNA 서열을 변경시키는 키트에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 인간 세포이며, 표적 DNA 분자는 AAVS1 좌를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 설치류 세포이며, 표적 DNA 분자는 Rosa26 좌를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예들은 상기 세포에 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산과 하나 또는 그 이상의 복구 주형을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 접촉시킴으로써, 리포터(reporter) 세포를 만드는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 복구 주형은 DNA를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 복구 주형은 하나 또는 그 이상의 형광 단백질을 인코드한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 복구 주형은 유전자의 프로모터 영역의 최소한 일부를 인코드한다.
특정 상황에 있어서, 예를 들면, 유전자-에디트된 세포들의 라이브러리를 만들 때, 세포 특성화 비용을 일부 줄이기 위하여 유전자 에디팅의 효율을 증가시키는 것이 유익할 수 있다. 유전자-에디팅 효율은 세포에 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 합성 RNA를 반복적으로 접촉시킴으로써 증가될 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 상기 세포에 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 하나 이상의 핵산을 반복적으로 접촉시킴으로써 세포를 유전자 에디팅하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 5일 연속 최소한 두 차례 접촉된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 약 24 시간 내지 약 48 시간 사이의 간격을 두고 두 차례 접촉된다.
암의 경우, 환자에게서 유전적으로 존재하지 않는 특이적 유전적 비정상의 존재로 인하여 악성 세포들이 생존 및 증식할 수 있다. 유전자-에디팅 단백질은 생존과 증식-연합된 경로들을 표적화하는데 이용될 수 있다는 것이 현재 밝혀졌으며, 이러한 방식에 이용될 때, 유전자-에디팅 단백질과 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산은 잠재적 항암 치료제를 구성할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들은 항암 치료제에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료제는 세포의 생존을 저해하고 및/또는 세포의 증식을 막거나, 지연 또는 제한하는 치료요법적 조성물이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 암 세포다. 추가 구체예에 있어서, 상기 치료제는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질 또는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질은 상기 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 하나 또는 그 이상의 서열들을 표적으로 한다. 이러한 서열들은 아팝토시스 저해제 (IAP) 패밀리의 유전자들이 포함된 아팝토시스-관련된 유전자들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다 (이를 테면, 표 2 및 U.S. 가출원 번호. 61/721,302의 표 2 참고(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다), 이를 테면 BIRC5, 텔로메어(telomere) 유지와 연합된 서열들, 이를 테면 유전자 텔로메라제 역 전사효소 (TERT) 및 텔로메라제 RNA 성분 (TERC), 혈관신생에 영향을 주는 서열을, 이를 테면 유전자 VEGF, 그리고 다음을 포함하는 기타 암-연합된 유전자들: BRAF, BRCA1, BRCA2, CDKN2A, CTNNB1, EGFR, MYC 패밀리, RAS 패밀리, PIK3CA, PIK3R1, PKN3, TP53, PTEN, RET, SMAD4, KIT, MET, APC, RB1, VEGF 패밀리, TNF, 그리고 리보뉴클레오티드 환원효소 패밀리의 유전자들. BIRC5의 유전자-에디팅 단백질 표적 서열들의 예는 표 3과 U.S. 가출원 번호. 61/721,302의 표 3에 제시되며, 이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입되고, 그리고 이들은 예시를 위하여 제공된 것이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 서열들중 최소 하나는 악성 세포와 비-악성 세포들 모두에 존재한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 서열들중 최소 하나는 악성 세포들 안에서 풍부하다. 추가 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 서열들중 최소 하나는 비-악성 세포들 안에서 풍부하다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료제 조성물은 하나 또는 그 이상의 복구 주형을 인코드하는 핵산을 더 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질은 비활성 또는 우성-음성 형태의 단백질을 발현시키도록 세포를 유도한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 단백질은 IAP 패밀리의 구성원이다. 추가 구체예에 있어서, 상기 단백질은 설바이빈(survivin)이다.
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다른 구체예들은 치료요법적으로 유효량의 유전자-에디팅 단백질 또는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료에 의해 환자의 암 세포들의 성장이 감소 또는 중지된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 치료에 의해 암의 진행 또는 재발이 지연된다. 한 구체예에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 BIRC5 유전자를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 그리고 서열 번호: 15로부터 선택된 서열을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 다수의 인접(adjacent) 결합 부위는 표 3, 표 4, U.S. 가출원 번호. 61/721,302의 표 3(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다), U.S. 가출원 번호. 61/785,404의 표 1(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다) 또는 U.S. 가출원 번호. 61/842,874의 표 1(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다)에서 열거된 하나 또는 그 이상의 서열에 대하여 최소한 약 50% 또는 최소한 약 60% 또는 최소한 약 70% 또는 최소한 약 80% 또는 최소한 약 90% 또는 최소한 약 95% 또는 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99% 상동성이다. 특정 상황에 있어서, 절두된(truncated) N-말단 도메인을 가진 유전자-에디팅 단백질을 이용하여 결합-부위 서열 상에 제 1-염기-T 제한을 제거할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 암은 신경아교종이다. 한 구체예에 있어서, 상기 환자는 이미 외과수술 및/또는 방사선요법을 받았거나 및/또는 외과술 및/또는 방사선요법을 동시에 받고 있다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 투여는 척추강내 주사, 두개강내 주사, 정맥 주사, 관류, 피하 주사, 복막내 주사, 내문(intraportal) 주사, 및 국소 운반중 하나 또는 그 이상의 방법에 의해 이루어진다.
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특정 구체예들은 다음을 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다: a. 환자로부터 하나 또는 그 이상의 암 세포들이 포함된 생검을 제거하고, b. 상기 하나 또는 그 이상의 암 세포들에서 암-연합된 유전적 표지(marker)의 서열을 결정하고, 그리고 상기 환자에게 치료요법적으로 유효량의 유전자-에디팅 단백질 또는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 투여하며, 이때 상기 표적 DNA 분자의 서열은 상기 암-연합된 유전적 표지의 서열에 최소한 약 50% 또는 약 60% 또는 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90% 또는 약 95% 또는 약 98%, 또는 약 99% 상동성이다. 한 구체예에 있어서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 암이 아닌 세포들에서 동일한 암-연합된 유전적 표지들의 서열에 대하여 상기 하나 또는 그 이상의 암 세포들에 있는 하나 또는 그 이상의 암-연합된 유전적 표지들의 서열을 비교하고, 상기 하나 또는 그 이상의 암 세포들과 상기 하나 또는 그 이상의 암이 아닌 세포들에서 상이한 서열을 가진 암-연합된 유전적 표지를 선택하며, 이때 상기 표적 DNA 분자 또는 결합 부위의 서열은 선택된 암-연합된 유전적 표지의 서열에 대해 최소한 약 50% 또는 약 60% 또는 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90% 또는 약 95% 또는 약 98% 또는 약 99% 상동성이다.
많은 암 세포들은 아팝토시스 (IAP) 단백질 패밀리의 저해제들중 한 구성원인 설바이빈(survivin)을 발현하는데, 인간의 경우 BIRC5 유전자에 의해 인코드된다. 설바이빈(survivin) mRNA을 포함하는 특정 mRNA 분자들의 발견을 감소시키는 RNA 간섭을 이용하면 일시적으로 특정 암 세포들의 성장을 저해할 수 있다. 그러나, 설바이빈(survivin) mRNA의 발현을 감소시키는 RNA 간섭을 이용하는 기존 방법들은 일시적인 효과를 낳고, 그리고 동물 모델에서 평균 사망까지의 시간(TTD)를 약간 증가시킬 뿐이다. BIRC5 유전자를 표적으로 하는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 세포가 발현시키도록 유도하면 BIRC5 유전자의 파괴를 초래할 수 있으며, 상기 세포가 설바이빈(survivin) 단백질의 비-기능성 변종의 발현 및/또는 분비하도록 유도할 수 있고, 상기 세포가 설바이빈(survivin) 단백질의 우성-음성 변종을 발현 및/또는 분비하도록 유도할 수 있으며, 상기 세포 및 주변 세포에서 하나 또는 그 이상의 아팝토시스 경로의 활성화를 촉발시키고, 상기 세포와 주변 세포들의 성장을 지연 또는 중단시킬 수 있고, 상기 세포와 주변 세포들의 사멸을 야기할 수 있고, 암의 진행을 저해시킬 수 있으며, 그리고 암 환자의 차도를 야기할 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 BIRC5 유전자를 표적으로 하는 유전자-에디팅 단백질에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 BIRC5 유전자에 있는 하나 또는 그 이상의 영역에 결합한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 그리고 서열 번호: 15로부터 선택된 서열에서 하나 또는 그 이상의 영역에 결합한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 그리고 서열 번호: 27로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 서열에 결합한다.. 추가 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 서열 번호: 34 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 이의 변종 또는 이의 유사체를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열들에 결합한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 표 3, 표 4, U.S. 가출원 번호. 61/721,302의 표 3(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다), U.S. 가출원 번호. 61/785,404의 표 1(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다) 또는 U.S. 가출원 번호. 61/842,874의 표 1(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다)에서 선택된 하나 또는 그 이상의 서열에 결합하거나, 또는 표 3, 표 4, U.S. 가출원 번호. 61/721,302의 표 3(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다), U.S. 가출원 번호. 61/785,404의 표 1(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다) 또는 U.S. 가출원 번호. 61/842,874의 표 1(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다)에서 선택된 하나 또는 그 이상의 서열에 대해 최소한 약 50% 또는 최소한 약 60% 또는 최소한 약 70% 또는 최소한 약 80% 또는 최소한 약 90% 또는 최소한 약 95% 또는 최소한 약 98%, 또는 약 99% 상동성인 하나 또는 그 이상의 서열에 결하한다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 상기 세포의 DNA안에 하나 또는 그 이상의 닉 또는 이중-가닥 브레이크를 만든다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 닉 또는 이중-가닥 브레이크는 BIRC5 유전자 안에 만들어진다. 추가 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 닉 또는 이중-가닥 브레이크는 BIRC5 유전자의 하나 또는 그 이상의 엑손 안에 만들어진다. 추가 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 닉 또는 이중-가닥 브레이크는 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 그리고 서열 번호: 15에서 선택된 서열 안에 만들어진다. 추가 구체예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 닉 또는 이중-가닥 브레이크는 아팝토시스 도메인 (별칭으로, ＂IAP＂, ＂IAP 도메인＂, ＂IAP 반복＂, ＂아팝토시스 단백질 반복의 베큘로바이러스 저해제＂, ＂BIR＂, 등.)의 저해제를 인코드하는 서열 안에 만들어진다. 추가 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 표 5, U.S. 가출원 번호. 61/785,404의 표 2(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다) 또는 U.S. 가출원 번호. 61/842,874의 표 2(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다)에서 선택된 하나 또는 그 이상의 서열에 결합하거나, 또는 표 5, U.S. 가출원 번호. 61/785,404의 표 2(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다) 또는 U.S. 가출원 번호. 61/842,874의 표 2(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다)에서 선택된 하나 또는 그 이상의 서열에 대하여 최소한 약 50% 또는 최소한 약 60% 또는 최소한 약 70% 또는 최소한 약 80% 또는 최소한 약 90% 또는 최소한 약 95% 또는 최소한 약 98% 상동성인 하나 또는 그 이상의 서열들에 결합한다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 유전자 에디팅 단백질은 표 2, 표 5, 표 6, 표 7, U.S. 가출원 번호. 61/721,302의 표 4(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다), U.S. 가출원 번호. 61/785,404의 표 2(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다) 또는 U.S. 가출원 번호. 61/842,874의 표 2(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다)로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자를 인코드하는 서열에 결합한다.
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일부 구체예들에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 암에서 과다발현되는 유전자를 포함한다. 암에서 과다발현되는 유전자의 예로는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: ABL1, BIRC5, BLK, BTK, CDK 패밀리 구성원, EGFR, ERBB2, FAS, FGR, FLT4, FRK, FYN, HCK, HIF1A, HRAS, HSP90AA1, HSP90AA1, HSPA4, KDR, KIF11, KIF11, KIF20A, KIF21A, KIF25, KIT, KRAS, LCK, LYN, MAPK1, MET, MYC, MYH1, MYO1G, NRAS, NTRK1, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PKN3, PLK1, RAF1, RB1, RET, RRM1, RRM2, SRC, TNF, TPM2, TYRO3, VEGFA, VEGFB, VEGFC, YES1, 그리고 ZAP70. 일부 구체예들에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 다음에서 선택된 유전자를 포함한다: ABL1, BIRC5, BLK, BTK, CDK 패밀리 구성원, EGFR, ERBB2, FAS, FGR, FLT4, FRK, FYN, HCK, HIF1A, HRAS, HSP90AA1, HSP90AA1, HSPA4, KDR, KIF11, KIF11, KIF20A, KIF21A, KIF25, KIT, KRAS, LCK, LYN, MAPK1, MET, MYC, MYH1, MYO1G, NRAS, NTRK1, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PKN3, PLK1, RAF1, RB1, RET, RRM1, RRM2, SRC, TNF, TPM2, TYRO3, VEGFA, VEGFB, VEGFC, YES1, 그리고 ZAP70 또는 이의 단편 또는 변종. 다른 구체예들에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 암에서 돌연변이된 유전자를 포함한다. 암에서 돌연변이된 유전자의 예로는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: AIM1, APC, BRCA1, BRCA2, CDKN1B, CDKN2A, FAS, FZD 패밀리 구성원, HNF1A, HOPX, KLF6, MEN1, MLH1, NTRK1, PTEN, RARRES1, RB1, SDHB, SDHD, SFRP1, ST 패밀리 구성원, TNF, TP53, TP63, TP73, VBP1, VHL, WNT 패밀리 구성원, BRAF, CTNNB1, PIK3CA, PIK3R1, SMAD4, 그리고 YPEL3. 일부 구체예들에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 다음에서 선택된 유전자를 포함한다: AIM1, APC, BRCA1, BRCA2, CDKN1B, CDKN2A, FAS, FZD 패밀리 구성원, HNF1A, HOPX, KLF6, MEN1, MLH1, NTRK1, PTEN, RARRES1, RB1, SDHB, SDHD, SFRP1, ST 패밀리 구성원, TNF, TP53, TP63, TP73, VBP1, VHL, WNT 패밀리 구성원, BRAF, CTNNB1, PIK3CA, PIK3R1, SMAD4, 그리고 YPEL3 또는 이의 단편 또는 변종. 한 구체예에 있어서, 상기 방법은 환자에게 치료요법적으로 유효량의 복구 주형을 투여하는 것을 더 포함한다.
