CN101622361A - 用于心律不齐的风险管理的遗传标记物 - Google Patents

Abstract

发明涉及通过评估被发现与心房纤颤、心房扑动和中风有关的多态性标记物的等位基因的存在或不存在，来确定对心律不齐、包括心房纤颤、心房扑动和中风的易感性的过程和方法。本发明还涉及了含有用于评估这些标记物的试剂的试剂盒，以及诊断方法、应用、和使用这些易感性标记物的过程。

Description

用于心律不齐的风险管理的遗传标记物

发明背景

心律不齐是一类医学病症，其中心脏的电活动不规律，或与正常相比更快或更慢。某些心律不齐是危及生命的，可以引起心脏停止或突然死亡。其它的会引起或倾向于引起其它恶化的症状或疾病，包括中风。纤颤是一种严重形式的心律不齐，其中由于收缩性细胞的功能缺乏统一性而使心肌出现不规则的或振颤运动。纤颤可以影响心房(心房纤颤(AF)或心房扑动(AFl))或心室(心室纤颤(VF))。

心房纤颤(AF)是涉及两个小的、位于上部的心脏腔室(心房)的异常的心脏节律(心律不齐)。正常心脏中的心跳，在窦房结在心房中产生的电通过心脏传播、并引起心肌收缩和泵出血液之后开始。在AF中，窦房结的有规律的电脉冲被混乱的、快速的电脉冲所代替，导致了不规则的心跳。

心房纤颤是最常见心律不齐。发生心房纤颤的风险随着年龄而增加——AF在80岁时影响4％的个体。个体可以在AF和正常节律之间自发轮换(突发性心房纤颤)，或者可能持续地以AF作为主要心脏节律而不返回正常节律(慢性心房纤颤)。心房纤颤通常是无症状的，但是可能导致心悸、昏厥、胸痛或甚至心力衰竭的症状。当心房纤颤导致心率太快或太慢时，这些症状特别常见。此外，心房的不稳定运动导致血流淤积(停滞)，增加了从心脏向脑部和其它区域移动的血液凝块的风险。因此，AF是心房纤颤的最可怕的并发症——中风的重要风险因素。

心房纤颤的症状可以用减慢心率的药物进行治疗。几种药物以及心脏电复律可用于将AF转变为正常心脏节律。外科和基于支架的疗法也可用于在某些个体中预防心房纤颤。患有AF的人通常被给药血液稀释剂例如华法林，以保护它们免于中风。

任何具有两次或以上被鉴定的心房纤颤的突然的患者，被说成是具有复发的心房纤颤。根据发病何时不经过治疗就结束，而将它进一步分类为突发性的和持久性的。当心房纤颤在7天内自发终止时，最普遍在24小时内自发终止，它被说成是突发性的。持久性的或慢性的心房纤颤是发病超过7天的AF。突发性与慢性或已确立的AF的区分是基于AF的复发史和目前发作的时间长度(Levy S.，J CardiovascElectrophysiol.8 Suppl，S78-82(1998))。

孤立性心房纤颤(LAF)被定义为不存在心肺疾病的临床或超声心动图发现的情况下的心房纤颤。

心房纤颤通常伴有与心率快或栓塞有关的症状。快速的、不规则的心率可能被感受为心悸、运动不耐，并有时产生呼吸短促的心绞痛和充血症状或浮肿。有时，心律不齐伴随着中风发作或短暂性缺血性发作(TIA)而被鉴定。在常规的身体检查或心电图(ECG/EKG)上检测到心房纤颤是不常见的，因为在某些病例中它可能是无症状的。突发性心房纤颤是短暂发生的心律不齐，因此难以诊断。突然发作可能发生在睡眠或运动时，它们的突然发作的本质可能需要长时间的ECG监测(例如Holter监测器)来进行诊断。

当怀疑心跳不规律时，可以在常用的诊断方法——心电图上诊断心房纤颤。特征性的发现包括缺少P波，在其位置中的混乱的电活性，以及由于脉冲向心室的不规则传导导致的R-R间期的不规律性。如果怀疑是突发性AF，可以使用Holter监测来记录突然发作(连续进行ECG记录24小时或以上)。

尽管许多AF病例没有确定的原因，但它可能是各种其它问题的结果(参见下文)。因此，对肾功能和电解质，以及促甲状腺激素和血液计数进行了例行测定。通常也进行胸部X-射线检查。在伴有胸痛的急性发作的AF中，可以进行心脏肌钙蛋白或其它损伤心肌的标记物的检测。通常还进行凝结研究(INR/aPTT)，因为可能进行抗凝结药物治疗。经食道的超声心动图可以有助于鉴定任何心脏内血栓(FusterV.，等，Circulation.；104，2118-2150(2001))。

心房扑动(AFl)的特征为心房中的异常快速心脏节律。出现心房扑动的患者同样也经历心房纤颤，反之亦然(Waldo，A.，ProgrCardiovasc Disease，48：41-56(2005))。因此，机械上或生物学上，AF和AFl可能是高度相关的。

AF(和AFl)与几种心脏原因相关，但是在可能发生在正常心脏中。已知的关联包括：高血压、二尖瓣狭窄(例如由风湿性心脏病或二尖瓣脱垂引起)、二尖瓣回流、心脏外科手术、冠状动脉病、肥厚型心肌病、过量饮酒(“狂饮”或“假期心脏”)、甲状腺机能亢进、迷走神经过度刺激、通常由于过量进食(“暴食”)、肺病(例如肺炎、肺癌、肺栓塞、肉状瘤病)、心包炎、极度情感混乱和先天性心脏病。

心脏的正常电传导系统允许由心脏窦房结(SA结)产生的脉冲传播到并刺激心肌(心脏的肌肉)。当心肌受到刺激时，它收缩。正是对心肌的有序刺激使得心脏有效地收缩，从而将血液泵到身体中。在心房纤颤中，由窦房结产生的提供心脏有节律的收缩的规则的脉冲，被心房组织的较大区域产生的快速的随机产生的放电所淹没。心房中有组织的电脉冲产生心房收缩；缺少这样的脉冲，正如在心房纤颤中那样，导致血流停滞、特别是在心房附属部分中，并容易发生血液凝结。从心房中中移出凝块将引起栓塞，产生的损伤取决于血液循环将它带到何处。栓塞到达脑部产生心房纤颤的最可怕的并发症——中风，而栓塞也可能驻留在肠系膜循环(为腹部器官供血的循环)或指头中，产生器官特异性损伤。

心房纤颤的治疗针对两个主要目标：(i)防止暂时循环不稳定；(ii)防止中风。实现前者的最常用方法包括心率和节律控制，而抗血凝通常是后者所需要的方法(Prystowsky E.N.，Am J Cardiol.；85，3D-11D(2000)；van Walraven C，等，Jama.288，2441-2448(2002))。心率控制、即将心率降低到正常水平的常用方法，包括β阻断剂(美托洛尔)、强心苷(例如地高辛)和钙通道阻断剂(例如维拉帕米)。所有这些药物通过减缓脉搏从心房的产生以及从心房向心室的传导来发挥作用。其它常用的药物包括奎尼丁、氟卡尼、普罗帕酮、丙吡胺(disopyramide)、索他洛尔和胺碘酮。节律控制可以通过心脏电复律、即通过施加DC电击，或通过心脏化学复律，使用药物例如胺碘酮、普罗帕酮和氟卡尼来实现。

用于中风的预防性措施包括抗凝血剂。代表性的抗凝血药剂的例子是达肝素(例如法安明)、达那肝素(例如Orgaran)、依诺肝素(例如Lovenox)、肝素(各种不同的)、Tinzaparin(例如Innohep)、华法林(例如Coumadin)。某些患有孤立性心房纤颤的患者有时用阿司匹林或氯吡格雷进行治疗。有证据表明，阿司匹林和氯吡格雷当一起使用时是有效的，但组合的效能仍然低于华法林(Connolly S.等，Lancet.；367，1903-1912(2006))(2)。新的抗凝剂希美加曲(ximelagatran)已经被显示与华法林具有同等的预防中风的效能，没有与华法林相关的困难的监测过程，并可能具有较少的不利的出血现象。不幸的是，ximegalatran和其它类似的抗血凝药物(通常被称为凝血酶直接抑制剂)还没有被广泛批准。

确定谁应该和不应该接受华法林的抗血凝治疗，不是直截了当的。CHADS2分值是用于确定中风风险(以及因此谁应该进行抗血凝治疗)的最好的被批准的方法。UK NICE准则代替了使用算法的选择。存在的问题是如果患者的年中风风险低于2％，那么与使用华法林有关的风险将超过患中风的风险(Gage B.F.等，Stroke 29，1083-1091(1998))。

心房纤颤有时可以通过治疗来控制。但是，心房纤颤的自然趋势是变成慢性病症。慢性AF导致增加的死亡风险。患有心房纤颤的患者具有明显增加的中风的机会。

心房纤颤常见于老年人。在发达国家，由于老年个体的比例不断增加，在下一个50年中，患有心房纤颤的患者的数量可能增加(Go A.S.等，Jama.，285，2370-2375(2001))(3)。在Framingham研究中，在40岁及以上年龄的男性和女性中，在一生中发生AF的风险是四分之一。在一生中AF的风险是高的(六分之一)。根据国家医院出院调查(1996年到2001年)关于包含AF作为主要出院诊断的病例的数据，发现45％的患者是男性，男性的平均年龄为66.8岁，女性为74.6岁。入院的种族分类被发现是71.2％的白人，5.6％的黑人，2％的其它种族，以及20％未明。此外，非洲裔美国人患者的平均年龄比其它种族更年青。在男性中的发病率范围从年龄为15-44岁的患者的每年每十万人中20.58人，到85岁及以上年龄的患者的每年每十万人中1203人。从1996-2001年，以AF作为首要列明的诊断的住院治疗人数，增加了34％。

中风是常见的严重疾病。在美国，每年有超过600,000人遭受中风，有超过160,000人死于与中风相关的原因(Sacco，R.L.等，Stroke 28，1507-17(1997))。此外，在美国，每年有超过300,000人出现暂时性缺血性发作，这是一种温和形式的中风。在西方国家，中风是严重丧失劳动能力的主导原因，以及死亡的第三主导原因(Bonita，R.，Lancet339，342-4(1992))。超过40岁的人在生命期中中风的风险超过10％。

中风的临床表现型是复杂的，但是可以宽泛地分成缺血性(占80-90％)和出血性中风(10-20％)(Caplan，L.R.Caplan′s Stroke：AClinical Approach，《Caplan中风：临床方法》，1-556(Butterworth-Heinemann，2000))。缺血性中风被进一步细分成大血管阻塞性疾病(在本文中称为颈动脉中风)，它通常由于颈总动脉和颈内动脉的动脉粥样硬化引起，以及小血管阻塞性疾病，它被认为是脑中的小的末端动脉的非动脉粥样硬化狭窄，以及由通常在心房纤颤或缺血性(动脉粥样硬化)心脏病的背景下从心脏产生的血液凝块造成的心源性中风(Adams，H.P.，Jr.等，Stroke 24，35-41(1993))。因此，看来中风不是一种疾病，而是反映出不同病源性机制的疾病的异源组(Alberts，MJ.Genetics of Cerebrovascular Disease《脑血管疾病的遗传学》，386(Futura Publishing Company，Inc.，New York，1999)；Hassan，A.& Markus，H.S.Brain 123，1784-812(2000))。但是，所有形式的中风具有共同的风险因子，例如高血压、糖尿病、高血脂和吸烟(Sacco，R.L.等，Stroke 28，1507-17(1997)；Leys，D.等，J.Neurol.249，507-17(2002))。中风的家族史也是一个独立的风险因子，表明存在可以与环境因子相互作用的遗传因子(Hassan，A.& Markus，H.S.Brain 123，1784-812(2000)；Brass，L.M.& Alberts，MJ.Baillieres Clin.Neurol.4，221-45(1995))。

常见形式的中风的遗传决定因素仍然大部分未知的。有特定基因中的突变可以引起罕见的孟德尔形式的中风的例子，例如CADASIL(伴皮质下梗塞和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病)中的Notch3基因(Tournier-Lasserve，E.等，Nat.Genet.3，256-9(1993)；Joutel，A.等，Nature 383，707-10(1996))、冰岛型遗传性伴淀粉样病变的脑出血中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Palsdottir，A.等，Lancet 2，603-4(1988))、荷兰型遗传性脑出血中的APP(Levy，E.等，Science 248，1124-6(1990))和遗传性海绵状血管瘤患者中的KRIT1基因(Gunel，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，6620-4(1995)；Sahoo，T.等，Hum.Mol.Genet.8，2325-33(1999))。这些罕见形式的中风中没有一种发生在动脉粥样硬化的背景下，因此，相应的基因不可能在更通常伴随动脉粥样硬化发生的常见形式的中风中发挥作用。

对于卫生护理系统来说，非常重要的是开发预防中风的策略。一旦中风发生之后，在受中风影响的血管所供应的脑部的大部分区域中将发生不可逆的细胞死亡。不幸的是，死亡的神经元不能够复活或用干细胞群体代替。因此，需要一开始就防止中风发生。尽管我们已经知道了某些增加中风风险的风险因子(上面列出的)，但对于确定参与中风的遗传因子以便更精确地确定中风的风险，仍存在有尚未满足的医学需求。此外，如果易感性等位基因在普通人群中是常见的，根据它们的存在预测疾病的特异性低的话，则为了对疾病状态的易感性进行有意义的预测，还需要其它的位点、例如保护性位点。对用于预防第一次中风或在以前发生过中风或暂时性缺血性发作的个体中预防再次中风的治疗性药剂，也存在着极大的需求。

AF是中风的独立的风险因子，使风险增加大约5倍。可归因于AF的中风风险随年龄而增加。AF对所有中风中的大约15-20％负责。AF也是中风复发和中风严重性的独立风险因子。最近的报告显示，患有AF并且没有用抗凝血剂治疗的人，复发中风的风险增加了2.1倍，复发严重中风的风险增加了2.4倍。已报道，患有由AF引起的中风的人与患有其它原因引起的中风的人相比，卧床不起的可能性是2.23倍。

对于导致对AF和中风的增加的倾向性的易感性因子的理解，存在着需求。AF的风险变体的鉴定，可用于例如评估哪个个体对于AF和随后的中风有特别高的风险。此外，可以对患有AF的个体或AF和/或中风的风险易感性变体的携带者进行预防性治疗。最后，AF和/或中风的风险变体的鉴定，可以导致药物疗法的新的靶的鉴定，以及新的治疗性措施的开发。

发明简述

本发明涉及发现了某些遗传标记物显示出与心律不齐、特别是心房纤颤和心房扑动以及中风是相关联的。该发现可用于本文描述的各种方法、步骤、装置、介质和试剂盒中，涉及了诊断和/或确定易感性的方法和步骤、对相关变体进行基因分型的方法、预测对治疗型药剂的反应的方法、预测预后的方法、监测治疗的进展的方法、以及在这些方法中使用的系统和试剂盒。

本发明的一个方面，涉及了在人类个体中确定对心律不齐或中风的易感性的方法，方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表5中显示的多态性标记物、以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个等位基因的存在或不存在的确定，是个体中对心律不齐或中风易感性的指示。在一个实施方案中，至少一个多态性标记物位于LD区块C04中，显示在本文的SEQ ID NO：50中。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。在一个实施方案中，至少一个标记物选自标记物rs2220427(SEQ ID NO：1)和标记物rs10033464(SEQ IDNO：41)，以及与其连锁不平衡的标记物。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物选自表19中显示的标记物。在一个实施方案中，方法还包括在个体中评估含有至少两个多态性标记物的至少一个单倍型的步骤。

另一方面，本发明涉及在人类个体中确定对心律不齐或中风的易感性的方法，包括确定在源自于个体的基因型数据组中是否存在至少一个多态性标记物的至少一个风险等位基因，其中至少一个多态性标记物选自表5中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个风险等位基因的存在的确定，表明了个体中对心律不齐或中风的增加的易感性。

在一个实施方案中，基因型数据组包含关于标记物身份以及个体的至少一个多态性标记物的等位基因状态的信息，即关于个体携带的标记物的两个等位基因的身份的信息和/或关于个体是否是至少一个多态性标记物的特定风险等位基因的携带者的信息。基因型数据组可以包含关于一个或多个标记物、包括两个或两个以上标记物、三个或三个以上标记物、五个或五个以上标记物、一百个或以上标记物等的等位基因信息。在某些实施方案中，基因型数据组包含了来自个体的全基因组评估的含有成百上千个标记物、或甚至一百万个或以上标记物的基因型信息。

另一方面，本发明涉及了一种方法，包括对来自人类个体的核酸进行分析，以确定与具有SEQ ID NO：50中显示的序列的基因组序列相关联的至少一个多态性标记物的至少一个等位基因或单倍型的存在或不存在的步骤；以及根据至少一个标记物或单倍型的存在或不存在，来确定个体中心律不齐或中风的遗传指标的状态的步骤。因此，个体的基因型和/或单倍型状态被用作个体中心律不齐、包括心房纤颤和心房扑动以及中风的指标。

本发明还涉及了在人类个体中评估对心律不齐或中风的易感性的方法，包括在来自个体的核酸中筛选SEQ ID NO：50中与心律不齐或中风在人类群体中的增加的发病率相关的至少一个多态性标记物或单倍型；其中核酸中至少一个多态性的风险标记物等位基因或风险单倍型的存在的确定，将个体鉴定为对心律不齐和/或中风具有升高的易感性，其中核酸中至少一个风险标记物等位基因或风险单倍型的不存在，将个体鉴定为不具有升高的易感性。

在一个实施方案中，本发明的过程或方法需要含有SEQ ID NO：50中显示的LD区块C04的连续的核酸片段或其互补序列的至少一个多态性标记物或单倍型，其中片段的大小小于500个核苷酸，并与LD区块C04的互补区段特异性杂交。在一个实施方案中，片段的大小大于15个核苷酸而小于400个核苷酸，其中片段与SEQ ID NO：50中显示的LD区块C04的互补区段特异性杂交。

在可选的实施方案中，多态性标记物或单倍型赋予的易感性是降低的易感性，即本发明的标记物和单倍型赋予了个体发生心律不齐、包括心房纤颤和心房扑动以及中风的降低的风险。在一个这样的实施方案中，降低的易感性的特征为比值比(OR)或相对风险(RR)小于0.8。在另一个实施方案中，降低的易感性的特征为比值比(OR)小于0.7。在另一个实施方案中，降低的易感性的特征为OR或RR小于0.6。在另一个实施方案中，降低的易感性的特征为OR或RR小于0.5。其它的实施方案涉及其它的OR或RR值，包括值为0.9、0.85、0.75、0.65、0.55等。

本发明的另一方面涉及用于在人类个体中评估对与心律不齐和/或中风有关的症状的易感性的标记物的鉴定方法，方法包括鉴定SEQID NO：50中的至少一个多态性标记物、或与SEQ ID NO：50中的至少一个标记物连锁不平衡的至少一个多态性标记物，确定被诊断患有心律不齐和/或中风的个体的样品的基因型状态和对照个体的样品的基因型状态，其中在被诊断患有心律不齐和/或中风的个体中至少一个多态性的至少一个等位基因的频率，与对照样品中至少一个等位基因的频率相比的显著差异，表明了至少一个多态性可用于评估对心律不齐和/或中风的易感性。在一个实施方案中，在被诊断患有心律不齐和/或中风的个体中至少一个多态性的至少一个等位基因的频率，与对照样品中至少一个等位基因的频率相比的增加，表明了至少一个多态性可用于评估对心律不齐的增加的易感性。在另一个实施方案中，在被诊断患有心律不齐和/或中风的个体中至少一个多态性的至少一个等位基因的频率，与对照样品中至少一个等位基因的频率相比的降低，表明了至少一个多态性可用于评估对心律不齐和/或中风的降低的易感性、或保护性。在优选实施方案中，频率的显著差异是通过统计学测量值来表征的。在一个实施方案中，统计学测量值是P-值。在具体的实施方案中，显著的P-值是小于0.05、小于0.01、小于0.001、小于0.0001、小于0.00001、小于0.000001、小于0.0000001、或小于0.00000001。在其它实施方案中，显著的差异由具有特定置信区间(CE)值的比值比(OR)或相对风险(RR)来表征。

另一方面，本发明涉及对从人类个体获得的核酸样品进行基因分型的方法，包括确定样品中预测心律不齐和/或中风的增加的风险至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个标记物选自表5中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在的确定，可以预测个体中心律不齐和/或中风的增加的风险。在一个实施方案中，基因分型使用选自等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、核酸测序、5’-外切核酸酶消化、分子信标分析、寡核苷酸连接分析、大小分析以及单链构象分析的方法来进行。在优选的实施方案中，方法包括等位基因特异性探针杂交。优选情况下，基因分型的方法包括使用位于至少一个多态性标记物两侧的核苷酸引物对，通过聚合酶链反应(PCR)扩增含有至少一个多态性标记物的核酸的区段。在基因分型的优选方法中，进行了下面的步骤：

1.将核酸的拷贝与检测寡核苷酸探针和增强子寡核苷酸探针在允许寡核苷酸探针与核酸特异性杂交的条件下相接触；其中

a)检测寡核苷酸探针长度为5-100个核苷酸，并与含有至少一个多态性位点、其核苷酸序列在SEQ ID NO：50中给出的核酸的第一个区段特异性杂交；

b)检测寡核苷酸探针在其3’末端含有可检测标记，在其5’末端含有淬灭基团；

c)增强子寡核苷酸长度为5-100个核苷酸，并与相对于寡核苷酸探针5’方向的核苷酸序列的第二个区段互补，以便当两个寡核苷酸都与核酸杂交时，增强子寡核苷酸位于检测寡核苷酸探针的3’方向；以及

d)在第一个区段和第二个区段之间存在单个碱基缺口，使得当寡核苷酸探针和增强子寡核苷酸探针都与核酸杂交时，在寡核苷酸之间存在单个碱基缺口；

2.使用当检测探针与核酸杂交时将从检测探针的3’末端裂解可检测标记以释放游离的可检测标记的内切核酸酶来处理核酸；以及

测量游离的可检测标记，其中游离的可检测标记的存在表明检测探针与核酸的第一个区段特异性杂交，并表明多态性位点的序列与检测探针互补。

本发明的另一方面涉及在人类个体中确定对心律不齐或中风的易感性的方法，方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的身份，其中至少一个标记物选自与PITX2基因相关联的标记物，其中至少一个等位基因的存在表明了个体中对心律不齐或中风的易感性。

本发明的某些实施方案涉及了另一个对心房纤颤、心房扑动或中风的至少一个其它生物标记物进行评估的步骤，其中从标记物获得的遗传信息的合并提供了对心房纤颤、心房扑动或中风的风险评估。在某些这样的实施方案中，生物标记物是遗传标记物或单倍型，即显示出或被设想与心房纤颤、心房扑动或中风的增加的或降低的风险相关的遗传风险因子。在其它实施方案中，生物标记物是蛋白生物标记物。在某些实施方案中，蛋白生物标记物选自纤维蛋白D-二聚体、凝血酶原活化片段1.2(F1.2)、凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)、纤维蛋白肽A(FPA)、脂蛋白相关的磷脂酶A2(Ip-PLA2)、β-血小板球蛋白、血小板因子4、P-选择素、von Willebrand因子、利尿钠肽前体(BNP)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、PARK7、二磷酸核苷激酶(NDKA)、tau、神经元特异性烯醇化酶、B型神经营养性生长因子、星形神经胶质蛋白S-100b、神经胶质纤丝酸性蛋白、C-反应性蛋白、血清淀粉样肽A、基质金属蛋白酶-9、血管和细胞内细胞粘附分子、肿瘤坏死因子α和白介素，包括白介素-1、-6和-8。在一个实施方案中，至少一个生物标记物包括祖细胞。在特定实施方案中，测定了一个以上的生物标记物。在优选实施方案中，生物标记物从个体的血浆中测量。其它的实施方案还涉及了将非遗传信息进行合并，在个体中进行心房纤颤、心房扑动或中风的风险评估、诊断或预后。非遗传信息可以包括年龄、发病时的年龄、性别、种族、以前的疾病诊断例如心律不齐(例如心房纤颤)和中风的诊断、个体的医学史、疾病的家族史、生物化学测量和临床测量(例如血压、血清脂含量)。通过本技术领域的专业人员已知的方法，这种来自各种不同的遗传标记物、或遗传标记物加上非遗传标记物的合并的信息的分析是可能的。在一个实施方案中，通过逻辑回归进行了分析以计算总风险。

本发明还涉及了在人类个体中诊断对中风的增加的易感性的方法，包括下列步骤：(a)确定个体是否经历过与心房纤颤、心房扑动或短暂性缺血性发作有关的症状；(b)确定来自个体的核酸样品是否含有选自表5中显示的标记物以及与其连锁不平衡的标记物中的至少一个多态性标记物的风险等位基因的至少一个拷贝；其中与心房纤颤、心房扑动和/或短暂性缺血性发作有关的症状的存在，以及风险等位基因的至少一个拷贝的存在，表明了中风的增加的易感性。

另一方面，本发明涉及评估个体对预防和/或缓解与心律不齐和/或中风相关的症状的治疗药剂的反应的可能性的方法，包括：在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个标记物的至少一个等位基因的存在的确定，表明了对心律不齐和/或中风治疗药剂发生阳性反应的可能性。

在一个实施方案中，治疗药剂是抗凝血剂、抗心律失常药剂、心率控制药剂、心脏复律药剂或心脏节律控制药剂。在另一个实施方案中，治疗药剂选自华法林、肝素、低分子量肝素、因子Xa抑制剂和凝血酶抑制剂、钠通道阻断剂、β阻断剂、钾通道阻断剂和钙通道阻断剂。

在另一个实施方案中，治疗药剂选自华法林、ximelagatran、肝素、依诺肝素、达肝素、亭扎肝素、阿地肝素、那屈肝素、瑞维肝素、磺达肝素、艾卓肝素、来匹卢定、比伐卢定、阿加曲班、达那类肝素、丙吡胺、莫雷西嗪、普鲁卡因胺、奎尼丁、利多卡因、美西律、妥卡胺、苯妥英、恩卡尼、氟卡胺、普罗帕酮、阿马林、西苯唑啉、地他义铵、艾司洛尔、普萘洛尔、美托洛尔、烯丙洛尔、阿替洛尔、卡维地洛、比索洛尔、醋丁洛尔、纳多洛尔、吲哚洛尔、拉贝洛尔、oxprenotol、喷布洛尔、噻吗洛尔、倍他洛尔、卡替洛尔、索他洛尔、左旋布诺洛尔、胺碘酮、阿齐利特、溴苄铵、多非利特、替地沙米、伊布利特、司美利特、N-乙酰普鲁卡因胺、盐酸尼非卡兰、维纳卡兰(vernakalant)、氨巴利特、维拉帕米、米贝拉地尔、地尔硫卓、地高辛、腺苷酸、伊布利特、胺碘酮、普鲁卡因胺、丙胺苯丙酮和氟卡胺。

本发明的另一方面涉及对被诊断有心律不齐和/或中风的个体的预后进行预测的方法，方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个等位基因的存在的确定，表明了个体中心律不齐和/或中风的更糟的预后。

监测经历了心律不齐和/或中风治疗的个体的治疗进展的方法也在本发明的范围之内，该方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个等位基因的存在的确定，表明了个体的治疗结果。

在本发明的具体实施方案中，例如在本发明的各种不同方法、应用、步骤、装置和试剂盒中，心律不齐的表现型的进一步特征为心房纤颤或心房扑动。本发明人已经确定，本文描述的AF风险变体所赋予的风险，对于发病年龄早的个体来说比发病年龄晚的个体更大。因此，在一个实施方案中，心房纤颤或心房扑动的进一步特征为在个体中的发病年龄小于80岁。在另一个实施方案中，心房纤颤或心房扑动的进一步特征为在个体中的发病年龄小于70岁。在另一个实施方案中，心房纤颤或心房扑动的进一步特征为在个体中的发病年龄小于60岁。在本发明的可选实施方案中，其它的年龄截止值也是可能的，并也被考虑到了，包括但不限于年龄截止值小于75岁、小于65岁、小于55岁。此外，在发病或诊断时的年龄大于55、60、65、70、75或80岁也被考虑到了，并包含在本发明的范围内，因此症状的诊断或疾病发作时的年龄范围包括但不限于50-80岁、55-75岁、60-80岁、65-75岁，等等。

在本发明的某些实施方案中，中风被进一步表征为缺血性中风。在其他实施方案中，中风表现型的特征可以是一种或多种缺血性中风亚表型大动脉粥样硬化(LAA)、心源性卒中(CES)和小血管疾病(SVD)。

在本发明的具体实施方案中，连锁不平衡(LD)由特定的定量截止值确定。正如在本文中详细描述的，连锁不平衡可以由测量值例如r²和|D′|来定义。因此，本发明的某些实施方案涉及由特定的r²和/或|D′|值所指明的某个范围内的测量值所定义的连锁不平衡的标记物。在一个这样的实施方案中，LD的特征为r²的数值大于0.1。在另一个实施方案中，LD的特征为r²的数值大于0.1。在另一个实施方案中，LD的特征为r²的数值大于0.5。在另一个实施方案中，LD的特征为r²的数值大于0.8。r²的其它截止值也被考虑到了，正如在本文中更详细描述的。在某些实施方案中，LD用r²和/或|D′|的某些截止值来表征。在一个这样的实施方案中，LD的特征为r²和/或|D′|分别大于0.2和0.8。这些或其它LD的度量值的其它组合和排列对于实施本发明来说也是可能的，并且也被考虑到了，并包含在本发明的范围内。

在某些实施方案中，本发明的过程、应用或方法还包括给被确定具有发生心律不齐或中风的增加的风险的个体，施用含有至少一种有效治疗或预防心律不齐或中风、或预防与心律不齐或中风有关的症状的治疗性药剂的组合物。因此，本发明可用于确定个体是否适合于特定的治疗模式。

在本文描述的各种不同方法和过程中使用的试剂盒也包含在本发明的范围内。因此，一种情况下，本发明涉及在人类个体中评估对心律不齐和/或中风的易感性的试剂盒，试剂盒包含用于在个体的基因组中选择性检测至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的试剂，其中多态性标记物选自其序列显示在SEQ ID NO：50中的区段中的多态性标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个等位基因的存在表明了对心律不齐和/或中风的易感性。

在一个实施方案中，至少一个多态性标记物选自表5中显示的标记物。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物选自标记物rs2220427(SEQ ID NO：1)和rs10033464(SEQ ID NO：41)，以及与其连锁不平衡的标记物。在一个优选实施方案中，至少一个多态性标记物选自表19中显示的标记物。在另一个优选实施方案中，至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ ID NO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。在一个实施方案中，试剂含有至少一个与个体的基因组的含有至少一个多态性标记物的区段杂交的连续的寡核苷酸、缓冲液和可检测标记。

在另一个实施方案中，试剂含有至少一对与从对象获得的基因组核酸区段的反向链杂交的寡核苷酸，其中每个寡核苷酸引物对被设计成能选择性扩增个体的基因组中包含一个多态性标记物的片段，其中片段的大小为至少30个碱基对。在优选实施方案中，至少一个寡核苷酸与个体的基因组完全互补。在一个实施方案中，寡核苷酸的长度为大约18到大约50个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为20-30个核苷酸。在一个优选实施方案中，试剂盒含有：

a.长度为5-100个核苷酸的检测寡核苷酸探针；

b.长度为5-100个核苷酸的增强子寡核苷酸探针；以及

c.内切核酸酶；

其中检测寡核苷酸探针与其核苷酸序列在SEQ ID NO：2中给出核酸的含有至少一个多态性位点的第一个区段特异性杂交；其中检测寡核苷酸探针在其3’末端含有可检测标记，在其5’末端含有淬灭基团；其中增强子寡核苷酸长度为5-100个核苷酸，并与相对于寡核苷酸探针5’方向的核苷酸序列的第二个区段互补，以便当两个寡核苷酸都与核酸杂交时，增强子寡核苷酸位于检测寡核苷酸探针的3’方向；其中在第一个区段和第二个区段之间存在单个碱基缺口，使得当寡核苷酸探针和增强子寡核苷酸探针都与核酸杂交时，在寡核苷酸之间存在单个碱基缺口；并且其中当检测探针与核酸杂交时，使用内切核酸酶处理核酸将从检测探针的3’末端裂解可检测标记，以释放游离的可检测标记。

本文描述的用于预测心律不齐(例如AF和心房扑动)和中风的风险的多态性标记物可用作诊断标记物。因此，一种情况下，本发明涉及寡核苷酸探针在制造用于在人类个体中诊断和/或评估心律不齐和/或中风的易感性的诊断试剂中的应用，其中探针与其核苷酸序列在SEQ ID NO：50中给出核酸的含有至少一个多态性位点的区段杂交，其中片段的长度为15-500个核苷酸。

在一个这样的实施方案中，多态性位点选自表5中显示的多态性标记物，以及与其连锁不平衡的多态性。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ IDNO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ ID NO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。

用于储存关于本文描述的疾病相关的标记物的信息的计算机可读介质，也在本发明的范围内。在一个这样的情况下，本发明涉及计算机可读介质，其上储存有至少一个多态性标记物的识别符；该至少一个多态性标记物的至少一个等位基因在多个被诊断患有心房纤颤、心房扑动和/或中风的个体中的频率的指示符；以及该至少一个多态性标记物的至少一个等位基因在多个参比个体中的频率的指示符；其中至少一个多态性标记物选自表5中显示的多态性标记物，以及与其连锁不平衡的多态性。在优选实施方案中，至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ IDNO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。

本发明还涉及了用于在人类个体中测定心律不齐和/或中风的遗传指示符的装置，包含：计算机可读存储器：以及储存在计算机可读存储器中的例行程序；其中例行程序适用于在处理器上执行，以分析至少一个人类个体的至少一个多态性标记物的基因型和/或单倍型数据，其中该至少一个多态性标记物选自表5中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，并根据标记物或单倍型数据产生输出，其中输出包括作为人类个体的心律不齐和/或中风的遗传指示符的至少一个标记物或单倍型的风险测量。在优选实施方案中，例行程序还包含测定多个被诊断患有心律不齐和/或中风的个体中至少一个多态性标记物的至少一个等位基因或至少一个单倍型的频率的指示符，以及多个参比个体中至少一个多态性标记物的至少一个等位基因或至少一个单倍型的频率的指示符，并在其基础上计算至少一个等位基因和/或单倍型的风险测量值；其中个体的风险测量值的计算，是基于个体的至少一个标记物和/或单倍型状态，与多个被诊断患有心房纤颤、心房扑动和/或中风的个体的至少一个标记物和/或单倍型信息的计算的风险的比较。在某些实施方案中，风险测量值被表示为比值比(OR)或相对风险(RR)，正如在本文中更详细描述的。

本文描述的在本发明中发现的用于预测心律不齐和中风的多态性标记物、以及与其连锁不平衡的标记物，都可用于实施本发明的各种不同情况。因此，尽管本发明人使用了特定的多态性标记物来检测4号染色体上的特定区域与心律不齐(例如心房纤颤和心房扑动)和中风的关联性，但评估与那些标记物强烈连锁不平衡的标记物也是同样有用的。因此，在本发明的方法、应用、试剂盒、步骤、装置和介质的一个实施方案中，用于本发明的方法或步骤的至少一个多态性标记物或单倍型，包含了在表5(例如表5A和5B)中显示的至少一个标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物或单倍型包括表9中显示的至少一个标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。在一个实施方案中，至少一个多态性标记物或单倍型包含表5中显示的至少一个标记物。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物或单倍型包含表9中显示的至少一个标记物。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物选自表4中显示的标记物。在一个实施方案中，至少一个标记物选自标记物rs2220427(SEQ IDNO：1)和标记物rs10033464(SEQ ID NO：41)，以及与其连锁不平衡的标记物。在另一个实施方案中，至少一个多态性标记物选自表19中显示的标记物。

在一个实施方案中，至少一个标记物或单倍型，包含至少一个标记物D4S406(SEQ ID IMO：45)、rs2723296(SEQ ID NO：35)、rs16997168(SEQ ID NO：36)、rs2723316(SEQ ID NO：37)、rs6419178(SEQ ID NO：38)、rs1448817(SEQ ID NO：39)、rs2634073(SEQ IDNO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs13105878(SEQ ID NO：40)、rs10033464(SEQ ID NO：41)、rs13141190(SEQ ID NO：42)、rs3853444(SEQ ID NO：43)和rs4576077(SEQ IDNO：44)。在另一个实施方案中，至少一个标记物或单倍型包含至少一个标记物D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ ID NO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。在另一个实施方案中，至少一个标记物选自rs10033464、rs2200733、rs13143308和rs2220427，以及与其连锁不平衡的标记物。

在另一个实施方案中，标记物D4S406的等位基因-2、-4和/或-8、标记物rs2723296的等位基因G、标记物rs16997168的等位基因T、标记物rs2723316的等位基因T、标记物rs6419178的等位基因A、标记物rs11448817的等位基因G、标记物rs2634073的等位基因A、标记物rs2200733的等位基因T、标记物rs2220427的等位基因T、标记物rs13105878的等位基因C、标记物rs10033464的等位基因T、标记物rs13141190的等位基因A、标记物rs3853444的等位基因A、和/或标记物rs4576077的等位基因T的存在，表明了个体中心律不齐或中风的增加的易感性。

在本发明的特定的实施方案中，风险变体(即多态性标记物(例如SNP)的特定等位基因或特定单倍型)所赋予的易感性是增加的易感性，即本发明的标记物和单倍型赋予了个体发生心律不齐、包括心房纤颤和心房扑动、以及中风的增加的风险。易感性典型情况下通过度量比值比(OR)、或可选地通过相对风险(RR)来表征。在一个实施方案中，增加的易感性的特征为比值比(OR)为至少1.3。在另一个实施方案中，增加的易感性的特征为比值比(OR)为至少1.4。在另一个实施方案中，增加的易感性的特征为比值比(OR)为至少1.5。在另一个实施方案中，增加的易感性的特征为比值比(OR)或相对风险(RR)为至少1.6。在另一个实施方案中，增加的易感性的特征为比值比(OR)或相对风险(RR)为至少1.8。其它的实施方案涉及了其它的OR值或相当的RR值，包括值1.25、1.35、1.45、1.55等。

本发明的某些实施方案涉及了特定的种族或血统。在一个这样的实施方案中，人类个体具有选自非洲黑人种族、亚洲种族、高加索人种族、西班牙人种族和阿拉伯人种族的血统。在特定实施方案中，种族是自己报告的。在其它实施方案中，血统通过特定的种族特异性遗传标记物的评估来确定。

附图简述

从下面对本发明的优选实施方案的更具体的描述，本发明的上述以及其它的目标、特点和优点将变得明显。

图1显示了对CEPH群体(HapMap数据)在含有本发明的变体的区域中的连锁不平衡(LD)作图。LD区块C04(NCBI Build 35中4号染色体上111，954，811-112，104，250的位置)在图上用黑框显示。图中显示了LD的两种度量，即位于图1的左上部分的D′和图的右下部分的r²。

图2显示了在LD区块中相关区域的单倍型结构的示意图。深色(左边)圆圈的面积与冰岛组中单倍型的单倍型频率成比例，浅色(右边)圆圈的面积与香港组中的单倍型频率成比例。显示在图的中间的居中的单倍型，不再能够确定存在于两个群体中的任何一个中(其估算的频率低于0.2％，不能与基因分型误差区分开)。

图3是rs2200733和rs10033464邻近的200kb的基因组区域的概况。它包含了预测的ESTs，在CEU HapMap样品中三种主要类型的等价的SNPs的位置，以及在各种不同种族的HapMap样品中区域的LD结构的概况。

图4显示了PITX2在人类心脏和主动脉中表达的Northern印迹分析。PITX2 cDNA克隆HU3_p983E0327D被用作探针，分别检测了左心房和主动脉中的1.8、2和3kb的转录本以及2.2和3kb的PITX2转录本。第1道：胎心，第2道：整个心脏，第3道：主动脉，第4道：心尖，第5道：左心房，第6道：右心房，第7道：左心室，第8道：右心室。印迹使用PITX2 cDNA克隆(HU3_p983E0327D)探测。

发明详述

本发明的优选实施方案的描述如下。

定义

在本发明的文本中，下面的术语将具有所指示的意义：

本文描述的心房纤颤(AF)是指按照已建立的医学标准所通常定义的AF。AF按ICD-10分类在类别148中，按ICD-9分类在类别427.3中。

本文描述的心房扑动(AFl)是指按照已建立的医学标准所通常定义的AFl。AFl按ICD-10分类在类别148中，按ICD-9分类在类别427.3中。

本文描述的“多态性标记物”、有时被称为“标记物”，是指基因组多态性位点。每种多态性标记物具有至少两个序列变体，其特征为多态性位点上的特定等位基因。因此，与多态性标记物的遗传关联表明存在与该具体多态性标记物的至少一个特定等位基因的关联。标记物可以含有在基因组中发现的任何变体类型的任何等位基因，包括SNPs、微卫星、插入、缺失、重复和易位。

“等位基因”是指染色体上给定位点(位置)的核苷酸序列。因此，多态性标记物等位基因是指染色体上标记物的组成(即序列)。来自个体的基因组DNA对于任何给定的多态性标记物来说含有两个等位基因，代表了每条染色体上标记物的每个拷贝。

在本文中，在群体中(自然群体或合成的群体，例如合成分子的文库)其上可能存在一种以上序列的核苷酸位置被称为“多态性位点”。

“单核苷酸多态性”或“SNP”是当基因组中特定位置上的单个核苷酸在物种的成员之间或一个个体中成对的染色体之间不同时发生的DNA序列变异。大多数SNP多态性具有两个等位基因。在这种情况下，每个个体或者是多态性的一个等位基因的纯合子(即个体的两个染色体拷贝在SNP位置处具有同样的核苷酸)，或者个体是杂合子(即个体的两条姊妹染色体含有不同的核苷酸)。在本文中报告的SNP的命名是指官方的参考SNP(rs)ID身份标签，是由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnological Information)(NCBI)为每个独特的SNP指定的。

本文描述的“变体”是指与参比DNA不同的DNA区段。“标记物”或“多态性标记物”按照本文的定义，是变体。与参比不同的等位基因被称为“变体”等位基因。

“微卫星”是在特定位点具有多个小的长度为2-8个核苷酸的碱基重复(例如CA重复)的多态性标记物，其中重复长度的数量在总群体中是变化的。“indel”是常见的多态性形式，含有一般只有几个核苷酸长的小的插入或缺失。

本文描述的“单倍型”是指基因组DNA的一个区段，其特征为沿着该区段排列有等位基因的特定组合。对于二倍体生物例如人类来说，单倍型含有每个多态性标记物或位点的等位基因对的一个成员。在某些实施方案中，单倍型可以含有两个或两个以上等位基因、三个或三个以上等位基因、四个或四个以上等位基因、或五个或五个以上等位基因。

本文描述的术语“易感性”包含了增加的易感性和降低的易感性。因此，本发明的特定多态性标记物和/或单倍型的特征可以是心房纤颤或中风的增加的易感性(即增加的风险)，被表征为相对风险(RR)或比值比(OR)大于1。或者，本发明的标记物和/或单倍型的特征可以是心房纤颤或中风的降低的易感性(即降低的风险)，被表征为相对风险小于1。

“核酸样品”是从个体获得的含有核酸的样品。在某些实施方案、即特定多态性标记物和/或单倍型的检测，核酸样品包含基因组DNA。这样的核酸样品可以从任何含有基因组DNA的来源获得，包括例如血液样品、羊水样品、脑脊液样品，或来自皮肤、肌肉、口腔或结膜粘膜、胎盘、胃肠道或其它器官的组织样品。

术语“心房纤颤和/或中风治疗药剂”是指可用于缓解或预防与心房纤颤(AF)、心房扑动(AFl)或中风相关的症状的药剂，在本文中有更详细的描述。

本文中描述的术语“与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸”是指已经被发现与心律不齐、例如心房纤颤(AF)、心房扑动(AFl)或中风相关的核酸。这包括但不限于本文描述的标记物和单倍型，以及与其强烈连锁不平衡(LD)的标记物和单倍型。在一个实施方案中，与心房纤颤、心房扑动或中风相关的核酸是指被发现与心房纤颤和中风有关的LD区块C04。在另一个实施方案中，与心房纤颤、心房扑动或中风相关的核酸是指PITX2基因。

本文描述的术语“LD区块C04”是指4号染色体上位于NCBI(国立生物技术信息中心)Build 35中的111，954，811-112，104，250的位置之间的连锁不平衡(LD)区块，其基因组序列显示在SEQ ID NO：50中。

本文描述的“片段”是指核酸或蛋白序列的区段。片段的大小小于它们的参比点，即大小为1000个核苷酸的参比核酸分子的片段的大小小于1000个核苷酸。本发明的核酸片段通常大小超过5个核苷酸，典型情况下大小超过15个核苷酸，其上限由它们的参比核苷酸或核苷酸片段的实际用途来决定。例如，在本发明的某些实施方案中，用作杂交探针的核苷酸片段的大小大于15个核苷酸并小于大约500个核苷酸。其它的大小范围适用于本发明的其它核苷酸片段和蛋白或肽片段。

本文描述的术语“PITX2”是指染色体4q25上的成对同源异型结构域蛋白转录因子2基因。该基因也被称为脑垂体同源异形盒2(PTX2)、rieg bicoid相关的同源异形盒转录因子1(RIEG1)、solurshin和all-1反应性基因1(ARP1)。

本发明涉及观察到人类基因组的染色体4q25上的某些多态性标记物，被发现与心律不齐和中风有关联。在本发明的特定实施方案中，染色体4q25上的多态性标记物与心律不齐性心房纤颤(AF)和心房扑动(AFl)和中风相关。正如在本文中进一步详细描述的，这些观察与诊断和治疗方法、应用、试剂盒和系统有着重要的、意想不到的牵连。

在赋予对AF的易感性的遗传变体的全基因组扫描中，在染色体4q25上发现了几个与AF相关的标记物。对于标记物rs2220427和rs2220733发现了与AF的最显著的关联性，二者都给出了接近10^-9的p-值(表2)，以及虽然较小但明显显著的与中风的关联性(表3)。大量的标记物作为这些标记物的完美的替代物被鉴定到，包括微卫星标记物D4S406(表1)和许多SNP标记物(表4)。

对结果的进一步精炼，发现关联性信号出现在标记物rs2200733和rs10033464(表7)、以及与那些标记物连锁不平衡的标记物(包括但不限于表9中列出的SNP标记物)的、用遗传学术语来说的中心。

最初在冰岛人群体中进行的观察在独立的冰岛人AF/AFl组、瑞典人AF组和美国AF组中进行了重复(表7)。当将冰岛人样品合并时，与rs2200733的关联性是明确的(OR＝1.72，P＝3.3x10^-41)，与rs10033464的关联性也大大超过了基因组范围上显著性的阈值(OR＝1.39，P＝6.9x10^-11)。假设乘法模型，两个变体合并的群体归因风险(PAR)在欧洲人血统的群体中是大约20％。此外，关联性也在来自香港的中国人AF组中进行了重复(表7)。

本发明人还发现，对于冰岛人样品来说，AF/AFl的诊断年龄与两个SNPs rs2200733和rs10033464相关。因此，对于每个rs2200733等位基因T来说诊断的发生早2.28年，对于每个rs10033464等位基因T来说诊断发生早1.10年(组合的P＝1.29x10^-6)。这种效应由在诊断年龄较小的个体中两个变体的关联性最强所表明，尽管即使在诊断年龄超过80岁的个体中风险仍然是显著的(表8)。在美国组中观察到了类似的发病年龄的效应(表8)。

发明人还观察到了变体与AFl之间的强烈关联性，它们看起来比与AF的关联性更强。与被诊断患有AFl的冰岛患者的亚组(N＝116)的关联性显示了这一点(对于rs2200733来说OR＝2.60，95％置信区间(CI)＝1.83-3.68，P＝7.5x10^-8，对于rs10033464来说OR＝1.94，95％CI＝1.26-3.00，P＝.0028)。事实上，对于rs2200733来说，这些确定的AFl病例的OR显著高于具有AF表型的病例的OR(P＝0.0026)，对于rs10033464来说，接近于明显高(P＝.084)。与SNPs rs2200733和rs10033464的关联性说明了这些AF和AFl都具有显著遗传风险因子的结果。

本发明人还进一步确定了与AF/AFl相关的变体也与中风、特别是缺血性中风相关(表21)。标记物rs2200733在缺血性中风和缺血性中风(IS)心源性中风亚表型(CES)中得到了显著的重复。在对其它的冰岛IS病例和对照(总共1,943个病例/25,708个对照)以及4个大的IS病例/对照重复组(4,294个病例/3,709个对照)进行基因分型之后，发现该标记物和标记物rs10033464与AF是主要病因的CES关联性最强(rs2200733：OR＝1.53，P＝1.5x10^-12；rs10033464：OR＝1.27，P＝5.9x10^-4)(表21)。

在含有rs2200733和rs10033464的LD区块中不存在已知的基因(图3)。该LD区块含有一个剪接EST(DA725631)和两个单外显子ESTs(DB324364和AF017091)。来自各种组织的cDNA文库的RT-PCR没有检测到这些ESTs的表达(表16)。位于邻近上游LD区块中的PITX2基因是与风险变体最接近的基因。含有PITX2基因的LD区块中的几个标记物与表18中显示的对AF和Afl显示出关联性的标记物相关。因此，可能PITX2基因中的变体是潜在的病因变体。可选地，有可能本文描述的本发明的变体影响了PITX2的功能、稳定性、表达、翻译后修饰、剪接、信使稳定性，或通过其它的方式影响了基因，导致了对与心房纤颤、心房扑动和/或中风相关的病症的倾向性。该基因编码的蛋白、成对同源异型结构域转录因子2，是AF/AFl的目的候选物，因为已知它通过指导心脏的不对称形态发生在心脏发育中发挥重要作用(Franco，D.，Trends Cardiovasc Med 13：157-63(2003))。此外，在小鼠中，敲除模型Pitx2已经被显示抑制了左心房中窦房结形成的缺省途径。在所有容易进入的组织例如血液和脂肪组织中，PITX2的mRNA表达非常低，妨碍了对基因型和表达水平之间的关联性的研究。PITX2上游的下一个基因是ENPEP，是负责在血管内皮中分解血管紧张肽II的氨肽酶。该基因的表达更加广泛，但是与AF相关的变体显示出与其在血液和脂肪组织中的表达没有相关性。没有其它已注解的基因位于有关联的变体的上游400kb区域和下游1.5Mb区域中。

标记物和单倍型评估

当在个体间进行比较时，群体中的基因组序列是不相同的。相反，个体间在基因组中的许多位置上表现出了基因组序列变异性。这种序列的变化通常被称为多态性，在每个基因组中有许多这样的位点。例如，人类基因组表现出在平均每500个碱基对就发生序列变异。最常见的序列体包括基因组中单一碱基位置的碱基变化，这种序列变体或多态性，通常被称为单核苷酸多态性(“SNPs”)。这些SNPs据信是在单个突变事件中发生的，因此通常可能在每个SNP位点存在两个可能的等位基因；原始的等位基因和突变的等位基因。由于自然遗传漂移并可能也由于选择压力，最初的突变产生了多态性，其特征为在任何给定的群体中其等位基因的特定频率。在人类基因组中发现了许多其它类型的序列变异，包括微卫星、插入、缺失、倒置和拷贝数变化。多态性微卫星在特定位点含有多个小的碱基重复(例如CA重复，互补链上的TG重复)，重复的长度的数量在总群体中是变化的。概括地说，多态性位点的每个版本的序列都代表了多态性位点的特定等位基因。这些序列变体都可以被称为多态性，它们发生在特定多态性位点，表明了所述序列变体的特征。概括地说，多态性可以包含任何数量的特定等位基因。因此，在本发明的一个实施方案中，多态性的特征为在任何给定群体中存在两种或两种以上等位基因。在另一个实施方案中，多态性的特征为存在三种或三种以上等位基因。在其它实施方案中，多态性的特征为四种或四种以上等位基因、五种或五种以上等位基因、六种或六种以上等位基因、七种或七种以上等位基因、九种或九种以上等位基因或十种或十种以上等位基因。所有这样的多态性都可用于本发明的方法和试剂盒中，因此在本发明的范围内。

