CN114317720A - hsa_circ_0066715基因的应用及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种hsa_circ_0066715基因的应用及其检测方法。根据提取的总RNA序列，设计并合成特异性PCR引物，利用Rt‑qPCR技术，发现hsa_circ_0066715在类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞中的表达显著降低，并且与RA疾病关键指标RF、CCP呈明显负相关关系，与RA疾病炎症指标ESR、CRP、DAS28呈明显负相关关系。故该基因可应用于制备类风湿关节炎的辅助诊断、治疗或者预后评估的试剂。设计并合成特异性过表达该基因的序列，能够通过调节炎症细胞因子表达，显著抑制滑膜成纤维细胞(FLS)的增殖及TNF‑α所诱导的FLS的炎症反应，可成为RA的分子靶向治疗工具。

Description

hsa_circ_0066715基因的应用及其检测方法

技术领域

本发明属于风湿免疫病分子生物学领域，具体涉及一种hsa_circ_0066715基因的应用及其检测方法。具体而言，本发明涉及环状RNA hsa_circ_0066715(因hsa_circ_0066715转录本与hsa_circ_CBLB_023相对应，以下简写hsa_circ_CBLB)基因在制备RA辅助诊断试剂、分子靶向治疗试剂或者预后评估试剂中的应用及相关检测方法。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是一种累及周围关节为主的多系统性、炎症性的自身免疫性疾病。RA疾病发生发展过程中伴随着机体免疫细胞增殖和凋亡动态的失衡，氧化应激激活及包括众多信号通路在内的多种信号传导通路失衡，导致免疫炎症的发生，最终促进RA疾病的发生发展。RA发病机制目前仍不明确。风湿性疾病主要表现为自身抗原免疫反应异常引起的局部或全身炎症症状，而且大部分疾病病因和发病机制尚不完全清楚，早期诊断困难，治疗效果不佳。因此，寻找RA早期诊断、靶向治疗和预后评估的生物标记物，对RA的治疗及预后具有重大的意义。

随着近年来高通量基因测序技术的发展，对于RA基因表达谱的研究越来越受到学者关注。环状RNA(circular RNA，circRNA)可能在RA疾病的发病过程中起到相当重要的作用。circRNA是一类以共价键形成环形结构的非编码RNA，因其良好的稳定性、高度的保守性越来越受到人们的关注。环状RNA调控靶基因表达的功能与多种疾病的发病有关，并且有作为临床生物学标记的应用价值。circRNA是广泛表达于真核细胞中的特殊的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncR-NA)，是不具有5′端帽子(5-cap)和3′端多聚腺苷酸尾(3-poly Atail)的共价封闭环。随着高通量RNA测序技术的不断进步，circRNA在免疫系统、肿瘤、神经系统疾病的发生发展中的重要调控作用被人们所揭示。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类新型内源性非编码RNA，因其具有的稳定性、保守性、丰富性等特点，有望成为人类疾病的生物标志物和靶向治疗靶点。circRNA的生物学特性、功能和其在风湿性疾病早期诊断、病情评估以及治疗中的作用。circRNA广泛参与类风湿性关节炎的发生发展。同时，circRNA表达的时空特异性与证候的动态时空特性相似，可为寻找特异性证候生物学标志谱提供新角度。

发明内容

针对目前RA缺乏诊断标志物，缺乏治疗药物靶向性、针对性，本发明提供了一种hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因在制备RA检测试剂、制备RA预后评估剂等方面中的应用。

首先，本发明提供了一对用于检测hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因的引物对，该引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

其次，本发明提供了一种RA检测试剂，该试剂包括核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQID NO.2所示的引物对；进一步，该检测试剂包括：5uL 2×SYBR Green mixture、1uLForward primer(10uM)、1uL Reverse primer(10uM)、浓度为2.5ng/μl的cDNA 1uL、浓度均为10umol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2各1μl、RNase Free water2uL。

第三，本发明提供一种hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因的检测方法，包括RA外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)提取、TRIzol法提取总RNA、RNA浓度和纯度的测定、cDNA合成及PCR扩增。

第四，本发明还提供了一种hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因在制备RA靶向治疗试剂中的应用，具体而言，即根据hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因制备特异性过表达序列、RAN全序列SEQ ID NO.3和剪切后序列SEQ ID NO.4，用于在滑膜成纤维细胞中过表达hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因。

第五，本发明提供了一种RA诊断试剂，所述试剂包括特异性过表达序列pcDNA3.1-hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该特异性过表达序列pcDNA3.1-hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)是针对hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)的全长序列设计并合成，其可用于感染滑膜成纤维细胞，使hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因在细胞中过表达。结果显示，该过表达序列能显著提高FLS中pcDNA3.1-hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)的表达水平，致炎性细胞因子IL-13、TNF-a、IL-23产生增加，抑炎性细胞因子IL-4分泌减少。

与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：

本申请系统地探究RA中hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因的表达，通过实施例研究证实：与健康对照组(HC)相比，RA患者PBMCs中hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)的表达明显降低，且与疾病活动性指标呈负相关关系。hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)过表达载体显著抑制TNF-α诱导FLS炎症反应和细胞增殖。本申请发现并验证了RA中的hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因的表达及功能。这一发现将有望进一步丰富和完善RA发病机制的研究，也为研发RA早期诊断、靶向治疗及预后评估的新型生物标志物带来希望。

附图说明

图1表示hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)在RA患者PBMCs中表达。

图2表示hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)与临床指标相关性分析。

图3表示hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)在RA-FLS中的表达。

图4表示hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)对RA-FLS细胞增殖的影响(A:FLS，B:RA-FLS，C:RA-FLS+pcDNA3.1-circ-CBLB-NC，D:RA-FLS+pcDNA3.1-circ-CBLB)。

图5表示hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)对炎症因子mRNA的影响。

图6表示hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)对炎症因子蛋白的影响(A:FLS，B:RA-FLS，C:RA-FLS+pcDNA3.1-circ-CBLB-NC，D:RA-FLS+pcDNA3.1-circ-CBLB)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明的相关原理及步骤，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件或按照厂商所建议的条件进行实施检测。

实施例1

RA患者PBMCs中hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)的表达情况

申请人在项目通过伦理委员会审核之后，系统研究人RA新的诊断和治疗靶点，通过抽取RA患者的外周血，提取PBMCs，RT-qPCR法检测hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因的表达。

本实施例共收集RA患者血液样本30例，对照组健康人(HC)血液样本30例，共60例样本(来源于30个RA患者具体信息见附表1，样本特点见附表2)。

表1 RA患者样本信息

表2 RA患者样本特点

hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因的检测方法，包括RA外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)提取、TRIzol法提取总RNA、RNA浓度和纯度的测定、cDNA合成及PCR扩增，其具体步骤如下：

