CN113874027A - 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 - Google Patents

用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113874027A
CN113874027A CN202080011978.1A CN202080011978A CN113874027A CN 113874027 A CN113874027 A CN 113874027A CN 202080011978 A CN202080011978 A CN 202080011978A CN 113874027 A CN113874027 A CN 113874027A
Authority
CN
China
Prior art keywords
treg
modified
expression
endogenous
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080011978.1A
Other languages
English (en)
Inventor
约翰·赵
詹森·莫金
诺亚·雅各布·图博
詹姆斯·马丁·卡贝纳二世
所罗门·马丁·申克
凯雷姆·乔纳坦·通塞尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ksq Treatment Co
KSQ Therapeutics Inc
Original Assignee
Ksq Treatment Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ksq Treatment Co filed Critical Ksq Treatment Co
Publication of CN113874027A publication Critical patent/CN113874027A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof

Abstract

本公开提供了与Treg的提高治疗功效的修饰有关的方法和组合物。在一些实施方案中，提供了经修饰以降低一种或多种内源靶基因的表达或降低内源蛋白的一种或多种功能来增强所述免疫细胞的免疫抑制功能的Treg。在一些实施方案中，提供了通过引入赋予抗原特异性的诸如外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的转基因进一步修饰的Treg。还提供了使用本文所述的修饰的Treg治疗自身免疫性疾病的方法。

Description

用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法
技术领域
本公开涉及用于编辑靶核酸序列或调节靶核酸序列的表达的方法、组合物和组分，及其结合免疫疗法(包括与调节性T细胞(任选受体工程化的调节性T细胞)一起使用)在自身免疫性疾病的治疗中的应用。
背景技术
免疫系统不适当或过度的应答会引起受影响生物体的各种症状，包括自身免疫性病症。利用遗传修饰的T细胞(特别是CAR-T细胞)的过继性细胞转移已经作为实体和血液恶性肿瘤的治疗剂进入临床测试。并且，过继性细胞转移在癌症以外的病症诸如自身免疫性病症中也有潜在的应用。然而，限制遗传修饰的免疫细胞的功效的因素包括(1)细胞增殖，例如过继性转移后T细胞的有限增殖；(2)细胞存活，例如诱导T细胞凋亡；和(3)细胞功能，例如在制造过程中和/或转移后，抑制因子对T细胞功能的抑制和免疫细胞的耗竭。利用过继T细胞、特别是在治疗自身免疫性病症方面有相当大的发展空间，并且需要提高过继性转移修饰的免疫细胞在自身免疫性病症治疗方面的功效。
发明内容
本文公开的本发明的一个方面涉及一种调节性T细胞(Treg)，其包含能够降低包含TNFRSF4的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统，其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。本文公开的本发明的一个方面涉及一种修饰的Treg，其中包含TNFRSF4的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能已经被基因调控系统降低，并且其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种修饰的Treg，其包含能够降低包含PRDM1的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统，其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。本文公开的本发明的一个方面涉及一种修饰的Treg，其中包含PRDM1的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能已经被基因调控系统降低，并且其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种修饰的Treg，其包含能够降低选自由以下组成的组的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP，其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。本文公开的本发明的一个方面涉及一种修饰的Treg，其中选自由以下组成的组的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能已经被基因调控系统降低：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP，并且其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。
在某些实施方案中，基因调控系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白。在一个实施方案中，基因调控系统包含选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂(antagomiR)或反义RNA的核酸分子。在一个实施方案中，基因调控系统包含酶蛋白，并且其中酶蛋白已经被工程化以与内源基因中的一种或多种中的靶序列特异性结合。在一些实施方案中，蛋白质是转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或大范围核酸酶(meganuclease)。
在一个实施方案中，基因调控系统包含核酸分子和酶蛋白，其中核酸分子是指导RNA(gRNA)分子并且酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。在一个实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂。在实施方案中，Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂。在一个实施方案中，Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。在实施方案中，异源蛋白选自由MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)和四个串联的mSin3结构域(SID4X)组成的组。
在实施方案中，基因调控系统能够降低至少2、3、4、5、6或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
在实施方案中，基因调控系统能够降低选自由以下组成的组的多种内源靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低选自由以下组成的组的至少2、3、4、5、6或更多种内源靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
在一个实施方案中，基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能，其中多种靶基因中的至少一种为TNFRSF4，并且其中多种靶基因中的至少一种选自PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。在一个实施方案中，多种靶基因中的一种为TNFRSF4，并且其中多种靶基因中的至少2、3、4、5、6或更多种选自PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
在一个实施方案中，基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能，其中多种靶基因中的至少一种为PRDM1，并且其中多种靶基因中的至少一种选自TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。在一个实施方案中，多种靶基因中的一种为PRDM1，并且其中多种靶基因中的至少2、3、4、5、6或更多种选自TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
在一些实施方案中，基因调控系统包含多种gRNA分子。在其他实施方案中，通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏将基因调控系统引入Treg中。在实施方案中，基因调控系统以编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。
在某些实施方案中，免疫抑制功能选自Treg增殖、Treg存活力、Treg稳定性、增加的免疫抑制细胞因子的表达或分泌，任选地其中免疫抑制细胞因子是IL-10，增加的Foxp3和Helios的共表达和/或对耗竭的抗性。在一个实施方案中，修饰的Treg还包含展示在细胞表面上的工程化免疫受体。在实施方案中，工程化免疫受体是包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)。
在某些实施方案中，工程化免疫受体是工程化T细胞受体(TCR)。在一个实施方案中，工程化免疫受体与靶细胞上表达的抗原特异性结合。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种修饰的Treg，其包含相对于未修饰的Treg中的一种或多种内源基因的表达和/或功能而降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源基因包含TNFRSF4，并且其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种修饰的Treg，其包含相对于未修饰的Treg中的一种或多种内源基因的表达和/或功能而降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源基因包含PRDM1，并且其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种修饰的Treg，其包含相对于未修饰的Treg中的一种或多种内源基因的表达和/或功能而降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源基因选自由以下组成的组：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP，并且其中降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强Treg的免疫抑制功能。
在一些实施方案中，修饰的Treg还包含展示在细胞表面上的工程化免疫受体。在实施方案中，工程化免疫受体是CAR或工程化TCR。在一个实施方案中，工程化免疫受体与靶细胞上表达的抗原特异性结合。
在一个实施方案中，修饰的Treg还包含降低的TNFRSF4的表达。在一个实施方案中，修饰的Treg包含降低的TNFRSF4的表达和/或功能以及降低的选自以下的至少一种靶基因的表达和/或功能：PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。在一个实施方案中，修饰的Treg包含降低的TNFRSF4的表达和/或功能以及降低的选自由以下组成的组的至少2、3、4、5、6或更多种靶基因的表达和/或功能：PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
在一个实施方案中，修饰的Treg还包含降低的PRDM1的表达。在一个实施方案中，修饰的Treg包含降低的PRDM1的表达和/或功能以及降低的选自以下的至少一种靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。在一个实施方案中，修饰的Treg包含降低的PRDM1的表达和/或功能以及降低的选自由以下组成的组的至少2、3、4、5、6或更多种靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
在实施方案中，基因调控系统包含选自siRNA和shRNA的核酸分子。在某些实施方案中，基因调控系统还能够降低选自由以下组成的组的一种或多种内源靶基因的表达：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。在一个实施方案中，基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能并且包含多种siRNA或shRNA，其中至少一种内源靶基因选自由以下组成的组：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
在某些实施方案中，基因调控系统能够降低选自由以下组成的组的至少2、3、4、5、6或更多种内源靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。在一个实施方案中，基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能并且包含多种siRNA或shRNA，其中多种靶基因中的至少一种为TNFRSF4，并且多种靶基因中的至少一种选自PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP2。在某些实施方案中，多种靶基因中的至少一种为TNFRSF4，并且多种靶基因中的至少2、3、4、5、6或更多种选自PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。在另一个实施方案中，基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能并且包含多种siRNA或shRNA，其中多种靶基因中的至少一种为PRDM1，并且多种靶基因中的至少一种选自TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP2。在一个实施方案中，多种靶基因中的至少一种为PRDM1，并且多种靶基因中的至少2、3、4、5、6或更多种选自TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种包含本文公开的修饰的Treg的组合物。在一个实施方案中，组合物包含至少1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109或1x1010个修饰的Treg。在某些实施方案中，组合物适合施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，组合物包含衍生自有需要的受试者的自体Treg。在一个实施方案中，组合物包含衍生自供体受试者的同种异体Treg。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种基因调控系统，所述系统能够降低细胞中一种或多种内源靶基因的表达，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白，并且其中一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4。在实施方案中，系统包含指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种基因调控系统，所述系统能够降低细胞中一种或多种内源靶基因的表达，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白，并且其中一种或多种内源靶基因包含PRDM1。在一些实施方案中，系统包含指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种基因调控系统，所述系统能够降低细胞中一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白，并且其中一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP2。在实施方案中，系统包含指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
可使用任何Cas蛋白，包括本文提供的那些。在实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂。在某些实施方案中，Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂。在一些实施方案中，Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。
在一个实施方案中，异源蛋白选自由MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域和四个串联的mSin3结构域(SID4X)组成的组。
在一个实施方案中，系统包含核酸分子，并且其中核酸分子是siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA。
在一些实施方案中，系统包含含有DNA结合结构域和酶结构域的蛋白质，并且选自锌指核酸酶和转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种包含本文公开的基因调控系统的试剂盒。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种gRNA核酸分子，其包含与内源靶基因中的靶序列互补的靶向结构域核酸序列，其中内源靶基因是TNFRSF4。本文公开的本发明的一个方面涉及一种gRNA核酸分子，其包含与内源靶基因中的靶序列互补的靶向结构域核酸序列，其中内源靶基因是PRDM1。本文公开的本发明的一个方面涉及一种gRNA核酸分子，其包含与内源靶基因中的靶序列互补的靶向结构域核酸序列，其中内源靶基因选自REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP2。
在实施方案中，靶序列包含PAM序列。在某些实施方案中，gRNA是模块化gRNA分子。在一个实施方案中，gRNA是双gRNA分子。在一些实施方案中，靶向结构域的长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多个核苷酸。在一个实施方案中，gRNA分子包含在其5'末端处或附近(例如，在其5'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰和/或在其3'末端处或附近(例如，在其3'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰。
