CN113234723B - 一种日本鳗鲡细胞因子il-6基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种日本鳗鲡细胞因子IL‑6基因启动子及其应用。通过IL‑6基因开放阅读框第一外显子序列比对分析日本鳗鲡基因组，对分析预测IL‑6基因5’侧翼区序列进行降落PCR方法克隆了IL‑6基因启动子序列，成功构建了IL‑6基因启动子pGL3‑IL‑6‑pro荧光素酶报告质粒。实验证明IL‑6基因启动子可被poly I:C、LPS以及嗜水气单胞菌诱导激活，并且发现重要信号通路炎症调控因子Caspase‑1能够显著上调IL‑6基因启动子的荧光素酶活性。本发明为研究日本鳗鲡细胞因子IL‑6基因的表达调控机制以及重要鱼类炎症相关NF‑κB、MAPK、以及I型干扰素信号通路网络调控机制的研究提供良好的实验系统，同时也可以利用该启动子构建表达载体后高效表达外源基因，或将该启动子应用于转基因鱼的构建，具有重要的理论和实际意义。

Description

一种日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子及其应用。

背景技术

白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)是一种重要的炎症早期细胞因子，在炎症反应中起着重要的作用，主要是由单核细胞、巨噬细胞、Th2型细胞和成纤维细胞产生(杨汉春.动物免疫学[M].北京:中国农业大学出版社,2003)。IL-6生物学功能主要是可以通过促进B细胞分化和产生免疫球蛋白、诱导肝细胞生成急性期反应蛋白以及促进T细胞成熟等，在介导先天性和适应性免疫应答中发挥重要作用。已有研究表明经嗜水气单胞菌、LPS、polyI:C等多种外源因子刺激后鱼类IL-6基因表达水平显著升高，表明IL-6在鱼类抗细菌和病毒免疫应答过程中发挥重要作用(Fu,X.,Z.Ding,J.Fan,H.Wang,F.Zhou,L.Cui,C.Boxiang,W.Wang and H.Liu(2016)."Characterization,promoter analysis andexpression of the interleukin-6 gene in blunt snout bream,Megalobramaamblycephala."Fishphysiology andbiochemistry 42(6):1527-1540.；Kong,H.J.,B.-H.Nam,Y.-O.Kim,W.-J.Kim,H.K.Cho,C.H.Lee,S.-J.Lee andK.-K.Kim(2010)."Characterization of the flounder IL-6 promoter and its regulation by the p65NF-κB subunit."Fish&Shellfish Immunology28(5):961-964.；Bird,S.,J.Zou,R.Savan,T.Kono,M.Sakai,J.Woo and C.Secombes(2005)."Characterisation and expressionanalysis of an interleukin 6homologue in the Japanese pufferfish,Fugurubripes."Developmental&Comparative Immunology 29(9):775-789.)。鱼类IL-6基因表达调控主要在转录水平上进行，其中IL-6基因启动子发挥关键的转录调控作用。

目前关于鱼类IL-6启动子克隆与序列分析仅在团头鲂(Megalobramaamblycephala)(Fu,X.,Z.Ding,J.Fan,H.Wang,F.Zhou,L.Cui,C.Boxiang,W.Wang andH.Liu(2016)."Characterization,promoter analysis and expression of theinterleukin-6 gene in blunt snout bream,Megalobrama amblycephala."Fishphysiology and biochemistry42(6):1527-1540.；扶晓琴,丁祝进,饶友亮,王卫民and刘红(2016)."团头鲂白细胞介素6基因启动子报告载体的构建及活性分析."华中农业大学学报000(001):86-91.)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(Zante,M.D.,A.Borchel,R.M.Brunner,T.Goldammer and A.Rebl(2015)."Cloning and characterization of theproximal promoter region of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)interleukin-6gene."Fish&Shellfish Immunology 43(1):249-256.)、金头鲷(Sparus aurata)(Castellana,B.,R.Marín-Juez and J.V.Planas(2013)."Transcriptional regulationof the gilthead seabream(Sparus aurata)interleukin-6 gene promoter."Fish&Shellfish Immunology 35(1):71-78.)以及牙鲆(Paralichthys olivaceus)(Kong,H.J.,B.-H.Nam,Y.-O.Kim,W.-J.Kim,H.K.Cho,C.H.Lee,S.-J.Lee and K.-K.Kim(2010)."Characterization of the flounder IL-6 promoter and its regulation by the p65NF-κB subunit."Fish&Shellfish Immunology 28(5):961-964.)中有所报道。但关于鳗鲡IL-6基因启动子的研究尚未见报道。