在某些情况下，对多态性位点处不同等位基因进行参比而不选择参比等位基因。或者，对于特定多态性位点可以指定参比序列。参比等位基因有时被称为“野生型”等位基因，它通常被选为第一个被测序的等位基因或来自“未受影响的”个体(例如没有显示出性状或疾病表型的个体)的等位基因。

本文指称的SNP标记物的等位基因，根据在使用的SNP分析中出现在多态性位点上的碱基A、C、G或T进行指称。本文使用的SNPs的等位基因编码如下：1＝A，2＝C，3＝G，4＝T。但是，本技术领域的专业人员将会认识到，在每种情况下，通过分析或读取相反的DNA链，可以测量到互补的等位基因。因此，对于其特征为A/G多态性的多态性位点(多态性标记物)来说，使用的分析方法可以被设计成特异性检测两种可能的碱基即A和G中的一种或两种的存在。可选地，通过设计分析方法，使得它被设计成检测DNA模板上的相反链，可以测量到互补碱基T和C的存在。从定量来说(例如根据相对风险)，从任一条DNA链(+链或-链)测量获得的结果是相同的。

典型情况下，对特定序列指定参比序列。与参比不同的等位基因有时被称为“变体”等位基因。本文使用的变体序列是指与参比序列不同但是基本上相似的序列。本文描述的多态性遗传标记物处的等位基因是变体。其它的变体可以包含影响到多肽的变化。当与参比核苷酸序列进行比较时，序列差异可以包括单个核苷酸或一个以上核苷酸的插入或缺失，从而导致阅读框移码；至少一个核苷酸的变化，导致了所编码的氨基酸的变化；至少一个核苷酸的变化，导致产生了未成熟的终止密码子；几个核苷酸的缺失，导致了核苷酸编码的一个或多个氨基酸的缺失；一个或几个核苷酸的插入，例如通过不对称重组或基因转换，导致了阅读框编码序列的中断；序列的全部或一部分的复制；易位；或核苷酸序列的重排。这样的序列变化可以改变核酸编码的多肽。例如，如果核酸序列中的变化导致了阅读框移码，阅读框移码可以导致编码的氨基酸的变化，和/或导致产生了未成熟的终止密码子，导致产生了截短的多肽。可选地，与疾病或性状有关的多态性可以是一个或多个核苷酸中的同义变化(即变化不导致氨基酸序列的变化)。这样的多态性可能例如改变剪接位点、影响mRNA的稳定性或运输，或影响转录或编码的多肽的翻译。也可以改变DNA，以增加在体细胞水平上发生结构变化、例如扩增或缺失的可能性。参比核苷酸序列编码的多肽是具有特定的参比氨基酸序列的“参比”多肽，由变体等位基因编码的多肽被称为具有变异的氨基酸序列的“变体”多肽。序列或参比序列可以表示双链DNA的(+)或(-)方向。正如专业技术人员所熟知的，这样的序列是相关的，彼此为反向互补序列。

单倍型是指DNA的区段，其特征为沿着区段排列有等位基因的特定组合。对于二倍体生物例如人类来说，单倍型含有每个多态性标记物或位点的一对等位基因中的一个成员。在某些实施方案中，单倍型可以含有两个或两个以上等位基因、三个或三个以上等位基因、四个或四个以上等位基因、或五个或五个以上等位基因，每个等位基因对应于区段上的特定多态性标记物。单倍型可以含有在多态性位点上具有特定等位基因的各种多态性标记物、例如SNPs和微卫星的组合。因此，单倍型含有各种不同遗传标记物等位基因的组合。

特定多态性标记物和/或单倍型的检测可以通过本技术领域已知的检测多态性位点的序列的方法来完成。例如，可以使用用于基因分型的标准技术检测SNPs和/或微卫星标记物的存在，例如基于荧光的技术(Chen，X.等，Genome Res.9(5)：492-98(1999))，利用PCR、LCR、巢式PCR以及其它用于核酸扩增的技术。可用于SNP基因分型的具体的方法包括但不限于TaqMan基因分型分析方法和SNPlex平台(Applied Biosystems)、质谱(例如来自Sequenom的MassARRAY系统)、微型测序方法、实时PCR、Bio-Plex系统(BioRad)、CEQ和SNPstream系统(Beckman)、分子倒置探针阵列技术(例如AffymetrixGeneChip)以及BeadArray技术(例如Illumina GoldenGate和Infinium分析方法)。通过这些以及其它本技术领域的专业人员可用的方法，可以鉴定出多态性标记物包括微卫星、SNPs或其它类型的多态性标记物的一个或多个等位基因。

在本文描述的某些方法中，对所研究的任何特定疾病或性状具有增加的易感性(即增加的风险)的个体，是在其中鉴定到了赋予对疾病或性状的增加的易感性的一个或多个多态性标记物的至少一个特定等位基因或单倍型(即风险标记物等位基因或单倍型)的个体。在一种情况下，风险标记物或单倍型是赋予了对疾病或性状的明显增加的风险(或易感性)的标记物或单倍型。在一个实施方案中，与标记物或单倍型相关的显著性通过相对风险(RR)来测量。在另一个实施方案中，与标记物或单倍型相关的显著性通过比值比(OR)来测量。在另一个实施方案中，显著性通过百分比来度量。在一个实施方案中，显著增加的风险被测量为风险(相对风险和/或比值比)为至少1.2，包括但不限于：至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、至少3.0、至少4.0和至少5.0。在具体的实施方案中，至少1.2的风险(相对风险和/或比值比)是显著的。在另一个具体实施方案中，至少1.3的风险是显著的。在另一个实施方案中，至少1.4的风险是显著的。在另一个实施方案中，至少大约1.5的相对风险是显著的。在另一个实施方案中，至少大约1.7的风险的显著增加是显著的。但是，也考虑到了其它的截止值，例如至少1.15、1.25、1.35等，这些截止值也在本发明的范围内。在其它实施方案中，风险的显著增加是至少大约20％，包括但不限于大约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％和500％。在一个具体的实施方案中，风险的显著增加是至少20％。在其它实施方案中，风险的显著增加是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少100％。但是，也考虑到了本技术领域的专业技术人员认为适合于表征本发明的其它截止值或范围，它们也在本发明的范围内。

本发明的风险多态性标记物或单倍型，是在具有疾病或性状(例如心律不齐或中风)(受影响的)风险的个体中至少一个标记物的至少一个等位基因或单倍型的出现频率，与它在对比组(对照)中的出现频率相比更高的标记物或单倍型，其中标记物或单倍型的存在表明了对疾病或性状的易感性。在一个实施方案中，对照组可以是群体样品，即来自总群体的随机样品。在另一个实施方案中，对照组由一组没有患病的个体代表。在一个实施方案中，这些没有患病的对照的特征可以是不存在一种或多种与特定疾病相关的症状。在另一个实施方案中，没有患病的对照组的特征为没有一种或多种疾病特异性风险因子。在一个实施方案中，这样的风险因子是至少一种环境风险因子。代表性的环境因子是已知影响或被考虑到影响发生特定疾病或性状的风险的天然产品、矿物质或其它化学物质。其它环境风险因子是与生活方式有关的风险因子，包括但不限于饮食习惯、主要居住地的地理位置和职业性风险因子。在另一个实施方案中，风险因子是至少一种遗传风险因子。

简单的相关性检验的例子是在2x2表格上进行的Fisher-精确检验。给定一组染色体，使用含有两种标记物或单倍型、含有一种标记物或单倍型而不含另一种、以及不含有标记物或单倍型的染色体的数量，构建出2x2表格。

在本发明的另一个实施方案中，对疾病或性状具有降低的易感性(即降低的风险)的个体，是在其中鉴定到了赋予对疾病或性状的降低的易感性的一个或多个多态性标记物的至少一个特定等位基因或单倍型的个体。赋予降低的风险的标记物等位基因和/或单倍型也被说成是保护性的。在一种情况下，保护性标记物或单倍型是赋予了对疾病或性状的明显降低的风险(或易感性)的标记物或单倍型。在一个实施方案中，显著降低的风险被测量为相对风险小于0.9，包括但不限于小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2和小于0.1。在一个具体的实施方案中，显著降低的风险是小于0.7。在另一个实施方案中，显著降低的风险是小于0.5。在另一个实施方案中，显著降低的风险是小于0.3。在另一个实施方案中，风险(或易感性)的降低是至少20％，包括但不限于至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和至少98％。在一个具体实施方案中，风险的显著降低是至少大约30％。在另一个实施方案中，风险的显著降低是至少大约50％。在另一个实施方案中，风险的显著降低是至少大约70％。但是，也考虑到了本技术领域的专业技术人员认为适合于表征本发明的其它截止值或范围，它们也在本发明的范围内。

本技术领域的专业人员将会认识到，在被研究的群体中存在标记物的两个等位基因，其中一个等位基因被发现在群体中具有性状或疾病的个体组中的频率高于对照组，而标记物的另一个等位基因被发现在具有性状或疾病的个体组中的频率低于对照组。在这种情况下，标记物的一个等位基因(被发现在具有性状或疾病的个体中频率增加的等位基因)将是有风险的等位基因，而另一个等位基因将是保护性等位基因。

连锁不平衡

重组这种自然现象，对于每对染色体来说在每次减数分裂事件过程中平均发生一次，代表了自然界为序列(因此也为生物学功能)提供变异的一种方式。已经发现，基因组中的重组不是随机发生的；相反，在重组率的频率上存在很大的变化，产生了具有高重组频率的小区域(也被称为重组热点)和具有低重组频率的较大的区域，这通常被称为连锁不平衡(LD)区块(Myers，S.等，Biochem Soc Trans34：526-530(2006)；Jeffreys，A.J.，等，Nature Genet 29：217-222(2001)；May，C.A.等，Nature Genet 31：272-275(2002))。

连锁不平衡(LD)是指两个遗传元件的非随机的搭配。例如，如果特定遗传元件(例如多态性标记物的等位基因，或单倍型)在群体中出现的频率为0.25(25％)，另一个元件出现的频率为0.25(25％)，假设元件随机分配，那么一个个体具有两个元件的预计的发生率为0.125(12.5％)。但是，如果发现两个元件一起出现的频率高于0.125，那么元件被说成是连锁不平衡的，因为它们倾向于以比根据它们独立的出现频率(例如等位基因或单倍型频率)预测的比例更高的比例一起遗传。粗略地说，LD一般与两个元件之间的重组事件的频率相关。群体中等位基因或单倍型的频率可以通过对群体中的个体进行基因分型并确定群体中每个等位基因或单倍型出现的频率来测定。对于二倍体群体例如人类群体来说，个体一般对每个遗传元件(例如标记物、单倍型或基因)具有两个等位基因。

为了评估连锁不平衡(LD)的强度已经提出了许多不同的测量方法。大多数捕获成对的双等位基因位点之间关联的强度。LD的两个重要的成对度量是r²(有时称为Δ²)和|D’|。两种度量的范围都是从0(没有不平衡)到1(“完全”不平衡)，但是它们的解释稍微有些不同。|D’|被定义为如果仅存在两个或三个可能的单倍型则等于1，如果所有四个可能的单倍型都存在则小于1。因此，小于1的|D’|值表明在两个位点之间可能在历史上已经发生过重组(回复突变也能导致|D’|小于1，但是对于单核苷酸多态性(SNPs)来说，通常认为这种情况发生的可能性比重组低)。度量r²表示两个位点之间的统计学相关性，如果只出现两个单倍型则取值为1。

r²度量大概是相关性作图的最具相关性的度量，因为在r²和检测易感性位点与SNPs之间的关联性所需的样品大小之间存在简单的反比关系。这些度量是针对成对位点定义的，但是对某些应用来说，可能需要确定在含有许多多态性位点的整个区域上LD有多强(例如测试在位点之间或群体范围内LD的强度是否有显著的差别，或者区域中的LD比在特定模型下预测的更高还是更低)。对整个区域的LD的测量不是直接进行的，而是使用一种方法测量r，这种方法是在群体遗传学中开发的。简单来说，r测量了在特定的群体模型下为了产生在数据中观察到的LD将需要多少重组。这种类型的方法也可能可以为确定LD数据是否为重组热点的存在提供了证据的难题提供统计学上严格的方法。对于本文描述的方法和过程来说，显著的r²值可以是至少0.1，例如至少0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1.0。在一个优选实施方案中，显著的r²值可以是至少0.2。可选地，本文描述的连锁不平衡是指其特征为|D’|的值为至少0.2，例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.85、0.9、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99的连锁不平衡。因此，连锁不平衡表示了不同标记物的等位基因之间的相关性。它由相关性系数或|D’|来度量(r²最高为1.0，|D’|最高为1.0)。连锁不平衡可以如本文描述在单一人类群体中测定，或者可以在含有来自一个以上人类群体的个体的样品集合中测定。在本发明的一个实施方案中，LD在来自一个或多个HapMap群体(高加索人，非洲人，日本人，中国人)的样品中，按照(http://www.hapmap.org)的定义来测定。在一个这样的实施方案中，LD在HapMap样品的CEU群体中测定。在另一个实施方案中，LD在YRI群体中测定。在另一个实施方案中，LD在来自冰岛人群体的样品中测定。

如果在群体水平上基因组中的所有多态性是一致的，那么它们中每个单独的多态性将需要在关联性研究中进行调查。但是，由于多态性之间的连锁不平衡，紧密连锁的多态性是强烈相关的，这减少了在关联性研究中为了观察到显著相关性所需调查的多态性的数量。LD的另一个结果是，许多多态性由于它们是强烈相关的，可能给出关联性信号。

已经在基因组范围内产生了基因组LD谱图，这样的LD谱图已经被建议用作框架对疾病基因进行作图(Risch，N.& Merkiangas，K，Science 273：1516-1517(1996)；Maniatis，N.等，Proc Natl Acad Sci USA99：2228-2233(2002)；Reich，DE等，Nature 411：199-204(2001))。

现在已经确定，人类基因组的许多部分可以被分成一系列不连续的含有几个共同的单倍型的单倍型区块；对于这些区块来说，连锁不平衡数据几乎没有提供表明重组的证据(参见例如Wall.，J.D.和Pritchard，J.K.，Nature Reviews Genetics 4：587-597(2003)；Daly，M.等，Nature Genet.29：229-232(2001)；Gabriel，S.B.等，Science 296：2225-2229(2002)；Patil，N.等，Science 294：1719-1723(2001)；Dawson，E.等，Nature418：544-548(2002)；Phillips，M.S.等，Nature Genet.33：382-387(2003))。

有两种主要的方法用于定义这些单倍型区块：区块可以被定义为具有有限的单倍型多样性的DNA区域(参见例如Daly，M.等，NatureGenet.29：229-232(2001)；Patil，N.等，Science 294：1719-1723(2001)；Dawson，E.等，Nature 418：544-548(2002)；Zhang，K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：7335-7339(2002))，或者定义为使用连锁不平衡鉴定的具有延长的历史上重组的过渡区之间的区域(参见例如Gabriel，S.B.等，Science 296：2225-2229(2002)；Phillips，M.S.等，Nature Genet.33：382-387(2003)；Wang，N.等，Am.J.Hum.Genet.71：1227-1234(2002)；Stumpf，M.P.，和Goldstein，D.B.，Curr.Biol.13：1-8(2003))。更近些时候，在人类基因组范围上重组率的精细图的和相应的热点的图谱已经被产生(Myers，S.等，Science 310：321-32324(2005)；Myers，S.等，Biochem Soc Trans 34：526530(2006))。图谱显示出在基因组范围内的重组中存在大量变化，在热点处重组率高达10-60cM/Mb，而在过渡区中接近于0，因此代表了有限单倍型多样性和高LD的区域。因此，谱图可用于将单倍型区块/LD区块定义为重组热点两翼的区域。在本文中使用的术语“单倍型区块”或“LD区块”包含了由任何上述的特征、或本技术领域的专业人员用于定义这种区域所用的其它可选方法定义的区块。

使用单个标记物或含有多个标记物的单倍型，单倍型区块可用于对表型和单倍型状态之间的相关性进行作图。可以在每个单倍型区块中鉴定主要的单倍型，然后可以鉴定一组“标签”SNPs或标记物(在单倍型中进行辨别所需的最小组的SNPs或标记物)。这些标签SNPs或标记物然后可用于评估来自个体组的样品，以便鉴定表型和单倍型之间的相关性。如果需要，可以对邻近的单倍型区块同时进行评估，因为在单倍型区块之间也可能存在连锁不平衡。

因此，显然，对于任何给定的观察到的与基因组中的多态性标记物的关联性来说，可能基因组中的其它标记物也显示出关联性。这是基因组范围内LD的不均衡分布的自然结果，正如通过重组率的大的变化所观察到的。因此，在某种意义上，用于检测关联性的标记物代表了与给定疾病或性状有关的基因组区域(即单倍型区块或LD区块)的“标签”，并因此可用于本发明的方法和试剂盒中。在被发现与疾病或性状有关的区域中可以存在有一个或多个引起结果的(功能性)变体或突变。这样的变体可能赋予比用于检测关联性的标签标记物观察到的更高的相对风险(RR)或比值比(OR)。因此，如本文所述，本发明涉及了用于检测与疾病的关联性的标记物，以及与标记物连锁不平衡的标记物。因此，在本发明的某些实施方案中，与本文所述的标记物和/或单倍型连锁不平衡的标记物可以被用作替代标记物。在一个实施方案中，替代标记物具有比最初被发现与本文所述的疾病相关的标记物或单倍型更小的相对风险(RR)和/或比值比(OR)值。在其它实施方案中，替代标记物具有比最初被发现与本文所述的疾病相关的标记物所最初测定的更大的RR或OR值。这样的实施方案的一个例子是与最初被发现与疾病相关的更常见的变体(＞10％群体频率)、例如本文描述的变体连锁不平衡的稀有的或相对稀有的(＜10％等位基因群体频率)变体。鉴定和使用这些标记物用于检测本文描述的本发明人发现的关联性，可以通过本技术领域的专业人员熟知的常规方法来进行，因此也在本发明的范围内。

与本文显示的与心律不齐(例如心房纤颤和心房扑动)和中风有关联的标记物连锁不平衡的某些多态性标记物，有可能位于本文SEQID NO：50中显示的序列所定义的LD区块C04的物理边界之外。这是所述区域中历史上的重组率的结果，历史上的重组可能导致产生了强烈连锁不平衡的区域(LD区块)，它带有与区块内的标记物连锁不平衡的区块外的剩余标记物。这样的标记物也在本发明的范围内，因为利用它们与在本文中显示出的与心律不齐和中风相关联的标记物的遗传关系，它们同样可用于实施本发明。这样的标记物的例子显示在表18中(rs7668322(SEQ ID NO：46)、rs2197815(SEQ ID NO：47)、rs6831623(SEQ ID NO：48)、rs2595110(SEQ ID NO：49))。

单倍型频率的测定

患者和对照组中单倍型的频率可以使用期望最大化算法来估算(Dempster A.等，J.R.Stat.Soc.B，39：1-38(1977))。可以使用这种算法来操作丢失的基因型和阶段的不确定性。在虚假设下，患者和对照被假定具有同样的频率。使用或然性方法，测试可选的假说，其中候选的风险单倍型、可以包含本文描述的标记物、被允许在患者中比对照中具有更高的频率，而两个组中其它单倍型的频率的比率被假设是相同的。在两种假说下分别将或然性最大化，并使用相应的1-df或然性比率统计数值来评估统计学显著性。

为了在连锁区域中寻找有风险和保护性标记物，研究了例如被基因分型的标记物的所有可能组合的关联性，只要那些标记物分布在可实践的区域中。可以将合并的患者和对照组随机分成两组，其大小与原始的患者和对照组相等。然后重复标记物和单倍型分析，确定记录到的最显著的p-值。这种随机化的流程可以被重复例如超过100次，以构建p-值的经验性分布。在优选实施方案中，p-值＜0.05是显著的标记物和/或单倍型关联性的指示。

单倍型分析

进行单倍型分析的一种通用方法包括将基于或然性的推论用于NEsted MOdels(Gretarsdottir S.等，Nat.Genet.35：131-38(2003))。该方法在NEMO程序中执行，允许使用许多多态性标记物、SNPs和微卫星。所述方法和软件被特别设计用于病例-对照研究，其目的是鉴定赋予了不同风险的单倍型组。它也是用于研究LD结构的工具。在NEMO中，在EM算法的帮助下，直接计算了最大或然性估算值、或然性比率和p-值，对于观察到的数据，将其作为缺失数据问题进行处理。

尽管基于从观察到的数据直接计算的或然率的或然率比率检验捕捉到了由于阶段的不确定性和缺失的基因型而丢失的信息，可用于可靠地给出有效的p-值，但了解由于信息的不完整而丢失了多少信息，仍然是有趣的。用于单倍型分析的信息测量测量描述在Nicolae和Kong(技术报告537号，芝加哥大学统计学院统计学系；Biometrics，60(2)：368-75(2004))中，作为为连锁分析定义的信息测量的自然延伸，并在NEMO中执行。

对于单个标记物与疾病的关联性来说，可以使用Fisher精确检验来计算每个单独等位基因的双边p-值。通常来说，除非特别指明，所有显示的p-值没有对多重比较进行调整。显示的频率(对于微卫星、SNPs和单倍型来说)是与携带者频率相反的等位基因频率。为了最小化由于作为连锁分析的家庭召集的患者的亲缘性造成的任何偏差，一级和二级亲属可以从患者名单中消除。此外，通过扩展在Risch，N.&Teng，J.(Genome Res.，8：1273-1288(1998))中描述的偏差调整步骤，合并具有亲缘关系的DNA(同上)以便它可以适用于普通家族关系、并呈递调整过的和未调整的p-值进行比较，可以重复检验，对患者间任何残留的亲缘性进行关联性校正。差异一般来说正如预期一样非常小。为了评估通过多次检验校正的单个标记物关联性的显著性，我们可以使用同样的基因型数据执行随机测试。可以将患者和对照组随机化，将关联性分析重做多次(例如多达500,000次)，在某些重复中对某些标记物等位基因产生的p-值小于或等于我们使用最初的患者和对照组时观察到的p-值，p-值即是这样的重复的分数。

对于单个标记物和单倍型分析来说，通过假设的乘法模型(单倍型相对风险模型)可以计算相对风险(RR)和群体归因风险度(PAR)(Terwilliger，J.D.& Ott，J.，Hum.Hered.42：337-46(1992)和Falk，C.T.& Rubinstein，P，Ann.Hum.Genet.51(Pt 3)：227-33(1987))，即一个人携带的两个等位基因/单倍型的风险的乘积。例如，如果A相对于a的风险是RR，那么纯合子AA的人的风险将是杂合子Aa的人的风险的RR倍，以及纯合子aa的人的风险的RR²倍。乘法模型具有简化分析和计算的良好性质——单倍型在受影响的群体中以及对照群体中是独立的，即处于Hardy-Weinberg平衡。因此，受影响的和对照的单倍型的数量每个都具有多项式分布，但是在可选假设下具有不同的单倍型频率。具体来说，对于两个单倍型h_i和h_j来说，风险(h_i)/风险(h_j)＝(f_i/p_i)/(f_j/p_j)，其中f和p分别是指受影响的群体和对照群体中的频率。尽管如果真正的模型不是乘法的将会损失一些效能，但除了极端情况下之外，损失趋于轻微。最重要的是，p-值总是有效的，因为它们是针对虚假设计算的。

使用NEMO计算连锁不平衡

成对标记物之间的LD可以使用标准定义的D’和r²来计算(Lewontin，R.，Genetics 49：49-67(1964)；Hill，W.G.& Robertson，A.Theor.Appl.Genet.22：226-231(1968))。使用NEMO，通过最大或然性来估算两个标记物等位基因组合的频率，通过或然性比率检验来评估连锁不平衡的偏差。通过平均由边缘等位基因概率权重的两个标记物的所有可能的等位基因组合的值，D’和r²的定义被扩展到包含微卫星。当对所有标记物组合进行作图以阐明特定区域中的LD结构时，我们将D’作图于左上角，将p-值作图于右下角。在LD图中，如果需要的话，标记物可以等间距作图而不按照它们的物理位置作图。

风险评估和诊断学

正如本文所述，某些多态性标记物和含有这样的标记物的单倍型被发现可用于心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)或中风的风险评估。风险评估可以包括使用标记物来诊断对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)或中风的易感性。多态性标记物的特定等位基因，在患有心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)或中风的个体中发现的频率，比在没有诊断出心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)或中风的个体中的频率更高。因此，这些标记物等位基因对于在个体中检测心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)或中风、或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)或中风的易感性，具有预测价值。含有风险标记物、例如本文描述的标记物的单倍型区块或LD区块中的标签标记物，可用作单倍型区块或LD区块中其它标记物和/或单倍型的替代物。具有等于1的r²值的标记物是风险变体的完美的替代物，即一个标记物的基因型完美地预测了另一个的基因型。具有小于1的r²值的标记物也可以作为风险变体的替代物，或者可选地代表相对风险值等于或可能甚至高于风险变体的变体。鉴定到的风险变体本身可以不是功能变体，但是在这种情况下与真正的功能变体连锁不平衡。本发明包括了为本文公开的标记物评估这样的替代标记物。这样的标记物被注解、作图和列表在专业技术人员熟知的公共数据库中，或者可选地，可以通过对使用本发明的标记物在一组个体中鉴定到的区域或区域的一部分进行测序，并在得到的序列组中鉴定多态性，来容易地鉴定。结果，本技术领域的专业人员可以容易地并且不需要繁琐的实验，对与本文描述的标记物和/或单倍型连锁不平衡的替代标记物进行基因分型。与检测到的风险变体连锁不平衡的标签或替代标记物，对于在个体中检测与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的关联性或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性，也具有预测价值。这些与本发明的标记物连锁不平衡的标签或替代标记物也可以包括其它在单倍型中不同的标记物，因为它们同样对于检测对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性，具有预测价值。

本发明的标记物和单倍型，例如在表5和9中显示的标记物以及与其连锁不平衡的标记物，可单独或组合地用于风险评估和诊断目的。因此，即使是在单个标记物造成的风险增加相对温和、即在10-30％的级别的情况下，关联性也可以具有明显的暗示。因此，相对普通的变体可能对总的风险有显著的贡献(群体归因风险度高)，或者标记物的组合可用于定义基于标记物的组合风险、对发生疾病有显著的组合风险的个体组。

因此，在本发明的一个实施方案中，多个变体(标记物和/或单倍型)被用于总体风险评估。在一个实施方案中，这些变体选自本文公开的变体。其它实施方案包括了使用本发明的变体与其它已知可用于诊断对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的变体的组合。在这样的实施方案中，在个体中确定了多个标记物和/或单倍型的基因型状态，并将个体的状态与相关变体的群体频率、或在临床健康的对象例如年龄匹配和性别匹配的对象中变体的频率进行比较。然后可以使用本技术领域已知的方法、例如多变量分析或联合风险分析，来确定根据多个位点处的基因型状态所赋予的总的风险。然后可以将基于这样的分析进行的风险评估用于本文描述的本发明的方法和试剂盒中。

如上所述，人类基因组的单倍型区块结构具有这样的作用，即与最初与疾病或性状相关的变体连锁不平衡的大量变体(标记物和/或单倍型)可以用作替代标记物，用于评估与疾病和性状的关联性。这样的替代标记物的数量依赖于几种因素，例如区域中的历史重组率、区域中的突变频率(即区域中多态性位点或标记物的数量)、以及区域中连锁不平衡的程度(LD区块的大小)。这些标记物通常位于使用本文描述的方法或通过本技术领域的专业人员已知的其它方法确定的所述LD区块或单倍型区块的物理边界内。但是，有时会发现标记物和单倍型关联性延伸到定义的单倍型区块的物理边界之外。在这样的情况下，这些标记物和/或单倍型也可用作物理上位于定义的单倍型区块内的标记物和/或单倍型的替代标记物和/或单倍型。因此，与本发明的标记物和单倍型连锁不平衡(典型的特征为r²大于0.1，例如r²大于0.2，包括r²大于0.3，也包括r²大于0.4)的标记物和单倍型也在本发明的范围之内，即使它们在物理上位于所定义的单倍型区块的边界之外。这包括了本文描述的标记物(例如表5和表9)，但是也可以包括与表5和9中列出的一种或多种标记物强烈连锁不平衡(例如特征为r²大于0.1或0.2，和/或|D’|＞0.8)的其它标记物。

对于本文描述的SNP标记物来说，与在患者中被发现是过量的等位基因(风险等位基因)相反的等位基因，在心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风患者中被发现具有降低的频率。这些标记物和单倍型与这样的标记物连锁不平衡和/或含有它们，因此对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风具有保护性，即它们赋予了携带有这些标记物和/或单倍型的个体以降低的发生心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的风险或易感性。

本发明的某些变体、包括某些单倍型，在某些情况下包含各种遗传标记物例如SNPs和微卫星的组合。单倍型的检测可以通过本技术领域已知的和/或本文描述的用于检测多态性位点的序列的方法来进行。此外，某些单倍型或标记物组与疾病表型之间的关联性可以使用标准的技术来证实。用于关联性的简单检验的一个代表性例子是在2x2表格上进行的Fisher精确检验。

在特定实施方案中，被发现与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的标记物或单倍型(例如列于表5(表5A和5B)、表9和/或表19中的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物)，是其中标记物或单倍型在具有心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风风险的个体(受影响的人)中出现的频率，比它在健康个体(对照)中出现的频率高的标记物或单倍型，其中标记物等位基因或单倍型的存在是心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感性的指示。在其它实施方案中，与一个或多个被发现与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的标记物(例如列于表5A和5B中的标记物等位基因，以及与其连锁不平衡的标记物)连锁不平衡的风险标记物，是在具有心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风风险的个体(受影响的人)中出现的频率比它们在健康个体(对照)中出现的频率高的标签标记物，其中标签标记物的存在是对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的增加的易感性的指示。在另一个实施方案中，与一个或多个被发现与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的标记物(例如列于表5A和5B中的标记物等位基因，以及与其连锁不平衡的标记物)连锁不平衡的风险标记物等位基因(即赋予增加的易感性)，是含有一个或多个在具有心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风风险的个体中出现的频率，比它们在健康个体(对照)中出现的频率高的等位基因的标记物，其中标记物的存在是对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风增加的易感性的指示。

研究群体

从普遍意义上讲，本发明的方法和试剂盒可以使用含有来自任何来源、即任何个体的基因组DNA的样品。在优选实施方案中，个体是人类个体。个体可以是成年人、儿童或胎儿。本发明还提供了对属于靶群体的成员的个体中标记物和/或单倍型的评估。在一个实施方案中，这样的靶群体是根据其它遗传因子、生物标记物、生物物理参数(例如体重、BMD、血压)、或总体健康和/或生活方式参数(例如疾病或相关疾病史、以前对疾病的诊断、疾病的家族史)，具有发生疾病的风险的个体的群体或组。

本发明提供了包含特定年龄亚组的个体的实施方案，例如超过40岁、超过45岁、或超过50、55、60、65、70、75、80或85岁的年龄亚组。本发明的其它实施方案对应于其它的年龄组，例如年龄小于85岁的个体，例如小于80岁、小于75岁、或小于70、65、60、55、50、45、40、35或30岁。其它实施方案涉及发病时的年龄在任何上述年龄范围内的个体。在某些实施方案中，还考虑到了年龄的范围可以是相关的，例如发病时的年龄大于45岁但小于60岁。但是，其它的年龄范围也被考虑到了，包括由上面列出的年龄值界定的所有范围。

其它实施方案涉及了发病年龄在特定年龄或年龄段的个体。因此，遗传的和非遗传的倾向性因子可能在什么年龄影响个体发生疾病，这是已知的。对于心血管疾病、包括心律不齐和中风来说，常见的风险因子可以影响个体是否以及在什么年龄发生疾病。因此，本发明的某些实施方案涉及了在某个年龄段中心律不齐(例如心房纤颤和/或心房扑动)或中风的发病年龄或诊断时的年龄。在一个实施方案中，具有发生中心律不齐(例如心房纤颤和/或心房扑动)或中风的风险的个体的发病年龄或诊断年龄在40岁以上。在其它实施方案中，个体的发病年龄或诊断年龄超过45岁，或超过50、55、60、65、70、75、80或85岁。本发明的其它实施方案I涉及了发病年龄或诊断年龄在85岁以下，例如在80岁以下、75岁以下或70、65、60、55、50、45、40、35或30岁以下的个体。一个优选实施方案包含了在80岁以下被诊断患有心房纤颤或心房扑动或中风的个体。另一个优选实施方案涉及了在70岁以下被诊断患有心房纤颤或心房扑动或中风的个体。另一个优选实施方案涉及了在60岁以下被诊断患有心房纤颤或心房扑动或中风的个体。另一个优选实施方案涉及了在50岁以下被诊断患有心房纤颤或心房扑动或中风的个体。其它实施方案涉及了发病年龄在上面描述的具体年龄段中的个体。也考虑到了在某些实施方案中，年龄段可以是相关的，例如发病年龄大于45岁但小于60岁，发病年龄大于60岁但小于70岁，发病年龄大于70岁但小于80岁，或发病年龄大于60岁但小于80岁。但是，其它的年龄段也被考虑到了，包括由上面列出的年龄值界定的所有年龄段。

本发明还涉及了任何性别、男性或女性的个体。它还提供了涉及来自一个或多个人类种群的人类对象的实施方案，包括但不限于班图人、Mandenk、约鲁巴人、San、木布提矮人、奥克尼群岛人、Adygel、俄罗斯人、萨丁尼亚人、托斯卡尼人、莫扎比特人、贝多因人、Druze、巴勒斯坦人、俾路支人、布拉灰人、莫克兰人、信德人、帕坦人、布鲁肖人、哈扎拉人、维吾尔人、kalash、汉族人、傣族人、达斡尔人、赫哲族人、拉祜族人、苗族人、鄂伦春族人、畲族人、土家族人、土族人、锡伯族人、彝族人、内蒙古族人、纳西族人、柬埔寨人、日本人、雅库特人、美拉尼西亚人、巴布亚人、加里提亚拿人、Surui、哥伦比亚人、玛雅人和皮玛族人。本发明还涉及了欧洲人群体、美洲人群体、欧亚人群体、亚洲人群体、中/南亚人群体、东亚人群体、中东人群体、非洲人群体、西班牙人群体和大洋洲人群体。欧洲人群体包括但不限于瑞典人、挪威人、芬兰人、俄罗斯人、丹麦人、冰岛人、爱尔兰人、凯尔特人、英格兰人、苏格兰人、荷兰人、比利时人、法国人、德国人、西班牙人、葡萄牙人、意大利人、波兰人、保加利亚人、斯拉夫人、塞尔维亚人、波斯尼亚人、捷克人、希腊人和土耳其人群体。

在一个优选实施方案中，本发明涉及了含有非洲黑人血统的群体，例如含有非洲人血统或谱系的人的群体。非洲黑人血统可以通过自己报告确定为非洲裔美国人(African-Americans)、非裔美国人(Afro-Americans)、美国黑人(Black Americans)，是黑色人种的一个成员，或黑人人种的一个成员。例如，非洲裔美国人或美国黑人是居住在北美并且起源于任何非洲黑色人种组的人。在另一个例子中，自己报告的非洲黑人血统的人可以具有至少一个非洲黑人血统的父母，或至少一个非洲黑人血统的祖父母。

个体对象中的种族组成也可以通过遗传分析来确定。血统的遗传分析可以使用不连锁的微卫星标记物来进行，例如在Smith等(Am JHum Genet 74，1001-13(2004))中提出的那些。

在某些实施方案中，本发明涉及了如上所述在特定群体中鉴定到的标记物和/或单倍型。本技术领域的专业人员将会认识到，在对不同的群体使用时，连锁不平衡(LD)测量将给出不同的结果。这是由于不同人类群体的不同群体史，以及在特定基因组区域中可能导致LD差异的不同选择压力。对于本技术领域的专业人员来说，某些标记物例如SNP标记物在一个群体中是多态性的但在另一个群体中不是，这种情况是熟知的。但是，本技术领域的专业人员将使用可用的或如本文教导的方法，在任何给定的人类群体中实施本发明。这可以包括评估本发明的LD区域中的多态性标记物，以便鉴定出那些在特定群体中表现出最强关联性的标记物。因此，本发明的有风险变体可以在不同的单倍型背景上、并以不同的频率存在于各种不同人类群体中。但是，使用本技术领域已知的方法和本发明的标记物，可以在任何给定人类群体中实施本发明。

遗传测试的用途

本技术领域的专业人员将会认识到并理解，一般来说，本文描述的变体本身不能提供将发生心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的个体的绝对鉴定。但是，本文描述的变体表明了携带有本发明的风险或保护性变体的个体将发生与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的症状的增加的和/或降低的可能性。但是，该信息本身是极具价值的，正如在下文中更详细指出的，因为它可以用于例如在早期阶段启动预防性措施，进行定期的生理和/或心理检查以监测症状的发展和/或出现，或计划定期的检查以鉴定所述的病症，以便能够在早期阶段实施治疗。

关于赋予了发生心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的风险的遗传变体的知识，为使用遗传测试辨别具有发生疾病的增加的风险的个体(即风险变体的携带者)和具有发生疾病的降低的风险的个体(即保护性变体的携带者)提供了机会。对于属于上述两个组的个体来说，遗传测试的核心价值是能够在早期阶段诊断心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的可能性，或心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的倾向性，以及为临床医师提供关于心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的预后的信息，以便能够实施最合适的治疗。

具有心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风家族史的个体和风险变体的携带者可以从遗传测试中获益，因为对遗传风险因子的存在的了解、或成为一个或多个风险因子的携带者的增加的风险的证据，可以为通过避免或最小化与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的心血管疾病的已知环境风险因子，来实行更健康的生活方式提供增加的激励。心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风患者的遗传测试，可以进一步给出关于疾病的首要原因的有价值的信息，可以帮助临床医生为每个个体选择最适合的疗法和药物治疗。

本发明还涉及对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的风险评估，包括确定个体是否具有发生心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的风险。本发明的多态性标记物可以单独或组合使用，以及与其它因子、包括其它遗传风险因子或生物标记物相组合，用于对个体进行心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的风险评估。许多已知影响个体对发生心血管疾病的风险的倾向性的因子，是心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性因子，它们对于本技术领域的专业人员来说是已知的，并可用于这样的评估的中。这些包括但不限于年龄、性别、吸烟状态、体育活动、腰围臀围比、心律不齐(特别是心房纤颤和/或心房扑动)和/或中风的家族史、以前诊断的心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风、肥胖症、高甘油三酯血症、低HDL胆固醇、高血压、升高的血压、胆固醇水平、HDL胆固醇、LDL胆固醇、甘油三酯、载脂蛋白AI和B水平、纤维蛋白原、铁蛋白、C反应性蛋白和白三烯水平。已经与心房纤颤/心房扑动和中风相关联的具体的生物标记物被讨论在Allard等(Clin Chem51：2043-2051(2005))和Becker(J Thromb Thrombolys 19：71-75(2005))中。它们包括但不限于纤维蛋白D-二聚体、凝血酶原活化片段1.2(F1.2)、凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)、纤维蛋白肽A(FPA)、脂蛋白相关的磷脂酶A2(Ip-PLA2)、β-血小板球蛋白、血小板因子4、P-选择素、von Willebrand因子、利尿钠肽前体(BNP)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、PARK7、二磷酸核苷激酶(NDKA)、tau、神经元特异性烯醇化酶、B型神经营养性生长因子、星形神经胶质蛋白S-100b、神经胶质纤丝酸性蛋白、C-反应性蛋白、血清淀粉样肽A、基质金属蛋白酶-9、血管和细胞内细胞粘附分子、肿瘤坏死因子α和白介素，包括白介素-1、-6和-8。循环系统祖细胞也已经被暗示可以作为AF的有用的生物标记物。在具体的实施方案中，对于个体确定了一个以上的生物标记物，并与本文描述的至少一个多态性标记物的确定结果相结合。优选情况下，测量来自个体的血浆或血清中的生物标记物，可选地，可以在其它含有可测量量的生物标记物的适合的组织中测量生物标记物，这样的实施方案也在本发明的范围之内。

本技术领域已知的方法可用于总体风险评估，包括多变量分析或逻辑回归。

心房纤颤对于个体患者和卫生护理系统整体来说都是非常重要的疾病。它可能是永久性的病症，但是也可以是突发性的并复发，在这种病例中它对诊断可能非常具有挑战性。心房纤颤和心房扑动的最具破坏性的并发症是衰弱性中风的发生。重要的是，中风在永久性和突发性心房纤颤中风险是相等的。已经重复地显示出，使用华法林抗凝结的疗法在心房纤颤的情况下可以显著降低中风的第一次和进一步的突然发作。因此，法华令的抗凝结作用对于几乎所有患有心房纤颤的患者来说是用于预防中风的标准疗法，不论它们是永久性的还是突发性类型。唯一不强烈推荐使用华法林的患者是年龄小于65岁的被认为是低风险的患者，即它们不具有器质性心脏病，包括没有高血压、没有冠状动脉疾病、没有以前的中风或暂时性缺血性发作史、没有糖尿病。该组患者对中风具有较低的风险，推荐使用阿司匹林进行中风预防。

由于突发性心房纤颤的本质，它可能非常难以诊断。当患者由于疾病相关的症状例如心悸、胸痛、呼吸短促、眩晕、心衰、暂时性缺血性发作或甚至中风而寻求医学关注时，可能已经恢复到正常的心脏节律，从而妨碍了心律不齐的诊断。在这些情况中，频繁实施心律监控以诊断病症。心律通常被连续监测24到48小时。不幸的是，心房纤颤的发作时无法预料的，使用这种方法经常会错过。诊断心律不齐、建立推荐的疗法、以及可能防止使人衰弱的第一次或复发的中风的机会，可能被错过，导致对病人的毁灭性结果。当对心房纤颤的怀疑非常强时，有时可以获得并使用延长的和更复杂的心律监测测量。这些测试是昂贵的，使用现有方法的诊断率通常较低，它们被零散地用于这种指征。在这些情况下，使用遗传测试的其它风险分级作用可能是极其有用的。了解所述个体携带有风险还是保护性遗传变体，对于诊断和/或治疗决定的做出可能是无法估价的贡献。在某些情况下，这种方式可以避免不必需的测试和治疗，在其它情况下，在更具攻击性的诊断方法的帮助下，心律不齐可以被诊断，和/或可以开始适当的治疗，从而消除了后来的疾病的并发症。

发明方法

在这里描述了对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风进行风险评估的方法，这些方法包含在本发明中。本发明还包含了评估个体对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的治疗药剂发生反应的可能性的方法，以及用于预测治疗药剂对治疗患者心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的有效性的方法。本发明还包含了用于分析来自对象的样品、以检测对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的试剂盒。

本发明的诊断和筛选分析方法

在某些实施方案中，本发明涉及了通过检测在心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风对象、或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感的对象中出现得更频繁的遗传标记物的特定等位基因，来诊断、或帮助诊断心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感性的方法。在特定实施方案中，本发明是通过检测至少一个多态性标记物(例如本文描述的标记物)的至少一个等位基因，来诊断对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的方法。通过本发明描述的方法，特定标记物的特定等位基因或单倍型的检测，是对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感性的指示。这样的预后或预测分析也可用于在心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的症状发作之前，确定对象的预防性治疗。

在某些实施方案中，本发明涉及了诊断、例如由专业医务人员执行的诊断的临床应用的方法，该方法可以包括评估或确定遗传风险变体及其说明。在其它实施方案中，本发明涉及了由外行人或非专业医务人员执行的风险评估(或诊断)的方法。基因分型技术中的最新技术进展，包括SNP标记物的高通量基因分型、例如分子倒置探针阵列技术(例如Affymetrix GeneChip)和BeadArray技术(例如IlluminaGoldenGate和Infinium分析)，已经使个体对他们自己的基因组的大量变体、或多达一百万个SNPs同时进行评估成为可能。得到的对个体可用的基因型信息，可以与来自公开的科学文献的关于与各种SNPs有关的疾病或性状风险的信息相比较。因此，本文描述的与疾病相关的等位基因的诊断应用，可以由健康专业人员根据临床测试的结果来进行，也可以由外行人或非专业医务人员，包括通过SNP基因分型为执行SNPs的评估提供服务的个体，在个体SNP的基础上或通过大规模的高通量的方法、例如阵列技术来进行。换句话说，根据遗传风险对易感性进行的诊断或评估，可以由健康专业人员、遗传顾问、基因分型服务提供者或外行人，根据他/她的基因型的信息以及关于各种不同风险因子的出版物，来做出。在本发明的上下文中，术语“诊断”和“诊断易感性”，意指任何可用的诊断方法，包括上面提到的诊断方法。

此外，在某些其它的实施方案中，本发明涉及通过检测在心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风患者中比在没有诊断出心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的个体中或总人群中出现频率低的特定遗传标记物等位基因或单倍型，来诊断或帮助诊断对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的降低的易感性的方法。

正如本文所述和示例的，特定的标记物等位基因或单倍型(例如在表5(表5A和5B)中列出的标记物和单倍型，以及与其连锁不平衡的标记物，例如在表4和/或9中列出的标记物以及与其连锁不平衡的标记物，例如表19中显示的标记物)与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关。在一个实施方案中，标记物等位基因或单倍型是赋予了对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的显著风险或易感性的标记物等位基因或单倍型。在另一个实施方案中，本发明涉及了在人类个体中诊断对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的方法，方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表5A和表5B中列出的多态性标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。在另一个实施方案中，本发明涉及通过筛选在表5A和5B中列出的至少一个标记物等位基因或单倍型、或与其连锁不平衡的标记物，在人类个体中诊断心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的方法。在另一个实施方案中，标记物等位基因或单倍型在患有心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感的对象(受影响的)中出现的频率，与它在健康的对象(对照，例如群体对照)中出现的频率相比，更高。在某些实施方案中，至少一个标记物等位基因或单倍型的关联性的显著性的特征为p-值＜0.05。在其它实施方案中，关联性的显著性的特征为p-值更小，例如＜0.01、＜0.001、＜0.0001、＜0.00001、＜0.000001、＜0.0000001、＜0.00000001或＜0.000000001。

在这些实施方案中，至少一个标记物等位基因或单倍型的存在是对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的指示。这些诊断方法包括检测与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的至少一个标记物等位基因或单倍型的存在或不存在。本文描述的单倍型包括各种不同遗传标记物(例如SNPs、微卫星)的等位基因的组合。构成特定单倍型的特定遗传标记物等位基因的检测，可以通过本文描述的和/或本技术领域已知的各种不同方法来进行。例如，遗传标记物可以在核酸水平上(例如通过直接的核苷酸测序或通过其它本技术领域的专业人员已知的方法)检测，也可以在氨基酸水平上检测，如果遗传标记物影响了由心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关核酸编码的蛋白的编码序列的话(例如，通过蛋白测序或通过使用识别这样的蛋白的抗体的免疫分析)。本发明的标记物等位基因或单倍型对应于与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的基因组DNA序列的片段。这样的片段含有所述的多态性标记物或单倍型的DNA序列，但是也可以含有与标记物或单倍型强烈LD(连锁不平衡)的DNA区段。在一个实施方案中，这样的区段含有由r²值大于0.2和/或|D’|＞0.8所确定的与标记物或单倍型连锁不平衡的区段。

在一个实施方案中，对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的诊断可以使用杂交方法来实现，例如Southern分析、Northern分析、和/或原位杂交(参见《分子生物学现代方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Ausubel，F.等主编，John Wiley &Sons，包括所有附录)。来自测试对象或个体的基因组DNA、RNA或cDNA生物样品(“测试样品”)是从怀疑患有心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风、对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有倾向性的对象(“测试对象”)获得的。对象可以是成年人、儿童或胎儿。测试样品可以来自于任何含有基因组DNA的来源，例如血液样品、羊水样品、脑脊液样品、或来自皮肤、肌肉、口腔或结膜粘膜、胎盘、胃肠道或其它器官的组织样品。来自胚胎细胞或组织的DNA测试样品可以通过适当的方法获得，例如通过羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样。然后检测DNA、RNA或cDNA样品。特定标记物等位基因的存在可以通过特异性针对特定等位基因的核酸探针的序列特异性杂交来指示。一种以上特定标记物等位基因或特定单倍型的存在，可以通过使用几种序列特异性核酸探针来指示，每种探针特异性针对特定等位基因。在一个实施方案中，单倍型可以通过特异性针对特定单倍型的(即与含有单倍型特征性的特定标记物等位基因的DNA链特异性杂交的)单一核酸探针来指示。序列特异性探针可以被导向以与基因组DNA、RNA或cDNA杂交。本文使用的“核酸探针”可以是与互补序列杂交的DNA探针或RNA探针。本技术领域的专业人员将了解如何设计这样的探针，使得只有在测试样品的基因组序列中存在特定等位基因时，才发生序列特异性杂交。

为了诊断对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性，通过将含有与心房纤颤和/或中风相关的核酸的测试样品、例如基因组DNA样品，与至少一种核酸探针相接触来形成杂交样品。用于检测mRNA或基因组DNA的探针的非限制性例子是能够与本文描述的mRNA或基因组DNA序列杂交的标记的核酸探针。核酸探针可以是例如全长的核酸分子或其一部分，例如长度为至少15、30、50、100、250或500个核苷酸、在严紧条件下足以与适当的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。核苷酸探针的长度可以多达1000个或以上的核苷酸，包括多达500个核苷酸、400个核苷酸、300个核苷酸、200个核苷酸或100个核苷酸。某些实施方案包含了长度为15到1000个核苷酸的核苷酸探针。其它的实施方案涉及长度为15到500个核苷酸、或长度为15到400个核苷酸、或长度为20到400个核苷酸的核苷酸探针的使用。本发明的核苷酸探针的其它大小范围也被考虑到了，正如专业技术人员所熟知的。在一个实施方案中，核酸探针可以包含本文描述的LD区块C04的核苷酸序列的全部或一部分，可选地含有本文描述的标记物的至少一个等位基因，或本文描述的至少一个单倍型，或者探针可以是与这样的序列互补的序列。在特定的实施方案中，核酸探针是本文描述的SEQ ID NO：50中显示的LD区块C04的核苷酸序列的一部分，可选地含有本文描述的标记物的至少一个等位基因，或一个多态性标记物的至少一个等位基因或包含本文描述的至少一个多态性标记物的单倍型，或者探针可以是这样的序列的互补序列。其它适合用于本发明的诊断分析的探针在本文中进行了描述。杂交可以通过本技术领域的专业人员熟知的方法来进行(参见例如《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel，F.等主编，John Wiley & Sons，包括所有附录)。在一个实施方案中，杂交是指特异性杂交，即没有错配的杂交(精确杂交)。在一个实施方案中，特异性杂交的杂交条件是高度严紧的。

特异性杂交、如果存在的话，使用标准方法来检测。如果在核酸探针与测试样品的核酸之间发生了特异性杂交，那么样品含有与核酸探针中存在的核苷酸互补的等位基因。对于本发明的任何标记物、或构成本发明的单倍型的标记物可以重复这个过程，或者可以同时使用多个探针在同一时间检测一个以上的标记物等位基因。设计含有一个以上特定单倍型的标记物等位基因的单个探针(例如探针含有与构成特定单倍型的2、3、4、5个或所有标记物互补的等位基因)，也是可能的。样品中单倍型的特定标记物的检测表明样品源具有特定单倍型(例如单倍型)，因此对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感。

在另一种杂交方法中，Northern分析(参见《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel，F.等主编，JohnWiley & Sons，同上)被用于鉴定与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的多态性的存在。对于Northern分析来说，RNA测试样品通过适合的方法从对象获得。如本文所述，核酸探针与来自对象的RNA的特异性杂交表明了特定等位基因与探针互补。关于核酸探针的使用的代表性的例子，参见例如美国专利Nos.5,288,611和4,851,330。

此外或可选地，在本文描述的杂交方法中，可以在核酸探针以外或代替核酸探针而使用肽核酸(PNA)探针。PNA是DNA模拟物，具有类似肽的无机骨架例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单位，以及通过亚甲基羰基键连接到甘氨酸的氮上的有机碱基(A、G、C、T或U)(参见例如Nielsen，P.等，Bioconjug.Chem.5：3-7(1994))。PNA探针可以被设计成与怀疑含有一个或多个与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的标记物等位基因或单倍型的样品中的分子特异性杂交。因此，PNA探针的杂交可用于诊断心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性。