在一些实施方案中，修饰的gRNA在引入T细胞中时表现出增加的对核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，修饰的gRNA在引入T细胞时表现出降低的先天性免疫应答。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种编码本文公开的gRNA分子的多核苷酸分子。本文公开的本发明的一个方面涉及一种编码本文公开的多种gRNA分子的多核苷酸分子。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种包含本文公开的一种或多种gRNA分子或本文公开的多核苷酸的组合物。本文公开的本发明的一个方面涉及一种包含本文公开的gRNA分子或本文公开的多核苷酸的试剂盒。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种产生修饰的Treg的方法，其包括：从受试者获得Treg；将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且其中一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4；以及培养Treg，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的Treg相比降低。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种产生修饰的Treg的方法，其包括：从受试者获得Treg；将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且其中一种或多种内源靶基因包含PRDM1；以及培养Treg，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的Treg相比降低。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种产生修饰的Treg的方法，其包括：将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4。本文公开的本发明的一个方面涉及一种产生修饰的Treg的方法，其包括：将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源靶基因包含PRDM1。
在实施方案中，基因调控系统是本文公开的任何系统。在实施方案中，方法还包括引入编码选自CAR和TCR的工程化免疫受体的多核苷酸序列。在实施方案中，通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏将基因调控系统和/或编码工程化免疫受体的多核苷酸引入Treg中。在一个实施方案中，基因调控系统以编码系统的一种或多种组分的多核苷酸序列、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种产生修饰的Treg的方法，其包括：获得Treg群体；扩增Treg群体；以及将基因调控系统引入Treg群体中，其中基因调控系统能够降低包含TNFRSF4的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能。在实施方案中，在扩增之前将基因调控系统引入Treg群体中。在一个实施方案中，在扩增之后将基因调控系统引入Treg群体中。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种产生修饰的Treg的方法，其包括：获得Treg群体；扩大Treg群体；以及将基因调控系统引入Treg群体中，其中基因调控系统能够降低包含PRDM1的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能。在一个实施方案中，在扩增之前将基因调控系统引入Treg群体中。在实施方案中，在扩增之后将基因调控系统引入Treg群体中。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的本文公开的修饰的Treg或本文公开的组合物。
在实施方案中，疾病或病症是自身免疫性病症。在实施方案中，自身免疫性病症是自身免疫性肝炎、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn's disease)、结肠炎、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、斑秃、血管炎、颞关节炎(temporal arthritis)、狼疮、腹腔疾病、休格连氏综合征、风湿性多肌痛、多发性硬化、关节炎、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)或牛皮癣。在某些实施方案中，自身免疫性病症是炎症性肠病(IBD)，例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在某些实施方案中，自身免疫性病症是系统性红斑狼疮。在某些实施方案中，自身免疫性病症是与实体器官移植相关的自身免疫应答，例如GVHD。在某些实施方案中，修饰的Treg对于受试者是自体的。在一个实施方案中，修饰的Treg对于受试者是同种异体的。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且其中一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4；以及培养Treg，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的Treg相比降低，其中修饰的Treg表现出一种或多种与未修饰的Treg相比增强的免疫抑制功能。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且其中一种或多种内源靶基因包含PRDM1；以及培养Treg，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的Treg相比降低，其中修饰的Treg表现出一种或多种与未修饰的Treg相比增强的免疫抑制功能。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源靶基因包含PRDM1。
在实施方案中，一种或多种免疫抑制功能选自Treg增殖、Treg存活力、Treg稳定性、增加的免疫抑制细胞因子的表达或分泌，任选地其中免疫抑制细胞因子是IL-10，增加的Foxp3和Helios的共表达和/或对耗竭的抗性。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4，并且其中基因调控系统的引入不降低Treg的稳定性。Treg的稳定性可以例如通过测量Foxp3 TSDR的甲基化来评估。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：将基因调控系统引入Treg，其中基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中一种或多种内源靶基因包含PRDM1，并且其中基因调控系统的引入增加Treg的稳定性。Treg的稳定性可以例如通过测量Foxp3 TSDR的甲基化来评估。
因此，例如，基因调控系统的引入可将去甲基化的Foxp3 TSDR的百分比增加至少10％、至少15％、至少20％或至少25％。基因调控系统的引入可将去甲基化的Foxp3 TSDR的百分比增加10-50％、10-30％、15-50％、15-30％、20-50％、20-30％、25-50％或25-30％。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种治疗有需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法，其包括施用有效量的本文公开的修饰的Treg或本文公开的组合物。在实施方案中，自身免疫性疾病选自由以下组成的组：自身免疫性肝炎、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病、结肠炎、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、斑秃、血管炎、颞关节炎、狼疮、腹腔疾病、休格连氏综合征、风湿性多肌痛、多发性硬化、关节炎、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)和牛皮癣。在某些实施方案中，自身免疫性病症是炎症性肠病(IBD)，例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在某些实施方案中，自身免疫性病症是系统性红斑狼疮。
本文公开的本发明的一个方面涉及一种治疗有需要的受试者中的与实体器官移植相关的自身免疫应答(例如GVHD)的方法，其包括施用有效量的本文公开的修饰的Treg或本文公开的组合物。
在一些方面，修饰的Treg是组织驻留Treg。在一些方面，Treg是组织驻留Treg。
附图说明
图1总结了通过体外CRISPR/Cas9功能基因组筛选鉴定的Treg选择性靶标。
图2A和图2B示出了使用本文所述的方法编辑人Treg细胞中的Foxp3和CD45基因。
图3A和图3B显示在体外培养系统中，PRDM1编辑的和TNFRSF编辑的Treg细胞的增殖能力提高。
图4A和图4B显示在体外培养系统中，PRDM1编辑的Treg细胞中Foxp3+Helios+细胞的比例增加。
图5显示，Foxp3 Treg特异性去甲基化区域(TSDR)去甲基化(Treg稳定性的度量)在TNFRSF4编辑的Treg细胞中维持，并且在PRDM1编辑的Treg细胞中增加。
图6A和图6B显示在体外培养系统中，PRDM1编辑的和TNFRSF编辑的Treg细胞中免疫抑制细胞因子白细胞介素-10的产生增加。
图7A和图7B显示，PRDM1编辑的Treg细胞在炎症病况下持续存在。
图8显示，PRDM1编辑的和TNFRSF4编辑的Treg的抑制能力与对照编辑的Treg相当。
图9A显示，在GvHD模型中，用PRDM1编辑的和TNFRSF4编辑的Treg治疗小鼠与用对照编辑的Treg治疗的小鼠相比表现出提高的存活。
图9B显示由于Treg治疗，CD8+效应T细胞的增殖能力降低。
具体实施方式
本公开提供了与T调节性细胞(Treg)在自身免疫性疾病的免疫疗法的背景下提高其治疗功效的修饰有关的方法和组合物。在一些实施方案中，通过本公开的方法修饰Treg以降低一种或多种内源靶基因的表达，或降低内源蛋白的一种或多种功能，使得免疫细胞的一种或多种免疫抑制功能得以增强。在一些实施方案中，通过引入赋予抗原特异性的转基因来进一步修饰Treg，诸如引入T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)表达构建体。在一些实施方案中，本公开提供了用于修饰Treg的组合物和方法，诸如基因调控系统的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了治疗自身免疫性病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的修饰的Treg。
I.定义
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一(a)”，“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
如本说明书中所使用的，除非另外指出，否则在本公开中使用的术语“和/或”是指“和”或“或”。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变型将被理解为暗示包括陈述的元件或整数或者元件或整数的组，但不排除任何其他元件或整数或者元件或整数的组。
如本申请中所使用的，术语“约”和“近似”被用作等同物。在本申请中使用的具有或不具有约/近似的任何数字旨在覆盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，术语“近似”或“约”是指落入在所述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文明显看出(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
“减小”或“降低”是指与参考值相比特定值减小或降低至少5％，例如减小5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。特定值的减小或降低也可以表示为与参考值相比值的倍数变化，例如与参考值相比减小至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多。
“增加”是指与参考值相比特定值增加至少5％，例如增加5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。特定值的增加也可以表示为与参考值相比值的倍数变化，例如与参考值的水平相比增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸以及具有修饰的肽骨架的多肽。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5与约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度不存在上限。寡核苷酸也被称为“寡聚体(oligomers)”或“寡聚体(oligos)”，并且可以从基因中分离，或通过本领域已知的方法化学合成。术语“多核苷酸”和“核酸”应理解为包括如可适用于所描述的实施方案的单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。
“片段”是指包含少于整个多肽或多核苷酸序列的多肽或多核苷酸分子的一部分。在一些实施方案中，多肽或多核苷酸的片段包含参考多肽或多核苷酸全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，多肽或多核苷酸片段可以包含5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个核苷酸或氨基酸。
术语“序列同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列之间的碱基或氨基酸相同且在相同的相对位置中的百分比。因此，与另一种多核苷酸或多肽序列相比，一个多核苷酸或多肽序列具有一定百分比的序列同一性。对于序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。术语“参考序列”是指与测试序列进行比较的分子。
“互补”是指通过碱基堆积和特异性氢键在包含天然或非天然存在的碱基或其类似物的两个序列之间配对的能力。例如，如果核酸的一个位置处的碱基能够与靶的对应位置处的碱基形成氢键，则认为所述碱基在该位置处彼此互补。核酸可包含通用碱基或者对氢键不提供正或负贡献的惰性无碱基间隔区。碱基配对可以包括规范的Watson-Crick碱基配对和非Watson-Crick碱基配对(例如，Wobble碱基配对和Hoogsteen碱基配对)。应当理解，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，并且诸如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚的通用碱基可以与任何A、C、U或T杂交并被认为与其互补。Nichols等人,Nature,1994；369:492-493和Loakes等人,Nucleic Acids Res.,1994；22:4039-4043。肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基，并且被认为与任何A、C、U或T互补。参见Watkins和SantaLucia,Nucl.Acids Research,2005；33(19):6258-6267。
如本文所指，“互补核酸序列”是包含使其能够在适当的体外和/或体内温度和溶液离子强度的条件下以序列特异性、反平行的方式(即，核酸特异性结合互补核酸)非共价结合至另一核酸的核苷酸序列的核酸序列。
用于比较和确定序列同一性百分比和互补性百分比的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可例如通过以下方法进行：Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现(在WisconsinGenetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI)；手动比对和目视检查(参见，例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)；使用本领域已知的算法包括BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于ltschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件为通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可公开获得的。
在本文中，术语“杂交”是指互补核苷酸碱基之间(例如，腺嘌呤(A)与DNA分子中的胸腺嘧啶(T)和RNA分子中的尿嘧啶(U)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与DNA和RNA分子中的胞嘧啶(C)形成碱基对)形成双链核酸分子的配对。(参见，例如，Wahl和Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399；Kimmel,(1987)Methods Enzymol.152:507)。另外，本领域中还已知对于两个RNA分子(例如，dsRNA)之间的杂交，鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如，G/U碱基配对是在tRNA反密码子碱基配对mRNA中的密码子的背景下的遗传密码简并(即，冗余)的部分原因。在本公开的背景下，指导RNA分子的蛋白结合区段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补，并且反之亦然。因此，当可以在给定的核苷酸位置对指导RNA分子的蛋白质结合区段(dsRNA双链体)制造G/U碱基对时，不认为所述位置是非互补的，而是认为是互补的。在本领域中应理解，多核苷酸的序列不需要与其可特异性杂交的靶核酸的序列100％互补。此外，多核苷酸可以在一个或多个区段上杂交以使得居间或相邻的区段不参与杂交事件(例如环结构或发夹结构)。多核苷酸可包含与其靶向的靶核酸序列内的靶区域至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列互补性。
术语“修饰的”是指与对应的未修饰的物质或化合物相比已经改变或变化的物质或化合物(例如细胞、多核苷酸序列和/或多肽序列)。
如本文所用，当用于核酸、多肽、细胞或生物体时，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的核酸、多肽、细胞或生物体。例如，可从自然中的来源分离并且不通过人在实验室中有意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。
“分离的”是指在不同程度上与在其天然状态下发现的通常伴随其的组分分离的材料。
“表达盒”或“表达构建体”是指可操作地连接至启动子的DNA多核苷酸序列。“可操作地连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预期的方式起作用的关系的并置。例如，如果启动子影响多核苷酸序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到多核苷酸序列。
如本文所用，术语“重组载体”是指能够转移或转运插入载体中的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。插入的多核苷酸可以是表达盒。在一些实施方案中，重组载体可以是病毒载体或非病毒载体(例如质粒)。
术语“样品”是指进行分析和/或遗传修饰的生物组合物(例如，细胞或组织的一部分)。在一些实施方案中，样品是直接从受试者获得的“原始样品”；在一些实施方案中，“样品”是处理原始样品以例如去除某些组分和/或分离或纯化感兴趣的某些组分的结果。
术语“受试者”包括动物，例如哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是灵长类动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，受试者是家畜，诸如牛、绵羊、山羊、牛、猪等；或家养动物，诸如狗和猫。在一些实施方案中(例如，特别是在研究背景下)，受试者是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物或猪(诸如近交猪)等。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。
“施用”在本文中是指将药剂或组合物引入受试者。
如本文所用，“治疗”是指将药剂或组合物递送至受试者以影响生理结果。
如本文所用，术语“有效量”是指产生特定生理作用所需的药剂或组合物的最小量。特定药剂的有效量可以基于药剂的性质以多种方式表示，诸如质量/体积、细胞的数量/体积、颗粒/体积、(药剂的质量)/(受试者的质量)、细胞的数量/(受试者的质量)、或颗粒/(受试者的质量)。特定药剂的有效量也可以表示为半最大有效浓度(EC50)，其是指导致特定生理应答的量值为参考水平与最大应答水平之间的一半的药剂浓度。
