JP2018504916A - 興味対象の配列を含む分子構成要素からｄｎａベクターを生産する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、唯一のタイプIIs制限酵素の存在下で、興味対象の配列を含む分子構成要素から「テーラーメイド」の二本鎖DNAベクターを一工程で作製する方法に関する。【選択図】なし

Description

技術分野
本発明は、興味対象の配列を含む分子構成要素から「テーラーメイド」の二本鎖DNAベクターを生産する方法に関する。
先行技術
現在、DNA操作は、依然として、クローニングベクター又は発現ベクターの使用に幅広く基づいている。プラスミド(幾つかの細菌に天然に存在する環状DNA分子)の機能的要素(抗生物質耐性遺伝子、クローニング部位、分子標識、プロモーター、別の生物の複製起点、選択カセットなど)に相当するDNAフラグメントの挿入又は除去により、種々の用途に適切な多くの異なるベクターの開発が可能となっており、各ベクターは特別で具体的な用途について開発されている。したがって、エンドユーザーは、自身のニーズに適合したベクターを選択し、自身の興味対象のDNAフラグメントにDNAクローニング法により導入する。この方法は、伝統的には、制限酵素(多くの場合で、短いパリンドローム配列のDNAを認識し、切断する酵素をいうタイプIIpの制限酵素)と、制限酵素により生じたDNAフラグメントを一続きに戻すDNAリガーゼとの使用に基づく。この方法は多数の工程を必要とするが、その工程数は、DNAを分解する外因性汚染物への暴露のリスク及び自己対合又は誤対合のリスクを増大させる。同様に、この方法は、程度の差はあれ効果的な多数の酵素を使用を必要とするが、このことは克服困難な短所である。ドナー及びアクセプターのプラスミドの適合性に応じた困難にも直面することがある。実際、用途の幅広い可能性に適合するために、機能性成分が異なる数多くのベクターが市販されている。しかし、各ベクターはその他のものと必ずしも適合性があるわけではなく、特にプラスミド配列中の制限部位の存在又は不在により、或るベクターから別のベクターへの配列移入は比較的複雑となる。或るプラスミドから別のプラスミドへのDNAフラグメントの移入は、幾らかの欠点を有しており、反応収率の急激な低下並びに時間及び試薬に関して高コストを生じる。
ライゲーション制限法及びその派生法に基づくクローニング活性は、エントリーベクター(通常は商業目的のもの)の使用に基づくものであるが、これは、エントリーベクターの機能性成分の性質及び数の制御の欠如を引き起こす。加えて、ライゲーション制限法の使用には、ベクターに挿入されるべきフラグメントのいずれかの側に利用可能な制限部位の提供が必要であり、ベクター自体にも同じ制限部位の提供が必要である。したがって、制限ライゲーションによるDNAの導入を可能にするには、使用する酵素のいずれも興味対象のDNAフラグメント内を切断せず、これら酵素の各々が、フラグメントを挿入すべき箇所であるベクター内の１か所のみで切断することを確実にしなければならない。このため、開発されたベクターはマルチクローニング部位(MCS)を含む。DNAフラグメントへのベクター挿入用のMCSの存在及び使用により、得られたハイブリッドDNA配列中に痕跡(挿入前後で数ヌクレオチドから数十ヌクレオチドの範囲の配列)が残る。この「瘢痕」ヌクレオチドはプラスミドの機能に必要でなく、時として有害でさえある(例えば、融合すべきタンパク質を含む２つの配列の場合)。
Gatewayシステムは、一方のプラスミドから他方のプラスミドへの挿入物の移入の問題に対する１つの解決策として提示されている。しかし、Gatewayシステムは、その他の利用可能な分子ツールと適合性のない、閉鎖系として認識される。更に、Gatewayシステムでは、組換え配列は固定されており、最終的なベクター中に常に痕跡が残る。Golden Gateアセンブリもまた、ドナープラスミド及びレシーバプラスミドをベースにし、Gatewayシステムにとてもよく似ている。
先行技術に記載されている方法の幾つかは、これら限界を克服する解決策として提案されている。例えば、ライゲーション非依存性クローニング若しくは、配列位置非依存性クローニング(LIC/SLIC)の方法又はGibson Assemblyにより、ユーザは複数の制限酵素を使用する必要がなくなり、そのことにより制限酵素の使用に関連した幾つかの技術的限界(適合性、興味対象の配列又はプラスミド中での部位の存在)が除かれる。しかし、それらによっても、最終的なベクターの機能性のより強力な制御は可能にならず、市販の分子ツールに依然として依存する。
出発ベクター及び最終ベクターから離れるために、Wang T.ら(2012), Appl Microbiol Biotechnol 93：1853-1863及びWeber E.(2011), PLoS ONE 6(2)：e16765及びEP2395087及びSarrion-Perdigones A.(2012), PLoS ONE 6 (7)：e21622)は、GoldenBraid又はGolden Gateなどの新しいモジュールクローニング法を提案している。Golden Gateは、WO 2008/095927(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)及びEnglerら PLoS ONE 4 (2009) e5553の論文に記載されている。この方法は、市販されている多く分子ツール(プラスミド)と適合性があり、また多数の供給業者から入手できるタイプの制限酵素の使用に基づいている。したがって、この方法のユーザは、一連の専用品に捕らわれずに済む。この汎用性の欠点は、所望する構築物の全要素が当該方法と適合性であることを検証するために行うべき作業にある。換言すれば、全要素は、タイプIIs酵素の制限部位を天然に欠くか、又は存在する可能性のある部位を除去するために改変しなければならない。
ニーズに合わせたベクターの生産のために、「モジュール」プラスミド骨格がOxford Genetics社(http://oxfordgenetics.com/)により開発された。SnapFast(登録商標)と名付けられたこの骨格は、プラスミドの機能性成分の側面に位置するように配列中に導入された制限部位を含む。このため、各成分は、実験者が望む各改変のための制限ライゲーション法を適用することにより、同じカテゴリの別の成分(例えば、プロモーター、ラベル)で置き換えることができる。しかし、この技法は比較的大量のDNAを必要とする。SnapFast(登録商標)システムは、おそらく、エントリーベクターの機能性の制御に関して、最大のフレキシビリティーをユーザに提供する分子生物学的ツールであるが、欠点が無いこともない。この代替物は、複数の制限酵素の使用に固有の欠点(例えば、興味対象の配列中での部位の存在の可能性、ヌクレオチド瘢痕)及び高い供給コストという欠点を有する。別の限界は、モジュール性が、このベクターの規定骨格により可能となる置換に限定される点である。
この限界を克服するために別のアプローチが開発されてきた。これらは、特に、リコンビナーゼ活性を基にしたクローニングに関する。この技法は、大きな構築物中の複数の制限部位から生ずる問題を低減するが、組換部位が最終アセンブリ製品に残り、このことがタンパク質をコードする配列の連結を伴わないアセンブリが妨げられるという事実(Weber E.(2011), PLoS ONE 6 (2)：e16765及びEP2395087)により制限される。加えて、この方法によれば構築中に少数のフラグメントのみ組み立てることができる。更に、最終ベクターの組成(興味対象の配列及び機能的モジュール)の完全な制御は達成されない。
このことは、遺伝子合成技術により可能になる。しかし、この技術は、ユーザが、製造前にベクターの完全な設計を提供することが必要とし、僅かなミスが投資の完全かつ不可逆的な喪失と同義である。加えて、この特注製造は高価で、長期のプロセスである。
文献US 2014 0038240は、幾つかの連続工程で実施されるアセンブリ法を記載する。この方法は、一本鎖DNAステイプル又はアダプターのいずれかの使用を必要とする。ステイプルに関連する欠点は、ステイプルが二次元構造をとり得、自己対合し得、タンパク質によりマスクされ得る点である。このことにより、アセンブリに関連した困難性及び低い収率に至ることがある。別の実施形態によれば、文献US 2014 0038240は、アダプターを利用して実施されるアセンブリ法を記載する。この実施形態は、一本鎖末端を生じさせるために或る数の制限酵素の使用を必要とする。
組換えによる全てのクローニング技法は、一般に、不要な配列(組換えに用いた配列)を最終ベクターに残す。
既存の方法又は技法のいずれによっても、ユーザは、容易に(単一工程で)、低コストで(単一酵素の存在下で)かつ短期間に、完全なモジュール方式の特注発現ベクターを製造することができない。
よって、複雑なDNA分子を組み立てて、完全に選択された(すなわち、その構成成分(特に機能性成分)の性質及び数を制御することができる)構築物を、良好な収率でエラーなく、容易に取得することを可能にする方法の提案が真に必要である。
したがって、上記の問題の全てを克服することができ、、より効果的、より経済的、より迅速な新たな方法を開発することが必要である。
本発明はこれら問題に対処するものである。
発明の開示
本発明は、少なくとも２つの興味対象の配列を含んでなる環状二本鎖DNAベクターを作製する方法に関し、該方法は次：
ａ)互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を、タイプIIs制限酵素である単一の制限酵素の存在下で同時に接触させる工程であって、各分子構成要素が線状二本鎖DNA分子であり、
(ｉ)前記タイプIIs制限酵素の特異的認識部位を有さず、機能単位又は非機能単位である少なくとも１つの単位を含んでなる興味対象の配列、及び
(ii)前記興味対象の配列の上流及び下流に隣接し、各々が、前記タイプIIs制限酵素の唯一の認識部位を含む少なくとも12ヌクレオチドの配列からなる２つの二本鎖DNAアダプター
を含み、ここで、前記単位は機能的モジュール又は非機能的モジュールである少なくとも１つのモジュールを含んでなり、前記上流のアダプターのタイプIIs制限酵素認識部位及び前記下流のアダプターのタイプIIs制限酵素認識部位は相近しており(convergent)、
該工程が
− 用いるタイプIIs制限酵素の認識部位の、切断による除去、
− 前記興味対象の配列の末端の各々での、少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの形成、ここで、少なくとも２つの興味対象の配列の１つの上流の少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAが、別の興味対象の配列の下流の少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAと相補性であり、
− 少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAの、ヌクレオチド相補性による対合、
− 単一の規定された順序正しい方向で互いに隣接した興味対象の配列の配置、
を導く工程、
ｂ)環状二本鎖DNAベクターが得られるように、少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAのライゲーション工程
を含んでなる。
１つの実施形態によれば、本発明の方法は、少なくとも２つの興味対象の配列を含んでなる環状二本鎖DNAベクターを作製する方法に関し、該方法は次：
ａ)互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を、タイプIIs制限酵素である単一の制限酵素の存在下で同時に接触させる工程であって、各分子構成要素が、非付着性末端を有する線状二本鎖DNA分子であり、
(ｉ)前記タイプIIs制限酵素の特異的認識部位を有さず、機能単位又は非機能単位である少なくとも１つの単位を含んでなる興味対象の配列、及び
(ii)前記興味対象の配列の上流及び下流に隣接し、各々が、前記タイプIIs制限酵素の唯一の認識部位を含む少なくとも12ヌクレオチドの配列からなる２つの二本鎖DNAアダプター
を含み、ここで、前記単位は機能的モジュール又は非機能的モジュールである少なくとも１つのモジュールを含んでなり、前記上流のアダプターのタイプIIs制限酵素認識部位及び前記下流のアダプターのタイプIIs制限酵素認識部位は相近しており、
該工程が
− 用いるタイプIIs制限酵素の認識部位の、切断による除去、
− 前記興味対象の配列の末端の各々での、少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの形成、ここで、少なくとも２つの興味対象の配列の１つの上流の少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAが、別の興味対象の配列の下流の少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAと相補性であり、
− 少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAの、ヌクレオチド相補性による対合、
− 単一の規定された順序正しい方向で互いに隣接した興味対象の配列の配置、
を導く工程、
ｂ)環状二本鎖DNAベクターが得られるように、少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAのライゲーション工程
を含んでなる。
本発明による方法は、タイプIIs制限酵素である唯１つの制限酵素の使用を必要とする。
本発明の特別な態様によれば、本発明によるベクター(特に、本発明の方法により取得したベクター)は、マルチクローニング部位を有しない。
本発明において、二本鎖DNAが５'→３'方向に読む慣例は尊重される。
記載した発明により、ベクターの製造における従来の制限酵素の使用を完全に排除し、よってその欠点を全て回避することが可能になる。このことにより、ベクターの製造に要する時間が遥かに短くなり、エラーの危険性も劇的に低下する。したがって、製造コストが顕著に低下し、各研究機関で多様な制限酵素のストックを持ち、維持する必要も低減する。
用語「従来の制限酵素」はタイプIIp制限酵素を意味する。
本発明により、サブクローニング法用のエントリーベクターの使用を排除することが可能になる。換言すれば、サブクローニングの実行を可能にするために、もはや複数のベクターのコレクションを獲得又は維持する必要はない。このことは、時間の節約として表れる(細菌培養及びプラスミド精製)。
加えて、本発明による方法は、複数の発現カセットを含むベクターの設計を可能にする。細胞又は生物の遺伝子改変に関して、このことにより、ユーザは、興味対象の系に興味対象の複数の遺伝子を同時に移入するために、唯１つのベクター、したがって単一の選択工程の使用をすることが可能となる。
本発明はまた、ベクターの内容物を、ユーザが選択した興味対象の配列のみに制限することが可能となる。従来の制限酵素の使用及びマルチクローニング部位を用いる必要性に由来する残存するプラスミド配列もヌクレオチド瘢痕もなくなる。よって、本発明により、ユーザは、製造されたベクターの成分を完全に制御することができる。
本発明は、対合の組合せによるキメラ遺伝子の作製に適しており、これらアプローチに基づく応用(例えば、分子内標識又はプロモーター分析)に完全に適合性である。このことに関して、本発明により、単一工程で数多くの異なる発現ベクターの同時作製が可能となる。したがって、本発明により、ベクターの全体構造を改変することなく、選択された成分(例えば、耐性遺伝子、分子マーカー)の１つ又は２以上で相互に異なる一連のベクターを迅速に(併行して)製造することが可能になる。
これら全ての理由から、記載された本発明は、最も効果的な公知の方法と比較して技術的及び経済的に魅力的な方法を構成するものである。
本発明によれば、用語「ベクター」は、遺伝子情報を含み、該遺伝子情報を伝達することができるDNA分子を意味する。ベクターはまた、プラスミド起源の分子又は遺伝子操作により改変されたプラスミドであることができ、選択した細胞又は生物へのDNA配列の移入を意図されるものである。
本発明によれば、「プラスミド」は、染色体DNAとは異なり、自律複製が可能なDNA分子である。プラスミドは、一般に、環状であり二本鎖を有する(二本鎖DNA)。
本発明による「プラスミド起源の分子」は、少なくとも一部がプラスミド由来の核酸から形成された分子である。
用語「発現ベクター」は、選択した細胞又は生物において遺伝子の遺伝情報を理解し、及び/又はその発現を可能にするために用いられる任意のベクターを意味する。
本発明によれば、各ベクターの機能性は、当該ベクターを構成するモジュールが持つ基本的機能の組合せ及び/又はその使用に従って規定される。
一般に、用語「興味対象の配列」は、実験者が使用したいと望み、及び/又は興味対象の別の配列と共に組み立てたいと望む核酸の配列を意味する。
本発明による用語「興味対象の配列」はまた、１又は２以上の機能モジュールに対応する遺伝子情報を含む核酸の配列を意味する。
用語「単位」は、DNA配列に含まれる全ての情報であって、ベクターの根本機能の１つに対応する組み込まれた遺伝子機能を該配列に提供するものを規定する。定義から、単位は、モジュールのセットから構成され、このモジュールの組合せにより当該単位の機能を生じる。
「細菌単位」又は「細菌維持単位」は、原核生物系におけるベクターの複製及び選択を保証する機能を有する。
「発現単位」は、興味対象の系(真核生物系又は原核生物系)における遺伝子産物の発現を可能にする機能を有する。
「真核又は原核細胞における組込単位」は、１又は２以上の導入遺伝子を興味対象の系のゲノムにおいて保持することを可能にする機能を有する。
ベクターは、最小単位として、細菌機能単位を含まなければならず、１若しくは２以上の発現単位及び/又は１若しくは２以上の組込単位を含むこともできる。
したがって、発現ベクターは、細菌機能単位及び発現単位を含まなければならない。発現ベクターはまた、１又は２以上の他の発現単位及び１又は２以上の組込単位を含むことができる。
物理的観点から、ベクターは、単位を、１又は２以上の興味対象の配列により提供されることができる。単位は、単一配列に含まれる場合、事実上機能的である。
本発明によれば、機能単位(細菌性単位、発現単位、組込単位)は、一般に、記載された機能に必要なモジュールのセット(少なくとも１つのモジュール)を含む。
本発明による機能単位は、それ自体で、ベクターに生物学的機能を付与するに十分である。
本発明によれば、機能単位は、機能的モジュール又は非機能的モジュールである少なくとも１つのモジュールを含む。
一般に、機能モジュールは、機能単位の機能に関与することによってベクターに機能を付与する核酸配列を意味する。機能モジュールは、その他のモジュールとの組合せで機能単位の機能に関与する配列により表される物理実体である。
よって、用語「モジュール」は、DNA配列に含まれる情報であって、ベクターの機能に有用な最小遺伝子機能を当該配列に付与するものを規定する。この最低基準を満たす情報は、例えば、次のものにより構成される：
− プロモーター
− コーディング配列
− ターミネーター
− 機能性RNA(イントロン、ヘアピンRNA、非コーディング長RNA)に対応する非コーディング配列
− エンハンサー
− インスレーター
− IRES配列
− リコンビナーゼ標的配列
− 複製起点
− 遺伝子座に対して相同な配列。
本発明によれば、機能モジュールは、ベクターの機能性に関与する基本機能を生じるに必要十分な遺伝子情報を含む配列(特に、複製起点、プロモーター、ターミネーター、組換え配列、コーディング又は非コーディング配列、翻訳調節配列など)である。
本発明による非機能モジュールは、特定の状況(例えば、特別な宿主細胞)では機能を有しないが、その他の機能的若しくは非機能的モジュールと組み合わされた場合又は適切な状況で用いられた場合には機能を有することができる。
例えば、機能的な発現単位(又は発現カセット)では、必要な最小モジュールは、プロモーター、発現産物をコードする配列、及びターミネーターである。この機能を改変するため、この単位にその他のモジュールを含ませることができる。
換言すれば、モジュールで規定される情報がそれ自体で機能を支持するに十分であるとき、該モジュールは機能的といわれる：例えば、コーディング配列全体(ATGから終止コドンまで)又は規定されたプロモーター(転写因子の認識部位及び転写開始部位の存在)は、機能モジュールを構成する。存在する情報ではこの最小機能が得られない場合、モジュールは非機能といわれる。例えば、不完全なコーディング配列(ATG又は終止コドンの不在)又は短縮型プロモーター(転写因子の認識部位の不在又は変異)は、定義から、「非機能」モジュールである。
したがって、モジュールは、組合せにより機能単位の生物学的機能を生じる、規定された単一機能を有する。
発現ベクターは、１つの細菌性機能単位及び１つの発現機能単位を少なくとも含む複数の単位を含むことができる。
用語「分子構成要素」は線状二本鎖DNA配列を意味する。有利な実施形態によれば、分子構成要素は、２つのDNA鎖の各々に３'オーバーハングヌクレオチド(アデニン)を有する線状二本鎖DNA配列である。より有利な実施形態によれば、分子構成要素は線状二本鎖平滑末端DNA配列である。
本発明による分子構成要素は、アダプターがいずれの側にも位置する興味対象の配列から構成される。
本発明によれば、１つの構成要素はベクターを形成し得ない。換言すれば、１つの構成要素は単独でベクターを構成することができない。
図30は、本発明による構築物の非限定的な例を示す。
この例では、興味対象の配列(SI)の順序正しいアセンブリは、４つの別個の機能単位を含むベクターを生じる：
− 細菌単位は２つのSI：Ａ及びＧから構成される。SIであるＡは機能モジュール(１)を含み、SIであるＧは２つの機能モジュール(９及び10)を含む。定義から、SIであるＡ及びＧは各々(細菌性の)非機能単位を含む。
− 組込単位は３つのSI：Ｂ、Ｅ、Ｆから構成される。SIであるＢ及びＦは各々、非機能モジュール(それぞれ2a及び2b)を含む。同一のベクター中にこれら２つの非機能モジュールが同時に存在することにより機能モジュールが構成される。この場合、再構成されたこの機能モジュールによって、配列Ｂ＋Ｆによる標的遺伝子座でのDNA配列Ｃ＋Ｄ＋Ｅの組込が可能となる。SIであるＥは、ポジティブ選択遺伝子をコードする３つの機能モジュール(６、７、８)を含む。この場合では、この遺伝子によって、ゲノムに配列Ｃ＋Ｄ＋Ｅが安定様式で組み込まれた標的細胞の選択が、選んだ選択遺伝子に対応する抗生物質での処理により可能となる。定義から及びこの例に記載した状況では、SIであるＢ、Ｅ、Ｆは各々、非機能性組込単位を含む。
− 発現単位１は２つのSI：Ｃ及びＤから構成される。SIであるＣ及びＤは各々、機能モジュール及び非機能モジュール：Ｃについては３及び4a；Ｄについては５及び4bを含む。この例では、アセンブリは、モジュール4a及び4b(これらは、結合すると、完全なコーディング配列を構成する)から機能モジュールを生じる。定義から、SIであるＣ及びＤは各々、非機能性発現単位を含む。
− 発現単位２は、SIであるＨに含まれる。SIであるＨは３つのモジュール：11、12、13を含む。定義から、SIであるＨは(発現)機能単位を含む。
表１は、本発明による単位及びモジュールの非制限的リストを示す。
表１．本発明による単位及びモジュールの例
特定の実施形態によれば、本発明は、一本鎖縫合DNAがいずれかの側に位置する興味対象の配列を含む分子構成要素に関する。
興味対象の配列に含まれる情報によれば、本発明によるアセンブリに用いられる分子構成要素は、最終ベクターに１又は２以上の機能、例えば；
− 複数の機能単位
− １つの機能単位
− １つの非機能単位
− １つの機能モジュール
− １つの非機能モジュール
− 複数の機能モジュール
を提供する。
用語「制限酵素」は、核酸に結合して該核酸を切断することができるタンパク質を意味する。
一般に、タイプIIs制限酵素は、非パリンドローム認識部位において、したがって配向様式で二本鎖DNAに特異的に結合し、該二本鎖DNAの２本の鎖を認識部位から固定距離で切断する酵素である。よって、認識部位及び切断部位のヌクレオチド配列は異なる。
慣例により、タイプIIs酵素の部位は、切断部位が認識部位の後に位置するように配向される。
本発明によれば、タイプIIs酵素はDNAに結合して結合部位の下流を切断する。
作製された付着性末端の長さ−又はタイプIIs酵素の認識部位と切断部位との間の距離−は、用いるタイプIIs酵素に依存する。
切断部位のヌクレオチドは認識部位の部分を構成しない；それらは、DNAを構成する４ヌクレオチドの塩基から選択することができる。
本発明による方法で用いられるタイプIIs酵素は、http://rebase.neb.com/rebase/rebase.htmlで言及されるタイプIIs酵素から選択される。
有利には、Lippowら(2009), Nucleic Acides Res, 37：3061-3073に記載されるように、一方のDNA鎖の切断部位から２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16又は17ヌクレオチドの距離に認識部位を有するタイプIIs酵素を用いる。本発明による切断部位は、２つのDNA鎖の各々に生成される切断箇所の間に含まれる配列として定義される。
本発明によれば、興味対象の配列は完全に定義されており、本発明による方法の工程(ａ)で用いられるタイプIIs酵素により認識される制限部位(認識部位)を含まない。
本発明によれば、「相近部位」は、タイプIIs酵素が、興味対象の配列の上流及び下流に一本鎖縫合DNAを生成することを可能にする部位を意味する。
有利な実施形態によれば、「タイプIIs酵素の相近認識部位」は、タイプIIs酵素がDNAのいずれにも結合し、興味対象の配列の上流及び下流でDNAを切断して(図１参照)、上流及び下流で一本鎖末端を生じるように、相近しておりDNAの２つの相補鎖の各々に１つ位置する、タイプIIs酵素の２つの認識部位を意味すると理解される。
本発明による用語「アダプター」は、分子構成要素において興味対象の配列のいずれか側に位置する少なくとも８ヌクレオチド又は９ヌクレオチド以上、特に８〜100ヌクレオチド、好ましくは12ヌクレオチドのDNA配列を意味する。
特に、本発明によるアダプターは、分子構成要素において興味対象の配列のいずれかの側に位置する少なくとも12ヌクレオチド又は13ヌクレオチド以上、特に12〜100ヌクレオチド、好ましくは12ヌクレオチドのDNA配列である。
アダプターは少なくとも次のもの：
− 本発明による組立てに用いるタイプIIs活性を有する酵素の結合部位に対応する５、６、７又は８以上のヌクレオチドの配列、
− 用いる酵素の結合部位と切断部位との間隔に対応する１〜８ヌクレオチド又は９ヌクレオチド以上の配列(この配列の長さは、用いるタイプIIs酵素の固有特性に依存する)、
− 用いるタイプIIs酵素の作用により生じる一本鎖末端に対応する２〜５ヌクレオチド又は６ヌクレオチド以上の配列(この配列により、組み立てられるべきフラグメントの対合が可能になるので、事実上、この針列は縫合DNAの定義に対応する)
を含む。
本発明によれば、アダプターは、本発明による方法の工程(ａ)で用いられるタイプIIs酵素により認識される単一の制限部位(認識部位)を含む。
用語「縫合DNA」は、２〜５ヌクレオチド又は６ヌクレオチド以上の一本鎖(又はモノフィラメント)配列を意味する。
本発明によれば、縫合DNAは、組立てに用いられるタイプIIs酵素の作用により興味対象の配列の上流及び下流で生じる一本鎖末端に対応する２〜５ヌクレオチド又は６ヌクレオチド以上の配列である。
２〜５ヌクレオチド又は６ヌクレオチド以上のこの配列(その相補配列と対合する)は、アダプター中に、したがって分子構成要素中に、そして最終反応産物(ベクター)中にも存在する。
用語「相補的」又は「相補性」は、２つの配列の100％のヌクレオチド塩基が互いに対合していることを意味する。本発明によれば、構成要素n-1の下流の一本鎖縫合DNAの配列の100％が、構成要素ｎの上流の一本鎖縫合DNAの配列の100％と対合し、したがってこの縫合DNAは相補的である。
一本鎖縫合DNAの２つの配列の対合は二本鎖縫合DNAを構成する。
本発明による用語「縫合DNA」はまた、構成要素ｎの上流の一本鎖配列と対合した、構成要素n-1の下流の一本鎖配列を意味する。
本発明によれば、縫合DNAは、本方法により得たベクター中の二本鎖DNA配列である。
本発明の過程で生成される縫合DNAの配列は、一方で、組立ての間の興味対象の配列の順序正しい方向付け及びその機能化を可能にし、他方で、最適収率を可能にするように完全に定義される。結果として、生成された縫合DNAの配列は、各分子構成要素の特徴であり(縫合DNAの配列の構成要素内選択)、また、分子構成要素の各々が互いに対して整列される順序に依存する(縫合DNAの配列の構成要素間選択)。
縫合DNAは瘢痕(特に、ベクターに機能障害を導入する瘢痕)ではない。
したがって、本発明によれば、縫合DNAは、分子構成要素の各々の一体部分であり、加えて、その全体又は一部が、モジュールを構成する遺伝子情報の一部を構成し得る。
縫合DNAは、コンピュータの支援を受けて、組立ての間の興味対象の配列の順序正しい方向付け及び最適収率を確実にするように合理的様式で選択する。
本発明によれば、興味対象の配列の上流末端及び下流末端の各々で作製される少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAは、「DNAパリンドロームをもたらすz×z個の組合せを除く４zの可能な組合せ(ｚは２〜10であり、ｚは一本鎖縫合DNAのヌクレオチド数である)」から選択される配列を含む。
本発明による方法は、本発明に従って定義されるタイプIIs制限酵素の作用と本発明に従って定義されるリガーゼの作用とを組み合わせる酵素反応を含む。１つの実施形態によれば、本発明による方法は組立て法である。反応産物はDNA分子であり、好ましくは環状で、所望の数の分子構成要素(これらは、縫合DNAの相補性に基づいて正しく順序付けられた様式で組み立てられている)を含むDNA分子である。各構成要素に含まれるモジュールの数にかかわらず、構成要素の順序正しい方向付けは、事実上、モジュールの順序正しい方向付けを確実にする。
有利な実施形態によれば、本発明による方法は瘢痕のない組立て法である。
１つの実施形態によれば、本発明によるアダプターは、タイプIIs酵素の他の認識部位を少なくとも１つ含む。ここで、該部位は、本発明による方法に用いられるものとは異なるタイプIIs酵素により認識され、本発明による方法に用いられるタイプIIs酵素により認識されない。