특정 유전자에서 돌연변이는 세포가 암이 될 가능성을 증가시킬 수 있다. 그러나, 특정 상황에 있어서, 예를 들면, 상기 암-연합된 유전자의 비-돌연변이형이 유익한 경우, 암이 아닌 세포들에서 암-연합된 유전자를 비활성화시키는 것이 결정적일 수 있다. 유전자-에디팅 단백질은 유전자의 돌연변이 형을 부분적으로 또는 완전하게 특이적으로 비활성화시키는데 이용될 수 있다는 것이 지금 발견되었다. 암-연합된 돌연변이의 예로는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: ALK (F1174, R1275), APC (R876, Q1378, R1450), BRAF (V600), CDKN2A (R58, R80, H83, D84, E88, D108G, W110, P114), CTNNB1 (D32, S33, G34, S37, T41, 또는 S45), EGFR (G719, T790, L858), EZH2 (Y646), FGFR3 (S249, Y373), FLT3 (D835), GNAS (R201), HRAS (G12, G13, Q61), IDH1 (R132), JAK2 (V617), KIT (D816), KRAS (G12, G13), NRAS (G12, G13, Q61), PDGFRA (D842), PIK3CA (E542, E545, H1047), PTEN (R130), 그리고 TP53 (R175, H179, G245, R248, R249, R273, W282). 따라서, 특정 구체예들은 질환-연합된 돌연변이에 결합되는 유전자-에디팅 단백질에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 돌연변이를 포함하지 않은 DNA보다는 특이적 돌연변이를 포함하는 DNA에 더 큰 친화력으로 결합한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 질환은 암이다.
알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 그리고 Lewy 체(bodies)를 가진 치매를 포함하는 신경퇴행성 질환은 중추 및/또는 말초신경계의 세포들의 기능이 점진적으로 상실되거나 및/또는 사멸되는 것을 특징으로 한다. 질환 진행은 단백질 α-시뉴클레인(synuclein) (인간의 경우 SNCA 유전자에 의해 인코드됨)을 포함하는 단백질이 풍부한(rich) 플락의 축적을 수반할 수 있다. 그 결과, 상기 플락에 결합하여, 면역계에 의해 파괴되도록 테그를 다는 항체를 이용하여 이들 플락을 파괴할 수 있는 치료제를 연구자들은 찾아왔다 그러나, 많은 경우에 있어서 플락의 파괴는 환자 증상 또는 질환의 진행에 효과가 없거나 또는 거의 없다. 신경퇴행성 질환-연관된 플락을 표적으로 하는 기존 치료법의 실패의 일부 원인은 플락 형성 초기 단계에서 발생되는 세포에 대한 손상을 복구하지 못하는 신경계 때문이라는 것이 최근 밝혀졌다. SNCA 유전자를 표적으로 하는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 발현시키도록 세포를 유도하면 SNCA 유전자의 파괴를 유도하게 될 수 있으며, α-시뉴클레인 단백질의 플락-저항성 변종을 발현시키도록 상기 세포를 유도할 수 있으며, 신경퇴행성 질환-연관된 플락의 성장을 지연 또는 중지시킬 수 있으며, 신경퇴행성 질환-연관된 플락의 악영향으로부터 상기 세포와 주변 세포를 보호할 수 있으며, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 그리고 Lewy 체를 가진 치매를 포함하는 신경퇴행성 질환의 진행을 지연 및/또는 중지시킬 수 있으며, 그리고 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 그리고 Lewy 체를 가진 치매를 포함하는 신경퇴행성 질환 환자에서 증상의 감소 및/또는 기능의 획득이 야기될 수 있다. 기타 신경퇴행성 질환은 예를 들면, 눈이 머는 것을 포함한 시력상실, 난청을 포함하는 청력상실, 균형 장애, 미각 및/또는 후각 상실, 그리고 기타 감각 장애가 포함된다. 따라서, 특정 구체예들은 SNCA 유전자를 표적으로 하는 유전자-에디팅 단백질에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 SNCA 유전자에 있는 하나 또는 그 이상의 영역에 결합한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 서열 번호: 51 또는 이의 생물학적으로 활성 단편, 이의 변종 또는 이의 유사체를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열들에 결합한다. 다른 구체예들은 환자에게 치료요법적으로 유효량의 유전자-에디팅 단백질 또는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는 신경퇴행성 질환 치료 방법에 관한 것이며, 이때 상기 유전자-에디팅 단백질은 질환-연합된 플락을 형성하는 단백질이 인코드된 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있으며, 이러한 결합에 의해 환자에서 질환-연합된 플락의 감소를 초래하거나 및/또는 질환의 진행을 지연 또는 중지시키게 된다. 한 구체예에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 SNCA 유전자를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 α-시뉴클레인을 인코드한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 및 치매로부터 선택된다.
특정 구체예들은 질환-유발 유독물을 식별하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 세포에 이 세포의 DNA 서열을 변경시키는 유전자-에디팅 단백질 또는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 트랜스펙션시키고, 이때 변경된 DNA 서열은 질환에 대하여 민감성을 부여하게 되며, 상기 세포에 질환-유발이 의심되는 유독물을 접촉시키고, 그리고 이 세포가 상기 질환과 연관된 표현형을 나타내는 정도를 평가하는 것을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 질환은 신경퇴행성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 생식 장해 또는 암이다. 다른 구체예들은 치료요법적 물질의 안전성을 평가하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 이 세포의 DNA 서열을 변경시키는 유전자-에디팅 단백질 또는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 트랜스펙션시키고, 이때 변경된 DNA 서열은 상기 치료제 물질의 하나 또는 그 이상의 고성 효과에 대하여 민감성을 부여하게 되며, 상기 세포에 상기 치료제 물질을 접촉시키고, 그리고 상기 세포 상에서 상기 치료제 물질의 하나 또는 그 이상의 독성 효과를 측정하는 것을 포함한다. 여전히 다른 구체예들은 치료요법적 물질의 효과를 평가하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 이 세포의 DNA 서열을 변경시키는 유전자-에디팅 단백질 또는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 트랜스펙션시키고, 이때 변경된 DNA 서열에 의해 상기 세포는 하나 또는 그 이상의 질환-연관된 표현형을 나타내게 되며, 상기 세포에 상기 치료제 물질을 접촉시키고, 그리고 상기 하나 또는 그 이상의 질환-연관된 표현형이 감소된 정도를 측정하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 환자는 단백병증(proteopathy)으로 진단된다. 예시적인 단백병증 및 단백병증-연합된 유전자는 표 6에 제시되며, 이들은 예를 들기 위함이며, 이에 제한되지 않는다. 한 구체예에 있어서, 상기 단백병증은 다음으로부터 선택된다: AA (2차) 아밀로이드증, 알렉산더질환, 알츠하이머 질환, 근위축성 측색 경화증, 대동맥 안쪽 아밀로이드증, ApoAI 아밀로이드증, ApoAII 아밀로이드증, ApoAIV 아밀로이드증, 비브리노겐 아밀로이드증, 심장 심방 아밀로이드증, 피질하 경색과 백색질뇌병증을 가진 뇌의 상염색체 우성 동맥질환, 대뇌의 β-아밀로이드 혈관증, 투석 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 심근병, 가족성 아밀로이드 폴리신경병증, 가족성 아밀로이드증 (핀란드형), 가족성 영국형 치매, 가족성 덴마크형 치매, 전두측두엽 변성, 유전적 대뇌의 아밀로이드 혈관증, 유전적 격자 각막 이상증, 헌팅턴 질환, 봉입체 근염/근병증, 리소자임 아밀로이드증, 갑상선 수질암종, 치성(Pindborg) 종양 아밀로이드, 파킨슨 질환, 뇌하수체 프로락틴분비종양, 없는온 질환, 폐포 단백증, 녹내장에서 망막 강글리온 세포 퇴행, 로돕신 돌연변이와 함께 망막색소변성, 노인성 전신 아밀로이드증, 세르피노병증, 시뉴클레인병증, 타우병증, 유형 II 당뇨병, 권투선수 치매 (만성 외상성뇌증), 전두측두엽치매, 전두측두엽 변성, 신경절세포종, 신경절신경아교종, 할러포르덴-슈파츠 질환, 납 독성뇌증, 지방갈색소증, 리티코-보디그 질환, 뇌막혈관종증, 진행성 핵상 마비, 아급성경화범뇌염, 매듭 프레도미넌트(tangle-predominant) 치매, 그리고 결절성 경화증. 또다른 구체예에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 APOA1, APOA2, APOA4, APP, B2M, CALCA, CST3, FGA, FGB, FGG, FUS, GFAP, GSN, HTT, IAPP, ITM2B, LYZ, MAPT, MFGE8, NOTCH3, NPPA, ODAM, PRL, PRNP, RHO, SAA 패밀리 구성원, SERPIN 패밀리 구성원, SFTPC, SNCA, SOD 패밀리 구성원, TARDBP, TGFBI, 그리고 TRR 또는 이의 단편 또는 변종으로부터 선택된 유전자를 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 표 6에서 선택된 유전자 또는 이의 단편을 인코드하며, 상기 환자는 표 6에서 열거된 대응하는 질환으로 진단받았다.
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타우병증의 예로는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 그리고 헌팅턴 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 기타 예시적인 타우병증은 권투선수 치매 (만성 외상성뇌증), 전두측두엽치매, 전두측두엽 변성, 신경절세포종, 신경절신경아교종, 할러포르덴-슈파츠 질환, 납 독성뇌증, 지방갈색소증, 리티코-보디그 질환, 뇌막혈관종증, 진행성 핵상 마비, 아급성경화범뇌염, 매듭 프레도미넌트 치매, 그리고 결절성 경화증을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 환자는 타우병증으로 진단된다. 한 구체예에 있어서, 상기 타우병증은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 그리고 헌팅턴 질환에서 선택된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 타우병증은 권투선수 치매 (만성 외상성뇌증), 전두측두엽치매, 전두측두엽 변성, 신경절세포종, 신경절신경아교종, 할러포르덴-슈파츠 질환, 납 독성뇌증, 지방갈색소증, 리티코-보디그 질환, 뇌막혈관종증, 진행성 핵상 마비, 아급성경화범뇌염, 매듭 프레도미넌트 치매, 그리고 결절성 경화증으로부터 선택된다.
자가면역 질환은 낭창, 다발성 경화증 (MS), 근위축성 측색 경화증 (ALS), 그리고 이식 거부를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 면역계의 하나 또는 그 이상의 요소들이 감염안된 그리고 암이 아닌 동질계(isogenic) 세포들 및/또는 조직을 공격함으로써 일부 야기되는 증상들을 특징으로 한다. 따라서, 특정 구체예들은 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 자가면역 질환은 낭창, 다발성 경화증 (MS), 근위축성 측색 경화증 (ALS), 그리고 이식 거부에서 선택된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 표적 DNA 분자는 숙주 면역계가 인지할 수 있는 폴리펩티드 서열을 인코드한다.