细胞的“群体”是指大于1的任意数量的细胞，但优选地至少1x103个细胞、至少1x104个细胞、至少1x105个细胞、至少1x106个细胞、至少1x107个细胞、至少1x108个细胞、至少1x109个细胞、至少1x1010个细胞或更多个细胞。细胞群体可以指体外群体(例如，培养中的细胞群体)或体内群体(例如，位于特定组织中的细胞群体)。
分子和细胞生物化学的一般方法可以在标准教科书中找到，如MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版(Sambrook等人,HaRBor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology,第4版(Ausubel等人编著,John Wiley&Sons1999)；Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors forGene Therapy(Wagner等人编著,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编著,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编著,AcademicPress 1997)；和Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)，其公开内容以引用的方式并入本文。
II.修饰的调节性T细胞
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的T调节性细胞(Treg)。本文中，术语“修饰的Treg”涵盖包含导致降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的一种或多种基因组修饰的Treg细胞，以及包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统的Treg。本文中，“未修饰的Treg”或“对照Treg”是指其中基因组未被修饰并且不包含基因调控系统或包含对照基因调控系统(例如，空载体对照、非靶向gRNA、加扰siRNA等)的细胞或细胞群体。在一些实施方案中，Treg或修饰的Treg可以是组织驻留Treg。
在一些实施方案中，修饰的Treg是动物细胞或来源于动物细胞，包括无脊椎动物和脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类或哺乳动物)。在一些实施方案中，修饰的Treg是哺乳动物细胞或来源于哺乳动物细胞(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、非人灵长类动物、人等)。在一些实施方案中，修饰的Treg是啮齿动物细胞或来源于啮齿动物细胞(例如，大鼠或小鼠)。在一些实施方案中，修饰的Treg是人细胞或来源于人细胞。
在一些实施方案中，修饰的Treg包含在内源靶基因的基因组DNA序列中的一个或多个修饰(例如，一个或多个核酸的插入、缺失或突变)，从而导致降低的内源基因的表达和/或功能。在此类实施方案中，修饰的Treg包含“修饰的内源靶基因”。在一些实施方案中，基因组DNA序列中的修饰降低或抑制mRNA转录，从而降低编码的mRNA转录物和蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，基因组DNA序列中的修饰降低或抑制mRNA翻译，从而降低编码的蛋白的表达水平。在一些实施方案中，基因组DNA序列中的修饰编码与内源蛋白的未修饰(即，野生型)型式(例如，下文所述的显性负突变体)相比功能降低或改变的修饰的内源蛋白。
在一些实施方案中，修饰的Treg包含在内源靶基因以外的基因组位置处的一种或多种基因组修饰，其导致降低的内源靶基因的表达和/或功能或导致内源蛋白的修饰型式的表达。例如，在一些实施方案中，将编码基因调控系统的多核苷酸序列插入基因组中的一个或多个位置中，从而在基因调控系统表达时降低内源靶基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，将编码内源蛋白的修饰型式的多核苷酸序列插入基因组中的一个或多个位置处，其中与蛋白质的未修饰或野生型型式(例如，下文所述的显性负突变体)相比，蛋白质的修饰型式的功能降低。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg包含一种或多种修饰的内源靶基因，其中与未修饰的Treg相比，所述一种或多种修饰导致由内源靶基因编码的基因产物(即，mRNA转录物或蛋白质)的表达和/或功能降低。例如，在一些实施方案中，修饰的Treg表现出降低的mRNA转录物表达和/或降低的蛋白质表达。在一些实施方案中，与未修饰的Treg中基因产物的表达相比，修饰的Treg中基因产物的表达降低至少5％。在一些实施方案中，与未修饰的Treg中基因产物的表达相比，修饰的Treg中基因产物的表达降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，与未修饰的Treg中基因产物的表达相比，本文所述的修饰的Treg表现出由多种(例如，两种或更多种)内源靶基因编码的基因产物的降低的表达和/或功能。例如，在一些实施方案中，与未修饰的Treg中基因产物的表达相比，修饰的Treg表现出2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因的基因产物的降低的表达和/或功能。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的Treg，其中一种或多种内源靶基因或其部分被缺失(即，“敲除”)，使得修饰的Treg不表达mRNA转录物或蛋白质。在一些实施方案中，修饰的Treg包含多种内源靶基因或其部分的缺失。在一些实施方案中，修饰的Treg包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因的缺失。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg包含一种或多种修饰的内源靶基因，其中与在未修饰的Treg中表达的对应蛋白(例如，“未修饰的内源蛋白”)的功能相比，对靶DNA序列的一种或多种修饰导致功能降低或改变的蛋白质(例如，“修饰的内源蛋白”)的表达。在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg包含编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种修饰的内源蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种修饰的内源靶基因。在一些实施方案中，修饰的内源蛋白表现出对由修饰的Treg表达或由另一种细胞表达的另一种蛋白质的降低或改变的结合亲和力；降低或改变的信号传导能力；降低或改变的酶活性；降低或改变的DNA结合活性；或者降低或改变的作为支架蛋白的能力。
在一些实施方案中，修饰的内源靶基因包含一个或多个显性负突变。如本文所用，“显性负突变”是指靶基因的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，使得编码的蛋白质对由未修饰的靶基因编码的蛋白质起拮抗作用。突变是显性负突变，因为负表型相对于对应的未修饰基因的正表型赋予基因优势。包含一个或多个显性负突变的基因和由其编码的蛋白质被称为“显性负突变体”，例如，显性负基因和显性负蛋白质。在一些实施方案中，显性负突变蛋白质由插入在Treg的基因组中一个或多个位置处的外源转基因编码。
显性负性的各种机制是已知的。通常，显性负突变体的基因产物保留未修饰基因产物的某些功能，但缺乏未修饰基因产物的一种或多种关键的其他功能。这导致显性负突变体拮抗未修饰的基因产物。例如，作为说明性的实施方案，转录因子的显性负突变体可能缺少功能性活化结构域，但是保留功能性DNA结合结构域。在此实例中，显性负转录因子不能像未修饰的转录因子那样活化DNA的转录，但是显性负转录因子可以通过阻止未修饰的转录因子与转录因子结合位点的结合来间接抑制基因表达。作为另一个说明性的实施方案，作为二聚体的蛋白质的显性负突变是已知的。此类二聚体蛋白的显性负突变体可以保留与未修饰的蛋白质二聚的能力，但是不能发挥其他功能。显性负单体通过与未修饰的单体二聚形成异二聚体，阻止未修饰的单体形成功能性同二聚体。
在一些实施方案中，修饰的Treg包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达或功能的基因调控系统。基因调控系统可以通过多种机制降低内源靶基因修饰的表达和/或功能，所述机制包括通过修饰内源靶基因的基因组DNA序列(例如，通过在基因组DNA序列中插入、缺失或突变一个或多个核酸)；通过调控内源靶基因的转录(例如，抑制或阻遏mRNA转录)；和/或通过调控内源靶基因的翻译(例如，通过mRNA降解)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg包含基因调控系统(例如，基于核酸的基因调控系统、基于蛋白质的基因调控系统或基于蛋白质/核酸组合的基因调控系统)。在此类实施方案中，包含在修饰的Treg中的基因调控系统能够修饰一种或多种内源靶基因。在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg包含基因调控系统，其包含：
(a)一种或多种核酸分子，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
(b)一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的核酸分子；
(c)一种或多种蛋白质，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
(d)一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的蛋白质；
(e)一种或多种指导RNA(gRNA)，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
(f)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gRNA；
(g)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
(h)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
(i)一种或多种指导DNA(gDNA)，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
(j)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gDNA；
(k)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
(l)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
(m)一种或多种gRNA，其能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合；
(n)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合的gRNA；
(o)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列；
(p)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列的定点修饰多肽；或
(q)以上的任何组合。
在一些实施方案中，将编码基因调控系统的一种或多种多核苷酸插入Treg的基因组中。在一些实施方案中，编码基因调控系统的一种或多种多核苷酸是附加型表达的，并且不插入Treg的基因组中。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg包含降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含插入在一个或多个基因组基因座处的一种或多种外源转基因(例如，遗传“敲入”)。在一些实施方案中，一种或多种外源转基因编码可检测标签、安全转换系统、嵌合转换受体和/或工程化抗原特异性受体。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg还包含编码可检测标签的外源转基因。可检测标签的实例包括但不限于FLAG标签、聚组氨酸标签(例如6xHis)、SNAP标签、Halo标签、cMyc标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、抗生物素蛋白、酶、荧光蛋白、发光蛋白、化学发光蛋白、生物发光蛋白和磷光蛋白。在一些实施方案中，荧光蛋白选自由以下组成的组：蓝色/UV蛋白(诸如BFP、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire和T-Sapphire)；青色蛋白(诸如CFP、eCFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-Cyan、TagCFP和mTFP1)；绿色蛋白(诸如：GFP、eGFP、meGFP(A208K突变)、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover和mNeonGreen)；黄色蛋白(诸如YFP、eYFP、Citrine、Venus、SYFP2和TagYFP)；橙色蛋白(诸如单体Kusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange和mOrange2)；红色蛋白(诸如RFP、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby和mRuby2)；远红色蛋白(诸如mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune和NirFP)；近红外蛋白(诸如TagRFP657、IFP1.4和iRFP)；长斯托克斯位移蛋白(诸如mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2和mBeRFP)；光活化蛋白(诸如PA-GFP、PAmCherry1和PATagRFP)；光转换蛋白(诸如Kaede(绿色)、Kaede(红色)、KikGR1(绿色)、KikGR1(红色)、PS-CFP2、PS-CFP2、mEos2(绿色)、mEos2(红色)、mEos3.2(绿色)、mEos3.2(红色)、PSmOrange和PSmOrange)；和光可转换蛋白(诸如Dronpa)。在一些实施方案中，可检测标签可以选自AmCyan、AsRed、DsRed2、DsRedExpress、E2-Crimson、HcRed、ZsGreen、ZsYellow、mCherry、mStrawberry、mOrange、mBanana、mPlum、mRasberry、tdTomato、DsRed单体和/或AcGFP，所有这些均可从Clontech获得。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg还包含编码安全转换系统的外源转基因。安全转换系统(本领域中也称为自杀基因系统)包含编码一种或多种蛋白质的外源转基因，所述蛋白质能够在将细胞施用于受试者后消除修饰的Treg。安全转换系统的实例在本领域中是已知的。例如，安全转换系统包括编码将无毒性前药转化为有毒性化合物的蛋白质的基因，诸如单纯疱疹胸苷激酶(Hsv-tk)和更昔洛韦(GCV)系统(Hsv-tk/GCV)。Hsv-tk将无毒性GCV转化为细胞毒性化合物，其导致细胞凋亡。因此，向已经用包含编码Hsv-tk蛋白的转基因的修饰的Treg治疗的受试者施用GCV可以选择性地消除修饰的Treg，同时保留内源Treg。(参见例如，Bonini等人,Science,1997,276(5319):1719-1724；Ciceri等人,Blood,2007,109(11):1828-1836；Bondanza等人,Blood 2006,107(5):1828-1836)。
另外的安全转换系统包括编码细胞表面标记的基因，使得通过经由ADCC施用对细胞表面标记具有特异性的单克隆抗体能够消除修饰的Treg。在一些实施方案中，细胞表面标记是CD20，并且可以通过施用抗CD20单克隆抗体(诸如利妥昔单抗)来消除修饰的Treg(参见例如，Introna等人,Hum Gene Ther,2000,11(4):611-620；Serafini等人,Hum GeneTher,2004,14,63-76；van Meerten等人,Gene Ther,2006,13,789-797)。在国际PCT公开号WO 2018006880中描述了使用EGF-R和西妥昔单抗或帕尼单抗的类似系统。另外的安全转换系统包括编码促凋亡分子的转基因，所述促凋亡分子包含一个或多个用于二聚化的化学诱导剂(CID)的结合位点，使得能够通过施用CID来消除修饰的Treg，所述CID诱导促凋亡分子的寡聚化和凋亡途径的活化。在一些实施方案中，促凋亡分子是Fas(也称为CD95)(Thomis等人,Blood,2001,97(5),1249-1257)。在一些实施方案中，促凋亡分子是胱天蛋白酶9(Straathof等人,Blood,2005,105(11),4247-4254)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg还包含编码嵌合转换受体的外源转基因。嵌合转换受体是工程化细胞表面受体，其包含来自内源细胞表面受体的细胞外结构域和异源细胞内信号传导结构域，使得细胞外结构域对配体的识别导致信号级联的活化，其与野生型形式的细胞表面受体所活化的信号级联不同。在一些实施方案中，嵌合转换受体包含与细胞内结构域融合的抑制性细胞表面受体的细胞外结构域，所述细胞内结构域导致传递活化信号而不是通常由抑制性细胞表面受体转导的抑制信号。在特定的实施方案中，来源于已知抑制Treg活化的细胞表面受体的细胞外结构域可以与活化细胞内结构域融合。然后，对应配体的接合将活化信号级联，其增加而不是抑制免疫效应细胞的活化。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg还包含识别由靶细胞表达的蛋白质靶的工程化抗原特异性受体，本文称为“修饰的受体工程化细胞”或“修饰的RE-细胞”。术语“工程化抗原受体”是指非天然存在的抗原特异性受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化抗原受体是CAR，其包含经由铰链和跨膜结构域与包含信号传导结构域的细胞质结构域融合的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR细胞外结构域以MHC非依赖性方式与由靶细胞表达的抗原结合，从而导致RE细胞的活化和增殖。在一些实施方案中，CAR的细胞外结构域识别与抗体或其抗原结合片段融合的标签。在此类实施方案中，CAR的抗原特异性取决于标记的抗体的抗原特异性，使得单个CAR构建体可以通过用一种抗体取代另一种抗体来靶向多种不同的抗原(参见例如，美国专利号9,233,125和9,624,279；美国专利申请公开号20150238631和20180104354)。在一些实施方案中，CAR的细胞外结构域可包含来源于抗体的抗原结合片段。可用于本公开的抗原结合结构域包括例如scFv；抗体；抗体的抗原结合区；重链/轻链的可变区；和单链抗体。
在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域可以来源于TCR复合物ζ链(诸如CD3ξ信号传导结构域)、FcγRIII、FcεRI或T淋巴细胞活化结构域。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，例如4-1BB、CD28、CD40、MyD88或CD70结构域。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含两个共刺激结构域，例如4-1BB、CD28、CD40、MyD88或CD70结构域中的任意两个。示例性CAR结构和细胞内信号传导结构域是本领域已知的(参见例如，WO 2009/091826；US 20130287748；WO 2015/142675；WO 2014/055657；和WO 2015/090229，以引用的方式并入本文)。
