CN101120093B - 包含新的调控元件的载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组DNA技术领域，尤其是开发用于重组蛋白表达的载体。异源基因在真核细胞中的表达需要RNA聚合酶II进行转录，这是被已知为启动子和增强子的顺式作用遗传元件驱动的。本发明提供一种用于获得高水平重组蛋白表达的启动子，所述启动子来自豚鼠巨细胞病毒的早期-立即启动子/增强子。本发明还公开了包含这种启动子的真核表达载体，在许多细胞类型中所述载体能够提供比可从人或小鼠巨细胞病毒的增强子/启动子元件获得的表达更高的表达水平。

Description

包含新的调控元件的载体

背景技术

本发明涉及重组DNA技术领域，尤其是开发用于重组蛋白表达的载体。在真核细胞中表达异源基因是生物技术的一个重要方面，在学术和商业方面均有应用。这些基因的表达需要RNA聚合酶II(PolII)进行转录，这是被已知为启动子和增强子的顺式遗传元件驱动的。

简单来说，启动子是位于下游少于100(通常少于50)碱基对(bp)的起始序列转录的定向元件。它们包含许多作为不同蛋白的结合位点的短的共有核苷酸序列，这些蛋白参与转录起始和已知为前-起始复合物的多-亚单位复合物的组装(McKnight and Tjian，1987，Cell46：795-805)。在大部分基因中，这发生在非常广泛的已知为TATA盒(TATAAA)的保守序列，TATA盒-结合蛋白(TBP，通用转录因子TF II D的一个亚单位)与其结合。随后超过10种其他转录因子有序组装，最终形成Pol II全酶复合物。RNA转录实际起始于下游约25-30碱基的起始位点(Breathnach和Chambon，1981，Annu Rev Biochem 50：349-393)，TBP也与其结合。

大部分功能性启动子还包含上游启动子元件(UPEs)，它们中最保守的是CAAT盒(CCAAT，转录因子CBF、C/EBP和NF-1的结合位点)，在上游大约70-200bp，和GC盒(GGGCGG，通用转录因子Sp-1的结合位点)，位于上游相似距离。尽管TATA盒单独就能产生基本水平的转录，但对大部分启动子来说优选水平的转录至少需要CAAT和GC盒。

增强子是非定向增强附近但不必直接紧邻的启动子的转录的序列(可以到几千碱基远(Kadonaga(2004)Cell116：247-257)。增强子包含代表广泛的转录激活蛋白结合位点的短(8-12bp)共有序列(Ondek等人，1988，Science236：1237-1244)，所述转录激活蛋白包括也与启动子元件有关的一些蛋白，例如NF-1和SP-1。这些序列经常以串联或者反向重复形式重复出现。

在一些天然转录单位中，包括许多DNA病毒诸如巨细胞病毒的非常活跃的立即/早期基因转录单位，增强子和启动子元件可以被功能性组合成有效的扩展的上游元件。

启动子可被调节，以对细胞类型、温度、金属离子或者其他因子作出应答；或者启动子可以是组成型的，产生对这些因子没有应答的转录。出于许多目的，在许多(如果不是全部的)细胞类型中产生持续高水平转录的组成型强启动子是非常有利的。许多年来在人巨细胞病毒中驱动立即/早期基因表达的增强子/启动子元件已被广泛用于驱动真核表达载体异源基因的这种表达(Foecking和Hoffstetter，1986，Gene45：101-105)。

人巨细胞病毒(CMV)是β疱疹病毒科成员，引起胃肠和呼吸道感染、肝炎和视网膜炎。和其他疱疹病毒属一样，CMV可持续潜伏感染，在免疫缺陷病人中被重新激活。在细胞培养中，人CMV在终极分化细胞诸如成纤维、上皮和内皮细胞以及单核细胞来源的巨噬细胞中有效复制(Isomura和Stinski，2003，J Virol77：3602-3614及其参考文献)。

在有效感染过程中，CMV基因有一个有序的表达模式，称为立即-早期(IE)、早期或者晚期。人CMV IE基因被认为在复制效率上起着关键作用(参见Castillo和Kowalik，2002，Gene290：19-34的综述)。

人CMV IE启动子的上游区域被分成3个区域，调节子、独特区和增强子。增强子还可被分为远端和近端增强子。远端增强子是有效IE基因表达和低MOI下病毒复制必需的。人CMVs具有用于IE基因表达的非常强的增强子。人CMV增强子具有4个包含NF-κ B或者rel结合位点的18-bp重复元件，5个包含CREB或者ATF结合位点的19-bp重复元件，2个AP-1结合位点和多个SP1位点(Thomsen等人，1984，Proc Natl AcadSci USA 81：659-663；Meier和Stinski，1996，Intervirology 39：331-342)。鼠CMV增强子包含6个NF-κ B或者rel结合位点、1个CREB或者ATF结合位点，和至少7个AP-1结合位点(Dorsch-Hasler等人，1985，Proc Natl Acad Sci USA 82：8325-8329)。不同的顺式-作用元件单独以及协同地稳定启动子上的RNA聚合酶II转录起始复合物。