1、RA患者PBMCs提取

室温条件下，在50mL离心管中加入6mL Ficoll-Paque PLUS；10mL离心管中加入4mL新鲜的抗凝血和等量的PBS，混匀，将稀释过的血液样本小心铺到Ficoll-Paque分离液上面，然后将离心管置于水平式离心机内，19℃400g离心35min；离心后分4层，从上往下依次为：血浆层、单核细胞层、Ficoll-Paque PLUS、红细胞层，吸掉血浆层，将单核细胞层转移到另一离心管中，加入至少3倍体积的PBS，混匀，19℃400g离心15min，弃上清；加入6mL PBS重悬细胞，19℃100g离心10min，弃上清；再加入1mL PBS重悬细胞，然后转移到1.5mL EP管中，19℃100g离心10min，弃上清，置-80℃冰箱保存。

2、RNA提取

1)收集细胞沉淀，加入1ml TRIzol裂解。

2)裂解完全后，加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。

3)4℃12000rpm离心10分钟，取上清(约500ul)加入到另一EP管中。

4)加入0.5mL预冷的异丙醇，温和混匀，-20℃孵育30分钟。

5)4℃12000rpm离心15分钟，弃去上清。

6)加入1mL预冷的75℅乙醇(无水乙醇用DEPC水稀释)。4℃12000rpm离心5分钟，弃上清。

7)重复步骤6)。

8)室温干燥RNA沉淀，加入20-50μL DEPC水，-80℃保存备用。

3、RNA浓度和纯度测定

用移液器取RNA样品1μL至缓冲液中，测定其在260nm和280nm处吸光值。根据OD260/OD280比值，估测RNA质量。OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，可以满足实验要求。当OD260/OD280<1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显；当OD260/OD280>2.2时，说明RNA已经降解。

4、RT反应

1)去除基因组DNA反应：在0.2mL EP管中加入

轻轻混匀、点动离心。

2)PCR仪上42℃加热2min，立即冰浴1min。

3)在上述EP管中加入

4)37℃，15min；85℃，5s。

5)取出上述反应液，即为cDNA，-80℃保存备用。

5、荧光定量PCR反应

1)取出cDNA作为荧光定量的模板，反应体系如下：

2)反应条件如下：

3)各检测指标引物

实验结果如图1所示，结果发现，与健康对照组(HC)相比，RA患者中hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)的mRNA表达显著降低。

Spearman相关分析显示，hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)的mRNA表达水平与RA疾病关键指标RF、CCP呈明显负相关关系，与RA疾病炎症指标ESR、CRP、DAS28呈明显负相关关系(如图2所示)。

实施例2

hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)过表达序列及其应用

本实施例针对hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)的全长序列设计，并合成其特异性过表达序列pcDNA3.1-hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)(其RAN全序列如SEQ IDNO.3所示，剪切后序列如SEQ ID NO.4所示)，感染FLS，使hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)基因在细胞中过表达，并进一步将该过表达基因载体应用于调控FLS的炎症反应。

具体病毒包装及细胞感染方法如下：

(1)293T细胞在6cm dish中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用3mLPBS洗涤细胞两次；(2)加1mL Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3分钟；(3)再加入2mL含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；(4)血球计数板计数，将细胞稀释至3x10⁵细胞/mL；(5)按5x10³细胞/孔的浓度接种96孔板，混匀后于37℃5％CO₂培养24h；(6)转染试剂Lipofectamin2000用于转染过表达质粒，剂量如下，每个剂量设三复孔；

(7)在1.5mL EP管中加入75μL(25μL/well*3well)无血清DMEM，再加入根据上述表格算出的不同剂量的质粒，混匀，取另一1.5mL EP管，加入75μL(25μL/well*3well)无血清DMEM，加入根据上述表格算出的相应剂量的Lipofectamin2000，混匀，室温放置5分钟后将两组管混合，室温放置20分钟，吸去96孔板中的培养液，每孔加入50μL无血清的DMEM培养液；(8)将转染混合物逐滴加入96孔板中，混匀后，在培养箱中温育5小时；(9)转染质粒组，吸弃转染液，更换为完全培养基，在培养箱孵育24h后观测；(10)48h后，RT-qPCR检测293T的感染效率；(11)48h后，收集293T细胞上清液至15ml离心管中，并于4℃，1500rpm离心5min，弃掉细胞沉淀，0.45μm滤器过滤后转移至1.5ml离心管，-80℃冰箱冻存；(12)在六孔板中接种待感染重组慢病毒的FLS，密度为5～8×10⁵/孔培养；(13)吸尽培养液，加入1mL重组慢病毒液，及8μLpolybrene(终浓度1μg/μL)，放入培养箱培养；(14)4h后半量换液；(15)24h后，全量换液；(16)48h后，RT-qPCR检测293T的感染效率。如此便获得hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)过表达和小干扰的FLS。

FLS在无血清培养基中培养过夜后，加入10ng/ml TNF-ɑ分别刺激成RA-FLS，用RT-qPCR检测hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)mRNA的表达水平，结果如图3所示，发现TNF-ɑ刺激为RA-FLS能够降低hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)mRNA表达，过表达hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)后hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)mRNA表达显著升高。

进一步通过平板克隆观察发现，经TNF-ɑ刺激为RA-FLS后，与FLS比较，RA-FLS组、pcDNA3.1-hsa_circ_0066715-NC组滑膜成纤维细胞明显增殖。过表达hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)后发现，能够明显抑制滑膜成纤维细胞增殖(如图4所示)。

图5结果显示，经TNF-ɑ刺激为RA-FLS后，用RT-PCR检测IL-4、IL-13、TNF-a、IL-23基因的表达。与FLS组相比，RA-FLS组IL-13、TNF-a、IL-23mRNA表达升高，IL-4mRNA表达降低。与RA-FLS组相比，pcDNA3.1-hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)组IL-13、TNF-a、IL-23mRNA表达显著降低，IL-4mRNA表达升高。

图6结果显示，经TNF-ɑ刺激FLS后，用免疫印迹法检测IL-4、IL-13、TNF-a、IL-23蛋白的表达。与FLS组相比，RA-FLS组IL-13、TNF-a、IL-23蛋白表达升高，IL-4蛋白表达降低。与RA-FLS组相比，pcDNA3.1-hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)组IL-13、TNF-a、IL-23蛋白表达显著降低，IL-4蛋白表达明显升高。

由此可见，hsa_circ_0066715(hsa_circ_CBLB)通过调控炎症炎症表达抑制滑膜炎症反应。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽中医药大学第一附属医院（安徽省中医院）

<120> hsa_circ_0066715基因的应用及其检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcctgctaga aggttaccag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgctaacgg accagtacac 20

