WO2005090562A1 - 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列 - Google Patents

軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列 Download PDF

Info

Publication number
WO2005090562A1
WO2005090562A1 PCT/JP2005/003385 JP2005003385W WO2005090562A1 WO 2005090562 A1 WO2005090562 A1 WO 2005090562A1 JP 2005003385 W JP2005003385 W JP 2005003385W WO 2005090562 A1 WO2005090562 A1 WO 2005090562A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
temperature
low
control element
nucleotide sequence
transcription
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/003385
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jun Fujita
Original Assignee
Jun Fujita
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jun Fujita filed Critical Jun Fujita
Priority to AT05719702T priority Critical patent/ATE508189T1/de
Priority to EP05719702A priority patent/EP1728859B1/en
Priority to CA002558269A priority patent/CA2558269A1/en
Priority to DE602005027824T priority patent/DE602005027824D1/de
Priority to AU2005224486A priority patent/AU2005224486B2/en
Priority to US10/592,520 priority patent/US20080038721A1/en
Priority to JP2006511142A priority patent/JP4613160B2/ja
Publication of WO2005090562A1 publication Critical patent/WO2005090562A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a mild low-temperature response factor that promotes gene transcription and translation at a low temperature.
  • Non-patent literature 1 Kauftnann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M.
  • Non-Patent Document 2 Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol. Bioeng. 2003 May
  • Non-Patent Document 3 Fujita J., J. Mol.Microbiol.Biotechnol.1999 Nov; l (2): 243-55 Disclosure of the Invention
  • the present invention increases protein production per unit time per cell at low temperatures, It is intended to provide a method for increasing the yield.
  • the present inventors have proposed a mammalian cold shock protein Cirp (cold inducible RNA-binding protein) (the genomic DNA sequence of which is shown in SEQ ID NO: 1) whose expression is increased by mild low temperature, and Rbm3 (RNA-binding motif protein). (Fujita J. Cold shock response in mammalian cells.J Mol Microbiol Biotechnoi. 1999)
  • the present invention provides a nucleotide sequence:
  • a low-temperature transcription control element containing a nucleotide sequence complementary to this sequence.
  • the term “mild low temperature” means a temperature of 15 to 36 ° C, preferably 30 to 34 ° C, particularly preferably 32 ° C.
  • the term “mild low-temperature transcription control element” refers to a nucleotide sequence that promotes gene transcription specifically at low temperatures.
  • the low-temperature, low-temperature transcription control element of the present invention acts as a low-temperature-specific low-temperature-specific gene for transcription of a gene.
  • the mild low-temperature transcription control element of the present invention is capable of exerting its function even when used alone. It is preferable to use 2 to 50, preferably 2 to 10 identical or different sequences having the same or different binding. . When used in combination, the same or different nucleotide sequences may be directly linked to each other, or may be linked by interposing any kind and number of nucleotide residues between the sequences.
  • the combination of the low-temperature low-temperature transcription control element is referred to herein as a “low-temperature low-temperature transcription control enhancer”.
  • the low-temperature low-temperature transcription control element and the low-temperature low-temperature transcription control sensor of the present invention are independent of the distance of the promoter power.
  • the present invention also relates to a vector comprising the low-temperature transcription control element or the low-temperature transcription control enhancer described above. [0009] The present invention also relates to a mammalian cell transformed with the vector.
  • the present invention is a method for screening a low-temperature low-temperature transcription control element, which comprises the following steps:
  • nucleotide sequences to be incorporated into vectors are shortened, and nucleotide sequences necessary to promote reporter gene transcription at mild low temperatures are identified.
  • the present invention is a method for improving a low-temperature low-temperature transfer control element, comprising the following steps:
  • the present inventors have further found a gene expression control sequence in the 5 'untranslated region (Untranslated Region (UTR)) of the Cirp gene mRNA that promotes translation under mild low temperatures. That is, the present invention provides a nucleotide sequence located 5 'to the coding sequence and 3' to the promoter:
  • the term "mild low-temperature translation control element” refers to a factor that promotes the translation of a transcribed mRNA specifically at a low temperature. This mild low-temperature translation control element, when transcribed, forms the 5 'untranslated region (UTR) of the mRNA.
  • mild low-temperature response factor means a mild low-temperature transcription control element and a Z or a low-temperature low-temperature translation control element.
  • transcription and translation of a gene can be promoted under mildly low temperatures.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a pCAT3 basic vector.
  • MCS represents the multicloning site
  • CAT represents the coding sequence of chloramue-coal acetyltransferase
  • PA represents the polyadenylation signal from the SV40 virus
  • Amp 1 represents the ampicillin resistance gene.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a pCAT3 promoter vector.
  • MCS represents a multicloning site
  • SV40 promoter represents a promoter derived from the SV40 virus
  • CAT represents a coding sequence of chloramphene-coal acetyltransferase
  • PA represents a polyadenylation signal derived from the SV40 virus.
  • Amp 1 represents an ampicillin resistance gene.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen).
  • MCS stands for multicloning site.
  • the firefly luciferase coding sequence was inserted between EcoRV and XbaI of this multicloning site, and the 5, untranslated region (UTR) of Cirp mRNA was inserted between the multicloning sites Kpnl and BamHI.
  • Examples of mild low-temperature transcription control elements include, but are not limited to, tccccgcc (SEQ ID NO: 2), gccccgcc (SEQ ID NO: 9), accccgcc (SEQ ID NO: 10), tccccgtc (SEQ ID NO: 11, tccccgct ( There are SEQ ID NO: 12), tccccgaa (SEQ ID NO: 21), ggcgggga (SEQ ID NO: 22), and ggggggga (location [J number 7]).
  • the low-temperature low-temperature transcription control element, the low-temperature low-temperature transcription control element, and the low-temperature low-temperature translation control element include a protecting group, a solid phase synthesis method using phosphoramidide using four types of deoxyribonucleotides, and hydrogen phosphonate.
  • a protecting group for example, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 35-81, 83-115 (1984); J. Org. Chem., 49, 2139 (1984); Tetrahedron Lett., 27,469 (1986); Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862; Tetrahedron
  • Prokaryotic, eukaryotic, and viral promoters can be used as the promoter.
  • Preferred are a mammalian promoter and a viral promoter.
  • preferred motors include, but are not limited to, the promoter of mouse thymidine kinase (TK), cytomegalovirus (CMV), SV40.
  • the mild cold response element or mild cold response element of the present invention, a promoter, and a coding sequence encoding a protein to be expressed are ligated and inserted into a vector.
  • the vectors include prokaryotic and eukaryotic cell expression vectors. Examples of preferred betaters include, but are not limited to, pCMV (Invitrogen), pCAT3 Promoter Vector (Promega), pSV2-Neovector. (V) Host cells to be used
  • the host cells are transfected with the vector. It is preferable to use mammalian cells as host cells. Examples of preferred mammalian cell lines include human cell lines 293, 293T, U-2OS, Huh-7, HeLa, etc., monkey cell lines COS-7, Vero, etc., and mouse cell lines NIHZ3T3, Balb / 3T3, B-6. , Hepal-6 and Chinese nomster cell line CHO.
  • transfusion method examples include a calcium phosphate method, a lipofection method, a retrovirus method, and an electroporation method.
  • a calcium phosphate method a salted calcium solution containing DNA (vector) is added dropwise to a phosphoric acid solution while stirring.
  • DNA-calcium phosphate precipitates finely, and when this solution is added to host cells, DNA-phosphate phosphate precipitates into the host cells as a result of phagocytosis, resulting in DNA being taken into cells Will be.
  • the host cells are cultured at a low temperature. It is not necessary to use a special medium, and a medium for mammalian cell culture can be used.
  • a typical medium is Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) and Kafun (Invitrogen).
  • D-MEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FCS fetal calf serum
  • Kafun Invitrogen
  • the present invention is a method for screening a low-temperature low-temperature transcription control element, comprising the following steps:
  • nucleotide sequence to be incorporated into the vector is shortened. Identifying the nucleotide sequence required to promote transcription of the target gene.
  • a gene whose transcription is enhanced at a culture temperature of 32 ° C is obtained by culturing mammalian cells at 37 ° C and mild low temperature, particularly preferably at 32 ° C, and extracting DNA from RNA extracted from each. Chip (microarray), cDNA subtraction method, etc. (for example, Moody, DE Genomic techniques: An overview of methods for the study of gene expression. J. Anim. Sci. 79 (E. Suppl.): E128-E135 , 2001)).
  • Prokaryotic, eukaryotic, and viral promoters can be used. Preferred are a mammalian promoter and a viral promoter. Examples of preferred promoters include, but are not limited to, the promoter of mouse thymidine kinase (TK), cytomegalovirus (CMV), SV40
  • the reporter gene encodes a protein that is easily detected, and includes, but is not limited to, a luciferase and a chloramphene- equipcetyltransferase gene.
