CN106381310B - 一种用t7噬菌体rna聚合酶和t7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法 - Google Patents

一种用t7噬菌体rna聚合酶和t7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106381310B
CN106381310B CN201610788821.5A CN201610788821A CN106381310B CN 106381310 B CN106381310 B CN 106381310B CN 201610788821 A CN201610788821 A CN 201610788821A CN 106381310 B CN106381310 B CN 106381310B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
sequence
plasmid
rna polymerase
expressing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610788821.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106381310A (zh
Inventor
沈鹤霄
华权高
马峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Original Assignee
CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CUSABIO BIOTECH Co Ltd filed Critical CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Priority to CN201610788821.5A priority Critical patent/CN106381310B/zh
Publication of CN106381310A publication Critical patent/CN106381310A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106381310B publication Critical patent/CN106381310B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/34—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription initiation element

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T‑Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1‑RNAP质粒；(3)将待表达基因两端分别加入T7启动子，IRES和T7终止子，然后连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。本发明提高了哺乳表达系统的表达量。

Description

一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞 表达蛋白的方法
技术领域
本发明涉及重组蛋白质制备领域，具体涉及一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法。
背景技术
目前哺乳动物细胞表达系统，通常采用pCMV启动子进行外源基因的表达，表达量相对原核系统T7启动子普遍低很多，T7启动子表达的蛋白，普遍可达到细胞总蛋白的5-20％甚至更高，并且普通的SDS-PAGE电泳即可检测，而真核表达系统相比差很多，通常都是需要用WB这种高灵敏度的方法进行检测。相对来讲，提高哺乳表达系统的产量具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，提高了哺乳表达系统的表达量。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T-Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；
(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；
(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。
作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述T7RNA聚合酶为T7噬菌体RNA聚合酶。
作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列，Nucleoplasmin核定位序列，EGL-13核定位序列，c-Myc核定位序列或TUS-protein核定位序列中的一种。
作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列。
作为进一步的优选，所述步骤(2)中，所述连接为采用T4DNA连接酶进行连接，所述连接后转化大肠杆菌DH5α，利用氨苄青霉素(Amp)抗性基因筛选阳性克隆，得到pcDNA3.1-RNAP。
作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述pUC57载体具有T7启动子、多克隆位点、IRES序列以及T7终止子。
作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述pUC57载体从pIRES载体上克隆得到多克隆位点B和IRES序列以及T7终止子。
作为进一步的优选，所述克隆方法包括：
1)设计含T7启动子序列的上游引物和t7终止子的下游引物来扩增相应序列；
2)PCR扩增T7启动子，IRES序列，多克隆位点B，通过引物和Platinum-pfx试剂盒，将pIRES载体的片段克隆到pUC57载体上。
作为进一步的优选，所述上游引物T7为：5'TAATACGACTCACTATAGAATTCCGCCCCTCTCC 3'，所述下游引物T7为：5'CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTTACCACATTTGTAGAGGTT 3'。
作为进一步的优选，所述步骤(4)中，在共转染真核细胞后的培养基中添加α-鹅膏蕈碱。
作为进一步的优选，所述步骤(4)中，所述α-鹅膏蕈碱的浓度为10μg/mL。
作为进一步的优选，所述真核细胞为真核细胞株293T。
本发明的有益效果是：
1、本发明组建成的T7启动子/RNA聚合酶的载体系统，可应用于外源基因在哺乳类动物细胞中的表达，提高了哺乳表达系统的表达量；并且使用IRES序列以解决T7RNA聚合酶转录没有真核翻译位点的问题。