鳗鲡(Anguilla)是亚洲各国广泛养殖的重要温水性鱼类，也是我国水产养殖品种单项出口创汇最多的品种之一，但近年来由于大规模、高密度养殖带来了鳗鲡病害细菌性疾病和病毒病的频繁发生与流行，造成巨大的经济损失(樊海平,杨明,张蕉霖and钟全福(2019)."鳗鲡疱疹病毒的流行情况与控制技术."科学养鱼(08):46-48.钟全福,樊海平,林煜and蔡荔萱(2020).我国鳗鲡产业标准体系的现状与分析.第十七届中国标准化论坛,中国福建福州.)。

鉴于鱼类IL-6在抗细菌和病毒免疫及其病害防治中的重要性，研究IL-6基因表达调控机制将为鱼类抗细菌和病毒病免疫应答机制的研究提供重要的理论依据，将为通过调节IL-6的表达来防治鱼类细菌和病毒病提供新的思路。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子及其应用，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了含有上述启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

优选地，所述表达盒由上述的启动子、由上述启动子启动转录的目的基因和终止子组成。

优选地，所述重组载体为pGL3-basic、pGL2-Basic、pGL4.10、pGLuc。

优选地，所述重组菌为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、酵母菌。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供了上述日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子在构建真核表达载体、鱼类细胞或哺乳动物细胞中高效表达外源基因中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：提供了上述日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子在构建转基因鱼中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本申请人成功克隆获得了日本鳗鲡IL-6基因序列。由于启动子是决定基因表达及其调控的关键因素，为研究日本鳗鲡IL-6基因的表达调控机制，我们通过日本鳗鲡IL-6开放阅读框序列与基因组序列比对分析获得可能的日本鳗鲡IL-6基因5′侧翼调控区序列，经过引物设计PCR克隆验证获得日本鳗鲡IL-6基因启动子序列，分析表明该IL-6基因启动子存在多个转录因子结合位点，C/EBP、IRF-1、AP-1、c-Jun、Sp1、GATA、c-Fos、NF-κB、c-Rel、TBP等结合位点，具有复杂的表达调控机制。经报告基因检测实验证明了该日本鳗鲡IL-6基因启动子具有较强的启动子活性。该日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的克隆及其强启动子活性在鱼类重要致病菌嗜水气单胞菌以及病毒模拟物poly I:C诱导表达分析，为研究日本鳗鲡细胞因子L-6基因的表达调控机制以及重要的鱼类炎症相关NF-κB、MAPK、以及I型干扰素信号通路网络调控机制的研究提供良好的实验系统，在应用方面为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造条件，具有重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子C/EBP、IRF-1、c-Jun、TBP等转录因子结合位点示意图。

图2为日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子AP-1、Sp1、GATA、c-Fos、NF-κB、c-Rel等转录因子结合位点示意图。

图3为采用双荧光素酶报告基因检测系统定量分析日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的活性图。

其中，横坐标pGL3表示空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为对照组)；

pGL3-IL-6-pro为荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为实验组)。

如图3所示，荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的7.6倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可以较好地启动荧光素酶报告基因的转录。

图4为在病毒模拟物人工合成双链RNA poly I:C(50μg/mL)刺激条件下日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的活性变化图。

其中，横坐标pGL3-Basic表示空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为对照组)；

pGL3-IL-6-pro为荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为实验组)。

如图4所示，经poly I:C刺激24h荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的9.3倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可被poly I:C诱导激活。

图5为在革兰氏阴性菌大肠杆菌重要表面抗原LPS(30μg/mL)刺激条件下日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的活性变化图。

其中，横坐标pGL3-Basic表示空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为对照组)；

pGL3-IL-6-pro为荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为实验组)。

如图5所示，经LPS刺激24h荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的8.5倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可被LPS诱导激活。

图6为在水产动物重要致病菌嗜水气单胞菌(10⁶cfu/mL)刺激条件下日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的活性变化图。

其中，横坐标pGL3-Basic表示空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为对照组)；

pGL3-IL-6-pro为荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为实验组)。

如图6所示，经嗜水气单胞菌刺激6h荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的16.3倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可被嗜水气单胞菌诱导激活。

