CN111434772A

CN111434772A - 一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用

Info

Publication number: CN111434772A
Application number: CN201910026600.8A
Authority: CN
Inventors: 童英; 卢俊南; 张明虹; 陈立志; 梁兴祥; 姚永超; 秦莉; 陈小平
Original assignee: Guangzhou Cas Lamvac Biotech Co Ltd
Current assignee: Zhongke Lanhua Guangzhou Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2020-07-21
Also published as: WO2020143125A1

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas9技术的基因编辑系统及其应用，以内源U6启动子依赖型载体系统为基础，在表达载体的Cas9表达盒内加入负筛选标记，并将包含同源臂的拯救载体上的抗药筛选标记转移至表达载体上，减少拯救载体的基础大小，扩大其容量，可介导在人疟原虫中敲入长达6.3kb外源基因片段，且获得的重组疟原虫不含抗药筛选标记和Cas9蛋白表达质粒的残留，可用同一药筛标记进行连续基因编辑，性能稳定，高效简洁，功能强大，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用。

背景技术

基因编辑是利用人工核酸酶或“分子剪刀”对DNA进行插入、删除或替换的技术，包括第一代的ZFN锌指核酸酶技术，第二代的TALEN技术以及第三代的CRISPR/Cas9技术。CRISPR/Cas9技术具有设计简单、位点多、效率高、特异性好、耗时短等优点，是目前最热的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统主要元件有靶向靶基因的sgRNA(single guide RNA)和Cas9核酸酶。该系统的作用原理为Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，在靶基因的特异位点进行切割，产生缺口。缺口产生后，细胞可以通过多种方式进行修复，主要包括经典的非同源末端(classical non-homologous end joining，NHEJ)修复和同源重组(homologousrecombination，HR)修复等。在没有模板的条件下，往往发生NHEJ修复，该修复过程会产生DNA的插入或缺失，造成移码突变，导致基因失活；在有同源模板情况下，可发生同源重组修复，实现对靶基因的精确编辑，如引入点突变或插入基因片段等；疟原虫缺乏非同源末端修复机制，其DNA缺口修复几乎完全依赖同源末端修复。

在恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，Pf)中，目前有两种不同的CRISPR/Cas9技术系统可供选择，分别为内源U6启动子依赖(U6promoter dependent，U6Pd)型和外源T7启动子依赖(T7promoter dependent，T7Pd)型。U6Pd型系统采用了双质粒设计(Ghorbal，M.，et al.(2014)."Genome editing in the human malaria parasite Plasmodiumfalciparum using the CRISPR-Cas9system."Nat Biotechnol 32(8):819-821.)，一个载体为Cas9蛋白表达载体，携带Cas9蛋白表达框和抗药筛选标记表达框，质粒大小为11096bp；另一个载体为sgRNA表达载体兼同源修复模板，携带sgRNA表达框、负筛选标记、抗药筛选标记和同源臂，sgRNA由Pf内源U6启动子表达，未加同源臂的质粒大小为9233bp。T7Pd型系统也采用了双质粒系统(Wagner J.C.，et al.(2014)."Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum."Nat Methods 11(9):915-918)，一个质粒为Cas9蛋白表达载体，携带Cas9蛋白表达框、sgRNA表达框和抗药筛选标记表达框，其中sgRNA的转录由T7启动子启动，由于疟原虫体内无T7RNA聚合酶，因此sgRNA无法自主转录；另一个质粒是T7RNA聚合酶表达载体及同源臂携带载体，同时携带另一个抗药筛选标记。

这两个系统的缺点在于：1.基因编辑后的虫子含有抗药筛选标记和Cas9蛋白表达载体的残留。目前Pf中能用的抗药筛选标记非常有限，只有hdhfr，bsd(blasticidin Sdeaminase)，neo(neomycin phosphotransferase)，pac(puromycin-N-acetyltransferase)，ydhodh(yeast dihydroorotate dehydrogenase)五种可供选择，而且药物昂贵，个别还没有商业化；如果需要对疟原虫的多个基因进行编辑时，上述两个基因编辑系统可能会因为药筛标记不够用而难以实现对Pf的多轮基因编辑；而Cas9蛋白表达载体的残留将产生潜在的基因编辑脱靶风险；2.携带同源臂用于同源修复的质粒基础大小较大，难以装载大片段进行敲入操作。

因此，对Cas9/sgRNA表达载体进行改进和优化，实现基因大片段的敲入、抗药筛选标记的去除和连续基因编辑，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用，所述系统以内源U6启动子依赖型载体系统为基础，在表达载体上加入负筛选标记，并将包含同源臂的拯救载体上的抗药筛选标记转移至表达载体上，优化摸索实验条件并验证，最终成功敲入基因大片段，获得无抗药标记和无Cas9蛋白表达载体残留、可用同一药筛标记进行连续基因编辑的重组虫株，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统，所述系统为内源U6启动子依赖型，包括表达载体和拯救载体；

所述表达载体包括抗药筛选标记、sgRNA表达盒和Cas9表达盒，所述Cas9表达盒包括负筛标记；

所述拯救载体包括同源臂插入位点和外源基因片段插入位点，不含有药筛标记。

本发明中，发明人在长期科研实践中，深入研究CRISPR/Cas9系统在疟原虫基因编辑中的优缺点，为解决敲入Cas9质粒和抗药标记残留问题，实现大基因片段的插入和连续基因编辑，对U6Pd型CRISPR/Cas9系统进行了改进，通过大量实验摸索发现，将原来分散在两个载体的sgRNA表达盒，Cas9表达盒整合到同一载体，构建成新的表达载体，该载体除sgRNA和Cas9表达盒外，还携带抗药筛选标记和负筛标记；另外一个载体为同源臂载体，该载体不携带任何药筛标记。该系统的作用原理为：Cas9/sgRNA复合物可以诱导产生DNA缺口，在没有同源模板存在的情况下，由于疟原虫缺乏有效的末端连接修复机制，这种DNA缺口将是致命的，必须要有同源臂载体的存在，疟原虫才可能被拯救存活。如果疟原虫只获得cas9和sgRNA表达载体，则该虫株会因为Cas9/sgRNA的剪切而又无法修复而死亡；如果疟原虫只获得同源臂载体，则虫株该又会因为没有抗药筛选标记被杀死；如果疟原虫获得上述两个载体，但没有发生正确的同源重组修复，那么该虫株也会因为Cas9/sgRNA的剪切而死亡，除非Cas9和sgRNA没有被正常表达，因此疟原虫只有同时获得两个载体并发生正确同源重组修复才能在正筛药物筛选下存活并被富集出来，但此时获得的活虫含有抗药筛选标记和Cas9蛋白表达载体的残留。由于在疟原虫增殖过程中会产生少量质粒丢失的虫子，因此通过撤除正筛药物同时加入负筛药物进行培养，即可将不含抗药筛选标记和Cas9蛋白表达载体残留的虫子富集出来。

该系统的优点在于：1.减少了药筛标记的使用；2.同源臂载体的基础大小降低，实现了装载更大的基因片段的功能；3、负筛标记实现了去除抗药筛选标记和Cas9蛋白表达载体残留的目的；4、可用同一药筛标记进行连续基因编辑。

优选地，所述抗药筛选标记包括HDHFR、BSD、NEO、PAC或YDHODH中的任意一种或至少两种的组合，优选为BSD。

目前Pf中能用的抗药筛选标记非常有限，只有hdhfr，bsd(blasticidin Sdeaminase)，neo(neomycin phosphotransferase)，pac(puromycin-N-acetyltransferase)，ydhodh(yeast dihydroorotate dehydrogenase)五种可供选择。

优选地，所述负筛选标记包括yFCU和/或HSV-TK，优选为yFCU。

酿酒酵母来源的负筛选基因yFCU(yeast cytosine deaminase and uridylphosphoribosyl transferase)的表达产物是胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶双功能嵌合蛋白，这种蛋白能催化无毒性的前体药物5-氟胞嘧啶(5-Fluorocytosine，5-Fc)，使其变为有毒性的5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)。然后，5-FU可进一步代谢为5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-单磷酸(5-FdUMP)，而5-FdUMP能抑制胸腺嘧啶合成酶的活性，结果导致三磷酸胸苷(TTP)不能合成，TTP池缺失，进而抑制DNA的有效合成。因此，若重组虫株中有包含yfcu基因的质粒，加入前体药物5-Fc后，带有质粒的虫子将会因为DNA合成受到抑制而死亡。