감염성 물질은 숙주 유기체 안에 존재하지 않는 핵산 서열들을 포함할 수 있다. 유전자-에디팅 단백질을 이용하여 감염성 물질 및/또는 감염 효과를 제거, 감소 또는 그렇지 않으면 전부 또는 일부를 변경시킬 수 있으며, 이러한 방식으로 이용될 때, 유전자-에디팅 단백질과 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산은 잠재적 항감염 치료제를 구성할 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 이러한 방식으로 처리될 수 있는 감염성 물질은 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 효모, 그리고 기생충을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 따라서, 특정 구체예들은 하나 또는 그 이상의 감염성 물질-연합된 서열들을 표적으로 하는 유전자-에디팅 단백질을 발현시키도록 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포, 곰팡이 세포, 효모 세포, 그리고 기생충 세포 중 하나다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포다. 추가 구체예에 있어서, 상기 세포는 인간 세포다. 다른 구체예들은 하나 또는 그 이상의 감염성 물질-연관된 서열들을 표적으로 하는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산이 포함된 치료요법적 조성물에 관한 것이다. 특정 구체예들은 감염에 민감한 또는 저항성과 연합된 하나 또는 그 이상의 서열들을 표적으로 하는 유전자-에디팅 단백질을 발현시키도록 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 다른 구체예들은 감염에 민감한 또는 저항성과 연합된 서열들을 표적으로 하는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산이 포함된 치료요법적 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 세포는 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산과 하나 또는 그 이상의 복구 주형을 인코드하는 핵산으로 트랜스펙션된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 복구 주형은 저항성 유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변종을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 복구 주형은 RNAi 서열을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 RNAi 서열은 shRNA다. 다른 구체예들은 환자에게 치료요법적으로 유효량의 유전자-에디팅 단백질 또는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 투여하는 것이 포함된 감염성 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이때 상기 유전자-에디팅 단백질은 감염성 물질 안에 존재하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열들에 결합할 수 있다.
DNA-복구 경로의 하나 또는 그 이상의 성분들의 발현 및/또는 기능을 변경시킴으로써, 비-상동성 단부 결합 사건에 대한 상동성 재조합 사건의 비율이 변경될 수 있음이 현재 밝혀졌다. DNA-복구 경로의 성분들이 인코드된 유전자의 비-제한적 예로는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: Artemis, BLM, CtIP, DNA-PK, DNA-PKcs, EXOl, FEN1, Ku70, Ku86, LIGIII, LIGIV, MRE11, NBS1, PARP1, RAD50, RAD54B, XLF, XRCC1, XRCC3, 그리고 XRCC4. 따라서, 특정 구체예들은 DNA-복구 경로의 하나 또는 그 이상의 성분들의 발현 및/또는 기능을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 발현 및/또는 기능은 증가된다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 발현 및/또는 기능은 감소된다. DNA-의존적 단백질 키나제 (DNA-PK)는 비-상동성 단부-결합 DNA-복구 경로의 성분이다. 상동성 재조합을 통한 복구는 DNA-PK의 발현 변경에 의해 증가될 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 한 구체예에 있어서, 세포는 DNA-PK 저해제에 접촉된다. DNA-PK 저해제의 예로는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 화합물 401 (2-(4-몰포리닐)-4H-피리도[2,1-a]이소퀴놀린-4-온), DMNB, IC87361, LY294002, NU7026, NU7441, OK-1035, PI 103 히드로클로라이드, 바닐린, 그리고 워트마닌(wortmannin).
유전적 돌연변이는 예를 들면, 정지 코돈을 도입시킴으로써 및/또는 개방 판독 틀(open reading frame)을 파괴함으로써, 단백질 산물의 길이에 영향을 줄 수 있다. 뒤센드 근이영양증이 포함된 특정 질환들은 절두된 및/또는 틀이동된(frameshifted) 단백질의 생산으로 야기될 수 있다. 유전자-에디팅 단백질을 이용하여 하나 또는 그 이상의 절두된 및/또는 틀이동된 단백질의 생산과 연합된 질환을 치료할 수 있다는 것이 지금 발견되었다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 질환-원인이 되는 돌연변이가 포함된 엑손의 약 1kb 또는 약 0.5kb 또는 약 0.1kb 이내에 이중 가닥 브레이크를 만든다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 하나 또는 그 이상의 야생형 서열들이 포함된 DNA와 공동-발현된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 DNA는 단일-가닥으로 되어 있다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 DNA는 이중-가닥으로 되어 있다. 절두된 단백질의 발현에 의해 야기되는 질환은 엑손 스키핑(skipping)에 의해 치료될 수 있다. 유전자-에디팅 단백질을 이용하여 엑손 스키핑이 유도될 수 있다는 것이 현재 발견되었다. 한 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 스킵되는 엑손의 약 1kb 또는 약 0.5kb 또는 약 0.1kb 이내에 이중 가닥 브레이크를 만든다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 스킵되는 엑손의 상류 인트론 약 1kb 또는 약 0.5kb 또는 약 0.1kb 이내에 이중 가닥 브레이크를 만든다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 유전자-에디팅 단백질은 스킵되는 엑손의 상류 인트론의 접합-수용체(splice-acceptor) 부위 약 1kb 또는 약 0.5kb 또는 약 0.1kb 이내에 이중 가닥 브레이크를 만든다.
핵산이 포함된 리포좀 제형을 포함하는 핵산이 생체내로 전달될 때 간 및/또는 비장에서 축적될 수 있다. 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산은 간과 비장에서 유전자 발현을 조절할 수 있고, 그리고 이러한 방식으로 이용된 상기 핵산은 간과 비장 질환의 치료를 위한 잠재적 치료제를 구성할 수 있다는 것이 지금 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예들은 환자에게 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 전달함으로써, 간 및/또는 비장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 구체예들은 하나 또는 그 이상의 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산이 포함된, 간 및/또는 비장 질환의 치료용 치료요법적 조성물에 관한 것이다. 치료될 수 있는 간 및/또는 비장의 질환 및 상태는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 간염, 알코올에 의해 유도된 간 질환, 약물에 의해 유도된 간 질환, 입스타인-바르(Epstein Barr) 바이러스 감염, 아데노바이러스 감염, 사이토메갈로바이러스 감염, 톡소포자충증, 록키산 홍반열, 비-알코올성 지방 간 질환, 혈색소증, 윌슨 질환, 길버트 질환, 그리고 간 및/또는 비장의 암. 본 발명의 상기 방법들을 이용하여 유전자-에디팅 단백질에 의해 표적화될 수 있는 서열들의 기타 예시(유전자, 유전자 패밀리 및 좌 포함)는 표 7에 제시되며, 이는 예시를 위하여 제공되는 것이며, 이에 한정시키고자 함은 아니다.
Figure pat00017
특정 구체예들은 본 발명의 상기 하나 또는 그 이상의 치료제 조성물과 하나 또는 그 이상의 어쥬번트 요법이 포함된 복합 요법에 관한 것이다. 예시적인 어쥬번트 요법은 표 8과 U.S. 가출원 번호. 61/721,302의 표 5(이의 내용은 본 명세서에서 참고자료에 편입된다)에 제시되며, 이는 예시를 위하여 제공되는 것이며, 이에 한정시키고자 함은 아니다.
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Figure pat00019
제약학적 조제물(preparations)은 운반 시약 (별칭으로 ＂트랜스펙션 시약＂) 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 제약학적으로 수용가능한 운반 시약들, 부형제, 그리고 조제물을 준비하고, 환자들(별칭으로 ＂대상＂)에게 약학 조제물을 투여하는 방법들이 포함된 방법들과 이의 용도는 당분야에 잘 공지되어 있으며, 그리고 예를 들면, US 특허 출원 공개 번호 US 2008/0213377(이의 전체는 본 명세서의 참고자료에 편입됨)이 포함된 다수의 공개물에서 제시된다.
예를 들면, 본 조성물들은 약학적으로 수용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 염은 예를 들면, J. Pharma. Sci. 66, 2-19 (1977) 그리고 The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl 및 C. G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002 (이들은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입됨)에 열거된 것들을 포함한다. 약학적으로 수용가능한 염의 비-제한적인 예로는 다음을 포함한다: 황산염, 구연산염, 아세트산염, 옥살산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 질산염, 중황산염, 인산염, 산 인산염, 이소니코틴산염, 젖산염, 살리실산염, 산 구연산염, 주석산염, 올레산염, 탄닌산염, 판토텐산염, 중주석산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레인산염, 겐티신산염(gentisinate), 푸마르산염, 글루콘산염, 글루카로산염(glucaronate), 사카라이드산염, 포름산염, 벤조산염, 글루타민산염, 메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 캄포르술폰산염, 파모산염, 페닐아세트산염, 트리플루오르아세트산염, 아크릴산염, 클로로벤조산염, 디니트로벤조산염, 히드록시벤조산염, 메톡시벤조산염, 메틸벤조산염, o-아세트옥시벤조산염, 나프탈렌-2-벤조산염, 이소부티레이트, 페닐부티레이트, α-히드록시부티레이트, 부틴-1,4-디카르복실레이트, 헥신-1,4-디카르복실레이트, 카프르산염(caprate), 카푸릴산염(caprylate), 계피산염, 글리콜산염, 헵타노에이트(heptanoate), 마뇨산염(hippurate), 말산염, 히드록시말레인산염, 말론산, 만델레이트, 메실레이트, 니코티네이트, 프탈레이트, 테라프탈레이트, 프로피오레이트, 프로피오네이트, 페닐프로피오네이트, 세바케이트, 수베르산염, p-브로모벤젠술폰산염, 클로로벤젠술폰산염, 에틸술폰산염, 2-히드록시에틸술폰산염, 메틸술폰산염, 나프탈렌-1-술폰산염, 나프탈렌-2-술폰산염, 나프탈렌-1,5-술폰산염, 크실렌술폰산염, 타르타레이트염, 알칼리 금속 이를 테면 나트륨, 칼륨의 수산화물, 그리고 리튬; 알칼리 토금속 이를 테면 칼슘 및 마그네슘의 수산화물; 기타 금속, 이를 테면 알루미늄 및 아연의 수산화물; 암모니아, 그리고 유기 아민, 이를 테면 치환안된 또는 히드록시-치환된 모노-, 디-, 또는 트리-알킬아민, 디사이클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-OH-저가 알킬아민), 이를 테면 모노-; 비스-, 또는 트리스-(2-히드록시에틸)아민, 2-히드록시-tert-부틸아민, 또는 트리스-(히드록시메틸)메틸아민, N,N-디-저가 알킬-N-(히드록실-저가 알킬)-아민, 이를 테면 N,N-디메틸-N-(2-히드록시에틸)아민 또는 트리-(2-히드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 그리고 아미노산 이를 테면 아르기닌, 리신, 그리고 이와 유사한 것들.
본 약학 조성물들은 액체 이를 테면 물과 석유, 동물, 식물성, 또는 합성 기원의 오일이 포함된 오일, 이를 테면 땅콩유, 대두유, 미네랄오일, 참깨유 및 이와 유사한 것들이 포함된 부형제를 포함할 수 있다. 약학 부형제는 예를 들면, 염, 아카시아검, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 규소, 요소 및 이, 이와 유사한 것들이 될 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 농조화제(thickening), 윤활제, 그리고 발색제가 이용될 수 있다. 한 구체예에 있어서,약학적으로 수용가능한 부형제는 대상에게 투여될 때 멸균된다. 적합한 약학 부형제는 전분, 포도당, 젖당, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 석회분말, 실라카겔, 스테아레이트 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 이와 유사한 것들을 또한 포함한다. 바람직한 경우, 본 명세서에서 설명된 임의의 물질은 소량의 가습제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 포함할 수 있다.
다양한 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 상기 조성물들은 예를 들면, 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 2.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 25 mg/kg의 유효 투여분량(dose)으로 투여될 수 있다. 유효한 투여분량(effective dose)으로 고려될 수 있는 정확한 측정은 환자의 체격, 나이 및 질환의 유형이 포함된 각 환자에게 개별적인 요인에 근거할 수 있다. 용량(dosages)은 본 명세서 및 당분야의 지식을 가진 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들면, 투여분량은 참고자료 Physicians＇ Desk Reference, 66th Edition, PDR Network; 2012 Edition (2011년 12월 27일), (이의 내용은 전체가 본 명세서의 참고자료에 편입됨)을 참고하여 결정될 수 있다.
본 발명의 활성 조성물들은 고유의 약학 조제물을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 이들 조성물은 상기 표적 조직이 이 경로를 통하여 이용가능하다면, 임의의 통상적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경로에는 경구, 비강 또는 볼을 포함한다. 대안으로, 투여는 피부내, 피하, 근육내, 복막내 또는 정맥 주사, 또는 암 조직으로 직접 주사에 의해 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 공개된 물질들은 카테테르 시스템에 의해 또한 투여될 수 있다. 이러한 조성물들은 본 명세서에서 설명된 것과 같은 약학적으로 수용가능한 조성물로 보통 투여될 것이다.
제형화 될 때, 투약형(dosage formulation)에 양립되는 방식, 그리고 치료요법적으로 효과적인 양으로 용액이 투여될 수 있다. 상기 제형은 다양한 투약형, 이를 테면 주사가능한 용액, 약물 방출 캡슐 및 이와 유사한 것들에 의해 용이하게 투여될 수 있다. 수성 용액으로 비경구(parenteral) 투여의 경우, 예를 들면, 용액은 예를 들면, 충분한 염수 또는 포도당으로 등장성이 우선 제공된 적절하게 완충된 액체 희석물이다. 이러한 수성 용액은 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하 그리고 복막내 투여용으로 이용될 수 있다. 바람직하게는, 멸균 수성 매체(media)는 당분야에 공지된, 특히 본 내용에 맞게 이용된다.