<210> 3

<211> 23356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcttttcca atggtcacct tggaagtgaa gaatatgatg ttcctccccg gctttctcct 60

cctcctccag ttaccaccct cctccctagc ataaagtgag ttttgttgaa tttggagatc 120

acttgtctat gcatcaagat atggtagagt ggttttgaga ggttctcagt acagacacta 180

catgatgaat agaaagtcat tgatagtaaa cagccagctg tatttacaaa ctaaattacc 240

ataaattaag atccttccct atactttgct ggtaaccaca acatctgtga gacttaccta 300

aactcttgag gttacataga gcaacaggga gagaaagcta cgcattcctt gcatcaaaga 360

gggtagagta gcacaatgag gtatcccttc aaatttacct cttctcctca gaggtatccc 420

attttatctc agcttcccag tttgacatca taaaataatc tttggttcca ccaggtttct 480

catttctcac atccattcag ctactaagtc cttttgatta ttcttttgga gtttttcata 540

ttcctctaat cttctccatt gctctagctt tgcctcagag ctggacaact gaaagagcct 600

tttatctgat aatctcttat gatcggagag ttagtatcaa tgggtttacg gctagtaaaa 660

tgagataact gggtatctca tttgaaaaat ggggccccag aggcacacta gatatctctc 720

attgatatct tcccaagtta aaccaggata aactggatat cccaattcta attttcctgc 780

tctttatatg aagtcaggat gtctgccttt cctccggtat attttgttca ctgtaactga 840

gttcatttaa tttaacttct gccttcccca ggtcaccttc ccactcaaaa actagcattg 900

tttccctttt tccattaaat taactctatg cacttctgct aacagtaaga tcctacagaa 960

ttttacccaa ctaaaatatt ttttagtgat tcctaatact tgccctgtaa ttatatctgg 1020

attgtttttt ctgactttgt gagattttta tgctgttcct cctgtgcttc accttttcct 1080

aatctttatc ctaaaggtcc atatctcaga ctctatttct ttgtgaaatg ttctgtgact 1140

tcttcaattg tagtgattaa gactgattta cattcctctt cctgcagttt atttcctact 1200

catttaatta tatactctgc catactgttt tctaatttta atgtgactct ccaattgaaa 1260

agattacaag actttgagga caaaaacttt gtgttctcta tctcccataa catcttactg 1320

tatttgatat atactaagta aatgatttgc atatagtaag taagtacaca gagaatacgt 1380

ggatgcttgg tttattgatt taaattttat ctgctgaggt ccttatttac aatagaaggt 1440

cttagagctt cttcattcct tcatctgcag ttcactgaac tcccactata catatcaatg 1500

caaaagaaaa ataaggtaga tcccagcccc ccagaaattt acagtctact ttagaaaata 1560

acattaatgt atatgaaatc attagagaat ggtgtgcact aacatttata atgctaactt 1620

agtagtttca aatgagtttg gaggagaggc tgttatagac tttgtgaatg aaggatgtca 1680

tggagggatg ggcatttcat gactcatgaa gtacaggcac aattgggaaa ggcagaatgt 1740

gagaaaaaac aagggtgtga aatttggcat cattcagggg acggtgggaa actcagcgaa 1800

ttagatcatt ctccagtggg aacttctctt ggaactgcga gatatttagc aggcatagga 1860

gttggaagca attatacata ctctgggtag taggctctaa atcagtgaca acatatgatt 1920

atattctagt gctaaatgaa ctctggatat atgtgcatgt aataaaacat ctaagctcaa 1980

ttacctttga taactcagag aacattagaa aatgaaatct tgctaattag agattaaatg 2040

ttcacattct gtttattaaa ttcatattgg caagcgagct ggaagttgca gtgtgcttca 2100

tttgtattta acattaaata cctgcttctc ctgtaaatga agcaagaata acaaattgat 2160

agtaaaatgt attttttcta atacttcagt tggtaagtgc atctaaaatt agtcatactt 2220

tctccctatt tactcttgat ttttccctca gaaacagtgc aattgtttca cttaactaga 2280

gaaatatttt aacagtgcat gcttgccagc aaattagttt tcaattttgc atgctgcaag 2340

tcagccatag ttagcagtac aaatgctagc ttttaatggc acagttatct ctccagttta 2400

tttttgtttc tgactctgtg ggtagcagtt gttcactgta gacaatatgc aaagtatata 2460

agagaaagaa aaaagtgaga tacataagca caagcatatg catatgctaa atatcaatgt 2520

ccagagtttt aacattttga cattttttat ttaaacttgt ttttacctta tttagattat 2580

atggtagaga taattttatg ccctcctttc ttaacattat cataagcatt tttcttaatt 2640

gtttagttat gcattgtgtt tattacaaaa ccagcatgga atgctgatgt gaacagtaga 2700

ataaaatcag actgtgtacc acacctgact ccgccattaa gtatttgtct tttttttttt 2760

tttttttgag atggagtctc actctgtcgc ccaggctgga gtgcagtggc gcgatctcgg 2820

ctcactgcaa cctctgcctc ctgggttcaa gcggttctcc tgcctcagcc tttcaagtag 2880

ctgggactat agtcgtccgc cactatgccc ggctaatttt tttattttta gtggagacgg 2940

ggtttcacca tattggccag gctggtctcg aactcctgac cttgtgatcc acccgcctca 3000

cactcccaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccaccatg cccagccttt gtcttatttt 3060