第二方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第一方面所述的系统。

优选地，所述宿主细胞包括恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫的中任意一种或至少两种的组合，优选为恶性疟原虫。

第三方面，本发明提供一种疟原虫基因编辑的方法，采用如第一方面所述的系统，包括如下步骤：

(1)构建第一方面所述的表达载体和拯救载体；

(2)根据目的基因筛选靶点序列并连接至表达载体中；

(3)将外源基因和来源于目的基因的同源臂克隆至拯救载体上；

(4)将步骤(2)的表达载体和步骤(3)的拯救载体制备成DNA-loaded RBC；

(5)将疟原虫裂殖体加入步骤(4)制备的DNA-loaded RBC中；

(6)进行抗药筛选获得重组疟原虫并进行PCR测序鉴定和外源基因表达分析，再进行负筛，得到抗药筛选标记、负筛标记和Cas9编码序列都丢失的疟原虫，

(7)对步骤(6)获得的重组疟原虫进行单克隆化，将不同单克隆进行表达载体残留检测和药物敏感性测试，检测药筛标记和Cas9蛋白表达质粒残留。

(8)按照步骤(1)-(6)的操作方法，使用同一药筛标记对疟原虫进行再次基因编辑。

优选地，所述疟原虫包括恶性疟原虫虫株Pf3D7、PfNF54、PfFCR3或PfDd2中的任意一种或至少两种的组合，优选为Pf3D7；

优选地，步骤(2)所述目的基因包括红内期非必须基因Pf47或P230P，优选为红内期非必须基因Pf47。

优选地，步骤(2)所述靶点序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1如下：

AACTACAGTTGGCTTAACAT.

优选地，步骤(3)所述外源基因包括R787OD和/或抗原基因，优选为R787OD。

R787OD重组蛋白基于人工PfEMP1R29var-V5-GFP-TM-ATS构建(Melcher，M.，etal.(2010)."Identification of a role for the PfEMP1semi-conserved headstructure in protein trafficking to the surface of Plasmodiumfalciparuminfected red blood cells."Cell Microbiol 12(10):1446-1462.)，在其R29var蛋白N端结构域后加入了“AgeⅠ酶切位点-GGPSG连接肽-PstⅠ酶切位点”，V5标签后加入了SacⅠ酶切位点，GFP后加入了“SacⅠ酶切位点-GGPSG连接肽-NheⅠ酶切位点”，编码框长4614bp；该重组蛋白由PfEF1α5’UTR驱动，由PbDT 3’UTR终止，整个表达框的大小为6286bp。

本发明将长度为6.3kb的重组人工恶性疟原虫表面蛋白1表达框(ORF长度为4.6kb)插入至疟原虫，以验证本质粒系统的大片段敲入潜能。恶性疟原虫表面蛋白1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1，PfEMP1)是目前研究最为深入的恶性疟原虫毒力因子。疟原虫进入寄生红细胞后，将PfEMP1置于红细胞表面，改变红细胞骨架和细胞膜表面结构，与不同血管内皮受体相结合，导致感染疟原虫的红细胞在不同组织的血管内聚集，逃避了人体脾脏的杀伤作用；利用PfEMP1可以被转运至红细胞表面这一特性，将PfEMP1的一些重要结构域与外源基因片段融合，构建成重组人工PfEMP1，从而将外源基因片段展示到红细胞表面，这一策略在基础研究和疫苗设计中都有重要价值。

优选地，步骤(4)所述制备DNA-loaded RBC的方法为：将载体在大肠杆菌中复制后提取纯化，电转至人红细胞，制备得到DNA-loaded RBC。

优选地，步骤(5)所述裂殖体的制备方法为：对体外培养的Pf3D7虫株进行明胶富集，获得裂殖体。

详细步骤如下：

第一步：构建通用型Cas9/sgRNA表达载体和拯救载体；

通用型Cas9/sgRNA表达载体包括：一个由P.falciparum U6小核RNA聚合酶3启动子(U6snRNA polymerase III promoter，5’U6，Gene ID:PF3D7_134110)启动子序列和3’非编码区(3’U6)所控制的sgRNA表达框，用于引导Cas9核酸酶靶向目标位点，其中包含BtgZI酶切位点，可以在此位点插入靶向目标基因的sgRNA序列；

一个由P.falciparum钙调素基因(calmodμLin，cam，Gene ID:PF3D7_1434200)启动子序列(5’CAM)和P.falciparum HRPII基因(histidine-rich protein II，HRPII，GeneID:PF3D7_0831800)的3’非编码区(3’HRP2)所控制的杀稻瘟菌素S抗性基因(Blasticidin-S deaminase，BSD，EC number:3.5.4.23)的表达框，用于基因编辑疟原虫的抗性筛选；

一个由P.falciparum热休克蛋白86(heat shock protein 86，Gene ID:PF3D7_0708400)启动子(5’hsp86)和鼠伯氏疟原虫Plasmodium berghei双功能二氢叶酸还原酶胸苷合酶(bifunctional dihydrofolate reductase-thymidylate synthase，DHFR-TS，GeneID:PBANKA_0719300)的3’端非编码序列(3’PbDT)控制的yfcu和Cas9表达框，yfcu基因是负筛标记，用于不含抗药标记和Cas9蛋白表达质粒残留疟原虫的筛选，Cas9是切割靶标DNA的核酸酶；

此外还包括一个氨苄抗性基因(Ampicillin，Amp)表达框，用于在大肠杆菌(例如DH5α，XL-10，Stbl3和NEB Stable等质粒DNA克隆菌株)中进行阳性克隆的筛选和维持该质粒在大肠杆菌中的稳定性；以及质粒DNA的基本骨架和在大肠杆菌中的质粒DNA复制起始点(ColE1origin)序列等。

通用型拯救载体主要包括：一个由P.falciparum的翻译延长因子的5’端启动子(5’PfEf1α，elongation factor 1-alpha，Gene ID:PF3D7_1357000)和鼠伯氏疟原虫Plasmodium berghei双功能二氢叶酸还原酶胸苷合酶(bifunctional dihydrofolatereductase-thymidylate synthase，DHFR-TS，Gene ID:PBANKA_0719300)的3’端非编码序列(3’PbDT)控制的报告基因GFP和renilla luciferase表达框(GFP/RUC)，在GFP和renillaluciferase编码序列的两端带有BtgZI酶切位点，用BtgZI酶切即可将报告基因GFP/RUC替换成其它基因。在5’-PfEf1α的上游和3’-PbDT的下游有多个酶切位点(MCs)，用于插入5’和3’同源臂；一个氨苄抗性基因(Ampicillin，Amp)表达框，用于在大肠杆菌(例如DH5α，XL-10，Stbl3和NEB Stable等质粒DNA克隆菌株)中进行阳性克隆的筛选和维持该质粒在大肠杆菌中的稳定性；以及质粒DNA的基本骨架和在大肠杆菌中的质粒DNA复制起始点(ColE1origin)序列。

第二步：筛选Cas9/sgRNA靶点序列，将靶点序列连接至通用型Cas9/sgRNA表达载体，构建能够靶向目标基因的Cas9/sgRNA表达载体，目标基因可以为疟原虫红内期非必须基因或疟原虫毒性相关基因；

