CN118086302A - 一种日本鳗鲡IFNc1基因启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及日本鳗鲡IFNc1基因启动子及其应用。本发明日本鳗鲡IFNc1基因启动子具有较强的启动子活性，可为研究鱼类IFNc1基因的表达调控机制的研究提供良好的实验系统，同时也可以利用该启动子构建表达载体后高效表达外源基因或用于免疫增强剂或抗病药物的筛选，具有重要的理论和实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种日本鳗鲡IFNc1基因启动子及其应用。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)属于II类细胞因子家族成员，是宿主抗病毒免疫应答反应中至关重要的细胞因子。虽然IFN本身不具备杀伤病毒的能力，但是与对应的受体结合后，再通过JAK-STAT信号转导途径触发信号，诱导其他抗病毒蛋白的表达，从而帮助宿主抵御病毒入侵。在硬骨鱼类中，I型IFN具有8种亚型：IFNa、IFNb、IFNc、IFNd、IFNe、IFNf和IFNi。根据半胱氨酸的数量和受体的配对情况，硬骨鱼类I型IFN又被分为了两组：I组I型IFN(IFNa、IFNd、IFNe和IFNh)和Ⅱ组I型IFN(IFNb、IFNc、IFNf和IFNi)。
基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要元件。鉴于鱼类I型IFNs在抗病毒免疫及病毒病防治中的重要性，研究其基因表达调控机制将为通过调节IFN的表达来防治鱼类病毒病提供新的思路。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种日本鳗鲡IFNc1基因启动子及其应用，解决了上述背景技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了日本鳗鲡IFNc1基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1
CTTACAACTTAAACTTCCCTCAATTAAATAAATTGTTTTCCTTTCATTTTAATGAACTTGTTTTGTATTATTTTTACGGTGCACGGTTGACTGCATAGCGGAAAAAGTCTGCTCCTAAAAATAAAATTTTAGGAGTGGCAGAAAATTTTGAAATTGTCTCTCATTTTTGCAAAAGTAGAATCAGAATTTAAGCAACTCATAACGACATAGAAAAAAGATGTATACAAGAAGCTAAGTATGTGGGTATGTAATTTAGTTTGTGAAGTTTCATTAATATGAACAGTTCACAGGTGAAAAATGACACGTCACAATATTTCACTTGCCAATTCACGTGAAATTTCATTGATAAGCGTGAACTCGCGAAGCTGTAGAATACGATGGCCATTTGATTTCAAATTCAGAGAATATTGGGGTAAACAGTAGTGAACTCGTGTGGACTGCCCGTTGTAATACCGTTAGAGTATCAATAAAATTATCATTATCACATAATTGCAAATTAATACATTTCGAGAGACTTTTCGAGAGACATTTAAAATCGTGTGATTAAGTTCCAAGTCGGTACATTCAAGTTTAAGACCGATTCATAGGCTCTTTTAAAAGTCGATTTTTCAAGATCGATGTCAGAAATACGTGCTTGTATCGTACGTGCATTTAGGCTTACATAGTTACAATTAACAATGACAAAAGAAATGAACACCCTCGTTCGAGATGATTCCTCTTATTGCACGAGACCAACAGCTCAAATTAACACGTCTGTACCATGGCGAACTCGAACGTCCACCTCTCCACAACTAATAAGCTACATTACGGAAGTAAGATAACCACAAGGGCTCAAAATTAACGCTGTCCCTCACATGCTAAGGAAGCAGTAGCGCAAAACAATAAAAGAAAAAAATAAAATAAATAATAAAATAAATAAATCAAATTAAAAAAACGCGATTTTTACAAAAGACATTAAAACACGGCAACACATTACAACACGTCACTGGCATTTCCAGAACATGTACCTTACGAATCCAGAGTTTGGTCGTCAAAAATTTAAGTCAAGTAAGCCCCACATAACTTAATGTGTTTGATATTTCCAGTTTCAGTTTCGATTTCCCTTTTGGATTCCAGTTTATAAATTCTACAATCCAGACATGGAGGGGAATATAGACAGCATAAAGGGTAATAAAGGTGGCCGCATTCTGAATGAAAAAGCAGACTGTGCTTAACCCTCCCT
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了含有上述启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
优选地，所述表达盒由上述的启动子、由上述启动子启动转录的目的基因和终止子组成。
优选地，所述重组载体为pGL3-basic、pGL2-Basic、pGL4.10、pGLuc。