taacaggaaa acttctctgg gcctttcccc atctggtaga agagaggatc agtttaactt 3120

aaattatctc caaaatcctt ttgagattca gctttttagg ttctatacag tgtgtttttt 3180

taaaggatac tgatggcaaa cctgacaata acagtgagtc aagagtcttg gctgtggatg 3240

gtcttagaac agaggtctta gcaaaatgcc actcacagaa ataggaatgt cagatgttcg 3300

agagttcatt tccatcttag actcttggta tatgtttcaa aatcaggcca aagcaaaatt 3360

acgcattcct accaaacata cacttctgta gttcttacaa atgttgaaaa ctccaatgtt 3420

aaatccaaga atgtcaaagc taacatttac cttacattta tactatgttg ttataaatat 3480

ttactgaaat agaattgtta aatatttgat attgtttact ctgattccca tttacatgat 3540

gtcagaggct gctgtcatag tgtttcctgt taaactgtat ctttgcaatt atttgacttt 3600

tattgtgtaa tttgtcttga gacctagaag agtatgaaat ttacttttaa aaaacatact 3660

gttgtaaaag caatctgaaa ttatttgtat ctatatactt aatttttcta aattaatgtt 3720

tttttctaaa tggtttctgc ttaacatctt tgacacttag ctataaatat aaaattttaa 3780

gtaaatccta gaaacatggg taattatttt tttggaggga gaacaaaata atcctatgtg 3840

gattcttttt actttatagt ttaaattatt tatttactaa attatattta ttttgaaata 3900

atttgatttt tcaaaattaa aactaaatga tactctgaat agttaaggaa atatttattt 3960

tacttggcac acaatagatt ggcaaatgaa cagaggcatt attacaagta ataatggagt 4020

aattacttcc aggtaagata atgttctgaa atgctgagga atatcttttt ttttttttaa 4080

gaattttttt tgtgtgtgtg ccttgtcttt tagagatgga ccttttgtac ttttgatata 4140

ttaaacttag gctttcaaat agccatgaat caatattact tggttttgca tttttgtaag 4200

aaaggttttt ttgttgttgg aggtggtatt atctattttt atgaatatat attcttataa 4260

tatatatttt tctaaagaga taagtccttg tatttttggt tccataaaca gagaatacaa 4320

atttcaccta actgtcctgt tttcattcag ttgctttact tactagaggt tcagtttgta 4380

caagataaaa tcctttatcc tctttggaat ttaagctcta gttagggaga agagaaagta 4440

aacaaataac tatattgtat attgtcagct agtggtaagt gctaggagga aaaataagca 4500

gggaagagga taaataatga tagagaggtt tatactttag atgaggtcat taggaaagac 4560

ctctctgaaa ggctaatatt tgaacagaaa cttgaaggaa gtaagggagc aaaccatgag 4620

gttatctgtg tgaagagcac agaggctgga tagaacacaa gtacaaagca acttcaaatc 4680

tgtttctccg atttacaaac aagttagtga aaatgcttat aagtaaagct tatcttaaag 4740

cttgatagta taccacacag actttttttt gatgtcatga aagacccttg aaaattagca 4800

tgtatatgat aaaatttagt gttttgagga aatgatttat atgtggcaca tgtgcaaaaa 4860

tcatttcaaa tatagctata ttttgttttg tctcttctct ggactattta tttgagttag 4920

acatttttcc ctgttaggat tgggataatg taatataaga aatatggtgt aatgtatagg 4980

gcaagctcta aagattctat tttaacagaa gatatttttt cgttacttgc cttcagatac 5040

tattaaagga agatagattc ttatatgtag aaaacaagct tactaattaa gcatagcatt 5100

ggatactatc tcctgtgctg gcgtgaaaat tcacttgttt cttggtttgt ttcaagtgtg 5160

catatgtaga agatgaatgt atttatcact gaaggctcaa ataactaaca caatgaattt 5220

aataaaatgt ccaggttgtg gggggggtgg tgactatgca tctttgagag tgtatgtccc 5280

tatgtattac cagtgtatta actcagtaat aacagcatca gtgcagaaca ctccgggaat 5340

gtaagatgag aatataaagg gattgcagta ataagtgtaa tggtaggctt taatgtggag 5400

tcagccaaat acaatttgtt cagctttatt cctctggtat cctaaaaatt tcccgtaagt 5460

ttagtcaatg actgaaaatt gtcccatgcc ccataagata gaaatttttt ctactgccaa 5520

atgtcacata catggataga taatgactaa atataaatct aattatttta cctgttattt 5580

agtagtaagt aaaattaaac ctgttttttg aatgagtttg tagaggaaaa taaaacccca 5640

catgtaattc cagatggtat aattagttac atgactctag ttttttattt tgctatttta 5700

tatacaactt ctttatctca tttgtaccat cctcttctgt tatttttttt gatagaaacc 5760

agtttttttt ttcagaactg gataagatta atttttaata aaaactatgt aatcttgaat 5820

aaaatacact gtaatgttat tcttttggtt tatttctaat ccaaatagac tattatactg 5880

atattaaaca ttttcattaa aaaacataag cagaaaaata aaatctgaat ctttagaact 5940

ttattaaaat ggtgataaat ggaacaccta agtatttttt tcatatttag atacaaacac 6000

cacttgaaaa ctattttttc acttctagat ataattctct aaaatctgtg taagttgaca 6060

atttatacta gtaagtttta gcaataagcc ttattattcc atgaagtatt agatgagctt 6120

tgcttttcac ttcattctga aataatctac tgatttgtgg caaagcaaaa gagtggggga 6180

aattactcga gaaattctct atcaatgaag gtaaaatatc aaattagcca caacgtatgt 6240

gatttaaaaa atggtccatt gttgactcat aatgaactgc ttctttggaa acttaaatct 6300

ttggagggaa cctgcaacag gcagatctta gaacatttct gatattgaat agttgttgaa 6360

tgtttagtga aaaatactgt tttcttttta catagtgtat gcttgaattg catagaaagg 6420

gattcattat aaatgaaagt atcttaggca tagagaggat gtacagtata tatttctcat 6480

ttcatttggt aatagaaccc attctggtcc ttgacttagc taaattgatg gctgtgttta 6540

caggaattta tggaaaagta atattataag tctctcccag ttccagtgcc atcagatcac 6600

cattttgcag cccatatact taacttcctt taattggaaa gtaaatcctc caaagttaaa 6660

ccataatagg tgtaataata gattattatt aaggccctta gcttgtgctg taggtagtga 6720

cactggacct tttgtcacta tgcttttgtc tctgtgcttt tgtctccctg taacgctcat 6780

gtgaattcta aagttgctca aacaacaaga atttaaagat cagtattgaa atttttttca 6840

