KR20210108360A - Nhej-매개 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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그레고리 제이. 코스트
진 아이. 우에니시
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크리스퍼 테라퓨틱스 아게
바이엘 헬쓰케어 엘엘씨
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Abstract

본 출원은 상동성-독립적 메커니즘에 의해 세포에서 게놈 편집을 위한, 특히 상동성-의존적 메카니즘에 의한 복구에 필요한 기구가 결여된 세포에서의 게놈 편집을 위한, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

NHEJ-매개 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 10월 30일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/752,959호에 우선권의 이익을 주장하며, 이는 모든 도면을 포함하여 그 전체가 본원에 명시적으로 참고로 포함된다.
서열 목록의 통합
첨부된 서열 목록의 자료는 이로써 본 출원에 참고로 포함된다. 첨부된 서열 목록 텍스트 파일인, 파일명 052984-528001WO_Sequence Listing.txt는 2019년 10월 28일에 작성되었으며, 24,932바이트이다.
기술분야
본 개시내용은 상동성-독립적 메커니즘에 의해 세포내 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 추가로, 다양한 질환 및 병태의 치료를 위해 이러한 조작된 세포를 사용하는 방법이 제공된다.
중증 결합 면역결핍은 림프 발달과 관련된 유전자, 예를 들어 IL2Rg, RAG1 및 IL7R, 또는 림프구 증식 및 대사와 관련된 유전자, 예를 들어 ADA 및 PNP의 돌연변이에 의해 가장 일반적으로 발생하는 희귀 유전 질환이다. 질환의 표현형은 T-세포 및/또는 B-세포가 부족하여 감염과 싸울 수 없다는 특징이 있다.
현재 SCID에 대한 가장 일반적인 치료법은 충분히 매치될만큼 가까운 것을 찾을 수 있는 사람들을 위한 골수 이식이다. 골수 이식을 받은 환자의 80%는 생존하는 동안 평생 면역억제를 해야 한다. 감마-레트로바이러스에 대한 유전자 치료가 시도되었지만, 높은 백혈병 발생으로 인해 노력이 중단되었다.
대다수의 SCID 환자는 이미 SCID에 대한 스크린의 일부인 특정 유전자좌에 돌연변이가 있다. 일단 확인되면, 환자의 골수에서 조혈 줄기 세포(HSC)를 수확하여 유전자 대체 또는 유전자 교정을 통해 SCID-유발 돌연변이 유전자(들)을 표적 게놈 편집할 수 있다. 그러나, HSC내 유전자 편집을 위한 현재 기술은 효과적인 치료 이점을 생성할 만큼 충분히 오래 지속되는 편집된 HSC를 생성할 수 없다. 따라서, HSC와 함께 사용하기 위한 개선된 유전자 편집 기술이 필요하다.
일 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 상동성-독립적 메커니즘에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포(HSC)의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, HSC는 장기 생착 HSC(LT-HSC) 또는 SCID-재증식 세포(repopulating cell)이다. 일부 실시형태에서, HSC는 하기 마커들: Lin(계통 음성)/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다.
또 다른 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 상동성-독립적 메커니즘에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, 휴지 T 세포의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 휴지 T 세포는 비-활성화 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; (b) 이중가닥 공여체 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 상동성-독립적 메커니즘에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계, 및 (c) 이중가닥 공여체 핵산을 표적 유전자좌로 통합하기에 충분한 시간 동안 HDR-결핍 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (a), (b) 및 (c)는 이중가닥 공여체 핵산에 대한 삽입 효율이 적어도 약 4%가 되도록 수행되는, HDR-결핍 세포의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산에 대한 삽입 효율은 적어도 약 8%이다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 게놈 변형 방법 중 임의의 것에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 세포로의 도입 후 제2 및/또는 제3 인식 서열에서 절단된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 게놈 변형을 위한 임의의 방법에 따르면, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형 방법에 따르면, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이며, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이고, 상기 방법은 프로토스페이서 서열 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 표적 유전자좌 및 공여체 핵산에서의 프로토스페이서를 표적화하는 스페이서를 포함하는 gRNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 순 배향이고, 이중가닥 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 이중가닥 공여체 핵산의 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 공여체 핵산의 프로토스페이서들은 동일하다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 공여체 핵산의 프로토스페이서들 중 적어도 하나는 gRNA 스페이서와 불완전하게 일치하는 지연-작용 프로토스페이서(DAP)이다. 일부 실시형태에서, DAP는 i) gRNA 스페이서보다 적어도 약 1개의 뉴클레오타이드 길이가 더 짧고/짧거나; ii) gRNA 스페이서와의 적어도 약 1개의 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산의 프로토스페이서는 DAP이고, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열 측면의 2개의 DAP를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산의 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 DAP이다.
일부 실시형태에서, RGEN을 사용하는 상기 기재된 임의의 게놈 변형 방법에 따르면, RGEN은 Cas9 뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, RGEN을 사용하는 상기 기재된 임의의 게놈 변형 방법에 따르면, 상기 방법은 RGEN 및 하나 이상의 gRNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP)을 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, RGEN을 사용하는 상기 기재된 임의의 게놈 변형 방법에 따르면, 상기 방법은 RGEN을 코딩하는 mRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, RGEN을 사용하는 상기 기재된 임의의 게놈 변형 방법에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈, 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형에 대한 방법에 따르면, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 1시간 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 5분 이내에 세포에 도입된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형에 대한 방법에 따르면, 세포는 저산소 조건 하에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형에 대한 방법에 따르면, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 48시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 24시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 2시간 이내에 배양된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형에 대한 방법에 따르면, 세포는 Notch 리간드의 존재 하에 배양된다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드는 델타-유사 Notch 리간드(DLL), Jagged-1, Jagged-2, 또는 이의 접합체이다. 일부 실시형태에서, 델타-유사 Notch 리간드는 DLL1, DLL3, 또는 DLL4이다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드는 Fc-DLL1, Fc-DLL3, Fc-DLL4, Fc-Jagged-1, 또는 Fc-Jagged-2이다.
또 다른 양태에서, (a) 편집된 HSC의 개체로부터 수득된 HSC의 입력 집단에 대해 상기 기재된 임의의 실시형태 중 어느 하나에 따른 게놈 변형 방법을 수행하여 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 집단을 포함하는 HSC의 산출 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 편집된 HSC의 집단을 상기 개체에게 투여하여 편집된 HSC가 개체에 생착되도록(예를 들어, 편집된 HSC가 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16주 이상 동안 개체 내에서 지속되도록) 하는 단계를 포함하는, 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 개체에서의 생착 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 개체에서 편집된 HSC의 생착 양은 상동성-의존적 메커니즘을 사용하여 제조된 상응하는 편집된 HSC의 생착 양과 동일하거나 이보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 개체로부터 수득된 HSC의 입력 집단은 LT-HSC 및 단기 생착 HSC(ST-HSC)를 포함하는 HSC의 혼합 집단을 포함하고, 생착된 편집된 HSC 집단은 편집된 LT-HSC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집된 HSC 집단을 개체에게 투여하는 단계는 HSC의 산출 집단을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 표적 유전자좌; (b) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 (c) 외인성 핵산 서열을 포함하는 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는 조작된 HSC가 제공되며, 상기 이중가닥 공여체 핵산은 상동성-독립적 메커니즘에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, HSC는 LT-HSC 또는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, HSC는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다.
또 다른 양태에서, 본원에는 상기 기재된 임의의 실시형태들에 따른 세포내 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법에 의해 제조된 조작된 HSC가 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 입력 HSC에 도입하는 단계로서, 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는, 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 입력 HSC에 도입하는 단계로서, 상기 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고, 상동성-독립적 메커니즘에 의해(예를 들어, NHEJ) 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, HSC는 LT-HSC 또는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, HSC는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다.
또 다른 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 표적 유전자좌; (b) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 (c) 외인성 핵산 서열을 포함하는 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는, 조작된 휴지 T 세포가 제공되며, 상기 이중가닥 공여체 핵산은 상동성-독립적 메커니즘에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 휴지 T 세포는 비-활성화 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 본원에는 상기 기재된 임의의 실시형태에 따른 세포내 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법에 의해 제조된, 조작된 휴지 T 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 입력 휴지 T 세포에 도입하는 단계로서, 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는, 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 입력 휴지 T 세포에 도입하는 단계로서, 상기 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고, 상동성-독립적 메커니즘에 의해(예를 들어, NHEJ) 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 휴지 T 세포는 비-활성화 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이며, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이고, 상기 조작된 세포는 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산에서 뉴클레아제에 대한 각각의 별개의 인식 서열에 특이적인 하나 이상의 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조작된 세포는 표적 유전자좌 및 공여체 핵산에서의 프로토스페이서를 표적화하는 스페이서를 포함하는 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 순 배향이고, 이중가닥 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 이중가닥 공여체 핵산의 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 공여체 핵산의 프로토스페이서들은 동일하다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 공여체 핵산의 프로토스페이서들 중 적어도 하나는 gRNA 스페이서와 불완전하게 일치하는 지연-작용 프로토스페이서(DAP)이다. 일부 실시형태에서, DAP는 i) gRNA 스페이서보다 적어도 약 1개의 뉴클레오타이드 길이가 더 짧고/짧거나; ii) gRNA 스페이서와의 적어도 약 1개의 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산의 프로토스페이서는 DAP이고, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열 측면의 2개의 DAP를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산의 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 DAP이다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 RGEN을 포함하는 임의의 조작된 세포들에 따르면, RGEN은 Cas9 뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 RGEN을 포함하는 임의의 조작된 세포들에 따르면, 상기 조작된 세포는 RGEN 및 하나 이상의 gRNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 RGEN을 포함하는 임의의 조작된 세포들에 따르면, 상기 조작된 세포는 RGEN을 코딩하는 mRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 조작된 세포들에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈, 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다.
또 다른 양태에서, 본원에는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 질환 또는 병태는 기능성 단백질의 결핍성 발현을 특징으로 하며, 상기 기재된 임의의 실시형태에 따른 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 조작된 세포에서 발현될 수 있는 단백질의 기능적 형태를 외인성 핵산이 코딩한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 SCID이고, 외인성 핵산은 림프 발달 또는 림프구 증식 및/또는 대사에 관여하는 개체에서 돌연변이된 유전자의 기능적 형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 핵산은 IL2Rg, RAG1, IL7R, ADA, 또는 PNP의 기능적 형태를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 고셔 병, 파브리 병, I-IX형 점액다당류증, 또는 부신백질이영양증이다.
도 1a는 Cas9/gRNA RNP의 존재 또는 부재 하에 표시된 농도의 pCR2.1-TOPO-psSCRAM-SA-P2A-H2Bj-Venus-BGHpA-psSCRAM(0-컷 벡터 플라스미드) 또는 pCR2.1-TOPO-psAAVS1-SA-P2A-H2Bj-Venus-BGHpA-psSCRAM(1-컷 벡터 플라스미드)로 처리된 K562 세포내 GFP 발현에 의해 결정된 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 14일(D14)의 유세포분석 결과를 보여주며, 여기서 pCR2.1-TOPO는 벡터 플라스미드 백본이며, psSCRAM은 PAM을 갖는 스크램블된 프로토스페이서 서열이고, psAAVS1은 동일한 프로토스페이서 서열이며, 게놈 DNA 서열로서 Cas9/gRNA RNP가 PAM으로 절단되고, SA는 스플라이스 수용체이고, P2A는 펩타이드 절단 신호 서열이며, H2Bj-Venus는 핵에서 GFP를 안정화시키는 히스톤 H2B에 융합된 변형된 GFP이고, BGHpA는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열이다.
도 1b는 7일(D7) 및 14일(D14)에 도 1a의 유세포분석 연구의 정량화를 보여준다.
도 2는 Cas9/gRNA RNP의 존재 또는 부재 하에 K562 세포내 표시된 농도의 0-컷 벡터 플라스미드 또는 1-컷 벡터 플라스미드의 표적화된 공여체 통합의 PCR 분석을 보여준다.
도 3a는 HDR, NHEJ 또는 HDR 및 NHEJ 둘 다에 의해 활성화된 T 세포에서 표적화된 통합에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도 3b는 도 3a의 유세포분석 연구의 정량화를 보여준다.
도 4는 각각 HDR 공여체, scAAV6 2-컷 NHEJ 공여체 또는 둘 다를 전달하는 AAV6를 이용하여 HDR, NHEJ 또는 HDR 및 NHEJ 둘 다에 의한 표적화된 통합을 갖는 활성화된 T 세포의 CD4/CD8 분포에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도 5a는 각각 HDR 공여체, scAAV6 2-컷 NHEJ 공여체 또는 둘 다를 전달하는 AAV6를 이용하여 HDR, NHEJ 또는 HDR 및 NHEJ 둘 다에 의한 비활성화 T 세포의 표적화된 통합에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도 5b는 도 5a의 유세포분석 연구의 정량화를 보여준다.
도 5c는 NHEJ에 의한 표적화된 통합을 갖는 비활성화 T 세포의 CD4/CD8 분포에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도 6은 프로토콜 1 또는 프로토콜 2를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도 7a는 프로토콜 1 또는 프로토콜 2를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 7b는 scAAV6 2-컷 공여체를 갖는 2개의 상이한 공여체로부터의 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 8a는 프로토콜 1 또는 프로토콜 2를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 절대 세포충실도를 보여준다.
도 8b는 scAAV6 2-컷 공여체를 갖는 2개의 상이한 공여체로부터의 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 절대 세포충실도를 보여준다.
도 9a는 D1 상에서 편집될 때 프로토콜 1 또는 프로토콜 2를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 2일(D2), 3일(D3), 4일(D4) 및 5일(D5)의 유세포분석 결과를 보여준다.
도 9b는 D1 상에서 편집될 때 프로토콜 1 또는 프로토콜 2를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4, 및 D5의 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 9c는 D1 상에서 편집될 때 프로토콜 1 또는 프로토콜 2를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4, 및 D5의 절대 세포충실도를 보여준다.
도 9d는 D1 상에서 편집될 때 프로토콜 1 또는 프로토콜 2를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4, 및 D5의 상대 세포충실도를 보여준다.
도 10a는 SFEM II 배지에서 D1 상에서 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4, 및 D5의 유세포분석 결과를 보여준다.
도 10b는 SCGM 배지 상에서 편집될 때 D1에 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4, 및 D5의 유세포분석 결과를 보여준다.
도 11a는 저산소 또는 정상산소 조건 하에서 scAAV6 2-컷 공여체로 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4 및 D5의 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 11b는 저산소 또는 정상산소 조건 하에서 scAAV6 2-컷 공여체로 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4 및 D5의 절대 세포충실도를 보여준다.
도 11c는 저산소 또는 정상산소 조건 하에서 scAAV6 2-컷 공여체로 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4 및 D5의 상대 세포충실도를 보여준다.
도 11d는 저산소 또는 정상산소 조건 하에서 scAAV6 2-컷 공여체로 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4 및 D5의 GFP+ 및 eGFP- 집단에서 CD34+:CD34- 세포의 비율을 보여준다.
도 12a는 scAAV6 2-컷 공여체로 D1 또는 D2에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4 및 D5의 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 12b는 scAAV6 2-컷 공여체로 D1 또는 D2에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4 및 D5의 절대 세포충실도를 보여준다.
도 12c는 scAAV6 2-컷 공여체로 D1 또는 D2에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3, D4 및 D5의 상대 세포충실도를 보여준다.
도 13은 scAAV6 2-컷 공여체로 H1(1시간) 또는 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2, D3 및 D4의 유세포분석 결과의 정량화 및 상대 세포충실도를 보여준다.
도 14a는 RNP Lonza 4-D 뉴클레오펙션(nucleofection) 프로토콜 DZ-100 또는 RNP Lonza 4-D 뉴클레오펙션 프로토콜 CA-137을 사용하여 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2의 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 14b는 RNP Lonza 4-D 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100 또는 RNP Lonza 4-D 뉴클레오펙션 프로토콜 CA-137을 사용하여 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2의 절대 세포충실도를 보여준다.
도 14c는 RNP Lonza 4-D 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100 또는 RNP Lonza 4-D 뉴클레오펙션 프로토콜 CA-137을 사용하여 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2의 상대 세포충실도를 보여준다.
도 15는 SpyFi Cas9 또는 GeneArt Cas9를 사용하여 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 유세포분석 결과의 정량화, 절대 세포충실도 및 상대 세포충실도를 보여준다.
도 16은 낮은 (+) 또는 높은 (+++) 양의 RNP 및 낮은 (+) 또는 높은 (+++) 양의 AAV를 사용하여 D1에 편집될 때 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 유세포분석 결과의 정량화, 절대 세포충실도 및 상대 세포충실도를 보여준다.
도 17은 Cas9/gRNA RNP의 존재 또는 부재 하에 CD34+ 세포에서 5000 vp/세포로 Ad5/35에 의해 전달된 2-컷 공여체의 표적화된 공여체 통합의 PCR 분석을 보여준다.
도 18a는 Tenascin C(TenC), Fc-DLL1(DLL1), 또는 Tenascin C + Fc-DLL1 코팅에서 배양되거나, 코팅없이 배양된 scAAV6 0-컷 공여체를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D2의 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 18b는 Tenascin C(TenC), Fc-DLL1(DLL1), 또는 Tenascin C + Fc-DLL1 코팅에서 배양되거나, 코팅없이 배양된 scAAV6 0-컷 공여체를 사용하여 인간 CD34+ 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합에 대한 D1, D2, 및 D3의 CD34+/CD90+/CD38-/CD45RA- 세포의 절대 세포충실도를 보여준다.
도 19는 scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주사된 마우스의 말초 혈액으로부터 0, 6, 9, 13 및 16주에 hCD45+ 세포(상단 패널) 및 GFP+ 세포(하단 패널)에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 20a는 scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주사된 마우스의 골수로부터 16주에 hCD45+ 세포(상단 패널) 및 GFP+ 세포(하단 패널)에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 20b는 scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D1에 주사 후 16주에 마우스의 골수로부터의 총 CD45+ 세포의 백분율로서 hCD34+, hCD3+, hCD33+, hCD19+, 및 다른 hCD45+ 세포의 상대적인 양을 보여준다.
도 21은 scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1(신선 해동)의 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포의 D2에 GFP+/CD34+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 22a는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 8주에 hCD45+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 22b는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D1에 주입 후, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입 후, 8주에 마우스의 말초 혈액으로부터의 총 CD45+ 세포의 백분율로서 hCD3+, hCD33+, hCD19+, 및 다른 hCD45+ 세포의 상대적인 양을 보여준다.
도 22c는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 8주에 hCD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 22d는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 8주에 총 CD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 23a는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 10주에 hCD45+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 23b는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D1에 주입 후, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입 후, 10주에 마우스의 말초 혈액으로부터의 총 CD45+ 세포의 백분율로서 hCD3+, hCD33+, hCD19+, 및 다른 hCD45+ 세포의 상대적인 양을 보여준다.
도 23c는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 10주에 hCD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 23d는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 10주에 총 CD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 24a는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 12주에 hCD45+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 24b는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D1에 주입 후, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입 후, 12주에 마우스의 말초 혈액으로부터의 총 CD45+ 세포의 백분율로서 hCD3+, hCD33+, hCD19+, 및 다른 hCD45+ 세포의 상대적인 양을 보여준다.
도 24c는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 12주에 hCD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 24d는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 12주에 총 CD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 25a는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 14주에 hCD45+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 25b는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D1에 주입 후, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입 후, 14주에 마우스의 말초 혈액으로부터의 총 CD45+ 세포의 백분율로서 hCD3+, hCD33+, hCD19+, 및 다른 hCD45+ 세포의 상대적인 양을 보여준다.
도 25c는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 14주에 hCD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 25d는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 14주에 총 CD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 26a는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 16주에 hCD45+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 26b는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D1에 주입 후, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입 후, 16주에 마우스의 말초 혈액으로부터의 총 CD45+ 세포의 백분율로서 hCD3+, hCD33+, hCD19+, 및 다른 hCD45+ 세포의 상대적인 양을 보여준다.
도 26c는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 16주에 hCD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 26d는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 16주에 총 CD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 27a는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 골수로부터 16주에 hCD45+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 27b는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D1에 주입 후, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입 후, 16주에 마우스의 골수로부터의 총 CD45+ 세포의 백분율로서 hCD3+, hCD33+, hCD19+, 및 다른 hCD45+ 세포의 상대적인 양을 보여준다.
도 28a는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 골수로부터 16주에 CD34+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 28b는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 골수로부터 16주에 hCD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 28c는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 골수로부터 16주에 총 CD45+ 세포의 백분율로서 GFP+ 세포에 대한 유세포분석 결과의 정량화를 보여준다.
도 29a는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터 hCD45+ 혈액 세포의 시간 경과를 보여준다.
도 29b는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터의 hCD45+ 혈액 세포의 백분율로서 GFP+ 세포의 시간 경과를 보여준다.
도 29c는 i) scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 D2에 주입된, 또는 ii) scAAV6 2-컷(신선 해동)의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 H1에 편집된 인간 CD34+ 세포와 함께 H2에 주입된, 마우스의 말초 혈액으로부터의 총 CD45+ 혈액 세포의 백분율로서 GFP+ 세포의 시간 경과를 보여준다.
출원인들은 상동성 직접 복구(HDR)를 제대로 수행하지 않는 세포의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 시스템 및 방법을 발견하였다. 특히, 출원인들은 장기 생착 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 휴지(휴식) T 세포를 포함하는 기타 휴지 세포에서 개선된 편집, 뿐만 아니라 조작된 세포를 제조하고 사용하는 방법, 및 그러한 방법에 유용한 조성물을 입증하였다.
이전의 데이터는 HDR을 겪은 HSC가 장기 생착 잠재력을 상실하여, 교정된 HSC가 질환의 영구적인 치료적 교정을 할 수 없게 만드는 것임을 보여주었다. 반대로, 장기 생착 잠재력을 보유하는 HSC는 분할되지 않으므로 HDR을 효율적으로 겪지 않는다. 대조적으로, 비상동 말단-연결(NHEJ)은 LT-HSC와 같은 휴지 세포를 포함한, 모든 세포 유형에서 작동하는 DNA 이중가닥 파단(DSB) 복구 메커니즘이다. 출원인들은 이 경로를 조작하여 휴지 LT-HSC 및 휴지 T 세포에서 이식유전자의 표적화된 통합을 매개하여, 편집된 세포의 장기 생착 및 이식유전자의 지속적인 발현을 허용할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 인간 CD34+ 세포는 생체 내 공여체 절단을 위해 CRISPR/Cas9 인식 부위와 NHEJ-매개 통합을 위한 이중가닥 공여체 주형을 사용하는 내인성 PPP1R12C 유전자좌에 GFP 발현 카세트의 표적화된 통합을 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 편집되었다. 편집된 세포가 주입된 마우스에서, 말초 출혈로부터의 hCD45+ 세포의 일부로서 GFP+ 세포의 양은 주입 후 16주까지 일정하게 유지되었으며, 이는 CRISPR/Cas9 시스템이 LT-HSC를 편집할 수 있고 편집된 LT-HSC가 치료 용도에 유용하기에 충분한 시간 동안 생착 및 지속될 수 있었음을 입증한다. 이 플랫폼 기술을 사용하면, LT-HSC에서 생착 잠재력의 손실없이 표적화된 유전자 교정 또는 이종 핵산의 삽입을 수행할 수 있으므로, 치료 용도에서 이러한 편집된 HSC를 사용할 수 있게 된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 참조된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 공보들은 달리 언급되지 않는 한, 그의 전체가 참고로 명시적으로 포함된다. 본원에서 용어에 대한 정의가 여러 개 있는 경우, 달리 언급하지 않는 한 본 섹션의 정의가 우선한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나"는 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
"약"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어 측정 가능한 값을 언급할 때 사용될 수 있으며, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 더욱 바람직하게는 ±l%, 및 더욱 더 바람직하게는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "단백질 서열"은 단백질의 1차 구조인 아미노산의 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "상류"는 폴리뉴클레오타이드 상의 위치의 위치 5' 및 폴리펩타이드상의 위치의 N-말단을 향하는 위치를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "하류"는 뉴클레오타이드 상의 위치의 위치 3' 및 폴리펩타이드상의 위치의 C-말단을 향한 위치를 지칭한다. 따라서, 용어 "N-말단"은 폴리펩타이드상의 위치의 N-말단을 향한, 요소의 위치 또는 폴리뉴클레오타이드 상의 위치를 지칭한다.
"핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오타이드, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 생성된 단편들, 및 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성된 단편들을 지칭한다. 핵산 분자는 자연-발생 뉴클레오타이드(예컨대 DNA 및 RNA)인 단량체들, 또는 자연-발생 뉴클레오타이드의 유사체들(예를 들어, 자연-발생 뉴클레오타이드의 거울상 이성질체 형태), 또는 둘의 조합으로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 당 모이어티 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어, 하나 이상의 하이드록실 기를 할로겐, 알킬 기, 아민 및 아지도 기로 대체하는 것을 포함하거나, 당이 에테르 또는 에스테르로 작용화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 모이어티는 아자-당 및 카르보사이클릭 당 유사체와 같은 입체적이고 전자적으로 유사한 구조로 대체될 수 있다. 염기 모이어티의 변형의 예는 알킬화 퓨린 및 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 잘 알려진 헤테로사이클릭 치환체를 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 상기 결합들의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한, 폴리아미드 백본에 부착된 자연-발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함하는, 소위 "펩타이드 핵산"을 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 RNA 또는 DNA이다.
