CN109385423B - 调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的小分子 - Google Patents

调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的小分子 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物生化免疫技术领域，具体涉及调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的小分子。所述的小分子命名为miR‑18b‑5p。本发明通过一系列研究，证实miR‑18b‑5p在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中显著低表达。miR‑18b‑5p模拟物和抑制物可抑制和促进感染结核分枝杆菌的巨噬细胞相关炎性因子例如IL‑α、IL‑6和IL‑1β等的表达，miR‑18b‑5p通过其靶标分子低氧诱导因子(Hif‑1α)调节结核分枝杆菌与巨噬细胞间的相互作用。

Description

调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的小分子
技术领域
本发明属于动物生化免疫技术领域，具体涉及调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的小分子microRNA-18b-5p,该小分子对结核分枝杆菌诱导的巨噬细胞炎性应答具有调节作用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的慢性消耗性人兽共患病。1993年4月23日，世界卫生组织(WHO)将结核病列为全球重点控制的传染病之一。WHO在《2017年全球结核报告》中指出，自人类2000年与结核病抗争以来，拯救了约5300万人的生命，并使结核病死亡率降低了37％；进一步提出了全球消灭结核病计划(Global Planto End TB)。然而，结核病仍是发病数和病死数最多的人类传染病。2016年，全球约有1040万例结核病新发病例，其中病死人数为170万人。中国一直是世界上结核病高负担国家之一，排名第三位，发病数约占全球总数的15％。耐药型结核病和混合感染等问题使结核病流行和防治日趋严峻，需要从新的角度提出研发新型疫苗、药物或诊断试剂的技术方案。
microRNA(miRNA)是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，广泛存在于各种真核细胞中，长度仅为20～24nt，具有高度保守性，时序性和组织特异性。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，通过剪切靶mRNA或抑制其翻译而调控基因的表达。目前研究表明，miRNA参与多种疾病的发生和发展，是潜在的诊断标识和治疗制剂的靶点，包括结核病。自噬、凋亡和炎症应答等免疫反应影响着结核分枝杆菌在宿主体内的生存，miRNA可通过调控各种靶标，影响结核分枝杆菌和宿主的互作。据报道，miR-155可靶向Socs1和Foxo3，进而促进凋亡；miR-223也可通过抑制Foxo3表达，促进细胞凋亡。miR144*、miR-125a和miR-30a在结核分枝杆菌的刺激下高表达，进而抑制DRAM2、UVRAG和Beclin-1，抑制宿主细胞的自噬。miR-147作为TLR和NF-κB通路中的负调控因子，可通过抑制TNF-α和IL-6的分泌，缓减结核分枝杆菌感染中机体的过度炎症反应。综上，说明miRNA在结核病的治疗中具有很大的应用潜力，可成为药物治疗的新靶点。另一方面，miRNA作为结核病的诊断标识也已有不少研究，活动性肺结核病人(active tuberculosis,ATB)体内巨噬细胞中miR-365的表达水平显著低于对照组健康人群(health control,HC)、以miR-29a为标识检测痰液检出结核分枝杆菌的灵敏度为80％、miR-155和miR-155*在PPD刺激后的ATB和HC的外周血单核细胞间表现出显著性差异表达，说明miRNA可单独或组合作为肺结核病的诊断标识。
细胞因子作为结核分枝杆菌和机体互作中重要的调控因子，国内外研究显示其可直接参与抗结核病免疫反应或免疫损伤。IL-10有助于MTB在巨噬细胞中存活，保护MTB，促进持续性感染。IFN-γ抑制MTB生长，而在其基因缺失小鼠体内，结核分枝杆菌的生长能力增强，结核病灶扩散，小鼠死亡率增高。IL-6是分泌IFN-γ的T细胞被激活所必需的细胞因子，可加强IFN-γ的作用强度。以上说明，通过调节细胞因子分泌可间接影响结核病的发生发展，细胞因子具有直接作为结核病治疗免疫制剂和药物作用靶点的潜能。