예시적인 대상 또는 환자들은 인간 및 기타 영장류 (이를 테면, 침팬지와 기타 유인원 그리고 원숭이 종), 농장 동물 (이를 테면, 소, 양, 돼지, 염소 및 말), 가정의 포유류 (이를 테면, 개와 고양이), 실험실 동물 (이를 테면, 설치류 이를 테면 마우스, 렛 그리고 기니아 피그), 그리고 조류 (이를 테면, 가정용, 야생 및 경기용 조류 이를 테면 닭, 칠면조 및 순계류(gallinaceous) 조류, 오리, 거위 및 이와 유사한 것들)이 포함되나 이에 국한되지 않은 임의의 척추동물을 말한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상은 포유류다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상은 인간이다.
본 발명은 다음의 비-제한적 실시예들을 통하여 더 설명된다.
실시예들
실시예 1 RNA 합성
인간 유전자 XPA, CCR5, TERT, MYC, 및 BIRC5를 표적으로 하는 인간 단백질 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc-2 (T58A), Lin28 또는 TALENs을 인코드하고, 다양한 조합의 정규 및 비-정규 뉴클레오티드가 포함된 RNA는 mRNA Cap 2＇-O-메틸전이효소와 T7 하이 일드(High yield) RNA 합성 키트 및 Vaccinia Capping System 키트 (모두 다 New England Biolabs, Inc.의 제품)를 이용하여, 제조업자의 지침 및 본원 발명자들의 기존의 공개된 발명들 (U.S. 출원 번호. 13/465,490 (현재 U.S. 특허 번호 8,497,124), U.S. 가출원 번호. 61/637,570, U.S. 가출원 번호. 61/664,494, 국제 출원 번호. PCT/US12/67966, U.S. 가출원 번호. 61/785,404, U.S. 출원 번호. 13/931,251, 그리고 U.S. 가출원 번호. 61/842,874( 이들 모든 내용은 본 명세서의 참고자료에 편입된다) (표 9, 도 1a, 도 1b, 및 도 15)에 따라 DNA 주형으로부터 합성되었다 상기 RNA는 그 다음 뉴클라아제-없는 물을 이용하여 100ng/μL 내지 200ng/μL사이가 되도록 희석되었다. 특정 실험을 위하여, RNase 저해제 (Superase·In, Life Technologies Corporation)는 1μL/100μg의 RNA 농도로 추가되었다. RNA 용액은 4℃에서 보관되었다. 재프로그래밍 실험을 위하여, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc-2 (T58A), 및 Lin28을 인코드하는 RNA는 3:1:1:1:1의 몰비로 혼합되었다.
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실시예 2 세포에 합성 RNA를 트랜스펙션
6-웰 플레이트에서 트랜스펙션을 위하여, 2μg RNA와 6μL 트랜스펙션 시약 (리포펙타민 RNAiMAX, Life Technologies Corporation)은 우선 복합 배지 (Opti-MEM, Life Technologies Corporation 또는 DMEM/F12 + 10μg/mL 인슐린 + 5.5μg/mL 트란스페린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 2μg/mL 에탄올아민)에서 각각 총 용적 60μL가 되도록 별도로 희석되었다. 그 다음 희석된 RNA와 트랜스펙션 시약은 혼합되고, 상기 트랜스펙션 시약-제조업자의 지침에 따라 15분간 실온에서 항온처리되었다. 그 다음 복합물은 배양물내 세포에 추가되었다. 30μL 내지 240μL의 복합물은 웰당 2mL의 트랜스펙션 배지가 미리 포함된 6-웰 플레이트의 각 웰에 추가되었다. 웰 안에 복합물이 분포되도록 부드럽게 플레이트를 흔들었다. 세포들은 4시간 내지 하룻밤 동안 복합물과 항온처리된 후, 이 배지는 새로운 트랜스펙션 배지 (2mL/웰)로 대체되었다. 24-웰과 96-웰 플레이트에서 트랜스펙션을 위하여 용적은 저울로 달았다. 대안으로, 0.5μg 내지 5μg의 RNA와 RNA μg당 2-3μL의 트랜스펙션 시약 (리포펙타민 2000, Life Technologies Corporation)은 각각 총 용적이 5μL와 100μL이 되도록 복합 배지 (Opti-MEM, Life Technologies Corporation 또는 DMEM/F12 + 10μg/mL 인슐린 + 5.5μg/mL 트란스페린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 2μg/mL 에탄올아민)에서 우선 별도로 희석되었다. 그 다음 희석된 RNA와 트랜스펙션 시약이 혼합되었으며, 10분간 실온에서 항온처리되었다. 그 다음 복합물은 배양물내 세포에 추가되었다. 10μL 내지 240μL의 복합물은 웰당 2mL의 트랜스펙션 배지가 미리 포함된 6-웰 플레이트의 각 웰에 추가되었다. 특정 실험에서, DMEM + 10% FBS 또는 DMEM + 50% FBS가 트랜스펙션 배지를 대신하여 이용되었다. 웰 안에 복합물이 분포되도록 부드럽게 플레이트를 흔들었다. 세포들은 4시간 내지 하룻밤 동안 복합물과 항온처리되었다. 특정 실험에서, 상기 배지는 트랜스펙션 후 4시간 또는 24시간 후 새로운 트랜스펙션 배지 (2mL/웰)로 대체되었다.
실시예 3 비-정규 뉴클레오티드들이 포함된 합성 RNA의 독성 및 합성 RNA로부터 단백질 해독
1차 인간 섬유아세포들은 실시예 2에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA를 이용하여 트랜스펙션되었다. 세포들은 고정되었고, Oct4에 대한 항체를 이용하여 트랜드펙션된 후 20-24시간에 착색되었다. 상기 RNA의 상대적인 독성은 고정시점에서 세포 밀도를 측정함으로써 결정되었다.
실시예 4 트랜스펙션 배지 제형화
세포들을 핵산으로 효과적으로 트랜스펙션시키고, 효율적인 재프로그래밍을 위하여 세포-배양 배지 (＂트랜스펙션 배지＂)가 개발되었다:
DMEM/F12 + 15mM HEPES + 2mM L-알라닐-L-글루타민 + 10μg/mL 인슐린 + 5.5μg/mL 트란스페린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 2μg/mL 에탄올아민 + 50μg/mL L-아스코르브산 2-인산염 세스퀴마그네슘 염 수화물 + 4μg/mL 콜레스테롤 + 1μM 히드로코르티손+ 25μg/mL 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레산염 + 2μg/mL D-알파-토코페롤 아세트산염 + 20ng/mL bFGF + 5mg/mL 처리된 인간 혈청 알부민.
다능성 줄기 세포들이 포함된 다양한 세포 유형의 강력한, 장기 배양을 지원하기 위하여 이 배지의 변형 (＂유지 배지＂)이 개발되었다:
DMEM/F12 + 2mM L-알라닐-L-글루타민 + 10μg/mL 인슐린 + 5.5μg/mL 트란스페린 + 6.7ng/mL 셀레나이트 나트륨 + 2μg/mL 에탄올아민 + 50μg/mL L-아스코르브산 2-인산염 세스퀴마그네슘 염 수화물 + 20ng/mL bFGF + 2ng/mL TGF-β1.
처리된 인간 혈청 알부민은 32mM 옥타노에이트 나트륨의 추가에 의해 처리되고, 이어서 60℃에서 4h동안 가열되고, 실온에서 6시간 동안 이온-교환 수지 (AG501-X8(D), Bio-Rad Laboratories, Inc.)로 처리되고, 덱스트란-피복된 활성탄 (C6241, Sigma-Aldrich Co. LLC.)으로 실온에서 하룻밤 동안 처리되고, 이어서 원심분리, 여과, 뉴클라아제-없는 물로 10% 용액으로 조정된 후, 배지의 다른 성분이 추가되어 처리된 배지는 다른 언급이 없는 한 본 명세서에서 설명된 모든 실시예에서 트랜스펙션 배지로 이용되었다. 재프로그래밍 실험을 위하여, 다른 언급이 없는 한, 피복안된 플레이트 상에서 DMEM + 10%-20% 혈청에서, 또는 피브로넥틴과 비트로넥틴-피복된 플레이트 상에서 트랜스펙션 배지에서 세포들이 도말되었다. 조건-상기 트랜스펙션 배지는 다른 언급이 없는 한, 조건화되지 않았다. 상기 트랜스펙션 배지의 제형화는 배양되는 특이적 세포의 필요에 부합되도록 조정될 수 있음이 이해된다. 처리된 인간 혈청 알부민은 배지의 수행능력에 음성적인 영향없이 다른 처리된 알부민, 예를 들면, 처리된 소의 혈청 알부민으로 대체될 수 있음이 추가 인정된다. 다른 글루타민 원천은 L-알라닐-L-글루타민, 예를 들면, L-글루타민을 대신하여 또는 이에 추가하여 이용될 수 있으며, 다른 완충 시스템은 HEPES, 예를 들면, 인산염, 중탄산염, 등을 대신하여 또는 이에 추가하여 이용될 수 있으며, 셀레늄은 셀레나이트 나트륨을 대신하여 또는 이에 추가하여 다른 형태, 예를 들면, 셀레누스 산(selenous acid)으로 제공될 수 있으며, 다른 항산화제가 L-아스코르브산 2-인산염 세스퀴마그네슘 염 수화물 및/또는 D-알파-토코페롤 아세트산염, 예를 들면, L-아스코르브산을 대신하여, 또는 이에 추가하여 이용될 수 있으며, 다른 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레산염, 예를 들면, Pluronic F-68 및/또는 Pluronic F-127을 대신하여 또는 이에 추가하여 이용될 수 있으며, 다른 기저배지가 DMEM/F12, 예를 들면, MEM, DMEM, 등을 대신하여 또는 이에 추가하여 이용될 수 있으며, 그리고 배양 배지의 성분들은 시간에 따라 변경될 수 있는데, 예를 들면, 배지의 기능에 음성적 영향을 주지 않고, 0일차에서 5일차 시점까지는 TGF-β이 없는 배지를 이용하고, 그 다음 5일차 이후부터 2ng/mL TGF-β이 포함된 배지를 이용할 수 있다는 것이 추가 인정된다. 다른 성분들, 예를 들면, 지방산, 리소포스파딕산, 리소스핑고미엘린, 스핑고신-1-인산염, 다른 스핑고리피드, Y-27632와 티아조비빈이 포함된 ROCK 저해제들, TGF-β/NODAL 패밀리 단백질 의 구성원, IL-6, Wnt 패밀리 단백질의 구성원, 등이 배지의 성능에 음성적 영향없이 적절한 농도로 추가될 수 있는데, 그리고 특이적 세포 유형의 성장을 촉진 또는 저해시키는 것으로 알려진 성분들, 및/또는 특이적 세포 유형의 성장을 촉진 또는 저해시키는 것으로 알려진 단백질 또는 다른 분자들의 항진제 및/또는 길항제, 예를 들면, 스핑고신-1-인산염과 다능성 줄기 세포들이 배지의 성능에 음성적 영향없이 적절한 농도로 추가될 수 있다는 것이 추가 인정된다. 본 발명은 정제된 화합물들로 추가되는 성분들, 잘-특정된 혼합물의 일부분으로 추가되는 성분들, 복합물 또는 특정안된 혼합물의 일부분, 예를 들면, 동물 또는 식물 오일의 일부분으로 추가되는 성분들, 그리고 생물학적 공정, 예를 들면, 조건화(conditioning)에 의해 추가되는 성분들에 대하여 대등하게 관계한다. 이들 성분들의 농도는 범위내 열거된 값으로부터 배지의 성능에 음성적 영향을 주지 않으면서 당업자에게 자명한 것으로 변화될 수 있다. 배지의 동물 성분-없는 형태는 모든 단백질 성분들의 재조합 형태, 그리고 반-합성 식물-유도된 콜레스테롤 (Avanti Polar Lipids, Inc.)이 포함된, 모든 다른 성분들의 비-동물-유도된 형태를 이용하여 만들었다.
실시예 5 비-정규 뉴클레오티드가 포함된 합성 RNA를 이용하여 인간 섬유아세포의 재프로그래밍
1차 인간 신생 섬유아세포들은 재조합 인간 피브로넥틴과 재조합 인간 비트로넥틴 (각각은 1μg/mL 및 1mL/웰의 농도로 DMEM/F12에서 희석되었으며, 그리고 실온에서 1시간 동안 항온처리되었다)으로 피복된 6-웰 플레이트 상에 트랜스펙션 배지내 웰당 10,000개의 세포 밀도로 도말되었다. 다음 날, 상기 세포들은 A, 0.5 7dG, 0.5 5mU, 및 5mC이 포함된 RNA를 이용하여 실시예 2에서와 같이 트랜스펙션되었는데, 첫 날 RNA 투여분량은 0.5μg/웰 이며, 둘째 날은 0.5μg/웰이며, 셋째 날은 2μg/웰이며, 넷째 날은 2μg/웰이고, 그리고 다섯째 날은 4μg/웰이었다. 재프로그래밍과 일치되는 형태를 보이는 세포들의 작은 콜로니는 빠르면 5일차부터 보이기 시작되었다. 상기 배지는 6일차에 유지 배지로 대체되었다. 세포는 Oct4에 대한 항체를 이용하여 착색되었다. 재프로그래밍과 일치되는 형태를 보이는 세포들의 Oct4-양성 콜로니는 웰 도체에서 볼 수 있었다 (도 2).