  • the vectors include prokaryotic and eukaryotic cell expression vectors. Examples of preferred vectors include, but are not limited to, pCMV (Invitrogen), pCAT3 promoter vector (Promega), pSV2-Neo vector.
  • Transfat the host cells with the vector to be used It is preferable to use mammalian cells as host cells.
  • mammalian cell lines include human cell lines 293, 293T, U-2OS, Huh-7, HeLa, etc., monkey cell lines COS-7, Vero, etc., and mouse cell lines NIH / 3T3, Balb / 3T3, B- 6, Hepal-6, Chinese nomster cell line CHO.
  • the transfection method include a calcium phosphate method, a lipofection method, a retrovirus method, and an electroporation method.
  • a saline solution containing DNA (vector) is added dropwise to a phosphoric acid solution while stirring. A fine precipitate of DNA-calcium phosphate is formed, and when this solution is added to the host cells, the precipitate of DNA-phosphate is phagocytosed into the host cells, resulting in the DNA being taken into the cells. Will be.
  • a medium for mammalian cell culture can be used.
  • a typical medium is Dulbecco's Modified Eagle with 10% fetal calf serum (FCS). Medium (D-MEM) (Invitrogen).
  • an enzyme that specifically promotes the transcription of the gene at a low temperature can be a sensor.
  • the nucleotide sequence that promotes the transcription of the gene under mild low temperature is shortened to obtain a mild low temperature transcription control element. It can be confirmed that the nucleotide sequence is complementary to the sequence of the mild low-temperature transcription control element by promoting the transcription of the gene at a low temperature.
  • the present invention is a method for improving a low-temperature low-temperature transfer control element, comprising the following steps:
  • the method also includes:
  • Mutant nucleotides in which one or two bases of the mild low-temperature transcription control elements are substituted with other bases are synthesized as described above.
  • Prokaryotic, eukaryotic, and viral promoters can be used. Preferred are a mammalian promoter and a viral promoter. Examples of preferred promoters include, but are not limited to, mouse thymidine kinase (TK), cytomegalovirus (CMV), the promoter of SV40.
  • TK mouse thymidine kinase
  • CMV cytomegalovirus
  • Reporter genes encode proteins that are readily detectable, and include, but are not limited to, luciferase and chloramue- equipcetyltransferase genes.
  • the vectors include prokaryotic and eukaryotic cell expression vectors. Examples of preferred vectors include, but are not limited to, pCMV (Invitrogen), pCAT3 promoter vector (Promega), pSV2-Neo vector. Transfat the host cells with the vector to be used. It is preferable to use mammalian cells as host cells.
  • Examples of preferred mammalian cell lines include human cell lines 293, 293T, U-2OS, Huh-7, HeLa, etc., monkey cell lines COS-7, Vero, etc., mouse cell lines NIH Z3T3, BalbZ3T3, B-6, Hepal — 6, Chinese nomster cell line CHO.
  • Examples of the transfusion method include a calcium phosphate method, a lipofection method, a retrovirus method, and an electroporation method.
  • a calcium phosphate method a salted calcium solution containing DNA (vector) is added dropwise to a phosphoric acid solution while stirring. A fine precipitate of DNA-calcium phosphate is formed. When this solution is added to the host cells, the precipitate of DNA-phosphate is absorbed into the host cells by phagocytosis, and as a result, the DNA is taken into the cells. Will be.
  • D-MEM Dulbecco's Modified Egg Medium
  • FCS fetal calf serum
  • an enzyme that specifically promotes the transcription of the gene at a low temperature can be a sensor. It can be confirmed that the nucleotide sequence is a nucleotide sequence complementary to the sequence of the low-temperature transcription control element by confirming that the transcription of the gene is promoted at a low temperature.
  • the invention also provides a nucleotide sequence located 5 'to the coding sequence and 3' to the promoter:
  • prokaryotic, eukaryotic, and viral promoters can be used.
  • Preferred are a mammalian promoter and a viral promoter.
  • preferred promoters include, but are not limited to, the promoter of mouse thymidine kinase (TK), cytomegalovirus (CMV), SV40.
  • TK mouse thymidine kinase
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 the promoter of mouse thymidine kinase
  • the low-temperature low-temperature transfer control element or the low-temperature low-temperature transfer control sensor is replaced with the low-temperature low-temperature translation control element. Can also be used at the same time.
  • the vector is a prokaryotic or eukaryotic cell expression vector.
  • preferred vectors include, but are not limited to, pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen), pSV2-neo vector.
  • Host cells are transfected with the vector to be used. It is preferable to use mammalian cells as host cells. Examples of preferred mammalian cell lines include human cell lines 293, 293T, U-2OS, Huh-7, HeLa, etc., monkey cell lines COS-7, Vero, etc., and mouse cell lines NIH / 3T3, Balb / 3T3, B— 6, Hepal-6, Chinese nomster cell line CHO. Examples of the transfection method include a calcium phosphate method, a lipofection method, a retrovirus method, and an electroporation method. For example, in the calcium phosphate method, a saline solution containing DNA (vector) is added dropwise to a phosphoric acid solution while stirring. A fine precipitate of DNA-calcium phosphate is formed, and when this solution is added to the host cells, the precipitate of DNA-phosphate is phagocytosed into the host cells, resulting in the DNA being taken into the cells. Will be.
  • D-MEM Dulbecco's Modified Egg Medium
  • FCS fetal calf serum
  • CDM8-LacZ j8-galactosidase expression vector to correct the efficiency of each transfection.
  • ATCC 0.5 — Cotransfection was performed with human cell line 293 cultured at 37 ° C for 1 day with 1.0 gZ35mm dish. The transfected cells were split into two and one was cultured at 32 ° C and the other at 37 ° C. The medium is D-MEM supplemented with 10% FCS.
  • Example 1 a human cell line 293T, U-2OS, Huh-7, a monkey cell line COS-7, a mouse cell line NIHZ3T3, Balb / 3T3, B-6, Hepal were used instead of human 293 cells as host cells. Similar experiments were performed using —6 with similar results.
  • Example 3 a human cell line 293T, U-2OS, Huh-7, a monkey cell line COS-7, a mouse cell line NIHZ3T3, Balb / 3T3, B-6, Hepal were used instead of human 293 cells as host cells. Similar experiments were performed using —6 with similar results.
  • Example 3
  • Cirp genomic gene 340 220 was prepared and incorporated into the multicloning site of the pCAT3 promoter vector (Promega) (Fig. 2).
  • This vector has an SV40 promoter.
  • human 293 cells were used to examine the transcription promoting activity at 32 ° C. after gene transfer by DNA transfection using the calcium phosphate method.
  • the transcription activity was calculated by dividing the amount of CAT protein by the / 3 galactosidase activity (Table 2).
  • the 10 bases including tccccgcc found above were connected in series by three in a row (ttccccgccgttccccgccgttccccgccgcccgcccgccgccg) (SEQ ID NO: 3) in the same manner as in Example 3 for multicloning of the pCAT3 promoter vector (Promega). Incorporated into the site. Negative control As a control, a pCAT3 promoter vector (mock) was used, and as a positive control, one incorporating Cirp genome-340220 and one incorporating SV40 enhancer were used. Table 3 shows the results after 24 hours of transfusion in 293 cells.
  • the ratio value of 32 ° C to 37 ° C was 2.52, confirming that it was one of the low-temperature transfer control enhancers.
  • the cells were transfected into 293T cells. After 24 hours, CATZLacZ was measured, and as a control, the ratio of 32 ° CZ37 ° C when the pCAT3 promoter vector was used was set to 1, and the low-temperature transcription promotion of each mutant (Enhasa 1) was performed. )
  • the activity is shown in the table below.
  • tccccgcc (SEQ ID NO: 2) 3.89 mutant 12 GAcccgcc (SEQ ID NO: 15) 1.76 mutant 3 tMccgcc (SEQ ID NO: 16) 1.07 mutant 34 tcAAcgcc (SEQ ID NO: 17) 1.47 mutant 45 tccAAgcc (related number 18) 0.35 mutant 56 tcccATcc (stroke number 19) 1.07 mutant 67 tccccTAc (SEQ ID NO: 20) 1.66 mutant 78 tccccgAA (ga column number 21) 3. 69 Control Mouth 1.00
  • the mutation of the first base to G or A, the mutation of the seventh base to T, and the mutation of the eighth base to T show the same low-temperature transcription promoting activity as the wild type. Mutation of the 6th base to A or C lowers the low-temperature transcription promoting activity compared to the wild type, but shows significant activity. As seen in mutant 78, mutation of the 7th to 8th AA to AA shows the same low-temperature transcription promoting activity as the wild type.
  • tccccgcc is a sequence showing low-temperature transcription promoting activity
  • the ability to be an enhancer may use these complementary sequences (eg, ggcgggga (SEQ ID NO: 22) for the complementary sequence to tccccgcc (SEQ ID NO: 2)).
  • ggcgggga SEQ ID NO: 22
  • tccccgcc SEQ ID NO: 2
  • the pGL3-basic plasmid (Promega) plasmid was inserted into the multicloning site (between EcoRV and Xbal) of the pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen) having the cytomegalovirus (CMV) promoter ( Figure 3).
  • the firefly luciferase cDNA that had been cut out was inserted.
  • the control is a plasmid that does not incorporate anything between Kpnl and BamHI.
  • pRLTK plasmids renila luciferase expression vector, to correct the efficiency of each transfection; Promega.
  • the transfected cells were split into two and one was cultured at 32 ° C and the other at 37 ° C.
  • the medium is 10% FCS + D-MEM.
  • the present invention can be widely used for protein production.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　　哺乳動物細胞を用いて組換えＤＮＡ法において産生するタンパク質を増加させることを目的とする。ヌクレオチド配列： 　　　　　　　　　　　ｘ１ｃｃｃｃｘ６ｘ７ｘ８ （式中、ｘ１は、ｔ、ｇ、またはａを表し、ｘ６は、ｇ、ａ，またはｃを表し、ｘ７は、ｃ、ａ，またはｔを表し、ｘ８は、ｃ、ａ，またはｔを表す） またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む軽度低温転写制御エレメントをエンハンサーとして用い、軽度低温で培養すると転写が促進される。 　またコード配列の５’側でプロモーターの３’側に配列番号６の軽度低温翻訳制御エレメントを配置し、軽度低温で培養すると翻訳が促進される。