2、本发明表达蛋白的方法使用α-鹅膏蕈碱抑制真核细胞中的RNA聚合酶Ⅱ的活性，使转染的基因在真核细胞中只受到T7噬菌体RNA聚合酶转录，转录效率高，表达蛋白量大。
3、本发明使用双质粒共转染表达系统，一个用于表达T7RNA聚合酶，用来合成外源RNA，一个用于表达待表达外源基因，本发明表达效率高，表达量大。
附图说明
图1为本发明实施例1转染真核细胞后48h荧光图。
图2为本发明实施例3转染真核细胞后48h荧光图。
具体实施方式
本发明通过提供一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，提高了哺乳表达系统的表达量。
为了解决上述缺陷，本发明实施例的主要思路如下：
本发明实施例用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T-Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；
(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；
(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。
所述步骤(1)中，使用T7RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号Am946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成哺乳动物细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。
核定位序列(Nuclear localization signal)是蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核。蛋白和mRNA在细胞核和细胞质之间的运输称为入核和出核。本发明实施例一般选用SV40T-Antigen核定位序列。
所述双质粒共转染表达系统，一个用于表达T7RNA聚合酶，用来合成外源RNA，一个用于表达待表达外源基因。所述共转染时，通常将两质粒按一定摩尔比混合。
为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本发明所述之用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统表达蛋白的方法。
实施例1
密码子优化
使用大肠杆菌BL21T7RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号Am946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成人细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。最后在这段基因上游加入HindIII，下游依次添加了SV40T-Antigen核定位序列和EcoRI酶切位点。片段长度为2600bp左右，序列见序列表。密码子优化及全基因合成均在武汉金开瑞完成。待优化序列生成后，通过Visual Gene Developer软件，进一步确认优化前后mRNA二级结构及自由能。
质粒构建
构建T7-RNAP的真核表达载体：将上述合成的基因克隆到质粒pUC57中，提取质粒备用，通过HindIII和EcoRI酶切位点双酶切连接到pcDNA3.1真核表达载体上，取5μgEcoRI/HindIII酶切过的pUC57-T7RNAP与约100ng pcDNA3.1经过同样双酶切消化、回收后的线形化的pcDNA3.1，用T4DNA连接酶按常规方法进行连接反应，连接后转化大肠杆菌DH5α，利用氨苄青霉素(Amp)抗性基因筛选阳性克隆，得到pcDNA3.1-RNAP，并进行DNA测序。
从pIRES载体上克隆多克隆位点B和IRES序列：整个长度为1600bp，设计含T7启动子序列(横线部分)的上游引物T7上：5'TAATACGACTCACTATAGaattccgcccctctcc 3'和下游引物T7下：5'CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTTACCACATTTGTAGAGGTT 3'来扩增相应序列，pIRES载体为模板，PCR扩增T7启动子，IRES，多克隆位点和poly A信号序列，通过特异性引物和Platinum-pfx试剂盒(Invitrogen)。整个片段克隆到pUC57载体上。完成表达载体的构建，下一步将eGFP基因克隆到该表达载体上，设计含BamHI和NotI双酶切位点的上下游引物，EGFP-上：5'TCAGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3'(BamH I)EGFP-下：5'TAGCCGCCGGCGTTAATGATGATGATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC 3'(NotI)以pIRES2-EGFP质粒为模板，扩增EGFP片段，双酶切连接到上述很多克隆位点的pUC57载体上，命名为pUC57-EGFP。
真核细胞的转染和蛋白的表达
a、预处理：用含8％无支原体新生牛血清的RPMI1640培养基，按常规方法传代培养293T细胞。转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25cm2的培养瓶中长满细胞可达5×106/mL，取3-4×105细胞铺在2mL的培养基中(不含双抗含血清)，使其在转染时密度为90-95％。
b、质粒DNA配制：按1∶1摩尔比混合pcDNA3.1-RNAP和pUC57-EGFP，每孔2μg混合质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250μL；多孔可批量配制。质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。
c、Lipofect配制：每孔5μL lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250μL温和混匀，温室放置5min。
d、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起(配制后30min内混合)，室温保温20min，保证每孔总体积500μL。
e、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。用移液管吸去上清。
f、每孔2mL PBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。
g、每孔用1mL DMEM清洗2遍。
h、每孔先加入OPTI-MEN 0.9mL，再加500μL DNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀。