许多优势地感染其他宿主种类的巨细胞病毒是已知的，但是，在许多情况下，确切的分类和种间相关性的程度都是暂定的。感染许多灵长类(包括非洲绿猴、恒河猴和倭黑猩猩)和啮齿类包括小鼠、大鼠和豚鼠的巨细胞病毒样病毒已经被识别。在这些中，只有小鼠和大鼠的启动子-增强子已经进行了详细功能分析。这些种类与人CMV的比较显示IE启动子-增强子的功能没有直接可比性，这可能是因为还存在未识别的在不同种的细胞中作用于下游转录的顺式-作用元件(Isomura和Stinski，2003，J Virol77：3602-3614)。

但是，人和小鼠的CMV IE启动子-增强子在真核表达载体中产生异源基因的持续高水平组成型表达，在生物技术中广泛应用。人CMV启动子的这种使用公开于US 5,168,062(Stinski/University of Iowa)。US 5,591,639(Bebbington/Celitech)要求保护利用启动子、增强子和包含人巨细胞病毒主要立即-早期基因的第一个内含子的功能完整的5′(上游)非翻译区域，其中这不是直接连接到它的天然DNA编码序列。US 4,968,615(Koszinowski等人)公开了小鼠CMV IE增强子的使用。

豚鼠CMV(GPCMV)引起与人CMV感染的病理学有很多相似的豚鼠疾病。力图表现基因组特征的努力(Isom等人，1984，J Virology49：426-436；Gao和Isom，1984，J Virology52：436-447)表明其基因组的结构组织在疱疹病毒属中是独特的。尽管大小与人和鼠CMV相似，GPCMV基因组比人CMV基因组简单得多，最接近于小鼠CMV的基因组。但是，GPCMV基因组具有几个不寻常的特征，尤其是在末端区域的结构。IE基因表达的后续研究通过与人CMV的序列比较发现了IE区域(Yin et al，1990，J Virol 64：1537-1548)，并分析了IE转录本的表达和加工。但是，还没有关于IE启动子-增强子对异源基因表达的有用性的分析。

包含IE1编码序列的5′端和上游启动子/增强子区域的GPCMV基因组的“HRv”(HindIII-EcoR V)立即-早期上游片段的序列，被测序(Yin，1991，Guinea pig cytomegalovirus immediate-early gene expression，PhDthesis，Pennsylvania State University，USA)，显示包含重复序列的区域，这是典型的CMV IE调节区域。鉴定了三个短重复序列，GP-1、GP-2和GP-3。GP-1是一个出现9次的18-bp重复序列(与GGCCCGGGACTTTCCA共有序列具有73-100％相似性)，包含NF-κ B结合位点，对应HCMV18-bp重复序列。GP-2是一个出现10次的17-bp重复序列(与TGTCCTTTTTGGCAAA共有序列具有86-100％相似性)，包含与共有的SRE(血清应答元件)相似的核心序列。GP-3在接近上游区域重复4次，包含GTGACTTT，这个序列鉴定是c-jun或者GCN4的结合位点(Hill等人，1984，Science234：451-457)。

尽管这项工作表明GPCMV IE上游区域包含强启动子，但是由于报告构建体的制备方式，一些假象(artefacts)不能被排除。首先，HRv片段看起来也包含IE1基因的第一个外显子和第一个内含子的一部分。这个内含子包含推定的NF-1结合位点的3个拷贝，它可以人为的促进启动子的显著效果。其次，用于检测GPCMV片段的报告构建体包含一个SV40启动子(自身是一个强病毒启动子)，这样的话报告表达来自与双GPCMV/SV40启动子的效果。结果导致不可能将单用GPCMV增强子/启动子与其他强启动子，或者甚至与其他CMV IE增强子/启动子进行比较。

本申请人的共同待决专利申请PCT/GB99/02357(WO00/05393)，在此引入作为参考，描述了在其天然染色体环境中负责建立跨越一个基因座的开放染色质结构的元件，所述基因座完全由遍在表达的持家基因构成。这些元件不是来自基因座控制区(LCR)，包含扩展的无甲基化CpG岛。术语遍在染色质开放元件(UCOE)被用于描述这种元件。

在哺乳动物DNA中，二核苷酸CpG被DNA甲基化转移酶识别，所述DNA甲基化转移酶将胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶。但是，5-甲基胞嘧啶不稳定，会转化为胸腺嘧啶。结果就是，CpG二核苷酸比预想的偶然出现的几率要少得多。不管怎么说基因组DNA一些部分的CpG频率与预想的接近，这些序列已知为“CpG岛”。此处使用的“CpG岛”定义为至少200bp的DNA序列，含有的GC含量至少为50％，并且观察/预测CpG含量的比例至少为0.6(即CpG二核苷酸的含量至少是预想的偶然出现的CpG二核苷酸的含量的60％)(Gardiner-Green M和FrommerM.J MoI Biol 196，261-282(1987)；Rice P，Longden I和Bleasby ATrends Genet 16，276-277(2000))。