例如在以下中讨论了对与自身免疫性疾病(例如GVHD、结肠炎和多发性硬化)相关的抗原具有特异性的CAR：Zhang等人,Frontiers in Immunology 9:1-8(2018)；国际公开号WO2017218850A1；和McDonald等人,JCI 2016；126(4):1413-1424，其各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，工程化抗原受体是工程化TCR。工程化TCR包含已从识别特定靶抗原的T细胞群体中分离并克隆的TCRα和/或TCRβ链。例如，TCRα和/或TCRβ基因(即TRAC和TRBC)可以从分离自患有特定疾病的个体的T细胞群体或已分离自用细胞类型免疫的人源化小鼠的T细胞群体中克隆而来。工程化TCR通过与其内源对应物相同的机制识别抗原(例如，通过识别在靶细胞表面上表达的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的背景下呈递的其同源抗原)。这种抗原接合刺激内源信号转导途径，从而导致TCR工程化细胞的活化和增殖。
A.免疫抑制功能
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg表现出一种或多种免疫抑制功能的增加，包括免疫抑制功能的产生、维持和/或增强。在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，本文所述的修饰的Treg表现出以下特征中的一个或多个：增加的增殖、增加的或延长的细胞存活力、改善的稳定性、改善的免疫抑制功能或增加的免疫抑制免疫因子(例如，抗炎细胞因子)的产生。
在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，本文所述的修饰的Treg表现出细胞增殖的增加。在这些实施方案中，结果是在给定的时间段之后，与未修饰的Treg相比，存在的修饰的Treg的数目增加。例如，在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，修饰的Treg表现出增加的增殖速率，其中修饰的Treg以比未修饰的Treg更快的速率分裂。在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，修饰的Treg表现出1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍的增殖速率增加。在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，修饰的Treg表现出延长的增殖时间，其中修饰的Treg和未修饰的Treg以相似的速率分裂，但是其中修饰的Treg维持更长一段时间的增殖状态。在一些实施方案中，修饰的Treg维持增殖状态的时间比未修饰的免疫细胞长1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍。
在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，本文所述的修饰的Treg表现出增加的或延长的细胞存活力。在此类实施方案中，结果是在给定的时间段之后，与未修饰的Treg相比，存在的修饰的Treg的数目增加。例如，在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg保持活力并持续的时间比未修饰的免疫细胞长1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍。
在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，本文所述的修饰的Treg表现出增加的对Treg耗竭的抗性。在一些实施方案中，与来自对照免疫细胞群体的细胞因子产量相比，修饰的免疫效应细胞的细胞因子产量增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。在一些实施方案中，通过与从对照免疫细胞群体观察到的增殖相比，修饰的免疫效应细胞的增殖增加证明了对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与对照免疫细胞群体的增殖相比，修饰的免疫效应细胞的增殖增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加的。
在一些实施方案中，在体外或离体制造过程中，测量了与对照免疫细胞群体相比修饰的Treg的耗竭。
在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，本文所述的修饰的Treg表现出增加的抗炎免疫因子的表达或产量。抗炎或免疫抑制免疫因子的实例包括抗炎或免疫抑制细胞因子，诸如IL-10。在实施方案中，本文所述的修饰的Treg表现出改善的稳定性。在实施方案中，稳定性可以例如通过测量Foxp3 TSDR的甲基化来评估。在实施方案中，本文所述的修饰的Treg表现出改善的免疫抑制功能。在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg对包括IL-17A和IFNγ的促炎症细胞因子没有影响。
在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，本文所述的修饰的Treg表现出增加的Foxp3和/或Helios的表达。在一些实施方案中，与未修饰的Treg相比，本文所述的修饰的Treg表现出增加的Foxp3和Helios的共表达。
用于测量免疫抑制功能的测定是本领域已知的。细胞表面受体表达可以通过流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹和/或qPCR测定。细胞因子和趋化因子的表达和产量可以通过流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹、ELISA和/或qPCR来测量。对细胞外刺激(例如，细胞因子、抑制性配体或抗原)的应答性或敏感性可以通过测定响应于所述刺激的细胞增殖和/或下游信号传导途径的活化(例如下游信号传导中间体的磷酸化)来测量。
B.内源途径和基因的调控
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg表现出降低的一种或多种内源靶基因的表达或功能。在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因存在于与增加的免疫抑制功能相关的途径中。在此类实施方案中，降低的一种或多种内源靶基因的表达或功能增强了免疫细胞的一种或多种免疫抑制功能。
适合通过本文所述的方法调控的示例性途径包括例如Treg增殖、Treg存活力、Treg稳定性和/或Treg免疫抑制活性途径。在一些实施方案中，在修饰的Treg中，内源靶基因在特定途径中的表达降低。在一些实施方案中，在修饰的Treg中，多种(例如，两种或更多种)内源靶基因在特定途径中的表达降低。例如，可以降低2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因在特定途径中的表达。在一些实施方案中，在修饰的Treg中，内源靶基因在一种途径中的表达和内源靶基因在另一种途径中的表达降低。在一些实施方案中，在修饰的Treg中，多种内源靶基因在一种途径中的表达和多种内源靶基因在另一种途径中的表达降低。例如，可以降低2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因在一种途径中的表达，并且可以降低2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因在另一种特定途径中的表达。
在一些实施方案中，多种内源靶基因在多种途径中的表达降低。例如，可以降低多种途径(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种途径)中的每一种中的一种内源基因。在其他方面，可以降低多种途径(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种途径)中的每一种中的多种内源基因(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种基因)。
示例性内源靶基因在下表1中示出。
在一些实施方案中，TNFRSF4的表达降低。TNFRSF4也称为“肿瘤坏死因子超家族成员4”、“ACT35抗原”、“TNFRSF4L受体”、“CD134”、“OX40”和“TAX转录激活的糖蛋白1受体”。TNFRSF4是TNFSF4(也称为OX40L和GP34)的受体。也报道了人TNFRSF4的可溶性同工型(isoform)(Taylor L等人,(2001)J Immunol Methods 255:67-72)。
在一些实施方案中，PRDM1的表达降低。PRDM1也称为“PR结构域锌指蛋白1”、“BLIMP1”、“PRDI-BF1”和“β-干扰素基因正性调节结构域I结合因子”。PRDM1是转录因子。
在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的以下基因中的一种或多种的表达和/或功能：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16或ADNP。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的选自表1的基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的选自表1的至少两种基因(例如，选自TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP的至少两种基因)的表达和/或功能。虽然本文描述了用于修饰TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP的表达的示例性方法，但是这些内源靶基因的表达也可以通过本领域已知的方法修饰。
在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的TNFRSF4的表达。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的PRDM1的表达。
在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的以下基因的表达：TNFRSF4以及PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP中的一种或多种。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的选自表1的基因的表达和降低的TNFRSF4的表达。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的以下基因的表达：PRDM1以及TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP中的一种或多种。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的选自表1的基因的表达和降低的PRDM1的表达。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的TNFRSF4的表达和降低的选自表1的两种基因的表达。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的PRDM1的表达和降低的选自表1的两种基因的表达。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的选自表1的多种基因的表达和降低的TNFRSF4的表达。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的选自表1的多种基因的表达和降低的PRDM1的表达。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的选自表1的两种基因的表达和降低的TNFRSF4的表达。在一些实施方案中，修饰的Treg包含降低的选自表1的两种基因的表达和降低的PRDM1的表达。在一些实施方案中，修饰的Treg可包含降低的PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP中的三种或更多种的表达以及降低的TNFRSF4的表达。在一些实施方案中，修饰的Treg可包含降低的TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP中的三种或更多种的表达以及降低的PRDM1的表达。
在一些实施方案中，TNFRSF4的表达被本文所述的基因调控系统降低。在一些实施方案中，PRDM1的表达被本文所述的基因调控系统降低。
表1：示例性内源基因
Figure BDA0003189135840000341
III.基因调控系统
本文中，术语“基因调控系统”是指当引入细胞中时能够修饰内源靶DNA序列从而调控编码的基因产物的表达或功能的蛋白质、核酸或其组合。适用于本公开的方法的多种基因编辑系统是本领域已知的，包括但不限于shRNA、siRNA、锌指核酸酶系统、TALEN系统和CRISPR/Cas系统。
如本文所用，“调控”在提及基因调控系统对内源靶基因的作用时涵盖内源靶基因序列的任何变化，内源靶基因的表观遗传状态的任何变化，和/或由内源靶基因编码的蛋白质的表达或功能的任何变化。
在一些实施方案中，基因调控系统可介导内源靶基因序列的变化，例如，通过将一个或多个突变引入内源靶序列中，诸如通过在内源靶序列中插入或缺失一个或多个核酸。可以介导内源靶序列的改变的示例性机制包括但不限于非同源末端连接(NHEJ)(例如，经典或替代)、微同源性介导的末端连接(MMEJ)、同源性定向修复(例如，内源供体模板介导的)、SDSA(合成依赖性链退火)、单链退火或单链入侵。
在一些实施方案中，基因调控系统可以介导内源靶序列的表观遗传状态的变化。例如，在一些实施方案中，基因调控系统可介导内源靶基因DNA的共价修饰(例如胞嘧啶甲基化和羟甲基化)或相关组蛋白的共价修饰(例如赖氨酸乙酰化、赖氨酸和精氨酸甲基化、丝氨酸和苏氨酸磷酸化以及赖氨酸泛素化和类泛素化)。
在一些实施方案中，基因调控系统可以介导由内源靶基因编码的蛋白质的表达的变化。在此类实施方案中，基因调控系统可通过修饰内源靶DNA序列或通过作用于由DNA序列编码的mRNA产物来调控编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，基因调控系统可以导致修饰的内源蛋白的表达。在此类实施方案中，由基因调控系统介导的对内源DNA序列的修饰导致内源蛋白的表达，其与未修饰的Treg中的对应内源蛋白相比，表现出降低的功能。在此类实施方案中，与未修饰的免疫细胞中对应的内源蛋白的表达水平相比，修饰的内源蛋白的表达水平可以增加、减少或者可以相同或基本上相似。
A.基于核酸的基因调控系统
如本文所用，基于核酸的基因调控系统是包含一种或多种核酸分子的系统，所述核酸分子能够调控内源靶基因的表达而无需外源蛋白。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶核酸序列互补的RNA干扰分子或反义RNA分子。
“反义RNA分子”是指与mRNA转录物互补的RNA分子，无论长度如何。反义RNA分子是指可以引入细胞、组织或受试者中并通过不依赖于内源基因沉默途径而是依赖于RNA酶H介导的靶mRNA转录物的降解的机制导致内源靶基因产物表达降低的单链RNA分子。在一些实施方案中，反义核酸包含修饰的骨架，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其他骨架，或可以包含非天然的核苷间键联。在一些实施方案中，反义核酸可包含锁核酸(LNA)。
如本文所用，“RNA干扰分子”是指通过内源基因沉默途径(例如，Dicer和RNA诱导的沉默复合物(RISC))降解靶mRNA来介导内源靶基因产物的降低的表达的RNA多核苷酸。示例性RNA干扰剂包括微小RNA(在本文中也称为“miRNA”)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、RNA适体和吗啉代。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种miRNA。miRNA是指长度约21-25个核苷酸的天然存在的小型非编码RNA分子。miRNA与一种或多种靶mRNA分子至少部分互补。miRNA可以通过翻译抑制、mRNA的切割和/或脱腺苷化来下调(例如降低)内源靶基因产物的表达。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种shRNA。shRNA是长度约50-70个核苷酸的单链RNA分子，其形成茎环结构并导致互补mRNA序列的降解。可以将shRNA克隆到质粒或非复制型重组病毒载体中，以引入细胞内，并导致shRNA编码序列整合到基因组中。因此，shRNA可以提供对内源靶基因翻译和表达的稳定且一致的抑制。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种siRNA。siRNA是指长度通常约21-23个核苷酸的双链RNA分子。siRNA与称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物缔合，在此过程中，“过客”有义链被酶切割。然后，由于序列同源性，活化的RISC中包含的反义“指导”链将RISC指导至对应的mRNA，并且相同的核酸酶切割靶mRNA，从而导致特异性基因沉默。siRNA的长度最佳为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，并在其3'末端具有2个碱基的突出端。可以将siRNA引入单个细胞和/或培养系统，并导致靶mRNA序列的降解。siRNA和shRNA在Fire等人,Nature,391:19,1998和美国专利号7,732,417；8,202,846和8,383,599中进一步描述。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种吗啉代。如本文所用，“吗啉代”是指修饰的核酸寡聚体，其中标准核酸碱基与吗啉环结合并通过二氨基磷酸酯键联连接。类似于siRNA和shRNA，吗啉代与互补mRNA序列结合。然而，吗啉代通过空间抑制mRNA翻译和改变mRNA剪接而不是靶向互补mRNA序列进行降解来发挥作用。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由选自表1中列出的靶基因的DNA序列编码的RNA具有至少90％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由选自表1中列出的靶基因的DNA序列编码的RNA具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由选自表1中列出的靶基因的DNA序列编码的RNA具有100％同一性。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含选自本领域已知的那些siRNA分子或shRNA分子，诸如可购自商业供应商诸如Sigma Aldrich、Dharmacon、ThermoFisher等的siRNA和shRNA构建体。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子(例如，两种或更多种siRNA、两种或更多种shRNA、两种或更多种RNA适体或两种或更多种吗啉代)，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由选自表1的靶基因的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子(例如，两种或更多种siRNA、两种或更多种shRNA、两种或更多种RNA适体或两种或更多种吗啉代)，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由选自表1的靶基因的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子(例如，两种或更多种siRNA、两种或更多种shRNA、两种或更多种RNA适体或两种或更多种吗啉代)，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由选自表1的靶基因的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性。
B.基于蛋白的基因调控系统
