KR102590276B1 - 조직 특이적 발현을 위한 융합 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TBG 프로모터와 CMV 인핸서를 결합시킨 융합 프로모터에 대한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 융합 프로모터는 간 세포에 특이적으로 발현하며 기존 TBG 프로모터 단독으로 작용할 때보다 유전자 전사효율과 단백질의 발현이 현저히 증가된 것을 확인한 바, 본 발명에 따른 융합 프로모터는 기존 TBG 프로모터가 가진 단점을 우수하게 개선한 프로모터이므로, 이를 간 질환 유전자 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

조직 특이적 발현을 위한 융합 프로모터 및 이의 용도{Fusion promoter for tissue-specific expression, and use Thereof}

본 발명은 조직 특이적, 특히 간 및 간 세포 특이적 발현을 증대시키기 위한 융합 프로모터 및 이의 용도에 대한 것이다.

유전자 치료는 생체 내에서 돌연변이 유전자를 교정할 수 있는 기회를 제공한다. 숙주 세포 내에서 원하는 유전자를 발현시키기 위해서는 세포 내로 구조 유전자를 수송하여 이를 발현시키는 발현벡터 및 유전자 전달기술이 필요하다. 이 때, 발현벡터는 벡터에 삽입된 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 벡터로서, 일반적으로 숙주 내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터 서열 등의 발현조절서열을 포함한다. 숙주 세포의 종류, 발현 시기, 발현량 등은 발현벡터를 선택함에 있어서 주요한 근거가 되며, 목적에 따라 이러한 점들을 충족시키기 위해 다양한 발현벡터가 개발되고 있다.

이에 있어 유전자의 높고 지속적인 발현의 목표를 달성하기 위하여, 거대 세포 바이러스 프로모터 (cytomegalovirus promoter, CMV) 및 포유류 신장 인자 1α (mammalian elongation factor 1α, EF1α) 프로모터와 같은 유비쿼터스 프로모터가 치료 유전자를 구동하는 데 사용되어 왔다.

그러나 이러한 시스템의 주요 단점 중 하나는 특정 세포집단이나 표적 기관에서 유전자 발현을 제한할 수 없다는 것이다. 따라서, 조직 특이적 프로모터는 유전자 치료 전략을 위한 벡터 디자인에서 매우 중요하다.

한편 간은 대사 과정에서 중요한 역할을 하고 다양한 대사질환에 중요한 기관이므로, 유전자 치료를 위한 매력적인 표적 기관이 될 수 있다.

티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터는 최근 몇 년 동안 간 세포 특이적으로 다양한 치료 유전자의 발현을 조절하기 위해 개발되고 적용되고 있다. 그러나 기존의 연구 결과에 의하면 TBG 프로모터에 의해 구동되는 외인성 유전자의 발현은 간 세포에 특이적으로 작동하지만, 유비쿼터스 프로모터인 CMV 및 EF1α보다 낮은 전사 활성을 가지는 것으로 확인되었다.

따라서, 간 질환의 유전자 치료를 위해서는 간세포 특이적이면서도 전사 활성이 더 높은 프로모터 시스템이 필요하다.

본 발명자들은 간 세포 특이적이면서도 유전자 전사 활성 및 단백질 발현 효율이 더 높은 프로모터에 대하여 연구하던 중, 기존 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터가 갖던 단점을 우수하게 개선한 융합 프로모터를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 융합 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 거대 세포 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 인핸서의 전체 또는 이의 일부 서열; 및 서열번호 2로 표시되는 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터의 전체 또는 이의 일부 서열;이 작동가능하게 연결된 융합 프로모터를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여, 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 발현된 목적 단백질을 수득하는 단계;를 포함하는 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 TBG 프로모터와 CMV 인핸서를 결합시킨 융합 프로모터는 간 세포에 특이적으로 발현하며 기존 TBG 프로모터 단독으로 작용할 때보다 유전자 전사 효율과 단백질의 발현이 현저히 증가된 것을 확인한 바, 본 발명에 따른 융합 프로모터는 기존 TBG 프로모터가 가진 단점을 우수하게 개선한 프로모터이므로 이를 간 질환 유전자 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 융합 프로모터 및 비교군(CMV 인핸서+CMV 프로모터 또는 TBG 프로모터 단독)의 평가를 위해 GFP 유전자가 결합된 재조합 벡터를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 융합 프로모터의 간 세포 특이적 발현을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 융합 프로모터의 간 유래 정상세포에서의 GFP 단백질 발현 및 mRNA 전사 효율을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 융합 프로모터의 간 유래 정상세포에서의 GFP 단백질 발현 강도를 형광활성세포분류기(fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 융합 프로모터와 비교군(조직 특이적 발현 특성의 다른 프로모터와 CMV 인핸서를 결합한 융합 프로모터)의 평가를 위해 GFP 유전자가 결합된 재조합 벡터의 조직 특이성을 평가한 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 거대 세포 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 인핸서의 전체 또는 이의 일부 서열; 및 서열번호 2로 표시되는 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터의 전체 또는 이의 일부 서열;이 작동가능하게 연결된 융합 프로모터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 “프로모터(promoter)”는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다.