i、置入CO2培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清，加入2mL不含双抗的但含10μg/mL的α-鹅膏蕈碱的DMEM。
j、再次置入CO2培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。500转，10min离心，取上清1mL/管(1.5mL EP管)分装标注，冻存-80℃。
双质粒共转染真核细胞株293T：以pcDNA3.1-RNAP/pUC57-EGFP双质粒组成共表达系统，用脂质体共转染真核细胞株293T，在细胞培养基中加入10μg/mL的α-鹅膏蕈碱，分别在24h、48h、72h观察细胞荧光表达情况。如图1所示。
实施例2
密码子优化
使用T7噬菌体RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号Am946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成人细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。最后在这段基因上游加入HindIII，下游依次添加了SV40T-Antigen核定位序列和EcoRI酶切位点。片段长度为2600bp左右，序列见序列表。密码子优化及全基因合成均在武汉金开瑞完成。待优化序列生成后，通过Visual Gene Developer软件，进一步确认优化前后mRNA二级结构及自由能。
质粒构建
构建T7-RNAP的真核表达载体：将上述合成的基因克隆到质粒pUC57中，提取质粒备用，通过HindIII和EcoRI酶切位点双酶切连接到pcDNA3.1真核表达载体上，取5μgEcoRI/HindIII酶切过的pUC57-T7RNAP与约100ng pcDNA3.1经过同样双酶切消化、回收后的线形化的pcDNA3.1，用T4DNA连接酶按常规方法进行连接反应，连接后转化大肠杆菌DH5α，利用氨苄青霉素(Amp)抗性基因筛选阳性克隆，得到pcDNA3.1-RNAP，并进行DNA测序。
从pIRES载体上克隆多克隆位点B和IRES序列以及poly A信号序列：整个长度为1600bp，设计含T7启动子序列的上游引物T7上：5'TAATACGACTCACTATAGaattccgcccctctcc3'和下游引物T7下：5'CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTTACCACATTTGTAGAGGTT 3'来扩增相应序列，pIRES载体为模板，PCR扩增T7启动子，IRES，多克隆位点和，通过特异性引物和Platinum-pfx试剂盒(Invitrogen)。整个片段克隆到pUC57载体上。完成表达载体的构建，下一步将eGFP基因克隆到该表达载体上，设计含BamHI和NotI双酶切位点的上下游引物，EGFP-上：5'TCAGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3'(BamH I)EGFP-下：5'TAGCCGCCGGCGTTAATGATGATGATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC 3'(NotI)以pIRES2-EGFP质粒为模板，扩增EGFP片段，双酶切连接到上述很多克隆位点的pUC57载体上，命名为pUC57-EGFP。
真核细胞的转染和蛋白的表达
a、预处理：用含8％无支原体新生牛血清的RPMI1640培养基，按常规方法传代培养293T细胞。转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25cm2的培养瓶中长满细胞可达5×106/mL，取3-4×105细胞铺在2mL的培养基中(不含双抗含血清)，使其在转染时密度为90-95％。
b、质粒DNA配制：按1∶1摩尔比混合pcDNA3.1-RNAP和pUC57-EGFP，每孔2μg混合质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250μL；多孔可批量配制。质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。
c、Lipofect配制：每孔5μL lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250μL温和混匀，温室放置5min。
d、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起(配制后30min内混合)，室温保温20min，保证每孔总体积500μL。
e、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。用移液管吸去上清。
f、每孔2mL PBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。
g、每孔用1mL DMEM清洗2遍。
h、每孔先加入OPTI-MEN 0.9mL，再加500μL DNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀。
i、置入CO2培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清。
j、再次置入CO2培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。500转，10min离心，取上清1mL/管(1.5mL EP管)分装标注，冻存-80℃。
双质粒共转染真核细胞株293T：以pcDNA3.1-RNAP/pUC57-EGFP双质粒组成共表达系统，用脂质体共转染真核细胞株293T，分别在24h、48h、72h观察细胞荧光表达情况。
本发明实施例2过程和实施例1类似，不同在于没有在转染后的培养基中添加10μg/mL的α-鹅膏蕈碱，结果显示，没有10μg/mL的α-鹅膏蕈碱抑制真核细胞转录酶Ⅱ，有部分细胞的表达量没有达到本发明实施例1的表达量。
实施例3
本发明实施例3过程和实施例1类似，不同之处在于真核细胞的转染和蛋白的表达步骤，具体如下：
a、预处理：用含8％无支原体新生牛血清的RPMI1640培养基，按常规方法传代培养293T细胞。转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25c㎡的培养瓶中长满细胞可达5×106/mL，取3-4×105细胞铺在2mL的培养基中(不含双抗含血清)，使其在转染时密度为90-95％。
b、质粒DNA配制：取pIRES2-EGFP，每孔2ug pIRES2-EGFP质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250μL；多孔可批量配制。质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。