无甲基化的CpG岛是本领域公知的(Bird等人(1985)Cell 40：91-99，Tazi和Bird(1990)Cell 60：909-920)，可以被定义为其中大部分胞嘧啶没有被甲基化的CpG岛，所述CpG岛通常跨越两个在空间上接近(0.1-3kb)的趋异转录的基因的5′端。这些DNA区域据报道在整个发育期间在所有组织中都保持低甲基化(Wise和Pravtcheva(1999)Genomics60：258-271)。它们通常与广泛表达基因的5′端，以及估计40％的显示组织限制性表达模式基因相关(Antequera，F.& Bird，A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，1195-11999(1993)；Cross，S.H.和Bird，A.P.Curr.Opin，Genet.Dev.5，309-314(1995))，并且已知位于活性染色质区域(Tazi，J.和Bird，A.Cell60，909-920(1990))。

“扩展的”无甲基化CpG岛是一种无甲基化CpG岛，它跨越包括超过一个转录起始位点的区域和/或跨越超过300bp，优选超过500bp。通过对该区域使用PCR并联合限制性内切酶，对扩展的无甲基化CpG岛的边界进行功能性定义，其中所述限制性内切酶在其识别序列消化(切割)DNA的能力对存在的任意CpG残基的甲基化状态敏感。一种这样类型的酶是Hpa II，它识别并消化通常出现在CpG岛中的位点CCGG，该位点但只是在中心CG残基未被甲基化的情况下消化。因此，对HpaII-消化的DNA进行的跨越包含Hpa II位点区域的PCR不会产生扩增产物，因为DNA未被甲基化会导致Hpa II消化。只有DNA被甲基化，PCR才会产生扩增产物。因此，在无甲基化区域之外，Hpa II不会消化DNA，可观察到PCR扩增产物，因此可以定义“扩展的无甲基化CpG岛”的边界。

国际申请WO00/05393表明跨越无甲基化CpG岛的区域，包括来自人TATA结合蛋白(TBP)/蛋白体组件-B1(PSMB1)和核内不均一核糖蛋白A2/B1(hnRNPA2)/异染色质蛋白1Hs γ(HP1^Hsγ)基因座位的双重趋异转录的启动子，使可操作连接的基因表达水平增强。与活跃转录启动子相关的无甲基化CpG岛具有改造染色质的能力，因此被认为是在看家基因座位建立和保持开放结构域的主要决定子。

UCOE产生有效基因整合事件的比例增加，以及转基因表达水平和稳定性的增加。这具有重要的科研和生物技术应用，包括制备转基因动物和在培养的细胞中产生重组蛋白产品。

WO00/05393公开了大约4.0kb的功能性UCOE片段，尤其是，图21的核苷酸4102到8286定义的“5.5RNP”片段(第11页，第6和7行公开)。相同申请公开了一个“1.5kb RNP”片段(图22和29，衍生过程描述在第51页，第1到5行)。但是，这个片段实际是上述“5.5RNP”片段的一个2165bp BamH I-Tth111 I片段，由该申请图21的核苷酸4102到6267组成。

另一个申请WO 02/24930，公开了人工构建的UCOEs，由天然产生的CpG岛组成。第三个申请，WO 04/067701描述了包括UCOEs的小功能片段的多核苷酸。这种多核苷酸包括不超过大约2kb的无甲基化CpG岛，或者更大的但不超过大约2kb的这种岛的片段。

考虑到生物技术中重组蛋白表达的重要性，仍然需要包括新的启动子/增强子组合的改进的表达载体。

发明概述

贯穿本说明书的描述和权利要求，词“包含”和“包括”和这些词的变形，意思是“包括但不限于”，不是用于(也没有)排除其他部分、添加物、组分、整数或者步骤。

贯穿本说明书的描述和权利要求，单数包括复数除非上下文另外限定。尤其是，在使用不定冠词时，说明书应该理解为包括复数以及单数，除非上下文另外限定。

与本发明的特定方面、实施方式或者实施例相关描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或者基团，应了解也可用于此处描述的任何其他方面、实施方式或者实施例，除非与其不相容。

此处使用的术语“可操纵连接的”涉及本发明多核苷酸中元件的操纵性的关系。“可操纵连接的”是本领域技术人员公知的术语，描述顺式作用DNA序列间的功能关系。确切的结构关系可以是或可以不是相关的，对不同类型的元件是有区别的。对启动子来说，它距离其驱动的开放阅读框5′端非常接近(通常在少于100bp内)。在扩展的无甲基化CpG岛例子中，显示对染色质结构的区域效应导致基因表达水平和一致性的增加。在所述例子中，包含扩展的无甲基化CpG岛的元件可以位于控制可表达的基因转录的增强子/启动子的5′端。但是，“可操纵连接的”包括其位于其他地方的可能性，只要能够证明明显的功能效果。