본 발명에서, 상기 “인핸서(Enhancer)”란 전사 개시 복합체의 다른 단백질과 결합하여 그것의 관련 프로모터에 의해 진행되는 전사 개시를 촉진하는 서열이다.

본 발명은 특히 CMV 인핸서와 TBG 프로모터를 결합하여 제작한 융합 프로모터로서, 간 세포에 특이적으로 작동하지만 유비쿼터스 프로모터인 CMV 및 EF1α보다 낮은 전사 활성을 가지는 것으로 알려진 TBG 프로모터의 단점을 우수하게 개선한 특징이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 CMV 인핸서와 TBG 프로모터가 결합된 융합 프로모터는 간 유래 정상 세포 또는 암 세포에서만 우수한 유전자 전사 효율과 단백질의 발현을 보여주었고, 이는 TBG 프로모터 단독 효율보다 우수하였다.

특히 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 CMV 인핸서를 TBG 외 다른 조직 특이적 발현의 특성을 지닌 프로모터와 결합하는 경우, 기존 보유한 조직 특이적 발현의 특성이 소멸되는 것을 확인한 바, 본 발명의 CMV 인핸서와 TBG 프로모터 결합은 기존 보유한 조직 특이적 발현 특성을 유지할 수 있는 유의성있는 결합인 것을 확인하였다.

따라서 본 발명에 따른 융합 프로모터는 다른 조직에서는 유전자의 발현을 유도하지 않으면서 간 또는 간 유래 세포에서 특이적으로 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터인 것을 특징으로 한다. 상기 간 유래 세포는 정상세포 및 암 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 프로모터에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 CMV 인핸서 또는 서열번호 2로 표시되는 TBG 프로모터는 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 거대 세포 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 인핸서의 전체 또는 이의 일부 서열과 상기 서열번호 2로 표시되는 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터의 전체 또는 이의 일부 서열은 서열번호 3으로 표시되는 링커로 결합되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 융합 프로모터는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하며, 상기 서열번호 4의 염기서열 뿐만 아니라 상기 서열번호 4의 염기서열의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서 간 또는 간 유래 세포에 특이적으로 프로모터 활성을 나타내는 염기서열을 포함한다.

또한 상기 서열번호 4의 염기서열 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 서열번호 4의 염기서열 및 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 서열번호 4의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 서열번호 4의 염기서열 및 이를 구성하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 서열번호 4의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 적재물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 CMV 인핸서 및 TBG 프로모터가 결합된 융합 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 다운스트림(downstream) 쪽으로 목적 단백질을 코딩하는 염기서열인 목적 유전자를 삽입함으로써 제조할 수 있다. 이에 추가적으로 전사 종결 서열이 도입된 형태일 수 있다.

본 발명의 벡터는 개체 또는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며 본 발명에 사용될 수 있는 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터 및 아그로박테리움 벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있으며, 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(Lentivirus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

그러나 당업자라면 본 발명의 융합 프로모터 및 상기 융합 프로모터로 발현하고자 하는 목적 유전자의 염기 서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 pAAV 벡터를 이용하여 본 발명의 융합 프로모터(eTBG)를 포함하는 pAAV eTBG:GFP를 제조하였다.

본 발명에서, 상기 "다운스트림(downstream)"은 참고 뉴클레오티드 서열의 3' 쪽에 위치한 뉴클레오티드 서열을 말한다. 구체적으로, 다운스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 개시 포인트 뒤에 오는 서열과 일반적으로 관련된다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 개시 부위의 다운스트림에 위치한다.