有利な実施形態によれば、本発明によりアダプターは、追加的に、少なくとも１つの制限部位を含み、より有利には、希な制限部位から選択される少なくとも１つの制限部位、更により有利には、NotI、PacI、PmeI、SwaI、SmiI、SgsI、SgrDI、SgrAI、SbfI、FseI、AscI、AsiSI、MreI、MssIから選択される希な制限部位を含む。
本発明による全ての実施形態において、本発明による方法に用いられるタイプIIs酵素の、各アダプター中に存在する認識部位は、アダプターにのみ位置する単一部位からなり、該部位は本発明による興味対象の配列には含まれない。
本発明による方法は、DNA配列(特に、単一DNA配列)を認識するタイプIIs酵素を唯１つ利用する。
本発明は、単一配列を認識する単一のタイプIIs酵素に限定されない。
所望の制限活性を有する(つまり、単一の配列に結合し、予想される一本鎖DNA配列を生じることができる)任意のタイプIIs酵素が本発明の一部を構成する。
同様に、タイプIIs酵素の認識及び/又は活性に影響を与えないか又はほとんど影響を与えない変異を有する配列は本発明の一部を構成する。
１つの実施形態によれば、本発明は、ベクターV1(配列番号41)を得るために、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)及びshB3Galt6 BsaI A(配列番号40)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明は、ベクターV1.1(配列番号48)を得るために、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、shB3GALT6 BsaI B(配列番号46)及びHygroR BsaI B(配列番号47)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明は、ベクターV1.2(配列番号53)を得るために、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、rosa26-5' BsaI A B(配列番号39)、shB3GALT6 BsaI B(配列番号46)、HygroR BsaI C(配列番号51)及びrosa26-3' BsaI A(配列番号52)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明はベクターV1.3(配列番号58)を得るために、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、rosa26-5' BsaI A(配列番号49)、pCMV BsaI C(配列番号50)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、shB3GALT6 BsaI B(配列番号46)、HygroR BsaI C(配列番号51)、rosa26-3' BsaI B(配列番号54)、pEF1a BsaI A(配列番号55)、TK BsaI A(配列番号56)及びTkter BsaI A(配列番号57)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明はベクターV2(配列番号62)を得るために、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)及びTkter BsaI A(配列番号57)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明はベクターV3(配列番号66)を得るために、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A (配列番号60)、mb3GALT6 BsaI B(配列番号63)、Tkter BsaI B(配列番号64)及びshB3Galt6 BsaI C(配列番号65)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明はベクターV2b(配列番号149)を得るために、構成要素Ori BsaI A(配列番号104)、AmpR BsaI A(配列番号105)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)及びTkter BsaI A(配列番号57)同時に接触する工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明はベクターV3b(配列番号150)を得るために、構成要素Ori BsaI A(配列番号104)、AmpR BsaI A(配列番号105)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mb3GALT6 BsaI B(配列番号63)、Tkter BsaI B(配列番号64)及びshB3Galt6 BsaI C(配列番号65)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明はベクターV1.1b(配列番号151)を得るために、構成要素Ori BsaI B(配列番号106)、AmpR BsaI B(配列番号107)、pEF1aL BsaI B(配列番号108)、EGFP-CAAX BsaI A(配列番号109)、BGHpA BsaI C(配列番号110)、pCMV BsaI D(配列番号111)、SiaT BsaI B(配列番号112)、mCherry BsaI B(配列番号113)、TKter BsaI B(配列番号64)及びHygroR BsaI D(配列番号114)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明はベクターV4(配列番号152)を得るために、構成要素Ori-2 BsaI C(配列番号115)、AmpR BsaI C(配列番号116)、MNN10-Lrec BsaI A(配列番号117)、KanMX BsaI A(配列番号119)、MNN10-Rrec BsaI A(配列番号118)を同時に接触させる工程を含む上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明は、配列番号30、31、32、33、34及び35の配列のベクターの群から選択されるベクターを得るための上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明は、配列番号41、48、53、58、62及び66の配列のベクターの群から選択されるベクターを得るための上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明は、配列番号149、150、151及び152の配列のベクターの群から選択されるベクターを得るための上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
１つの実施形態によれば、本発明は、配列番号30、31、32、33、34、35、41、48、53、58、62、66、149、150、151及び152の配列のベクターの群から選択されるベクターを得るための上記の環状二本鎖DNAベクター作製法に関する。
特別な態様によれば、本発明は、上記方法に関し、該方法は：
ａ)ｎ個の分子構成要素を同時に接触させる工程であって、各分子構成要素が線状二本鎖DNA分子(特に、非付着性末端を有する線状二本鎖DNA分子)であり、(ｉ)前記タイプIIs制限酵素の特異的認識部位を有さず、機能単位又は非機能単位である少なくとも１つの単位を含んでなる興味対象の配列(SI)i、及び(ii)互いに異なり、それぞれ前記興味対象の配列(SI)iの上流及び下流に隣接し、各々が少なくとも12ヌクレオチドの配列からなる２つの二本鎖DNAアダプターA(i-1,i)及びA(i,i+1)
を含み、ここで、
前記単位は、機能的モジュール又は非機能的モジュールである少なくとも１つのモジュールを含んでなり、
− 二本鎖DNAアダプターA(i-1,i)の少なくとも12ヌクレオチドの配列が、前記タイプIIs制限酵素の唯一の認識部位、及び前記タイプIIs制限酵素の認識部位の下流の少なくとも２ヌクレオチドの縫合DNA s(i-1, i)を含み、
− 二本鎖DNAアダプターA(i+1,i)の少なくとも12ヌクレオチドの配列が、前記タイプIIs制限酵素の唯一の認識部位、及び前記タイプIIs制限酵素の認識部位の上流の少なくとも２ヌクレオチドの縫合DNA s(i,i+1)を含み、
前記上流の二本鎖DNAアダプターA(i-1,i)のタイプIIs制限酵素認識部位及び前記下流の二本鎖DNAアダプターA(i,i+1)のタイプIIs制限酵素認識部位は相近しており、
(SI)1は、i=1である興味対象の配列(SI)iであり、
(SI)nは、i=nである興味対象の配列(SI)iであり、
ｎが２〜100の整数であり、ｉが１〜ｎの範囲であり、ｉはi=1のときにはｎとは異なり、i=nのときにはi+1は1であり、
i=1のときには、i-1=nであり、結果として、(SI)1の上流で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA si-1が(SI)nの下流で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA sn+1の相補配列であり、
i=nのときには、(SI)nの下流で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA sn+1が(SI)1の上流で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA si-1の相補配列であり、
該工程が
− 用いるタイプIIs制限酵素の認識部位の除去、
− (SI)iの上流末端及び下流末端の各々での、少なくとも２ヌクレオチドの一本鎖縫合DNAによる付着末端の形成、
− (SI)iの下流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの、(SI)i+1の上流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAとのヌクレオチド相補性及び(SI)iの上流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの、(SI)i-1の下流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAとのヌクレオチド相補性による対合、
− 単一の規定された順序正しい方向で互いに隣接した(SI)iの配置
を導く工程、
ｂ)環状二本鎖DNAベクターが得られるように、少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAのライゲーション工程
を含んでなる。
本発明によれば、興味対象の配列の下流のアダプターのタイプIIs酵素の認識部位は、該認識部位が除去されて一本鎖縫合DNAが生じるよう酵素がDNAを切断するように、位置し、配向している(図１)。
本発明によれば、本方法はリガーゼの存在下で実施される。
用語「リガーゼ」は、核酸鎖を結合する、リガーゼ(EC6)、特にDNAリガーゼ(EC 6.5.1.1)のクラスの酵素を意味する。本発明によるリガーゼは、DNA末端、オリゴヌクレオチド、RNA、ハイブリッドRNA-DNAを結合する。本発明によりリガーゼは、好ましくは、付着性末端で核酸分子を結合する。
本発明による方法に用いられるリガーゼは、T3、T4、T7又はTaqリガーゼから選択されるリガーゼであり、好ましくはT3リガーゼ、より好ましくはT7リガーゼ(T7 DNAリガーゼ)、更により有利にはT4リガーゼである。
１つの有利な実施形態によれば、本発明による方法は、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を単一のタイプIIs制限酵素の存在下で同時に接触させる工程(ａ)が、20℃〜55℃の範囲の温度で２分間〜30分間行われ、
ライゲーション工程(ｂ)が10℃〜40℃の範囲の温度で２分間〜30分間行われ、
(ａ)及び(ｂ)は１〜49回繰り返すことができ、
更に、
(ｃ)41〜60℃の範囲にて0.5分間〜15分間の少なくとも１つのインキュベーション工程、及び、場合により、
(ｄ)61〜90℃の範囲にて0.5分間〜15分間のインキュベーション工程
を含んでなる方法である。
１つの有利な実施形態によれば、本発明による方法は、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を単一のタイプIIs制限酵素の存在下で同時に接触させる工程(ａ)が、20℃〜55℃の範囲の温度で２分間〜30分間行われ、
ライゲーション工程(ｂ)が10℃〜40℃の範囲の温度で２分間〜30分間行われ、
(ａ)及び(ｂ)は１〜49回繰り返すことができ、
更に、
(ｃ)41〜60℃の範囲にて0.5分間〜15分間の少なくとも１つのインキュベーション工程、及び、
(ｄ)61〜90℃の範囲にて0.5分間〜15分間のインキュベーション工程
を含んでなる方法である。
１つの特別な実施形態によれば、本発明による方法は、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を単一のタイプIIs制限酵素の存在下で同時に接触させる工程(ａ)が、20℃〜55℃の範囲の温度で２分間〜30分間行われ、
ライゲーション工程(ｂ)がTAqリガーゼの存在下40℃を超える範囲の温度で行われる方法である。この１つの特定の実施形態によれば、ライゲーション工程(ｂ)は95℃より低い温度、好ましくは65℃より低い温度で行われる。
ライゲーション工程(ｂ)は２分間〜30分間行われ、
(ｂ)は１〜49回繰り返すことができ、
更に、この方法は、
(ｃ)41〜60℃の範囲にて0.5分間〜15分間の少なくとも１つのインキュベーション工程、及び、場合により、
(ｄ)61〜90℃の範囲にて0.5分間〜15分間のインキュベーション工程
を含んでなる。
１つの特別な実施形態によれば、本発明による方法は、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を単一のタイプIIs制限酵素の存在下で同時に接触させる工程(ａ)が、20℃〜55℃の範囲の温度で２分間〜30分間行われ、
ライゲーション工程(ｂ)がTAqリガーゼの存在下40℃を超える範囲の温度で行われる方法である。この１つの特定の実施形態によれば、ライゲーション工程(ｂ)は95℃より低い温度、好ましくは65℃より低い温度で行われる。
ライゲーション工程(ｂ)は２分間〜30分間行われ、
(ｂ)は１〜49回繰り返すことができ、
更に、この方法は、
(ｃ)41〜60℃の範囲にて0.5分間〜15分間の少なくとも１つのインキュベーション工程、及び、
(ｄ)61〜90℃の範囲にて0.5分間〜15分間のインキュベーション工程
を含んでなる。
別の１つの実施形態によれば、本発明による環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、少なくとも２つの興味対象の配列の１つが少なくとも１つの非機能単位を含んでなる方法である。
別の１つの実施形態によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、少なくとも２つの興味対象の配列を含んでなり、該少なくとも２つの興味対象の配列は非機能性単位により形成され、相互に隣接する興味対象の配列の配置により二本鎖DNAの機能的実体が導かれる方法である。
１つの実施形態によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、少なくとも２つの興味対象の配列の１つが少なくとも１つの機能単位を含んでなる環状二本鎖DNAベクターの作製方法である。
本発明によれば、機能単位は、発現機能単位若しくは遺伝子、真核細胞若しくは原核細胞への組込みの機能単位、又は細菌性機能単位であることができる。
本発明によれば、発現機能単位又は遺伝子は、各々が独立して機能モジュールと考えられる、コーディング配列及び非コーディングエレメント(例えば、プロモーター又はターミネーター)を含む。
本発明による遺伝子は、ポリペプチド鎖又はリボ核酸(RNA)の合成を特定するデオキシリボ核酸(DNA)の配列である。遺伝子はまた遺伝子情報の単位として定義することができる。遺伝子は、プロモーターと呼ばれるヌクレオチド配列を含み、その役割はDNAのRNAへの転写の開始、とりわけ調節を可能にすることである。コーディングRNAの場合、こうして生成されたRNA分子は、タンパク質に翻訳され得る。タンパク質に翻訳される情報に対応するDNA配列は、オープンリーディングフレームと呼ばれる。非翻訳RNAもまた機能的であり得る(例えば、リボソームRNA、転移RNA、干渉RNA)。遺伝子は、転写の終端を示すターミネーターと呼ばれる終止配列が末端を形成し得る。
１つの実施形態によれば、本発明によるベクターは、少なくとも１つ遺伝子の発現若しくは阻害又は少なくとも１つのRNA若しくは少なくとも１つタンパク質の生成若しくはブロッキングを許容することにより、遺伝子情報の少なくとも一部分を宿主細胞に供給することを可能にする。
本発明によれば、環状二本鎖DNAの作製方法は、少なくとも１つの機能単位が、下記エレメントから選択される機能単位である方法である：
(i)細菌性機能単位、
(ii)発現機能単位、
(iii)真核細胞若しくは原核細胞への組込みの機能単位、又は
(iv)これらの組合せ。
本発明によれば、ベクターは、すくなとも３つの機能的エレメント：１．細菌性複製起点、２．細菌性選択マーカー、３．発現カセットを含むことができる。
本発明による環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、少なくとも２つの興味対象の配列の１つが、少なくとも１つの非機能単位を含む方法である。
細菌性機能単位は、細菌性複製起点又は細菌性選択マーカーを含む機能単位を意味すると理解される。
本発明による複製起点は、細菌起源のもの又は人工起源のものであることができる(「ori」とも呼ばれる)。複製起点は、特に細菌細胞における、一方向又は双方向の複製を開始させる単一DNA配列である。複製は、DNAがDNAポリメラーゼにより合成されるプロセスである。この機構は、酵素のエラーを除き、単一のDNA分子から、当初分子と同一の２つのDNA分子の取得を可能にする。複製起点の構造は種間で差がある。細菌複製の機能単位において、複製起点は細菌起源のものである。
参照により本明細書に組み込まれる複製起点の例は、Wangらによる論文(Zhijun Wang, Li Jin, Zhenghong Yuan, Grzegorz Wegrzyn, Alicja Wegrzyn. Classification of plasmid vectors using origin of replication, selection marker and promoter as criteria. Plasmid, 61 (2009) 47-51)の49頁の表１に記載されているものである。
本発明の１つの態様によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、細菌性機能単位がWangら(2009)の文献(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)において紹介されているエレメントから選択される少なくとも１つの細菌性複製起点を含む方法である。
本発明の別の１つの有利な態様によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、細菌性機能単位がWangら(2009)の表１中の全ての原核生物性複製起点から選択される少なくとも１つの複製起点を含む方法である。プラスミドは、好ましくは、pMB1、pUC、ColE1、p15A、pSC101、R1、RK2、R6K、pA81、pRAS3.1、pTi、pBPS1、pUO1、pKH9、pWKS1、pCD1、pMAK3、pBL63.1、pTA1060、p4M、pHT926、pCD6、pJB01、plME300、pMD5057、pTE44、pDP1又はpT38である。
本発明による選択マーカーは、その発現が宿主に測定可能な特性(例えば、色素を生じ又は抗生物質に抵抗する能力)をもたらす遺伝子である。
細菌性選択マーカーは、その発現が形質転換細菌(興味対象のマーカーの発現を可能にするベクターが組み込まれている)に測定可能な特性をもたらす遺伝子である。
例えば、細菌性選択マーカーは、規定されたスクリーニングに従う細菌の選択を可能にする。選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性の補完を可能にする遺伝子、光学的に検出可能な分子の発現をコードする遺伝子(色素、化学発光マーカー、蛍光色素)又はその産物が細菌コロニーの識別を可能にする他の任意の遺伝子であり得る。
したがって、定義より、例えば細菌性選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子又はスクリーニング遺伝子である。
本発明の１つの更なる態様によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、細菌性機能単位が少なくとも１つの機能モジュールを含み、該機能モジュールがマーカー、特に選択マーカー、好ましくは抗生物質耐性遺伝子又はスクリーニング遺伝子である選択マーカーである、方法である。
細菌性選択マーカーの例は、抗生物質に耐性とするエレメントをコードする遺伝子であり、例えば：
− アンピシリンに耐性とする遺伝子bla (AmpR)、
− ネオマイシンに耐性とする遺伝子neo、
− カナマイシンに耐性とする遺伝子aph(kanR)、
− クロラムフェニコールに耐性とする遺伝子cat、
− スペクチノマイシンに耐性とする遺伝子aadA7、
− ゲンタマイシンに耐性とする遺伝子aaC1、
− テトラサイクリンに耐性とする遺伝子tetA、
− エリスロマイシンに耐性とする遺伝子erm、
− バンコマイシンに耐性とする遺伝子van。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、抗生物質耐性遺伝子がアンピシリンbla、アンピシリンblaA、アンピシリンblaZ、カナマイシンaph、ネオマイシンneo、クロラムフェニコールcat、クロラムフェニコールclmA、クロラムフェニコールcatAIII、クロラムフェニコールcatB2、クロラムフェニコールcmx、ゲンタマイシンaacC1、ゲンタマイシンaacC2、テトラサイクリンtetA(A)、テトラサイクリンtetA(C)、テトラサイクリンtetA(D)、テトラサイクリンtetA(E)、テトラサイクリンtetA(G)、テトラサイクリンtetA(H)、テトラサイクリンtetA(L)、テトラサイクリンtetA(Q)、テトラサイクリンtetA(S)、テトラサイクリンtetA(Y)、テトラサイクリンtetA(Z)、エリスロマイシンerm、バンコマイシンvan、スペクチノマイシンaadA7、ストレプトマイシンstr(Wangら(2009)の表２)から選択される方法である。
本発明による、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、抗生物質耐性遺伝子がアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン又はスペクチノマイシンに耐性とする遺伝子から選択される方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、スクリーニング遺伝子が遺伝子lac Zαである方法である。
本発明の方法による発現機能単位は、少なくとも１つの機能モジュールを含む単位であり、該機能モジュールが以下のエレメント：
(i)下記から選択される遺伝子の発現を調節する配列又は遺伝子調節配列の活性を調節する配列：プロモーター、ターミネーター、「内部リボソーム進入部位(IRES)」配列、
(ii)産物をコードするヌクレオチド配列、特に発現産物をコードするヌクレオチド配列、より具体的にはタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(iii)分子標識をコードする配列、又は
(iv)これらエレメントの組合せ。
の１つにより形成される。
本発明によれば、プロモーター又はプロモーター配列は、遺伝子の構成成分たるDNA領域であり、RNAへのDNAの転写に不可欠である。プロモーターは、RNA合成の開始前に、転写因子及びRNAポリメラーゼが最初に結合するDNA領域である。プロモーター配列は、一般に、転写の開始部位の上流に位置する。本発明による方法に用いられるプロモーターは、構成性又は誘導性である。
本発明によれば、コーディング配列又はリーディングフレームワークは、RNAポリメラーゼである酵素により転写されたとき、RNA、特にメッセンジャーRNA(mRNA)に対応する
DNA配列である。コーディング配列は、当該分子の読取る方向に、プロモーターの下流でターミネーターの上流に位置する。
転写mRNAは、１又は２以上のオープンリーディングフェーズ(ペプチド又はタンパク質に転写可能なRNA)に限定されず、１又は２以上の非コーディングRNA(例えば、小干渉RNA、マイクロRNA、触媒性RNA)に対応することもある。
本発明によれば、ターミネーター又は転写ターミネーターは、転写を担う酵素によるRNAの転写の終点を示すDNA配列である。本発明によれば、ターミネーターは原核生物性又は真核生物性のターミネーターである。
本発明によれば、IRES(内部リボソーム進入部位)配列は、真核細胞において、メッセンジャーRNAの翻訳の開始を可能にする配列である。真核細胞性mRNAの翻訳のための通例のプロセスは、mRNAをスキャンするリボソームによる、５'末端に位置するキャップから最初の開始コドンまでの走査機構に基づく。IRESにより、キャップ及び走査機構の存在とは無関係に、この開始コドンでリボソームの直接動員が可能となる。IRESは、リボソーム又は翻訳開始因子と直接相互作用するmRNAの構造化された領域である。
本発明によれば、分子標識は、DNA、特に興味対象のタンパク質に融合されるペプチド又はタンパク質をコードするDNAの配列である。
標識の配列は、興味対象のタンパク質の最初のコドンの上流若しくは興味対象のタンパク質の最後のコドンの下流に、又は興味対象のタンパク質のオープンリーディングフレームワーク内に、インフェーズで、挿入されるか、又は本発明に従って組み立てられる。標識の固有特性により、直接(蛍光色素)又は間接(抗体又は別のタンパク質により認識されるエピトープ、酵素活性など)の興味対象のタンパク質の可視化及び精製が可能になる。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、発現機能単位が少なくとも１つの機能モジュールを含み、該機能モジュールがプロモーター、タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びターミネーターを含む方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、発現機能単位が少なくとも１つの機能モジュールを含み、該機能モジュールがプロモーター、タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はターミネーターを含む方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、発現機能単位が少なくとも１つの発現機能モジュールを含み、該機能モジュールがプロモーター、タンパク質をコードするヌクレオチド配列、分子標識及びターミネーターを含む方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、発現機能単位が少なくとも１つの発現機能モジュールを含み、該機能モジュールがプロモーター、タンパク質をコードするヌクレオチド配列、分子標識又はターミネーターを含む方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、発現機能単位が少なくとも１つの発現機能モジュールを含み、該発現機能モジュールがプロモーター、タンパク質をコードするヌクレオチド配列、IRES配列、タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列及びターミネーターを含む方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、発現機能単位が少なくとも１つの発現機能モジュールを含み、該発現機能モジュールがプロモーター、タンパク質をコードするヌクレオチド配列、IRES配列、タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列又はターミネーターを含む方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、少なくとも１つの機能モジュールが、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現機能モジュールである方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、機能モジュールがプロモーターである方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、機能モジュールがプロモーターであり、該プロモーターがヒトサイトメガロウイルス(CMV)のプロモーター、EF1αプロモーター、ウイルスSV40のプロモーター、β-アクチンのプロモーター、又はユビキシンＣのプロモーターである方法である。本発明によるプロモーターは、好ましくは、Wangら(2009)の表３に記載されるプロモーターから選択されるプロモーターである。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、機能モジュールが発現産物をコードする遺伝子である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、機能モジュールがBCNI(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)の「Gene」データベースで言及されている遺伝子から選択される発現産物をコードする遺伝子であり、該発現産物をコードする遺伝子は、その配列がHomo sapiens種、Mus musculus種、Rattus norvegicus種、Danio rerio種、Caenorhabditis elegans種、Saccharomyces Cerevisiae種、Arabidopsis thaliana種、rosophila melanogaster種又は言及されている他の任意の種に属することができる遺伝子である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、機能モジュールがターミネーターである方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、機能モジュールがターミネーターであり、該ターミネーターがポリアデニル化配列である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、少なくとも１つの機能モジュールが配列Aviタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、Ｅタグ、FLAGタグ、HAタグ、Hisタグ、Mcタグ、Ｓタグ、SBPタグ、Softag 1、Softag 3、Strepタグ、TCタグ、V5タグ、VSVタグ、Xpressタグ、isopeptag、SpyTag、BCCP(ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、マルトース結合タンパク質タグ、Nusタグ、チオレドキシンタグ、Fcタグ、障害促進アミノ酸(Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｇ、...)を含む設計された内因性障害タグ及びTyタグから選択されるマーカー又は分子標識である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、少なくとも１つの機能モジュールが分子マーカー(又は分子標識)であり、該分子マーカーがマルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、タンパク質直列親和性精製(TAP)タグ、TAPタグ若しくは蛍光タンパク質をコードする配列(好ましくはGFP)又はこれらの数多くの変種(BFP、CFP、YFP、mCherryなど)の１つから選択される親和性タンパク質である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、特に、少なくとも１つの機能単位が真核細胞における組込みの機能単位である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、真核細胞における組込みの機能単位が、下記：