在本发明的一个实施方案中，收集从对象获得含有基因组DNA的测试样品，并可以使用聚合酶链反应(PCR)扩增含有一个或多个本发明的标记物或单倍型的片段。如本文所述，与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的特定标记物等位基因或单倍型的鉴定，可以使用各种不同的方法来进行(例如序列分析、限制性消化分析、特异性杂交、单链构象多态性分析(SSCP)、电泳分析等)。在另一个实施方案中，诊断通过使用定量PCR(动力学热循环)进行表达分析来实现。该技术可以使用例如商业化的技术，例如(AppliedBiosystems，Foster City，CA)。该技术可以评估由与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的多肽或剪接变体的表达或组成中的变化的存在。此外，变体的表达可以作为物理上或功能上的差异进行定量。

在本发明的另一个方法中，通过限制性消化进行的分析可用于检测特定的等位基因，如果等位基因导致相对于参比序列来说产生或消除了限制性位点的话。可以进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析，例如按照《分子生物学现代方法》(Current Protocols in MolecularBiology，同上)中的描述来进行。相关DNA片段的消化图谱表明了样品中特定等位基因的存在或不存在。

序列分析也可用于检测与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的特定等位基因或单倍型(例如表5(表5A和5B)、表9和/或表19的多态性标记物)。因此，在一个实施方案中，特定标记物等位基因或单倍型的存在或不存在的确定，包括了从对象或个体获得的DNA或RNA的测试样品的序列分析。可以使用PCR或其它适合的方法扩增与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸的一部分，然后可以通过对样品中基因组DNA的多态性位点(或单倍型中的多个多态性位点)进行测序，来直接检测特定等位基因的存在。

通过使用扩增的寡核苷酸与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针的斑点印迹杂交(参见例如Saiki，R.等，Nature，324：163-166(1986))，等位基因特异性寡核苷酸也可用于检测与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸中特定等位基因的存在(例如表5(表5A和5B)、表9和/或表19的多态性标记物)。“等位基因特异性寡核苷酸”(在本文中也称为“等位基因特异性寡核苷酸探针”)是大约10-500个碱基对、大约15-400个碱基对、大约15-200个碱基对、大约15-100个碱基对、大约15-50个碱基对、或大约15-30个碱基对的寡核苷酸，与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸特异性杂交，并在多态性位点上含有特定等位基因(例如本文描述的标记物或单倍型)。特异性针对一个或多个特定的与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸的等位基因特异性寡核苷酸探针，可以使用标准的方法来制备(参见例如《分子生物学现代方法》，(Current Protocols in Molecular Biology)，同上)。可以使用PCR来扩增所需区域。含有扩增的区域的DNA可以使用标准方法进行斑点印迹(参见例如《分子生物学现代方法》，(Current Protocols in MolecularBiology)，同上)，并将印迹与寡核苷酸探针相接触。然后可以检测探针与扩增区域的特异性杂交的存在。等位基因特异性寡核苷酸探针与来自对象的DNA的特异性杂交，是与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的多态性位点上特定等位基因的指示(参见例如Gibbs，R.等，Nucleic Acids Res.，17：2437-2448(1989)和WO 93/22456)。

通过加入类似物例如锁核酸(LNAs)，引物和探针的大小可以被减小到8个碱基。LNAs是一类新的双环状DNA类似物，其中呋喃糖环中的2′和4′位置通过O-亚甲基(氧-LNA)、S-亚甲基(硫-LNA)或氨基亚甲基(氨基-LNA)基团相连接。所有这些LNA变体的共同之处是与互补核酸的亲和性，到目前为止在DNA类似物中是被报道的最高的。例如特别是所有的氧-LNA九聚体当与互补的DNA或RNA复合时，熔点温度(T_m)分别为64℃和74℃，相反，对应的DNA九聚体与DNA和RNA的熔点温度均为28℃。当LNA单体与标准的DNA或RNA的单体组合使用时，也可以获得T_m的显著增加。对于引物和探针来说，取决于含有LNA单体的位置(例如在3′末端、5′末端、或在中间)，T_m可以得到相当大的提高。

在另一个实施方案中，与来自对象的靶核酸序列区段互补的寡核苷酸探针的阵列，可用于在与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸(例如表5A和5B的多态性标记物以及与其连锁不平衡的标记物)中鉴定多态性。例如，可以使用寡核苷酸阵列。寡核苷酸阵列典型地包含多个连接到基质表面上不同已知位置上的不同的寡核苷酸探针。这些寡核苷酸阵列、也被称为“基因芯片”(Genechips^TM)，在本技术领域中已经广泛描述过了(参见例如美国专利No.5,143,854、PCT专利公开Nos.WO 90/15070和92/10092)。一般来说，这些阵列可以使用机械合成方法或组合了光蚀刻方法和固相寡核苷酸合成方法的光指导的合成方法，或通过本技术领域的专业人员已知的其它方法来生产(参见例如Fodor，S.等，Science，251：767-773(1991)；Pirrung等，美国专利No.5,143,854(也参见已出版的PCT申请No.WO 90/15070)；和Fodor.S.等，已出版的PCT申请No.WO92/10092和美国专利No.5,424,186，每个文件的全部教导在此引为参考)。使用机械合成方法合成这些阵列的技术描述在例如美国专利No.5,384,261中，其全部教导在此引为参考。在另一个实施方案中，可以使用线性阵列。关于使用寡核苷酸阵列检测多态性的其它描述可以在例如美国专利Nos.5,858,659和5,837,832中发现，这两个专利的全部教导在此以其全文引为参考。

本技术领域的专业人员可以获得的其它核酸分析方法可用于检测与心房纤颤和/或中风相关的多态性位点中的特定等位基因(例如表5(表5A和5B)、表9和/或表19的多态性标记物)。代表性的方法包括例如直接手动测序(Church和Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1991-1995(1988)；Sanger，F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467(1977)；Beavis等，美国专利No.5,288,644)；自动化荧光测序；单链构象多态性分析(SSCP)；均一变性凝胶电泳(CDGE)；变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Sheffield，V.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：232-236(1989))；迁移率变动分析(Orita，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：2766-2770(1989))；限制性酶分析(Flavell，R.等，Cell，15：25-41(1978)；Geever，R.等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：5081-5085(1981))；异源双链分析；化学错配裂解(CMC)(Cotton，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4397-4401(1985))；RNase保护分析(Myers，R.等，Science，230：1242-1246(1985))；使用识别核苷酸错配的多肽例如大肠杆菌mutS蛋白；以及等位基因特异性PCR。

在本发明的另一个实施方案中，对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的诊断，在本发明的遗传标记物或单倍型导致了多肽的组成或表达发生改变的情况下，可以通过检查与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的多肽的表达和/或组成来进行。因此，对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感性的诊断，在本发明的遗传标记物或单倍型导致了多肽的组成或表达发生改变的情况下，可以通过检测这些多肽中的一个、或与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的另一个多肽的表达和/或组成来进行。本发明的显示出与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的关联性的单倍型和标记物，可能通过它们对这些邻近基因中的一个或多个(例如PITX2基因)的影响来发挥作用。影响这些基因的可能机制包括例如影响转录、影响RNA剪接、改变mRNA可选剪接形式的相对量、影响RNA稳定性、影响从细胞核向细胞质的运输、以及影响翻译的效率和精确性。

因此，在另一个实施方案中，本发明的显示出与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的相关性的变体(标记物或单倍型)，影响了邻近基因的表达。众所周知，影响基因表达的调控元件可以位于与基因的启动子区域相距几十或几百kb的位置。因此，通过分析本发明的至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，评估这样的邻近基因的表达水平是可能的。因此设想，本发明的标记物或单倍型的检测，可用于评估与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关联的一个或多个基因的表达。

各种不同的方法可用于检测蛋白表达水平，包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。评估了来自对象的测试样品中由与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的多肽在表达中的变化和/或组成中的变化的存在。由与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的多肽在表达中的变化可以是例如定量的多肽表达(即产生的多肽的量)的变化。由与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的多肽的组成的变化是定性的多肽表达(例如突变体多肽的表达或不同剪接变体的表达)的变化。在一个实施方案中，对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感性的诊断，通过检测由与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的特定剪接变体或剪接变体的特定图谱来进行。

也可以同时存在这两种变化(定量的和定性的)。本文中使用的多肽表达或组成中的“变化”，是指测试样品中多肽的表达或组成、与对照样品中多肽的表达或组成相比的变化。对照样品是与测试样品相应的样品(例如来自于同样类型的细胞)，来自于没有感染心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风、和/或不具有对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风易感性的对象。在一个实施方案中，对照样品来自于不具有本文描述的标记物等位基因或单倍型的对象。同样地，与对照样品相比，测试样品中一个或多个不同剪接变体的存在，或测试样品中明显不同量的不同剪接变体的存在，可以表明对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性。在等位基因相对于对照样品中的参比改变了剪接位点的情况下，与对照样品相比，测试样品中多肽的表达或组成的变化可以指示特定的等位基因。用于检测核酸编码的多肽的表达和组成的各种不同的方法对于本技术领域的专业人员来说是已知的，并且都可以使用，包括光谱法、比色法、电泳、等电聚焦和免疫分析(例如David等，美国专利No.4,376,110)例如免疫印迹(参见例如《分子生物学现代方法》，(Current Protocols inMolecular Biology)，特别是第10章，同上)。

例如，在一个实施方案中，可以使用能够与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的多肽结合的抗体(例如具有可检测标记的抗体)。抗体可以是多克隆的，也可以是单克隆的。可以使用完整的抗体，也可以使用其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂)。对于探针或抗体来说，术语“标记的”意指包含了通过将可检测物质连接(即物理连接)到探针或抗体上以对探针或抗体直接标记，以及通过与被直接标记的另一种试剂进行反应而对探针或抗体的间接标记。间接标记的例子包括使用标记的第二抗体(例如荧光标记的第二抗体)检测第一抗体，以及用生物素对DNA探针进行末端标记，以便可以使用荧光标记的链亲和素来检测它。

在这种方法的一个实施方案中，将测试样品中与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的核酸编码的多肽的水平或量，与对照样品中多肽的水平或量进行比较。测试样品中多肽的水平或量高于或低于对照样品中多肽的水平或量，使得差异在统计学上显著，表明了核酸编码的多肽的表达发生了变化，并且诊断了负责引起表达差异的特定等位基因或单倍型。可选地，将测试样品中多肽的组成与对照样品中多肽的组成进行比较。在另一个实施方案中，可以对测试样品和对照样品中的多肽的水平或量以及组成二者都进行评估。

在另一个实施方案中，对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性的诊断，通过检测至少一个本发明的标记物或单倍型(例如与表5A和5B中列出的标记物以及与其连锁不平衡的标记物相关的等位基因)，以及与其它基于蛋白的、基于RNA的或基于DNA的分析方法相结合来进行。本发明的方法也可以与对象的家族史和风险因子(例如环境风险因子、生活方式风险因子)的分析组合起来使用。

试剂盒

用于本发明的方法和步骤的试剂盒包含可用于本文描述的任何方法的组分，包括例如杂交探针，限制性酶(例如用于RFLP分析)，等位基因特异性寡核苷酸，与本文描述的本发明的核酸(例如含有至少一个本发明的多态性标记物和/或单倍型的基因组区段)编码的改变的多肽、或本文描述的本发明的核酸编码的未改变的(天然)多肽结合的抗体，用于扩增与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的核酸的手段，用于分析与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的核酸的核酸序列的手段，用于分析与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的核酸编码的多肽的氨基酸序列的手段，等。试剂盒可以包含例如必需的缓冲液、用于扩增本发明的核酸(例如本文描述的一个或多个多态性标记物)的核酸引物、以及使用这些引物对扩增的片段进行等位基因特异性检测的试剂和必需的酶(例如DNA聚合酶)。此外，试剂盒可以提供与本发明的方法组合使用的分析方法的试剂，例如用于心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的诊断分析方法的试剂。

在一个实施方案中，本发明是用于分析从对象获得的样品、以在对象中检测心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的存在、或对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性，其中试剂盒含有在个体的基因组中选择性检测本发明的至少一个多态性的至少一个等位基因所需的试剂。在特定的实施方案中，试剂含有与个体的基因组中含有至少一个本发明的多态性的片段杂交的至少一个连续的寡核苷酸。在另一个实施方案中，试剂含有至少一对与从对象获得的基因组区段的相反链杂交的寡核苷酸，其中每个寡核苷酸引物对被设计成选择性扩增个体的基因组中含有至少一个多态性的片段，其中多态性选自表5A和5B中列出的多态性，以及与其连锁不平衡的多态性标记物。在另一个实施方案中，片段的大小为至少20个碱基对。这样的寡核苷酸或核酸(例如寡核苷酸引物)可以使用表明了心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的多态性(例如SNPs或微卫星)两侧的核酸序列的部分来设计。在另一个实施方案中，试剂盒含有一个或多个标记的核酸，能够对与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的一个或多个特定多态性标记物或单倍型进行等位基因特异性检测，以及用于检测标记的试剂。适合的标记包括例如放射性同位素、荧光标记、酶标记、酶辅助因子标记、磁性标记、自旋标记、表位标记。

在特定实施方案中，通过试剂盒的试剂检测的多态性标记物或单倍型包含一个或一个以上标记物、两个或两个以上标记物、三个或三个以上标记物、四个或四个以上标记物或五个或五个以上标记物，标记物选自表5A和5B中显示的标记物。在另一个实施方案中，被检测的标记物或单倍型包含表5A和5B中显示的标记物。在另一个实施方案中，被检测的标记物或单倍型包括表4和9中列出的标记物。在另一个实施方案中，被检测的标记物或单倍型包括与含有表5A和5B中列出的标记物的组中的至少一个标记物强烈连锁不平衡的标记物组中的至少一个标记物，其中强烈连锁不平衡由r²的值大于0.2所定义。在另一个实施方案中，被检测的标记物或单倍型包括与含有表4和9中列出的标记物的组中的至少一个标记物强烈连锁不平衡的标记物组中的至少一个标记物，其中强烈连锁不平衡由r²的值大于0.2所定义。在另一个实施方案中，被检测的标记物或单倍型含有标记物rs2220427(SEQ ID NO：1)或标记物rs1033464(SEQ ID NO：41)，或与其连锁不平衡的标记物。在另一个实施方案中，被检测的标记物或单倍型含有表19中显示的至少一个标记物。在另一个实施方案中，被检测的标记物或单倍型含有标记物D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ ID NO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)，以及与其连锁不平衡的标记物。在另一个实施方案中，标记物或单倍型含有标记物D4S406的等位基因-2、-4和/或-8、标记物rs2634073的等位基因A、标记物rs2200733的等位基因T、标记物rs2220427的等位基因T、标记物rs10033464的等位基因T、和/或标记物rs13143308的等位基因G。在一个这样的实施方案中，连锁不平衡由r²的值大于0.1所定义。在另一个这样的实施方案中，连锁不平衡由r²的值大于0.2所定义。

在一个优选实施方案中，用于检测本发明的标记物的试剂盒含有与含有被检测的SNP多态性的模板DNA区段杂交的检测寡核苷酸探针，增强子寡核苷酸探针和内切核酸酶。正如前面解释的，检测寡核苷酸探针在其3’末端含有荧光部分或基团，在其5’末端含有淬灭剂，增强子寡核苷酸按照Kutyavin等(Nucleic Acid Res.34：e128(2006))的描述使用。荧光部分可以是Gig Harbor绿或Yakima黄，或其它适合的荧光基团。检测探针被设计成与含有被检测的SNP多态性的短核苷酸序列杂交。优选情况下，SNP位于从末端残基到离检测探针的3’末端-6个残基之间的任何位置。增强剂是在检测探针3’方向上与DNA模板杂交的短的寡核苷酸探针。探针被设计成当两个探针都与模板结合时，在检测探针和增强子核苷酸探针之间存在单个核苷酸缺口。缺口产生了合成的脱碱基位点，可以被内切核酸酶例如内切核酸酶IV识别。酶将染料从完全互补的检测探针上切下，但是不能裂解含有错配的检测探针。因此，通过测量释放出的荧光部分的荧光，可以对由检测探针的核苷酸序列定义的特定等位基因的存在进行评估。

检测探针可以具有任何适合的大小，尽管优选情况下探针相对较短。在一个实施方案中，探针的长度为5-100个核苷酸。在另一个实施方案中，探针长度为10-50个核苷酸，在另一个实施方案中，探针长度为12-30个核苷酸。其它长度的探针也是可能的，并在本技术领域的专业人员的普通技能的范围内。

在优选实施方案中，含有SNP多态性的DNA模板在检测前通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增，用于这种扩增的引物被包含在试剂盒中。在这样的实施方案中，被扩增的DNA被用作检测探针和增强子探针的模板。

在检测探针、增强子探针和/或用于通过PCR扩增模板的引物的某些实施方案中，包括了使用修饰的碱基，包括修饰的A和修饰的G。使用修饰的碱基可用于调整核苷酸分子(探针和/或引物)与模板DNA的熔点温度，例如在含有低百分率G或C碱基的区域中增加熔点温度，其中可以使用具有与其互补的T形成三个氢键的能力的修饰的A，或者用于在含有高百分率G或C碱基的区域中降低熔点温度，例如使用在双链DNA分子中与其互补的C碱基只能形成两个氢键的修饰的G碱基。在优选实施方案中，修饰的碱基被用于设计检测核苷酸探针。在这些方法中可以选择任何专业技术人员已知的修饰碱基，根据本文的教导对适合的碱基进行选择也在专业人员的能力范围内，已知的碱基可以从专业人员已知的商业来源获得。

在一个这样的实施方案中，标记物或单倍型的存在是对心房纤颤和/或中风的易感性(增加的易感性或降低的易感性)的指示。在另一个实施方案中，标记物或单倍型的存在是对心房纤颤和/或中风治疗试剂的反应的指示。在另一个实施方案中，标记物或单倍型的存在是对心房纤颤和/或中风预后的指示。在另一个实施方案中，标记物或单倍型的存在是对心房纤颤和/或中风治疗的进展的指示。这样的治疗可以包括外科干预、药物治疗或通过其它手段(例如生活方式改变)。

治疗药剂

本发明的变体(例如本发明的标记物和/或单倍型，例如表5A和5B和/或表19中列出的标记物)可用于鉴定新的心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的治疗性靶。例如，含有与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风相关的变体(标记物和/或单倍型)的基因或与其连锁不平衡的基因或它们的产物，以及被这些变体基因或它们的产物直接或间接调控或与它们相互作用的基因或它们的产物，可以成为开发治疗性药剂的靶，以治疗心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风、或阻止或延迟与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的症状的出现。治疗性药剂可以含有一种或多种例如小的非蛋白和非核酸分子、蛋白、肽、蛋白片段、核酸(DNA、RNA)、PNA(肽核酸)，或它们的可以调节靶基因或它们的基因产物的功能和/或水平的衍生物或模拟物。

本发明的核酸和/或变体、或含有它们的互补序列的核酸，可用作反义构建物以控制细胞、组织或器官中的基因表达。与反义技术有关的方法对于专业技术人员来说是众所周知的，被描述和综述在《反义药物技术：原理，策略与应用》(AntisenseDrug Technology：Principles，Strategies，and Applications，Crooke主编，Marcel Dekker Inc.，New York(2001))中。一般来说，反义核酸分子被设计成与基因表达的mRNA的区域互补，使得反义分子与mRNA杂交，从而阻断mRNA翻译成蛋白。对于本技术领域的专业人员来说，已知有几类反义寡核苷酸，包括裂解物和阻断物。前者与靶RNA位点结合，激活细胞内核酸酶(例如RnaseH或Rnase L)，其裂解靶RNA。阻断物与靶RNA结合，通过对核糖体进行空间位阻来抑制蛋白的翻译。阻断物的例子包括核酸、吗啉代化合物、锁核酸和甲基膦酸酯(Thompson，Drug Discovery Today，7：912-917(2002))。反义寡核苷酸可直接用作治疗性药剂，也可用于确定和证实基因的功能，例如通过基因敲除或基因击落实验。反义技术被进一步描述在Lavery等，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.6：561-569(2003)，Stephens等，Curr.Opin.Mol.Ther.5：118-122(2003)，Kurreck，Eur.J.Biochem.270：1628-44(2003)，Dias等，Mol.Cancer Ter.1：347-55(2002)，Chen，Methods Mol.Med.75：621-636(2003)，Wang等，Curr.Cancer Drug Targets 1：177-96(2001)和Bennett，Antisense Nucleic AcidDrug.Dev.12：215-24(2002)中。

本文描述的变体可用于选择和设计特异性针对特定变体的反义试剂。使用关于本文描述的变体的信息，可以设计出特异性靶向含有本发明的一个或多个变体的mRNA分子的反义寡核苷酸或其它反义分子。通过这种方式，含有一个或多个本发明的变体(标记物和/或单倍型)的mRNA分子的表达可以被抑制或阻断。在一个实施方案中，反义分子被设计成与靶核酸的特定等位基因形式(即一个或几个变体(等位基因和/或单倍型))特异性结合，从而抑制源自于该特定等位基因或单倍型的产物的翻译，但是不与靶核酸分子在特定多态性位点上的其它或可选的变体结合。

由于反义分子可用于失活mRNA以便抑制基因表达，从而抑制蛋白表达，因此分子可用于治疗疾病或紊乱，例如心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风。方法可以包括用含有与mRNA中的一个或多个区域互补的核苷酸序列的核酶进行裂解，以减弱mRNA被翻译的能力。这样的mRNA区域包括例如蛋白编码区，特别是对应于蛋白的催化活性、底物和/或配体结合位点或其它功能性结构域的蛋白编码区。

自从最初在线虫(C.elegans)中发现以来(Fire等，Nature391：806-11(1998))，在最近的十年中，对RNA干扰(RNAi)现象的研究非常活跃，在近年中，也在积极推行它在治疗人类疾病中的潜在应用(综述在Kim & Rossi，Nature Rev.Genet.8：173-204(2007)中)。RNA干扰(RNAi)，也被称为基因沉默，其基础是使用双链RNA分子(dsRNA)关闭特定的基因。在细胞中，细胞质双链RNA分子(dsRNA)被细胞复合物加工成小干扰RNA(siRNA)。siRNA指导蛋白-RNA复合物靶向靶mRNA上的特定位点，导致mRNA的裂解(Thompson，DrugDiscovery Today，7：912-917(2002))。典型情况下，siRNA分子长度为大约20、21、22或23个核苷酸。因此，本发明的一个方面涉及分离的核酸分子，以及将那些分子用于RNA干扰，即作为小干扰RNA分子(siRNA)。在一个实施方案中，分离的核酸分子的长度为18-26个核苷酸，优选长度为19-25个核苷酸，更优选长度为20-24个核苷酸，更优选长度为21、22或23个核苷酸。

RNAi介导的基因沉默的另一个途径源自于内源性编码的原始微型RNA(pri-miRNA)转录本，它在细胞中被加工以产生前体miRNA(pre-miRNA)。这些miRNA分子从细胞核输出到细胞质中，在这里经历加工以产生成熟的miRNA分子(miRNA)，它们通过识别mRNAs的3’非翻译区中的靶位点，然后通过加工性P-体降解mRNA，来直接抑制翻译(综述在Kim & Rossi，Nature Rev.Genet.8：173-204(2007)中)。

RNAi的临床应用包括掺入合成的siRNA双链体，它们优选大小为20-23个核苷酸，并优选具有2个核苷酸的3’重叠。基因表达的降低是通过靶mRNA的序列特异性设计建立起来的。几个用于这种分子的最适设计和合成的商业化位点对于本技术领域的专业人员来说是已知的。

其它的应用提供了较长的siRNA分子(典型长度为25-30个核苷酸，优选为大约27个核苷酸)，以及小的发夹RNAs(shRNAs；典型长度为大约29个核苷酸)。后者是天然表达的，描述在Amarzguioui等(FEBS Lett.579：5974-81(2005))中。化学合成的siRNAs和shRNAs是体内加工的底物，在某些情况下提供了比较短的设计更强有力的基因沉默(Kim等，Nature Biotechnol.23：222-226(2005)；Siolas等，NatureBiotechnol.23：227-231(2005))。一般来说，siRNAs提供暂时的基因表达沉默，因为它们的细胞内浓度被随后的细胞分裂稀释了。相反，表达的shRNAs介导长期的、稳定的靶转录本的降低，只要shRNA的转录发生就行(Marques等，Nature Biotechnol.23：559-565(2006)；Brummelkamp等，Science 296：550-553(2002))。

因为RNAi分子、包括siRNA、miRNA和shRNA、以序列依赖性的方式起作用，因此本发明的变体(例如与LD区块C04相关的标记物和单倍型，例如表5A和5B中列出的标记物)可用于设计RNAi试剂，它们识别含有特定等位基因和/或单倍型(例如本发明的等位基因和/或单倍型)的特定核酸分子，同时不识别含有其它等位基因或单倍型的核酸分子。因此，这些RNAi试剂可以识别并破坏靶核酸分子。与反义试剂相同，RNAi试剂可用作治疗性药剂(即用于关闭与疾病相关的基因或与疾病相关的基因的变体)，但是也可以用于对基因功能进行表征和证实(例如通过基因敲除或基因击落实验)。

RNAi的递送可以通过本技术领域的专业人员已知的各种方法来进行。使用非病毒递送的方法包括胆固醇、稳定的核酸-脂类颗粒(SNALP)、重链抗体片段(Fab)、适体和纳米颗粒。病毒递送的方法包括使用慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。在某些实施方案中，siRNA分子被化学修饰以增加它们的稳定性。这可以包括在核糖的2’位置的修饰，包括2’-O-甲基嘌呤和2’-氟代嘧啶，它们提供了对Rnase活性的抗性。其它的化学修饰也是可能的，并为本技术领域的专业人员所知。

下面的参考文献为RNAi以及使用RNAi靶向特定基因的可能性提供了进一步的概述：Kim & Rossi，Nat.Rev.Genet.8：173-184(2007)，Chen & Rajewsky，Nat.Rev.Genet.8：93-103(2007)，Reynolds等，Nat.Biotechnol.22：326-330(2004)，Chi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：6343-6346(2003)，Vickers等，J.Biol.Chem.278：7108-7118(2003)，Agami，Curr.Opin.Chem.Biol.6：829-834(2002)，Lavery等，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.6：561-569(2003)，Shi，Trends Genet.19：9-12(2003)，Shuey等，Drug Discov.Today 7：1040-46(2002)，McManus等，Nat.Rev.Genet.3：737-747(2002)，Xia等，Nat.Biotechnol.20：1006-10(2002)，Plasterk等，curr.Opin.Genet.Dev.10：562-7(2000)，Bosher等，Nat.Cell Biol.2：E31-6(2000)和Hunter，Curr.Biol.9：R440-442(1999)。

导致发生疾病包括心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的增加的倾向性或风险的遗传缺陷、或引起疾病的缺陷，可以通过给带有缺陷的对象施用含有修复序列的核酸片段，在遗传缺陷的位点处提供正常的/野生型核苷酸，来永久地校正。这样的位点特异性修复序列可以包含被操作以促进对象的基因组DNA的内源修复的RNA/DNA寡核苷酸。修复序列的施用可以通过适当的载体来进行，例如与聚乙烯亚胺复合、包裹在阴离子脂质体中、病毒载体例如腺病毒载体、或其它适合于促进施用的核酸的细胞内摄入的药物组合物。然后可以克服遗传缺陷，因为嵌合的寡核苷酸诱导正常的序列整合到对象的基因组中，导致正常的/野生型基因产物的表达。替换是可繁殖的，因此提供了永久性的修复和与疾病或病症有关的症状的缓解。

本发明提供了鉴定可用于治疗心律不齐、例如心房纤颤或心房扑动、和/或中风的化合物或药剂的方法。因此，本发明的变体可用作鉴定和/或开发治疗性药剂的靶。这样的方法可以包括分析药剂或化合物调节含有至少一个本发明的变体(标记物和/或单倍型)的核酸或核酸编码的产物的活性和/或表达的能力。这反过来可用于鉴定抑制或改变编码的核酸产物的不需要的活性或表达的药剂或化合物。用于执行这样的实验的分析方法可以在专业技术人员已知的基于细胞的系统或无细胞系统中进行。基于细胞的系统包括天然表达目标核酸分子的细胞，或已经被遗传修饰以表达某些所需核酸分子的重组细胞。

在患者中变体的基因表达可以通过含有变体的核酸序列的表达(例如含有本发明的至少一个变体的基因，它可以被转录成含有至少一个变体的RNA，并进一步翻译成蛋白)、或通过由于变体影响了正常转录本的表达水平或图谱、例如在基因的调节或控制区域中的变体而导致的正常/野生型核酸序列的改变的表达，来进行评估。用于基因表达的分析方法包括直接的核酸分析(mRNA)、表达的蛋白水平的分析、或参与途径例如信号途径的并行化合物的分析。此外，对于信号途径作出响应而被上调或下调的基因的表达，也可以被分析。一个实施方案包括了将报告基因例如荧光素酶与目标基因的调控区可操作连接。

在一个实施方案中，将细胞与候选化合物或药剂相接触，并测定mRNA的表达，可以鉴定基因表达的调节剂。将存在候选化合物或药剂的情况下mRNA的表达水平与不存在化合物或药剂的情况下的表达水平进行比较。根据这种比较，用于治疗疾病例如心房纤颤、心房扑动和中风的候选化合物或药剂可以被鉴定为调节变体基因的基因表达的化合物或药剂。当在存在候选化合物或药剂的情况下与不存在它的情况下相比，mRNA或编码的蛋白的表达统计学显著地增加时，候选化合物或药剂被鉴定为核酸表达的刺激剂或上调物。当在存在候选化合物或药剂的情况下与不存在它的情况下相比，核酸的表达或蛋白水平统计学显著地降低时，候选化合物被鉴定为核酸表达的抑制剂或下调物。

本发明还提供了使用通过药物(化合物和/或药剂)筛选鉴定到的化合物作为基因调节剂(即基因表达的刺激剂和/或抑制剂)来进行治疗的方法。

本发明的另一方面，提供了药物包(试剂盒)，药物包包含治疗性药剂，以及一套本文公开的给人类施用治疗性药剂以诊断性测试本发明的一种或多种变体的说明书。治疗性药剂可以是小分子药物、抗体、肽、反义或RNAi分子，或其它治疗性分子。在一个实施方案中，被鉴定为本发明的至少一种变体的携带者的个体被要求服用处方剂量的治疗性药剂。在一个这样的实施方案中，被鉴定为本发明的至少一个变体的纯合的携带者的个体被要求服用处方剂量的治疗性药剂。在另一个实施方案中，被鉴定为本发明的至少一个变体的非携带者的个体被要求服用处方剂量的治疗性药剂。

评估对治疗性药剂响应的可能性的方法、监测治疗的进展的方法以及治疗的方法

正如本技术领域已知的，个体对具体的疗法(例如治疗性药剂或治疗方法)可能有不同的响应。药物基因组学致力于由于药物特性的改变和/或药物作用的异常或变化，遗传变异(例如本发明的变体(标记物和/或单倍型))是如何影响药物响应的问题。因此，响应差异的基础可以部分通过遗传学方法来确定。由于遗传变异影响药物响应而产生的临床结果，在某些个体中(例如本发明的遗传变体的携带者或非携带者)可能导致药物的毒性或药物的治疗失败。因此，本发明的变体可以确定治疗性药剂和/或方法作用于身体的方式，或者身体代谢治疗性药剂的方式。

因此，在一个实施方案中，多态性位点上特定等位基因或单倍型的存在是对特定治疗方式的不同、例如不同响应率的指示。这意味着被诊断患有心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的患者，以及携带有本发明的多态性的某些等位基因或单倍型(例如本发明的有风险和保护性等位基因和/或单倍型)的患者，将对特定的治疗、药物和/或用于治疗疾病的其它疗法具有较好的、或较糟的响应。因此，标记物等位基因或单倍型的存在或不存在，可以帮助确定对患者应该使用什么疗法。例如，对于新诊断的患者来说，可以评估本发明的标记物或单倍型的存在(例如如本文描述的通过测试源自于血液样品的DNA)。如果患者对标记物等位基因或单倍型阳性(也就是说存在标记物的至少一个特定等位基因或单倍型)，那么医生可以推荐一种特定的疗法，而如果患者对标记物的至少一个等位基因或单倍型阴性，那么可以推荐不同的疗法过程(可以包括推荐进行除了连续监测疾病的进展之外，不进行即时的疗法)。因此，患者的携带者状态可用于帮助确定是否应该进行特定的治疗方式。价值在于能够在早期阶段诊断疾病、以选择最适合的疗法的可能性，并给临床医生提供关于疾病的预后/攻击性的信息，以便能够使用最适合的疗法。

心房纤颤和心房扑动的治疗一般针对两个主要目标：(i)预防中 风和(ii)治疗症状。

(i)中风的预防

在心房纤颤中，抗血凝是用于预防中风的选择疗法，并被表明适合于绝大多数患有这种心律不齐的患者。唯一不强烈推荐使用抗血凝的患者是年龄小于65岁的被认为是低风险的患者，即它们不具有器质性心脏病，没有高血压、没有以前的中风或暂时性缺血性发作史、没有糖尿病。该组总体来说对中风具有较低的风险，推荐使用阿司匹林进行中风预防。对于所有其它患者来说，不论心房纤颤是永久性的、复发突发性的还是复发永久性的，都建议使用抗血凝疗法。不能归纳出出现首次突发性心房纤颤的发作的患者应该被如何治疗，而是需要根据每个患者的个人情况来决定。即使当感觉到患有心房纤颤的患者在使用抗心律不齐疗法(控制节律)后维持了窦性心律时，也建议使用抗血凝疗法，因为这种类型的抗心律不齐疗法不能影响中风的风险。

抗血凝剂。正如上面详细描述的，在心房纤颤中，推荐使用抗血凝来预防心源性脑栓塞和中风。研究得最广泛的口服抗血凝剂是华法林，这种药物被普遍推荐用于心房纤颤中的长期口服抗血凝治疗。华法林除了出血之外几乎没有副作用，但是在疗法过程中需要定期仔细地监测血液值(以测量抗血凝的效果)。口服抗血凝剂显示出在患有心房纤颤的患者中预防中风的前途，并且具有不需要象华法林那样定期监测的优点。但是，已经发现ximelagatran引起了无法解释的肝损伤，并在2006年从市场上撤回。几种药剂可用于静脉内和/或皮下疗法，包括肝素和低分子量肝素(例如依诺肝素、达肝素、亭扎肝素、阿地肝素、那屈肝素和瑞肝素)。当需要快速起始抗血凝作用，或者如果在高风险患者中口服抗血凝疗法必需被中断、或者例如由于一系列步骤使得在其它患者中口服抗血凝疗法长于一周时，推荐使用这些药物治疗。其它的肠胃外抗血凝剂也是可用的，但是不特别推荐用在心房纤颤的疗法中；例如因子Xa抑制剂磺达肝素和艾卓肝素、凝血酶抑制剂lepirudin、比伐芦定和阿加曲班以及达那肝素。

(ii)症状控制。用于控制心房纤颤的症状的医药和外科疗法按照患者个体量身定做，包括使用药物进行心率和/或节律控制、射频切除和/或外科手术。

抗心律不齐药物。一般来说，抗心律不齐药剂被用于抑制心脏心律不齐、包括心房纤颤和心房扑动特征性的心脏异常节律。抗心律不齐药剂的一种分类方法是Vaughan Williams分类，其中定义了五种主要的抗心律不齐药剂。I类药剂是快速钠通道阻断剂，并基于阻断的动力学和强度以及他们对复极化的影响进行亚分类。Ia类型包括丙吡胺、莫雷西嗪、普鲁卡因胺和奎尼丁。Ib类型的药剂是利多卡因、美西律、妥卡尼和苯妥英。Ic类型的药剂是恩卡胺、氟卡胺、普罗帕酮、阿马灵、西苯唑啉和地他铵。II类型的药剂是β阻断剂，它们阻断儿茶酚胺对β-肾上腺素能受体的效应。β阻断剂的例子是艾司洛尔、普萘洛尔、美托洛尔、阿普洛尔、阿替洛尔、卡维地洛、比索洛尔、醋丁洛尔、纳多洛尔、心得静、拉贝洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、噻吗洛尔、倍他洛尔、卡替洛尔、索他洛尔和左旋布诺洛尔。III类型的药剂具有混合的性质，但是总的来说是钾通道阻断剂，并延长复极化。该类型中的药物是胺碘酮、阿齐利特、溴苄铵、多非利特、替地沙米、伊布利特、司美利特、索他洛尔、N-乙酰普鲁卡因胺、盐酸尼非卡兰、维那卡兰和氨巴利特。IV类型的药剂是钙通道阻断剂，包括维拉帕米、米贝拉地尔和地尔硫卓。最后，V类型含有混杂的抗心律不齐药物，包括地高辛和腺苷。

心率控制。心率控制的维持的药理学测量包括β阻断剂、钙通道阻断剂和地高辛。所有这些药物减缓了通过房室结的电传导，并减缓了心室速率对快速心房纤颤的反应。某些主要用于节律控制的抗心律不齐药物(参见下文)也减缓房室结传导速度，因此也减缓了心室的心率反应。这些包括某些III类型的和Ic类型的药物，例如胺碘酮、索他洛尔和氟卡胺。

心脏复律。从心房纤颤或心房扑动的心律复律到窦性心律，可以使用同步直流电心脏复律来电学实现，或使用药物例如伊布利特、胺碘酮、普鲁卡因胺、普罗帕酮和氟卡胺来完成。

心律控制

用于维持窦性心律、即心律控制的药物，主要包括来自III、Ia和Ic类型的抗心律不齐药物例子是来自III类型的索他洛尔、胺碘酮和多非利特，来自Ia类型的丙吡胺、普鲁卡因胺和奎尼丁，以及来自Ic类型的氟卡胺和普罗帕酮。使用这些抗心律不齐药物的治疗是复杂的，可能是危险的，应该在特别训练过使用这些药物的医生的指导下进行。许多抗心律不齐的药物具有严重的副作用，只应该在特定人群中使用。例如，Ic类型的药物不应该用于患有冠状动脉疾病的患者，即使它们可以抑制心房纤颤，它们实际上可以在心房扑动中促进快速心室反应。Ia类型的药物在没有结构性心脏病的患者中应该用作最后的手段。索他洛尔(与大部分III类型的抗心律不齐药物一样)，可以导致QT间期的显著延长、特别是在患有肾衰的患者中，并促进了严重的心室性心律不齐。索他洛尔和多非利特以及Ia类型的药物都需要在住院患者的基础上开始，以监测QT间期。尽管胺碘酮通常具有好的耐受性并被广泛使用，但在长期疗法中，胺碘酮具有许多严重的副作用。

遗传测试如何可以直接影响治疗的选择

当个体出现第一次(被诊断的)突发性心房纤颤的发作，并且或者自发转变成窦性心律、或者在发作后48小时内经历了电复律或化学复律时，开始或者不开始抗血凝疗法的决定，根据所讨论患者的风险情况和管理医生的偏好性而各不相同。这可能是难以作出的选择，因为对患者进行抗血凝疗法对于患者的生活来说有巨大的影响。通常在这样的情况下选择不进行抗血凝疗法，这可能对患者没有显著的结果。另一方面，患者后来可能发生中风，对其进行预防的机会因此可能错过了。在这样的情况下，了解到患者是风险变体的携带者可能是极其重要的，支持了抗血凝疗法的开始。

在65岁以下被诊断患有心房纤颤并被认为具有低的中风风险、即没有器质性心脏病、没有高血压、没有糖尿病并且以前没有中风史的个体，一般仅仅用阿司匹林治疗来预防中风，而不使用抗血凝疗法。如果这样的患者被发现是本文描述的风险变体的携带者，这可以被认为是支持了比推荐的更早开始抗血凝疗法。这将是合理的考虑，因为从心房纤颤导致的中风的结果可能是毁灭性的。

缺血性中风根据被怀疑的病因一般被分类成5种亚类；大动脉动脉粥样硬化、小动脉阻塞、心源性栓塞(大部分由于心房纤颤)、其它已确定病因的中风和未确定病因(没有发现病因或存在一种以上似乎合理的病因)的中风。重要的是，由于心源性栓塞引起的中风具有最高的复发率，最容易使人丧失行动能力，并与最低的存活率相关。因此，必须不能忽视作为中风的主要病因的心房纤颤，特别是因为治疗措施根据亚类而变化。因此，如果个体被诊断患有中风或暂时性缺血性发作，并且尽管标准逐步建立，但合理的病因还没有被鉴定出来，那么了解到患者是风险变体的携带者可能是极有价值的，并且支持了或者开始进行抗血凝治疗，或者开始更具攻击性的诊断测试，以试图诊断心房纤颤。

此外，本发明的标记物可用于增加临床试验的能力和有效性。因此，是本发明的至少一个风险变体的携带者的个体、即是赋予发生心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的增加的风险的至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的携带者的个体，可能更可能对特定的治疗方式、例如上面描述的治疗方式做出响应。在一个实施方案中，携带有特定的治疗(例如小分子药物)所靶向的途径和/或代谢网络中的基因的风险变体的个体，更可能是治疗的响应者。在另一个实施方案中，携带有其表达和/或功能被风险变体改变的基因的个体，更可能是靶向该基因、其表达或其基因产物的治疗方式的响应者。本应用可以提高临床试验的安全性，但是也可以增加临床试验证明出统计学显著的效能的机会，否则这种效能仅限于群体的某些亚组。因此，这种试验的一个可能的结果是，某些遗传变体例如本发明的标记物和单倍型的携带者，统计学显著地可能显示出对治疗性药剂的阳性响应，即当按照处方服用治疗性药剂或药物时，经历了与心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风有关的症状的缓解。

另一方面，本发明的标记物和单倍型可用于指导对特定个体的药物试剂的选择。利用本发明的风险变体，可以实现治疗方式的个性化选择、生活方式的改变或二者的组合。因此，关于本发明的特定标记物的个体状态的信息，在靶基因或基因产物受到本发明的风险变体影响的情况下，可用于选择治疗选项。变体的某些组合可能适合于治疗选项的一种选择，而其它基因变体组合可以靶向其它治疗选项。根据需要，这样的变体组合可以包括一种变体、两种变体、三种变体或四种或四种以上的变体，以临床可靠的精确性确定治疗模式的选择。

计算机执行的应用

本发明还涉及本文描述的与心律不齐(例如心房纤颤和心房扑动)和中风有关联的多态性标记物和单倍型的计算机执行的应用。这样的应用可以用于储存、操作或分析在本发明的方法中有用的基因型数据。一个例子涉及在可读介质上储存来自于个体的基因型信息，以便能够给第三方(例如个体)提供基因型信息，或用于从基因型数据衍生信息，例如通过将基因型数据与关于对心律不齐(例如心房纤颤和心房扑动)和中风的增加的易感性有贡献的遗传风险因子的信息进行比较，并在这些比较的基础上报告结果。

一种这样的情况涉及计算机可读介质。一般来说，这样的介质有能力储存(i)至少一个多态性标记物或单倍型的识别信息；(ii)在患有心律不齐(例如心房纤颤和心房扑动)和/或中风的个体中该至少一个标记物的至少一个等位基因的频率、或单倍型的频率的指示符；以及在参比群体中该至少一个标记物的至少一个等位基因的频率、或单倍型的频率的指示符。参比群体可以是无疾病的个体的群体。可选地，参比群体是来自总群体的随机样品，因此充分地代表了群体。频率指示符可以是计算出的频率、等位基因和/或单倍型拷贝的计数、或实际频率的归一化的或操作过的值，它们适合用于特定的介质。

其它关于个体的信息也可以储存在介质上，例如血统信息、性别信息、身体属性或特征(包括身高和体重)、生物化学测量值(例如血压、血脂水平、空腹葡萄糖水平、胰岛素反应测量值)、生物标记物结果、或其它希望与特定个体的基因型状态一起储存或操作的有用信息。

本发明还涉及适合用于测定或操作遗传数据的装置，这些遗传数据可用于确定人类个体中对心律不齐(例如心房纤颤和心房扑动)和中风的易感性。这样的装置可以包含计算机可读存储器，以及储存在计算机可读存储器中的用于操作数据的例行程序，以及用于产生含有遗传数据的测量值的输出的例行程序。这样的测量值可以包括例如等位基因或单倍型频率、基因型计数、性别、年龄、表现型信息的值，比值比(OR)或相对风险(RR)、群体可归因风险(PAR)的值，或其它作为原始基因型数据的直接统计数据或基于遗传数据的计算值的有用信息。

上述的应用都可以使用本发明的标记物和单倍型来进行实践，这些标记物和单倍型已经在评估对心律不齐(例如心房纤颤和心房扑动)和中风的易感性的方法中进行了更详细的描述。因此，一般来说，这些应用可以被减少到使用表5、表4、表9和表19中列出的标记物、以及与其连锁不平衡的标记物，来进行实施。在一个实施方案中，标记物或单倍型出现在其序列显示在SEQ ID NO：50中的基因组区段中。在另一个实施方案中，标记物和单倍型包括选自表19所示的标记物的至少一个标记物。在另一个实施方案中，标记物和单倍型包括至少一个选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ IDNO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)的至少一种标记物，任选地包括与其连锁不平衡的标记物。在一个这样的实施方案中，连锁不平衡由r2的数值大于0.1来定义。在另一个这样的实施方案中，连锁不平衡由r2的数值大于0.2来定义。在另一个实施方案中，标记物或单倍型含有选自标记物D4S406中的等位基因-2、-4和/或-8、标记物rs2634073的等位基因A、标记物rs2200733的等位基因T、标记物rs2220427的等位基因T、标记物rs10033464的等位基因T、和/或标记物rs13143308的等位基因G的至少一个等位基因。

核酸和多肽

本文描述的核酸和多肽可用于上面描述的本发明的方法和试剂盒中。

本文使用的“分离”的核酸分子，是与正常情况下位于基因或核苷酸序列两侧(例如在基因组序列中)的核酸分开的，和/或已经从其它转录的序列中(例如在RNA文库中)完全或部分纯化出的核酸分子。例如，本发明的分离的核酸，相对于它自然发生的复杂的细胞环境、或通过重组技术生产时的培养基、或化学合成时的化学前体或其它化学物质来说，可以是基本上分离的。在某些情况下，分离的物质将形成组合物(例如含有其它物质的粗提液)、缓冲系统或试剂混合物的一部分。在其它情况下，物质可以被纯化到例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或柱层析(例如HPLC)测定时基本上均一。本发明的分离的核酸分子可以占所有存在的大分子物质的至少大约50％、至少大约80％或至少大约90％(摩尔数的基础上)。对于基因组DNA来说，术语“分离的”也可以指从与基因组DNA天然关联的染色体分离出的核酸分子。例如，分离的核酸分子可以含有少于大约250kb、200kb、150kb、100kb、75kb、50kb、25kb、10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的、在核酸分子所源自的细胞的基因组DNA中位于核酸分子两侧的核苷酸。

核酸分子可以与其它编码或调节序列融合，并仍被当作是分离的。因此，载体中包含的重组DNA包含在本文使用的“分离的”的定义内。分离的核酸分子也包含异源宿主细胞或异源生物体中的重组DNA分子，以及溶液中的部分纯化的或基本上纯化的DNA分子。“分离的”核酸分子也包括本发明的DNA分子的体内和体外RNA转录本。分离的核酸分子或核苷酸序列可以包括化学合成的或通过重组方法产生的核酸分子或核苷酸序列。这样的分离的核苷酸序列可用于例如编码的多肽的制造、作为探针用于分离同源序列(例如从其它哺乳动物物种)、用于基因作图(例如通过与染色体原位杂交)、或用于检测组织(例如人类组织)中基因的表达，例如通过Northern印迹分析或其它杂交技术。

本发明还涉及了在高度严紧杂交条件下、例如用于选择性杂交的条件下，与本文描述的核苷酸序列杂交的核酸分子(例如与含有本文描述的标记物或单倍型相关的多态性位点的核苷酸序列特异性杂交的核酸分子)。在一个实施方案中，本发明包含了在在高度严紧杂交和清洗条件(例如用于选择性杂交的条件)下，与含有LD区块C04(SEQID NO：50)的核苷酸序列的核苷酸序列杂交的变体。这样的核酸分子可以通过等位基因特异性或序列特异性杂交(例如在高度严紧条件下)来检测和/或分离。用于核酸杂交的严紧条件和方法对于专业技术人员来说是众所周知的(参见例如《分子生物学现代方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Ausubel，F.等，John Wiley & Sons，(1998)，以及Kraus，M.和Aaronson，S.，Methods Enzymol.，200：546-556(1991)，在此以其全文引为参考)。

两个核苷酸或氨基酸序列的百分同一性可以通过出于最适比较的目的将序列进行比对(例如可以在第一个序列的序列中引入缺口)来确定。然后比较相应位置上的核苷酸或氨基酸，两个序列之间的百分同一性是序列共有的同样的位置的数量的函数(即％同一性＝同一的位置的数量/总的位置的数量x100)。在某些实施方案中，出于比较目的进行比对的序列的长度是参比序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。两个序列的实际比较可以通过众所周知的方法来进行，例如使用数学算法。这样的数学算法的非限制性的例子描述在Karlin，S.和Altschul，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993)中。这样的算法被整合在NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中，描述在Altschul，S.等，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997)中。在使用BLAST和带缺口BLAST程序时，可以使用相应程序(例如NBLAST)的缺省参数。参见万维网ncbi.nlm.nih.gov网点。在一个实施方案中，用于序列比较的参数可以被设置为分值＝100，字长＝12，或可以是不同的(例如W＝5或W＝20)。

其它的例子包括了Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法，在Torellis，A.和Robotti，C.，Comput.Appl.Biosci.10：3-5(1994)中描述的ADVANCE和ADAM算法；以及在Pearson，W.和Lipman，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444-48(1988)中描述的FASTA。在另一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分同一性可以使用GCG软件包(Accelrys，Cambridge，UK)中的GAP程序来完成。

本发明还提供了分离的核酸分子，它们含有的片段或一部分在高度严紧条件下，与含有或包含LD区块C04(SEQ ID NO：50)的核苷酸序列、或含有或包含LD区块C04(SEQ ID NO：50)的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列的核酸杂交，其中核苷酸序列含有本文描述的标记物和单倍型中包含的至少一个多态性等位基因。本发明的核酸片段的长度为至少大约15、至少大约18、20、23或25个核苷酸，可以是30、40、50、100、200、500、1000、10,000个或以上的核苷酸长。

本发明的核酸片段在例如本文描述的分析方法中被用作探针或引物。“探针”或“引物”是以碱基特异性的方式与核酸分子的互补链杂交的寡核苷酸。除了DNA和RNA之外，这样的探针和引物包括多肽核酸(PNA)，它描述在Nielsen，P.等，Science 254：1497-1500(1991)中。探针或引物含有与核酸分子的至少大约15个、典型为大约20-25个、在某些实施方案中大约40、50或75个连续的核苷酸杂交的核苷酸序列区域。在一个实施方案中，探针或引物含有本文描述的至少一个多态性标记物的至少一个等位基因或至少一个单倍型，或其互补序列。在特定实施方案中，探针或引物可以含有100个或以下的核苷酸；例如，在某些实施方案中从6到50个核苷酸，或例如从12到30个核苷酸。在其它实施方案中，探针或引物与连续的核苷酸序列或连续的核苷酸序列的互补序列至少70％同一、至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一或至少95％同一。在另一个实施方案中，探针或引物能够与连续的核苷酸序列或连续的核苷酸序列的互补序列选择性杂交。通常情况下，探针或引物还含有标记，例如放射性同位素、荧光标记、酶标记、酶辅助因子标记、磁性标记、自旋标记和表位标记。

本发明的核酸分子、例如本文描述的那些，可以使用专业技术人员熟知的标准分子生物学技术来鉴定和分离。可以将扩增的DNA标记(例如放射性标记)并用作探针，筛选来自人类细胞的cDNA文库。cDNA可以源自于mRNA并包含在适合的载体中。可以分离到相应的克隆，在体内切除后可以获得DNA，然后可以通过本技术领域现有的方法在任一或两个方向上对克隆的插入片段进行测序，以鉴定编码具有适合分子量的多肽的正确的阅读框架。使用这些以及类似的方法，可以对多肽和编码多肽的DNA进行分离、测序和进一步的表征。