본 발명에서, 상기 "목적 유전자"는 목적하는 생성물을 암호화하는 일정 길이의 핵산 서열로서 정의될 수 있다. 목적하는 생성물은 그 자체가 생물학적으로 활성인 단백질이다. 이러한 목적 유전자는 일반적으로 센스 방향으로 벡터 내에 존재할 것이지만, 특정 유전자를 불활성화시키기 위하여 안티센스 방향으로 존재할 수도 있다. 목적 유전자가 생물학적으로 활성인 단백질을 암호화하는 유전자라면 그 유전자는 통상 코딩서열은 반드시 포함할 것이며, 5' 비번역리더서열(5'UTR), 3'비번역서열(3'UTR) 및 인트론(Intron)을 포함할 수 있다. 또한 목적 유전자는 절단된 형태의 단백질, 융합된 형태의 단백질, 태그된 형태의 단백질을 암호화하는 서열일 수 있으며, cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있고, 천연 형태의 생성물을 암호화하는 서열이거나 원하는 돌연변이 형태의 생성물을 암호화하는 서열일 수 있다. 이러한 목적 유전자는 그 목적 생성물이 인간에게 직·간접적으로 유용한 것이라면 임의의 것이라도 무방하다. 또한 이러한 목적 유전자는 임의의 것으로부터 기원할 수 있는데, 예컨대 식물, 세균, 동물, 바이러스 등으로부터 기원할 수 있다.

본 발명에서 상기 "목적 유전자의 발현"은 상기 목적 유전자를 발현시켜 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 생산하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서 목적 유전자를 발현하는 방법은 상기 목적 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체(숙주 세포)를 배양하여 상기 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키는 방법일 수 있으며, 이를 통해 상기 단백질이 관여되는 생합성 경로의 최종산물을 제조할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 상기 목적 유전자에 작동가능하게 연결된 조절 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조절 핵산서열은 그것에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사/번역에 영향을 줄 수 있는, 전사 개시 부위의 상류 또는 하류에 존재하는 임의의 핵산서열을 말한다. 예컨대 인핸서, 전사를 조절하기 위한 오퍼레이터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위, 복제 개시점, 전사 종결 서열 등을 말한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 형질전환된 숙주 유기체의 선별을 가능 또는 용이하게 하기 위하여 선택 마커 유전자를 하나 이상 포함하거나, 발현시키고자 하는 목적 유전자의 발현 여부를 정성적·정량적으로 분석하기 위하여 리포터 유전자를 하나 이상 포함할 수 있다. 이러한 선택 마커 유전자나 리포터 유전자는 전술한 바와 같이 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있다.

따라서 본 발명의 재조합 벡터는 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin) 및 네오마이신(neomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "항생제 저항성 유전자"는 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 발명에서 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 “리포터 유전자(또는 검출용 유전자)"는 상기 유전자의 효과에 기초하여 동정될 수 있는 동정하는 인자를 코딩하는 염기를 말하며, 여기서 상기 효과는 관심 염기의 유전을 추적하거나 관심 염기를 물려 받은 세포나 유기체를 동정하기 위해, 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위해 사용된다. 공지되고 당해 기술에서 사용되는 리포터 유전자의 예는 하기를 포함한다: 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)과 같은 형광 단백질, 루시퍼라제(Luciferase, Luc)와 같은 발광 단백질, 클로로암페니콜 아세틸전이효소(Chloramphenicol acetyltransferase, CAT), 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase, LacZ), 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase, Gus) 등.

더불어 상기 목적 유전자가 특정 질환의 치료를 위한 유전자라면, 본 발명의 융합 프로모터가 갖는 간 또는 간 유래 세포에 대한 특이적 발현 특성을 기반으로 상기 치료 유전자의 표적화를 위하여 사용될 수 있다.

즉 본 발명에 따른 CMV 인핸서 및 TBG 프로모터가 결합된 융합 프로모터가 삽입된 재조합 벡터에, 발현시키고자 하는 치료 유전자가 포함된 형태의 유전자 전달체로 제공될 수 있다.