− 選択遺伝子、
− 真核細胞中での保持のための配列、
− 組込みの配列、特に、相同組込みの配列、
− DNA編集に関与する１若しくは２以上の配列及び/又は標的化相同組換えに関与する１若しくは２以上の配列、又は
− これらエレメントの組合せ
から選択される少なくとも１つのエレメントを含む方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、選択遺伝子がポジティブ選択遺伝子又はネガティブ選択遺伝子である方法である。
１つの有利な実施形態によれば、選択遺伝子はポジティブ選択遺伝子又はネガティブ選択遺伝子であり、外部基質の存在に依存していてもよいし、していなくてもよい。
本発明によれば、ポジティブ選択遺伝子は、通常は当該細胞又は宿主に対して毒性である物質(例えば、抗生物質、除草剤又は医薬品)の存在下で、そのゲノムが遺伝子改変されている細胞又は宿主の生存又は増殖を可能にする遺伝子である。外部基質に条件付けられておらず、しかし細胞(場合により、細菌、真菌、動物又は植物)の発生を調節する生理学的プロセスを改変するポジティブ選択遺伝子もある。
本発明によれば、ネガティブ選択遺伝子は、或る特定の条件(制御可能であり、実験者に既知である)下で、遺伝子改変されている細胞又は宿主の死を引き起こす。本発明によれば、真核細胞での保持のための配列は、ベクターが、宿主ゲノムへ組み込まれることなく、レシピエント細胞の細胞子孫において保持されるように意図されている場合に用いることができるDNA配列である。この配列は、改変細胞の種に特異的な複製起点(例えば、酵母についての自律的複製配列(ARS))又は複製されたDNA分子を娘細胞の各々に分けることを可能にするセントロメア配列であり得る。
本発明によれば、真核生物ゲノムに相同な配列は、相同組換えにより組込みを可能にする配列である。発現ベクターは、生物又は標的細胞のゲノムDNAに対応するDNA配列を含むことができる。これら配列は実験的に決定され、相同組換えを受け易さについて知られる遺伝子座に対応することができる。
本発明によれば、DNA編集に関与する配列は、リコンビナーゼにより特異的に認識され、DNA分子の標的化改変を可能にするDNA配列である。例えば、リコンビナーゼCreにより認識される配列LoxP1又はリコンビナーゼFlpにより認識される配列FRTである。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、選択遺伝子がポジティブ選択遺伝子、特に真核細胞におけるポジティブ選択遺伝子である方法である。
１つの実施形態によれば、ポジティブ選択遺伝子は、ハイグロマイシンＢ若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子、G418若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子、アンピシリン若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子、テトラサイクリン若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子、ピューロマイシン若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子又はゼオシン若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子から選択される抗生物質耐性遺伝子である。
別の１つの実施形態によれば、真核細胞におけるポジティブ選択遺伝子は、ハイグロマイシンＢ若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子、G418若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子、ピューロマイシン若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子又はゼオシン若しくはその誘導体に対する耐性遺伝子から選択される抗生物質耐性遺伝子である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、ネガティブ選択遺伝子が酵母におけるチミジンキナーゼをコードするネガティブ選択遺伝子である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、真核細胞での保持のための配列が自律的複製配列(ARS)又は酵母について定義したようなセントロメア配列である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、相同組込みの配列がRosa26遺伝子座又はヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子座である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、DNA編集に関与する配列及び/又は標的化相同組換えに関与する配列が遺伝子配列ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT(配列番号67)(式中、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ又はＣ)のバクテリオファージP1「locus of X over P1」(LoxP1)の34ヌクレオチドの配列、好ましくはCreリコンビナーゼ-LoxP配列である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、DNA編集に関与する配列及び/又は標的化相同組換えに関与する配列が配列FRT Flp-FRT、特に配列GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC(配列番号68)である方法である。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、タイプIIs制限酵素がBsaI、Eco31I、BbsI、Bpil、BsmBI、Esp3I、BspMI、BfuAI及びBveIから選択されるタイプIIs制限酵素である方法である。
本発明による方法に用いられる単一のタイプIIs制限酵素は好ましくはBbslであり、より好ましくは本発明の方法で使用される単一のタイプIIs酵素はBsalである。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、興味対象の配列の下流又は上流の二本鎖DNAアダプターが追加的にタイプIIs制限酵素の少なくとも１つの認識部位、有利にはNotI、PacI、PmeI、SwaI、SmiI、SgsI、SgrDI、SgrAI、SbfI、FseI、AscI、AsiSI、MreI、MssIのような希な制限酵素の少なくとも１つの認識部位、より有利にはKpnI、AgeI、EcoRI及びBstBI、SalI及びMluIから選択される制限酵素の２つの認識部位を含む方法である。
一般に、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、興味対象の配列の上流及び下流の二本鎖DNAアダプターがタイプIIs制限酵素の少なくとも１つ認識部位(少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程(ａ)において存在するタイプIIs制限酵素の唯１つの認識部位を含む)を含んでなり、該タイプIIs制限酵素は、アダプターのDNAを切断して興味対象の配列のいずれか又は両方の側に少なくとも２ヌクレオチドの一本鎖末端を生じる酵素(又は本発明による方法で工程(ａ)に用いられるタイプIIs酵素)である方法である。
１つの特別な実施形態によれば、本発明による方法は、興味対象の配列の上流及び下流の二本鎖DNAアダプターが、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程において存在するタイプIIs制限酵素の認識部位以外のタイプIIs制限酵素の認識部位を有しない方法である。
１つの有利な実施形態によれば、本発明によろ環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、興味対象の配列の上流及び下流の各二本鎖DNAアダプターが、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程(ａ)において存在するタイプIIs制限酵素の単一(かつ唯一)の認識部位だけを含み、各アダプターはタイプIIs制限酵素の他の認識部位を有しない方法である。
より正確には、本発明による環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、
興味対象の配列の上流及び下流の各二本鎖DNAアダプターが、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程(ａ)において存在するタイプIIs制限酵素である単一のタイプIIs制限酵素の単一(かつ唯一)の認識部位だけを含んでなり、タイプIIs制限酵素はアダプターのDNAを切断して興味対象の配列のいずれか又は両方の側に少なくとも２ヌクレオチドの一本鎖末端を生じる酵素(又は本発明による方法に用いられるタイプIIs酵素)である方法である。
１つの有利な実施形態によれば、本発明による環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、各アダプターに存在するタイプIIs制限酵素の認識部位が本発明による方法に用いられるタイプIIs制限酵素の単一認識部位からなる方法である。
特に、本発明による方法に用いられるタイプIIs制限酵素の単一の認識部位は、Bbslにより、より好ましくはBsalにより認識される部位である。
１つの特別な実施形態によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、興味対象の配列の上流及び下流の二本鎖DNAベクターが、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程(ａ)において存在するタイプIIs制限酵素の単一(かつ唯一)の認識部位、及び、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程(ａ)において存在する酵素以外の酵素であるタイプIIs制限酵素の少なくとも１つの認識部位を含んでなる方法である。
本発明によれば、
興味対象の配列の上流末端及び下流末端の各々における少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAは、２〜10ヌクレオチド、好ましくは２〜５ヌクレオチド、より具体的には４ヌクレオチドを含んでなる。
本発明による方法は、興味対象の配列の上流末端及び下流末端の各々の付着性一本鎖縫合DNAが２〜10ヌクレオチド、好ましくは２〜５ヌクレオチド、より具体的には４ヌクレオチドを含む方法である。
１つの特別な実施形態によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、興味対象の配列の上流末端及び下流末端の各々における少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAが互いに独立して２、３、４、５、６、７、８、９、10、11又は12ヌクレオチドを含む方法である。
本発明による方法において、或る分子構成要素から生じた少なくとも２ヌクレオチドの各付着性一本鎖縫合DNAは別の分子構成要素から生じた少なくとも２ヌクレオチドの単一の付着性一本鎖縫合DNAと対合する。
本発明の１つの更なる態様によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAが反応混合物中に存在する他の単一の、少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAとのみ対合することができる方法である。
本発明によれば、反応媒体は本発明による方法を実施できる媒体である。
１つの特別な実施形態によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、興味対象の配列の上流及び下流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAがスコアリングマトリクスの支援で設計される。
本発明によれば、環状二本鎖DNAベクターの作製方法は、タイプIIs制限酵素が、該タイプIIs制限酵素の特異的認識部位から２〜15ヌクレオチド、２〜14、２〜13、２〜12、２〜11、２〜10、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４又は２〜３ヌクレオチドの範囲の距離でDNAを切断する方法である。
有利には、タイプIIs制限酵素は、該タイプIIs酵素の特異的認識部位から２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14又は15ヌクレオチドの距離でDNAの二本鎖の一方を切断する。
本発明の方法によれば、上流で生じる少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの相補配列は、同じ構成要素の下流で生じる少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAに対して相補的ではなく、(第１の構成要素の)配列(SI)1の上流で生じる少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA(si-1)の相補配列は、(最後の構成要素の)配列(SI)nの下流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA(sn+1)と相補的である。
本発明によれば、本方法は、少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程の前に、該分子構成要素の各々を、化学合成により、又は、前記アダプターの配列に相当する配列及び興味対象の配列の少なくとも14ヌクレオチドを５'から３'へ含んでなるフォワードプライマーと、興味対象の配列の少なくとも14ヌクレオチド及び前記アダプターの配列に相当する少なくとも１つの配列を５'から３'へ含んでなるリバースプライマーとを用いて、構成要素に含まれる興味対象の配列のPCRによる増幅工程により調製する工程を含んでなる。
１つの実施形態において、本方法は、少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程の前に、該分子構成要素の各々を、化学合成により、又は、前記アダプターの配列に相当する配列及び興味対象の配列の少なくとも14〜20ヌクレオチドを５'から３'へ含んでなるフォワードプライマーと、興味対象の配列の少なくとも14〜20ヌクレオチド及び前記アダプターの配列に相当する少なくとも１つの配列を５'から３'へ含んでなるリバースプライマーとを用いて、構成要素に含まれる興味対象の配列のPCRによる増幅工程により調製する工程を含んでなる。
１つの実施形態において、本方法は、少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程の前に、該分子構成要素の各々を、化学合成により、又は、前記アダプターの配列に相当する配列及び興味対象の配列の少なくとも14、15、16、17、18、19、又は20ヌクレオチドを５'から３'へ含んでなるフォワードプライマーと、興味対象の配列の少なくとも14、15、16、17、18、19、又は20ヌクレオチド及び前記アダプターの配列に相当する少なくとも１つの配列を５'から３'へ含んでなるリバースプライマーとを用いて、構成要素に含まれる興味対象の配列のPCRによる増幅工程により調製する工程を含んでなる。
PCRはポリメラーゼ連鎖反応であり、バルクのDNAを再生産することを可能にする。
本発明はまた、以下：
分子構成要素の各々を調製する工程であって、該工程は、マトリクスに含まれる興味対象の配列を、アダプターに相当する少なくとも１つの配列及び興味対象の配列の少なくとも14ヌクレオチドを５'から３'へ含んでなるフォワードプライマーと、アダプターに相当する少なくとも１つの配列及び興味対象の配列の少なくとも14ヌクレオチドを５'から３'へ含んでなるリバースプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する工程によって構成される工程
互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を、タイプIIs制限酵素である単一の制限酵素の存在下で同時に接触させる工程であって、各分子構成要素が非付着性末端を有する線状二本鎖DNA分子であり、
(ｉ)前記タイプIIs制限酵素の特異的認識部位を有さず、機能単位又は非機能単位である少なくとも１つの単位を含んでなる興味対象の配列、及び
(ii)前記興味対象の配列の上流及び下流に隣接し、各々が、前記タイプIIs制限酵素の唯一の認識部位を含む少なくとも12ヌクレオチドの配列からなる２つの二本鎖DNAアダプター
を含み、ここで、前記単位は機能的モジュール又は非機能的モジュールである少なくとも１つのモジュールを含んでなり、前記上流のアダプターのタイプIIs制限酵素認識部位及び前記下流のアダプターのタイプIIs制限酵素認識部位は相近しており、
該工程が
− 用いるタイプIIs制限酵素の認識部位の、切断による除去、
− 前記興味対象の配列の末端の各々での、少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの形成、ここで、少なくとも２つの興味対象の配列の１つの上流の少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAが、別の興味対象の配列の下流の少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAに対合することができ、
− 少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAの、ヌクレオチド相補性による対合、
− 単一の規定された順序正しい方向で互いに隣接した興味対象の配列の配置、
を導く工程、
ｂ)環状二本鎖DNAベクターが得られるように、少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAのライゲーション工程
を含んでなる、環状二本鎖DNAベクターを作製する方法に関する。
PCRはポリメラーゼ連鎖反応であり、バルクのDNAを再生産することを可能にする。
本発明の特定の実施形態
本発明には数多くの可能な変形が存在する。組立てには幾つかの制限酵素を用いることができる。これらには、BsaI、BpiI、BsmBI、Esp3I、BspMIなどのタイプIIs制限酵素が含まれる。事実、認識部位から遠位に切断部位を有し、２若しくは３ヌクレオチド又は４ヌクレオチド以上のオーバーハングを有する配列を生じる任意のタイプIIs酵素を組立てに用いることができる。組立てのためのインキュベーション条件(緩衝液、温度、時間、DNAリガーゼの性質)は、用いる酵素に従って最適化することができる。組立てに用いる各酵素について、DNAフラグメントの集合及び当該酵素の認識部位を有しない興味対象の配列の集合を作製する。
１．DNA構成要素の調製
DNA構成要素は、マトリクスから、注意深く選択したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技法により調製する。遺伝子合成(化学合成)も、構成要素を取得する代替方法として使用することができる。
PCRによれば、プライマーが、高忠実性ポリメラーゼによるDNAフラグメントの増幅を実現させ、可能な最大限度で、DNAポリメラーゼによりランダムに導入され得る変異の数を制限する。一方で、これらプライマーにより、組立てに用いるタイプIIs酵素の認識部位を含むアダプター、及び配向されたアセンブリの取得を可能にする縫合DNAの導入が可能になる。よって、構成要素は、２つのアダプターが側方(当該興味対象の配列の５'側及び３'側)に位置する興味対象の配列を含む。興味対象の配列中に存在する可能性がある、組立てに用いるタイプIIs制限酵素の認識部位は、望ましくなく、指向性変異誘発又は任意の他の適切な方法により事前に除去しなければならない。
1.1 プライマーの定義
構成要素の作製に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、２つの必須部分を含む。
５'側部分に、これらプライマーはアダプターの配列を含む。アダプターは下記：
− 最小限２ヌクレオチドの配列(タイプIIエンドヌクレアーゼの１又は２以上の制限部位を含むか、又は当該制限部位の一部であることができる)、
− 組立てに用いるタイプIIs活性を有する酵素の結合部位に対応する５、６、７ヌクレオチド又は８ヌクレオチド以上の配列、
− 用いる酵素の結合部位と切断部位との間の間隔に対応する１〜８ヌクレオチド又は９ヌクレオチド以上の配列(この配列の長さは、用いるタイプIIs酵素の固有特性に依存する)、
− 用いるタイプIIs酵素の作用により生じる一本鎖末端に対応する２〜５ヌクレオチド又は６ヌクレオチド以上の配列(この配列は組み立てられるフラグメントの対合を可能とするものであり、事実上、縫合の定義に対応する)
を含んでなる配列を含む。
３'側部分に、これらプライマーは、興味対象の配列の５'末端に対応する14〜100ヌクレオチドの配列を含む。この配列により、マトリクスの相補的領域での当該プライマーのハイブリダイゼーション及び興味対象の配列の増幅が可能になる。この配列は様々な大きさであるが、14ヌクレオチド以上である。加えて、配列は、ｉ)所与の構成要素の製造用に設計される２つのプライマーについてむしろ近接するTm(融解温度)を考慮し、ii)可能であれば、少なくとも１つのＧ又はＣを含むが、３以上のＧ又はＣが連続しないようプライマーを仕上げるように選択される。
本発明によれば、「マトリクス」は、増幅すべき興味対象の配列を含むDNA分子を意味する。例えば、マトリクスは、ゲノムDNA又はｍRNA若しくはプラスミドの逆転写により得られる相補DNAであり得る。
別の１つの実施形態によれば、アダプターの配列とマトリクスの相補配列との間に補充配列を挿入することができる。補充配列は、例えば、興味対象の配列がコードするタンパク質産物に融合される補充アミノ酸をコードする配列であり得る。
1.2 プロトコールによるPCR(高忠実性)及び得られる産物の制御
各構成要素は高忠実性DNAポリメラーゼを用いて増幅する。phusion taq DNAポリメラーゼ(Thermo Scientific)は、製造業者のプロトコールに従って用いるが、任意の高忠実性DNAポリメラーゼを用いることができる。用いるマトリクスの量は最小限とする(構成要素に依存して10pg〜２ng/μl)。
PCR産物は、キット(例えば、Macherey Nagel PCR及びgel cleanup kit(登録商標))を利用して直接精製するか(PCRクリーンアップ)、又はTAE緩衝液(Tris 40mM pH８、アセテート20mM、EDTA １mM)中のアガロースゲルに堆積させ、泳動後に、PCR産物を含むアガロースゲル片を切り出して精製し(ゲルクリーンアップ)、その後DNAをナノ分光光度計(例えば、nanodrop(登録商標))を用いて定量する。
1.3 存在する可能性のあるタイプIIs酵素の部位(例えば、Bsal)の除去ストラテジ：
構成要素を組み立てることができ、本発明による方法が効果的であるように、興味対象の配列内には、本発明による方法(組立て)に用いるタイプIIs制限酵素のいかなる部位も存在すべきでない。このためには、Englerら(2008)が記載するように、Golden Gate変異誘発技法を用いたが、任意の部位特異的変異誘発技法を用いることができる(Cormack, B. 2001. Directed Mutagenesis Using the Polymerase Chain Reaction. Current Protocols in Molecular Biology. 37：8.5:8.5.1-8.5.10)。場合により、興味対象の配列の生物学的機能(例えば、DNAに対する結合部位、二次構造、発現産物)を保存するに必要な変異を導入する。
1.4 縫合DNAの選択方法
本発明によるアダプターの使用により、分子構成要素は、ヌクレオチドベースでの組立てが可能である。この精度レベルによりヌクレオチド瘢痕の排除が可能となる。
用語「瘢痕」は、組立て技法の使用により最終ベクター内に必然的に存在する任意のヌクレオチド又はヌクレオチド群であって、当該ベクター自体内でいかなる機能をも担うことのないものを意味する。
縫合DNAの選択は正確な組立ての促進に重要である。これは複数の単純な基準を満たさなければならない。第一に、縫合DNAはパリンドロームであってはならない：事実、パリンドローム縫合DNAは自己と結合することができ、このことが組立てを困難とし、及び/又はヘッド-ツー-テイル様式で結合した構成要素二量体の形成をもたらし得る。
本発明によれば、同一構成要素の組立体の幾つかの例(ヘッド-ツー-テイル)に対応する自己対合を回避して二本鎖を形成するために、縫合DNAはパリンドローム(例えば：ACGT、この逆平行配列ACGTは同一である)であってはならない。
パリンドローム配列は、DNAの２本鎖の各々で５'から３'へ同じように読める配列である。
本発明による方法では、５'側及び３'側の縫合DNAが互いに相補でないように選択されるので、「自己環化」は起こり得ない。切断により生じる逆平行配列は、遊離したアダプターの非付着性末端である。
次に、或る組立て位置での使用のために選択した縫合DNAは、別の位置での使用の可能性が排除される。最後に、組立て物の二箇所で著しく類似する(１ヌクレオチドだけ異なる)縫合DNAを選択することは避ける。なぜならば、そのような選択は適当でない組立て及びライゲーションをもたらし得るからである。事実、部分相補対合(３/４ヌクレオチドのみ相互作用)、「ミスマッチ」又は誤対合は、或る特的のDNAリガーゼの活性には十分であるので、異常構造の形成に繋がる可能性がある。
この基準は異常な構築物の取得頻度を軽減する。
このガイドラインに従うために、簡単なプログラムが開発されており、このプログラムは、既に選択された縫合DNAにもよるが、非適合性とみなされる縫合DNAを排除するものである。このプログラムは、縫合DNA組合せのマトリクスの使用に基づく：各240の可能な非パリンドローム組合せについて、他の239の各々との適合性のスコアが算出されている。このスコアの算出法をスキームに示す(図２)。
結果として、４つの非パリンドロームヌクレオチドの２つの配列の各対合(57,600の組合せ)は、０〜10のスコア(０は相補性が全く無いこと(０％)に対応し、10は完全に相補性であること(100％)を示す)に帰属させる。相補性は縫合DNA間の相補性を意味する。このスコアは示したマトリクスに取り入れられている(図３)。所与のベクターについて、必要な全ての縫合DNAは、各縫合DNAが、組立てに必要なその他の縫合DNAの各々と、最小の相補性スコアを有するように選択される。
２．一般的な組立てプロトコール
構成要素を互いに組み合わせて所望のベクターを得るためには、該構成要素を等モル比で、単一のタイプIIs制限酵素及びリガーゼの存在下に混合することが必要である。
有利には、構成要素は、適切な緩衝液中、等モル比で、単一のタイプIIs制限酵素及びリガーゼの存在下に混合する。
各分子構成要素の量(ng)は、次式：Ｑ(ng)＝サイズ(bp)×649(ng/nmol/bp)×(20〜100).10-6(nmol)のとおりに算出し、体積は、次式：Ｖ(μl)＝Ｑ(ng)/濃度(ng/μl)のとおりに算出する。
混合物は０〜６℃の範囲の温度で、好ましくは４℃で作製する。
次に、４個以下の分子構成要素の組立てには、混合物を37℃の温度に30分間〜６時間曝露する。
５個以上の構成要素の組立には、混合物を、37℃で２分間、その後16℃で３分間のインキュベーションサイクル(25〜50サイクル)に供する。
次に、50℃で５分間(残る(切断されていない)タイプIIsのエンドヌクレアーゼ部位の切断)、続けて80℃で５分間(酵素の不活化)、混合物をインキュベートする。
次に、反応混合物をコンピテント細菌の形質転換に用い、その後、形質転換細菌を選択する。
３．構築物の検証
２つのレベルの検証が考えられる：
１)- 生成された分子の、配列に関する検証
２)- ベクターの、機能性に関する検証