图7为以信号通路重要炎症因子Caspase-1过表达条件下对日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的活性变化图。

其中，横坐标pcDNA3.1表示空载体pcDNA3.1、荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro以及海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞24h后的荧光素酶相对活性(作为对照组)；

横坐标pcDNA-Caspase1表示真核表达质粒pcDNA-Caspase1、荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro以及海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞24h后的荧光素酶相对活性(作为实验组)。

如图7所示，与pcDNA3.1空载体相比较，信号通路重要炎症因子真核表达质粒pcDNA-Caspase1转染EPC细胞后，能够显著上调pGL3-IL-6-pro启动子荧光素酶活性高达118.9倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可被炎症因子Caspase-1正向调控并激活。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的克隆

一、采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒对日本鳗鲡肌肉组织基因组DNA进行提取和纯化。具体操作如下：

1、取10mg的日本鳗鲡肌肉组织用刀片切碎后置于2ml离心管中，加入180μL的Buffer GL、20μL的Proteinase K和10μL的RNase A(10mg/mL)，于56℃水浴温浴过夜裂解。向裂解液中加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，充分吸打混匀。

2、将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。将500μL的BufferWA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。将700μL的BufferWB(用之前加入指定体积的100％乙醇)沿管壁四周加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。再次将700μL的Buffer WB沿管壁四周加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

3、将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入加热至65℃的150μL的灭菌水室温静置5分钟。12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。

4、提取得到的基因组DNA进行吸光度测定其浓度。

二、采用两轮降落PCR的方法扩增出日本鳗鲡IL-6基因启动子序列。具体步骤如下：

1、通过日本鳗鲡细胞因子IL-6基因开放阅读框第一外显子序列(SEQ ID NO：2)比对分析日本鳗鲡基因组，对分析预测具有IL-6基因5’侧翼区序列进行扩增，上游引物“5'-TTGTGAATGCCTGAGTTGAAGAC-3'”(SEQ ID NO：3)为IL-6基因5’侧翼区序列，下游引物“5'-TACCACGACAGCGATGAAAAGCAG-3'”(SEQ ID NO：4)为IL-6基因开放阅读框第一外显子序列，由上海生物工程公司合成。

日本鳗鲡细胞因子IL-6基因开放阅读框第一外显子序列(如SEQ ID NO：2所示)：

ATGTTTGCATCGACATACCCGCTGCTTTTCATCGCTGTCGTGGTA

2、第一轮PCR采用Takara公司高保真酶GC Buffer(Mg²⁺plus)进行扩增，反应体系：2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase 12.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、gDNA 0.5μL、灭菌水11μL；降落PCR反应程序为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，54℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，52℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min；4℃5min。

3、第二轮PCR采用Takara公司10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)进行扩增，反应体系：Ex Taq 0.13μL、10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL、dNTP Mixture(2.5mM each)2μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、第一轮PCR产物0.5μL、灭菌水18.87μL；降落PCR反应程序为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，54℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，52℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min；4℃5min。

4、第二轮PCR扩增得到的PCR产物连接到TaKaRa公司pMD19T-Simple vector载体进行序列测定与分析，从而获得含有日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子序列的pMD19T-IL-6-pro重组质粒。

