JP6960409B2 - プロモーター - Google Patents
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Description
(i)特異性因子は、所与のプロモーターまたはプロモーターのセットに対するRNAポリメラーゼの特異性を変化させ、それらに結合する可能性を高くするか低くする(例えば、原核生物の転写において使用されるシグマ因子)。
(ii)リプレッサーは、オペレーター(プロモーター領域に近接するかプロモーター領域と重なっているDNA鎖上のコード配列)に結合し、鎖に沿ったRNAポリメラーゼの進行を妨げ、従って、遺伝子の発現を妨げる。
(iii)転写因子は、タンパク質コード配列の開始点にRNAポリメラーゼを配置し、次いで、mRNAを転写するためにポリメラーゼを解放する。
(iv)アクチベーターは、RNAポリメラーゼと特定のプロモーターとの間の相互作用を増強し、遺伝子の発現を促進する。エンハンサーは、DNAを輪にして特定のプロモーターを開始複合体に導くためにアクチベーターによって結合されるDNAヘリックス上の部位である。
(v)サイレンサーは、特定の転写因子が結合すると、遺伝子の発現をサイレンスすることができるDNA配列の領域である。
(a)配列番号1、配列番号2または配列番号3に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも80%のヌクレオチド配列同一性を有する第1のポリヌクレオチド、または当該第1のポリヌクレオチドの機能的フラグメント;および
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも80%のヌクレオチド配列同一性を有する第2のポリヌクレオチド、または当該第2のポリヌクレオチドの機能的フラグメント;
を含む核酸分子であって、(a)と(b)が、この順番で5’−3’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、核酸分子を提供する。
(a)配列番号1、配列番号2または配列番号3に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;および
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;
を含み、ここで、(a)と(b)は、5’−3’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;および
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;
を含み、ここで、(a)と(b)は、この順番で隣接して5’−3’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
(a)配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;および
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;
を含み、ここで、(a)と(b)は、この順番で隣接して5’−3’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
(a)配列番号3に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;および
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;
を含み、ここで、(a)と(b)は、この順番で隣接して5’−3’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
(a)配列番号1、配列番号2または配列番号3に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも80%のヌクレオチド配列同一性を有する第1のポリヌクレオチド、または当該第1のポリヌクレオチドの機能的フラグメント;
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも80%のヌクレオチド配列同一性を有する第2のポリヌクレオチド、または当該第2のポリヌクレオチドの機能的フラグメント;および
(c)配列番号5、配列番号6または配列番号7に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも80%のヌクレオチド配列同一性を有する第3のポリヌクレオチド、または当該第3のポリヌクレオチドの機能的フラグメント;
を含む核酸分子であって、(a)、(b)および(c)が、この順番で5’−3’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、核酸分子も提供する。
(a)配列番号1、配列番号2または配列番号3に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;および
(c)配列番号5、配列番号6または配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有する第3のポリヌクレオチド;
を含み、ここで、(a)、(b)および(c)は、この順番で5’−3’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;および
(c)配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有する第3のポリヌクレオチド;
を含み、ここで、(a)、(b)および(c)は、この順番で隣接して5’−3’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
(a)配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;および
(c)配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有する第3のポリヌクレオチド;
を含み、ここで、(a)、(b)および(c)は、この順番で隣接して5’−3’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
(a)配列番号3に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;および
(c)配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有する第3のポリヌクレオチド;
を含み、ここで、(a)、(b)および(c)は、この順番で隣接して5’−3’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
(i)ヘルパープラスミド(例えば、本発明のプロモーターの調節制御下にあるレンチウイルスのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むもの);
(ii)ウイルスゲノムプラスミド(例えば、必要とされる導入遺伝子の単純な挿入に適合していてもよいパッケージングシグナルを有するもの);
(iii)緩衝液;
(iv)制限酵素;
(v)トランスフェクション培地;および
(vi)哺乳動物細胞
からなる群より選択される1つ以上の追加の構成要素と共に、本発明の発現ベクターおよび/または宿主細胞を含むキットも提供する。
表1で特定されている配列からなる組換えプロモーターフラグメントを作製した。
ホタルルシフェラーゼアッセイで使用したレポーターベクターは、以下のように構築した。
図1に示されるSnapFast(SF)ベクターを使用した。SnapFastベクターのバックボーンは、pUCの細菌の複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子およびマルチクローニングサイトからなる。ホタルルシフェラーゼをコードする配列を、NcoI制限部位とXbaI制限部位の間でマルチクローニングサイトにクローニングした(図1を参照のこと)。ルシフェラーゼをコードする配列は、Kozakリボソーム結合部位を包含する。
材料および方法
各組換えプロモーターに由来するコロニーからプラスミドDNAを精製した。組換えプロモーターを含むレポーターベクターを、いくつかの96ウェルプレートにおいてHEK293細胞に個々にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を37℃で24時間インキュベートした。Luciferase Assay Systemキット(Promega、Wisconsin、USA)を用いて各ウェルをルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