c、Lipofect配制：每孔510μg/mL的α-鹅膏蕈碱l lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250μL温和混匀，温室放置5min。
d、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起(配制后30min内混合)，室温保温20min，保证每孔总体积500μL。
e、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。用移液管吸去上清。
f、每孔2mLPBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。
g、每孔用1mL DMEM清洗2遍。
h、每孔先加入OPTI-MEN0.9mL，再加500μL DNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀。
i、置入CO2培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清，加入2mL不含双抗的DMEM。
j、再次置入CO2培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。500转，10min离心，取上清1mL/管(1.5mL EP管)分装标注，冻存-80℃。
用脂质体转染真核细胞株293T，仅转染pIRES2-EGFP质粒，分别在24h、48h、72h观察细胞荧光表达情况。如图2所示。
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
1、本发明组建成的T7启动子/RNA聚合酶的载体系统，可应用于外源基因在哺乳类动物细胞中的表达，提高了哺乳表达系统的表达量；并且使用IRES序列以解决T7RNA聚合酶转录没有真核翻译位点的问题。
2、本发明表达蛋白的方法使用α-鹅膏蕈碱抑制真核细胞中的RNA聚合酶Ⅱ的活性，使转染的基因在真核细胞中只受到T7噬菌体RNA聚合酶转录，转录效率高，表达蛋白量大。
3、本发明使用双质粒共转染表达系统，一个质粒用于表达T7RNA聚合酶，表达的T7RNA聚合酶用来合成外源RNA，一个质粒用于表达待表达外源基因，本发明表达效率高，表达量大。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉华美生物工程有限公司
<120> 一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2715
<212> DNA
<213> Bacteriophage T7
<400> 1
atgaacacca tcaacatcgc caagaacgac ttcagcgaca tcgagctggc cgccatcccc 60
ttcaacaccc tggccgacca ctacggcgag cggctggccc gggagcagct ggccctggag 120
cacgagagct acgagatggg cgaggcccgg ttccggaaga tgttcgagcg gcagctgaag 180
gccggcgagg tggccgacaa cgccgccgcc aagcccctga tcaccaccct gctgcccaag 240
atgatcgccc ggatcaacga ctggttcgag gaggtgaagg ccaagcgggg caagcggccc 300
accgccttcc agttcctgca ggagatcaag cccgaggccg tggcctacat caccatcaag 360
accaccctgg cctgcctgac cagcgccgac aacaccaccg tgcaggccgt ggccagcgcc 420
atcggccggg ccatcgagga cgaggcccgg ttcggccgga tccgggacct ggaggccaag 480
cacttcaaga agaacgtgga ggagcagctg aacaagcggg tgggccacgt gtacaagaag 540
gccttcatgc aggtggtgga ggccgacatg ctgagcaagg gcctgctggg cggcgaggcc 600
tggagcagct ggcacaagga ggacagcatc cacgtgggcg tgcggtgcat cgagatgctg 660
atcgagagca ccggcatggt gagcctgcac cggcagaacg ccggcgtggt gggccaggac 720
agcgagacca tcgagctggc ccccgagtac gccgaggcca tcgccacccg ggccggcgcc 780
ctggccggca tcagccccat gttccagccc tgcgtggtgc cccccaagcc ctggaccggc 840
atcaccggcg gcggctactg ggccaacggc cggcggcccc tggccctggt gcggacccac 900
agcaagaagg ccctgatgcg gtacgaggac gtgtacatgc ccgaggtgta caaggccatc 960
aacatcgccc agaacaccgc ctggaagatc aacaagaagg tgctggccgt ggccaacgtg 1020
atcaccaagt ggaagcactg ccccgtggag gacatccccg ccatcgagcg ggaggagctg 1080
cccatgaagc ccgaggacat cgacatgaac cccgaggccc tgaccgcctg gaagcgggcc 1140
gccgccgccg tgtaccggaa ggacaaggcc cggaagagcc ggcggatcag cctggagttc 1200
atgctggagc aggccaacaa gttcgccaac cacaaggcca tctggttccc ctacaacatg 1260
gactggcggg gccgggtgta cgccgtgagc atgttcaacc cccagggcaa cgacatgacc 1320
aagggcctgc tgaccctggc caagggcaag cccatcggca aggagggcta ctactggctg 1380
aagatccacg gcgccaactg cgccggcgtg gacaaggtgc ccttccccga gcggatcaag 1440
ttcatcgagg agaaccacga gaacatcatg gcctgcgcca agagccccct ggagaacacc 1500
tggtgggccg agcaggacag ccccttctgc ttcctggcct tctgcttcga gtacgccggc 1560
gtgcagcacc acggcctgag ctacaactgc agcctgcccc tggccttcga cggcagctgc 1620