日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

TTGTGAATGCCTGAGTTGAAGACTTAGGAAATATGGATGTTTGGCATACTTTTGAGAAATGTGCCGAACTGAACTAGTGAATAAACTAGTTGTTACATTTACTGGTCGTTAATTGTATTTATTTCGCTCATTGTGTATTCAACCTTGCTAGAAGATTTATTTATTTAAGATTTCCATTTTTATACAAACCAAGACAGGGCAATGAAATCATTTGAAATCTGAATTACATCCGTTGTGCTGACCCGAAGGTGCTTTTTCCTCATAAAACTCGCCAGTACATTAGCGGTTCATAACCGTATCAGGAATCTTTTGCATCTGGGTTGATGCGCTGTGTCGATTCAAGAACCTTTAAACAACGTTCACCAATTATGTTTTTATTTCGTGCTAAATAAACGGGCATTTGTAAAATGGGCATCCATAACTTCTGTACCTGCTTCCCAAAGTAGTTTAATCCCAGAAGGCAGAGAATTTTTCTTCATTTCCCTTTTTAATTACGTTTGCGTACCTCGTGAAGTATTCCGAGGACTGTTACACAACGCACGCTGCTCGTTTCCATCGAAGTCAAATACCAAAAAGGTTGACACCCAAAATAGTCCTCGTATTGCAGAAGCATGTCAGTGTACATGCTTACATCCTATTAATTTTCATTTTTGTAGGTTGAGTGTACTACTTCCCATGAAAGTCGGAGGAAAAGTTACGATTTCAACACTTCCTGGGTTCTCAAAATGCGTTGGTTAACACTGCTGACTCTTTCATAGCAAATGCCAGATGTCGCTTCACTTCGCTCTTTCAAGTAGCCTACTGATGGCATTGCCTAATTGATACTGTACAGCGATTATGAAATGGATCTCTTTTCCACAGATGTTTAACAGCTGGTAAGTATATTTATACTTTACCAGAATACACAAATCGAGGTTTTAATAAGCCCAGGGGAAGTTCTTATCAGAACTTCTACTAATTGCGCGATGAGCCTATGTTAATATATGCTGTATATAGTTTCCTTACGTTCACACAAGATTGACTAGTGTTTAATTGTAAATGGTAAATGGACTGAATTGTAATTTACAATGTGACGTCTGATGTTTAATAGATCCGTAAAATAGGCTAGTTTCACTTGAATGGCGTCAAGAAATTATCCTGTTTTCCGATATCATTACACTGACCGAATTCAATTGACATTAAAATTTTTGCTGACCAGTGGGCTAATTCTTTTTAACGAGTTCTCTATGATAAATATTCGTTTGCCGTTTTACTGTCTTGACGTATTTCATGTTGCATTTCTTATTTGTATTAATTAGACTAGCTAATAAATACAGTACGACTGGTTTTTGAATTTTTCAGTGATTCGATCCATTGCTCTATGCTAAGCATTACAATATGTAGCTAATGAAGTCAATTTCTCAAAAATTTGTTTTTCTGCAAAGAAGGTAATCTACTTGGATACACTGCTGAATACAGCAACGACTTAATCCCTTTCCAAAATGCCATAGGTTATTTTGGCTGAACGTCCAGAATGAGAAGTGTTTTGGTAATTTTTTCTAGTTATGACGCGTTCTTACCCTGCCGACAAAATATTCCACATGTGGTTAAAACCATAGTCGCATGACATGTTTCGGCTTGTTCGTGTTTTGATTTAGACTATTAGAATGTAATACAGCTGCACTGGTCCCCCGCGCACAAATCGGATCATATCTGTTTTGGTCCAGTGGTGGTTGTTGACGACTGCTGCAGTGGTGTCGACTATCTTGACAAATTGAGGTTAAATTTCCAAGGCTAAGTTATGCTTGTTTAATTTTGGAATAATTGCTTTGCGAGCATTTGCTACTTCTGAAAGACTGGAGCTTCCTTATAATTGTTGGTAGCTTTATGCTCCAGTTAAGTCATTCCAACACCGCGTGCCTAGGTAGTCAACTAATAGTTTACTGTTGGCCTATAGGCTACATCTCATGCATGTATTTGAAATTTAGTGGACTTTGGTCTTTATTTTATGAACATTGATTTGGACTGCATGTCCTTTGAAATGTTGATACCTCAACCATATTTCTCATTTTACCCAGATCTTGATCTCAGTGAATCACCTGTAGCCTGCAGTGATTATACTTCTATATTTAATCTGAACAGGTAGGCTAATTTCTTTTTTTTTTTTTAACAGTTTCTGTTGTGGTGGTTGTTGCTGATATCTGTCGTGGCTTTTAGAATGAATAGCCCTTTGTTGGACAGAGCTACAGCTTGAACAACATGGAGTTGTTACTTAAAACATAAAAAAGGAAGTCAGTAAAGAAGAATTAATGTTAATCCCTTTTTTTTATTTATTCTGAAACAGATTATTTTGGTTCATAGAAACGGTTGTCTGCCTAATTAGAGAAATGTGAAAATGCTCATTCATTGTTAATAACAAGAACATTGTCAGTCATGTACGTATTGTATTGCCAAATTTCAATAAATATGCATTTTCATATGTTAATGTAAGGAGCTAAAGGCAGG