結果を図2に示す。組換えプロモーターフラグメントp567およびp576は、このアッセイにおいてCMV(現在の至適基準)よりも良好に機能した。
経時的実験のために、3つの組換えプロモーター(p565、p567およびp576)を選択した。結果を図3に示す。
本発明の組換えプロモーターp565によって駆動されるタンパク質発現レベルを、対照として示されるCMVプロモーターでの発現と共に図4に示す。商業的に有用である4つの異なる抗原(タンパク質「W」、「X」、「Y」および「Z」)の発現について、p565プロモーターを標準的なCMVプロモーターと比較した。各抗原について、コード配列を、図1に示すものと同等のベクターにおいてCMVプロモーターまたはp565プロモーターのいずれかの下流にクローニングした。
分枝状PEI(25kDa)を用いた一過性トランスフェクションの方法によって、ヒト胎児腎臓細胞(HEK293)でCMVプロモーターまたはプロモーターP565iから様々なヒト遺伝子(表2を参照のこと)を過剰発現させた。
分枝状PEI(25kDa)を用いた一過性トランスフェクションの方法によって、CHO K1細胞でCMVプロモーターまたはプロモーターP565iから様々なヒト遺伝子(表3を参照のこと)を過剰発現させた。
分枝状PEI(25kDa)を用いた一過性トランスフェクションの方法によって、HCT116細胞でCMVプロモーター、P565iプロモーター、P565プロモーター、P576プロモーター、P567プロモーターから緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現させた。
配列番号3
AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCC
配列番号2
CTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATT
配列番号1
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCACTAGTCGCCGTGAACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCC
配列番号4
ATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC
配列番号7
GTTGTTCGCTTTGATAAACTTCCAGGATTCGGAGACAGTATTGAAGCTCAGGTACAGAAATAATTTCACCTTTCTTTCTCTTTCTATTCAGTGTGGCACATCTGTAAACGTTCACTCTTCACTTAGAGACATCCTCAACCAAATCACCAAACCAA
配列番号6
GCCCAGGAAGTACACGAGAAGCTCCGAGGATTGGCTGAAGTCCAACGTCTCTGATTGCGGTGGCTCAGAGCACCCGTATCATTTTGGAGGTGAGTGGCTTTGGTTCCCGGCTGAGGTGGAGTGGGCTGAGGACTAGACTGAGCCCTCGGACATGGAGGTGGGGATGGGGCAGACTCATCCCATTCTTGACCAAGCCCTTGTTCTGCTCCCTTCCCAGGCTCTGTGACTGGGGCAACCTGCAAGGAGCTGGCCAGCCAGCCTGACGTGGACGGCTTCCTTGTGGGTGGTGCTTCCCTCAAGCCCGAATTCGTGGACATCATCAACGCCAAACAA
配列番号5
TGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAG
Claims (15)
- (a)配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも95%のヌクレオチド配列同一性を有する第1のポリヌクレオチド;および
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも95%のヌクレオチド配列同一性を有する第2のポリヌクレオチド;
を含む核酸分子であって、(a)と(b)が隣接してこの順番で5’−3’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、前記核酸分子。 - 前記第1のポリヌクレオチドが、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列のうちの1つに対する少なくとも96%、97%、98%、99%または100%のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記第2のポリヌクレオチドが、配列番号4に示されるポリヌクレオチド配列に対する少なくとも96%、97%、98%、99%または100%のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項1または2に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、
(a)配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;および
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;
を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸分子。 - 前記核酸分子が、
(c)配列番号5に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも95%のヌクレオチド配列同一性を有する第3のポリヌクレオチド;
をさらに含み、
(a)、(b)および(c)が隣接してこの順番で5’−3’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子。 - 前記第3のポリヌクレオチドが、配列番号5に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも96%、97%、98%、99%または100%のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項5に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する第1のポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する第2のポリヌクレオチド;および
(c)配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有する第3のポリヌクレオチド;
を含み、
(a)、(b)および(c)が隣接してこの順番で5’−3’に連結されている、
請求項5又は6に記載の核酸分子。 - 前記核酸分子が、誘導性エレメントをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 哺乳動物細胞が、マウス、ラット、ハムスター、サルまたはヒトの細胞である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、pSVまたはpCMVのプラスミドベクター、ワクシニアまたはレトロウイルスのベクター、またはバキュロウイルスベクターである、請求項10に記載の発現ベクター。
- 前記核酸分子が、異種ポリヌクレオチドに機能可能に連結されている、請求項10または請求項11に記載の発現ベクター。
- 請求項10〜12のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む、哺乳動物宿主細胞。
- そのゲノムが、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸分子または請求項10〜12のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む、非ヒト哺乳動物。
- (i)ヘルパープラスミド;
(ii)ウイルスゲノムプラスミド;
(iii)緩衝液;
(iv)制限酵素;
(v)トランスフェクション培地;および
(vi)哺乳動物細胞
からなる群より選択される1つ以上の追加の構成要素と共に、請求項10〜12のいずれか1項に記載の発現ベクターおよび/または請求項13に記載の宿主細胞を含む、キット。
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