상기 유전자 전달체는 당 분야에 알려진 유전자 치료를 위한 것이라면 제한없이 사용 가능하며, 바람직하게는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adenoassociated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 폴리머, 리포좀 또는 니오좀일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 다른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "형질전환"은 DNA의 세포내로의 도입을 말한다. 도입된 DNA는 일반적으로 DNA가 삽입된 조각을 함유하는 벡터의 형태이다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종, 또는 숙주 세포와는 상이한 종으로부터 기원할 수 있거나, 또는 이는 숙주 종으로부터 기원한 일부 DNA 및 일부 외부 DNA를 함유하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.

본 발명의 융합 프로모터 또는 상기 융합 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주세포내로 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl₂) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법 (electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 융합 프로모터가 갖는 간 또는 간 유래 세포에 대한 특이적 발현 특성을 기반으로 상기 세포는 간 유래 세포인 것이 바람직하며, 상기 간 유래 세포는 간 유래 정상세포 및 암 세포를 포함한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여, 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.

더불어 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 발현된 목적 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적 단백질 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "배양"은 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 상기 세포는 통상의 배지에서 생육 가능하다. 배지는 특정 세포를 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 융합 프로모터 제조

간 세포 특이적이면서도 효능을 증가시킨 프로모터를 위하여, CMV 인핸서 영역(서열번호 1로 표시)을 기존 간세포 특이적 유전자 발현을 위하여 사용하던 TBG 프로모터 영역(서열번호 2로 표시)의 앞에 링커(서열번호 3으로 표시)로 결합하여 융합 프로모터(eTBG로 기재)를 제작하였다(서열번호 4로 표시).

구체적인 서열 정보는 하기 표 1과 같다.

명칭	염기서열(5‘→3’	서열번호
CMV 인핸서	CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG	1
TBG 프로모터	GCATGTATAATTTCTACAGAACCTATTAGAAAGGATCACCCAGCCTCTGCTTTTGTACAACTTTCCCTTAAAAAACTGCCAATTCCACTGCTGTTTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGCTGCCTCTTGGTGCTTTTGCCTATGGCCCCTATTCTGCCTGCTGAAGACACTCTTGCCAGCATGGACTTAAACCCCTCCAGCTCTGACAATCCTCTTTCTCTTTTGTTTTACATGAAGGGTCTGGCAGCCAAAGCAATCACTCAAAGTTCAAACCTTATCATTTTTTGCTTTGTTCCTCTTGGCCTTGGTTTTGTACATCAGCTTTGAAAATACCATCCCAGGGTTAATGCTGGGGTTAATTTATAACTAAGAGTGCTCTAGTTTTGCAATACAGGACATGCTATAA	2
링커	GTACCGCTAGCAAGCTT	3
eTBG 프로모터	CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTACCGCTAGCAAGCTTGCATGTATAATTTCTACAGAACCTATTAGAAAGGATCACCCAGCCTCTGCTTTTGTACAACTTTCCCTTAAAAAACTGCCAATTCCACTGCTGTTTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGCTGCCTCTTGGTGCTTTTGCCTATGGCCCCTATTCTGCCTGCTGAAGACACTCTTGCCAGCATGGACTTAAACCCCTCCAGCTCTGACAATCCTCTTTCTCTTTTGTTTTACATGAAGGGTCTGGCAGCCAAAGCAATCACTCAAAGTTCAAACCTTATCATTTTTTGCTTTGTTCCTCTTGGCCTTGGTTTTGTACATCAGCTTTGAAAATACCATCCCAGGGTTAATGCTGGGGTTAATTTATAACTAAGAGTGCTCTAGTTTTGCAATACAGGACATGCTATAA	4

보다 구체적으로, CMV 인핸서는 애드진(Addgene)으로부터 분양받은 플라스미드 #61591을 주형으로 하여, 센스(sense) 5’-CGG TCT CTG TAC TCG TTA CAT AAC TTA CGG TAA ATG G-3’, 안티센스(antisense) 5‘-CAT GCA AGC TTG CTA GCG GTA CCA TGG TAA TAG CGA TGA CTA ATA C-3’의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 프라이머(primer)로 사용하여 Phusion DNA 중합효소(ThermoFisher에서 구매 #F553S)로 PCR하였다. TBG 프로모터는 애드진(Addgene)에서 분양받은 플라스미드 #61593을 주형으로 하여, 센스(sense) 5’-TAC CAT GGT ACC GCT AGC AAG CTT GCA TGT ATA ATT TCT ACA GAA CCT AT-3’, 안티센스(antisense) 5’- AAG GAT CCG TCG ACC GGT ATC TTT CCA TTT TTA TAG-3’의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 퓨전 DNA 중합효소로 PCR하였다. 더불어 상기 PCR로 증폭된 CMV 인핸서와 TBG 프로모터를 혼합한 후 센스(sense) 5’-CGG TCT CTG TAC TCG TTA CAT AAC TTA CGG TAA ATG G-3’, 안티센스(antisense) 5’- AAG GAT CCG TCG ACC GGT ATC TTT CCA TTT TTA TAG-3’의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 Phusion DNA 중합효소로 라이게이션 PCR(ligation PCR)하여 융합 프로모터 eTBG를 제작하였다.