"~에 대한 코딩" 또는 "코딩"은 본원에 사용되며, 아미노산의 정의된 서열과 같은 다른 거대 분자의 합성을 위한 주형 역할을 하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA에서 뉴클레오타이드의 특정 서열의 특성을 지칭한다. 따라서, 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하면, 유전자가 단백질을 코딩한다.
"폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열"은 서로 축퇴된 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산이 제공되며, 여기서 핵산은 융합 단백질을 코딩한다.
"벡터", "발현 벡터", "공여체" 또는 "작제물"은 세포에서 이종성 핵산의 발현을 제공하기 위해 조절 요소를 갖는 세포로 이종성 핵산을 도입하는 데 사용되는 핵산이다. 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모 및 바이러스 게놈을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모 또는 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 박테리아 시스템에서 단백질 발현을 위한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현" 또는 "단백질 발현"은 전사된 RNA 분자를 단백질 분자로 번역하는 것을 지칭한다. 단백질 발현은 시간적, 공간적, 발달적 또는 형태학적 특성뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 표시에 의해 특성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 또는 단백질들은 리간드의 존재 하에 단백질이 이량체화를 위해 위치하도록 발현된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자, 예를 들어 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치는 능력을 갖는 DNA 분자를 지칭한다. 프로모터, 리더, 인트론 및 전사 종결 영역과 같은 조절 요소는 유전자 조절 활성을 가지며 살아있는 세포에서 유전자의 전체 발현에 필수적인 역할을 하는 DNA 분자이다. 따라서, 식물에서 기능하는 프로모터와 같은 분리된 조절 요소는 유전 공학 방법을 통해 식물 표현형을 변형하는 데 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제2 분자에 결합된 제1 분자를 지칭하며, 여기서 분자는 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 2개의 분자들은 단일 연속 분자의 일부일 수 있으며, 인접할 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 세포에서 관심있는 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 조절하는 경우, 프로모터는 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다.
"프로모터"는 특정 유전자의 전사를 개시하는 DNA 영역이다. 프로모터는 유전자의 전사 시작 부위 근처, 동일한 가닥 및 DNA의 상류(센스 가닥의 5' 영역)에 위치할 수 있다. 프로모터는 조건부, 유도성 또는 구성적 프로모터일 수 있다. 프로모터는 박테리아, 포유류 또는 곤충 세포 단백질 발현에 특이적일 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 제공되는 일부 실시형태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 박테리아, 포유류 또는 곤충 세포 단백질 발현에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 조건부, 유도성 또는 구성적 프로모터이다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. "동물"은 냉혈 및 온혈 척추 동물과 무척추 동물, 예컨대 어류, 조개류, 파충류, 및 특히 포유류를 포함한다. "포유류"는 제한없이 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지 및 유인원, 및 특히 인간을 포함한다. 일부 대안에서, 대상체는 인간이다.
NHEJ-매개 게놈 편집을 위한 시스템
일 양태에서, 본원에는 외인성 핵산의 표적화된 통합을 포함하는 조작된 세포(예를 들어, LT-HSC와 같은 조작된 조혈 줄기 세포)를 생성하기 위한 시스템이 제공되며, 여기서 외인성 핵산은 비-상동 말단 접합(NHEJ)에 의해 표적 유전자좌에 삽입된다. 시스템은 a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 b) 이중가닥 공여체 핵산을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 표적 유전자좌에서 게놈 편집을 매개할 수 있고, 여기서 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 시스템은 편집될 세포를 추가로 포함한다. 또한, 특히 생체 외 게놈 편집을 사용하여 기능적 표적 단백질 결핍과 관련된 장애 또는 건강 상태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위한 시스템이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상체는 표적 세포에서 표적 단백질의 기능적 결손(예를 들어, 표적 단백질의 결핍된 발현 및/또는 활성)으로 인한 질환을 가지며, 시스템은 표적 세포 또는 그의 후대에서 게놈 편집을 매개하여, 질환이 치료되도록 대상체에서 게놈-편집된 세포 또는 그의 후대에서 표적 단백질 또는 그의 기능적 유도체의 충분한 발현을 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 세포 또는 이의 전구세포는 생체 외에서 편집되고 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 시스템에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열은 외인성 핵산 서열의 제1 말단에 바로 인접하거나, 약 5개 이상(예컨대 약 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000개 이상)의 염기가 외인성 핵산 서열의 제1 말단에서 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 뉴클레아제에 대한 제3 인식 서열은 외인성 핵산 서열의 제2 말단에 바로 인접하거나, 약 5개 이상(예컨대 약 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000개 이상)의 염기가 외인성 핵산 서열의 제2 말단에서 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 시스템에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 RNA 게놈의 dsDNA 중간체), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 게놈은 인테그라제-결핍 렌티바이러스 게놈이다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 시스템에 따르면, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 시스템은 표적 유전자좌에서 제1 인식 서열을 절단하도록 RGEN을 유도할 수 있는 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RGEN이 공여체 핵산에서 하나 이상의 인식 서열을 절단하도록 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템은 RGEN을 포함하는 리보핵산(RNP) 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다.
일부 실시형태에서, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 시스템에 따르면, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산에서 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이다. 일부 실시형태에서, 시스템은 프로토스페이서 서열 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 각각의 프로토스페이서는 동일하고, 시스템은 프로토스페이서 서열을 표적화하는 하나의 gRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서 본원에 기재된 시스템은 i) 제1 프로토스페이서를 포함하는 제1 핵산 및 ii) 스페이서를 포함하는 gRNA를 포함하며, 여기서 제1 프로토스페이서는 스페이서와 불완전한 매칭이고, 여기서 제1 프로토스페이서가 스페이서와 매칭하는 정도는 제1 프로토스페이서에서 제1 핵산의 변형을 허용하기에 충분하다. 상응하는 gRNA와 관련된 이러한 프로토스페이서는 본원에서 "지연된-작용 프로토스페이서" 또는 "DAP"로도 지칭된다. 이러한 시스템은 DAP와 스페이서 사이의 매칭 정도를 변화시킴으로써 제1 프로토스페이서에서 제1 핵산의 RGEN-매개 절단의 시간적 제어를 허용한다. 일부 실시형태에서, DAP는 스페이서보다 길이가 적어도 약 1개(예컨대 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드만큼 더 짧다. 일부 실시형태에서, DAP는 스페이서와 적어도 약 1개(예컨대, 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 예를 들어, gRNA는 서열 번호 8의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 스페이서를 포함할 수 있고, 제1 프로토스페이서는 서열 번호 16~28 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 프로토스페이서를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템은 제2 프로토스페이서를 포함하는 제2 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로토스페이서는 스페이서와 완전히 일치한다. 예를 들어, gRNA는 서열 번호 8의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 스페이서를 포함할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 서열 번호 9의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 프로토스페이서를 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 gRNA 스페이서와 불완전하게 일치하는 제1 프로토스페이서에서 제1 핵산에 대한 절단의 시작과 비교 시 gRNA 스페이서와 완전히 일치하는 제2 프로토스페이서에서 제2 핵산에 대한 절단을 더 빠르게 시작하면서, 단일 gRNA를 사용하여 각각의 프로토스페이서에서 제1 및 제2 핵산의 RGEN-매개된 절단의 다른 시간적 프로파일을 허용한다.
표적 부위 절단의 시간적 제어를 용이하게 하기 위해, 표적 핵산 또는 공여체 주형과 같은, 핵산에서 DAP의 존재는 몇 가지 이점을 갖는다. 우선, 이러한 핵산에 DAP가 존재하면 서로 다른 시간에 투여되는 각 유전자좌에 대해 다중 gRNA를 사용할 필요없이 다중 유전자좌에서 표적 부위 절단을 시간적으로 제어할 수 있다. 이를 통해 게놈 편집 시스템을 비교적 적은 공간에 패키징할 수 있으며, 더 적은 gRNA를 사용하면 오프-타겟 효과의 가능성이 줄어든다. 본 개시내용의 실시형태의 추가 이점은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 시스템에 따르면, 시스템은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 표적 유전자좌에서 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 시스템은 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 상동성 직접 복구(HDR)에 필요한 기구가 부족하다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 예컨대 장기 생착 조혈 줄기 세포(LT-HSC)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다. 일부 실시형태에서, 세포는 휴지 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 시스템에 따르면, 시스템은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 표적 유전자좌에서 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 시스템은 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 시스템에 따르면, 시스템은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 표적 유전자좌에서 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 여기서 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 시스템은 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 추가로 포함한다.
NHEJ-매개 게놈 편집 방법
일 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, 세포내 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 세포내 임의의 게놈 변형 방법에 따르면, 세포는 상동성 직접 복구(HDR)에 필요한 기구가 부족하다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 예컨대 장기 생착 조혈 줄기 세포(LT-HSC)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다. 일부 실시형태에서, 세포는 휴지 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 사용하는 본원에 기재된 임의의 방법에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 세포로의 도입 후 제2 및/또는 제3 인식 서열에서 절단된다. 일부 실시형태에서, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 사용하는 본원에 기재된 임의의 방법에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 RNA 게놈의 dsDNA 중간체), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 게놈은 인테그라제-결핍 렌티바이러스 게놈이다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 사용하는 본원에 기재된 임의의 방법에 따르면, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 방법은 표적 유전자좌에서 제1 인식 서열을 절단하도록 RGEN을 유도할 수 있는 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RGEN이 공여체 핵산에서 하나 이상의 인식 서열을 절단하도록 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 리보핵산(RNP)을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다.
일부 실시형태에서, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 방법에 따르면, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산에서 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 프로토스페이서 서열 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 각각의 프로토스페이서는 동일하고, 방법은 프로토스페이서 서열을 표적화하는 하나의 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, DAP는 gRNA 스페이서보다 길이가 적어도 약 1개(예컨대 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드만큼 더 짧다. 일부 실시형태에서, DAP는 gRNA 스페이서와 적어도 약 1개(예컨대, 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 세포는 상동성 직접 복구(HDR)에 필요한 기구가 부족하다. 일부 실시형태에서, 세포는 HSC, 예컨대 LT-HSC이다. 일부 실시형태에서, 세포는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다. 일부 실시형태에서, 세포는 휴지 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형의 방법에 따르면, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 1시간 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 5분 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계는 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 게놈 변형 방법에 따르면, 방법은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전에 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNP는 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 1시간 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, RNP는 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 5분 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형의 방법에 따르면, 세포는 저산소 조건 하에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형의 방법에 따르면, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 48시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 24시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 2시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계는 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 임의의 게놈 변형의 방법에 따르면, 세포는 Notch 리간드의 존재 하에 배양된다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드는 델타-유사 Notch 리간드(DLL), Jagged-1, Jagged-2, 또는 이의 접합체이다. 일부 실시형태에서, 델타-유사 Notch 리간드는 DLL1, DLL3, 또는 DLL4이다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드는 Fc-DLL1, Fc-DLL3, Fc-DLL4, Fc-Jagged-1, 또는 Fc-Jagged-2이다.
일 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, HSC의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, HSC는 장기 생착 HSC(LT-HSC) 또는 SCID-재증식 세포(repopulating cell)이다. 일부 실시형태에서, HSC는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함하는, HSC 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 HSC 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함하는, HSC 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 HSC 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함하는, HSC 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 HSC 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, 휴지 T 세포의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 휴지 T 세포는 비-활성화 T 세포이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 휴지 T 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 휴지 T 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 휴지 T 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 휴지 T 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 휴지 T 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 휴지 T 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 휴지 T 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일 양태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; (b) 이중가닥 공여체 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, HDR-결핍 세포의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 이중가닥 공여체 핵산을 표적 유전자좌로 통합하기에 충분한 시간 동안 HDR-결핍 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 단계들은 이중가닥 공여체 핵산에 대한 삽입 효율이 적어도 약 4%(예컨대 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상 중 임의의 것)이 되도록 수행된다. 일부 실시형태에서, HDR-결핍 세포는 분열하지 않고 복제하지 않고, 따라서 HDR에 대한 기구를 발현하지 않는 임의의 세포 유형이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계를 포함하는, HDR-결핍 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 HDR-결핍 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계를 포함하는, HDR-결핍 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 HDR-결핍 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계를 포함하는, HDR-결핍 세포 내 표적 유전자좌 내로 외인성 핵산을 통합하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 HDR-결핍 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
조작된 세포
일부 양태에서, 표적 염색체 유전자좌에 통합된 외인성 핵산 서열을 포함하는, 조작된 세포, 예컨대 조작된 포유동물 세포(예를 들어, HSC, T 세포)가 본원에 제공되며, 여기서 외인성 핵산 서열은 NHEJ에 의해 표적 유전자좌에 통합되었다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 본원에 기재된 임의의 게놈 편집 방법에 의해 생산된다. 용어 "조작된 세포"는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 후대 또는 잠재적 후대를 지칭한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 그러한 후대는 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에는 (a) 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 표적 유전자좌; (b) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 (c) 외인성 핵산 서열을 포함하는 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는, 조작된 세포(예를 들어, HSC, 예컨대 LT-HSC, 또는 T 세포, 예컨대 휴지 T 세포)가 제공되며, 상기 이중가닥 공여체 핵산은 상동성-독립적 메커니즘(예를 들어, NHEJ)에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 본원에는 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 세포 내 표적 유전자좌에서 게놈 변형을 위한 방법에 의해 제조된 조작된 세포(예를 들어, HSC, 예컨대 LT-HSC, 또는 T 세포, 예컨대 휴지 T 세포)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 입력 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 입력 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 상동성-독립적 메커니즘(예를 들어, NHEJ)에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 조작된 세포들에 따르면, 세포는 상동성 직접 복구(HDR)에 필요한 기구가 부족하다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 예컨대 장기 생착 조혈 줄기 세포(LT-HSC)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다. 일부 실시형태에서, 세포는 휴지 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 RNA 게놈의 dsDNA 중간체), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 게놈은 인테그라제-결핍 렌티바이러스 게놈이다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 표적 유전자좌에서 제1 인식 서열을 절단하도록 RGEN을 유도할 수 있는 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RGEN이 공여체 핵산에서 하나 이상의 인식 서열을 절단하도록 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 RGEN을 포함하는 리보핵산(RNP) 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다.
일부 실시형태에서, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산에서 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 프로토스페이서 서열 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 각각의 프로토스페이서는 동일하고, 조작된 세포는 프로토스페이서 서열을 표적화하는 하나의 gRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서 본원에 기재된 조작된 세포는 i) 제1 프로토스페이서를 포함하는 제1 핵산 및 ii) 스페이서를 포함하는 gRNA를 포함하고, 여기서 제1 프로토스페이서는 스페이서와 불완전한 일치를 갖는 DAP이고, 여기서 제1 프로토스페이서가 스페이서와 일치하는 정도는 제1 프로토스페이서에서 제1 핵산의 변형을 허용하기에 충분하다. 일부 실시형태에서, DAP는 스페이서보다 길이가 적어도 약 1개(예컨대 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드만큼 더 짧다. 일부 실시형태에서, DAP는 스페이서와 적어도 약 1개(예컨대, 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 제2 프로토스페이서를 포함하는 제2 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로토스페이서는 스페이서와 완전히 일치한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 조작된 세포는 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 조작된 세포에서 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 상동성 직접 복구(HDR)에 필요한 기구가 부족하다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 HSC, 예컨대 LT-HSC이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 휴지 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 조작된 세포는 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 조작된 세포에서 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 여기서 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 여기서 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 조작된 세포에 따르면, 조작된 세포는 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 조작된 세포에서 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 여기서 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 여기서 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 LT-HSC 및 단기 생착 HSC(ST-HSC) 둘 다를 포함하는 HSC, 예컨대 CD34+이지만 CD90+/-, CD38+/- 및/또는 CD45RA+/-인 HSC이다.
HSC는 공지된 기술에 따라 수집될 수 있고, 유세포분석 및/또는 면역자기 선택과 같은, 항체에 대한 친화도 결합과 같은 공지된 기술에 의해 농축되거나 고갈될 수 있다. 일부 실시형태에서, HSC는 환자로부터 얻은 자가 HSC이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 T 세포, 또는 T 세포로 분화할 수 있는 전구체 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 CD3+, CD8+, 및/또는 CD4+ T 림프구이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이며, 이는 미성숙 CD8+ T 세포, 중앙 기억 CD8+ T 세포, 효과기 기억 CD8+ T 세포 또는 벌크 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다.
림프구(T 림프구)는 공지된 기술에 따라 수집될 수 있고, 유세포분석 및/또는 면역자기 선택과 같은, 항체에 대한 친화도 결합과 같은 공지된 기술에 의해 농축되거나 고갈될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 환자로부터 얻은 자가 T 세포이다.
본 개시내용은 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 세포를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
조작된 세포 생착 방법
일부 실시형태에서, 본원에는 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 편집된 HSC 집단을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 생착시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 편집된 HSC는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16주 이상 동안 개체 내에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 편집된 HSC의 집단은 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 제조된다. 일부 실시형태에서, 개체에서 편집된 HSC의 생착 양은 상동성-의존적 메커니즘을 사용하여 제조된 상응하는 편집된 HSC의 생착 양과 동일하거나 이보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 편집된 HSC의 집단은 개체로부터 수득된 HSC의 입력 집단으로부터 유래된 HSC의 산출 집단에 포함된다. 일부 실시형태에서, 개체로부터 수득된 HSC의 입력 집단은 LT-HSC 및 ST-HSC를 포함하는 HSC의 혼합 집단 및 편집된 LT-HSC를 포함하는 생착된 편집된 HSC의 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 HSC의 산출 집단을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본원에 기재된 개체 내 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 임의의 생착 방법에 따르면, 상기 편집된 HSC는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, 방법에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, HSC는 장기 생착 조혈 줄기 세포(LT-HSC)이다. 일부 실시형태에서, HSC는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, HSC는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 임의의 생착 방법에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 세포로의 도입 후 제2 및/또는 제3 인식 서열에서 절단된다. 일부 실시형태에서, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 임의의 생착 방법에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 RNA 게놈의 dsDNA 중간체), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 게놈은 인테그라제-결핍 렌티바이러스 게놈이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 임의의 생착 방법에 따르면, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 편집된 HSC의 제조 방법은 표적 유전자좌에서 제1 인식 서열을 절단하도록 RGEN을 유도할 수 있는 gRNA를 HSC에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RGEN이 공여체 핵산에서 하나 이상의 인식 서열을 절단하도록 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 편집된 HSC의 제조 방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 리보핵산(RNP)을 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집된 HSC의 제조 방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 임의의 생착 방법에 따르면, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산에서 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이다. 일부 실시형태에서, 편집된 HSC의 제조 방법은 프로토스페이서 서열 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 HSC에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 각각의 프로토스페이서는 동일하고, 방법은 프로토스페이서 서열을 표적화하는 하나의 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 편집된 HSC를 생착시키는 방법에 사용된 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 상기 HSC 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 상기 방법은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, DAP는 gRNA 스페이서보다 길이가 적어도 약 1개(예컨대 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드만큼 더 짧다. 일부 실시형태에서, DAP는 gRNA 스페이서와 적어도 약 1개(예컨대, 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 편집된 HSC를 생착시키는 방법에 사용된 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 상기 HSC 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 상기 방법은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 편집된 HSC를 생착시키는 방법에 사용된 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 상기 HSC 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 상기 방법은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 편집된 HSC를 생착시키는 방법에 사용된 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 HSC에 도입되기전에 HSC에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 HSC에 도입되기 전 1시간 이내에 HSC에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 HSC에 도입되기 전 5분 이내에 HSC에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계는 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 편집된 HSC를 생착시키는 방법에 사용된 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 방법은 공여체 핵산이 HSC에 도입되기전에 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNP는 공여체 핵산이 HSC에 도입되기 전 1시간 이내에 HSC에 도입된다. 일부 실시형태에서, RNP는 공여체 핵산이 HSC에 도입되기 전 5분 이내에 HSC에 도입된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 편집된 HSC를 생착시키는 방법에 사용된 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 제조하는 임의의 방법에 따르면, HSC는 저산소 조건 하에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 편집된 HSC를 생착시키는 방법에 사용된 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 제조하는 임의의 방법에 따르면, HSC는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 HSC에 도입하기전 약 48시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, HSC는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 HSC에 도입하기전 약 24시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, HSC는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 HSC에 도입하기전 약 2시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계는 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 HSC에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개체 내 편집된 HSC를 생착시키는 방법에 사용된 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC를 제조하는 임의의 방법에 따르면, HSC는 Notch 리간드의 존재 하에 배양된다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드는 델타-유사 Notch 리간드(DLL), Jagged-1, Jagged-2, 또는 이의 접합체이다. 일부 실시형태에서, 델타-유사 Notch 리간드는 DLL1, DLL3, 또는 DLL4이다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드는 Fc-DLL1, Fc-DLL3, Fc-DLL4, Fc-Jagged-1, 또는 Fc-Jagged-2이다.
치료 방법
일부 실시형태에서, 단백질의 기능적 형태를 발현하기 위한 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 편집된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 질환 또는 병태는 기능성 단백질의 결핍성 발현을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 질환은 중증 합병성 면역결핍(SCID)이며, 상기 방법은 대상체에서 돌연변이된 단백질의 기능적 형태를 발현하기 위해 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 편집된 HSC 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, HSC는 림프 발달에 관여하는 단백질, 예를 들어 IL2Rg, RAG1, 또는 IL7R을 발현하도록 편집된다. 일부 실시형태에서, HSC는 림프구 증식 및/또는 대사에 관여하는 단백질, 예를 들어 ADA 또는 PNP를 발현하도록 편집된다. 일부 실시형태에서, 질환은 고셔 병, 파브리 병, I-IX형 점액다당류증, 또는 부신백질이영양증이다.
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 임의의 방법에 따르면, 편집된 세포는 (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계; 및 (b) 이중가닥 공여체 핵산을 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, 방법에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 세포는 상동성 직접 복구(HDR)에 필요한 기구가 부족하다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 예컨대 장기 생착 조혈 줄기 세포(LT-HSC)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다. 일부 실시형태에서, 세포는 휴지 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 임의의 방법에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 세포로의 도입 후 제2 및/또는 제3 인식 서열에서 절단된다. 일부 실시형태에서, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다.
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 임의의 방법에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 RNA 게놈의 dsDNA 중간체), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 게놈은 인테그라제-결핍 렌티바이러스 게놈이다.
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 임의의 방법에 따르면, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 편집된 세포의 제조방법은 표적 유전자좌에서 제1 인식 서열을 절단하도록 RGEN을 유도할 수 있는 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RGEN이 공여체 핵산에서 하나 이상의 인식 서열을 절단하도록 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 편집된 세포의 제조방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 리보핵산(RNP)을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집된 세포의 제조방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다.
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 임의의 방법에 따르면, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산에서 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이다. 일부 실시형태에서, 편집된 세포의 제조방법은 프로토스페이서 서열 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 각각의 프로토스페이서는 동일하고, 방법은 프로토스페이서 서열을 표적화하는 하나의 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용되는 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 세포를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 상기 방법은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, DAP는 gRNA 스페이서보다 길이가 적어도 약 1개(예컨대 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드만큼 더 짧다. 일부 실시형태에서, DAP는 gRNA 스페이서와 적어도 약 1개(예컨대, 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 RGEN을 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용되는 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 세포를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 상기 방법은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용되는 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 세포를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 세포 게놈은 표적 유전자좌 내에 제1 프로토스페이서를 포함하며, 상기 방법은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용되는 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 세포를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 1시간 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 5분 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계는 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용되는 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 세포를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 방법은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전에, RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNP는 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 1시간 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, RNP는 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 5분 이내에 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용되는 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 세포를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 세포는 저산소 조건 하에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용되는 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 세포를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 48시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 24시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 2시간 이내에 배양된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계는 RGEN 및 gRNA를 포함하는 RNP를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈, 예를 들어 scAAV 게놈이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용되는 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 세포를 제조하는 임의의 방법에 따르면, 세포는 Notch 리간드의 존재 하에 배양된다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드는 델타-유사 Notch 리간드(DLL), Jagged-1, Jagged-2, 또는 이의 접합체이다. 일부 실시형태에서, 델타-유사 Notch 리간드는 DLL1, DLL3, 또는 DLL4이다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드는 Fc-DLL1, Fc-DLL3, Fc-DLL4, Fc-Jagged-1, 또는 Fc-Jagged-2이다.