已有研究表明miR-18b-5p在结肠癌、黑色素瘤和鼻咽癌等疾病中与细胞迁移、凋亡和增殖相关，但其在结核病中的调控作用未见有报道，因此，对于miR-18b-5p的研究有助于我们开发结核病诊断标识和治疗制剂的新型技术方案。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的缺陷，获得一种调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的小分子microRNA-18b-5p(miRNA)，研究和证实其可调节感染的巨噬细胞的功能，并证实其可能的应用前景。通过一系列研究，本发明通过体外证实了MicroRNA-18b-5p(简称miR-18b-5p)在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中呈显著的下调表达。通过模拟物和抑制剂实现miR-18b-5p过表达和抑制表达，并证实分别具有抑制和促进感染结核分枝杆菌的巨噬细胞相关炎性因子(IL-α、IL-6和IL-1β等)的表达。miR-18b-5p的调节作用通过靶标分子低氧诱导因子(Hif-1α)而实施。
具体地，本发明技术方案如下所述，所述的方法包括以下步骤：
1、miR-18b-5p的发现：利用基于全基因组的RNA-seq对结核分枝杆菌(MTB)感染的巨噬细胞系(THP-1细胞)进行RNA测序，以未感染细胞作为对照，筛选差异表达的miRNAs并进行验证，确定miR-18b-5p在MTB感染的THP-1和RAW264.7细胞中的表达被下调。
2、miR-18b-5p的促炎作用：利用抑制剂(mmu-miR-18b-5p inhibitors)证实，抑制miR-18b-5p发挥了促炎作用。
3、miR-18b-5p的抑炎作用：利用模拟物(mmu-miR-18b-5p mimics)证实，miR-18b-5p过表达具有抑炎作用。
4、确定了miR-18b-5p的靶标分子：miR-18b-5p的调节作用通过靶标分子低氧诱导因子(Hif-1α)而实施。
更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是mmu-miR-18b-5p成熟体和双链mmu-miR-18b-5p mimics5’-3’的序列。
序列表SEQ ID NO:2是mmu-miR-18b-5p inhibitors的序列。
序列表SEQ ID NO:3是双链control mimics 5’-3’的序列。
序列表SEQ ID NO:4是control inhibitors的序列。
序列表SEQ ID NO:5是检测miRNA的下游通用引物序列。
序列表SEQ ID NO:6是检测内参u6的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:7是检测hsa-miR-18b-5p的引物序列。
序列表SEQ ID NO:8是检测mmu-miR-18b-5p的引物序列。
序列表SEQ ID NO:9是检测mmu-IL-10的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:10是检测mmu-IL-10的下游引物序列。
序列表SEQ ID NO:11是检测mmu-IL-1β的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:12是检测mmu-IL-1β的下游引物序列。
序列表SEQ ID NO:13是检测mmu-IL-1α的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:14是检测mmu-IL-1α的下游引物序列。
序列表SEQ ID NO:15是检测mmu-IL-6的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:16是检测mmu-IL-6的下游引物序列。
序列表SEQ ID NO:17是检测mmu-β-actin的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:18是检测mmu-β-actin的下游引物序列。
序列表SEQ ID NO:19是检测hsa-Hif-1α的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:20是检测hsa-Hif-1α的下游引物序列。
序列表SEQ ID NO:21是检测mmu-Hif-1α的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:22是检测mmu-Hif-1α的下游引物序列。
序列表SEQ ID NO:23是检测hsa-β-actin的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:24是检测hsa-β-actin的下游引物序列。
序列表SEQ ID NO:25是双链mmu-si-RNA-2176 5’-3’的序列。