“功能同源”是指在严谨条件下能够与公开的序列杂交的多核苷酸序列，所述序列具有能够在两种或多种组织中增加可操纵连接的的可表达的开放阅读框架的表达的类似性质。严谨的杂交/洗涤条件是本领域公知的。例如，在60℃0.1×SSC、0.1％SDS洗涤后稳定的核酸杂交物。如果核酸序列是已知的，可以计算出合适的杂交条件，这是本领域公知的。例如，可通过用于杂交的核酸的GC含量确定杂交条件。参见Sambrook et al(1989)，Molecular Cloning；A Laboratory Approach。一个用于计算特定同源性的核酸分子间完成杂交所需的严谨条件的通用公式是：

T_m＝81.5℃+16.6Log[Na⁺]+0.41[％G+C]-0.63(％甲酰胺)

本发明的一个目的是提供包括转录增强子的新DNA分子和载体，其中增强子能够在真核细胞中提供可操纵连接的可表达的核酸序列的非常高水平的表达。具有优势的是增强子可以与其天然相联的启动子和/或其他促进转录的遗传元件联用。

本发明涉及豚鼠巨细胞病毒早期-立即启动子/增强子及其在表达载体中的应用，尤其是为了获得重组蛋白高水平的表达。本发明提供真核表达载体，所述载体能够在许多细胞类型中提供比获自人类或小鼠CMV IE增强子/启动子元件更高的表达水平。

豚鼠巨细胞病毒早期-立即上游调控区由IE1基因上游的大约1500bp组成，更具体的是图1和SEQ ID NO：1所示的序列。它包括启动子和增强子元件。提到“启动子”至少表示转录起始位点，TATA盒和CAAT盒，是包含图1(SEQ ID NO：1)的核苷酸779-880的片段或者其功能同源物。

因此，本发明提供分离分离的多核苷酸，包括至少100，优选200，更优选至少500个如图1和SEQ ID NO：1所示的豚鼠CMV立即/早期调控区的连续多核苷酸以及可表达的多核苷酸序列，所述可表达的多核苷酸序列的转录被位于增强子和基因之间或者其他可表达序列间的启动子驱动，所述启动子可以是内源性的豚鼠CMV立即/早期启动子或者一些其他异源的与增强子不是天然相联的启动子。可表达的多核苷酸序列不是豚鼠CMV立即/早期基因，不是与启动子天然可操纵连接的。本领域技术人员应该了解，在环形分离的多核苷酸(如在质粒载体中)情况下，“之间”表示直接可操纵连接的可表达多核苷酸序列的上游(就正义链而言是5′)，及可操纵连接的增强子的下游(3′)。应了解这种分离的多核苷酸可以包括不与感兴趣的插入的可表达序列的表达相联的其他启动子(例如那些表达选择标记物所需要的启动子或者那些与其他元件相联的启动子)。

因此分离的多核苷酸包括

a)包括SEQ ID NO：1的至少200个，优选至少500个连续核苷酸的元件和

b)包括可表达的多核苷酸序列的元件；

其特征在于所述分离的多核苷酸包括，按可表达的多核苷酸序列的正义链从5′至3′方向，增强子，单一启动子和所述可表达的多核苷酸序列，其中所述增强子与所述启动子可操纵连接，所述启动子与所述可表达的多核苷酸序列直接可操纵连接，其中所述启动子与所述表达多核苷酸序列不是天然可操纵连接的。

优选分离的多核苷酸包括立即/早期调控区的包含核苷酸50至550的5′片段，或者，包括核苷酸275至775的3′片段。这种片段包括功能性增强子片段，而没有内源性启动子。

在一个实施方案中，因此，本发明分离的多核苷酸包括至少来自豚鼠CMV的立即/早期调控区的启动子与不是天然可操纵连接的的可表达核酸序列直接可操纵连接，所述启动子优选包括SEQ ID NO:1的核苷酸779至880。“直接可操纵连接的”表示基因或者其他可表达的核酸的转录被启动子直接驱动。

优选，所述的分离的多核苷酸还包括来自豚鼠CMV的主要立即/早期调控区的增强子，更优选包括SEQ ID NO：1的核苷酸1至887。

在一个优选实施方案中，所述分离的多核苷酸还包括扩展的、无甲基化CpG岛，所述CpG岛与所述可表达核酸序列可操纵连接。更优选，所述扩展的、无甲基化CpG岛包括一个或多个另外的启动子，尤其是趋异转录的二元或者双向启动子。因此本发明提供包括图1(SEQ IDNO：1)的至少200个连续核苷酸的分离的核苷酸，与可表达的多核苷酸序列可操纵连接，还包括与所述可表达的核酸序列可操纵连接的的扩展的、无甲基化CpG岛。这种扩展的、无甲基化CpG岛可以方便的置于增强子序列的邻近或者上游。优选这种分离多核苷酸包括至少图1(SEQID NO：1)的500个连续多核苷酸，更优选立即/早期调控区的包括核苷酸50至550的5′片段，或者，包括核苷酸275至775的3′片段。最更优选它包括SEQ ID NO:1的核苷酸1至887。