Description

軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列
技術分野
[0001] 本発明は軽度の低温にお!ヽて遺伝子の転写および翻訳を促進させる軽度低温応 答因子に関する。
背景技術
[0002] モノクローナル抗体、成長因子、凝固因子など多くの医薬品や検査試薬がバイオ テクノロジ一により産生されるようになってきた。
一般に 10— 15°Cと!、う低温にぉ 、ては、リコンビナントタンパク質の正し!/、フォール デイングが促進され、そのタンパク質分解酵素による分解も抑制されることから (Baneyx, P ., In vivo folding of recombinant proteins in Escherichia coli. In Manual of industrial microbiology and biotechnology, 2nd ed. (Demain, A.L., Davies, J.E., Altas, R.M., et al, eds.), ASM Press, Washingtonm D.C., pp.551— 565, 1999)、糸且換 えタンパク質をバクテリアに産生させる場合には、 37°Cではなく 20°C以下の低温で の培養が利用されている。この際、低温ではタンパク質合成が一般に低下するため に、 目的タンパク質の収量が悪くなる可能性がある。そこで、 目的タンパク質の発現 プロモーターとして低温ショックタンパク質 CspAのプロモーターと 5，非翻訳領域（U TR)を利用し、この問題を解決している。（Baneyx, F. and Mujacic, M.,
し old— inducible promoters for heterologous protein expression. Methods in
Molecular Biology, 205, 1—18, 2001.)
しかし、バクテリアと哺乳動物細胞では、タンパク質の翻訳後修飾に大きな違いが あり、特に医薬品の場合にはグリコシルイ匕の状態が治療効果に重要である。そこで、 組換えタンパク質医薬品の産生には、哺乳動物細胞 (特にチャイニーズハムスター の細胞株）が利用されて 、る。この細胞培養を利用した製造のコストを減らすために は、タンパク質の収量を上げる必要がある。 37°Cで通常の培養を行った場合、細胞 は急激に増殖した後死滅するために、細胞が生存して目的タンパク質を生産する期 間が短いという欠点がある。そこで、細胞増殖を抑制し、長期間細胞を生存させること iS 細胞増殖阻害剤添加、増殖阻害遺伝子 p27の発現、軽い低温（30 - 32°C)での 培養、その他の方法により試みられている。 （Schatz SM et al, Biotechnol Bioeng 2003 Nov 20;84(4):433- 438参照）
なかでも軽！、低温での培養では、 1)培養温度が 37°Cの場合よりも細胞が長！、期 間生存してタンパク質合成を行う。 2)タンパク質分解酵素の活性が低下して目的タン ノ ク質の分解が減少する。 3)タンパク質のグリコシルイ匕や異性体の産生は 37°C培 養の時と同程度である。また、シアル酸付カ卩はかえつて 37°Cでよりも良好である。 4) ノ クテリアでの場合と同様に目的タンパク質の正しいフォールデイングが起きやすい 可能性があるという特徴がある (Kauftnann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72(6):592- 602 ;Yoon SK, Song JY,
Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82(3):289— 98)。
肝心のリコンビナントタンパク質収量に関しては、細胞の生存期間が延びるために 総収量が増える場合が多い。しかし、細胞あたりの単位時間でのタンパク質産生量（ specific productivity)をみた場合には、ばらつき（細胞の種類や目的タンパク質の種 類によるの力 未知の要因による）があり、 37°Cでの specific productivityよりもかえつ て低下する例が多く問題点となっている（(Kauftnann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72(6):592- 602 ;Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82(3):289- 98)。なお、遺伝子発現制 御機構が異なるために、バクテリアの低温ショックタンパク質 CspAのプロモーターと 5 '非翻訳領域（UTR)を哺乳動物に利用することはできない。
非特干文献 1： Kauftnann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M.
Biotechnol. Bioeng. 2001 Mar 20;72(6):592- 602
非特許文献 2 :Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol. Bioeng. 2003 May
5;82(3):289-98
非特許文献 3 : Fujita J., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999 Nov;l(2):243- 55 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明は低温において細胞あたりの単位時間でのタンパク質産生量を高め、総 収量を上げる方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明者は軽度低温により発現の亢進する哺乳動物の低温ショックタンパク質 Cir p (cold inducible RNA-binding protein) (そのゲノム DNA配列を配列番号 1に示す） および Rbm3(RNA- binding motif protein 3)を発見し先に報告した (Fujita J. Cold shock response in mammalian cells. J Mol Microbiol Biotechnoi. 1999
Nov;l(2):243-55.)0このたびこれらのタンパク質遺伝子のプロモーターの 5，側に、軽 Vヽ低温温度下にお ヽて転写を促進させる遺伝子発現制御配列を発見したことに基 いて本発明を完成させた。
[0005] 即ち、本発明は、ヌクレオチド配列：
X CCCCX X X
1 6 7 8
(式中、 Xは、 t、 g、または aを表し、 Xは、 g、 a,または cを表し、 Xは、 c、 a,または t
1 6 7 を表し、 Xは、 c、 a,または tを表す）
8
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む軽度低温転写制御エレメントに関 する。
[0006] 本明細書において、「軽度低温」とは 15— 36°C、好ましくは 30— 34°C、特に好まし くは 32°Cの温度を!、う。「軽度低温転写制御エレメント」とは軽度低温にお!、て特異 的に遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列を ヽぅ。本発明の軽度低温転写制 御エレメントは遺伝子の転写に軽度低温特異的なェンノ、ンサ一として作用する。
[0007] 本発明の軽度低温転写制御エレメントは単独で用いてもその機能を発揮し得る力 同一または異なる該配列を 2— 50個、好ましくは 2— 10個結合して用いるのが好まし い。結合させて用いる場合、同一または異なる該ヌクレオチド配列を相互に直接連結 してもょ ヽが、該配列間に任意の種類および数のヌクレオチド残基を介在させて結合 させてもょ 、。軽度低温転写制御エレメントを結合させたものを本明細書では「軽度 低温転写制御ェンハンサー」と呼ぶ。本発明の軽度低温転写制御エレメントおよび 軽度低温転写制御ェンノヽンサ一はプロモーター力 の距離には無関係である。
[0008] 本発明は、上に記載の軽度低温転写制御エレメントまたは軽度低温転写制御ェン ハンサーを含むベクターにも関する。 [0009] 本発明は該ベクターで形質転換された哺乳動物細胞にも関する。
[0010] 本発明は、軽度低温転写制御エレメントのスクリーニング方法であって、以下のェ 程：
1)軽度低温、特に好ましくは 32°Cの培養温度で転写の亢進する遺伝子を提供し、
2)該遺伝子の転写開始点の 5'上流 1. 5キロベース力 第一ェキソンの範囲をクロ 一二ングし、
3)クロー-ングしたヌクレオチド配列を、適当なプロモーターとともに、レポーター遺 伝子を発現するベクターに組み込み、
4)該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
5)培養細胞を軽度低温および 37°Cでそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現さ せ、軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるポリヌクレオチド配列を 得、
6)軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるポリヌクレオチド配列に ついて、ベクターに組み込むヌクレオチド配列を短くしていき、軽度低温においてレ ポーター遺伝子の転写を促進させるに必要なヌクレオチド配列を同定する、 ことを含む方法に関する。
[0011] 本発明は、軽度低温転写制御エレメントの改良方法であって、以下の工程：
1)軽度低温転写制御エレメントのうち 1又は 2塩基を他の塩基に置換した変異ヌクレ ォチドを合成し、
2)適当なプロモーターとともに、レポーター遺伝子を発現するベクターに組み込み、
3)該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