实施例2日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的的转录因子结合位点分析

上网登录基因5′侧翼区转录因子结合位点在线预测软件Alibaba2(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)

将已经克隆测试验证获得的IL-6基因启动子序列复制后以fasta格式粘贴在对话框内，点击START进行转录因子结合位点的预测分析。部分结果如图1～图2：

日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子主要转录因子结合位点如下：

实施例3日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的活性分析

一、含有日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子片段的重组荧光素酶报告基因载体pGL3-IL-6-pro的构建。

1、将日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子片段插入Promega公司荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，使萤火虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的表达由日本鳗鲡IL-6基因启动子启动子控制，构建得到的荧光素酶重组载体命名为pGL3-IL-6-pro。具体步骤如下：

合成带有SacI酶切位点的上游引物：

5'-GAGCTCTTGTGAATGCCTGAGTTGAAGAC-3'(SEQ ID NO：5)，

带有HindⅢ酶切位点的下游引物：

5'-AAGCTTCCTGCCTTTAGCTCCTTACATTAA-3'(SEQ ID NO：6)。

采用Takara公司高保真酶GC Buffer(Mg²⁺plus)进行扩增，反应体系：2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase 12.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、pMD19T-IL-6-pro重组质粒0.5μL、灭菌水11μL；降落PCR反应程序为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，54℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，52℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min；4℃5min。用Omega公司胶回收试剂盒进行PCR产物回收。

2、回收后的PCR产物和载体pGL3-Basic分别进行SacI/HindⅢ双酶切(ThermoScientific Fermentas Fast Digest)。双酶切反应体系总共40μL，包括4μL10×FastDigest Green Buffer，酶SacI及酶HindⅢ各2μL，载体/PCR产物各1.5μg，灭菌水补至40μL，将以上体系于PCR管中混匀后进行酶切反应，反应程序为：37℃，60min；80℃，20min；4℃，5min。用Omega公司胶回收试剂盒分别回收上述经SacI/HindⅢ双酶切的PCR产物和载体pGL3-Basic，并用Takara公司T4连接酶连接经双酶切的PCR产物和载体pGL3-Basic，连接反应体系为20μL，包括2μL 10×T4 Buffer，1μL T4 DNA连接酶，40ng双酶切的载体pGL3-Basic，300ng双酶切的PCR产物，灭菌水补至20μL，将以上体系于PCR管中混匀后进行16℃连接过夜。

3、上述连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR筛选阳性克隆，用Omega公司无内毒素小量质粒试剂盒提取质粒，并经测序确认启动子片段插入的正确性，从而获得含有日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子片段的重组荧光素酶报告基因载体pGL3-IL-6-pro。

二、采用双荧光素酶报告基因检测系统分析日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子的基础活性。

1、把状态较好的EPC细胞接种至48孔细胞板中(1×10⁵/孔)，加入L15培养基(L15基础培养基含有10％Gibco澳洲胎牛血清)，转入恒温培养箱28℃中过夜培养，使其贴壁并恢复至对数生长期的状态，贴壁量达到80％左右时，进行转染实验。在转染前2h更换细胞培养基。

2、转染时，按每孔0.5μL Lipofectamine 3000 Reagent转染试剂和20μL Opti-MEM低血清培养基配制转染试剂稀释液，混匀后室温孵育5min。再按每孔20μL Opti-MEM低血清培养基与每孔所需质粒充分混匀，其中对照组含有20ng海肾荧光素酶内参报告基因载体pRL-TK、300ng荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic载体，实验组含有20ng海肾荧光素酶内参报告基因载体pRL-TK、300ng重组荧光素酶报告基因载体pGL3-IL-6-pro，随后加入0.5μLP3000^TM试剂并混匀。将所配的质粒稀释液逐滴滴加到转染试剂稀释液中，混匀为转染复合物溶液，室温孵育15min后，缓慢加入EPC细胞培养孔，于恒温培养箱(28℃)中培养。

3、24h后收集转染细胞，用双荧光素酶报告基因检测系统分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，通过计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性。荧光素酶酶活测定的方法参考Promega公司双萤光素酶报告基因检测系统说明书进行，具体步骤为：