agcggcatcc agcacttcag cgccatgctg cgggacgagg tgggcggccg ggccgtgaac 1680
ctgctgccca gcgagaccgt gcaggacatc tacggcatcg tggccaagaa ggtgaacgag 1740
atcctgcagg ccgacgccat caacggcacc gacaacgagg tggtgaccgt gaccgacgag 1800
aacaccggcg agatcagcga gaaggtgaag ctgggcacca aggccctggc cggccagtgg 1860
ctggcctacg gcgtgacccg gagcgtgacc aagcggagcg tgatgaccct ggcctacggc 1920
agcaaggagt tcggcttccg gcagcaggtg ctggaggaca ccatccagcc cgccatcgac 1980
agcggcaagg gcctgatgtt cacccagccc aaccaggccg ccggctacat ggccaagctg 2040
atctgggaga gcgtgagcgt gaccgtggtg gccgccgtgg aggccatgaa ctggctgaag 2100
agcgccgcca agctgctggc cgccgaggtg aaggacaaga agaccggcga gatcctgcgg 2160
aagcggtgcg ccgtgcactg ggtgaccccc gacggcttcc ccgtgtggca ggagtacaag 2220
aagcccatcc agacccggct gaacctgatg ttcctgggcc agttccggct gcagcccacc 2280
atcaacacca acaaggacag cgagatcgac gcccacaagc aggagagcgg catcgccccc 2340
aacttcgtgc acagccagga cggcagccac ctgcggaaga ccgtggtgtg ggcccacgag 2400
aagtacggca tcgagagctt cgccctgatc cacgacagct tcggcaccat ccccgccgac 2460
gccgccaacc tgttcaaggc cgtgcgggag accatggtgg acacctacga gagctgcgac 2520
gtgctggccg acttctacga ccagttcgcc gaccagctgc acgagagcca gctggacaag 2580
atgcccgccc tgcccgccaa gggcaacctg aacctgcggg acatcctgga gagcgacttc 2640
gccttcgccc caaaaaagaa gagaaaggta gatccaaaaa agaagagaaa ggtaggatcc 2700
accggatcta gataa 2715

Claims (9)

1.一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；
(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；所述pUC57载体具有T7启动子、多克隆位点、IRES序列以及T7终止子；
(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。
2.根据权利要求1所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述T7RNA聚合酶为T7噬菌体RNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列，Nucleoplasmin核定位序列，EGL-13核定位序列，c-Myc核定位序列或TUS-protein核定位序列中的一种。
4.根据权利要求1所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述pUC57载体从pIRES载体上克隆得到多克隆位点B和IRES序列以及T7终止子。
5.根据权利要求4所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统表达在哺乳动物细胞蛋白的方法，其特征在于：所述克隆方法包括：
1)设计含T7启动子序列的上游引物和t7终止子的下游引物来扩增相应序列；
2)PCR扩增T7启动子，IRES序列，多克隆位点B，通过引物和Platinum-pfx试剂盒，将pIRES载体的片段克隆到pUC57载体上。
6.根据权利要求5所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述上游引物T7为：5'TAATACGACTCACTATAGAATTCCGCCCCTCTCC3'，所述下游引物T7为：5'CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTTACCACATTTGTAGAGG TT 3'。
7.根据权利要求1所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，在共转染真核细胞后的培养基中添加α-鹅膏蕈碱。
8.根据权利要求7所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述α-鹅膏蕈碱的浓度为10μg/mL。
9.根据权利要求1所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述真核细胞为真核细胞株293T。
CN201610788821.5A 2016-08-31 2016-08-31 一种用t7噬菌体rna聚合酶和t7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法 Active CN106381310B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610788821.5A CN106381310B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 一种用t7噬菌体rna聚合酶和t7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610788821.5A CN106381310B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 一种用t7噬菌体rna聚合酶和t7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106381310A CN106381310A (zh) 2017-02-08
CN106381310B true CN106381310B (zh) 2020-02-04

Family