실시예 6 합성 RNA를 이용하여 피더-없는, 계대-없는, 면역억제제-없는, 조건화-없는의 1차 성인 섬유아세포의 재프로그래밍
6-웰 플레이트의 웰은 재조합 인간 피브로넥틴과 재조합 인간 비트로넥틴 (DMEM/F12, 1μg/mL,1mL/웰)의 혼합물로 1시간 동안 실온에서 피복되었다. 1차 성인 인간 섬유아세포들은 피복된 웰 안의 트랜스펙션 배지에서 웰당 10,000개 세포의 밀도로 도말되었다. 세포들은 37℃, 5% CO2, 및 5% O2에서 유지되었다. 다음 날부터 세포들은 실시예 1에서 합성된 RNA로 5일간 매일 실시예 2에 따른 트랜스펙션이 시작되어, 5일간 지속되었다. 5일간 매일 트랜스팩션된 각 총량은 0.5μg, 0.5μg, 2μg, 2μg, 그리고 4μg이었다. 4번째 트랜스펙션을 시작할 때, 상기 배지는 일일 두차례 대체되었다. 최종 트랜스펙션후 그날 상기 배지는 10μM Y-27632가 보충된 트랜스펙션 배지로 대체되었다. 재프로그램된 형태를 가진 세포들의 조밀한 콜로니는 4일차에 각 트랜스펙션된 웰에서 볼 수 있었다 (도 8).
실시예 7 성인 인간 피부 생검 조직으로부터 세포의 효과적이고, 신속한 유도 및 재프로그래밍
승인된 프로토콜에 따라 건강한 31세의 지원자에서 전층-두께의 피부 펀치 생검이 실행되었다. 간략하게 설명하자면, 좌측 상박 피부 일부를 2.5% 리도카인 국소 제공에 의해 마취시켰다. 이 부위는 70% 이소프로판올로 살균되었으며, 1.5 mm-직경 펀치를 이용하여 전체 두깨 피부 생검이 실행되었다. 상기 조직은 인산염-완충된 염수 (PBS)로 헹궈내었으며, 250μL의 TrypLE Select CTS (Life Technologies Corporation)가 포함된 1.5mL 튜브 안에 넣어 두었고, 그리고 37℃에서 30분간 항온처리되었다. 그 다음 상기 조직은 250μL의 DMEM/F12-CTS (Life Technologies Corporation) + 5mg/mL 콜라게나아제가 포함된 1.5mL 튜브로 옮기고, 37℃에서 2시간 항온처리되었다. 집게를 이용하여 상피가 제거되었으며, 조직은 기계적으로 해리되었다. 세포들은 DMEM/F12-CTS에서 2회 세척되었다. 동일한 지원자에서 정맥절개술(Phlebotomy)이 또한 실행되었으며, 정맥혈은 Vacutainer SST 튜브(Becton, Dickinson and Company)에 수집되었다. 혈청은 제조업자의 지시에 따라 단리되었다. 동질동계(Isogenic) 도말 배지는 DMEM/F12-CTS + 2mM L-알라닐-L-글루타민 (Sigma-Aldrich Co. LLC.) + 20% 인간 혈청를 혼합하여 준비되었다. 피부 조직 시료에서 얻은 세포는 피브로넥틴-피복된 6-웰 플레이트의 동질계 도말 배지에서 도말되었다. 섬유아세포 형태를 가진 많은 세포들이 2일차 시점에서 부착되고 확산되기 시작하였다 (도 3a). 세포들은 Synth-a-Freeze (Life Technologies Corporation)에서 확장되었고, 동결되었다.
세포는 웰당 5,000개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 계대되었다. 다음 날, 상기 배지는 트랜스펙션 배지로 대체되었으며, 상기 세포들은 A, 0.5 7dG, 0.4 5mU, 및 5mC이 포함된 RNA를 이용하여 실시예 2에서와 같이 트랜스펙션되었는데, 첫 날 RNA 투여분량은 0.5μg/웰 이며, 둘째 날은 0.5μg/웰이며, 셋째 날은 2μg/웰이며, 넷째 날은 2μg/웰이고, 그리고 다섯째 날은 2μg/웰이었다. 특정 웰들에는 6일차와 7일차에 추가로 2μg/웰 트랜스펙션이 제공되었다. 또한, 특정 웰들에는 4일차부터 계속 2ng/mL TGF-β1이 제공되었다. 상기 배지는 6일차에 유지 배지로 대체되었다. 재프로그래밍과 일치되는 형태를 보이는 세포들의 콜로니는 빠르면 5일차 내지 10일 사이에 보이기 시작되었다. (도 3b). 콜로니는 신속하게 성장되었으며, 많은 것들은 배아 줄기-세포 콜로니와 유사한 형태를 나타내었다 (도 3c). 콜로니를 찍어내어, 재조합 인간 피브로넥틴과 재조합 인간 비트로넥틴 (각각 1μg/mL 및 1mL/웰의 농도로 DMEM/F12에서 희석되었으며, 실온에서 1시간 동안 항온처리되었다)이 피복된 웰에 도말되었다. 세포들은 신속하게 성장되었으며, 계통이 확립되도록 계대되었다.
실시예 8 CCR5를 표적으로 하는 RiboSlice의 합성
다음 서열들: L1: TCATTTTCCATACAGTCAGT, L2: TTTTCCATACAGTCAGTATC, R1: TGACTATCTTTAATGTCTGG, and R2: TATCTTTAATGTCTGGAAAT을 표적으로 하는 RiboSlice 쌍은 실시예 1에 따라 합성되었다 (도 4a와 도 4b). 이들 쌍들은 인간 CCR5 유전자의 센스 가닥 (L1 및 L2) 또는 안티센스 가닥 (R1 및 R2) 안에 20-bp 부위를 표적으로 한다. 다음의 쌍들이 만들어졌다: L1&R1, L1&R2, L2&R1, 그리고 L2&R2.
실시예 9 부정합(Mismatch) 탐지 뉴클레아제를 이용하여 CCR5 유전자-에디팅 효과의 측정
1차 인간 섬유아세포들은 재조합 인간 피브로넥틴과 재조합 인간 비트로넥틴 (각각 1μg/mL 및 1mL/웰의 농도로 DMEM/F12에서 희석되었으며, 그리고 실온에서 1시간 동안 항온처리되었다)으로 피복된 6-웰 플레이트 상에 트랜스펙션 배지내 웰당 10,000개의 세포 밀도로 도말되었다. 다음 날부터 상기 세포들은 실시예 8에서 합성된 RNA로 5일간 매일 실시예 2에 따른 트랜스펙션되었다. 상기 트랜스펙션 후 2일차, 게놈 DNA가 단리되었고, 정제되었다. CCR5 유전자내의 영역은 프라이머 F: AGCTAGCAGCAAACCTTCCCTTCA 및 R: AAGGACAATGTTGTAGGGAGCCCA을 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 150ng의 증폭된 PCR 산물은 10mM Tris-Cl + 50mM KCl + 1.5mM MgCl2에서 150ng의 기준 DNA와 혼성화되었다. 상기 혼성화된 DNA는 부정합-탐지 엔도뉴클레아제 (SURVEYOR 뉴클라아제, Transgenomic, Inc.)로 처리되었으며, 생성된 산물은 아가로즈 겔 전기영동 (도 4c 및 도 4d)에 의해 분석되었다.
실시예 10 RiboSlice을 이용한 반복 트랜스펙션에 의한 고-효율 유전자 에디팅
1차 인간 섬유아세포들은 실시예 9와 같이 도말되었다. 다음 날부터 상기 세포들은 실시예 8에서 합성된 RNA로 5일간 매일 실시예 2에 따른 트랜스펙션되었다. 다음 날 웰중 하나에 있는 세포들은 두번째 트랜스펙션되었다. 제 2 트랜스펙션 후 2일 시점에서, 유전자 에디팅의 효율은 실시예 9에서와 같이 측정되었다 (도 4e).
실시예 11 RiboSlice 및 DNA-없는, 피더-없는, 면역억제제-없는, 조건화-없는 인간 섬유아세포의 재프로그래밍을 이용하여 CCR5의 유전자-에디팅
1차 인간 섬유아세포들은 실시예 9와 같이 도말되었다. 다음 날부터 상기 세포들은 실시예 8에서 합성된 RNA로 실시예 2에 따른 트랜스펙션되었다. 대략 48h 후, 상기 세포들은 실시예 5에 따라, 실시예 1에서 합성된 RNA를 이용하여 재프로그램되었다. 재프로그래밍의 형태학적 특징을 가진 세포들의 큰 콜로니들이 실시예 5에서와 같이 보이기 시작되었다 (도 4f). 계통을 확립하기 위하여 콜리니들을 찍어내었다. 유전자 에디팅을 확인하기 위하여 세포 계통은 직접 서열화되었다 (도 4g).
실시예 12 HIV/AIDS용 유전자-에디트된 재프로그램된 세포를 포함하는 개인맞춤화된 세포-대치 요법
환자 피부 세포들은 본 발명자의 기존의 공개된 발명 (U.S. 출원 번호. 13/465,490, U.S. 가출원 번호. 61/637,570, 그리고 U.S. 가출원 번호. 61/664,494) 및/또는 실시예 11에 따라 유전자 에디트되며, 조혈 세포로 재프로그램된다. 그 다음 배양 용기로부터 세포들은 효소적으로 방출되며, 그리고 CD34+/CD90+/Lin- 또는 CD34+/CD49f+/Lin- 세포들이 또한 단리된다. 약 1 X 103 내지 약 1 X 105 세포들은 환자의 주요 혈관 안으로 주입된다. 조혈 세포들은 골수 공간으로 회귀되어, 접목된다(engraft).
실시예 13 APP-비활성화된 렛 배아 줄기 세포의 생산
렛의 배아 줄기 세포들은 렛 줄기 세포 배지에서 웰당 10,000개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 도말된다. 다음 날부터 상기 세포들은 다음의 서열을 표적으로 하는 실시예 1에서 합성된 0.5μg/웰의 RiboSlice로 실시예 2와 같이 트랜스펙션된다: L: ttctgtggtaaactcaacat 그리고 R: tctgactcccattttccatt (0.25μg L 및 0.25μg R).
실시예 14 APP-비활성화된 렛의 배아 줄기 세포를 이용하여 APP-녹아웃 렛의 생산
렛의 배아 줄기 세포들은 실시예 13에 따라 유전자-에디팅되고, 렛의 낭포로 현미주사된다(microinjected). 현미주사된 낭포들은 그 다음 상상임신한 암컷 렛에게 전이된다.
실시예 15 녹아웃 렛의 생성을 위하여 APP-비활성화된 배의 생산
다음 서열들: L: ttctgtggtaaactcaacat 및 R: tctgactcccattttccatt을 표적으로 하는 RiboSlice 쌍은 실시예 1에 따라 합성된다. 5μg/μL 농도의 RiboSlice는 1-세포-단계 렛의 배아의 풋핵(pronucleus) 또는 세포질로 주사된다. 그 다음 배아는 상상임신 암컷 렛에게 전이된다.
실시예 16 비-정규 뉴클레오티드들이 포함된 합성 RNA와 복구 주형으로 세포를 트랜스펙션
6-웰 플레이트에서 트랜스펙션을 위하여, 인간 APP 유전자의 엑손 16을 표적으로 하는 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 1μg RNA, 상기 표적 세포에 존재하지 않는 PstI 제한 부위가 포함된 단일-가닥으로 된 복구 주형 DNA 1μg, 그리고 6μL 트랜스펙션 시약 (리포펙타민 RNAiMAX, Life Technologies Corporation)은 우선 총 용적 120 μL가 되도록 별도로 복합 배지 (Opti-MEM, Life Technologies Corporation)에서 희석되었다. 희석된 RNA, 복구 주형, 그리고 트랜스펙션 시약은 그 다음 혼합되고, 상기 트랜스펙션 시약의 제조업자의 지시에 따라 15분간 실온에서 항온처리되었다. 복합물은 배양물내 세포에 추가되었다. 대략 120μL의 복합물은 웰당 2mL의 트랜스펙션 배지가 미리 포함된 6-웰 플레이트의 각 웰에 추가되었다. 웰 안에 복합물이 분포되도록 부드럽게 플레이트를 흔들었다. 세포들은 4시간 내지 하룻밤 동안 복합물과 항온처리된 후, 이 배지는 새로운 트랜스펙션 배지 (2mL/웰)로 대체되었다. 다음 날, 상기 배지는 DMEM + 10% FBS로 교환되었다. 트랜스펙션 후 2일차, 게놈 DNA가 단리되었고, 정제되었다. APP 유전자 안의 영역은 PCR에 의해 증폭되었고, 증폭된 산물은 PstI으로 절단되고, 겔 전기영동에 의해 분석되었다 (도 16).
실시예 17 안전한 정박 위치에서 렛의 배아 줄기 세포로 전이유전자의 삽입
렛의 배아 줄기 세포들은 렛 줄기 세포 배지에서 웰당 10,000개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 도말된다. 다음 날, 실시예 1에 따라 합성된, 다음 서열들: L: TATCTTCCAGAAAGACTCCA 및 R: TTCCCTTCCCCCTTCTTCCC을 표적으로 하는 RiboSlice와 렛의 Rosa26 좌 주변 영역에 상동성인 대략적으로 400개 염기가 각 포함된 두 영역의 측면에 있는 전이 유전자가 포함된 복구 주형으로 상기 세포들은 실시예 13과 같이 트랜스펙션된다.