在一些实施方案中，基于蛋白的基因调控系统是包含一种或多种蛋白质的系统，所述蛋白质能够以序列特异性方式调控内源靶基因表达而无需核酸指导分子。在一些实施方案中，基于蛋白的基因调控系统包含含有一种或多种锌指结合结构域和酶结构域的蛋白质。在一些实施方案中，基于蛋白的基因调控系统包含含有转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)结构域和酶结构域的蛋白质。此类实施方案在本文中被称为“TALEN”。
1.锌指系统
基于锌指的系统包含融合蛋白，所述融合蛋白包含两种蛋白结构域：锌指DNA结合结构域和酶结构域。“锌指DNA结合结构域”、“锌指蛋白”或“ZFP”是通过一种或多种锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述一种或多种锌指是其结构通过锌离子配位而稳定的结合结构域内的氨基酸序列区。锌指结构域通过与靶DNA序列结合，将酶结构域的活性导向序列的附近，并因此诱导靶序列附近的内源靶基因的修饰。锌指结构域可以被工程化以实际上与任何所需的序列结合。因此，在鉴定出包含需要切割或重组的靶DNA序列的靶遗传基因座(例如，表1中提及的靶基因中的靶基因座)之后，可将一种或多种锌指结合结构域工程化以与靶遗传基因座中的一种或多种靶DNA序列结合。包含锌指结合结构域和酶结构域的融合蛋白在细胞中的表达影响靶遗传基因座的修饰。
在一些实施方案中，锌指结合结构域包含一个或多个锌指。Miller等人(1985)EMBO J.4:1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American Febuary:56-65；美国专利号6,453,242。通常，单个锌指结构域的长度为约30个氨基酸。单个锌指与三核苷酸(即三联体)序列(或可以与相邻锌指的四核苷酸结合位点重叠一个核苷酸的四核苷酸序列)结合。因此，锌指结合结构域被工程化以结合的序列(例如靶序列)的长度将决定工程化锌指结合结构域中锌指的数目。例如，对于其中指基序不与重叠的亚位点结合的ZFP，六核苷酸靶序列被两指结合结构域结合；九核苷酸靶序列被三指结合结构域结合，诸如此类。靶位点中单个锌指的结合位点(即亚位点)不必是连续的，而是可以被一个或若干个核苷酸隔开，这取决于多指结合结构域中锌指之间氨基酸序列(即指间接头)的长度和性质。在一些实施方案中，单个ZFN的DNA结合结构域包含三与六个之间的单个锌指重复序列，并且每个可识别9与18个之间的碱基对。
锌指结合结构域可以被工程化以与选择的序列结合。参见例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可以具有新颖的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。
用于被锌指结构域结合的靶DNA序列的选择可以例如根据美国专利号6,453,242中公开的方法来完成。本领域技术人员将清楚，核苷酸序列的简单视觉检查也可用于选择靶DNA序列。因此，用于靶DNA序列选择的任何手段均可用于本文所述的方法。靶位点通常具有至少9个核苷酸的长度，并因此被包含至少三个锌指的锌指结合结构域结合。然而，例如4指结合结构域与12核苷酸靶位点的结合，5指结合结构域与15核苷酸靶位点的结合或6指结合结构域与18核苷酸靶位点的结合也是可以的。显而易见，较大的结合结构域(例如7、8、9指和更多指)与较长的靶位点的结合也是可以的。
在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指系统选自本领域已知的那些，诸如可购自商业供应商诸如Sigma Aldrich的那些。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有100％同一性。
锌指融合蛋白的酶结构域部分可从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可以衍生出酶结构域的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见，例如，2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,Mass.；和Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。切割DNA的其他酶是已知的(例如51核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；也参见Linn等人(编著)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能片段)中的一种或多种可以用作切割结构域的来源。
适合用作本文所述的ZFP的酶结构域的示例性限制性核酸内切酶(限制性酶)存在于许多物种中，并且能够与DNA进行序列特异性结合(在识别位点处)，并能够在结合位点处或附近切割DNA。某些限制性酶(例如，IIS型)在从识别位点去除的位点处切割DNA，并具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶FokI在一条链上距其识别位点9个核苷酸处和在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的酶结构域和一种或多种锌指结合结构域。
其切割结构域可与结合结构域分离的示例性IIS型限制性酶是FokI。这种特定的酶作为二聚体具有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10,570-10,575。因此，对于使用锌指-FokI融合物的靶向双链DNA切割，可以使用两个融合蛋白(每个包含FokI酶结构域)来重构催化活性的切割结构域。可替代地，也可以使用包含锌指结合结构域和两个FokI酶结构域的单个多肽分子。在美国专利号9,782,437中描述了包含FokI酶结构域的示例性ZFP。
2.TALEN系统
基于TALEN的系统包含含有TAL效应子DNA结合结构域和酶结构域的蛋白质。它们是通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域(切割DNA链的核酸酶)融合而制成的。上述的FokI限制性酶是适用于基于TALEN的基因调控系统的示例性酶结构域。
TAL效应子是黄单孢菌属(Xanthomonas)细菌在感染植物时通过其III型分泌系统分泌的蛋白质。DNA结合结构域包含重复的高度保守的33-34个氨基酸的序列，其中第12和第13个氨基酸不同。这两个位置(称为重复可变二残基(RVD))是高度可变的并且与特定性核苷酸识别高度相关。因此，TAL效应子结构域可以被工程化以通过选择包含适当RVD的重复区段的组合来结合特异性靶DNA序列。RVD组合的核酸特异性如下：HD靶向胞嘧啶，NI靶向腺嘌呤，NG靶向胸腺嘧啶，并且NN靶向鸟嘌呤(尽管在一些实施方案中，NN也可以以较低的特异性结合腺嘌呤)。
在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有100％同一性。
用于装配TAL效应子重复序列的方法和组合物是本领域已知的。参见例如，Cermak等人,Nucleic Acids Research,39:12,2011,e82。用于构建TAL效应子重复序列的质粒可购自Addgene。
C.基于组合核酸/蛋白质的基因调控系统
组合基因调控系统包含定点修饰多肽和核酸指导分子。本文中，“定点修饰多肽”是指与核酸指导分子结合的多肽，其通过与其结合的核酸指导分子靶向靶核酸序列(例如，内源靶DNA或RNA序列)，并修饰靶核酸序列(例如，靶核酸序列的切割、突变或甲基化)。
定点修饰多肽包含两个部分，与核酸指导物结合的部分和活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含表现出定点酶活性(例如，DNA甲基化、DNA或RNA切割、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化等)的活性部分，其中酶活性的位点由指导核酸确定。在一些情况下，定点修饰多肽包括具有修饰内源靶核酸序列的酶活性(例如，核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性)的活性部分。在其他情况下，定点修饰多肽包含具有修饰与内源靶核酸序列相关联的多肽(例如组蛋白)的酶活性(例如甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酰化活性、脱腺苷酰化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性或脱豆蔻酰化活性)的活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含调节靶DNA序列的转录(例如，增加或减少转录)的活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含调节靶RNA序列的表达或翻译(例如，增加或减少转录)的活性部分。
核酸指导物包含两个部分：与内源靶核酸序列互补并能够与其结合的第一部分(本文中称为“核酸结合区段”)，以及能够与定点修饰多肽相互作用的第二部分(本文中称为“蛋白质结合区段”)。在一些实施方案中，核酸指导物的核酸结合区段和蛋白质结合区段包含在单个多核苷酸分子内。在一些实施方案中，核酸指导物的核酸结合区段和蛋白质结合区段各自包含在单独的多核苷酸分子内，使得核酸指导物包含两个彼此缔合以形成功能性指导物的多核苷酸分子。
核酸指导物通过与靶核酸序列特异性杂交来介导组合的蛋白质/核酸基因调控系统的靶特异性。在一些实施方案中，靶核酸序列是RNA序列，诸如包含在靶基因的mRNA转录物中的RNA序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是包含在靶基因的DNA序列中的DNA序列。本文提及靶基因涵盖所述特定基因的全长DNA序列，其包含多个靶遗传基因座(即，特定靶基因序列的部分(例如，外显子或内含子))。在每个靶遗传基因座内的是本文中称为“靶DNA序列”的DNA序列的较短片段，其可以通过本文所述的基因调控系统进行修饰。此外，每个靶遗传基因座包含“靶修饰位点”，其是指由基因调控系统诱导的修饰的精确位置(例如，插入、缺失或突变的位置，DNA断裂的位置或表观遗传修饰的位置)。
本文所述的基因调控系统可包含单个核酸指导物，或可包含多个核酸指导物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸指导物)。
在一些实施方案中，组合的蛋白质/核酸基因调控系统包含衍生自Argonaute(Ago)蛋白(例如，T.thermophiles Ago或TtAgo)的定点修饰多肽。在此类实施方案中，定点修饰多肽是T.thermophiles Ago DNA核酸内切酶，并且核酸指导物是指导DNA(gDNA)(参见，Swarts等人,Nature 507(2014),258-261)。在一些实施方案中，本公开提供了编码gDNA的多核苷酸。在一些实施方案中，gDNA编码核酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。在一些实施方案中，本公开提供了编码TtAgo定点修饰多肽或其变体的多核苷酸。在一些实施方案中，编码TtAgo定点修饰多肽的多核苷酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。
在一些实施方案中，本文所述的基因编辑系统是CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)核酸酶系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是2类系统。2类CRISPR/Cas系统分为三种类型：II型、V型和VI型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas9蛋白的2类II型系统。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas9 DNA核酸内切酶(或其变体)，并且核酸指导分子是指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas12蛋白(例如，Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b(也称为C2c1)、Cas12c(也称为C2c3)、Cas12d(也称为CasY)和Cas12e(也称为CasX))的2类V型系统。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas12DNA核酸内切酶(或其变体)，并且核酸指导分子是gRNA。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas13蛋白(例如，Cas13a(也称为C2c2)、Cas13b和Cas13c)的2类VI型系统。(参见，Pyzocha等人,ACS Chemical Biology,13(2),347-356)。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas13 RNA核糖核酸内切酶，并且核酸指导分子是gRNA。
Cas多肽是指可以与gRNA分子相互作用并且与gRNA分子一起归巢或定位于靶DNA或靶RNA序列的多肽。Cas多肽包括天然存在的Cas蛋白，以及与天然存在的Cas序列相差一个或多个氨基酸残基的工程化的、改变的或以其他方式修饰的Cas蛋白。
指导RNA(gRNA)包含两个区段，DNA结合区段和蛋白质结合区段。在一些实施方案中，gRNA的蛋白质结合区段包含在一个RNA分子中，而DNA结合区段包含在另一个单独的RNA分子中。此类实施方案在本文中称为“双分子gRNA”或“两分子gRNA”或“双gRNA”。在一些实施方案中，gRNA是单个RNA分子，并且在本文中被称为“单指导RNA”或“sgRNA”。术语“指导RNA”或“gRNA”是包含性的，是指两分子指导RNA和sgRNA两者。
gRNA的蛋白质结合区段部分地包含两个互补的核苷酸片段，它们彼此杂交以形成双链RNA双链体(dsRNA双链体)，其促进与Cas蛋白的结合。gRNA的核酸结合区段(或“核酸结合序列”)包含与特异性靶核酸序列互补并能够与其结合的核苷酸序列。gRNA的蛋白质结合区段与Cas多肽相互作用，并且gRNA分子与定点修饰多肽的相互作用导致Cas与内源核酸序列结合，并在靶核酸序列内或周围产生一个或多个修饰。靶修饰位点的精确位置由以下两者确定：(i)gRNA与靶核酸序列之间的碱基配对互补性；和(ii)短基序(称为前间隔序列邻近基序(PAM))在靶DNA序列中的位置(在靶RNA序列中称为前间隔序列侧翼序列(PFS))。PAM/PFS序列是Cas与靶核酸序列结合所必需的。多种PAM/PFS序列是本领域已知的，并适用于特定的Cas核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶)(参见例如，Nat Methods.2013年11月；10(11):1116–1121和Sci Rep.2014；4:5405)。在一些实施方案中，PAM序列位于靶DNA序列中靶修饰位点的50个碱基对内。在一些实施方案中，PAM序列位于靶DNA序列中靶修饰位点的10个碱基对内。可以通过这种方法靶向的DNA序列仅受限于PAM序列与靶修饰位点的相对距离以及介导序列特异性的gRNA介导的Cas结合的独特20个碱基对序列的存在。在一些实施方案中，PFS序列位于靶RNA序列的3'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的5'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的3'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的内含子或外显子内。
在一些实施方案中，本公开提供了编码gRNA的多核苷酸。在一些实施方案中，编码gRNA的核酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。在一些实施方案中，本公开提供了编码定点修饰多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码定点修饰多肽的多核苷酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。
1.Cas蛋白
在一些实施方案中，定点修饰多肽是Cas蛋白。可使用任何Cas蛋白，包括本文提供的那些。多种物种的Cas分子可用于本文所述的方法和组合物中，包括来源于以下的Cas分子酿脓链球菌(S.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、嗜热链球菌(S.thermophiles)、燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌属物种(Actinomyces sp.)、Cycliphilus denitrificans、少食氨基单胞菌(Aminomonas paucivorans)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp)、海洋芽小梨形菌(Blastopirellulamarina)、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterospoxus)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、拉里弯曲杆菌(Campylobacter lari)、Candidatus puniceispirillum、解纤梭菌(Clostridium cellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒杆菌(Corynebacterium matruchotii)、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、伽马变形杆菌(Gammaproteobacterium)、重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、流感嗜血菌(Haemophilusparainfluenzae)、唾液嗜血菌(Haemophilus sputomm)、加拿大螺杆菌(Helicobactercanadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、雪貂螺杆菌(Helicobactermustelae)、多养型泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、金氏金菌(Kingella kingae)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、李斯特菌科细菌(Listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌属物种(Methylocystis sp.)、发孢甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟氏菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟氏菌属物种(Neisseria sp.)、沃氏奈瑟氏菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌属物种(Nitrosomonas sp.)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、食琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacteriumsuccinatutens)、蒲桃雷尔氏菌(Ralstonia syzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属物种(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌属物种(Sphingomonas sp.)、葡萄园芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus vineae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、罕见小球菌属物种(Subdoligranulum sp.)、运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)、密螺旋体属物种(Treponema sp.)或Verminephrobacter eiseniae。
在一些实施方案中，Cas蛋白是天然存在的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶选自由以下组成的组：C2C1、C2C3、Cpf1(也称为Cas12a)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3和Csf4。
在一些实施方案中，Cas蛋白是核糖核酸内切酶，诸如Cas13蛋白。在一些实施方案中，Cas13蛋白是Cas13a(Abudayyeh等人,Nature 550(2017),280-284)、Cas13b(Cox等人,Science(2017)358:6336,1019-1027)、Cas13c(Cox等人,Science(2017)358:6336,1019-1027)或Cas13d(Zhang等人,Cell 175(2018),212-223)蛋白。
在一些实施方案中，Cas9蛋白是任何Cas9蛋白，包括本文具体提供的任何Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白是野生型或天然存在的Cas9蛋白或Cas9直系同源物。野生型Cas9是一种多结构域酶，其使用HNH核酸酶结构域来切割DNA的靶链，并使用RuvC样结构域来切割非靶链。野生型Cas9与DNA的基于gRNA特异性的结合导致双链DNA断裂，其可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)进行修复。示例性的天然存在的Cas9分子在Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述，并且另外的Cas9直系同源物在国际PCT公开号WO 2015/071474中描述。此类Cas9分子包括第1类群细菌科、第2类群细菌科、第3类群细菌科、第4类群细菌科、第5类群细菌科、第6类群细菌科、第7类群细菌科、第8类群细菌科、第9类群细菌科、第10类群细菌科、第11类群细菌科、第12类群细菌科、第13类群细菌科、第14类群细菌科、第15类群细菌科、第16类群细菌科、第17类群细菌科、第18类群细菌科、第19类群细菌科、第20类群细菌科、第21类群细菌科、第22类群细菌科、第23类群细菌科、第24类群细菌科、第25类群细菌科、第26类群细菌科、第27类群细菌科、第28类群细菌科、第29类群细菌科、第30类群细菌科、第31类群细菌科、第32类群细菌科、第33类群细菌科、第34类群细菌科、第35类群细菌科、第36类群细菌科、第37类群细菌科、第38类群细菌科、第39类群细菌科、第40类群细菌科、第41类群细菌科、第42类群细菌科、第43类群细菌科、第44类群细菌科、第45类群细菌科、第46类群细菌科、第47类群细菌科、第48类群细菌科、第49类群细菌科、第50类群细菌科、第51类群细菌科、第52类群细菌科、第53类群细菌科、第54类群细菌科、第55类群细菌科、第56类群细菌科、第57类群细菌科、第58类群细菌科、第59类群细菌科、第60类群细菌科、第61类群细菌科、第62类群细菌科、第63类群细菌科、第64类群细菌科、第65类群细菌科、第66类群细菌科、第67类群细菌科、第68类群细菌科、第69类群细菌科、第70类群细菌科、第71类群细菌科、第72类群细菌科、第73类群细菌科、第74类群细菌科、第75类群细菌科、第76类群细菌科、第77类群细菌科或第78类群细菌科的Cas9分子。
在一些实施方案中，天然存在的Cas9多肽选自由以下组成的组：SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9和NmeCas9。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含与Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737；Hou等人,PNAS Early Edition 2013,1-6)中描述的Cas9氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Cas多肽包含以下活性中的一种或多种：
(a)切口酶活性，即切割核酸分子的单链，例如非互补链或互补链的能力；
(b)双链核酸酶活性，即切割双链核酸的两条链并产生双链断裂的能力，在一个实施方案中，这是存在两种切口酶活性；
(c)核酸内切酶活性；
(d)核酸外切酶活性；和/或
(e)解旋酶活性，即解旋双链核酸的螺旋结构的能力。
在一些实施方案中，将Cas多肽与募集DNA损伤信号传导蛋白、核酸外切酶或磷酸酶的异源蛋白融合，以进一步增加通过一种或另一种修复机制修复靶序列的可能性或速率。在一些实施方案中，野生型Cas多肽与核酸修复模板共表达以促进外源核酸序列通过同源性定向修复的引入。
在一些实施方案中，不同的Cas蛋白(即，来自各种物种的Cas9蛋白)可有利地用于各种提供的方法中，以便利用不同Cas蛋白的各种酶特征(例如，用于不同的PAM序列偏好；用于增加或减小的酶活性；用于增加或减小的细胞毒性水平；改变NHEJ、同源性定向修复、单链断裂、双链断裂等之间的平衡)。
在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于酿脓链球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGG、NAG、NGA(Mali等人,Science 2013；339(6121):823-826)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于嗜热链球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGGNG和/或NNAGAAW(W＝A或T)(参见，例如，Horvath等人,Science,2010；327(5962):167-170，和Deveau等人,J Bacteriol2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于变形链球菌(S.mutans)的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGG和/或NAAR(R＝A或G)(参见，例如，Deveau等人,JBACTERIOL 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NNGRR(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGRRT(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序N GRRV(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序N GATT或NGTTT(R＝A或G，V＝A，G或C)(参见，例如，Hou等人,PNAS 2013,1-6)。在上述实施方案中，N可以是任何核苷酸残基，例如，A、G、C或T中的任一种。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)的Cas13a蛋白，并识别单个3'A、U或C的PFS序列基序。
在一些实施方案中，提供了编码Cas蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公开号WO 2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述的Cas蛋白具有至少90％同一性的Cas蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公开号WO 2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述的Cas蛋白具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的Cas蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公开号WO 2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述的Cas蛋白具有100％同一性的Cas蛋白。
2.Cas突变体
在一些实施方案中，Cas多肽被工程化以改变Cas多肽的一种或多种特性。例如，在一些实施方案中，Cas多肽包含改变的酶特性，例如改变的核酸酶活性(与天然存在的或其他参考Cas分子相比)或改变的解旋酶活性。在一些实施方案中，工程化的Cas多肽可具有改变其大小的改变，例如氨基酸序列的缺失，其减小序列大小，但对Cas多肽的另一种特性没有显著影响。在一些实施方案中，工程化的Cas多肽包含影响PAM识别的改变。例如，可以改变工程化的Cas多肽以识别除了被对应的野生型Cas蛋白识别的PAM序列以外的PAM序列。
具有所需特性的Cas多肽可以通过多种方式制备，包括改变天然存在的Cas多肽或亲本Cas多肽，以提供具有所需特性的突变体或改变的Cas多肽。例如，可以将一个或多个突变引入亲本Cas多肽(例如，天然存在或工程化的Cas多肽)的序列中。此类突变和差异可以包括取代(例如，保守取代或非必需氨基酸的取代)；插入；或缺失。在一些实施方案中，相对于亲本Cas多肽，突变体Cas多肽包含一个或多个突变(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50个突变)。
在一个实施方案中，突变体Cas多肽包含与天然存在的Cas多肽不同的切割特性。在一些实施方案中，Cas是失活的Cas(dCas)突变体。在此类实施方案中，Cas多肽不包含任何内在的酶活性，并且不能介导靶核酸切割。在此类实施方案中，dCas可以与能够以基于非切割的方式修饰靶核酸的异源蛋白融合。例如，在一些实施方案中，dCas蛋白与转录激活物或转录阻遏物结构域(例如，Kruppel相关盒(KRAB或SKD)；Mad mSIN3相互作用结构域(SID或SID4X)；ERF阻遏物结构域(ERD)；MAX相互作用蛋白1(MXI1)；甲基CpG结合蛋白2(MECP2)等)融合。在一些此类情况下，dCas融合蛋白通过gRNA靶向靶核酸中的具体位置(即序列)，并发挥基因座特异性调控，诸如阻断RNA聚合酶与启动子的结合(其选择性抑制转录激活物功能)，和/或修饰局部染色质状态(例如，当使用修饰靶DNA或修饰与靶DNA相关联的多肽的融合序列时)。在一些情况下，变化是瞬时的(例如，转录阻遏或活化)。在一些情况下，变化是可遗传的(例如，当对靶DNA或与靶DNA相关联的蛋白质例如核小体组蛋白进行表观遗传修饰时)。
在一些实施方案中，dCas是dCas13突变体(Konermann等人,Cell173(2018),665-676)。然后可以将这些dCas13突变体与修饰RNA的酶融合，包括腺苷脱氨酶(例如ADAR1和ADAR2)。腺苷脱氨基酶将腺嘌呤转化为肌苷，翻译机制将其视为鸟嘌呤，从而在RNA序列中产生功能性A→G变化。在一些实施方案中，dCas是dCas9突变体。
在一些实施方案中，突变体Cas9是Cas9切口酶突变体。Cas9切口酶突变体仅包含一个催化活性结构域(HNH结构域或RuvC结构域)。Cas9切口酶突变体保留基于gRNA特异性的DNA结合，但仅能够切割一条DNA链，从而导致单链断裂(例如“切口”)。在一些实施方案中，两个互补的Cas9切口酶突变体(例如，一个具有失活的RuvC结构域的Cas9切口酶突变体，以及一个具有失活的HNH结构域的Cas9切口酶突变体)在同一细胞中用对应于两个各自靶序列的两个gRNA表达；一个在有义DNA链上的靶序列，以及一个在反义DNA链上的靶序列。这种双切口酶系统导致交错的双链断裂，并且可以增加靶特异性，因为它不太可能产生两个足够近的脱靶切口以产生双链断裂。在一些实施方案中，Cas9切口酶突变体与核酸修复模板共表达，以促进外源核酸序列通过同源性定向修复的引入。
在一些实施方案中，本文所述的Cas多肽可以被工程化以改变Cas多肽的PAM/PFS特异性。在一些实施方案中，突变体Cas多肽具有与亲本Cas多肽的PAM/PFS特异性不同的PAM/PFS特异性。例如，可以修饰天然存在的Cas蛋白，以改变突变体Cas多肽识别的PAM/PFS序列，来减少脱靶位点、提高特异性或消除PAM/PFS识别需求。在一些实施方案中，可以修饰Cas蛋白以增加PAM/PFS识别序列的长度。在一些实施方案中，PAM识别序列的长度为至少4、5、6、7、8、9、10或15个氨基酸。可以使用定向进化生成识别不同PAM/PFS序列和/或具有降低的脱靶活性的Cas多肽。可用于Cas多肽的定向进化的示例性方法和系统描述于例如Esvelt等人Nature 2011,472(7344):499-503中。
示例性Cas突变体描述于国际PCT公开号WO 2015/161276和Konermann等人,Cell173(2018),665-676中，其以引用的方式整体并入本文。
3.gRNA
本公开提供了将定点修饰多肽定向至具体靶核酸序列的指导RNA(gRNA)。gRNA包含核酸靶向区段和蛋白质结合区段。gRNA的核酸靶向区段包含与靶核酸序列中的序列互补的核苷酸序列。因此，gRNA的核酸靶向区段通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用，并且核酸靶向区段的核苷酸序列确定gRNA将结合的靶核酸内的位置。可以修饰gRNA的核酸靶向区段(例如，通过遗传工程)以与靶核酸序列内的任何所需序列杂交。
指导RNA的蛋白质结合区段与定点修饰多肽(例如Cas蛋白)相互作用以形成复合物。指导RNA通过上述核酸靶向区段将结合的多肽指导至靶核酸内的特定核苷酸序列。指导RNA的蛋白质结合区段包含两个彼此互补并形成双链RNA双链体的核苷酸片段。
在一些实施方案中，gRNA包含两个单独的RNA分子。在此类实施方案中，两个RNA分子中的每个包含彼此互补的核苷酸片段，使得两个RNA分子的互补核苷酸杂交以形成蛋白质结合区段的双链RNA双链体。在一些实施方案中，gRNA包含单个RNA分子(sgRNA)。
gRNA对靶基因座的特异性由核酸结合区段的序列介导，所述区段包含约20个与靶基因座内的靶核酸序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，对应的靶核酸序列的长度为大约20个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的gRNA序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列至少90％互补。在一些实施方案中，本公开的gRNA序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％互补。在一些实施方案中，本公开的gRNA序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列100％互补。
在一些实施方案中，靶核酸序列是RNA靶序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是DNA靶序列。在一些实施方案中，gRNA序列的核酸结合区段与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，gRNA序列的核酸结合区段与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，gRNA序列的核酸结合区段与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1中列出的靶基因的靶DNA序列具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，每种gRNA分子包含DNA结合区段，其中核酸结合区段中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，每种gRNA分子包含核酸结合区段，其中核酸结合区段中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，每种gRNA分子包含核酸结合区段，其中核酸结合区段中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自表1的靶基因的靶DNA序列具有100％同一性。
在一些实施方案中，使用本领域已知的算法(例如Cas-OFF finder)设计本文所述的gRNA序列的核酸结合区段以使脱靶结合最小化，来鉴定特定靶基因座或靶基因所特有的靶序列。
在一些实施方案中，本文所述的gRNA可包含一种或多种引入对核酸酶的稳定性的修饰的核苷或核苷酸。在此类实施方案中，与未修饰的gRNA相比，这些修饰的gRNA可引发降低的先天免疫应答。术语“先天免疫应答”包括对通常病毒或细菌来源的外源核酸(包括单链核酸)的细胞应答，其涉及诱导细胞因子(特别是干扰素)表达和释放以及细胞死亡。
在一些实施方案中，本文所述的gRNA在5'末端处或附近(例如，在其5'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)被修饰。在一些实施方案中，通过包含真核mRNA帽结构或帽类似物(例如，G(5')ppp(5')G帽类似物、m7G(5')ppp(5')G帽类似物或3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G抗反向帽类似物(ARCA))来修饰gRNA的5'末端。在一些实施方案中，通过用磷酸酶(例如小牛肠碱性磷酸酶)处理以除去5'三磷酸基团来修饰体外转录的gRNA。在一些实施方案中，gRNA包含在其3'末端处或附近(例如，在其3'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰。例如，在一些实施方案中，通过添加一个或多个(例如25-200个)腺嘌呤(A)残基来修饰gRNA的3'末端。
在一些实施方案中，修饰的核苷和修饰的核苷酸可以存在于gRNA中，但是也可以存在于其他基因调控系统中，例如，基于mRNA、RNAi或siRNA的系统中。在一些实施方案中，修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一种或多种：
(a)磷酸二酯骨架键联中非连接的磷酸氧中的一个或两个和/或连接的磷酸氧中的一个或多个的改变，例如替换；
(b)核糖组分例如核糖上的2'羟基的改变，例如替换；
(c)用“脱磷”接头批量替换磷酸部分；
(d)天然存在的核碱基的修饰或替换；
(e)核糖磷酸骨架的替换或修饰；
(f)寡核苷酸的3'末端或5'末端的修饰，例如末端磷酸基团的去除、修饰或替换或部分的缀合；以及
(g)糖的修饰。
在一些实施方案中，以上列出的修饰可以组合以提供可以具有两个、三个、四个或更多个修饰的修饰的核苷和核苷酸。例如，在一些实施方案中，修饰的核苷或核苷酸可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一些实施方案中，gRNA的每个碱基均被修饰。在一些实施方案中，gRNA分子的磷酸基团中的每一个均被硫代磷酸酯基团替换。
在一些实施方案中，可以使用软件工具来优化对用户靶序列内gRNA的选择，例如以使整个基因组的总脱靶活性最小化。脱靶活性可能与切割不同。例如，对于使用酿脓链球菌Cas9进行的每种可能的gRNA选择，软件工具可以鉴定整个基因组中所有的包含多达一定数量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)的错配碱基对的潜在脱靶序列(在NAG或NGG PAM之前)。可以例如使用实验得出的加权方案来预测在每个脱靶序列处的切割效率。然后可以根据其总的预测的脱靶切割对每种可能的gRNA进行排序；排序最高的gRNA表示可能具有最大的在靶切割和最小的脱靶切割的那些gRNA。其他功能，例如用于gRNA载体构建的自动试剂设计、用于在靶Surveyor测定的引物设计以及用于通过下一代测序进行高通量检测和脱靶切割定量的引物设计，也可以包括在所述工具中。
IV.产生修饰的调节性T细胞的方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生修饰的Treg的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将基因调控系统引入Treg群体中，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能。