4)培養細胞を軽度低温および 37°Cでそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現さ せ、軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列を同 定する、
ことを含む方法に関する。
[0012] 本発明者はさらに Cirp遺伝子 mRNAの 5 '側の非翻訳領域（Untranslated Region (UTR))に、軽度低温下において翻訳を促進させる遺伝子発現制御配列を発見した 即ち本発明は、コード配列の 5'側でプロモーターの 3'側に配置される、ヌクレオチ ド配列：
actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctc gcgtcaggga
cctgcccgac tcagcggctg cc (酉列备号 23)
を含む軽度低温翻訳制御エレメントに関する。
[0013] 本明細書にぉ 、て、「軽度低温翻訳制御エレメント」とは軽度低温にぉ 、て特異的 に、転写された mRNAの翻訳を促進させる因子をいう。この軽度低温翻訳制御エレ メントは転写された場合、 mRNAの 5 '非翻訳領域 (UTR)を形成する。
また「軽度低温応答因子」と言う場合は軽度低温転写制御エレメントおよび Zまた は軽度低温翻訳制御エレメントを意味する
発明の効果
[0014] 本発明によれば、軽度低温にぉ 、て遺伝子の転写と翻訳を促進させることができる 図面の簡単な説明
[0015] [図 l]pCAT3ベーシックベクターを表わす模式図である。 MCSはマルチクローニン グサイトを表わし、 CATはクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼのコード配 列を表わし、 PAは SV40ウィルス由来のポリアデニル化シグナルを表わし、 Amp1は アンピシリン耐性遺伝子を表わす。
[0016] [図 2]pCAT3プロモーターベクターを表わす模式図である。 MCSはマルチクロー- ングサイトを表わし、 SV40プロモーターは SV40ウィルス由来のプロモーターを表わ し、 CATはクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼのコード配列を表わし、 P Aは SV40ウィルス由来のポリアデ-ル化シグナルを表わし、 Amp1はアンピシリン耐 性遺伝子を表わす。
[0017] [図 3]pcDNA3. 1 (+ )ベクター（インビトロジェン社）を表わす模式図である。 MCS はマルチクロー-ングサイトを表わす。このマルチクロー-ングサイトの EcoRVと Xba Iの間にホタルルシフェラーゼのコード配列を挿入し、マルチクロー-ングサイト Kpnl と BamHIの間に Cirp mRNAの 5，非翻訳領域（UTR)を組み込んだ。
発明を実施するための最良の形態 [0018] 軽度低温転写制御エレメントの例は、限定するものではな 、が、 tccccgcc (配列番 号 2)、 gccccgcc (配列番号 9)、 accccgcc (配列番号 10)、 tccccgtc (配列番号 11、 tccccgct (配列番号 12)、 tccccgaa (配列番号 21)、 ggcgggga (配列番号 22)、 ggggggga (配歹 [J番号 7)がある。
[0019] (i)軽度低温応答エレメントの製造
軽度低温転写制御エレメント、軽度低温転写制御ェンノヽンサ一及び軽度低温翻訳 制御エレメントは保護基のっ 、た 4種類のデォキシリボヌクレオチドを用いホスホロァ ミダイドを用いる固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで 得ることができる (例えば， Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 35-81,83-115 (1984); J. Org. Chem., 49,2139 (1984); Tetrahedron Lett., 27,469 (1986); Tetrahedron Lett.,22, 1859-1862; Tetrahedron
Lett.,21, 719-722(1980); J. Am. Chem. Soc., 103,3185- 3191(1981)を参照）。今日で は市販の DNA合成装置（例えば Applied Biosystem社製など）によって容易に合成 できる。
[0020] (ii)使用するプロモーター
プロモーターとしては、原核生物、真核生物、ウィルスのプロモーターを使用できる 。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウィルスプロモーターである。好ましいプ 口モーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ (TK) ,サイトメ ガロウィルス (CMV)、 SV40のプロモーターを含む。
[0021] (iii)コード酉己歹 IJ
発現させるべき遺伝子には制限がなくいずれのタンパク質をコードする配列も用い ることがでさる。
[0022] (iv)使用するベクター
本発明の軽度低温応答エレメントまたは軽度低温応答ェンノヽンサ一、プロモーター および、発現させるべきタンパク質をコードするコード配列を連結してベクターに挿入 する。ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターである。好ましいベタ ターの例は、限定されるものではないが pCMV (インビトロジェン社）、 pCAT3プロモ 一ターベクター（プロメガ社）、 pSV2—ネオベクターを含む。 [0023] (v)使用する宿主細胞
該ベクターで宿主細胞をトランスフエタトする。宿主細胞としては哺乳動物細胞を用 いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株 293、 293T, U-2 O S, Huh - 7、 HeLa等、サル細胞株 COS—7、 Vero等、マウス細胞株 NIHZ3T3, B alb/3T3, B-6, Hepal— 6、チャイニーズノヽムスター細胞株 CHO等である。
トランスフエクシヨンの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、レトロゥ ィルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液に DN A (ベクター）を含む塩ィ匕カルシウム溶液を攪拌しながら 1滴ずつ加える。 DNA—リン 酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞にカ卩えると DNA-リン酸力 ルシゥムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、 DNAが細胞内に取り こまれることになる。
[0024] (vi)培養条件
宿主細胞は軽度低温にぉ 、て培養する。培地は特別のものを使用する必要はなく 、哺乳動物細胞培養用の培地を使用できる。典型的な培地の例は、 10%ゥシ胎児 血清（FCS)添カ卩のダルベッコ改変イーグル培地（D— MEM) (インビトロジヱン社）で ある。
[0025] 本発明は、軽度低温転写制御エレメントのスクリーニング方法であって、以下のェ 程：
1)軽度低温、特に好ましくは 32°Cの培養温度で転写の亢進する遺伝子を提供し、
2)該遺伝子の転写開始点の 5'上流 1. 5キロベース力 第一ェキソンの範囲をクロ 一二ングし、
3)クロー-ングしたヌクレオチド配列を、適当なプロモーターとともに、レポーター遺 伝子を発現するベクターに組み込み、
4)該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
5)培養細胞を軽度低温および 37°Cでそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現さ せ、軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるポリヌクレオチドを得、
6)軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるポリヌクレオチドにつ ヽ て、ベクターに組み込むヌクレオチド配列を短くしていき、軽度低温においてレポ一 ター遺伝子の転写を促進させるに必要なヌクレオチド配列を同定する、 ことを含む方法に関する。
[0026] 32°Cの培養温度で転写の亢進する遺伝子は、哺乳動物細胞を 37°C及び軽度低 温、特に好ましくは 32°C、で培養し、それぞれから抽出した RNAに対して、 DNAチッ プ（マイクロアレー）、 cDNAサブトラクシヨン法など（例えば、 Moody, D.E. Genomic techniques:An overview of methods for the study of gene expression. J. Anim. Sci. 79(E. Suppl.):E128-E135, 2001を参照）を応用することで得ることができる。
使用するプロモーターとしては原核生物、真核生物、ウィルスのプロモーターを使 用できる。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウィルスプロモーターである。好 ましいプロモーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ (TK) ,サイトメガロウィルス (CMV)、 SV40のプロモーターを含む
[0027] レポーター遺伝子としては、検出が容易なタンパク質をコードしているものであり、 限定されるものではな 、がルシフェラーゼ、クロラムフエ-コールァセチルトランスフエ ラーゼ遺伝子を含む。ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターであ る。好ましいベクターの例は、限定されるものではないが pCMV (インビトロジェン社） 、 pCAT3プロモーターベクター（プロメガ社）、 pSV2—ネオベクターを含む。