조성물
본 개시내용에 설명된 바와 같이 조작된 세포를 생성하기 위한 시스템의 하나 이상의 요소를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 b) 이중가닥 공여체 핵산 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 뉴클레아제는 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 표적 유전자좌에서 게놈 편집을 매개할 수 있고, 여기서 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 편집될 세포를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 조성물에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 조성물에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 RNA 게놈의 dsDNA 중간체), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 게놈은 인테그라제-결핍 렌티바이러스 게놈이다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 조성물에 따르면, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이다. 일부 실시형태에서, RGEN은 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 표적 유전자좌에서 제1 인식 서열을 절단하도록 RGEN을 유도할 수 있는 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RGEN이 공여체 핵산에서 하나 이상의 인식 서열을 절단하도록 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 RGEN을 포함하는 리보핵산(RNP) 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 mRNA 또는 플라스미드이다.
일부 실시형태에서, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 임의의 조성물에 따르면, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산에서 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 프로토스페이서 서열 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 각각의 프로토스페이서는 동일하고, 조성물은 프로토스페이서 서열을 표적화하는 하나의 gRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서 본원에 기재된 조성물은 i) 제1 프로토스페이서를 포함하는 제1 핵산 및 ii) 스페이서를 포함하는 gRNA 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 제1 프로토스페이서는 스페이서와 불완전한 일치를 갖는 DAP이고, 여기서 제1 프로토스페이서가 스페이서와 일치하는 정도는 제1 프로토스페이서에서 제1 핵산의 변형을 허용하기에 충분하다. 일부 실시형태에서, DAP는 스페이서보다 길이가 적어도 약 1개(예컨대 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드만큼 더 짧다. 일부 실시형태에서, DAP는 스페이서와 적어도 약 1개(예컨대, 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 제2 프로토스페이서를 포함하는 제2 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로토스페이서는 스페이서와 완전히 일치한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물에 따르면, 조성물은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 프로토스페이서 및 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 상동성 직접 복구(HDR)에 필요한 기구가 부족하다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 예컨대 장기 생착 조혈 줄기 세포(LT-HSC)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 SCID-재증식 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 중 임의의 것)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 중 임의의 것)으로 특징화된다. 일부 실시형태에서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화된다. 일부 실시형태에서, 세포는 휴지 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물에 따르면, 조성물은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물에 따르면, 조성물은 a) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, b) 스페이서 또는 gRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 gRNA 및 c) 이중가닥 공여체 핵산 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 외인성 핵산이 삽입될 표적 유전자좌 내 제1 프로토스페이서를 절단할 수 있으며, 여기서 제1 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하지 않는 DAP이고, 여기서 공여체 핵산은 제2 프로토스페이서에 의해 양쪽 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 gRNA는 RGEN을 표적화하여 공여체 핵산에서 제2 프로토스페이서를 절단할 수 있고, 제2 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하며, 공여체 핵산은 외인성 핵산이 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입될 수 있도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 공여체 핵산은 i) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌로 원하는 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서를 생성하지 않고, ii) 절단된 공여체 핵산을 절단된 표적 유전자좌에 다른 배향으로 삽입하면 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 절단될 수 있는 외인성 핵산 측면에 있는 프로토스페이서가 생성되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 제1 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 제2 프로토스페이서는 역 배향이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 추가로 포함한다.
또한, 본원에는 본 개시내용에 기재된 바와 같이 제조된, 유전적으로 변형된 세포, 예컨대 포유동물 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한, 본원에 제공되고 기재된 조작된 세포를 포함하는 키트 및 시스템 및/또는 조작된 세포를 생성시키기 위한 시스템 요소가 본원에 제공된다. 따라서, 예를 들어, 본원에는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열; 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터; 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 세포 중 하나 이상을 포함하는 키트가 제공된다.
핵산
게놈-표적화 핵산 또는 가이드 RNA
본 개시내용은 표적 핵산 내의 특정 표적 서열로 연관된 폴리펩타이드(예를 들어, 부위-지향적 폴리펩타이드 또는 DNA 엔도뉴클레아제)의 활성을 지시할 수 있는 게놈-표적화 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산은 RNA이다. 게놈-표적화 RNA는 본원에서 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"로 지칭된다. 가이드 RNA는 관심 표적 핵산 서열 및 CRISPR 반복 서열에 혼성화하는 적어도 하나의 스페이서 서열을 갖는다. 유형 II 시스템에서, gRNA는 tracrRNA 서열이라고 하는 제2 RNA도 갖는다. 유형 II 가이드 RNA(gRNA)에서, CRISPR 반복 서열과 tracrRNA 서열은 서로 혼성화하여 이중체를 형성한다. 유형 V 가이드 RNA(gRNA)에서, crRNA는 이중체를 형성한다. 두 시스템에서, 이중체는 부위-지향적 폴리펩타이드와 결합하여, 가이드 RNA와 부위-지향적 폴리펩타이드가 복합체를 형성한다. 게놈-표적화 핵산은 부위-지향적 폴리펩타이드와의 연관성 덕에 복합체에 대한 표적 특이성을 제공한다. 따라서, 게놈-표적화 핵산은 부위-지향적 폴리펩타이드의 활성을 지시한다.
일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산은 단일-분자 가이드 RNA이다. 이중-분자 가이드 RNA는 2개의 RNA 가닥을 갖는다. 제1 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 선택적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열 및 최소 CRISPR 반복 서열을 갖는다. 제2 가닥은 최소 tracrRNA 서열(최소 CRISPR 반복 서열에 상보적), 3' tracrRNA 서열 및 선택적 tracrRNA 연장 서열을 갖는다. 유형 II 시스템의 단일-분자 가이드 RNA(sgRNA)는 5'에서 3' 방향으로, 선택적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 선택적 tracrRNA 연장 서열을 갖는다. 선택적 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 대한 추가의 기능성(예를 들어, 안정성)을 기여하는 요소를 가질 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복 및 최소 tracrRNA 서열을 연결하여 헤어핀 구조를 형성한다. 선택적 tracrRNA 연장에는 하나 이상의 헤어핀이 있다. 유형 V 시스템의 단일-분자 가이드 RNA(sgRNA)는 5'에서 3' 방향으로 최소 CRISPR 반복 서열과 스페이서 서열을 갖는다.
예시적인 게놈-표적화 핵산은 국제공개 WO2018002719에 기재되어 있다.
공여체 DNA 또는 공여체 주형
DNA 엔도뉴클레아제와 같은 부위-지향적 폴리펩타이드는 핵산, 예를 들어 게놈 DNA에서 이중가닥 파단 또는 단일가닥 파단을 도입할 수 있다. 이중가닥 파단은 세포의 내인성 DNA-복구 경로(예를 들어, 상동성-의존적 복구(HDR) 또는 비상동성 말단 결합(NHEJ) 또는 대체 비상동성 말단 결합(A-NHEJ) 또는 미세상동성-매개된 말단 결합(MMEJ)을 자극할 수 있다. NHEJ는 상동성 주형에 대한 필요없이 절단된 표적 핵산을 복구할 수 있다. 이는 때때로 절단 부위의 표적 핵산에서 작은 결실 또는 삽입(인델)을 초래할 수 있으며, 유전자 발현의 파괴 또는 변경을 초래할 수 있다.
이중가닥 파단이 발생한 세포의 핵 내부에 외인성 DNA 분자가 충분한 농도로 공급되면, NHEJ 복구 과정에서 이중가닥 파단 부위에 외인성 DNA가 삽입되어 게놈에 대한 영구적인 추가가 될 수 있다. 외인성 DNA에 뉴클레아제 표적 부위를 포함하면 NHEJ-매개 DNA 복구 중에 표적 부위로의 삽입을 크게 자극한다. 이러한 외인성 DNA 분자는 일부 실시형태에서 공여체 주형으로 지칭된다. 공여체 주형이 선택적으로, 프로모터, 인핸서, 폴리A 서열 및/또는 스플라이스 수용체 서열(본원에서 "공여체 카세트"라고도 함)과 같은 관련 조절 서열과 함께 이식유전자에 대한 코딩 서열을 함유하는 경우, 이식유전자는 게놈내 통합된 핵산으로부터 발현되어, 세포의 수명 동안 영구적인 발현을 초래할 수 있다. 더욱이, 공여체 DNA 주형의 통합된 핵산은 세포 분열시에 딸 세포로 전달될 수 있다.
일부 실시형태에서, 공여체 DNA는 뉴클레아제와 함께, 또는 독립적으로 다양한 방법, 예를 들어 형질감염, 나노-입자, 미세-주입 또는 바이러스 형질도입에 의해 공급될 수 있다.
일부 실시형태에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 본원에 기재된 임의의 공여체 주형에 따르면, 외인성 핵산 서열은 gRNA 표적 부위에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 위치한다. 예를 들어, 이러한 공여체 주형은 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 5' 및/또는 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 3'을 갖는 외인성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공여체 주형은 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 5'를 갖는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 주형은 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 3'를 갖는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 주형은 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 5' 및 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 3'를 갖는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 주형은 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 5' 및 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 3'를 갖는 외인성 핵산 서열을 포함하며, 2개의 gRNA 표적 부위는 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 주형은 적어도 하나의 gRNA 표적 부위를 포함하며, 공여체 주형내 적어도 하나의 gRNA 표적 부위는 공여체 주형의 외인성 핵산 서열이 통합되는 표적 유전자좌의 gRNA 표적 부위와 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 주형은 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 5' 및 외인성 핵산 서열의 gRNA 표적 부위 3'를 갖는 외인성 핵산 서열을 포함하며, 2개의 gRNA 표적 부위는 공여체 주형의 외인성 핵산 서열이 통합되는 표적 유전자좌의 gRNA 표적 부위와 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 gRNA 표적 부위는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 gRNA 표적 부위는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 공여체 주형은 이중가닥 공여체 핵산이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열을 포함하고 NHEJ에 의해 표적 유전자좌로 삽입되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 제1 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제2 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 뉴클레아제는 동일한 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 인식 서열은 동일한 인식 서열이다. 일부 실시형태에서, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 뉴클레아제는 RGEN이고, 제1 및 제2 인식 서열은 프로토스페이서 서열이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이중가닥 공여체 핵산은 프로토스페이서에 의해 한쪽 또는 양쪽 말단에 측면에 있는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 핵산 서열은 그의 5' 말단에 측면에 프로토스페이서가 위치한다. 일부 실시형태에서, 외인성 핵산 서열은 그의 3' 말단에 측면에 프로토스페이서가 위치한다. 일부 실시형태에서, 외인성 핵산 서열은 그의 5' 및 3' 말단에 측면에 프로토스페이서가 위치한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 순 배향이고, 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 공여체 핵산의 프로토스페이서는 역 배향이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이중가닥 공여체 핵산은 gRNA의 스페이서와 불완전한 일치를 갖는 지연-작용 프로토스페이서(DAP)에 의해 한쪽 또는 양쪽 말단에 측면에 있는 외인성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 DAP가 스페이서와 일치하는 정도는 gRNA에 의해 유도되는 RGEN에 의해 DAP에서 공여체 핵산의 변형을 허용하기에 충분하다. 일부 실시형태에서, DAP는 스페이서보다 길이가 적어도 약 1개(예컨대 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드만큼 더 짧다. 일부 실시형태에서, DAP는 스페이서와 적어도 약 1개(예컨대, 적어도 약 2, 3개 또는 그 이상 중 임의의 것) 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 예를 들어, gRNA는 서열 번호 8의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 스페이서를 포함할 수 있고, DAP는 서열 번호 16~28 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열로부터의 프로토스페이서를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중가닥 공여체 핵산을 사용하는 본원에 기재된 임의의 방법에 따르면, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 RNA 게놈의 dsDNA 중간체), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈이다. 일부 실시형태에서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 게놈은 인테그라제-결핍 렌티바이러스 게놈이다.
부위-지향적 폴리펩타이드 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산
일부 실시형태에서, 게놈 편집 방법 및 조성물은 따라서 부위-지향적 폴리펩타이드 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 사용할 수 있다. 부위-지향적 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 부위-지향적 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 RNA인 경우, gRNA 서열에 공유적으로 연결되거나 별도의 서열로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 부위-지향적 폴리펩타이드 또는 DNA 엔도뉴클레아제의 펩타이드 서열이 그의 핵산 서열 대신에 사용될 수 있다.
벡터
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 게놈-표적화 핵산을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 본 개시내용의 부위-지향적 폴리펩타이드 및/또는 본 개시내용의 방법의 실시형태를 수행하는데 필요한 임의의 핵산 또는 단백질성 분자를 갖는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 핵산은 벡터(예를 들어, 재조합 발현 벡터)이다.
고려되는 발현 벡터는 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, SV40, 단순 포진 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 레트로바이러스(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식 육종 바이러스 및 유선 종양 바이러스로부터 유래된 벡터) 및 기타 재조합 벡터에 기초한 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 진핵 표적 세포에 대해 고려되는 다른 벡터는 벡터 pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVLSV40(Pharmacia)을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 진핵 표적 세포에 대해 고려되는 추가 벡터는 벡터 pCTx-1, pCTx-2, 및 pCTx-3 을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 다른 벡터는 숙주 세포와 호환되는 한 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 하나 이상의 전사 및/또는 번역 제어 요소를 갖는다. 사용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소 중 임의의 것이 발현 벡터에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 서열 또는 CRISPR기구의 성분 또는 다른 요소를 불활성화시키는 자가-불활성화 벡터이다.
적합한 진핵 프로모터(즉, 진핵 세포에서 기능하는 프로모터)의 비제한적인 예는 거대세포 바이러스(CMV) 즉시 초기로부터의 것, 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복(LTR), 인간 신장 인자-1 프로모터(EF1), 닭 베타-액틴 프로모터(CAG)에 융합된 거대세포 바이러스(CMV) 인핸서를 갖는 하이브리드 작제물, 뮤린 줄기 세포 바이러스 프로모터(MSCV), 포스포글리세레이트 키나제-1 유전자좌 프로모터(PGK) 및 마우스 메탈로티오네인-I을 포함한다.
Cas 엔도뉴클레아제와 관련하여 사용되는 가이드 RNA를 포함하는 소형 RNA를 발현하기 위해, 예를 들어 U6 및 H1 프로모터를 포함하는 RNA 중합효소 III 프로모터와 같은 다양한 프로모터가 유리할 수 있다. 이러한 프로모터의 사용을 향상시키기 위한 설명 및 매개변수는 당 업계에 알려져 있으며, 추가 정보 및 접근법이 정기적으로 설명되고 있으며; 예를 들어, 문헌[Ma, H. et al, Molecular Therapy - Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12]을 참고한다.
발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적당한 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 부위-지향적 폴리펩타이드에 융합되어 융합 단백질을 생성하는 비-천연 태그(예를 들어, 히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, 녹색 형광 단백질 등)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터(예를 들어, 열 충격 프로모터, 테트라사이클린-조절 프로모터, 스테로이드-조절 프로모터, 금속-조절 프로모터, 에스트로겐 수용체-조절 프로모터 등)이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, UBC 프로모터)이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 공간적으로 제한되고/되거나 시간적으로 제한된 프로모터(예를 들어, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 등)이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 유전자가 게놈에 삽입된 후 게놈에 존재하는 내인성 프로모터 하에 발현될 경우 숙주 세포에서 발현될 하나 이상의 유전자에 대한 프로모터를 갖지 않는다.
부위-지향적 폴리펩타이드 또는 DNA 엔도뉴클레아제
NHEJ 및/또는 HDR로 인한 표적 DNA의 변형은 예를 들어 돌연변이, 결실, 변경, 통합, 유전자 수정, 유전자 대체, 유전자 태깅, 이식유전자 삽입, 뉴클레오타이드 결실, 유전자 파괴, 전좌 및/또는 유전자 돌연변이로 이어질 수 있다. 비-천연 핵산을 게놈 DNA에 통합하는 과정은 게놈 편집의 한 예이다.
부위-지향적 폴리펩타이드는 DNA를 절단하기 위한 게놈 편집에 사용되는 뉴클레아제이다. 부위-지향적 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산으로서 세포 또는 환자에게 투여될 수 있다.
CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템의 맥락에서, 부위-지향적 폴리펩타이드는 가이드 RNA에 결합할 수 있으며, 이는 차례로 폴리펩타이드가 지향되는 표적 DNA의 부위를 특정한다. 본원의 CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템의 실시형태에서, 부위-지향적 폴리펩타이드는 DNA 엔도뉴클레아제와 같은 엔도뉴클레아제이다. 이러한 RNA-유도 부위-지향적 폴리펩타이드는 본원에서 RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RGEN으로도 지칭된다.
예시적인 부위-지향적 폴리펩타이드는 국제공개 WO2018002719에 기재되어 있다.
표적 서열 선택
일부 실시형태에서, 특정 참조 유전자좌에 대한 5' 경계 및/또는 3' 경계의 위치에서의 이동은 유전자 편집의 특정 적용을 촉진하거나 향상시키기 위해 사용되며, 이는 본원에 추가로 기재되고 설명된 바와 같이, 편집을 위해 선택된 엔도뉴클레아제 시스템에 부분적으로 의존한다.
이러한 표적 서열 선택의 첫 번째 비제한적인 양태에서, 많은 엔도뉴클레아제 시스템은 절단을 위한 잠재적 표적 부위의 초기 선택을 유도하는 규칙 또는 기준을 가지고 있으며, 예를 들어, CRISPR 유형 II 또는 유형 V 엔도뉴클레아제의 경우 DNA 절단 부위에 인접한 특정 위치에서 PAM 서열 모티프가 필요하다.
표적 서열 선택 또는 최적화의 또 다른 비제한적인 양태에서, 표적 서열 및 유전자 편집 엔도뉴클레아제의 특정 조합에 대한 "오프-타겟" 활성의 빈도(즉, 선택된 표적 서열과 다른 부위에서 발생하는 DSB의 빈도)는 표적 활성의 빈도와 관련하여 평가된다. 어떤 경우에는 원하는 유전자좌에서 올바르게 편집된 세포는 다른 세포에 비해 선택적인 이점을 가질 수 있다. 예시적이지만 비제한적인 선택적 이점의 예에는 향상된 복제 속도, 지속성, 특정 조건에 대한 저항성, 환자에게 도입된 후 생체 내에서의 성공적인 생착 또는 지속성 향상 속도, 및 그러한 세포의 유지 또는 증가된 수 또는 생존력과 관련된 기타 속성의 획득이 포함된다. 다른 경우, 원하는 유전자좌에서 올바르게 편집된 세포는 올바르게 편집된 세포를 식별, 정렬 또는 선택하는 데 사용되는 하나 이상의 스크리닝 방법에 의해 양성적으로 선택될 수 있다. 선택적 이점과 지시된 선택 방법 모두 교정과 관련된 표현형을 활용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 의도된 세포 집단을 선택하거나 정제하는데 사용되는 새로운 표현형을 생성하는 제2 변형을 생성하기 위해 2회 이상 편집될 수 있다. 이러한 두 번째 변형은 선택 가능하거나 스크리닝 가능한 마커에 대한 제2 gRNA를 첨가하여 생성될 수 있었다. 어떤 경우에는, cDNA와 선택 가능한 마커를 함유하는 DNA 단편을 사용하여 원하는 유전자좌에서 세포를 올바르게 편집할 수 있다.
실시형태들에서, 임의의 선택적 이점이 적용 가능하거나 임의의 지시된 선택이 특정 경우에 적용될 것인지 여부에 관계없이, 또한 적용의 효과를 향상시키기 위해 및/또는 원하는 표적 이외의 부위에서 원하지 않는 변경에 대한 가능성을 감소시키기 위해 오프-표적 빈도를 고려함으로써 표적 서열 선택이 안내된다. 추가로 설명되고 본원 및 당 업계에 예시된 바와 같이, 오프-표적 활성의 발생은 표적 부위와 다양한 오프-표적 부위 사이의 유사성 및 비유사성뿐만 아니라 사용된 특정 엔도뉴클레아제를 포함하는 다수의 인자에 의해 영향을 받는다. 오프-표적 활성의 예측을 지원하는 생물정보학 도구를 사용할 수 있으며, 종종 이러한 도구를 사용하여 오프-표적 활성의 가능성이 가장 높은 부위를 식별할 수 있으며, 그런 다음 실험 설정에서 평가하여 온-표적 활성에 대한 오프-표적 활성의 상대적 빈도를 평가할 수 있어서, 온-표적 활성에 대한 더 높은 서열을 선택할 수 있게 된다. 이러한 기술의 예시적인 예가 본원에 제공되고, 다른 기술은 당 업계에 공지되어 있다.
표적 서열 선택의 또 다른 양태는 상동성 재조합 이벤트에 관한 것이다. 상동성 영역을 공유하는 서열은 개입 서열의 결실을 초래하는 상동성 재조합 이벤트에 대한 초점 역할을 할 수 있다. 이러한 재조합 이벤트는 염색체 및 기타 DNA 서열의 정상적인 복제 과정에서, 그리고 이중가닥 파단(DSB)의 복구의 경우와 같이 DNA 서열이 합성될 때 발생하며, 이는 또한 정상 세포 복제주기 동안에 정기적으로 발생하지만 다양한 이벤트(예컨대 UV 광 및 DNA 파단의 다른 유도제)의 발생 또는 특정 작용제(예컨대 다양한 화학적 유도제)의 존재에 의해 향상될 수 있다. 이러한 많은 유도제는 DSB가 게놈에서 무차별적으로 발생하도록 하고 DSB는 정상 세포에서 정기적으로 유도되고 복구된다. 복구하는 동안 원본 서열은 완전한 충실도로 재구성될 수 있지만, 일부 경우에는 DSB 부위에서 작은 삽입 또는 결실("인델"이라고 함)가 도입된다.
DSB는 또한 본원에 기재된 엔도뉴클레아제 시스템의 경우에서와 같이 특정 위치에서 특이적으로 유도될 수 있으며, 이는 선택된 염색체 위치에서 지시된 또는 우선적인 유전자 변형 이벤트를 유발하는데 사용될 수 있다. DNA 복구(및 복제)의 맥락에서 상동 서열이 재조합되는 경향은 여러 상황에서 활용될 수 있으며, CRISPR과 같은 유전자 편집 시스템의 한 용도의 기초가 되며, "공여체" 폴리뉴클레오타이드의 사용을 통해 제공된 관심 서열을 원하는 염색체 위치에 삽입하기 위해 상동성 직접 복구가 사용된다.
10개 이하의 염기쌍을 가질 수 있는 "미세상동성"의 작은 영역일 수 있는 특정 서열 사이의 상동성 영역은 또한 원하는 결실을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 DSB는 인접한 서열과 함께 미세상동성을 나타내는 부위에 도입된다. 이러한 DSB의 정상적인 복구 과정동안, 높은 빈도로 발생하는 결과는 DSB 및 수반되는 세포 복구 프로세스에 의해 촉진되는 재조합의 결과로 개입 서열의 결실이다.
그러나, 일부 상황에서, 상동성 영역내에서 표적 서열을 선택하는 것은, 또한 유전자 융합(결실이 코딩 영역에 있을 때)을 포함하는 훨씬 더 큰 결실을 야기할 수 있으며, 이는 특정 상황에서 요구될 수 있거나 요구될 수 없다.
본원에 제공된 예는 본원에 기재된 하나 이상의 시스템 성분을 삽입하도록 설계된 DSB의 생성을 위한 다양한 표적 영역의 선택뿐만 아니라, 온-표적 이벤트에 대한 오프-표적 이벤트를 최소화하도록 설계된 이러한 영역 내의 특정 표적 서열의 선택을 추가로 설명한다.
핵산 변형
일부 실시형태에서, 세포에 도입된 폴리뉴클레오타이드는 독립적으로 또는 조합하여, 예를 들어 활성, 안정성 또는 특이성을 향상시키기 위해; 전달을 변경시키기 위해; 숙주 세포에서 타고난 면역 반응을 감소시키기 위해; 또는 본 명세서에 추가로 기술되고 당 업계에 공지된 다른 개선을 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 변형을 갖는다.
특정 실시형태에서, 변형된 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템에 사용되며, 이 경우 가이드 RNA(단일-분자 가이드 또는 이중-분자 가이드) 및/또는 세포에 도입된 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA 또는 RNA가 하기에 기재되고 예시된 바와 같이 변형될 수 있다. 이러한 변형된 폴리뉴클레오타이드는 임의의 하나 이상의 게놈 유전자좌를 편집하기 위해 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템에 사용될 수 있다.