실시예 18 인간화된 LRRK2 렛
렛의 배아 줄기 세포들이 도말되고, 다음 서열들을 표적으로 하는, 실시예 1에 따라 합성된 RiboSlice으로 실시예 13에서와 같이 트랜스펙션된다: L: TTGAAGGCAAAAATGTCCAC 및 R: TCTCATGGAGTCCAGGA. 트랜스펙션 후 2일 시점에서, 상기 세포들은 실시예 17에 따라 트랜스펙션되는데, 이때 전이유전자는 인간 LRRK2 유전자, 그리고 임의선택적으로 인간 LRRK2 프로모터 영역의 일부 또는 전부를 포함한다.
실시예 19 안전한 정박 위치에서 인간의 섬유아세포로 전이유전자의 삽입
1차 인간 섬유아세포들은 실시예 9에서와 같이 도말된다. 다음 날, 실시예 1에 따라 합성된, 다음 서열들: L: TTATCTGTCCCCTCCACCCC 및 R: TTTTCTGTCACCAATCCTGT을 표적으로 하는 RiboSlice와 인간 AAVS1 좌 주변 영역에 상동성인 대략적으로 400개 염기가 각 포함된 두 영역의 측면에 있는 전이 유전자가 포함된 복구 주형으로 상기 세포들은 실시예 2와 같이 트랜스펙션된다.
실시예 20 안전한 정박 위치로 RNAi 서열의 삽입
1차 인간 섬유아세포들은 실시예 19에 따라 도말되고, 트랜스펙션되며, 이때 상기 전이유전자는 앞에 PolIII 프로모터를 앞에 두고, shRNA를 인코드하는 서열을 포함한다.
실시예 21 RiboSlice를 이용하여 Myc의 유전자 에디팅
1차 인간 섬유아세포들은 DMEM + 10% FBS에서 웰당 50,000개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 도말된다. 2일 후, 상기 배지는 트랜스펙션 배지로 교환되었다. 4시간 후, 상기 세포들은 실시예 1에 따라 합성된, 다음 서열들: L: TCGGCCGCCGCCAAGCTCGT 및 R: TGCGCGCAGCCTGGTAGGAG을 표적으로 하는 1μg/웰의 RiboSlice를 이용하여, 실시예 2에 따른 트랜스펙션되었다. 다음 날, 다음 프라이머: F: TAACTCAAGACTGCCTCCCGCTTT 및 R: AGCCCAAGGTTTCAGAGGTGATGA을 이용하여 실시예 9에서와 같이 유전자-에디팅 효율이 측정되었다 (도 5).
실시예 22 Myc를 표적으로 하는 RiboSlice가 포함된 암 요법
HeLa 경부 암종 세포들은 엽산-없는 DMEM + 2mM L-알라닐-L-글루타민 + 10% FBS에서 웰당 50,000개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 도말된다. 다음 날, 상기 배지는 트랜스펙션 배지로 교환되었다. 다음 날, 상기 세포들은 실시예 21에 따른 트랜스펙션되었다.
실시예 23 RiboSlice를 이용하여 BIRC5 의 유전자 에디팅유전자
1차 인간 섬유아세포들은 DMEM + 10% FBS에서 웰당 50,000개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 도말된다. 2일 후, 상기 배지는 트랜스펙션 배지로 교환되었다. 4시간 후, 상기 세포들은 실시예 1에 따라 합성된, 다음 서열들: L: TTGCCCCCTGCCTGGCAGCC 및 R: TTCTTGAATGTAGAGATGCG을 표적으로 하는 1μg/웰의 RiboSlice를 이용하여, 실시예 2에 따른 트랜스펙션되었다. 다음 날, 다음 프라이머: F: GCGCCATTAACCGCCAGATTTGAA 및 R: TGGGAGTTCACAACAACAGGGTCT 을 이용하여 실시예 9에서와 같이 유전자-에디팅 효율이 측정되었다 (도 6).
실시예 24 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice가 포함된 암 요법암 요법
HeLa 경부 암종 세포들은 엽산-없는 DMEM + 2mM L-알라닐-L-글루타민 + 10% FBS에서 웰당 50,000개의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 도말된다. 다음 날, 상기 배지는 트랜스펙션 배지로 교환되었다. 다음 날, 상기 세포들은 실시예 23에 따른 트랜스펙션되었다 (도 7a와 도 7b).
실시예 25 암-세포-계통의 배양
암 세포 계통 HeLa (경부 암종), MDA-MB-231 (유방), HCT 116 (결장), U87 MG (신경아교종), 및 U-251 (신경아교종)는 배양물에서 증식되었다. 세포들은 DMEM + 10% FBS 또는 DMEM + 50% FBS에서 배양되었고, 그리고 37℃, 5%CO2, 그리고 외기 O2 또는 5% O2에서 유지되었다. 모든 조건에서 세포들은 신속하게 성장되었고, HBSS에서 트립신 용액을 이용하여 매 2-5일마다 일상적으로 계대되었다.
실시예 26 RiboSlice 유전자-에디팅 RNA 기획 프로세스 및 알고리즘
BIRC5 유전자의 주석이 달린 DNA 서열은 eFecth 유틸리티 및 파이톤 스크립트(python script)를 이용하여 NCBI로부터 검색되었다 동일한 파이톤 스크립트를 이용하여 BIRC5 유전자의 4개 엑손 각각 안에 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 확인하였다. 그 다음 상기 스크립트는 이들 서열과, 다음의 조건을 만족하는 요소들을 서열화하기 위하여 각 측면에 인접한 40개 염기를 조사하였다: (i) 한 요소는 1차 가닥상에 존재하고, 다른 요소는 상보적 가닥에 존재하며, (ii) 각 요소는 T로 시작하고, 그리고 (iii) 이들 요소는 12개보다 적지 않지만, 20개 염기를 넘지않는 범위로 분리되어 있다. 그 다음 각 요소에는 점수가 배당되는데, 이 점수는 Qblast (NCBI)을 이용하여 인간 게놈 안에 다른 요소들에 결합 가능성을 나타낸다. 이 점수는 상기 표적 서열에 부합되는 것을 배제하고, 9개의 최저 E-값의 역의 합산으로 산출되었다. 쌍 점수는 개별 요소들의 점수를 추가하여 산출되었다.
실시예 27 유전자-에디팅 단백질 (RiboSlice)을 인코드하는 RNA의 합성
유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 RNA는 실시예 26에 따라 기획되었고, 실시예 1에 따라 합성되었다 (표 10, 도 9). 상기 RNA는 뉴클라아제-없는 물을 이용하여 200ng/μL 내지 500ng/μL의 농도로 희석되었고, 그리고 4℃에서 보관되었다.
Figure pat00024
실시예 28 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice의 활성 분석
1차 성인 인간 섬유아세포들은 실시예 26에 따라 기획되고, 실시예 27에 따라 합성된 BIRC5를 표적으로 하는 6개의 RiboSlice 쌍으로 실시예 2에 따라 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 후 2일차, 게놈 DNA가 단리되었고, 정제되었다. 유전자-에디팅 효율을 측정하기 위하여, 150ng의 증폭된 PCR 산물은 10mM Tris-Cl + 50mM KCl + 1.5mM MgCl2에서 150ng의 기준 DNA와 혼성화되었다. 상기 혼성화된 DNA는 SURVEYOR 부정합 특이적 엔도뉴클레아제 (Transgenomic, Inc.)로 처리되었으며, 생성된 산물은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다(도 10a). 예상 크기의 밴드가 나타난 것으로 6개의 테스트된 모든 RiboSlice 쌍은 BIRC5 유전자를 효과적으로 에디트하였다는 것이 설명되었다 (도 10a에서 별표).
실시예 29 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice의 유사분열-저해 분석
1차 성인 인간 섬유아세포들은 실시예 28에 따라 유전자 에디트되었고, 그 다음 배양물에서 증식되었다. 11일 후, 게놈 DNA는 단리되었고, 정제되었고, 그리고 실시예 28에서와 같이 유전자-에디팅 효율이 측정되었다 (도 10b). 세포들로부터 단리된 게놈 DNA에서 예상 크기의 밴드가 나타난 것으로써 볼 수 있는 바와 같이 테스트된 RiboSlice 쌍들중에서 증식하는 섬유아세포들의 증식을 억제한 것은 아무것도 없었고(도 10b에서 별표), 이는 이들 RiboSlice 쌍의 정상적인 섬유아세포에 대해 독성이 낮음을 설명한다.
실시예 30 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice의 항암 활성 분석
실시예 25에 따라 배양된 1차 성인 인간 섬유아세포들과 HeLa 경부 암종 세포들은 쌍으로 실시예 28에 따라 RiboSlice 쌍이 트랜스펙션되었다. 섬유아세포들의 증식은 트랜스펙션 시약-연관된 독성으로 인하여 잠시 느려졌지만, 트랜스펙션 2일 이내에 회복되었다. 대조적으로, HeLa 세포들의 증식은 상당히 느려졌으며, 분절화된 핵을 가진 많은 확대된 세포들이 트랜스펙션된 웰에서 관찰되었다. 2-3 일 후, 많은 세포들은 아팝토시스를 나타내는 모양을 표현하였으며, 이는 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice 의 잠재적 항암 활성을 설명한다.
실시예 31 생체내 RiboSlice 안전성 연구
40 마리의 암컷 NCr nu/nu 마우스에게 50% Matrigel (BD Biosciences)에서 5 x 106 MDA-MB-231 종양 세포들을 피하로 주사하였다. 세포 주사 용적은 마우스당 0.2mL이었다. 연구 시작 시점에서 마우스의 연령은 8 내지 12주령이었다. 쌍 정합(pair match)이 실행되었고, 동물은 각 10 마리씩 4개 집단으로 분류되었으며, 종양의 평균 크기가 100-150mm3에 이르면, 처리가 시작되었다. 체중은 처음 5일간 매일 측정되었고, 그 다음 연구 종료까지 2주마다 측정되었다. 처리는 운반체 (리포펙타민 2000, Life Technologies Corporation)와 복합된 RiboSlice BIRC5-1.2로 구성되었다. 각 집단의 투여 분량 용액을 준비하기 위하여, 308μL의 복합 완충액 (Opti-MEM, Life Technologies Corporation)은 2개의 멸균된 RNase-없는 1.5mL 튜브로 피펫팅되었다. 22μL의 RiboSlice BIRC5-1.2 (500ng/μL)는 2개 튜브중 하나에 추가되었고, 튜브의 내용물은 피펫팅에 의해 혼합되었다. 22μL의 운반체가 두번째 튜브에 추가되었다. 제 2 튜브의 내용물은 혼합되었고, 그 다음 제 1 튜브로 옮기고, 피펫핑에 의해 제 1 튜브의 내용물과 혼합되어, 복합물이 형성되었다. 복합물은 10분간 실온에서 항온처리되었다. 항온처리 동안, 주사기에 로딩되었다. 동물에게 한 마리당 총 60μL의 용적에서 동물당 1μg RNA의 총 투여분량이 정맥 또는 종양 안으로 주사되었다. 2일마다 주사를 놓고, 총 5회 처리가 제공되었다. 체중에 따른 투여분량의 조정은 없었다. 17일간 동물은 추적되었다. 평균 체중의 유의적인 감소가 관찰되지 않았고 (도 11; RiboSlice BIRC5-1.2는 ＂ZK1＂으로 라벨됨), RiboSlice 유전자-에디팅 RNA의 생체내 안전성이 증명된다.
실시예 32 신경아교종 모델에서 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice의 항암 활성 분석
실시예 25에 따라 배양된 U-251 신경아교종 세포 계통은 RiboSlice 쌍으로 실시예 28에 따라 트랜스펙션되었다. 신경아교종 세포들은 HeLa 세포들과 유사한 처리에 반응하였으며: 증식은 상당히 느려졌으며, 분절화된 핵을 가진 많은 확대된 세포들이 트랜스펙션된 웰에서 관찰되었다. 2-3 일 후, 많은 세포들은 아팝토시스를 나타내는 모양을 표현하였으며, 이는 신경아교종 모델에서 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice 의 잠재적 항암 활성을 설명한다.
실시예 33 핵산을 세포로 운반하기 위한 시약들의 선별
트랜스펙션 효율과 시험관내 독성에 대하여 폴리에틸렌이민 (PEI), 다양한 시판되는 지질-기반 트랜스펙션 시약, 펩티드-기반 트랜스펙션 시약 (N-TER, Sigma-Aldrich Co. LLC.), 그리고 몇 가지 지질-기반 및 스테롤-기반 운반 시약들이 포함된 운반 시약들이 선별되었다. 운반 시약들은 RiboSlice BIRC5-1.2와 복합되었고, 이 복합물은 실시예 25에 따라 배양된 HeLa 세포들로 전달되었다. 트랜스펙션 후 24시간 시점에 세포 밀도를 분석함으로써 독성이 평가되었다. 트랜스펙션 효율은 실시예 30에서 설명된 것과 같이 형태학적 변화를 분석함으로써 평가되었다. 테스트된 시약들은 광범위한 독성 및 트랜스펙션 효과를 나타내었다. 더 많은 비율의 에스테르 결합이 포함된 시약은 낮은 비율의 에스테르 결합 또는 에스테르 결합이 없는 시약보다 낮은 독성을 나타내었다.