图1：miR-18b-5p在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞和对照组中的差异表达(*p<0.05：**p<0.01；***p<0.001)。附图标记说明：图1中的A图是miR-18b-5p在MTB感染的THP-1细胞与对照组的相对表达量比较图；图1中的B图是miR-18b-5p在MTB感染的RAW264.7细胞与对照组的相对表达量比较图；图1中的C图和D图分别是miR-18b-5p在MTB感染的THP-1细胞与对照组的相对测序TPM值比较图。
图2：miR-18b-5p转染效率和过表达、抑制表达效率的检测。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。附图标记说明：图2中的A图是RAW264.7细胞转染FAM-NC-mimics后的荧光量分析；图2中的B图是RAW264.7细胞转染control mimics、mmu-miR-18b-5p mimics和control inhibitors、mmu-miR-18b-5p inhibitors后过表达和抑制表达效率测定。
图3：miR-18b-5p过表达和抑制表达导致感染MTB的RAW264.7细胞中相关细胞因子及p38、磷酸化p38蛋白表达量的变化。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。附图标记说明：图3中的A图是IL-6、IL-1α、IL-1β和IL-10在过表达和抑制表达miR-18b-5p的RAW264.7细胞和对照组的相对表达量比较图。图3中的B图是p38和p-p38在过表达和抑制表达miR-18b-5p的RAW264.7细胞和对照组的相对表达量比较图。
图4：miR-18b-5p过表达和抑制表达导致感染MTB的RAW264.7细胞上清中细胞因子IL-6表达量的变化。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图5：miR-18b-5p靶标生物信息学分析。附图标记说明：图5中的A图是miR-18b-5p预测靶标维恩图；图5中的B图是预测靶标的kegg pathway聚类分析图。
图6：Hif-1α在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞和对照组中的差异表达。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。附图标记说明：图6中的A图是Hif-1α在MTB感染的THP-1细胞与对照组的相对表达量比较图；图6中的B图是Hif-1α在MTB感染的RAW264.7细胞与对照组的相对表达量比较图。
图7：miR-18b-5p过表达和抑制表达后感染MTB的RAW264.7细胞中Hif-1α的表达量(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。附图标记说明：图7中的A图是Hif-1αmRNA在过表达和抑制表达miR-18b-5p的RAW264.7细胞和对照组的相对表达量比较图；图7中的B图是Hif-1α蛋白在过表达和抑制表达miR-18b-5p的RAW264.7细胞和对照组的相对表达量比较图。
图8：si-RNA-2176沉默Hif-1α表达的检测。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。附图标记说明：图8中的A图是siRNA-2176转染组相比于其它si-RNA和对照组中Hif-1αmRNA表达量比较图；图8中的B图是siRNA-2176转染组相比于其它si-RNA和对照组中Hif-1α蛋白表达量比较图。
图9：抑制表达miR-18b-5p的RAW264.7中同时沉默Hif-1α蛋白的表达。感染MTB后，细胞上清中细胞因子IL-6表达量的变化(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
具体实施方式
以下通过miR-18b-5p调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的研究实施例对本发明进行详细说明。
实施例1 结核分枝杆菌诱导巨噬细胞差异表达miR-18b-5p的筛选
1、结核分枝杆菌和巨噬细胞互作的高通量测序
利用人急性白血病单核细胞(THP-1)(细胞编号ATCC TIB-202，由北京结核病控制研究所李传友研究员馈赠)，结核分枝杆菌为临床分离的牛源结核分枝杆菌1458株(NZ_CP013475.1,1.Chen Y,Wu J,Tu L,Xiong X,Hu X,Huang J,Xu Z,Zhang X,Hu C,Hu X,GuoA,Wang Y,Chen H.(1)H-NMR spectroscopy revealed Mycobacterium tuberculosiscaused abnormal serum metabolic profile of cattle.PLoS One.2013,8(9):e74507.