优选地，所述重组菌为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、酵母菌。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供了上述日本鳗鲡IFNc1基因启动子在构建真核表达载体、鱼类细胞或哺乳动物细胞中高效表达外源基因中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：提供了上述日本鳗鲡IFNc1基因启动子在免疫增强剂或抗病药物筛选中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：
经转录因子结合位点在线预测软件对本发明日本鳗鲡IFNc1基因启动子序列进行潜在的转录因子结合位点预测，分析表明该IFNc1基因启动子存在多个转录因子结合位点，如MAF、TBP等，具有复杂的表达调控机制。经报告基因检测实验证明了该日本鳗鲡IFNc1基因启动子具有较强的启动子活性。因此，日本鳗鲡IFNc1基因启动子的克隆及其强启动子活性的诱导表达分析，为研究鱼类IFNc1基因的表达调控机制的研究提供良好的实验系统；同时也可以利用该启动子构建表达载体后高效表达外源基因或用于免疫增强剂或抗病药物的筛选，具有重要的理论和实际意义。
附图说明
图1为日本鳗鲡IFNc1基因转录因子结合位点示意图1。
图2为日本鳗鲡IFNc1基因转录因子结合位点示意图2。
图3为日本鳗鲡IFNc1基因转录因子结合位点示意图3。
图4为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析日本鳗鲡IFNc1基因启动子的活性图。其中，横坐标表示pGL-3为空载体pGL-3Basic转染EPC细胞的相对萤光素酶活性(作为对照)；AjIFNc1-pro表示重组质粒pGL-3-AjIFNc1pro转染EPC细胞的相对萤光素酶活性；*表示显著性差异P<0.05。
图5为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析日本鳗鲡IFNc1基因启动子在polyI:C刺激下的活性图。其中，横坐标control表示没有poly I:C刺激时重组质粒pGL-3-AjIFNc1pro转染EPC细胞的相对萤光素酶活性(作为对照)；poly I:C表示在poly I:C刺激后重组质粒pGL-3-AjIFNc1pro转染EPC细胞的相对萤光素酶活性；*表示显著性差异P<0.05。
图6为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析日本鳗鲡干扰素调节因子IRF1、IRF7和IRF11对日本鳗鲡IFNc1基因启动子的诱导作用图。其中，横坐标Flag表示空载体p3×FLAG-CMV-14与重组载体pGL-3-AjIFNc1pro共转染EPC细胞的相对萤光素酶活性(作为对照)；IRF1表示重组载体p3×FLAG-CMV-14-AjIRF1与重组载体pGL-3-AjIFNc1pro共转染EPC细胞的相对萤光素酶活性；IRF7表示重组载体p3×FLAG-CMV-14-AjIRF7与重组载体pGL-3-AjIFNc1pro共转染EPC细胞的相对萤光素酶活性；IRF11表示重组载体p3×FLAG-CMV-14-AjIRF11与重组载体pGL-3-AjIFNc1pro共转染EPC细胞的相对萤光素酶活性；*表示显著性差异P<0.05，**表示显著性差异P<0.01。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1日本鳗鲡IFNc1基因启动子的克隆
以日本鳗鲡基因组为模板，以AjIFNc1pro-F：CTTACAACTTAAACTTCCCTC(如SEQ IDNO：2所示)和AjIFNc1pro-R：AGGGAGGGTTAAGCACAGTC(如SEQ ID NO：3所示)为引物，采用TaKaRa ExTaq酶，PCR扩增得到日本鳗鲡IFNc1基因启动子序列(如SEQ ID NO：1所示)，PCR反应体系如下：
| 10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus) | 5μL |
| dNTP Mixture | 4μL |
| AjIFNc1pro-F(10mM) | 2μL |
| AjIFNc1pro-R(10mM) | 2μL |
| 日本鳗鲡基因组(100ng/μL) | 2μL |
| TaKaRa Ex Taq(5U/μL) | 0.25μL |
| ddH2O | 34.75μL |
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切割回收清晰的电泳条带，用SteadyPureDNA凝胶回收试剂盒(Accurate Biology)纯化。将回收产物构建进入pMD19-T(TaKaRa)载体中，命名为pMD19-T-AjIFNc1pro，并进行测序验证。
SEQ ID NO：1