使用する該ベクターで宿主細胞をトランスフエタトする。宿主細胞としては哺乳動物 細胞を用いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株 293、 293T , U - 2 OS, Huh - 7、 HeLa等、サル細胞株 COS— 7、 Vero等、マウス細胞株 NIH /3T3, Balb/3T3, B— 6, Hepal— 6、チャイニーズノヽムスター細胞株 CHO等であ る。トランスフエクシヨンの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、レトロ ウィルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液に D NA (ベクター）を含む塩ィ匕カルシウム溶液を攪拌しながら 1滴ずつ加える。 DNA—リ ン酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞にカ卩えると DNA—リン酸力 ルシゥムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、 DNAが細胞内に取り こまれることになる。
培地は特別のものを使用する必要はなぐ哺乳動物細胞培養用の培地を使用でき る。典型的な培地の例は、 10%ゥシ胎児血清 (FCS)添加のダルベッコ改変ィーグ ル培地（D— MEM) (インビトロジェン社）である。
軽度低温、好ましくは 32°Cでのレポーター遺伝子の発現量の、 37°Cでのレポータ 一遺伝子の発現量に対する比が 1以上であれば軽度低温において特異的に遺伝子 の転写を促進させるェンノヽンサ一であり得る。軽度低温にぉ 、て遺伝子の転写を促 進させるヌクレオチド配列について、組み込まれている配列を短くしていき、軽度低 温転写制御エレメントを得る。ェンノヽンサ一であることは該軽度低温転写制御エレメ ントの配列に相補的なヌクレオチド配列も、軽度低温にお!、て遺伝子の転写を促進 させることを確認すること〖こより確認できる。
[0028] 本発明は、軽度低温転写制御エレメントの改良方法であって、以下の工程：
1)軽度低温転写制御エレメントのうち 1又は 2塩基を他の塩基に置換した変異ヌクレ ォチドを合成し、
2)適当なプロモーターとともに、レポーター遺伝子を発現するベクターに組み込み、
3)該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
4)培養細胞を軽度低温および 37°Cでそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現さ せ、軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列を同 定する、
ことを含む方法にも関する。
[0029] 軽度低温転写制御エレメントのうち 1又は 2塩基を他の塩基に置換した変異ヌクレ ォチドを合成は前記のように行う。使用するプロモーターとしては原核生物、真核生 物、ウィルスのプロモーターを使用できる。好ましくは哺乳動物プロモーター、および ウィルスプロモーターである。好ましいプロモーターの例は、限定されるものではない がマウスチミジンキナーゼ（TK)、サイトメガロウィルス（CMV)、 SV40のプロモータ 一を含む。
レポーター遺伝子としては、検出が容易なタンパク質をコードしているものであり、 限定されるものではな 、がルシフェラーゼ、クロラムフエ-コールァセチルトランスフエ ラーゼ遺伝子を含む。ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターであ る。好ましいベクターの例は、限定されるものではないが pCMV (インビトロジェン社） 、 pCAT3プロモーターベクター（プロメガ社）、 pSV2—ネオベクターを含む。 使用する該ベクターで宿主細胞をトランスフエタトする。宿主細胞としては哺乳動物 細胞を用いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株 293、 293T , U-2 OS, Huh - 7、 HeLa等、サル細胞株 COS - 7、 Vero等、マウス細胞株 NIH Z3T3、 BalbZ3T3、 B— 6、 Hepal— 6、チャイニーズノヽムスター細胞株 CHO等であ る。トランスフエクシヨンの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、レトロ ウィルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液に D NA (ベクター）を含む塩ィ匕カルシウム溶液を攪拌しながら 1滴ずつ加える。 DNA—リ ン酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞にカ卩えると DNA—リン酸力 ルシゥムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、 DNAが細胞内に取り こまれることになる。
培地は特別のものを使用する必要はなぐ哺乳動物細胞培養用の培地を使用でき る。典型的な培地の例は、 10%ゥシ胎児血清 (FCS)添加のダルベッコ改変ィーグ ル培地（D— MEM) (インビトロジェン社）である。
軽度低温、好ましくは 32°Cでのレポーター遺伝子の発現量の、 37°Cでのレポータ 一遺伝子の発現量に対する比が 1以上であれば軽度低温において特異的に遺伝子 の転写を促進させるェンノヽンサ一であり得る。ェンノヽンサ一であることは該軽度低温 転写制御エレメントの配列に相補的なヌクレオチド配列も、軽度低温にお!、て遺伝子 の転写を促進させることを確認することにより確認できる。
[0030] 本発明はまた、コード配列の 5'側でプロモーターの 3'側に配置される、ヌクレオチ ド配列：
actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctc gcgtcaggga
cctgcccgac tcagcggctg cc (酉列备号 23)
を含む軽度低温翻訳制御エレメントに関する。
[0031] 使用するプロモーターとしては原核生物、真核生物、ウィルスのプロモーターを使 用できる。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウィルスプロモーターである。好 ましいプロモーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ (TK) ,サイトメガロウィルス (CMV)、 SV40のプロモーターを含む。 また、軽度低温転 写制御エレメントまたは軽度低温転写制御ェンノヽンサ一を軽度低温翻訳制御エレメ ントと同時に使用することもできる。
[0032] ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターである。好ましいベクター の例は、限定されるものではないが pcDNA3.1(+)ベクター（インビトロジェン社）、 pSV2-ネオベクターを含む。
[0033] 使用する該ベクターで宿主細胞をトランスフ タトする。宿主細胞としては哺乳動物 細胞を用いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株 293、 293T , U-2 OS, Huh - 7、 HeLa等、サル細胞株 COS— 7、 Vero等、マウス細胞株 NIH /3T3, Balb/3T3, B— 6, Hepal— 6、チャイニーズノヽムスター細胞株 CHO等であ る。トランスフエクシヨンの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、レトロ ウィルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液に D NA (ベクター）を含む塩ィ匕カルシウム溶液を攪拌しながら 1滴ずつ加える。 DNA—リ ン酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞にカ卩えると DNA—リン酸力 ルシゥムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、 DNAが細胞内に取り こまれることになる。
培地は特別のものを使用する必要はなぐ哺乳動物細胞培養用の培地を使用でき る。典型的な培地の例は、 10%ゥシ胎児血清 (FCS)添加のダルベッコ改変ィーグ ル培地（D— MEM) (インビトロジェン社）である。
実施例
[0034] 実施例 1
マウスの Cirpの転写開始点の actcgc—-の aを + 1として、 5，側に 970塩基 (一 970 )力も第 1ェクソン 56塩基（ + 56)までの Cirpゲノム遺伝子、およびその 5，側を欠失さ せた断片 (表 1)を pCAT3—ベーシックベクター（プロメガ社）のマルチクロー-ングサ イトに組み込んだ (図 1)。このベクターはレポータータンパク質としてクロラムフエニコ ールァセチルトランスフェラーゼ（CAT)遺伝子を有する。
次いで、これらのプラスミド各 2. 5—5. 0 gZ35mmディッシュを、 CDM8— LacZ ( j8—ガラクトシダーゼ発現ベクターであり、各トランスフエクシヨンの効率を補正するた めに使用した。 ATCC社） 0. 5— 1. 0 gZ35mmディッシュとともに、 37°Cで 1日培 養したヒト細胞株 293にコトランスフエクシヨンした。 トランスフエクシヨンした細胞を 2つに分け、 1方を 32°Cで、他方を 37°Cでそれぞれ 培養した。培地は 10%FCS添加 D— MEMである。
36時間後、遠心分離によって細胞を回収し、全細胞溶解液を作成した。それぞれ の温度で生成したクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ（CAT)タンパク質 の量を CAT ELISAキット（ロシュ'ダイァグノステック社)を用いて測定し、 β ガラク トシダーゼ (LacZ)活性を β ガラクトシダーゼアツセィキット（ストラタジーン社)を用 いて測定した。各断片の転写促進活性を表 1に示す。転写活性としては CATタンパ ク質量を β ガラクトシダーゼ活性で割った値を示した。