2.Xiong X,Wang R,Deng D,Chen Y,Liu H,Wang T,Wang J,Zhu X,Zhu X,Zhu Y,Lu X,Chen H,Zheng H,Guo A.Comparative Genomics of a BovineMycobacteriumtuberculosis Isolate and Other Strains Reveals Its PotentialMechanism of Bovine Adaptation.Front Microbiol.2017,8:2500.)，按感染比(感染比(MOI)为细菌和细胞的数量比)为1:10进行感染，12h后终止感染，洗去胞外菌，继续培养，收取6h和24h的感染细胞样本，同时收集未感染的细胞作为对照组，用常规trizol法(trizol试剂购自Invitrogen公司)提取细胞总RNA，送武汉生命之美科技有限公司进行RNA-seq测序。进一步进行miRNA表达的生物信息学分析，筛选差异表达的miRNA。
2、miR-18b-5p在MTB感染的巨噬细胞中表达量的检测方法
(1)miRNA基于加尾的反转录合成cDNA
用常用的细胞总RNA提取法从MTB感染的巨噬细胞中提取总RNA，采用polyA加尾法(All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit，购自GeneCopoeia)进行反转录，合成miR-18b-5p cDNA。其主要原理为多聚腺苷酸聚合酶在miRNA的3’端引入多聚A尾，同时在逆转录酶和试剂盒提供的特殊引物(OligodT adaptor primer)作用下，合成cDNA。具体操作步骤中的试剂见表1。
表1 miRNA反转录体系
Figure BDA0001820585700000051
各反应组份混合后稍加离心，在PCR仪中进行反应，反应条件如下：37℃，60min；85℃，5min。-20℃保存。
(2)miRNA基于染料法的定量验证
本发明采用相对荧光定量PCR方法(常规SYBR Green染料法)对miRNA进行差异表达的定量验证，相关引物见序列表4。具体操作步骤中的试剂见表2。
表2 荧光定量PCR体系表
Figure BDA0001820585700000061
荧光定量流程为：95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；后两个步骤为40个循环。
3、结果分析
1)测序结果分析
对测序数据进行生物信息学比较分析，发现多个上调和下调的miRNAs，而miR-18b-5p是其中一个下调差异性最显著的miRNA(见图1中的C图和D图)。经过文献检索，发现miR-18b-5p在结核中的作用未见报道，因此申请人决定对其进行进一步研究。
2)miR-18b-5p在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中显著下调表达
用MTB按感染比为10:1感染小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)和THP-1细胞，12h后终止感染，洗去胞外菌，继续培养，收取6h和24h样。miRNA基于染料法的定量结果显示，在MTB感染的RAW264.7和THP-1细胞中，miR-18b-5p的表达量均显著性下调，在THP-1细胞中下降了0.55倍(6h)和0.22倍(24h)，在RAW264.7细胞中下降了0.69倍(6h)和0.47倍(24h)，且24h下降的程度在两类细胞中都大于6h(见图1中的A图和B图),与测序结果一致。即miR-18b-5p在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中为显著下调表达。
实施例2
miR-18b-5p抑制剂和模拟物调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的作用。
1、抑制或过表达miR-18b-5p促进或抑制MTB诱导的巨噬细胞炎症应答
(1)巨噬细胞培养、准备和转染
小鼠腹腔巨噬细胞细胞系RAW264.7(细胞编号ATCCTIB-71)，复苏后用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(购自Hyclone公司)在5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养，待细胞传至3-10代可进行转染试验，将细胞转至12孔细胞培养板中培养，使密度为1x106/孔。过12-24h待每孔细胞长至70％-80％进行转染。