一般来说，本发明的分离的核酸序列在Southern凝胶中可以用作分子量标准品，并作为被标记的染色体标记物以对相关基因位置进行作图。核酸序列也可用于与患者中的内源DNA序列进行比较，以鉴定心律不齐(心房纤颤或心房扑动)和/或中风、或对心律不齐(心房纤颤或心房扑动)和/或中风的易感性，以及例如作为探针用于杂交和发现相关的DNA序列或从样品中扣除已知的序列(例如扣除杂交)。核酸序列还可以用于产生引物用于遗传指纹法、使用免疫技术产生抗多肽抗体、和/或作为抗原产生抗DNA抗体或引发免疫应答。

抗体

还提供了特异性结合一种形式的基因产物但是不结合另一种形式的基因产物的多克隆抗体和/或单克隆抗体。还提供了与含有多态性位点或多个位点的变体或参比基因产物的一部分结合的抗体。本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合的抗原结合位点的分子。与本发明的多肽特异性结合的分子，是与该多肽或其片段结合、但是与样品、例如天然含有多肽的生物学样品中的其它分子基本上不结合的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab’)₂片段，可以通过用酶例如胃蛋白酶处理抗体来产生。本发明提供了与本发明的多肽结合的多克隆和单克隆抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一群抗体分子，只含有一种能够与本发明的多肽的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。因此，单克隆抗体组合物典型地表现出对与其发生免疫反应的本发明的特定多肽的单一结合亲和性。

多克隆抗体可以按照以前的描述通过用所需的免疫原例如本发明的多肽或其片段免疫适当的对象来制备。可以通过标准的技术随时间监测被免疫的对象中的抗体滴度，例如使用固定化的多肽的酶联免疫吸附分析(ELISA)。如果需要，可以从哺乳动物(例如从血液)中分离针对多肽的抗体分子，并通过众所周知的技术例如蛋白A层析进一步纯化以获得IgG级份。在免疫后适当的时间，例如当抗体滴度最高时，可以从对象获得生产抗体的细胞，用于通过标准技术制备单克隆抗体，例如最初由Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)描述的杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today 4：72(1983))、EBV杂交瘤技术(Cole等，《单克隆抗体与癌症疗法》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，1985，Inc.，pp.77-96)或trioma技术。用于生产杂交瘤的技术是众所周知的(一般来说，参见《免疫学现代方法》(Current Protocols in Immunology)(1994)Coligan等主编，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)。简单来说，将永生的细胞系(典型为骨髓瘤)与用来自上述的免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(典型为脾细胞)融合，并筛选获得的杂交瘤细胞的培养上清液，以鉴定产生与本发明的多肽结合的单克隆抗体的杂交瘤。

多种众所周知的用于融合淋巴细胞和永生细胞系的方案中的任何一种都可用于产生针对本发明的多肽的单克隆抗体(参见例如《免疫学现代方法》(Current Protocols in Immunology)，同上；Galfre等，Nature 266：55052(1977)；R.H.Kenneth，《单克隆抗体：生物学分析中的新次元》(Monoclonal Antibodies：A New Dimension In BiologicalAnalyses)，Plenum Publishing Corp.，New York，New York(1980)；以及Lerner，Yale J.Biol.Med.54：387-402(1981))。此外，普通技术人员将会认识到，这种方法的许多变化形式也将可以使用。

或者，为了制备分泌单克隆抗体的杂交瘤，可以通过用多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)，从而分离与多肽结合的免疫球蛋白文库成员，来鉴定和分离针对本发明的多肽的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如Pharmacia的重组噬菌体抗体系统，目录号No.27-9400-01；以及Stratagene SurfZAP^TM噬菌体展示试剂盒，目录号No.240612)。此外，特别适合用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的例子可以在下列文献中发现，例如美国专利No.5,223,409，PCT公开号WO 92/18619，PCT公开号WO 91/17271，PCT公开号WO 92/20791，PCT公开号WO92/15679，PCT公开号WO 93/01288，PCT公开号WO 92/01047，PCT公开号WO 92/09690，PCT公开号WO 90/02809，Fuchs等，Bio/Technology 9：1370-1372(1991)，Hay等，Hum.Antibod.Hybridomas3：81-85(1992)，Huse等，Science 246：1275-1281(1989)，和Griffiths等，EMBO J.12：725-734(1993)。

此外，可以使用标准的重组DNA技术制造的、含有人类和非人类部分的重组抗体、例如嵌合和人源化单克隆抗体，在本发明的范围内。这样的嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本技术领域已知的重组DNA技术来生产。

总的来说，本发明的抗体(例如单克隆抗体)可用于通过标准技术、例如亲和层析或免疫沉淀，来分离本发明的多肽。多肽特异性抗体可以便于从细胞纯化天然的多肽以及在宿主细胞中表达的重组生产的多肽。此外，特异性针对本发明的多肽的抗体，可用于检测多肽(例如细胞裂解物、细胞上清液或组织样品中的)，以评估多肽表达的丰度和图谱。作为临床测试步骤的一部分，抗体在诊断上可用于监测组织中的蛋白水平，以例如确定给定治疗方案的效能。抗体可以与可检测底物结合，以便于其检测。可检测的底物的例子包括各种不同的酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射活性物质。适合的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的例子包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光物质的例子包括7-羟基香豆素(umbelliferone)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白，适合的放射活性材料的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

抗体也可用于药物基因组学分析。在这样的实施方案中，针对本发明的核酸编码的变体蛋白、例如由含有本发明的至少一个多态性标记物的核酸编码的变体蛋白的抗体，可用于鉴定需要修改治疗模式的个体。

此外，抗体可用于评估在疾病状态中、例如在疾病的活动阶段中，或者在具有疾病的倾向性的个体中，与蛋白的功能相关的变体蛋白的表达，疾病特别是心律不齐(心房纤颤或心房扑动)和/或中风。特异性针对由含有本文描述的至少一个多态性标记物或单倍型的核酸编码的本发明的变体蛋白的抗体，可用于筛选变体蛋白的存在，例如用于筛选由变体蛋白的存在所指示的对心律不齐(例如心房纤颤或心房扑动)和/或中风的倾向性。

抗体可以用于其它方法中。因此，抗体可以用作诊断工具，用于评估蛋白、例如本发明的变体蛋白，与电泳迁移率、等电点、胰蛋白酶或其它蛋白酶消化分析一起使用，或用于本技术领域的专业人员已知的其它物理分析中。抗体也可用于组织分型。在一个这样的实施方案中，特定的变体蛋白与在特定组织类型中的表达相关联，然后可以使用特异性针对变体蛋白的抗体来鉴定特定的组织类型。

蛋白、包括变体蛋白的亚细胞定位，也可以使用抗体来确定，并且可用于评估各种不同组织的细胞中蛋白的异常亚细胞定位。这样的用途可以用于遗传测试中，但是也可以用于监测特定的治疗模式。在治疗的目的是校正变体蛋白的表达水平或存在、或变体蛋白的异常组织分布或发育表达的情况下，可以使用特异性针对变体蛋白或其片段的抗体来监测治疗的效能。

抗体还可用于抑制变体蛋白的功能，例如通过阻断变体蛋白与结合分子或配偶体的结合。这样的用途也可用于治疗涉及了抑制变体蛋白的功能的治疗的情况中。例如，抗体可用于阻断或竞争性抑制结合，从而调节(即激活或拮抗)蛋白的活性。可以制备针对含有特定功能所需的位点的特定蛋白片段的抗体，或针对与细胞或细胞膜有关的完整蛋白的抗体。为了在体内施用，可以将抗体与其它的治疗有效荷载物连接，例如放射性核素、酶、免疫原性表位或细胞毒性药剂、包括细菌毒素(白喉毒素或植物毒素，例如篦麻毒素)。抗体或其片段的体内半衰期可以通过与聚乙二醇连接进行PEG化而增加。

本发明还涉及在本文描述的方法中使用抗体的试剂盒。这包括但不限于用于检测测试样品中变体蛋白的存在的试剂盒。一个优选实施方案包括抗体例如标记的或可标记的抗体和用于检测生物学样品中的变体蛋白的化合物或试剂，用于测定样品中变体蛋白的量或存在和/或不存在的手段，和用于将样品中变体蛋白的量与标准进行比较的手段，以及使用试剂盒的说明书。

现在，将通过下面的非限制性的实施例对本发明进行举例说明。

实施例

实施例1、在4号染色体上鉴定心房纤颤的风险变体

下面包含了通过SNP标记物的单点分析发现与心房纤颤和中风相关的易感性因子的鉴定的描述。

方法。研究得到了冰岛数据保护委员会和国家生物伦理委员会的批准。

冰岛AF组。患者都是在1987年到2003年间在冰岛雷克雅未克的Landspitali大学医院被诊断患有AF。诊断得到了12导联心电图的证实，证明了没有P波以及，不定期地具有不规则的R-R间隔。所有的ECGs由心脏病专家人工阅读。

冰岛中风组。中风组来自于冰岛的两所主要医院和冰岛心脏联合会。患有出血性中风的患者占所有患者的6％(不包含患有冰岛型遗传性伴淀粉样病变的脑出血的患者和患有蛛网膜下出血的患者)。缺血性中风占总患者的67％，TIAs占27％。在该研究中中风亚类的分布类似于在其它高加索人群体中报道的(Mohr，J.P.，等，Neurology，28：754-762(1978)；L.R.Caplan，In Stroke，A Clinical Approach(中风的临床方法)，Butterworth-Heinemann，Stoneham，MA，第三版，(1993))。

基因分型。使用来自Illumina的Infinium HumanHap300 SNP芯片，对437个冰岛被诊断患有心房纤颤(AF)的个体和7406个群体对照进行了基因组范围的扫描，该芯片可以在单个芯片(Illumina，San Diego，CA，USA)上分析大约317,000个单核苷酸多态性(SNPs)。在其它病例-对照组中进行的SNP基因分型的重复使用Centaurus平台(Nanogen)来进行。对于总共347个被诊断患有中风的个体和7497个对照，也进行了被发现与心房纤颤相关的LD区块中的SNPs的分析。

关联性分析的统计学方法。对于单标记物与心房纤颤或中风的关联来说，我们使用了或然性比率检验了计算每个等位基因的双面p-值。我们假设乘法模型，计算了相对风险(RR)和群体归因风险(PAR)(C.T.FaIk，P.Rubinstein，Ann Hum Genet 51(Pt 3)，227(1987)；J.D.Terwilliger，J.Ott，Hum Hered 42，337(1992))。对于CEPH高加索人HapMap数据来说，我们使用了D′(R.C.Lewontin，Genetics 50，757(1964))和R²(W.G.Hill，A.Robertson，Genetics 60，615(Nov，1968))的标准定义来计算成对SNPs之间的LD。当对所有的SNP组合进行作图以阐明特定区域中的LD结构时，我们将D′作图在左上角，p-值作图在右下角。在我们给出的LD图中，标记物被等距离作图，而不是按照它们的物理位置作图。

结果

基因组范围的关联性研究

使用Illumina 330K芯片，我们对437个冰岛心房纤颤患者和7406个群体对照个体进行了成功的基因分型。使用单一SNPs进行了关联性分析。对于标记物rs2220427和rs2220733发现了最显著的关联性，二者都给出了接近10^-9的p-值。在对执行的测试的数量进行校正后，rs2220427的值是显著的，即在基因组范围的水平上，关联性是显著的。

在患病的个体中存在显著过量的纯合子。我们排除了乘法模型(P＝.002)和隐性模型(P＝.001)。拟合最好的模型给出杂合携带者的风险为1.46，纯合携带者的风险为5.17。将该完全模型与没有关联性的虚模型进行比较，(未校正的)P-值是5.43e-11。这些数据显示出，具有两个风险等位基因的拷贝的个体的风险，比基于简单的乘法模型预计的风险更高。

使发病年龄模型适合于所有基因型，给出了P-值为4.84e-5。据估算，杂合子的发病年龄被非携带者早1.4090年，纯合携带者的发病年龄据估算比非携带者早9.6126年。这显示出了对发病年龄的显著影响——携带风险变体的个体与作为风险变体的非携带者的个体相比，具有明显的在较小年龄发生AF的风险。

研究了rs2220427附近的标记物后，我们意识到，微卫星标记物D4S406可以作为rs2220427的替代标记物。具体来说，根据单倍型频率，发现等位基因-2、-4和-8(相对于CEPH参比来说)足以标记SNP：

表1、rs2220427和D4S406之间的关系

因此，对于D4S406标记物而不是rs222047标记物进行分型的个体来说，等位基因-2、-4和-8的合并导致了对SNP的等位基因4的频率的非常好的估算。通过这种方式，我们分析了含有1269个病例和69,070个对照的冰岛AF重复组。结果是相当戏剧性的，关联性所伴随的p-值为2.94e-14，相对风险(乘法模型)为1.53。因此，我们最初的发现在独立的冰岛组中得到了重复。

表2、AF患者与4号染色体(LD区块C04)的关联性。显示的是在乘法模型下的RR值。

表3、中风与LD区块C04(SEQ ID NO：50)中的标记物的关联性

表4、在国际HapMap数据组中的CEU群体中(欧洲血统的个体)与rs2220427完美连锁不平衡(r²＝1.0)的标记物。也显示了与来自约鲁巴人(尼日利亚)和亚洲人(中国和日本)的样品的关联性——组的描述进一步记录在http://www.hapmap.org上。

SNP	Allele	CEU_R2	CEU_frq	YRI_R2	YRI_frq	ASIA_R2	ASIA_frq
								rs17042059	1	1	0.117647	0.500382	0.117647	0.473183	0.30814
rs4529121	1	1	0.116667	0.604601	0.1	0.539766	0.337079
								rs4543199	2	1	0.116667	0.502036	0.116667	0.539766	0.337079
rs10019689	1	1	0.116667	0.128175	0.341667	0.664071	0.388889
								rs4626276	2	1	0.116667	0.603474	0.10084	0.537439	0.333333
rs17042076	2	1	0.117647	0.128175	0.341667	0.664071	0.388889
								rs11098089	2	1	0.117647	0.549368	0.108333	0.539766	0.337079
rs11930528	4	1	0.11017	0.120773	0.321429	0.662926	0.377907
								rs17042098	1	1	0.116667	0.669219	0.092437	0.64297	0.355556
rs17042102	1	1	0.091743	NA	NA	0.580822	0.302632
								rs17042121	3	1	0.116667	0.736119	0.141667	0.639142	0.353933
rs10516563	3	1	0.109244	0.846743	0.128205	0.636329	0.364706
								rs4605724	1	1	0.116667	0.748252	0.083333	0.645257	0.359551
rs2350269	4	1	0.11017	0.495806	0.098214	0.628257	0.346154
								rs6533527	1	1	0.116667	0.425151	0.133333	0.804123	0.421348
rs17042144	2	1	0.119658	0.727891	0.077586	NA	NA
								rs1906618	2	1	0.115044	NA	NA	NA	NA
rs1906617	2	1	0.116667	0.541206	0.183333	0.977348	0.454545
								rs12646447	2	1	0.119658	1	0.108333	1	0.444444
rs12646754	4	1	0.119658	0.681842	0.11017	1	0.425
								rs2129981	1	1	0.116667	1	0.108333	1	0.444444
rs12639654	4	1	0.116667	0.139505	0.016667	1	0.438202
								rs6817105	2	1	0.117647	0.27862	0.299145	1	0.440476
rs17042171	1	1	0.109244	0.281063	0.302521	1	0.425287
								rs1906591	1	1	0.116667	1	0.108333	1	0.444444
rs1906592	3	1	0.109244	0.283489	0.3	1	0.446429
								rs2200732	2	1	0.112069	0.272544	0.308334	1	0.449438
rs2200733	4	1	0.116667	0.276161	0.301724	1	0.445783
								rs4611994	2	1	0.116667	0.272544	0.308334	1	0.449438
rs4540107	1	1	0.116667	0.27862	0.305085	1	0.44382
								rs1906593	4	1	0.117647	0.285134	0.301724	1	0.438202
rs1906596	2	1	0.121739	0.255864	0.330275	0.97478	0.448718

表5、

A、LD区块C04(C04上的111，954，811和112，104，250之间；NCBIBuild 35；SEQ ID NO：50)中的SNP标记物。

B、LD区块C04(C04上的111，954，811和112，104，250之间；NCBIBuild 35；SEQ ID NO：50)中的微卫星标记物。

表6、序列列表中出现的序列的索引

实施例2、AF风险变体的表征

下面包含了关于染色体4q25上赋予了心房纤颤的风险的变体的鉴定的进一步描述。

心房纤颤(AF)是男性中最常见的持续性心律不齐，其特征为心房混乱的电活性¹。它在80岁以上的每10个个体中影响1人，引起显著的发病率，是死亡率的独立的预测因素²。最近的研究提供了AF的遗传影响的证据^3-5。钾通道基因中的突变已经与家族性AF相关联^6-10，但是仅占所有AF病例的一小部分^11，12。我们进行了基因组范围的关联性分析，随后在三个欧洲血统的群体和一个来自香港的中国人群体中进行了重复研究，在染色体4q25上的两个序列变体与AF之间发现了强烈的关联性。大约35％的欧洲血统的个体具有至少一个变体，AF的风险被每个拷贝增加1.72和1.39。与较强的变体的关联性在中国人群体中被重复，其中它被75％的个体所携带，AF的风险被每个拷贝增加1.42。在患有典型心房扑动(AFl)的个体中观察到了较强的关联性。两个变体都邻近PITX2，它已知在心脏的左右对称中发挥了关键作用^13-15。我们使用Illumina Hap300 BeadChip在患有AF和/或AFl的冰岛群体中进行了基因组范围的关联性研究。在来自冰岛的550个患者和4476个对照的样品中，单独地测试了满足我们的质量标准的316,515个SNPs与AF/AFl的关联性。三个强烈关联的SNPs，它们都位于染色体4q25上的单个连锁不平衡(LD)区块中，是在解释了316,515个被测试的SNPs之后被发现具有基因组范围上的显著性的仅有的SNPs(P＜0.05/316，515＝1.58x10^-7)：rs2200733(OR＝1.75；P＝1.6x10^-10)，rs2220427(OR＝1.75；P＝1.9x10^-10)和rs2634073(OR＝1.60；P＝2.1x10^-9)。将这些结果和所有其它基于冰岛群体的结果根据个体的亲缘性进行了调整。两个最显著的SNPs、rs2200733和rs2220427、在CEPH CEUHapMap¹⁶数据组中彼此是完美的替代物，在冰岛数据组中彼此是接近完美的替代物(D′＝1，t²＝.999)，因此，在下面的讨论中将只涉及rs2200733。在冰岛数据组中rs2634073与rs2200733的关联性较弱(D′＝.95，r²＝.605)。使用Illumina Hap300 SNPs在前三个SNPs附近进行进一步研究并调节了与rs2200733的关联性后，鉴定到了与一个新的SNP rs10033464的关联性(OR＝1.42；P＝.0024)。在解释了与rs2200733和rs10033464的关联性之后，与rs2634073的关联性不再是显著的(P＝0.30)。此后，所有rs2200733T和rs10033464T的关联性结果，包括在表7中显示的，都是基于与不带有两个风险变体中的任何一个的野生型单倍型的比较，而不是与每个SNP的主要等位基因的分别的比较。具体来说，rs2200733T和rs10033464T的比值比被分别有条件地计算，可以被解释为是每个变体与野生型相比的估算的相对风险。rs2200733的风险等位基因T和rs10033464的风险等位基因T在冰岛的估算群体等位基因频率分别为12.05％和8.53％，并且在冰岛数据组或CEUHapMap数据组中，从未被观察到一起存在于同一染色体上。第三个SNP、rs13143308，具有完全对应于携带有rs2200733的等位基因T或rs10033464的等位基因T的染色体的次要等位基因，通过CEU HapMap数据组被鉴定到。图2证明了在相关区域的关键SNPs上的单倍型结构。作为在CEU HapMap样品中的这三个关键SNPs中的每个的完美替代物(即完美替代品，对于标签SNP来说r²＝1.0)的SNPs组，被提供在表9中，其相对位置显示在图3中。我们强调，被提到的SNPs应该被当作是与它们等价的SNPs所定义的单倍型的代表，主要是出于方便的目的而选择的。

鉴定到了与两个SNPs位于同样的LD区块中的微卫星标记物D4S406。在冰岛，D4S406的四个最短的等位基因中的三个(-8，-4和-2)合并起来，形成了rs2200733的等位基因T的近乎完美的替代物(D′＝.995，r²＝.98)，剩下的两个最短的等位基因(-6和0)形成了rs10033464的等位基因T的良好的替代物(D′＝.98，r²＝.75)(表10)。在解释了短的等位基因的效应之后，没有D4S406的剩余的(较长的)等位基因与AF/AFl相关联。为了重复在冰岛组中进行的原始的观察，当SNP基因型不能获得时，使用D4S406基因型提供信息。

在重复我们的最初发现的尝试中，我们分析了另外的含有2,251个AF/AFl患者和13,238个对照的冰岛样品(表7)。在这些样品中两个SNPs与AF/AFl的关联性得到了重复(对于rs2200733来说，OR＝1.64，P＝2.7x10^-23；对于rs10033464来说，OR＝1.40，P＝8.2x10^-8)，并且二者在合并的冰岛样品中都得到了基因组范围的显著性(对于rs2200733来说，OR＝1.68，P＝1.9x10^-30；对于rs10033464来说，OR＝1.38，P＝9.4x10^-9)。我们还对404个其它的AF病例和2,036个其它的对照中，在我们的信号周围的区域中的所有18个Hap300 IlluminaSNPs进行了分型。在解释了与rs2200733和rs10033464的关联性之后，这些SNPs都没有保持显著(表11)。

在重复我们的结果的进一步尝试中，我们在两个欧洲血统的群体中测试了这些变体与AF的关联性，一个群体来自瑞典，含有143个病例和738个对照，另一个来自美国(U.S.)，含有636个病例和804个对照(表7)。在两个群体中与rs2200733的关联性得到了强烈的重复(瑞典组中OR＝2.01，P＝0.00027；美国组中OR＝1.84，P＝9.8x10^-10)。与rs10033464的关联性较弱，但是在瑞典群体中仍然被重复出来(OR＝1.65，P＝0.0087)，在美国群体中接近显著(OR＝1.30，P＝0.052)。当与冰岛样品合并时，与rs2200733的关联性是明确的(OR＝1.72，P＝3.3x10^-41)，rs10033464的显著性也明显位于基因组范围的显著性的阈值之上(OR＝1.39，P＝6.9x10^-11)。假设乘法模型，合并的两个变体的群体归因风险(PAR)在欧洲血统的群体中是大约20％。

最后，我们试图在来自香港的含有333个病例和2836个对照的汉族中国人群体中重复这些信号。与rs2200733 T的关联性被显著重复(OR＝1.42，P＝0.00064)，但是与rs10033464 T的关联性不显著，尽管在正确的方向上(OR＝1.08，P＝0.55)(表7)。有趣的是，rs2200733的等位基因T在中国人中的频率(对照中的等位基因频率：0.528)远高于在欧洲血统的人中的频率(对照中的等位基因频率：0.098-0.139)(图2)，这反映在大约35％的较大的合并PAR中，尽管估计的风险较低。在中国人CHB和日本人JPT HapMap样品中含有两个变体的LD区块比在CEU HapMap样品中更加片段化(图3)。因此，我们分析了在香港群体中与CEU样品中的rs2200733完美连锁不平衡、但是与CHB和JPT样品中的标记物不是完美连锁不平衡的几个标记物(表12)。这些标记物与rs2200733相比具有较弱与AF的表观关联性，表明驱动关联性的功能性变体位于原始的rs2200733变体附近大约20kb的区域中，并由在CHB和JPT样品中与rs2200733保持等价的SNPs所定义(在图3中为红色)。

对于最初的冰岛发现样品来说，rs2200733具有比rs10033464显著高的OR(P＝0.041)。在重复样品中也保持这样，总的来说与两种变体相关的风险存在显著的差别(在合并的欧洲人样品中P＝0.00019，在香港样品中P＝0.0099)。当研究基因型特异性比值比时，在合并的数据组中可检测到与乘法模型的某些偏离(对于欧洲样品来说P＝0.018，参见表13)。杂合携带者的估计风险与非携带者相比是类似的，但是rs2200733T和rs10033464T的纯合携带者的估计风险分别高于和低于根据乘法模型预测的。在香港样品中观察到了类似的倾向；尽管样品的大小太小，不能显著地检测到这样的偏离。在合并的欧洲血统的群体中，rs2200733T的纯合个体与野生型单倍型的纯合个体相比，观察到的OR是3.64，这在中国人群体中是1.77，证实了这些变体在任何AF的预测模型中都是重要的成分。

冰岛样品的AF/AFl的诊断年龄与两个SNPs相关(对于每个rs2200733等位基因T来说诊断的发生早2.28年，对于每个rs10033464等位基因T来说诊断发生早1.10年，组合的P＝1.29x10^-6)。诊断年龄的效应也通过在将诊断年龄分层时测量关联的强度来评估。在诊断年龄较小的个体中两个变体的关联性最强，尽管即使在诊断年龄超过80岁的个体中风险仍然是显著的(表8)。对于瑞典样品来说，没有获得关于AF的诊断年龄的信息。美国样品包含两个主要的组，患有单独的AF或AF和高血压(HTN)的较年轻的患者，以及大多数是出血性和缺血性中风患者的较年老的AF病例。在两个群体中，都存在在较年轻AF病例中比较年老病例中更强的相关性的明显的趋势。我们对数据的分析没有显示出任何性别造成的关联性差异(表8)。

AFl通常伴随AF发生，但是也可以单独发生¹⁷。有趣的是，我们在变体与AFl冰岛患者的小的亚组(N＝116)之间观察到了强的关联性(对于rs2200733来说OR＝2.60，95％置信区间(CI)＝1.83-3.68，P＝7.5x10^-8，对于rs10033464来说OR＝1.94，95％ CI＝1.26-3.00，P＝.0028)。事实上，对于rs2200733来说，这些确定的AFl病例的OR显著高于具有AF表型的病例的OR(P＝0.0026)，对于rs10033464来说，接近于明显高(P＝.084)。我们的结果表明，尽管这些性状具有共同的遗传风险因子，AFl受到表型拷贝的影响比AF小。

在冰岛样品中，没有变体显示出与肥胖症、高血压或心肌梗塞的关联性，它们都是已知的AF的风险因子(在所有情况下观察到的OR＜1.1，表14)。尽管这些阴性结果不能排除新的变体与这些表型相关的可能性，但它们与美国组中单独AF的高风险和携带者中较早的发病年龄一起，表明新的变体不通过这些已知的风险因子影响AF的风险。

在含有rs2200733和rs10033464的LD区块中不存在已知的基因(图3)。该LD区块含有一个剪接EST(DA725631)和两个单外显子ESTs(DB324364和AF017091)。来自各种组织的cDNA文库的RT-PCR没有检测到这些ESTs的表达(表16)。位于邻近上游LD区块中的PITX2基因是与风险变体最接近的基因。含有PITX2基因的LD区块中的几个标记物与表18中显示的对AF和Afl显示出关联性的标记物相关。该基因编码的蛋白、成对同源异型结构域蛋白转录因子2，是AF/AFl的有趣的候选物，因为已知它通过指导心脏的不对称形态发生在心脏发育中发挥重要作用¹³。此外，在小鼠中，敲除模型Pitx2被显示抑制了左心房中窦房结形成的缺省途径^14，15。在所有容易进入的组织例如血液和脂肪组织中，PITX2的mRNA表达非常低，妨碍了对基因型和表达水平之间的关联性的研究。PITX2上游的下一个基因是ENPEP，负责在血管内皮中分解血管紧张肽II的氨肽酶¹⁸。该基因的表达更加广泛，但是与AF相关的变体显示出与其在血液和脂肪组织中的表达没有相关性。没有其它已注解的基因位于有关联的变体的上游400kb区域和下游1.5Mb区域中。

概括来说，我们在染色体4q25上鉴定到了在三个不同的欧洲血统的群体中与AF强烈相关的两个变体。较强的变体在中国人群体中也得到了较好的重复，在其中它比在欧洲血统的群体中更常见并具有更高的PAR。这种关联性在较年轻患者和具有单独的AF的患者中特别明显，但是也出现在患有更常见形式的AF的较年老的患者中。尽管这种关联性的机制尚不清楚，但我们的结果为AF的分子基础的进一步研究提供了基础。

方法

对象

冰岛病例含有从1987年到2005年在国家的两个最大的医院被诊断忠有AF和/或AFl的所有患者。瑞典病例是在从1996年到2002年间作为正在进行的遗传流行病学研究——南斯德哥尔摩缺血性中风研究的一部分被召集的。美国病例是具有AF诊断的中风患者、与较年轻的患有单发性AF或AF与共同存在的高血压诊断的连续的患者的混合。香港病例是具有AF诊断的中风和糖尿病患者的集合。在所有研究群体中，AF诊断通过12导联的心电图来确认。

冰岛对照组从参加了deCODE的其它遗传研究的个体中随机选择，排除了患者和对照的一级亲属(表15)。瑞典对照组从与患者同一个地区的献血者(2001年)和健康的志愿者(1990-1994年)中召集。美国对照从大型初级护理机构(practice)和参加出血性中风研究的患者中召集。香港对照是没有AF诊断的个体。

冰岛研究群体

该研究最初包含了所有同意参加的、从1987年到2005年间在雷克雅未克的唯一地区性治疗(referral)中心Landspitali大学医院以及全国第二大医院Akureyri地区医院被诊断有AF和/或AFl(ICD 10诊断I48，ICD 9诊断427.3)的患者。所有的AF诊断通过12导联的心电图(EKG)来确认，由心脏病专家人工读图。所有的病例都被包含了，不论患者是否具有临床症状，除了那些只是在心脏打开手术后才立刻诊断到的病例。

在基因组范围的SNP基因分型尝试中，使用Infinium II分析方法和Sentrix HumanHap300 BeadChip(Illumina，San Diego，CA，USA)，对于一组550个病例按照我们的质量控制标准进行了成功的基因分型。该最初组的550个患者(370个男性和180个女性)的平均诊断年龄是72.5岁(SD＝11.0)，范围为34.7-96.2岁。2,273个患者(1359个男性和913个女性)的验证组的平均诊断年龄为70.5岁(SD＝13.0)，范围为16.8-100.6岁。在该研究中使用的无AF/AFl对照(在起始的基因组范围的筛选阶段中包含了2,201个男性和2,275个女性，平均年龄为61.5岁(SD＝15.8)，在验证阶段包含了5,654个男性和7,597个女性，平均年龄为61.9岁(SD＝18.4))，由从冰岛谱系数据库中以及从其它正在deCODE进行的相关遗传研究的个体中随机选择的对照组成。与AF/AFl患者具有一级亲属关系(兄弟姐妹、父母或后代)的对照、或对照的一级亲属，从分析中被排除。

冰岛MI、肥胖症和高血压群体

从超过10,000个登记的个体中鉴定了患有MI的个体，他们：a)在冰岛，在1981年到2002年间，在75岁以前患有MI，并满足MONICA判据9(参考文献11)，或在2003和2005年有雷克雅未克的主要医院的MI出院诊断。在登记的所有个体中的MI诊断严格地遵从基于病征、症状、心电图、心脏的酶和尸检发现的诊断标准。对于平均年龄为72.6岁(SD＝11.7)的2,462个男性和1,114女性来说，基因型数据可以获得。对于参加deCODE的心血管心房纤颤和/或中风(CVD)遗传学项目的个体(患有CVD的患者，他们的一级亲属或配偶)来说，测量了体重指数(BMI)。出于本研究的目的，BMI＞35的对象被定义为肥胖。对于平均年龄为53.2岁(SD＝16.1)的555个男性和1,046个女性来说，基因型数据可以获得。高血压患者，包括了拜访冰岛的Landspitali大学医院流动性高血压诊所、和/或有医院的出院诊断的患者。通过证实他们服用抗高血压药物作为高血压的治疗方法，使诊断得到了验证。对于1,293个男性和1,327女性获得了基因型数据，他们的平均年龄为71.5岁(SD＝12.5)。研究得到了冰岛数据保护委员会和冰岛国家生物伦理学委员会的批准。从所有患者、亲属和对照获得了书面正式同意书。

瑞典研究群体

从1996年到2002年间，拜访了瑞典Karolinska大学医院的中风部门或中风门诊病人诊所、瑞典斯德哥尔摩的Huddinge部门的患有缺血性中风或TIA的患者，被召集起来，作为一项正在进行的遗传流行病学研究——南斯德哥尔摩缺血性中风研究(SSISS)的一部分。研究得到了Karolinska研究所生物伦理学委员会的批准(Dnr 286/96和08/02)。在瑞典样品中AF的诊断是基于12导联的EKG。瑞典AF病例中男性部分为46.2％，瑞典AF病例中风诊断的平均年龄是74.4岁(SD＝8.7)。

在本研究中使用的瑞典对照是从瑞典中部与患者相同的地区召集的基于群体的对照，代表了该区域中的普通人群。个体或者是献血者(在2001年召集)，或者是通过Karolinska大学医院临床化学部召集的健康的志愿者(在1990年-1994年收集)，代表了正常的参比人群。在瑞典对照中男性部分为59.7％，瑞典对照在召集时的平均年龄是43.1岁(SD＝12.3)。

美国研究群体

美国对象是在1998年1月到2006年7月之间在麻省总医院(MGH)的正在进行的病例-对照和组群研究中招集的。这些研究的所有方面已经得到当地管理审查委员会的批准。在病例-对照研究中招集的对象由因患有通过CT或MRI证实的急性缺血性或出血性中风而就医、被许可进入单独的急性护理医院的患者组成。在召集的328个出血性中风患者中，有78个被诊断患有AF，他们被用作本研究的病例，剩下的250个被用作对照。170个缺血性中风患者具有AF的诊断，被用作病例，但是没有缺血性中风患者被用作对照。患者被排除了蛛网膜下出血和由头部外伤、肿瘤、血管畸形或脉管炎导致的脑内出血。从服务于医院所在区域的大的初级护理机构(＞18000个患者)以及医院的抗血凝管理服务部召集了624个无中风的对照。在收集的作为对照的624个个体中，有70个被诊断患有AF，出于本研究的目的被用作病例。用作对照的所有个体中50.9％是男性，他们的平均年龄是67.4岁(SD＝12.3)。所有对象或陪同的填报者提供了参加遗传研究的正式同意书，并就医学史、药物治疗、社会和家族史进行了预期中的会谈。通过会谈和浏览医学记录，对心房纤颤的存在或不存在进行了预期中的记录。

美国对象的第二部分由涉及心律不齐服务的患有单发性AF或AF与共同存在的高血压诊断的连续患者组成，他们提供了参加遗传学研究的书面的正式同意书。包含的标准是通过EKG记录到的AF，以及年龄小于或等于65岁。排除的标准是通过超声波心动描记术评估的结构性心房纤颤和/或中风、风湿性心房纤颤和/或中风、甲状腺机能亢进、心肌梗塞或充血性心力衰竭。每位患者经历了身体检查和标准化的会谈，以鉴定过去的医学状况、药物治疗、症状和启动AF的可能触发因素。通过12导联的EKG、超声心动图和实验室研究对所有的患者进行了评估。EKGs和超声心动图使用标准判据进行解释。

香港研究群体

香港研究群体中的所有对象是居住在香港的南方汉族中国人血统。病例由从威尔士王子医院糖尿病登记处²³选择的217个个体(49.1％为男性，平均年龄为68.1岁(SD＝9.6))，以及来自中风登记处²⁴的116个对象(30.2％为男性，平均年龄为76.1岁(SD＝10.9))组成。所有对象通过EKG诊断患有心房纤颤。对由2,836个没有AF证据的个体组成。对于每个参加的对象获得了正式的同意书。该研究得到了香港中文大学临床研究伦理学委员会的批准。

Illumina基因组范围的基因分型

使用含有源自于国际HapMap项目第一期的317503个单倍型标签SNPs的Infinium HumanHap300 SNP芯片(Illumina，SanDiego，CA，USA)，对所有冰岛病例和对照样品进行了分析。在用芯片分析的SNPs中，162个SNPs没有产生基因型，另外178个SNPs的产率低于90％。48个SNPs是单态性的，另外107个是接近单态性的(即在合并的患者和对照组中次要等位基因的频率低于0.001)。另外475个SNPs在对照中显示出与Hardy-Weinberg平衡非常显著的偏离(p＜1x10^-10)。最后，在调查了几个内部正在进行的不同的基因组范围的关联性研究的特定区域和可能的信号后，确定了有几个标记物(n＝18)具有基因分型问题。因此，在文本中显示的最后的分析使用了316,515个SNPs。将任何访问率低于98％的样品从分析中排除。

单SNP和微卫星基因分型

SNP基因分型通过Centaurus(Nanogen)平台²⁵进行。每个Centaurus SNP分析的质量，通过在CEU和/或YRI HapMap样品中对每个分析进行基因分型，并将结果与HapMap数据进行比较来评估。具有＞1.5％不匹配比率的分析不被使用，对于已知连锁不平衡的标记物使用了连锁不平衡(LD)测试。

关联性分析

尝试了对所有参加的个体的rs2200733、rs4611994(rs2200733的完美替代物)、rs13143308和rs6843082(rs13143308的完美替代物)进行基因分型。对于每个SNPs来说，在每个组中的产率高于90％。此外，对于所有冰岛和瑞典对象来说，D4S406微卫星的基因分型是可用的。因为基因分型中的冗余性，观察到的基因型减少了通过我们以前使用的或然性方法²⁶而造成的信息损失的量。这确保了表中显示的结果总是基于同样数量的个体，允许对数据进行有意义的比较。由于关于rs10033464的数据是唯一可以在最初的冰岛发现样品和HapMap项目中直接可用的数据，rs2200733 C rs13143308 T单倍型被用作该SNP的标签。这种标签在最初发现样品和CEPH CEU HapMap样品中都是完美的。

关联性分析使用了以前描述的并在NEMO软件中执行的或然性步骤。我们使用标准的或然性比率统计学数据测试了等位基因与每个表现型的关联性，其中如果对象是无关联的，在虚假设下，统计学数据将接近具有卡方分布，自由度为1。等位基因特异性OR根据个体的两个染色体的乘法模型假设来计算⁴。使用Mantel-Haenszel模型⁵将来自多个病例-对照组的结果合并，其中允许组具有不同的等位基因群体频率、单倍型和基因型，但是被假设具有相同的相对风险。在任何对照组中不存在与Hardy-Weinberg平衡(HWE)的显著偏差。

在表7和8中，根据与不带有风险等位基因的野生型rs2200733 C、rs13143308 G、rs10033464 G单倍型的比较，计算了rs2200733和rs10033464的P值。rs2200733 T的相应的有条件的比值比被定义为[f(rs2200733T)/f(WT)]/[p(rs2200733T)/p(WT)]，其中WT表示野生型单倍型，f(.)和p(.)分别表示病例和对照中的频率。在乘法模型下，当对照可以被当作群体对照时，这种有条件的比值比是rs2200733 T相对于野生型的相对风险的适合的估算值。rs13143308T的有条件的比值比具有类似的定义，并具有类似的解释。

亲缘性校正和基因组对照

冰岛病例-对照组中的某些个体彼此是亲戚，导致前述的卡方检验的平均值＞1，中值＞0.675²⁶。通过使用以前描述的我们通过731,175个冰岛人的谱系学模拟基因型³⁰的步骤，我们估算了膨胀系数。对于其中316,515个基因组范围扫描的SNPs的基因型可用的最初的发现样品来说，我们也通过使用基因组对照并计算316,515个卡方统计数据的平均值，并象以前描述的那样^31，32，通过计算316,515个卡方统计数据的中值并将其除以0.675²⁶，估算了膨胀系数。对于这些起始样品来说，通过我们的谱系学方法和两种基因组对照方法估算的膨胀系数，给出了相似的膨胀系数估算值；分别为1.047、1.058和1.054。显示的P值和置信区间基于根据谱系学方法估算的膨胀系数进行了调整。

cDNA文库的PCR筛选

为了证实LD区块中剪接的ESTs(DA725631、DB324364和AF017091)的表达，我们筛选了可商购的cDNA文库和在deCODE产生的文库。筛选的商业化文库是心脏(Clontech-639304)、主动脉(Clontech-639325)、骨髓(Clontech 7416-1)、睾丸(Clontech 7414-1)和全脑(BD S0598)的Marathon Ready cDNA文库。此外，对于全血和EBV转化的人类类淋巴母细胞来说，构建了cDNA文库。使用来自Qiagen的RNeasy RNA分离试剂盒(Cat.75144)和RNeasy RNA全血分离试剂盒(Cat.52304)，分别从类淋巴母细胞系和全血中分离了总RNA。在deCODE，使用带有随机引物的高能cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems PN 4322171)制备了cDNA文库。

PCR筛选使用

2 PCR酶RT PCR系统(Clontech)，按照制造商的说明书、并使用来自Operon Biotechnologies的PCR引物来进行。PCR反应在10μl体积中进行，终浓度为3.5μM正向和反向引物(表16)、2mM dNTP、1xAdvantage 2PCR缓冲液和0.5μl cDNA文库。

Northern印迹分析

商业化的多组织poly-ANorthern印迹从Clontech获得(人类心血管系统，Cat.636825)。

使用的探针：

i)PITX2 cDNA克隆(HU3_p983E0327D)，从RZPD DeutschesRessourcenzentrum für Genomforschung GmbH，Germany(http://www.rzpd.de/products/genomecube.shtml)获得(序列被证实，数据未显示)；

ii)对应于ENPEP转录本的外显子1-12的cDNA克隆从RT-PCR实验获得。ENPEP克隆的序列被证实：

TCCTGCTCCAGCTTGTGGATATTTTGCAAAAAAGCTCTCCATCTGCCACAGTTGCAGTTCAGTGTTG

AATGGCTCTGCTATTGTGACAATTCGGCCAAGGTTTCTGTTATTGAGTGTATATCTGTTGACTAGAT

AGTCCCAGTTGAGTTGTATCCAATTCCAGGCCATGTTCTTCCCATAGCTGTTATATGAGATATATCG

AATGACTGTAAACACATCCTGAGTTTTAATAAGGTTCGTGTCCTTGAGCAAATCCAAATACCTTGAC

AAAAGAGTAACGTTCTTCACTGATGCTAATCCATACAGCAGTTTTTCTTTTTCTTGAGCTAATGAAGT

TTTCTGGTATTGCTCAAGAGTGTAGTTCCATGAAATCTCATTGCCAGAGTTCTGCATCCCATACCGA

TACACCAGAAGCCTGAGATTTACGGGAAGGCTTACAGTCCCATTTAGCCACTGCTCAAATAACGAG

GAAGCATTGTTCAAGGCTTCTCTGTCTCCCATCTTGCACGCAAACCCTAACACGGAGGAACGGAGT

AACTTTGTGACATGGTCTCCAGCATCATTCCATCCCAGAGAATCTGCAATAGGCTTCACTTGACCTT

GGAAGTATTCCTCAATCATAGGATATAGCTCTTTATCATCTTCAAACATGCTAATGATGTAGGTTACA

GCTGAAATTACTCTCTGCCATGGTAAAAAATTCTCTTCCCTTTTGAGATACTTGGTCAAGTTCAAAG

CCACCTTATAATCTAGAAGTTGAGCTCTTGCCAAGGCAAAAGCATCATCAATAAGACTTGCACGATC

TGCTGAAGAAAATGTCTTGTGGTTCAAGGAGAGCGCTGTAGCTATCGAGTCCCAAGTTGCTACTTC

ATAATTTACACGATAAAACCCAATATGATCTGGGTTTATTTTGAGAAAAGCATTTCCACTAGGATTA

GAGGAGTTCAAAGTGATTCCTTCTTTTTCTGACCTATTAAATAACACACTGCTTGTTATATTATCTTC

AGTCCATTTAACTGGGATATTCCATGTATAACCAAGATCTGAAGGGGGCTGAGAAGGGTTAGCTCT

TGGGTCCAACAAAAAGCGTTTCTGTGTGATGTTCTTGACACCGTTCACGTTAAGCACAGGATAACC

CATCTgGTCTGGTCCAGGTGTCCATTACTTCTTTCACTGGTAGCCTACTTGCCTCTTCCAGTGCTGC

CCAAAAAT

将cDNA片段使用Megaprime标记试剂盒(GE Healthcare Cat.RPN1607)用[α-³²P]dCTP(比活性6000Ci/mmol)进行放射性标记，使用ProbeQuant G-50微型柱(GE Healthcare Cat.27-5335-01)将未掺入的核苷酸从反应中除去。将膜在Rapid-hyb缓冲液(GE Healthcare Cat.RPN 1635)中预杂交至少30分钟，然后用100-300ng标记的cDNA探针杂交。杂交在Rapid-hyb缓冲液中于65℃进行过夜。将标记的探针在95℃加热5分钟，然后加入到预杂交溶液中的滤膜上。杂交后，将膜在2xSSC，0.05％ SDS在室温的低严紧条件下清洗30-40分钟，然后在0.1xSSC，0.1％SDS在50℃的高严紧条件下清洗两次，40分钟。将印迹立即密封，在Kodak BioMax MR X-射线胶片(Cat.8715187)上曝光。

AF区域中的候选调节变体的调查

UCSC浏览器被用于与AF相关联的SNPs(hg版本17，4号染色体，111，942，401-112，114，901)周围的172.5kb区域中的SNPs的提取位置和保守转录因子结合位点(TFBS)。两个表被交叉引用，位于结合位点中的SNPs被进一步研究与HapMap数据中的rs2220427或rs6843082的连锁不平衡。这是对人类基因组的16、17和18版进行的，但是结果以人类基因组17版的坐标报告。这产生了3个位于已知的转录因子的保守结合位点中的SNPs(表17)。注意，该分析仅仅检测了有限的功能候选物样品，因为i)AF单倍型还没有被完全测序，ii)几个候选SNPs在Hapmap中没有被分型，不知道它们是否位于AF单倍型上，iii)在保守性较低的区域中的多态性可能是有功能的。

3个TFBS的进化保守性

利用UCSC基因组中的Multiz比对可以对受这些SNPs影响的区域的进化保守性进行评估。在所有三种情况中TF结合位点的核心部分是完整的，但是受影响的位置具有不同程度的保守性。受rs12510087影响的SOX5在哺乳动物中是最不保守的，但是第二个(受rs2220427影响)是显著保守的(除了负鼠之外，它在所有物种中维持与鸡中相同)。rs17042171突变发生在NFAT结合位点的核心GGAAAA基序的最后一位上。保守性显示出该位置上G是优选的，产生了GGAAAG基序。

ENPEP的基因型与表达之间的相关性

在经过过夜空腹后(从下午9点开始)，在上午8到10点之间收集血液，在2小时内从来自1,002个个体的血液提取RNA。RNA的分离使用RNeasy Midi试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)进行。在使用10ml利多卡因-肾上腺素(1％)局部麻醉后，通过在比基尼线上的3cm切口(总是从同样的位点以避免位点特异性的偏差)从673个个体取出皮下脂肪样品(5-10cm³)。使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)纯化总RNA。

总RNA的完整性通过在Agilent 2100生物分析仪(AgilentTechnologies，Palo Alto，U.S.，CA)上进行分析来评估。每个标记的RNA样品含有合并的参比物，总共1,765个样品，与Agilent Technologies制造的人类25K阵列进行杂交。按照以前的描述对阵列图像进行处理，以获得背景噪音、单通道强度和相关的测量误差估算值¹¹。两个样品之间的表达变化被定量为平均的对数(log₁₀)表达比率(MLR)，即与背景相比的表达比率，对于阵列上的每个点校正了两个通道的强度值¹²。杂交经过标准的QC处理，即尖峰中的化合物的信噪比、重复性和精确性，比较了Cy3与Cy5的强度。

没有有关联的SNP与血液(对于rs2200733和rs10033464来说分别为P＝0.90和P＝0.82)或脂肪组织(对于rs2200733和rs10033464来说分别为P＝0.23和P＝0.37)中根据年龄和性别调整的ENPEP的表达相关。

表7、染色体4q25上的rs2200733和rs10033464与AF/AFl的关联性分析

每行含有来自两个变体rs2200733T和rs10033464T^b的联合分析的结果。对于每个病例-对照研究显示了病例和对照的数量(N)，对于每个变体，显示了在病例和对照中变体的等位基因频率、具有95％CI的OR和双面P-值。此外，报告了比较两个变体的效应的P-值和它们的联合群体归因风险(PAR)。例如，第一行表示，对于最初的冰岛发现样品来说，相对于野生型(rs2200733C、rs13143308G、rs10033464G单倍型)，rs2200733T的估算的比值比(OR)为1.84(95％CI(1.54-2.21)，P＝4.1x10-¹¹))，相对于野生型来说rs10033464T的估算的OR为1.42(95％CI(1.13-1.77)，P＝0.0024)。

^ars2200733T和rs10033464T与野生型rs2200733C、rs13143308G、rs10033464G单倍型的比较的结果。

^b在瑞典和美国样品中，rs10033464T被rs2200733C、rs13143308T单倍型标记。

^c病例(上方)和对照(下方)中的频率

^drs2200733T和rs10033464T的ORs的比较的P值。

^e根据某些个体的亲缘性对关联性分析进行了调整。

^f对于欧洲血统的合并的研究群体来说，PAR通过使用平均的、未权重的群体的对照频率来计算，而OR和P值使用Mantel-Haenszel模型来估算。

表8、冰岛组中诊断年龄的关联性和美国组中AF亚表型的关联性

每行含有来自两个变体rs2200733 T和rs10033464 T^a的联合分析的结果。对于每个病例-对照研究显示了病例和对照的数量(N)，男性病例的百分数和病例的平均年龄(±SD)。对于每个变体，显示了具有95％CI的OR以及P-值。此外，报告了两个变体的组合效应的P-值，以及测试在每个患者亚组中性别之间是否存在变体的等位基因频率的差异的联合P值。

^ars2200733T和rs10033464T与野生型rs2200733C、rs13143308G、rs10033464G单倍型的比较的结果。

^b在美国样品中，rs10033464T被rs2200733C、rs13143308T单倍型标记。

^c根据某些个体的亲缘性对关联性分析进行了调整。

表9、在CEU HapMap数据中与rs10033464、rs13143308和rs2200733等价的SNPs

SNP	标记SNP	Build 35位置	SEQ ID NO：50位置
				rs12639654	rs2200733	112062899	108089
rs6817105	rs2200733	112063372	108562
				rs17042171	rs2200733	112065891	111081
rs1906591	rs2200733	112066493	111683
				rs1906592	rs2200733	112066608	111798
rs2200732	rs2200733	112067646	112836
				rs2200733	rs2200733	112067773	112963
rs4611994	rs2200733	112068645	113835
				rs4540107	rs2200733	112068706	113896
rs1906593	rs2200733	112069526	114716
				rs1906596	rs2200733	112069840	115030
rs2220427	rs2200733	112072493	117683

表10、在冰岛组中覆盖关键SNPs和D4S406微卫星的单倍型结构(估算频率＞0.1％的单倍型)

频率	D4S406	rs2200733	rs13143308	rs10033464
					0.08000.006470.002250.04150.001080.05920.006790.01690.009230.1350.08530.15870.1630.09280.03980.101	-8-6-4-20022446810121416	TCTTTCCCCCCCCCCC	TTTTTTTGTGGGGGGG	GTGGGTTGTGGGGGGG

表11、在扩展的冰岛AF/AFl病例和对照组中与rs2200733和rs10033464周围的200kb区域中所有的Hap300 Illumina SNPs的关联性。结果没有对个体的亲缘性进行调整。