[0035] [表 1]
表 1
C i r わゲノム 5， 側の転写促進碰
Figure imgf000013_0001
24時間後のデータも同様の結果であった。
これらの結果から、ゲノム遺伝子の 220— 0に遺伝子転写の基本的プロモーター が存在し、— 340—— 220に 32°Cに応答して転写を促進するェンハンサ一が存在す る可能性が考えられる。
[0036] 実施例 2
実施例 1において、宿主細胞としてヒト 293細胞に代えて、ヒト細胞株 293T, U— 2 OS, Huh— 7、サル細胞株 COS— 7、マウス細胞株 NIHZ3T3, Balb/3T3, B— 6 , Hepal— 6を使用して同様の実験を行って同様の結果を得た。 [0037] 実施例 3
Cirpゲノム遺伝子—340 220の!ヽろ 、ろな欠失変異体を作製し、 pCAT3プロ モーターベクター（プロメガ社）のマルチクロー-ングサイトに組み込んだ（図 2)。この ベクターは SV40のプロモーターを有する。実施例 1と同様に、ヒト 293細胞を用いて 、リン酸カルシウム法を用いた DNAトランスフエクシヨンによる遺伝子導入後、 32°Cで の転写促進活性を調べた。陰性コントロールとしてなにも 、れて 、な 、PCAT3プロ モーターベクター（mOCk)を用いた。
36時間でのデータを示す。転写活性としては CATタンパク質量を /3 ガラクトシダ ーゼ活性で割った値を示した (表 2)。
[0038] [表 2] 表 2
C i r Pゲノム 5 ' 個 1断片の転写促進活性
Figure imgf000014_0001
この結果より、ゲノム遺伝子— 310—— 290および 260—— 220の 2箇所に 32°Cに 応答して転写を促進するェンハンサ一が存在することが考えられる。この 2箇所の塩 基配列を比較することにより tccccgcc (配列番号 2)という共通する塩基配列を見出し た。
[0039] 実施例 4
上で見出した tccccgccを含む 10塩基を直列に 3個つな 、で連続させたもの（ ttccccgccgttccccgccgttccccgccg) (配列番号 3)を実施例 3と同様に pCAT3プロモー ターベクター（プロメガ社)のマルチクロー-ングサイトに組み込んだ。陰性コントロー ルとしてなにも 、れて 、な 、pCAT3プロモーターベクター（mock)を、陽性コント口 ールとしては Cirpゲノム—340 220を組み込んだもの、および SV40ェンハンサ 一を組み込んだものを用いた。 293細胞にトランスフエクシヨン 24時間後の結果を表 3に示す。
[表 3] 表 3
Figure imgf000015_0001
実施例 5
[0041] さらに、ェンハンサーであれば反対向きでも有効であるはずなので、 5， - tccccgcc-3 ，を含む 10塩基を反対向き（つまり 5，- cggCggggaa-3，）（配列番号 4)に 3個連結させ た配歹 U (cggcggggaacggcggggaacggcggggaa) (目 ti歹 [J番号 5)を pCAT3プロモーターべ クタ一のマルチクロー-ングサイトに組み込んで実施例 4と同様の実験を行った。 この場合も 32。C/37。Cの比の値は 3. 83であり軽度低温転写制御のェンハンサ 一であることが確認された。
[0042] 実施例 6
マウス Cirpゲノムで見出した 8塩基 tccccgcc (配列番号 2)のみを 2個連結させたも の（tccccgcctccccgcc) (配列番号 6)を pCAT3プロモーターベクターのマルチクロー ユングサイトに組み込んで実施例 4と同様の実験をおこなった。
この場合も 32。CZ37。Cの比の値は 2. 51であり軽度低温転写制御のェンハンサ 一であることが確認された。
[0043] 実施例 7
ヒト RBM3ゲノム（GenBank NT_011568)の転写開始点の約 260塩基、 5 '上流に存 在する 8塩基 ggggggga (配列番号 7)のみを 3個連結させたもの（ gggggggagggggggaggggggga) (配歹 [J番号 8)を pCAT3プロモーターベクターのマノレチ クロー-ングサイトに組み込んで実施例 4と同様の実験をおこなった。
この場合も 32°CZ37°Cの比の値は 2. 52であり軽度低温転写制御のェンハンサ 一であることが確認された。
[0044] 実施例 8
上で見出した配列 tccccgcc (配列番号 2)の 1または 2塩基を変異させた変異体（ 下表）を含む 10塩基を直列に 3個つないで連続させたものを実施例 4と同様のベクタ 一に糸且み込み、 293T細胞にトランスフエクシヨンした。 24時間後に CATZLacZを 測定して、コントロールとしてなにも 、れて 、な 、pCAT3プロモーターベクターを用 いときの 32°CZ37°Cの比を 1として、それぞれの変異体の低温転写促進 (ェンハサ 一)活性を下表に示す。
[0045] [表 4] 表 4
1変異体の^:温 写促進 (ェンハンサ一)活性
エレメント 配列 , ェンハン ·
*^j ί一 tccccgcc (配列番号 2 ) 3. 89 変異体 1 g Gccccgcc (配列番号 9 ) 3, 60 変異体: Accccgcc (配列番号 1 0) 3. 74 変異体 7t tccccgTc (配列番号: 1 1 ) 3. 63 変異体 8t tccccgci (配列番号 1 2 ) 4. 08 変異体 6a tccccAcc (配列番母 1 3) 2, 14 変異体 6c tccccCcc (配列番号 1 4) 2. 27 コント ール 1. 00
[0046] [表 5] 表 5
2変異体の低温 fe写促進 (ェンハンサー)碰
エレメント 列 ェンハンサー
tccccgcc (配列番号 2 ) 3. 89 変異体 12 GAcccgcc (配列番号 1 5 ) 1. 76 変異体 3 tMccgcc (配列番号 1 6 ) 1. 07 変異体 34 tcAAcgcc (配列番号 1 7) 1. 47 変異体 45 tccAAgcc (關番号 1 8 ) 0. 35 変異体 56 tcccATcc (画番号 1 9 ) 1. 07 変異体 67 tccccTAc (配列番号 2 0 ) 1. 66 変異体 78 tccccgAA (ga列番号 2 1 ) 3. 69 コント口一ノレ 1. 00
[0047] 1番目の塩基の Gまたは Aへの変異、 7番目の塩基の Tへの変異、 8番目の塩基の Tへの変異は野生型と同様の低温転写促進活性を示す。 6番目の塩基の Aまたは C への変異で低温転写促進活性は野生型に比べ低下するものの、有意な活性が認め られる。変異体 78にみられるように、 7番目 8番目の 2塩基の AAへの変異は、野生型 と同程度の低温転写促進活性を示す。
よって tccccgccが低温転写促進活性を示す配列であるが、
t (又は g, a) ccccg ( i3~ , cノ c (^ よ a, ！；ノ c、^ a, t)
でも良いことがわ力る。
また、ェンハンサーであること力 これらの相補的な配列（例えば tccccgcc (配列番 号 2)に対する相補的な配列は ggcgggga (配列番号 22) )を用いても良!、。
[0048] 実飾 19
サイトメガロウィルス (CMV)プロモーターを持つ pcDNA3. 1 (+ )ベクター（インビ トロジェン社）（図 3)のマルチクロー-ングサイト（EcoRVと Xbalの間）に、 pGL3— ba sicプラズミド（プロメガ社)カゝら切り出したホタルルシフェラーゼ cDNAを組み込んだ。 次いで、マウス Cirp転写産物（mRNA)の act——の aを 1として、 3 '側に 82塩基： actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctc gcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc (酉己列番号 23)
を pcDNA3. 1 (+ ) (インビトロジェン社）のマルチクロー-ングサイト（Kpnlと BamH Iの間）に組み込んだ。コントロールは Kpnlと BamHIの間に何も組み込んでいない ブラズミドである。
次いで、これらのプラスミド各 2. 5—5. 0 gZ35mmディッシュを、 pRLTKプラズ ミド (renilaルシフェラーゼ発現べクタ一であり、各トランスフエクシヨンの効率を補正 するために使用した。プロメガ社) 0. 5— 1. 0 g/35mmディッシュとともに、 37°C で 1日培養したヒト細胞株 293Tにコトランスフエクシヨンした。
トランスフエクシヨンした細胞を 2つに分け、 1方を 32°Cで、他方を 37°Cでそれぞれ 培養した。培地は 10%FCS + D— MEMである。
36時間後、遠心分離によって細胞を回収し、全細胞溶解液を作成した。それぞれ の温度で生成したホタルと renilaのルシフェラーゼ活性を、 Dua卜 Lucifer as e Reporter Assayキット (プロメガ社)を用いて測定した。各断片の翻訳促進活性を表 6に示す。 翻訳活性としてはホタルルシフェラーゼ活性を renilaルシフェラーゼ活性で割った値 を示した。
[0049] [表 6]
C i r p mRNAの 5 ' 非翩訳領域 (UT R) の翻訳促進活性
Figure imgf000018_0001
この結果、 32°Cでのタンパク貧産生量は、 Cirp mRNAの 5 ' UTRが付いた場合 は付 ヽて ヽな 、場合の 1. 7倍に増加し、 Cirp mRNAの 5， UTRが付!ヽて ヽな!、通 常のプラズミドをトランスフエクシヨンして 37°Cで培養した場合と同等の目的タンパク 質産生が得られることがわ力つた。
産業上の利用可能性
[0050] 本発明はタンパク質の生産に広く用いることができる