本发明通过常规脂质体(lipofectamine2000，购自Invitrogen公司)转染法，瞬时转染mmu-miR-18b-5p模拟物(mmu-miR-18b-5pmimics，序列见SEQ ID NO:1)、模拟物对照(control mimics，序列见SEQ ID NO:3)和mmu-miR-18b-5p抑制剂(mmu-miR-18b-5p inhibitors，序列见SEQ ID NO:2)、抑制剂对照(control inhibitors，序列见SEQ ID NO:4)(购自吉玛基因公司)，具体转染量为FAM-control-mimics、control mimics、miR-18b-5p mimics 80nM+Lipofectamine2000 3μl每孔，control inhibitors、miR-18b-5p inhibitors 80nM+Lipofectamine2000 3μl每孔。待转染4-6h后，洗去转染液，加入1mL DMEM 培养基，18-24h后进行感染实验。
(2)MTB培养、计数和感染
牛源结核分枝杆菌1458株的培养与计数工作均在华中农业大学动物生物安全三级实验室(Animal Biosafety Laboratory Level 3，ABSL-3)内严格按生物安全操作规程进行。从华中农业大学动物生物安全三级实验室冻藏液体菌种中用一次性接种环在中性罗氏培养基(张现松.牛分枝杆菌和卡介苗对树突状细胞及CD4～+T细胞分化的影响[D].华中农业大学,2013.)划线培养，一个月左右。挑取单个菌落接种到7H9(购自BD公司)含10％OADC增菌液(购自BD公司)液体培养基37℃静置培养，一般培养15天左右，至达到对数期。吸取培养液到离心管中，4000rpm，10min离心收集菌体，之后加入适量的7H9液体培养基重悬细菌，用1mL注射器反复吹吸悬液，静置5-10min后收集上清液，保存至细胞冻存管中。随即取一管细菌冻存液，做配比稀释，均匀涂布于7H11平板上，37℃倒置培养，至细菌菌落完全由肉眼能较明显分辨出时，计算菌落数，求取平均值。细胞与细菌的感染比为1：10，将分散好的细菌加到上述已过表达或抑制表达miR-18b-5p的巨噬细胞中，于CO2、37℃培养箱中培养8h后，用新鲜培养基洗除细胞外的细菌。然后在CO2、37℃培养箱中互作，并于0h、12h和24h这三个时间点收集细胞总RNA样本、上清样本和细胞总蛋白样本。
(3)总RNA提取、相对荧光定量PCR和western-blot
用常用的trizol(购自Invitrogen)法提取各组样品细胞总RNA，用反转录试剂盒(购自Vazyme)反转录成cDNA，具体操作的试剂见表3。
表3 mRNA反转录体系
Figure BDA0001820585700000071
Figure BDA0001820585700000081
其中，加入4×gDNA wiper Mix后，42℃，2min；后混匀在PCR仪上进行，25℃，10min；50℃，30min；85℃，5min。
细胞因子表达的检测方法同上述miRNA表达量检测方法，所用的具体引物见表4。
表4 荧光定量相关的引物序列
Figure BDA0001820585700000082
在本发明中，western-blot为常用的操作方式，其中所用抗体包括：Phospho-p38MAP Kinase Antibody(体积比为1:1000,9211,购自Cell Signaling Technology)；p38MAPK Antibody(体积比为1:1000,9212，购自Cell Signaling Technology)；betaActin Mouse Monoclonal antibody(体积比为1:2000,60008-1-Ig,购自Proteintech)。
4)ELISA检测
上清样中的炎性因子的检测，按照Mouse IL-6ELISA kit(欣博盛生物科技有限公司)试剂盒的说明书操作。
2、结果分析
(1)过表达和抑制表达miR-18b-5p模型的建立
用荧光显微镜观察转染FAM-control minics 6h后细胞内绿色荧光表达情况，确认转染成功，转染率约为50～60％。进一步用qRT-PCR方法检测转染36h后的miR-18b-5p过表达和抑制表达效率，结果为，miR-18b-5p过表达12.5倍，抑制率则为0.5倍(图2)。这说明本发明的转染方式正确，且转染进入细胞内的模拟物和抑制剂发挥了作用，表明过表达和抑制表达miR-18b-5p模型建立成功。
(2)过表达和抑制表达miR-18b-5p调控MTB诱导巨噬细胞炎症应答