第三步：将来自目标基因的同源臂和外源基因片段克隆到通用型拯救载体上；外源基因包括抗原基因、治疗剂基因、免疫调节剂基因或肽基因；

第四步：将上述两个载体在大肠杆菌中复制后提取并纯化，电转至人红细胞中，制备成DNA-loaded RBC；

第五步：对体外培养的Plasmodium falciparum 3D7(Pf3D7)虫株进行明胶富集，获得裂殖体，将裂殖体加入至DNA-loaded RBC中；

第六步：药筛获得重组疟原虫；

第七步：对重组疟原虫进行PCR鉴定和外源基因表达情况分析；

第八步：对重组疟原虫进行负筛；

第九步：对负筛后的疟原虫进行单克隆化；

第十步：对负筛后的重组疟原虫单克隆进行药筛标记和Cas9蛋白表达质粒残留情况检测。

第十一步：采用上述方法使用同一药筛标记对疟原虫进行再次基因编辑。

优选地，一种疟原虫基因编辑的方法，采用第一方面所述的系统，具体包括如下步骤：

(1)构建第一方面所述的表达载体和拯救载体；

(2)根据目的基因Pf47筛选靶点序列并连接至表达载体中；

(3)将外源基因R787OD和来源于目的基因Pf47的同源臂克隆至拯救载体上；

(4)将步骤(2)的表达载体和步骤(3)的拯救载体在大肠杆菌中复制后提取纯化，电转至人红细胞，制备成DNA-loaded RBC；

(5)对体外培养的Pf3D7虫株进行明胶富集，获得裂殖体，将裂殖体加入步骤(4)制备的DNA-loaded RBC中；

(6)进行抗药筛选并进行PCR测序鉴定和外源基因表达分析，再进行负筛选，得到抗药筛选标记、负筛标记和Cas9编码序列都丢失的疟原虫；

(7)对步骤(6)的重组疟原虫单克隆化后进行表达载体残留检测和药物敏感性测试，检测药筛标记和Cas9蛋白表达质粒残留；

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的系统或第三方面所述的方法用于疟原虫基因大片段敲入和/或设计肿瘤疫苗的应用。

已有的研究结果表明：疟原虫感染能高效激活机体固有免疫和肿瘤抗原特异性CTLs，拮抗肿瘤免疫抑制微环境，抑制肿瘤血管生成；疟原虫感染引起的发热可以杀死肿瘤细胞，且作用持续时间长；疟原虫能够表达大的外源基因，可以容纳和表达多个外源基因，且外源基因的表达水平高，因此，在疟原虫中敲入肿瘤抗原基因或免疫调节剂基因或是两者的组合，构建成以疟原虫为载体的肿瘤疫苗，将在肿瘤的治疗或预防中具有重要的应用价值。

所述敲入为敲除一段目的基因并插入新的外源基因。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的基因编辑系统，以内源U6启动子依赖型载体系统为基础，在表达载体的Cas9表达盒内加入负筛选标记，并将包含同源臂的拯救载体上的抗药筛选标记转移至表达载体上，减少拯救载体的基础大小，扩大其容量，可介导在人疟原虫中敲入长达6.3kb外源基因片段，且获得的重组疟原虫不含抗药筛选标记和Cas9蛋白表达质粒的残留，可用同一药筛标记进行连续基因编辑，性能稳定，高效简洁，功能强大。

附图说明

图1为本发明Cas9/sgRNA表达载体pCBS-yfcu的结构和sgRNA插入位点；

图2为拯救载体pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI的结构和酶切位点，MCs为同源臂插入位点，BtgZI酶切位点为外源基因片段插入位点；

图3为pCBS-yfcu-pf47质粒结构图；

图4为pARM-R787ODki-pf47质粒结构图；

图5(A)为R787OD片段敲入和PCR鉴定原理，LH和RH：5’同源臂和3’同源臂；P1，P2，P3，P4表示PCR引物；

图5(B)为PCR检测结果；wt：野生型pf3D7虫株；ki：R787OD片段敲入的疟原虫虫株；

图6(A)和图6(B)为R787OD转基因疟原虫中目标基因的转录和蛋白表达情况的RT-PCR检测结果，wt：野生型pf3D7虫株；ki：R787OD片段敲入的疟原虫虫株；-RT：逆转录时未加逆转录酶的对照，用于检测RNA中是否有DNA残留；+RT：逆转录时加入逆转录酶；

图6(C)为R787OD转基因疟原虫中目标基因的转录和蛋白表达情况的WesternBlot检测结果，GAPDH为内参；

图7为R787OD转基因疟原虫中目标基因在红细胞内的表达情况，Cy3，Cy3标记的羊抗鼠二抗(红色荧光)；BF，明场；wt：野生型pf3D7虫株；ki：R787OD片段敲入的疟原虫虫株；标尺＝10μm；

图8(A)为R787OD转基因疟原虫负筛不同单克隆中游离质粒的PCR检测的BSD和Cas9编码基因的PCR检测结果；Bulk：负筛前的转基因疟原虫，Clone 1，2，3，4：负筛后的R787OD转基因疟原虫单克隆；

图8(B)为负筛后虫株中R787OD片段整合情况检测，wt：野生型pf3D7虫株，Clone1：负筛后的R787OD转基因疟原虫单克隆；

图9为负筛后的R787OD转基因疟原虫中目标基因在红细胞内的表达情况。Cy3，Cy3标记的羊抗鼠二抗(红色荧光)；BF：明场；wt：野生型pf3D7虫株；ki-ep-：负筛后的R787OD转基因疟原虫单克隆虫株；标尺＝10μm；

图10为BSD对负筛后R787OD转基因疟原虫的杀伤效果，wt：野生型pf3D7虫株；ki-ep-：负筛后的R787OD转基因疟原虫单克隆虫株。

图11(A)为R787OD转基因疟原虫的PfNT1基因N端GFP标签敲入原理和PCR鉴定原理，LH和RH：5’同源臂和3’同源臂；P1，P2，P3，P4表示PCR引物；

图11(B)为PCR检测结果；wt：野生型pf3D7或R787OD虫株；ki：PfNT1基因N端敲入GFP标签的疟原虫；

图11(C)在R787OD转基因疟原虫的PfNT1基因N端敲入GFP标签的荧光显微镜观察结果，BF：明场。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1通用型Cas9/sgRNA表达载体pCBS-yfcu质粒的设计及构建

首先，对Cas9/sgRNA表达载体pCBS质粒进行了改进，在该载体中引入了酿酒酵母来源的负筛选基因yfcu；

由于pCBS质粒的大小已经超过12kb，再插入一个完整的负筛选基因表达盒，大小将接近15kb；为了减低载体构建的难度，将酵母来源的负筛选基因yfcu与cas9基因并入同一个表达盒，二者以2A肽序列(SEQ ID NO.2:GGTTCGGGAGAGGGCAGAGGATCCCTGCTAACATGCGGTGATGTCGAGGAGAATC CTGGCCCAGAATCGCTCGAG)连接，在Cas9基因ORF前的XhoⅠ位点直接插入yfcu-2A融合基因，具体构建过程如下：

第一步：以pCC4质粒(Maier，AG.，et al.(2006)."Negative selection usingyeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodiumfalciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination."Molecular&Biochemical Parasitology 150:118-121.)为模板，PCR扩增获得yfcu基因的ORF片段，反应体系如表1：

表1

反应程序：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃2min，33个循环；60℃7min；16℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。

PCR引物及序列如下：

160817Ryfcu的序列为SEQ ID NO.3:

GTTAGCAGGGATCCTCTGCCCTCTCCCGAACCAACACAGTAGTATCTGTCAC

160817Fyfcu的序列为SEQ ID NO.4:

CACATTTCGAATAAACTCGAGATGGTGACAGGGGGAATGGC.

第二步：overlap PCR获得yfcu-2A融合基因的编码片段，首先是退火延伸合成2A肽的编码区段，反应体系如表2：

表2

反应程序：98℃30s；98℃10s，50℃30s，60℃1min；4℃保存备用。

引物序列如下：

F2a的序列SEQ ID NO.5:

GGCAGAGGATCCCTGCTAACATGCGGTGATGTCGAGGAGAATCCTGGCCC

R2a的序列SEQ ID NO.6:

GTCCTTATAGTCCATCTCGAGCGATTCTGGGCCAGGATTCTCCTC

然后是yfcu基因与2A通过overlap PCR连接，直接往2A的退火延伸反应体系中加入yfcu基因的ORF扩增片段，反应程序为：98℃10s，50℃30s，60℃2min，3个循环；60℃7min；4℃保存备用；加入1μL yfcu基因的正向扩增引物160817Fyfcu，接着进行PCR扩增：98℃10s，50℃15s，60℃2min，29个循环；60℃7min；16℃保存，1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。

第三步：XhoⅠ单酶切获得pCBS质粒框架，酶切反应体系及程序按XhoⅠ使用说明书进行操作。37℃孵育2h，1％琼脂糖凝胶电泳回收。

第四步：

快速克隆法(Vazyme，C112-02)连接构建目标载体，反应体系、质粒框架和插入片段的使用量根据试剂盒说明书进行计算。将连接产物转化XL10感受态细胞(Vazyme，C503-03)，根据感受态的说明书进行转化操作。

待氨苄抗性平板上长出菌落后，挑取单菌落至装有5mL LB培养基的离心管，37℃，220rpm振荡培养10-11h，保存菌种(500μL菌液，加500μL 30％甘油，混匀后-80℃冻存)，剩余菌液使用质粒小提试剂盒进行质粒提取，操作步骤按质粒提取试剂盒说明书进行。

将质粒测序鉴定，测序用引物及序列如下：

160908Rseqyfcu-2A的序列SEQ ID NO.7：CACAATTTGCTTTTGCACAGG

160908FseqGFP-2A的序列SEQ ID NO.8：GAACGTCTACTTGCTACCTC

测序结果分析用Snapgene软件分析。

通过以上步骤构建成功的pCBS-yfcu质粒大小约为13.4kb，其结构如图1所示，包括：一个由P.falciparum U6小核RNA聚合酶3启动子(U6snRNApolymerase III promoter，5’U6，Gene ID:PF3D7_134110)启动子序列和3’非编码区(3’U6)所控制的sgRNA表达框，用于引导Cas9核酸酶靶向目标位点。其中包含BtgZI酶切位点，可以在此位点插入靶向目标基因的sgRNA序列；一个由P.falciparum钙调素基因(calmodμLin，cam，Gene ID:PF3D7_1434200)启动子序列(5’CAM)和P.falciparum HRPII基因(histidine-rich protein II，HRPII，Gene ID:PF3D7_0831800)的3’非编码区(3’HRP2)所控制的杀稻瘟菌素S抗性基因(Blasticidin-S deaminase，BSD，EC number:3.5.4.23)的表达框，用于基因编辑疟原虫的抗性筛选；一个由P.falciparum热休克蛋白86(heat shock protein 86，Gene ID:PF3D7_0708400)启动子(5’hsp86)和鼠伯氏疟原虫Plasmodium berghei双功能二氢叶酸还原酶胸苷合酶(bifunctional dihydrofolate reductase-thymidylate synthase，DHFR-TS，GeneID:PBANKA_0719300)的3’端非编码序列(3’PbDT)控制的yfcu和Cas9表达框，yfcu基因是负筛标记，Cas9是切割靶标DNA的核酸酶；此外还包括一个氨苄抗性基因(Ampicillin，Amp)表达框，用于在大肠杆菌(例如DH5α，XL-10，Stbl3和NEB Stable等质粒DNA克隆菌株)中进行阳性克隆的筛选和维持该质粒在大肠杆菌中的稳定性；以及质粒DNA的基本骨架和在大肠杆菌中的质粒DNA复制起始点(ColE1origin)序列等。

实施例2通用型拯救载体pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI的设计及构建

拯救载体的结构如图2所示，其主要组成部分为：一个由P.falciparum的翻译延长因子的5’端启动子(5’PfEf1α，elongation factor 1-alpha，Gene ID:PF3D7_1357000)和鼠伯氏疟原虫Plasmodium berghei双功能二氢叶酸还原酶胸苷合酶(bifunctionaldihydrofolate reductase-thymidylate synthase，DHFR-TS，Gene ID:PBANKA_0719300)的3’端非编码序列(3’PbDT)控制的报告基因GFP和renilla luciferase表达框(GFP/RUC)，在GFP和renilla luciferase编码序列的两端带有BtgZI酶切位点，用BtgZI酶切即可将报告基因GFP/RUC替换成其它基因。在5’-PfEf1α的上游和3’-PbDT的下游有多个酶切位点(MCs)，用于插入5’和3’同源臂；一个氨苄抗性基因(Ampicillin，Amp)表达框，用于在大肠杆菌(例如DH5α，XL-10，Stbl3和NEB Stable等质粒DNA克隆菌株)中进行阳性克隆的筛选和维持该质粒在大肠杆菌中的稳定性；以及质粒DNA的基本骨架和在大肠杆菌中的质粒DNA复制起始点(ColE1origin)序列，其具体构建过程如下：

第一步：从商业化T载体(pMDTM19-T)扩增AmpR-ori片段，PCR扩增反应体系与表1相同。反应条件为：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃2min 40s，33个循环；60℃7min；16℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳回收。

引物序列为：

Fampori的序列SEQ ID NO.9：

GGATCCGGTACCGCGGCCGCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAG

Rampori的序列SEQ ID NO.10：

CTCGAGAAGCTTAGATCTGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC

第二步：扩增GFP和renilla luciferase编码框，以Lu等构建好的pARM-GFP/RUCki为模板(具体构建方法参见Lu，J.，et al.(2016)."Aredesigned CRISPR/Cas9system formarker-free genome editing in Plasmodium falciparum."Parasit Vectors 9:198.)，在GFP编码区的5’端加入BtgZⅠ位点，在renilla luciferase编码区的3’端加入另一个BtgZⅠ位点，需要敲入其他基因时，用BtgZⅠ单酶切此载体，所得框架将含有完整的启动子和终止子，插入需要表达的基因即可；

PCR扩增的反应体系同表1，反应条件为：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃2min，33个循环；60℃7min；16℃保存。

引物序列为：

3’pbdtF的序列SEQ ID NO.11：

GCGATGCTGCCCGACATGTTCGTTTTTCTTATTTATATATTTATACC

3'pbdtR的序列SEQ ID NO.12:

GCGGCCGCGGTACCGGATCCCTACCCTGAAGAAGAAAAGTC

5'ef1aF的序列SEQ ID NO.13:

GCAGATCTAAGCTTCTCGAGTTTAACGGTTCACCCCTCTTAAC

5'ef1aR的序列SEQ ID NO.14:

AGTTCCTAGGTTTGAAATAATTTTAATTTTTTTTTTTTTTAAATAG

160817Fgfp-ruc的序列SEQ ID NO.15：

TTATTTCAAACCTAGGAACTCATCGCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC

160818Rgfp-ruc的序列SEQ ID NO.16：

AACATGTCGGGCAGCATCGCTTATTGTTCATTTTTGAGAACTCG

1％琼脂糖凝胶电泳回收3’pbdt、5'ef1a和gfp-ruc三条带。

接下来用overlap PCR将5'ef1a和gfp-ruc两条带融合，在PCR反应体系中加入5'ef1a和gfp-ruc的胶回收产物，用5'ef1aF和160818Rgfp-ruc引物进行PCR反应，反应体系同表1，反应条件为：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃2min40s，33个循环；60℃7min；16℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳回收5'ef1a-gfp-ruc融合条带。

然后用overlap PCR将5'ef1a-gfp-ruc条带与3’pbdt融合，在PCR反应体系中加入5'ef1a-gfp-ruc和3’pbdt胶回收产物，用5'ef1aF和3'pbdtR引物进行PCR反应，反应体系同表1，反应条件为：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃3min30s，33个循环；60℃7min；16℃保存，1％琼脂糖凝胶电泳回收5'ef1a-gfp-ruc-3'pbdt融合条带，此条带即为GFP和renillaluciferase编码框。

第三步，

快速克隆法连接构AmpR-ori片段与GFP和renillaluciferase编码框，反应体系、质粒框架和插入片段的使用量根据试剂盒说明书进行计算。

转化操作及后续的单菌落挑取，扩培，菌种保存，质粒提取同上所述。

质粒直接进行测序鉴定，测序结果分析用Snapgene软件分析。

实施例3Cas9/sgRNA靶点的筛选

使用sgRNAcas9软件(Java版本)进行靶点筛选，按要求导入靶基因序列和Pf基因组序列，设定参数；靶点序列，即sgRNA序列应为5’-N(19)GG，5’-N(20)GG或5’-N(21)GG序列，优先选择5’-N(20)GG序列；由于本发明没有使用体外转录，只是构建了普通质粒载体，因此本发明的sgRNA序列是指sgRNA对应的DNA序列。

选择Pf非必须基因Pf47作为靶基因，在sgRNAcas9软件中输入Pf3D7的Pf47基因序列(GeneID:PF3D7_1346800)和Pf3D7基因组序列(从PlasmoDB数据库下载)，根据软件给出的结果，选择在基因组中脱靶可能性最低的靶点，其序列为AACTACAGTTGGCTTAACATGG；为避免构建好的载体被Cas9切割，只将AACTACAGTTGGCTTAACAT序列即SED ID NO.1用于构建Cas9/sgRNA表达载体。

实施例4靶向pf47基因位点的Cas9/sgRNA表达载体pCBS-yfcu-pf47的设计和构建

第一步：合成包含pf47sgRNA序列并将引物退火，具体操作如下：

引物序列：

150723Rifpf47的序列SEQ ID NO.17：

GCTATTTCTAGCTCTAAAACAACTACAGTTGGCTTAACAT

150723Fifpf47的序列SEQ ID NO.18:

CATATTAAGTATATAATATTATGTTAAGCCAACTGTAGTT

将引物加水稀释到浓度为10uM，用如表3所示反应体系和程序在PCR仪上进行退火：

表3

退火反应程序：98℃30s；45℃10min；4℃保存；

第二步：将pCBS-yfcu质粒用BtgZI单酶切，反应体系和程序按照BtgZI使用说明书进行操作，用1.0％琼脂糖凝胶电泳质粒片段。

第三步：

快速克隆法将pf47sgRNA退火产物与单酶切后的pCBS-yfcu质粒连接，反应体系、质粒片段和退火产物的使用量根据试剂盒说明书进行计算。

转化操作及后续的单菌落挑取，扩培，菌种保存，质粒提取同前所述。质粒直接进行测序鉴定，测序引物的序列为SEQ ID NO.19：GTATGTACACAATTATTTATAAGTCCAA；测序结果分析用Snapgene软件分析。测序正确后用Magen质粒大提试剂盒对pCBS-yfcu-pf47质粒进行大量制备，由于一次电转实验需要约200μg-400μg质粒，质粒浓度需大于2μg/μL，因此采用以下程序对质粒进行浓缩：

a)估算含有质粒溶液的体积V，加入V/9体积的3M NaAc使NaAc终浓度为0.3M；

b)加入2倍体积冰冷无水乙醇，-20度沉淀2h；

c)15000g，4℃离心10min；

d)加入1-1.5mL 75％乙醇洗涤，15000g，4℃离心5min；

e)重复步骤d一次；

f)将75％乙醇吸干净，后将离心管置于超净工作台内晾干；

g)加入的ddH₂O溶解；

pCBS-yfcu-pf47的质粒结构见图3。

实施例5拯救载体pARM-R787ODki-pf47的设计和构建

(1)5’同源臂的插入

第一步：用XhoI对pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI载体进行单酶切，酶切反应条件按XhoI使用说明书进行操作，1％琼脂糖凝胶电泳回收载体片段。

第二步：以Pf3D7虫血为模板扩增pf47基因5’同源臂，PCR反应体系同表1，反应程序为：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃40s，33个循环；60℃7min；16℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳回收条带；

引物序列如下：

5'armF的序列为SEQ ID NO.20：

GCGGAAGAGCAGATCTAAGCTTCGAGCCGTATGATTTATCATTTG

5'armR的序列为SEQ ID NO.21：

AAGAGGGGTGAACCGTTAAACTCGAGACCGGTCACATACGTATTGTGTTGAG

第三步：

快速克隆法将pf47基因5’同源臂与XhoI单酶切后的pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI载体连接，连接、转化、单菌落挑取，扩培，菌种保存，质粒提取同前所述，将质粒送测序，确认5’同源臂插入正确；此步构建好的载体为pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI-pf475’arm；

(2)3’同源臂的插入

第一步：将上述pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI-pf475’arm载体用KpnI单酶切，酶切反应条件按KpnI使用说明书进行操作。1％琼脂糖凝胶电泳回收载体片段。

第二步：以Pf3D7虫血为模板扩增pf47基因3’同源臂，PCR反应体系同表1，反应条件：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃50s，33个循环；60℃7min；16℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳回收条带；

引物序列如下：

3'armF的序列为SEQ ID NO.22：

ACTTTTCTTCTTCAGGGTAGGGATCCGGTACGGATGTACTATAAACAACCCTAC

3'armR的序列为SEQ ID NO.23：

ACACATGCAGCTCCCGGAGCGGCCGCGGATCTTGAGATGAAAGCATAC

第三步：

快速克隆法将pf47基因3’同源臂与KpnI单酶切后的pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI-pf475’arm载体连接，连接、转化、单菌落挑取，扩培，菌种保存，质粒提取同前所述；将质粒送测序，确认3’同源臂插入正确。此步构建好的载体为pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI-pf47，此载体将作为通用载体用于下一步的质粒构建，也可以用作电转的阳性对照质粒。

(3)用ORF长度为4.6kb的外源基因R787OD替换GFP/RUC片段

第一步：将长度为4616bp的人工PfEMP1R787OD重组蛋白插入至pf3D7的pf47基因位点，R787OD重组蛋白人工PfEMP1R29var-V5-GFP-TM-ATS构建，在其R29var蛋白N端结构域后加入了“AgeⅠ酶切位点-GGPSG连接肽-PstⅠ酶切位点”，V5标签后加入了SacⅠ酶切位点，GFP后加入了“SacⅠ酶切位点-GGPSG连接肽-NheⅠ酶切位点”，编码框长4614bp，该重组蛋白由PfEF1α5’UTR驱动，由PbDT 3’UTR终止，整个表达框的大小为6286bp。

第二步：构建不带GFP报告基因的pARM-R787OD-Pf47载体。基于R29var-V5-GFP-TM-ATS，在R29var蛋白N端结构域后加入“AgeⅠ酶切位点-GGPSG连接肽-PstⅠ酶切位点”，V5标签后加入“SacⅠ酶切位点-GGPSG连接肽-NheⅠ酶切位点”，获得R787DGOI片段，然后通过

快速克隆法与pARM-BtgZⅠ(GFP/RUC)BtgZⅠ-Pf47质粒的通用框架连接，R787OD片段直接由通用生物系统(安徽)有限公司合成并连接到pUC57载体(pUC57-R29-TmATS)。

R787OD片段的PCR反应体系同表1，反应程序：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃5min，32个循环；60℃7min；4℃保存，1％琼脂糖凝胶电泳回收R787OD片段。

PCR引物序列如下：

160817Fr29TmATS的序列为SEQ ID NO.24：

AAAATTAAAATTATTTCAAAATGACGCCAAAGCGTACAAG

160817Rr29TmATS的序列为SEQ ID NO.25：

ATAAATAAGAAAAACGAACAttaGTCGACTATATTCCATACATCCGATATAGG

质粒框架制备：对pARM-BtgZⅠ(GFP/RUC)BtgZⅠ-Pf47质粒进行BtgZⅠ单酶切，回收大片段，酶切体系及反应程序同前所述，酶切后1％琼脂糖凝胶回收大片段。

快速克隆法将R787DGOI片段与BtgZⅠ单酶切后的pARM-BtgZI(GFP/RUC)BtgZI-pf47载体连接，连接、转化、单菌落挑取，扩培，菌种保存，质粒提取同前所述，用SacⅠ、SalⅠ和XbaⅠ对质粒进行酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测，酶切鉴定阳性的质粒送样测序，测序引物如下：

16930FseqR787的序列为SEQ ID NO.26：ACACATTAAGTGGTAACAAACA

16930RseqR787-1的序列为SEQ ID NO.27：CAGATCCATCATCATGTGCG

16930RseqR787-2的序列为SEQ ID NO.28：CGTAACAGGTGTGCATTTC

16930RseqR787-3的序列为SEQ ID NO.29：ATGCTTATCCTCATCGTGGTG

16930RseqR787-4的序列为SEQ ID NO.30：TCTTCGTCTGTATCTCCTTCAAC

16930RseqR787-5的序列为SEQ ID NO.31：CTAAACGTTCATGATGATTTTCCC

测序结果分析所用软件如前所述。

第三步：构建pARM-R787OD-Pf47载体；在pARM-R787OD-Pf47的SacⅠ位点处插入GFP基因，采用

快速克隆法连接，GFP的ORF片段扩增：以Lu等(Lu，J.，et al.(2016)."A redesigned CRISPR/Cas9system for marker-free genome editing inPlasmodium falciparum."Parasit Vectors 9:198.)构建的pARM-GFP/RUCki质粒为模板，PCR体系同表1，反应程序如下：30s；98℃10s，50℃15s，60℃1min 30s，33个循环；60℃7min；16℃保存，1％琼脂糖凝胶电泳回收。

快速克隆法将R787OD片段与SacⅠ单酶切后的pARM-R787OD-Pf47载体连接，37℃孵育3h，1％琼脂糖凝胶电泳回收。

转化操作及后续的单菌落挑取，扩培，菌种保存，质粒提取如前所述。用SacI对质粒进行酶切鉴定。将酶切鉴定阳性的质粒送样测序，测序区段为GFP的ORF，测序引物如下：

161024FseqGFP的序列为SEQ ID NO.32：

GGAAAACTACCTGTTCCATGGC

161024RseqGFP的序列为SEQ ID NO.33：

GCCATGATGTATACATTGTGTGAG

测序结果分析所用软件，质粒的大量制备和浓缩如前所述。

构建好的pARM-R787ODki-Pf47质粒结构图如图4所示。

实施例6电转

电转200μg pCBS-yfcu-pf47和400μg pARM-R787ODki-Pf47质粒至人新鲜红细胞，制备成DNA-loaded RBC，电转液的配制和电转操作完全按照Methods in malariaresearch，Six Edition，P350-351的描述执行；电转结束后，在含有质粒的红细胞中加入成熟的Pf裂殖体，置于三气培养箱培养，每天换液一次，换液间隔时间不超过24小时。

实施例7恶性疟原虫虫株P.falciparum 3D7的体外培养和裂殖体的分离

采用标准化条件对人恶性疟原虫虫株P.falciparum 3D7进行体外培养：包括使用完全培养基(10.4g/L RPMI 1640，25mM HEPES，0.5％(wt/vol)AlbuMAX I，1.77mM碳酸氢钠，100μM次黄嘌呤，12.5μg/mL硫酸庆大霉素，pH值7.2)，1％红细胞压积，37℃三气培养箱(1％O₂，3％CO₂，和96％N₂)中培养。采用吉姆萨染色法(Giemsa staining)计数感染率(感染率＝染虫红细胞数/总红细胞数，一般统计10个视野左右的细胞数，红细胞总数≥1000)；根据感染率的高低决定是否换液，感染率高于5％时每天换液一次，换液时间间隔不超过24小时。待疟原虫感染率达5％左右，用明胶富集的方法分离获得裂殖体。将虫血从细胞培养瓶中转移至离心管，350×g离心5min，去尽上清，用等体积Hepes-buffered RPMI 1640(37℃预热)重悬浮，加入2倍体积1％明胶(gelatin)，轻轻混匀，于37℃细胞培养箱中直立静置15-20min至虫血出现分层；将上层悬浮物转移至一个新的离心管，350×g离心5min，去尽上清，用30mL Hepes-buffered RPMI1640(37℃预热)洗涤两次，350×g离心5min，去尽上清，沉淀为晚期裂殖体。

实施例8药物正筛培养

当感染率达80-90％时(尽量使用初始感染率高的虫血，使得48h内达到这个感染率)，开始加Blasticidin S至终浓度为5μg/mL进行药筛培养，同时补加100μl 50％RBC，接下来，每隔24h涂片检查一次，一般加药24h后虫子的生长基本得到控制，感染率不再上升，4天左右基本上看不到活虫，药压10天左右开始撤药培养。如外源片段插入成功，则20-30天后可以再次看到活虫；药物正筛培养时每周补充50μL50％压积的红细胞。

实施例9转基因疟原虫的PCR及测序鉴定

首先用PCR方法在DNA水平检测了R787OD插入片段在疟原虫基因组中的整合情况，PCR模板为虫血，引物序列和PCR反应条件如下:

引物序列及用途见表4：

表4

反应体系见表1(体系可缩至25μL，所有组分的加入体积按比例缩减)。反应程序为：98℃30s；98℃10s，50℃15s，60℃9min，33个循环；60℃9min；16℃保存；将R787OD表达框的扩增产物(8.0kb)进行测序鉴定，由测序公司自行设计引物测序；

PCR检测和测序结果均证实R787OD表达框已准确插入到了Pf47位点见图5(A)-图5(B)。

实施例10转基因疟原虫中目标基因表达情况分析

由于R787OD表达框包含了GFP，理论上用荧光显微镜可以观察到GFP的表达，然而荧光显微镜观察结果显示，所得的转基因疟原虫没有绿色荧光，原因可能是GFP位于787个氨基酸的R787结构域和478个氨基酸的“跨膜区-ATS胞内区”之间，可能遭遇更大的空间位阻而无法正确折叠。

为了确认R787OD插入片段是否表达，先用RT-PCR方法在RNA水平检测目的基因能否被转录；使用RNAiso Blood(Takara，Code No.9113)试剂盒分别提取野生型Pf3D7和R787OD转基因疟原虫RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行；逆转录用

II Q RTSuperMix for qPCR(+gDNAwiper)(Vazyme，R223-01)进行，具体操作按照试剂盒说明书进行；由于R787OD融合基因包含GFP报告基因，因此RT-PCR检测可以以gfp为目的基因，所用引物如下：

gfp-171017F的序列SEQ ID NO.38：GCCCGAAGGTTATGTACAGG

gfp-171017R的序列SEQ ID NO.39：CGCTTCCATCTTCAATGTTGT

此对引物的扩增长度为263bp，另有内参基因actin的检测引物：

actin-171017F的序列SEQ ID NO.40：GGTGATGAAGCACAAACCAA

actin-171017R的序列SEQ ID NO.41：CCAGTGGTACGACCAGAAGAA

扩增长度为287bp；

RT-PCR检测反应体系同表1。结果显示目的基因能正常转录，见图6(A)和图6(B)；同时还用Western blot在蛋白水平检测了目的基因的表达情况，Western blot检测方法如下：

试剂的配制：

1M Tris-HCl(pH6.8)：取12.14g Tris-base，加60mL去离子水充分溶解，用浓盐酸调pH值至6.8，去离子水定容100mL，室温保存备用；

1.5M Tris-HCl(pH8.8)：取27.23g Tris-base，加80mL去离子水充分溶解，用浓盐酸调pH值至8.8，用去离子水定容150mL，室温保存备用；

10％SDS(w/v)：称取10g SDS，加80mL去离子水充分溶解(可加热促进溶解)，用去离子水定容100mL，室温保存备用；

10％过硫酸铵(APS)：称取1g过硫酸铵，用8mL离子水充分溶解，然后用去离子水定容至10mL，分装保存(最好现配现用，可于4℃短期保存)；

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取15g Tris-base，94g甘氨酸，5g SDS，加入800mL的去离子水，搅拌溶解，用去离子水定容1L，室温保存备用；

5×膜转移缓冲液：称取15g Tris-base，72g甘氨酸，加入800mL去离子水溶解，用去离子水定容1L，室温保存备用，如果使用PVDF膜或NC膜加20％甲醇；

TBS缓冲液：称取8.8g氯化钠，加入20mL 1M Tris-HCl(pH8.0)，加入去800mL离子水，充分溶解后用去离子水定容1L，室温保存备用，(参考《TaKaRa商品目录2012-2013》附录的配制方法)；

TBST缓冲液：取0.5mL的Tween-20，加入TBS搅拌至充分溶解并定容至1L，室温保存备用；

5％脱脂奶粉：称取2.5g脱脂奶粉，加入50mL TBST，充分溶解，4℃短期保存备用；

(1)SDS-PAGE胶制备：根据需要参考《TaKaRa商品目录2012-2013》附录的SDS-PAGE胶配制方法进行配制，或者直接使用预制胶。

(2)样品制备：先用70％的percoll分离获得野生型Pf3D7和R787OD转基因疟原虫裂殖体，然后加入上样缓冲液，吹打裂解虫体，沸水中煮5min，离心去掉沉淀，获得1-2×10⁴虫体/μL的裂解物。