실시예 34 고-농도 리포좀성 RiboSlice
고-농도 리포좀성 RiboSlice는 1μg RNA, 500ng/μL와 3μL의 복합 배지 (Opti-MEM, Life Technologies Corporation), 그리고 RNA μg 당 RNA 2.5μL의 트랜스펙션 시약 (리포펙타민 2000, Life Technologies Corporation) 과 2.5μL의 복합 배지를 혼합함으로써 준비되었다. 희석된 RNA와 트랜스펙션 시약이 그 다음 혼합되었으며, 10분간 실온에서 항온처리되어, 고-농도 리포좀성 RiboSlice가 형성되었다. 대안으로, DOSPA 또는 DOSPER이 포함된 트랜스펙션 시약이 이용된다.
실시예 35 생체내 RiboSlice 효과 연구-피하 신경아교종 모델
40 마리의 암컷 NCr nu/nu 마우스에게 1 x 107의 U-251 종양 세포들을 피하로 주사하였다. 세포 주사 용적은 마우스당 0.2mL이었다. 연구 시작 시점에서 마우스의 연령은 8 내지 12주령이었다. 쌍 정합(pair match)이 실행되었고, 동물은 각 10 마리씩 4개 집단으로 분류되었으며, 종양의 평균 크기가 35-50mm3에 이르면, 처리가 시작되었다. 체중은 처음 5일간 매일 측정되었고, 그 다음 연구 종료까지 2주마다 측정되었다. 칼리퍼(Caliper) 측정은 2주마다 측정되었으며, 종양 크기가 산출되었다. 처리는 운반체 (리포펙타민 2000, Life Technologies Corporation)와 복합된 RiboSlice BIRC5-2.1로 구성되었다. 각 집단의 투여 분량 용액을 준비하기 위하여, 294μL의 복합 완충액 (Opti-MEM, Life Technologies Corporation)은 196μL의 RiboSlice BIRC5-1.2 (500ng/μL)이 포함된 튜브로 피펫팅되었고, 튜브의 내용물은 피펫팅에 의해 혼합되었다. 245μL의 복합 완충액은 245μL의 운반체가 포함된 튜브로 피펫팅되었다. 제 2 튜브의 내용물은 혼합되었고, 그 다음 제 1 튜브로 옮기고, 피펫핑에 의해 제 1 튜브의 내용물과 혼합되어, 복합물이 형성되었다. 복합물은 10분간 실온에서 항온처리되었다. 항온처리 동안, 주사기에 로딩되었다. 동물에게 한 마리당 총 20μL 또는 50μL의 용적에서 동물당 2μg 또는 5μg의 RNA의 총 투여분량이 정맥 또는 종양 안으로 주사되었다. 2일마다 주사를 놓고, 총 5회 처리가 제공되었다. 체중에 따른 투여분량의 조정은 없었다. 25일간 동물은 추적되었다.
실시예 36 고활성/고충실성RiboSlice 시험관내-전사 주형의 합성
T7 박테리오파아지 RNA-중합효소 프로모터, 5＇-해독안된 영역, 강력한 Kozak 서열, TALE N-말단 도메인, 실시예 26에 따라 기획된 18개 반복 서열, TALE C-말단 도메인, 그리고 StsI 서열 (서열 번호: 1), StsI-HA 서열 (서열 번호: 2), StsI-HA2 서열 (서열 번호: 3), StsI-UHA 서열 (서열 번호: 4), StsI-UHA2 서열 (서열 번호: 5), StsI-HF 서열 (서열 번호: 6) 또는 StsI-HF2 서열 (서열 번호: 7)이 포함된 뉴클라아제 도메인을 인코드하는 시험관내 전사 주형이 표준 클로닝 및 분자 생물학 기술에 의해 합성되며, 또는 대안으로, 유전자 단편 어셈블리 기술 (이를 테면, gBlocks, Integrated DNA Technologies, Inc.)을 이용하여 직접 화학 합성에 의해 합성된다.
실시예 37 고활성/고충실성RiboSlice 유전자-에디팅 RNA의 합성
고활성 RiboSlice와 고충실성 RiboSlice는 실시예 36에 따라 합성된 시험관내 전사 주형을 이용하여 실시예 27에 따라 합성되었다.
실시예 38 Proteopathy의 치료를 위하여 복제-불능 바이러스를 인코드하는 RiboSlice의 생성
플락-형성 단백질 서열이 인코드된 DNA 서열을 표적으로 하는 RiboSlice가 포함된 뉴클레오티드 서열은 복제-불능 바이러스성 게놈이 포함된 포유류 발현 벡터 안에 혼입되고, 그리고 패키지 세포로 트랜스펙션되어 복제-불능 바이러스가 만들어진다. 배양 상청액이 수집되며, 찌꺼기를 제거하기 위하여 0.45μm 필터를 이용하여 여과된다.
실시예 39 암 치료를 위하여 복제-가능 종양붕괴성 바이러스를 인코드하는 RiboSlice의 생성
BIRC5 유전자를 표적으로 하는 RiboSlice가 포함된 뉴클레오티드 서열은 복제-가능 바이러스성 게놈이 포함된 포유류 발현 벡터 안에 혼입되고, 그리고 패키지 세포로 트랜스펙션되어 복제-가능 바이러스가 만들어진다. 배양 상청액이 수집되며, 실시예 38에 따라 여과된다.
실시예 40 생체내 RiboSlice 효과 연구 - 정위(Orthotopic) 신경아교종 모델, 척추강내 투여 경로
40 마리의 암컷 NCr nu/nu 마우스에게 1 x 105의 U-251 종양 세포들을 두개강내로 주사하였다. 세포 주사 용적은 마우스당 0.02mL이다. 연구 시작 시점에서 마우스의 연령은 8 내지 12주령이다. 10일 후, 동물은 각 군에 10마리씩 4집단으로 나뉘었고, 치료가 시작된다. 체중은 처음 5일간 매일 측정되며, 그 다음 연구 종료까지 2주마다 측정되었다. 처리는 운반체 (리포펙타민 2000, Life Technologies Corporation)와 복합된 RiboSlice BIRC5-2.1로 구성된다. 각 집단의 투여 분량 용액을 준비하기 위하여, 294μL의 복합 완충액 (Opti-MEM, Life Technologies Corporation)은 196μL의 RiboSlice BIRC5-1.2 (500ng/μL)이 포함된 튜브로 피펫팅되고, 튜브의 내용은물 피펫팅에 의해 혼합된다. 245μL의 복합 완충액은 245μL의 운반체가 포함된 튜브로 피펫팅된다. 제 2 튜브의 내용물은 혼합되고, 그 다음 제 1 튜브로 옮기고, 피펫핑에 의해 제 1 튜브의 내용물과 혼합되어, 복합물이 형성된다. 복합물은 10분간 실온에서 항온처리된다. 항온처리 동안, 주사기에 로딩되었다. 동물에게 동물당 10-20μL 총 용적으로, 동물 당 1-2μg RNA의 총 투여분량이 척추강내로 주사된다. 2일마다 주사를 놓고, 총 5회 처리가 제공된다. 체중에 따른 투여분량의 조정은 없다. 60 일간 동물은 추적되었다.
실시예 41 RiboSlice 로 신경아교종 치료-IV 관류
신경아교종 진단을 받은 환자에게 실시예 34에 따라 준비된 1mg의 고농도 리포좀성 RiboSlice BIRC5-2.1을 4주 동안 주당 3회 1시간 과정에 걸쳐 IV로 주입된다. 500mm3 이상의 초기 종양 용적의 경우, 이 종양은 RiboSlice 치료를 시작하기에 앞서 외과적으로 축소되며(debulked), 그리고 임의 선택적으로 방사선요법 및/또는 화학요법을 받는다. 상기 환자에게 복합 요법으로 표준 투여 섭생을 이용하여 TNF-α 및/또는 5-FU가 임의선택적으로 투여된다.
실시예 42 신경아교종을 RiboSlice-복제-가능 종양붕괴성 바이러스로 치료
환자에게 실시예 39에 따라 제조된 복제가능 바이러스 입자(1000CFU/mL) 1mL 를 척추강내 또는 두개강내 주사로 투여한다.
실시예 43 SNCA를 표적으로 하는 RiboSlice로 파킨슨 질환 치료
파킨슨 질환으로 진단을 받은 환자에게 SNCA 유전자를 표적으로 하는 50μg의 RiboSlice를 척추강내 또는 두개강내 주사로 투여한다.
실시예 44 APP를 표적으로 하는 RiboSlice로 알츠하이머 질환 치료
알츠하이머 질환으로 진단을 받은 환자에게 APP 유전자를 표적으로 하는 50μg의 RiboSlice를 척추강내 또는 두개강내 주사로 투여한다.
실시예 45 IAPP를 표적으로 하는 RiboSlice로 유형 II 당뇨병 치료
유형 II 당뇨병으로 진단을 받은 환자에게 IAPP 유전자를 표적으로 하는 5mg의 RiboSlice를 정맥내, 복막내 또는 내문주사로 투여한다.
실시예 46 iRiboSlice 개인맞춤화된(Personalized) 암 요법
암으로 진단을 받은 환자에게서 생검을 취한다. 생검으로부터 게놈 DNA를 단리하고, 정제하며, 상기 DNA의 서열 (전체-게놈 서열, 진유전체(exome) 서열 또는 하나 또는 그 이상의 암-연합된 유전자의 서열)이 결정된다. 환자의 개별 암 서열을 표적으로 하는 RiboSlice 쌍 (iRiboSlice)은 실시예 26에 따라 기획되며, 실시예 27에 따라 합성된다. 이 환자에게 암의 유형 및 위치에 적합한 투여 경로를 이용하여 개인맞춤화된 iRiboSlice가 투여된다.
실시예 47 유전학적으로 다양한/치료-저항성 암을 위한 RiboSlice 혼합물
유전학적으로 다양한 및/또는 치료-저항성 암을 진단받은 환자에게 다발성 암-연합된 유전자 및/또는 하나 또는 그 이상의 암-연합된 유전자에서 다발성 서열을 표적으로 하는 RiboSlice 쌍 혼합물이 투여된다.
실시예 48 미토콘드리아 질환을 위한 Mito-RiboSlice
미토콘드리아 질환으로 진단을 받은 환자에게 상기 질환-연합된 서열을 표적으로 하며, 미토콘드리아 국소화 서열이 포함된 2mg의 RiboSlice가 근육내 주사를 통하여 투여된다.
실시예 49 안과 질환을 RiboSlice 안약으로 치료
각막 또는 결막 질환을 진단받은 환자에게 0.5% 등장액 용액으로 제형화된 RiboSlice가 투여된다.
실시예 50 피부 질환을 RiboSlice 국소 제형으로 치료
피부 질환을 진단받은 환자에게 1% 국소 크림/연고로 제형화된 RiboSlice가 투여되며, 여기에는 상기 RNA의 분해를 방지하는 하나 또는 그 이상의 안정화제게 포함된다.
실시예 51 폐 또는 호흡기 질환은 RiboSlice 에어로졸 제형으로 치료
폐 또는 호흡기 질환으로 진단받은 환자에게 0.5% 에어로졸 스프레이로 제형화된 RiboSlice가 투여된다.
실시예 52 감염성 물질에 존재하는 DNA 서열을 표적으로 하는 RiboSlice 를 이용하여 감염성 질환 치료
감염성 질환으로 진단을 받은 환자에게 환자가 감염된 특이적 감염성 물질 안에 존재하는 서열을 표적으로 하는 RiboSlice를 감염 위치 및 유형에 적합한 투여 경로를 이용하고, 투여 경로 및 감염의 중증도에 적합한 투여 분량으로 투여된다.
실시예 53 체외수정(in vitro Fertilization)을위하여 유전자-에디트된 인간 접합체(Zygotes)
인간 생식 세포, 접합체 또는 초기-단계 낭포는 질환-연합된 돌연변이 또는 바람직하지 못한 형질과 연합된 돌연변이를 인코드하는 유전자를 표적으로 하는 RiboSlice로 트랜스펙션된다. 이 게놈은 특징화되며, 그리고 상기 세포는 체외수정을 위하여 준비된다.
실시예 54 유전자-에디팅 단백질들의 활성, 충성도 강화를 위한 절단-도메인 스크린
상이한 절단 도메인이 각각 포함된 RiboSlice 쌍들의 패널은 실시예 26에 따라 기획되며, 그리고 실시예 27에 따라 합성된다. RiboSlice 쌍들의 활성은 실시예 28에서와 같이 결정된다.
실시예 55 파킨슨 질환-유발 독물을 스크리닝하는 유전자-에디트된 세포
1차 인간 성인 섬유아세포들은 SNCA를 표적으로 하는 RiboSlice (표 11)와 SNCA A30P, E46K, 및 A53T 돌연변이를 가진 세포를 만드는 복구 주형을 이용하여 실시예 28에 따라 유전자 에디트된다. 세포들은 재프로그램되며, 도파민 신경세포로 분화된다. 이 뉴우런들은 파킨슨 질환을 야기할 수 있는 유독물을 확인하기 위하여 고-처리량 α-시뉴클레인-응집 유독물-선별 분석에 이용된다.