在过表达和抑制表达miR-18b-5p巨噬细胞模型基础上，通过感染MTB，检测相关细胞因子。结果显示，当过表达miR-18b-5p时，细胞的促炎性因子IL-6、IL-1β和IL-1α表达被抑制，抑炎性因子IL-10的表达得到促进。当抑制表达miR-18b-5p时，则促进细胞的促炎性因子IL-6、IL-1β和IL-1α表达，抑炎性因子IL-10表达减少。且在12h miR-18b-5p促进或抑制IL-6、IL-1β和IL-1α效应最强。IL-10的促进或抑制最优效果则是在0h，过表达miR-18b-5p时尤为明显(图3中的A图)。结果发现，过表达和抑制表达miR-18b-5p分别具有抑制和促进相关炎性因子(IL-1、IL-6和IL-1等)表达的作用。另外，通过对与调控炎性相关的几条信号通路进行检测，发现当过表达miR-18b-5p，MTB感染的RAW264.7细胞炎症应答被抑制时，p38蛋白表达量无变化，但磷酸化p38蛋白的表达量则降低。相反地，当抑制表达miR-18b-5p，炎症应答得到促进时，p38蛋白的表达量无变化，但磷酸化p38蛋白的表达量升高。说明MAPK-p38信号通路参与miR-18b-5p调控结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的炎症应答(图3中的B图)。另外，本发明采用ELISA方法检测了三个时间点上清中IL-6的表达情况，结果见图4，其结果与qRT-PCR检测结果一致。这说明miR-18b-5p是一种能调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的小分子RNA，首次证明miR-18b-5p在结核分枝杆菌感染中具有调控宿主细胞炎症应答的功能，可能作为结核病治疗制剂或药物作用靶点。
实施例3 miR-18b-5p的靶标Hif-1α蛋白在MTB和巨噬细胞互作中的作用
1、miR-18b-5p的靶标预测和验证方法
1)miR-18b-5p在线靶标预测和聚类分析
本实施例应用的预测软件包括microRNA.org(http://www.microrna.org)、Targetscans7(http://www.targetscan.org)、miRBD(http://mirdb.org/miRDB/)和miRecords(http://c1.accurascience.com/miRecords/)等，对预测出的大量数据进行初步筛选，主要依据为靶标基因mRNA 3’端UTR与miRNA 5’端种子序列互补区的保守性、互补性和热力学稳定性。聚类分析和通路分析中所用的在线软件主要包括KEGG PATHWAYDatabase(http://www.kegg.jp/kegg/)和DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)。
2)miR-18b-5p靶标验证
按过表达和抑制表达miR-18b-5p模型，感染MTB，收集0h、12h和24h细胞总RNA样和总蛋白样。用qRT-PCR和western-blot进一步筛选和验证。Hif-1α的mRNA表达量的检测方法同上述细胞因子表达量的检测方法，所用的引物序列见表4。western-blot为常用操作方法，其中所用抗体为Anti-HIF-1alpha antibody(体积比为1:1000,ab179483，购自Abcam公司)和beta Actin Mouse Monoclonal antibody(1:2000,60008-1-Ig,购自Proteintech公司)。
3)miR-18b-5p抑制表达同时沉默Hif-1α蛋白表达细胞模型的建立
将小鼠腹腔巨噬细胞细胞系RAW264.7复苏后用含10％FBS的DMEM培养基在5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞传至3-10代可进行转染实验，将细胞转至12孔细胞培养板中培养，密度为1x106/孔。过12-24h待每孔细胞长至70％-80％时进行转染。本实施例通过常规脂质体(lipofectamine 2000，购自Invitrogen公司)转染法，瞬时转染mmu-si-RNA-2176(其序列见SEQ ID NO:25)和对照siRNA(control mimics)，共转染mmu-miR-18b-5p抑制剂(mmu-miR-18b-5p inhibitors)+对照siRNA(control mimics)和mmu-miR-18b-5p抑制剂(mmu-miR-18b-5p inhibitors)+mmu-si-RNA-2176。具体转染量为mmu-si-RNA-2176、对照siRNA(control mimics)80nM+Lipofectamine2000 3μl每孔；具体共转染量为mmu-miR-18b-5p抑制剂(mmu-miR-18b-5p inhibitors)80nM+对照siRNA(control mimics)80nM+Lipofectamine2000 5μl每孔，mmu-miR-18b-5p抑制剂(mmu-miR-18b-5pinhibitors)80nM+mmu-si-RNA-2176 80nM+Lipofectamine2000 5μl每孔。待转染4-6h后，洗去转染液，加入1mL DMEM培养基，18-24h后进行感染实验。
4)ELISA检测