在一个实施方案中，所述扩展的、无甲基化CpG岛包括44kb DNA片段，跨越人TATA结合蛋白基因和12kb5′和3′侧翼序列，或其功能片段。优选，功能片段包括25kb DNA片段，跨越具有1kb5′和5kb3′侧翼序列的人TATA结合蛋白或者其功能片段。更优选，TATA结合蛋白基因相联的扩展的、无甲基化CpG岛的功能片段不超过2kb，更优选仅为大约1kb，最优选包括987bp BspE1-Esp31限制片段。

在第二个实施方案中，所述扩展的、无甲基化CpG岛包括60kbDNA片段，跨越具有30kb5′和20kb3′侧翼序列的人hnRNP A2基因，或者其功能片段。优选，所述功能片段包括16kb DNA片段，跨越具有5kb5′和1.5kb3′侧翼序列的人hnRNP A2基因，更优选不超过2kb的人hnRNP A2基因的片段，最优选不超过1.6kb，包括1546bp Esp31限制片段。优选，所述片段方向为正向。

在第三个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包括β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域的片段，优选人源的，更优选范围在100bp至2kb的跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域的DNA片段。

在第四个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包括PDCD2CpG岛/启动子区域的片段，优选人源的，更优选范围在100bp至2kb的跨越人PDCD2CpG岛/启动子区域的DNA片段。

在最后另一个实施方案中，所述扩展的、富含CpG的无甲基化CpG岛是一个人工序列，天然不存在，包括范围在100bp至1.9kb的跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域的DNA片段和范围在100bp至2kb的跨越人PDCD2 CpG岛/启动子区域的DNA片段。优选所述片段与其趋异定向的启动子直接毗连。

本发明的另一方面提供了包括上述分离多核苷酸的载体。载体可以是任意能够将DNA转移到细胞的载体。优选载体是真核表达载体。这种载体包括能够指导和增强真核细胞转录的元件，诸如启动子和增强子。优选它们优选还包括其他促进和优化其功能的特点。这些特点包括选择的复制起点以便在合适的真核宿主细胞和原核细胞中复制用于制备载体自身，一种或多种选择标记物(通常是对抗生素或者毒素产生抗性)以便在两种细胞类型中选择包含载体的细胞，允许载体扩增或其片段整合的元件，和方便的位于主要增强子/启动子下游的多接头或者多克隆位点以便方便的插入编码所需多肽产物的可表达的多核苷酸序列(通常称为“插入物”)。这种优化是本领域公知的。

优选，载体是整合型载体或者游离型载体。

优选整合型载体包括重组逆转录病毒载体。重组逆转录病毒载体包括逆转录病毒基因组的至少部分DNA，所述部分能够感染靶细胞。使用的术语“感染”表示病毒将遗传材料转移到宿主或者靶细胞的过程。优选，用于构建本发明载体的逆转录病毒是复制缺陷型的，以去除靶细胞的病毒复制的影响。在这些例子中，根据常规技术可以通过辅助病毒包装复制缺陷型病毒基因组。通常，任何满足上述感染标准和能够进行功能基因转移的逆转录病毒均可用于本发明。

合适的逆转录病毒包括但不限于pLJ、pZip、pWe和pEM，这是本领域技术人员公知的。用于复制缺陷型逆转录病毒合适的包装病毒系包括，例如

Crip、

Cre、

2和

Am。

用于本发明的其他载体包括腺病毒、腺相关病毒、SV40病毒、牛痘病毒、HSV和痘病毒载体。优选载体是腺病毒。腺病毒载体是本领域技术人员公知的，已经被用于递送基因到许多细胞类型，包括气道上皮、骨骼肌、肝、脑和皮肤(Hitt等人，1997；Anderson，1998)。

另一个优选载体是腺相关病毒(AAV)载体。AAV载体是本领域技术人员公知的，已经被用于稳定转导人T-淋巴细胞、成纤维细胞、鼻息肉、骨骼肌、脑、类红细胞和造血干细胞用于基因治疗用途。国际专利申请WO 91/18088描述了特定的基于AAV的载体。

优选游离型载体包括瞬时非复制型游离载体，和自主复制型游离载体，它们具有衍生自诸如那些来自EBV、人乳多空病毒(BK)和BPV-1的病毒复制起点的功能。这种整合型和游离型载体是本领域技术人员公知的，在本领域技术人员公知的文献中有完整描述。尤其是，合适的游离型载体描述在WO 98/07876。

哺乳类人工染色体可在本发明中用作载体。Calos(1996)讨论了哺乳类人工染色体的用途。

在一个优选实施例中，本发明的载体是质粒。质粒可以是非复制型、非整合型的质粒。

此处使用的术语“质粒”是指编码可表达的基因的任意核酸，包括线性或者环状核酸以及双链或者单链核酸。核酸可以是DNA或者RNA，可以包括修饰的核苷酸或者核糖核苷酸，可以通过诸如甲基化或者添加保护基团或者帽-或者尾结构的方法进行化学修饰。