aagataggta tcaataaaca tacacttgaa aaatcttagt ttttctttga tctttgaatg 6900

tcctatctaa tgacttagat aatatggttg aaacttaaat ctttagattt ttcaaaatgc 6960

cttcttgtaa tggtcacaaa gaaaagcccc taaaattgtt tctgttctaa ctaataaaaa 7020

gaaataaaaa tgaatgttaa ttcaggcatg tttgtttaat ataccaaagg cctcttgctc 7080

cctctataga aggtgctgca aaattgcagt cacttagttt ttttgttttt tttttttcct 7140

tcctttttaa attgaacaga tttctcatga ggttcatgat gattaacaaa aagatttgga 7200

tccatgtgtg tattcccaat gccttgcaaa ctagttggtc gtcctaaagt gaatcaggat 7260

gagtttgtgc atttctgcct tggcattttt cattggcttc agccagggtt agattaaact 7320

ctggtagcaa cagttacgaa aaacattgtt tatgtttgcc catttgtttg ggtttgtttt 7380

atttggttta tttactctta tggataagtg aaatgcttaa tgtttttgat attaggtgat 7440

ggttttactc attttaattc tcttttattt agccagggaa tttaaaccat aaaaataatg 7500

tacttcaaag acttaaaaat aagttctctc attatctaca tctaatcatt ccattcattt 7560

ctagctctca gttgttggta ggaagaaaaa cctaacaact tcaactataa tttcacagga 7620

tagttaagtt ttacagaatt aaactggata tttttccaac tatagataat attcacagga 7680

gacaaaaagt ttgaccattc tataaagact tctttaatat ataaaacaac catgcttatt 7740

attgtagcat catattttac ccatttaatt taaattggaa caaaatatta atattttaat 7800

agatttggtt tgaataaatt tgtacatttt gtcttacaaa tccaacatct ttttatttta 7860

ttcgacaggt tactagtttt tcctattgtg ccatttaaaa ttgtgaggat gaaaattctt 7920

ttatcccatc aagggtctta acaaaagatt gaaaattgtt ttcatttgta tttgatataa 7980

gaacagcttc tctgatgata ccctgtaatt gaaaaatgaa cataagtgat aaagtagctt 8040

ctttgacttg aatatgtcac atcagacttg cctgttttga atattatgct taaactagat 8100

tggatttttt ttcccctggt aggtgtactg gtccgttagc aaattctctt tcagagaaaa 8160

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ccctgaattc acaaccatct cattgtcata atgtaaaacc tcctgttcgg taagagtatg 8280

ggcagatttt tgccacttac atctgcataa gcattatcat ttgtaatgtt tgtttttaaa 8340

caattgattc acgtctaatt aaaaatcctt aatttccagc tcaaatcctt ctcttcctat 8400

tataccattt ccagcattac ttttaaagaa aactaaaaga tgcagatttc tcattaatca 8460

ggaagtcact ttattttatc agttctaaac acctatctca tgaagaaaaa ttagtgctca 8520

gaaactaagg tattattctg accttcctta gaatttttct tcatgatgta catactagta 8580

taatttaaat tcattttcct tcttgatgta cttgctacct acttctattc agattttgaa 8640

gaagtgggaa aaaaatacca aggtgtttct cttaactttt tgtttttcta tcaagtgcta 8700

tttaccttcc tttagatcaa ataagaatgt gaggaatagg ccaggcgtgg tggctcacgc 8760

ctgtaatcct agcactttgg gaggctgagg cgggcagatc atgaggtcag gagtttgaaa 8820

ccagcctgac caacatggtg aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaat gagccgggtg 8880

tggtggtggg cgcctgtaat cccagctact caggaggctg aggcaggaga atcgcttgaa 8940

cccgggaggc ggaggttgca gtgagccgag attgtgccac tgcactccag cctgggtgac 9000

agagcgagac accatctcaa aaaaaaaaaa agaatgtgtg gaataatggg ggttttttcc 9060

ttacttttgt ggcttattct cacttacatg gggatagcct tggtctttga cttggaagct 9120

ccatcgaggt aaataagagt tattaataat gggttgtttg tattgaaata ttactttatc 9180

tttaagtaaa ggcatgagtc tgcatttata ttattgaatt tataaactga aatctattat 9240

ttctgggttt gtttgtttta cctgactgaa atatatgagg tactcagtac tcccagctac 9300

aaaacttact ttctgagttc tggtttcctt tgtataacat tcctggggcc atgcttggca 9360

catagaatag ggctcaagta ctgctggtgg ccctacattc cagcatctct ccatgactga 9420

ctgagggata ggggagatgg caattacttc agtcatctgt gccatcttta cttagtgtgc 9480

catttccttt tgaggtcaag tcaatcaact gaaaacattt tataagtaca gtgttccctt 9540

cttttccaat gaaaaactaa aaaatgtttt aatgtgtttc ttcaggcatc tcactgaggt 9600

aggaaatgca gcacttggaa agagaagcac attttcattt taagcagatg tctgtcttaa 9660

taagtgaccc tggttagaat tatcaacatt ctgctgaatt attacccaga attgttaata 9720

gtctacagcg caggacttta tttttttaaa agcaagaacc taaacactcc ttgctattgc 9780

tggtgtttag ataagacatc tgttgataaa atcatatcat tgagaagaca aagaaataac 9840

gaggagctaa ttttatgtat cagaagaacc aagtagctag tgatgtattt gagaacaaaa 9900

gatattcctt ctcatcaaat ataagttgtt acaattttcg gttctttggc tcttacaaat 9960

gtgcagtaat ttttaaaaac taaagtagga tgagcttttt ttggtctctt tgggagtctt 10020

attttttttc attgctggat aagtgaggag tataatttta atacgttaaa ttttaattgt 10080

tacatcatat tggatgtgat tttttgtggc agagctccca aatcttgaaa ataaatttga 10140

attataacca tcattaccat ttttctattg ttacagaaaa gtaataaacg ttgataatcc 10200

ctaaatgtaa ttggagtgaa ttctttatct aatttgttct tgaaagctga tggatgaagt 10260

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tttttccccc tttggaacat caggagaagt gaattgtcaa tatgtagaaa aagtgaccca 10380

gtaaatgagt aattcaattt aatttcagta aaaatccatc attattatga agattcaata 10440

catgataact atttttaaat gaactatatc tggcccctta aagagaagtg gccaccagag 10500

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tccattacat acgcactttt actttgctct aaaaattcag agtaaatcag agaaaagtaa 10620