(3)电泳：上样20μL浓缩胶采用80V，跑30min；分离胶采用120V；

(4)转膜：PVDF膜使用前先活化处理(甲醇浸泡10s，然后立即浸于转膜缓冲液中)，转膜采用100V，1.5h，电泳槽置于冰水浴中；

(5)封闭：转膜成功后，用TBST清洗，然后将膜浸泡于5％脱脂奶粉/TBST中，4℃过夜封闭；

(6)一抗孵育：一抗(Anti-V5mouse monoclonal antibody，上海生工)按1:1 000-2 000的比例稀释于5％脱脂奶粉/TBST中，室温孵育1h；

(7)二抗孵育：一抗孵育完毕，用TBST洗膜，然后孵育二抗，二抗(Goat Anti-MouseIgG H&L，Abcam，ab205719)按1:5 000的比例稀释于5％脱脂奶粉/TBST中，室温孵育1h；

(8)显影：使用天能化学发光成像分析系统进行显影操作，化学发光底物试剂盒A液和B液混合后，均匀滴加在PVDF膜上；

Western blot结果显示：目的基因能够表达，条带单一，特异性高，见图6(C)，但是检测到的蛋白大小约250kDa，远高于理论值175.8kDa，提示可能发生了翻译后修饰。

进一步用免疫荧光方法检测了目的基因在红细胞中的表达情况，免疫荧光检测方法如下：

溶液配制方法：

PBSTx：在PBS中加入Triton X-100至终浓度为0.1％，混匀，即为PBSTx；

封闭液5％BSA/PBSTx：1g BSA溶于20mL PBS，分装成1mL/管置于-20℃保存，实验前取适量出来解冻，加入Triton X-100至终浓度为0.1％；

anti-GFP Rabit pAb工作液：1:250稀释，即每1μLAnti-V5mouse mAb加入250μL封闭液5％BSA/PBSTx；

Goat Anti-Rabbit IgG H&L(FITC)：1:500稀释，即每1μLCy3Goat anti-mouseIgG加入500μL封闭液5％BSA/PBSTx；

Anti-V5mouse mAb工作液：1:250稀释，即每1μLLAnti-V5mouse mAb加入250μL封闭液5％BSA/PBSTx；

Cy3Goat anti-mouse IgG工作液：1:500稀释，即每1μLCy3Goat anti-mouse IgG加入500μL封闭液5％BSA/PBSTx。

DAPI(5ug/mL)工作液：将DAPI储液(5mg/mL)按1:1000稀释，即每1μLDAPI工作液加入500μL封闭液5％BSA/PBSTx。

实验方法：

1.取虫血涂布于细胞爬片上，24孔板内，4％PFA室温固定1小时或4℃固定过夜；

2.去固定液，用洗涤液洗3次，每次5分钟，洗涤时用摇床摇动；

3.用封闭液封闭60分钟，封闭时在摇床上轻轻摇动；

4.去封闭液，用160μL Anti-V5mouse mAb或anti-GFP Rabit pAb工作液4℃杂交过夜；

5.去除Anti-V5mouse mAb或anti-GFP Rabit pAb工作液，用洗涤液洗涤5次，每次5分钟，洗涤时用摇床摇动；

6.去除洗涤液，加入160μL Cy3Goat anti-mouse IgG或Goat Anti-Rabbit IgGH&L(FITC)和DAPI工作液室温避光作用1小时；

7.去除Cy3Goat anti-mouse IgG或Goat Anti-Rabbit IgG H&L(FITC)工作液，用洗涤液洗涤5次，每次5分钟，洗涤时用摇床摇动，期间注意避光操作；

8.洗涤结束后将爬片晾干，在载玻片上加少量荧光显微镜油镜专用的香柏油，将细胞爬片正面朝上粘贴于载玻片上，用荧光显微镜拍照；

免疫荧光检测结果显示R787OD蛋白定位于红细胞胞浆，呈明显的点状分布，见图7。

实施例11转基因疟原虫的药物负筛

原虫率达到5％以上，加入5-FC至终浓度为38μM进行负筛选，每天换液至涂片观察不到活虫，改为隔天换液，负筛持续2-3周后，涂片可以看到活虫。

实施例12负筛后虫株的单克隆化

负筛后的虫株，待感染率达到3％以上时，采用有限稀释法对其进行单克隆化，3周左右获得单克隆。

实施例13负筛后单克隆虫株中游离质粒残留的检测

对负筛后获得单克隆虫株进行PCR检测，以鉴定BSD和Cas9编码基因的存在情况，同时对负筛所得的疟原虫的Pf47位点进行检测，确保负筛后获得的疟原虫是R787OD虫株。

实验结果表明，负筛后的单克隆虫株中检测不到BSD和Cas9编码基因的存在，而R787OD片段仍然存在于Pf47位点，说明负筛后的虫株是R787OD转基因疟原虫，且其体内已无药物抗性和Cas9基因编码序列残留，见图8(A)和图8(B)。

胞内免疫荧光检测显示，负筛获得的R787OD单克隆虫株，目的蛋白呈点状分布于红细胞胞浆，与未负筛的疟原虫一致(见图9)；结果表明，负筛后未对转基因疟原虫中外源基因的表达产生影响。

实施例14负筛后单克隆虫株的药物敏感性检测

采用“微孔板-SYBR Green I”法检测R787OD不同单克隆对Blasticidin S的敏感度，结果显示其IC50值为0.89-0.94μg/mL之间，而野生型疟原虫则为1.02μg/mL，统计分析两者之间无显著差异；用5μg/mL的Blasticidin S药筛浓度检测负筛后R787OD虫株能否被有效杀伤，结果显示，负筛后的R787OD和野生型pf3D7虫株之间没有明显区别，均能被有效杀伤(见图10)；说明5μg/mL的Blasticidin S足以抑制R787OD，若需要对R787OD虫株进行再次基因编辑，仍然可以用BSD基因作为药物筛选标记。

实施例15对R787OD虫株的再次基因编辑——在PfNT1基因的N端敲入GFP标签

1、用于PfNT1基因编辑的表达载体和拯救载体的构建

按实施例3、4中的方法，选择在基因组中脱靶可能性最低的靶点，其序列为TATAATCACCCCTGGATTCTGG，将SEQ ID NO.1TATAATCACCCCTGGATTCT序列连接至通用型Cas9/sgRNA表达载体pCBS-yfcu质粒，构建成pCBS-yfcu-PfNT1载体；

参考实施例5中的方法，构建包含5’同源臂和3’同源臂的拯救载体pARM-GFP2aNT1载体，其中5’同源臂序列为SEQ ID NO 42：

GGTTCTCTTTGATACCTATTTTGAAGAATATATATATATATATATAATAAAAATATATTATTTAAAAAGTATGTACAAATTTATTATATAATTAATAACATATAATAAAATAATAATATAATATAACATAATATATATATACATATATATATATATATAGTATAAATTATATAAACTTATTTTAAAATATGTTATATATATATAATATTATATTGTATATATATATATTATATATATATATTATATTATAATAATATTATTATATATAATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTCTTTTTTCTTTTTGACTCTTTTCCATATATATATATATATATATATTTATTTAATAAATATATTTTGTAAAATTTAAAGAATATATATATATTAATATTATGTATATATATTATATAATTAATATAGTAAATAAATAAATATACATATAAATATAATATTATATATATAATATTTTTAGGTATTTATAAAATATATATATATATATATATATATATTTATATATATGTGCTGTTTACATATATATTAATAGGTTAATATATATATATATTTATTTATATTTATATGAATATATAAATATATTATATATTTATTTTGTTTATTTATCTATTATTATTTTATAAAGTAAAA

敲入的GFP标签序列为SEQ ID NO 43：

ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGGTTATGGTGTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGGTTCGGGAGAGGGCAGAGGATCCCTGCTAACATGCGGTGATGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA

3’同源臂序列为SEQ ID NO 44：

ATGTCAACAGGTAAAGAGTCAAGTAAGGCTTACGCCGACATAGAAAGTAGAGGAGACTATAAAGATGATGGAAAGAAAGGATCTACATTAAGCAGTAAACAACATTTCATGTTATCTTTAACCTTTATATTAATAGGTTTAAGTTCTTTGAATGTATGGAATACAGCCTTAGGATTAAATATAAATTTTAAATATAATACCTTTCAGATTACAGGTTTAGTATGTTCCTCAATTGTAGCTTTATTTGTTGAGATTCCCAAAATAATGTTACCATTTCTTTTGGGTGGTTTATCAATTTTATGTGCAGGTTTTCAAATATCTCACAGTTTTTTTACAGATACACAATTTGATACATATTGTTTAGTAGCTTTTATTGTTATTGGTGTAGTGGCAGGATTAGCTCAAACCATTGCATTTAATATAGGATCAACCATGGAAGATAATATGGGTGGTTATATGTCAGCAGGTATTGGTATATCAGGAGTATTTATTTTTGTTATTAATTTATTACTTGATCAATTCGTATCTCCCGAAAAACATTATGGTGTTAATAAAGCAAAGTTATTATATTTATATATAATCTGTGAACTTTGTTTAATATTAGCTATAGTATTTTGTGTATGTAATTTAGATTTAACAAACAAGAATAATAAAAAAGATGAAGAAAATAAAGAAAACAATGCCACATTATCTTATATGGAATTATTTAAAGATAGTTACAAAGCTATATTAACTATGTTTCTTGTAAACTGG

2、PfNT1基因编辑疟原虫的获得

参考实施例6、7、8中的方法，选择R787OD虫株的一个单克隆进行电转和Blasticidin S药筛，Blasticidin S药筛3周左右可以看到活虫。

3、PfNT1基因编辑疟原虫的鉴定

参考实施例9中的方法，用PCR的方法对GFP标签在PfNT1基因N端的整合情况进行了检测，PCR引物序列如表5所示；PCR和测序结果均表明GFP标签已经精确插入至PfNT1基因的N端，用荧光显微镜能观察到GFP的表达。

表5

综上所述，本发明提供的基因编辑系统，以内源U6启动子依赖型载体系统为基础，在表达载体的Cas9表达盒内加入负筛选标记，并将包含同源臂的拯救载体上的抗药筛选标记转移至表达载体上，减少拯救载体的基础大小，扩大其容量，可介导在人疟原虫中敲入长达6.3kb外源基因片段，且获得的重组疟原虫不含抗药筛选标记和Cas9蛋白表达质粒的残留，可使用同一药筛标记对其进行连续基因编辑，性能稳定，高效简洁，功能强大，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州中科蓝华生物科技有限公司

<120> 一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及其应用

<130> 2018年

<160> 48

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

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<212> DNA

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gaacgtctac ttgctacctc 20

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ttatttcaaa cctaggaact catcgcatga gtaaaggaga agaacttttc 50

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<212> DNA

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catattaagt atataatatt atgttaagcc aactgtagtt 40

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gtatgtacac aattatttat aagtccaa 28

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<212> DNA

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gcggaagagc agatctaagc ttcgagccgt atgatttatc atttg 45

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<212> DNA

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acttttcttc ttcagggtag ggatccggta cggatgtact ataaacaacc ctac 54

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<212> DNA

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acacatgcag ctcccggagc ggccgcggat cttgagatga aagcatac 48

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<212> DNA

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aaaattaaaa ttatttcaaa atgacgccaa agcgtacaag 40

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ataaataaga aaaacgaaca ttagtcgact atattccata catccgatat agg 53

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<212> DNA

<213> 人工合成

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acacattaag tggtaacaaa ca 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

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<212> DNA

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cgtaacaggt gtgcatttc 19

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

tcttcgtctg tatctccttc aac 23

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ctaaacgttc atgatgattt tccc 24

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ggaaaactac ctgttccatg gc 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

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gccatgatgt atacattgtg tgag 24

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccatttcttg cttcagttat gtagatacta tgatg 35

<210> 35

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccactgacag aaaatttgtg ccc 23

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<212> DNA

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gtaacagctg ctgggattac ac 22

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工合成

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tttaaaaagt atgtacaaat ttattatata attaataaca tataataaaa taataatata 120

atataacata atatatatat acatatatat atatatatag tataaattat ataaacttat 180

tttaaaatat gttatatata tataatatta tattgtatat atatatatta tatatatata 240

ttatattata ataatattat tatatataat atattttttt tttttttttt tttttttttt 300

ttttttcttt ttttcttttt tctttttgac tcttttccat atatatatat atatatatat 360

ttatttaata aatatatttt gtaaaattta aagaatatat atatattaat attatgtata 420

tatattatat aattaatata gtaaataaat aaatatacat ataaatataa tattatatat 480

ataatatttt taggtattta taaaatatat atatatatat atatatatat ttatatatat 540

gtgctgttta catatatatt aataggttaa tatatatata tatttattta tatttatatg 600

aatatataaa tatattatat atttattttg tttatttatc tattattatt ttataaagta 660

aaa 663

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<212> DNA

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gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaaggttcg 720

ggagagggca gaggatccct gctaacatgc ggtgatgtcg aggagaatcc tggccca 777

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<212> DNA

<213> 人工合成

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atgtcaacag gtaaagagtc aagtaaggct tacgccgaca tagaaagtag aggagactat 60

aaagatgatg gaaagaaagg atctacatta agcagtaaac aacatttcat gttatcttta 120

acctttatat taataggttt aagttctttg aatgtatgga atacagcctt aggattaaat 180

ataaatttta aatataatac ctttcagatt acaggtttag tatgttcctc aattgtagct 240

ttatttgttg agattcccaa aataatgtta ccatttcttt tgggtggttt atcaatttta 300

tgtgcaggtt ttcaaatatc tcacagtttt tttacagata cacaatttga tacatattgt 360

ttagtagctt ttattgttat tggtgtagtg gcaggattag ctcaaaccat tgcatttaat 420

ataggatcaa ccatggaaga taatatgggt ggttatatgt cagcaggtat tggtatatca 480

ggagtattta tttttgttat taatttatta cttgatcaat tcgtatctcc cgaaaaacat 540

tatggtgtta ataaagcaaa gttattatat ttatatataa tctgtgaact ttgtttaata 600

ttagctatag tattttgtgt atgtaattta gatttaacaa acaagaataa taaaaaagat 660

gaagaaaata aagaaaacaa tgccacatta tcttatatgg aattatttaa agatagttac 720

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<210> 45

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<211> 21

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<213> 人工合成

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<213> 人工合成

<400> 47

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<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 48

cggagatatt atgactttct tg 22

Claims

1.一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统，其特征在于，所述系统为内源U6启动子依赖型，包括表达载体和拯救载体；

所述拯救载体包括同源臂插入位点和外源基因片段插入位点。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗药筛选标记包括HDHFR、BSD、NEO、PAC或YDHODH中的任意一种或至少两种的组合，优选为BSD；

优选地，所述负筛选标记包括yFCU和/或HSV-TK，优选为yFCU。

3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1或2所述的系统；

优选地，所述宿主细胞包括恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的中任意一种或至少两种的组合，优选为恶性疟原虫。

4.一种疟原虫基因编辑的方法，采用如权利要求1或2所述的系统，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建权利要求1或2所述的表达载体和拯救载体；

(2)根据目的基因筛选靶点序列并连接至表达载体中；

(5)将疟原虫裂殖体加入步骤(4)制备的DNA-loaded RBC中；

(6)进行抗药筛选和负筛，获得重组疟原虫；

(7)对步骤(6)获得的重组疟原虫进行单克隆化，将不同单克隆进行表达载体残留检测和药物敏感性测试；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述疟原虫包括恶性疟原虫虫株Pf3D7、PfNF54、PfFCR3或PfDd2中的任意一种或至少两种的组合，优选为Pf3D7；

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述外源基因包括R787OD和/或抗原蛋白基因，优选为R787OD。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述制备DNA-loadedRBC的方法为：将载体在大肠杆菌中复制后提取纯化，电转至人红细胞，制备得到DNA-loaded RBC；

8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)构建权利要求1或2所述的表达载体和拯救载体；

(2)根据目的基因Pf47筛选靶点序列并连接至表达载体中；

(6)进行抗药筛选并进行PCR测序鉴定和外源基因表达分析，再进行负筛选；

9.一种采用权利要求4-8中任一项所述方法制备得到的重组疟原虫。

10.一种如权利要求1或2所述的系统、权利要求3所述的宿主细胞、权利要求4-8中任一项所述的方法或权利要求9所述的重组疟原虫用于疟原虫基因大片段敲入和/或设计肿瘤疫苗的应用。