１)- インビトロでの組立てと併行して、所望のベクターの配列を再構築するための、フラグメントのコンピュータによる仮想組立てを実施する。このことにより、ベクターの制限マップが確立する。得られたクローンを検証するために、環状DNAのミニ調製物を、選択した１又は２以上の酵素により消化して、異なるサイズの少なくとも３つのフラグメントを生成する。酵素は、好ましくは、組み立てたフラグメントの各々に少なくとも１つの部位が存在するように選択する。アガロースゲル電気泳動後の制限プロフィールの分析により、フラグメントが全て所望の順序で組み立てられていることの検証が可能となる。
得られたクローンを検証する他の方法、特に、フラグメントのサイズを測定して構築物を検証するPCRによる検証法が考えられる。加えて、ベクターの全体又は一部の配列決定が可能である(Prober JM, Trainor GL, Dam RJ, Hobbs FW, Robertson CW, Zagursky RJら(16 Oct 1987). "A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides". Science 238 (4825)：336-4.)。
２)- 本発明によるベクターに組込まれた興味対象の配列によれば、ベクターを形成する単位及び/又はモジュールの機能性を、直接的又は間接的に測定及び/又は定量することも可能である。例えば、適切な抗生物質(例えば、カナマイシン、アンピシリン、クロロフェニコール)の存在下で作製した形質転換細菌の培養物由来のベクターの抽出は、細菌性単位を形成するモジュールの機能性の検証を可能にする。同じように、適切な薬物(例えば、G418mハイグロマイシン、ピューロマイシン)による選択で提供される真核細胞クローンの作製は、真核細胞への組込み単位を形成するモジュールの機能性の検証を可能にする。最後に、発現産物(mRNA、マイクロRNA、長鎖非コーディングRNA)の存在は、PCRにより、又はRNA-Fish(Langer-Safer PR, Levine M, Ward DC (July 1982)"Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (14)：4381-5. doi:10.1073/pnas.79.14.4381)若しくはSmartFlare(Prigodich, A. E.，Randeria, P. S.，Briley, W.，Kim, N.，Daniel, W. L.，Giljohann, D. A.，Mirkin, C. A.，"Multiplexed Nanoflares: mRNA Detection in Live Cells," Anal. Chem. 2012, 84, 2062-2066, doi: 10.1021/ac202648w)のような細胞中のRNAの存在を測定可能とする任意の方法により、ベクターを受容した標的細胞から抽出したトータルRNAに基づいて検出することができる。場合により、干渉RNAの発現は、該干渉RNAにより標的される内因性遺伝子の発現(mRNA)の減少を測定することで検出可能である。
１つの有利な態様によれば、本発明は、ベクターV1、V1.1、V1.2、V1.3、V2及びV3から選択されるベクターに関する。
１つの有利なベクターによれば、本発明は、ベクターV1、V1.1、V1.2、V1.3、V2、V3、V2b、V3b、V1.1b、V4から選択されるベクターに関する。
有利には、本発明は、マルチクローニング部位も瘢痕も有しないベクターに、更により有利には当該ベクターの組立てに用いたタイプIIs酵素の制限部位も瘢痕も有しないベクターに関する。
１つの有利な態様によれば、本発明は、ベクターV1の群に、特に本発明の方法に従って得られたベクターV1の群に関する。
１つの有利な態様によれば、本発明は、ベクターV1.1の群に、特に本発明の方法に従って得られたベクターV1.1の群に関する。
１つの有利な態様によれば、本発明は、ベクターV1.2の群に、特に本発明の方法に従って得られたベクターV1.2の群に関する。
１つの有利な態様によれば、本発明は、ベクターV1.3の群に、特に本発明の方法に従って得られたベクターV1.3の群に関する。
１つの有利な態様によれば、本発明は、ベクターV2の群に、特に本発明の方法に従って得られたベクターV2の群に関する。
１つの有利な態様によれば、本発明は、ベクターV3の群に、特に本発明の方法に従って得られたベクターV3の群に関する。
１つの有利な態様によれば、本発明は、ベクターV4の群に、特に本発明の方法に従って得られたベクターV4の群に関する。
本発明によるベクターV1(配列番号41)は、構成要素Ori AmpR BsaI B (配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)及びshB3Galt6 BsaI A(配列番号40)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV1.1(配列番号48)は、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、shB3GALT6 BsaI B(配列番号46)及びHygroR BsaI B(配列番号47)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV1.2(配列番号53)は、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、rosa26-5' BsaI A(配列番号49)、pCMV BsaI C(配列番号50)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、shB3GALT6 BsaI B(配列番号46)、HygroR BsaI C(配列番号51)及びrosa26-3' BsaI A(配列番号52)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV1.3(配列番号58)は、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、rosa26-5' BsaI A(配列番号49)、pCMV BsaI C(配列番号50)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、shB3GALT6 BsaI B(配列番号46)、HygroR BsaI C(配列番号51)、rosa26-3' BsaI B(配列番号54)、pEF1a BsaI A(配列番号55)、TK BsaI A(配列番号56)及びTkter BsaI A(配列番号57)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV2(配列番号62)は、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)及びTkter BsaI A(配列番号57)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV3(配列番号66)は、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mb3GALT6 BsaI B(配列番号63)、Tkter BsaI B(配列番号64)及びshB3Galt6 BsaI C(配列番号65)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV2b(配列番号149)は、構成要素Ori BsaI A(配列番号104)、AmpR BsaI A(配列番号105)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)及びTkter BsaI A(配列番号57)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV3b(配列番号150)は、構成要素Ori BsaI A(配列番号104)、AmpR BsaI A(配列番号105)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mb3GALT6 BsaI B(配列番号63)、Tkter BsaI B(配列番号64)及びshB3Galt6 BsaI C(配列番号65)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV1.1b(配列番号151)は、構成要素Ori BsaI B(配列番号106)、AmpR BsaI B(配列番号107)、pEF1aL BsaI B(配列番号108)、EGFP-CAAX BsaI A(配列番号109)、BGHpA BsaI C(配列番号110)、pCMV BsaI D(配列番号111)、SiaT BsaI B(配列番号112)、mCherry BsaI B(配列番号113)、 TKter BsaI B(配列番号64)及びHygroR BsaI D(配列番号114)の組合せから構築される。
本発明によるベクターV4(配列番号152)は、構成要素Ori-2 BsaI C(配列番号115)、AmpR BsaI C(配列番号116)、MNN10-Lrec BsaI A(配列番号117)、KanMX BsaI A(配列番号119)及びMNN10-Rrec BsaI A(配列番号118)の組合せから構築される。
本発明によるベクターは、配列番号41、48、53、58、62及び66の配列から選択される配列を有するベクターである。
本発明によるベクターは、配列番号149、150、151及び152の配列から選択される配列を有するベクターである。
本発明によるベクターは、配列番号41、48、53、58、62、66、149、150、151及び152の配列から選択される配列を有するベクターである。
本発明によるベクターは、配列番号30、31、32、33、34及び35の配列から選択される配列を有するベクターである。
本発明の方法で得られたベクターは、配列番号30、31、32、33、34及び35の配列のベクターである。
本発明の方法で得られたベクターは、配列番号30、31、32、33、34、35、41、48、53、58、62、66、149、150、151及び152の配列のベクターである。
別の１つの実施形態によれば、本発明は、本発明の方法を実施して得られるとおりの環状二本鎖DNAベクターに関する。
本発明はまた、マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、ｎ×U2a及びｍ×U2b
(ここで、
U1は細菌性機能単位を表し、
U2aは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIに依存性であり発現産物がタンパク質である発現機能単位を表し、
U2bは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIIに依存性であり発現産物が非コーディングRNAである発現機能単位を表し、
ｎは０以上であり、
ｍは、ｎ＋ｍ≧２という条件で、０以上であり、
単位U1は、場合により、単位ｎ×U2aと隣接し、これらは、場合により、単位ｍ×U2bと隣接し、
単位U1は、好ましくは、単位ｎ×U2aと隣接し、これらは、好ましくは、単位ｍ×U2bと隣接する)
を含んでなる配列からなる、複数の導入遺伝子の同時発現を可能にする二本鎖DNAベクターに関する。
これらベクターはベクターV1の群を構成する。
このベクターV1の群は本発明の方法に従って製造することができる。
１つの更なる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施して得られたとおりにベクターV1の群に関する。
本発明はまた、マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、ｎ×U2a、ｍ×U2b及びU3a
(ここで、
U1は細菌性機能単位を表し、
U2aは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIに依存性であり発現産物がタンパク質である発現機能単位を表し、
U2bは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIIに依存性であり発現産物が非コーディングRNAである発現機能単位を表し、
ｎは０以上であり、
ｍは、ｎ＋ｍ≧２という条件で、０以上であり、
U3aはポジティブ選択カセットを表し、
単位U1は、場合により、単位ｎ×U2aと隣接し、これらは、場合により、単位ｍ×U2bと隣接し、これらは、場合により、U3aと隣接し、
単位U1は、好ましくは、単位ｎ×U2aと隣接し、これらは、好ましくは、単位ｍ×U2bと隣接し、これらは、好ましくは、U3aと隣接する)
を含んでなる配列からなる、標的ゲノムへの非相同組換えによる導入遺伝子の組込みの選択を可能にする二本鎖DNAベクターに関する。
これらベクターはベクターV1.1の群を構成する。
このベクターV1.1の群は、本発明の方法に従って作製することができる。
１つの更なる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施して得られるとおりのベクターV1.1の群に関する。
本発明はまた、マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U3b、ｎ×U2a、ｍ×U2b、U3a及びU3c
(ここで、
U1は細菌性機能単位を表し、
U3bは相同組換配列Ｘの５'側のモチーフを表し、
U2aは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIに依存性であり発現産物がタンパク質である発現機能単位を表し、
U2bは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIIに依存性であり発現産物が非コーディングRNAである発現機能単位を表し、
ｎは０以上であり、
ｍは、ｎ＋ｍ≧２という条件で、０以上であり、
U3aはポジティブ選択カセットを表し、
U3cは相同組換配列Ｘの３'側のモチーフを表し、
単位U1は単位U3bと隣接し、これは単位ｎ×U2aと隣接し、これらは単位ｍ×U2bと隣接し、これらはU3aと隣接し、これは単位U3cと隣接する)
を含んでなる配列からなる、標的ゲノムへの非相同組換えによる複数の導入遺伝子の同時組込みの選択を可能にする二本鎖DNAベクターに関する。
これらベクターはベクターV1.2の群を構成する。
このベクターV1.2の群は、本発明の方法に従って作製することができる。
１つの更なる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施して得られるとおりのベクターV1.2の群に関する。
本発明はまた、マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U3b、ｎ×U2a、ｍ×U2b、U3a、U3c及びU3d
(ここで、
U1は細菌性機能単位を表し、
U3bは相同組換配列Ｘの５'側のモチーフを表し、
U2aは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIに依存性であり発現産物がタンパク質である発現機能単位を表し、
U2bは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIIに依存性であり発現産物が非コーディングRNAである発現機能単位を表し、
ｎは０以上であり、
ｍは、ｎ＋ｍ≧２という条件で、０以上であり、
U3aはポジティブ選択カセットを表し、
U3cは相同組換配列Ｘの３'側のモチーフを表し、
U3dはネガティブ選択カセットを表し、
単位U1は単位U3bと隣接し、これは単位ｎ×U2aと隣接し、これらは単位ｍ×U2bと隣接し、これらはU3aと隣接し、これは単位U3cと隣接し、これは単位U3dと隣接する)
を含んでなる配列からなる、非相同組換えによる１又は２以上の導入遺伝子が組み込まれている宿主細胞の消去を可能にする二本鎖DNAベクターに関する。
これらベクターはベクターV1.3の群を構成する。
このベクターV1.3の群は本発明に従って作製することができる。
本発明の更なる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施して得られるとおりのベクターV1.3の群に関する。
本発明はまた、マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U2c、ｎ×U2d及びU2e
(ここで、
U1は細菌性機能単位を表し、
U2cは転写トランスアクチベータをコードする遺伝子を表し、
U2dは、そのプロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベータに依存性である遺伝子を表し、
U2eは、そのプロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベータに非依存性である遺伝子を表し、
ｎは１以上であり、
ｍは０以上であり、
単位U1は、場合により、単位U2cと隣接し、これは、場合により、単位n×U2dと隣接し、これらは、場合により、単位m×U2eと隣接し、
単位U1は、好ましくは、単位U2cと隣接し、これは、好ましくは、単位n×U2dと隣接し、これらは、好ましくは、単位m×U2eと隣接する)
を含んでなる配列からなる、誘導性様式での１又は２以上の導入遺伝子の発現を可能にする二本鎖DNAベクターに関する。
これらベクターはベクターV2の群を構成する。
このベクターV2の群は本発明に従って作製することができる。
本発明の更なる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施して得られるとおりのV2の群に関する。
本発明はまた、マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U2f、U2c及びU2g
(ここで、
U1は細菌性機能単位を表し、
U2cは転写トランスアクチベータをコードする遺伝子を表し、
U2fは、そのプロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーターであり、その発現産物が遺伝子Ｘを標的する小干渉RNAの短ヘアピンRNA(shRNA)である遺伝子を表し、
U2gは、そのプロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベータに依存性であり、その発現産物が遺伝子U2fの産物に非感受性であるように遺伝子Ｘの変異型産物である遺伝子を表し、
単位U1は、場合により、単位U2fと隣接し、これは、場合により、単位U2cと隣接し、これは、場合により、単位U2gと隣接し、
単位U1は、好ましくは、単位U2fと隣接し、これは、好ましくは、単位U2cと隣接し、これは、好ましくは、単位U2gと隣接する)
を含んでなる配列からなる、誘導性制御下での遺伝子補完の実行を可能にする二本鎖DNAベクター関する。
これらベクターはベクターV3の群を構成する。
このベクターV3の群は本発明の方法に従って作製することができる。
本発明の更なる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施して得られるとおりのV3の群に関する。
本発明はまた、マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U3a、U3b及びU3c
(ここで、
U1は細菌性機能単位を表し、
U3aはポジティブ選択カセットを表し、
U3bは相同組換え配列Ｘの５'側モチーフを表し、
U3cは相同組換え配列Ｘの３'側モチーフを表し、
単位U1は単位U3bと隣接し、これらは単位U3aと隣接し、これは単位U3cと隣接する)
を含んでなる配列からなる、そのゲノムが標的化相同組換えにより編集されている細胞の選択を可能にする二本鎖DNAベクターに関する。
これらベクターはベクターV4の群を構成する。
このベクターV4の群は本発明の方法に従って作製することができる。
本発明の更なる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施して得られるとおりのベクターV4の群に関する。
図面の要旨
図１：Ａ：興味対象の配列(SI)のいずれかの側でアダプター(Ａ)に結合したタイプIIs酵素(丸印)が、その認識部位でDNAに結合し、認識部位(矢印)から或る距離で該DNAを切断して、順序正しい組立てを可能とする、少なくとも２ヌクレオチドの２つの一本鎖末端(縫合DNA)を有するSIを作製するための分子構成要素を示す模式図。
Ｂ：別の一本鎖末端と対合することができる一本鎖末端を生じる、タイプIIs酵素により誘導される切断箇所の例(これら一本鎖末端は瘢痕なしで組み立てられる)。
図２：縫合DNA選択(縫合DNA間選択)のための適合性スコアの算出方法を表す図。
図３：可能な全ての組合せについて得たスコアのマトリクス。
図４：本発明に従って作製したプラスミド(実施形態１)及び構成要素組立て用縫合DNAを表す模式図。
図５：実施形態１のプラスミドpHCsiaT-EGFPの制限マップ及び組立て体の検証。
図６：本発明によるベクターV1(配列番号41)と、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)及びshB3Galt6 BsaI A(配列番号40)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図において、１＝Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、２＝pCMV BsaI B(配列番号37)、３＝hFUT3 BsaI A(配列番号38)、４＝BGHpA BsaI B(配列番号39)、５＝shB3Galt6 BsaI A(配列番号40)である。
図７：ベクターV1の三重消化EcoRV/PvuI/SalIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ1705、992、602、561及び357塩基対の５フラグメントを生じる。
１：1 705 bp、SalI [3821]〜PvuI [1305]
２：992 bp、EcoRV [2829]〜SalI [3821]
３：606 bp、SalI [1866]〜SalI [2472]
４：561 bp、PvuI [1305]〜SalI [1866]
５：357 bp、SalI [2472]〜EcoRV [2829]
図８：本発明によるベクターV1.1(配列番号48)と、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)及びHygroR BsaI B(配列番号47)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図において、１＝Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、２＝pCMV BsaI B(配列番号37)、３＝hFUT3 BsaI A(配列番号38)、４＝BGHpA BsaI B(配列番号39)、５＝shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)、６＝HygroR BsaI B(配列番号47)である。
図９：ベクターV1.1の三重消化EcoRV/PvuI/SalIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ2217、1104、992、606、561及び357塩基対の６フラグメントを生じる。
１：2217 bp、PvuI [4925]〜PvuI [1305]
２：1104 bp、SalI [3821]〜PvuI [4925]
３：992 bp、EcoRV [2829]〜SalI [3821]
４：606 bp、SalI [1866]〜SalI [2472]
５：561 bp、PvuI [1305]〜SalI [1866]
６：357 bp、SalI [2472]〜EcoRV [2829]
図10：ベクターV1.1(配列番号48)の機能検証：ベクターV1.1で安定的にトランスフェクトされた4T1マウス細胞のクローンから抽出したトータルRNAからqRT-PCRにより測定したhFUT3及びmB3GALT6の発現プロフィール。
図11：本発明によるベクターV1.2(配列番号53)と、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、rosa26-5' BsaI A(配列番号49)、pCMV BsaI C(配列番号50)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)、Hygro BsaI C(配列番号51)及びrosa26-3' BsaI A(配列番号52)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図において、１＝Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、２＝rosa26-5' BsaI A(配列番号49)、３＝pCMV BsaI C(配列番号50)、４＝hFUT3 BsaI A(配列番号38)、５＝BGHpA BsaI B(配列番号39)、６＝shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)、７＝HygroR BsaI C(配列番号51)、８＝rosa26-3' BsaI A(配列番号52)である。
図12：ベクターV1.2の三重消化EcoRV/PvuI/SalIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ6492、1649、1104、992、606及び357塩基対の６フラグメントを生じる。
１：6492 bp、PvuI [6009]〜PvuI [1301]
２：1649 bp、PvuI [1301]〜SalI [2950]
３：1104 bp、SalI [4905]〜PvuI [6009]
４：992 bp、EcoRV [3913]〜SalI [4905]
５：606 bp、SalI [2950]〜SalI [3556]
６：357 bp、SalI [3556]〜EcoRV [3913]
図13：本発明によるベクターV1.3(配列番号58)と、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、rosa26-5' BsaI A(配列番号49)、pCMV BsaI C(配列番号50)、hFUT3 BsaI A(配列番号38)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)、HygroR BsaI C(配列番号51)、rosa26-3' BsaI B(配列番号54)、pEF1a BsaI A(配列番号55)、TK BsaI A(配列番号56)及びTkter BsaI A(配列番号57)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図において、１＝Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、２＝rosa26-5' BsaI A(配列番号49)、３＝pCMV BsaI C(配列番号50)、４＝hFUT3 BsaI A(配列番号38)、５＝BGHpA BsaI B(配列番号39)、６＝ shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)、７＝ HygroR BsaI C(配列番号51)、８＝rosa26-3' BsaI B(配列番号54)、９＝pEF1a Bsa I A(配列番号55)、10＝TK BsaI A(配列番号56)、11＝Tkter BsaI A(配列番号57)である。
図14：ベクターV1.3の三重消化EcoRV/PvuI/SalIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ5206、2379、1649、1104、992、606、357、302、252及び104塩基対の10フラグメントを生じる。
１：5206 bp、PvuI [6009]〜SalI [11215]
２：2379 bp、EcoRV [11873]〜PvuI [1301]
３：1649 bp、PvuI [1301]〜SalI [2950]
４：1104 bp、SalI [4905]〜PvuI [6009]
５：992 bp、EcoRV [3913]〜SalI [4905]
６：606 bp、SalI [2950]〜SalI [3556]
７：357 bp、SalI [3556]〜EcoRV [3913]
８：302 bp、SalI [11215]〜SalI [11517]
９：252 bp、SalI [11517]〜EcoRV [11769]
10：104 bp、EcoRV [11769]〜EcoRV [11873]
図15：本発明によるベクターV2(配列番号62)と、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI(配列番号60)、mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)及びTkter BsaI A(配列番号57)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図において、１＝Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、２＝pCMV BsaI B(配列番号37)、３＝TO3G BsaI A(配列番号59)、４＝BGHpA BsaI B(配列番号39)、５＝pTRE3G BsaI A(配列番号60)、６＝mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)、７＝Tkter BsaI A(配列番号57)である。
図16：ベクターV2の三重消化NdeI/SalI/XhoIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ2334、1132、602、472、361及び245塩基対の６フラグメントを生じる。
１：2334 bp、XhoI [4678]〜SalI [1866]
２：1132 bp、NdeI [3074]〜XhoI [4206]
３：602 bp、SalI [2472]〜NdeI [3074]
４：472 bp、XhoI [4206]〜XhoI [4678]
５：361 bp、NdeI [2111]〜SalI [2472]
６：245 bp、SalI [1866]〜NdeI [2111]
図17：本発明によるベクターV3(配列番号66)と、構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)、Tkter BsaI B(配列番号64)及びshB3Galt6 BsaI C(配列番号65)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図において、１＝Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)、２＝pCMV BsaI B(配列番号37)、３＝TO3G BsaI A(配列番号59)、４＝BGHpA BsaI B(配列番号39)、５＝pTRE3G BsaI A(配列番号60)、６＝mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)、７＝Tkter BsaI B(配列番号64)、８＝shB3Galt6 BsaI C(配列番号65)である。
図18：ベクターV3の三重消化NdeI/SalI/XhoIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ2110、1107、602、478、472、361、245及び146塩基対の８フラグメントを生じる。
１：2110 bp、NdeI [5308]〜SalI [1862]
２：1132 bp、NdeI [3070]〜XhoI [4202]
３：602 bp、SalI [2468]〜NdeI [3070]
４：478 bp、XhoI [4674]〜SalI [5152]
５：472 bp、XhoI [4202]〜XhoI [4674]
６：361 bp、NdeI [2107]〜SalI [2468]
７：245 bp、SalI [1862]〜NdeI [2107]
８：156 bp、SalI [5152]〜NdeI [5308]
図19：本発明によるベクターV2b(配列番号149)と、構成要素Ori BsaI A(配列番号104)、AmpR BsaI A(配列番号105)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)及びTkter BsaI A(配列番号57)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図20：ベクターV2bの三重消化NdeI/SalI/XhoIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ2334、1132、602、472、361及び245塩基対の６フラグメントを生じる。
１：2334 bp、XhoI [4678]〜SalI [1866]
２：1132 bp、NdeI [3074]〜XhoI [4206]
３：602 bp、SalI [2472]〜NdeI [3074]
４：472 bp、XhoI [4206]〜XhoI [4678]
５：361 bp、NdeI [2111]〜SalI [2472]
６：245 bp、SalI [1866]〜NdeI [2111]
図21：4T1細胞へのベクターV2bのエレクトロポレーションによる移入後に定量的PCRにより測定したmB3GALT6の相対発現。１．ベクターの非存在下でエレクトロポレートした細胞。２．V2.bの存在下でエレクトロポレートした細胞(ドキソサイクリンで処理されていない細胞)。３．エレクトロポレートした後、ドキソサイクリンで24時間処理した細胞。この実験は、ベクターV2bによりコードされる転写物mB3Galt6の発現がドキソサイクリンの存在下でのみ4T1細胞において増加することを示すものであり、ベクターV2bにおける誘導性導入遺伝子及びそのコアクチベータの併存を証明するものである。
図22：本発明によるベクターV3b(配列番号150)と、構成要素Ori BsaI A(配列番号104)、AmpR BsaI A(配列番号105)、pCMV BsaI B(配列番号37)、TO3G BsaI A(配列番号59)、BGHpA BsaI B(配列番号39)、pTRE3G BsaI A(配列番号60)、mb3Galt6 BsaI B(配列番号63)、Tkter BsaI B(配列番号64)及びshB3Galt6 BsaI C(配列番号65)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図23：ベクターV3bの三重消化NdeI/SalI/XhoIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ2110、1132、602、478、472、361、245及び156塩基対の８フラグメントを生じる。
１：2110 bp、NdeI [5312]〜SalI [1866]
２：1132 bp、NdeI [3074]〜XhoI [4206]
３：602 bp、SalI [2472]〜NdeI [3074]
４：478 bp、XhoI [4678]〜SalI [5156]
５：472 bp、XhoI [4206]〜XhoI [4678]
６：361 bp、NdeI [2111]〜SalI [2472]
７：245 bp、SalI [1866]〜NdeI [2111]
８：156 bp、SalI [5156]〜NdeI [5312]
図24：本発明によるベクターV1.1b(配列番号151)と、構成要素Ori BsaI B(配列番号106)、AmpR BsaI B(配列番号107)、pEF1aL BsaI B(配列番号108)、EGFP-CAAX BsaI A(配列番号109)、BGHpA BsaI C(配列番号110)、pCMV BsaI D(配列番号111)、SiaT BsaI B(配列番号112)、mCherry BsaI B(配列番号113)、TKter BsaI B(配列番号64)及びHygroR BsaI D(配列番号114)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図25：ベクターV1.1bの三重消化EcoRV/PstI/ScaIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ2281、1723、1309、757、635、505及び360塩基対の７フラグメントを生じる。
１：2281 bp、EcoRV [3036]〜PstI [5317]
２：1723 bp、ScaI [7261]〜ScaI [1414]
３：1309 bp、PstI [5317]〜PstI [6626]
４：757 bp、ScaI [1414]〜PstI [2171]
５：635 bp、PstI [6626]〜ScaI [7261]
６：505 bp、PstI [2171]〜PstI [2676]
７：360 bp、PstI [2676]〜EcoRV [3036]
図26：ベクターV1.1bでのエレクトロポレーションの24時間後の4T1細胞の顕微鏡観察
Ａ：白色光での顕微鏡下で視認可能な細胞の群。
Ｂ：緑色蛍光を用いて顕微鏡下で観察したＡと同じ視野(GFP可視化)。
Ｃ：赤色蛍光を用いて顕微鏡下で観察したＡと同じ視野(mCherry可視化)。
Ｄ：Ｂ及びＣで観察した視野の重ね合わせ。
図27：本発明によるベクターV4(配列番号152)と、構成要素Ori-2 BsaI C(配列番号115)、 AmpR BsaI C(配列番号116)、MNN10-Lrec BsaI A(配列番号117)、KanMX BsaI A(配列番号119)及びMNN10-Rrec BsaI A(配列番号118)の組立てを可能にする縫合DNAの模式図。
図28：ベクターV4の二重消化PmeI/HindIIIによる制限フィンガープリント。
消化はそれぞれ1280、1012、856、631及び567塩基対の５フラグメントを生じる。
１：1280 bp、PmeI [1857]〜HindIII [3137]
２：1012 bp、PmeI [845]〜PmeI [1857]
３：856 bp、PmeI [4335]〜PmeI [845]
４：631 bp、HindIII [3137]〜HindIII [3768]
５：567 bp、HindIII [3768]〜PmeI [4335]
図29：インベルターゼグリコシル化のプロフィール分析による酵母遺伝子MNN10の無効化の検証。
Ａ：遺伝子Pmr1が不活化された株の泳動プロフィール(この遺伝子の変異はインベルターゼグリコシル化の顕著な低下をもたらす)。
Ｂ：野生型株のインベルターゼの泳動プロフィール。
Ｃ：遺伝子MNN10がプラスミドV4の欠失カセットを用いる相同組換えにより無効化されている株のインベルターゼグリコシル化のプロフィール。
図30：記載された方法による発現ベクターの構築を示す模式図。Ａ：８つのDNA構成要素を示す図。各構成要素はＡ〜Ｈと印された興味対象の配列(SI)(灰色)を含み、興味対象の配列は１〜13と番号付けられた複数のモジュール(灰色影付)を含むことができる。非機能モジュールは、番号に加えて、ａ及びｂで印す。構成要素はまた、SIの上流及び下流のアダプターを含むが、その「縫合DNA」部分は白色で示し、最も外側の部分は黒色で示す。この模式図では、互いに相補性である縫合DNAは点線で繋げられている。Ｂ：記載された方法に従って得られたＡに示したSIを含む環状ベクター(ｘはｙと繋がっている)を直線表示した図。SIは黒色線で区切られているが、この時点では連続しており、縫合DNA(白色)により結合されている。縫合DNAの２つの付着性鎖の各々は、隣接するSIにより提供されているものである。本文で定義した機能単位に従うベクターの構造を、示した分子の下方に矩形を用いて表示する。単位を構成するモジュールの組合せが転写を意図されるDNA配列に対応する場合にあ、転写の方向を矢印で示す。
図Ａ及びＢに示される例では、モジュールは次のように定義される：
モジュール１：複製起点
モジュール2a：ゲノム組込みの二部編成配列、左側部分
モジュール３：転写ターミネーター
モジュール4a：不完全コーディング配列(終止コドンを含む３'側部分)
モジュール4b：不完全コーディング配列(ATGコドンを含む５'側部分)
モジュール５：真核細胞性プロモーター
モジュール６：真核細胞性プロモーター
モジュール７：真核細胞性ポジティブ選択マーカーをコードする配列
モジュール８：転写ターミネーター
モジュール2b：ゲノム組込みの二部編成配列、右側部分
モジュール９：原核細胞性選択マーカーのコーディング配列
モジュール10：細菌性プロモータ
モジュール11：真核細胞性プロモータ
モジュール12：完全コーディング配列
モジュール13：転写ターミネーター
１．作製した構成要素の例
表２：本発明に従って作製した構成要素の例 出発マトリクスは、本発明の方法に従って使用することができるように遺伝子改変されている(表には示さず)。