aatgtaaact ctgatttcta tagctctttg tcagttgatt gttatagagc tatatgctga 10680

aggcaaaata tgctccttat cttctcttcc tgctgctatc ttcccatggc tcaattttaa 10740

ccattgtgtt catagtatga ttccgaagaa ttaataccaa taatttggct gggttcggtg 10800

gctcatgcct gttatcccag cactttggga gggtgaggta ggcagatcac ttgcggccag 10860

gagtttgaga ccagcctggg caacatggca aaaccctact aaaaaataaa aaaaattggc 10920

tgggcgtggt ggtgcacgct tgtaatccca gctacttggg aggctaaggc atgggaattg 10980

cttgaacctg gtaggcggag gttgcggtga gccaagatca tgccactgca ctccagcctt 11040

tgcaacacac agatacacac acaacaaaac aaaaaaagcc ccaacaactc aagcatactt 11100

ttctggtaag tagtaccctt tacaaacaca ttaaaaactg tacttgtcgt gtacccaagg 11160

cctttgctaa agtcattttc tgtagtgtca gagggccaga attttgttct tggcagtggt 11220

gaaatagtac cacaggctct agttctttga atgttcctgt cagaattgta atggaattat 11280

tgaaagttca ataatttttc ttcttttatg tgctgtagct tatttttatt acaaggaaat 11340

tttaagttac agaagcaaaa atatgatatt aaatactatc aacaaataat aaagtcattg 11400

agactgctat atgtttttgc cttggcacat acatcttttt ttacttcaaa aacttgacca 11460

ggttctattg aattcttcca cagagataag ttaattttac atagtgttta ggatatcaac 11520

aatttttgtg gcccttgtaa ttcttggtta tagtttaaaa aaagagagac tgtgttactt 11580

gagatattta cttctacatt ttaaaataag ggatgagtat cttgatgtta ttactggtaa 11640

ttttgagaaa agaaaaatat atgttcaaac tttattaaat aaacaggaat actagttccc 11700

tctacctctc aagttacttt taattggaaa gtattctcct tatataattt tactctgaac 11760

tgtcctttag gtcttgtgat aatggtcact gtatgctgaa tggaacacat ggtccatctt 11820

cagagaagaa atcaaacatc cctgacttaa gcatatattt aaagggtacg tatagaatat 11880

aatttccttt gtgatgtaca tcttaatggt cagaatttaa aggcaaaatt tcatgccatt 11940

gtactgaaaa tacattaagg ttttgtgtta tcctctagga gatgtttttg attcagcctc 12000

tgatcccgtg ccattaccac ctgccaggcc tccaactcgg gacaatccaa agcatggttc 12060

ttcactcaac aggacgccct ctgattatga tcttctcatc cctccattag gttgaaacct 12120

ttaaaaaagt tttgaacaac ccacccctcc ttcttttaat ttcagaattt tcagaattca 12180

gagttcagta taacacagac tcactgggtt gtgaatttgc ctgaaatttg aatgggttct 12240

ccaggtgccg gtgactccca agttcacgag accattactc catgtagatg attaaggtag 12300

tagtgtagta gttgggcatc agtcaggttt taagcaagtt gttttgtcca tactaaatgt 12360

agtctaaaaa cacatgagag ctttgtgctc tagtagtttt gaagtgatga cttgaagtgt 12420

tgagattttc tttaagtata ataattctta ataaatatga acttgctttt cttgcagcat 12480

gagcaccagt tccacttacg ctaattaaat tatgcaaaat taaatagttg tatgtagaga 12540

actgataata aattctgttt tattctaatc attacaactg taacacattc aaaaaaatct 12600

caatttcctt gtttcaaatt ataataatga agaaacatcc tatgtgtatt tttgtttgta 12660

tccacaggtg aaggtatatg taggtgtgtg tatatgttga agttggctgg tgccactgtc 12720

actgttaatt tcattaattc taattaggaa gcatctcacc ctgtttttag aagacagaat 12780

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gatgaaagtc aatttacaag cttttctgaa ctggctgtta ggccaccaga aatacgaaat 12900

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atcttttgct cctgttctct ctgtagttca ggactttatt ctcacctaca tcaattacaa 13020

aaggctccta actctgttac ctacagtctt tctctccctt ccacttcttc ctgcacactt 13080

gtttttgaca tattacccag atcttcatca cctggataag cattgttcaa taaagctttc 13140

tgtggtgatg taaaggatct gtatatttgc atatgggtta agtgtgatta tggaactgac 13200

ttttcattaa atttaaatag ctaaatgtgg atgggtgact actttatatg acaaagtaga 13260

cagattttcc aacctgtctt tttaccttga cctttttcta ggtcttctta tgcgtgtcat 13320

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tttttgagcc ttctgatatc ccaggacttc ctgttcttca acacttcact gaataccact 13440

tgtctacatt tctctttcct catccaatgc atatgtctct tttatgggac caataaaaca 13500

ctttcacttg taaatcatac ctatttgtga gctttttttt aagctccttt catggaatct 13560

cagctccttg agtcagagcc ttataatttt gattttcata tcatgcatga gcctggccca 13620

gtgtcagatg tttaagggct gaaaaaagat ttgaataaat atgataatgt aggaaatagc 13680

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aatatgatta aagaaattag tgtgccaatt ttttctaaag caagttcagt aaatagtaat 13800

atcttttttt ttttttgaga cagtctttct ctgtcaccag gctggagtgc aatggcacga 13860

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gagtagccag gattacagtc acgtaccacc atgcccggct aattttttgt attttagcag 13980

acatggggtt tcaccatgtt ggccaggatg gtctagatct cctgacctca tgatccaccc 14040

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tctttaaata tgccattatg tttaaatcat tcaacttaaa agtgtgaatt tttattatta 14160

gaatatgtgt ttatgtatac cctgtctcat tcctaaagta ttttgagata gcttaccaaa 14220

catgtgcttt tttttttttt tttttttttt ttaaagactc aaggtaatga aaactatgag 14280

tagaatagta aggtgtgaca ggggacaaat aagtagatat aaaactatgc tgcaatattc 14340

tagttattaa agctgggaaa tatgcaaatg taagtagtgc ttggaaccag agaaggttct 14400

atatttagct gttcttctgt agctaaatct gacaaattga aaaatatcat attctctgct 14460

ctaggtacat tttatgtata ttttgacagc atatcaaata tatgaaacat taggttaaat 14520

aaattaaaat ccagtggaat aaactatatg ggataatcta aactattctt tgacattaaa 14580

ttatatgtat ttgaggtgat tttccagtta aaggctgtga actctttttg ctacacagaa 14640

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attattactt ttgttagatg ctgtgtattt tgattaatga agttctgctg ctgatatcga 15000

cctttcttta aatgcaggtg aagatgcttt tgatgccctc cctccatctc tcccacctcc 15060

cccacctcct gcaaggcata gtctcattga acattcaaaa cctcctggct ccagtagccg 15120

gccatcctca ggacaggatc tttttcttct tccttcaggt aggagggaaa agccaaagaa 15180

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tcattagtct ctacctccct agcagaacag aaaaatccct gggtggtaaa agtagcaatc 15300

gtgggtacgt ttgtttgtca gttgattggt ttaatgccaa cataattaca gagatggaaa 15360

gagcaataag gaactacagt agaaatgatg ctgtagagat tgtccagtcc agaaacctcc 15420

ttatgttaca aatgcaaccc tgagaaccag aactgctaag gggttaggct aatagtaatg 15480

ggaacaatat ttagactttg tcttccgatt cccaatgcaa tgttttttaa taggttttta 15540

aaattttact agatatgcct tagtgtcata attttgttca aaacataaga ttttggtaaa 15600

ttatgttgtt ataacaagaa tagagaagtt tttctgaaat agctgcattt tattgttttg 15660

ttgtgatatt tttaatgcct cagtgtgtat ctactcacta attattggta ttctaaggaa 15720

aactaatttt ttcttagtaa ctatttaata ttattattta catatgtata tattatataa 15780

tattatttgt ttaatattag taaactaatt ttttatatta gtatatttta aaatttcaaa 15840

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caggaaaaag aaaaaaaaat gttatatgga atctgctgat actaattaac agttccagtc 15960