Claims

請求の範囲
[I] ヌクレオチド配列：
X CCCCX X X
1 6 7 8
(式中、 Xは、 t、 g、または aを表し、 Xは、 g、 a,または cを表し、 Xは、 c
7 、 a,または t
1 6
を表し、 Xは、 c、 a,または tを表す）
8
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む軽度低温転写制御エレメント。
[2] ヌクレオチド配列が tccccgcc (配列番号 2)である請求項 1に記載の軽度低温転 写制御エレメント。
[3] ヌクレオチド配列が gccccgcc (配列番号 9)である請求項 1に記載の軽度低温転写 制御エレメント。
[4] ヌクレオチド配列が accccgcc (配列番号 10)である請求項 1に記載の軽度低温転 写制御エレメント。
[5] ヌクレオチド配列が tccccgtc (配列番号 11)である請求項 1に記載の軽度低温転 写制御エレメント。
[6] ヌクレオチド配列が tccccgct (配列番号 12)である請求項 1に記載の軽度低温転 写制御エレメント。
[7] ヌクレオチド配列が tccccgaa (配列番号 21)である請求の範囲第 1項に記載の、軽 度低温転写制御エレメント。
[8] ヌクレオチド配列が ggcgggga (配列番号 22)である請求項 1に記載の軽度低温転 写制御エレメント。
[9] ヌクレオチド配列が ggggggga (配列番号 7)である請求項 1に記載の、軽度低温転 写制御エレメント。
[10] 同一または異なる、請求項 1に記載の軽度低温転写制御エレメントが連結されてい る軽度低温転写制御ェンハンサー。
[I I] 同一または異なる、請求項 1に記載の軽度低温転写制御エレメントが他のヌクレオ チド残基を介して結合されている軽度低温転写制御ェンノ、ンサ一。
[12] 請求項 1一 9のいずれかに記載の軽度低温転写制御エレメントまたは請求項 10ま たは 11に記載の軽度低温転写制御ェンノ、ンサ一を含むベクター。
[13] 請求項 12に記載のベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
[14] 軽度低温転写制御エレメントをスクリーニングする方法であって、
1)軽度低温、好ましくは 32°Cの培養温度で転写の亢進する遺伝子を提供し、
2)該遺伝子の転写開始点の 5'上流 1. 5キロベース力 第一ェキソンの範囲をクロ 一二ングし、
3)クロー-ングしたヌクレオチド配列を、適当なプロモーターとともに、レポーター遺 伝子を発現するベクターに組み込み、
4)該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
5)培養細胞を軽度低温および 37°Cでそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現さ せ、軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列を得、
6)軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列つ！/、て 、ベクターに組み込むヌクレオチド配列を短くしていき、軽度低温においてレポータ 一遺伝子の転写を促進させるに必要なヌクレオチド配列を同定する、
ことを含む方法。
[15] 軽度低温転写制御エレメントの改良方法であって、以下の工程：
1)軽度低温転写制御エレメントのうち 1又は 2塩基を他の塩基に置換した変異ヌクレ ォチドを合成し、
2)適当なプロモーターとともに、レポーター遺伝子を発現するベクターに組み込み、
3)該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換し、
4)培養細胞を軽度低温および 37°Cでそれぞれ培養し、レポーター遺伝子を発現さ せ、軽度低温にぉ 、てレポーター遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列を同 定する、
ことを含む方法
[16] コード配列の 5'側でプロモーターの 3'側に配置される、ヌクレオチド配列：
actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctc gcgtcaggga
cctgcccgac tcagcggctg cc (酉列备号 23)
を含む軽度低温翻訳制御エレメント。
[17] 請求項 15に記載の軽度低温翻訳制御エレメントを含むベクター。 [18] 請求項 16に記載のベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
PCT/JP2005/003385 2004-03-23 2005-03-01 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列 WO2005090562A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT05719702T ATE508189T1 (de) 2004-03-23 2005-03-01 Zur beschleunigung der genexpressionbei einer mässig niedrigen temperatur fähige sequenz
EP05719702A EP1728859B1 (en) 2004-03-23 2005-03-01 Sequence capable of accelerating gene expression at moderately low temperature
CA002558269A CA2558269A1 (en) 2004-03-23 2005-03-01 Sequence capable of accelerating gene expression at moderately low temperature
DE602005027824T DE602005027824D1 (de) 2004-03-23 2005-03-01 Zur beschleunigung der genexpressionbei einer mässig niedrigen temperatur fähige sequenz
AU2005224486A AU2005224486B2 (en) 2004-03-23 2005-03-01 Sequence capable of accelerating gene expression at moderately low temperature
US10/592,520 US20080038721A1 (en) 2004-03-23 2005-03-01 Sequence Capable Of Accelerating Gene Expression At Moderately Low Temperature
JP2006511142A JP4613160B2 (ja) 2004-03-23 2005-03-01 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-084987 2004-03-23
JP2004084987 2004-03-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005090562A1 true WO2005090562A1 (ja) 2005-09-29