BGH-PolyAシグナル：ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル
CMV：サイトメガロウィルス
EGFP：強化緑色蛍光タンパク質
EYFP：強化黄色蛍光タンパク質
表３．本発明に従って構築した構成要素
以下の実施例は、本発明をより良く説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。

本発明による組立てプロトコールの例
ベクターの作製用に選択した各分子構成要素20〜100fmolを、下記のものを含む容量20μlの溶液中で混合する：
− ２μlのライゲーション緩衝液 10×、
− 10Ｕ(１μl)のタイプIIs制限酵素(例えば、Bsal)、
− ３Ｕ(１μl)のリガーゼ(フラグメント数が４以下の場合)又は20Ｕ(１μl)の高濃度(HC)リガーゼ(フラグメント数が５以上の場合)
qsp：超純水。
混合物は氷上(すなわち約４℃の温度)で作製する。
次に、混合物は、組み立てる構成要素の数が４以下の場合には、37℃(30分間〜６時間)でインキュベートし、又はフラグメントの数が５以上の場合には、37℃で２分間、16℃で３分間のインキュベーションサイクル(25〜50サイクル)に付する。
このインキュベーション期間の終時に、50℃で５分間(残るBsal部位の切断)、続けて80℃で５分間(酵素の不活化)、反応物をインキュベートする。
次に、２〜10μlの各組立て体を用いて、50〜100μlのコンピテント細菌を形質転換し、全ての形質転換細菌を、(細菌単位の抗生物質耐性モジュールに対応する)選択抗生物質を補充したLBアガーを含む１又は２以上のペトリ皿に拡げる。
実施形態１
この第１の実施例における目的は、哺乳動物細胞のGolgiコンパートメントで異なる色の蛍光タンパク質を発現することができる６つの構築物を作製することである。ベクターは、安定的な株の作製に使用可能でなくてはならないが、その作製には、組込み単位中への選択モジュールの導入が必要である。組立てが正しいプラスミドを視覚的に認識できるようにするため、及び混入物や不正確なクローンの比率を評価するために、Lac Zを発現する細菌性カセットも加える。
所望のベクターは下記のもの含んでなる：
・細菌性複製単位：
− 耐性遺伝子bla (AmpR)が後に続く複製起点を含むモジュール、
− 遺伝子lacZαの活性により青-白スクリーニングを可能にする(２つのフラグメント中の)モジュール、
・ 次のものを含む融合タンパク質の発現カセット：
− プロモーターモジュール(CMV)、
− ヒト遺伝子ST6GAL1のcDNAによりコードされた最初の111アミノ酸で形成される、Golgiコンパートメントをアドレス指定するモジュール(ORFの最初の部分)、
− アドレス指定モジュールにＣ末端で融合される蛍光タンパク質をコードするモジュール(６つの交換可能なモジュール)、
− 転写ターミネーター(BGHpolyA)に対応するモジュール
・ 真核細胞への組込み単位：
− プロモーターSV40の制御下にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子を含むモジュール。
各縫合DNAは本発明に従って選択され、再構築プラスミドを図４に示す。
分子構成要素の製造
表４．指定した構成要素の増幅に用いるプライマーのリスト(認識部位Bsalに下線を付し、縫合DNAを太字で示す)
表５．PCR実行用反応混合物の組成例
表６．増幅サイクル
＊ 蛍光モジュールは全て同じ濃度に調整した。
表７．構成要素の特性及びPCR条件
PCRの終時に、産物をアガロースゲル電気泳動に供して、ゲルから切り出した細片を当業者に周知の方法に従って精製し定量する。
異なる分子構成要素/ベクター構築物の組立てプロトコール
表８．組立てミックスの組成
組立ては、37℃で２分間に続けて16℃で３分間の50回のインキュベーションサイクル、、その後50℃で５分間のインキュベーション、最後に80℃で５分間のインキュベーションにより行った。
各構築について、形質転換後に得た３つのコロニーのDNAを抽出して、酵素PvuHF及びScalHFによる制限により分析した(図５)。
本発明の方法により、単一酵素の存在下に単一工程で、少なくとも６つの分子構成要素(より好ましくは、少なくとも８つの構成要素)をエラーなく組み立てることが可能になる。
本発明の方法により、単一酵素の存在下に単一工程で、少なくとも６つの分子構成要素を収率100%で組み立てることが可能になる。
本発明の方法により、単一酵素の存在下に単一工程で、少なくとも６つの構成要素、最高で30の構成要素を組み立てることが可能になる。
よって、本発明により、二本鎖DNAの線形機能モジュールから環状二本鎖DNAベクターを、１つの特定の方法に従って作製することが可能になる。この方法は、タイプIIs酵素である単一制限酵素の存在下で該モジュールを組み立てる単一工程を含む。
実施形態１の種々の構築物に用いられる構成要素の配列
構成要素Ori-AmpR BsaI A (2005 bp) (配列番号17)
GAGGTACCGGTCTCATTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACGTGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCAAGGACGAGACCGGTACCTC
構成要素pCMV BsaI A (677bp) (配列番号18)
GAGGTACCGGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCCGCCACCTGAGACCGGTACCTC
構成要素SiaT BsaI A (370bp) (配列番号19)
GAGGTACCGGTCTCCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTGAGACCGGTACCTC
構成要素EGFP BsaI A (758bp) (配列番号20)
GAGGTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTgtccTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGctacCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATGGAGACCGGTACCTC
構成要素EGFP BsaI A (758bp) (配列番号21)
GAGGTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATGGAGACCGGTACCTC
構成要素ECFP BsaI A (758bp) (配列番号22)
GAGGTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATGGAGACCGGTACCTC
構成要素EYFP BsaI A (758bp) (配列番号23)
GAGGTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATGGAGACCGGTACCTC
構成要素mCherry BsaI A (749bp) (配列番号24)
GAGGTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAAACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATGGAGACCGGTACCTC
構成要素TagBFP BsaI A (746bp) (配列番号25)
GAGGTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGAGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGGACAACCATCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACTAGCTTCCTCTACGGCAGCAAGACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTCAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAGGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCACATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCTTCACCGAAACGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAAACGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGAGCCATCTGATCGCAAACATCAAGACCACATATAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCTGGCGTCTACTATGTGGACTACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCAACAACGAAACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCAGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAGCTTAATTCCGGATGATGGAGACCGGTACCTC
構成要素BGHpA BsaI A (267bp) (配列番号26)
GAGGTACCGGTCTCATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGGAGACCGGTACCTC
構成要素LacZα-up BsaI A (278) (配列番号27)
GAGGTACCGGTCTCGTTCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGGAGACCGGTACCTC
構成要素LacZα-down BsaI A (299bp) (配列番号28)
GAGGTACCGGTCTCGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGACCTGCAGGGCCAGTGAGACCGGTACCTC
構成要素HygroR BsaI A (1650bp) (配列番号29)
GAGGTACCGGTCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCGAGACCGGTACCTC
実施形態１で得られたベクターの配列
本発明によるベクターpHCsiaT-E1GFP(配列番号30)は、構成要素Ori-AmpR BsaI A(配列番号17)、pCMV BsaI A(配列番号18)、SiaT BsaI A(配列番号19)、BGHpA BsaI A(配列番号26)、LacZα-up BsaI A(配列番号27)、LacZα-down BsaI A(配列番号28)、HygroR BsaI A(配列番号29)及びE1GFP BsaI A(配列番号20)の組合せから構築される。
ベクターpHCsiaT-E1GFP(配列番号30)
TGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAGTTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGTCCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGACCTGCAGGGCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACG
本発明によるベクターpHCsiaT-EGFP(配列番号31)は、構成要素Ori-AmpR BsaI A(配列番号17)、pCMV BsaI A(配列番号18)、SiaT BsaI A(配列番号19)、BGHpA BsaI A(配列番号26)、LacZα-up BsaI A(配列番号27)、LacZα-down BsaI A(配列番号28)、HygroR BsaI A(配列番号29)及びEGFP BsaI A(配列番号21)の組合せから構築される。
ベクターpHCsiaT-EGFP(配列番号31)
TGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGACCTGCAGGGCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACG
本発明によるベクターpHCsiaT-ECFP(配列番号32)は、構成要素Ori-AmpR BsaI A(配列番号17)、pCMV BsaI A(配列番号18)、SiaT BsaI A(配列番号19)、BGHpA BsaI A(配列番号26)、LacZα-up BsaI A(配列番号27)、LacZα-down BsaI A(配列番号28)、HygroR BsaI A(配列番号29)及びECFP BsaI A(配列番号22)の組合せから構築される。
ベクターpHCsiaT-ECFP(配列番号32)
TGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGACCTGCAGGGCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACG
本発明によるベクターpHCsiaT-EYGFP(配列番号33)は、構成要素Ori-AmpR BsaI A(配列番号17)、pCMV BsaI A(配列番号18)、SiaT BsaI A(配列番号19)、BGHpA BsaI A(配列番号26)、LacZα-up BsaI A(配列番号27)、LacZα-down BsaI A(配列番号28)、HygroR BsaI A(配列番号29)及びEYFP BsaI A(配列番号23)の組合せから構築される。
ベクターpHCsiaT-EYFP(配列番号33)
TGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGACCTGCAGGGCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACG
本発明によるベクターpHCsiaT-mCherry(配列番号34)は、構成要素Ori-AmpR BsaI A(配列番号17)、pCMV BsaI A(配列番号18)、SiaT BsaI A(配列番号19)、BGHpA BsaI A(配列番号26)、LacZα-up BsaI A(配列番号27)、LacZα-down BsaI A(配列番号28)、HygroR BsaI A(配列番号29)及びmCherry BsaI A(配列番号24)の組合せから構築される。
ベクターpHCsiaT-mCherry(配列番号34)
TGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAAACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGACCTGCAGGGCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACG
本発明によるベクターpHCsiaT-TagBFP(配列番号35)は、構成要素Ori-AmpR BsaI A(配列番号17)、pCMV BsaI A(配列番号18)、SiaT BsaI A(配列番号19)、BGHpA BsaI A(配列番号26)、LacZα-up BsaI A(配列番号27)、LacZα-down BsaI A(配列番号28)、HygroR BsaI A(配列番号29)及びTagBFP BsaI A(配列番号25)の組合せから構築される。
ベクターpHCsiaT-TagBFP(配列番号35)
TGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGGAGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGGACAACCATCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACTAGCTTCCTCTACGGCAGCAAGACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTCAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAGGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCACATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCTTCACCGAAACGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAAACGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGAGCCATCTGATCGCAAACATCAAGACCACATATAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCTGGCGTCTACTATGTGGACTACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCAACAACGAAACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCAGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAGCTTAATTCCGGATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGACCTGCAGGGCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACG
以下の実施例の目的は、癌性マウス系統においてヒト導入遺伝子(cDNA)を安定的に発現させることができ、及び/又は第２のマウス遺伝子(shRNA)の発現を安定的に阻害することができるベクターを作製することであった。下記の一連のベクターは、上記の２つの発現単位の存在及び(記載した方法に特有の)マルチクローニング部位の非存在を特徴とする独創的な構築物(ベクターV1)からの組込み機能を発現することができる異なる機能モジュールの実装を説明するものである。
下記の構成要素は、実施形態１について上記したように、従来のプロトコールに従うPCRにより取得した。組立ては、上記のプロトコールに従って、リガーゼT4 HCの緩衝液中、酵素Bsal(NEB)及びリガーゼT4 HC(Promega)を用いて実施した。
実施形態２
ベクターV1群：複数の導入遺伝子の同時発現を可能にする(マルチクローニング部位を含まない)ベクター
U1 ＋ n×U2a ＋ m×U2b
U1：細菌性機能性単位
U2a：プロモーターがRNAポリメラーゼIIプロモーター依存性であり、発現産物がタンパク質である発現機能単位
U2b：プロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーター依存性であり、発現産物が長鎖非コーディングRNAである発現機能単位
ｎ≧０、ｍ≧０及びｎ＋ｍ≧２
実施例：酵素hFUT3の発現をさせる一方で、mB3Galt6の発現を抑制させるベクター。
ベクターV1の構築に使用される構成要素のリスト(図６)
構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)
GAGGTACCGGTCTCATATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGACGAGACCGGTACCTC
構成要素pCMV BsaI B(配列番号37)
GAGGTACCGGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCCGAGACCGGTACCTC
構成要素hFUT3 BsaI A(配列番号38)
GAGGTACCGGTCTCACACCATGGATCCCCTGGGTGCAGCCAAGCCACAATGGCCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCACTGCTATTTCAGCTGCTGGTGGCTGTGTGTTTCTTCTCCTACCTGCGTGTGTCCCGAGACGATGCCACTGGATCCCCTAGGGCTCCCAGTGGGTCCTCCCGACAGGACACCACTCCCACCCGCCCCACCCTCCTGATCCTGCTATGGACATGGCCTTTCCACATCCCTGTGGCTCTGTCCCGCTGTTCAGAGATGGTGCCCGGCACAGCCGACTGCCACATCACTGCCGACCGCAAGGTGTACCCACAGGCAGACACGGTCATCGTGCACCACTGGGATATCATGTCCAACCCTAAGTCACGCCTCCCACCTTCCCCGAGGCCGCAGGGGCAGCGCTGGATCTGGTTCAACTTGGAGCCACCCCCTAACTGCCAGCACCTGGAAGCCCTGGACAGATACTTCAATCTCACCATGTCCTACCGCAGCGACTCCGACATCTTCACGCCCTACGGCTGGCTGGAGCCGTGGTCCGGCCAGCCTGCCCACCCACCGCTCAACCTCTCGGCCAAGACCGAGCTGGTGGCCTGGGCGGTGTCCAACTGGAAGCCGGACTCAGCCAGGGTGCGCTACTACCAGAGCCTGCAGGCTCATCTCAAGGTGGACGTGTACGGACGCTCCCACAAGCCCCTGCCCAAGGGGACCATGATGGAGACGCTGTCCCGGTACAAGTTCTACCTGGCCTTCGAGAACTCCTTGCACCCCGACTACATCACCGAGAAGCTGTGGAGGAACGCCCTGGAGGCCTGGGCCGTGCCCGTGGTGCTGGGCCCCAGCAGAAGCAACTACGAGAGGTTCCTGCCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAGCCCCAAGGACCTGGCCCGGTACCTGCAGGAGCTGGACAAGGACCACGCCCGCTACCTGAGCTACTTTCGCTGGCGGGAGACGCTGCGGCCTCGCTCCTTCAGCTGGGCACTGGATTTCTGCAAGGCCTGCTGGAAACTGCAGCAGGAATCCAGGTACCAGACGGTGCGCAGCATAGCGGCTTGGTTCACCTGATCGAGACCGGTACCTC
構成要素BGHpA BsaI B(配列番号39)
GAGGTACCGGTCTCATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGCGAGACCGGTACCTC
構成要素shB3Galt6 BsaI A(配列番号40)
GAGGTACCGGTCTCATTCGACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTGTATTCGAGACCGGTACCTC
ベクターV1(配列番号41、V1群のベクターの例)
TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGGATCCCCTGGGTGCAGCCAAGCCACAATGGCCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCACTGCTATTTCAGCTGCTGGTGGCTGTGTGTTTCTTCTCCTACCTGCGTGTGTCCCGAGACGATGCCACTGGATCCCCTAGGGCTCCCAGTGGGTCCTCCCGACAGGACACCACTCCCACCCGCCCCACCCTCCTGATCCTGCTATGGACATGGCCTTTCCACATCCCTGTGGCTCTGTCCCGCTGTTCAGAGATGGTGCCCGGCACAGCCGACTGCCACATCACTGCCGACCGCAAGGTGTACCCACAGGCAGACACGGTCATCGTGCACCACTGGGATATCATGTCCAACCCTAAGTCACGCCTCCCACCTTCCCCGAGGCCGCAGGGGCAGCGCTGGATCTGGTTCAACTTGGAGCCACCCCCTAACTGCCAGCACCTGGAAGCCCTGGACAGATACTTCAATCTCACCATGTCCTACCGCAGCGACTCCGACATCTTCACGCCCTACGGCTGGCTGGAGCCGTGGTCCGGCCAGCCTGCCCACCCACCGCTCAACCTCTCGGCCAAGACCGAGCTGGTGGCCTGGGCGGTGTCCAACTGGAAGCCGGACTCAGCCAGGGTGCGCTACTACCAGAGCCTGCAGGCTCATCTCAAGGTGGACGTGTACGGACGCTCCCACAAGCCCCTGCCCAAGGGGACCATGATGGAGACGCTGTCCCGGTACAAGTTCTACCTGGCCTTCGAGAACTCCTTGCACCCCGACTACATCACCGAGAAGCTGTGGAGGAACGCCCTGGAGGCCTGGGCCGTGCCCGTGGTGCTGGGCCCCAGCAGAAGCAACTACGAGAGGTTCCTGCCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAGCCCCAAGGACCTGGCCCGGTACCTGCAGGAGCTGGACAAGGACCACGCCCGCTACCTGAGCTACTTTCGCTGGCGGGAGACGCTGCGGCCTCGCTCCTTCAGCTGGGCACTGGATTTCTGCAAGGCCTGCTGGAAACTGCAGCAGGAATCCAGGTACCAGACGGTGCGCAGCATAGCGGCTTGGTTCACCTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTG.
実施形態２の三重消化EcoRV、Pvul、SalIによる制限分析(構造検証)を図７に示す。
実施形態２の機能検証：従来プロトコール(例えば、リポトランスフェクション又はエレクトロポレーション)に従って、ベクターV1で真核細胞(例えば、4T1マウス乳癌細胞)をトランスフェクトする。従来プロトコールに従って、トランスフェクションの24時間後及び48時間後に細胞を採集し、溶解してトータルRNAを抽出し、逆転写により相補DNA(cDNA)を作製する。次に、従来プロトコールに従って、これらcDNAを定量的PCR分析用マトリクスとして用いる。

定量的PCRの具体的条件：
後記の３工程を40サイクル実施する：変性 94℃にて30秒間；ハイブリダイゼーション 60℃にて30秒間；伸長 72℃にて30秒間。

用いたプライマー：
mB3Galt6
BETA3Galt6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC(配列番号42)
BETA3Galt6ms2-as CACACGTCCTCGGGTCC(配列番号43)
HFUT3
FUT35：CACTAGTCGACTAGGGATAACAGG(配列番号44)
FUT33：ATGTCCATAGCAGGATCAGGAG(配列番号45)
実施形態３
ベクターV1.1の群：標的ゲノムへの非相同組換えによる導入遺伝子組込みの選択を可能にするベクターV1
U1 ＋ n×U2a ＋ m×U2b ＋ U3a
U1：細菌性機能単位
U2a：プロモーターがRNAポリメラーゼIIプロモーター依存性であり、発現産物がタンパク質である発現機能単位
U2b：プロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーター依存性であり、発現産物が長鎖非コーディングRNAである発現機能単位
U3aはポジティブ選択カセットである、
ｎ≧０、ｍ≧０及びｎ＋ｍ≧２
実施例：酵素hFUT3の発現をさせる一方で、mB3Galt6の発現を抑制させるベクター。
ベクターV1.1の構築に使用される構成要素のリスト(図８)
構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)
構成要素pCMV BsaI B(配列番号37)
構成要素hFUT3 BsaI A(配列番号38)
構成要素BGHpA BsaI B(配列番号39)
構成要素shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)
GAGGTACCGGTCTCATTCGACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTGCCAGCGAGACCGGTACCTC
構成要素HygroR BsaI B(配列番号47)
GAGGTACCGGTCTCACCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTATTCGAGACCGGTACCTC
V1.1(配列番号48、V1.1群のベクターの例)
TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGGATCCCCTGGGTGCAGCCAAGCCACAATGGCCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCACTGCTATTTCAGCTGCTGGTGGCTGTGTGTTTCTTCTCCTACCTGCGTGTGTCCCGAGACGATGCCACTGGATCCCCTAGGGCTCCCAGTGGGTCCTCCCGACAGGACACCACTCCCACCCGCCCCACCCTCCTGATCCTGCTATGGACATGGCCTTTCCACATCCCTGTGGCTCTGTCCCGCTGTTCAGAGATGGTGCCCGGCACAGCCGACTGCCACATCACTGCCGACCGCAAGGTGTACCCACAGGCAGACACGGTCATCGTGCACCACTGGGATATCATGTCCAACCCTAAGTCACGCCTCCCACCTTCCCCGAGGCCGCAGGGGCAGCGCTGGATCTGGTTCAACTTGGAGCCACCCCCTAACTGCCAGCACCTGGAAGCCCTGGACAGATACTTCAATCTCACCATGTCCTACCGCAGCGACTCCGACATCTTCACGCCCTACGGCTGGCTGGAGCCGTGGTCCGGCCAGCCTGCCCACCCACCGCTCAACCTCTCGGCCAAGACCGAGCTGGTGGCCTGGGCGGTGTCCAACTGGAAGCCGGACTCAGCCAGGGTGCGCTACTACCAGAGCCTGCAGGCTCATCTCAAGGTGGACGTGTACGGACGCTCCCACAAGCCCCTGCCCAAGGGGACCATGATGGAGACGCTGTCCCGGTACAAGTTCTACCTGGCCTTCGAGAACTCCTTGCACCCCGACTACATCACCGAGAAGCTGTGGAGGAACGCCCTGGAGGCCTGGGCCGTGCCCGTGGTGCTGGGCCCCAGCAGAAGCAACTACGAGAGGTTCCTGCCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAGCCCCAAGGACCTGGCCCGGTACCTGCAGGAGCTGGACAAGGACCACGCCCGCTACCTGAGCTACTTTCGCTGGCGGGAGACGCTGCGGCCTCGCTCCTTCAGCTGGGCACTGGATTTCTGCAAGGCCTGCTGGAAACTGCAGCAGGAATCCAGGTACCAGACGGTGCGCAGCATAGCGGCTTGGTTCACCTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTGCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATC
実施形態３の三重消化EcoRV、Pvul、Sali(1μgのDNAを10単位の各酵素により37℃で15分間消化)による制限分析を図９に示す。
実施形態３の機能検証：従来プロトコール(例えば、リポトランスフェクション又はエレクトロポレーション)に従って、ベクターV1.1で真核細胞(例えば、4T1マウス乳癌細胞)をトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞をハイグロマイシンで処理する(50μg/mL、７日間)。従来プロトコールに従って、細胞を採集し、溶解してトータルRNAを抽出し、逆転写により相補DNA(cDNA)を作製する。次に、従来プロトコールに従って、これらcDNAを定量的PCR分析用マトリクスとして用いる(図10)。

定量的PCRの具体的条件：
後記の３工程を40サイクル実施する：変性 94℃にて30秒間；ハイブリダイゼーション 60℃にて30秒間；伸長 72℃にて30秒間。

用いたプライマー：
mB3Galt6
BETA3Galt6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC(配列番号42)
BETA3Galt6ms2-as CACACGTCCTCGGGTCC(配列番号43)
hFUT3
FUT35 CACTAGTCGACTAGGGATAACAGG(配列番号44)
FUT33 ATGTCCATAGCAGGATCAGGAG(配列番号45)
実施形態４
ベクターV1.2の群：標的ゲノムへの相同組換えによる複数導入遺伝子の同時組込の選択を可能にするベクターV1.1
U1 ＋ U3b ＋ U2 ＋ U3a ＋ U3c
U1：細菌性機能単位
U2：n×U2a ＋ m×U2b、ｎ≧０、ｍ≧０及びｎ＋ｍ≧２
U2a：プロモーターがRNAポリメラーゼIIプロモーター依存性であり、発現産物がタンパク質である発現機能単位
U2b：プロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーター依存性であり、発現産物が長鎖非コーディングRNAである発現機能単位
U3a＝ポジティブ選択カセット
U3b＝相同組換配列Ｘの５'側モチーフ
U3c＝相同組換配列Ｘの３'側モチーフ
実施例：酵素hFUT3の発現をさせる一方で、mB3Galt6の発現を抑制させるベクター。
ベクターV1.2の構築に使用される構成要素のリスト(図11)
構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)