ID=57939464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610788821.5A Active CN106381310B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 一种用t7噬菌体rna聚合酶和t7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106381310B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118065A (zh) * 2018-10-31 2020-05-08 康码（上海）生物科技有限公司 一种真核生物的基因改造方法及其相应的基因工程细胞及应用
CN111534533B (zh) * 2020-04-27 2022-04-19 北京化工大学 一种t7rna聚合酶和t7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法
CN112301054A (zh) * 2020-10-23 2021-02-02 华南农业大学 利用k1e噬菌体rna聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞表达病毒蛋白的方法
CN115141846B (zh) * 2022-06-02 2023-03-10 武汉滨会生物科技股份有限公司 一种双启动子质粒及其构建方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104769112A (zh) * 2012-11-01 2015-07-08 菲克特生物科学股份有限公司 用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104769112A (zh) * 2012-11-01 2015-07-08 菲克特生物科学股份有限公司 用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Efficient Reverse Genetics Reveals Genetic Determinants of Budding and Fusogenic Differences between Nipah and Hendra Viruses and Enables Real-Time Monitoring of Viral Spread in Small Animal Models of Henipavirus Infection;Tatyana Yun等;《Journal of Virology》;20150131;第89卷(第2期);169-171 *
T7RNA聚合酶/启动子系统在原核和真核细胞表达系统中的应用;阎海等;《国外医学分子生物学分册》;19921231;第14卷(第4期);1242-1253 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106381310A (zh) 2017-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Trepotec et al. Segmented poly (A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life
CN106381310B (zh) 一种用t7噬菌体rna聚合酶和t7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法
EP4008336A1 (en) A recombinant nucleic acid molecule of transcriptional circular rna and its application in protein expression
Oberbek et al. Generation of stable, high‐producing cho cell lines by lentiviral vector‐mediated gene transfer in serum‐free suspension culture
CN107177593B (zh) 利用优化的基因密码子扩展系统通读提前终止密码子疾病中的截短蛋白
CN107012121B (zh) 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建
Kalwy et al. Toward more efficient protein expression: keep the message simple
CN107893073B (zh) 一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型hek293细胞株的方法
JP6960409B2 (ja) プロモーター
CN107177592A (zh) 抑制性tRNA通读提前终止密码子疾病中的截短蛋白
CN113025579A (zh) 一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系及其构建方法
CN117844806B (zh) 一种5’-utr元件及其在提高蛋白表达量中的应用
DK2771470T3 (en) TRANSCRIPTION DEVICES AND THEIR USE IN EXPRESSION VECTORS
WO2019184372A1 (zh) 高效表达重组人神经生长因子的基因组合
CN107893085B (zh) 一种可用于孤核受体活性调节剂筛选的双荧光素酶报告基因质粒及其构建与应用
CN104975009A (zh) 一种新型的含mar核心片段的动物细胞表达载体
US20210009649A1 (en) Intron for increasing expression level of rhngf
CN109988777A (zh) 谷氨酰胺合成酶基因以及应用
CN116555342A (zh) 一种经改造的pT7TS质粒及其应用
CN112342243A (zh) 表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用
WO2016011448A2 (en) Methods and compositions for expression of polypeptides in a cell
EP2933331B1 (en) Expression cassette
JP2023537007A (ja) 非天然アミノ酸の部位特異的組み込みのための安定な細胞株
CN114561430B (zh) 人源化细胞瞬时表达用表达载体、表达系统、构建方法及其应用
WO2019037131A1 (zh) 一种cd27真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant