CN109929865B - 基于gal4-uas系统的crispr辅助反式增强子激活基因表达的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于GAL4‑UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法及其应用，该激活基因表达的方法通过CRISPR‑GAL4‑UAS系统将增强子DNA反式募集到靶基因上，依靠反式增强子DNA本身以及反式增强子DNA与CRISPR系统的互作，激活靶基因表达。本发明通过对常规dCas9的改造发展了一种捕获dCas9(cdCas9)；借助cdCas9/sgRNA复合物中cdCas9融合GAL4与带UAS序列的巨细胞病毒(CMV)增强子DNA的结合，将CMV增强子反式募集到靶基因上，高效激活靶基因的表达；本发明的方法在生物医学中具有广泛应用价值，可以应用在制备生物检测及治疗试剂中。

Description

基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的 方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于GAL4-UAS系统的 CRISPR辅助的反式增强子激活基因表达的方法及其应用。

背景技术

人工激活基因的表达在基础生物学研究和生物医学应用中具有重要作用。例如，基因的功能往往是通过在基础研究中人工激活其在细胞或体内的表达来探索的。在生物医学中，通常需要通过激活内源基因将细胞重编程为诱导干(iPS) 细胞或其他分化细胞。在医学上，癌症可以通过抑制各种激酶，激活增强免疫力，细胞凋亡和分化的相关基因来治疗。因此，各种人工基因激活剂已经被开发。例如，激活域融合锌指(ZF)，转录激活物样效应因子(TALE)和成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白已经开发用于基因激活。在这些蛋白质和复合物中，CRISPR相关(Cas)蛋白因其简单性而被广泛使用。

CRISPR最初是一种细菌免疫系统，通过酶消化侵入的噬菌体DNA。该系统已经发展成为高效的基因编辑工具。此外，该系统也被开发成为一种新型的基因调控工具。例如，灭活的Cas9(dCas9)及其相关的单链向导RNA(sgRNA) 在近年来被最广泛地用于调节基因表达。所以，dCas9和sgRNA已被广泛用于激活或抑制基因表达。例如，dCas9蛋白与各种基因激活或阻遏结构域如VP48， VP160，VP64，VPR(VP64-p65-Rta)和KRAB融合。此外，dCas9蛋白还与具有转录调控功能的其他功能域融合，如p300，LSD1，Dnmt3a和Tet1。基于这些结构域，已经开发出更多精心设计的活化剂用于更有效地激活哺乳动物细胞中的靶基因，如SunTag(dcas9-GCN4/sgRNA加scFV-VP64)和SPH (dCas9-GCN4/sgRNA加scFV-p65-HSF1)。更复杂的一些诱导型dCas9系统已经开发用于控制细胞中dCas9激活剂的活性，例如光激活的CRISPR/Cas9效应因子，混合药物诱导型CRISPR/Cas9技术(HIT)和通过基于人抗体的化学诱导二聚体(AbCID)门控的CRISPR活化剂.这些典型的dCas9融合蛋白在其体内应用受到限制是它们很难被腺相关病毒(AAV)包装，AAV是一种最适合非整合型基因治疗载体的类型，但是其包装能力有限。

除了设计dCas9之外，sgRNA还被设计用于开发新的基于dCas9的激活剂。与dCas9工程相比，sgRNA可以被更加简单，灵活且高效地重新设计。此外，由于其有限的病毒包装长度，工程化的sgRNA更有助于基于dCas9的活化剂在体内的应用。最广泛使用的工程化sgRNA是在3'末端与s2环(sgRNA-MS适体) 融合的sgRNA，可以与转录激活结构域VP64-HSF1融合的二聚化MS2噬菌体外壳蛋白结合(MS2-VP64-HSF1，MPH)。该系统现在被称为协同活化介质(SAM) 系统。类似地，另一种基于sgRNA的dCas9激活剂被开发，命名为Casilio系统，由dCas9蛋白组成，sCRNA附加有RNA结合蛋白Pumilio/FBF(PUF)的一个或多个结合位点(sgRNA-PBS)以及与PUF结构域(PUF融合体)融合的效应子(例如VP64和p65-HSF1)。以相同的方式，通过延伸sgRNA构建模块化支架RNA编码目标基因座和调节作用，包括效应子蛋白募集位点。对于这些募集 RNA模块，充分表征的病毒RNA序列MS2，PP7和com分别由MCP，PCP和 Com RNA结合蛋白识别。转录激活结构域VP64与每种相应的RNA结合蛋白融合。通过延伸sgRNA包括识别特定信号的修饰的核糖开关，创建了基于 CRISPR-Cas9的“信号导体”，调节内源基因的转录对应感兴趣的外源或内源信号 (比如药物)。显然，这些嵌合sgRNA受其长的复合RNA适体和同源RNA结合融合蛋白的限制。

尽管已经开发了基于变体dCas9的激活剂，但目前基于dCas9的转录激活剂在内源性基因激活和重编程方面仍然是低效的。通过系统地比较它们在不同细胞类型和物种(人，小鼠，和果蝇)，发现与dCas9-VP64相比，大多数第二代活化剂显示出显著的活化水平，其中三种活化剂包括VPR，SAM和Suntag是最有效的。在各种目标基因和细胞环境中，VPR、SAM和Suntag系统始终优于以前的VP64。此外，就基因表达的倍数增加而言，VPR、SAM和Suntag一般落入彼此的数量级之内。更重要的是，尝试通过融合VPR、SAM和Suntag来构建改进的嵌合活化剂是不成功的。因此，未来通过探索其他独特的结构或新的活化区域来改善基于dCas9的活化剂。

基因激活对基础生物学研究和生物医学至关重要。因此，各种基因激活剂被开发，例如激活域的融合锌指(ZF)、转录激活剂样效应因子(TALE)和成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白质，其中CRISPR蛋白质灭活Cas9 (dCas9)因其优点而被广泛使用。然而，目前的基因激活剂仍然受到其低效基因活化活性的限制。

GAL4是一个酵母(Saccharomyces cerevisiae)转录激活因子。上游激活序列(upstream active sequence，UAS)是酵母中一种类似高等真核生物增强子的序列。GAL4能识别基因启动子的UAS中17bp长的一段序列 5'-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3'(R表示嘌呤、Y表示嘧啶、N表示任意脱氧核苷酸)。GAL4与原核生物乳糖操纵子相似，在酵母中GAL4与UAS结合可以调节与半乳糖代谢相关基因的表达。Gal4具有两个结构域：DNA结合结构域(N末端结构域)和激活结构域(C末端结构域)。其具有一个锌簇结构域(Zinc cluster)，具体为Zn(2)-Cys(6)双核簇结构域。其起作用的形式常为同源二聚体。 GAL4/UAS系统被用于基因表达研究的一个有效工具。例如，Gal4可以结合 GAL1基因上游的4个UASg，当出现半乳糖后，GAL4的结合可以使GAL1的表达增加约1000倍。虽然这是一个起源于酵母的调控系统，但是经过几代科学家的努力，这个系统最早是在果蝇(Drosophila)中建立，后来在小鼠、家蚕、爪蟾、斑马鱼、拟南芥(Arabidopsis)等模式生物中。结合各种信号分子，已成为研究中的明星。UAS/GAL4系统被广泛地应用为一种果蝇遗传学异位表达系统。双元表达系统是其中一个途径，它能够很好地控制转殖基因在模式生物中的表达。在果蝇中，典型的双元表达系统是GAL4-UAS，这个系统中的酵母转录因子基因GAL4受特定启动子控制。反过来，GAL4可以激活另一个包含上游活化序列(UAS)的外源插入基因。此双元表达系统可以进一步被GAL4抑制子——GAL80所调控。目前，UAS/GAL4系统已被广泛用于合成生物学中，成为控制基因表达的重要工具。

大约三十年前，人类巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子(以下简称CMV 增强子)被发现是一种具有高转录活性的天然哺乳动物启动子。后来的研究逐渐发现，在各种哺乳动物细胞中，CMV增强子是已知的最强启动子。因此，这种增强子已被广泛用于驱动各种基因在哺乳动物细胞中的异位表达。例如，CMV 增强子也被用于激活转基因动物的广泛组织中的外源基因的异位表达，基因工程产生蛋白质和人类基因治疗。我们最近通过改变该增强子中的天然NF-κB结合位点为人工选择具有高结合亲和力的NF-κB结合序列，来进一步改善CMV增强子的转录活性。

增强子(enhancer)是基因组中的一段DNA序列，距离其所调控的基因位置较远，上面有转录因子的结合靶点。增强子所在的DNA可通过弯曲形成环 (loop)结构使增强子上结合的转录因子与启动上结合的转录机器(由通用转录因子与RNA聚合酶)相互作用，促进基因的表达。由于增强子调控其靶基因是通过DNA共线性(即在一条DNA链上)实现，因此增强子是典型的顺式(cis) 调控元件。而转录因子等基因表达调控因子是通过与DNA结合实现其基因表达调控功能，因此转录因子是典型的反式(trans)调控因子。基于增强子对基因表达调控的机理，我们推测如果利用一种DNA结合蛋白将具有强转录激活活性的增强DNA锚定到靶基因启动子区，该种增强子DNA也许像基因组中的天然增强子一样激活基因表达。由于这种形式的增强子不与靶基因DNA共线，而是通过DNA结合蛋白募集到靶基因上，其作用方式类似转录因子的作用方式，因此我们将其称为反式增强子(trans enhancer)，以便区分于基因组中的天然顺式增强子(cis enhancer)。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法。本发明方法中将dCas9与 GAL4蛋白的DNA结合结构域相融合，发展了一种具有UAS序列结合能力的新型dCas9蛋白，被命名为捕获dCas9(capture dCas9，cdCas9)；该方法中还将可与GAL4结合的UAS序列与巨细胞病毒(CMV)增强子(简称CMV增强子) 连接在一起，形成UAS-CMV增强子。在细胞内经表达形成的 dCas9-GAL4/sgRNA复合物，既可以依靠sgRNA结合靶基因启动子区，同时可以依靠GAL4结合导入细胞的UAS-CMV增强子，从而将UAS-CMV增强子反式募集到靶基因启动子区；依靠UAS-CMV反式增强子本身，以及UAS-CMV 反式增强子与dCas9-GAL4/sgRNA复合物的相互作用激活靶基因的表达。

本发明还提供了一种基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于GAL4-UAS系统的 CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法，通过融合GAL4的CRISPR系统将带有UAS序列的增强子DNA反式募集到靶基因上，依靠带有UAS序列的反式增强子DNA本身，以及带有UAS序列的反式增强子DNA与结合GAL4的 CRISPR系统的互作，激活靶基因表达。

其中，所述CRISPR系统指CRISPR蛋白与其引导RNA(sgRNA)形成的可与靶DNA序列结合的复合物，可与靶DNA序列结合的复合物为死亡Cas9 (dCas9)蛋白与其sgRNA结合形成的复合物dCas9/sgRNA。

其中，所述CRISPR系统包括CRISPR蛋白表达载体与sgRNA表达载体、 CRISPR蛋白与sgRNA表达载体，或CRISPR蛋白与sgRNA。这些不同类型的分子或其表达产物可与反式增强子DNA经转染进入细胞，激活细胞内靶基因的表达。

其中，所述通过CRISPR-GAL4-UAS系统将增强子DNA反式募集到靶基因上，是指通过对dCas9的改造形成一种捕获dCas9(capture dCas9，cdCas9)，通过cdCas9蛋白与其sgRNA结合形成的复合物cdCas9/sgRNA，将增强子DNA反式募集到靶基因上。

其中，所述dCas9包括常规dCas9蛋白以及经过基因融合改造过的dCas9 蛋白；所述经过基因融合改造过的dCas9蛋白为融合各种激活域(AD)的dCas9 蛋白(dCas9-AD)。

进一步地，所述激活域(AD)包括VP64、VPR等。

其中，所述捕获dCas9为常规dCas9或dCas9-AD蛋白融合GAL4改造而成的一种新型dCas9蛋白；其中GAL4部分为其捕获序列，用以结合反式增强子 DNA。

作为优选，所述dCas9为融合GAL4的dCas9-VP64蛋白 (dCas9-VP64-GAL4)。

其中，所述GAL4为全长序列GAL4蛋白或GAL4的DNA结合结构域。

作为优选，GAL4为GAL4的DNA结合结构域。

其中，所述反式增强子DNA为一段末端带有一段UAS序列的增强子DNA；其中增强子DNA具有募集细胞内转录因子以激活基因表达的功能，而UAS序列具有与GAL4蛋白或GAL4的DNA结合结构域结合的功能。

其中，UAS序列为多个重复的GAL4结合靶点。

作为优选，UAS序列为5个重复的GAL4结合靶点。

作为优选，增强子DNA为人巨细胞病毒(CMV)增强子。

其中，所述sgRNA为常规引导RNA(sgRNA)或经改造的其他结构的 sgRNA。

进一步地，所述其他结构的sgRNA是指在常规sgRNA的5′端和/或3′端增加某种序列的sgRNA，如3′端增加MS结合序列的sgRNA。这种增加的序列不影响或经细胞内加工后不影响sgRNA与dCas9的结合以及dCas9/sgRNA复合物与靶DNA的结合。

本发明所述的基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法在制备生物检测及治疗试剂中的应用。

申请人申请过一项类似的基于CRISPR系统的基因激活专利，即“一种 CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法及其应用”(专利申请号： 201810935298.6)。在该专利中，通过对常规引导RNA(sgRNA)的改造发展了一种捕获sgRNA(csgRNA)；借助dCas9-AD/csgRNA复合物中csgRNA与带单链突出巨细胞病毒(CMV)增强子DNA的杂交，将CMV增强子反式募集到靶基因上，高效激活靶基因的表达。很明显，基于csgRNA-sCMV的反式增强子技术便于体外应用，例如体外细胞重编程和基因激活以获得功能。然而，基于 csgRNA-sCMV的反式增强子在体内应用中仍然面临困难。反式增强子使用线性 CMV增强子DNA片段，其具有与csgRNA的3'末端互补的单链突出端。除非用纳米颗粒基因载体与dCas9-VP64和csgRNA的表达载体一起转染体外预先制备的反式增强子，否则难以在体内细胞中产生这种反式增强子DNA。而且，这种基于csgRNA-sCMV的反式增强子不能借助目前最有效的体内转基因载体——病毒载体(例如腺相关病毒；AAV)进入人体内细胞，而AAV病毒载体已被FDA 批准用于人类遗传疾病的临床基因治疗。AAV是目前广泛使用的人类基因治疗的安全病毒载体。

为了解决这个问题，本发明中开发了基于GAL4-UAS系统的一种新策略，该策略使用了dCas9-VP64-GAL4、sgRNA和UAS-CMV三种组件。通过 dCas9-VP64-GAL4蛋白中GAL4和UAS之间的相互作用，将UAS-CMV增强子反式募集到靶向基因上，高效激活靶基因的表达。本发明发现线性和环形形式的 UAS-CMV增强子均可以被dCas9-VP64-GAL4募集到靶向基因上并激活靶基因的表达用。相较于csgRNA-sCMV系统，本发明基于GAL4-UAS系统的CRISPR 辅助反式增强子激活基因表达方法，非常重要的创新点在于解决了CRISPR辅助反式增强子激活基因表达方法的体内应用问题。本发明使用的三个组件都可以运用腺相关病毒(AAV)载体非常容易地导入体内细胞。此外，本发明使用的三个组件或可进一步合并为两个组件甚至单一组件，可进一步减少AAV载体组成，提高体内转染效率，非常有利于本发明技术的实际应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法开发了一种新的基于dCas9的基因激活系统，通过一个简单的sgRNA与cdCas9 结合以及招募反向CMV增强子靶向基因。本发明发明中反式增强子由 dCas9-VP64-GAL4/sgRNA和UAS-CMV组成，可以高效激活在各种哺乳动物细胞中的外源和内源基因表达，比目前广泛使用的dCas9-VP64更有效。因此，本发明开发了一种激活内源基因的反式增强子新策略。这种创造性策略比目前基于 dCas9的基因激活系统具有优势。

本发明开发了一种基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的新方法。该方法通过对常规dCas9的改造发展了一种捕获dCas9 (cdCas9)，如本发明使用的dCas9-VP64-GAL4；借助dCas9-VP64-GAL4/sgRNA 复合物中GAL4与带UAS序列的巨细胞病毒(CMV)增强子DNA的结合，将 CMV增强子反式募集到靶基因上，捕获的反式CMV增强子可以像天然环状顺式增强子一样高效激活靶基因(包括外源和内源基因)的表达。该方法在生物医学中具有广泛应用价值，可以应用在制备生物检测及治疗试剂中。

附图说明

图1为基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的原理示意图；在dCas9-VP64的末端融合GAL4DNA结合结构域，用于捕获具有 UAS序列的反式CMV增强子；捕获的反式CMV增强子可以像天然环状顺式增强子一样起作用以激活靶基因(包括外源和内源基因)的表达；Capture dCas9 (cdCas9)：捕获dCas9，dCas9-VP64-GAL4表示dCas9、VP64和GAL4三种功能域的融合蛋白，PAM为前间隔序列邻近基序(protospacer adjacentmotif)， Promoter为启动子，Target gene为靶基因，TSS为转录起始位点(transcriptionstart site)，Transcription machine为转录机器。Trans-enhancer为反式增强子，UAS-CMV enahcner/promoter为UAS-CMV增强子或启动子，sgRNA为单引导RNA (single-guidedRNA)；

图2为在293T细胞中，通过基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子在HNF4α启动子控制下激活外源报告基因ZsGreen；293T细胞分别用各种载体转染，荧光显微镜下拍摄细胞；本实验中构建并使用了两种结构的反式CMV 增强子，一种为线性(linear)反式CMV增强子(LUAS-CMV)，另一种为环状 (vector)反式CMV增强子(VUAS-CMV)；Phase：细胞在明场下的成像， ZsGreen：细胞在荧光下的成像，pEZX-HP-ZsGreen-A为HNF4α启动子控制下的ZsGreen表达载体，dCas9-VP64-GAL4为dCas9-VP64-GAL4表达载体，sgRNA 为sgRNA表达载体，VUAS-CMV为环状反式CMV增强子，LUAS-CMV为线性反式CMV增强子，每组图像下的载体名称表示细胞被这些载体共转染；

图3为在293T细胞中，通过基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子在HNF4α启动子控制下激活外源报告基因ZsGreen；293T细胞用各种载体转染，并用流式细胞术鉴定细胞的荧光强度；本实验中构建并使用了两种结构的反式CMV增强子，一种为线性(linear)反式CMV增强子(LUAS-CMV)，另一种为环状(vector)反式CMV增强子(VUAS-CMV)；Phase：细胞在明场下的成像，ZsGreen：细胞在荧光下的成像，pEZX-HP-ZsGreen-A为HNF4α启动子控制下的ZsGreen表达载体，dCas9-VP64-GAL4为dCas9-VP64-GAL4表达载体， sgRNA为sgRNA表达载体，VUAS-CMV为环状反式CMV增强子，LUAS-CMV 为线性反式CMV增强子，每副图像下的载体名称表示细胞被这些载体共转染；

图4为在293T细胞中，通过基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子在HNF4α启动子控制下激活外源报告基因ZsGreen；293T细胞用各种载体转染，并用流式细胞术鉴定细胞的荧光强度，对3次独立的转染实验的结果进行统计分析；**表示达到极显著(p<0.01)，Percentage为百分数，细胞转染载体说明同图3；

图5为在293T细胞中，通过基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活内源基因HNF4α的表达；运用荧光定量PCR对HNF4α基因的表达进行检测，并对3次独立的转染实验的结果进行统计分析；**表示达到极显著 (p<0.01)，Percentage为百分数，细胞转染载体说明同图3；

图6为在HepG2细胞中，通过基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活内源基因HNF4α的表达；运用荧光定量PCR对HNF4α基因的表达进行检测，并对3次独立的转染实验的结果进行统计分析；**表示达到极显著 (p<0.01)，Percentage为百分数，细胞转染载体说明同图3。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的原理图解。

图1为通过基于GAL4-UAS系统的CRISPR-辅助反式增强子激活基因表达的原理示意图。通过向dCas9-VP64蛋白羧基端融合GAL4的DNA结合结构域，产生捕获dCas9(cdCas9)蛋白(dCas9-VP64-GAL4)。该融合蛋白中的dCas9 部分可结合sgRNA，靶向结合目的基因(如本研究中的HNF4α)；VP64具有转录激活作用；GAL4可结合含有其结合靶点UAS的DNA。相应地，设计具有 UAS序列的双链CMV增强子序列(UAS-CMV)；本发明实验中构建并使用了两种结构的反式CMV增强子，一种为线性(linear)反式CMV增强子 (LUAS-CMV)，另一种为环状(vector)反式CMV增强子(VUAS-CMV)。图 1仅示意了使用LUAS-CMV的情况。通过这些dCas9-VP64-GAL4和UAS-CMV 设计，当sgRNA将dCas9-VP64-GAL4蛋白引导到位于靶基因的启动子区域中的靶位点时，UAS-CMV将被dCas9-VP64-GAL4的GAL4结合(捕获)。这个相互作用过程将把UAS-CMV锚定到靶基因的启动子区域。因此锚定的UAS-CMV 可像天然环状顺式增强子一样激活靶基因的表达。由于 dCas9-VP64-GAL4/sgRNA锚定的UAS-CMV在转录中起转录因子的作用，因此它可被视为反式增强子，以便区别于天然增强子的顺式作用。

实施例1

载体构建

实验方法：

构建载体pcDNA-dCas9-VP64-GAL4：载体pcDNA-dCas9-VP64购自 Addgene。使用引物(GAL4-BsiEW-F和GAL4-BspE-R)(表1)从pGBKT7载体(购自淼灵质粒共享平台)扩增获得GAL4的DNA结合结构域编码序列，然后利用限制性内切酶BsiWI和BspEI连入载体pcDNA-dCas9-VP64后成为载体 pcDNA-dCas9-VP64-GAL4。

制备UAS-CMV载体或片段：首先人工合成5×UAS序列，序列的5′是用于连入CMV的酶切位点(BglII和HindIII)，5×UAS序列连入pEASY-Blunt后得到载体pEASY-Blunt-UAS。然后使用引物UAS-CMV-Bgl-F和 UAS-CMV-Hind-R(表1)，以pEGFP-C1(Addgene)为模板，扩增得到两端分别带有BglII和HindIII酶切位点的CMV片段，然后利用这两个酶切位点连入pEASY-Blunt-UAS载体，从而获得载体pEASY-Blunt-UAS-CMV，这个载体直接作为环状反式增强子(VUAS-CMV)。以pEASY-Blunt-UAS-CMV为模板，用引物CMV-UAS-Bgl-F和UAS-CMV-R(表1)可扩增线性反式增强子(LUAS-CMV)。

表1.用于载体构建中高保真扩增的引物。(SEQ ID NO.1-6)

制备sgRNA表达载体：选择HNF4α为靶标，用CHOPCHOP (https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)设计设计靶向HNF4α基因启动子区的 sgRNA。使用含有U6启动子和三个RNA骨架的pEASY-sgRNA载体构建sgRNA 表达。化学合成的互补寡核苷酸(表2)具有20bp靶特异性区域，侧翼为两个 BbsI位点，稀释至10μM并以相同的摩尔混合。反应中每种寡核苷酸的最终浓度是1μM。充分混合后，互补寡核苷酸在高温(95℃)下变性并通过自然冷却过程退火。将杂交产物稀释800倍，然后连接到pEASY-sgRNA中。连接反应体系(10μL)由1μL BbsI，0.3μL T4DNA连接酶，1μL 10×T4DNA连接酶缓冲液，10×BSA(牛血清白蛋白)(终浓度0.1mg/mL)，50ng质粒pEASY-sgRNA，和ddH₂O达到10μl总反应体积。连接反应为：10个循环包括37℃5分钟和16℃ 10分钟，37℃30分钟和80℃5分钟。将连接产物导入DH5α感受态细胞中，并通过在具有100μg/mL氨苄青霉素，40μL 20mg/mL X-gal和40μL 0.1M IPTG的LB琼脂平板上进行蓝白色筛选来筛选白色克隆。载体通过测序验证。然后使用正向引物U6-F和反向引物U6-R(表3)通过PCR从质粒pEASY-sgRNA扩增线性sgRNA表达序列。PCR产物通过PCR纯化试剂盒(Axygen)纯化。这些序列作为sgRNA转录模板，用于将细胞转染。

表2.用于制备sgRNA的靶特异性区域(20bp)的寡核苷酸。(SEQ ID NO.7-8)

表3.用于载体构建中高保真扩增的引物。(SEQ ID NO.9-10)

引物名称	序号	序列
			U6-F	SEQ9	5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′
U6-R	SEQ10	5′-AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3′

构建HNF4α启动子报告基因表达载体：将HNF4α启动子序列克隆到 ZsGreen基因的上游来构建ZsGreen报告载体。使用引物HNF4α-P-F和 HNF4α-P-R(表4)通过PCR从HepG2细胞的基因组DNA扩增1000bp的HNF4α启动子序列。然后将启动子序列连接到产生HNF4α启动子报告载体 pEZX-HP-ZsGreen-A的pEZX-ZsGreen-A中。

表4.用于载体构建中高保真扩增的引物。(SEQ ID NO.11-12)

实验结果：

通过上述载体构建实验，经测序获得如下载体序列：

pEASY-sgRNA骨架载体：(SEQ ID NO.13)

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGC TGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTA CAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAA AATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTC GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCAG CGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGC AGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACG CAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC AGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTGCCCTTAAGGGCAGCTTC AATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAAC GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCAC ATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCC CTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGAAGACCTGTT TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGA AAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT

sgRNA转录模版：(SEQ ID NO.14)

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGC TGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTA CAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAA AATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTC GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTA GTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT

sgRNA序列：(SEQ ID NO.15)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG UGCUUUU

UAS-CMV序列(5×UAS+CMV序列)：(SEQ ID NO.16)

AGATCTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCC CAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACG CCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACT GCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTG ACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTT ATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA TGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACT CACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTT GGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCAT TGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAG CTAAGCTTCGGTCAACAGTTGTCCGCGGTCAACAGTTGTCCGCGGTCAACA GTTGTCCGCGGTCAACAGTTGTCCGCGGTCAACAGTTGTCCG

HNF4a启动子报告载体(pEZX-HP-ZsGreen-A)：(SEQ ID NO.17)

TGAGATCCAAAACTGAGACAAAAGAAACGGGGCTGTTCCAAAAAAA AAGCTAGGTGGCAGGTGTCTAACATGCCAGGGAGCTAAAACAGAGTGTGT GAGTTTCAGCAGCAGGTTGAATTTAGAATGGGGAAGGAGACCAGAGGAGA CGCCAGACAGGATGACTTTGTCCCATTGGCCTGGAGGCAGCCCCATGTTTC TCCACCCCTCATATCACTCACCAGTTTGTAATAGTATCTTTGAATGACGATCT GATTAAGGTCCGTCTCCTCCATTAGTCCACAAGTTTCGGGGGTACATCTACT TTGCTCATTTCCATATCCCCAGAGTCTAGCACAAGGCCTGGTACATAGTAGG TGCTCAATAAATATGTTAGATGAAAGGAAGATAACACCTCTATGTACTAGCA GTGAGACTCCAGGCATGCAATTTCTCTCTGTCCTTCAGTCCCTTCATCTCAA GGTTTAATTTAAATATGGTAACGCCTGTATGCAACTCCCAGCATCCAGTAGG CACTCACTAAACACAGTTCTCCACCCTCCTTTTTTCCTCTGCCCCTCCCTCG GTTTTCCCACTACTTCCTGCATGGTGACACACCCATAGTTTGGAGCCATAAA ACCCAACCCAGGTTGGACTCTCACCTCTCCAGCCCCTTCTGCTCCGGCCCTGTCCTCAAATTGGGGGGCTGATGTCCCCATACACCTGGCTCTGGGTTCCCCT AACCCCAGAGTGCAGGACTAGGACCCGAGTGGACCTCAGGTCTGGCCAGG TCGCCATTGCCATGGAGACAGCAACAGTCCCCAGCCGCGGGTTCCCTAAGT GACTGGTTACTCTTTAACGTATCCACCCACCTTGGGTGATTAGAAGAATCAA TAAGATAACCGGGCGGTGGCAGCTGGCCGCACTCACCGCCTTCCTGGTGG ACGGGCTCCTGGTGGCTGTGCTGCTGCTGTGAGCGGGCCCCTGCTCCTCCA TGCCCCCAGCTCTCCGGCTGGGTGGGCTTAAGCTTCTCGACTTCCAGCTTG GCATAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGATCCGGTACTGTTGGTA AAGCCACCGGATCCAGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAA GGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGT TCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCC ATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATC TTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAG GACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGAC CGCTCCTTCCTGTTCGAGGACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATC ACCGTGAGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTACGG CGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAGAAGATGACCGACAACT GGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTG AAGGGCGACGTGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGCG CTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGTGCCCCGCAAGATGC CCGACTGGCACTTCATCCAGCACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGAC GCCAAGAACCAGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTC CGCCTTGCCCGCCGCGCACCCGGGTTACTCTAGAGTCGGGGCGGCCGGCTA G

dCas9-VP64-GAL4编码序列：(SEQ ID NO.18)

ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGCTATCGGCACAAATAGCGTCG GATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGG TTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTC TTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACA GCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGA TTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGA AGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTT TGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATC ATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAAT CTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGT ACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGT AGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGA AAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAA TCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATT TGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTT AGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCA GCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAC TGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAA CATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCA GAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGT TATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAA TTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATC AAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTT ATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTC GAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATG GATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGT TGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTT GATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATG AGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGG AATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGA TTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGA TTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAA GATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAA AGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTA AAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTC GCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAG GGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTT GCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAG AAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAA CATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGA CTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAG AAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCC AGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAA TTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAA AATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGG ACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATGCCATTGTT CCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGT TCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTC AAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAA CTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATC ACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATG AAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATT AGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAAC AATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTT TGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAA AGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAA AGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACA GAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACT AATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCAC AGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGA AGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTC GGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGG TTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAA AAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGC TAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATAT AGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGA GAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTT TTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACG AACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTAT TGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTA GATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAA CAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCG CTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACA AAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATG AAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACCCAATTGCCGGATCCA AGGCTAGCCCGAAAAAGAAACGCAAAGTTGGGCGCGCCGACGCGCTGGA CGATTTCGATCTCGACATGCTGGGTTCTGATGCCCTCGATGACTTTGACCTG GATATGTTGGGAAGCGACGCATTGGATGACTTTGATCTGGACATGCTCGGC TCCGATGCTCTGGACGATTTCGATCTCGATATGTTAATTAACTACCCGTACGG AATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAA AAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGA ACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGACT AGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCT ATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGAT TCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGT GAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCC TCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAG TAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATCGTAA

实施例2

通过反式增强子激活外源报告基因

实验方法：

细胞培养和转染：

从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心获得293T，并在37℃和5％ (v/v)CO₂的培养箱培养。细胞在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培养基中培养。细胞在 12孔板的每个孔中汇合度>70％时，用800ng总DNA，包括350ng质粒 (pcDNA-dCas9-VP64-GAL4)，150ng线性sgRNA表达模板(U6-sgRNA)，150 ng LUAS-CMV或VUAS-CMV，和150ng pEZX-HP-ZsGreen-A溶解于Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)脂质体中使用以下方案转染。对于每次转染，当细胞生长至4×10⁵/孔的密度时，将细胞与600μL的Opti-MEM (ThermoFisherScientific)在37℃下培养0.5小时。每次转染制备100 μLOpti-MEM，800ng总DNA，100μLOpti-MEM和4μL Lipofectamine 2000的原液。然后将溶液涡旋并在室温下温育5分钟。此后，将Opti-MEM/Lipofectamine 溶液加入储存在100μL Opti-MEM中的单独等分试样中，涡旋，并在室温下温育20分钟，然后加入到每个孔中。将细胞与转染溶液一起温育4小时后，用800 μL含有10％FBS的新鲜DMEM培养基替换每个孔的培养基。细胞在37℃和5％ CO₂下再孵育36小时。在实验结束时，并在200×放大倍数下的荧光显微镜 (Olympus)下拍照并观察所有细胞。

在激活HNF4α启动子报告基因时，用sgRNA+pcDNA-dCas9-VP64+ pEZX-HP-ZsGreen-A、LUAS-CMV+pEZX-HP-ZsGreen-A，以及VUAS-CMV+ pEZX-HP-ZsGreen-A共转染293T细胞作为对照组。

实验结果：

为了观察CRISPR-辅助反式增强子是否能够激活基因表达，构建了HNF4α启动子的报告基因载体pEZX-HP-ZsGreen-A。然后用LUAS-CMV或 VUAS-CMV、dCas9-VP64-GAL4和sgRNA转染293T细胞。发现该系统激活了报告基因ZsGreen的表达(图2；dCas9-VP64-GAL4/sgRNA-LUAS-CMV或 VUAS-CMV pEZX-HP-ZsGreen-A)。其中线性反式增强子组的激活效果最高(图 2；dCas9-VP64-GAL4/sgRNA-LUAS-CMV pEZX-HP-ZsGreen-A)。而其他缺少部分元件的对照组均未成功激活报告基因ZsGreen的表达(图2)。

对细胞中报告基因ZsGreen的表达水平进行了流式定量测定，结果显示报告基因ZsGreen的表达均被线性线性反式增强子和环状反式增强子激活(图3； dCas9-VP64-GAL4/sgRNA-LUAS-CMV或VUAS-CMV pEZX-HP-ZsGreen-A)。其中线性反式增强子组的激活效果最高(图3；dCas9-VP64-GAL4/ sgRNA-LUAS-CMV pEZX-HP-ZsGreen-A)。而其他缺少部分元件的对照组均未成功激活报告基因ZsGreen的表达(图3)。

对3次独立转染(生物学重复)的报告基因ZsGreen表达的流式定量结果进行统计学分析，可见相较于对照组，报告基因ZsGreen的表达均被线性线性反式增强子和环状反式增强子显著激活(图4)。

图2-4说明本发明的构建的基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法，相较于目前常用的dCas9-VP64/sgRNA激活系统，可以更加显著地激活外源报告在细胞内的表达。其激活效果较传统 dCas9-VP64/sgRNA系统提高十多倍(图4)。

实施例3

反式增强子激活内源基因

实验方法：

细胞培养和转染：

从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心获得293T和HepG2，并在 37℃和5％(v/v)CO₂的培养箱培养。细胞在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)或Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中培养。细胞在12孔板的每个孔中汇合度>70％时，用800ng总DNA，包括500ng质粒 (pcDNA-dCas9-VP64-GAL4)，150ng线性sgRNA表达模板(U6-sgRNA)，和 150ng LUAS-CMV或VUAS-CMV，溶解于Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)脂质体中使用以下方案转染。对于每次转染，当细胞生长至4×10⁵/ 孔的密度时，将细胞与600μL的Opti-MEM(ThermoFisher Scientific)在37℃下培养0.5小时。每次转染制备100μLOpti-MEM，800ng总DNA，100μL Opti-MEM和4μL Lipofectamine 2000的原液。然后将溶液涡旋并在室温下温育 5分钟。此后，将Opti-MEM/Lipofectamine溶液加入储存在100μL Opti-MEM中的单独等分试样中，涡旋，并在室温下温育20分钟，然后加入到每个孔中。将细胞与转染溶液一起温育4小时后，用800μL含有10％FBS的新鲜DMEM或 RPMI 1640培养基替换每个孔的培养基。细胞在37℃和5％CO₂下再孵育36小时。

定量RT-PCR：使用TRIzol TM(Invitrogen)试剂从转染的细胞中提取总RNA。在1×Hifair TMⅢSuperMix(YEASEN，11137ES50)组成的20μl体系中由高达 3μg总RNA合成cDNA。使用GADPH mRNA作为对照将所有mRNA水平归一化。根据制造商的方案，使用ABI Step OnePlus(Applied Biosystems)通过定量 PCR分析不同处理的细胞的转录水平。定量PCR使用的引物见表5。

表5.qPCR引物(SEQ ID NO.19-22)

实验结果：

为了研究转录增强子对内源基因的转录激活，选择HNF4α基因作为激活靶点。为该基因中设计了一个启动子靶向sgRNA。然后用dCas9-VP64-GAL4/sgRNA 和UAS-CMV转染该细胞系。同时，用dCas9-VP64-GAL4、dCas9-VP64/sgRNA 和dCas9-VP64-GAL4/sgRNA转染细胞作为对照。通过qPCR检测基因表达。通过比较，发现dCas9-VP64-GAL4/sgRNA-LUAS-CMV或VUAS-CMV转染在293T 细胞(图5)和HepG2细胞(图6)中均显著激活了内 源基因HNF4α的表达，而其他对照组均未激活两种细胞中内 源基因HNF4α的表达(图5和图6)。图5 和图6显示了3次独立转染检测结果的统计学分析结果，可见LUAS-CMV和 VUAS-CMV均可以作为反式增强子与dCas9-VP64-GAL4/sgRNA配合显著激活两种细胞内内 源基因HNF4α的表达。而LUAS-CMV的激活效果更好。

序列表

<110> 东南大学

<120> 基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacccgtacg gaatgaagct actgtcttct atcgaacaag 40

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtagtccgga ttacgataca gtcaactgtc 30

<210> 3

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcagatctc gagctcaagc ttcgaacggt caacagttgt ccgcggtcaa cagttgtccg 60

cggtcaacag ttgtccgcgg tcaacagttg tccgcggtca acagttgtcc g 111

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tg 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcgaagctt agctctgctt atatagacct cc 32

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cactataggg cgaattgaag ctgccctt 28

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggaagacgg caccggccag tcacttaggg aacccggttt gggtcttcga 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgaagaccc aaaccgggtt ccctaagtga ctggccggtg ccgtcttcct 50

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagggcctat ttcccatgat tcc 23

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc 30

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgctcgagt gagatccaaa actgagacaa aagaaacggg gctg 44

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccaagctta agcccaccca gccggagagc tgggggcatg gagg 44

<210> 13

<211> 796

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat 300

tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc 360

aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 420

tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca 480

tgattacgcc aagctgccct taagggcagc ttcaattcgc cctatagtga gtcgtattac 540

aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 600

aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 660

gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggacgcgaag acctgtttta 720

gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc 780

gagtcggtgc tttttt 796

<210> 14

<211> 353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngttttagag ctagaaatag caagttaaaa 300

taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttt 353

<210> 15

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 16

<211> 605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agatctcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 60

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 120

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 180

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 240

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 300

tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 360

acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 420

tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 480

gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctaagctt cggtcaacag ttgtccgcgg 540

tcaacagttg tccgcggtca acagttgtcc gcggtcaaca gttgtccgcg gtcaacagtt 600

gtccg 605

<210> 17

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgagatccaa aactgagaca aaagaaacgg ggctgttcca aaaaaaaagc taggtggcag 60