Family

ID=34993700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/003385 WO2005090562A1 (ja) 2004-03-23 2005-03-01 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20080038721A1 (ja)
EP (1) EP1728859B1 (ja)
JP (1) JP4613160B2 (ja)
KR (1) KR20060135830A (ja)
CN (2) CN1938424A (ja)
AT (1) ATE508189T1 (ja)
AU (1) AU2005224486B2 (ja)
CA (1) CA2558269A1 (ja)
DE (1) DE602005027824D1 (ja)
WO (1) WO2005090562A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007029641A1 (ja) * 2005-09-05 2007-03-15 Jun Fujita 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列
CN101870973A (zh) * 2010-06-04 2010-10-27 浙江省农业科学院 提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109734793B (zh) * 2019-03-14 2022-12-02 深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心） 一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用
CN113073097B (zh) * 2020-01-03 2023-08-04 珠海联邦制药股份有限公司 一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子及其应用
CN113969280B (zh) * 2020-07-22 2023-08-29 珠海联邦制药股份有限公司 一种cho细胞内源性冷诱导rna-结合蛋白启动子核心序列及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002016655A2 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 The Scripps Research Institute Stress-regulated genes of plants, transgenic plants containing same, and methods of use

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5846719A (en) * 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5986084A (en) * 1997-08-18 1999-11-16 Pitsch; Stefan Ribonucleoside-derivative and method for preparing the same
AUPS204502A0 (en) * 2002-05-01 2002-06-06 Nucleics Pty Ltd A method for increasing the affinity of an oligonucleotide for a target nucleic acid
EP1710249A4 (en) * 2004-01-27 2008-02-20 Nippon Shinyaku Co Ltd RIBONUCLEIC ACID COMPOUND AND METHOD FOR LIQUID PHASE SYNTHESIS OF OLIGONUCLEIC ACID COMPOUND

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002016655A2 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 The Scripps Research Institute Stress-regulated genes of plants, transgenic plants containing same, and methods of use

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAI Q. ET AL: "An unusual group 2 LEA gene family in citrus responsive to low temperature.", PLANT MOL BIOL., vol. 29, no. 1, 1995, pages 11 - 23, XP002993546 *
JARILLO J.A. ET AL: "Two related low-temperature-inducible genes of Arabidopsis encode proteins showing high homology to 14-3-3 proteins, a family of putative kinase regulators.", PLANT MOL BIOL., vol. 25, no. 4, 1994, pages 693 - 704, XP002993547 *
NISHIYAMA H. ET AL: "A glycine-rich RNA binding protein mediating cold-inducible suppression of mammalian cell growth.", J CELL BIOL., vol. 137, no. 4, 1997, pages 899 - 908, XP002993548 *
NISHIYAMA H. ET AL: "Cloning and characterization of human CIRP (cold-inductible RNA binding protein) cDNA and chromosomal assignment of the gene.", GENE., vol. 204, no. 1-2, 1997, pages 115 - 120, XP004100701 *
YIN X. ET AL: "Isolating the promoter of a stress-induced gene encoding betaine aldehyde dehydrogenase from the halophyte Atriplex centralasiatica Iljin.", BIOCHIM BIOPHYS ACTA., vol. 1577, no. 3, 2002, pages 452 - 456, XP004383776 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007029641A1 (ja) * 2005-09-05 2007-03-15 Jun Fujita 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列
JPWO2007029641A1 (ja) * 2005-09-05 2009-03-19 藤田　潤 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列
CN101870973A (zh) * 2010-06-04 2010-10-27 浙江省农业科学院 提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列
CN101870973B (zh) * 2010-06-04 2012-02-15 浙江省农业科学院 提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列

Also Published As

Publication number Publication date
CN101857864A (zh) 2010-10-13
EP1728859B1 (en) 2011-05-04
AU2005224486A1 (en) 2005-09-29
DE602005027824D1 (de) 2011-06-16
KR20060135830A (ko) 2006-12-29
CA2558269A1 (en) 2005-09-29
US20080038721A1 (en) 2008-02-14
JPWO2005090562A1 (ja) 2008-05-08
AU2005224486B2 (en) 2008-12-04
EP1728859A4 (en) 2007-12-05
JP4613160B2 (ja) 2011-01-12
CN1938424A (zh) 2007-03-28
EP1728859A1 (en) 2006-12-06
ATE508189T1 (de) 2011-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10760064B2 (en) RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
Balasubramanian et al. Rapid recombinant protein production from piggyBac transposon-mediated stable CHO cell pools
WO2019120193A1 (zh) 拆分型单碱基基因编辑系统及其应用
WO2005090562A1 (ja) 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列
US9260721B2 (en) Expression vector and methods of producing high levels of proteins
JP6960409B2 (ja) プロモーター
Fliedl et al. Optimization of a quantitative PCR based method for plasmid copy number determination in human cell lines
US20210002646A1 (en) Dnmt3b gene-deficient cho cell line, preparation and applications thereof and recombinant protein expression system using the same
WO2015182941A9 (ko) 신규 카탈라아제 신호서열 및 이를 이용한 카탈라아제 발현방법
JP2022528252A (ja) 環状ｒｎａを使用したタンパク質翻訳およびその応用
EP2665821A1 (en) S/mar containing expression vectors, cell and cell lines as well as methods using the same
CN116083400B (zh) Cas蛋白截短体、构建其的方法及其应用
Usategui-Martín et al. Analysis of Lymphotoxin Alpha Expression in Human Retina and Generation of Expression Vectors to Functional Characterization of Polymorphisms in the Tumor Necrosis Factor Locus
WO2023173105A2 (en) Tetracycline inducer/repressor system and simplified viral particle production
WO2021137742A1 (ru) Генотерапевтический днк-вектор
JPWO2007029641A1 (ja) 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列
WO2023060589A1 (zh) 多转座子系统
Wang et al. Sus scrofa matrix attachment region enhances expression of the PiggyBac system transfected into HEK293T cells
CN118086302A (zh) 一种日本鳗鲡IFNc1基因启动子及其应用
CN112301054A (zh) 利用k1e噬菌体rna聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞表达病毒蛋白的方法
CN118147143A (zh) 一种日本鳗鲡IFNe基因启动子及其应用
Thomson et al. PCR-based plasmid vector construction for generation of recombinant viruses

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005224486

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2558269

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006511142

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10592520

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2005224486

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20050301

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005224486

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3455/CHENP/2006

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020067019645

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580009572.5

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005719702

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005719702

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020067019645

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10592520

Country of ref document: US

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)