表12、在来自香港的中国人样品中等价于CEU HapMap中的rs2200733的SNPs的关联性研究

报告的LD值是在合并的CHB和JPT HapMap样品中与rs2200733的LD值。

表13、通过基因型与AF/AFl的关联性

三种可能的单倍型被编码为

0＝rs2200733C，rs13143308G，rs10033464G

1＝rs2200733T，rs13143308T，rs10033464G

2＝rs2200733C，rs13143308T，rs10033464T

表14、考虑了AF的风险因子后各种表现型与风险变体的关联性

表15、冰岛对照组来源的概述。注意个体可以来自于多个项目，某些个体可能作为先证者的亲属已经被收集。

表16、用于cDNA文库的ESTs筛选的引物

^*EST名称来自于NCBI BUILD 35。

表17、位于与AF相关联的区域中的保守TFBS中的SNPs。

链表示突变所位于的基因组比对中的链。

多态性是该位点的多态性的两个等位基因。

表18、与LD区块C04中的标记物连锁不平衡的PITX2基因中或附近的标记物。显示了PITX2(标记物1)中或附近的标记物以及它们与LD区块C04中的标记物(标记物2)的相关性。

表19、r²的值大于0.1的与标记物rs2220427和标记物rs10033464连锁不平衡的标记物。LD根据HapMap CEU群体样品计算。

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实施例3、4号染色体的变体与缺血性中风的关联性

中风在西方国家是常见的死亡原因和成年人丧失活动能力的主要原因。现在，在低收入和中等收入国家中，由于人口老化以及心血管疾病的可修饰风险因子的变化¹，它也正在成为主要的健康难题。中风不是一种单独的疾病，而是由具有许多遗传和环境风险因子的一组异源的病症构成的高度复杂的综合症^2，3。关于双生子、家族史和动物模型的研究^4-8，为常见形式的中风的遗传成分提供了证据，但是还没有鉴定出在群体间显示出一致结果的主要风险变体。

占脑损伤的绝大部分(＞80％)的缺血性中风(IS)，是由导致脑动脉阻塞的血栓形成或栓塞所引起的。各种不同的病理生理机制可以引起IS，但是最常见的是大动脉动脉粥样硬化(LAA)、心源性中风(CES)和小血管疾病(SVD)⁹。

方法

研究群体

冰岛：冰岛中风患者从1993年到2006年间在雷克雅未克唯一的大学医院、Landspitali大学医院被诊断患有缺血性中风或TIA的超过4000个个体的登记表中召集。中风患者在过去的9年中通过deCODE的心血管疾病(CVD)遗传学项目登记。中风诊断由神经学家临床证实(参见下文)。发现组包括1,661个患者，当分析4q25上的SNPs时，我们使用了另一组282个患者(平均年龄±SD：77.2±11.3岁，45％是女性)。我们使用了来自多个不同的Decode正在研究的遗传学项目的25,708个对照(平均年龄±SD：59.2±21.1岁，59％为女性)，其中包括：腹动脉瘤(250个)，心房纤颤(1,150个)，上瘾(750个)，阿茨海默氏病(350个)，焦虑症(200个)，哮喘(1300个)，COPD(850个)，结肠癌(200个)，深静脉血栓形成(550个)，诵读困难(200个)，传染病(250个)，长寿(400个)，肺癌(750个)，心肌梗塞(2,400个)，偏头痛(1,100个)，外周动脉疾病(1,200个)，多囊卵巢综合症(1,200个)，先兆子痫(700个)，前列腺癌(400个)，牛皮癣(750个)，风湿性关节炎(550个)，多动腿综合症(350个)和2型糖尿病(400个)。

研究得到了冰岛数据保护委员会(DPC)和冰岛国家生物伦理学委员会的批准。所有参加者给出了正式同意书。

瑞典：从1996年到2002年间，拜访了瑞典Karolinska大学医院的中风部门或中风门诊病人诊所、瑞典斯德哥尔摩的Huddinge部门的患有缺血性中风的瑞典患者，被召集起来，作为一项正在进行的遗传流行病学研究——南斯德哥尔摩缺血性中风研究(SSISS)的一部分(平均年龄±SD：67.3±11.8岁，44％为女性)。在本研究中使用的瑞典对照是从瑞典中部与患者相同的地区召集的基于群体的对照，代表了该区域中的普通人群。个体或者是在Huddinge或Karolinska大学医院召集的献血者，或者是通过Karolinska大学医院临床化学部召集的健康的志愿者(在1990年-1994年召集)，代表了正常的参比人群(来自Huddinge医院的对照平均年龄±SD：46.8±15.9岁，41％为女性，在Karolinska医院召集的献血者的年龄信息不可用)。研究得到了Karolinska研究所生物伦理学委员会的批准。

德国南部：德国群体，在本文中称为德国-S，由2001-2006年间在德国慕尼黑大学Klinikum Grosshadem的神经学系中风部门连续召集的IS患者(平均年龄±SD：65.3±13.7岁，38％为女性)组成。对照组由没有心血管疾病史的年龄和性别相当的个体(平均年龄±SD：62.7±10.9岁，38％为女性)组成。他们是从KORA S4研究、一项慕尼黑附近基于社区的流行病学项目²³中选择的。研究得到了当地伦理学委员会的批准，从所有个体(或亲属或法定监护人)获得了正式的同意书。

德国威斯特伐利亚地区：第二个德国人群体，被称为德国-W，通过医院召集了在2000-2003年间参加位于德国西部的威斯特伐利亚地区中风登记处的缺血性中风患者(平均年龄±SD：70.4±12.6岁，53％为女性)。没有自身报告的中风史的群体对照，从在同样地区进行的代表性的、远景的、基于群体的多特蒙德健康研究²⁴中抽取，然后与病例进行了频率匹配(平均年龄±SD：52.3±13.7岁，53％为女性)。两项研究都得到了Munster大学伦理学委员会的批准。所有的参加者给出了他们的正式同意书。

英国，英格兰东南部：召集了1995-2002年间拜访脑血管服务部的欧洲血统的缺血性中风患者。所有病例由一个有经验的中风神经学家浏览原始图片来确定表现型(平均年龄±SD：64.6±12.7岁，41％为女性)。也通过对家庭医生的名单进行取样，从与患者同样的地理区域召集了没有表现出脑血管疾病症状的社区对照。对取样进行了分层，以提供与患者组中类似的年龄和性别分布(平均年龄±SD：64.8±8.6岁，41％为女性)。研究得到了当地研究伦理学委员会的批准，从所有参加者获得了正式同意书。

基因分型。研究中只包含了患有缺血性而不是出血性中风的患者。所有的患者进行了临床相关的诊断整理，包括使用计算机断层扫描术(CT)或/和磁共振成像(MRI)得到的脑成像，以及辅助性诊断调查，包括颈动脉和脑动脉的双重超声波检查、超声波心动描记术、Holter监测、MR-血管造影术、CT血管造影术和血液化验。来自冰岛、德国-S和瑞典的患有临床诊断的暂时性缺血性发作(TIA)的患者被包含在缺血性中风组中。将患者按照急性中风治疗中的Org 10172试验(TOAST)²⁵，分成病因学亚类。这种分类包括六个类别：(1)大动脉阻塞性疾病(大血管疾病)，(2)心源性栓塞(心源性中风)，(3)小血管疾病(陷窝性中风)，(4)其它确定的病因，(5)尽管进行了诊断努力但是病因未知的，或(6)超过一种以上病因的。将被分类在TOAST类别4-6中的患者从德国-W的中风群体中排除。在冰岛组中，如果狭窄≥70％，患者被分类为患有大动脉阻塞性疾病，这是比通常使用的即≥50％更严格的标准。在冰岛发现组和四个重复样品组中按照急性中风治疗中的Org 10172试验(TOAST)分类系统²⁵分类成亚型的中风患者，列于表1中。

Illumina基因组范围的基因分型。使用含有源自于国际HapMap项目第一期的317,503个标签SNPs的Infinium HumanHap300 SNP芯片(Illumina)，对所有冰岛病例和对照样品进行了分析。在用芯片分析的SNPs中，6,622个SNPs被排除，因为它们显示出(i)在病例或对照中访问率低于95％，(ii)在群体中次要等位基因频率低于1％，或(iii)在对照中显著偏离Hardy-Weinberg平衡(p＜1x10^-10)。将任何产率低于98％的样品从分析中排除。在最后的分析使用了310,881个SNPs。

单SNP基因分型。所有121个SNP的单SNP基因分型在冰岛雷克雅未克的deCODE遗传学中心使用Centaurus(Nanogen)平台进行²⁶。每个SNP分析的质量，通过将CEU HapMap样品的基因分型与公开可用的HapMap数据进行比较来评估。所有SNPs通过了不匹配测试、连锁不平衡(LD)测试，是Hardy-Weinberg平衡的。

关联性分析。为了进行关联性分析，使用了标准的或然性比率统计学，在deCODE产生的NEMO软件²⁷中运行，根据风险的乘法模型假设，即一个人携带的两个等位基因的风险相乘，计算了每个单独的等位基因的双面P值和比值比(OR)。对于标记物来说，显示了等位基因频率而不是携带者频率。

在染色体4q25上的位点上，我们分析了三个SNPs——rs2200733、rs10033464和rs13143308。第三个SNP，rs13143308，与rs2200733和rs10033464都高度连锁不平衡(二者都是D′＝0.99)，并具有与携带rs2200733等位基因T或rs10033464等位基因T的染色体完全对应的次要等位基因。在所有群体中使用Centaurus分析对它进行了基因分型，并将其用于在Illumina Infinium平台上对rs2200733或rs10033464数据丢失的那些个体进行基因型推断。在表21和补充表22中，在与不含有任何风险等位基因的野生型rs2200733等位基因C、rs13143308等位基因G、rs10033464等位基因G单倍型¹¹进行比较的基础上，计算了两个风险等位基因rs2200733-T和rs10033464-T的P值和OR。

对于冰岛研究组来说，在使用基因组对照方法¹⁰对对象的亲缘性以及其它可能的群体分层现象进行调整之后，给出了P值。对于IS、CES、LAA或SVD患者组的基因组范围的关联性分析来说，卡方统计数据的膨胀因子分别被估算为1.07、1.04、1.06和1.02。对于其它对4q位点进行分型的病例和对照来说，我们使用以前描述的模拟²⁸估算了膨胀因子。对于IS、CES、排除CES的IS、LVD、SVD、其它的、未知的、以及一种以上病因的组来说，得到的膨胀因子分别为1.09、1.03、1.06、1.05、1.01、1.00、1.01和1.00。

由于使用了大量对照，在对病例和对照的亲缘性进行调整之后的有效样品大小，相应于测试了2,690个IS患者和2,690个对照。CES、LAA和SVD患者的相应的有效样品大小分别为710、417和467。

使用Mantel-Haenszel模型将来自多个病例-对照组的结果进行合并，在该模型中允许组具有不同的等位基因、单倍型和基因型群体频率，但是被假设具有共同的相对风险²⁹。

结果

研究了LD区块C04中的变体与缺血性中风的关联性。为了进一步研究4q25上的两个AF风险变体rs2200733和rs10033464，对发生缺血性中风及其亚型大动脉动脉粥样硬化(LAA)、心源栓塞性中风(CES)和小血管疾病(SVD)的贡献，我们在冰岛样品中对标记物rs2200733和标记物rs10033464进行了基因分型，并且为了重复的目的，我们在来自德国南部(1,181个病例和1,189个对照，德国-S)、瑞典(1,032个病例和1,387个对照)、德国的威斯特伐利亚地区(1,388个病例和1,106个对照，德国-W)和英国(654个病例/676个对照，UK)的组中也对重复数据组进行了分析。研究组的表现型分类显示在表20中。

表20、被基因分型的中风病例的TOAST亚分类，n(％)

TOAST＝急性中风治疗中的Org 10172试验

其它来自冰岛的患者(282)和对照(14,893)也对这些特定的SNPs进行了基因分型。通过将每个SNP与野生型单倍型相比较，进行了关联性测试(参见方法)。如图21中所示，rs2200733在所有样品组中赋予了缺血性中风的增加的风险，与缺血性中风的关联性是高度显著的，合并的OR＝1.26(P＝8.8x10^-11)。对于rs10033464来说，与缺血性中风的关联性不显著(OR＝1.03，P＝0.45)。但是，两个SNPs都与心源性中风显著相关，并且该风险明显高于缺血性中风组整体(rs2200733：OR＝1.53，P＝1.5x10^-12；rs10033464：OR＝1.27，P＝5.9x10^-4)。正如预期，这给出了心房纤颤对这种亚表型的已知的分布。通过从缺血性中风组中除去心源性中风患者，在剩余的缺血性中风患者中两种SNPs的观察到的效应变弱了，但是对于较强的变体来说仍然是显著的(rs2200733：OR＝1.18，P＝1.5x10^-5；rs10033464：OR＝0.96，P＝0.39)。除了心源栓塞性中风之外，大动脉动脉粥样硬化和病因未确定的中风是仅有的显示出与rs2200733的显著的关联性的亚表型(OR＝1.22，P＝1.5x10^-3，表2和OR＝1.18，P＝0.01)。这些结果表明被分类为原因不明的中风或大动脉动脉粥样硬化的中风的显著部分，可能是由于未诊断到的、间歇的AF。

正如在上面(实施例2)讨论的，风险等位基因rs2200733和rs10033464与心房纤颤的诊断年龄显著相关。在我们的对心源性中风的诊断年龄的研究中观察到了同样方向的不显著的趋势(每个Trs2200733拷贝0.62年，P＝0.33，每个T rs10033464拷贝0.29年，P＝0.71，表23)，表明观察到的年龄对AF的影响也可以适用于心源性中风，尽管影响较弱。

表23、诊断年龄对rs2200733等位基因T和rs10033464等位基因T的风险等位基因数量的线性回归。显示的是使用诊断年龄作为响应(单位为年)、风险等位基因数量作为预测变量而获得的回归系数和相应的双面P-值。在所有测试中包含了性别作为共变因子，在对所有合并组的测试中也包含了种群作为共变因子。在分析中使用的病例的数量显示在括号中(n)。

讨论

通过对1661个冰岛IS患者和10815个对照的研究以及在大型的已经很好地表征了的欧洲人缺血性中风病例/对照样品组中的跟踪重复，我们鉴定并证实了染色体4q25上的由rs2200733标记的风险变体，与缺血性中风相关联。正如预期的那样，在我们的研究中，这些变体与亚表型心源性中风关联最强，心源性中风是心房纤颤的主要的并发症。在没有心源性中风的缺血性中风患者中观察到的风险可能是由于未能诊断到心房纤颤、从而也未能诊断为心源性，因为心房纤颤通常是无症状的或间歇式的，因此可能在中风患者中难以检测。

多达30％的缺血性中风由心源性脑栓塞引起(5，6)，其中大部分在存在心房纤颤的情况下发生(7，8)。心房纤颤是男性中最常见的持续性的心律不齐，其流行性随着年龄而增加，影响了大约10％的年龄超过80岁的人(3，9)。同样，AF是中风的最有力的独立的风险因素之一，在群体水平上，AF与中风的风险4倍到5倍的增加有关(3，7，8，10)。此外。心源性中风一般是严重的，反映在与其它亚型的中风相比，具有较多的丧失行动能力、较高的中风复发率和较高的死亡率(6，11)。为了降低将来患有中风的风险，AF风险的早期检测是重要的。在患有AF的患者中进行了中风预防临床试验显示，抗凝结剂药物(例如华法林)显著降低了中风的风险(7，12)，比抗血小板药剂例如阿司匹林和氯吡格雷有效得多。我们的结果强烈建议，很大部分中风患者具有未诊断的心房纤颤，并被分类为病因未明的中风或大血管中风。这样的患者可能患有无症状的、间歇的AF，在常规的24-48小时的心脏监测检查中不能检测到。这一点得到了两项对经历了另外4到7天不需卧床的心脏监测的中风后患者进行的研究的支持；以前未诊断到的间歇的AF的比率为5.6和14.3％(13，14)。如果被误诊为病因未明的中风或大血管中风的话，具有无症状的或间歇的AF的中风患者可能会治疗不充分，因为这样的患者被给予抗血小板药剂而不是华法林。因此，这些AF的标记物可以帮助确定哪个患者可能受益于作为门诊患者进行延长的心脏监测以记录是否存在AF。为了确定这些发现是否能够转化成对中风的较好的预防或治疗，还需要远景式的研究。

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22.Jabaudon，D.，Sztajzel，J.，Sievert，K.，Landis，T.& Sztajzel，R.Usefulness of ambulatory 7-day ECG monitoring for the detection of atrialfibrillation and flutter after acute stroke and transient ischemic attack.(不需卧床的7日ECG监测对于急性中风和短暂性缺血性发作后心房纤颤和心房扑动的检测的有用性)Stroke 35，1647-51(2004).

23.Wichmann，H.E.，Gieger，C.& lllig，T.KORA-gen--resource forpopulation genetics，controls and a broad spectrum of disease phenotypes.(KORA-gen——群体遗传学、对照和广谱疾病表现型的资源)Gesundheitswesen 67 Suppl 1，S26-30(2005).

24.Berger，K.等，The glu298asp polymorphism in the nitric oxidesynthase 3 gene is associated with the risk of ischemic stroke in two largeindependent case-control studies.(在两项大的、独立的病例-对照研究中一氧化氮合成酶3基因中的glu298asp多态性与缺血性中风的风险有关)Hum Genet 121，169-78(2007).

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序列表

<110>解码遗传学私营有限责任公司(deCODE Genetics)

<120>用于心律不齐的风险管理的遗传标记物

(GENETIC MARKERS FOR RISK MANAGEMENT OF CARDIAC ARRHYTHMIA)

<130>SCT091945-20

<160>51

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

tgtattctta acagtctgtg tataatccta aatgatacac atgggttggc atagtgtgct   60

cagtttgatt ccagggatat ctcaggctta tttaacaatg ytacccttag aacaacatta  120

gcatactaat ctatactact ggccgcgaac cacattcctt ggtatctttt aactggatgg  180

attgagacta ttgccccaga t                                            201

<210>2

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

ggcttttaat acattactgg aagtttaaga aatttaaaaa atattttttc tcttgacaaa   60

ccctgttttt aaaatagatg gaattgctag ggattcggct rgtgttaatt gcatttttct  120

attcctgtgc tatgtgtact aatcaccatc ctatgccccc ttcacctgct ctctaagtcc  180

cctgtagatg aatgcctctg a                                            201

<210>3

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

gttaacacaa ttattgattt cctgtctctc attccccagt aatcctcttc agtcttccat     60

atcttagtaa tagtaccatc atcctctagg tccttaatct rtaaatctag tagtctttct    120

ggatttccca gctacttctt ttcagtgtct tgcatggtta ctttttttga tgtattcttt    180

aaacagtggt gttttggctt a                                              201

<210>4

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>4

tcagaaatat actaatggag ttctttattg aaagaaaaca tatataagaa tcttcttaat     60

ataagaataa tatctgctcc atcaactgca tctcaaaatt ygtgctagga tttagcaagt    120

tgtacaaaga acacaagcct ttatctcaat aggtctgggt tcttttccca attgtcactg    180

gctgtgtgac atcaagaaaa a                                              201

<210>5

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>5

ggaaaatggt gtgcattatt taaagaaggt ccccagaatg ttgtataaaa tttgtccact     60

ggatgaaaat gtatatactt accaacaaag gaggttgtga satatagtct gtccatgttc    120

atgaggaaga ggagaacaaa tattgggaaa aagctagctt cttagacaca agaacaatga    180

cagaggcatt taaaaatgtg t                                              201

<210>6

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>6

atgaggaaga ggagaacaaa tattgggaaa aagctagctt cttagacaca agaacaatga     60

cagaggcatt taaaaatgtg tcccagataa ttgagaaaaa maccagcaaa aaaaggaagg    120

ggagtgaacc cgggaggcgg agcttgcagt gagccgagat tgcgccactg cagtccagcc    180

tgggcgacag agcaagactc t                                              201

<210>7

<211>200

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

atcttctgat ttgggtagtg gtgcattttc acccaaagct aaattgcaaa gaaagtggac     60

aatgatcaag catagatatt gatcccatat ttcttaacct ytatgaatct attatcttcc    120

aaaaatccat ttaggattta gatagaaagc aggatttcct tttgactcta cagtgtataa    180

aacacagaac atctgagaaa                                                200

<210>8

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

tgcgtgtgtg tatgcataca agcatgcatg tatgcatgtt atcctgatgc cgcttttgtg     60

ttctttttct gtttttctct cctgcaagac atgtactctg mcagttttct gtattttctg    120

gttgtttctg agatttaaga aaacaagcca tttctgcaga aacccgcaac aaagggtagg    180

ttgatttaca tcagtatttg g                                              201

<210>9

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>9

gaagactggg gcagcaccga ctcccacaat ccgttccacc aattcaccct acgacacaaa     60

ctaaacagca agcaaacaaa atcctctttg gactccacat yttcccccct ctgttctgtt    120

gcataaatag atttttttat acaaactatc tatacacact ctgcccgctt cctcttcttc    180

ctttcattct tcaacgtttt c                                              201

<210>10

<211>199

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

cctccaaaag gccctacctt cagctatcat cacattgggg ggattagatt ctaacatata     60

aattttgggg ggacacaaac atgcagtcca tagcagtgtc rgttcagcat gatttgagga    120

ataggaatcc cctctagact gcaggtaccc ctgactgttt acctaaaatt aaactattag    180

agattaattt ttctattca                                                 199

<210>11

<211>201

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

ttcatattag agatcttttt aatgaaaatt agtggagaaa aaatttaggg taaggactgt     60

tgcctaggaa tatatttatt tttatgattt ccttaaatac raaaaaccaa ttctttgcgg    120

gtgttcacag ttggagaatg gttgtaagtt ctacctgcta ttttggtaag tcaaaccaat    180

atagtcttat tcatcccttt t                                              201

<210>12

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>12

tcagtaaagc ccaaatttaa tgaacttcaa tttcctagat ttcacttaaa ggtggatgtt     60

gagagaatgt agatgtagaa agaaccagaa ctggaaaact rtaaatttag caaacactta    120

aacatacact atttggtagt gttttctagt cttcattctt gcaatacagt ttctgaatcc    180

ttctaaaatg ggtattttct c                                              201

<210>13

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>13

ttgagaagcc ttctagatga tttgaaacag gtggtcctat gaccacactc tcatgatctc     60

ttgcctcaac tggtgccttg atgctggtac tcattcatat yttgtcctta gacttgtaat    120

ttaaaatttg cctgtttttt atggtaccca ttatgaattg gtacctctta ttcttagcag    180

atatttttac tttttatttt t                                              201

<210>14

<211>200

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>14

atacaaagct gtaaggggca agaggtacat gggccagccg taaagtttgt ttattcaaat     60

ggagcttgtt gatctgtcat atttttcaag ttgagctact mtgccagggc aacattctac    120

tgtattcaaa tcagctgttt tggaattggt acacctgcta gtgtctgttt ctgaacactg    180

aatgagttgc cataagggag                                                200

<210>15

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>15

catatggact aggtacccac tcacctggat gactatttca caactttctt tcttttcaaa     60

attccagtcc ctttcctcat tttcaatttt agctgattga ytttttttaa aatgagacat    120

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tactcttcct tcccccctca a                                              201

<210>16

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>16

atgaacaagc ttttctcgaa acagttctgc catccagcac gatttttgtc ccctttgcaa     60

caaagcccct tgaaggagtt gtctatactt cttgttttca mttccattcc tcacattctc    120

tcttaaccca ttctaatcag ttaggcttct actgccctcc cctatggtct ccaatggcct    180

ctactttgct aaagactagt t                                              201

<210>17

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>17

cttatactgt tccatgcata cagtttctca tctaatgagt agtattatag ataaatatct     60

acaaataaag tgagacttgt taaatgctta gcaccatgac ygtcactttg tataatctta    120

acaaatgtta gctattacaa ttataaccaa taatgataat tattaagttg ttagccagaa    180

gaaagatatc ttggttatag c                                              201

<210>18

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>18

tctttttgag aaatgtgata agaatataca gagtgagaaa ttactagctg ttgtttgacc     60

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cacacataca cacacaagat ataccaaaaa caagtgtaat tcacatgaaa gaaattgtgg    180

tgggtatcta gcattttata t                                              201

<210>19

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>19

aaaacagtag atatgatctc tcatgacttt agcaagattt tagatttagc ccagcatgat     60

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aatgtaaatt tgtttaacat t                                              201

<210>20

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>20

gtggttatca cagtacccaa taggtagttt ttctacccgt gcttctctcc ctccctgcca     60

tagtagtcca cagtgcctat tgttcccatg tttatgtcta yacgtactca gtgcttagct    120

ccctgttccc atgtttatgt ctgtatgtac tcagtgctta gctccctgtt cccgtgttta    180

tgtctatatg tactcaatgc t                                              201

<210>21

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>21

ttgggtgttt taatttagtg attcttttga tgttttctgg gggatagaat ttccatttct     60

ttctgatttt gtatcaacct tgaatgtgga attaaaatag yaaatctcta ctttgtattt    120

tatatataaa taaaaattct acatattaca tatgtagctg atattaatat gtattatata    180

cacaatataa ttttattaca t                                              201

<210>22

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>22

catccacagc catgaggcca cataacacaa gccctccagt ctcagctctg acaccacttt     60

ctcagagagg cattccctga gcacctaaga ggcctctcac mcttaccctc cttattctct    120

accctggctg ctttattctc tacctggttt ctatcttggc tcttatgaat tgcagttatt    180

ttttatttgt ttatgaaatt g                                              201

<210>23

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>23

ttcttagtaa tttttataga aaatttagca tggatatcat acatctgtgt gtgtgtgtgt     60

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgcattc caagtcttca yaaatggggt tgtattataa    120

atactgatat atacctggct ctttcactta atcagaaggc  taagtgacca tctgtttgag    180

tccctagaaa tatactgttt t                                               201

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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tttacttttg attcagattg ataccttttg ctgattactt gtcattttat tttcatttct     60

ttgaattgct tatttacatt aattgatcag ttttttatta ycttttttct ggtccttttc    120

ttactaattt gtacaagcat tgtataaatt agaaaattag ctctcaactg tcaaaatatg    180

atgccaacct tttctttttt g                                              201

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>25

tttagagtta atactagaga agaatctcac ttgaaaacat ttcacctata tgtatgcggt     60

gtcttggtag acagggtgcc tgaggacagt ggcatagcaa mtttccagtg aggtaattta    120

atttgttaaa ttaaataatt agatttattc ctcatgttgc cttggggtga tgaggaggag    180

ttaaggacat ggagaaaaa                                                 199

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>26

aaactgaaaa atagactcct attttgaaac ctagaaaaaa gttgtgcttt aaacttttct     60

ctgtcaaatg agaattgctt aattcttata cttaaggaac rtgggaaatg aaaaggcaga    120

atgtatagtg ttggtccttt gatggaattt ctgagaaaaa acaaactatt ccagatgatg    180

actaaatcac atagtttta                                                 199

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>27

atgaactagt gcatcacact gactgcctgc tctgtgtcag gttctacttg aggccccaga     60

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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tgatgtgaaa aaacagaagt attaatgaaa tgctgtggga acataaacta actagggagt     60

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tcctggtaga gggaagcct                                                 199

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>29

aatcctggaa tccaggttaa gaattctttc tctgggcagt gagtgccact gacaatattt     60

cagtaaaaga gggacaggag aaactttggt tatagaatga ygactgctgt aatttaaaca    120

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aaaataaaat agaacatg                                                  198

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<213>Homo sapiens

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agtaaaagag ggacaggaga aactttggtt atagaatgat gactgctgta atttaaacaa     60

tgaaatggaa tggggagagg ctgaagttaa ccacatcatg maggaggttt tgggattata    120

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tgattccaag gtttctaact t                                              201

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<213>Homo sapiens

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gattcaatag acagctattg aagagtgacg tgaaagtgac actgcaggag gtggaagaat     60

aaacaagaaa aagtggagat tgcgaatcta gattacttct ytaagggatt ggttaggaaa    120

agatagaaga ggagaaagag gcaaaaagaa tagggagatt gcttatttta ggacataaga    180

gactagcaaa catggtggac t                                              201

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>32

aaatataaat tatagcagca acatattgaa taattgcaac aagtataggt gttgcttatt     60

tcatgtctat catctaacta ttaattttta ccagataaaa ytagtacatt agggaataca    120

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tattagtagt gatgattttc t                                              201

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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aattgccttc tgctggaggg taggaaaact ttcttgggag gtggttttac aaggaatggg     60

tcagaacatt aaaggtcaga gaatgggaag gggcaatcag atagaagaaa tcatgggaat    120

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tggaacttat agtggaagat racattggaa atgtaaattg tagctggatt gttgaagtcc    240

ataaagacaa cccaaggtct gagactttat tctgtaggca atagagagag cccctgaaag    300

cttttcaggt gggaagtatt attatcagag ctgaactcta ggcagggcag gttcagagag    360

gtgcactgat ggcaaaggaa gtacttgaag agcttgcaaa t                        401

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gcagaatgta tagtgttggt cctttgatgg aatttctgag aaaaaacaaa ctattccaga     60

tgatgactaa atcacatagt tttaaatctt ctgtagattt ytaatggttt tttttcaaaa    120

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cctaacaatt ttacaatgaa a                                              201

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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taatcactga gcctgctgta cttattctgt cagtcttttt gccaaaaaga tttcatgggt     60

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attttacggg tttttaagag aataaattct gtgataagtt                          400

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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tctaggaccc tgggtgccca gccttctttg tacaggttcc tgttccttcc cttccagcct     60

gcatctggct gacttcagcc tgcaaatgct tcagaacaac ctttcttgtg cagcatcttt    120

gtgtgatggg ggaagcactg aagaagaagg taccacagtc tacctgcttg ggccttctgg    180

tgattatttc ttcaactcag ytgtcttgat ctgagggaga gttttatgag ctaaaaatct    240

gtcagtgttt ccatttacca agtagctatt caatcgtttt atagcctaac cattcccaat    300

taccctcaat taaaacttgg cacatatgtt gacaacctta gatgcaattt tttaattgaa    360

aattgttgat ggcttttgat tgaagtctaa aaccaaaagt                          400

<210>37

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>37

ctctcttgct ttcccctgcc cttctggctt ccaccatgtg atgatgtatt aagaaggcac     60

ttgacagctg ctggcacctt gatcttggac ttcccacctc cagaactctg agaaaataaa    120

tttctgttct ttataattac ccagtctgtg atattctgtt ataggagcat aaatgaaata    180

agacaccgat gtttttctta ygattagatg ggggttatgt gttttggata tgatgactac    240

agaggtaaag tgcattatca tcacattata tcaagaatat gtactatcaa catgacttat    300

cactgttgag tttaaccttg atcacctaat tgaggtagtg tttgtcagtt tactccacta    360

actcattttt cctcctttct gaggtgtatt atttggaagg                          400

<210>38

<211>400

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>38

aaaccacaat gtgataccat ctcacactag tcagaatggc tattactaaa aagtcaaaaa     60

caatagatgc tggcgaggct gcagagaaaa ggcttttata cactgttggt gggaatataa    120

attagttcag ccactgtgga aagcagtttg gagatttctc aaagaactta aaacagagct    180

accatttgat ccagtaccca raggaaaata aatagatcat tataaccaaa agacacaagc    240

attcatatgt tcattgccac actattcaca atagcaaaga catggaatca acctgggtgc    300

ccatcattgg tggactggat aaagaaaatg tgatatacac atatacacca tggaatactc    360

tgcagcatta aaaagaataa catcatgttc tttgcagcaa                          400

<210>39

<211>400

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>39

ttgggcggct ctgtacctat cagaatgttt ctacaccctc ggtactgaag ctgaatgctg     60

agaaggagga aaggcaaaga ggttgctgta cctcttgctc ttctcctgtc cccgttattc    120

tacggctgaa ttaggtggct tttttcccct tcctatgtgg cagggacttt tcttgtgtcc    180

tatcttgagt tcttcagact ratagtaaaa ttgacggtta agccagccgg actggctttt    240

aatacattac tggaagttta agaaatttaa aaaatatttt ttctcttgac aaaccctgtt    300

tttaaaatag atggaattgc tagggattcg gctggtgtta attgcatttt tctattcctg    360

tgctatgtgt actaatcacc atcctatgcc cccttcacct                          400

<210>40

<211>400

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>40

tgcagggaac ataggtaagc ttagaatatg gctattttta actgaaactg tactgacttt     60

ctttttgaag atgctgatac aacttctgac actgttggtg atgagtggtg cataacagcc    120

gtttcagctc tgaggctatc aaatagtgaa agagaatctt ctacatacaa atcccaggac    180

accagaacag ctcttaacag mcctcacttt cctgagtaag ctgaaggtgg ctaactaaaa    240

ggcctgagag aaattactgc ctaaacaatg aaggaaggag aaaaccccca aggaagacaa    300

tgtaaagatt aagtaacaag gtttcaattt gatacaatgt ggggaatttc agtttaattc    360

taatttatac taatttctca taattgtctt gatcctttac                          400

<210>41

<211>400

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>41

agaataatca tacagcagga atgcaaacac gtgatttcca aagagaattt tattccatat     60

ggtatttttc ccctaactaa gaattaattg caactttaaa gaaggtttga ttgtgtctat    120

gaaaaacatt ttaactactg aggaattcta aatgacttca atttaaaatt ttcttttttt    180

acattgttag agtcaagaaa kaagtgcttt catcaagctc tgagttacag aatttattag    240

agtaaaggga agaggataac cttcagatgt cttctgtggt gaaatgttga agttaaaaat    300

tttaaatgtt tgcagactaa agacatcctc ggctgtgagg cctaaaagaa taaacaaaat    360

gtgacatgtt ttattttgtt acttaaccct tgtataaaaa                          400

<210>42

<211>400

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>42

atatataaag cagctctttt gagtatatgt tcaagtgtgc tatacctctc catccagtgc     60

tctcttacaa atgctggatt tgggacttcc tgtcttaacc tgggatccca cattagggac    120

ttcctctctt gacctgggat ccgcacattt cagattgcct gtagagcttt tccagccttt    180

aagacaaact ctgaatccat raattgagcc agttgctgga aagctaaaat cctatctctg    240

tcaaagtgga gcagagagac aaaggtgagt ccacaaaaac agattttctt acctcagagt    300

gatgtgaagg acaaggtggc tccagtgtct aaactctggg agtgagagaa tagcgaagaa    360

ctgcccctga atccagtaag ttaaagaaac ggcagtgcta                          400

<210>43

<211>400

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>43

tatatagtac tcatatattt cacaataatg tgactaagat gattgcctat ctgaaaaaat     60

aaatgcccat tataccttgt gcatagaggg aattcaataa atatggagtt tgttaaaggg    120

aactcagccg gcaactgtga aatcataagt taataaataa aatacaatga tgatttacca    180

taatcaaatt agccagtaac rtatatacat attacaagtc agctctcata aaaaggcctt    240

tgctactttt tctgacacaa ctgcatgatt ctttttattc agtgtacatt tatgtgataa    300

actctcatta gagtctaaaa agtttgatat tccccttata aaacatacag aaggagagct    360

cgttaaagta atggatttat ttaacaactg tttttttctt                          400

<210>44

<211>400

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>44

ttatatggaa tgtaaataag gacatgaaaa agaattgtaa aagtcaacca agagctctga     60

tactaaattc attgaggaca ctgataccca ttgtcatgaa tggtgacact ggcactataa    120

aaatcatttt atgtataaga atgactgtga caaagtttta atttttgaaa atatagttgt    180

ataaggtttc tcatgtctgg yattttagct tttggtttga gaattatttt aaaagaatat    240

aggacaattt agttactgga ttggtattca aactactgga cttactcaat attcttccat    300

caaaatcaaa tccaaaagaa cagagattta ttctcatatc taataggaat ctagtagaca    360

atgctaaaat tagtgaacta agtaaggtga atcaaagtta                          400

<210>45

<211>246

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>45

tcctcaggga ggtctaatca tatgttttct taaaccaaac tcttttcctt ttcattaggc     60

tttcttgagg caattggcta attaatgata ataaatagtt attgagcatc acagatattc    120

taaatcctcc agtgtcatac atttggaagg aaaaaagacc agtagataaa cttaggaaga    180

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtat gtgtaacaaa catgccttaa    240

aaccag                                                               246

<210>46

<211>399

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>46

atattgagca acagccaccc tctctgggtc cctgcaaatg gtacccattt ttccaaccca     60

cagctctagc tgctcaacca tttgagattt ggggtaacta cctgggggaa cagtgttcag    120

atggcagtgg gagttaccac ctcacagtgg cctggggaag agaagagaaa gagattagag    180

gagggggcat ttgctaaaak cactcaacga acatgctgtt aatgcttcct cacatttgca    240

tgttactgcc acagttttcc taggtgtcac tgagtctcca gaaagcaact acttgccgaa    300

ctaagtaaaa taaggagaat ggtatagcac atgtgtttgg agaaggggaa ggaagggtgg    360

aatatgaaat tgagcataga tatccaggtc aggaaagaa                           399

<210>47

<211>399

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>47

gcccccaaga agtgatgtgt ctgctagaaa agccctgaac atagaatttc ctgactttgt     60

ttttaattta gttctttcag gcatcacgct gcataaccag gtgtaactct ctaaaagtct    120

ctatgacaga attttccatc tgttaaatta ggctaataat attttcatct ttttttaggg    180

taaagatgtg aaatatttgk agaactctgg aaaacatgcc ccctactaat tagagctttt    240

tgatgtgaca tcattttctt cagtacttgg agtttagtca atagatatac agtgtagctg    300

tgaaattatg aagcatgaga atgcattacc aagggaccgt aggaggctct ttactgaaaa    360

gtgtagctgg ctatatttct ggaagtaatt taaacatag                           399

<210>48

<211>399

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>48

acacagagca catagggctt gaagacctgt tatggggcat ggatgtgctt gacagggaag     60

cagggaagaa gtagcaaggc aaccgggagc acttttgagt ttcctctctt tgccaggcat    120

gagaagacca cttggtgtgc attttagatg gtgctgagat gggatcaaca aaggtggagt    180

gtgcaaaaga tgagagacay tgggcaatgt ggaaatgaag aataggatta ttgctcggaa    240

ggattatggt tgtgtttaat aggaataacc aaagcaaaca atgatcacat ttgttgtcct    300

tcaccttgtc aaatagtgat ttaggggcta gggaagtata tcacctctga ggttgctaca    360

acatcctttt ctgcccacct tctccagaac ttagtatta                           399

<210>49

<211>399

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>49

tttaatttct ttggaaatta aatttgcttg gaaacagtgc tataaagagt tgatgtctcc     60

aaaggtgatt ttttttgttt tatataaata aggttttgct tttgctagtt gagcgcagtt    120

ctaggctttt cgcccttagc tcacacacac cccttctgcc tgcttggact ttaatggctc    180

aagacagcct tgagctcacy gggaaaagaa aatgactgtt aaaaattatc cttgaaattg    240

gttatttggc aacattctta attgtatgga aattcattaa ggcatatttc atatataatt    300

agctcaaggt tgttgattct acaggcttta tggatttaaa tctgattgat aataaagtaa    360

acaagagagt cgaatttaaa gcgtggctct ctcgggtta                           399

<210>50

<211>149440

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>50

tcctttcttt tattaatgta gtgactgctt aggataggta actatcctaa gtaggagaga     60

gaactgagaa atgtgcccat aataatcact ttcaaactat cattaaaaca gacaataact    120

ctttcatcat tttttgtatc taaaggatta aattgataca atattcttac catgccaaaa    180

agtacacaat tatttagaga gcagagatca tatgtttcca tgaaccagta tttccctatt    240

gaatggtaat gtttctttta gtaacaaatg agttcttata cttaatatta gggcaagtgc    300

ttgctacaaa atgtcagtaa tatattcatg aggtgaatca ctttggaaca gtcttttaag    360

caatttctga gcttgtggct tgccctcttt agagtggcca gtgacttagt ccctcaaaaa    420

tgaggatgca gttcaggtag aacaggagcc ctgaaattat acaaagtgct agaaagtatt    480

aatagttgga gttgaattga ggagacaaga ggaaggcttg tcacaaatga ctttttagag    540

ttgggtctgt ggcagaaaca gccagttgtt ccctggtatc tcctctctcc tgtttctatg    600

gaagcagaat ttttagctgg gcctcttgtg caattggtgt atacatatga tggaattcta    660

gccaataaga tattagcaag gttgctgtgt gcaacttcta gattgtgttc tcaaagggag    720

aggatgtgcc tttctgttct cttcttgtcc ctgctgactg gaatgtgtta ggagaactgg    780

agctgaggca gctgtgattg agcaaaaagc tagaaggagt ccaggatcct ggcactacag    840

aactgctgta cttgcatgac ttctgggact gcacttgaga gagaaataca cttctatttt    900

gttcaagaca ccactatttc aggtctgtct attacaaaag ccaaactgat ataccacaaa    960

tacaggggac agagtccttc cattgggtca gtctccaagc cttttggttc agcaccacat   1020

gtgattaact tctgggataa tgggactcac tttatcatca tcatcatcac caccagatac    1080

ttccagctgg ggaggcatcc cttctcattc agttgtaggt ccaaactgaa tcctagcctc    1140

cacccatatt tttctactgc taacctggta aaaaccttcc caggtatttg gaggctgtta    1200

ttgactgaca aaattcatat taaaagccaa tctccattgt ggtggtatta ggaggtggtt    1260

aatttagggg gtgattaggt catgaggaat ccacaatcat ggatgggatt aatgccctta    1320

taaaagaggt taaagaaagc tgccttgttt tttctgccat ctgaagacac aaaaggcacc    1380

atctatgagg gatgggtcct caccagacct ggcatctgct ggcaccttga tcttgcactt    1440

cccagtctct tgaactgtaa gaaatacatt tctgttgttt ataaattact cagtcaaagg    1500

tattttgctt tagcagccaa aatagattaa aacagagggg ataagtagat ttacaagata    1560

aatactttaa gtattgagta gatttcacaa gactgatttt tcctgtccac aatcccttga    1620

gcctccttca gacttcagta gaaagtactg acctccaaaa tctgaaacct tcaaagaaga    1680

tgctctgctc ccactgtcat tttttaaagt ttattctttc tgaacctgag atcttgcata    1740

gcaaagaacc tattctagat atttagtggg gtattggaag cattagaaat cgaacttatt    1800

tgcatcatat ttatgtgatt caactacatt tatctgattt atctaactgg aagcccttgt    1860

tttttgtatt tagattttaa tctctctgct ttgtttcttc atacagtgaa gtgtcagagg    1920

caacatgttg gtagaagagc tctggtcagg aattaggaaa ctggagaact catcctgggt    1980

gtgctgttta ccagcatggc tctctgaccc tcaattttcc cagtcaagtt gggattttaa    2040

tattttctct cagtgcctca atttactatt ctgtgattaa ccctttggtg catggaaata    2100

atgagaaaaa aagtgccttg aacatcatga agtcttatat caccgtaggt tagaaggagt    2160

ctccgtgaat ttgcgctggc agtcttcgtg gtgaagttgg attgttaatt ctcagtcaca    2220

aatgtgaact tgcgttcctg ccaacagatg ctctcagcaa gtttctcaat aatttatata    2280

cttgtaccct tttctctgga caattgcctc ctcactttcc cccccaaata gctatctaga    2340

tatctagata atttctttta agttaccttt agttttgtct ataaaagatg attttacaga    2400

ttcaggtctt aagacatatc agtgtttacc caatggcaca taagaaatgt tttggtcatt    2460

tctggattta agtatagtta ctctcctttg aaggcaaaca catgttcccc ttggataaag    2520

gagttagtgt tggttgctcc ttcctttctg cttcctcact ttctattttc ctttttcata    2580

tcatttgcta cccagtattg tcataatggg gtcacagtga agagcagcag ggacttagtc    2640

tcactaactg ttgcacctcg ggcttggcac catgccaggc atctagcagt ttctcattcc    2700

atacatgttg aatgaatgaa tgagcaaatg tgaaggataa attttctatc tgggacaggc    2760

agtgtggcag taatacagta cagattagtg ttcagattgg ctggtgattg aatggcactg    2820

agtcagtctt gcctgtgtca ctgaaactga gacctcagaa gtttagcttg atagaataga    2880

catgggttag aggaaaaagt tactgatgtt ggagcaggaa atacagcatg gaaaacagaa    2940

gtaaatgtct gtggaaagga gctggggagc ttgaaacagg tctggtgctg tgtcaagctt    3000

actgctgcag ctctgggaaa tatcttgttc agaaccatac acttcaggct ctgtaagtaa    3060

atcactgaga attatttatt tctgctgtgt ctttaggctt tttttttgtt tttggccatc    3120

atataggaag agtggattcc tttagaatat gacattcata tcttcctctt ctcagacatt    3180

tgaacaagta atcatctatc tcagaagcat tactggtttt ttttttagcc agacaaaact    3240

taaaatatct tatctattac aaattgcttt caggataata atgttgttct gtaactttat    3300

ttgatgactc ttcacagtaa gtagacaaat aatttttacg tgccaggtca tttaaaaaac    3360

ccctcccgag tagggatctc tgtaggtaca taaaagtaaa caattaaggg aaattctcat    3420

taagaaaaat gtctaataga attagagaga acctactttt tgctacttta attccatgct    3480

cccctccccc agcttcaaca atgtcaccag gttgagaaac agaaggagaa aaagattaat    3540

cattagtaaa aacacaccct tctgcccctc cccctggcat cctgaaattt gagtgagtca    3600

aaaatatgta acatttaatc agaggagttg attttttccc attcgtgtac tatcccccct    3660

tcctctctcc attccctttt gaaaggggaa ggtgattttt ttggcttcac tcatgtctag    3720

tcaaccttta tcctctccct tctccctttt caatctctag ggtgtatttt ggagaaaacc    3780

ttccccgacc ccccctttct ggcattcatt attttcttta cttttagaca ctaatggttt    3840

caaaaccaat ctcaacacat gactcagtta ttttagaaag gactgtacta tatcttttta    3900

gatccttttc aggcctcaca tacaaacttc caaatgtagg ctaaggacgt gttcctttct    3960

ttgtatgttt tcctgtacca atttttcagt agttggttag ctggccaaaa acgtttattc    4020

taataagtgt atcaaagtgg ctttctcccc atctcttact ccctcctttt ctttgttcct    4080

tcctttcctt ttttcttccc tccctttctc tctttattct ttcttctctg gttttactct    4140

cttccccact tagatgctca gaacttggat taggtgctaa gaataaaaaa aaatgatatg    4200

ataaaatccc agccctcagg gaactcacaa ttatcgatta actgtgaatt cccttgcaat    4260

ggaacaagtg tcctaaaagg ggggtggaat ggtgcccggg aaggaagacc agagaaagcc    4320

ctactgccag aggtggaaat gggaggggcc ctaaaggagg aaagagcatg cagattttgc    4380

aggggtggga tgggacagac aggcacatag aggaaacagc agattcagag ataaaaagaa    4440

atgagaagtt tagggcaatg cagactggaa tagatatgga gatgagtcag agatgagacc    4500

agaaaggtct tgaaaggcct gcttagggtt tagactttcg actgtaggca ctggagccgt    4560

tgatgatttt gtggaataga gggatctgcc tggatggagt tagaacagag gggagcaggg    4620

aagagaagaa acatagggcg acaaaataaa aatattgtga tagtctaggt aaacaattat    4680

aaaggactga actaaggcaa tgggcagagg ctgaaactga ggagacgaac ctgaggccta    4740

tttggaggtg cactggacag gacataatgg atgattagat gtggagtcga gggaggggga    4800

cgagtctcca agtctagcca gctttctgtt tcctgacctg gtgccgttca ttgagatagg    4860

taacactgaa gtgggagagg ttttgaggga ggaaagatga tgaattcttg gcactaattc    4920

agactgtatc attaagctaa cgaaccatct tgccagtaga agctgttgct agaaagaaga    4980

accaggaaag gcagttacat caacacagct cttctgatat attggtaggg agaaacttca    5040

gaactctaat ggaaaataca tggattagaa atcaaataag tgattttttt gaaaaaaatt    5100

gcaaaataca tatatagcta gtactttgca tgaaggtgaa aatactgatt aggcattagg    5160

gttaaaataa cattaaggat gaattttatt agtatatttc caaaacattt ctgggagact    5220

agggaactct atgccatacc tcctctaaat taaactgtac attatatgcc tcatttttct    5280

cttatagctt ctatcactgg aaagcagctc agccatgtta tctttaaact tcatttctat    5340

ggtaaagaga gctcttcatt tacaaaatat tttgtgatca ttaaactaca gaaacatgac    5400

tagcattgtt aaatggtcaa tagctgagga cctacaaaat atctttaaaa agcctcaaag    5460

catttgtgca ctgcgcctct agggctacat gctgcctaga gaaattatct aactagtttg    5520

gcatctctcc agaagactgg ttaccaaact gcattgggtt catgctgaac tagcagttat    5580

ttcacaagga ttttcactag tgctaatctg catgtgtgga attcctgttc agaggttgtt    5640

tttctgagct gtttagttga gccagattac aaattgactc tgtttggtgt gaacagaaac    5700

ctatttacaa tgcagatctc tcaagccaat tttctggtta aatttcatcc attaaatttt    5760

ttctattctt atataaaaaa cgtgtctaca gggcatttac ctttttacat ttcaaattgt    5820

aaagtggtga tgtggactgc cttgaaatct tggaaaagtt taaatttcct tctagaaatt    5880

aatcataaga tcacatagta tctttaattt ttaaattgtt attaattaat ttatttattt    5940

tagagatggg gtcttgctat attgcccagg ctgaactcaa gctcccggac tcaagcatcc    6000

ttccttacca ctgtttttaa ttaattcata attataaaaa gaagtactaa aaattcattt    6060

atatgcctaa gacaaacaga tttgtcggaa ttatgatttt aagtattggt aaattaggac    6120

agatttctaa aatttatgtt catagagttt tgttgttgtt gttaagggac ccacttttat    6180

gttggtcatt aatatgaatt aaatattact tcctcataga aaccctaatg atttttcttt    6240

tggtcaaaca tagacctagg tttgtttctt agactatgct attaattttg tgtcatcaca    6300

gaaagtagcc cagtcttatt ttgagattgg tttattttcc ctggacattt gggatgaata    6360

gctcagcata acagattatt ctatatactt tagtttcaag catttaaagt ggagtccaag    6420

ttttagcatc aggaaccaat taaatgatag ttaaatctga ctgaaaaatt aatggtccag    6480

aacagaaact gtgtagcttt ttttttttca gcacttctgt tttaaataaa aatctggatg    6540

cttcccagta aaacacaaag cgtcattaaa aaaaaagcag ttgaatataa ataaaaccac    6600

acccagtctt aaaaatcatt taatgatgat tgtattctta gtctgctatt aaacacaagg    6660

tgtttatcag ccttcatggg ctgctaagag tttggctaca aaacacatag cactgtgggg    6720

caatgtagga ttgcagtgct actgtgcctc tttagggtga gtatggtttg ctcttcaatg    6780

tgattattct atagtcaaat catctagcat gattgtgata gcatctgatt tgtgccatag    6840

gcgtcaatca gatttatgct aatattttgt actaatgatc aatataacag cagagaaaag    6900

tgttgatgtt cagcccactg acttaaacct tactaacggg ccttgacaga acatagtggc    6960

cttagatttt atgtgagtag aagagttcag gcttgaacat ttggctgccg cttcaagcac    7020

cctacacaga aagtcagtat agtaccttta atctggctct aattcaaacc tatcagtaat    7080

cactgagcct gctgtactta ttctgtcagt ctttttgcca aaaagatttc atgggtagca    7140

atatcagaag catttttgta attaaattat tgtcgcttta ctggaaaatc tccttacatt    7200

tgcaaagggt gaatgtgttc ttatttcccc cactccctac ttgacttgta gtttacgcag    7260

gcacttttgg ctgcgtgcgt ttccagccta atggcctcct taccgcaata ttcattttgg    7320

ttgggttact ccagccatca ttttccagag acagtcataa tccctcaatg atgacagaag    7380

tcatttgatc ttggggaaca agaaataaaa cgagcaacaa taatttcttt aggaccattt    7440

tacgggtttt taagagaata aattctgtga taagttagac tctgtgcttc taacttgggt    7500

cacagcatct taacattttt cctgcgggaa ctaaagagca tactgtacaa tatgaaaagt    7560

agcctttcgt agaccgccac tcccttctct gagttctggt gtatcttatc acttctcacg    7620

aataggactg ccattcggcg cttatatatc tgcctctttc atggcatctt aacttctttg    7680

aggcccgtga cattagttac gtggttacgc agttgttagc gatgactgcc tggcccatag    7740

caggtgctca ttgtatgctt gatgcatgag tggataaaaa tactcattct ggtcctgggc    7800

cagatctatt tcttgctttc ctcagttttg gcctatgcct cagggaagct gaccccagta    7860

gcgtgcattt ctcaggctcc cacacatcgg gcattaggaa gcagtggcag gagacagaag    7920

ggaaggaaga agggaaaatc cagggtcttt ctctgctcga tctgcattgg ggtggggggg    7980

cggggtgcac aacctttgag acttaagctc acgctggata ggctgcagtg attccaactt    8040

cttttgggtg acaccattca ctgggctctg ataatagtgc ttccgccctt actcccgcag    8100

cactgggagt ggctccctcg tcttactgat ttttggcttt cttcactttc cccagtttgg    8160

tttctcagca attttatcac ctgtgtaacc cattccttgc acgaaattcc ttctgtttta    8220

aatacttatc gtctgttcag tgttgtattg tcatacaaag ttgaaattac acctcccaac    8280

cttaaacctt tttaataaag agggacttgc cttatacttt aggggcacat agttgcctgg    8340

gatctttgct cacactgcag agtctccaaa gtgtacctac actgagggga gagttaagag    8400

gttcctttgg ggatcttatg cctgcacttt ctggaaatac ctaatcctta catattgtga    8460

taatattctt gcttttgtcc tttatttgga attattgccg catattttaa gcgtgttctt    8520

atgatattag gggatatcct tccttcctaa tgtgaagggg catccccaat ctgccttagt    8580

aatttgacat agtagggcta tagagtcaca gaacaactga gagtggctct tacagacaga    8640

gaaaagacag gattctgtca ttggcagttt gtccaggttc tgaaggtgag aaaggcctag    8700

atcggtttta aatgtatgta atttctttaa aaatttctgt catacactac gtagttgtat    8760

agctcttgga ataagcacat ggagtggtga aattccccta gatagcaccc ccaaattctg    8820

gcactttaaa attctttgta aactttcaca atgagctgaa agttaattca aacctacata    8880

gattctatgc ctcccttttc tcatctttgt agctctcctt tattcttcac agggggatgg    8940

gaagagaaag gaatccggct gacatcaaat tatgaatatt ggtttaagtt cttaacaagc    9000

ttgcatttca catgcacagc taacccacaa aagacactgg attttccaag gggttagttt    9060

caaatctaca agaatgaggg atttcagcac agccctctgt cttactttct tgcatggatt    9120

tggccatgca gccaggcaat ggtggtgtgg ttagctgtct gttgtcggga aaggagtcat    9180

ctaatggagg actccttaat aaaactcctt aataaaacgt gaaattttag tactgagtct    9240

gatttttatc attcataatc ctgtgtttat tcaggacatt caaatgcttt tgggggagaa    9300

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tacttatttc cacaagaatt tcagaacttt agatctaaaa gggatttaaa aaatcttctg    9420