当转染入宿主细胞时，非复制型、非整合型质粒不复制，也不特异整合入宿主细胞的基因组(即不以高频率整合，不整合在特异位点)。

本发明载体的高度优选实施方案包括SEQ ID NO：2的核苷酸1至1003和1747至5749；SEQ ID NO：3的核苷酸1至9328和10072至14119；或者SEQ ID NO：4的核苷酸1至2592和3336至7383，该表达载体适合在完整序列编码的示例增强绿色荧光蛋白报告基因的位置插入可表达的序列。

本发明还提供转染本发明载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任意真核细胞。优选是哺乳动物细胞，更优选是人或者啮齿动物细胞。

已知许多技术可用于根据本发明所述将载体递送到细胞，包括使用核酸凝聚剂、电穿孔、与石棉络合、聚凝胺(polybrene)、DEAE纤维素、葡聚糖、脂质体、阳离子脂质体、脂多胺、聚鸟氨酸、粒子轰击和直接显微注射。

通过病毒或者非病毒递送方法，本发明的载体可以非特异或特异的(即到指定亚型的宿主细胞)递送到宿主细胞。优选病毒来源的递送方法包括产生病毒颗粒的组装细胞系作为本发明载体的转染受体，其中设计了病毒包装信号，例如那些腺病毒、疱疹病毒和乳多空病毒的信号。在本发明中还可使用优选基于非病毒的递送方式和方法，包括直接裸核酸注射、核酸凝集肽和非肽，阳离子脂质体和包裹在脂质体中。

构思使用核酸凝集肽递送本发明的载体。核酸凝集肽对凝集载体并将其递送到细胞非常有效，在国际专利申请WO 96/41606中有描述。WO 96/41606描述了官能团可以结合到肽上以便递送本发明的载体。这些官能团可以包括靶向特定细胞类型的配体，例如单克隆抗体、胰岛素、转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白，或者糖。因此配体可以采用非特异方式或者特异方式靶向定位细胞，这受细胞类型的限制。

官能团还可以包括脂、例如棕榈酰、油酰、或者硬脂酰；中性亲水聚合物例如聚乙二醇(PEG)或者聚乙烯吡咯烷(PVP)；融合肽例如流感病毒的HA肽；或者重组酶或者整合酶。官能团还包括细胞内运输蛋白例如核定位序列(NLS)，内含体逃逸信号例如破膜肽，或者指导细胞直接到细胞质的信号。

本发明还提供包含此处所述的分离的多核苷酸或者载体的宿主细胞。优选所述细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞，更优选人或啮齿动物细胞。

在另一方面，本发明提供表达可表达的多核苷酸的方法，优选该多核苷酸编码多肽，包括将本发明的分离的多核苷酸插入到此处所述的合适表达载体，然后将所述载体插入到此处所述合适的宿主细胞，在合适条件下培养所述宿主细胞以获得表达。

优选，所述多肽是对治疗有用的多肽，优选选自免疫球蛋白或者免疫球蛋白的功能性表位-结合片段、生长因子、受体或其可溶性片段和血液凝集因子。

本发明还提供包括本发明多核苷酸、载体或者宿主细胞和制药上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂或者介质的药物制品。

附图简述

图1显示GPCMV IE增强子/启动子(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列。显示转录因子AP-1，NF-κB，SRF和GCN4的潜在结合部位，以及CAAT和TATA盒，CRS起始位点和转录起点(箭头)。

图2显示通过许多EGFP报告构建体获得的CHO-K1细胞中的表达水平，表示为通过FACS检测的荧光中值。结果比较人和豚鼠GPCMV IE增强子/启动子，具有和不具有1.5kb hnRNP UCOE元件。

图3显示报告质粒CET 1005 GPCMV-EGFP的图谱，包括驱动增强绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)表达的GPCMV IE增强子/启动子(GPCMV)，。真核选择标记物是表达自小鼠磷酸甘油酯激酶启动子的嘌呤霉素抗性基因。原核选择标记物是氨苄抗性。

图4显示报告质粒CET1015 8kb-GPCMV-EGFP的图谱。这与CET1005 GPCMV-EGFP相似，且在GPCMV IE增强子/启动子上游添加8kbhnRNP UCOE。

图5显示报告质粒CET1015 1.5kb-GPCMV-EGFP的图谱。这与CET1015 8kb-GPCMV-EGFP相似，除了用1.5kb hnRNP UCOE元件替代8kb hnRNP UCOE。