(1)配制实验所需试剂：1×PLB裂解液：1体积5×Passive Lysis Buffer加4体积双蒸水混匀配制而成；Start试剂(LARⅠ)：将Luciferase Assay Substrate粉末完全溶解于10mL Luciferase Assay BufferⅡ溶液，用1.5mL离心管分装后，于-80℃冰箱保存；Stop试剂：视实验量将1体积的50×Stop&Substrate用49体积的Stop&/>Buffer稀释。

(2)缓慢吸去48孔细胞培养板中的细胞培养液，于每孔加入65μL的1×PLB裂解液。

(3)将48孔细胞培养板置于细胞振荡器上，振荡裂解15min。将裂解后的细胞液转移至1.5mL离心管，离心(13000rpm，4℃，10min)。

(4)取3μL离心后的上清液于透光性良好的1.5mL离心管中。

(5)加入10μL Start试剂，用GloMax 20/20发光检测仪检测样品中的萤火虫荧光素酶活性数值。随后加入10μL Stop试剂检测样品中的海参荧光素酶活性数值。两者活性的比值即为各样品的荧光素酶相对活性。

以空载体pGL3-Basic和pRL-TK共同转染的EPC细胞作为对照组，计算出pGL3-IL-6-pro启动子的相对活性(图3)。

如图3所示，荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的7.6倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可以较好地启动荧光素酶报告基因的转录。

三、免疫刺激实验

将pGL3-Basic和日本鳗鲡IL-6基因启动子荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro分别与海肾荧光素酶内参报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞，转染12h后，在细胞培养液中分别加入poly I:C(50μg/mL)、LPS(30μg/mL)以及嗜水气单胞菌(10⁶cfu/mL)进行免疫刺激，分别在刺激12h、12h以及6h后分别收集转染细胞进行荧光素酶相对活性测定。

在poly I:C(50μg/mL)刺激条件下日本鳗鲡IL-6基因启动子的活性变化见图4。荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的9.3倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可被poly I:C诱导激活，“*”p<0.05，“**”p<0.01。

在LPS(30μg/mL)刺激条件下日本鳗鲡IL-6基因启动子的活性变化见图5。荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的8.5倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可被LPS诱导激活，“*”p<0.05，“**”p<0.01。

在水气单胞菌(10⁶cfu/mL)刺激条件下日本鳗鲡IL-6基因启动子的活性变化见图6。pGL3-IL-6-pro转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的16.3倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可被嗜水气单胞菌诱导激活，“*”p<0.05，“**”p<0.01。

四、炎症信号因子过表达对日本鳗鲡IL-6的调控作用实验

将空载体pcDNA3.1和真核表达质粒pcDNA-Caspase1分别与荧光素酶重组载体pGL3-IL-6-pro、海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞24h后收集转染细胞进行荧光素酶相对活性测定。

日本鳗鲡Caspase-1过表达条件下日本鳗鲡IL-6基因启动子的活性变化见图7。与pcDNA3.1空载体相比较，信号通路重要炎症因子真核表达质粒pcDNA-Caspase1转染EPC胞后，能够显著上调pGL3-IL-6-pro启动子荧光素酶活性高达118.9倍，说明了日本鳗鲡IL-6基因启动子可被炎症因子Caspase-1正向调控并激活，“*”p<0.05，“**”p<0.01。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一种日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2484

<212> DNA

<213> 日本鳗鲡(Anguilla japonica)