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tggcttgtag cagaatagag attaaaatct agaatgattt tcatcttgct acctttaatt    9540

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tcttgacctt aaacgtatca ggtctggccc agattcttta tgggagacaa tcaaaaatga    9660

aaagtgcaca cagagcacat agggcttgaa gacctgttat ggggcatgga tgtgcttgac    9720

agggaagcag ggaagaagta gcaaggcaac cgggagcact tttgagtttc ctctctttgc    9780

caggcatgag aagaccactt ggtgtgcatt ttagatggtg ctgagatggg atcaacaaag    9840

gtggagtgtg caaaagatga gagacattgg gcaatgtgga aatgaagaat aggattattg    9900

ctcggaagga ttatggttgt gtttaatagg aataaccaaa gcaaacaatg atcacatttg    9960

ttgtccttca ccttgtcaaa tagtgattta ggggctaggg aagtatatca cctctgaggt   10020

tgctacaaca tccttttctg cccaccttct ccagaactta gtattataac aatagacaca   10080

tgaaagctcc agtttgctta aacaatagca tctctattta aatatctatt cactaaagtg   10140

ataaatctcc tcatttggga aaggtaattt cttgtaagta caaggaaaca aacaagtatt   10200

tggaatatga gctactgcta ttatttcaga gtaaataatt cttttttgtt ttcatttttt   10260

tttttttaca tttttaacct agaatattac tccactgtat agtgaacatt tatggttaaa  10320

ttttcccatg actttctatg ctataggcct cgattaggta ttctgttctc attcaataaa  10380

agcttttcac tgaaaataaa tgtcattatg ttgtaatgag tttcaatatc tactgacctt  10440

acctggattt tggagggtga gttggctgtg agcgattcag cacctcttta tccttccctt  10500

gagacactaa ttactcatta aattttcttt ttatcctttt tgctatattt caaaaatgcc  10560

aaatataaag atttttgaaa aatgagaaac tagtggaaat gtctgcaagt gtttctttta  10620

acttaaaaat atagatagcc aagtgagaaa gatataatgc aaactttggg gtctttattt  10680

tagctggtta tatctagatc tgactgaaat tgggtattcc gagtttcatc ctgaagcaaa  10740

tttctatagc tgagttataa gtccctgaaa aatgaggttt atgatgaaaa tgttgaaaga  10800

ccctcaactt taggacaagg cacaactata attttacagg cattaggcac ctaaaataac  10860

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ctatatttta tgcacacaaa aagacttact tcataagaca aggagcacag ggattttcat  10980

tccaatattc aacaatacta ttactaaagg gctctctcct tctactctca taattgagtg  11040

atcttaagtg atatttaaaa gaaaatatca ttccgctaaa cttacatgta aagatgatat  11100

gtggcagagc aatttaaaat tttcaagcag aatgtattcc agcaatgtat ttggtatgtc  11160

atgaaactga atggatggat cataataatg tcttaatatt ctattctata gcaacaaaga  11220

aaatgagtgt ttagttttgc ttgtgtagag caatagctga agtgcttata tctgagtctg  11280

cagtgcaata aaaaatatat atatatattt ttttcttaga gaccttgctt ttattgattt  11340

tggatacata cccaaaagtg ggattgtgcc tgttagattg catttctttt tttttaatta  11400

attaatttat tttttaaatt attatacttt aagttttagg gtacatgtgc acattgtgca  11460

ggttagttac atatgtatac atgtgccatg ctggtgtgct gcacccacta actcgtcatc  11520

tagcattagg tatatctccc aatgctatcc cttcccctcc ccccacccca caacagtccc  11580

cagagtatga tgttcccctt cctgtgtcca tgtgatctca ttgttcaatt cccacctatg  11640

agtgagaata tgctgtgttt ggttttttgt tcttgtgata gtttactgag aatgatgatt  11700

tccaatttca tccatgtccc tacaaaggac atgaactcat cattttttat ggctgcatag  11760

tattccatgg tgtatatgtg ccacattttc ttaatccaga ctatcattgt tggacatttg  11820

ggttggttcc aagtctttgc tattgtgaat aatgccgcaa taaacatatg tgtgtatgtg  11880

tctttatagc agcatgattt atagtccttt gggtatatac ccagtaatgg gatggctggg  11940

tcaaatggta tttctagttc tagacccctg aggaatcgcc acactgactt ccacaatggt  12000

tgaactagtt tacagtccca ccaacagtgt aaaagtgttc ctatttctcc acatcctctc  12060

cagcacctgt tgtttcctga ctttttaatg attgccattc taactggtgt gagatggtat  12120

ctcattgtgg ttttgatttg catttctctg atggccagtg atggtgagca ttttttcatg  12180

tgttttttgg ctgcataaat gtcttctttt gagaagtgtc tgttcatgtc cttcacccac  12240

tttttgatgg ggttgttttt tttcttgtaa atttgtttga gttcattgta gattctggat  12300

attagccctt tgtcagatga gtaggttgcg aaaattttct cccattctgt aggttgcctg  12360

ttcactctga tggtagtttc ttttgctgtg cagaagctct ttagtttaat tagatcccat  12420

ttgtcaattt tggcttttgt tgccattgct tttggtgttt tacacatgaa gtccttgccc  12480

atgcctatgt cctgaatggt aatgcctagg ttttcttcta gggtttttat ggttttaggt  12540

ctaatattta agtctttaat ccatcttgaa ttaatttttg tataaggtat aaggaaggga  12600

tccagtttca gctttctcca taaggctagc cagttttccc agcaccattt attaaatagg  12660

gaatcctttc cccattgctt gtttttctca ggtttgtcaa agatcagata gttgtagata  12720

tgtggcgtta tttctgaggg ctctgttctg ttccattgat ctatatctct gttttggtac  12780

cagtaccatg ctgttttggt tactgtagcc ttgtagtata gtttgaagtc aggtagtgtg  12840

atgcctccag ctttgttctt ttggcttagg attgacttgg cgatgcgggg tcttttttgg  12900

ttccatatga actttaaagt agttttttcc aattctgtga agaaaggcat tggtagcttg  12960

atggggatgt cactgaatct gtaaattacc ttgggcagta tggccatttt cacaatattg  13020

attcttccta cccatgagca tggaatgttc ttccatttgt ttgtatcctc ttttatttcc  13080

ttgagcagcg gtttgtagtt ctccttgaag aggtccttca catcccttgt aagttggatt  13140

cctaggtact ttattctctt tgaagcaatt gtgaatggga gttcactcat gatttggctc  13200

tctgtttgtc tgttgttggt gtataggaat gcttgtgatt tttgtacatt gattttgtat  13260

cctgagactt tgctgaagtt gcttatcagc ttaaggagat tttgggctga gacaatgggg  13320

ttttctagat atacaatcat gtcatctgca gacagggaca atttgacttc ctcttttcct  13380

aattgaatac cctttatttc cttctcctgc ctaattgccc tggccagaac ttccaacact  13440

atgttgaata ggagtggtga gagagggcat ccctgtcttg tgccactttt caaagggaat  13500

gcttccagtt tttgcccatt cagtatgata ttggccatgg gtttgtcata gatagctctt  13560

attattttga aatatgtccc atcaatacct aatttattga gagtttttag catgaacggt  13620

tgttgaattt tgtcaaaggc cttttctgca tctattgaga taatcatgtg gtttttgtct  13680

ttggctcagt ttatatgctg gattacattt attgatttgc gtatattgaa ccagccttgc  13740

atcccaggga tgaagcccac ttgatcatgg tgggtaagct ttttgatgtg ctgctggatt  13800

cgttttgcca gtattttatt gaggattttt gcatcaatgt tcatcaagga tattggtcta  13860

aaattctctt ttttggttgt gtctctgccc ggctttggta tcacaatgac gctggcctca  13920

taaaatgagt tagggaggat tccttctttt tctattgatt ggaatagttt cagaaggaat  13980

ggtaccagtt tctccttgta catctggtag aattcggctg tgaatccatc tggtcctgga  14040

ctctttttgg ttggtaaaat tctctaaaat tctctttttt ggttgtgtct ctgcccggct  14100

ttggtatcag aacgacgctg gcctcataaa atgagttaag gaggattccc tctttttcta  14160

ttgattggaa tagtttcaga aggaatggta ccagttcctc cttgtacctc tggtagaatt  14220

cggctgtgaa tccatctggt cctggactct ttttggttgg taagctattg attattgcca  14280

caatttcaga gcctgttaat ggtctattca gagattcaac ttcttcctgg tttagtcttg  14340

ggagaatgta tgtgtcaagg aatttatcca tttcttctag attttctagt ttatttgcgt  14400

agaggtgttt gtagtattct ctgatggtag tttgtatttc tgtgggattg gtggtgatat  14460

cccctttatc attttttatt gcatctattt gattcttctc tctttttttc tttattattc  14520

ttgttagcgg tctatcaatt ttgttgatcc tttcaaaaaa ccagctcctg gattcattaa  14580

ttttttgaag ggtttgttgt gtctctattt ccttcagttc tgctctgatt ttagttattt  14640

cttgccttct gctagctttt gaatgtgttt gctcttgctt ttctagttct tttaattgtg  14700

atgttagggt gtcaattttg gatctttcct gctttctctt gtgggcattt agtgctataa  14760

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ggtgtggtgc tgaaaaaaat gtatattctg ttgatttggg gtggagagtt ctgtagatgt  15120

ctattagttc tgcttggtgc agagctgagt tcaattcctg ggtatccttg ttgactttct  15180

gtctcattga tctgtctaat gttgacagtg gggtgttaaa gtctcccatt attaatgtgt  15240

gggagtctaa gtctctttgt aggtcactga ggacttgctt tatgaatctg ggtgctcctg  15300

tattgggtgc atatatattt aggatagtta gttcttcttg ttgaattgat ccctttacca  15360

ttatgtaatg gtcttctttg tctcttttga tctttgttgg tttaaagtct gttttatcag  15420

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atcctttcat tttgagccta tgtgtatctc tgcacgtgag atgggtttcc tgaatacagc  15540

acactgatgg gtcttgactc tttatccaat tttccagtct gtctttgaat tggagcattt  15600

agtccatttt catctaaagt taatattgtt atgtgtgaat ttgatcccgt cattatgatg  15660

ttagctggtt attttgctcg ttagttgatg tagtttcttc ctagtctgga tggtcttcac  15720

attttggcat gattttgcag cggctggtac tggttgttcc tttccatgtt tagcgcttcc  15780

tccaggagct cttttagggc aggcctggtg atgacaaaat ctctcagcat ttgcttgtct  15840

gtaaagtatt ttatgtctcc ttcacttatg aagcttagtt tggctggata tgaaattgtg  15900

ggttgaaaat tcttttcttt aagaatgttg aatattggcc cccactctct tctggcttgt  15960

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cctttctctc tggctgccct taacattttt tccttcattt caactttggt gaatctgaca  16080

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agagtgtttt tcaacttggt tccattctcc ccatcacttt caggtacacc aatcagacgt  16260

agatttggtc ttttcacata gtcccgtatt tcttggaggc tttgcttgtt tctttttatt  16320

cttttttctc taaactttcc ttctcgcttc atttcattca tttcatcttc cattgctgat  16380

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tgagccttgg ttttcagctg catcagctcc tttaagcact tctctgtatt ggttattcta  16500

gttatacatt cttctaaatt tttttcaaag ttttcaactc ctttgccttt ggtttgaatg  16560

tcctcccgta gctcagagta atttgattgt ctgaagcctt cttctctcag cttgtcaaag  16620

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gaggcgctct gatttttaga gtttccagtt tttctgttct gttttttccc catctttgtg  16740

gttttatcta cttttgatct ttgatgatgg tgatatacag atgggttttt ggtgtggatg  16800

tcctttctgt ttgttagttt tccttctaac agacaggacc ctcagctgca ggtctgttgg  16860

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gctcgggggt caggggtcag ggacccactt gaggaggcag tctgcccgtt ctcagatctc  16980

cagctgcgta ctgggagaac cactgctctc ttcaaagctg tcagacaggg ccatttaagt  17040

ctgcagaggt tactgctgtc tttttgtttg tctgtgccct gcccccatag gtggagccta  17100

cagaggcaag caggcctcct tgagctgtgg tgggctccac ccagtttgag cttcccggct  17160

gctttgttta cctaagcaag cctgggtaat ggtgggcgcc cctcccccag cctcgctgcc  17220

gccttgcagt ttgatctcag actgctgtgc tagcaatcag cgagactccg tggggtagga  17280

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aagcgcagta ttcgggtggg agtgacccga ttctccaggt gccgtcagtc acccctttct  17400

ttgattgggt aagggaactc cctgaccctt tgcttcccga gtgaggcaat gcctcgccct  17460

gcttcagctc gtgcacggtg cgcgcaccca ctgtcctgtg cccactgtct ggcacttcct  17520

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tgattgtaca cagatacaac agtttgctct ttttctgttt cttttctgct tctatttgtt  19380

ctgtttcttt ttttctcttt tcatttgtat tgcatatgtt tatgatttca ttttaacaca  19440

actattagct atatacatat ctttccaatc agagtgcacc tttaaatagt attgttctac  19500

ttcatatgca gtctaagaac cttaaaatag tacactttta tttcctccct ccaattcttt  19560

gtgctattgt cataaatttt acttctactc aggttataca tcctacaata cattgctact  19620

gcttttgctt tcgttatttt taaataattt aaataactat aaaaaattaa ataattaaaa  19680

attttaaata tttaccctaa ttctcctgtt ttgattctct caatttcttt gtgtagatcc  19740

aaattcccat ctggtttgac catatccttt ctgcttgaag aacttcattt aatatttctt  19800

gtggtacagg cattttggca ataaattctc tctgcttttg tttgtctgga aaaaattctt  19860

tatttcaaag aaatagtttc attggatata tagattctta atttacagtt tttcactttt  19920

ctgtacttta aagatggtac tccattgtct tctggtttgc ttatagtttc taataagaaa  19980

tctgtgataa ttctttattt gtttttctgt atgtagtttt tttttccagc tactttcaag  20040

atttttctct ctgtttttag tttttagcaa gttaactctg atgcttcttc ttcatttgtt  20100

ttttaaattt tgttaatcct gtttgggttc cccaagtatc ttgcattatg cattatgttt  20160

tttgttatct tttgtcagtt tagaaatgtg tgtgtatata tatacattta taaatacata  20220

aatatatata tgaaaatgtg tgtgtatata tatttacata tacattttaa atgtatgtgt  20280

gtatttacat atacatttta aatatatgtg tgtatatata cattcaaaat attttatata  20340

tacatttaaa atactatata tatatatata aaaactatat atatatagtt tttctttttt  20400

ttttgagaag gagtcttgct ctgttgccca ggctggggtt tagtggggca atctcggctc  20460

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aaaatacttt ttttcctgtc atgttttttc ttctcttttt aggaatctac ttatacaatt  20760

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ttcatgtttc actttggata gttactattt acctatcttt aattctttac tctgttgtgt  20880

ttgctgataa aactgacaaa tgaatttcca tcttcgatat tgtgttttta atttctataa  20940

tttgcatttg gctcttcttt atagtttcaa tctctgtgct gaaaatccta atttattgag  21000

gcatgtttcc cattttttcc tcttgatcct ttaacatatt aattatgatc tcaaaaatgt  21060

ccttgtctga tcgttctaat agctgaatca tctctggatc tggttctgtt gtctaatctc  21120

gacaaaggtt ttttttttgg ttgtttttct tttcattttg tgcaaagtag attgtattat  21180

tttttaaatt gtatattgac aaattatagt tgtatatatt tatataaatg gtcttatgac  21240

ttttgaatac aatgtggaat gattaaacta agctaattaa catatctatt acttcaaata  21300

tttaacttct tttgtcatga gaacattagg aatttattct cttagtgata cggaaaggta  21360

caatatttaa ttattagcta tattcagcat gcggtactat tgatctaaaa aaaattaaac  21420

tcattcctct tatctaactg agactttgta tcctttgact atcatctccg gatttgtgtc  21480

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tctgcttcta tgagttcagt tgttttagat ttcacatata agtgagaaca tgcagtattt  21600

atctttcaat gtttggctta tttcacttag cataatattc tctaattcta cccatgttgt  21660

tccaaacaac agaatttctt tctttttaaa ggttgaatag tatttcattt tgtatatata  21720

ccacactttc tttatccatt tattccttta tggacactta ggttgattcc ataatttggc  21780

tattgtgaat agtgctgcaa tgaacatggg gatacaggca ggcatctctt caacacactg  21840

atttttaaat ctttcgggta tcagaaattg tattactaaa tgatgtggta attctatttt  21900

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acagtgtaca aggattccct ttcctccaaa tccttgctaa cacctgtctt ttgttgcttt  22020

catagtagcc attctaacag ttgtgaggtg ctatctcatt gtggttttaa tttgcatctc  22080

tttaatgatt agtgatgttg agcatttttt catatatctg aagtcatttg tatgtcttct  22140

tttgagaaat gtctatttag atcctttgcc catttcttaa ttgggtaatt tgttttcttt  22200

ttagagggtt gtttgagttt cttatatatt ttatatattg atccattatt agatgtatgg  22260

cttgcagata ttttctccca atccataggt tgtctcttca ctctgttaat tgtttccttt  22320

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ttttttttct agtagtttta cagttttaga tcttacattt atgtctttaa tctattttga  22500

gttagttttt ctatgtggtg taaaataagg gtccaatttc attcttttcc ctatagacac  22560

ccagttttcc caacaccatt tgttgttcca attggatatt cttggcacct ttgttgaaaa  22620

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tatgtctatt tttatgccag taccatgctg ttttagttac tattgatttg tagtatagtt  22740

tgaaatctaa tagtgtaatg cctccaacta ttttcttttt gcaaataatt gacttagtta  22800

tttgtaattt ttttgagagg tttcataaga attttaaaaa ctttttctac atctgtgaga  22860

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gacattttaa caatattaat ccttccaatt catgaacatg agagatattt ttatttattt  22980

atgttttctt gaatttcttt cattaatgtt ttatagtttt tagtgacagg tctttcactt  23040

cttaggttaa atttattcct aagtacattt ttttttgtag cgattgtaaa taagacggtt  23100

ctcctgattt ctttttcaga aacttcattg ttagtgtaga gaaacactac tgatttttgt  23160

gtcttgattt tgtatcctgc aactttactg aatttatcag ttctaagtat tttttctttt  23220

ttatagaatc tttaggtttt tttttaatat ataagataac atggtctgaa aatagggaca  23280

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gatattaaat tttgtcaaat gcttttcctg tatctagtga gataatcata tgatttttat  23580

ccttcatcct attaatgtga catattacat ttataaattt gtgtgtgtta agccatcttt  23640

gcatcctagg aattagtccc aattgattgt agtgaataat tcttttaatg tgttgttgaa  23700

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tgtagttttc ttttcttgtg atgtcctttt ctggctttgg tgtcaggata atgttggtct  23820

tgtaaaagga gtttggaagt atttcctctg ctctgatttt ttggaacaat ttgtggagaa  23880

ttggtattag gtctttaaat gtttgataga attcagcagt gaagccatca ggtcctgagc  23940

tgtttttttt gatggaagac tttatattac agcttcaatc ttctcttgtt attggtctgt  24000

ttggattttt atatttcttt gtgattcggc cttgataagt tgcatgtgtc tagaaatgta  24060

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tcttttcaaa aaaacccaac tcagtttcat tgatcttttt tattgctttt ctagtctcta  24300

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acttttttgt ctggtaattt ttttgttgac tgtgaagctt tttttttttt ttttttttag  24420

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tattagtaca gttgaataga tttcctgttg tctgcctacc ccaatgggcc aatggatttt  25020

gctactagtt ctctctcagt agctgatggc tttgcctggg agtggaggtg tacagttttc  25080

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cttatccact tttacgttgg cagattcttc cttactcttc caaagatgga acagttcatt  25500

atcccattta ttttcagaag ggtttattgc tctttggaat ttagttttag tttgcctgat  25560

ttattttgta actctgtgat tttagctctg atgggcttaa gaagagtgat atttttgtag  25620

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ccagctttct caacaaacat aaaatactaa tataaaaaaa tggagattcc taagtctagt  25800

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ggatgtgata tactgtcatt tacttttact taacacttcc aattcatttt aataggatag  26040

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gtgagataat aaatttccac tgtgttaagc caccatgtct gtagaaattt cttacagtga  26640

ccataggaca ctaatacatg tatcttagtc tttaaaaaaa atctatttgt gactgggcga  26700

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ttttatttta ttattaaaaa aattttgagt acataatagc tgtatatatt gtcttgacag  27060

aagaatttta atttgtttca attatcttat ttgaaatgtc attgaataaa agtcagttgt  27120

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ccaggctgga gtacagtggt acgatcttgg ctcactgcaa cctctgcctc ccgggttcaa  27240

gcaagtctcc tgcctcagcc tcctgaatag ctgagacaat gggcatgtgc cactacaccc  27300

agataatttg tatttttagt agagatgggg tttcgccatg ttggccaggc tggtcttgaa  27360

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taaaagtgtt aactcaattt acttaaaagc aataaaacat tagagaaaat tatgcttggc  27540

ctgagatgaa atacatatat ttacagatta ctcttatgag tgatttgttg gtagattttt  27600

ggatgcttct cattaatcct gacatgaatt gacaccaatg gtcatacagt catacatttg  27660

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agtactttca cgaacacctg tggaagtcat tatacacggt taaacaacca cagactctaa  29280

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catttcgaat tataatctga attgtaatcc ccaggtgttg agggagggac atggtgggag  29400

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accagatctg atggttttaa aagtggcact ttcccctgtg ctcacttgct gtctcctgcc  29520

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gtcttaggta gtatctttat agtaatatga aaacagacta atacatagac ctttataatt  29700

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tatttttgtg gtccttagat ttccaaatcc tttagaagag ggtaatatta atacttcctc  29820

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tatgtgtgaa atccttgcca ccttcaactt gatagtaaca agtcacagaa gatgaatatc  30780

tagttttata atcctaaaat acaggcttaa tagcaaatca tgaaagtaaa gatttgatta  30840

tagagattag aagaatagaa attgggtttt acagtaatcg aataactatt aagaatactt  30900

caaacgcctt gaaagaatcc ttaaaatacc aaggtttaaa acaagatcta gatatggact  30960

gagggttttt cccaaggaaa aaatatccta ctcacttaat taagcaattt ttaaaaattg  31020

tcatacaact gtttaaatac agtctcttag gtttctaaaa taacaaatta cgtgggaaaa  31080

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tttttaatat ttgtgggtac ataataggtg tacatattaa tggggtacat gagatgtttt  44640

gatacaggca tgaaagatga aataatcaca tcatggaaaa tggggtatcc atcccctcaa  44700

gtattcctct tcttgaagga aaaaaaactc accccatatc ttccccaccc tcaatttact  44760

aattcctttc tctgccaccc ttcctggcta agttctttag aaaagtagtc tatatgctgt  44820

caccctttct atgcagtttc aaaccactca aatatggctt tcttctctct accatttcac  44880

tgaaatcact tgtgccaaat ccaatgttta tgattatgct cttgtcttac ttaatttccc  44940

ggtagcattt agcatagctg attattttct cttttgggaa aaaaatttcg atgtctctta  45000

gcttccacac tcttctggct ttcttcttgt ctcattagca actcaatctc attctttact  45060

ggcttttcct ctttttttgt aattttaatt ttatttaaat tattttcaat ttcaatagtt  45120

tttggggaag aggtggtgtt tggttacatg gatacattct ttagtggtga tttctgagat  45180

tctggtgcac ccgtcacctg agcagtgtac atggtagcca tcgtgtactc ttttaaaccg  45240

caaccccacc catcctttcc cccaagtccc cagagtccat tatatcattc ttacgccttt  45300

gcatcctcat agcttagctc ctatttacaa gtgaaaacat acgatgtttg ttctcccatt  45360

cctgagttac ttcacttaga ataatgctct ccaatttcat ccaagttgat gtgaattcca  45420

ctattttatt cctttttatg gctgagtagt attttatggt atatttacat atattatata  45480

tatatgtata tatacacata attttcttta tccactggtt aattgcttga tgggcattta  45540

ggctggttcc atatttttgc aattgggaat tgtgctgcta caaacatgca tgtgcaagtg  45600

tcttttttat ataatgattt ctttttctgt gggtagaacc agtattggga ttgctggatc  45660

aaatggtagt tctactctta gttctttaag gaatctccac actgttctcc atagtggtcg  45720

taccagttta cattttctcc agcagtgtaa aagtgttcct ttcttaccac atccatgcta  45780

acatctatta ctttttgatt tttaaattat gccattcttg caggagtaag atggtattgc  45840

attgtgattt tgacttgcat ttccttgatc attagtgatg ttgagcattt tttcatatgt  45900

gtttggccat ttgtctatct tcttttgaaa attgtctgtt catgtcctta gcccactttt  45960

tgatgggatt atttgttttt tttccttgat gatttgtttg agttccttgt agattctgga  46020

tactaatcct ttgtcagatg catagtttgt gaatatattc tcccactctg tgggttgtct  46080

gtttactctg ctgattattt cttttgccgt acagaagctt tttagtttaa ttaagtccca  46140

cttatttatc tttatttttg ttgcatttgt ttttgggttc ttggtcatga actctttgcc  46200

taagccaatg tctagaagag tttttctgat gttatctcct agaattttta tggtttcagg  46260

tcttatattt aagcctttga ttcatcttga gttgattttt gtataaggtg agagatgagg  46320

atccagtttt attcttctac gtgtggcttg ccaattatcg cagcaccatt tgttgaacag  46380

ggtgacaggg tgtcttttcc tcactttact tttttgtttg ctttgttgaa gattacttgg  46440

ctgtaagtat ttgactttgt ttctgagttc tctattctgt ttcattggtc tacatgtgtg  46500

cttttatact agtaccatgc tgttttggta actatagcct tgtagtagta tagtttgaag  46560

tcaggtaaag tgatgcctcc agatttcttc tttttgctta gtcttgcttt ggctatgtgg  46620

gccctttgtt tggttccata tgaattttag agttgttttt ttctagttct gtgaagaatg  46680

atgatggtat tttgatggga attgcattga atttatagat tgtttttggc agtatggtca  46740

tcttcatgtt attgattcta cctatccatg agcatggtat gtgtttccat ttgttagtgt  46800

catctattgt ttctttcaac agtgttttgt agttttcctt gtagagatct ttgacgtctt  46860

tcgttaggta tattcctaag tatttttatt tttttgcagc cattgtaaaa ggggttgagt  46920

tcttgatttg attctcatct tgattcctgt tggtgtatag cagtgttact gatttatgta  46980

tgttgatttt gtatcctgaa actttgctga attcatttgt cagatctagg agctttttgg  47040

atgagtcttt agggttttct tcctatagga ccatatcatc agtgaatagc aacagtttga  47100

cttcctcttt accaatttgg atgcccttta tttctttctc ttgtctgatt gttcaggcta  47160

ggacttccag tactatgttg actagaaatg gtaaaagtgg gcatccttgt cttgttccac  47220

ttctcagagg gagtgctttc aacttttcct cattcagtat aatgttggct atgggtttgt  47280

catagatggc ttttgttacc ttaaagtatg tcctttcttt gctgattttg ctgaggattt  47340

taatcataaa gggatgctgg attttgtcaa atgctctttt ctgcatctat tacgatgatc  47400

atattatttt tgtttttaat tctgtttaat gtagtgtatc acatttattg acttgcatat  47460

gttaagccat ccctgcctcc ctggtatgaa acccacttga ccatggctta ttagcttttt  47520

gatatggtgt tggatttggt tggctagtat tttgttgagg atttttgcat ttatgtttat  47580

cagggatatt ggtttgtagt tttctttttt tgttatgacc tttcctggtt ttggtattag  47640

ggtgatactg gcttcataga ataatttagg gaggattccc tttttcttta tcttttggaa  47700

tagtgtcaat agggttggta ccaactcttc ttcgaatatc tgatagaatt cagctgtgaa  47760

tccatctggt cctgggcttt ttttgttggc aattttttta ttactgcttc aattctcact  47820

acttcttatt ggtctgttca gagtttctat ttctgtctgg tttaatctag gaaggttgaa  47880

tatttccagg aatttaccca tttcctctag gttttctagt ttgtgtgcat aacagtgttc  47940

atagtagcct tgaataatct tttgtatttc tgtagtattg gttgtaatat ctcccatttc  48000

atggcttttc ctcttaactc aaactctaaa tgttggccat cttcagggct tagtccagcc  48060

tttatttttt tttaaatatt ttttccaaag ttccctctcc caactttatg actttaaata  48120

ccacataatt agaattttcc acatttgtat ctcctcagac ttctcgtctg agctatggac  48180

tcaaacattc aaactatctt cttgatgtct ctgtttgaag gaatcacagc catcttaaac  48240

ttaacatggt taacacaatt attgatttcc tgtctctcat tccccagtaa tcctcttcag  48300

tcttccatat cttagtaata gtaccatcat cctctaggtc cttaatctgt aaatctagta  48360

gtctttctgg atttcccagc tacttctttt cagtgtcttg catggttact ttttttgatg  48420

tattctttaa acagtggtgt tttggcttag catctactca cttttcattt gaatttttct  48480

ccctaatcaa ttggatctac ttctatggct tcattgtcat catatgctga tgactttctg  48540

aatttatctc taaccttgga tttgcttctg aaattgtggc ccttatattt aaatacttag  48600

tcaacatctt tatttcgatg ttccacagga aacctcaaat tttcctatcc agaatggaat  48660

ttgctacatt cccaataact catgcttcct tcttgtcccc tctctcagtg aataatatga  48720

gcatctaata gagtcacaag ctagaatcct ggataccact cttggtaagt tgtccctttt  48780

tcattcacat taaatccatc aggttttgtc acctcgatgt ctaaaatatg gcacaaattt  48840

gttaactcat cttcctttct catgaaacta ccttggaaca ggtctttcta atttttgtct  48900

agactgttgc agcagtctcc tcattttcat ttttactcac ttccattcta ttcttcaaga  48960

agtcagaatg atttctgaga aagcaaataa gaccatgtca ttgtcctgtg taaagccatt  49020

tattttaata ttatgcttca taaatctgca atcattttgt ttatccattt gtttatctat  49080

gattgtcatc cctcattggg attcatgctc catgtgaaga aggttgtgtc tgcttatctt  49140

ttgtttctta agcatcttgc acagtttccc aagcaccatt tcttaatgat aatagtaatg  49200

atgaaaaaca acaaagggac tcagtaatca acatagaggt ctggtcacca gaaatcccaa  49260

aatagtgcag ttcagttttg tactaaaatg acattttagt gaatttaaac taagacattt  49320

tagtaaataa atctagtatg gaattccatt tttcagcttt gttttcaagg gattgtgaat  49380

ctaggcacat gagtgagtag ttttccctgt tactctatat gaggcctaca gcttgctcaa  49440

gcaagttcag gaccacagct aggccctttg aagaaatcca tatgtgtaga actctaacca  49500

ggtcagacgt aagttacaga tattcttaaa gtgacttttt gtctttctgg ctggatatga  49560

tactgtagtt tctgtaaaac aaaggaggac catttagttt caaaaataca atatgggtaa  49620

atacaatata gataacttgg taataaaagg attttaattt aatttaggta tttatgttta  49680

gataccagct actagtaaaa taccacctcc ccccacaaca aacacatata ctctagtagt  49740

ttctaatgct tatagaaaaa tggacttaat gatttttgga ttaatctttc ttaattttca  49800

tttgcttttc aatcttcttt gggaaaaggg taacctgtgt ctcaactttt tatgatgatc  49860

aatttacaca tcatatatat atatattttt ggatatatac cctaatggga ttgctcggct  49920

gattggtagt tctaagttct ttgagaaatc tccaaactgc tttccacact ggccaaacta  49980

atttacattc ccaccagcaa tgtatataca catcataatt tgaatatgct atgttccaga  50040

ttagttgcca gcaagaaggg gtgagatggg ggctaagaaa aagatgatag caatataaaa  50100

agagatttga aataaatata tatatcagtt taaaaatata tatttattct gggtgatact  50160

gatgcgtcaa tgtgagttca tcaattgtgt ggtaacaatg tatcacttcg gtgggggatg  50220

ttggtaatgg ggaggcccac acatgagtgg aagcaaggga tatgtgggaa atctctgtat  50280

cttccactca tctttgctat gaacctaaga ctgctctaca gaataaagtc tattaaaaaa  50340

tatatatctt accagtggca ggggtgtggg tagagtggag agtggggcta gggagtttca  50400

gggcataagg gttaagccgt gtcttcattc agatacccca tggaaccact gaagggcttt  50460

cccaggtatc ctacagtagc atggcataca ctcaaggtta gtggagagaa ctcttaactg  50520

gtaaaatgtg tgaattctgt gtttctaggc aattatgaac accaggtaaa acaatgtcag  50580

ttctttaacc tcagaacctt tgcggagtgg tcagctaaag tgaactagac agtgactcag  50640

gaaatctaag catttctgtt ttttttttct tcattatttt tgtgtcagaa acttggtggt  50700

taattgtgta gttaacccgt ggctggctgt agagggattc tattctctaa atgcaatccc  50760

atataaaatg agtcttacca gcttataaaa gaaaaagttc cctatatcat taatttttat  50820

aagtgtaatc acatcagaaa tatactaatg gagttcttta ttgaaagaaa acatatataa  50880

gaatcttctt aatataagaa taatatctgc tccatcaact gcatctcaaa atttgtgcta  50940

ggatttagca agttgtacaa agaacacaag cctttatctc aataggtctg ggttcttttc  51000

ccaattgtca ctggctgtgt gacatcaaga aaaactccta acattgcagg ggcacttttc  51060

ttatctctag aaagagttgc actagatgat gcccaagaat ttctctggct ttagaatttt  51120

ctgtttcatc ttccaaactt ggaaattcat tgattttgat gtttttatgg ttgcatgctc  51180

atattatata accaagatga ctgtgtgcta aattaatgct aatccccagg actaaataaa  51240

agttatttga aaactgtggt gcattgattg ccatctctta atgaaacttc cgggaccttg  51300

attaacctag atgttcgttt ttgttgttgg agaatctggc tgttggtatg gtatcaatat  51360

gcatggcaat aactttagaa ttattggtga gataagaaat agtttcaaaa tccatgtaac  51420

tcctcttgtg cagtgaaagg aatactaaaa ttttaaagat acattttgaa ttttggcctt  51480

acctttttaa tgactctgtg acattgctaa gtcacttaat ttctctgata tttaattttt  51540

tgcgtctttg aagaaaggga taatgcctgt tctgcataca ttataagtcg actataagtg  51600

aaaatagttt tataggagaa ttctctttga gttattgcaa aatgcaaaac attctaaaga  51660

ttgtagttta atcttttgcc atggcaaaga taaattactt ccaactgcta attttgggaa  51720

gcgagcaata atattttatg aatgtctctc tgggttggag acctgcagca tttgtaggaa  51780

atcacataca ggcggcatca tttgataatt ctgctatcct gatcctgctt actgcaatat  51840

ccatcagtag agtaagggta tgtctgagga atactgtatg gcactctgca ctcttcatag  51900

aagtgattac ttgttgaaac aaaggctatg gcagacacag tatcatcaat cttctgactt  51960

ggtacttcat ttctttgggt ctagtctttt ttatcctggc tctagcactt actggcatgt  52020

gaacttgtaa catgctacct aaccctgatg agcttataaa aggaaaagtt gtatagatca  52080

ttaattttta taaactaggc accagttttc ctctccctca aaaatggtag ctattgtatt  52140

tgctactctt acattattat tctctaagtg cagagatttg caggcatata catcctaaag  52200

aaagggtatt aaaagtccca aagtttataa atcactgctt tccccaaatc ctctattgcc  52260

aatgggcatt attatttagg attagagatt actgagaata acagagaccc aaaatatact  52320

gtcttaagta aaattgaaat ttatttctct gacactgaaa ggtttgtaga taagtagttt  52380

aaggctgatg tggtgggtca gttccacaga gtcctcaggg ccccagctcc gtctattgtg  52440

ttgctctttt gtgtgtggct cctaatttac caaggtcatc tcatggctca acatagttgc  52500

tctagctcca gccatcaagt ccacattcta gctagcagaa aagaggaagg gacaacagaa  52560

aaggaaaatg gtgtgcatta tttaaagaag gtccccagaa tgttgtataa aatttgtcca  52620

ctggatgaaa atgtatatac ttaccaacaa aggaggttgt gacatatagt ctgtccatgt  52680

tcatgaggaa gaggagaaca aatattggga aaaagctagc ttcttagaca caagaacaat  52740

gacagaggca tttaaaaatg tgtcccagat aattgagaaa aaaaccagca aaaaaaggaa  52800

ggggagtgaa cccgggaggc ggagcttgca gtgagccgag attgcgccac tgcagtccag  52860

cctgggcgac agagcaagac tctgtctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaagga aggggatata  52920

tgtagctatg ttagtctgag ttaggtggtt attatgagga ttttgttgtt gttgttgtta  52980

catgtaatta tcaaacatac cgaagcctaa tttgcagtct tgagcttttg tttttttagc  53040

tgttattgag aggaaaacaa tctcctggat tcttttctca tcctggaagt atggatgcct  53100

tctctagtaa gtaagtttat tttgctttca gtgaagcata tgtattacct ttaaaaaaac  53160

attaattata ttctgttatt tttttgacta gaaaaccata tactttaaga aggatttaat  53220

aacttggtcc ctgggtgtca atcaataaag cacgtgaata accagtgcaa agtggtcact  53280

cggctgccca aggggaggtc atccaagaat gaaatcagtg taacaacagc tgaattgcat  53340

ccttcatcaa atgcatgtaa aacagaccag aaagacatca attcccaatg ctggtatggg  53400

tggtctttct actgcatgta taatttccaa tttaacaaag gttaatacca tgttgtaatt  53460

tgaaatgtca aaataataaa tcctatgtgg gtaaactaga tggtggtttt aaaatttata  53520

atgaatattc agttgaaata gtaaagtcat ttaaatcaca tcagcagagt ttttctcttt  53580

ttcaaactag tgatacacac acacatatat atatatatat atatatatgt gtgtgtgtgt  53640

gtgtgtgtgt gtatcactag tttataccag aatagatata tattctgggt aacagctttt  53700

atgggtctga tatcagatca gataactaac atctgatacc ttgtctttta ggtcagcatg  53760

gcccagtatg attggaggca atgacatatt attaagtaaa aaattctaga tagagtgttt  53820

ccttttgaca gcttttaatc acctgttact ttctttcagt tttttattcc ttgaggtaac  53880

ttattttaga ggctagtttg aatatttaat ctgttcttgt cttttactgt gaatttcctt  53940

ctaaatttta attcacaata ttattcatat taaatctgtt cataagataa aatgtgttag  54000

taatttcgtc tttttaaaat tgaatttatt ttaataattt tctttaatca aaaaattaaa  54060

attccctcct aggaacaagg cacaaaaggc tcaagagctt caatttactt ctcttcttct  54120

tctttttttt ttgtcttgtt tttttgtttt gtttatctta ttttacttta agttccagga  54180

tacatgtgca gaacctgcag gtttgttaca taggtaaacg tgtgccatgg tggtttaatc  54240

cccacatgca ttagctattt gtcctgctgc tctccctccc ctccccaccc cgacaggccc  54300

tggtgtgtgt tgttgccctc cgtgtgtcca tgtgttctcg ctgttcagct tccacttatg  54360

agagagaaca tacttctctt ctttacctat ggtaaattca cttttgatgg gtgtgcttgt  54420

caatactgaa aatgttctcc attgctttta aaaaagaaat agtcacatca gcaaaatggc  54480

tacctttcat tttgggtatt tcattactct tttttggata cctgttagtt taattcattt  54540

aaacaatcat gtattgaaag gctacttggt tccaggtgtt tgccaagatt gggaaatata  54600

aacatgagtg aagtatggtt cctgaccttg agaagttcag agtctagagt ctgaactttc  54660

taatttgaat tgcttttaga aaacaaaaat agaatatcaa tcattctggg agatttaaat  54720

gatggattta agataagaaa tgggtaattt aaacataata gaaagcaatg tagagatctg  54780

ttttgtttta aatctctatc cttgtattga acttgcatgt gagttttcca tctctctata  54840

ttactaatgt tccagaagaa gccgaccttg gcaacaaaaa gatcacttta ccaccaatat  54900

attacaaaga ctgatttgga tgcaacttag aacctgtgaa aatctagtcc tcttttattt  54960

actcaaagat cctttccatt ttacggtact ttgcctataa gaatagtgtt aaaattagat  55020

gtgatatcca aatcttctga tttgggtagt ggtgcatttt cacccaaagc taaattgcaa  55080

agaaagtgga caatgatcaa gcatagatat tgatcccata tttcttaacc tttatgaatc  55140

tattatcttc caaaaatcca tttaggattt agatagaaag caggatttcc ttttgactct  55200

acagtgtata aaacacagaa catctgagaa acagaaacat ccaaccttaa tcatgttcca  55260

ctttaagtga aggtaaaagt aataaagttg tgttggtaca aatctttaat agaattttta  55320

tgtaaatagg ggattcttat gttactttaa tgcaaaatag aaagaaaaca aatgaaattt  55380

tatatgaaaa ttaaaaacct aagagtcaaa aggtagatgt atgtagaatc ctccacagtc  55440

ggcctatcaa tgaattcctt tctcattttt ctcttggtct gcattcagca gtgtcatctt  55500

ttctttcttt ctttactctc ccctttcttc tcctttgctt ccttctcagt ttcttgctcc  55560

ctttctgcca gctttttgaa aatgccatac tgtaccccac ctttccctgg ttggactcct  55620

ctgacttctg agagttcctc tggtaggaag tagtccagtg attgcctgtt gacttcacaa  55680

ggaagagttc ttaaatatgc tgttttctta gcagcttgga gaaaagcaag tgaatggctt  55740

tcatcttaga gggaaatctg tagggacaat gtgggtgcac ttccttgcat agagctaccg  55800

tttgcactgc atgggctctg aggttctttt acttcccttt tcatacctct ttaagagagg  55860

cccctagaga accaactctc tgatttttgt gcttgggaag ctcttggaaa actgatgttt  55920

ttctccctga tgtaaagtca gtagtcttag gactgaaagc ttagattcca gctttgagct  55980

ctgatttatt gttctctgat gtatgtggat ccagctagga ctttaatact tacttcagtt  56040

catttcctgc attgatttct caggtaatct caagatgccc tataaggtcc ttgaaggctc  56100

tgaaacccct gacgtcccag gcctatgcca ggtttgccct aaggaccttg gtcaatttcc  56160

tttacaacca catcccagcc cctacactcc tgatcttggt cgtccttgta ttacttggta  56220

atgctttctt tctattttat ttggacttgg cccttcagat gtcccagtgg ggtctcagca  56280

tgttctacca ctggctaata aatgaggtgc tcagtgtagt gggaaaggtg taggttatga  56340

aatcacacaa acttgtgttt gtgtcctagc tctaaacctt tctccctatg taatgtggac  56400

aattcactat tttttttttt tttttgagat ggagtctcgc tttgttgccc aggctggagt  56460

gcagtggcgt aatcttggct cactgcaagc tccacttcct aggttcacgc cattctcctg  56520

cctcagcctc ccaagtggcc gggattacag gtgcccacca ccacgcccgg ctaatttttt  56580

gtatttttag tagagatggg gtttcaccat gttagccagg atggtctcaa tctcctgacc  56640

tcgtgaccca cccgccttgg cctcccaaag tgctgggatt acagacatga gccaccgcgc  56700

ctggccaaca attcactatt taaccttagc ttccttagcc ataaaatggg cataataatt  56760

tcaatcccct gggaattgtt gtgagaatta tatgaaatat tcacgtaaat cacctgcccc  56820

tttgtctgaa agcagtggga gctcaatcaa gttgattccc tttctctcct ctgtatgtat  56880

gcatgagtgt atgtgtacaa acatgcgagt atagatgtat gcgtgtgtgt atgcatacaa  56940

gcatgcatgt atgcatgtta tcctgatgcc gcttttgtgt tctttttctg tttttctctc  57000

ctgcaagaca tgtactctga cagttttctg tattttctgg ttgtttctga gatttaagaa  57060

aacaagccat ttctgcagaa acccgcaaca aagggtaggt tgatttacat cagtatttgg  57120

tcctaccaac tcttccagaa tagaactatg ttcccttttt atgctctaca actctggaga  57180

taaagaaaca catgaaaaat aaccctagtt ctcaattcct ttagttattt ttcctggtat  57240

ccattccctt aatatttcca aatggtaggt acttcttgat gtatctattt agacaccact  57300

tattaactta cacttaacta taagatgagg agttaacttt tttcaactac cccacactcc  57360

ccttcacagt ctatcacagg ttggggtaca aactactcaa tgttttcagt attatgactt  57420

tgtagatgtt cactgaagtg aactagtaga gtactatgat aatttattct ttcttgaaca  57480

atatattttc ccctggggtt aatatttcct ggaatgaaaa acattttctg tttaatttgt  57540

ttaattttta atatatctac taaaagtcct tcccagatac agagatttgt tcatcagatc  57600

aaagcctcct attaccccac aattaaatga atcagttaat atactgctgg cacacctcca  57660

tttgttttca gtcttccaaa aatgtgttga taattcccac ccactgtttc ttctttctca  57720

ctcgttcatt cctatgccat taaaaaaatt cctttattca ttaacatgta tgtttctgag  57780

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atctgtctca atgataatgc tgtgggacaa ggcttttgca gtgaactgaa gttctatccc  57960

attaactccc atctactttt tctcttgtta tttagcatta tggagactat ttactttttg  58020

tactcatttc ctgttgctgc tgcaataaaa atgaccacaa atttagtctt ttgaaacaac  58080

cgcaattttt tatcttattg ttctggaggt cagaagttta aaaagggtgg gcagagctat  58140

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cttatattcc tcggctcatg gccccacatc actctaactt ctacttttat tgtgacaact  58260

cctttcctga ctctgatctt ctgtcttcct ctttcatctt ttaaggaccc ttgtgattac  58320

attgggtcca catggatatc cattgtccca tttggataat atggataatc cattgtccca  58380

tttgaatata cttaacttag tcacacctgt aaagttcctt ctgccatgca agataactta  58440

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ccatgtgtca ggggagggaa gtgatgggat catgggggcg atttacccta tgctcttctt  58680

gtgatggtga gtgagttctc tcacgagatg tgacggtttt ataagcactg gcatttcgct  58740

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ccatcatgat tttaagttcc ttggggcctc ccctgcaacg cagaactgtg agtcaattaa  58860

accttttttt ttctttatga attacccagt ctcaggtatt tctttatagc agtgtgaaaa  58920

ctgactaata aatctcctct aaaacttctt tttaggttat cataagaatt gttttcactt  58980

gcttggtaat tgatgtggct tccagattca tcaccatcct tattgcctcc atctgctttt  59040

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taatccctca gttttttttc atgtaaagta ctggtgaggt ttttcccatc ctgtatttct  59280

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gtggaggaac tcacatcttc cctcttaata tgttcaaggc ttcttgggga agttggcact  59520

atgactggtc atctctggct aatcatctat ttctactgag ctctcaactc ccaatctgca  59580

tcctatgttc cacgccactg tcactttttt gcattttgtt gtcctaggct ggatacctca  59640

atttctatct ccaccaaagt tctaccaacc caggtttata tatgtagact tttactgaag  59700

gtctgaagtt atgaaaagag atagcatgca gcttagatag taacaaaaca aaacaaaaat  59760

gaatattaga cctcagaagt atctttatca ttcttgcctc tgtgaactcc tcccagggcc  59820

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tcaggctttc agggccaacc ttcccttctt tattttctgc tgcagagcca ggtgtcctca  59940

ttggagactt cacctttttg ggggtaaaga aactatgaag gtatttggct gaacagaaat  60000

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ctaaaaaaaa aaaaatcaca caaaaaaaat ctcataatgt tttaagaaag tttacaaatt  60180

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ttttaacata agaaaaaggt tcaacctttt ttccatttat ctctgtgaaa aattcatgtc  60300

cttatgctag tttattataa tttttgaaag gcgattccac tgcacagtgt ttttgttctc  60360

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ctgtaattat ttaaaattaa gcggttaatt ttaaataatt aactaatttt aaataaaata  60480

attaatctta aaataggata gagaataaag agcaattcta taaactttac ttggtgttgg  60540

tactagtacc tcaataaaaa ttttggcaaa aatgccacta cttttgtggc acaaggatag  60600

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ttttctctta ggatttgaag agattttctc ttaggacaat tttatgttct tggtgttctc  60720

tttttccttc taagatatgt ttttaacaat aaattataca tttttaaaga tttttttccc  60780

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tgcaatgtaa actttcatga attagtttaa gaattaagac taaggcctgg tgcagtagct  60900