CTTACAACTTAAACTTCCCTCAATTAAATAAATTGTTTTCCTTTCATTTTAATGAACTTGTTTTGTATTATTTTTACGGTGCACGGTTGACTGCATAGCGGAAAAAGTCTGCTCCTAAAAATAAAATTTTAGGAGTGGCAGAAAATTTTGAAATTGTCTCTCATTTTTGCAAAAGTAGAATCAGAATTTAAGCAACTCATAACGACATAGAAAAAAGATGTATACAAGAAGCTAAGTATGTGGGTATGTAATTTAGTTTGTGAAGTTTCATTAATATGAACAGTTCACAGGTGAAAAATGACACGTCACAATATTTCACTTGCCAATTCACGTGAAATTTCATTGATAAGCGTGAACTCGCGAAGCTGTAGAATACGATGGCCATTTGATTTCAAATTCAGAGAATATTGGGGTAAACAGTAGTGAACTCGTGTGGACTGCCCGTTGTAATACCGTTAGAGTATCAATAAAATTATCATTATCACATAATTGCAAATTAATACATTTCGAGAGACTTTTCGAGAGACATTTAAAATCGTGTGATTAAGTTCCAAGTCGGTACATTCAAGTTTAAGACCGATTCATAGGCTCTTTTAAAAGTCGATTTTTCAAGATCGATGTCAGAAATACGTGCTTGTATCGTACGTGCATTTAGGCTTACATAGTTACAATTAACAATGACAAAAGAAATGAACACCCTCGTTCGAGATGATTCCTCTTATTGCACGAGACCAACAGCTCAAATTAACACGTCTGTACCATGGCGAACTCGAACGTCCACCTCTCCACAACTAATAAGCTACATTACGGAAGTAAGATAACCACAAGGGCTCAAAATTAACGCTGTCCCTCACATGCTAAGGAAGCAGTAGCGCAAAACAATAAAAGAAAAAAATAAAATAAATAATAAAATAAATAAATCAAATTAAAAAAACGCGATTTTTACAAAAGACATTAAAACACGGCAACACATTACAACACGTCACTGGCATTTCCAGAACATGTACCTTACGAATCCAGAGTTTGGTCGTCAAAAATTTAAGTCAAGTAAGCCCCACATAACTTAATGTGTTTGATATTTCCAGTTTCAGTTTCGATTTCCCTTTTGGATTCCAGTTTATAAATTCTACAATCCAGACATGGAGGGGAATATAGACAGCATAAAGGGTAATAAAGGTGGCCGCATTCTGAATGAAAAAGCAGACTGTGCTTAACCCTCCCT
实施例2日本鳗鲡IFNc1基因启动子序列的转录因子结合位点分析
上网登录基因5′侧翼区转录因子结合位点在线预测软件Alibaba2(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)
将已经克隆测试验证获得的IFNc1基因启动子序列复制后以fasta格式粘贴在对话框内，点击START进行转录因子结合位点的预测分析。结果如图1～图3所示。
实施例3日本鳗鲡IFNc1基因启动子的活性分析
一、含日本鳗鲡IFNe基因启动子的双荧光素酶报告质粒的构建
1.将PGL-3Basic载体进行NheⅠ/HindⅢ双酶切，酶切体系为：
| 10×QuickCut Buffer | 2μL |
| NheⅠ | 1μL |
| HindⅢ | 1μL |
| pGL-3Basic | 1μg |
| ddH2O | 补至20μL |
37℃水浴酶切30min。
2.以pMD19-T-AjIFNc1pro重组质粒为模板，以AjIFNc1pro-pGL-F：CTCTTACGCGTGCTAGCCTTACAACTTAAACTTCCCTC(如SEQ ID NO：4所示)和AjIFNc1pro-pGL-R：CCGGAATGCCAAGCTTAGGGAGGGTTAAGCACAGTC(如SEQ ID NO：5所示)为引物采用TaKaRa ExTaq酶，PCR扩增得到带有pGL-3载体的同源互补序列的日本鳗鲡IFNc1基因启动子序列，PCR反应体系如下：
| 10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus) | 5μL |
| dNTP Mixture | 4μL |
| AjIFNc1pro-F(10mM) | 2μL |
| AjIFNc1pro-R(10mM) | 2μL |
| pMD19-T-AjIFNepro(100ng/μL) | 1μL |
| TaKaRa Ex Taq(5U/μL) | 0.25μL |
| ddH2O | 35.75μL |
3.用SteadyPureDNA凝胶回收试剂盒(Accurate Biology)分别回收经过NheⅠ/HindⅢ双酶切的PGL-3Basic载体和PCR扩增得到带有pGL-3Basic载体的同源互补序列的日本鳗鲡IFNc1基因启动子序列，利用OK clon DNA连接试剂盒(Accurate Biology)连接经双酶切的PGL-3Basic载体和PCR回收产物，连接体系如下：
| 5×OK Clon Master Mix | 2μL |
| 双酶切后的PGL-3Basic | 100ng |
| PCR产物 | 50ng |
| ddH2O | 补充至10μL |
50℃连接10min。
4.将连接产物转化进大肠杆菌DH5α感受态中，经PCR检测阳性克隆后测序验证，序列正确的为重组质粒pGL-3-AjIFNc1pro。