<400> 1

ttgtgaatgc ctgagttgaa gacttaggaa atatggatgt ttggcatact tttgagaaat 60

gtgccgaact gaactagtga ataaactagt tgttacattt actggtcgtt aattgtattt 120

atttcgctca ttgtgtattc aaccttgcta gaagatttat ttatttaaga tttccatttt 180

tatacaaacc aagacagggc aatgaaatca tttgaaatct gaattacatc cgttgtgctg 240

acccgaaggt gctttttcct cataaaactc gccagtacat tagcggttca taaccgtatc 300

aggaatcttt tgcatctggg ttgatgcgct gtgtcgattc aagaaccttt aaacaacgtt 360

caccaattat gtttttattt cgtgctaaat aaacgggcat ttgtaaaatg ggcatccata 420

acttctgtac ctgcttccca aagtagttta atcccagaag gcagagaatt tttcttcatt 480

tcccttttta attacgtttg cgtacctcgt gaagtattcc gaggactgtt acacaacgca 540

cgctgctcgt ttccatcgaa gtcaaatacc aaaaaggttg acacccaaaa tagtcctcgt 600

attgcagaag catgtcagtg tacatgctta catcctatta attttcattt ttgtaggttg 660

agtgtactac ttcccatgaa agtcggagga aaagttacga tttcaacact tcctgggttc 720

tcaaaatgcg ttggttaaca ctgctgactc tttcatagca aatgccagat gtcgcttcac 780

ttcgctcttt caagtagcct actgatggca ttgcctaatt gatactgtac agcgattatg 840

aaatggatct cttttccaca gatgtttaac agctggtaag tatatttata ctttaccaga 900

atacacaaat cgaggtttta ataagcccag gggaagttct tatcagaact tctactaatt 960

gcgcgatgag cctatgttaa tatatgctgt atatagtttc cttacgttca cacaagattg 1020

actagtgttt aattgtaaat ggtaaatgga ctgaattgta atttacaatg tgacgtctga 1080

tgtttaatag atccgtaaaa taggctagtt tcacttgaat ggcgtcaaga aattatcctg 1140

ttttccgata tcattacact gaccgaattc aattgacatt aaaatttttg ctgaccagtg 1200

ggctaattct ttttaacgag ttctctatga taaatattcg tttgccgttt tactgtcttg 1260

acgtatttca tgttgcattt cttatttgta ttaattagac tagctaataa atacagtacg 1320

actggttttt gaatttttca gtgattcgat ccattgctct atgctaagca ttacaatatg 1380

tagctaatga agtcaatttc tcaaaaattt gtttttctgc aaagaaggta atctacttgg 1440

atacactgct gaatacagca acgacttaat ccctttccaa aatgccatag gttattttgg 1500

ctgaacgtcc agaatgagaa gtgttttggt aattttttct agttatgacg cgttcttacc 1560

ctgccgacaa aatattccac atgtggttaa aaccatagtc gcatgacatg tttcggcttg 1620

ttcgtgtttt gatttagact attagaatgt aatacagctg cactggtccc ccgcgcacaa 1680

atcggatcat atctgttttg gtccagtggt ggttgttgac gactgctgca gtggtgtcga 1740

ctatcttgac aaattgaggt taaatttcca aggctaagtt atgcttgttt aattttggaa 1800

taattgcttt gcgagcattt gctacttctg aaagactgga gcttccttat aattgttggt 1860

agctttatgc tccagttaag tcattccaac accgcgtgcc taggtagtca actaatagtt 1920

tactgttggc ctataggcta catctcatgc atgtatttga aatttagtgg actttggtct 1980

ttattttatg aacattgatt tggactgcat gtcctttgaa atgttgatac ctcaaccata 2040

tttctcattt tacccagatc ttgatctcag tgaatcacct gtagcctgca gtgattatac 2100

ttctatattt aatctgaaca ggtaggctaa tttctttttt tttttttaac agtttctgtt 2160

gtggtggttg ttgctgatat ctgtcgtggc ttttagaatg aatagccctt tgttggacag 2220

agctacagct tgaacaacat ggagttgtta cttaaaacat aaaaaaggaa gtcagtaaag 2280

aagaattaat gttaatccct tttttttatt tattctgaaa cagattattt tggttcatag 2340

aaacggttgt ctgcctaatt agagaaatgt gaaaatgctc attcattgtt aataacaaga 2400

acattgtcag tcatgtacgt attgtattgc caaatttcaa taaatatgca ttttcatatg 2460

ttaatgtaag gagctaaagg cagg 2484

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 日本鳗鲡(Anguilla japonica)

<400> 2

atgtttgcat cgacataccc gctgcttttc atcgctgtcg tggta 45

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgtgaatgc ctgagttgaa gac 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taccacgaca gcgatgaaaa gcag 24

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagctcttgt gaatgcctga gttgaagac 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttcctg cctttagctc cttacattaa 30

Claims (7)

1.一种日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有权利要求1所述启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

3.如权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒由权利要求1所述的启动子、由权利要求1所述启动子启动转录的目的基因和终止子组成。

4.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pGL3-basic、pGL2-Basic、pGL4.10、pGLuc。

5.如权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、酵母菌。

6.如权利要求1所述的日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子在构建真核表达载体、鱼类细胞或哺乳动物细胞中高效表达外源基因中的应用。

7.如权利要求1所述的日本鳗鲡细胞因子IL-6基因启动子在构建转基因鱼中的应用。