可以使用各种递送方法和制剂以各种形式将本文所述的基因调控系统(例如基于核酸、蛋白质或核酸/蛋白质的系统)的组分引入靶细胞中。在一些实施方案中，通过重组载体(例如，病毒载体或质粒)递送编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸。在一些实施方案中，当系统包含多于一种单一组分时，载体可以包含多个多核苷酸，每个多核苷酸都编码所述系统的组分。在一些实施方案中，当系统包含多于一种单一组分时，可以使用多个载体，其中每个载体包含编码所述系统的特定组分的多核苷酸。在一些实施方案中，载体还可以包含编码信号肽的序列(例如，用于核定位、核仁定位、线粒体定位)，所述序列与编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸融合。例如，载体可以包含与编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸融合的核定位序列(例如，来自SV40)。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入在体外发生。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入在体内发生。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入离体发生。
在一些实施方案中，包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的重组载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于基于以下的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如，Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:1088 1097,1999；WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如，美国专利号7,078,387；Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人，，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,GeneTher 4:683 690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人,Hum MolGenet 5:591 594,1996；Srivastava，WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，，Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi等人,PNAS 94:1031923,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和来源于逆转录病毒的载体，所述病毒诸如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。
在一些实施方案中，包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的重组载体是质粒。许多合适的质粒表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购获得的。以举例的方式提供以下载体；对于真核宿主细胞：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其他质粒载体，只要它与宿主细胞相容即可。根据所用的细胞类型和基因调控系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)都可用于表达载体中(参见例如，Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
在一些实施方案中，编码本文描述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到控制元件，例如转录控制元件，诸如启动子。转录控制元件在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)或原核细胞(例如，细菌或古细菌细胞)中可以是功能性的。在一些实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到多个控制元件，其允许多核苷酸在原核和真核细胞中都表达。根据所用的细胞类型和基因调控系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)都可用于表达载体中(参见例如，Bitter等人(1987)Methodsin Enzymology,153:516-544)。
合适的真核启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-l的启动子。合适的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内。表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。表达载体还可包含编码与定点修饰多肽融合的蛋白质标签(例如，6xHis标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生嵌合多肽。
在一些实施方案中，将编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到诱导型启动子。在一些实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到组成型启动子。
将多核苷酸和重组载体引入宿主细胞的方法是本领域已知的，并且可以使用任何已知方法来将基因调控系统的组分引入细胞。合适的方法包括例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送(参见例如，Panyam等人,Adv Drug Deliv Rev.2012年9月13日.pii:S0169-409X(12)00283-9)、微流体递送方法(参见例如，国际PCT公开号WO 2013/059343)等。在一些实施方案中，经由电穿孔的递送包括将细胞与基因调控系统的组分在盒、室或试管中混合，并施加一个或多个限定持续时间和振幅的电脉冲。在一些实施方案中，将细胞与基因调控系统的组分在连接到装置(例如泵)的容器中混合，所述装置将混合物进料到盒、室或试管中，在其中施加一个或多个具有限定持续时间和振幅的电脉冲，之后将细胞递送到第二容器。适用于在特定实施方案中考虑的特定实施方案的多核苷酸递送系统的说明性实例包括但不限于由Amaxa Biosystems、Maxcyte,Inc.、BTX MolecularDelivery Systems、NeonTM Transfection Systems和Copernicus Therapeutics Inc提供的那些。
在一些实施方案中，将基因调控系统的一种或多种组分或编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列在非病毒递送媒介物中引入细胞，所述非病毒递送媒介物诸如转座子、纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)、脂质体、外来体、减毒细菌或病毒样颗粒。在一些实施方案中，媒介物是减毒细菌(例如，天然或人工工程化成侵入性但减毒以防止致病性，包括单增李斯特菌、某些沙门氏菌属(Salmonella)菌株、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和修饰的大肠杆菌(Escherichia coli))、对靶特异性细胞具有营养和组织特异性向性的细菌以及具有修饰的表面蛋白以改变靶细胞特异性的细菌。在一些实施方案中，媒介物是遗传修饰的噬菌体(例如，具有大包装能力、较低免疫原性、含有哺乳动物质粒维持序列并且掺入了靶向配体的工程化噬菌体)。在一些实施方案中，媒介物是哺乳动物病毒样颗粒。例如，可以生成修饰的病毒颗粒(例如，通过纯化“空”颗粒，然后将病毒与所需物质离体装配)。媒介物也可以被工程化以掺入靶向配体来改变靶组织特异性。在一些实施方案中，媒介物是生物脂质体。例如，生物脂质体是来源于人细胞的基于磷脂的颗粒(例如，红细胞血影，其是被分解成来源于受试者的球形结构的红细胞，并且其中可以通过附着各种组织或细胞特异性配体来实现组织靶向)、分泌性外来体或内吞来源的受试者衍生膜结合的纳米囊泡(30-100nm)(例如，可以由各种细胞类型产生，并因此可以被细胞吸收而无需靶向配体)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg的方法包括从样品获得Treg群体。在一些实施方案中，样品包括组织样品、流体样品、细胞样品、蛋白质样品或者DNA或RNA样品。在一些实施方案中，组织样品可来自体内的任何组织类型，包括但不限于肠道、皮肤、肺、肝、脾、淋巴结和脂肪组织细胞培养基(包含一个或多个细胞群体)、缓冲溶液(包含一个或多个细胞群体)等。
在一些实施方案中，处理样品以从样品的其余部分富集或分离特定的细胞类型，诸如Treg。
在一些实施方案中，在培养物中扩增分离的Treg以产生扩增的Treg群体。可以将一种或多种活化或生长因子在扩增过程中添加到培养系统中。例如，在一些实施方案中，可以将一种或多种细胞因子(诸如TGF-β和/或IL-2)添加到培养系统中以增强或促进细胞增殖和扩增。在一些实施方案中，可以将一种或多种活化抗体(诸如抗CD3抗体)添加到培养系统中以增强或促进细胞增殖和扩增。在一些实施方案中，Treg可以在扩增过程中与饲养细胞共培养。在一些实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个扩增期。用于免疫细胞的离体扩增的方法是本领域已知的，例如，如美国专利申请公开号20180282694和20170152478以及美国专利号8,383,099和8,034,334中所述。
在培养和扩增过程中的任何时间点，可以将本文所述的基因调控系统引入Treg以产生修饰的Treg群体。在一些实施方案中，在从样品中富集后立即将基因调控系统引入Treg群体。在一些实施方案中，在一个或多个扩增过程之前、期间或之后，将基因调控系统引入Treg群体。在一些实施方案中，在从样品中富集或从受试者中收获之后，并且在任何扩增回合之前，立即将基因调控系统引入Treg群体。在一些实施方案中，在扩增之后将基因调控系统引入Treg群体中。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的修饰的Treg可以立即使用。可替代地，可以将细胞在液氮温度下冷冻并长时间储存，解冻并能够重复使用。在此类情况下，通常将细胞在10％二甲亚砜(DMSO)、50％血清、40％缓冲培养基或本领域中通常用于在此类冷冻温度下保存细胞的某种其他这种溶液中冷冻，并以本领域公知的用于解冻冷冻的培养细胞的方式进行解冻。
在一些实施方案中，可以在不同的培养条件下对修饰的Treg进行体外培养。细胞可以在培养物中扩增，即在促进其增殖的条件下生长。培养基可以是液体或半固体，例如含有琼脂、甲基纤维素等。细胞群体可以悬浮在适当的营养培养基中，诸如Iscove改良DMEM或RPMI 1640，通常补充有胎牛血清(约5-10％)、L-谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)和抗生素，例如青霉素和链霉素。培养物可能含有调节性T细胞对之有应答的生长因子。如本文所定义，生长因子是能够通过对跨膜受体的特定作用而在培养物中或在完整组织中促进细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。
A.使用CRISPR/Cas系统产生修饰的调节性T细胞
在一些实施方案中，产生修饰的Treg的方法包括使靶DNA序列与包含gRNA和Cas多肽的复合物接触。如上所述，gRNA和Cas多肽形成复合物，其中gRNA的DNA结合结构域将复合物靶向靶DNA序列，并且其中Cas蛋白(或与无酶活性的Cas蛋白融合的异源蛋白)修饰靶DNA序列。在一些实施方案中，在将gRNA和Cas蛋白(或编码gRNA和Cas蛋白的多核苷酸)引入细胞之后，在细胞内形成此复合物。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的核酸是DNA核酸，并将其通过转导引入细胞。在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑系统的Cas9和gRNA组分由单个多核苷酸分子编码。在一些实施方案中，编码Cas蛋白和gRNA组分的多核苷酸包含在病毒载体中，并通过病毒转导引入细胞。在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑系统的Cas9和gRNA组分由不同的多核苷酸分子编码。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的多核苷酸包含在第一病毒载体中，而编码gRNA的多核苷酸包含在第二病毒载体中。在此实施方案的一些方面中，将第一病毒载体在第二病毒载体之前引入细胞。在此实施方案的一些方面中，将第二病毒载体在第一病毒载体之前引入细胞。在此类实施方案中，载体的整合导致Cas9和gRNA组分的持续表达。然而，Cas9的持续表达可能会在一些细胞类型中导致增加的脱靶突变和切割。因此，在一些实施方案中，可以通过转染将编码Cas蛋白的mRNA核酸序列引入细胞群体。在此类实施方案中，Cas9的表达将随时间推移而降低，并且可以减少脱靶突变或切割位点的数目。
在一些实施方案中，通过将gRNA分子和Cas蛋白混合在一起并孵育足以允许复合物形成的一段时间，在无细胞系统中形成此复合物。然后可以将包含gRNA和Cas蛋白并且在本文中称为CRISPR-核糖核蛋白(CRISPR-RNP)的此预形成的复合物引入细胞中，以便修饰靶DNA序列。
B.使用shRNA系统产生修饰的调节性T细胞
在一些实施方案中，一种产生修饰的Treg的方法，其将编码一种或多种具有与靶基因的mRNA转录物互补的序列的shRNA分子的一种或多种DNA多核苷酸引入细胞中。可以经由小基因盒将具体的DNA序列引入细胞核中，从而修饰Treg以产生shRNA。逆转录病毒和慢病毒均可用于将编码shRNA的DNA引入Treg中。引入的DNA可以成为细胞自身DNA的一部分或保留在细胞核中，并指导细胞机制以产生shRNA。
V.组合物和试剂盒
如本文所用，术语“组合物”是指本文所述的基因调控系统或修饰的Treg的制剂，其能够施用或递送至受试者或细胞。通常，制剂包括所有生理上可接受的组合物，包括其衍生物和/或前药、溶剂化物、立体异构体、外消旋体或互变异构体，以及任何生理上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。“治疗性组合物”或“药物组合物”(在本文中可互换使用)是基因调控系统或修饰的Treg的组合物，其能够施用于受试者以治疗特定的疾病或病症，或者与细胞接触以修饰一种或多种内源靶基因。
本文采用短语“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内、适用于与人类和动物组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
在一些实施方案中，本公开提供用于实施本文所述方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可包括：
(a)一种或多种核酸分子，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
(b)一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的核酸分子；
(c)一种或多种蛋白质，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
(d)一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的修饰蛋白质；
(e)一种或多种gRNA，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
(f)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gRNA；
(g)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
(h)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
(i)一种或多种指导DNA(gDNA)，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
(j)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gDNA；
(k)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
(l)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
(m)一种或多种gRNA，其能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合；
(n)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合的gRNA；
(o)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列；
(p)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列的定点修饰多肽；
(q)本文所述的修饰的Treg；或
(r)以上的任何组合。
在一些实施方案中，试剂盒包含基因调控系统的一种或多种组分(或编码一种或多种组分的一种或多种多核苷酸)和用于重构和/或稀释组分的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含基因调控系统的一种或多种组分(或编码一种或多种组分的一种或多种多核苷酸)，并且还包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：用于将基因调控系统引入细胞中的缓冲液；洗涤缓冲液；对照试剂；对照表达载体或RNA多核苷酸；用于由DNA体外产生基因调控系统的试剂等。试剂盒的组分可以在单独的容器中或可以组合在单个容器中。
除上述组分以外，在一些实施方案中，试剂盒还包括使用试剂盒的组分来实施本公开的方法的说明书。用于实施所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在诸如纸或塑料等的基底上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中或存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关联)。在其他实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质例如CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等上的电子存储数据文件存在。在其他实施方案中，试剂盒中不存在实际的说明书，但是提供了例如经由互联网从远程来源获得说明书的手段。此实施方案的一个实例是一种试剂盒，其包括网址，在所述网址上可以查看和/或可以从中下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书的手段被记录在合适的基底上。
VI.治疗方法与应用
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg和基因调控系统可用于多种治疗应用。例如，在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg和/或基因调控系统可出于诸如基因疗法(例如用于治疗疾病)、用作自身免疫性疾病治疗剂或用于生物学研究的目的而施用于受试者。
在一些实施方案中，受试者可以是新生儿、青少年或成人。特别感兴趣的是哺乳动物受试者。可以用本方法治疗的哺乳动物物种包括犬科动物和猫科动物；马；牛；羊等和灵长类动物，特别是人类。动物模型，特别是小型哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔等)可用于实验研究。
本文所述的修饰的Treg，其群体及其组合物的施用可以通过注射、冲洗、吸入、食用、电渗、血液透析、离子电渗和本领域已知的其他方法进行。在一些实施方案中，施用途径是局部的或全身的。在一些实施方案中，施用途径是动脉内、颅内、皮内、十二指肠内、乳腺内、脑膜内、腹膜内、鞘内、肿瘤内、静脉内、玻璃体内、眼科、肠胃外、脊髓、皮下、输尿管、尿道、阴道或子宫内。