실시예 2. 벡터의 제조

간 세포 특이성과 유전자 발현 강도를 평가하기 위하여, 도 1과 같이 GFP(Green fluorescent protein)를 발현할 수 있는 pAAV(Adeno-Associated Virus) 벡터의 GFP 염기서열의 앞에 위치한 프로모터 영역에 각각 CMV(인핸서+프로모터)가 삽입된 벡터(CMV:GFP로 기재), TBG 프로모터가 삽입된 벡터(TBG:GFP로 기재) 및 본 발명의 eTBG 프로모터가 삽입된 벡터(eTBG:GFP로 기재)를 제작하였다.

먼저, pAAV-프로모터제외-SV40polyA(pAAV-promoterless-SV40polyA) 벡터는 애드젠에서 분양받은 플라스미드 #61591을 주형으로 하여, 센스(sense) 5’- GGA TCC GCG GCC GCA GAT CCG CGT GCA GGA ACC CCT AGT GAT GGA GTT GGC CAC T-3’, 안티센스(antisense) 5’- GGT ACC ACT AGA GGC CGC AGG AAC CCC TAG TGA TGG-3’의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 Phusion DNA 중합효소로 PCR하였다. PCR로 증폭된 선형의 DNA는 T4 DNA 라이게이즈(ligase)를 이용하여 환형 플라스미드로 전환하였다. 다음에는 BamHⅠ과 NotⅠ의 제한효소(NEB에서 구매)로 플라스미드를 선형화한 후, 하기 표 2의 MCS-SV40polyA-1에서 -3까지의 상보적으로 결합된 DNA 조각들과 혼합하고 T4 DNA 라이게이즈(ThermoFisher에서 구매)를 이용하여 환형 플라스미드로 결합하였다.

pAAV-CMV-SV40polyA 벡터는 다음과 같이 제작되었다. 먼저 애드젠에서 분양받은 플라스미드 #61591을 주형으로 하여, 센스(sense) 5’-CGG TCT CTG TAC TCG TTA CAT AAC TTA CGG TAA ATG G-3’, 안티센스(antisense) 5‘-GAT GGA TCC GTC GAC CGG TAG TTA GCC AGA GAG CTC TGC TTA TAT AGA-3’의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 Phusion DNA 중합효소로 PCR하여 제작된 CMV 프로모터에 BsaⅠ과 BamHⅠ의 제한효소(NEB에서 구매)를 처리한 후, KpnⅠ과 BamHⅠ의 제한효소(NEB에서 구매)로 선형화한 상기 pAAV-promoterless-SV40polyA 벡터와 혼합한 후 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 환형 플라스미드로 결합하여 제작하였다.

더불어 pAAV-TBG-SV40polyA 벡터는 앞에서 설명한 과정으로 제작된 TBG 프로모터에 KpnⅠ과 BamHⅠ의 제한효소를 처리한 후, KpnⅠ과 BamHⅠ의 제한효소로 선형화한 상기 pAAV-promoterless-SV40polyA 벡터와 혼합한 후 T4 DN ligase를 이용하여 환형 플라스미드로 결합하여 제작하였다.

또한 pAAV-eTBG-SV40polyA 벡터는 앞에서 설명한 과정으로 제작된 eTBG 융합 프로모터에 BsaⅠ과 BamHⅠ의 제한효소를 처리한 후, KpnⅠ과 BamHⅠ의 제한효소로 선형화한 상기 pAAV-promoterless-SV40polyA 벡터와 혼합한 후 T4 DNA ligase를 이용하여 환형 플라스미드로 결합하여 제작하였다.