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gagaatcttt attcccaact gattccctta tcagcttcct cagttgatta ttagtcatgt 16200

ctaccattag tttttcttag tttttttttt ttttttttac ttggtttgat agtttagaaa 16260

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caatttctta aagtggttta tttttcaaga ataatcttct gcttttacat cagtaaatat 16380

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atgagtttac tggattctgc caatgaaagc actagtgtca taatccattc cggtccaagc 16500

aggaagtata gtgtatgagt ccgttttcac actgccataa aagcactacc caagactagg 16560

taatttgtaa agaaaagggg tttcattgct tcacagttct gcatgcctgg ggaggcctca 16620

gaaaacatac aatcatggca gaggtgaagg ggaaccaggg catgtcttac atggcagcag 16680

gtgccagaga gagtgagcaa gcagggaaaa tgccagacat ttatcaaaaa ccagatctca 16740

tgagcactca ctatcatgag aacagcatgg gggaaccacc cccatgatcc agtcatctcc 16800

catcagttcc ctccctaaca cgtggggatt acaactcaaa atgaaatttg agtggggaca 16860

cagagccaaa ccatatcata actgcttggg cttttattca tatagttagt tacatgtaaa 16920

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taataaaaga gaacatttta cacaaataca cacttttacc tgtttttgtc aaaagaattg 17220

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attaatagat ggacatattc taattctctt cccaataata tcaacatccc ttataataag 17580

tatttcttaa aaaaaaaaaa aggcaacttt tttgtttcct tttccagtct ttcataatca 17640

tttacatgac agatttctag tctggtacca gatcctttat gacttttttt tttttttttt 17700

ttttgagaca gggtctcact ctgttgccca ggctggagta cagtggtgcg atctcagttc 17760

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gctgataaat gagcatttga gtattgtttt gcaaagtatt taatacatta tactgtctaa 18180

agaaatgtaa aagattcatt atagcagttc tccctaagaa ttgactttat taagaatatg 18240

ctataaatgc taaagtttaa ctcagtagtt ttagaattat aaaaggtaaa taaaagggac 18300

tgcaaaattt aaacaaactc tgtgagcatt ttaccgttgt tttcgttgtt cagtctgtaa 18360

aatcttagtc tggtgtaatg atacatcttt tctaaacatt attgagattt ggtttcctga 18420

ggaaataatt atttctaatt aaagacaaat gataggtgtc ttaggaagag aggttgaatt 18480

ttctcatgat attatactaa gtacctaatc aagcctacat ttttattcca gcattcagtg 18540

ccctgcacag ttgggccagg ttcagctttt cagccttata gctcattgac ttctatatag 18600

tagtgattgt caaattgcag tgtcctatgt ctctgcaaaa gtgcctcagt actgttgtag 18660

gatcaagggg gcagggcaag cagaggcagg gctctcattc ttcttttatc tcttttctat 18720

tttaggcctt catgtaagat ttcttttggc agaatagtaa tgcctacagc tgtacatgag 18780

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ttacactctt ttgtctccaa tcccaaggct accactagtg tatatgtgct tttttccata 18900

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taactaggtg tctttgtgca gtgcacaaaa tacagtgttt ttgtcagtct ttatgctacc 19080

tttattttgc tgtttctcta acctgtaatc tcacttgaag atcttatcta atcttaaagt 19140

cacagttcaa ctctgaaagc tagccaaatt gactttatta aagataaatg gaagttttat 19200

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acaattgttg aaaaggtttt aggggttttg ttgactacaa tctttataaa gcatcatcat 19320

gatgagaaag cgcatgccat ttggggcttg aactcacaga attcaaatct gaggagtgaa 19380

gtcctccaca gtactcagcc tttgtggaga ccactgtgtt cagatgttga agcattaatg 19440

ggctagagca gcaattctca aattgtgttc tccggattca caacattagc atctcctggg 19500

gatttgcttt aaaatgaaaa ttcaagactt aataaatcag aaaccctggg aatgggactc 19560

agtggtcaca agccttcctg gtgattctga tgcatgttca agtttgaaat atactgggct 19620

ggggtattct caaaaaagtg caaccaggat gataaagtaa actagagtgg attaaaggaa 19680

ctgagaattg gctcagagaa gagaagacct tggatgtaga cgagagttgt cttcagttac 19740

agtatttggg aaagaaggat tatatttttt ccatgtcact tcagaaggta ggagtaagat 19800

caatgggaaa tgttaagaat gaaaattgca ttcatcctac aaagaagttt cctaaatcat 19860

tacgaattgt tctaccttga gtgtagtgag ttatctgaca ctggaggatt taaaccaatg 19920

gtagatcatt acatagtaga gatatgaaca tgagctaaag catgagggca gcaaagaggg 19980

gagaactttg tttcacctaa atggctcttc aaaccttttt tagcattagt ttctgctttg 20040

atatactcta ttaaaatttg ggggataatt gataaatctt ccaggtggtt tatggatggc 20100

cagggaggaa atttgccatt gttttaatta tttaatttta tttgcctctg tttttacact 20160

tggtaaaaat ttggaagtgt ttcagatagt gaagaaaaaa aagaattaag aaaaacattc 20220

caggccaggt acaggctcat gcctgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcaggcata 20280

tttcttgagc tcaggaattt gacaccagcc tggccaacat ggtgaaactc cagctctaca 20340

aaaatacaaa aattagccgg gtgttggtgg ctcgcgcctg tagtctcagc tacttgggag 20400

gccaaggcaa gagaatggct tgtgcccggg aggcagaggt tgcagtgagt caagattgaa 20460

ccactccact ccagcctggg tgacagaaca agacgctctc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20520