5.将上述经过测序鉴定的含有重组载体PGL-3-AjIFNc1pro的大肠杆菌DH5α细胞扩大培养，抽提质粒，检测质粒浓度与纯度备用。
二、利用双荧光素酶报告基因检测系统分析日本鳗鲡IFNc1基因启动子的基础活性
1.EPC细胞培养在含10％FBS(Gibco)，2％AP-PS(Hyclone)的MEM(Hyclone)培养基中。取生长状态良好的EPC细胞接种至24孔板中，每孔1×106个细胞，28℃培养过夜。
2.使用Opti-MEMTM(Gibco)培养基稀释LipofectamineTM3000试剂(Invitrogen)，充分混匀；使用Opti-MEMTM稀释DNA，制备DNA预混液，然后加入P3000TM试剂，充分混匀；室温孵育15min后，加入细胞中。每孔所转染质粒包括0.02μg pRL-TK质粒以及0.2μg pGL-3-AjIFNc1pro重组质粒或pGL-3Basic空载体，转染6小时后更换培养基，继续培养18小时。
3.荧光素酶活性的检测参考Reporter Assay System(Promega)说明书，具体操作如下：
在24孔板中，吸出细胞培养基，加入500μL PBS漂洗一次，吸净PBS；每孔加入80μL1×PLB裂解液，室温震荡10min，吸取20μL裂解液上清加入到1.5mL EP管中，加入100μL荧光素酶检测试剂LAR II，混合均匀后，用Junior LB9509管式发光检测仪(Berthold)检测萤火虫荧光素酶的值，取出1.5mL EP管，迅速加入100μL Stop&试剂，混合均匀，用仪器检测海参荧光素酶的值。每孔的相对荧光素酶活性用(萤火虫荧光素酶的值)/(海参荧光素酶的值)表示。
4.以转染空载体pGL-3Basic的EPC细胞为对照，计算出该启动子的相对活性，结果见图4。由图4可以看出，重组质粒pGL-3-AjIFNc1pro转染EPC细胞的相对萤光素酶活性为空载体pGL-3Basic转染EPC细胞的2.49倍，说明了日本鳗鲡IFNc1基因启动子可以较好地启动萤光素酶基因的转录。
三、免疫刺激实验
免疫刺激实验共实施以下两个方案：
①将重组质粒pGL-3-AjIFNc1pro与pRL-TK质粒共转染进EPC细胞，24小时后转染1μg/mL poly I:C(Sigma)，继续培养24小时后收集细胞。
②将日本鳗鲡干扰素调节因子IRF1、IRF7和IRF11真核表达重组载体p3×FLAG-CMV-14-AjIRF1、p3×FLAG-CMV-14-AjIRF7和p3×FLAG-CMV-14-AjIRF11分别与pGL3-AjIFNc1pro及pRL-TK共转染进EPC细胞，培养24小时后收集细胞。
在poly I:C刺激条件下日本鳗鲡干扰素IFNc1基因启动子的活性变化见图5。由图5可以看出，poly I:C刺激后，重组质粒pGL-3-AjIFNc1pro转染EPC细胞的相对萤光素酶活性为未刺激时的4.97倍，说明poly I:C刺激能诱导日本鳗鲡IFNc1基因启动子活性的增强，日本鳗鲡IFNc1基因启动子能够被poly I:C诱导激活。
日本鳗鲡干扰素调节因子IRF1、IRF7和IRF11分别与重组质粒pGL3-AjIFNc1pro共转染EPC细胞中，日本鳗鲡IFNc1基因启动子的活性变化见图6。由图6可以看出，p3×FLAG-CMV-14-AjIRF1、p3×FLAG-CMV-14-AjIRF7和p3×FLAG-CMV-14-AjIRF11分别共转染EPC细胞中的相对荧光素酶活性显著高于空载体p3×FLAG-CMV-14与重组载体pGL-3-AjIFNc1pro共转染EPC细胞中的相对荧光素酶活性，分别为对照组的12.81、2.92和7.46倍，说明日本鳗鲡干扰素调节因子IRF1、IRF7和IRF11可以诱导激活日本鳗鲡IFNc1基因启动子。
综上，本发明日本鳗鲡IFNc1基因启动子具有较强的启动子活性，存在多个转录因子结合位点，如MAF、TBP等，具有复杂的表达调控机制，能够为研究鱼类IFNc1基因的表达调控机制的研究提供良好的实验系统；同时也可以利用该启动子构建表达载体后高效表达外源基因或用于免疫增强剂或抗病药物的筛选，具有重要的理论和实际意义。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (7)
1.一种启动子，其特征在于，所述启动子为日本鳗鲡IFNc1基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.含有权利要求1所述启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
3.如权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒由权利要求1所述的启动子、由权利要求1所述启动子启动转录的目的基因和终止子组成。
4.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pGL3-basic、pGL2-Basic、pGL4.10、pGLuc。
5.如权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、酵母菌。
6.如权利要求1所述的启动子在构建真核表达载体、鱼类细胞或哺乳动物细胞中高效表达外源基因中的应用。
7.如权利要求1所述的启动子在免疫增强剂或抗病药物筛选中的应用。
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