그리고 GFP는 애드젠으로부터 분양받은 플라스미드 #11680을 주형으로 하여, 센스(sense) 5’-TTA GAT CTA CCA TGG TGA GCA AGG GCG AGG A-3’, 안티센스(antisense) 5’-TTG AAT TCC CGG ATC CCT TGT ACA GCT CGT CCA T-3’의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 프라이머로 사용하여 Phusion DNA 중합효소로 PCR하여 제작하였다.

최종적으로 상기에서 제작한 pAAV-CMV-SV40polyA, pAAV-TBG-SV40polyA, pAAV-eTBG-SV40polyA의 세 가지 벡터 각각을 BamHⅠ과 EcoRⅠ으로 선형화한 후, BglⅡ와 EcoRⅠ의 제한효소를 처리한 GFP와 혼합하고 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 환형 플라스미드로 결합하여 CMV:GFP, TBG:GFP 및 eTBG:GFP를 제작하였다.

실시예 3. 조직 특이성 및 발현 강도 평가

3.1 간 유래 세포 및 타조직 유래 세포에서의 평가

프로모터에 의한 GFP 발현에 있어서, 조직 특이성과 발현 강도를 평가하기 위하여 세포실험을 진행하였다. 모든 세포는 온도 37℃와 CO₂ 농도가 5%로 일정하게 유지되는 세포 배양기에서 ATCC(American Type Culture Collection) 권장 배지에 배양하였다.

본 발명에 따른 eTBG 프로모터의 조직 특이성을 평가하기 위하여, 간 세포인 HepG2, Hepa1c1c-7와 섬유아세포 NIH3T3, 사람 태아 신장세포인 HEK293을 이용한 실험을 진행하였다. 각각의 세포주에 5 μg의 eTBG:GFP를 형질주입하였고, 48시간 후 GFP 항체(Santa Cruz, sc-9996)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 조직 특이성을 평가하였다.

벡터의 형질주입을 위하여 500 μl의 Opti-MEM 배지(media)에 20 μg의 L-PEI(Linear-Polyethylenimine; Sigma-Aldrich에서 구매)와 5 μg의 eTBG:GFP를 넣고 잘 교반하여, 30분 반응시간을 거친 후 세포에 처리하였다. 48시간 후 웨스턴 블롯팅을 시행하기 위해 RIPA 버퍼(Radioimmunoprecipitation assay buffer; ThermoFisher에서 구매)를 처리함으로서 세포를 용해하여 단백질을 추출한 후, BCA(Bicinchoninic acid) 단백질 분석(Biorad에서 구매)을 통해 단백질 농도를 정량하였다. 이 후 세포 용해물 내에 존재하는 여러 단백질을 크기에 따라 분리하기 위하여 10% 아크릴아마이드(Acrylamide) 겔을 만들어 전기영동을 시행하였다. 겔에 존재하는 분리된 단백질들을 나이트로셀룰로오스 멤브레인(Nitrocellulose membrane; ThermoFischer에서 구매)으로 옮긴 후, 최종적으로 GFP 항체(Santa Cruz에서 구매, sc-9996)를 이용하여 GFP의 단백질양을 비교함으로써 조직 특이성을 평가하였다.

그 결과 도 2와 같이, 본 발명에 따른 eTBG 프로모터에 의한 GFP 발현은 인간 간암세포인 HepG2와 생쥐 간암세포인 Hepa1c1c7에서만 나타났으며, 인간태아 신장세포인 HEK293과 생쥐 섬유아세포인 NIH3T3에서는 발현되지 않아서 eTBG의 전사 활성은 간 세포 특이적인 것을 확인할 수 있었다.

3.2 간 유래 세포에서 eTBG의 발현 강도 평가

더불어 간 유래 세포(HepG2, Hepa1c1c-7 또는 Hepa1-6)에 상기 실시예 2에서 제조한 세 가지 종류의 벡터(CMV:GFP, TBG:GFP 또는 eTBG:GFP)를 형질주입하였다. 각각의 벡터를 5 μg씩 형질주입하여 48시간 뒤 웨스턴 블롯팅과 qRT-PCR을 통해 발현 강도를 평가하였다.

웨스턴 블롯팅은 상기 3.1에 기재된 방법과 동일하게 수행하였으며, qRT-PCR은 하기와 같이 수행하였다.