上清样中的炎性因子检测按照Mouse IL-6ELISA kit(欣博盛生物科技有限公司)说明书操作。
5)结果与分析
(1)miR-18b-5p在线靶标预测结果
应用在线预测软件包括microRNA.org、Targetscans7.1、miRBD、starBase、miRSystem和miRecords，为了进一步缩小靶标范围，求取五个软件预测结果的韦恩图，其中至少能被两个软件预测到的共有172个靶基因，五个软件都可预测到的共有7个靶基因(见图5中的A图)。对172个预测靶基因在DAVID Bioinformatics Resources 6.8在线软件上进行聚类分析，所使用聚类阈值Count＝2，EASE＝0.1。得到排名前15的相关通路(图5中的B图)。从聚类结果发现除去排在前面几个与癌症和神经相关的通路，主要聚类到与炎症、凋亡和内吞相关的通路中，即miR-18b-5p在结核分枝杆菌和巨噬细胞互作中很有可能在炎症、凋亡和内吞方面有调控作用。
(2)miR-18b-5p靶向作用于Hif-1α在转录水平和蛋白水平中的检测
根据靶标的预测结果、前期测序结果和miR-18b-5p在结核分枝杆菌感染中的作用方向，本发明选择了NR1H2、MAP3K1、IRF2和Hif-1α这四个靶标作为进一步研究的对象。通过相对荧光定量PCR和western blot对上述样品中NR1H2、MAP3K1、IRF2和Hif-1α的表达量进行了检测，发现Hif-1α在MTB感染的RAW264.7和THP-1细胞中呈显著上调表达，在THP-1细胞中上调了2.61倍(6h)和2.29倍(24h)，在RAW264.7细胞中上调了2.08倍(6h)和1.51倍(24h)(图6)。为了进一步确定miR-18b-5p和Hif-1α的靶向关系，以过表达和抑制表达miR-18b-5pRAW264.7细胞模型，感染MTB，通过qRT-PCR检测过表达或抑制表达miR-18b-5p是否影响Hif-1α在转录水平上的表达，通过western-blot检测过表达或抑制表达miR-18b-5p是否影响Hif-1α在蛋白水平上的表达。结果显示，在转录水平上，过表达miR-18b-5p可以抑制Hif-1α的表达，相反，抑制表达miR-18b-5p可以促进Hif-1α的表达。在蛋白水平，过表达miR-18b-5p可以抑制Hif-1α蛋白的表达。相反，抑制表达miR-18b-5p可以促进Hif-1α蛋白的表达(图7)，确定Hif-1α是miR-18b-5p的靶标。
(3)沉默Hif-1α可缓减抑制miR-18b-5p引起的促炎效应
为了筛选最佳沉默Hif-1α蛋白表达的si-RNA，分别转染待检si-RNA，感染MTB，收集12h的细胞总RNA和总蛋白，通过qRT-PCR和Westernblot检测，结果显示，siRNA-2176相比于其它si-RNA和对照组，可明显沉默Hif-1αmRNA和蛋白的表达(图8)。
为了进一步验证miR-18b-5p调控MTB感染的巨噬细胞的炎症应答的功能是否与Hif-1α有关，本实施例在抑制表达miR-18b-5p的RAW264.7中同时沉默Hif-1α蛋白的表达，感染MTB，通过ELISA实验检测IL-6的表达量，研究沉默Hif-1α是否可缓减抑制miR-18b-5p引起的促进IL-6表达的效应。结果显示，在终止感染24h后，与对照组相比，Hif-1α可显著性缓减抑制miR-18b-5p引起的促进IL-6表达的效应(图9)。据此，本实施例结论表明：沉默Hif-1α蛋白的表达可缓减抑制表达miR-18b-5p对IL-6表达的促进效应，即Hif-1α参与miR-18b-5p调控MTB感染的巨噬细胞的炎症应答的功能。
Hif-1α作为miR-18b-5p调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答过程中的桥梁，且其本身已被报道具有抑制MTB在宿主体内生存和增强宿主免疫防御能力，具有较大的潜力作为结核治疗中的新靶点。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞炎症应答的小分子
<141> 2018-09-21
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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ccaguuacgu uccuuugau 19

Claims (1)

1.结核病相关的小分子microRNA-18b-5p的抑制物在制备抗结核病感染药物/试剂中的应用，其特征在于，所述小分子为microRNA-18b-5p的抑制物为序列SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸。
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