이러한 용도의 비제한적인 예시를 위해 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템을 사용하여, 가이드 RNA의 변형이 사용되어, 단일-분자 가이드 또는 이중-분자, 및 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제일 수 있는, 가이드 RNA를 갖는 CRISPR/Cas9/Cpf1 게놈 편집 복합체의 형성 또는 안정성을 향상시킬 수 있다. 가이드 RNA의 변형은 또한 또는 대안적으로 게놈 편집 복합체와 게놈의 표적 서열 사이의 상호 작용의 개시, 안정성 또는 동역학을 향상시키기 위해 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 온-표적 활성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 가이드 RNA의 변형은 또한 또는 대안적으로 특이성, 예를 들어 다른(오프-표적) 부위에서의 효과와 비교하여 온-표적 부위에서의 상대적인 게놈 편집 비율을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
변형은 또한 또는 대안적으로, 예를 들어, 세포에 존재하는 리보뉴클레아제(RNase)에 의한 분해에 대한 내성을 증가시킴으로써 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는 데 사용될 수 있으며, 이에 의해 세포에서의 반감기가 증가되도록 한다. 가이드 RNA 반감기를 향상시키는 변형은 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제가 번역되어야 하는 RNA를 통해 편집될 세포에 도입되어 엔도뉴클레아제를 생성하는 실시형태에서 특히 유용할 수 있는데, 그 이유는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA와 동시에 도입된 가이드 RNA의 반감기를 증가시키는 것은 가이드 RNA 및 코딩된 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제가 세포에서 공존하는 시간을 증가시키는 데 사용될 수 있기 때문이다.
변형은 또한 또는 대안적으로 세포 내로 도입된 RNA가 선천적 면역 반응을 유발할 가능성 또는 정도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 하기에, 및 당 업계에 설명된 바와 같이 소형 간섭 RNA(siRNA)를 포함하여 RNA 간섭(RNAi)의 맥락에서 잘 특성화된 이러한 반응은 RNA의 반감기 감소 및/또는 면역 반응과 관련된 사이토카인 또는 기타 요인의 유발과 관련되는 경향이 있다.
(예컨대 세포에 존재하는 RNAse에 의한 분해를 증가시킴으로써) RNA의 안정성을 향상시키는 변형, 결과 생성물(즉, 엔도뉴클레아제)의 번역을 향상시키는 변형, 및/또는 세포에 도입된 RNA가 선천적 면역 반응을 유발할 가능성 또는 정도를 감소시키는 변형을 포함하여, 세포로 도입되는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA에 대해 하나 이상의 유형의 변형이 이루어질 수도 있다.
상기 및 다른 것과 같은 변형의 조합이 마찬가지로 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas9/Cpf1의 경우, 하나 이상의 유형의 변형이 가이드 RNA(상기 예시된 것들 포함)에 이루어질 수 있고/있거나, 하나 이상의 유형의 변형이 Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA(상기 예시된 것들 포함)에 이루어질 수 있다.
예시적인 변형된 핵산은 국제공개 WO2018002719에 기재되어 있다.
전달
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에 사용된 임의의 핵산 분자, 예를 들어 본 개시내용의 게놈-표적화 핵산 및/또는 부위-지향적 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 세포로의 전달을 위한 전달 비히클의 표면에 또는 전달 표면 상에 패키징된다. 고려되는 전달 비히클은 나노스피어, 리포솜, 양자점, 나노입자, 폴리에틸렌 글리콜 입자, 하이드로겔 및 미셀을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 당 업계에 기재된 바와 같이, 다양한 표적화 모이어티는 원하는 세포 유형 또는 위치와 이러한 비히클의 우선적 상호작용을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 복합체, 폴리펩타이드 및 핵산을 세포 내로 도입하면, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포솜-매개 형질감염, 입자건 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세주입, 나노입자-매개 핵산 전달 등에 의해 발생할 수 있다.
예시적인 전달 방법 및 시약은 국제공개 WO2018002719에 기재되어 있다.
본 개시내용은 특정 대안을 참조하여 상기에서 설명되었다. 그러나, 상기 기재된 것 이외의 다른 대안이 본 개시내용의 범위 내에서 동등하게 가능하다. 상기 기재된 것과 다른 방법 단계가 본 개시내용의 범위 내에서 제공될 수 있다. 본원에 기재된 다른 특징 및 단계들은 설명된 것과 다른 조합으로 결합될 수 있다.
본 명세서에서 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련하여, 당업자는 문맥 및/또는 용도에 적절한대로 복수에서 단수로 및/또는 단수에서 복수로 해석할 수 있다. 명확성을 위해 다양한 단수/복수 순열이 본 명세서에서 명시적으로 설명될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에서, 특히 첨부된 청구범위(예를 들어, 첨부된 청구범위의 본문)에서 사용되는 용어는 일반적으로 "개방" 용어(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이들로 한정되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이들로 한정되지 않는"으로 해석되어야 하는 것 등)로 의도된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
또한, 본 개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠시(Markush) 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 당업자는 본 개시내용이 또한 마쿠시 그룹의 구성원의 임의의 개별 구성원 또는 하위그룹의 관점에서 설명된다는 것을 인식할 것이다.
제1 내지 제11 양태의 대안의 임의의 특징은 본 명세서에서 확인된 모든 양태 및 대안에 적용될 수 있다. 더욱이, 제1 양태 내지 제11 양태의 대안의 임의의 특징은 독립적으로, 부분적으로 또는 전체적으로 임의의 방식으로 본원에 기재된 다른 대안과 결합될 수 있으며, 예를 들어, 1, 2, 또는 3개 이상의 대안이 전체적으로 또는 부분적으로 결합될 수 있다. 또한, 제1 내지 제11 양태의 대안의 임의의 특징은 다른 양태 또는 대안에 대해 선택적이 될 수 있다. 다양한 예시적인 대안 및 구현과 관련하여 위에서 설명되었지만, 하나 이상의 개별 대안에서 기재된 다양한 특징, 양태 및 기능은 그들이 기재된 특정 대안에 대한 적용가능성에 제한되지 않지만, 대신에, 그러한 대안이 기재되었는지 여부 및 그러한 특징이 기술된 대안의 일부로서 제시되는지 여부에 관계없이 본 출원의 다른 대안 중 하나 이상에 단독으로 또는 다양한 조합으로 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 출원의 폭 및 범위는 상기 기재된 예시적인 대안 중 어느 것에 의해 제한되어서는 안 된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 공보 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 한, 명세서는 그러한 모순되는 자료를 대체 및/또는 우선하도록 의도된다. 본원에 참조로 포함된 공보 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 정도까지, 명세서는 그러한 모순되는 물질을 대체 및/또는 우선하도록 의도된다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시형태의 세부사항은 하기 첨부된 상세한 설명에서 설명된다. 본 개시내용에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 재료 및 방법이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명으로부터 명백해질 것이다. 설명에서, 단수형은 문맥 상 달리 명시하지 않는 한 복수형도 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우 본 설명이 우선할 것이다.
본 명세서에 설명된 실시예 및 실시형태는 단지 예시를 위한 것이며, 그에 비추어 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되어야 함을 이해해야 한다. 본 명세서에서 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본원에 제공된 개시내용의 일부 실시형태는 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1: K562 세포내 NHEJ-매개 표적화된 통합
본 연구는 K562 세포에서 공여체 절단이 있거나 없는 NHEJ-매개 표적화된 통합의 실행가능성을 결정하기 위해 수행되었다. 발현을 위한 내인성 PPP1R12C 프로모터에 의존하는 GFP 발현 카세트를 갖는 플라스미드 공여체 벡터를 생체 내 공여체 절단을 위해 CRISPR/Cas9 인식 부위를 포함하거나 포함하지 않고 클로닝하였다.
본 실험에서, -1일에 1.50, 2.75 및 3.50 pmols의 1-컷 플라스미드 공여체(pCR2.1-TOPO-psAAVS1-SA-P2A-H2Bj-Venus-BGHpA-psSCRAM)로, 또는 3.50 pmols의 0-컷 플라스미드 공여체(pCR2.1-TOPO-psSCRAM-SA-P2A-H2Bj-Venus-BGHpA-psSCRAM)로 300,000개의 K562 세포를 뉴클레오펙션시켰다. pCR2.1-TOPO: 벡터 플라스미드 백본; psSCRAM: PAM을 사용하는 스크램블된 프로토스페이서 서열; psAAVS1: Cas9/gRNA RNP가 PAM으로 절단하는 게놈 DNA 서열과 동일한 프로토스페이서 서열; SA: 스플라이스 수용체; P2A: 펩타이드 절단 신호 서열; H2Bj-Venus: 핵에서 GFP를 안정화시키는 히스톤 H2B에 융합된 변형된 GFP; 및 BGHpA: 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열. 24시간 후, 각 조건의 K562 세포를 RNP와 함께 또는 없이 뉴클레오펙션시켰다. RNP는 12 pmols Cas9(Feldan)와 60 pmols AAVS1 가이드 RNA(Axolabs)의 복합체였다. K562 세포주에 대해 Lonza 4D Nucleofector®의 표준 뉴클레오펙션 프로토콜을 사용하였다. 세포는 뉴클레오펙션 후 7일(D7) 및 14일(D14)에 유세포분석에 의해 분석하고, 게놈 DNA(gDNA)를 통합의 분자 분석을 위해 D7에 수집하였다.
유세포분석 결과는 도 1a 및 1b에 도시되어 있다. GFP+ 신호에 의해 결정된 편집 효율은 하기와 같았다: NHEJ 0-컷 3.5 pmols -RNP: D7=3.25%, D14=7.9%; NHEJ 0-컷 3.5 pmols +RNP: D7=3.28%, D14=6.86%; NHEJ 1-컷 1.50 pmols -RNP: D7=2.78%, D14=7.34%; NHEJ 1-컷 1.50 pmols +RNP: D7=13.7%, D14=15.7%; NHEJ 1-컷 2.75 pmols -RNP: D7=3.95%, D14=7.29%; NHEJ 1-컷 2.75 pmols +RNP: D7=20.3%, D14=18.9%; NHEJ 1-컷 3.50 pmols -RNP: D7=4.46%, D14=7.25%; NHEJ 1-컷 3.50 pmols +RNP: D7=23.0%, D14=22.2%. 이러한 결과는 공여체 절단으로 향상된 편집 효율성을 입증한다.
D7에 추출된 gDNA는 통합 검출을 위한 인-아웃 PCR에 사용되었다(도 2의 도식 참조). gDNA 샘플은 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 하기 프라이머 조합들 중 하나를 사용하여 PCR 증폭하였다: 5' 정배향 AB(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 3' 정배향 CV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 5' 역배향 AC(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 3' 역배향 BV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 100 ng 게놈 DNA; 1 μl GC-인핸서; 및 H2O 최대 총 20 μl. 도 2에 도시된 바와 같이, 모든 샘플은 예상대로 아웃-아웃 밴드를 가졌지만, RNP에 의해 표적화된 적어도 하나의 컷 부위가 있는 Cas9/gRNA RNP 및 공여체 플라스미드로 처리된 샘플만이 인-아웃 PCR 밴드에 의해 입증된 바와 같이 이식유전자의 통합을 보여주었다.
실시예 2: 분할 및 비분할 세포에서 NHEJ-TI 대 HDR-TI에 대한 모델로서의 T-세포
본 연구는 인간 CD3+ T 세포에서 분할 세포 대 비분할 세포에서 NHEJ-매개 표적화된 통합 대 HDR-매개 표적화된 통합의 실행가능성을 결정하기 위해 수행되었다. 생체 외 배양에서 정제된 T 세포는 자연적으로 휴지되며, 성장 및 확장을 개시하도록 자극되지 않는 한 HDR을 효율적으로 겪지 않는다. 하기는 자극 및 비자극 T 세포 모두에서 HDR-매개 표적화된 통합 및 NHEJ-매개 표적화된 통합을 설명한다.
후-STIM(분할) T-세포 표적화된 통합
Figure pct00001
Pan CD3+ T-세포를 StemCell Technologies 키트(17951)를 통해 분리하고, AIMV(Invitrogen 12055083) + 5% CTS 면역 세포 혈청 교체(SR)(Invitrogen A2596101)에서 배양하고, T 세포 활성화/확장 키트(Miltenyi Biotec 130-093-627)를 사용하여 IL-2 100 ng/ml(PeproTech) 및 IL-7 100 ng/ml(PeproTech)로 활성화하였다.
VBL(CBGU004)의 NHEJ-TI 바이러스(서열 번호 6)는 50,000 vg/세포의 MOI에서 사용하고, VBL(CBGGU014)의 HDR-TI 바이러스(서열 번호 7)는 50,000 vg/세포의 MOI에서 사용하였다. RNP는 GeneArt v2 Cas9 1 pmol/10,000 세포 및 Synthego gRNA(서열 번호 8) 2.5 pmol/10,000 세포를 포함했다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권고에 따라 Primary Cell P3 뉴클레오펙터 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 EO-115와 함께 사용하였다.
세포 배양
본 실험에서, 조건 당 20만개의 세포(총 320만개의 세포)를 해동하고 DMSO를 세척하였다(1 ml 냉동 세포를 해동하고, 10 ml 배지에 희석함). 세포를 350 x g에서 10분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 튜브를 두드려 세포를 재현탁시켰다. 배지를 활성화 비드와 함께 100만 세포/ml로 첨가하고, 세포를 48시간 동안 배양하였다.
비드 고갈
해동 후 2일째에, 세포를 50 ml 원뿔형 튜브에 수집하고, 강력하게 피펫팅하여 응집된 세포를 해리시켰다. 세포를 함유하는 튜브를 자기 스탠드에 놓고 10분 동안 인큐베이션한 후, 상층액을 다른 50 ml 원뿔형 튜브에 부드럽게 피펫팅했다. 세포를 포함하는 튜브를 다시 자기 스탠드에 놓고 10분 동안 배양한 다음 상층액을 다른 50ml 원뿔형 튜브에 부드럽게 피펫팅했다. 튜브를 350 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 100만 세포/ml로 재현탁하고, 뉴클레오펙션 전에 적어도 2시간 동안 배양하였다.
RNP 뉴클레오펙션
세포를 50 ml 원뿔형 튜브에 수집하고, 350 x g에서 10분 동안 원심분리한 후 RNP 복합체를 제조하였다. 이전에 분취된 RNP 복합체를 해동하고, P3 뉴클레오펙션 시약 + RNP 마스터 믹스 20:50 pmol Cas9:gRNA/10 μl 뉴클레오펙션 시약을 준비했다. 10 μl의 뉴클레오펙션 시약/웰을 적당한 웰/조건에서 16-웰 뉴클레오펙션 스트립에 분취하였다. 수집된 세포를 P3 뉴클레오펙션 시약에 200,000개 세포/10 μl(20,000개 세포/μl)로 재현탁하고, 10 μl 세포-함유 뉴클레오펙션 시약을 총 부피 20 μl에 대해 16-웰 뉴클레오펙션 스트립의 각 웰에 분배하였다.
바이러스성 형질도입
뉴클레오펙션 전에, 바이러스성 형질도입 배지를 준비하였다. 무혈청 배지의 바이러스-함유 마스터 믹스를 하기와 같이 준비했다: a. 50,000 vg/세포 바이러스에 80 μl 총 부피; b. 320 μl(+ 추가), 400억(vg + 추가). 배지-단독 대조군도 준비하였다. 80 μl 형질도입 배지 또는 대조군을 96-웰 플레이트의 웰에 분취하였다.
뉴클레오펙션 후, 80 μl의 형질도입 배지를 100 μl 피펫으로 흡인하고, 16-웰 뉴클레오펙션 스트립의 웰로 부드럽게 옮겼다. 100 μl의 형질도입 배지/뉴클레오펙션 배지 혼합물을 흡인하고, 96-웰 플레이트의 해당 웰로 다시 피펫팅하였다. 세포(현재 2 x 106 세포/ml)를 2시간 동안 인큐베이션하여 형질도입을 허용한 다음, 1 ml 배지가 있는 24-웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 세포를 최대 2주 동안 배양하고, 2일(D2), 4일(D4), 7일(D7) 및 14일(D14)에 유세포분석으로 분석하였다. 게놈 DNA를 2일(D2)에 수집하여 컷팅 효율을 결정하고, 7일(D7)에 공여체 통합을 결정하였다.
NO-STIM(비분할) T-세포 표적화된 통합
Figure pct00002
Pan CD3+ T-세포를 StemCell Technologies 키트(17951)를 통해 분리하고, AIMV(Invitrogen 12055083) + 5% CTS 면역 세포 SR(Invitrogen A2596101)에서 IL-2 100 ng/ml(PeproTech), IL-7 100 ng/ml(PeproTech), IL-15 100 ng/ml(PeproTech), SCF 100 ng/ml(PeproTech), 및 FLT3L 100 ng/ml(PeproTech)와 함께 배양하였다.
VBL(CBGU004)의 NHEJ-TI 바이러스(서열 번호 6)는 50,000 vg/세포의 MOI에서 사용하고, VBL(CBGGU014)의 HDR-TI 바이러스(서열 번호 7)는 50,000 vg/세포의 MOI에서 사용하였다. RNP는 GeneArt v2 Cas9 1 pmol/10,000 세포 및 Synthego gRNA(서열 번호 8) 2.5 pmol/10,000 세포를 포함했다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권고에 따라 Primary Cell P3 뉴클레오펙터 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 EO-115와 함께 사용하였다.
세포 배양
본 실험에서, 조건 당 500만개의 세포(총 120만개의 세포)를 해동하고 DMSO를 세척하였다(5 ml 냉동 세포를 해동하고, 50 ml 배지에 희석함). 세포를 350 x g에서 10분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 튜브를 두드려 세포를 재현탁시켰다. 배지를 200만 내지 500만 세포/ml로 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다.
RNP 뉴클레오펙션
세포를 50 ml 원뿔형 튜브에 수집하고, 350 x g에서 10분 동안 원심분리한 후 RNP 복합체를 제조하였다. 이전에 분취된 RNP 복합체를 해동하고, P3 뉴클레오펙션 시약 + RNP 마스터 믹스 200:500 pmol Cas9:gRNA/50 μl 뉴클레오펙션 시약을 준비하였다. 50 μl의 뉴클레오펙션 시약을 적당한 조건에서 100-μl 뉴클레오펙션 큐벳에 분취하였다. 수집된 세포를 P3 뉴클레오펙션 시약에 2,000,000개 세포/50 μl로 재현탁하고, 50 μl 세포-함유 뉴클레오펙션 시약을 총 부피 100 μl에 대해 각 뉴클레오펙션 큐벳에 분배하였다.
바이러스성 형질도입
뉴클레오펙션 전에, 바이러스성 형질도입 배지를 준비하였다. 무혈청 배지의 바이러스-함유 마스터 믹스를 하기와 같이 준비했다: a. 50,000 vg/세포 바이러스에 900 μl 총 부피; b. 4800 μl(+ 추가)와 100억(vg + 추가). 배지-단독 대조군도 준비하였다. 900 μl 형질도입 배지 또는 대조군을 24-웰 플레이트의 웰에 분취하였다.
뉴클레오펙션 후, 약 500 μl의 형질도입 배지를 전달 피펫으로 흡인하고, 뉴클레오펙션 큐벳으로 부드럽게 옮겼다. 모든 형질도입 배지/뉴클레오펙션 배지 혼합물을 흡인하고, 24-웰 플레이트의 상응하는 웰로 다시 피펫팅하였다. 세포를 최대 2주 동안 배양하고, 2일(D2), 4일(D4), 7일(D7) 및 14일(D14)에 유세포분석으로 분석하였다. 게놈 DNA를 2일(D2)에 수집하여 컷팅 효율을 결정하고, 7일(D7)에 공여체 통합을 결정하였다.
결과는 도 3a, 3b, 4, 5a, 5b, 및 5c에 도시되어 있다. HDR-TI는 활성화된 T 세포에서 선호되는 반면(도 3a 및 3b), NHEJ-TI는 활성화되지 않은 T 세포에서 선호되었다(여기서 이들은 검출 가능한 HDR-TI가 아님; 도 5a 및 5b). 또한, 도 5c에 도시된 바와 같이, NHEJ-편집된 비활성화된 T 세포는 주로 CD4+였다(4.97% CD8+에 비해 91.1% CD4+).
실시예 3: CD34 세포에서 NHEJ-매개 TI 테스트.
본 연구는 인간 CD34+ 세포에서, 생체 내 공여체 절단이 있거나 없는 NHEJ-매개 표적화된 통합의 실행가능성을 결정하기 위해 수행되었다. 본 연구에서는, 조작 순서가 표적화된 통합의 수율 및 생존율/세포충실도에 영향을 미치는지 확인하기 위해 두 가지 프로토콜을 비교하였다. HSC는 2-컷 공여체(서열 번호 5) 또는 0-컷 공여체(서열 번호 4) 및 RNP를 운반하는 scAAV6으로 처리하였다.
Figure pct00003
조건 당(Stem Cell Technologies 또는 AllCells로부터) 20 만개의 CD34+ 세포가 사용되었다. scAAV6 0-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 4) 또는 2-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 5)(Vector Biolabs)를 20,000 vg/cell의 MOI에서 사용했다. RNP는 24 pmols Cas9(Feldan) 내지 120 pmols AAVS1 가이드 RNA(서열 번호 8)(Axolabs)를 포함했다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100과 함께 사용되었다.
세포 배양
분취된 배지 및 사이토카인은 사용 직전에 해동하였다. 해동된 사이토카인과 소분자를 StemSpan SFEM II에 첨가하여 37℃로 데워진 완전한 배지를 생성하였다. 200,000 개 세포/조건에 충분한 hCD34+ 바이알을 해동하고, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, 총 부피를 CD34+ 배양 배지를 사용하여 총량을 15 ml로 했다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 세포를 1 ml CD34+ 배양 배지에 재현탁시켰다. 저-결합 T75 플라스크(최대 200,000개 세포/ml)에서 총 부피를 적어도 20 ml로 늘리고, 세포를 적어도 24시간 동안 휴지시켰다.
RNP 뉴클레오펙션
Lonza 4D Nucleofector®를 각 웰에 적합한 프로그램과 함께 사용하였다. 뉴클레오펙션 완충액 P3을 보충제와 미리 혼합하고, Cas9:gRNA RNP를 이전에 설명한대로 제조하고, 10 μl/튜브로 분취하였다. 후속 실험을 위해 충분한 RNP를 해동시켰다. 세포를 1.5, 15 또는 50 ml 튜브에 수집하고, 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰고, 그 동안 상응하는 양의 RNP 또는 mRNA를 뉴클레오펙션 스트립의 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙션 시약을 최대 10 μl 부피까지 첨가했다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 세포 상청액을 흡인하거나 따라내고 세포를 완충액 P3 + 보충제의 샘플 당 ½ 부피로 재현탁한다. 뉴클레오펙션 시약의 세포 10 μl를 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙터를 제조업체의 프로토콜에 따라 실행한다. 뉴클레오펙션 후 사전-가온된 완전 배지 80 μl를 각 웰에 즉시 첨가하고, 준비된 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 부드럽게 피펫팅하였다.
AAV 감염
AAV를 얼음 위에서 해동시켰다. 해동된 사이토카인과 소분자를 StemSpan SFEM II에 추가하여 사용 직전에 완전한 배지를 생성하고 37℃로 가온시켰다. 세포를 15 ml 원뿔형 튜브에 수집하고 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 그 동안 AAV 희석액을 저-결합 단백질 튜브에서 제조하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 μl 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 준비하고, 상응하는 양의 AAV 희석물을 각 웰에 첨가하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 완전 배지 조건 수의 50 μl에 재현탁시켰다. 50 μl의 세포를 각 웰에 첨가하고, 세포를 가습된 37℃ 정상산소 인큐베이터에 2시간 동안 다시 두었다. 이어서 세포를 1.5 ml 멸균 에펜도르프 튜브에 수집하고, 90 x g에서 10분 동안 회전시켰으며, 그 동안 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.7 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 상층액을 따라내고, 세포를 300 μl 완전 배양 배지에 재현탁하고, 준비된 배양 플레이트로 옮겼다.
조건-특이적 프로토콜
프로토콜 1(P1)
프로토콜 1(P1)을 먼저 AAV 처리한 다음, RNP 처리로 수행하였다. 세포를 AAV로 처리하고, 2시간 후 1.5 ml 멸균 에펜도르프 튜브에 수집하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰으며, 그 동안 뉴클레오펙션 시약과 RNP가 준비되었으며, 웰당 900 μl 완전 배지가 있는 24-웰 배양 플레이트가 준비되었다. 세포를 20 μl P3 +/- RNP에 재현탁하고, 100 μl의 세포를 준비된 24-웰 배양 플레이트에 옮겼다. 세포는 2일마다 배지를 추가하면서 최대 +5일 동안 정상산소 배양기에서 배양하였다.
프로토콜 2(P2)
프로토콜 2(P2)를 먼저 RNP 처리한 다음, AAV 처리로 수행하였다. RNP와 함께 또는 없이 세포를 뉴클레오펙션하고, 100 μl의 세포를 준비된 배양 플레이트에 옮겼다. 세포를 1시간 동안 휴지시킨 다음, AAV로 2시간 동안 처리하였다. 그런 다음 세포를 수집하고, 회전시키고, 신선한 배지에 재현탁하고, 정상산소 인큐베이터에서 최대 +5일 동안 배양하고, 2일마다 배지를 추가하였다.
데이터 수집
TIDE 분석
세포를 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에 수집하였다. 그 후 세포를 헹구고, 남은 배지를 1 ml PBS와 함께 수집하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 따라내었다. 총 부피가 1.2 ml를 초과하면, 동일한 튜브에서 단계 1~4를 반복하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen DNeasy® 키트(카탈로그 번호 69506)를 사용하여 gDNA를 추출했다.
gDNA 샘플은 하기 매개변수와 함께 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 1 μl 프라이머 1 AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10), 1 μl 프라이머 2 AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11), 200 ng 게놈 DNA, 1 μl GC-인핸서, 및 H2O 최대 총 20 μl를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 1. 변성: 95℃ 00:010:00; 2. 변성: 95℃ 00:00:15; 3. 어닐링: 60℃ 00:00:15; 4. 연장: 72℃ 00:02:00; 반복 단계들 2~4 x35 사이클; 5. 최종 연장 72℃ 00:07:00; 6. 유지 12℃.
정제된 PCR 생성물을 하기와 같이 시퀀싱하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28106)를 사용하여 PCR 정리를 수행하였다. 정제된 PCR 생성물을 Sanger 시퀀싱을 위해 Sequetech에 제출하였다. 시퀀싱에 사용되는 중첩 프라이머: AAVS1 TIDE-4R: cctctccatcctcttgctttctttg(서열 번호 12); 및 AAVS1 TIDE-4F: aactgcttctcctcttgggaagt(서열 번호 13).
TSUNAMI Batch TIDE 분석(웹페이지 54.234.74.37/home/ 또는 54.158.189.0/home/)을 사용하여 CRISPR/Cas9 컷팅 효율에 대해 인델(INDEL) 분석을 수행하였다. 분석을 시작하기 위해 필요한 데이터 파일을 업로드하였다: CSV 파일 목록 - 헤더가 없는 4개의 열이 포함된 ".csv" 파일(샘플 이름 목록 - 산출 파일에서 라벨링에 사용됨; 예상 gRNA 서열 - PAM 서열의 바로 상류의 예상되는 gRNA 서열을 나타내는 20nt(5'-3') DNA 문자열(PAM은 포함되지 않음); 테스트 샘플 이름, 대조군 샘플 이름); 시퀀싱 파일(.ab1 또는 .scf 파일). 분석을 위해 하기 매개변수를 입력하였다. 왼쪽 경계: 기본값은 100 bp이며; 오른쪽 경계: 파단 부위에 기본 설정 - 10 bp; 분해 창: 분해에 사용되는 서열 세그먼트를 결정하며(기본 설정은 업로드된 서열에 대해 가능한 가장 큰 창이다); 인델(Indel) 크기 범위: 모델링할 인델의 최대 크기를 설정한다. 기본값은 10이며; P-값 임계 값: 기본값은 p<0.001이다. 그런 다음 결과를 생성하고, 산출의 품질 측정을 평가하고, 필요한 경우 매개변수를 조정하였다(파단 부위 이전의 평균 이상 서열 신호 <10%(대조군 및 테스트 샘플 모두); 분해 결과의 경우 R2>0.9). 참고문헌: Brinkman et al, Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16;42(22):e168. doi: 10.1093/nar/gku936.
통합 검출을 위한 인-아웃 PCR
TIDE 분석을 위해 추출된 동일한 gDNA를 통합 검출을 위한 인-아웃(in-out) PCR에 사용하였다. gDNA 샘플은 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 하기 프라이머 조합들 중 하나를 사용하여 PCR 증폭하였다: 5' 정배향 AB(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 3' 정배향 CV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 5' 역배향 AC(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 3' 역배향 BV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 100 ng 게놈 DNA; 1 μl GC-인핸서; 및 H2O 최대 총 20 μl.
TOPO-TA 클로닝
TOPO-TA 클로닝은 4 μl 인-아웃 PCR 앰플리콘, 1 μl 염 용액 및 1 μl TOPO-TA 벡터(pCR™ 2.1-TOPO® 벡터)를 사용하여 수행하였다. 반응물을 25℃에서 15분간 인큐베이션한 다음, 얼음 위에서 냉각시켰다.
TOP10 화학적 적격성 세포를 얼음 위에서 해동하고, 2 μl TOPO-TA 클로닝 생성물을 상기 해동된 TOP10 화학적 적격성 세포에 첨가하였다. 세포 현탁액을 부드럽게 두드려 혼합하고, 얼음 위에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 42℃에서 45초 동안 열 충격을 가했다. 이어서 세포를 얼음위에서 5분 동안 인큐베이션하고, 250 μl SOC 배지를 첨가하고, 세포를 박테리아 진탕기에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 150 μl의 세포를 X-gal-코팅된 카르베니실린 한천 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 성장 및 시퀀싱을 위해 흰색 콜로니를 선택했다.
유세포분석
세포를 세포 배양 플레이트로부터 5 ml FACS 튜브로 수집하고, 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 따라내었다. 세포 표면 항원에 대한 생존성 염료 및/또는 접합된 항체를 첨가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하고, 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 따라내고, 총 부피를 200 μl까지 늘리고, 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, Attune 고 처리량 시스템을 사용하여 실행했다.
결과는 도 6, 7a, 7b, 8a, 및 8b에 도시되어 있다. P1과 P2 모두 편집 효율은 2-컷 공여체의 경우 0-컷 공여체보다 높았고, P2는 해당 조건에서 P1에 비해 더 높은 편집 효율을 보였으며(도 6 및 7a), 공여체의 이점을 더욱 입증하였으며, RNP 처리에 이어 AAV 처리가 더 효율적인 표적화된 통합으로 이어진다는 것을 시사한다.
실시예 4: CD34 세포에서 NHEJ-매개 TI 시험: SCGM 대 SFEM-II 배지, 저산소증 대 정상산소증, D1-편집 대 D2-편집
본 연구는 인간 CD34+ 세포에서 생체 내 공여체 절단이 있거나 없는 NHEJ-매개 표적화된 통합의 실행가능성을 결정하기 위해 수행되었다. 여기에서는 배지 또는 O2 수준이 NHEJ-TI에 영향을 미치는지 조사했다. HDR-매개 표적화된 통합을 통해 편집하기 전에 48시간 동안 P2 및 P1 휴지 및 사전-자극 HSC 모두 1일(D1) 대 2일(D2) 휴지 기간 조건을 테스트하였다.
Figure pct00004
Figure pct00005
본 실험에서, 조건 당 200,000개의 CD34+ 세포(Stem Cell Technologies로부터 입수)를 사용하였다. 세포를 SCGM(CellGenix, GMP 등급) 또는 SFEM-II(Stem Cell Technologies)에서 SCF 100 ng/ml; TPO 100 ng/ml; FLT3L 100 ng/ml; 및 저산소 조건(5% O2, 5% CO2, 90% N2) 또는 정상산소 조건(ATM O2, 5% CO2, 90% N2)에서 IL6 100 ng/ml 와 함께 배양하였다.
RNP는 24 pmols Cas9(Feldan) 내지 120 pmols AAVS1 가이드 RNA(서열 번호 8)(Axolabs)를 포함했다. scAAV6 2-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 5)(Vector Biolabs)를 20,000 vg/세포의 MOI에서 사용하고 2 x 106 세포/ml에서 2 시간 인큐베이션한 다음 0.9ml 신선한 배지로 옮겼다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100과 함께 사용되었다.
세포 배양
분취된 배지 및 사이토카인은 사용 직전에 해동하였다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SCGM 또는 SFEM II에 첨가하여 37℃로 데워진 완전한 배지를 생성하였다. 200,000개 세포/조건들에 충분한 hCD34+ 바이알을 해동하고, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, CD34+ 배양 배지를 사용하여 총 부피를 15 ml로 했다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. 세포를 1 ml CD34+ 배양 배지에 재현탁시키고, 저-결합 T75 플라스크(최대 200,000개 세포/ml)에서 총 부피를 적어도 20 ml로 했다.
RNP 뉴클레오펙션
Lonza 4D Nucleofector®를 각 웰에 적합한 프로그램과 함께 사용하였다. 뉴클레오펙션 완충액 P3을 보충제와 미리 혼합하고, Cas9:gRNA RNP를 이전에 설명한대로 제조하고, 10 μl/튜브로 분취하였다(후속 실험을 위해 충분한 RNP를 해동시켰다). 세포를 1.5, 15 또는 50 ml 튜브에 수집하고, 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰고, 그 동안 상응하는 양의 RNP 또는 mRNA를 상기 뉴클레오펙션 스트립의 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙션 시약을 최대 10 μl 부피까지 첨가했다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 세포 상청액을 흡인하거나 따라내고, 세포를 완충액 P3 + 보충제의 샘플 당 ½ 부피로 재현탁하였다. 뉴클레오펙션 시약의 세포 10 μl를 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙터를 제조업체의 프로토콜에 따라 실행하였다. 뉴클레오펙션 후, 사전-가온된 완전 배지 80 μl를 각 웰에 즉시 첨가하고, 준비된 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 부드럽게 피펫팅하였다.
AAV 감염
AAV를 얼음 위에서 해동시켰다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SCGM 또는 SFEM II에 첨가하여 사용 직전에 완전한 배지를 생성하고, 37℃로 가온했으며, 그 동안 AAV 희석액을 저-결합 단백질 튜브에서 준비하였다. 96-웰 배양 플레이트를 준비하고, 80 μl 완전 배지 및 상응하는 양의 AAV 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 100 μl의 뉴클레오펙션된 세포(80 μl 구조 배지가 첨가됨)를 16-웰 스트립에서 준비된 배양 플레이트로 옮기고, 세포를 가습된 37℃ 저산소 인큐베이터에 2시간 동안 다시 두었다. 이어서 세포를 수집하고, 그 동안 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.7 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 재현탁하고, 준비된 24-웰 배양 플레이트로 옮겼다. 96-웰 배양 플레이트를 200 μl의 신선한 배지와 격렬한 피펫팅으로 세척하고, 배지를 24-웰 플레이트의 해당 웰로 옮겼다.
세포를 4일 동안 배양한 후, 1.5 ml 튜브에 수집하고, 펠릿화하였다. gDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Machery-Nagel 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 수집하였다.
TIDE 분석
세포를 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에 수집하였다. 그 후 세포를 헹구고, 남은 배지를 1 ml PBS와 함께 수집하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 따라내었다. 총 부피가 1.2 ml를 초과하면, 동일한 튜브에서 단계 1~4를 반복하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen DNeasy® 키트(카탈로그 번호 69506)를 사용하여 gDNA를 추출했다.
gDNA 샘플은 하기 매개변수와 함께 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 1 μl 프라이머 1 AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10), 1 μl 프라이머 2 AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11), 200 ng 게놈 DNA, 1 μl GC-인핸서, 및 H2O 최대 총 20 μl를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 1. 변성: 95℃ 00:010:00; 2. 변성: 95℃ 00:00:15; 3. 어닐링: 60℃ 00:00:15; 4. 연장: 72℃ 00:02:00(반복 단계들 2~4 x35 사이클); 5. 최종 연장 72℃ 00:07:00; 6. 유지 12℃.
정제된 PCR 생성물을 하기와 같이 시퀀싱하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28106)를 사용하여 PCR 정리를 수행하였다. 정제된 PCR 생성물을 Sanger 시퀀싱을 위해 Sequetech에 제출하였다. 시퀀싱에 사용되는 중첩 프라이머: AAVS1 TIDE-4R: cctctccatcctcttgctttctttg(서열 번호 12); 및 AAVS1 TIDE-4F: aactgcttctcctcttgggaagt(서열 번호 13).
TSUNAMI Batch TIDE 분석(웹페이지 54.234.74.37/home/ 또는 54.158.189.0/home/)을 사용하여 CRISPR/Cas9 컷팅 효율에 대해 인델(INDEL) 분석을 수행하였다. 분석을 시작하기 위해 필요한 데이터 파일을 업로드하였다: CSV 파일 목록 - 헤더가 없는 4개의 열이 포함된 ".csv" 파일(샘플 이름 목록 - 산출 파일에서 라벨링에 사용됨; 예상 gRNA 서열 - PAM 서열의 바로 상류의 예상되는 gRNA 서열을 나타내는 20nt(5'-3') DNA 문자열(PAM은 포함되지 않음); 테스트 샘플 이름, 대조군 샘플 이름); 시퀀싱 파일(.ab1 또는 .scf 파일). 분석을 위해 하기 매개변수를 입력하였다. 왼쪽 경계: 기본값은 100 bp이며; 오른쪽 경계: 파단 부위에 기본 설정 - 10 bp; 분해 창: 분해에 사용되는 서열 세그먼트를 결정하며(기본 설정은 업로드된 서열에 대해 가능한 가장 큰 창이다); 인델(Indel) 크기 범위: 모델링할 인델의 최대 크기를 설정한다. 기본값은 10이며; P-값 임계 값: 기본값은 p<0.001이다. 그런 다음 결과를 생성하고, 산출의 품질 측정을 평가하고, 필요한 경우 매개변수를 조정하였다(파단 부위 이전의 평균 이상 서열 신호 <10%(대조군 및 테스트 샘플 모두); 분해 결과의 경우 R2>0.9). 참고문헌: Brinkman et al, Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16;42(22):e168. doi: 10.1093/nar/gku936.
통합 검출을 위한 인-아웃 PCR
TIDE 분석을 위해 추출된 동일한 gDNA를 통합 검출을 위한 인-아웃(in-out) PCR에 사용하였다. gDNA 샘플은 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 하기 프라이머 조합들 중 하나를 사용하여 PCR 증폭하였다: 5' 정배향 AB(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 3' 정배향 CV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11) 1 μl; 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 5' 역배향 AC(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15) 1 μl); 3' 역배향 BV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 100 ng 게놈 DNA; 1 μl GC-인핸서; 및 H2O 최대 총 20 μl.
유세포분석
세포를 세포 배양 플레이트로부터 5 ml FACS 튜브로 수집하고, 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 따라내었다. 세포 표면 항원에 대한 생존성 염료 및/또는 접합된 항체를 첨가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하고, 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 따라내고, 총 부피를 200 μl까지 늘리고, 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, Attune 고 처리량 시스템을 사용하여 실행했다. 유세포분석 CD34 생체 외 패널은 CD34 BV510; CD90 PerCP-Cy5.5; CD38 APC; CD45RA PE; 및 Ghost Red 780 생존성 염료를 포함하였다.
결과는 도 9a, 9b, 9c, 9d, 10a, 10b, 11a, 11b, 11c, 11d, 12a, 12b, 및 12c에 도시되어 있다. SCGM 배지는 500 nm 범위의 이동을 일으켜, eGFP 및 CD34-BV510 채널의 음의 집단을 이동시켰다. 이것은 명확한 eGFP+ 세포 집단의 부족을 설명할 수 있다. 산소 수준은 편집 속도에 큰 영향을 미치지 않았다. 그러나, 저산소 조건은 세포 성장을 감소시키고, 가능하게는 세포 순환을 감소시켜 HSC가 더 휴지 상태임을 시사한다. LT-HSC 집단은 정상산소증에 비해 저산소증에 유지되었다. D1-편집은 D2-편집에 비해 약간의 이점을 나타냈다. HSC가 배양액에서 소모되는 시간을 줄이면 생착 잠재력을 유지할 수 있다. 오랜 기간 동안 배양된 HSC가 생착 잠재력을 잃는다는 것이 이전에 밝혀졌다. HDR-매개 표적화된 통합을 위해서는 2일 사전-자극이 필요했지만, HSC는 NHEJ-매개 TI에 대해 추가 하루가 필요하지 않은 것으로 보인다.
실시예 5: CD34 세포에서 NHEJ-매개 TI 테스트: H1-편집 대 D1-편집
본 연구는 인간 CD34+ 세포에서 생체 내 공여체 절단이 있거나 없는 NHEJ-매개 표적화된 통합의 실행가능성을 결정하기 위해 수행되었다. 이전에는 해동 후 24시간(D1) 사전-자극/구조 배양이 높은 생존율을 유지하면서 NHEJ-매개 표적화된 통합에 충분하다고 결정되었다. 이 연구에서는, 해동 후 24시간 구조 배양에 비해 해동 후 1시간(H1) 구조 배양이 효율적이고 실행가능한 NHEJ-매개 TI에 충분한 지 조사하였다.
Figure pct00006
본 실험에서, 조건 당 200,000개의 CD34+ 세포(Stem Cell Technologies로부터 입수)를 사용하였다. 세포를 저산소 조건(5% O2, 5% CO2, 90% N2)에서 SCF 100 ng/ml; TPO 100 ng/ml; FLT3L 100 ng/ml; 및 IL6 100 ng/ml 와 함께 SFEM-II(Stem Cell Technologies)에서 배양하였다.
RNP는 10:25 pmol 비율의 Cas9(GeneArt V2) 및 AAVS1 가이드 RNA(서열 번호 8)(Synthego)를 포함했다. scAAV6 0-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 4)(Vector Biolabs)를 20,000 vg/세포의 MOI에서 사용하고, 2 x 106 세포/ml에서 2시간 인큐베이션한 다음 0.9 ml 신선한 배지로 옮겼다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100과 함께 사용되었다.
세포 배양
H1-편집 조건의 경우, 해동 후 1 내지 2시간 후 아래에 기술된 바와 같이 세포를 조작하였다. D1-편집 조건의 경우, 해동 후 24시간 아래에 기술된 바와 같이 세포를 조작했다.
분취된 배지 및 사이토카인은 사용 직전에 해동하였다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 첨가하여 완전한 배지를 생성하고, 이를 37℃로 가온시켰다. 200,000개 세포/조건들에 충분한 hCD34+ 바이알을 해동하고, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, CD34+ 배양 배지를 사용하여 총 부피를 15 ml로 했다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. 세포를 1 ml CD34+ 배양 배지에 재현탁시키고, 저-결합 T75 플라스크(최대 200,000개 세포/ml)에서 총 부피를 적어도 20 ml로 했다.
RNP 뉴클레오펙션
Lonza 4D Nucleofector®를 각 웰에 적합한 프로그램과 함께 사용하였다. 뉴클레오펙션 완충액 P3을 보충제와 미리 혼합하고, Cas9:gRNA RNP를 이전에 설명한대로 제조하고, 10 μl/튜브로 분취하였다(후속 실험을 위해 충분한 RNP를 해동시켰다). 세포를 1.5, 15 또는 50 ml 튜브에 수집하고, 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰고, 그 동안 상응하는 양의 RNP 또는 mRNA를 상기 뉴클레오펙션 스트립의 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙션 시약을 최대 10 μl 부피까지 첨가했다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 세포 상청액을 흡인하거나 따라내고, 세포를 완충액 P3 + 보충제의 샘플 당 ½ 부피로 재현탁하였다. 뉴클레오펙션 시약의 세포 10 μl를 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙터를 제조업체의 프로토콜에 따라 실행하였다. 뉴클레오펙션 후, 사전-가온된 완전 배지 80 μl를 각 웰에 즉시 첨가하고, 준비된 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 부드럽게 피펫팅하였다.
AAV 감염
AAV를 얼음 위에서 해동시켰다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 추가하여 사용 직전에 완전한 배지를 생성하고 37℃로 가온했으며, 그 동안 AAV 희석액을 저-결합 단백질 튜브에서 준비하였다. 96-웰 배양 플레이트를 준비하고, 80 μl 완전 배지 및 상응하는 양의 AAV 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 100 μl의 뉴클레오펙션된 세포(80 μl 구조 배지가 첨가됨)를 16-웰 스트립에서 준비된 배양 플레이트로 옮기고, 세포를 가습된 37℃ 저산소 인큐베이터에 2시간 동안 다시 두었다. 이어서 세포를 수집하고, 그 동안 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.7 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 재현탁하고, 준비된 24-웰 배양 플레이트로 옮겼다. 96-웰 배양 플레이트를 200 μl의 신선한 배지와 격렬한 피펫팅으로 세척하고, 배지를 24-웰 플레이트의 해당 웰로 옮겼다.
세포를 4일 동안 배양한 후, 1.5 ml 튜브에 수집하고, 펠릿화하였다. gDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Machery-Nagel 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 수집하였다.
TIDE 분석
세포를 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에 수집하였다. 그 후 세포를 헹구고, 남은 배지를 1 ml PBS와 함께 수집하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 따라내었다. 총 부피가 1.2 ml를 초과하면, 동일한 튜브에서 단계 1~4를 반복하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen DNeasy® 키트(카탈로그 번호 69506)를 사용하여 gDNA를 추출했다.
gDNA 샘플은 하기 매개변수와 함께 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 1 μl 프라이머 1 AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10), 1 μl 프라이머 2 AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11), 200 ng 게놈 DNA, 1 μl GC-인핸서, 및 H2O 최대 총 20 μl를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 변성: 95℃ 00:010:00; 2. 변성: 95℃ 00:00:15; 3. 어닐링: 60℃ 00:00:15; 4. 연장: 72℃ 00:02:00(반복 단계들 2~4 x35 사이클); 5. 최종 연장 72℃ 00:07:00; 6. 유지 12℃.
정제된 PCR 생성물을 하기와 같이 시퀀싱하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28106)를 사용하여 PCR 정리를 수행하였다. 정제된 PCR 생성물을 Sanger 시퀀싱을 위해 Sequetech에 제출하였다. 시퀀싱에 사용되는 중첩 프라이머: AAVS1 TIDE-4R: cctctccatcctcttgctttctttg(서열 번호 12); 및 AAVS1 TIDE-4F: aactgcttctcctcttgggaagt(서열 번호 13).
TSUNAMI Batch TIDE 분석(웹페이지 54.234.74.37/home/ 또는 54.158.189.0/home/)을 사용하여 CRISPR/Cas9 컷팅 효율에 대해 인델(INDEL) 분석을 수행하였다. 분석을 시작하기 위해 필요한 데이터 파일을 업로드하였다: CSV 파일 목록 - 헤더가 없는 4개의 열이 포함된 ".csv" 파일(샘플 이름 목록 - 산출 파일에서 라벨링에 사용됨; 예상 gRNA 서열 - PAM 서열의 바로 상류의 예상되는 gRNA 서열을 나타내는 20nt(5'-3') DNA 문자열(PAM은 포함되지 않음); 테스트 샘플 이름, 대조군 샘플 이름); 시퀀싱 파일(.ab1 또는 .scf 파일). 분석을 위해 하기 매개변수를 입력하였다. 왼쪽 경계: 기본값은 100 bp이며; 오른쪽 경계: 파단 부위에 기본 설정 - 10 bp; 분해 창: 분해에 사용되는 서열 세그먼트를 결정하며(기본 설정은 업로드된 서열에 대해 가능한 가장 큰 창이다); 인델(Indel) 크기 범위: 모델링할 인델의 최대 크기를 설정한다. 기본값은 10이며; P-값 임계 값: 기본값은 p<0.001이다. 그런 다음 결과를 생성하고, 산출의 품질 측정을 평가하고, 필요한 경우 매개변수를 조정하였다(파단 부위 이전의 평균 이상 서열 신호 <10%(대조군 및 테스트 샘플 모두); 분해 결과의 경우 R2>0.9). 참고문헌: Brinkman et al, Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16;42(22):e168. doi: 10.1093/nar/gku936.
통합 검출을 위한 인-아웃 PCR
TIDE 분석을 위해 추출된 동일한 gDNA를 통합 검출을 위한 인-아웃(in-out) PCR에 사용하였다. gDNA 샘플은 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 하기 프라이머 조합들 중 하나를 사용하여 PCR 증폭하였다: 5' 정배향 AB(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 3' 정배향 CV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 5' 역배향 AC(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 3' 역배향 BV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 100 ng 게놈 DNA; 1 μl GC-인핸서; 및 H2O 최대 총 20 μl.
유세포분석
세포를 세포 배양 플레이트로부터 5 ml FACS 튜브로 수집하고, 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 따라내었다. 세포 표면 항원에 대한 생존성 염료 및/또는 접합된 항체를 첨가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하고, 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 따라내고, 총 부피를 200 μl까지 늘리고, 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, Attune 고 처리량 시스템을 사용하여 실행했다. 유세포분석 CD34 생체 외 패널은 CD34 BV510; CD90 PerCP-Cy5.5; CD38 APC; CD45RA PE; 및 Ghost Red 780 생존성 염료를 포함하였다.
결과는 도 13에 도시되어 있다. 해동 후 1시간 후에 편집된 세포는 약간 더 낮은 효율이기는 하지만 성공적인 NHEJ-매개 표적화된 통합의 증거를 보여주었다. 그러나, 세포가 D1에 비해 H1에서 편집되었을 때 상대 세포충실도 및 생존율이 약간 증가했다. 세포를 같은 날 해동, 편집 및 주입하는 프로토콜은 기술의 임상 적용을 단순화할 수 있다. 이는 HDR-매개 TI에 필요한 사전 자극 단계가 필요하지 않기 때문에 NHEJ-TI에 고유하다.
실시예 6: CD34 세포에서 NHEJ-매개 TI 테스트: 뉴클레오펙션 프로토콜(DZ-100 대 CA-137), Cas9 공급원(Aldevron SpyFi, GeneArt V2)
본 연구는 인간 CD34+ 세포에서 생체 내 공여체 절단이 있거나 없는 NHEJ-매개 표적화된 통합의 실행가능성을 결정하기 위해 수행되었다. 여기에서, Cas9의 공급원뿐만 아니라 뉴클레오펙션 프로토콜을 비교하였다.
Figure pct00007
본 실험에서, 조건 당 200,000개의 CD34+ 세포(Stem Cell Technologies로부터 입수)를 사용하였다. 세포를 저산소 조건(5% O2, 5% CO2, 90% N2)에서 SCF 100 ng/ml; TPO 100 ng/ml; FLT3L 100 ng/ml; 및 IL6 100 ng/ml 와 함께 SFEM-II(Stem Cell Technologies)에서 배양하였다.
RNP는 120 pmols AAVS1 가이드 RNA(서열 번호 8)(Synthego)에 대한 24 pmols Cas9(GeneArt V2 대 Aldevron SpyFi)를 포함했다. scAAV6 2-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 5)(Vector Biolabs)를 20,000 vg/세포의 MOI에서 사용하고 2 x 106 세포/ml에서 2 시간 인큐베이션한 다음 0.9ml 신선한 배지로 옮겼다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100 또는 CA-137과 함께 사용되었다.
세포 배양
분취된 배지 및 사이토카인은 사용 직전에 해동하였다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 첨가하여 완전한 배지를 생성하고, 이를 37℃로 가온시켰다. 200,000개 세포/조건들에 충분한 hCD34+ 바이알을 해동하고, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, CD34+ 배양 배지를 사용하여 총 부피를 15 ml로 했다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. 세포를 1 ml CD34+ 배양 배지에 재현탁시키고, 저-결합 T75 플라스크(최대 200,000개 세포/ml)에서 총 부피를 적어도 20 ml로 했다.
RNP 뉴클레오펙션
Lonza 4D Nucleofector®를 각 웰에 적합한 프로그램과 함께 사용하였다. 뉴클레오펙션 완충액 P3을 보충제와 미리 혼합하고, Cas9:gRNA RNP를 이전에 설명한대로 제조하고, 10 μl/튜브로 분취하였다(후속 실험을 위해 충분한 RNP를 해동시켰다). 세포를 1.5, 15 또는 50 ml 튜브에 수집하고, 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰고, 그 동안 상응하는 양의 RNP 또는 mRNA를 상기 뉴클레오펙션 스트립의 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙션 시약을 최대 10 μl 부피까지 첨가했다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 세포 상청액을 흡인하거나 따라내고, 세포를 완충액 P3 + 보충제의 샘플 당 ½ 부피로 재현탁하였다. 뉴클레오펙션 시약의 세포 10 μl를 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙터를 제조업체의 프로토콜에 따라 실행하였다. 뉴클레오펙션 후, 사전-가온된 완전 배지 80 μl를 각 웰에 즉시 첨가하고, 준비된 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 부드럽게 피펫팅하였다.
AAV 감염
AAV를 얼음 위에서 해동시켰다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 추가하여 사용 직전에 완전한 배지를 생성하고 37℃로 가온했으며, 그 동안 AAV 희석액을 저-결합 단백질 튜브에서 준비하였다. 96-웰 배양 플레이트를 준비하고, 80 μl 완전 배지 및 상응하는 양의 AAV 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 100 μl의 뉴클레오펙션된 세포(80 μl 구조 배지가 첨가됨)를 16-웰 스트립에서 준비된 배양 플레이트로 옮기고, 세포를 가습된 37℃ 저산소 인큐베이터에 2시간 동안 다시 두었다. 이어서 세포를 수집하고, 그 동안 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.7 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 재현탁하고, 준비된 24-웰 배양 플레이트로 옮겼다. 96-웰 배양 플레이트를 200 μl의 신선한 배지와 격렬한 피펫팅으로 세척하고, 배지를 24-웰 플레이트의 해당 웰로 옮겼다.
세포를 4일 동안 배양한 후, 1.5 ml 튜브에 수집하고, 펠릿화하였다. gDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Machery-Nagel 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 수집하였다.
TIDE 분석
세포를 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에 수집하였다. 그 후 세포를 헹구고, 남은 배지를 1 ml PBS와 함께 수집하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 따라내었다. 총 부피가 1.2 ml를 초과하면, 동일한 튜브에서 단계 1~4를 반복하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen DNeasy® 키트(카탈로그 번호 69506)를 사용하여 gDNA를 추출했다.
gDNA 샘플은 하기 매개변수와 함께 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 1 μl 프라이머 1 AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10), 1 μl 프라이머 2 AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11), 200 ng 게놈 DNA, 1 μl GC-인핸서, 및 H2O 최대 총 20 μl를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 1. 변성: 95℃ 00:010:00; 2. 변성: 95℃ 00:00:15; 3. 어닐링: 60℃ 00:00:15; 4. 연장: 72℃ 00:02:00(반복 단계들 2~4 x35 사이클); 5. 최종 연장 72℃ 00:07:00; 6. 유지 12℃.
정제된 PCR 생성물을 하기와 같이 시퀀싱하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28106)를 사용하여 PCR 정리를 수행하였다. 정제된 PCR 생성물을 Sanger 시퀀싱을 위해 Sequetech에 제출하였다. 시퀀싱에 사용되는 중첩 프라이머: AAVS1 TIDE-4R: cctctccatcctcttgctttctttg(서열 번호 12); 및 AAVS1 TIDE-4F: aactgcttctcctcttgggaagt(서열 번호 13).
TSUNAMI Batch TIDE 분석(웹페이지 54.234.74.37/home/ 또는 54.158.189.0/home/)을 사용하여 CRISPR/Cas9 컷팅 효율에 대해 인델(INDEL) 분석을 수행하였다. 분석을 시작하기 위해 필요한 데이터 파일을 업로드하였다: CSV 파일 목록 - 헤더가 없는 4개의 열이 포함된 ".csv" 파일(샘플 이름 목록 - 산출 파일에서 라벨링에 사용됨; 예상 gRNA 서열 - PAM 서열의 바로 상류의 예상되는 gRNA 서열을 나타내는 20nt(5'-3') DNA 문자열(PAM은 포함되지 않음); 테스트 샘플 이름, 대조군 샘플 이름); 시퀀싱 파일(.ab1 또는 .scf 파일). 분석을 위해 하기 매개변수를 입력하였다. 왼쪽 경계: 기본값은 100 bp이며; 오른쪽 경계: 파단 부위에 기본 설정 - 10 bp; 분해 창: 분해에 사용되는 서열 세그먼트를 결정하며(기본 설정은 업로드된 서열에 대해 가능한 가장 큰 창이다); 인델(Indel) 크기 범위: 모델링할 인델의 최대 크기를 설정한다. 기본값은 10이며; P-값 임계 값: 기본값은 p<0.001이다. 그런 다음 결과를 생성하고, 산출의 품질 측정을 평가하고, 필요한 경우 매개변수를 조정하였다(파단 부위 이전의 평균 이상 서열 신호 <10%(대조군 및 테스트 샘플 모두); 분해 결과의 경우 R2>0.9). 참고문헌: Brinkman et al, Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16;42(22):e168. doi: 10.1093/nar/gku936.
통합 검출을 위한 인-아웃 PCR
TIDE 분석을 위해 추출된 동일한 gDNA를 통합 검출을 위한 인-아웃(in-out) PCR에 사용하였다. gDNA 샘플은 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 하기 프라이머 조합들 중 하나를 사용하여 PCR 증폭하였다: 5' 정배향 AB(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 3' 정배향 CV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 5' 역배향 AC(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 3' 역배향 BV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 100 ng 게놈 DNA; 1 μl GC-인핸서; 및 H2O 최대 총 20 μl.
유세포분석
세포를 세포 배양 플레이트로부터 5 ml FACS 튜브로 수집하고, 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 따라내었다. 세포 표면 항원에 대한 생존성 염료 및/또는 접합된 항체를 첨가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하고, 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 따라내고, 총 부피를 200 μl까지 늘리고, 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, Attune 고 처리량 시스템을 사용하여 실행했다. 유세포분석 CD34 생체 외 패널은 CD34 BV510; CD90 PerCP-Cy5.5; CD38 APC; CD45RA PE; 및 Ghost Red 780 생존성 염료를 포함하였다.
결과는 도 14a, 14b, 14c, 및 15에 도시되어 있다. DZ-100 뉴클레오펙션 프로그램은 CA-137 뉴클레오펙션 프로그램보다 더 잘 수행되었다. 편집 효율은 DZ-100을 사용했을 때 상당히 높았지만, 세포의 절대 세포충실도는 크게 다르지 않았다. GeneArt V2 Cas9는 Aldevron의 SpyFi Cas9보다 성능이 뛰어났다. GeneArt V2 Cas9에서는 편집 효율성이 훨씬 더 높았지만 SpyFi는 생존율을 개선하지 못했다.
실시예 7: CD34 세포에서 NHEJ-매개 TI 테스트: RNP 및 AAV 적정
본 연구는 인간 CD34+ 세포에서 생체 내 공여체 절단이 있거나 없는 NHEJ-매개 표적화된 통합의 실행가능성을 결정하기 위해 수행되었다. NHEJ-매개 TI 효율을 유지하면서 생존율을 높이기 위해 RNP 수준과 AAV 수준을 적정하였다.
Figure pct00008
본 실험에서, 조건 당 200,000개의 CD34+ 세포(Stem Cell Technologies로부터 입수)를 사용하였다. 세포를 저산소 조건(5% O2, 5% CO2, 90% N2)에서 SCF 100 ng/ml; PO 100 ng/ml; FLT3L 100 ng/ml; 및 IL6 100 ng/ml 와 함께 SFEM-II(Stem Cell Technologies)에서 배양하였다.
RNP는 1) Lo: 10:50 pmols; 또는 2) Hi: 20:100 pmols의 Cas9(GeneArt V2):AAVS1 가이드 RNA(서열 번호 8)(Synthego)를 포함했다. scAAV6 2-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 5)(Vector Biolabs)를 1) Lo: 20,000 vg/세포; 또는 2) Hi: 60,000 vg/세포의 MOI에서 사용하고 2 x 106 세포/ml에서 2 시간 인큐베이션한 다음 0.9ml 신선한 배지로 옮겼다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100과 함께 사용되었다.
세포 배양
분취된 배지 및 사이토카인은 사용 직전에 해동하였다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 첨가하여 완전한 배지를 생성하고, 이를 37℃로 가온시켰다. 200,000개 세포/조건들에 충분한 hCD34+ 바이알을 해동하고, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, CD34+ 배양 배지를 사용하여 총 부피를 15 ml로 했다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. 세포를 1 ml CD34+ 배양 배지에 재현탁시키고, 저-결합 T75 플라스크(최대 200,000개 세포/ml)에서 총 부피를 적어도 20 ml로 했다.
RNP 뉴클레오펙션
Lonza 4D Nucleofector®를 각 웰에 적합한 프로그램과 함께 사용하였다. 뉴클레오펙션 완충액 P3을 보충제와 미리 혼합하고, Cas9:gRNA RNP를 이전에 설명한대로 제조하고, 10 μl/튜브로 분취하였다(후속 실험을 위해 충분한 RNP를 해동시켰다). 세포를 1.5, 15 또는 50 ml 튜브에 수집하고, 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰고, 그 동안 상응하는 양의 RNP 또는 mRNA를 상기 뉴클레오펙션 스트립의 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙션 시약을 최대 10 μl 부피까지 첨가했다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 세포 상청액을 흡인하거나 따라내고, 세포를 완충액 P3 + 보충제의 샘플 당 ½ 부피로 재현탁하였다. 뉴클레오펙션 시약의 세포 10 μl를 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙터를 제조업체의 프로토콜에 따라 실행하였다. 뉴클레오펙션 후, 사전-가온된 완전 배지 80 μl를 각 웰에 즉시 첨가하고, 준비된 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 부드럽게 피펫팅하였다.
AAV 감염
AAV를 얼음 위에서 해동시켰다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 추가하여 사용 직전에 완전한 배지를 생성하고 37℃로 가온했으며, 그 동안 AAV 희석액을 저-결합 단백질 튜브에서 준비하였다. 96-웰 배양 플레이트를 준비하고, 80 μl 완전 배지 및 상응하는 양의 AAV 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 100 μl의 뉴클레오펙션된 세포(80 μl 구조 배지가 첨가됨)를 16-웰 스트립에서 준비된 배양 플레이트로 옮기고, 세포를 가습된 37℃ 저산소 인큐베이터에 2시간 동안 다시 두었다. 이어서 세포를 수집하고, 그 동안 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.7 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 재현탁하고, 준비된 24-웰 배양 플레이트로 옮겼다. 96-웰 배양 플레이트를 200 μl의 신선한 배지와 격렬한 피펫팅으로 세척하고, 배지를 24-웰 플레이트의 해당 웰로 옮겼다.
세포를 4일 동안 배양한 후, 1.5 ml 튜브에 수집하고, 펠릿화하였다. gDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Machery-Nagel 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 수집하였다.
TIDE 분석
세포를 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에 수집하였다. 그 후 세포를 헹구고, 남은 배지를 1 ml PBS와 함께 수집하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 따라내었다. 총 부피가 1.2 ml를 초과하면, 동일한 튜브에서 단계 1~4를 반복하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen DNeasy® 키트(카탈로그 번호 69506)를 사용하여 gDNA를 추출했다.
gDNA 샘플은 하기 매개변수와 함께 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 1 μl 프라이머 1 AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10), 1 μl 프라이머 2 AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11), 200 ng 게놈 DNA, 1 μl GC-인핸서, 및 H2O 최대 총 20 μl를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 1. 변성: 95℃ 00:010:00; 2. 변성: 95℃ 00:00:15; 3. 어닐링: 60℃ 00:00:15; 4. 연장: 72℃ 00:02:00(반복 단계들 2~4 x35 사이클); 5. 최종 연장 72℃ 00:07:00; 6. 유지 12℃.
정제된 PCR 생성물을 하기와 같이 시퀀싱하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28106)를 사용하여 PCR 정리를 수행하였다. 정제된 PCR 생성물을 Sanger 시퀀싱을 위해 Sequetech에 제출하였다. 시퀀싱에 사용되는 중첩 프라이머: AAVS1 TIDE-4R: cctctccatcctcttgctttctttg(서열 번호 12); 및 AAVS1 TIDE-4F: aactgcttctcctcttgggaagt(서열 번호 13).
TSUNAMI Batch TIDE 분석(웹페이지 54.234.74.37/home/ 또는 54.158.189.0/home/)을 사용하여 CRISPR/Cas9 컷팅 효율에 대해 인델(INDEL) 분석을 수행하였다. 분석을 시작하기 위해 필요한 데이터 파일을 업로드하였다: CSV 파일 목록 - 헤더가 없는 4개의 열이 포함된 ".csv" 파일(샘플 이름 목록 - 산출 파일에서 라벨링에 사용됨; 예상 gRNA 서열 - PAM 서열의 바로 상류의 예상되는 gRNA 서열을 나타내는 20nt(5'-3') DNA 문자열(PAM은 포함되지 않음); 테스트 샘플 이름, 대조군 샘플 이름); 시퀀싱 파일(.ab1 또는 .scf 파일). 분석을 위해 하기 매개변수를 입력하였다. 왼쪽 경계: 기본값은 100 bp이며; 오른쪽 경계: 파단 부위에 기본 설정 - 10 bp; 분해 창: 분해에 사용되는 서열 세그먼트를 결정하며(기본 설정은 업로드된 서열에 대해 가능한 가장 큰 창이다); 인델(Indel) 크기 범위: 모델링할 인델의 최대 크기를 설정한다. 기본값은 10이며; P-값 임계 값: 기본값은 p<0.001이다. 그런 다음 결과를 생성하고, 산출의 품질 측정을 평가하고, 필요한 경우 매개변수를 조정하였다(파단 부위 이전의 평균 이상 서열 신호 <10%(대조군 및 테스트 샘플 모두); 분해 결과의 경우 R2>0.9). 참고문헌: Brinkman et al, Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16;42(22):e168. doi: 10.1093/nar/gku936.
통합 검출을 위한 인-아웃 PCR
TIDE 분석을 위해 추출된 동일한 gDNA를 통합 검출을 위한 인-아웃(in-out) PCR에 사용하였다. gDNA 샘플은 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 하기 프라이머 조합들 중 하나를 사용하여 PCR 증폭하였다: 5' 정배향 AB(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 3' 정배향 CV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11) 1 μl; 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 5' 역배향 AC(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15) 1 μl); 3' 역배향 BV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 100 ng 게놈 DNA; 1 μl GC-인핸서; 및 H2O 최대 총 20 μl.
유세포분석
세포를 세포 배양 플레이트로부터 5 ml FACS 튜브로 수집하고, 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 따라내었다. 세포 표면 항원에 대한 생존성 염료 및/또는 접합된 항체를 첨가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하고, 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 따라내고, 총 부피를 200 μl까지 늘리고, 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, Attune 고 처리량 시스템을 사용하여 실행했다. 유세포분석 CD34 생체 외 패널은 CD34 BV510; CD90 PerCP-Cy5.5; CD38 APC; CD45RA PE; 및 Ghost Red 780 생존성 염료를 포함하였다.
결과는 도 16에 도시되어 있다. 감소된 RNP 레벨은 편집 효율을 감소시켰다. 증가된 AAV 수준은 증가된 수준의 RNP와 함께 사용될 때 효율성을 상당히 증가시켰고, 상대 생존율을 감소시키지 않았다.
실시예 8: 2-컷 공여체의 표적 공여체 통합의 PCR 분석
이 연구는 인간 CD34+ 세포에서 표적 공여체 통합을 매개하는데 Cas9/gRNA RNP에 대한 요건들을 결정하기 위해 수행되었다.
본 실험에서, 조건 당 200,000개의 CD34+ 세포를 사용하였다. 세포를 저산소 조건(5% O2, 5% CO2, 90% N2)에서 SCF 100 ng/ml; TPO 100 ng/ml; FLT3L 100 ng/ml; 및 IL6 100 ng/ml 와 함께 SFEM-II(Stem Cell Technologies)에서 배양하였다.
RNP는 Cas9 (GeneArt V2):AAVS1 가이드 RNA(Synthego)를 20:50 pmol의 비율로 포함했다. Ad5/35 2-컷 NHEJ 벡터(Welgen Inc)를 5000 vp/세포의 MOI에서 2 x 106 세포/ml에서 2시간 배양하여 사용했다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100과 함께 사용되었다.
RNP 뉴클레오펙션 및 바이러스 감염은 전술한 바와 같이 수행하였다. 통합 검출을 위한 인-아웃 PCR 분석은 뉴클레오펙션 및 Ad5/35 처리 7일 후에 수행하였다.
결과는 도 17에 도시되어 있다. 모든 샘플은 아웃-아웃 밴드를 가졌지만, Ad5/35 및 RNP 뉴클레오펙션으로 처리된 샘플만이 인-아웃 PCR 밴드에 의해 입증된 바와 같이 이식유전자의 통합을 보여주었다.
실시예 9: CD34 세포에서 NHEJ-매개 TI 테스트: 배양 조건 - 매트릭스 단백질
이전 실시예는 CD34 HSC에서 NHEJ-매개 표적화된 통합을 위한 전체적으로 최적화된 편집 조건을 보여준다. 배양 조건은 HDR에 최적화되어, HSC에서 세포 순환이 필요했다. 그러나, HSC에서 세포 증식을 유도하면 일반적으로 분화가 유도되어, LT-HSC의 분획이 고갈된다. NHEJ-매개 TI는 세포가 순환하고 성장할 필요가 없다. 여기에서는 매트릭스 단백질이 효율적인 표적화된 통합을 유지LT-HSC 표현형을 유지할 수 있는지 여부를 조사했다. NOTCH 신호전달 유도를 위한 테나신 C, 매트릭스 단백질 및 DLL1-Fc 코팅의 사용을 조사하였다. 이 두 가지 요인은 골수 니쉐(niche), HSC 개발 및 유지와 관련이 있다.
Figure pct00009
본 실험에서, 조건 당 200,000개의 CD34+ 세포(Stem Cell Technologies로부터 입수)를 사용하였다. 세포를 저산소 조건(5% O2, 5% CO2, 90% N2)에서 SCF 100 ng/ml; TPO 100 ng/ml; FLT3L 100 ng/ml; 및 IL6 100 ng/ml 와 함께 SFEM-II(Stem Cell Technologies)에서 배양하였다.
배양 플레이트(조직 배양-처리된 24-웰 플레이트)는 하기와 같이 준비하였다. 1. 대조군 플레이트(저-부착 플레이트). 2. 테나신-C: 1 μg/cm2(EMD Millipore); 3. DLL1-Fc: 1 μg/cm2(R&D Systems); 4. 테나신-C: 1 μg/cm2(EMD Millipore) + DLL1-Fc: 1 μg/cm2(R&D Systems).
RNP는 Cas9(GeneArt V2):AAVS1 가이드 RNA(서열 번호 8)(Synthego)를 10:25 pmol의 비율로 포함했다. scAAV6 0-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 4)(Vector Biolabs)를 20,000 vg/세포의 MOI에서 사용하고, 2 x 106 세포/ml에서 2시간 인큐베이션한 다음 0.9 ml 신선한 배지로 옮겼다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100과 함께 사용되었다.
세포 배양
테나신 C로 코팅된 세포 배양 플레이트를 하기와 같이 준비하였다. 해동된 테나신 C 100 μg을 차가운 PBS 24 ml에 희석하고, 0.22 μm PVDF 막으로 여과하여 멸균하고, PBS-TenC 혼합물 0.5 ml/웰을 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 파라필름으로 덮고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBS-TenC 혼합물은 사용 직전에 흡인되었다.
DLL1-Fc로 코팅된 세포 배양 플레이트를 하기와 같이 준비하였다. DLL1-Fc는 12 ml의 차가운 PBS에 50 μg의 DLL1-Fc를 희석하여 PBS(제조업체의 프로토콜)에서 재구성하고, PBS-DLL1-Fc 혼합물 0.5 ml/웰을 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 파라필름으로 덮고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBS-DLL1-Fc 혼합물은 사용 직전에 흡인되었다.
테나신 C 및 DLL1-Fc로 코팅된 세포 배양 플레이트를 하기와 같이 준비하였다. 해동된 테나신 C 50 μg을 12 ml 차가운 PBS에 희석하고 0.22 μm PVDF 막으로 여과하여 멸균하였다. 재구성된 DLL1-Fc 50 μg을 첨가하고, PBS-TenC-DLL1-Fc 혼합물 0.5 ml/웰을 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 파라필름으로 덮고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBS-TenC-DLL1-Fc 혼합물은 사용 직전에 흡인되었다.
분취된 배지 및 사이토카인은 사용 직전에 해동하였다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 첨가하여 완전한 배지를 생성하고, 이를 37℃로 가온시켰다. 200,000개 세포/조건들에 충분한 hCD34+ 바이알을 해동하고, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, CD34+ 배양 배지를 사용하여 총 부피를 15 ml로 했다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. 세포를 1 ml CD34+ 배양 배지에 재현탁시키고, 저-결합 T75 플라스크(최대 200,000개 세포/ml)에서 총 부피를 적어도 20 ml로했다.
RNP 뉴클레오펙션
Lonza 4D Nucleofector®를 각 웰에 적합한 프로그램과 함께 사용하였다. 뉴클레오펙션 완충액 P3을 보충제와 미리 혼합하고, Cas9:gRNA RNP를 이전에 설명한대로 제조하고, 10 μl/튜브로 분취하였다(후속 실험을 위해 충분한 RNP를 해동시켰다). 세포를 1.5, 15 또는 50 ml 튜브에 수집하고, 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰고, 그 동안 상응하는 양의 RNP 또는 mRNA를 상기 뉴클레오펙션 스트립의 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙션 시약을 최대 10 μl 부피까지 첨가했다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 세포 상청액을 흡인하거나 따라내고, 세포를 완충액 P3 + 보충제의 샘플 당 ½ 부피로 재현탁하였다. 뉴클레오펙션 시약의 세포 10 μl를 각 웰에 첨가하고, 뉴클레오펙터를 제조업체의 프로토콜에 따라 실행하였다. 뉴클레오펙션 후, 사전-가온된 완전 배지 80 μl를 각 웰에 즉시 첨가하고, 준비된 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 부드럽게 피펫팅하였다.
AAV 감염
AAV를 얼음 위에서 해동시켰다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 추가하여 사용 직전에 완전한 배지를 생성하고 37℃로 가온했으며, 그 동안 AAV 희석액을 저-결합 단백질 튜브에서 준비하였다. 96-웰 배양 플레이트를 준비하고, 80 μl 완전 배지 및 상응하는 양의 AAV 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 100 μl의 뉴클레오펙션된 세포(80 μl 구조 배지가 첨가됨)를 16-웰 스트립에서 준비된 배양 플레이트로 옮기고, 세포를 가습된 37℃ 저산소 인큐베이터에 2시간 동안 다시 두었다. 이어서 세포를 수집하고, 그 동안 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.7 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 재현탁하고, 준비된 24-웰 배양 플레이트로 옮겼다. 96-웰 배양 플레이트를 200 μl의 신선한 배지와 격렬한 피펫팅으로 세척하고, 배지를 24-웰 플레이트의 해당 웰로 옮겼다.