gtgtctaaca tgccagggag ctaaaacaga gtgtgtgagt ttcagcagca ggttgaattt 120

agaatgggga aggagaccag aggagacgcc agacaggatg actttgtccc attggcctgg 180

aggcagcccc atgtttctcc acccctcata tcactcacca gtttgtaata gtatctttga 240

atgacgatct gattaaggtc cgtctcctcc attagtccac aagtttcggg ggtacatcta 300

ctttgctcat ttccatatcc ccagagtcta gcacaaggcc tggtacatag taggtgctca 360

ataaatatgt tagatgaaag gaagataaca cctctatgta ctagcagtga gactccaggc 420

atgcaatttc tctctgtcct tcagtccctt catctcaagg tttaatttaa atatggtaac 480

gcctgtatgc aactcccagc atccagtagg cactcactaa acacagttct ccaccctcct 540

tttttcctct gcccctccct cggttttccc actacttcct gcatggtgac acacccatag 600

tttggagcca taaaacccaa cccaggttgg actctcacct ctccagcccc ttctgctccg 660

gccctgtcct caaattgggg ggctgatgtc cccatacacc tggctctggg ttcccctaac 720

cccagagtgc aggactagga cccgagtgga cctcaggtct ggccaggtcg ccattgccat 780

ggagacagca acagtcccca gccgcgggtt ccctaagtga ctggttactc tttaacgtat 840

ccacccacct tgggtgatta gaagaatcaa taagataacc gggcggtggc agctggccgc 900

actcaccgcc ttcctggtgg acgggctcct ggtggctgtg ctgctgctgt gagcgggccc 960

ctgctcctcc atgcccccag ctctccggct gggtgggctt aagcttctcg acttccagct 1020

tggcatagag ggtatataat ggaagctcga cttccagatc cggtactgtt ggtaaagcca 1080

ccggatccag ccaccatggc ccagtccaag cacggcctga ccaaggagat gaccatgaag 1140

taccgcatgg agggctgcgt ggacggccac aagttcgtga tcaccggcga gggcatcggc 1200

taccccttca agggcaagca ggccatcaac ctgtgcgtgg tggagggcgg ccccttgccc 1260

ttcgccgagg acatcttgtc cgccgccttc atgtacggca accgcgtgtt caccgagtac 1320

ccccaggaca tcgtcgacta cttcaagaac tcctgccccg ccggctacac ctgggaccgc 1380

tccttcctgt tcgaggacgg cgccgtgtgc atctgcaacg ccgacatcac cgtgagcgtg 1440

gaggagaact gcatgtacca cgagtccaag ttctacggcg tgaacttccc cgccgacggc 1500

cccgtgatga agaagatgac cgacaactgg gagccctcct gcgagaagat catccccgtg 1560

cccaagcagg gcatcttgaa gggcgacgtg agcatgtacc tgctgctgaa ggacggtggc 1620

cgcttgcgct gccagttcga caccgtgtac aaggccaagt ccgtgccccg caagatgccc 1680

gactggcact tcatccagca caagctgacc cgcgaggacc gcagcgacgc caagaaccag 1740

aagtggcacc tgaccgagca cgccatcgcc tccggctccg ccttgcccgc cgcgcacccg 1800

ggttactcta gagtcggggc ggccggctag 1830

<210> 18

<211> 4770

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720

ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900

ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960

atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860

ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160

catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220

gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280

attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340

atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400

gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460

gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatgcc 2520

attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580

gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640

aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700

acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760

ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820

actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880

aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940

taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000

tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060

atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120

aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180

cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240

gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300

cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360

gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420

tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480

aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540

tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600

tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660

caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720

cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780

cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840

attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900

ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960

cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020

gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080

gatttgagtc agctaggagg tgacccaatt gccggatcca aggctagccc gaaaaagaaa 4140

cgcaaagttg ggcgcgccga cgcgctggac gatttcgatc tcgacatgct gggttctgat 4200

gccctcgatg actttgacct ggatatgttg ggaagcgacg cattggatga ctttgatctg 4260

gacatgctcg gctccgatgc tctggacgat ttcgatctcg atatgttaat taactacccg 4320

tacggaatga agctactgtc ttctatcgaa caagcatgcg atatttgccg acttaaaaag 4380

ctcaagtgct ccaaagaaaa accgaagtgc gccaagtgtc tgaagaacaa ctgggagtgt 4440

cgctactctc ccaaaaccaa aaggtctccg ctgactaggg cacatctgac agaagtggaa 4500

tcaaggctag aaagactgga acagctattt ctactgattt ttcctcgaga agaccttgac 4560

atgattttga aaatggattc tttacaggat ataaaagcat tgttaacagg attatttgta 4620

caagataatg tgaataaaga tgccgtcaca gatagattgg cttcagtgga gactgatatg 4680

cctctaacat tgagacagca tagaataagt gcgacatcat catcggaaga gagtagtaac 4740

aaaggtcaaa gacagttgac tgtatcgtaa 4770

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gacattcggg cgaagaagat 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aagatgatgg ctttgaggta gg 22

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggatttggtc gtattggg 18

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggaagatggt gatgggatt 19

Claims (3)

1.一种基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法，其特征在于，通过融合GAL4 的CRISPR系统将带有UAS序列的增强子DNA反式募集到靶基因上，依靠带有UAS序列的反式增强子DNA本身以及带有UAS序列的反式增强子DNA与结合GAL4 的CRISPR系统的互作，激活靶基因表达；所述CRISPR系统指cdCas9与sgRNA形成的可与靶DNA序列结合的复合物；所述cdCas9为常规dCas9或dCas9-AD蛋白融合GAL4改造而成的一种捕获dCas9；所述dCas9-AD为经过基因融合改造过的融合各种激活域的dCas9蛋白；所述反式增强子DNA是一段末端带有一段UAS序列的双链DNA，具有募集细胞内转录因子以激活基因表达的功能；所述反式增强子DNA末端的UAS序列可与cdCas9的GAL4结合。

2.根据权利要求1所述的基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法，其特征在于，所述GAL4为全长序列GAL4蛋白或GAL4的DNA结合结构域。

3.一种权利要求1所述的基于GAL4-UAS系统的CRISPR辅助反式增强子激活基因表达的方法在制备生物检测及治疗试剂中的应用。

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