Figure pat00025
실시예 56 암-유발 독물을 스크리닝하는 유전자-에디트된 세포
1차 인간 성인 섬유아세포들은 TP53을 표적으로 하는 RiboSlice (표 12)와 TP53 P47S, R72P, 및 V217M 돌연변이를 가진 세포를 만드는 복구 주형을 이용하여 실시예 28에 따라 유전자 에디트된다. 세포들은 재프로그램되며, 간세포로 분화된다. 이 간세포들은 암을 야기할 수 있는 유독물을 확인하기 위하여 고-처리량 시험관 형질변환 유독물-선별 분석에 이용된다.
Figure pat00026
실시예 57 조작된 유전자-에디팅 단백질(RiboSlice)을 인코드하는 RNA의 기획 및 합성
실시예 26에 따라 기획된 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 RNA는 실시예 27에 따라 합성된다(표 13). 각 유전자-에디팅 단백질은 표 13에 나타낸 것과 같이 35-36개 아미노산-길이의 반복 서열들이 포함된 전사 활성물질-유사 (TAL) 효과물질 반복 도메인이 포함된 DNA-결합 도메인이 포함된다. 상기 36개 아미노산-길이 반복 서열들에 대해 서열 ID 번호가 주어진다. 주형 이름에서 라벨 ＂18＂은 18번째 반복 서열이 36개 아미노산 길이임을 나타낸다. 주형 이름에서 라벨 ＂EO＂는 모든 다른 반복 서열이 36개 아미노산 길이임을 나타낸다. 라벨 ＂18＂ 또는 ＂EO＂ 다음에 이어진 아미노산은 상기 36개 아미노산-길이 반복 서열(들)에서 C-말단에 있는 아미노산을 나타낸다. 라벨 ＂StsI＂는 뉴클라아제 도메인이 StsI 절단 도메인을 포함한다는 것을 나타낸다. ＂StsI＂ 라벨이 없는 주형은 FokI 절단 도메인을 포함하였다.
Figure pat00027
실시예 58 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice의 활성 분석
실시예 57에 따라 합성된 RiboSlice 분자들의 활성은 실시예 28에 따라 분석되었다(도 12a, 도 12b, 및 도 14). 하나 또는 그 이상의 36개 아미노산-길이 반복 서열들이 포함된 유전자-에디팅 단백질을 발현시키는 세포들에서 고효율 유전자 에디팅이 관찰되었다. 아미노산 서열: GHGG가 포함된 하나 또는 그 이상의 반복 서열들을 포함하는 유전자-에디팅 단백질을 발현시키는 세포들에서 최고의 유전자 에디팅이 관찰되었다.
실시예 59 생체내 RiboSlice AAV 안전성 및 효과 연구 - 피하 신경아교종 모델, 종양내 경로 운반
실시예 35에 따라 U-251 인간 신경아교종 세포들이 포함된 종양을 가진 동물들이 준비되었다. GFP를 인코드하는 AAV 혈청형 2, BIRC5-2.1L RiboSlice, 그리고 BIRC5-2.1R RiboSlice가 표준 기술에 따라 준비되었다 (AAV-2 Helper Free Expression System, Cell Biolabs, Inc.). 바이러스 원액은 4℃ (단기) 또는 -80℃ (장기)에 보관되었다. 동물에게 1일차에 160μL GFP AAV 또는 1일차와 15일차에 80μL BIRC-2.1L RiboSlice AAV + 80μL BIRC5-2.1R RiboSlice AAV를 종양내로 제공되었다. 25일간 동물은 추적되었다. 평균 체중의 유의적인 감소가 관찰되지 않았고 (도 13a); 이로써 RiboSlice AAV의 생체내 안전성이 증명된다. RiboSlice AAV 집단에서 종양 성장이 저해되었으며(도 13b), 이로써 RiboSlice AAV의 생체내 효과가 증명된다.
실시예 60 RiboSlice AAV를 이용한 암 치료
환자에게 실시예 59에 따라 제조된 RiboSlice AAV 바이러스 입자 1mL 를 척추강내 또는 두개강내 주사로 투여한다. 투약은 필요에 따라 반복된다. 500mm3 이상의 초기 종양 용적을 가진 환자의 경우, 이 종양은 RiboSlice AVV 치료를 시작하기에 앞서 외과적으로 축소되며, 그리고 임의 선택적으로 방사선요법 및/또는 화학요법을 받는다. 상기 환자에게 복합 요법으로 표준 투여 섭생을 이용하여 TNF-α 및/또는 5-FU가 임의선택적으로 투여된다.
실시예 61 iRiboSlice AVV 개인맞춤화된(Personalized) 암 요법
암으로 진단을 받은 환자에게서 생검을 취한다. 생검으로부터 게놈 DNA를 단리하고, 정제하며, 상기 DNA의 서열 (전체-게놈 서열, 진유전체(exome) 서열 또는 하나 또는 그 이상의 암-연합된 유전자의 서열)이 결정된다. 환자의 개별 암 서열을 표적으로 하는 RiboSlice 쌍 (iRiboSlice)은 실시예 26에 따라 기획되며, 실시예 59에 따라 합성된다. 이 환자에게 암의 유형 및 위치에 적합한 투여 경로를 이용하여 개인맞춤화된 iRiboSlice AVV가 투여된다.
실시예 62 리포좀 제형 및 핵산 포집화
다음의 제형을 이용하여 리포좀이 준비된다: 완충액으로 3.2mg/mL N-(카르보닐-에톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (MPEG2000-DSPE), 9.6mg/mL 온전한게 수소화된 포스파티딜콜린, 3.2mg/mL 콜레스테롤, 2mg/mL 암모니움 황산염, 및 히스티딘. 수산화 나트륨을 이용하여 pH가 조절되며, 슈크로즈를 이용하여 등장성이 유지된다. 리포좀를 만들기 위하여, 지질은 유기 용매 안에서 혼합되고, 건조되며, 교반하면서 수화되고, 평균 구멍 직경이 800nm인 폴리카르보네이트 필터를 이용한 압출에 의해 크기에 따라 분류되었다. 핵산은 핵산 1μg 당 10μg의 리포좀 제형을 복합시키고, 실온에서 5 분간 항온처리됨으로써 포집화된다.
실시예 63 엽산염-표적화된 리포좀 제형화
실시예 62에 따라 리포좀이 준비된다: 단, 지질 혼합물에 추가된 0.27mg/mL 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[엽산(폴리에틸렌 글리콜)-5000] (FA-MPEG5000-DSPE)이 추가된다.
실시예 64 BIRC5를 표적으로 하는 리포좀형 RiboSlice가 포함된 암 요법
실시예 23에 따라 합성된 RiboSlice 쌍을 포집화한 리포좀은 실시예 62 또는 실시예 63에 따라 준비된다. 상기 리포좀은 주사 또는 정맥 주입에 의해 투여되며, 종양 반응 및 인터페론 혈장 수준은 매일 감시된다.
실시예 65 암-연합된 유전자를 표적으로 하는 리포좀형 RiboSlice가 포함된 암 요법
실시예 1에 따라 합성된 암-연합된 유전자를 표적으로 하는 RiboSlice를 포집화한 리포좀은 실시예 62 또는 실시예 63에 따라 준비된다. 상기 리포좀은 주사 또는 정맥 주입에 의해 투여되며, 종양 반응 및 인터페론 혈장 수준은 매일 감시된다.
실시예 66 RNA를 인코드하는 리포좀형 단백질을 포함하는 요법
실시예 1에 따라 치료요법적 단백질을 인코드하는 합성 RNA를 포집화한 리포좀은 실시예 62 또는 실시예 63에 따라 준비된다. 상기 리포좀은 주사 또는 정맥 주입에 의해 투여된다.
실시예 67 BIRC5 및 TNF-α을 표적으로 하는 RiboSlice가 포함된 복합 암 요법
환자들에게 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)와 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice를 포집화한 리포좀이 격리 림브 관류(ILP) 투여된다( 실시예 64 참고). 사지를 따뜻하게 한 후, 리포좀은 대략적으로 5 분에 걸쳐 체외 ILP 회로의 동맥 라인으로 주사되며, 관류는 추가 85 분 동안 진행된다. 1-2 일 후, ILP는 3-5 분에 걸쳐 체외 ILP 회로의 동맥 라인으로 주사되는 TNF-α으로 반복되며, 관류는 추가 60 분 동안 지속된다. 종양 반응 및 인터페론 혈장 수준은 매일 감시된다.
실시예 68 BIRC5 및 플로오로우라실 (5-FU)을 표적으로 하는 RiboSlice가 포함된 복합 암 요법.
1일차에 환자들은 BIRC5를 표적으로 하는 RiboSlice를 포집한 리포좀의 60분 정맥 주입을 받고 (실시예 64 참고), 이어서 2일차와 3일차에 5-FU의 46 시간 정맥 주입을 받는다. 종양 반응 및 인터페론 혈장 수준은 매일 감시된다.
등가물(EQUIVALENTS)
당업계 숙련자는 일반적인 실험을 통하여 본 명세서에서 구체적으로 설명된 특정 구체예들에 대등한 다수의 등가물을 인지하거나 또는 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 포괄된다.
참고자료의 편입
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개내용은 이들의 전문이 참고자료에 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Angel, Matthew Rohde, Christopher <120> METHODS AND PRODUCTS FOR EXPRESSING PROTEINS IN CELLS <130> FABI-005/02WO <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Leu Glu Lys Ser Asp Ile Glu Lys Phe Lys Asn Gln Leu Arg Thr 1 5 10 15 Glu Leu Thr Asn Ile Asp His Ser Tyr Leu Lys Gly Ile Asp Ile Ala 20 25 30 Ser Lys Lys Lys Thr Ser Asn Val Glu Asn Thr Glu Phe Glu Ala Ile 35 40 45 Ser Thr Lys Ile Phe Thr Asp Glu Leu Gly Phe Ser Gly Lys His Leu 50 55 60 Gly Gly Ser Asn Lys Pro Asp Gly Leu Leu Trp Asp Asp Asp Cys Ala 65 70 75 80 Ile Ile Leu Asp Ser Lys Ala Tyr Ser Glu Gly Phe Pro Leu Thr Ala 85 90 95 Ser His Thr Asp Ala Met Gly Arg Tyr Leu Arg Gln Phe Thr Glu Arg 100 105 110 Lys Glu Glu Ile Lys Pro Thr Trp Trp Asp Ile Ala Pro Glu His Leu 115 120 125 Asp Asn Thr Tyr Phe Ala Tyr Val Ser Gly Ser Phe Ser Gly Asn Tyr 130 135 140 Lys Glu Gln Leu Gln Lys Phe Arg Gln Asp Thr Asn His Leu Gly Gly 145 150 155 160 Ala Leu Glu Phe Val 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ccgcatctct acattcaaga actggccctt 120 cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg ggtgagactg cccggcctcc tggggtcccc 180 cacgcccgcc t 191 <210> 13 <211> 190 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggctgccacg tccactcacg agctgtgctg tcccttgcag atggccgagg ctggcttcat 60 ccactgcccc actgagaacg agccagactt ggcccagtgt ttcttctgct tcaaggagct 120 ggaaggctgg gagccagatg acgaccccat gtaagtcttc tctggccagc ctcgatgggc 180 tttgttttga 190 <210> 14 <211> 198 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cccttcagct gcctttccgc tgttgttttg atttttctag agaggaacat aaaaagcatt 60 cgtccggttg cgctttcctt tctgtcaaga agcagtttga agaattaacc cttggtgaat 120 ttttgaaact ggacagagaa agagccaaga acaaaattgt atgtattggg aataagaact 180 gctcaaaccc tgttcaat 198 <210> 15 <211> 170 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gctctggttt cagtgtcatg tgtctattct ttatttccag gcaaaggaaa ccaacaataa 60 gaagaaagaa tttgaggaaa ctgcggagaa agtgcgccgt gccatcgagc agctggctgc 120 catggattga ggcctctggc cggagctgcc tggtcccaga gtggctgcac 170 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ttgccccctg cctggcagcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ttcttgaatg tagagatgcg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tgggtgcccc gacgttgccc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tgcggtggtc cttgagaaag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tcaaggacca ccgcatctct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tgcaggcgca gccctccaag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tggccgaggc tggcttcatc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tgggccaagt ctggctcgtt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ttggcccagt gtttcttctg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tcgtcatctg gctcccagcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tgcgctttcc tttctgtcaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 tcaaaaattc accaagggtt 20 <210> 28 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Glu Asp Tyr 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misc_feature <222> (748)..(749) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (784)..(785) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (818)..(819) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 57 Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 30 Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr 35 40 45 Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val 50 55 60 Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His 65 70 75 80 Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val 85 90 95 Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala 100 105 110 Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala 115 120 125 Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp 130 135 140 Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly 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  1. 유전자-에디팅 단백질을 인코드하는 핵산을 포함하는 조성물을 사용하여 상태를 치료하는 방법.
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