형질주입된 Hepa1-6 세포로부터 RNA를 추출하기 위하여 TRIzol (Invitrogen에서 구매, 15596-018)을 사용하였다. 추출된 RNA를 Oligo dT와 역전사효소(Promega에서 구매, M1701), dNTP와 함께 반응시켜 cDNA로 전환시켰다. 이 후 cDNA를 이용한 유전자 증폭을 위해 RealHelix™ qPCR kit (Nanohelix에서 구매, QP2-S500)를 사용하였으며, 각 유전자에 대한 primer 서열은 다음과 같다. GFP 프라이머(센스(sense) 5’-CCCGACAACCACTACCTGAG-3’, 안티센스(antisense) 5’-TTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’)와 생쥐 18S 리보솜의 RNA(Mus Musculus 18S ribosomal RNA) 프라이머(센스(sense) 5’-GCAATTATTCCCCATGAACGAGG-3’, 안티센스(antisense) 5’-GGCCTCACTAAACCATCCAATC-3’).

모든 실험에 사용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 바이오닉스(Bionicss)에서 주문하여 합성하여 사용하였다.

간 유래 세포주인 Hepa1c1c-7, HepG2, Hepa1-6에 각각의 벡터를 형질주입한 후 GFP 발현 정도를 단백질 수준에서 평가한 결과 도 3 중 A 및 B와 같이, 본 발명에 따른 eTBG 프로모터를 형질주입한 경우 CMV보다는 약하지만, TBG 단독 실험군과 비교하였을 때 그 강도가 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

더불어 간 세포 Hepa1-6에 각각의 벡터를 형질주입한 후 GFP 발현 정도를 RNA 수준에서 평가한 결과 도 3 중 C와 같이, 본 발명에 따른 eTBG 프로모터에 의한 GFP mRNA의 수준이 TBG 프로모터와 비교하였을 때 현저하게 증가되어 있는 것을 확인하였다.

추가적으로 형광활성세포분류기(fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 벡터의 효율을 평가하였다. 간세포 Hepa1-6에서 각각의 벡터를 형질주입한 후, 48시간 뒤 분석을 진행하였다. 이때 각 벡터의 형질주입 효율을 보정하기 위한 값을 도출하기 위하여, pCS2B TaqBFP 벡터도 형질주입하였고 BFP+GFP+/BFP의 비율을 평가 기준으로 확립하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 각 프로모터에 의한 GFP 발현 비율은 CMV 프로모터는 77.99%, 본 발명에 따른 eTBP 프로모터는 55.10%, TBG 프로모터는 1.22%로 상기 웨스턴 블롯팅 및 qRT-PCR과 유사한 패턴의 결과를 얻었다.

따라서 본 발명에 따른 eTBP 프로모터는 간 세포에 있어서 기존 TBG 프로모터 단독보다 유전자 전사 효율과 단백질의 발현이 현저히 증가되었음을 확인하였다.

실시예 4. eTBG 프로모터 특이성 확인

CMV 인핸서와 TBG 프로모터를 결합한 융합 프로모터의 특이성을 확인하기 위하여, TBG 프로모터 외 조직 특이적 발현을 보임이 공지된 다른 프로모터와 상기 CMV 인핸서를 결합하여 효능을 확인하였다. 이를 위하여 골수계세포, 성상세포 또는 심근세포에서 특이적으로 작용한다고 알려진 CD68, GFAP(glial fibrillary acidic protein) 및 TNT4(Troponin T2 cardiac type, promoter 4) 프로모터 앞에 CMV 인핸서를 추가한 벡터를 상기 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법으로 제작하였다(도 5 중 A).

본 발명의 융합 프로모터를 포함한 벡터(eTBG:GFP)와 비교군(CMV:GFP, eCD68:GFP, eGRAP:GFP, eTNT4:GFP)의 조직 특이성을 평가하기 위하여, 섬유모세포주인 NIH3T3 세포주에 상기 벡터들을 형질주입하고 GFP의 발현을 역상형광현미경(Nikon, Eclipse Ti-S)의 녹색 형광 필터를 통해 확인한 후, 100배의 배율로 이미지를 촬영하였다. 이 후 상기 실시예 3과 동일한 방식으로 qRT-PCR을 시행하였다.

그 결과 도 5 중 B 및 C와 같이, 본 발명에 따른 eTBG 프로모터의 경우 간세포가 아닌 섬유모세포에서는 발현이 거의 나타나지 않아서 조직 특이성이 단백질 및 mRNA 수준에서 유지되고 있음을 확인하였다. 그러나 eTBG를 제외한 다른 비교군 프로모터들은 발현되지 않아야 할 섬유모세포주인 NIH3T3 세포에서 발현이 확인되고 있으므로, 조직 특이성이 손실되었음을 알 수 있었다.