atccatactt cctcctccta atcattgata ggtatccttc cttttttttt gttgtttttt 20580

tgtttagttt tgttttgttt tttgcctacg agtatgtaag ttcacattta tgtaaaattt 20640

atttctcata gtatatgcta tttataacca ttttccagtt aatatgtcat gagcaatgta 20700

tatagttgtt aaatatttgt acacaatata atttttattg atgtatattt cctcatttct 20760

tttttaagta gcaaaccatt tcctcccagt cttcccttag ttttttataa tctctcaaat 20820

aagtactaaa ttttcagttt tgcagtgctg tactataaat cacaggcagt agtactttgc 20880

tttttacaac agattagtct ctgtatgtgt atccatttat ttctcaaaca cttatataag 20940

tgataaattg gctgtgatca tttcagtttg ttttaatcct gtggatataa tatttttctt 21000

tagtttttga agaatttatt ttagaaaagc tttattactt tacaaagttt tcttatcagg 21060

ggacaattgg taattattat actctgtgta gcaattgtgt tatatctaat ctctttccct 21120

ttaaagcctg aatgcttcca actttataat ttgctttaga gagcccagtt taccctatgg 21180

ctgacaaata gcaaacttag gatatgatgc aagatagaac atgataatga ttcaaaacag 21240

aaccataagc aggtattttt gctatttata ataatatttt gagtgtatct agtacctttt 21300

aaataatata gtttaatgga agaatatagt acagtggtat attttatagt ctatgtatgg 21360

ctctgaagtg tatccagagt ttacttttta accttaaata aatagatgat tagaaatagc 21420

attaagtgta tttgacaaac ctataaattt cccgtaaaga aataagcaag tgtatgtatt 21480

gtaaaagaca gtctttcctc tgacttaatg ttgtatcagg ggcatttaga gtctacaaga 21540

acctaaagta aattttatga aatatctagt gcaaaatctt tgggaaattt caaaatttat 21600

gctgaaatca ccatatttgt ttcctttggt ttctctaaca aaccaaaaga tcaacattgt 21660

ctcatgcgat ttatcttctc attccttcct aaaaatattt ctggaaaatt aatggagctg 21720

gaccaccaat tcttcaaata ttgaaaactc aaaatctaag agttatttta atcttgaaat 21780

taatgaaaac aagttaaaga gccttgtcta agtcaaaaag tcctcagcaa agctggtgat 21840

aattattata ctccaaaaaa ggtgaaaaga taatggcttc aaatcctgcc ttacattatc 21900

cagtcaaaaa ctaatataaa aatagtcaat atttaagcct atgttttcat cgtaagtaat 21960

caaatactta catattatta atgtctaagg gagtggaagt taaaacaatg aaattcaatc 22020

gggtcttctt taatatttac aatttttgct ttacattagc aattcaggtt tcactgattt 22080

taaaattgtg aacaatctga atttgtgtgg atttatttgt ggtagttaaa agtaaatatt 22140

aagtgcaagc tatttgccaa gagtgttcta ggtgctatgt ttgatttagg aggtataatt 22200

caaacatgag aagtaggaaa agatccctca gatccctgtc ctcagaagaa ttgacggtac 22260

tttcagagat atcgacaaca taaaagtact atgagaggaa agcagcggtg cctgaggtgg 22320

gagtgatagc tagataaatt attagtgaac caaggttttc agatgtaatg tttgtctact 22380

caaaaaggga atcaattctc taagaattta aacccatata atactatgaa tgttaaacca 22440

gttgggttta tggtattaat gatttaatac agcaacactg acaaaatctc tttttctccc 22500

tttagttcca gttagtaaat atcatatttt ttactatttc agatgccccg tctctgactg 22560

ccaaggtggt aaattatcac attttactgt atattcaaat gttaattact aaatggcata 22620

attttaacaa ttaaatttac tattttgtga gccaactaac aacaatgatg ttaagcatag 22680

gatgcccaat ataataataa gcaccttgta tgtacagaag attttacatg cacaaattca 22740

tttaatccac acaaatccga agtttcaggt ctgttttaca aattttgtat gcccaatgct 22800

tagagagatc aagtaatttg ataatactct tatagggagg atccaaaccc atggttttat 22860

gtatatttgt ttgtttgttt tttgctttta ctttagaaca gtttctatac attgtacagg 22920

ttggattggg acagaaaata aaatttagaa gctgttttta ttgtcaacaa tcttataatt 22980

aaatatatct gcaaaatata aatataaaac aagtagtctt tattatctgg aaataaatgt 23040

gaagagcata tttaagcaag tgatgaataa attagaaaat atgcaggcag taaaaaatgg 23100

ttaatatcag tcatgaattt aattttctaa tttatttttg aaagccataa tcttcataaa 23160

ataattctag aatttttttc ttcagccaat caacagagat catcctttta atttgaaact 23220

tgtttttatt tttaagatcc ctttgttgat ctagcaagtg gccaagttcc tttgcctcct 23280

gctagaaggt taccaggtga aaatgtcaaa actaacagaa catcacagga ctatgatcag 23340

cttccttcat gttcag 23356

<210> 4

<211> 730

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcttttcca atggtcacct tggaagtgaa gaatatgatg ttcctccccg gctttctcct 60

cctcctccag ttaccaccct cctccctagc ataaagtgta ctggtccgtt agcaaattct 120

ctttcagaga aaacaagaga cccagtagag gaagatgatg atgaatacaa gattccttca 180

tcccaccctg tttccctgaa ttcacaacca tctcattgtc ataatgtaaa acctcctgtt 240

cggtcttgtg ataatggtca ctgtatgctg aatggaacac atggtccatc ttcagagaag 300

aaatcaaaca tccctgactt aagcatatat ttaaagggag atgtttttga ttcagcctct 360

gatcccgtgc cattaccacc tgccaggcct ccaactcggg acaatccaaa gcatggttct 420

tcactcaaca ggacgccctc tgattatgat cttctcatcc ctccattagg tgaagatgct 480

tttgatgccc tccctccatc tctcccacct cccccacctc ctgcaaggca tagtctcatt 540

gaacattcaa aacctcctgg ctccagtagc cggccatcct caggacagga tctttttctt 600

cttccttcag atccctttgt tgatctagca agtggccaag ttcctttgcc tcctgctaga 660

aggttaccag gtgaaaatgt caaaactaac agaacatcac aggactatga tcagcttcct 720

tcatgttcag 730

Claims (5)

1.一种检测hsa_circ_0066715基因表达量的试剂在制备类风湿关节炎检测试剂中的应用，其特征在于，所述检测hsa_circ_0066715基因表达量的试剂包括核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测hsa_circ_0066715基因表达量的试剂进一步包括：5uL 2×SYBR Green mixture、1uL Forward primer(10uM)、1uL Reverseprimer(10uM)、浓度为2.5ng/μl的cDNA 1uL、浓度均为10umol/L的SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2各1μl、RNase Free water2uL。

3.一种hsa_circ_0066715基因的检测方法，其特征在于，包括类风湿关节炎RA外周血单个核细胞提取、TRIzol法提取总RNA、RNA浓度和纯度的测定、cDNA合成及PCR扩增。

4.一种hsa_circ_0066715基因在制备类风湿关节炎RA靶向治疗试剂中的应用，其特征在于，根据hsa_circ_0066715基因制备特异性过表达序列和RAN全序列SEQ ID NO.3，用于在滑膜成纤维细胞中过表达hsa_circ_0066715基因。

5.一种类风湿关节炎RA诊断试剂，其特征在于，所述试剂包括特异性过表达序列pcDNA3.1-hsa_circ_0066715，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，用于感染滑膜成纤维细胞，使hsa_circ_0066715基因在细胞中过表达。

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