構成要素rosa26-5' BsaI A(配列番号49)
GAGGTACCGGTCTCAAGGACCCCGCGGCAGGCCCTCCGAGCGTGGTGGAGCCGTTCTGTGAGACAGCCGGGTACGAGTCGTGACGCTGGAAGGGGCAAGCGGGTGGTGGGCAGGAATGCGGTCCGCCCTGCAGCAACCGGAGGGGGAGGGAGAAGGGAGCGGAAAAGTCTCCACCGGACGCGGCCATGGCTCGGGGGGGGGGGGGCAGCGGAGGAGCGCTTCCGGCCGACGTCTCGTCGCTGATTGGCTTCTTTTCCTCCCGCCGTGTGTGAAAACACAAATGGCGTGTTTTGGTTGGCGTAAGGCGCCTGTCAGTTAACGGCAGCCGGAGTGCGCAGCCGCCGGCAGCCTCGCTCTGCCCACTGGGTGGGGCGGGAGGTAGGTGGGGTGAGGCGAGCTGGACGTGCGGGCGCGGTCGGCCTCTGGCGGGGCGGGGGAGGGGAGGGAGGGTCAGCGAAAGTAGCTCGCGCGCGAGCGGCCGCCCACCCTCCCCTTCCTCTGGGGGAGTCGTTTTACCCGCCGCCGGCCGGGCCTCGTCGTCTGATTGGCTCTCGGGGCCCAGAAAACTGGCCCTTGCCATTGGCTCGTGTTCGTGCAAGTTGAGTCCATCCGCCGGCCAGCGGGGGCGGCGAGGAGGCGCTCCCAGGTTCCGGCCCTCCCCTCGGCCCCGCGCCGCAGAGTCTGGCCGCGCGCCCCTGCGCAACGTGGCAGGAAGCGCGCGCTGGGGGCGGGGACGGGCAGTAGGGCTGAGCGGCTGCGGGGCGGGTGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAGGGGCGTGCTGAGCCAGACCTCCATCGCGCACTCCGGGGAGTGGAGGGAAGGAGCGAGGGCTCAGTTGGGCTGTTTTGGAGGCAGGAAGCACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTTCTCCGGAGGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTGCCCCCTCTTCCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTTACAACGAGACCGGTACCTC
構成要素pCMV BsaI C(配列番号50)
GAGGTACCGGTCTCAACAAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCCGAGACCGGTACCTC
構成要素hFUT3 BsaI A(配列番号38)
構成要素BGHpA BsaI B(配列番号39)
構成要素shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)
構成要素HygroR BsaI C(配列番号51)
GAGGTACCGGTCTCACCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCGTAGCGAGACCGGTACCTC
構成要素rosa26-3' BsaI A(配列番号52)
GAGGTACCGGTCTCAGTAGAGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAGTTTTTTAATAGGGGCAAATAGGAAAATGGAGGATAGGAGTCATCTGGGGTTTATGCAGCAAAACTACAGGTATATTGCTTGTATCCGCCTCGGAGATTTCCATGAGGAGATAAAGACATGTCACCCGAGTTTATACTCTCCTGCTTAGATCCTACTACAGTATGAAATACAGTGTCGCGAGGTAGACTATGTAAGCAGATTTAATCATTTTAAAGAGCCCAGTACTTCATATCCATTTCTCCCGCTCCTTCTGCAGCCTTATCAAAAGGTATTTAGAACACTCATTTTAGCCCCATTTTCATTTATTATACTGGCTTATCCAACCCCTAGACAGAGCATTGGCATTTTCCCTTTCCTGATCTTAGAAGTCTGATGACTCATGAAACCAGACAGATTAGTTACATACACCACAAATCGAGGCTGTAGCTGGGGCCTCAACACTGCAGTTCTTTTATAACTCCTTAGTACACTTTTTGTTGATCCTTTGCCTTGATCCTTAATTTTCAGTGTCTATCACCTCTCCCGTCAGGTGGTGTTCCACATTTGGGCCTATTCTCAGTCCAGGGAGTTTTACAACAATAGATGTATTGAGAATCCAACCTAAAGCTTAACTTTCCACTCCCATGAATGCCTCTCTCCTTTTTCTCCATTATAACTGAGCTATAACCATTAATGGTTTCAGGTGGATGTCTCCTCCCCCAATATACCTGATGTATCTACATATTGCCAGGCTGATATTTTAAGACATAAAAGGTATATTTCATTATTGAGCCACATGGTATTGATTACTGCTACTAAAATTTTGTCATTGTACACATCTGTAAAAGGTGGTTCCTTTTGGAATGCAAAGTTCAGGTGTTTGTTGTCTTTCCTGACCTAAGGTCTTGTGAGCTTGTATTTTTTCTATTTAAGCAGTGCTTTCTCTTGGACTGGCTTGACTCATGGCATTCTACACGTTATTGCTGGTCTAAATGTGATTTTGCCAAGCTTCTTCAGGACCTATAATTTTGCTTGACTTGTAGCCAAACACAAGTAAAATGATTAAGCAACAAATGTATTTGTGAAGCTTGGTTTTTAGGTTGTTGTGTTGTGTGTGCTTGTGCTCTATAATAATACTATCCAGGGGCTGGAGAGGTGGCTCGGAGTTCAAGAGCACAGACTGCTCTTCCAGAAGTCCTGAGTTCAATTCCCAGCAACCACATGGTGGCTCACAACCATCTGTAATGGGATCTGATGCCCTCTTCTGGTGTGTCTGAAGACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAATCCTCCTTCTTCTTCTTTTTTTTTTTTTAAAGAGAATACTGTCTCCAGTAGAATTACTGAAGTAATGAAATACTTTGTGTTTGTTCCAATATGGAAGCCAATAATCAAATACTCTTAAGCACTGGAAATGTACCAAGGAACTATTTTATTTAAGTGAACTGTGGACAGAGGAGCCATAACTGCAGACTTGTGGGATACAGAAGACCAATGCAGACTTAATGTCTTTTCTCTTACACTAAGCAATAAAGAAATAAAAATTGAACTTCTAGTATCCTATTTGTTAAACTGCTAGCTTTACTAACTTTTGTGCTTCATCTATACAAAGCTGAAAGCTAAGTCTGCAGCCATTACTAAACATGAAAGCAAGTAATGATAATTTTGGATTTCAAAAATGTAGGGCCAGAGTTTAGCCAGCCAGTGGTGGTGCTTGCCTTTATGCCTTAATCCCAGCACTCTGGAGGCAGAGACAGGCAGATCTCTGAGTTTGAGCCCAGCCTGGTCTACACATCAAGTTCTATCTAGGATAGCCAGGAATACACACAGAAACCCTGTTGGGGAGGGGGGCTCTGAGATTTCATAAAATTATAATTGAAGCATTCCCTAATGAGCCACTATGGATGTGGCTAAATCCGTCTACCTTTCTGATGAGATTTGGGTATTATTTTTTCTGTCTCTGCTGTTGGTTGGGTCTTTTGACACTGTGGGCTTTCTTAAAGCCTCCTTCCCTGCCATGTGGACTCTTGTTTGCTACTAACTTCCCATGGCTTAAATGGCATGGCTTTTTGCCTTCTAAGGGCAGCTGCTGAGATTTGCAGCCTGATTTCCAGGGTGGGGTTGGGAAATCTTTCAAACACTAAAATTGTCCTTTAATTTTTTTTTAAAAAATGGGTTATATAATAAACCTCATAAAATAGTTATGAGGAGTGAGGTGGACTAATATTAATGAGTCCCTCCCCTATAAAAGAGCTATTAAGGCTTTTTGTCTTATACTAACTTTTTTTTTAAATGTGGTATCTTTAGAACCAAGGGTCTTAGAGTTTTAGTATACAGAAACTGTTGCATCGCTTAATCAGATTTTCTAGTTTCAAATCCAGAGAATCCAAATTCTTCACAGCCAAAGTCAAATTAAGAATTTCTGACTTTAATGTTATTTGCTACTGTGAATATAAAATGATAGCTTTTCCTGAGGCAGGGTATCACTATGTATCTCTGCCTGATCTGCAACAAGATATGTAGACTAAAGTTCTGCCTGCTTTTGTCTCCTGAATACTAAGGTTAAAATGTAGTAATACTTTTGGAACTTGCAGGTCAGATTCTTTTATAGGGGACACACTAAGGGAGCTTGGGTGATAGTTGGTAAATGTGTTTAAGTGATGAAAACTTGAATTATTATCACCGCAACCTACTTTTTAAAAAAAAAAGCCAGGCCTGTTAGAGCATGCTAAGGGATCCCTAGGACTTGCTGAGCACACAAGAGTAGTACTTGGCAGGCTCCTGGTGAGAGCATATTTCAAAAAACAAGGCAGACAACCAAGAAACTACAGTAAGGTTACCTGTCTTTAACCATCTGCATATACACAGGGATATTAAAATATTCCAAATAATATTTCATTCAAGTTTTCCCCCATCAAATTGGGACATGGATTTCTCCGGTGAATAGGCAGAGTTGGAAACTAAACAAATGTTGGTTTTGTGATTTGTGAAATTGTTTTCAAGTGATAGTTAAAGCCCATGAGATACAGAACAAAGCTGCTATTTCGAGGTCACTTGGTTATACTCAGAAGCACTTCTTTGGGTTTCCCTGCACTATCCTGATCATGTGCTAGGCCTACCTTAGGCTGATTGTTGTTCAAATAACTTAAGTTTCCTGTCAGGTGATGTCATATGATTTCATATATCAAGGCAAAACATGTTATATATGTTAAACATTTGGACTTAATGTGAAAGTTAGGTCTTTGTGGGTTTTGATTTTAATTTCAAAACCTGAGCTAAATAAGTCATTTTACATGTCTTACATTTGGTGAATTGTATATTGTGGTTTGCAGGCAAGACTCTCTGACCTAGTAACCCTCCTATAGAGCACTTTGCTGGGTCACAAGTCTAGGAGTCAAGCATTTCACCTTGAAGTTGAGACGTTTTGTTAGTGTATACTAGTTATATGTTGGAGGACATGTTTATCCAGAAGATATTCAGGACTATTTTTGACTGGGCTAAGGAATTGATTCTGATTAGCACTGTTAGTGAGCATTGAGTGGCCTTTAGGCTTGAATTGGAGTCACTTGTATATCTCAAATAATGCTGGCCTTTTTTAAAAAGCCCTTGTTCTTTATCACCCTGTTTTCTACATAATTTTTGTTCAAAGAAATACTTGTTTGGATCTCCTTTTGACAACAATAGCATGTTTTCAAGCCATATTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTTTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTATAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTTTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATCCGCCTGCCTCTGCCTCCTGAGTGCCGGGATTAAAGGCGTGCACCACCACGCCTGGCTAAGTTGGATATTTTGTATATAACTATAACCAATACTAACTCCACTGGGTGGATTTTTAATTCAGTCAGTAGTCTTAAGTGGTCTTTATTGGCCCTTATTAAAATCTACTGTTCACTCTAACAGAGGCTGTTGGACTAGTGGGACTAAGCAACTTCCTACGGATATACTAGCAGATAAGGGTCAGGGATAGAAACTAGTCTAGCGTTTTGTATACCTACCAGCTTATACTACCTTGTTCTGATAGAAATATTTAGGACATCTAGCTTATCTATTCGAGACCGGTACCTC
V1.2(配列番号53、V1.2群のベクターの例)
TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGACCCCGCGGCAGGCCCTCCGAGCGTGGTGGAGCCGTTCTGTGAGACAGCCGGGTACGAGTCGTGACGCTGGAAGGGGCAAGCGGGTGGTGGGCAGGAATGCGGTCCGCCCTGCAGCAACCGGAGGGGGAGGGAGAAGGGAGCGGAAAAGTCTCCACCGGACGCGGCCATGGCTCGGGGGGGGGGGGGCAGCGGAGGAGCGCTTCCGGCCGACGTCTCGTCGCTGATTGGCTTCTTTTCCTCCCGCCGTGTGTGAAAACACAAATGGCGTGTTTTGGTTGGCGTAAGGCGCCTGTCAGTTAACGGCAGCCGGAGTGCGCAGCCGCCGGCAGCCTCGCTCTGCCCACTGGGTGGGGCGGGAGGTAGGTGGGGTGAGGCGAGCTGGACGTGCGGGCGCGGTCGGCCTCTGGCGGGGCGGGGGAGGGGAGGGAGGGTCAGCGAAAGTAGCTCGCGCGCGAGCGGCCGCCCACCCTCCCCTTCCTCTGGGGGAGTCGTTTTACCCGCCGCCGGCCGGGCCTCGTCGTCTGATTGGCTCTCGGGGCCCAGAAAACTGGCCCTTGCCATTGGCTCGTGTTCGTGCAAGTTGAGTCCATCCGCCGGCCAGCGGGGGCGGCGAGGAGGCGCTCCCAGGTTCCGGCCCTCCCCTCGGCCCCGCGCCGCAGAGTCTGGCCGCGCGCCCCTGCGCAACGTGGCAGGAAGCGCGCGCTGGGGGCGGGGACGGGCAGTAGGGCTGAGCGGCTGCGGGGCGGGTGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAGGGGCGTGCTGAGCCAGACCTCCATCGCGCACTCCGGGGAGTGGAGGGAAGGAGCGAGGGCTCAGTTGGGCTGTTTTGGAGGCAGGAAGCACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTTCTCCGGAGGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTGCCCCCTCTTCCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTTACAAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGGATCCCCTGGGTGCAGCCAAGCCACAATGGCCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCACTGCTATTTCAGCTGCTGGTGGCTGTGTGTTTCTTCTCCTACCTGCGTGTGTCCCGAGACGATGCCACTGGATCCCCTAGGGCTCCCAGTGGGTCCTCCCGACAGGACACCACTCCCACCCGCCCCACCCTCCTGATCCTGCTATGGACATGGCCTTTCCACATCCCTGTGGCTCTGTCCCGCTGTTCAGAGATGGTGCCCGGCACAGCCGACTGCCACATCACTGCCGACCGCAAGGTGTACCCACAGGCAGACACGGTCATCGTGCACCACTGGGATATCATGTCCAACCCTAAGTCACGCCTCCCACCTTCCCCGAGGCCGCAGGGGCAGCGCTGGATCTGGTTCAACTTGGAGCCACCCCCTAACTGCCAGCACCTGGAAGCCCTGGACAGATACTTCAATCTCACCATGTCCTACCGCAGCGACTCCGACATCTTCACGCCCTACGGCTGGCTGGAGCCGTGGTCCGGCCAGCCTGCCCACCCACCGCTCAACCTCTCGGCCAAGACCGAGCTGGTGGCCTGGGCGGTGTCCAACTGGAAGCCGGACTCAGCCAGGGTGCGCTACTACCAGAGCCTGCAGGCTCATCTCAAGGTGGACGTGTACGGACGCTCCCACAAGCCCCTGCCCAAGGGGACCATGATGGAGACGCTGTCCCGGTACAAGTTCTACCTGGCCTTCGAGAACTCCTTGCACCCCGACTACATCACCGAGAAGCTGTGGAGGAACGCCCTGGAGGCCTGGGCCGTGCCCGTGGTGCTGGGCCCCAGCAGAAGCAACTACGAGAGGTTCCTGCCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAGCCCCAAGGACCTGGCCCGGTACCTGCAGGAGCTGGACAAGGACCACGCCCGCTACCTGAGCTACTTTCGCTGGCGGGAGACGCTGCGGCCTCGCTCCTTCAGCTGGGCACTGGATTTCTGCAAGGCCTGCTGGAAACTGCAGCAGGAATCCAGGTACCAGACGGTGCGCAGCATAGCGGCTTGGTTCACCTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGA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ATATCAAGGCAAAACATGTTATATATGTTAAACATTTGGACTTAATGTGAAAGTTAGGTCTTTGTGGGTTTTGATTTTAATTTCAAAACCTGAGCTAAATAAGTCATTTTACATGTCTTACATTTGGTGAATTGTATATTGTGGTTTGCAGGCAAGACTCTCTGACCTAGTAACCCTCCTATAGAGCACTTTGCTGGGTCACAAGTCTAGGAGTCAAGCATTTCACCTTGAAGTTGAGACGTTTTGTTAGTGTATACTAGTTATATGTTGGAGGACATGTTTATCCAGAAGATATTCAGGACTATTTTTGACTGGGCTAAGGAATTGATTCTGATTAGCACTGTTAGTGAGCATTGAGTGGCCTTTAGGCTTGAATTGGAGTCACTTGTATATCTCAAATAATGCTGGCCTTTTTTAAAAAGCCCTTGTTCTTTATCACCCTGTTTTCTACATAATTTTTGTTCAAAGAAATACTTGTTTGGATCTCCTTTTGACAACAATAGCATGTTTTCAAGCCATATTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTTTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTATAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTTTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATCCGCCTGCCTCTGCCTCCTGAGTGCCGGGATTAAAGGCGTGCACCACCACGCCTGGCTAAGTTGGATATTTTGTATATAACTATAACCAATACTAACTCCACTGGGTGGATTTTTAATTCAGTCAGTAGTCTTAAGTGGTCTTTATTGGCCCTTATTAAAATCTACTGTTCACTCTAACAGAGGCTGTTGGACTAGTGGGACTAAGCAACTTCCTACGGATATACTAGCAGATAAGGGTCAGGGATAGAAACTAGTCTAGCGTTTTGTATACCTACCAGCTTATACTACCTTGTTCTGATAGAAATATTTAGGACATCTAGCTTATC
実施形態４の三重消化EcoRV、Pvul、Saliによる制限分析を図12に示す。
実施形態４の機能検証：従来プロトコール(例えば、リポトランスフェクション又はエレクトロポレーション)に従って、ベクターV1.2で真核細胞(例えば、4T1マウス乳癌細胞)をトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞をハイグロマイシンで処理する(50μg/mL、７〜14日間)。従来プロトコールに従って、細胞を採集し、溶解してトータルRNAを抽出し、逆転写により相補DNA(cDNA)を作製する。次に、従来プロトコールに従って、これらcDNAを定量的PCR分析用マトリクスとして用いる。

定量的PCRの具体的条件：
後記の３工程を40サイクル実施する：変性 94℃にて30秒間；ハイブリダイゼーション 60℃にて30秒間；伸長 72℃にて30秒間。

用いたプライマー：
mB3Galt6
BETA3Galt6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC(配列番号42)
BETA3Galt6ms2-as CACACGTCCTCGGGTCC(配列番号43)
hFUT3
FUT35 CACTAGTCGACTAGGGATAACAGG(配列番号44)
FUT33 ATGTCCATAGCAGGATCAGGAG(配列番号45)
実施形態５
ベクターV1.3の群：非相同組換により１又は２以上の導入遺伝子が組み込まれている宿主細胞の除去を可能にするベクターV1.2
U1 ＋ U3b ＋ U2 ＋ U3a ＋ U3c ＋ U3d
U1：細菌性機能性単位
U2：n×U2a ＋ m×U2b、ｎ≧０、ｍ≧０及びｎ＋ｍ≧２
U2a：プロモーターがRNAポリメラーゼIIプロモーター依存性であり、発現産物がタンパク質である発現機能単位
U2b：プロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーター依存性であり、発現産物が長鎖非コーディングRNAである発現機能単位
U3a＝ポジティブ選択カセット
U3b＝相同組換配列Ｘの５'側モチーフ
U3c＝相同組換配列Ｘの３'側モチーフ
U3dはネガティブ選択カセットである。
実施例：酵素hFUT3の発現をさせる一方で、mB3Galt6の発現を抑制させるベクター。
ベクターV1.3の構築に使用される構成要素のリスト(図13)
構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)
構成要素rosa26-5' BsaI A(配列番号49)
構成要素pCMV BsaI C(配列番号50)
構成要素hFUT3 BsaI A(配列番号38)
構成要素BGHpA BsaI B(配列番号39)
構成要素shB3Galt6 BsaI B(配列番号46)
構成要素HygroR BsaI C(配列番号51)
構成要素rosa26-3' BsaI B(配列番号54)
GAGGTACCGGTCTCAGTAGAGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAGTTTTTTAATAGGGGCAAATAGGAAAATGGAGGATAGGAGTCATCTGGGGTTTATGCAGCAAAACTACAGGTATATTGCTTGTATCCGCCTCGGAGATTTCCATGAGGAGATAAAGACATGTCACCCGAGTTTATACTCTCCTGCTTAGATCCTACTACAGTATGAAATACAGTGTCGCGAGGTAGACTATGTAAGCAGATTTAATCATTTTAAAGAGCCCAGTACTTCATATCCATTTCTCCCGCTCCTTCTGCAGCCTTATCAAAAGGTATTTAGAACACTCATTTTAGCCCCATTTTCATTTATTATACTGGCTTATCCAACCCCTAGACAGAGCATTGGCATTTTCCCTTTCCTGATCTTAGAAGTCTGATGACTCATGAAACCAGACAGATTAGTTACATACACCACAAATCGAGGCTGTAGCTGGGGCCTCAACACTGCAGTTCTTTTATAACTCCTTAGTACACTTTTTGTTGATCCTTTGCCTTGATCCTTAATTTTCAGTGTCTATCACCTCTCCCGTCAGGTGGTGTTCCACATTTGGGCCTATTCTCAGTCCAGGGAGTTTTACAACAATAGATGTATTGAGAATCCAACCTAAAGCTTAACTTTCCACTCCCATGAATGCCTCTCTCCTTTTTCTCCATTATAACTGAGCTATAACCATTAATGGTTTCAGGTGGATGTCTCCTCCCCCAATATACCTGATGTATCTACATATTGCCAGGCTGATATTTTAAGACATAAAAGGTATATTTCATTATTGAGCCACATGGTATTGATTACTGCTACTAAAATTTTGTCATTGTACACATCTGTAAAAGGTGGTTCCTTTTGGAATGCAAAGTTCAGGTGTTTGTTGTCTTTCCTGACCTAAGGTCTTGTGAGCTTGTATTTTTTCTATTTAAGCAGTGCTTTCTCTTGGACTGGCTTGACTCATGGCATTCTACACGTTATTGCTGGTCTAAATGTGATTTTGCCAAGCTTCTTCAGGACCTATAATTTTGCTTGACTTGTAGCCAAACACAAGTAAAATGATTAAGCAACAAATGTATTTGTGAAGCTTGGTTTTTAGGTTGTTGTGTTGTGTGTGCTTGTGCTCTATAATAATACTATCCAGGGGCTGGAGAGGTGGCTCGGAGTTCAAGAGCACAGACTGCTCTTCCAGAAGTCCTGAGTTCAATTCCCAGCAACCACATGGTGGCTCACAACCATCTGTAATGGGATCTGATGCCCTCTTCTGGTGTGTCTGAAGACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAATCCTCCTTCTTCTTCTTTTTTTTTTTTTAAAGAGAATACTGTCTCCAGTAGAATTACTGAAGTAATGAAATACTTTGTGTTTGTTCCAATATGGAAGCCAATAATCAAATACTCTTAAGCACTGGAAATGTACCAAGGAACTATTTTATTTAAGTGAACTGTGGACAGAGGAGCCATAACTGCAGACTTGTGGGATACAGAAGACCAATGCAGACTTAATGTCTTTTCTCTTACACTAAGCAATAAAGAAATAAAAATTGAACTTCTAGTATCCTATTTGTTAAACTGCTAGCTTTACTAACTTTTGTGCTTCATCTATACAAAGCTGAAAGCTAAGTCTGCAGCCATTACTAAACATGAAAGCAAGTAATGATAATTTTGGATTTCAAAAATGTAGGGCCAGAGTTTAGCCAGCCAGTGGTGGTGCTTGCCTTTATGCCTTAATCCCAGCACTCTGGAGGCAGAGACAGGCAGATCTCTGAGTTTGAGCCCAGCCTGGTCTACACATCAAGTTCTATCTAGGATAGCCAGGAATACACACAGAAACCCTGTTGGGGAGGGGGGCTCTGAGATTTCATAAAATTATAATTGAAGCATTCCCTAATGAGCCACTATGGATGTGGCTAAATCCGTCTACCTTTCTGATGAGATTTGGGTATTATTTTTTCTGTCTCTGCTGTTGGTTGGGTCTTTTGACACTGTGGGCTTTCTTAAAGCCTCCTTCCCTGCCATGTGGACTCTTGTTTGCTACTAACTTCCCATGGCTTAAATGGCATGGCTTTTTGCCTTCTAAGGGCAGCTGCTGAGATTTGCAGCCTGATTTCCAGGGTGGGGTTGGGAAATCTTTCAAACACTAAAATTGTCCTTTAATTTTTTTTTAAAAAATGGGTTATATAATAAACCTCATAAAATAGTTATGAGGAGTGAGGTGGACTAATATTAATGAGTCCCTCCCCTATAAAAGAGCTATTAAGGCTTTTTGTCTTATACTAACTTTTTTTTTAAATGTGGTATCTTTAGAACCAAGGGTCTTAGAGTTTTAGTATACAGAAACTGTTGCATCGCTTAATCAGATTTTCTAGTTTCAAATCCAGAGAATCCAAATTCTTCACAGCCAAAGTCAAATTAAGAATTTCTGACTTTAATGTTATTTGCTACTGTGAATATAAAATGATAGCTTTTCCTGAGGCAGGGTATCACTATGTATCTCTGCCTGATCTGCAACAAGATATGTAGACTAAAGTTCTGCCTGCTTTTGTCTCCTGAATACTAAGGTTAAAATGTAGTAATACTTTTGGAACTTGCAGGTCAGATTCTTTTATAGGGGACACACTAAGGGAGCTTGGGTGATAGTTGGTAAATGTGTTTAAGTGATGAAAACTTGAATTATTATCACCGCAACCTACTTTTTAAAAAAAAAAGCCAGGCCTGTTAGAGCATGCTAAGGGATCCCTAGGACTTGCTGAGCACACAAGAGTAGTACTTGGCAGGCTCCTGGTGAGAGCATATTTCAAAAAACAAGGCAGACAACCAAGAAACTACAGTAAGGTTACCTGTCTTTAACCATCTGCATATACACAGGGATATTAAAATATTCCAAATAATATTTCATTCAAGTTTTCCCCCATCAAATTGGGACATGGATTTCTCCGGTGAATAGGCAGAGTTGGAAACTAAACAAATGTTGGTTTTGTGATTTGTGAAATTGTTTTCAAGTGATAGTTAAAGCCCATGAGATACAGAACAAAGCTGCTATTTCGAGGTCACTTGGTTATACTCAGAAGCACTTCTTTGGGTTTCCCTGCACTATCCTGATCATGTGCTAGGCCTACCTTAGGCTGATTGTTGTTCAAATAACTTAAGTTTCCTGTCAGGTGATGTCATATGATTTCATATATCAAGGCAAAACATGTTATATATGTTAAACATTTGGACTTAATGTGAAAGTTAGGTCTTTGTGGGTTTTGATTTTAATTTCAAAACCTGAGCTAAATAAGTCATTTTACATGTCTTACATTTGGTGAATTGTATATTGTGGTTTGCAGGCAAGACTCTCTGACCTAGTAACCCTCCTATAGAGCACTTTGCTGGGTCACAAGTCTAGGAGTCAAGCATTTCACCTTGAAGTTGAGACGTTTTGTTAGTGTATACTAGTTATATGTTGGAGGACATGTTTATCCAGAAGATATTCAGGACTATTTTTGACTGGGCTAAGGAATTGATTCTGATTAGCACTGTTAGTGAGCATTGAGTGGCCTTTAGGCTTGAATTGGAGTCACTTGTATATCTCAAATAATGCTGGCCTTTTTTAAAAAGCCCTTGTTCTTTATCACCCTGTTTTCTACATAATTTTTGTTCAAAGAAATACTTGTTTGGATCTCCTTTTGACAACAATAGCATGTTTTCAAGCCATATTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTTTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTATAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTTTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATCCGCCTGCCTCTGCCTCCTGAGTGCCGGGATTAAAGGCGTGCACCACCACGCCTGGCTAAGTTGGATATTTTGTATATAACTATAACCAATACTAACTCCACTGGGTGGATTTTTAATTCAGTCAGTAGTCTTAAGTGGTCTTTATTGGCCCTTATTAAAATCTACTGTTCACTCTAACAGAGGCTGTTGGACTAGTGGGACTAAGCAACTTCCTACGGATATACTAGCAGATAAGGGTCAGGGATAGAAACTAGTCTAGCGTTTTGTATACCTACCAGCTTATACTACCTTGTTCTGATAGAAATATTTAGGACATCTAGCTTATCATGCCGAGACCGGTACCTC
構成要素pEF1a BsaI A(配列番号55)
GAGGTACCGGTCTCAATGCaaGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCCGATGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTCCGCGGCCCCGAACTAGGCCTAGGCGTCTGATCACTAGTGACTCTAGTCCTAGTCGACTAGGGATAACAGGGGCCCCGAGACCGGTACCTC
構成要素TK BsaI A(配列番号56)
GAGGTACCGGTCTCAGCCCATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCTGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCTCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCAGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGATACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACAAACATCGTGTTGGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTTGACCTGGCTATGCTGGCCGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTGCTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGGGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGATTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTCCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATCTGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACTGACCGCCGAGACCGGTACCTC
構成要素Tkter BsaI A(配列番号57)
GAGGTACCGGTCTCACCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCTATTCGAGACCGGTACCTC
ベクター1.3(配列番号58、V1.3群のベクターの例)
TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGACCCCGCGGCAGGCCCTCCGAGCGTGGTGGAGCCGTTCTGTGAGACAGCCGGGTACGAGTCGTGACGCTGGAAGGGGCAAGCGGGTGGTGGGCAGGAATGCGGTCCGCCCTGCAGCAACCGGAGGGGGAGGGAGAAGGGAGCGGAAAAGTCTCCACCGGACGCGGCCATGGCTCGGGGGGGGGGGGGCAGCGGAGGAGCGCTTCCGGCCGACGTCTCGTCGCTGATTGGCTTCTTTTCCTCCCGCCGTGTGTGAAAACACAAATGGCGTGTTTTGGTTGGCGTAAGGCGCCTGTCAGTTAACGGCAGCCGGAGTGCGCAGCCGCCGGCAGCCTCGCTCTGCCCACTGGGTGGGGCGGGAGGTAGGTGGGGTGAGGCGAGCTGGACGTGCGGGCGCGGTCGGCCTCTGGCGGGGCGGGGGAGGGGAGGGAGGGTCAGCGAAAGTAGCTCGCGCGCGAGCGGCCGCCCACCCTCCCCTTCCTCTGGGGGAGTCGTTTTACCCGCCGCCGGCCGGGCCTCGTCGTCTGATTGGCTCTCGGGGCCCAGAAAACTGGCCCTTGCCATTGGCTCGTGTTCGTGCAAGTTGAGTCCATCCGCCGGCCAGCGGGGGCGGCGAGGAGGCGCTCCCAGGTTCCGGCCCTCCCCTCGGCCCCGCGCCGCAGAGTCTGGCCGCGCGCCCCTGCGCAACGTGGCAGGAAGCGCGCGCTGGGGGCGGGGACGGGCAGTAGGGCTGAGCGGCTGCGGGGCGGGTGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAGGGGCGTGCTGAGCCAGACCTCCATCGCGCACTCCGGGGAGTGGAGGGAAGGAGCGAGGGCTCAGTTGGGCTGTTTTGGAGGCAGGAAGCACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTTCTCCGGAGGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTGCCCCCTCTTCCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTTACAAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGGATCCCCTGGGTGCAGCCAAGCCACAATGGCCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCACTGCTATTTCAGCTGCTGGTGGCTGTGTGTTTCTTCTCCTACCTGCGTGTGTCCCGAGACGATGCCACTGGATCCCCTAGGGCTCCCAGTGGGTCCTCCCGACAGGACACCACTCCCACCCGCCCCACCCTCCTGATCCTGCTATGGACATGGCCTTTCCACATCCCTGTGGCTCTGTCCCGCTGTTCAGAGATGGTGCCCGGCACAGCCGACTGCCACATCACTGCCGACCGCAAGGTGTACCCACAGGCAGACACGGTCATCGTGCACCACTGGGATATCATGTCCAACCCTAAGTCACGCCTCCCACCTTCCCCGAGGCCGCAGGGGCAGCGCTGGATCTGGTTCAACTTGGAGCCACCCCCTAACTGCCAGCACCTGGAAGCCCTGGACAGATACTTCAATCTCACCATGTCCTACCGCAGCGACTCCGACATCTTCACGCCCTACGGCTGGCTGGAGCCGTGGTCCGGCCAGCCTGCCCACCCACCGCTCAACCTCTCGGCCAAGACCGAGCTGGTGGCCTGGGCGGTGTCCAACTGGAAGCCGGACTCAGCCAGGGTGCGCTACTACCAGAGCCTGCAGGCTCATCTCAAGGTGGACGTGTACGGACGCTCCCACAAGCCCCTGCCCAAGGGGACCATGATGGAGACGCTGTCCCGGTACAAGTTCTACCTGGCCTTCGAGAACTCCTTGCACCCCGACTACATCACCGAGAAGCTGTGGAGGAACGCCCTGGAGGCCTGGGCCGTGCCCGTGGTGCTGGGCCCCAGCAGAAGCAACTACGAGAGGTTCCTGCCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAGCCCCAAGGACCTGGCCCGGTACCTGCAGGAGCTGGACAAGGACCACGCCCGCTACCTGAGCTACTTTCGCTGGCGGGAGACGCTGCGGCCTCGCTCCTTCAGCTGGGCACTGGATTTCTGCAAGGCCTGCTGGAAACTGCAGCAGGAATCCAGGTACCAGACGGTGCGCAGCATAGCGGCTTGGTTCACCTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGA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TGAATAGGCAGAGTTGGAAACTAAACAAATGTTGGTTTTGTGATTTGTGAAATTGTTTTCAAGTGATAGTTAAAGCCCATGAGATACAGAACAAAGCTGCTATTTCGAGGTCACTTGGTTATACTCAGAAGCACTTCTTTGGGTTTCCCTGCACTATCCTGATCATGTGCTAGGCCTACCTTAGGCTGATTGTTGTTCAAATAACTTAAGTTTCCTGTCAGGTGATGTCATATGATTTCAT


ATATCAAGGCAAAACATGTTATATATGTTAAACATTTGGACTTAATGTGAAAGTTAGGTCTTTGTGGGTTTTGATTTTAATTTCAAAACCTGAGCTAAATAAGTCATTTTACATGTCTTACATTTGGTGAATTGTATATTGTGGTTTGCAGGCAAGACTCTCTGACCTAGTAACCCTCCTATAGAGCACTTTGCTGGGTCACAAGTCTAGGAGTCAAGCATTTCACCTTGAAGTTGAGACGTTTTGTTAGTGTATACTAGTTATATGTTGGAGGACATGTTTATCCAGAAGATATTCAGGACTATTTTTGACTGGGCTAAGGAATTGATTCTGATTAGCACTGTTAGTGAGCATTGAGTGGCCTTTAGGCTTGAATTGGAGTCACTTGTATATCTCAAATAATGCTGGCCTTTTTTAAAAAGCCCTTGTTCTTTATCACCCTGTTTTCTACATAATTTTTGTTCAAAGAAATACTTGTTTGGATCTCCTTTTGACAACAATAGCATGTTTTCAAGCCATATTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTTTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTATAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTTTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATCCGCCTGCCTCTGCCTCCTGAGTGCCGGGATTAAAGGCGTGCACCACCACGCCTGGCTAAGTTGGATATTTTGTATATAACTATAACCAATACTAACTCCACTGGGTGGATTTTTAATTCAGTCAGTAGTCTTAAGTGGTCTTTATTGGCCCTTATTAAAATCTACTGTTCACTCTAACAGAGGCTGTTGGACTAGTGGGACTAAGCAACTTCCTACGGATATACTAGCAGATAAGGGTCAGGGATAGAAACTAGTCTAGCGTTTTGTATACCTACCAGCTTATACTACCTTGTTCTGATAGAAATATTTAGGACATCTAGCTTATCATGCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCCGATGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTCCGCGGCCCCGAACTAGGCCTAGGCGTCTGATCACTAGTGACTCTAGTCCTAGTCGACTAGGGATAACAGGGGCCCATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCTGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCTCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCAGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGATACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACAAACATCGTGTTGGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTTGACCTGGCTATGCTGGCCGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTGCTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGGGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGATTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTCCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATCTGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACTGACCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCC
実施形態５の三重消化EcoRV、Pvul、Saliによる制限分析を図12に示す。
実施形態５の機能検証：従来プロトコール(例えば、リポトランスフェクション又はエレクトロポレーション)に従って、ベクターV1.3で真核細胞(例えば、4T1マウス乳癌細胞)をトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞をハイグロマイシンで処理し(50μg/mL、７〜14日間)、続けてガンシクロビルで処理する(３〜６日間、５〜40μM)。従来プロトコールに従って、細胞を採集し、溶解して、トータルRNAを抽出し、逆転写により相補DNA(cDNA)を作製する。次に、従来プロトコールに従って、これらcDNAを定量的PCR分析用マトリクスとして用いる。