图6比较HEK293细胞(剪切的腺病毒5型DNA转化的人胚肾细胞)中人和豚鼠CMV IE增强子/启动子元件驱动的EGFP表达。

图7显示使用基于荧光酶的报告构建体的相似比较。

详细描述

实施例1

使用包括hCMV启动子或者gpCMV启动子的载体产生稳定转染的CHO-K1细胞

按以下方式制备质粒构建体。氨苄抗性基因通过PCR从

(Stratagene)分离，在引物5′-TGTCGCGAGTCTGACAGTTACCAATGCT TAATC 3′(SEQ ID NO：5)，5′-CATCGCGAGCACTTTTCGGGGAAAT GTGTGCGC-3′(SEQ IDNO：6)的每个末端引入Nru I位点。PCR产物插入pMae II的Pvu II位点(Nucleic Acids Research 2001 29:E26)产生pCA1。下述寡核苷酸

1.5′-TCGAAGTTTAAACATTTAAATCTAGAAGCTTAT-3′

(SEQ ID NO:7)

2.5′-CCGGTATCGATAAGCTTCTAGATTTAAATGTTTAAACT-3′

(SEQ ID NO:8)

3.5′-CGATACCGGTGGCGCGCCAATTGTTAATTAAGATCTGG-3′

(SEQ ID NO：9)

4.5′-CCCATTGGGCCAGATCTTAATTAACAATTGGCGCGCCA-3′

(SEQ ID NO：10)

5.5′-CCCAATGGGCCGTACGAATTCCTTAGGCTCGAG-3′

(SEQ ID NO：11)

6.5′-GGCCCTCGAGCCTAAGGAATTCGTACGG-3′(SEQ IDNO：12)

进行退火(1和2；3和4；5和6；然后三个二聚体再一起进行退火)，用于代替Xho I和Not I位点间pCA1的多克隆位点，在构建过程中这些位点被破坏。这产生pCA1MCS。通过Age I限制性消化，Age I位点从pPGK-Puro-bgh pA内的PGK启动子中去除，然后用T4 DNA聚合酶补平并再连接。PGK-嘌呤霉素pA盒作为EcoR I-Xho I片段从这个载体移除，连接入用EcoR I和Xho I进行相似消化的pCA1MCS。这个载体命名为pCIA-Puro(CET 1000)。pCIA-Puro中的bghpA用HSV TkpA代替。HSV-Tk polyA作为SsfB I-Eco109 I片段从pEGFP-N1移除，用T4DNA聚合酶补平，连接入经过Sac I消化和T4DNA聚合酶补平的pCIA-Puro。这个载体命名为CET 1005。

为构建pCET10051.5kb-GPCMV-EGFP，用BsmB I从pCET20(前述)切下1.5kb hnRNP UCOE片段，利用T4DNA聚合酶补平，然后克隆入pEGFP-N1(Clontech，Palo Alto，CA，USA)补平的Xho I位点，产生pEGFP-N11.5kb-EGFP。然后用Nhe I(平端)/Not I从这个质粒切下2.4kb“hnRNP-EGFP”盒，亚克隆入已经用Swa I/Not I消化的pCET1005-EGFP骨架，得到pCET1005 1.5kb-EGFP。然后用Nhe I和EcoR I从pPCRScript GPCMV(由Geneart，Regensburg，Germany合成)切下GPCMV启动子，补平，亚克隆入这个质粒补平的BamH I，产生pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP。利用Pme I/Sac I切下1.5kb hnRNPUCOE，补平，重新连接骨架产生质粒pCET1005 GPCMV-EGFP。

为构建pCET1015 8kb-GPCMV-EGFP，pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP的5.3kb Sac I(平端)/Pac I片段亚克隆入pCET1015的Asc I(平端)/Pac I-消化的骨架。通过将来自pCET20补平的1.5kb hnRNP BsmBI片段亚克隆入pCET1005-EGFP补平的Cla I位点，构建质粒pCET10051.5kb-HCMV-EGFP。

CHO-K1在F12(HAM)营养混合物(Gibco，UK)中培养，其中添加10％胎牛血清(Invitrogen，UK)，5U/ml青霉素和链霉素混合物(Sigma，UK)。为稳定转染CHO-K1，质粒用Pci I线性化，在酚：氯仿：异戊醇和氯仿抽提，乙醇沉淀，重悬于无菌水中，浓度为0.25μg/μl。在无菌电穿孔杯中，等摩尔量的线性化质粒在无菌水中稀释到25μl(1.39μg pCET1005-EGFP，1.78μg pCET1005 1.5kb-HCMV-EGFP，1.45μg pCET1005 GPCMV-EGFP或者1.85μg pCET10051.5kb-GPCMV-EGFP)，与5×10⁶CHO-K1细胞在250μl生长培养基中混合。在冰浴15分钟后，细胞在250V/975μF电穿孔(BioRad Gene PulserII^TM)，在室温继续孵育10分钟。然后将细胞转移到10ml生长培养基，离心收集，转移到225cm²组织培养瓶，总体积50ml生长培养基。在加入嘌呤霉素(Sigma，UK)至浓度12.5μg/ml前，细胞在37℃5％CO₂孵箱中孵育24小时。在收集稳定转染子前，细胞培养8天(4天后替换选择培养基)，亚培养至6孔组织培养板(维持选择压力)，使用荧光激活细胞分类术进行分析，利用FL1通道观察EGFP。图2清楚显示两个包含gpCMV的构建体pCET1005-GPCMV-EGFP(图3)和pCET1005-1.5kb-GPCMV-EGFP(图5)比使用hCMV启动子的相应构建体，pCET1005-EGFP和pCET1005-1.5kb-HCMV-EGFP，产生表达转基因的水平更高的细胞群。