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tattgcaaaa aagaaaagtg aagtgcagtt cattttttgt atctgtagct ataattttta  61260

tataacatca aagtttaact ttctaatatg acctgagtag ctattttatg tgttctgtta  61320

ttacttgaat tgctcacagg tctcagtaag ttaatacata aaatattaaa tgcagattca  61380

aaatttggtc tgctcttgac tatgcagtgg aaatttataa cattttcttt catacaccct  61440

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cagaactatt aatatatatt ttatatttat tatattttat gaaaataaca tatacatata  61560

tttaaaaact tcatatttta caaaaagcaa ttattataaa ttatcagtct caaaataaag  61620

attacaatgt gttactctga atttccagct acatgaataa tctagggtac ctgcaaggtt  61680

ttgcttccca caatgtgcat cctacagttc ttggacccac agaagtcagc ctgtataaga  61740

actgtgggat caaaatctga ccaaatacca tgaagctaaa gatatcgccc acaaaagtgg  61800

tttttctctc tttcactaag aagaggaaag gctgtttgtg tttaagtgca tcgtgggggt  61860

taaactgtgt cctcctaaaa cccccagtac tccagaatgt gaccttattt ggaagtaagt  61920

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ccagcttatt aattattatt attttttttt ggtagaggca gggtctcact attttgccca  62220

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tattacaggc atgagccact acgcctggca aaagggaaaa tttacacaca gagacagaca  62340

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attaataatt tcttaactcc ctgatctatt tctaaactaa aatatggtgg gaaaacactt  62640

tatttagggg gaaattttct tactacagga agaccgttgg tcaatattaa ttaacatatt  62700

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actgcccttg ccaagggtct aagactccat gccagcaaca tttccccctc atcttactcc  63180

tcccattggt agcatttggc actgttaacc atttgctcct tgctggaatg cctctctggc  63240

ttctgtgata ccatactccc cgggtcttca ccatatctta ctgaacattc ctctgtcttt  63300

gctggctctt cctgctctat ctgttcttta tttgttgttc ctttgagctt tgccgtaggt  63360

cctcctttct tttctgtttc tactgtctcc ctgggctgtc tcattcaatc tcatggattt  63420

aaatattata tataggctga tgaattttct gagttccaga cttttatatc caactaccta  63480

tctactcgac gtctgtattt gtaaatgtca ttgtatcttg taaacaacat cttccaaact  63540

gaattcttta ttcccatgca accaagcctt tgtttcttcc aacactttat catctcagta  63600

aaatccacca gaagtctaca agtcagccct tattcctctc ttcccctaat ttaccatcca  63660

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aatttaaaca gcctctatct aatcactctt ctgcccctct tgccttcccc tccctcatta  63780

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tgcttaaaac tcttctatga attcctattg cacttagatt aaaatccaga cctattctag  63900

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tttgagtttt atacccattc tgaggagaat tgatttagta acatataggt gaaaaagaca  64440

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tgtatgtgtg agagtgtgtg tgtatttcta acttaatatt aacatctgga aaagcatgag  64740

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tatttatcta ggtaccatgt aaaattgtga ttcatcagta tgtaagtacc actttttgaa  64860

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tagtttacca agttatatct atctctctat atttatgttt ggagttttgc ccttattgat  65160

gaccctgtat ggaaaagact ggtcaatcct acttagcatt aatcctttgc acggggagac  65220

tactcttgga gactgagtgt attttcagtc tttacaaatg atgaactatt gaatagatca  65280

cacacacatg cagatgaacc caatttcatg tctaacagca tatattcatt ttatttcata  65340

tattaatcta tatataaaat atgaaagttg cttttcaata gaatgatgga tggctgatga  65400

tctatttatt attccttagt cttccttttg atgaactaca cctattcact actcagacaa  65460

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taatactaag tgttgggaaa atacttagga agcagggcta attcatcatg gtattagaag  65820

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ctatgctaat tgcatctgta ccagtcacat aatgagaatg gccaatgcta tgcagtggat  65940

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cacattacca taatattatc acagaatgga aataaatagc aagccaacct tttctgaatg  66060

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ctatatagtt ctgaccacat ctgaaaactt gtctttcctc tttaaagaca ggaaacttca  66360

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tgacctaatt gcctccaaaa ggccctacct tcagctatca tcacattggg gggattagat  66900

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ttagatttct gagtcactga aaattcacct cagttgtcct gttttagtca ttaacattgt  67560

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ttaaccattg aatatgatat taactgtggg cttttgcaga ttctctaaaa aaaaaaaaac  69420

tcaagttgaa gaagctccta tctaatccta gtttgctgag aatttatatc ataaacggat  69480

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tggtatctca ttgtggtttt gatttgcatt tctctgatgg ccagtgatga tgagcatttt  82200

ttcatgtgtt ttttggctgc ataaatgtct tcttttgaga agtgtctgtt gatgtccttt  82260

gcccactttt tgatggggct atttgttttt ttcttgtaaa tttgtttgag ttcattgtag  82320

attctggata ttagcccttt gtcagatgag taggttgcaa aaattttctc caattttgta  82380

ggttgcctgt tcactctgat ggtagtttct tttgctgtgc agaagctctt tagtttaatt  82440

agatcccatt tgtcaatttt ggctttggtt gccattgctt ttggtgtttt agacatgaag  82500

tccttgccca tgcctatgtc ctgaatggta atgcctaggt tttcttctag ggtttttatg  82560

gttttaggtc taacgtttaa gtctttaatc catcttgaat taatttttgt ataaggtgta  82620

aggaagggat ccagtttcat ctttctacat atggctagcc agttttccca gcaccattta  82680

ttaaataggg aatcctttcc ccattgcttg tttttctcag gtttgtcaaa gatcagatag  82740

ttgtagatat gtggcgttat ttctgagggc tctgttctgt tccattgatc tatatctctg  82800

ttttggtacc agtaccatgc tgttttggtt actgtagcct tgtagtatag tttgaagtca  82860

ggtagcgtga tgcctccagc tttgttcttt tggcttagga ttgacttggc gatgcggggt  82920

cttttttggt tccatatgaa ctttaaagta gttttttcca attctgtgaa ggaagtcatt  82980

ggtagcttga tggggttggc attgaatcta taaattacct tgggcagtat ggccatttcc  83040

acgatattga ttcttcctac ccatgagcat ggaatgttct tccatttgtt tgtatcctct  83100

tttatttcct tgagcagtgg tttgtagttc tccttgaaga ggtccttcat atcccttgta  83160

agttggattc ctaggtattt tattctcttt gaagcaattg tgaatgggag ttcactcatg  83220

atttggctct ctgtctgtta ttggtgtata agaatgcttg tgatttttgt acattgattt  83280

tgtatcctga gattttgttg aagttgccta tcagcttaag gagattttgg gctgagagga  83340

tggggttttc tagataaaca atcatgtcat ctggaaacag ggacaatgtg acttcctctt  83400

ttcataattg aatacccttt atttccttct cctgcctgat tgccctggcc agaacttcca  83460

acactatgtt gtataggagt ggtgagagag ggcatccctg tcttatgcca gttttcaaag  83520

ggaatgcttc cagtttttgc ccattcagta tgatattggc tgtgggtttg tcatacatag  83580

ctcttattat tttgagatat gtcccatcaa tacctaattt attgagagtt tttatcatga  83640

agggttgttg aattttgtca aaggcctttt ctgcacctat tgagataatc atgcggtttt  83700

tttctttggt tctgtttata ttctggatta catttattga tttgtgtata ttgaaccatc  83760

cttgcctccc aggtatgaag cccacttgat catggtggag aagctttttg atgtgctgct  83820

ggattcagtt tgccagtatt ttattgagga tttttgcatc aatgttcatc aaggatattg  83880

gtctaaaatt ctcttttttg gttgtgtctc tgcccggctt tggtatcagg atggtgctgg  83940

cctcataaaa tgagttaggg aggattccct ctttttctat tgattggaat agttttagaa  84000

ggaatggtac caattcctcc ttgaacctct ggtagaattc ggctgtgaat ccatctggtc  84060

ctggactctt tttggttggt aagctattga ttattgccac aatttcacag cctgttattg  84120

gtctattcag agattcaact tcttcctggt ttagtcttgg gagggtgtat gtgtcgagga  84180

atttatccat ttcttctaga ttttctagtt tatttgtgta gaggtgtttg tagtattctc  84240

tgatggtagt ttgtatttct gtggggtcgg tggtgatatc ccctttatca ttttttattg  84300

catctatttg attcttctct gttttcttct ttgttagtct tgctagtggt ctatcagttt  84360

tgttgatcct ttcaaaaaac cagctcctgg attcattaat tttttgaagg gttttttgtg  84420

tctctatttc cttcagttct tctctgattt tagttatttc ttgccttctg ctagcttttg  84480

aatgtgtttg ctcttgcttt tctagttctt ttaattgtga tgttagggtg tcaattttgg  84540

atctttcctg ctttctcttg tgggcattta gtgctataaa tttccatcta cacactgctt  84600

tgaatgtgtc ccagagattc tggtatgttg tgtctctgtt ctccttggtt tcaaagaaca  84660

tctttatttc tgccttcatt tcattatgta cccagtagtc attcaggagc aggttgttca  84720

gtttccatgt agttgagcgg ttttgagtga gtttcttaat cctgagttct agtttgattg  84780

cactgtggtc tgagagacag tttgttataa tttctgttct tttacatttg ctgaggagtg  84840

ctttacttcc aactatgtgg tcaattttgg aataggtgtg gtgtggtgct gaaaaaaatg  84900

tatattctgt tgatttgggg tggagagttc tgtagatgtc tattaggtct gcttggtgca  84960

gagctgagtt caattcctgg gtattcttgt taactttctg tcacgttgat ctgtctaatg  85020

ttgacagtgg ggtgttaaag tctcccatta ttattgtgtg ggagtctaag tctctttgta  85080

ggtcactcag gacttgcttt atgaaactgg gtgctcctgt attgggtgca tatatattta  85140

ggatagttag ctcttcttgt tgaattgatc cctttaccat tatgtaatgg ccttctttgt  85200

ctcttttgat ctttgttggt ttaaagtctg ttttatcaga gactaggatt gcaacccctg  85260

cctttttttg ttttccattt gctcgataga tcttcctcca tccttttatt ttgagcctat  85320

gtgtgtctct gcacatgaga tgggtttcct gaatacagca cactgatggg tcttgactct  85380

ttatccaatt ttccagtctg tgtcttttaa ttggagcatt tagtccattt tcatttaaag  85440

ttaatattgt tatgtgtgaa tgtgatcctg tcgttttgat gttggctggt tattttgctc  85500

gttagttgat gcagtttctt cctagcctcg atggtcttta caatttggca tgattttgca  85560

gtggctggta ccggttgttc ctttccatgt ttagtgcttc cttcaggagt tcttttaggg  85620

caggcctggt ggtgacaaaa tctctcagca tttgcttgtc tgtaaagtat tttatttctc  85680

cttcgcttat gaagcttagt ttggctggat atgaaattct gggttgaaaa ttctttagga  85740

atgttgaata ttggccccca ctctcttctc gcttgtagag tttctgccaa gagatctgct  85800

gttagtctga tgggcttccc tttgtgggta acctgacctt tctctctggc tgcccttaac  85860

attttttcct tcatttcaac tttgatgaat ctgacaatta tgtgtcttgg ggttgctctt  85920

ctcgaggaat atctttgtgg cattctctgt atttcctgaa tctgaatgtt ggcctgcctt  85980

gctagattga ggaagttctc ctggataata tcctgcagag tgttttccaa cttggttcca  86040

tcctgcctgt cactttcagg taccccaatc agacgtagat ttggtctttt cacatagtcc  86100

catatttctt ggaggctttg tttgtttctt tttattcttt tttctctaaa cttctcttct  86160

cacttcattt cattcatttc atcttccatc actgataccc tttcttccag ttgatcgcat  86220

cagctcctga ggcttctgca ttcttcacat agttctcgag ccttggcttt cagatccatc  86280

agctccttta agcacttctc tgtattggtt attctagtta tacattcgtc taaatttttt  86340

tcaaagtttt caacttgttt gcctttggtt tgaatttcct cctgtagctc ggagtagttt  86400

gatcgtctga agccttcttc tctcaactca tcaaagtcat tctccgtcca gctttgttcc  86460

gttgctggtg aggaactgcg ttcctttgga ggaggagagg cgctctgctt tttagagttt  86520

ccagattttc tgctccgttt tttccccatc tttgtggttt tatctacttt tggtctttga  86580

tgatggtgat gtacagatga gattttggtg tggatgtcct ttctgtttgt tagttttcct  86640

tctaacagac aggaccctca gctgcaggtc tgttggagtt tgctagaggt ccactccaga  86700

ccctgtttgc ctgggtaaca gctgcggtgg ctgcagaaca gcggattttt gtgaaccatg  86760

aatgctgctg tctgatcgtt cctctggaag ttttgtctca gaggagtacc cggccgtgtg  86820

aggtgtcagt ctgcccctac tggggggtgc ctcccagtta ggctgcttgg gggtcagggg  86880

tcagggaccc tcttgaggag gcagtctgcc tgttctcaga tctccagctg cgtgctggga  86940

caaccactgc tctcttcaaa gctgtcagac agggacattt aagtctgcag aggttactgc  87000

tgtctttttg tttgtctgtg ccctgccccc agagatggag cctatagagg caggcaggcc  87060

tccttgagct gtgttgggct ccacccagtt caagcttcct ggctgctttg tttacctaag  87120

caagcctggg caatggtggg cgcccctccc ccagcctcgc tgccaccttg cagtttggtc  87180

tcagactgct gtgctagcaa tcagtgagac tccataggcg taggaccctc tgagccatgt  87240

gcgggatata atgtcctggt gcgctgtttt ttaagccggt cggaaaagcc cagtattagg  87300

gtaggagtga cccgattttc caggtgccat ctgtcacccc tttctttgac taggaaacgg  87360

aactccctga ccccttgcgc ttcctgagtg aggcaatgcc tcgccctgct tcggctcatg  87420

cacggtgcac tgcacccact gacctgcacc cactgtctgg cactccctag tgagatgaac  87480

ccagtacctc agatggaaat gcagaaatca cctgtcttct gcgttgctca ctctgggagc  87540

tgtagaccag agctgttcct attcggccat cttggctgct tcccgccaaa tttctgttgt  87600

ctataagcaa cccagtttat gctattttgt tatagaaacc tgaatagact aagtgactca  87660

gtttcttatg ctatgtagtg tctttgttca gtaaaaacag ttagcgatgt cctgctattg  87720

atattgaaaa aaggttgagt tattttcctt ctttcagtgg acatttggag gtctatacaa  87780

agctgtaagg ggcaagaggt acatgggcca gccgtaaagt ttgtttattc aaatggagct  87840

tgttgatctg tcatattttt caagttgagc tactctgcca gggcaacatt ctactgtatt  87900

caaatcagct gttttggaat tggtacacct gctagtgtct gtttctgaac actgaatgag  87960

ttgccataag ggagaaaata taattctctt catcaactag aaaatataat tcaaagtagc  88020

aataagatct gtaagatacc tacaatcaat gtaataaaga acacatttat tttatgtgga  88080

aaaatttaaa actgtactaa agataaataa taataatctt tagtaaactg tacgaaagga  88140

aataaataat aatctttctg attagagaga catttcatgc ttctggctgg aatgacttaa  88200

tattgtgaaa ataccacgta cttcttgaat taatctataa attcaatata atttcaatca  88260

aaatatcagt tatatttttc gtgtactggg aagaataatt gttcacaaat aataaattta  88320

aatttaataa caataaaaag tatacgtggg tgaatcttgc ttgctctatc aaatattgag  88380

aaattagccc aagaacagac aaactgaccg acaaaatgga ataaaaagtg caaagacaga  88440

ttcgtgtgta tgtgtaaata tatttaattt acaataaaat gacactgcaa gtcaaggggg  88500

aaaagatgga ttattaggaa aatgttggga aaactggttt accatatgca gaaagataaa  88560

cttgattgct aactaacagc attcaaaagt agactctaga tgtgacaagt aaaactatac  88620

agttaacaga agaaacagta gaagaaagcc tttgatccta gagaatgatt tctcagactt  88680

tcctggagaa tgatttctag aactttcaaa gaacaaactg taaggcaaat gttggtgaat  88740

ttgtttatat ctaaactaat gatttctaat taatgaatgg aaaatgttaa gagctaacaa  88800

aatgggtgca tctatatgtt caagatatta atatctaaaa acggtaaata tctagaatat  88860

ataagaaata cttgcaaatt aataaggaaa agacaacaat ctcaacagaa aaatacataa  88920

agcataagaa taagcaatgt acaaatattt taagaaacac aaaataatgc actttttttg  88980

gcaagaaaac acacaatgca aaatcttaaa gacattagaa tgcctgtgga ggggaatttt  89040

aatatttaaa aatagttatg taccatacta gattttggat attgaagaca gaaatgaatt  89100

taattcctcc atgttcagct atgctaagca ataatgtttg aggaaaaaaa aacacatcct  89160

aatagccata aattagatta taatagaaat cagtaggagg ccgtggcacc tgtctagata  89220

tgtgctgctg aatacctgga cttgggtggt ggcaagggaa tggagtgatg ggtcagcagg  89280

cttttgtatt ggcatggatg tttgagggaa tgaaataaat aaataaacat gagttttaaa  89340

gccaagtgaa ggtccaattt ccagtagtac tgcttagaat catttgaact aattgttcaa  89400

ctaaaaatgt tggataaact ttaaaaaaat tcttaaaatg taaacaactt ggcaagacat  89460

aaagccattt cagatcaaaa tgtataattc ctttatccca ctgtgactcc caatctactg  89520

atcctaccca catttcagtg tccctcaccc ccatgatatc ctaattttcc tctttgatta  89580

cttaaattgc atagacaatt aatataaatc actcccttgt atatttcctt gattcctttg  89640

tccttcttgg gttttactat agtggcttgg ctcaacttaa ttaaacccaa gtttctcccc  89700

ctatacttgt gtagctgagc atggttgatg caaaacataa aacatacaac cacattgaat  89760

ggcatcactt taaatttaac gttatcaagc aaacatactt tctgtcccta gtccattcat  89820

atggactagg tacccactca cctggatgac tatttcacaa ctttctttct tttcaaaatt  89880

ccagtccctt tcctcatttt caattttagc tgattgactt tttttaaaat gagacattta  89940

gaacaatcta gagagaactt cccaacacca tgtttgatca tcagcattac attcctttac  90000

tcttccttcc cccctcaatg aaatatacat gcttttatca aaagccaatc cctctatttg  90060

tgccgtagat gtgatccctt ctcacctttt ccatgacatt tctccagcaa ttctccccac  90120

tgcttcttat gacatcaatt tttcacttta ctgaagtatt ctcctttagc atacaaatct  90180

gctgttattt cttccatatg aaacaatatg aacaagcttt tctcgaaaca gttctgccat  90240

ccagcacgat ttttgtcccc tttgcaacaa agccccttga aggagttgtc tatacttctt  90300

gttttcactt ccattcctca cattctctct taacccattc taatcagtta ggcttctact  90360

gccctcccct atggtctcca atggcctcta ctttgctaaa gactagttct tgcccctcat  90420

tttagtcttg acccatcagt aacatttact tctgattatt gattgttcaa ttctttttaa  90480

catatgcttt cttttggctt ctaggacatc acacactcct tttccctcct gctttgctgg  90540

tcttctattc ctctgtcttc ttcactggtt ttttcttttt tctcgtatat tttagagttg  90600

gaaagtatcc tagagtgttt tcgttttttt ctcttttttc tttgtactca ctatctcagt  90660

gatcccgttc tcatctgatt ttgaggcctt gaataccatc tgtatgttta tgactcccaa  90720

atttatatct tccgctcaat ctctttccaa ttagctactt gatattttta cttgtacatc  90780

tgatagatta ttttaaactc aacatattaa aaacagaact tctgaaacct tccacactgt  90840

caaacaaaca tataaaaagt ataacaatac tactttggtt gatgacaact caggccataa  90900

gcctttgtct aatatttgac tattctctga ctcttatacc ccacatccca tactttatta  90960

attgcattgg aaattcagtt tccatctatg taaagctcca tgttgatctg ctgcaaggat  91020

agttgtgggc cccagtgcaa taaaaatgtg gggctcctga tagggaaggg aagtcaatga  91080

ttccttctta cgggtccttc ttctaatcca tggtgaacag atgaccctcc atagattgtc  91140

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gttagtggtc acagggatgg tgtagggagg aggaggctgg acagggccta ggtggccaag  91440

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gtttccaacc acctgtgcat gctcccttgt cccatcaaac ttcacttaaa aatgcaaatt  91560

cagatgatca gattcaatgg ataatcttag ccaagttatt taacttctct aagcctgttt  91620

tccttagatc atcatttcaa tatggtggct gcagagtact aaattgcaaa tgcagggctt  91680

ttttgagcat tgagtcttgt gtgactgcat tgattacgct cccatgaagc cagccctgat  91740

ctggtgatat tgcctagcca aaaataagac tccatttaat gattgccttt tgcctttctt  91800

actggtactt ctgacttctc ttccttctga ttgcccaatt ggcatctttt ctaggctgtc  91860

aaattttacc cagagcctcc aggatttgtg atgacttcga agaaggtttg gactctgatc  91920

tccgatcttc agttttcaga acccagttag ttatgagtta gggatggtct tttttttttg  91980

cacgtaacac ttaaaagcat gaattttgaa gacaactaga ccagagttta agtcctgtgt  92040

ttgctcttac ttgatgggtg aacttgggca agttatttaa cctcgctaag gcttgctttc  92100

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cctctctgtg cctcagtttc ttcctctgaa aatgggaatg ataatactac ctaccctata  92220

ggattgtatt gaagattcag tgagttagta catgctaaag tacttggaaa atgctcagaa  92280

caggctggca ccattgcaag ggtttagtaa atgctaacta ttctattcat ttattcattg  92340

aaaaaatgtt tatgtagcac ttatactgtt ccatgcatac agtttctcat ctaatgagta  92400

gtattataga taaatatcta caaataaagt gagacttgtt aaatgcttag caccatgact  92460

gtcactttgt ataatcttaa caaatgttag ctattacaat tataaccaat aatgataatt  92520

attaagttgt tagccagaag aaagatatct tggttatagc tgtttgatgg taatgagagg  92580

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ttctattttt ccatgcagag tgagcagcat agatctcaga tgacaacttg gtctccctac  92700

catttgatca agataaaatt gaattggacc ccctatctca taacctgcat acaccattag  92760

acctcccaag atttcttcaa aagatccacc caaggattta tgctttcata atcctctttt  92820

cttgtgagtg gttttttccc agcaacatgt ctaacaagga aagagaccac agatctaggt  92880

tttctaaaag aataccctca cattagtgaa aaacatagaa tttagtgtat attttgcagg  92940

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gttagtgatt cttgttcttc taaacccctc tgttactctg ctgccatact gggcattttt  93060

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cccaattttc ctggaaaata attggatgtt ttctggctta cactcccaaa cttatattta  93180

gacatttatc aagtgctcaa ctcatcaatg gccttctagt aatataattc attcttcaga  93240

gaaaattcag tggtgaaata tttccttatt atatttgctt tatatgtttg gcaatatgta  93300

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ttaggctttt agtaatatga tgggagtccc tgacctcatg ggtatttaat taaaaagtta  93420

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tttaaaagag ccttgtcaga attaaacttt gtttttcagc tactctgtac tcactctctg  93540

gtcctcccac ttagatctag gaaccgagta aggactggca gtatatgcaa tggggagtag  93600

tggctggaag gtgagtctcc agatgacatc cgggatctag tgccttcatt tctctgatga  93660

agccatgcaa ataaccataa gagaaaaagt taattgaggt gatgagtgga tgaagagagt  93720

gagtcatggt taccaagaat aaaagtgctg agttgttgat gaggtacaga aataattagt  93780

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gtatgaaact taataattgg tactcattta atcttaagta gggtccaaaa tgttcttctg  93900

cttggtctga ttctttcttc ttttgttcaa actcctttga tagacaaaca gaggaaagag  93960

aaggaggcaa ctgttccaag atagattctt ccccaataca gaaaagagag acaagaaaaa  94020

tcataatttt caatgccata tatttgtatg taatgcagac caaacttctt gtttaaaaat  94080

gataaagtaa gtcatgctta taaggctcat ggcttggtgt tttctcagca agaaaaacag  94140

atccaaaggt tgatatagtc tagaggatct actagattga tcttaaaatg aaaaactata  94200

taatgctaaa gaacaatgtt agaaaatcgt ctagataaaa agtagttcct ttctaaataa  94260

aaaagctact tcccacatac gttctcttga ttatgctcca aattctaggt cctaaataca  94320

attcaataaa tatatgaaca ataagcgttg aaatggaaga cgagcaatca ataatttatc  94380

atagcccatt tacatgatct tgtagagtat gaacccagat atattgtttc cactaatcta  94440

tggtactatc ttaatgaact aagaggagat atacagattc agtacgttag gccttcaaat  94500

aacattttta aagcttcctt tttcttagtt tattgcaaaa ggaaatattg gttcctcctg  94560

aatagatgta gtggttagat aaatttcagc actcaagaga ccaaaaaaaa aggccatgag  94620

agaaaatatc tttcttagac tcacttaagc ttgttatctt ttggctgttg cctgtattct  94680

tttgcattct ttagccacat tggttattca aacacagtga attaaagcca ttagttttag  94740

ttttgatgat cttgtataga aggttagttg atacggggtt ttgcatgtaa aatcagggtt  94800

agctgatatt cattctataa attcagcatt ttgtgagaat tttgatggag tcttaaagcc  94860

ctttttaaat atttcattga attgatagga gtcttgtgta agtaaagaaa ctctattccc  94920

aagctgatcc actgatttgt ggacttgtca cttggtagta gatacttgtt tttggcatca  94980

catatccatt tacccttcat ctgggtaata agaggttaat gtttatttag aaatcaattt  95040

cttccctatt tttagctaca cagttagaat tgactccact actgatccta catgtgtggt  95100

ttgtgagttc aggcttgact cagagcttct ccttctggcc atgataatca gcatgaacat  95160

atgattcggt cagagacaag aagacacaaa gagaattttg caggtgattg tgagaaattt  95220

tttttcctat tggacttaaa tcgagtggga taaaatcaac aagaaaaatg cagagctcag  95280

taatgtagaa aaactttgtc ctatgacgtt gcttcagccc tgaatccagc cagacatgcc  95340

cccaaccagt cttaccttta gacttttcaa ttacaggagc caatacattt cctttttggt  95400

taagccaaat ataggttggg ctttctctca cttgcaacca aaagagttct cattgacatg  95460

ggcttcttct ttatcttctt ctttttttaa ttctaagaca aacttgagtg aatctgtttg  95520

gatggtggct tgcctatcat tgttttcatc ttacccaagt tgaccacacc cacagagaca  95580

tgctctgtta ttttcagttt actcagatga ttttttttta acataaagaa ttttctgcat  95640

aaagaaaagc tttacaatgg tgctttgagt tgaattgtgt ggtctctgca tctcccttat  95700

ttgcatgtgg aagtcctaat ttctagtgct tcagtgtggc cttatttgaa gggtctttac  95760

agaagtaatc cagttgaaat gacatcatta gggtaggccc taatccaata tgactggcat  95820

tcttataaaa aggggaaatt tgaatacaga cacacataca gggagaatgc catgcgaaga  95880

tgccggaaga agatggccat ctgcaagccc aggagggagg cctgaaacag cacgttccct  95940

cacagccctc agaagaaaac aaccctgtgg ataccttgat cctgaacttc tagactgtgg  96000

aactgagaga caataatttt ccattgttta agccatctaa tgtgtgatac tttattacag  96060

caacgctggc aaatgcatac aattggcaaa agggactcgc attaaaacct gagtgagtaa  96120

ataaaaagaa gtacaatttt atttgattta atttgataga gcattcacta caagttgttg  96180

ttatttgtag agctagaaat ggattaagaa agcacttggg aaaatcaagg atggcaaagt  96240

tataaactaa ataaaggaag agattcaatg tatttaatat tcaaagctga tttcagggaa  96300

gattgctttt ggcaagaaaa tgaatgcgcc atatttacag catgtgtggc aatttctatg  96360

tttctatact tcgatattta gaaaattaat gtaatgtgat atggcatttc atgctttctt  96420

aaaatatttc aaaacatata tttttctgca aatccttcaa taaaaaaact aagaaatttc  96480

agaataatcc caatgtttat acattttcat tgctgccttt ctttaaaatc tgtcataaaa  96540

taatcattaa aaattattac aattttcttg aattataatt gtcctaaacc acttactttc  96600

ttttatggaa ctacaagaaa aaatataaaa acgccagtta aactcttact taaagccaaa  96660

cccctttaca tttaaattct ggactaatag ccaaggattt agattcagag gttggctaat  96720

tacaagaaag aaaacagaac tctagtgaaa ggtatcccta tcatttacat acatgtttat  96780

attaatatgt gtatatatat gtatatccac acagacacaa agtattatat aaggtttgtt  96840

ttaaaatgaa tatatttgat ttgaaaggct aaaaaagatt acagatctca gaatgttttg  96900

tcacagaata gatatgatac ctccaaatta agtggacaaa tttttaagta gcctgatcta  96960

tgaaaactat ataaatgtaa actttttctt actagatatt acataaaatg acagacaact  97020

ctttaatttt cttaaaactc tgacacattt tacagttgtc tgtcttggtg ttggatgaag  97080

gagcaaagag aatgctgttt tacagaggtt acatttctcc tactatatga cagagatttt  97140

aaaaaaagta ttgtcctttt gccctccctc ttcaaagagt gaaatcctac tcataagcaa  97200

aaattgattt tttaaaaata aaagacgtta ttgtttgccc tttctaccag aactgcatga  97260

tattgccatg gtctcaattt atactccata tggtttgtag gaatatttca tataaagtat  97320

ttgtgggaat tcttaggaaa aagatgtttt gccaatagac aataaaatac tcttcagttt  97380

ccaaatttag agatcaaaag ttttatgtga ttcgttgcct ctagcatcta ttctatttca  97440

tggtttgtca tattctaaca ttttgcatta tttaaaaaaa tctttcttag aatgaggctg  97500

aataaagcat gcagaattgt ctgcttggaa attgtacaca tagcattaaa caacttttta  97560

acacgttgtt gtgtgcttaa ttcctcgata atctcatcct aattatttac tgctttacat  97620

ctttttattt tttaattttt taaaattaat acatagtatt ttgcatatgt atgagctaca  97680

tgtgagtatt tgttacctgc atagaatatg taacaatcaa gtcagggtgt ctggggtgta  97740

acttaccttg agttcttact tttatgtctt agtaatattc aagtcctctt ttctagctac  97800

cttaaaatat acagtatatt attactaact atagtcaccc tactctgctt tagaacattg  97860

gaacgtatta gtacttctgt ctgtttacat ccatttaaga acctgtcttc atccccctct  97920

ccccaacctt catacccgtt cccagcctct atcctccacc tcccgttctt ttgtgttacc  97980

cagggcagta cacaacttca aaggatatag cctgtgttaa attggaggac acacacacaa  98040

gaacaacaac actttaagga aaagtgttct ttcactagcg gcttctgagt cttattaaag  98100

gaaaatgaag tttctatata aaatgctaga tacccaccac aatttctttc atgtgaatta  98160

cacttgtttt tggtatatct tgtgtgtgta tgtgtgtgtg tgtgtgtgta tgcacacacc  98220

ctttgtaaat ttgggttaca gaggcagaaa tcaaaaggtc aaacaacagc tagtaatttc  98280

tcactctgta tattcttatc acatttctca aaaagactgt actgttctat gtgatattga  98340

tcttgattat ttctgtgaac acattttctt agttaataat atgcagaatt ctgactctat  98400

tgtatctctt ctcttcattt ttgagaattt tagtgccaga aaggacattt attttatcca  98460

gctgcaaact taaataagct cttcatttct ctaggtcact gatggcaaat gttaaacaaa  98520

tttacatttg ggattttcta ttcatttccc acccggttga cactgagcca gtgataacca  98580

ctcaatagct gtgcagccct caatagtatg tgtgacccat actgtgtttc cagttcattg  98640

atgactctat catgctgggc taaatctaaa atcttgctaa agtcatgaga gatcatatct  98700

actgttttcc ctttgtgtcc caagagtgac ttcctttgaa aaaatgtgaa aaagagtttt  98760

cactgtagtc agtctagatg ttaaaacttt atttgagcac gagtttctgt aaaatagaac  98820

ttgaagatcc tgtaaagtta aaacatatag gcacactttt tcttcctggt cactttgggc  98880

ctgttctgta gcagtgtctg cccataattg gtatagtaaa ctgttctcta gttatgagct  98940

tcttatcaag ctctcaggag tgcattgatt ctatttttgg ttaattttta attatttata  99000

cttatgtcac taagctgatt aaagtggaga attaacctca agcttagccg agtggcagct  99060

tctctcagtc aaagacaagg atactgactg gttgtcagaa tatttgggtt ctcttgtcaa  99120

ttaccaccca aagctacatg ttctccagga agatccttta cctttatatc agtttcatca  99180

tctgaaaggt gaagataaca atatgtattt tactgaacat gaagggcttt cccaactatc  99240

aaatgagata aaatatatgt aagttgtttt aacactctaa atatttgaat tatttactta  99300

ataacatatt tgcatttttt taggattcat atattagtaa catatttttc aaaataatac  99360

cttaaacaat atgtttcacc atgataaaca tttccagatt ctgattatat attttctact  99420

ttatggctga ggctatggtt taaaaatata ttgtgtgata tattgctaat aaattaaaat  99480

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tgtacttctg ttgaaaatat atatgtgaaa ttaaatgttt ttgtataatt aaattgtttt  99720

gtaaaaaatt ttaatcttct attatttgtg ttttagtcaa attaaagtgt gtgtgtatac  99780

catatccaga gaatgtattt cctctgaagt gatcaggaga tttcatttat ttccctatgt  99840

taccttggag aaaattactt ttagaatagg taaaatgtaa ataaggggta gtgaaattaa  99900

atttttactt gcctatgact tttcctacta tttactttat atcttatatt gtttaaacaa  99960

gttaagtggg gaagaatagg aattattttg ggaacagcag agcaggtgaa ggtgtagggt 100020

ttgggcagct ggtaagactt taacattttt atccttcaag tgtactagcc accttaaaat  100080

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ttttcattga aaatttatat ctattttctt catctgttat gatttttttt ctgaaagtga  100260

cattgtctct gttgataaat ctggaaataa aaatgttaag accagcaatg gctatttcta  100320

agtttattct atagggaagc agaaataata gcttgggatt tataattact tctgaaataa  100380

cttcatcctc tgaatactgt taattttttc tttttttgtt ttttattttt attgagacag  100440

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ggcctcctgg gctcgaatga ttctctcagc tcagcttccc aagtagctgg gactacaggt  100560

gcgcactacc atgcccggct aattttttat ttttattttt agtacagatg ggggtctccc  100620

tatgttgccc aggctggtct tgaactcctg ggctcaagca atcctcctgc ttaaactcca  100680

aaagtgctgg gtttacaggt gtgagtcaat tcaccttggc agtattttct acattctcac  100740

ttacgagcac ttcattgcag tcataccatt ggaccatgag taatcttata aatgacatac  100800

attattttac agtcctatta aaattgttta ctttctattt tagggaaata tttcataaat  100860

gattatttca aatcaaagaa cttagtgaac agagtaacat atctaaaaat atgaaactcc  100920

aggatgctgc cttctaaggg ttgagcaact aatatgttat ttatgttact actttgagct  100980

ttctgttggg attttcataa tttagtatta tatattgtag aacaaaaatt agatggacaa  101040

gcactctctt ggtccatgta atttattttt catcttattt cagtagcttt gtagaggact  101100

atggttacaa taataataaa aataaactaa tctgaaacaa ttttaaagat gtaaagtttt  101160

ccagagcatc aaaagcacgt tctgatagtc tacaaccact ctaggtggtg tggaaatgta  101220

tataaacaga taaacaagtt ttgcatctgg gactttataa tttaaagtgg caggaaatga  101280

aagaaacagg taggtaacag aaaaacatgg tattgatgtt gaatatgttt tcctacaggt  101340

gtgtgtgtgt gtacgtgtac gtttggaagg tgaagaacat agtggggaga caggaagctc  101400

agtactcagg cagatcagcc agataccgtc catgttgcaa ctaagttccc atcaacacca  101460

ggcaaggata aacaatacta gggttatgga tgataactct agtcatttta aatagtattt  101520

tttcctaatt attagctgaa taattagagg gaatataagt ttcccttggg tgtcctccta  101580

gatgctgaag ctagtcacta agcagggtgc tgagagctgg atgcaggatc caagggccat  101640

cacgctggac ccgtcttcac tcatgcccct tagctgaagt gctcagatcc acacatatca  101700

ccggccagtg aaaacaggaa tagccaattg gacagcctac acatggttac ccatggctcc  101760

aagtgcaagt gctccaaatt ataatgagga agctgcatct tcttttctga cctagccatg  101820

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gttaggatat aggctccatt tcttcttctt ttttaataac ttcaactttt tagattcaag  101940

ggtcgtacat atgcaggttt gttacacagg tgcattgtgt gatgctgagg tttagggaat  102000

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acgtactcag tgcttagctc cctgttccca tgtttatgtc tgtatgtact cagtgcttag  102180

ctccctgttc ccgtgtttat gtctatatgt actcaatgct tagttttaaa tgagaacacg  102240

tggtatttgg ttttttgttc ctgtattaat tcatttagga taatggcctc cagctgcatc  102300

catgttgctg caaagtacat gatttcattc tttttttata gctgcatagt atcccatggt  102360

gtatatgtgc cacattttct ttatctagtc cactgttgat gggcatctag gttgattcca  102420

catctttact attgtgcagc aatgaacata ggggtgcata tgtctttttt tttaaacaac  102480

ttattttcct ttggatatat acccaataat gggattgttg gattgaatga tagttctgtt  102540

ttaagttctt tgagaaatct ccaaactgct ttccacagtg gctgaactaa tttacattcc  102600

cattaagaat gtataagcat tctgctttct ctgtaacctt gccaacacgt gttgtgtttt  102660

tggcttttta ataatagcca ttctgactca tgtgagatgg tatatcattg tggttttgat  102720

ttgcatttct ctgataatga gtgatgagaa gcagttttcc atatgtttgt tggccgctta  102780

tgtgtctttt gagaagtgtc tgttaatgtc ctttcccatt tttaaatagg gctgtttgtt  102840

tttttgcttg atgatttgtg taagttcctt atagaccctg gatattagac ctttgttgga  102900

tgcatggttt gtgaatattt tctcccattc tgtaggttgt ctgtttagtc tgttgatggt  102960

ttcttttgct gtgtgaagtc tctttagttt aattaggtcc cacttgtcga tttttgtttt  103020

tgttgcaatg acttttggga acctagtcat aaattctttg ccaaggtcaa tgtcaagaag  103080

agtatttcct aggttgtctt ctaggatttt tatagtttga gcagacttca cttcttaaag  103140

ggagacatat caaggtcaca ttgtatatga gacatgggat gggaaatatt atagccatct  103200

ttggaaaacg tgatgtacta tggagcttat gtaagtattt atatgcactc acatctgagg  103260

taatctcttt cagtctcata aatttaatta aatgccatat acaaactaat gagttccaag  103320

tctatatctc cagtcctgac ttccgccctg agttctagat ctatatattc aactgcctac  103380

ttgagatttc cactgaatgt tatggcagag atttttagtt gtctcacaac atccaatctt  103440

attctacagt gttataattt tggatgaaca catggtaact cagaataaag cttatcattt  103500

acccctaccc tcactcctga tgtttggtgt agttatgtca caaaattttg gctaagagga  103560

taaaagggag tgctgttgga cagcttctga gaccctttgc tcattcttct acctttctcc  103620

attctgatgc ttggactaga gcttaatctt gaactaggag atgatgtcca cactccagat  103680

ctcatagaga agaaagttgg aatgattttc ttcctccagg ctcttatgcg gaagagatta  103740

aaaactctat cttatttaag ctacctaact tacagttaaa cctaatcatt tcagactgga  103800

catggcaaaa cagaactcct aatttccctc tgttaatctg cctgttactt ggatgtcttc  103860

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cttggagtgt tggtggtact tcttagctga atgtcccact gagtcctgtt agccatgaaa  104640

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ctcagcactt cataggaatg ggctctgaga gtgcttctta gtaaatgtca gtctcctccc  104940

tgaagaaaat aacctaggac acatattttt acttgtctct tgtttattgt tgatatctcc  105000

cagtagaatg caatctcaat gagggcaagg attttttatc agttttgttt gctactgaat  105060

cccagtacct agaacacaga gcttcaaaaa tatttaataa ataaatggcc ttgtttagga  105120

tgacaaaact agtaatcctt gaagctagag ttcaaactaa atttggaatt cagagctgtt  105180

cctctctcac actataagtg gaatgcaggg tttctcaaca gaagaaccag ataatcttgg  105240

accagataat tttttattgt gggagcactc ctgtgcctta taggatgctt agcaacatcc  105300

ctggcctctg cctactagat gcctgtagca ttcccacctc acccccaagt tgtgataaca  105360

aaaactgtct gcaggtattg acaggtattc ctcgggggca aaattgtgcc caattgaaaa  105420

tcactggcct acggtggttt tgactgattg gcaataatat tccactcact aatattaaaa  105480

agttctaata gtagttcatg tttcctgctg aaagtttgtt tctttggttg tttcacatcc  105540

ataaatacac tttaatggag atctgatttc acagagtcat gtgaataact actgttttta  105600

caaatgggga tggctagcat gattttcagg gctgatgtga gtgaagccac tgggtaacag  105660

aaagaaacac atatgcactg ttataattag tgtgtctgtt ttaggctgca tatcagttta  105720

cagagctttg cccatgtgtg ttgaagacaa aagaaagact ttaggaatga gaatccagca  105780

atgaattgta ggatattttt gtcaaggtaa attaatcttc cttttgcttt catccttttg  105840

tttcaattca ttcttattaa actttcatag aaaatatcct gtgtttttgt attatcatcc  105900

atactacctt cttttattga aaaatccata aagtaaaggg aatcagtttt catgctgtct  105960

ttgaaaacac cgggcactat gcttcagaat tatttttgtt gcttctgctg atgataatgg  106020

ttacactata taacctcatg ccagatataa atagtgaagt gacaattata ctgcatacaa  106080

tggaatgtat caccgttgct tttggcttca cggagtcctc tgtattcaca caaaagagtg  106140

aagctactta caggattttc ggaaaaaaat gatgtacttt tccaaagaat ggtgggagaa  106200

ggatatcctt tctcattagt caccagaaat gtgcttcctc cttccatgtc aaaggagaag  106260

tagaattggg tgttttaatt tagtgattct tttgatgttt tctgggggat agaatttcca  106320

tttctttctg attttgtatc aaccttgaat gtggaattaa aatagcaaat ctctactttg  106380

tattttatat ataaataaaa attctacata ttacatatgt agctgatatt aatatgtatt  106440

atatacacaa tataatttta ttacatatta tattattaat aatatatata tttccttttt  106500

tcctcattag ttgggtatga ctttgatcaa gttatttaat cattttatgt ctcggtttcc  106560

tcatgcgtaa aataggaata agaatagaat ttatctcata aagttgtttt ggacatggca  106620

tgaatataat gcataggtac ttagaatatt atacacagtg tatacactca ataaacctag  106680

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ctaggtgagc attagaaaca tagtggtaga caagtttact ttggtccttc tgtcacagag  106860

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gcaattcata agagccaaga tagaaaccag gtagagaata aagcagccag ggtagagaat  106980

aaggagggta agggtgagag gcctcttagg tgctcaggga atgcctctct gagaaagtgg  107040

tgtcagagct gagactggag ggcttgtgtt atgtggcctc atggctgtgg atgaatgagt  107100

acagttatca tggatttgcc tgaccaaatg caggtgacat atcttccata gctcttgtta  107160

ttctccatat cccttttgcc atcacaatgg gaaatggggc ttagaaatat atacagacac  107220

tttctcacca attgacttaa ctgggggcta accattaagt agtgaatccc ccagaccact  107280

cacttttggt tagggtttga gttattttga gttagggttc atggaagtca tttgggatgt  107340

gaaaatgcaa tcaggttttt tttttttttt ttttttgaga cggagtctcg ctctgtcacc  107400

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ctaatttaat ttttttgtat ttttagtaga gacggggttt caccgtgtta gccaggatgg  107580

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cagaaatatg ttaagcctga caaaagtctt ttcttgctgg cagctgcagc tgtctgggtc  107760

cctagaggtt catcttactt actgaaatgt ggtttttaat tttaaaccaa gaaaaacaaa  107820

actccaatgt atttgatttt tcaaaagaaa aagttattta acaagtcaaa atgaaagtaa  107880

tatatgcata aagagtacag aaagtttaat atgagaacta aaactcacct ttttcttcag  107940

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tttatagaaa atttagcatg gatatcatac atctgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt  108060

gtgtgtgtgt gtgcattcca agtcttcaca aatggggttg tattataaat actgatatat  108120

acctggctct ttcacttaat cagaaggcta agtgaccatc tgtttgagtc cctagaaata  108180

tactgttttt ttatgattgt acaatgtctt tttttatgac agtatcacaa aatattgtat  108240

tttagtctta tcaataagtc tttggattat tttcctgatt atttttatta taaataattc  108300

tgtaaagaac attctagtca gtgggaatat tatctgttca gtaggctcaa tttctaacaa  108360

tggaatcgct gagtcaaaga atgtttattc attgttgatt ttgatcatta ctaaatttta  108420

ccaatctgta aggtgaaaac ttatatgtga tttgaatttt ttttactttt gattcagatt  108480

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ttgtataaat tagaaaatta gctctcaact gtcaaaatat gatgccaacc ttttcttttt  108660

tgttattgat cttttaactt tctatttttt ggcatttttc ttaatagttc cttggttttg  108720

tgtcatgttt aggaaggcct ttcatattac aaaattaaag aaatatttcc ccatgttttc  108780

ttttgataca tttatggttt cattttgtaa ttcaaaattt cagatccatc tggaatttat  108840

tttggcataa ggagtcattt ccttttcaaa atgatgaagc agttgtcacc atattattta  108900

ttgaataata tgttaatgac tcattattac tctaataaag tgtatggctt agatttcgga  108960

atcagaaata actaaattca aatgttggtg tgaatgttct tttgttagat ttaatatagg  109020

cttaatagtg tagagtcaca atatcttaac tgaagctctt ggcaccacat gcattatact  109080

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gggtgtcagg tcatggtggc tgtcatctct tcctattggt atccactgaa atccccatat  109200

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attctctcag atactctcag ctctcattct ctcagctact tctgaacccc ttcccttgcg  109320

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ctaaagcaag agacatctca aagtctttga tagggaagag acacaggtta agaaggaatc  109860

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attcaatact atagaaaaac caactttcag agttaaaaaa aaagattaaa caaagccaaa  109980

tttattactt ttccaggttt aataaaacaa ttttaagggg tttcatagtc atcattataa  110040

aaaatgtcaa catagccatt caatgaactt agttggactt tagccaattg gtgaatatta  110100

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atatcctggt ctctcatagt caaaattttc tattgggaga aagcaattga agggctgcct  110340

taattattca gatttatttt tccttgaaat gtattttgaa gattttgatt ttggcagtaa  110400

tgaatttcat acgaacattt tactggttat caaaataatt tgcaagaacc aactagggcc  110460

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ctaagtttag atttagattt cccaaagcca agaaaatgtt aacatgatgt tccacctaca  110640

attttaggag gaagtctata taattcttga atttaaatgt ggatcactaa ttatagttat  110700

aacactaaat tattcctgag tgggtttgtt tagtattcaa atgtcatccc agaggaggaa  110760

tcttttatct atagagctgt catagataag caatataatt cgaaccctct ttctaactaa  110820

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tgaggacagt ggcatagcaa ctttccagtg aggtaattta atttgttaaa ttaaataatt  111120

agatttattc ctcatgttgc cttggggtga tgaggaggag ttaaggacat ggagaaaaaa  111180

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catagattta gccgatggac tttcgcaatt caggaaaact gtcagagaag actcattctc  111300

actgaaggtt catttaggtt gtcagtagca aagaaaaaga tattgtacga agctgccttg  111360

gaggcactcg cataaaaatt atgttaccat ttatctatag ttgcattgag ttattcttat  111420

aaactgatga tactaccaac ccaaattgac aattcttgag aatacacaca cacacacgca  111480

catgaaaagt tttcataaaa atgctgtttg ataatttgtg tcctgttatc tctaacaagt  111540

aaacaggtaa aaataaaata ccttcatgcg gtgaagaagt ataaactgaa aaatagactc  111600

ctattttgaa acctagaaaa aagttgtgct ttaaactttt ctctgtcaaa tgagaattgc  111660

ttaattctta tacttaagga acgtgggaaa tgaaaaggca gaatgtatag tgttggtcct  111720

ttgatggaat ttctgagaaa aaacaaacta ttccagatga tgactaaatc acatagtttt  111780

aaatcttctg tagattttta atggtttttt ttcaaaaacg catattgttc aatataataa  111840

atatttgtag agtcaggaaa atgacaaatt ctttcttcct aacaatttta caatgaaaag  111900

taatggtagt ccaactaccg aaaattctaa gaaatttgtg gctttcagtt gtgactatga  111960

caaagaaagt gactacagaa tgtgtcacat tccatcaaag tcactcaggg ctttgttact  112020

ctttaaaaat gcttcttggt ggattcacaa atgtgcagta tgatacaaaa aagaaaaaaa  112080

tcacaccagt tagtatcttt gctagagttt tgtagaaatt taagattatg ataatcccca  112140

ccattcatcc ttttgaacca caaaattata gaaacttgat ttatactcta cagtatattt  112200

tttgatggct taaagtatag aatgcaactt atttatctgt gattcttcta gaagggtagg  112260

gaagagaaat cattttaaaa agtgtatcag aaaccaagct gagaagagtt gaggagcaca  112320

tctgggctgg attcacgtct atgtaattca ctgtgagaat tcccattgaa ttacacagga  112380

caataattag acccagagaa acagatcagt acttttctaa cttaacattt ttatcgtcat  112440

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gctcattcag agaattttca ctaagaattt atttgctttt taaaatacag aaaagtcata  112680

aaatagaaaa agtttaggca aagacttccc tttgcctgct tgggtggatg aatgaatgaa  112740

ctagtgcatc acactgactg cctgctctgt gtcaggttct acttgaggcc ccagatacta  112800

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tatgatgtga aaaaacagaa gtattaatga aatgctgtgg gaacataaac taactaggga  112920

gtagtaattc tgccttggtg gtacttgggt tttgattttg atcagagaaa attagaacag  112980

gtaatattta aggtagtttt gaagaatgag taaaattttc cagaaagttt ggggaatgta  113040

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agtaggtagc atggggacct ggaaggtagg tggaggccag atgaggaggt tctatcctca  113220

gcattttttt cctctgtcct ctaggctcct tacctatttt gggtcatgga cctcttaggg  113280

cagtggtttg caaaattcat tgcgtattag aatcacctac ggagatttaa aaaatcgttc  113340

agaaacctag gccacatccc atagagcctc tgggaatgag atccaggact caataattta  113400

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cagcattagt atcagccaag aacttggtaa aaatgccaat tcccagacca aaattcagac  113520

ctagtgaatt tgaaactatg atggggtcca gcaatctgtg ttttaaaaag ctctccagga  113580

ggttttcatg tatgctaaag tttgagagtc actgtcatag agaatctaat gaagctgata  113640

gtttttccag aacatgtacc gcatgttgaa ttttaaacat aattctaggt ggtagatgga  113700

aattccctct gatccctttc cattttctcc cccaaatcct ggaatccagg ttaagaattc  113760

tttctctggg cagtgagtgc cactgacaat atttcagtaa aagagggaca ggagaaactt  113820

tggttataga atgatgactg ctgtaattta aacaatgaaa tggaatgggg agaggctgaa  113880

gttaaccaca tcatgcagga ggttttggga ttataaaata aaatagaaca tggtgacaca  113940

gaggttgtgt gtggtgatcg aaagggaaca gaaaatgatt ccaaggtttc taacttgagc  114000

tcagagtgaa tgaaaactac ttgggagagg gactataaaa agagaaggct tggaggcaaa  114060

taatggtaat tactggacat gtatggggag tgcattaaaa acaggtctag agcttagttg  114120

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ttctcatcct ctgttgacat tttgggtctg ctaattcttc attttagagg gatattttgt  114240

gcattttaag ctatttattg gcattccagc tctctatcca ctagatgcca gcagccaata  114300

ccctctgcag tgatgacaac caaaaatgtc ttcagacatt gcctaatgtc ttttggtggc  114360

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ttattgacta agtggagggc aagtggtgaa ggaggatcca ttaagtgttc ataaagattg  114480

ggagaaagtg gcatcaagac agcacaaaaa ggctgagttc cccaaagaag gtggttgggt  114540

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gattattgtg aaacagattc aatagacagc tattgaagag tgacgtgaaa gtgacactgc  114660