세포를 4일 동안 배양한 후, 1.5 ml 튜브에 수집하고, 펠릿화하였다. gDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Machery-Nagel 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 수집하였다.
TIDE 분석
세포를 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에 수집하였다. 그 후 세포를 헹구고, 남은 배지를 1 ml PBS와 함께 수집하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 따라내었다. 총 부피가 1.2 ml를 초과하면, 동일한 튜브에서 단계 1~4를 반복하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen DNeasy® 키트(카탈로그 번호 69506)를 사용하여 gDNA를 추출했다.
gDNA 샘플은 하기 매개변수와 함께 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 1 μl 프라이머 1 AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10), 1 μl 프라이머 2 AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11), 200 ng 게놈 DNA, 1 μl GC-인핸서, 및 H2O 최대 총 20 μl를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 1. 변성: 95℃ 00:010:00; 2. 변성: 95℃ 00:00:15; 3. 어닐링: 60℃ 00:00:15; 4. 연장: 72℃ 00:02:00(반복 단계들 2~4 x35 사이클); 5. 최종 연장 72℃ 00:07:00; 6. 유지 12℃.
정제된 PCR 생성물을 하기와 같이 시퀀싱하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28106)를 사용하여 PCR 정리를 수행하였다. 정제된 PCR 생성물을 Sanger 시퀀싱을 위해 Sequetech에 제출하였다. 시퀀싱에 사용되는 중첩 프라이머: AAVS1 TIDE-4R: cctctccatcctcttgctttctttg(서열 번호 12); 및 AAVS1 TIDE-4F: aactgcttctcctcttgggaagt(서열 번호 13).
TSUNAMI Batch TIDE 분석(웹페이지 54.234.74.37/home/ 또는 54.158.189.0/home/)을 사용하여 CRISPR/Cas9 컷팅 효율에 대해 인델(INDEL) 분석을 수행하였다. 분석을 시작하기 위해 필요한 데이터 파일을 업로드하였다: CSV 파일 목록 - 헤더가 없는 4개의 열이 포함된 ".csv" 파일(샘플 이름 목록 - 산출 파일에서 라벨링에 사용됨; 예상 gRNA 서열 - PAM 서열의 바로 상류의 예상되는 gRNA 서열을 나타내는 20nt(5'-3') DNA 문자열(PAM은 포함되지 않음); 테스트 샘플 이름, 대조군 샘플 이름); 시퀀싱 파일(.ab1 또는 .scf 파일). 분석을 위해 하기 매개변수를 입력하였다. 왼쪽 경계: 기본값은 100 bp이며; 오른쪽 경계: 파단 부위에 기본 설정 - 10 bp; 분해 창: 분해에 사용되는 서열 세그먼트를 결정하며(기본 설정은 업로드된 서열에 대해 가능한 가장 큰 창이다); 인델(Indel) 크기 범위: 모델링할 인델의 최대 크기를 설정한다. 기본값은 10이며; P-값 임계 값: 기본값은 p<0.001이다. 그런 다음 결과를 생성하고, 산출의 품질 측정을 평가하고, 필요한 경우 매개변수를 조정하였다(파단 부위 이전의 평균 이상 서열 신호 <10%(대조군 및 테스트 샘플 모두); 분해 결과의 경우 R2>0.9). 참고문헌: Brinkman et al, Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16;42(22):e168. doi: 10.1093/nar/gku936.
통합 검출을 위한 인-아웃 PCR
TIDE 분석을 위해 추출된 동일한 gDNA를 통합 검출을 위한 인-아웃(in-out) PCR에 사용하였다. gDNA 샘플은 10 μl AmpliTaq Gold® 360 2x Master Mix, 하기 프라이머 조합들 중 하나를 사용하여 PCR 증폭하였다: 5' 정배향 AB(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 3' 정배향 CV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11) 1 μl; 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15)); 5' 역배향 AC(1 μl 프라이머 A: AAVS1-아웃사이드F(cggaactctgccctctaacg, 서열 번호 10); 1 μl 프라이머 C: IntAmp2(CGTAAACGGCCACAAGTTCA, 서열 번호 15) 1 μl); 3' 역배향 BV(1 μl 프라이머 V: AAVS1-아웃사이드R(ctgggataccccgaagagtg, 서열 번호 11); 1 μl 프라이머 B: IntAmp1(GATGGGGGTGTTCTGCTGG, 서열 번호 14)); 100 ng 게놈 DNA; 1 μl GC-인핸서; 및 H2O 최대 총 20 μl.
유세포분석
세포를 세포 배양 플레이트로부터 5 ml FACS 튜브로 수집하고, 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하였다. 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 따라내었다. 세포 표면 항원에 대한 생존성 염료 및/또는 접합된 항체를 첨가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 최대 4 ml의 FACS 완충액을 첨가하고, 세포를 350 x g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 따라내고, 총 부피를 200 μl까지 늘리고, 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, Attune 고 처리량 시스템을 사용하여 실행했다. 유세포분석 CD34 생체 외 패널은 CD34 BV510; CD90 PerCP-Cy5.5; CD38 APC; CD45RA PE; 및 Ghost Red 780 생존성 염료를 포함하였다.
결과는 도 18a 및 18b에 도시되어 있다. 매트릭스 단백질에서 세포를 배양하는 것은 대조군 세포에 비해 편집된 세포의 생존율과 절대 세포충실도를 증가시키지 않았다. 흥미롭게도, DLL1-Fc에서 배양된 세포는 LT-HSC 표현형(CD34+CD91+CD45RA-CD38-)을 가진 세포 수를 유지했다. 테나신 C의 효과는 DLL1-Fc의 효과를 무효화했다. DLL1-Fc와 테나신 C는 NHEJ-매개 표적화된 통합 효율에 영향을 미치지 않았다.
실시예 10: NHEJ-TI 생착 연구 2
본 연구는 인간 CD34+ 세포에서 생체 내 공여체 절단이 있거나 없는 NHEJ-매개 표적화된 통합의 실행가능성을 결정하기 위해 수행되었다. 여기서, 주입 전 세포 내 공여체 절단이 있거나 없는, NHEJ-TI에 의해 변형된 CD34+ HSC의 생착 잠재력을 조사했다.
본 연구에서는 총 20마리의 마우스를 하기 조건에서 사용하였다. 배양 대조군: 마우스 3마리; RNP 단독: 마우스 3마리; scAAV6 0-컷 단독: 마우스 3마리; scAAV6 2-컷 단독 마우스: 마우스 3마리; RNP + scAAV6 0-컷: 마우스 4마리; 및 RNP + scAAV6 2-컷: 마우스 4마리.
500,000 CD34+ 세포/마우스(Stem Cell Technologies로부터 입수)를 사용하고, 세포를 저산소 조건(5% O2, 5% CO2, 90% N2)에서 SCF 100 ng/ml; TPO 100 ng/ml; FLT3L 100 ng/ml; 및 IL6 100 ng/ml 와 함께 SFEM-II(Stem Cell Technologies)에서 배양하였다.
RNP는 50:250 pmol의 비율로 Cas9(GeneArt V2):AAVS1 가이드 RNA(서열 번호 8)(Synthego)를 포함했다. scAAV6 0-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 4)(Vector Biolabs) 또는 scAAV6 2-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 5)(Vector Biolabs)를 2 x 106 세포/ml로 2시간 배양하면서 60,000 vg/세포의 MOI로 사용하였다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100과 함께 사용되었다.
실험 타임라인은 하기와 같다. 0일(D0)-세포가 해동됨: 1,000만 동원된 CD34+ HSC(Stem Cell Technologies). 1일(D1)-세포를 조작했다: RNP의 뉴클레오펙션 및 scAAV6 감염. 2일(D2) - 마우스에 주입했다: 마우스를 아침에 200 cGy로 조사한 다음, 오후에 주입했다. 6주차 - 중간 수혈을 수행한다. 9주차 - 중간 수혈을 수행한다. 13주차 - 중간 수혈을 수행한다. 16주차 - 종말점 분석.
세포 배양
분취된 배지 및 사이토카인은 사용 직전에 해동하였다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 첨가하여 완전한 배지를 생성하고, 이를 37℃로 가온시켰다. 500,000 개 세포/조건에 충분한 hCD34+ 바이알을 해동하고, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, CD34+ 배양 배지를 사용하여 총 부피를 15 ml로 했다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. 세포를 1 ml CD34+ 배양 배지에 재현탁시키고, 저-결합 T75 플라스크(최대 200,000개 세포/ml)에서 총 부피를 적어도 20 ml로 했다.
RNP 뉴클레오펙션
Lonza 4D Nucleofector®를 각 웰에 적합한 프로그램과 함께 사용하였다. 뉴클레오펙션 완충액 P3을 보충제와 미리 혼합하고, Cas9:gRNA RNP를 이전에 설명한대로 제조하고, 10 μl/튜브로 분취하였다(후속 실험을 위해 충분한 RNP를 해동시켰다). 세포를 50 ml 튜브에 수집하고, 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰고, 그 동안 상응하는 양의 RNP를 각각의 뉴클레오펙션 큐벳에 첨가하고, 뉴클레오펙션 시약을 최대 50 μl 부피까지 첨가했다. 각 조건에 대해 각각의 T25 플라스크에 5 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 세포 상청액을 흡인하거나 따라내고, 세포를 완충액 P3 + 보충제의 샘플 당 ½ 부피로 재현탁하였다. 뉴클레오펙션 시약의 세포 50 μl를 각 큐벳에 첨가하고, 뉴클레오펙터를 제조업체의 프로토콜에 따라 실행하였다. 뉴클레오펙션 후, 사전-가온된 완전 배지 500 μl를 각 큐벳에 즉시 첨가하고, 준비된 배양 플라스크에 세포를 부드럽게 피펫팅하였다.
AAV 감염
AAV를 얼음 위에서 해동시켰다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 추가하여 사용 직전에 완전한 배지를 생성하고 37℃로 가온했으며, 그 동안 AAV 희석액을 저-결합 단백질 튜브에서 준비하였다. 배양 플라스크는 750 μl 또는 1 ml 완전 배지 및 상응하는 양의 AAV 희석액을 T75 플라스크에 첨가하여 제조하였다. 600 μl의 뉴클레오펙션된 세포(500 μl 구조 배지가 추가됨)를 뉴클레오펙션 플라스크에서 준비된 AAV 감염 배양 플라스크로 옮기고, 세포를 다시 가습된 37℃ 저산소 인큐베이터에 6시간 동안 두었다. 이어서 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, 90 x g에서 10분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 세포를 7.5 ml 또는 10 ml에 재현탁하고, 밤새 계속 배양하기 위해 T75 플라스크로 옮기고, 분취량의 세포를 보존하여, 분석 편집을 위한 배양을 계속하였다.
세포를 15 ml 원뿔형 튜브에 수집하고, 펠릿화하고, 상청액을 흡인시키고, 세포를 165 μl 또는 220 μl 주입 완충액(PBS + 0.5% BSA)에 재현탁시켰다. 10 μl 분취량의 세포를 1:100으로 희석하고, Vi-Cell을 사용하여 카운팅하였다. 나머지 세포는 주입할 때까지 얼음에 보관했다. 조작 중 세포 해동에서 주입 준비까지의 세포 손실 수준은 예상보다 높았으며 각 마우스는 최대 200,000개의 세포만 받았다.
세포의 편집 효율은 하기와 같다:
D2 eGFP 수준: 배양 대조군: 0.31% eGFP+; RNP 단독: 0.21% eGFP+; scAAV6 0-컷 단독: 0.28% eGFP+; scAAV6 2-컷 단독: 1.29% eGFP+; RNP+scAAV6 0-컷: 1.10% eGFP+; RNP+scAAV6 2-컷: 2.93% eGFP+.
D3 eGFP 수준: 배양 대조군: 0.064% eGFP+; RNP 단독: 0.17% eGFP+; scAAV6 0-컷 단독: 0.32% eGFP+; scAAV6 2-컷 단독: 0.71% eGFP+; RNP+scAAV6 0-컷: 1.64% eGFP+; RNP+scAAV6 2-컷: 4.14% eGFP+.
D4 eGFP 수준: 배양 대조군: 0.24% eGFP+; RNP 단독: 0.38% eGFP+; scAAV6 0-컷 단독: 0.35% eGFP+; scAAV6 2-컷 단독: 0.53% eGFP+; RNP+scAAV6 0-컷: 1.67% eGFP+; RNP+scAAV6 2-컷: 4.49% eGFP+.
이들 데이터는 공여체 절단을 사용할 때 개선된 편집 효율을 추가로 입증한다.
scAAV6 0-컷 또는 scAAV6 2-컷의 NHEJ-매개 표적화된 통합에 의해 D1에 편집된 인간 CD34+ 세포를 D2에 주입한 마우스의 말초 혈액으로부터의 0, 6, 9, 13 및 16주에 hCD45+ 세포(상단 패널) 및 GFP+ 세포(하단 패널)에 대해, 결과가 도 19에 도시되어 있으며, 이는 주입 후 16주까지 RNP + scAAV6 2-컷으로 처리된 세포가 주입된 마우스에서 GFP+ 세포의 지속성을 입증하였으며, 편집된 세포가 장기 생착 HSC임을 시사한다. 도 20a는 마우스의 골수로부터 16주에 hCD45+ 세포(상단 패널) 및 GFP+ 세포(하단 패널)에 대한 결과를 보여주며, 이 시점에서 RNP + scAAV6 2-컷으로 처리된 세포가 주입된 마우스에서 GFP+ 세포의 지속성을 추가로 입증하였다. 도 20b는 16주에 마우스 골수로부터의 총 CD45+ 세포의 백분율로서 hCD34+, hCD3+, hCD33+, hCD19+, 및 다른 hCD45+ 세포의 상대적인 양에 대한 결과를 보여주며, 이 시점에서 RNP + scAAV6 2-컷으로 처리된 세포가 주입된 마우스에서 hCD45+ 세포의 가장 큰 부분집단이 CD33+였음을 입증하였다. 결과는 놀랍고, 트랜스제닉 분획이 종종 급격히 감소하는 HSPC에서 HDR-매개 표적화된 통합에서 일반적으로 볼 수 있는 것과 다르다.
실시예 11: NHEJ-TI 생착 연구 3
본 연구에서, NHEJ-매개 표적화된 통합 프로토콜이 더욱 최적화되었다. NHEJ-TI에 의해 변형된 CD34+ HSC의 생착 잠재력을 평가하여 조작 중 세포 손실을 설명했다. DLL1-Fc 및 해동-편집-주입 조건에서 배양된 CD34+ HSC의 생착 잠재력도 평가하였다.
본 실험에서는 36마리의 마우스를 사용하였다: 1) PBS 대조군: 마우스 3마리; 2) 배양 대조군: 마우스 3 마리; 3) RNP 단독: 마우스 3마리; 4) scAAV6 0-컷 단독: 마우스 3마리; 5) scAAV6 2-컷 단독: 마우스 3마리; 6) RNP + scAAV6 0-컷: 마우스 4마리; 7) RNP + scAAV6 2-컷: 마우스 4마리; 8) DLL1 코팅된 플레이트상에서 RNP + scAAV6 2-컷: 마우스 4마리; 9) 신선한 해동: 마우스 3마리; 10) RNP + scAAV6 2-컷(D0 편집 - 해동 - 주입): 마우스 4마리.
백만개의 CD34+ 세포/마우스(Stem Cell Technologies로부터 입수)를 D1+1 조건에 사용하였다. 160만개의 CD34+ 세포/마우스를 해동하여 세포 손실을 설명했다. 500,000개의 CD34+ 세포/마우스를 신선한 해동 및 배양 대조군 조건에 사용했다. 세포를 저산소 조건(5% O2, 5% CO2, 90% N2)에서, SCF 100 ng/ml; TPO 100 ng/ml; FLT3L 100 ng/ml; 및 IL6 100 ng/ml 와 함께 SFEM-II(Stem Cell Technologies)에서 배양하였다.
RNP는 50:250 pmol의 비율로 Cas9(Feldan):AAVS1 가이드 RNA(서열 번호 8)(Synthego)를 포함했다. scAAV6 0-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 4)(Vector Biolabs) 및 scAAV6 2-컷 NHEJ 벡터(서열 번호 5)(Vector Biolabs)를 50,000 vg/cell의 MOI에서 2 x 106 세포/ml에서의 2시간 배양과 함께 사용하였다.
Lonza 4D Nucleofector®는 제조업체의 권장에 따라 Primary Cell P3 Nucleofector 용액(Lonza V4XP-3032) 및 뉴클레오펙션 프로토콜 DZ-100 또는 CA-137과 함께 사용되었다.
연구에 사용된 실험 타임 라인은 하기와 같다. 0일(D0): 세포가 해동됨; D1+1 주입: 4천만 CD34+ 세포(GCSF-동원). 1일(D1): D1+1 세포가 조작됨; RNP 및 scAAV6 감염의 뉴클레오펙션. 2일(D2): 마우스에 주입함; 아침 - 마우스에 200 cGy 조사; D0 해동-편집-주입 조건: 세포가 조작됨; 오후 - D1+1 조건: 마우스에 주입함; D0 조건: 마우스에 주입하였다. 8, 10, 12, 및 14주: 중간 수혈. 16주차: 종점 분석.
세포 배양
분취된 배지 및 사이토카인은 사용 직전에 해동하였다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 첨가하여 완전한 배지를 생성하고, 이를 37℃로 가온시켰다. 1,600,000개 세포/조건에 충분한 hCD34+ 바이알을 해동하고, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, CD34+ 배양 배지를 사용하여 총 부피를 15 ml로 했다. 세포를 90 x g에서 9분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. 세포를 1 ml CD34+ 배양 배지에 재현탁시키고, 저-결합 T75 플라스크(최대 250,000개 세포/ml)에서 총 부피를 적어도 20 ml로 했다.
RNP 뉴클레오펙션
Lonza 4D Nucleofector®를 각 웰에 적합한 프로그램과 함께 사용하였다. 뉴클레오펙션 완충액 P3을 보충제와 미리 혼합하고, Cas9:gRNA RNP를 이전에 설명한대로 제조하고, 10 μl/튜브로 분취하였다(후속 실험을 위해 충분한 RNP를 해동시켰다). 세포를 50 ml 튜브에 수집하고, 100 μl(총 1:100)의 세포를 취하여 1 ml(1:10 희석)로 희석하여, Vi-Cell XR을 사용하여 생존율 및 세포 농도를 측정하였다. 세포를 90 x g에서 10분 동안 회전시켰고, 그 동안 상응하는 양의 RNP를 각각의 뉴클레오펙션 큐벳에 첨가하고, 뉴클레오펙션 시약을 최대 50 μl 부피까지 첨가했다. 각 조건에 대해 각각의 T25 플라스크에 5 ml 완전 배지를 첨가하여 배양 플레이트를 제조하였다. 세포 상청액을 흡인하거나 따라내고, 세포를 완충액 P3 + 보충제의 샘플 당 ½ 부피로 재현탁하였다. 뉴클레오펙션 시약의 세포 50 μl를 각 큐벳에 첨가하고, 뉴클레오펙터를 제조업체의 프로토콜에 따라 실행하였다. 뉴클레오펙션 후, 사전-가온된 완전 배지 500 μl를 각 큐벳에 즉시 첨가하고, 준비된 배양 플라스크에 세포를 부드럽게 피펫팅하였다.
AAV 감염
AAV를 얼음 위에서 해동시켰다. 해동된 사이토카인과 소분자를 SFEM II에 추가하여 사용 직전에 완전한 배지를 생성하고 37℃로 가온했으며, 그 동안 AAV 희석액을 저-결합 단백질 튜브에서 준비하였다. 배양 플라스크는 750 μl 또는 1 ml 완전 배지 및 상응하는 양의 AAV 희석액을 T75 플라스크에 첨가하여 제조하였다. 600 μl의 뉴클레오펙션된 세포(500 μl 구조 배지가 추가됨)를 뉴클레오펙션 플라스크에서 준비된 AAV 감염 배양 플라스크로 옮기고, 세포를 다시 가습된 37℃ 저산소 인큐베이터에 6시간 동안 두었다. 이어서 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, 90 x g에서 10분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 세포를 7.5 ml 또는 10 m 배지l에 재현탁하고, 밤새 계속 배양하기 위해 T75 플라스크로 옮기고, 분취량의 세포를 보존하여, 분석 편집을 위한 배양을 계속하였다.
세포를 15 ml 원뿔형 튜브에 수집하고, 펠릿화하고, 상청액을 흡인시키고, 세포를 165 μl 또는 220 μl 주입 완충액(PBS + 0.5% BSA)에 재현탁시켰다. 10 μl 분취량의 세포를 1:100으로 희석하고, Vi-Cell을 사용하여 카운팅하였다. 나머지 세포는 주입할 때까지 얼음에 보관했다.
DLL1-Fc 조건 특이적 프로토콜: 1) T75 플라스크를 실시예 9에서 이전에 기재된 바와 같이 DLL1-Fc로 코팅하였다; 2) 세포를 해동하고 DLL1-Fc 코팅된 플레이트에서 하룻밤 배양하였다; 3) 조작을 위해 세포를 분리하기 위해, 상층액을 수집하고, 플레이트를 세척하고, PBS 중 1 mM EDTA로 5분 동안 2회 인큐베이션하였다; 4) 세포를 상기 기재된 바와 같이 편집하였다; 5) RNP 뉴클레오펙션 후, AAV 감염을 새로운 DLL1-Fc 코팅된 T75 플라스크에서 수행하였다; 6) 세포를 하룻밤 배양하였다; 7) 상기 기재된 주입을 위해 세포를 준비하였으나, 다시 플레이트를 세척하고, PBS 중 1 mM EDTA에서 5분 동안 2회 인큐베이션하였다.
해동-편집-주입 조건 특이적 프로토콜: 1) 세포를 주사 당일 해동시켰다; 2) 세포를 저 부착 T75 플라스크에서 완전한 배지에서 1시간 동안 휴지시켰다; 3) 세포를 상기 기재된 바와 같이 조작하였다; 4) AAV 감염 2시간 후, 세포를 희석하지 않고 수집하여 주입을 위해 준비하였다.
각 마우스는 필요한 수의 세포(배양 대조군 및 신선한 해동을 위한 500,000개 세포/마우스, 다른 조건의 경우 1,000,000개 세포/마우스)를 받았다. 결과는 도 21, 22a~22d, 23a~23d, 24a~24d, 25a~25d, 26a~26d, 27a, 27b, 28a~28c, 및 29a~29c에 도시되어 있다.
세포의 초기 편집 효율은 하기와 같았다: 배양 대조군: 0.01% GFP+; RNP 단독: 0.62% GFP+; AAV 0-컷 단독: 0.42% GFP+; AAV2-컷 단독: 0.73% GFP+; AAV 0-컷 + RNP: 1.54% GFP+; AAV 2-컷 + RNP: 3.07% GFP+; AAV2-컷 + RNP + DLL1-Fc: 2.49% GFP+; 신선한 해동: 0.24% GFP+; 신선한 해동 AAV 2-컷 + RNP: 2.58% GFP+, 배양 대조군, RNP 단독, AAV 0-컷 단독, AAV 2-컷 단독, 및 신선한 해동 조건들의 GFP+ 신호의 백분율은 배경 소음이다. 이들 데이터는 공여체 절단을 사용할 때 개선된 편집 효율을 추가로 입증한다.
16주 후 골수 생착 백분율: 배양 대조군: 38% ± 27% hCD45+; RNP 단독: 37% ± 25% hCD45+; AAV 0-컷 단독: 19% ± 8.4% hCD45+; AAV 2-컷 단독: 23% ± 17% hCD45+; AAV 0-컷 + RNP: 18% ± 11% hCD45+; AAV 2-컷 + RNP: 15% ± 6.7% hCD45+; AAV 2-컷 + RNP + DLL1-Fc: 35% ± 19% hCD45+; 신선한 해동: 38% ± 6.6% hCD45+; 신선한 해동 AAV 2-컷 + RNP: 47% ± 12% hCD45+. 16주에 hCD45+ 세포의 가장 많은 양의 생착은 AAV 2-컷 + RNP를 사용한 신선한 해동 조건에서 관찰되었다.
16주 후 골수 GFP + 백분율: 배양 대조군: 0.30% ± 0.19% GFP+; RNP 단독: 0.76% ± 0.14% GFP+; AAV 0-컷 단독: 0.64% ± 0.33% GFP+; AAV 2-컷 단독: 0.70% ± 0.013% GFP+; AAV 0-컷 + RNP: 1.36% ± 0.077% GFP+; AAV 2-컷 + RNP: 4.1% ± 0.90% GFP+; AAV 2-컷 + RNP + DLL1-Fc: 3.6% ± 1.9% GFP+; 신선한 해동: 0.66% ± 0.039% GFP+; 신선한 해동 AAV 2-컷 + RNP: 2.4% ± 1.7% GFP+, 배양 대조군, RNP 단독, AAV 0-컷 단독, AAV 2-컷 단독, 및 신선한 해동 조건들의 GFP+ 신호의 백분율은 배경 소음이다. 16주에 가장 많은 양의 GFP+ 세포가 AAV 2-컷 + RNP 조건에서 관찰되었다. 도 29b에 도시된 바와 같이, 말초 출혈로부터의 hCD45+ 세포의 분획으로서 GFP+ 세포의 양은 NHEJ-매개 편집을 위해 RNP + AAV로 처리된 세포가 주입된 마우스에서 16주까지 일정하게 유지되었으며, 이는 편집된 HSC가 장기 생착 HSC임을 입증했다.