实施例2

HEK293细胞在Dulbecco’s Eagle培养基(DMEM；Sigma，UK)中培养，其中添加10％胎牛血清及5U/ml青霉素和链霉素混合物(Sigma，UK)。为稳定转染，HEK293细胞以1×10⁶细胞/孔密度接种于6孔板，然后在37℃5％CO₂孵箱中孵育24小时。然后用10μl Lipofectamine 2000(Invitrogen，UK)将4μg所示质粒(pCET1005-EGFP or pCET1005-gpCMV-EGFP)(用Pci I线性化)转染细胞。

DNA和Lipofectamine2000分别在250μl OptiMEM I(Gibco，UK)中稀释，在室温孵育5分钟后，混合然后再孵育20分钟。细胞的生长培养基替换成1ml添加15％FCS的OptiMEM I，然后加入DNA/Lipofectamine 2000混合物。在加入3.5ml添加10％FCS的OptiMEMI前，细胞在37℃5％CO₂孵箱中孵育5小时。收集前细胞在37℃5％CO₂孵箱中孵育24小时，然后转移到225cm²组织培养瓶，总体积50mlDMEM生长培养基，添加0.5μg/ml嘌呤霉素。在离心收集稳定转染子前，细胞生长大约14天(每隔3-4天更换选择培养基)，亚培养至6孔组织培养板(维持选择压力)，使用荧光激活细胞分类术进行分析，利用FL1通道观察EGFP。图6显示用gpCMV构建体产生细胞群表达EGFP的水平比用hCMV构建体产生的细胞群高3-4倍。

实施例3

按实施例1所述培养CHO-K1细胞。转然到12孔前24小时接种1.5×10⁵CHO-K1细胞。24小时后，用1.5μl FUGENE(Roche，UK)将1μg荧光酶报告质粒(phCMV-Luc or pgpCMV-Luc)转染细胞。为此，FUGENE和DNA分别稀释到Opti-MEM I(Invitrogen)中，混合，加入到细胞中前在室温孵育30分钟。24小时后用Berthold光度计(Berthold，Wildbad，Germany)分析荧光酶表达。通常，按先前所述进行细胞裂解和荧光酶报告分析(Lipinski等人，Gene Therapy，2001(8)：274-281)。转染进行3个复孔，每个代表性试验的平均和标准差被显示(图7)。很清楚gpCMV载体的荧光酶活性比hCMV质粒高至少2倍。

在先前已经有质粒hCMV-Luc的描述(Lipinski等人，Gene Therapy(2001)8：274-281)。通过从pCRScript/gpCMV(用户基因合成公司：Geneart，Regensburg，Germany)制备Nde I/EcoR I片段，并将这个gpCMV启动子片段克隆入pGL3basic(Promega)补平的Xho I位点，产生质粒gpCMV-Luc。

Claims (10)

1.一种分离的多核苷酸，包括

a.由SEQ ID NO：1组成的元件，和

b.包括可表达的多核苷酸序列的元件；

其特征在于所述分离的多核苷酸按可表达的多核苷酸序列的正义链从5’至3’方向包括，增强子，单一启动子和所述可表达的多核苷酸序列，其中所述增强子与所述启动子可操纵连接，所述启动子与所述可表达的多核苷酸序列直接可操纵连接，其中所述启动子与所述可表达的多核苷酸序列不是天然可操纵连接的。

2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，包括来自豚鼠CMV的立即-早期调控区的启动子，所述启动子与不是天然可操纵连接的可表达的核酸序列直接可操纵连接。

3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，还包括与所述可表达的核酸序列可操纵连接的扩展的、无甲基化CpG岛。

4.一种载体，包括前述权利要求中任意一项所述的分离的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的真核表达载体。

6.一种宿主细胞，包括权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，或者权利要求4或5所述的载体。

7.一种表达多肽的方法，包括将编码所述多肽的可表达的核酸序列插入根据权利要求4或5所述的表达载体中，然后将所述载体插入到合适宿主细胞，在合适条件下培养所述宿主细胞以允许表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述多肽是对治疗有用的多肽。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的多肽选自免疫球蛋白或者免疫球蛋白的功能性表位-结合片段、生长因子、可溶性受体和血液凝集因子。

10.一种药物制品，包括权利要求1至3中任意一项所述的多核苷酸，权利要求4或5所述的载体，或者权利要求6所述的宿主细胞，和制药上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂或者介质。

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