定量的PCRの具体的条件：
後記の３工程を40サイクル実施する：変性 94℃にて30秒間；ハイブリダイゼーション 60℃にて30秒間；伸長 72℃にて30秒間。

用いたプライマー：
mB3Galt6
BETA3Galt6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC(配列番号42)
BETA3Galt6ms2-as CACACGTCCTCGGGTCC(配列番号43)
hFUT3
FUT35 CACTAGTCGACTAGGGATAACAGG(配列番号44)
FUT33 ATGTCCATAGCAGGATCAGGAG(配列番号45)
実施形態６
ベクターV2の群：誘導可能な様式で１又は２以上の導入遺伝子の発現を可能にするベクター
U1 ＋ U2c ＋ n×U2d ＋ m×U2e
U1：細菌性機能性単位
U2c＝転写トランスアクチベーター(例えば、タンパク質TAT)をコードする遺伝子
U2g＝プロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベーターに依存性であるる遺伝子(ｎ≧１)
U2d＝プロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベーターに非依存性である遺伝子(ｍ≧０)
実施例：酵素mB3Galt6の誘導性発現を可能にするベクター
ベクターV2の構築に使用される構成要素のリスト(図15)
構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)
構成要素pCMV BsaI B(配列番号37)

構成要素TO3G BsaI A(配列番号59)
GAGGTACCGGTCTCACACCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAATGATCGAGACCGGTACCTC
構成要素BGHpA BsaI B(配列番号39)

構成要素pTRE3G BsaI A(配列番号60)
GAGGTACCGGTCTCATTCGCTTTCGTCTTCAAGAATTCCTGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAACCAGCGAGACCGGTACCTC
構成要素mB3Galt6 BsaI A(配列番号61)
CCAGATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGACCGC
構成要素Tkter BsaI A(配列番号57)

V2(配列番号62、V2群のベクターの例)
TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGCTTTCGTCTTCAAGAATTCCTGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAACCAGAGCATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAACTTCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGATGTCACCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCC
実施形態６の三重消化NdeI、SalI、XhoIによる制限分析を図16に示す。
実施形態６の機能検証：従来プロトコール(例えば、リポトランスフェクション又はエレクトロポレーション)に従って、ベクターV2で真核細胞(例えば、4T1マウス乳癌細胞)をトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を100〜1000ng/mLのドキソサイクリンで24〜48時間処理する。従来プロトコールに従って、細胞を採集し、溶解して、トータルRNAを抽出し、逆転写により相補DNA(cDNA)を作製する。次に、従来プロトコールに従って、これらcDNAを定量的PCR分析用マトリクスとして用いる。

定量的PCRの具体的条件：
後記の３工程を40サイクル実施する：変性 94℃にて30秒間；ハイブリダイゼーション 60℃にて30秒間；伸長 72℃にて30秒間。

用いたプライマー：
BETA3Galt6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC(配列番号42)
BETA3Galt6ms2-as CACACGTCCTCGGGTCC(配列番号43)
実施形態７
ベクターV3の群：誘導可能な制御下で遺伝子補完の実施を可能にするベクター。
U1 ＋ U2f ＋ U2c +U2g
U1：細菌性機能性単位
U2f＝プロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーターであり、発現産物が遺伝子Ｘを標的とする小分子干渉RNAの短ヘアピンRNA(shRNA)前駆体である遺伝子。
U2c＝転写トランスアクチベーター(例えば、VIH-1又は-2のタンパク質TAT)をコードする遺伝子
U2g＝プロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベーターに依存性であり、発現産物が遺伝子Ｘの産物の変異型であることにより遺伝子U2fの産物に対して非感受性である遺伝子
実施例：酵素mB3Galt6の発現の抑制する一方で、この酵素の発現を誘導可能な様式で過剰発現するベクター(補完可能)。
ベクターV3の構築に使用される構成要素のリスト(図17)
構成要素Ori-AmpR BsaI B(配列番号36)
構成要素pCMV BsaI B(配列番号37)
構成要素TO3G BsaI A(配列番号59)
構成要素BGHpA BsaI B(配列番号39)
構成要素pTRE3G BsaI A(配列番号60)
構成要素mB3Galt6 BsaI B(配列番号63)
GAGGTACCGGTCTCACCAGAGCATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAACTTCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGATGTCACCGCCGAGACCGGTACCTC
構成要素Tkter BsaI B(配列番号64)
GAGGTACCGGTCTCACCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCACAACGAGACCGGTACCTC
構成要素shB3Galt6 BsaI C(配列番号65)
GAGGTACCGGTCTCAACAAACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTGTATTCGAGACCGGTACCTC
V3(配列番号66、V3群のベクターの例)
TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGCTTTCGTCTTCAAGAATTCCTGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAACCAGAGCATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAACTTCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGATGTCACCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCACAAACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTG
実施形態７の三重消化NdeI、SalI、XhoIによる制限分析を図18に示す。
構築物７の機能検証：従来プロトコール(例えば、リポトランスフェクション又はエレクトロポレーション)に従って、ベクターV3で真核細胞(例えば、4T1マウス乳癌細胞)をトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を100〜1000ng/mLのドキソサイクリンで24〜48時間処理するか又は処理しない。従来プロトコールに従って、細胞を採集し、溶解して、トータルRNAを抽出し、逆転写により相補DNA(cDNA)を作製する。次に、従来プロトコールに従って、これらcDNAを定量的PCR分析用マトリクスとして用いる。

定量的PCRの具体的条件：
後記の３工程を40サイクル実施する：変性 94℃にて30秒間；ハイブリダイゼーション 60℃にて30秒間；伸長 72℃にて30秒間。

用いたプライマー：
BETA3Galt6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC(配列番号42)
BETA3Galt6ms2-as CACACGTCCTCGGGTCC(配列番号43)
実施形態８
V2b(ベクターV2の群に属する)：誘導可能な様式で１又は２以上の導入遺伝子の発現を可能にするベクター。細菌性機能性単位が１つではなく２つの構成要素から構成されている点でV2bはV2と異なる。
U1 ＋ U2c ＋ n×U2d ＋ m×U2e
U1：細菌性機能性単位
U2c＝転写トランスアクチベーターをコードする遺伝子。
U2g＝プロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベーターに依存性である遺伝子(ｎ≧１)
U2d＝プロモーターが遺伝子U2c0によりコードされるトランスアクチベーターに非依存性である遺伝子(ｍ≧０)
実施例：酵素mB3Galt6の誘導性発現を可能にするベクター
ベクターV2bの構築に使用される構成要素のリスト(図19)
構成要素Ori BsaI A(配列番号104)
GAGGTACCGGTCTCATATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTTTTATGAGACCGGTACCTC
構成要素AmpR BsaI A(配列番号105)
GAGGTACCGGTCTCTTTTATTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGACGAGACCGGTACCTC
構成要素pCMV BsaI B(配列番号37)
構成要素TO3G BsaI A(配列番号59)
構成要素BGHpA BsaI B(配列番号39)
構成要素pTRE3G BsaI A(配列番号60)
構成要素mb3Galt6 BsaI B(配列番号63)
構成要素Tkter BsaI A(配列番号57)
ベクターV2b(配列番号149、V2群のベクターの例)
TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTTTTATTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGCTTTCGTCTTCAAGAATTCCTGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAACCAGAGCATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAACTTCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGATGTCACCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCC
実施形態８の三重消化NdeI、SalI、XhoIによる制限フィンガープリント(構造検証)を図20に示す。
実施形態８の機能検証：従来プロトコール(例えば、リポトランスフェクション又はエレクトロポレーション)に従って、ベクターV2bで真核細胞(例えば、4T1マウス乳癌細胞)をトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を100〜1000ng/mLのドキソサイクリンで24〜48時間処理する。従来プロトコールに従って、細胞を採集し、溶解してトータルRNAを抽出し、逆転写により相補DNA(cDNA)を作製する。次に、従来プロトコールに従って、これらcDNAを定量的PCR分析用マトリクスとして用いる(図21)。
この実験は、ベクターV2bによりコードされる転写物mB3Galt6の発現がドキソサイクリンの存在下でのみ4T1細胞において増加することを示すものであり、ベクターV2bにおける誘導性導入遺伝子及びそのコアクチベータの併存を証明するものである。

定量的PCRの具体的条件：
後記の３工程を40サイクル実施する：変性 94℃にて30秒間；ハイブリダイゼーション 60℃にて30秒間；伸長 72℃にて30秒間。

用いたプライマー：
BETA3Galt6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC(配列番号42)
BETA3Galt6ms2-as CACACGTCCTCGGGTCC(配列番号43)
実施形態９
V3b(ベクターV3の群に属する)：誘導可能な制御下で遺伝子補完の実施を可能にするベクター。細菌性機能性単位が１つではなく２つの構成要素から構成されている点でV3bはV3と異なる。
U1 ＋ U2f ＋ U2c + U2g
U1：細菌性機能性単位
U2f＝プロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーターであり、発現産物が遺伝子Ｘを標的とする小分子干渉RNAの短ヘアピンRNA(shRNA)前駆体である遺伝子。
U2c＝転写トランスアクチベーター(例えば、VIH-1又は-2のタンパク質TAT)をコードする遺伝子
U2g＝プロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベーターに依存性であり、発現産物が遺伝子Ｘの産物の変異型であることにより遺伝子U2fの産物に対して非感受性である遺伝子

実施例：酵素mB3Galt6の発現の抑制する一方で、この酵素の発現を誘導可能な様式で過剰発現するベクター(補完可能)。
ベクターV3bの構築に使用される構成要素のリスト(図22)
構成要素Ori BsaI A(配列番号104)
構成要素AmpR BsaI A(配列番号105)
構成要素pCMV BsaI B(配列番号37)
構成要素TO3G BsaI A(配列番号59)
構成要素BGHpA BsaI B(配列番号39)
構成要素pTRE3G BsaI A(配列番号60)
構成要素mb3Galt6 BsaI B(配列番号63)
構成要素Tkter BsaI B(配列番号64)
構成要素shB3Galt6 BsaI C(配列番号65)
ベクターV3b(配列番号150、V3群のベクターの例)
TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTTTTATTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGCTTTCGTCTTCAAGAATTCCTGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAACCAGAGCATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAACTTCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGATGTCACCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCACAAACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTG
実施形態９の三重消化NdeI、SalI、XhoIによる制限フィンガープリント(構造検証)を図23に示す。
実施形態10
V1.1b(ベクターV1.1の群に属する)：標的ゲノムにおける非相同組換による導入遺伝子の組込みの選択を可能にするベクター。
細菌性機能性単位が１つではなく２つの構成要素で構成されている点で、このベクターはV1.1とは異なる。
U1+ U2 ＋ U3a
U1：細菌性機能性単位
U2：n×U2a ＋ mxU2b、ｎ≧０、ｍ≧０及びｎ＋ｍ≧２
U2a：プロモーターがRNAポリメラーゼIIプロモーター依存性であり、発現産物がタンパク質である発現機能単位
U3a：ポジティブ選択カセット
実施例：蛍光性ドメイン及び細胞コンパートメント(ここでは、細胞膜及びゴルジ装置)に特異的にアドレス指定するドメインで形成された２つの融合タンパク質の発現を可能にするベクター。
ベクターV1.1bの構築に使用される構成要素のリスト(図24)
構成要素Ori BsaI B(配列番号106)
GAGGTACCGGTCTCTATTACGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACCGAGACCGGTACCTC
構成要素AmpR BsaI B(配列番号107)
GAGGTACCGGTCTCAAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAATGCTGAGACCGGTACCTC
構成要素pEF1aL BsaI B(配列番号108)
GAGGTACCGGTCTCAATGCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGATATCCGAGACCGGTACCTC
構成要素EGFP-CAAX BsaI A(配列番号109)
GAGGTACCGGTCTCCTATCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGAAGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTGTAATTATGTAAGAGTGGAGACCGGTACCTC
構成要素BGHpA BsaI C(配列番号110)
GAGGTACCGGTCTCAGAGTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTAGCGAGACCGGTACCTC
構成要素pCMV BsaI D(配列番号111)
GAGGTACCGGTCTCAGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCTTCGCGAGACCGGTACCTC
構成要素SiaT BsaI B(配列番号112)
GAGGTACCGGTCTCCTTCGATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGGGTGATGAGACCGGTACCTC
構成要素mCherry BsaI B(配列番号113)
GAGGTACCGGTCTCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAAACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACCGCTGAGACCGGTACCTC
構成要素TKter BsaI B(配列番号64)

構成要素HygroR BsaI D(配列番号114)
GAGGTACCGGTCTCAACAACAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCATTACGAGACCGGTACCTC
ベクター1.1b(配列番号151、V1.1群のベクターの例)
CGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAATGCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGAAGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTGTAATTATGTAAGAGTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCTTCGATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAAACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGACAACAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCATTA
実施形態10の三重消化EcoRV、PstI、ScaIによる制限フィンガープリント(構造検証)を図25に示す。
実施形態10の機能検証：従来プロトコール(例えば、リポトランスフェクション又はエレクトロポレーション)に従って、ベクターV1.1bで真核細胞(例えば、4T1マウス乳癌細胞)をトランスフェクトする。トランスフェクションの24時間後、細胞を、白色光及び蛍光下で光学顕微鏡を用いて観察する。
GFP蛍光下で視認可能な細胞は、各細胞の膜輪郭に沿ってマーキングされている。mCherry蛍光下で視認可能な細胞は、ゴルジ装置に対応して、点状にマーキングされている。GFP標識及びmCherry標識を重ね合わせると、視認可能な全ての細胞は２つの標識を同時に発現する。非蛍光細胞はエレクトロポレーション後にベクターを受容していない細胞である。このことから、細胞への単一ベクターの導入後に別個の細胞コンパートメントに正しく発現された２つの蛍光マーカーの同時発現が十分に示される。
実施形態11
ベクターV4の群：ゲノムが標的化相同組換えにより編集された細胞の選択を可能にするベクター。
U1 ＋ U3b ＋ U3a ＋ U3c
U1：細菌性機能性単位
U3a＝ポジティブ選択カセット
U3b＝相同組換配列Ｘの５'側モチーフ
U3c＝相同組換配列Ｘの３'側モチーフ
実施例：遺伝子MNN10が欠失した酵母株S. cerevisiaeの選択を可能にするベクター。
ベクターV4の構築に使用される構成要素のリスト(図27)
構成要素Ori-2 BsaI C(配列番号115)
GAGGTACCGGTCTCTGGGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTTTAAACTGAGACCGGTACCTC
構成要素AmpR BsaI C(配列番号116)
GAGGTACCGGTCTCAAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAGTGATGAGACCGGTACCTC
構成要素MNN10-Lrec BsaI A(配列番号117)
GAGGTACCGGTCTCTGTGAGTTTAAACATGCATTCAAAGGTCATAATTGCTGCTCTATTTACAGTCGTCCATAATGACATTTCTCTTTGATTATTTTCTTGTTTTTTCGCTCTTCTCAAGTGGATGTTACATAACAAACAAAACAGAAAAAATTGTTTAAATATAAAGTTTAAAAGTTATCTTTGATTCCGCACCTGAATTTTTGGATTGAAGGCCAAAGGAGGTTTATCAGGGAGAGAAAAGCTCTCTATTTATTTTTATAAGGAATAATTGTGCATGTACAACTATACAATTGCGTGAGACCGGTACCTC
構成要素KanMX BsaI A(配列番号119)
GAGGTACCGGTCTCGTGCGGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGTCGTAGAGACCGGTACCTC
構成要素MNN10-Rrec BsaI A(配列番号118)
GAGGTACCGGTCTCTTCGTAATGGAAGTTATCAATATTGTAAAGAGAAGCATTTACAAGCTTTTATTTTTCTTTTTAATTTCCACTACTGGTTCTGCTTTAAAATGTTGTTTTATAATTTATGTACATTTAGGCCTATAGAAGATTCTTTCAATAATATGCTACACATTCTTTTATTTTTCCATCATATGTTGGAGTTTATGCCTCCTCGGCAGGAGTTGGGCGGTGCGAAGAGAAGAAAAAGAGTGAAACTAAAAAAAGGAATCTGCCTTTGCATAAGTTCAAAAGTGCAATTTTAGTGTTGGATTTAAACGGGAAAAATTGAAATGGCCATCGAAACAATACTTGTAATAAACAAATCAGGCGGACTAATCTATCAGCGGAATTTTACCAACGACGAACAGAAATTGAACAGCAATGAATACTTAATTCTTGCTAGTACACTGCACGGTGTATTCGCCATCGCGAGCCAGCTGACTCCGAAGGCATTACAGCTAACTCAACAAACGAACATCGAAAATACCATCCCATATATACCTTACGTGGGCATGTCCAGCAATAGGAGCGATACAAGAAATGGAGGTGGCAATAACAACAAACACACTAATAATGAAAAACTGGGCAGTTTAAACGGGGAGAGACCGGTACCTC
ベクターV4(配列番号152、V4群のベクターの例)
CGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTTAAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAGTGAGTTTAAACATGCATTCAAAGGTCATAATTGCTGCTCTATTTACAGTCGTCCATAATGACATTTCTCTTTGATTATTTTCTTGTTTTTTCGCTCTTCTCAAGTGGATGTTACATAACAAACAAAACAGAAAAAATTGTTTAAATATAAAGTTTAAAAGTTATCTTTGATTCCGCACCTGAATTTTTGGATTGAAGGCCAAAGGAGGTTTATCAGGGAGAGAAAAGCTCTCTATTTATTTTTATAAGGAATAATTGTGCATGTACAACTATACAATTGCGGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGTCGTAATGGAAGTTATCAATATTGTAAAGAGAAGCATTTACAAGCTTTTATTTTTCTTTTTAATTTCCACTACTGGTTCTGCTTTAAAATGTTGTTTTATAATTTATGTACATTTAGGCCTATAGAAGATTCTTTCAATAATATGCTACACATTCTTTTATTTTTCCATCATATGTTGGAGTTTATGCCTCCTCGGCAGGAGTTGGGCGGTGCGAAGAGAAGAAAAAGAGTGAAACTAAAAAAAGGAATCTGCCTTTGCATAAGTTCAAAAGTGCAATTTTAGTGTTGGATTTAAACGGGAAAAATTGAAATGGCCATCGAAACAATACTTGTAATAAACAAATCAGGCGGACTAATCTATCAGCGGAATTTTACCAACGACGAACAGAAATTGAACAGCAATGAATACTTAATTCTTGCTAGTACACTGCACGGTGTATTCGCCATCGCGAGCCAGCTGACTCCGAAGGCATTACAGCTAACTCAACAAACGAACATCGAAAATACCATCCCATATATACCTTACGTGGGCATGTCCAGCAATAGGAGCGATACAAGAAATGGAGGTGGCAATAACAACAAACACACTAATAATGAAAAACTGGGCAGTTTAAACGGGG
実施形態11の三重消化HindIII及びPmeIによる制限フィンガープリント(構造検証)を図28に示す。
実施形態11の機能検証：ベクターV4を用いて、相同組換えにより酵母遺伝子MNN10を不活化した。このことのために、ベクターの欠失カセットを酵素Pmelでの消化により放出させ、酵母株BY4741へ形質転換した。G418を含む選択培地で72時間増殖後に得られたコロニーを移し、遺伝子MNN10の無効化をPCRにより検証した。構築物の機能性検証のために、このように得られたMNN10変異体のインベルターゼの未変性ゲルでの泳動プロフィールを分析して、野生型株及び変異株pmr1のものと比較することにより、グルコシル化の重度の欠如が示された。
図29に示すように、MNN10変異体のインベルターゼの泳動プロフィール(レーンＣ)は、野生型株のインベルターゼの泳動プロフィール(レーンＢ)とは明らかに異なり、MNN10変異体における該酵素のグルコシル化の欠如を示している。グルコシル化の欠如は、変異体pmr1(レーンＡ)で観察されたもの程は激しくなく、Ｎ-グルコシル化におけるこれら遺伝子の産物の役割が知られているものに相当する。
本発明の異なる構成要素の生産に使用されたマトリクスの配列
マトリクスeZ-Ori-AmpR(配列番号153)：
GCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACGTGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCA
マトリクスBGH polyA(配列番号154)：
TCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTG
マトリクスeZ-E1GFP(配列番号155)：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGTCCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
マトリクスEGFP(配列番号156)：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
マトリクスECFP(配列番号157)：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCC
マトリクスEYFP(配列番号158)：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTAC
マトリクスmCherry(配列番号159)：
ATGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAAACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA
マトリクスhFUT3 cDNA(配列番号160)：
ATGGATCCCCTGGGTGCAGCCAAGCCACAATGGCCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCACTGCTATTTCAGCTGCTGGTGGCTGTGTGTTTCTTCTCCTACCTGCGTGTGTCCCGAGACGATGCCACTGGATCCCCTAGGGCTCCCAGTGGGTCCTCCCGACAGGACACCACTCCCACCCGCCCCACCCTCCTGATCCTGCTATGGACATGGCCTTTCCACATCCCTGTGGCTCTGTCCCGCTGTTCAGAGATGGTGCCCGGCACAGCCGACTGCCACATCACTGCCGACCGCAAGGTGTACCCACAGGCAGACACGGTCATCGTGCACCACTGGGATATCATGTCCAACCCTAAGTCACGCCTCCCACCTTCCCCGAGGCCGCAGGGGCAGCGCTGGATCTGGTTCAACTTGGAGCCACCCCCTAACTGCCAGCACCTGGAAGCCCTGGACAGATACTTCAATCTCACCATGTCCTACCGCAGCGACTCCGACATCTTCACGCCCTACGGCTGGCTGGAGCCGTGGTCCGGCCAGCCTGCCCACCCACCGCTCAACCTCTCGGCCAAGACCGAGCTGGTGGCCTGGGCGGTGTCCAACTGGAAGCCGGACTCAGCCAGGGTGCGCTACTACCAGAGCCTGCAGGCTCATCTCAAGGTGGACGTGTACGGACGCTCCCACAAGCCCCTGCCCAAGGGGACCATGATGGAGACGCTGTCCCGGTACAAGTTCTACCTGGCCTTCGAGAACTCCTTGCACCCCGACTACATCACCGAGAAGCTGTGGAGGAACGCCCTGGAGGCCTGGGCCGTGCCCGTGGTGCTGGGCCCCAGCAGAAGCAACTACGAGAGGTTCCTGCCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAGCCCCAAGGACCTGGCCCGGTACCTGCAGGAGCTGGACAAGGACCACGCCCGCTACCTGAGCTACTTTCGCTGGCGGGAGACGCTGCGGCCTCGCTCCTTCAGCTGGGCACTGGATTTCTGCAAGGCCTGCTGGAAACTGCAGCAGGAATCCAGGTACCAGACGGTGCGCAGCATAGCGGCTTGGTTCACCTGA
マトリクスeZ-hygromycinR K7(配列番号161)：
CAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATC
マトリクスKanMX4 K7(配列番号162)：
GTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTG
マトリクスLacZα(配列番号163)：
GCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGAC
マトリクスmB3Galt6 cDNA(配列番号164)：
ATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGATGTCA
eZ-mB3Galt6 cDNAマトリクスプロモーター、shRNA非感受性(配列番号165)
ATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAACTTCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGATGTCA
酵母S.cerevisiae MNN10遺伝子マトリクス(配列番号166)
AAACATGCATTCAAAGGTCATAATTGCTGCTCTATTTACAGTCGTCCATAATGACATTTCTCTTTGATTATTTTCTTGTTTTTTCGCTCTTCTCAAGTGGATGTTACATAACAAACAAAACAGAAAAAATTGTTTAAATATAAAGTTTAAAAGTTATCTTTGATTCCGCACCTGAATTTTTGGATTGAAGGCCAAAGGAGGTTTATCAGGGAGAGAAAAGCTCTCTATTTATTTTTATAAGGAATAATTGTGCATGTACAACTATACAATATGTCTAGTGTACCTTATAATTCCCAACTTCCTATATCCAACCATCTAGAGTACGATGAAGATGAAAAGAAGAGCAGAGGCTCAAAACTAGGCCTGAAATATAAAATGATATACTGGAGGAAAACTTTATGCAGTTCGCTAGCGAGATGGAGAAAGCTAATACTATTAATATCTTTAGCTTTGTTTTTATTCATATGGATAAGCGATTCCACCATAAGCAGAAATCCATCTACCACAAGTTTTCAAGGCCAAAATAGTAACGATAATAAGTTGAGTAATACTGGTTCTAGCATCAACTCCAAAAGATATGTACCACCATATTCTAAGAGATCAAGATGGTCGTTTTGGAATCAAGATCCTAGGATTGTCATTATATTAGCGGCAAACGAAGGTGGTGGTGTATTGAGGTGGAAAAATGAGCAAGAATGGGCTATCGAAGGCATATCAATAGAAAATAAGAAGGCCTATGCGAAGAGACATGGATATGCGTTGACTATCAAGGATTTGACAACGTCCAAAAGATACTCTCACGAATACAGAGAGGGTTGGCAAAAAGTAGATATATTGAGACAGACGTTCAGGGAGTTTCCTAATGCAGAATGGTTCTGGTGGTTGGACCTGGATACTATGATAATGGAGCCTTCTAAATCATTAGAAGAACATATTTTCGACAGATTGGAAACTCTGGCTGACAGAGAATTGAAAAGTTTTAATCCCCTAAACCTAAGAGACGACATACCCTATGTCGATTATTCAGAGGAAATGGAGTTTCTAATAACACAAGATTGTGGAGGCTTCAATTTGGGCTCATTTCTGATAAAAAATAGCGAATGGTCTAAGCTGCTTCTAGATATGTGGTGGGACCCCGTTCTGTATGAACAAAAACATATGGTTTGGGAACATAGAGAACAAGATGCGTTAGAGGCATTATATGAAAACGAACCGTGGATTCGTTCGAGAATAGGATTTTTGCCCTTAAGAACGATCAATGCATTCCCACCGGGAGCATGCTCTGAATACAGTGGTGACTCAAGATACTTTTACAGTGAGAAAGACCATGATTTTGTTGTGAATATGGCCGGATGCAATTTTGGCAGAGATTGCTGGGGCGAGATGCAGTACTACACCACTTTAATGGAAAAACTGAATAGGAAATGGTACACGAGATTTTTCTTCCCATAAAATGGAAGTTATCAATATTGTAAAGAGAAGCATTTACAAGCTTTTATTTTTCTTTTTAATTTCCACTACTGGTTCTGCTTTAAAATGTTGTTTTATAATTTATGTACATTTAGGCCTATAGAAGATTCTTTCAATAATATGCTACACATTCTTTTATTTTTCCATCATATGTTGGAGTTTATGCCTCCTCGGCAGGAGTTGGGCGGTGCGAAGAGAAGAAAAAGAGTGAAACTAAAAAAAGGAATCTGCCTTTGCATAAGTTCAAAAGTGCAATTTTAGTGTTGGATTTAAACGGGAAAAATTGAAATGGCCATCGAAACAATACTTGTAATAAACAAATCAGGCGGACTAATCTATCAGCGGAATTTTACCAACGACGAACAGAAATTGAACAGCAATGAATACTTAATTCTTGCTAGTACACTGCACGGTGTATTCGCCATCGCGAGCCAGCTGACTCCGAAGGCATTACAGCTAACTCAACAAACGAACATCGAAAATACCATCCCATATATACCTTACGTGGGCATGTCCAGCAATAGGAGCGATACAAGAAATGGAGGTGGCAATAACAACAAACACACTAATAATGAAAAACTGGGCAGTTT
CMVマトリクスプロモーター(配列番号167)
ACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCCGC
EF1alphaマトリクスプロモーター、短縮版(配列番号168)
AGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCCGATGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTCCGCGGCCCCGAACTAGGCCTAGGCGTCTGATCACTAGTGACTCTAGTCCTAGTCGACTAGGGATAACAGGG
EF1alphaマトリクスプロモーター(配列番号169)
GTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
TRE3Gマトリクスプロモーター(配列番号170)
CTTTCGTCTTCAAGAATTCCTGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAA
マトリクスeZ-Rosa26-3'(配列番号171)：
AGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAGTTTTTTAATAGGGGCAAATAGGAAAATGGAGGATAGGAGTCATCTGGGGTTTATGCAGCAAAACTACAGGTATATTGCTTGTATCCGCCTCGGAGATTTCCATGAGGAGATAAAGACATGTCACCCGAGTTTATACTCTCCTGCTTAGATCCTACTACAGTATGAAATACAGTGTCGCGAGGTAGACTATGTAAGCAGATTTAATCATTTTAAAGAGCCCAGTACTTCATATCCATTTCTCCCGCTCCTTCTGCAGCCTTATCAAAAGGTATTTAGAACACTCATTTTAGCCCCATTTTCATTTATTATACTGGCTTATCCAACCCCTAGACAGAGCATTGGCATTTTCCCTTTCCTGATCTTAGAAGTCTGATGACTCATGAAACCAGACAGATTAGTTACATACACCACAAATCGAGGCTGTAGCTGGGGCCTCAACACTGCAGTTCTTTTATAACTCCTTAGTACACTTTTTGTTGATCCTTTGCCTTGATCCTTAATTTTCAGTGTCTATCACCTCTCCCGTCAGGTGGTGTTCCACATTTGGGCCTATTCTCAGTCCAGGGAGTTTTACAACAATAGATGTATTGAGAATCCAACCTAAAGCTTAACTTTCCACTCCCATGAATGCCTCTCTCCTTTTTCTCCATTATAACTGAGCTATAACCATTAATGGTTTCAGGTGGATGTCTCCTCCCCCAATATACCTGATGTATCTACATATTGCCAGGCTGATATTTTAAGACATAAAAGGTATATTTCATTATTGAGCCACATGGTATTGATTACTGCTACTAAAATTTTGTCATTGTACACATCTGTAAAAGGTGGTTCCTTTTGGAATGCAAAGTTCAGGTGTTTGTTGTCTTTCCTGACCTAAGGTCTTGTGAGCTTGTATTTTTTCTATTTAAGCAGTGCTTTCTCTTGGACTGGCTTGACTCATGGCATTCTACACGTTATTGCTGGTCTAAATGTGATTTTGCCAAGCTTCTTCAGGACCTATAATTTTGCTTGACTTGTAGCCAAACACAAGTAAAATGATTAAGCAACAAATGTATTTGTGAAGCTTGGTTTTTAGGTTGTTGTGTTGTGTGTGCTTGTGCTCTATAATAATACTATCCAGGGGCTGGAGAGGTGGCTCGGAGTTCAAGAGCACAGACTGCTCTTCCAGAAGTCCTGAGTTCAATTCCCAGCAACCACATGGTGGCTCACAACCATCTGTAATGGGATCTGATGCCCTCTTCTGGTGTGTCTGAAGACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAATCCTCCTTCTTCTTCTTTTTTTTTTTTTAAAGAGAATACTGTCTCCAGTAGAATTACTGAAGTAATGAAATACTTTGTGTTTGTTCCAATATGGAAGCCAATAATCAAATACTCTTAAGCACTGGAAATGTACCAAGGAACTATTTTATTTAAGTGAACTGTGGACAGAGGAGCCATAACTGCAGACTTGTGGGATACAGAAGACCAATGCAGACTTAATGTCTTTTCTCTTACACTAAGCAATAAAGAAATAAAAATTGAACTTCTAGTATCCTATTTGTTAAACTGCTAGCTTTACTAACTTTTGTGCTTCATCTATACAAAGCTGAAAGCTAAGTCTGCAGCCATTACTAAACATGAAAGCAAGTAATGATAATTTTGGATTTCAAAAATGTAGGGCCAGAGTTTAGCCAGCCAGTGGTGGTGCTTGCCTTTATGCCTTAATCCCAGCACTCTGGAGGCAGAGACAGGCAGATCTCTGAGTTTGAGCCCAGCCTGGTCTACACATCAAGTTCTATCTAGGATAGCCAGGAATACACACAGAAACCCTGTTGGGGAGGGGGGCTCTGAGATTTCATAAAATTATAATTGAAGCATTCCCTAATGAGCCACTATGGATGTGGCTAAATCCGTCTACCTTTCTGATGAGATTTGGGTATTATTTTTTCTGTCTCTGCTGTTGGTTGGGTCTTTTGACACTGTGGGCTTTCTTAAAGCCTCCTTCCCTGCCATGTGGACTCTTGTTTGCTACTAACTTCCCATGGCTTAAATGGCATGGCTTTTTGCCTTCTAAGGGCAGCTGCTGAGATTTGCAGCCTGATTTCCAGGGTGGGGTTGGGAAATCTTTCAAACACTAAAATTGTCCTTTAATTTTTTTTTAAAAAATGGGTTATATAATAAACCTCATAAAATAGTTATGAGGAGTGAGGTGGACTAATATTAATGAGTCCCTCCCCTATAAAAGAGCTATTAAGGCTTTTTGTCTTATACTAACTTTTTTTTTAAATGTGGTATCTTTAGAACCAAGGGTCTTAGAGTTTTAGTATACAGAAACTGTTGCATCGCTTAATCAGATTTTCTAGTTTCAAATCCAGAGAATCCAAATTCTTCACAGCCAAAGTCAAATTAAGAATTTCTGACTTTAATGTTATTTGCTACTGTGAATATAAAATGATAGCTTTTCCTGAGGCAGGGTATCACTATGTATCTCTGCCTGATCTGCAACAAGATATGTAGACTAAAGTTCTGCCTGCTTTTGTCTCCTGAATACTAAGGTTAAAATGTAGTAATACTTTTGGAACTTGCAGGTCAGATTCTTTTATAGGGGACACACTAAGGGAGCTTGGGTGATAGTTGGTAAATGTGTTTAAGTGATGAAAACTTGAATTATTATCACCGCAACCTACTTTTTAAAAAAAAAAGCCAGGCCTGTTAGAGCATGCTAAGGGATCCCTAGGACTTGCTGAGCACACAAGAGTAGTACTTGGCAGGCTCCTGGTGAGAGCATATTTCAAAAAACAAGGCAGACAACCAAGAAACTACAGTAAGGTTACCTGTCTTTAACCATCTGCATATACACAGGGATATTAAAATATTCCAAATAATATTTCATTCAAGTTTTCCCCCATCAAATTGGGACATGGATTTCTCCGGTGAATAGGCAGAGTTGGAAACTAAACAAATGTTGGTTTTGTGATTTGTGAAATTGTTTTCAAGTGATAGTTAAAGCCCATGAGATACAGAACAAAGCTGCTATTTCGAGGTCACTTGGTTATACTCAGAAGCACTTCTTTGGGTTTCCCTGCACTATCCTGATCATGTGCTAGGCCTACCTTAGGCTGATTGTTGTTCAAATAACTTAAGTTTCCTGTCAGGTGATGTCATATGATTTCATATATCAAGGCAAAACATGTTATATATGTTAAACATTTGGACTTAATGTGAAAGTTAGGTCTTTGTGGGTTTTGATTTTAATTTCAAAACCTGAGCTAAATAAGTCATTTTACATGTCTTACATTTGGTGAATTGTATATTGTGGTTTGCAGGCAAGACTCTCTGACCTAGTAACCCTCCTATAGAGCACTTTGCTGGGTCACAAGTCTAGGAGTCAAGCATTTCACCTTGAAGTTGAGACGTTTTGTTAGTGTATACTAGTTATATGTTGGAGGACATGTTTATCCAGAAGATATTCAGGACTATTTTTGACTGGGCTAAGGAATTGATTCTGATTAGCACTGTTAGTGAGCATTGAGTGGCCTTTAGGCTTGAATTGGAGTCACTTGTATATCTCAAATAATGCTGGCCTTTTTTAAAAAGCCCTTGTTCTTTATCACCCTGTTTTCTACATAATTTTTGTTCAAAGAAATACTTGTTTGGATCTCCTTTTGACAACAATAGCATGTTTTCAAGCCATATTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTTTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTATAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTTTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATCCGCCTGCCTCTGCCTCCTGAGTGCCGGGATTAAAGGCGTGCACCACCACGCCTGGCTAAGTTGGATATTTTGTATATAACTATAACCAATACTAACTCCACTGGGTGGATTTTTAATTCAGTCAGTAGTCTTAAGTGGTCTTTATTGGCCCTTATTAAAATCTACTGTTCACTCTAACAGAGGCTGTTGGACTAGTGGGACTAAGCAACTTCCTACGGATATACTAGCAGATAAGGGTCAGGGATAGAAACTAGTCTAGCGTTTTGTATACCTACCAGCTTATACTACCTTGTTCTGATAGAAATATTTAGGACATCTAGCTTATC
マトリクスeZ-Rosa26-5'(配列番号172)：
CCCCGCGGCAGGCCCTCCGAGCGTGGTGGAGCCGTTCTGTGAGACAGCCGGGTACGAGTCGTGACGCTGGAAGGGGCAAGCGGGTGGTGGGCAGGAATGCGGTCCGCCCTGCAGCAACCGGAGGGGGAGGGAGAAGGGAGCGGAAAAGTCTCCACCGGACGCGGCCATGGCTCGGGGGGGGGGGGGCAGCGGAGGAGCGCTTCCGGCCGACGTCTCGTCGCTGATTGGCTTCTTTTCCTCCCGCCGTGTGTGAAAACACAAATGGCGTGTTTTGGTTGGCGTAAGGCGCCTGTCAGTTAACGGCAGCCGGAGTGCGCAGCCGCCGGCAGCCTCGCTCTGCCCACTGGGTGGGGCGGGAGGTAGGTGGGGTGAGGCGAGCTGGACGTGCGGGCGCGGTCGGCCTCTGGCGGGGCGGGGGAGGGGAGGGAGGGTCAGCGAAAGTAGCTCGCGCGCGAGCGGCCGCCCACCCTCCCCTTCCTCTGGGGGAGTCGTTTTACCCGCCGCCGGCCGGGCCTCGTCGTCTGATTGGCTCTCGGGGCCCAGAAAACTGGCCCTTGCCATTGGCTCGTGTTCGTGCAAGTTGAGTCCATCCGCCGGCCAGCGGGGGCGGCGAGGAGGCGCTCCCAGGTTCCGGCCCTCCCCTCGGCCCCGCGCCGCAGAGTCTGGCCGCGCGCCCCTGCGCAACGTGGCAGGAAGCGCGCGCTGGGGGCGGGGACGGGCAGTAGGGCTGAGCGGCTGCGGGGCGGGTGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAGGGGCGTGCTGAGCCAGACCTCCATCGCGCACTCCGGGGAGTGGAGGGAAGGAGCGAGGGCTCAGTTGGGCTGTTTTGGAGGCAGGAAGCACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTTCTCCGGAGGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTGCCCCCTCTTCCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTT
マトリクスmB3Galt6 shRNA TR506016D(配列番号173)：
ACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTG
マトリクスeZ-SiaT-TGS-Hook(配列番号174)：
ATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGGGGTCGGGG
マトリクスTagBFP(配列番号175)：
ATGTCGGGGAGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGGACAACCATCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACTAGCTTCCTCTACGGCAGCAAGACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTCAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAGGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCACATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCTTCACCGAAACGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAAACGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGAGCCATCTGATCGCAAACATCAAGACCACATATAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCTGGCGTCTACTATGTGGACTACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCAACAACGAAACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCAGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAGCTTAATTCCGGATGA
マトリクス チミジンキナーゼcDNA(配列番号176)：
ATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCTGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCTCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCAGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGATACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACAAACATCGTGTTGGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTTGACCTGGCTATGCTGGCCGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTGCTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGGGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGATTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTCCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATCTGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACTGA
マトリクスTK term(配列番号177)：
GGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGGCCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCC
マトリクスTetON-3G cDNA(配列番号178)：
ATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAA

Claims (22)

  1. ａ)互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を、タイプIIs制限酵素である単一の制限酵素の存在下で同時に接触させる工程であって、各分子構成要素が線状二本鎖DNA分子であり、
    (ｉ)前記タイプIIs制限酵素の特異的認識部位を有さず、機能単位又は非機能単位である少なくとも１つの単位を含んでなる興味対象の配列、及び
    (ii)前記興味対象の配列の上流及び下流に隣接し、各々が、前記タイプIIs制限酵素の唯一の認識部位を含む少なくとも12ヌクレオチドの配列からなる２つの二本鎖DNAアダプター
    を含み、ここで、前記単位は機能的モジュール又は非機能的モジュールである少なくとも１つのモジュールを含んでなり、前記上流のアダプターのタイプIIs制限酵素認識部位及び前記下流のアダプターのタイプIIs制限酵素認識部位は相近しており、
    該工程が
    − 用いるタイプIIs制限酵素の認識部位の、切断による除去、
    − 前記興味対象の配列の末端の各々での、少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの形成、ここで、少なくとも２つの興味対象の配列の１つの上流の少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAが、別の興味対象の配列の下流の少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAと相補性であり、
    − 少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAの、ヌクレオチド相補性による対合、
    − 単一の規定された順序正しい方向で互いに隣接した興味対象の配列の配置、
    を導く工程、
    ｂ)環状二本鎖DNAベクターが得られるように、少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAのライゲーション工程
    を含んでなる、少なくとも２つの興味対象の配列を含んでなる環状二本鎖DNAベクターを作製する方法。
  2. ａ)ｎ個の分子構成要素を同時に接触させる工程であって、各分子構成要素が線状二本鎖DNA分子であり、
    (ｉ)前記タイプIIs制限酵素の特異的認識部位を有さず、機能単位又は非機能単位である少なくとも１つの単位を含んでなる興味対象の配列(SI)i、及び
    (ii)互いに異なり、それぞれ前記興味対象の配列(SI)iの上流及び下流に隣接し、各々が少なくとも12ヌクレオチドの配列からなる２つの二本鎖DNAアダプターA(i-1,i)及びA(i,i+1)
    を含み、ここで、
    前記単位は、機能的モジュール又は非機能的モジュールである少なくとも１つのモジュールを含んでなり、
    二本鎖DNAアダプターA(i-1,i)の少なくとも12ヌクレオチドの配列が
    - 前記タイプIIs制限酵素の唯一の認識部位及び
    - 前記タイプIIs制限酵素の認識部位の下流の少なくとも２ヌクレオチドの縫合DNA s(i-1, i)
    を含み、二本鎖DNAアダプターA(i+1,i)の少なくとも12ヌクレオチドの配列が
    - 前記タイプIIs制限酵素の唯一の認識部位、及び
    - 前記タイプIIs制限酵素の認識部位の上流の少なくとも２ヌクレオチドの縫合DNA s(i,i+1)
    を含み、
    前記上流の二本鎖DNAアダプターA(i-1,i)のタイプIIs制限酵素認識部位及び前記下流の二本鎖DNAアダプターA(i,i+1)のタイプIIs制限酵素認識部位は相近しており、
    (SI)1は、i=1である興味対象の配列(SI)iであり、
    (SI)nは、i=nである興味対象の配列(SI)iであり、
    ｎが２〜100の整数であり、ｉが１〜ｎの範囲であり、ｉはi=1のときにはｎとは異なり、i=nのときにはi+1は1であり、
    i=1のときには、i-1=nであり、結果として、(SI)1の上流で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA si-1が(SI)nの下流で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA sn+1の相補配列であり、
    i=nのときには、(SI)nの下流で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA sn+1が(SI)1の上流で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA si-1の相補配列であり、
    該工程が
    − 用いるタイプIIs制限酵素の認識部位の除去、
    − (SI)iの各々の上流末端及び下流末端の各々での、少なくとも２ヌクレオチドの一本鎖縫合DNAによる付着末端の形成、
    − (SI)iの下流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの、(SI)i+1の上流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAとのヌクレオチド相補性及び(SI)iの上流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの、(SI)i-1の下流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAとのヌクレオチド相補性による対合、
    − 単一の規定された順序正しい方向で互いに隣接した(SI)iの配置
    を導く工程、
    ｂ)環状二本鎖DNAベクターが得られるように、少なくとも２ヌクレオチドの前記付着性一本鎖縫合DNAのライゲーション工程
    を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を単一のタイプIIs制限酵素の存在下で同時に接触させる工程(ａ)が、20℃〜55℃の範囲の温度で２分間〜30分間行われ、
    ライゲーション工程(ｂ)が10℃〜40℃の範囲の温度で２分間〜30分間行われ、
    (ａ)及び(ｂ)は１〜49回繰り返すことができ、
    更に、
    (ｃ)41〜60℃の範囲にて0.5分間〜15分間の少なくとも１つのインキュベーション工程、及び、場合により、
    (ｄ)61〜90℃の範囲にて0.5分間〜15分間のインキュベーション工程
    を含んでなる請求項１又は２に記載の方法。
  4. 少なくとも２つの興味対象の配列の１つが少なくとも１つの非機能単位を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. タイプIIs制限酵素がBsaI、Eco31I、BbsI、Bpil、BsmBI、Esp3I、BspMI、BfuAI及びBveIから選択されるタイプIIs制限酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記興味対象の配列の下流又は上流の二本鎖DNAアダプターが、タイプIIp制限酵素の少なくとも１つの認識部位、有利には、NotI、PacI、PmeI、SwaI、SmiI、SgsI、SgrDI、SgrAI、SbfI、FseI、AscI、AsiSI、MreI、MssIのような稀な制限酵素の少なくとも１つの認識部位、より有利にはKpnI及びAgeI、EcoRI及びBstBI、SalI及びMluIから選択される制限酵素の２つの認識部位を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記興味対象の配列の上流及び下流の二本鎖DNAアダプターが、互いに異なる少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程において存在するタイプIIs制限酵素の認識部位以外のタイプIIs制限酵素の認識部位を有さない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 興味対象の配列の上流末端及び下流末端の各々における少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAが２〜10ヌクレオチド、好ましくは２〜５ヌクレオチド、より具体的には４ヌクレオチドを含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 或る分子構成要素から生じた少なくとも２ヌクレオチドの各付着性一本鎖縫合DNAが別の分子構成要素から生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAと対合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 興味対象の配列の下流末端及び上流末端の各々で生じた少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAが、DNAパリンドロームを生じるｚ×ｚ組合せを除く４zの可能な組合せの配列(ｚは一本鎖縫合DNAのヌクレオチド数であり、２〜10である)を含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 興味対象の配列の上流及び下流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAがスコアリングマトリクスの支援で設計される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記タイプIIs制限酵素が、前記タイプIIs酵素の特異的認識部位から２〜15ヌクレオチド、２〜14、２〜13、２〜12、２〜11、２〜10、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４又は２〜３ヌクレオチドの範囲の距離でDNAを切断する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 上流で生じる少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAの相補配列(ただし、配列(SI)nの下流の少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA(sn+1)に対して相補性である、(SI)1の上流で生じる少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNA(si-1)の相補配列を除く)が、下流で生じる少なくとも２ヌクレオチドの付着性一本鎖縫合DNAに対して相補性でない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  14. 少なくとも２つの分子構成要素を同時に接触させる工程の前に、該分子構成要素の各々を、化学合成により、又は、前記アダプターの配列に相当する配列及び興味対象の配列の少なくとも14ヌクレオチドを５'から３'へ含んでなるフォワードプライマーと、興味対象の配列の少なくとも14ヌクレオチド及び前記アダプターの配列に相当する少なくとも１つの配列を５'から３'へ含んでなるリバースプライマーとを用いて、構成要素に含まれる興味対象の配列のPCRによる増幅工程により調製する工程を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施することにより得られる環状二本鎖DNAベクター。
  16. マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、ｎ×U2a及びｍ×U2b
    (ここで、
    U1は細菌性機能単位を表し、
    U2aは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIに依存性であり発現産物がタンパク質である発現機能単位を表し、
    U2bは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIIに依存性であり発現産物が非コーディングRNAである発現機能単位を表し、
    ｎは０以上であり、
    ｍは、ｎ＋ｍ≧２という条件で、０以上であり、
    単位U1は、場合により、単位ｎ×U2aと隣接し、これらは、場合により、単位ｍ×U2bと隣接し、
    単位U1は、好ましくは、単位ｎ×U2aと隣接し、これらは、好ましくは、単位ｍ×U2bと隣接する)
    を含んでなる配列からなる、複数の導入遺伝子の同時発現を可能にする二本鎖DNAベクター。
  17. マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、ｎ×U2a、ｍ×U2b及びU3a
    (ここで、
    U1は細菌性機能単位を表し、
    U2aは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIに依存性であり発現産物がタンパク質である発現機能単位を表し、
    U2bは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIIに依存性であり発現産物が非コーディングRNAである発現機能単位を表し、
    ｎは０以上であり、
    ｍは、ｎ＋ｍ≧２という条件で、０以上であり、
    U3aはポジティブ選択カセットを表し、
    単位U1は、場合により、単位ｎ×U2aと隣接し、これらは、場合により、単位ｍ×U2bと隣接し、これらは、場合により、U3aと隣接し、
    単位U1は、好ましくは、単位ｎ×U2aと隣接し、これらは、好ましくは、単位ｍ×U2bと隣接し、これらは、好ましくは、U3aと隣接する)
    を含んでなる配列からなる、標的ゲノムへの非相同組換えによる導入遺伝子の組込みの選択を可能にする二本鎖DNAベクター。
  18. マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U3b、ｎ×U2a、ｍ×U2b、U3a及びU3c
    (ここで、
    U1は細菌性機能単位を表し、
    U3bは相同組換配列Ｘの５'側のモチーフを表し、
    U2aは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIに依存性であり発現産物がタンパク質である発現機能単位を表し、
    U2bは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIIに依存性であり発現産物が非コーディングRNAである発現機能単位を表し、
    ｎは０以上であり、
    ｍは、ｎ＋ｍ≧２という条件で、０以上であり、
    U3aはポジティブ選択カセットを表し、
    U3cは相同組換配列Ｘの３'側のモチーフを表し、
    単位U1は単位U3bと隣接し、これは単位ｎ×U2aと隣接し、これらは単位ｍ×U2bと隣接し、これらはU3aと隣接し、これは単位U3cと隣接する)
    を含んでなる配列からなる、標的ゲノムへの非相同組換えによる複数の導入遺伝子の同時組込みの選択を可能にする二本鎖DNAベクター。
  19. マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U3b、ｎ×U2a、ｍ×U2b、U3a、U3c及びU3d
    (ここで、
    U1は細菌性機能単位を表し、
    U3bは相同組換配列Ｘの５'側のモチーフを表し、
    U2aは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIに依存性であり発現産物がタンパク質である発現機能単位を表し、
    U2bは、プロモーターがRNAポリメラーゼIIIに依存性であり発現産物が非コーディングRNAである発現機能単位を表し、
    ｎは０以上であり、
    ｍは、ｎ＋ｍ≧２という条件で、０以上であり、
    U3aはポジティブ選択カセットを表し、
    U3cは相同組換配列Ｘの３'側のモチーフを表し、
    U3dはネガティブ選択カセットを表し、
    単位U1は単位U3bと隣接し、これは単位ｎ×U2aと隣接し、これらは単位ｍ×U2bと隣接し、これらはU3aと隣接し、これは単位U3cと隣接し、これは単位U3dと隣接する)
    を含んでなる配列からなる、非相同組換えによる１又は２以上の導入遺伝子が組み込まれている宿主細胞の消去を可能にする二本鎖DNAベクター。
  20. マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U2c、ｎ×U2d及びU2e
    (ここで、
    U1は細菌性機能単位を表し、
    U2cは転写トランスアクチベータをコードする遺伝子を表し、
    U2dは、そのプロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベータに依存性である遺伝子を表し、
    U2eは、そのプロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベータに非依存性である遺伝子を表し、
    ｎは１以上であり、
    ｍは０以上であり、
    単位U1は、場合により、単位U2cと隣接し、これは、場合により、単位n×U2dと隣接し、これらは、場合により、単位m×U2eと隣接し、
    単位U1は、好ましくは、単位U2cと隣接し、これは、好ましくは、単位n×U2dと隣接し、これらは、好ましくは、単位m×U2eと隣接する)
    を含んでなる配列からなる、誘導性様式での１又は２以上の導入遺伝子の発現を可能にする二本鎖DNAベクター。
  21. マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U2f、U2c及びU2g
    (ここで、
    U1は細菌性機能単位を表し、
    U2cは転写トランスアクチベータをコードする遺伝子を表し、
    U2fは、そのプロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーターであり、その発現産物が遺伝子Ｘを標的する小干渉RNAの短ヘアピンRNA(shRNA)である遺伝子を表し、
    U2gは、そのプロモーターが遺伝子U2cによりコードされるトランスアクチベータに依存性であり、その発現産物が遺伝子U2fの産物に非感受性であるように遺伝子Ｘの変異型産物である遺伝子を表し、
    単位U1は、場合により、単位U2fと隣接し、これは、場合により、単位U2cと隣接し、これは、場合により、単位U2gと隣接し、
    単位U1は、好ましくは、単位U2fと隣接し、これは、好ましくは、単位U2cと隣接し、これは、好ましくは、単位U2gと隣接する)
    を含んでなる配列からなる、誘導性制御下での遺伝子補完の実行を可能にする二本鎖DNAベクター。
  22. マルチクローニング部位を含まず、次の機能単位：U1、U3a、U3b及びU3c
    (ここで、
    U1は細菌性機能単位を表し、
    U3aはポジティブ選択カセットを表し、
    U3bは相同組換え配列Ｘの５'側モチーフを表し、
    U3cは相同組換え配列Ｘの３'側モチーフを表し、
    単位U1は単位U3bと隣接し、これらは単位U3aと隣接し、これは単位U3cと隣接する)
    を含んでなる配列からなる、そのゲノムが標的化相同組換えにより編集されている細胞の選択を可能にする二本鎖DNAベクター。
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