Figure pct00010
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SEQUENCE LISTING <110> Casebia Therapeutics Cost, Gregory J. Uenishi, Gene I. <120> Compositions and Methods for NHEJ-Mediated Genome Editing <130> 052984-528001WO <150> 62/752,959 <151> 2018-10-30 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1511 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> 0-cut SA-GFP expression cassette <400> 1 cctgcactac cagagctaac tcactgacct cttctcttcc tcccacaggg cctcgagaga 60 tctggcagcg gaggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 120 gaggagaacc ctggacctac cggtatgcct gaaccctcta agtctgctcc cgccccgaaa 180 aagggctcca agaaggcggt gactaaggcg cagaagaaag gcggcaagaa gcgcaagcgc 240 agccgcaagg agagctattc catctatgtg tacaaggttc tgaagcaggt ccaccctgac 300 accggcattt cgtccaaggc catgggcatc atgaattcgt ttgtgaacga cattttcgag 360 cgcatcgcag gtgaggcttc ccgcctggcg cattacaaca agcgctcgac catcacctcc 420 agggagatcc agacggccgt gcgcctgctg ctgcctgggg agttggccaa gcacgccgtg 480 tccgagggta ctaaggccgt caccaagtac accagcgcta aggacatggt gagcaagggc 540 gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 600 cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 660 aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 720 acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 780 aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttctttaa ggatgacggc 840 aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 900 ctgaagggca tcgactttaa agaggacggg aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 960 tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1020 ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 1080 aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 1140 tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 1200 accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaacatat ggctgatcag 1260 cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 1320 tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 1380 attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 1440 aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctacc tgcactacca 1500 gagctaactc a 1511 <210> 2 <211> 1511 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> 1-cut SA-GFP expression cassette <400> 2 cctatcctgt ccctagtggc cccctgacct cttctcttcc tcccacaggg cctcgagaga 60 tctggcagcg gaggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 120 gaggagaacc ctggacctac cggtatgcct gaaccctcta agtctgctcc cgccccgaaa 180 aagggctcca agaaggcggt gactaaggcg cagaagaaag gcggcaagaa gcgcaagcgc 240 agccgcaagg agagctattc catctatgtg tacaaggttc tgaagcaggt ccaccctgac 300 accggcattt cgtccaaggc catgggcatc atgaattcgt ttgtgaacga cattttcgag 360 cgcatcgcag gtgaggcttc ccgcctggcg cattacaaca agcgctcgac catcacctcc 420 agggagatcc agacggccgt gcgcctgctg ctgcctgggg agttggccaa gcacgccgtg 480 tccgagggta ctaaggccgt caccaagtac accagcgcta aggacatggt gagcaagggc 540 gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 600 cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 660 aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 720 acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 780 aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttctttaa ggatgacggc 840 aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 900 ctgaagggca tcgactttaa agaggacggg aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 960 tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1020 ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 1080 aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 1140 tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 1200 accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaacatat ggctgatcag 1260 cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 1320 tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 1380 attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 1440 aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctacc tgcactacca 1500 gagctaactc a 1511 <210> 3 <211> 1511 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> 2-cut SA-GFP expression cassette <400> 3 cctatcctgt ccctagtggc cccctgacct cttctcttcc tcccacaggg cctcgagaga 60 tctggcagcg gaggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 120 gaggagaacc ctggacctac cggtatgcct gaaccctcta agtctgctcc cgccccgaaa 180 aagggctcca agaaggcggt gactaaggcg cagaagaaag gcggcaagaa gcgcaagcgc 240 agccgcaagg agagctattc catctatgtg tacaaggttc tgaagcaggt ccaccctgac 300 accggcattt cgtccaaggc catgggcatc atgaattcgt ttgtgaacga cattttcgag 360 cgcatcgcag gtgaggcttc ccgcctggcg cattacaaca agcgctcgac catcacctcc 420 agggagatcc agacggccgt gcgcctgctg ctgcctgggg agttggccaa gcacgccgtg 480 tccgagggta ctaaggccgt caccaagtac accagcgcta aggacatggt gagcaagggc 540 gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 600 cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 660 aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 720 acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 780 aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttctttaa ggatgacggc 840 aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 900 ctgaagggca tcgactttaa agaggacggg aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 960 tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1020 ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 1080 aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 1140 tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 1200 accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaacatat ggctgatcag 1260 cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 1320 tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 1380 attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 1440 aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctacc tatcctgtcc 1500 ctagtggccc c 1511 <210> 4 <211> 1892 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> 0-cut SA-GFP scAAV <400> 4 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggacg 120 cgtaggccta agcttggtac cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgc 180 ccttctttga gttagctctg gtagtgcagg tagagcccac cgcatcccca gcatgcctgc 240 tattgtcttc ccaatcctcc cccttgctgt cctgccccac cccacccccc agaatagaat 300 gacacctact cagacaatgc gatgcaattt cctcatttta ttaggaaagg acagtgggag 360 tggcaccttc cagggtcaag gaaggcacgg gggaggggca aacaacagat ggctggcaac 420 tagaaggcac agtcgaggct gatcagccat atgttacttg tacagctcgt ccatgccgag 480 agtgatcccg gcggcggtca cgaactccag caggaccatg tgatcgcgct tctcgttggg 540 gtctttgctc agggcggact gggtgctcag gtagtggttg tcgggcagca gcacggggcc 600 gtcgccgatg ggggtgttct gctggtagtg gtcggcgagc tgcacgctgc cgtcctcgat 660 gttgtggcgg atcttgaagt tcaccttgat gccgttcttc tgcttgtcgg ccatgatata 720 gacgttgtgg ctgttgtagt tgtactccag cttgtgcccc aggatgttcc cgtcctcttt 780 aaagtcgatg cccttcagct cgatgcggtt caccagggtg tcgccctcga acttcacctc 840 ggcgcgggtc ttgtagttgc cgtcatcctt aaagaagatg gtgcgctcct ggacgtagcc 900 ttcgggcatg gcggacttga agaagtcgtg ctgcttcatg tggtcggggt agcggctgaa 960 gcactgcacg ccgtaggtca gggtggtcac gagggtgggc cagggcacgg gcagcttgcc 1020 ggtggtgcag atgaacttca gggtcagctt gccgtaggtg gcatcgccct cgccctcgcc 1080 ggacacgctg aacttgtggc cgtttacgtc gccgtccagc tcgaccagga tgggcaccac 1140 cccggtgaac agctcctcgc ccttgctcac catgtcctta gcgctggtgt acttggtgac 1200 ggccttagta ccctcggaca cggcgtgctt ggccaactcc ccaggcagca gcaggcgcac 1260 ggccgtctgg atctccctgg aggtgatggt cgagcgcttg ttgtaatgcg ccaggcggga 1320 agcctcacct gcgatgcgct cgaaaatgtc gttcacaaac gaattcatga tgcccatggc 1380 cttggacgaa atgccggtgt cagggtggac ctgcttcaga accttgtaca catagatgga 1440 atagctctcc ttgcggctgc gcttgcgctt cttgccgcct ttcttctgcg ccttagtcac 1500 cgccttcttg gagccctttt tcggggcggg agcagactta gagggttcag gcataccggt 1560 aggtccaggg ttctcctcca cgtctccagc ctgcttcagc aggctgaagt tagtagctcc 1620 gcttcctccg ctgccagatc tctcgaggcc ctgtgggagg aagagaagag gtcagtgagt 1680 tagctctggt agtgcaggta ccaagggcga attctgcaga tatccatcac actggcttaa 1740 ttaagggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc 1800 gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 1860 agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca gg 1892 <210> 5 <211> 1895 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> 2-cut SA-GFP scAAV <400> 5 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60 gcccgggctt tgcccgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggacg 120 cgtaggccta agcttggtac cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgc 180 ccttggtacc tatcctgtcc ctagtggccc cctgacctct tctcttcctc ccacagggcc 240 tcgagagatc tggcagcgga ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg 300 gagacgtgga ggagaaccct ggacctaccg gtatgcctga accctctaag tctgctcccg 360 ccccgaaaaa gggctccaag aaggcggtga ctaaggcgca gaagaaaggc ggcaagaagc 420 gcaagcgcag ccgcaaggag agctattcca tctatgtgta caaggttctg aagcaggtcc 480 accctgacac cggcatttcg tccaaggcca tgggcatcat gaattcgttt gtgaacgaca 540 ttttcgagcg catcgcaggt gaggcttccc gcctggcgca ttacaacaag cgctcgacca 600 tcacctccag ggagatccag acggccgtgc gcctgctgct gcctggggag ttggccaagc 660 acgccgtgtc cgagggtact aaggccgtca ccaagtacac cagcgctaag gacatggtga 720 gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg 780 taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc 840 tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 900 ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 960 acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttctttaagg 1020 atgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc 1080 gcatcgagct gaagggcatc gactttaaag aggacgggaa catcctgggg cacaagctgg 1140 agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca 1200 aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 1260 accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 1320 gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 1380 agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taacatatgg 1440 ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 1500 gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 1560 tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 1620 caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctaccta 1680 tcctgtccct agtggcccca agcttaaggg cgaattctgc agatatccat cacactggct 1740 taattaaggg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg 1800 ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 1860 ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcagg 1895 <210> 6 <211> 1613 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> 2-cut SA-tNGFR scAAV <400> 6 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggacg 120 cgtaggccta agcttggtac cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgc 180 ccttggtacc tatcctgtcc ctagtggccc cctgacctct tctcttcctc ccacagggcc 240 tcgagagatc tggcagcgga ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg 300 gagacgtgga ggagaaccct ggacctaccg gtatgggggc aggtgccacc ggccgcgcca 360 tggacgggcc gcgcctgctg ctgttgctgc ttctgggggt gtcccttgga ggtgccaagg 420 aggcatgccc cacaggcctg tacacacaca gcggtgagtg ctgcaaagcc tgcaacctgg 480 gcgagggtgt ggcccagcct tgtggagcca accagaccgt gtgtgagccc tgcctggaca 540 gcgtgacgtt ctccgacgtg gtgagcgcga ccgagccgtg caagccgtgc accgagtgcg 600 tggggctcca gagcatgtcg gcgccgtgcg tggaggccga cgacgccgtg tgccgctgcg 660 cctacggcta ctaccaggat gagacgactg ggcgctgcga ggcgtgccgc gtgtgcgagg 720 cgggctcggg cctcgtgttc tcctgccagg acaagcagaa caccgtgtgc gaggagtgcc 780 ccgacggcac gtattccgac gaggccaacc acgtggaccc gtgcctgccc tgcaccgtgt 840 gcgaggacac cgagcgccag ctccgcgagt gcacacgctg ggccgacgcc gagtgcgagg 900 agatccctgg ccgttggatt acacggtcca cacccccaga gggctcggac agcacagccc 960 ccagcaccca ggagcctgag gcacctccag aacaagacct catagccagc acggtggcag 1020 gtgtggtgac cacagtgatg ggcagctccc agcccgtggt gacccgaggc accaccgaca 1080 acctcatccc tgtctattgc tccatcctgg ctgctgtggt tgtgggcctt gtggcctaca 1140 tagccttctg acatatggct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 1200 tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 1260 ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 1320 tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 1380 tgcggtgggc tctacctatc ctgtccctag tggccccaag cttaagggcg aattctgcag 1440 atatccatca cactggctta attaagggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 1500 tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc 1560 gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 1613 <210> 7 <211> 3591 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> HDR-TI SA-GFP ssAAV <400> 7 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggccaat tcagtcgata actataacgg tcctaaggta 180 gcgatttaaa tacgcgctct cttaaggtag ccccgggacg cgtcaattga gatctggatc 240 cggtacctgc actaccagag ctaactcatg ctttctctga ccagcattct ctcccctggg 300 cctgtgccgc tttctgtctg cagcttgtgg cctgggtcac ctctacggct ggcccagatc 360 cttccctgcc gcctccttca ggttccgtct tcctccactc cctcttcccc ttgctctctg 420 ctgtgttgct gcccaaggat gctctttccg gagcacttcc ttctcggcgc tgcaccacgt 480 gatgtcctct gagcggatcc tccccgtgtc tgggtcctct ccgggcatct ctcctccctc 540 acccaacccc atgccgtctt cactcgctgg gttccctttt ccttctcctt ctggggcctg 600 tgccatctct cgtttcttag gatggccttc tccgacggat gtctcccttg cgtcccgcct 660 ccccttcttg taggcctgca tcatcaccgt ttttctggac aaccccaaag taccccgtct 720 ccctggcttt agccacctct ccatcctctt gctttctttg cctggacacc ccgttctcct 780 gtggattcgg gtcacctctc actcctttca tttgggcagc tcccctaccc cccttacctc 840 tctagtctgt gctagctctt ccagccccct gtcatggcat cttccagggg tccgagagct 900 cagctagtct tcttcctcca acccgggccc ctatgtccac ttcaggacag catgtttgct 960 gcctccaggg atcctgtgtc cccgagctgg gaccacctta tattcccagg gccggttaat 1020 gtggctctgg ttctgggtac ttttatctgt cccctccacc ccacagtggg gccactaggg 1080 acagctgacc tcttctcttc ctcccacagg gctctggcag cggaggaagc ggagctacta 1140 actttagtct gcttaatcaa gctggagacg tggaggagaa ccctggacct accggtatgc 1200 ctgaaccctc taagtctgct cccgccccga aaaagggctc caagaaggcg gtgactaagg 1260 cgcagaagaa aggcggcaag aagcgcaagc gcagccgcaa ggagagctat tccatctatg 1320 tgtacaaggt tctgaagcag gtccaccctg acaccggcat ttcgtccaag gccatgggca 1380 tcatgaattc gtttgtgaac gacattttcg agcgcatcgc aggtgaggct tcccgcctgg 1440 cgcattacaa caagcgctcg accatcacct ccagggagat ccagacggcc gtgcgcctgc 1500 tgctgcctgg ggagttggcc aagcacgccg tgtccgaggg tactaaggcc gtcaccaagt 1560 acaccagcgc taaggacatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 1620 tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 1680 agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 1740 ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 1800 accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 1860 aggagcgcac catcttcttt aaggatgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 1920 tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttt aaagaggacg 1980 ggaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 2040 ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 2100 gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 2160 tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 2220 agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 2280 acgagctgta caagtaacat atggctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 2340 atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 2400 cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 2460 ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 2520 tggggatgcg gtgggctcta tgattggtga cagaaaagcc ccatccttag gcctcctcct 2580 tcctagtctc ctgatattgg gtctaacccc cacctcctgt taggcagatt ccttatctgg 2640 tgacacaccc ccatttcctg gagccatctc tctccttgcc agaacctcta aggtttgctt 2700 acgatggagc cagagaggat cctgggaggg agagcttggc agggggtggg agggaagggg 2760 gggatgcgtg acctgcccgg ttctcagtgg ccaccctgcg ctaccctctc ccagaacctg 2820 agctgctctg acgcggctgt ctggtgcgtt tcactgatcc tggtgctgca gcttccttac 2880 acttcccaag aggagaagca gtttggaaaa acaaaatcag aataagttgg tcctgagttc 2940 taactttggc tcttcacctt tctagtcccc aatttatatt gttcctccgt gcgtcagttt 3000 tacctgtgag ataaggccag tagccagccc cgtcctggca gggctgtggt gaggaggggg 3060 gtgtccgtgt ggaaaactcc ctttgtgaga atggtgcgtc ctaggtgttc accaggtcgt 3120 ggccgcctct actccctttc tctttctcca tccttctttc cttaaagagt ccccagtgct 3180 atctgggaca tattcctccg cccagagcag ggtcccgctt ccctaaggcc ctgctctggg 3240 cttctgggtt tgagtccttg gcaagcccag gagaggcgct caggcttccc tgtccccctt 3300 cctcgtccac catctcatgc ccctggctct cctgcccctt ccctacaggg gttcctgcac 3360 taccagagct aactcaaagc ttctagatat cctctcttaa ggtagcatcg agatttaaat 3420 tagggataac agggtaatgg cgcgggccgc aggaacccct agtgatggag ttggccactc 3480 cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg 3540 gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g 3591 <210> 8 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 sgRNA <400> 8 ggggccacua gggacaggau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> Wild-type AAVS1 protospacer with PAM <400> 9 ggggccacta gggacaggat tgg 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> Primer 1 AAVS1-outsideF <400> 10 cggaactctg ccctctaacg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> Primer 2 AAVS1-outsideR <400> 11 ctgggatacc ccgaagagtg 20 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 TIDE-4R <400> 12 cctctccatc ctcttgcttt ctttg 25 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 TIDE-4F <400> 13 aactgcttct cctcttggga agt 23 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IntAmp1 <400> 14 gatgggggtg ttctgctgg 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IntAmp2 <400> 15 cgtaaacggc cacaagttca 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 1 <400> 16 ggggccacta gggagaggat agg 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 2 <400> 17 ggggccacta gggccaggat agg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 3 <400> 18 ggggccacta ggaacaggat agg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 4 <400> 19 gggaccacta gggacaggat agg 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 5 <400> 20 ggagccacta gggacaggat agg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 6 <400> 21 gaggccacta gggacaggat agg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 7 <400> 22 tgggccacta gggacaggat agg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 8 <400> 23 caggccacta gggacaggat agg 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 9 <400> 24 taggccacta gggacaggat agg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 10 <400> 25 ctagccacta gggacaggat agg 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 11 <400> 26 tatgccacta gggacaggat agg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 12 <400> 27 gatgccacta gggacaggat agg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAVS1 DAP with PAM 13 <400> 28 gtagccacta gggacaggat agg 23

Claims (50)

  1. 조혈 줄기 세포(HSC)의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법으로서,
    (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HSC에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는 단계;
    (b) 이중가닥 공여체 핵산을 HSC에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 상동성-독립적 메커니즘에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, HSC는 장기 생착 HSC(LT-HSC) 또는 SCID-재증식 세포(repopulating cell)인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, HSC는 하기 마커들: Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-에 의해 특징화되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, Lin-은 CD235a-, CD41a-, CD3-, CD19-, CD14-, CD16-, CD20-, 및 CD56- 중 하나 이상으로 특징화되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, Lin-은 CD235a-/CD41a-/CD3-/CD19-/CD14-/CD16-/CD20-/CD56-로 특징화되는, 방법.
  6. 휴지 T 세포(quiescent T cell)의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법으로서,
    (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는, 단계;
    (b) 이중가닥 공여체 핵산을 휴지 T 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 상동성-독립적 메커니즘에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 휴지 T 세포는 비활성화 T 세포인, 방법.
  8. HDR-결핍 세포의 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법으로서,
    (a) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 표적 유전자좌가 뉴클레아제에 대한 제1 인식 서열을 포함하는, 단계;
    (b) 이중가닥 공여체 핵산을 HDR-결핍 세포에 도입하는 단계로서, 이중가닥 핵산이 외인성 핵산 서열을 포함하고 상동성-독립적 메커니즘에 의해 표적 유전자좌에 삽입되도록 구성되는, 단계, 및
    (c) 이중가닥 공여체 핵산을 표적 유전자좌로 통합하기에 충분한 시간 동안 HDR-결핍 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서
    단계 (a), (b) 및 (c)는 이중가닥 공여체 핵산에 대한 삽입 효율이 적어도 약 4%가 되도록 수행되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 이중가닥 공여체 핵산에 대한 삽입 효율이 적어도 약 8%인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제1 말단 측면에 있는 뉴클레아제에 대한 제2 인식 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열의 제2 말단 측면에 있는 제3 인식 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 이중가닥 공여체 핵산은 세포로의 도입 후 제2 및/또는 제3 인식 서열에서 절단되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 원하는 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 생성하지 않고, 절단된 이중가닥 공여체 핵산이 다른 배향으로 표적 유전자좌에 삽입되어, 변형된 표적 유전자좌에서 뉴클레아제에 대한 인식 서열이 생성되도록 이중가닥 공여체 핵산이 구성되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)이며, 표적 유전자좌 및 이중가닥 공여체 핵산의 뉴클레아제에 대한 각각의 인식 서열은 프로토스페이서 서열이고, 상기 방법은 프로토스페이서 서열 중 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 표적 유전자좌 및 공여체 핵산에서의 프로토스페이서를 표적화하는 스페이서를 포함하는 gRNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 순 배향이고, 이중가닥 공여체 핵산의 외인성 핵산은 순 배향이고, 이중가닥 공여체 핵산의 프로토스페이서는 역 배향인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 표적 유전자좌 및 공여체 핵산의 프로토스페이서들은 동일한, 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 표적 유전자좌 및 공여체 핵산의 프로토스페이서들 중 적어도 하나는 gRNA 스페이서와 불완전하게 일치하는 지연-작용 프로토스페이서(DAP)인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, DAP는 i) gRNA 스페이서보다 적어도 약 1개의 뉴클레오타이드 길이가 더 짧고/짧거나; ii) gRNA 스페이서와의 적어도 약 1개의 뉴클레오타이드 미스매치를 포함하는, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 공여체 핵산의 프로토스페이서는 DAP이고, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 이중가닥 공여체 핵산은 외인성 핵산 서열 측면의 2개의 DAP를 포함하는, 방법.
  22. 제18항 또는 제19항에 있어서, 공여체 핵산의 프로토스페이서는 gRNA 스페이서와 완전히 일치하고, 표적 유전자좌의 프로토스페이서는 DAP인, 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN은 Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN 및 하나 이상의 gRNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP)을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN을 코딩하는 mRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이중가닥 공여체 핵산은 이중가닥 바이러스 게놈인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 이중가닥 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈, 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 게놈인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, AAV 게놈은 자기-상보적 AAV(scAAV) 게놈인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, scAAV 게놈은 scAAV6 게놈인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전에 세포에 도입되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 1시간 이내에 세포에 도입되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 공여체 핵산이 세포에 도입되기 전 5분 이내에 세포에 도입되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 저산소 조건 하에서 배양되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 48시간 이내에 배양되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 24시간 이내에 배양되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 공여체 핵산을 세포에 도입하기전 약 2시간 이내에 배양되는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 Notch 리간드의 존재 하에 배양되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, Notch 리간드는 델타-유사 Notch 리간드(DLL), Jagged-1, Jagged-2, 또는 이의 접합체인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 델타-유사 Notch 리간드는 DLL1, DLL3, 또는 DLL4인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, Notch 리간드는 Fc-DLL1, Fc-DLL3, Fc-DLL4, Fc-Jagged-1, 또는 Fc-Jagged-2인, 방법.
  41. 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 개체에서의 생착 방법으로서,
    (a) 개체로부터 수득된 HSC의 입력 집단에 대해 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법을 수행하여 표적 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 편집된 HSC의 집단을 포함하는 HSC의 산출 집단을 생성하는 단계; 및
    (b) 편집된 HSC의 집단을 상기 개체에게 투여하여 편집된 HSC가 개체에 생착되도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 개체 내 편집된 HSC의 생착 양은 상동성-의존적 메커니즘을 사용하여 제조된 상응하는 편집된 HSC의 생착 양과 동일하거나 이보다 더 큰, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 개체로부터 수득된 HSC의 입력 집단은 LT-HSC 및 단기 생착 HSC(ST-HSC)를 포함하는 HSC의 혼합 집단을 포함하고, 생착된 편집된 HSC 집단은 편집된 LT-HSC를 포함하는, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 편집된 HSC 집단을 개체에게 투여하는 단계는 HSC의 산출 집단을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제1항 내지 제5항 및 제10항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 HSC내 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법에 의해 제조된, 조작된 HSC.
  46. 제6항 내지 제7항 및 제10항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 휴지 T 세포내 표적 유전자좌에서의 게놈 변형을 위한 방법에 의해 제조된, 조작된 휴지 T 세포.
  47. 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 질환 또는 병태는 기능성 단백질의 결핍성 발현을 특징으로 하며, 제45항 또는 제46항에 따른 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 외인성 핵산은 조작된 세포에서 발현될 수 있는 단백질의 기능적 형태를 코딩하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 SCID이고, 외인성 핵산은 림프 발달 또는 림프구 증식 및/또는 대사에 관여하는 개체에서 돌연변이된 유전자의 기능적 형태를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 IL2Rg, RAG1, IL7R, ADA, 또는 PNP의 기능적 형태를 코딩하는, 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 고셔 병, 파브리 병, I-IX형 점액다당류증, 또는 부신백질이영양증인, 방법.
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