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gataatatta attatgaagg agagtatgga aatataaatt atagcagcaa catattgaat  114960

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cagataaaac tagtacatta gggaatacat ttaatctaca atacaggaaa gtcctgttga  115080

tatgattttg cctgtgggct gggtgactgt attagtagtg atgattttct tttttctttt  115140

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acacatacca tttggtacaa gccttatttg tcttgccttg ggtctggaac cacttttgca  115260

gtaacacatt tagaaaagag aaatcaagag caaaaaaggc ttcaatatag tttatttttt  115320

tttgccagta actttcttgt tgcacaacta ttatatatga aattattctt tctaaacatg  115380

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcacgta ctcatgtgtt tcagttccca ggttcttttc  115440

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ttaatctgat ctattccaga gcaaaatctc tcaggttgac ttgaagcttt aatttttact  115680

ctggttttca cacctttttg tttattaggt cataagtaat gagctctgaa tgcttaagaa  115740

cctgttcaag ttcacattag tagcttatca gggttgtaga tagagtgaaa acaaattcgg  115800

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ttcttaaatg ataaccatgt tttattctga cttgggcccg ctttgaggaa gaacttgagc  119040

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aaatgtcagg aagacagaag ctacctgtct gtgtcatatt agtgcccttc ctacaatctg  119220

taaattctaa taaggccctg taggaatagc agaaaatacc atagactctt tctcctgaga  119280

gagacaatgt tgagacgggt ggtaaccggc ccagtaagtc tggcccaaaa atatgactag  119340

atcttctgtc tcctgatgcc ttctttgcat cctgaattct tttcatatgg atgcccttca  119400

aagctggctg gtagccctcc ttctactcgg ggctcctagg cttcagggtt ggagcctgct  119460

gatggtgtta aacacacagt gactttatgg tgctggtcat tgaggctaag gtgaagccag  119520

ttgcacttga tttattcagt acatgattcc atgtctcaag aagtgaaaat ccagtgaact  119580

gagcctgtgc cctagttctc attaacaact taatccaaat ccacttgaaa tgctcactct  119640

tgaagtcgtc agtgatgatg gcatgatttg tttgctgagg tctgttagtt caataggata  119700

attataaata gaatttataa acagttccga ataatactct atttcttgta aatcaatgta  119760

aaatttccca aggagttgaa attaatttta cgtttgtgcg atatacaaat aagtgagagc  119820

ccttcagtgt tcagtgctca gtgtgcaaaa ctacagagtc atctcacatg tttctttgaa  119880

ataaactatg taaaactaag aaagtgggaa agaaaaatta gaacaaaaga tattctaggt  119940

gatttcttat agtcatatca tgatcaggtt aatttatata agacacttga tacatttcat  120000

ctacatcagc ttgtttagaa gtctagagtc aaagccttct ctgatccaga cttggtggac  120060

tatctgagca gaagaatgtg ctggcaggct gattgagcta tgtcatttta ttgagggttt  120120

gatccaggaa agaattaaaa ccatactttg ctctaccccc tatacagtca tttagtacta  120180

gaagtttgct tctataaaca aaaggccgtc atcacttctt cctctgttct ttagatcttt  120240

gaaaatcaag ccaattcaca gtggccctat atgtaatttt tatagcctaa agaacatatc  120300

agaagtatct gtctaatctc cctatccacc ctccactatt agatctagaa aaggcacgag  120360

catcatataa aattcatgcc agaaaactat ctttatatta actataatta ttctaactat  120420

aattattctg tgttggcatt tttcttctgc tgccctttat tacataagtg ggaaaactat  120480

gattttaagt aaatgaaata gccactgaac taaaataaat gtgacttgat acatattctc  120540

ttaatgaaat gtctgttgga gactagaata acgttttggg atactagcca agtcaaacct  120600

taagactttt taggtttgac tgatgctagg gagctgctgg attctggaaa taaaacaaag  120660

gtgttttaca cctgatagaa attattgaac atgtcgaaga caggttcaaa ggtattttca  120720

tttcaactta aaaaaagtag tgcagggaac ataggtaagc ttagaatatg gctattttta  120780

actgaaactg tactgacttt ctttttgaag atgctgatac aacttctgac actgttggtg  120840

atgagtggtg cataacagcc gtttcagctc tgaggctatc aaatagtgaa agagaatctt  120900

ctacatacaa atcccaggac accagaacag ctcttaacag ccctcacttt cctgagtaag  120960

ctgaaggtgg ctaactaaaa ggcctgagag aaattactgc ctaaacaatg aaggaaggag  121020

aaaaccccca aggaagacaa tgtaaagatt aagtaacaag gtttcaattt gatacaatgt  121080

ggggaatttc agtttaattc taatttatac taatttctca taattgtctt gatcctttac  121140

gtagagatcg gtttggataa aggaatcata gctatgagaa ggcagttagt tactcagtga  121200

atccaaatgg caaattctct gatgagaaag gggatgtcct cagggaggtc taatcatatg  121260

ttttcttaaa ccaaactctt ttccttttca ttaggctttc ttgaggcaat tggctaatta  121320

atgataataa atagttattg agcatcacag atattctaaa tcctccagtg tcatacattt  121380

ggaaggaaaa aagaccagta gataaactta ggaagagtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt  121440

gtgtgtgtgt gtgtatgtgt aacaaacatg ccttaaaacc aggaattgtg gttgtaaact  121500

gggaagacat acataaaaga tgggatggct taagtcacag agacagacag aaacttcact  121560

ttgtgtgatc atgcagagct ctccttatat ataataggtg taagaataat catttccaca  121620

tctgtatttg gactttggcc ccatctctta aatcagagtt ataaattctg tgaagctgat  121680

taatcttatt ttatgggtag ctgtaaataa agagaaaggc tgtctttcag ccttacttaa  121740

ggaaaaacaa gaaatctttg caaaatagaa atttgggaaa ggatgttgag agggtatgat  121800

ggtaggtaca cgggagacat actgggtttg ctcttgttat ctagggaatg gaatgagggt  121860

gtcttttcaa agcagggggt aataaaaaga gcttaggctt tggggtgcag cagctctgac  121920

tttggatcct ggctctccac tgaccagctt tgtgactttg gacatgttac ttaacctctc  121980

tgacgccaag ttttatttgt aaaaatggag ataataccca gattacagaa ttattttggg  122040

aattagggat gattataaaa gtacacaggg atgattagta aagtacacag tgtttggcac  122100

ttaataatcg gtagctgtta ttattgatat tactgtttga ttgcaaagct gaaaaggcct  122160

cagaaatcac aatcagatgg ctcatgtgag atcatgatgg ggtcctctct tctgaaaaca  122220

catgctactt aagtctgtga gaggaattat ggatgaattg tcacagatta aactttatga  122280

ggtagctctc gttggtgcgt gatggtttgc actttgctat tcttcctttt cgcatgagag  122340

aatctcatct ctggaatgaa atttacctgg atttatcaca agagcacatg cttcgagttt  122400

gatttggatg cgatcacctg ttaccctgaa atgaaaactt ctttttcttg ttttgggaga  122460

atctccctgg cttaattgaa gaagtttccc ctcaaagatt cattcagatt cactcagatc   122520

agagggtaat cttctaattt aaaagccaat ttatgacgaa aatcctaatg caaagaggca   122580

aacgtgtcta ctagagttgg gcacaataga tttgtgtagt tgtaacattt tttgctactt   122640

tttttcccca agcaatctca aaaacaacaa caaaaaagta tgttaacaag actagttgaa   122700

attaatactc tgctattaga gtgtacgcgg accggctcac tcccttcttt tccaccgtgc   122760

tgcacgctgc agttcctaga agacacgaca cgctccttcc ttaacgaatt ccatccctga   122820

aatcagtgac gattggcatc aggccaggtc gacttctttt ggactcctta caagaccttg   122880

ttcgtatttt gtttttatta gttcttacta ttctaatttc tctcactgtc gcatttttca   122940

ttggtttaag ctctcagcag tcttgctttc ttgccaactt aaaaacaaac aaataaaacc   123000

aagttagcac tggggcgggt ttcccccaac tcacagcact aattgtataa tcaccactca   123060

aaagtcaaca gactaagtcc aatttgtttt taaacacggg caactcttga gcctttgcat   123120

ttggaaatgt ctttctgccc atttgttgga tttagaataa taaactgcct atgtaaatga   123180

gagggtgcca gccttcagca gcccacaccc tcaaactgcc actcgacgat tcaaacatac   123240

agttcttgag gaaaagcctg ttgtgaaagt taatggttat aaaaagcact tatttacatc   123300

tgttttagtg tagccttgaa gagtgcaatt aattaagaag tttctggtgt ggtaagaata   123360

atcatacagc aggaatgcaa acacgtgatt tccaaagaga attttattcc atatggtatt   123420

tttcccctaa ctaagaatta attgcaactt taaagaaggt ttgattgtgt ctatgaaaaa   123480

cattttaact actgaggaat tctaaatgac ttcaatttaa aattttcttt ttttacattg   123540

ttagagtcaa gaaataagtg ctttcatcaa gctctgagtt acagaattta ttagagtaaa   123600

gggaagagga taaccttcag atgtcttctg tggtgaaatg ttgaagttaa aaattttaaa   123660

tgtttgcaga ctaaagacat cctcggctgt gaggcctaaa agaataaaca aaatgtgaca   123720

tgttttattt tgttacttaa cccttgtata aaaaagcaca acaaaaaatg tatataaatc   123780

atatttttat ttctttctga aaacacggac atggattttt ggtgatgatc ttctatgtag  123840

tggcatcatg ccataggtta aagagtggtt agtgtgtatg caaatagctt tattttggta  123900

tggcagtttc ttaaagcaga aagttttaaa ggtatacaac ataaattctg tgaagatatg  123960

ttcttctcct tctgttgcaa tatgctacgc attccagtat tttgctgtag cccagcaatg  124020

aacaatgcaa agagatgaag aggggaaaaa caaaaacatg gcagctgaaa gcaagactgg  124080

tggagaaagg atgctcgttg ctgcctaggc acagaaagag aatgtgacat cctagaggag  124140

ggaaaaagaa taaaaacaac ttggatacag gcagagaacc tatttctatc aaatgcagtt  124200

acaacagttg ctgagaagaa aatttcaatc aataacaaag agctcttatc acatgcaact  124260

ttaatttgat tggcatgaca tttccattat atgctaatga attacagatg atgagaacgg  124320

ctgttgcctt ctgagtgcaa ttgaacattc atcaatcagt tacttaaatg ccagactgtc  124380

tgaaatatta aaggaagttg ttgctatttt ggagatgaaa gtaaacaaac tggaaatctt  124440

gaattaattg agaaaaggat acacgttgat aagtaggatt tggcaagtta ttacttctct  124500

gagtggatgt cagtgcaggt atcttattct cagtggaata agtgtgtccc tgcaaagcta  124560

actgaaaaac aaattctctt aagtgaatcc tgtttttctg ttgactagca ttatacaatt  124620

attgactatt actctgggga aaaaaaggct gatcctagaa tgtaataaga tcactctcaa  124680

gtatgcaaca tttttgacaa ttcaagttta aaggaaaata actatccact aaaatattaa  124740

caataatcct caaaatagca ggaacattga aattatcaca attgagtaac agtactaaat  124800

aaagttgttg caaaagaaaa atgcaaaaga aaaaacacat gatataaaat tactaaattt  124860

tcatcctttc cccatcaaaa aaatccaaaa tgtttggagc tttagaattt taattaaggt  124920

tttcatcagt ctcaagccac ctaaagatgt ctaagtttat tttttcatca tcctttccac  124980

ttccctttta cttgtcctta gcattttact ctagatggtt ttcctattaa tttaaaaaat  125040

agttatgctg ctttacatgt gaggaaatgg aacattcagc taagtgctaa aatatctaat  125100

ctttgcaaaa cacgaatttt gttctgcttt ctgcagagac atggtcagct ggggtattta  125160

ggtaatggca aagatgatca atttgcaaac tttttgtgct ataaaaattg atttgttacc  125220

actacctcac accaattagg atggctgcta ttaaaaaagc cagaatgtaa caagtgttgg  125280

caaagatgta gagaaattgg aacccttgtg cactgttggt aagaaagtaa catgccagct  125340

tctgtggaaa acagcacgat agtttctcaa aaattaaaaa taggattacc ataatcataa  125400

ttatctagca attctacctc tgcatatgta tcccacataa ttgaagagat atttatatac  125460

ccatgctcat agtcttaaaa tatgctagtt ttggtggaaa acttgagtta aaatttctta  125520

aatattgaaa cgtcttgtca aaactttcca agctattaac ttttcccttc ctgaagtctt  125580

attcatatcc agccaaaatg tggaggcaac ccaagtgtcc actgactggt gagtggataa  125640

acaaaatgtg gtctatacat acaacaaact attatccagt ctttcaaagg agggaattct  125700

gacacatcat cagcatggat aatccttgag gacattatgc taagtgaaat aagccagtca  125760

caaaggacaa atactgtagg attccattta tatgaggaac tagaatagac aaatttacaa  125820

agacagaaag taaaatgatg gttgccaggg gctagagtga ggagggaatg ggaattactg  125880

ttttatgggt ctgaagtttc tatctggaaa gatgaaagat gttctggaga tggatggtgg  125940

tggtagttac acagcaatgt gaatgtactt agtgctcctg aactgtatat ttaaaataat  126000

caagatggta aatgttatgt gatatgtaat taattaattc acaattaata atgaaatttt  126060

aaaagttgta aaaaatggat ttgttgccaa atgactagat ttacgaatta aagcaatgtc  126120

tgctatacta attaggatgt attactgaat caacacagtt ttttgagaat tattagactt  126180

ttctgcaacg tacatagaga gaaaatgtca aatagatttg gctgcctctg ttcgaacaag  126240

cagaggtggc actaaatgtt ccaaattcta ttcatatgag ggcacttctt cttaaaacac  126300

ataactttat ttctttgtag ctctcttagt aaattctcca gagagtaaga gcaaaagctg  126360

ggggtgtttg aggaatagcc aggggtctga gtgactggag aaacatgaag aaggtggggc  126420

agagggagga ggttagttca gatgaagtca gagagccaac tagggaccat ggctttttcc  126480

ttgcacagga tggggaaacc atggcagggt tttgaataga agagtattgt ggggtttttt  126540

ttgtttgttt tttttgagac agagtctcac ttactctgtt gccctgtgca gtggtgcaat  126600

ctcagctcac tgcaacgttg gcctcccagg ttcaagagat tctcctgcct cagcctcccg  126660

agtagctggg attacaggca tgcaacacca caccctggat aatttttgaa tttttagtag  126720

aggcgggggt ttcactgtgt tggccaggct ggtctcaaac tcctgacctc aagtgatctg  126780

cccgcctctg cctcccaaag tcctgggatt acaggtgtga gccactgcac ccggccatgt  126840

gatttgatat atgtttaaaa agtacacaaa ctgtgtacta caagggagat gaaatggaag  126900

tgcagaaatg gaattctaga ggtgagagat tactttcacc tgggggaatc ctggaaacaa  126960

aaatctgagg ctgagctaca gaggagaaag aaatgtattc cttttcacat ttgagtatgc  127020

ttgagaatct ctaaacagca caactgcacc aagaattctc ttgcattatt actctgtact  127080

attaatttgt ttgttgatag cagcaaatga gctttcactt actgagtcct gtgtgagccc  127140

agactatttc agcacttaag agtccttcaa tgactacctc agaggtggat ctcagggtgt  127200

ctggggctcc tatgcacata tgtttcttgt tgtttacaaa gctctttgga cttaatctga  127260

atgagagttg ccctaaaaag ctggagacaa atgattagcc ataaagtttt atttttcaac  127320

atttaatttt tagaataatt aatttaataa cagattttag ggcatgtatt ccttgctact  127380

tagtggttta tgtctctttt aggagaatac ctcattatgt tctctatatt gtcacataag  127440

agatgctggt tctgcttttg attctaggag tcagtttaag tgaccataga tgatatacgt  127500

agtgtatatc atctagggct ggaaggtaat caattaacaa acggtttaaa ttgcttgggc  127560

ctgaagattc tagagtttct gcaagaacaa aatcaagcct gtcttctata tccttgagaa  127620

aaccttctat atttatagta gtgctttcct caaattcaac ctgactgtaa aaatgcatga  127680

tgatgtgcca aataaaggaa gtgtgcgtgc acacacacac acacacaaaa ttagtaagaa  127740

ttagtaacaa caaattctaa acacaagcct tgatatgcta aaaactataa tatggtaaaa  127800

aaataaaaat aaaaaaatca aatgctttca gcttaaaatg ccctgccaag gtttttttct  127860

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acagaaatag aactcaactg tgcccttcct tggtatattc aaataacttt cttcaacact  127980

tatgcaattc tgtgaattgg taacgtcatt gaaaatatgc tagttttggt ataagttgag  128040

ttaaaatgtc tcaaatattg aaaagtcttg tcaaaagttt ccaaactatt ttttctctcc  128100

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ttacattttt tctttggaaa aaaaatttgg ttgaatgatt gactaattat aaaagatatg  128220

gcccaaatta aaaataactg aagtttatga cattgaagga agatatgctt tatctctgta  128280

ctctaaatac aattctattc tttttcctga aattatatct gtgaatttct gtattctttc  128340

tattttgtta aaaaatttat ttgaaaaatg ctgaaaaacc caaaatgcaa aaactactta  128400

gaattaaaca atttaggaaa caacacagat gtacaagtga gagccatccc taggcactgc  128460

ccctgcttca ctaattctac aacagagtgg taacccagtt aacctatgtt tttcaatttt  128520

catgtgttta taggcagtcc tatgtataca tatctaccaa acaactgact ctgctattca  128580

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attctatctt tctatctaat tctacctcag atgtcacagt ctggaggtct gctggggaaa  128700

gggactacac ataaattttg cttggtttga gccatttaat gtgtttgaaa aaatggaatt  128760

tgcatccctt ttgatgacag gccttctgat tcctattaat ttcactcaac tctttattat  128820

catatctgct tagtgatctg aagcatttat atttgcggct tccaaataat attccattat  128880

attgttatag tctcatttat ttagcccctc ctcatattgg aacttgaagt ggctcttcct  128940

ccccaccttt ttttttatta ttaaaaacaa tgctgtcctg atcattctta agtacctact  129000

ctatgttatt tctttggtat aaatttttga aagtggggtt gctcagttgt agaatattac  129060

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ttccaggaat agtatatagg agttaaattt tcttataccc tttaccaata ggttgtatcg  129180

acttgttaaa tttttttcat tctgaatagc gataaaatta ttatggcttt aaaaagtatt  129240

ttttaaacta ttgatgaaat tgaccttttc atatgtttat tgctatatgt atatatatat  129300

gtatatatat agtctgtgaa tttcacaatc ctatgctatg actgtttttc atatggataa  129360

tctgtctgaa atgtaaaata ttaatctttg ctttaaatgt tgaagataac tttttttagt  129420

ttttggatgt cttttaactt tgttctttta ccttttgaca tataggaatt taagatttgt  129480

atttaattaa atttcttatg tgtcgcttta aaaacttctt tgtcttagta agtttgaggg  129540

gcaatttatc aatttgtact cttatacagt gttggtggga atgtaaggaa tagtacacat  129600

aagcaatggt aaaatttggc aaaaaaatcc catatataca cacacacaca cacacacaca  129660

cacacacaca cacacacaca tgcatatatg gcatagcaca agaatgtgca attcacagaa  129720

tatatattat atagcaacaa aatatggaaa gaggtcaatt attatatatg tgtagaaata  129780

cacacagcac tgtttaacac agctttaagt gtaagaacaa agcccataag atgttcattt  129840

cttcaatatt tagtaaatat atcaaacatt ttctgtacac aaagcacatt tgaaagcttg  129900

aaacttaaaa tctaactagt ttctaaaata ccttaaaaaa tactgtggca tggaagctag  129960

tgttcttttg gaattttcat tttcgattta tatgtgtttt ctgaaaacaa cagaacacat  130020

acaacacctc tccctgccgt attgttgtat taagcaatgt tgggattgat gtgaagatta  130080

aatcttcatg tctgccttta tctgtctcct acttttacat gtttgacctg tgaattgaac  130140

tgattttgtt tacttctatt cttttatctc ttttatttgt gataaatttt caatattaat  130200

ttacctaaag gaggtatctt atttgtaatt gaaatctcaa ccatagcagt aaggtgtgga  130260

tttattctga ggatgataca atggcctaaa ttaatgtggc aatggattcc agcagttttt  130320

ctgttttaag tttgaaaaac tttgtaagtc ttacttcttg atgatcagag aggttgttgt  130380

gggttttgtg tggcacttct ctcccttaag ggatctgact gatagaatcg acgtttaaag  130440

aaaagtacat gtgtgtgtat atacatatta tatataatat aatatatatt atatgttata  130500

tagtatgtat tatatataat ataatatata tgttatatcg tatgtattat atataatata  130560

tattatatgt tatatatatt atgtattata tatattatat acatgataat aatttgcaag  130620

gagtgtcaac ataataaagc tttagtgcag catcctagag atatttgcag attaacacct  130680

tgtttgctaa ttgtgtcagt gctcaactta agttgcaaaa tatgaatgta aagagtatga  130740

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ccctctcttg ctggcccact tttcactcct atctactcct ataaccagaa aaattatgta  130920

tattatatat attatatatt atatgagata tataatatgt atatataata tgttacatat  130980

tataacatat aatatgtata tataatatgt tatatattat aatatataat atgtattata  131040

tattatataa tatgtattgt atattatatg tatatatata catatatatg tattatatat  131100

tatatataat atgtattata tataatatat aatatgtatt atatatacta tatgcatatg  131160

tattatatgt attatatatt atatataata tgtatataca cacacatata tataaagcag  131220

ctcttttgag tatatgttca agtgtgctat acctctccat ccagtgctct cttacaaatg  131280

ctggatttgg gacttcctgt cttaacctgg gatcccacat tagggacttc ctctcttgac  131340

ctgggatccg cacatttcag attgcctgta gagcttttcc agcctttaag acaaactctg  131400

aatccataaa ttgagccagt tgctggaaag ctaaaatcct atctctgtca aagtggagca  131460

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taactttata ctcaattaat atacttacat atacacatat tcataaatat attttgaata  135300

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catggctcaa acacagctca aactttaccc agcaatgagc tttctattgg cttgacttgg  137340

aaaatacaat ttatatgtgt catgtaaaag gggaaatgat acatcagaac tttattataa  137400

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tctacaggcc ttctctgcta aaatcccagt tttgtttagt tccaagtaat gtgatagaag  137760

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ctcaagggga aaacatgtgt actgaaatat tccttataca tagagggaat ttttatcaaa  139560

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acacagtttt caaaagcaga tcaaaatatt tttgaggcat agcaatcatc taatctgcct  139860

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tctctgtata tcttgttaaa atttgaaacc agaggcttta agttgtatgt taggatttca  141840

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cttagaaaaa acagtgatta ggtattacaa tgttaaagat cttacagtcc agtctcttta  141960

ctatatggat aaagaaatgg aggtgtgagg taaggaagta ctgtgatgaa ggtaacataa  142020

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tatatgagag actcagggtt ttacggactg tcaaagtaag acttagtaag aaatgcatcg  143640

tgattaaatg agtatacgat gtgtgaagaa tgtttacacc agtacaagga aacctagttg  143700

gtcatctgct agaaagtcaa attggcagtg gttgtttcta atgtatcttt ttcttgtgtg  143760

atgtgtcata tgtataatga ttacatttta gataaagtga atggatctat caaacattta  143820

tcagactcct tcactgtaag gtgctgtgga ggtgcctcat ttaaaccacc atagttaaac  143880

ctcaaagagc agccctatgg atctggcaat tttattctca acttcgtttt agaggtgagg  143940

aaattaaagc aaagacaact taagtaattt ttccaaggtt ctaagactgt gctcaaagac  144000

aggattttaa ttccactgtc ttttttcttt ctatcacatc acacagtggt tgcaacttgc  144060

ttttctgtaa atgtaatgaa ggaaacatcg cagaccttgt ataaaactca tctacagatt  144120

ctttggtagt taggtctttt tagtgctgct ttgataatga attctggtaa aaaaaattct  144180

tttataataa taaaatgttt ttaaaaatcc tccttgaatt ttctgaagtg caatagcaga  144240

taacgcagct gtgaatgata aaaatacctc actgcactgt ttctatttgt cattgctcag  144300

ctgaagagaa acagggccaa ctgcgaccat aactgagaga cttctgaaag ttattttcca  144360

attttaatct accatatatt cagtggttac tttgtgccag ctagtaagcc agttagacac  144420

tgtgtattca ttttttaaaa agtagtgtag ctttattatt ttctggtttt gccatttgaa  144480

aaattattct cccccctccc cgcctacatc aggccatctt cctctcacac cactgaatca  144540

gggaagaatc tgctaccgaa cagtagtatt tactgaccaa gagataactg tacctcattt  144600

tgaaggtgat tcctctttct acctaaactg tattagtatt tttaaatctt caggtagtgt  144660

atatcggaat cactagtgaa cttgtaaaaa ggcatatttt taagcaccac ctaagtattt  144720

taaatcacta cattttaaat agcatcccag tttactgcat gtaaagaagg cttccctctt  144780

gaaggaaagg catcttttcc acaaacagaa tctagagacc agttggggat cctagtggga  144840

ggattgtttg gaacagaagc atcccgagaa tcgtaacttt ataggctttc cacctccaga  144900

attatgcttt tctttttctt ttccttatct attcatttat ttattcatcc attcttcagg  144960

catttatgat ttgctggcaa caatggataa gaagcagtct tggcaaataa ggagctcaca  145020

gtctagcagg gagacataca catcattcct aaaaacagca tcacccttag gcccaggcaa  145080

gaagaggccc tgccttggcc tgtgtgcttt agaaagctta ccttctggtc tgccatttgg  145140

ctgtgcccct tgctatggga gtgggaattt ggagagacaa aataatgtaa tcaactgcag  145200

ttcacgtctc ctagatgaca ggattatctg ctggtctagt ccccggcctg tgcctctttc  145260

ctgagtccat tccttggact ctgccactgg tttgcacaca ccaaagccca agggatcgtc  145320

caaataccta gctgtttgca gggacaatgg atggaacgtg gacagggctg agatatctat  145380

gtgtacacat gtgaagctat tgtagtgtgg aatgaagata gaggtggcag gactggttca  145440

gaagagaagc ttatgttctg ggattgaagg gtagatctcc cagtgtggca agttctggct  145500

cagagaagta caaggagttt gagaattcta actttgaacc taaccgtcta gaagaaatat  145560

ttcgcagggc aggaggagat aatatatttt atttaacagc ttgtcagctt gatttataac  145620

ctttaaatat atgagtatat aacaagtgag cttccatttg tactgttgcc ccagaccctg  145680

aaaatgttaa gggagggctg cacttggaat taagagagtc ctgaggagtg gagtcaccca  145740

gcttgtctga atcaggcaac acttgagcta gatattaagc aatggtcaat tgggaattat  145800

ttaggcaaga taaatggatc aaagatgaga gaaaatggca gggcaacgca gggcaggaca  145860

tggaattgac aactgcattt aatgcacgag ccaaggcaaa aaggcagcaa atcgcatgaa  145920

gtgtgtttgg gccttaaaat gcaagtagag cagagtttac taaaagctag ggagcttcca  145980

cctttaggtt ttctcacttg aacagtccct gatgagttct gaggatttct aggggttgta  146040

agggttttag gtagaaagag gatgccagat tgcaatctgg aatcatttct gtgtaaacat  146100

ttctatttaa tcgcctaagg agatttcaaa gaaagagacc catattttta agtcccagta  146160

tatgttgtga tttctttttt tgtcctagat aaatatttac ttttgtatct aattttgtat  146220

cctttttctt caatagaatt ctctcctaaa ttataggtgc ctcagatctc acccaaagtg  146280

gattcacctc tgagttcaat atatcttgga aagatgaggc tagagaaatt gcagagaacc  146340

aggcttgatt ctttgcaggc cacagagcca tgagatttag tcagggaagt gacctgggta  146400

tttatacatt gggtattttc cacatgatgg gccatttgga gacaatagac atattggaga  146460

ttcttctaac aatcccacag agtaaaaatg tagttttgaa ccagggcagt ggagaaaaaa  146520

tatttattga gtaaaattgg caagactgag tgtttgatta gaaatgcata gtggaagagt  146580

tcaaagaaga gtttgcaatt tctaattttg aggtcttata aattacatcc agttttaatt  146640

gtgttgagtt tatatctgca taggatatgc aagtagagac atccagcagt cagttaagag  146700

tgtgattctg aagcttgggg gagacagctg ggctggctgg gaatatctat gaatgtgtgt  146760

gtgtctgtgt gtgtagtgac ataccttcac acacacaaat acctatgtac atttgcatct  146820

gcatttatat atacatgcat atctttttga gcccaaatat gtatttggga gttatcagta  146880

tacagttgaa accaccagaa tgaatgaagt caatcaggaa aagcatttaa aatgggtaca  146940

ccagagagct gatgacagaa acctgagaaa cacaaatgtt tcagtaacga acagaggaag  147000

aggacaatag aaaggacaca gcaaagtgag aattttctca aaatcttaaa aatcatagga  147060

gggcagtttt ttaaatgagg gaataattga cagtgtcaat aaagcaatga taattaaaaa  147120

gtgcaatttg gtaactagga agtcattgga gattttctgg agtttaagag ggaatggaaa  147180

gcagctttca gtgggatgag aagtgacttg gaaatgagga atggagacgg tatctttctt  147240

gaagaataca gttactctta aaagttaaat tgtaaacata tgaaaaattg tttgtattct  147300

gaagggaact ggaaatcaag tgaggtatct ctttttgtct ctctccattc tctatcttcg  147360

ggctgagaga ggcttgggca tgctcacgat gactcatgaa gtcaggtccc agggggcagg  147420

tatgattcaa gagccttatt gggactcact atctgctgtg catgaaggaa ataagatgat  147480

catgatgctt acagtgaagt aaaagtgttg gtaggtggtg tttcaggctt tgctagagca  147540

agatatgaaa acagtgagtg agtggcaaca aattactctg gtatgatttc ttcaggtgca  147600

ctcattcctt tacacagcta atagatttga gtttggtatt cagctgggag gcataataga  147660

ggttaatggg taatatggtt tggctgtgtc cccacctaaa tctcatcttg aattgtagtt  147720

cccataattc ccataattgt gggtgggacg cagtgggaga taattgaatc atcggagtgg  147780

tttcccccat actgttctcg tggtagggaa taagtctcat gagatctgat ggtttataag  147840

gggaaactcc ttttgcttgg tttttttttt tttatatata tatatataaa gaggagttct  147900

cctgcatatg ctctcttctt gcctgctgcc aggtaagaca tgactttgct tctccttgcc  147960

ttctgccatg attgtgaggc ctccctagcc atgtgaactg tgagtcaatt aagccttttt  148020

cctttataaa tacccagtct cgggtaagtc tttattagca gcatgagaac agactaatac  148080

aatgggtaca ataaatggaa tgttctagag caaaaaggtc cccaaccttt ttggcaccag  148140

ggtctggttt cgtggaagac agtttttcca ccaatggggg ttatagtttt gggatgattc  148200

aagtgcatta tatttattgt gcactatatt tctattatta ttacactgta atatataagg  148260

agataattat acaactcacc ataatgtaga atcagtggga gccttgagct tgtttcctgc  148320

aattagatgg tcccatctga gggtgatagg agacagtgac agatcatcag gcattagatt  148380

ctcataaaga gcatgcagca gagacccctc acatgtgcgg ttcacaagag ggtgtatgct  148440

cctatgaaaa tctaatgccg cggctgatct gacaggaggt ggaactcggg tggtaatgca  148500

aacgatgggg agcagctgta aatacagatg aagcttcact cacttaatgg ctgcccacct  148560

cctgctgtgt ggccccctaa caggccacag actggtactg gtctgtggtc tgggggttgg  148620

ggacccctgt tctagaggtt aaagaatact tagcaaatca acaatgagga ttgagagaga  148680

aaccaagaga tagtcgacaa tctcagaaga acttgaaaag ctcaggactt tgataagtta  148740

atggagaggg gtgaataaag aaaggatctg agggagctgg ggtggtagaa catggggtta  148800

gttttgagag tttatgattg cagagatgta atgatgtgtg atgataacag aattgagaat  148860

ctagctgaag tgttttgaag tctatggttg aaattggttg aaagtgaaaa ttattcaatt  148920

taacaaggtt tagaaacctc agacagagaa taaaaaattc tagacttccc aagatacatt  148980

taaaaaagat aatttcaact tctctttaga tttagggggt atgtgtgcag gcttattaca  149040

tgggtatgtt atgtgtttgt ggtatggatg atcctgtcac ccaggtagtg agtatagtac  149100

tcaataggta gttttttagc ccttactccc tcctctctct acccaccagt agccccaggt  149160

atctattgtt tcgatctttg tatctatgtg tacccagtgt ttagcttcta ctcacaagtg  149220

aaagtatgca atattcagtt ttctgcttct gtgttaattc acttagaata atggccttca  149280

cctgcatcta tgttgctgca aaggatatga tttcattctt ttttatggct gggtagtatt  149340

ctatgatgtc tgtgtaccac attttcttta tccaatctac agttgatggg cacctaagtc  149400

atgtctttgc tattgtgcat aatgctgcag tgatgcaaac                        149440

<210>51

<211>599

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>51

gagaattatt taactgtttt gtgtcaacat atctatgtat aaaatctgga atagtctaaa     60

acttggggga tggaccagta taaccacagc ttcagctctt cttcgttata taaaagagct    120

ggcagtaccc tttttttgtt tctcttctca tggccttctt atttatcatt ttttcctttc    180

tgctttttaa aaaaatctag aatacatttc tttatccaaa ttctgtattt tcttcttaac    240

agagctccaa acttacattc tccatgaaaa ctttgatgga taaaccaaat gcataaatak    300

ctttgcctta tttctaacct ctttgaccct gatatattca gttcatatca acaagttgtc    360

attgtcttcc agattgtcta gttatgtcat aaatatgtgt ttcaactccc caagtaggaa    420

ctgattttcc tcctttttgt tcatctccta taacattgag cacagtgctg ggccccaaat    480

acttccggaa tgaatcatga caagctgaag actgtgtaaa gataaaaaga aaatcatact    540

gaagctcttc tggcaaaagg tcagttgaaa tttatgacaa atgtcagtag ctgaagacg    599

Claims (79)

1.确定人类个体对心律不齐或中风的易感性的方法，该方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表5中显示的多态性标记物、以及与其连锁不平衡的标记物，

并且其中至少一个等位基因的存在或不存在的确定，是个体对心律不齐或中风易感性的指示。

2.确定人类个体对心律不齐或中风的易感性的方法，包括确定在源自于个体的基因型数据组中是否存在至少一个多态性标记物的至少一个风险等位基因，其中至少一个多态性标记物选自表5中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个风险等位基因的存在的确定，表明了个体对心律不齐或中风的增加的易感性。

3.权利要求1或2的方法，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。

4.前述权利要求任一项的方法，其中至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ IDNO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)，以及与其连锁不平衡的标记物。

5.前述权利要求任一项的方法，其中标记物D4S406的等位基因-2、-4和/或-8、标记物rs2634073的等位基因A、标记物rs2200733的等位基因T、标记物rs2220427的等位基因T、标记物rs10033464的等位基因T、和/或标记物rs13143308的等位基因G的存在，表明了个体对心律不齐或中风的增加的易感性。

6.前述权利要求任一项的方法，其中易感性是增加的易感性，其特征为比值比(OR)为至少1.3。

7.前述权利要求任一项的方法，其中易感性是增加的易感性，其特征为比值比(OR)为至少1.4。

8.前述权利要求任一项的方法，其中易感性是增加的易感性，其特征为比值比(OR)为至少1.5。

9.前述权利要求任一项的方法，其中易感性是增加的易感性，其特征为比值比(OR)为至少1.6。

10.前述权利要求任一项的方法，其中易感性是增加的易感性，其特征为比值比(OR)为至少1.8。

11.评估人类个体对心律不齐或中风的易感性的方法，包括在来自个体的核酸中筛选SEQ ID NO：50中与心律不齐或中风在人类群体中的增加的发病率相关的至少一个多态性标记物等位基因或单倍型；

其中核酸中至少一个多态性的风险标记物等位基因或风险单倍型的存在的确定，将个体鉴定为对心律不齐和/或中风具有升高的易感性，

其中核酸中至少一个风险标记物等位基因或风险单倍型的不存在，将个体鉴定为不具有升高的易感性。

12.权利要求11的方法，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。

13.权利要求11的方法，其中至少一个多态性标记物选自表5中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。

14.权利要求11-13任一项的方法，其中至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs 10033464(SEQ IDNO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。

15.权利要求11-14任一项的方法，其中标记物D4S406中的等位基因-2、-4和/或-8、标记物rs2634073的等位基因A、标记物rs2200733的等位基因T、标记物rs2220427的等位基因T、标记物rs10033464的等位基因T、和/或标记物rs13143308的等位基因G的存在，表明了个体对心律不齐或中风的增加的易感性。

16.用于评估人类个体对心律不齐和/或中风的易感性的标记物的鉴定方法，方法包括

a.鉴定SEQ ID NO：50中的至少一个多态性标记物、或与SEQ IDNO：50中的至少一个标记物连锁不平衡的至少一个多态性标记物；

b.确定被诊断患有心律不齐和/或中风的个体的样品的基因型状态；以及

c.确定对照个体的样品的基因型状态，

其中在被诊断患有心律不齐和/或中风的个体中至少一个多态性的至少一个等位基因的频率，与对照样品中至少一个等位基因的频率相比的显著差异，表明了至少一个多态性能用于评估对心律不齐和/或中风的易感性。

17.权利要求16的方法，其中在被诊断患有心律不齐和/或中风的个体中至少一个多态性的至少一个等位基因的频率，与对照样品中至少一个等位基因的频率相比的增加，表明了至少一个多态性能用于评估对心律不齐的增加的易感性。

18.权利要求16的方法，其中在被诊断患有心律不齐和/或中风的个体中至少一个多态性的至少一个等位基因的频率，与对照样品中至少一个等位基因的频率相比的降低，表明了至少一个多态性能用于评估对心律不齐和/或中风的降低的易感性、或保护性。

19.权利要求16-18任一项的方法，其中频率的显著的差异是由统计学测量值来表征的。

20.对从人类个体获得的核酸样品进行基因分型的方法，包括确定样品中预测心律不齐和/或中风的增加的风险至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个标记物选自表5中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在的确定，能预测个体中心律不齐和/或中风的增加的风险。

21.权利要求20的方法，其中基因分型包括使用位于至少一个多态性标记物两侧的核苷酸引物对，通过聚合酶链反应(PCR)扩增含有至少一个多态性标记物的核酸的区段。

22.权利要求20或21的方法，其中基因分型使用选自等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、核酸测序、5’-外切核酸酶消化、分子信标分析、寡核苷酸连接分析、大小分析以及单链构象分析的方法来进行。

23.权利要求22的方法，其中方法包括等位基因特异性探针杂交。

24.权利要求20-23任一项的方法，包括：

1.将核酸的拷贝与检测寡核苷酸探针和增强子寡核苷酸探针在允许寡核苷酸探针与核酸特异性杂交的条件下相接触；其中

a)检测寡核苷酸探针长度为5-100个核苷酸，并与含有至少一个多态性位点、其核苷酸序列在SEQ ID NO：50中示出的核酸的第一个区段特异性杂交；

b)检测寡核苷酸探针在其3’末端含有可检测标记，在其5’末端含有淬灭基团；

c)增强子寡核苷酸长度为5-100个核苷酸，并与相对于寡核苷酸探针5’方向的核苷酸序列的第二个区段互补，以便当两个寡核苷酸都与核酸杂交时，增强子寡核苷酸位于检测寡核苷酸探针的3’方向；以及

d)在第一个区段和第二个区段之间存在单个碱基缺口，使得当寡核苷酸探针和增强子寡核苷酸探针都与核酸杂交时，在寡核苷酸之间存在单个碱基缺口；

2.使用当检测探针与核酸杂交时将从检测探针的3’末端裂解可检测标记以释放游离的可检测标记的内切核酸酶来处理核酸；以及

3.测量游离的可检测标记，其中游离的可检测标记的存在表明检测探针与核酸的第一个区段特异性杂交，并表明多态性位点的序列与检测探针互补。

25.权利要求24的方法，其中核酸的拷贝通过聚合酶链反应(PCR)扩增来提供。

26.确定人类个体对心律不齐或中风的易感性的方法，方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的身份，其中至少一个标记物选自与PITX2基因相关联的标记物组，其中至少一个等位基因的存在表明了个体对心律不齐或中风的易感性。

27.权利要求26的方法，其中至少一个标记物选自rs7668322(SEQID NO：46)、rs2197815(SEQ ID NO：47)、rs6831623(SEQ ID NO：48)和rs259110(SEQ ID NO：49)，以及与其连锁不平衡的标记物。

28.权利要求26或27的方法，其中的易感性是增加的易感性。

29.权利要求26或27的方法，其中的易感性是降低的易感性。

30.前述权利要求任一项的方法，其中心律不齐是心房纤颤或心房扑动。

31.权利要求30的方法，其中心房纤颤或心房扑动的进一步特征为个体的发病年龄小于80岁。

32.权利要求30的方法，其中心房纤颤或心房扑动的进一步特征为个体的发病年龄小于70岁。

33.权利要求30的方法，其中心房纤颤或心房扑动的进一步特征为个体的发病年龄小于60岁。

34.前述权利要求任一项的方法，其中中风是缺血性中风。

35.前述权利要求任一项的方法，其中连锁不平衡的特征为r²的数值大于0.2。

36.评估个体对用于预防和/或缓解与心律不齐和/或中风相关的症状的治疗药剂的响应的可能性的方法，包括：在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个标记物的至少一个等位基因的存在的确定，表明了对心律不齐和/或中风的治疗药剂的阳性响应的可能性。

37.权利要求36的方法，其中治疗药剂是抗凝血剂、抗心律失常药剂、心率控制药剂、心脏复律药剂或心脏节律控制药剂。

38.权利要求36或37的方法，其中治疗药剂选自华法林、肝素、低分子量肝素、因子Xa抑制剂、凝血酶抑制剂、钠通道阻断剂、β阻断剂、钾通道阻断剂和钙通道阻断剂。

39.权利要求36-38任一项的方法，其中治疗药剂选自华法林、希美加曲、肝素、依诺肝素、达肝素、亭扎肝素、阿地肝素、那屈肝素、瑞维肝素、磺达肝素、艾卓肝素、来匹卢定、比伐卢定、阿加曲班、达那类肝素、丙吡胺、莫雷西嗪、普鲁卡因胺、奎尼丁、利多卡因、美西律、妥卡胺、苯妥英、恩卡尼、氟卡胺、普罗帕酮、阿马林、西苯唑啉、地他义铵、艾司洛尔、普萘洛尔、美托洛尔、烯丙洛尔、阿替洛尔、卡维地洛、比索洛尔、醋丁洛尔、纳多洛尔、吲哚洛尔、拉贝洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、噻吗洛尔、倍他洛尔、卡替洛尔、索他洛尔、左旋布诺洛尔、胺碘酮、阿齐利特、溴苄铵、多非利特、替地沙米、伊布利特、司美利特、N-乙酰普鲁卡因胺、盐酸尼非卡兰、维纳卡兰、氨巴利特、维拉帕米、米贝拉地尔、地尔硫卓、地高辛、腺苷酸、伊布利特、胺碘酮、普鲁卡因胺、丙胺苯丙酮和氟卡胺。

40.对被诊断有心律不齐和/或中风的个体的预后进行预测的方法，方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个等位基因的存在的确定，表明了个体心律不齐和/或中风的更糟的预后。

41.监测经历了心律不齐和/或中风治疗的个体的治疗进展的方法，该方法包括在从个体获得的核酸样品中确定至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的存在或不存在，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个等位基因的存在的确定，表明了个体的治疗结果。

42.权利要求36-41任一项的方法，其中至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ IDNO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。

43.权利要求36-41任一项的方法，其中连锁不平衡的特征为r²的数值至少为0.2。

44.权利要求36-43任一项的方法，其中心律不齐是心房纤颤或心房扑动。

45.权利要求36-44任一项的方法，其中心房纤颤或心房扑动的进一步特征为个体的发病年龄小于80岁。

46.权利要求36-44任一项的方法，其中心房纤颤或心房扑动的进一步特征为个体的发病年龄小于70岁。

47.权利要求36-44任一项的方法，其中心房纤颤或心房扑动的进一步特征为个体的发病年龄小于60岁。

48.权利要求36-44任一项的方法，其中中风是缺血性中风。

49.前述权利要求任一项的方法，还包含在来自个体的样品中评估心房纤颤、心房扑动或中风的至少一个生物标记物。

50.前述权利要求任一项的方法，还包含分析非遗传信息，以对个体进行风险评估、诊断或预后。

51.权利要求50的方法，其中非遗传信息选自年龄、发病时的年龄、性别、种族、社会经济状态、以前的疾病诊断、对象的医学史、心房纤颤、心房扑动和/或中风的家族史、生物化学测量和临床测量。

52.权利要求49-51任一项的方法，还包括通过逻辑回归计算总风险。

53.评估人类个体对心律不齐和/或中风的易感性的试剂盒，试剂盒包含用于在个体的基因组中选择性检测至少一个多态性标记物的至少一个等位基因的试剂，其中多态性标记物选自其序列显示在SEQ IDNO：50中的区段中的多态性标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，其中至少一个等位基因的存在表明了对心律不齐和/或中风的易感性。

54.权利要求53的试剂盒，其中至少一个多态性标记物选自表5中显示的标记物。

55.权利要求53或54的试剂盒，其中至少一个多态性标记物选自表9中显示的标记物，以及与其连锁不平衡的标记物。

56.权利要求53-55任一项的试剂盒，其中至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ IDNO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。

57.权利要求53-56任一项的试剂盒，其中心律不齐是心房纤颤或心房扑动。

58.权利要求53-57任一项的试剂盒，其中中风是缺血性中风。

59.权利要求53-58任一项的试剂盒，其中连锁不平衡的特征为r²的数值大于0.2。

60.权利要求53-59任一项的试剂盒，其中试剂含有至少一个与个体的基因组的含有至少一个多态性标记物的片段杂交的连续的寡核苷酸、缓冲液和可检测标记。

61.权利要求53-60任一项的试剂盒，其中试剂含有至少一对与从对象获得的基因组核酸区段的反向链杂交的寡核苷酸，其中每个寡核苷酸引物对被设计成选择性扩增个体的基因组中包含一个多态性标记物的片段，其中片段的大小为至少30个碱基对。

62.权利要求60或61的试剂盒，其中至少一个寡核苷酸与个体的基因组完全互补。

63.权利要求60-62任一项的试剂盒，其中寡核苷酸的长度为大约18到大约50个核苷酸。

64.权利要求60-63任一项的试剂盒，其中寡核苷酸的长度为20-30个核苷酸。

65.权利要求53-64任一项的试剂盒，其中试剂盒含有：

a.长度为5-100个核苷酸的检测寡核苷酸探针；

b.长度为5-100个核苷酸的增强子寡核苷酸探针；以及

c.内切核酸酶；

其中检测寡核苷酸探针与其核苷酸序列在SEQ ID NO：50中示出的核酸的含有至少一个多态性位点的第一个区段特异性杂交；并且

其中检测寡核苷酸探针在其3’末端含有可检测标记，在其5’末端含有淬灭基团；

其中增强子寡核苷酸长度为5-100个核苷酸，并与相对于寡核苷酸探针5’方向的核苷酸序列的第二个区段互补，以便当两个寡核苷酸都与核酸杂交时，增强子寡核苷酸位于检测寡核苷酸探针的3’方向；

其中在第一个区段和第二个区段之间存在单个碱基缺口，使得当寡核苷酸探针和增强子寡核苷酸探针都与核酸杂交时，在寡核苷酸之间存在单个碱基缺口；并且

其中当检测探针与核酸杂交时，使用内切核酸酶处理核酸将从检测探针的3’末端裂解可检测标记，以释放游离的可检测标记。

66.寡核苷酸探针在制造用于诊断和/或评估人类个体的心律不齐和/或中风的易感性的诊断试剂中的应用，其中探针与其核苷酸序列在SEQ ID NO：50中示出的核酸的含有至少一个多态性位点的区段杂交，其中片段的长度为15-500个核苷酸。

67.权利要求66的应用，其中多态性位点选自表5中显示的多态性标记物，以及与其连锁不平衡的多态性。

68.权利要求66或67的应用，其中至少一个多态性位点选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ IDNO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。

69.权利要求66-68任一项的应用，其中心律不齐是心房纤颤或心房扑动。

70.权利要求66-69任一项的应用，其中中风是缺血性中风。

71.权利要求66-70任一项的应用，其中连锁不平衡由r²的数值为至少0.2和/或|D′|的值为至少0.8来定义。

72.计算机可读介质，其上储存有：

a.至少一个多态性标记物的识别符；

b.该至少一个多态性标记物的至少一个等位基因在多个被诊断患有心房纤颤、心房扑动和/或中风的个体中的频率的指示符；以及

c.该至少一个多态性标记物的至少一个等位基因在多个参比个体中的频率的指示符；

其中至少一个多态性标记物选自表5中显示的多态性标记物，以及与其连锁不平衡的多态性。

73.权利要求72的介质，其中至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ IDNO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs 10033464(SEQ ID NO：41)和rs 13143308(SEQ ID NO：51)。

74.权利要求72或73的介质，其中中风是缺血性中风。

75.用于测定人类个体的心律不齐和/或中风的遗传指标的装置，包含：

a.计算机可读存储器：以及

b.储存在计算机可读存储器中的例行程序；

其中例行程序适用于在处理器上执行，以分析至少一个人类个体的至少一个多态性标记物的基因型和/或单倍型数据，其中该至少一个多态性标记物选自表5中显示的多态性标记物，以及与其连锁不平衡的标记物，并根据标记物或单倍型数据产生输出，其中输出包括作为人类个体的心律不齐和/或中风的遗传指标的至少一个标记物或单倍型的风险测量。

76.权利要求75的装置，其中例行程序还包含测定多个被诊断患有心律不齐和/或中风的个体中至少一个多态性标记物的至少一个等位基因和/或至少一个单倍型的频率的指示符，以及多个参比个体中至少一个多态性标记物的至少一个等位基因或至少一个单倍型的频率的指示符，并在其基础上计算至少一个等位基因和/或单倍型的风险测量值；

并且其中个体的风险测量值的计算，是基于个体的至少一个标记物和/或单倍型状态，与多个被诊断患有心房纤颤、心房扑动和/或中风的个体的至少一个标记物和/或单倍型信息的计算的风险的比较。

77.权利要求75或76的装置，其中至少一个多态性标记物选自D4S406(SEQ ID NO：45)、rs2634073(SEQ ID NO：33)、rs2200733(SEQ ID NO：28)、rs2220427(SEQ ID NO：1)、rs10033464(SEQ IDNO：41)和rs13143308(SEQ ID NO：51)。

78.权利要求75-77任一项的装置，其中风险测量值由比值比(OR)或相对风险(RR)表征。

79.权利要求75-78任一项的装置或介质，其中连锁不平衡的特征为r²的数值大于0.2。

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