따라서, 인핸서와 조직 특이적 프로모터를 결합시킨 융합 프로모터에 있어서, 그 발현 강도가 강해졌다하더라도 기존 보유한 조직 특이성이 손실될 수도 있음을 확인하였다.

그러므로 본 발명에 따른 CMV 인핸서와 TBF 프로모터가 결합된 융합 프로모터는 간에서의 유전자 전사 효율 및 단백질 발현 효능이 매우 우수하게 증가되었을 뿐만 아니라 기존 보유한 조직 특이성이 손상되지 않아, 간 또는 간 유래 세포에서 우수한 특이적 발현을 보일 수 있는 프로모터임을 상기 실시예들을 통하여 확인하였다.

종합적으로 본 발명에 따른 TBG 프로모터와 CMV 인핸서를 결합시킨 융합 프로모터는 간 세포 특이적인 발현을 보이며 기존 TBG 프로모터 단독으로 작용할 때보다 유전자 전사 효율과 단백질의 발현이 현저히 증가된 것을 확인한 바, 본 발명에 따른 융합 프로모터는 기존 TBG 프로모터가 가진 단점을 우수하게 개선한 프로모터이므로 이를 간 질환 유전자 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Fusion promoter for tissue-specific expression, and use Thereof <130> 1-423P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 304 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV enhancer <400> 1 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catg 304 <210> 2 <211> 409 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBG promoter <400> 2 gcatgtataa tttctacaga acctattaga aaggatcacc cagcctctgc ttttgtacaa 60 ctttccctta aaaaactgcc aattccactg ctgtttggcc caatagtgag aactttttcc 120 tgctgcctct tggtgctttt gcctatggcc cctattctgc ctgctgaaga cactcttgcc 180 agcatggact taaacccctc cagctctgac aatcctcttt ctcttttgtt ttacatgaag 240 ggtctggcag ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct 300 cttggccttg gttttgtaca tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt 360 aatttataac taagagtgct ctagttttgc aatacaggac atgctataa 409 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 gtaccgctag caagctt 17 <210> 4 <211> 730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eTGB promoter <400> 4 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catggtaccg ctagcaagct tgcatgtata atttctacag aacctattag aaaggatcac 360 ccagcctctg cttttgtaca actttccctt aaaaaactgc caattccact gctgtttggc 420 ccaatagtga gaactttttc ctgctgcctc ttggtgcttt tgcctatggc ccctattctg 480 cctgctgaag acactcttgc cagcatggac ttaaacccct ccagctctga caatcctctt 540 tctcttttgt tttacatgaa gggtctggca gccaaagcaa tcactcaaag ttcaaacctt 600 atcatttttt gctttgttcc tcttggcctt ggttttgtac atcagctttg aaaataccat 660 cccagggtta atgctggggt taatttataa ctaagagtgc tctagttttg caatacagga 720 catgctataa 730

Claims (10)

1. 서열번호 1로 표시되는 거대 세포 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 인핸서; 및 서열번호 2로 표시되는 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터가 작동가능하게 연결된 융합 프로모터로서,
   상기 융합 프로모터는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는, 융합 프로모터.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 서열번호 1로 표시되는 거대 세포 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 인핸서와 상기 서열번호 2로 표시되는 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터는 서열번호 3으로 표시되는 링커로 결합되는 것을 특징으로 하는, 융합 프로모터.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 융합 프로모터는 간 또는 간 유래 세포에서 특이적으로 발현되는 것을 특징으로 하는, 융합 프로모터.
   
5. 제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 따른 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
   
6. 제 5항에 있어서,
   상기 재조합 벡터는 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin) 및 네오마이신(neomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
7. 제 5항의 재조합 벡터로 형질전환된 분리된 숙주 세포.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 세포는 간 유래 세포인 것을 특징으로 하는 분리된 숙주 세포.
   
9. 제 5항의 재조합 벡터를 분리된 숙주 세포에 형질전환하여, 분리된 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현시키는 방법.
   
10. 제 7항에 따른 분리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 발현된 목적 단백질을 수득하는 단계;를 포함하는 목적 단백질 제조방법.