在一些实施方案中，施用途径是通过输注(例如连续或推注)。用于局部施用(即，递送至损伤或疾病部位)的方法的实例包括通过例如用于鞘内递送的Ommaya贮器(参见例如美国专利号5,222,982和5,385,582，其以引用的方式并入本文)；通过推注，例如通过注射器，例如注射到关节；通过连续输注，例如通过诸如具有对流的插管(参见例如，美国专利申请公开号2007-0254842，其以引用的方式并入本文)；或通过植入其上已经可逆地固定细胞的装置(参见例如美国专利申请公开号2008-0081064和2009-0196903，其以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，施用途径是通过局部施用或直接注射。在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg可以单独地或与合适的底物或基质一起提供给受试者，例如以支持所述细胞在它们移植至其中的组织中生长和/或组织化。
在一些实施方案中，向受试者施用至少1x103个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用至少5x103个细胞、1x104个细胞、5x104个细胞、1x105个细胞、5x105个细胞、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、1x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010、1x1011、5x1011、1x1012、5x1012或更多个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x107与约1x1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x108与约1x1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x109与约1x1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x1010与约1x1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x1011与约1x1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x107与约1x1011个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x107与约1x1010个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x107与约1x109个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x107与约1x108个之间的细胞。向受试者施用治疗的次数可以变化。在一些实施方案中，将修饰的Treg引入受试者可以是一次性事件。在一些实施方案中，此类治疗可能需要持续的一系列重复治疗。在一些实施方案中，在观察到效果之前，可能需要多次施用修饰的Treg。确切的方案取决于疾病或病状、疾病的阶段以及所治疗的个体受试者的参数。
在一些实施方案中，本文所述的基因调控系统用于在体内修饰细胞DNA或RNA，诸如用于基因疗法或生物学研究。在此类实施方案中，基因调控系统可以诸如通过上文所述的方法直接施用于受试者。在一些实施方案中，本文所述的基因调控系统用于离体或在体外修饰Treg群体。在此类实施方案中，将本文所述的基因调控系统施用于包含Treg的样品。
在一些实施方案中，将本文所述的修饰的Treg施用于受试者。在一些实施方案中，施用于受试者的本文所述的修饰的Treg是自体Treg。在上下文中，术语“自体的”是指来源于它们所施用的同一受试者的细胞。例如，可以从受试者获得Treg，将其根据本文所述的方法离体修饰，然后施用于同一受试者以便治疗疾病。在此类实施方案中，施用于受试者的细胞是自体Treg。在一些实施方案中，施用于受试者的修饰的Treg或其组合物是同种异体Treg。在上下文中，术语“同种异体”是指来源于一个受试者但施用于另一个受试者的细胞。例如，可以从第一受试者获得Treg，将其根据本文所述的方法离体修饰，然后施用于第二受试者以便治疗疾病。在此类实施方案中，施用于受试者的细胞是同种异体Treg。
在一些实施方案中，将本文所述的修饰的Treg施用于受试者以便治疗疾病。在一些实施方案中，治疗包括将有效量的细胞群体(例如，修饰的Treg群体)或其组合物递送至有需要的受试者。在一些实施方案中，治疗是指治疗哺乳动物例如人的疾病，包括(a)抑制疾病，即，阻止疾病发展或预防疾病进展；(b)缓解疾病，即，使疾病状态消退或缓解疾病的一种或多种症状；以及(c)治愈疾病，即改善一种或多种疾病症状。在一些实施方案中，治疗可以指一种或多种疾病症状的短期(例如暂时和/或急性)和/或长期(例如持续)减轻。在一些实施方案中，治疗导致疾病症状的改善或补救。所述改善是可观察到的或可测量的改善，或者可以是受试者的总体健康感觉的改善。
施用于特定受试者的修饰的Treg的有效量将取决于多种因素，其中若干个因素因患者而异，包括所治疗的病症和病症的严重性；所用具体药剂的活性；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径；治疗的持续时间；组合使用的药物；处方医师的判断；以及医学领域中已知的类似因素。
在一些实施方案中，修饰的Treg的有效量将是至少1x103个细胞，例如5x103个细胞、1x104个细胞、5x104个细胞、1x105个细胞、5x105个细胞、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、1x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010、1x1011、5x1011、1x1012、5x1012或更多个细胞。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Treg和基因调控系统可用于治疗自身免疫性病症。除非另外说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文可互换使用。如本文所用，术语“自身免疫性病症”是起源于并针对个体自身组织或器官的疾病或病症，或其共分离体(co-segregate)或表现或由其产生的病况。自身免疫性疾病主要由适应性免疫应答失调引起，并且形成针对自身结构的自身抗体或自身反应性T细胞。
示例性自身免疫性病症包括自身免疫性肝炎、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病、结肠炎、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、斑秃、血管炎、颞关节炎、狼疮、腹腔疾病、休格连氏综合征、风湿性多肌痛、多发性硬化、关节炎、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)和牛皮癣。
以引用的方式并入
本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。但是，本文中引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及均不是并且不应当被认为承认或以任何形式暗示它们构成了有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常识的一部分。
实施例
实施例1：材料和方法
本文所述的实验利用CRISPR/Cas9系统来调节调节性T细胞(Treg)中内源靶基因的表达，以实现其作为治疗自身免疫性疾病的免疫疗法的临床用途。
I.材料
gRNA：除非另有说明，否则所有实验均使用单分子gRNA(sgRNA)。双gRNA分子如所示使用，并通过在95℃下在无核酸酶的双链体缓冲液(IDT目录号11-01-03-01)中将200μMtracrRNA(IDT目录号1072534)与200μM靶特异性crRNA(IDT)双链化5分钟以形成100μMtracrRNA:crRNA双链体而形成，其中tracrRNA和crRNA以1:1比率存在。
Cas9:通过引入Cas9 mRNA或Cas9蛋白在靶细胞中表达Cas9。除非另有说明，否则在以下实验中使用包含来源于酿脓链球菌的核定位序列(Cas9-NLS mRNA)(Trilink L-7206)的编码Cas9的mRNA或来源于酿脓链球菌的Cas9蛋白(IDT目录号1074182)。
RNP：gRNA-Cas9核糖核蛋白(RNP)通过将1.2μL 100μM tracrRNA:crRNA双链体与1μL 20μM Cas9蛋白和0.8μL PBS组合而形成。将混合物在室温下孵育20分钟以形成RNP复合物。
慢病毒表达构建体：将具有各自靶向人基因组中单个基因的56,408个sgRNA的文库克隆到含有人U6启动子的表达载体中。总计5,137个基因被此gRNA文库靶向。质粒还包含驱动RFP表达的EF1L启动子、T2A序列和嘌呤霉素抗性盒。
编码上述sgRNA文库的慢病毒如下生成。简而言之，在转染前24小时，将578x106个LentiX-293T细胞铺在10层CellSTACK中。将无血清OptiMEM、TransIT-293和辅助质粒(116μg VSVG和231μg PAX2-Gag-Pol)与上述462μg的sgRNA表达质粒合并，并孵育5分钟。将此混合物加入含有新鲜培养基的LentiX-293T细胞中。转染后18小时更换培养基，并且转染后48小时收集病毒上清液。上清液用
Figure BDA0003189135840000721
核酸酶处理，并通过0.45μm过滤器以分离病毒颗粒。然后将病毒颗粒通过切向流过滤(TFF)进行浓缩，等分，滴定并保存在-80℃下。
II.方法
人Treg细胞分离：以逐步的方式从来自健康志愿者血液供体的新鲜leukopack或全血中分离出外周血Treg和CD4+T效应子(Teff)细胞。首先，通过Ficoll梯度离心法获得外周血单核细胞(PBMC)。接下来，使用EasySep人CD4+T细胞分离试剂盒(StemCellTechnologies，目录号17952)通过负性免疫磁珠选择来分离CD4+T细胞。为了富集Treg，用抗CD25-PE的单克隆抗体进一步标记分离的CD4+T细胞，然后使用EasySep人PE阳性选择试剂盒(StemCell Technologies，目录号18561)进行阳性选择。随后用对CD4和CD127具有特异性的单克隆抗体标记富集的CD4+CD25+细胞，之后进行荧光活化细胞分选(FACS)以获得纯Treg群体。基于以下参数对Treg进行分选：CD4+CD25highCD127dim。
人Treg细胞离体扩增：将分离的Treg在补充有人灭活血清AB(10％)和人L-2(60ng/ml或300单位/ml)的X-VIVO 15T细胞扩增培养基(Lonza，目录号04-418Q)中以2x106个细胞/mL接种。在培养第0天和第10天，将抗CD3/CD28 Treg扩增珠或Immunocult HumanCD3/CD28/CD2 T细胞活化剂(四聚体)分别以1:4或1:1的细胞:珠比率加入培养物中，或在活化剂的情况下以1X方式加入。每2-3天，将另外的人IL-2补充到培养物中。
Treg细胞的慢病毒转导：在扩增10天后，使用抗CD3/CD28 Treg扩增珠再活化Treg18小时，之后在1.5mL体积的X-VIVO 15培养基，6ng/mL人IL-2中以每孔5x106个细胞接种于6孔板中。在相同的扩增后，使用Immunocult Human CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂再活化Teff 18小时，之后在1.5mL体积的X-VIVO 15培养基，6ng/mL人IL-2中以每孔5x106个细胞接种于6孔板中。将表达sgRNA文库的慢病毒分别以能够感染所有细胞的80％的MOI添加到两种细胞类型中。向每个孔中添加20μL Retronectin(1mg/mL)。添加X-VIVO 15培养基至最终体积为每孔2.0mL。在室温下将板以600×g旋转1.5小时。18小时(第2天)后，洗涤细胞并将其在X-VIVO 15中以1x106个细胞/mL接种。向Treg培养物中添加60ng/mL IL2，并且向Teff培养物中添加10ng/mL IL2和T细胞活化剂。
T细胞的电穿孔：在指示的情况下，通过电穿孔将gRNA和/或Cas9引入Treg细胞。例如，在用表达特异性sgRNA的慢病毒转导Treg细胞的情况下，可以在转导后将Cas9 mRNA电穿孔到细胞中。可替代地，双gRNA双链体可以与Cas9蛋白复合形成RNP，然后可将其电穿孔到Treg细胞中。Cas9 mRNA或RNP的电穿孔方案如下。
在Treg和Teff细胞再活化三天后(扩增第13天)，收获用表达特异性sgRNA的慢病毒转导的Treg和Teff细胞，并以100x106个细胞/mL的浓度重悬于核转染(nucleofection)缓冲液(来自Amaxa P3 primary cell 4D-Nuclefector X kit S(目录号V4XP-3032)的18％补体1，82％P3缓冲液)中。将酿脓链球菌Cas9-NLS mRNA以每20μL细胞溶液4μg(4μL，1mg/mL)添加到细胞混合物中，然后将24μL的细胞/mRNA混合物添加到每个反应孔。按照“T细胞，Human，Stim”程序(EO-115)进行细胞电穿孔。电穿孔后，向每个孔加入80μL温热的X-VIVO 15培养基，并将细胞在含有IL-2(Treg：60ng/mL；Teff 10ng/mL)的X-VIVO 15培养基中以2x106个细胞/mL的密度汇集到培养瓶中。在再活化后第4天，洗涤细胞、进行计数并将其用于功能测定，如下所述。靶基因的编辑效率通过对表面或细胞内蛋白质(例如CD45、Foxp3)的FACS分析和/或对基因组剪切位点(cut-site)的TIDE/NGS分析来确定。
通过下一代测序评估基因编辑。对于此方法，使用Qiagen Blood and CellCulture DNA Mini Kit(目录号：13323)按照供应商推荐的方案从编辑的T细胞中分离基因组DNA(gDNA)并进行定量。gDNA分离之后，使用基因座特异性PCR引物进行PCR以扩增编辑的基因组DNA的区域，所述引物包含添加Illumina下一代测序衔接子所需的突出端。将所得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，以确保发生了基因组基因座的特异性和充分扩增，然后根据供应商推荐的方案使用Monarch PCR&DNA Cleanup Kit(目录号：T1030S)进行PCR清洁。然后对纯化的PCR产物进行定量，并进行第二次PCR，以退火Illumina测序衔接子和多重测序所需的样品特异性索引序列。此后，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳以评估大小，然后使用AMPure XP珠(内部生产)进行纯化。然后使用Kapa Illumina LibraryQuantification Kit(目录号：KK4923)和Kapa Illumina Library Quantification DNAStandards(目录号：KK4903)通过qPCR对纯化的PCR产物进行定量。然后使用IlluminaNextSeq 500/550Mid Output Reagent Cartridge v2(目录号：FC-404-2003)将定量的产物加载到Illumina NextSeq 500系统上。对所产生的测序数据进行分析以评估在编辑的T细胞库的DNA中预期的剪切位点处的插入和缺失。
编辑的Treg细胞的免疫分型和TSDR分析：在编辑Treg细胞4天后，将细胞用CellTrace Violet试剂标记以追踪细胞分裂，并在人IL-2(500单位/ml)存在下用抗CD3/CD28 Treg扩增珠刺激。刺激4天后，用eBioscience Cell Stimulation Cocktail(加蛋白转运抑制剂)(eBioscience，目录号：00-4975-03)再刺激细胞5小时。用以下抗体进行细胞表面染色：抗CD4(SK3)、抗CD25(MA-251)、抗TNFRSF4(Ber-ACT35)和抗CD45(HI30)。在4℃下，在人FcBlock试剂(BD Biosciences，目录号564219)存在下进行染色20分钟。为了检测细胞内蛋白质，在表面染色后，使用eBioscience Foxp3/Transcription Factor StainingBuffer Set(eBioscience，目录号：00-5523-00)将细胞固定并透性化，并用以下抗体染色：抗Foxp3(259D/C7)、Helios(22F6)和IL-10(JES3-9D7)。LSRFortessa(BD Biosciences)用于数据收集，并且使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。对于TSDR分析，如前所述，使用Qiagen Blood and Cell Culture DNAMini Kit(目录号：13323)按照供应商推荐的方案从编辑的Treg中分离基因组DNA。基因组DNA的亚硫酸氢盐转化和焦磷酸测序通过EpigenDx(测定ID ADS783-FS2)进行，以定量FOXP3基因区域的甲基化状态。
编辑的Treg对同种异体T效应细胞的体外抑制：Treg的抑制功能使用Collison等人(“In vitro Treg suppression assays,”Methods Mol Biol.707:21-37(2011))开发的方法的改进形式来确定。将冷冻的sgRNA编辑的Treg和未编辑的同种异体效应T细胞(以下称为T应答细胞)解冻并在补充有10％灭活男性人类血清和600单位/ml IL-2的X-VIVO 15T细胞扩增培养基(Lonza，目录号04-418Q)中静置过夜。将T应答细胞和Treg在含有0.1％BSA的PBS中洗涤，然后在分别含有10μM CellTrace Violet或4μM CFSE的相同缓冲液中在室温下孵育10分钟。将标记的T应答细胞重悬于T细胞扩增培养基中，并以每孔50,000个细胞(50μl)接种于96孔的U形底板中。在单独的板上，将重悬于T细胞扩增培养基中的标记的Treg以每孔50,000个细胞(50μl)接种，连续稀释，然后与T应答细胞以1:2至1:32的比率混合。最后，将100μl的0.5μl/ml ImmunoCultTM Human CD3/CD28 T细胞活化剂添加到每孔中。不含Treg或CD3/28四聚体的孔分别作为阳性和阴性对照。在37℃下培养4天后，用针对CD4、CD3、Foxp3和Helios的抗体(如上所述)对细胞进行染色。在BD LSRFortessa X-20细胞分析仪(BD Biosciences)上获取数据，并使用FlowJo(TreeStar Inc.)分析T应答细胞的增殖。Treg抑制率确定为：抑制率(％)：100-[100×(％含有Treg的增殖细胞)/(％不含Treg的增殖细胞)。
编辑的Treg体内功能的评估：在移植物抗宿主病(GvHD)的NSG人PBMC异种小鼠模型中评估CRISPR编辑的人Treg降低自身免疫应答的能力。改编了Cuende等人先前描述的模型(“Monoclonal antibodies against GARP/TGF-β1complexes inhibit theimmunosuppressive activity of human regulatory T cells in vivo,”Sci TranslMed.7(284):284ra56(2015))以通过转移人Treg来调节。对雌性NCG小鼠(8至12周龄)静脉内注射20x106个人外周血单核细胞(PBMC)。14天后，将小鼠按体重随机分为4组，每组5只动物，并且对3组静脉内给予2x106个编辑的人Treg。一组作为未治疗的对照，并且不接受Treg治疗。治疗前，通过用包含以下的gRNA/Cas9 RNP复合物电穿孔来编辑人Treg：(1)靶向OR1A1基因的对照gRNA(SEQ ID NO:1GCTGACCAGTAACTCCCAGG)；(2)靶向PRDM1基因的单个gRNA(SEQ ID NO:2TTGGACAGATCTATTCCAGA)；和(3)靶向TNFRSF4基因的单个gRNA(SEQ IDNO:3GGATGTGCGTGGGGGCTCGG)。通过下一代测序评估靶向PRDM1和TNFRSF4基因的gRNA/Cas9复合物的编辑效率，并分别确定为99％和83％。Treg转移后每周测量三次体重和GvHD评分(体重减轻、活性、姿势、皮毛质地和皮肤完整性评分的总和)。还对在Treg转移后15天获得的外周血样品进行流式细胞术，以追踪CD8+T效应细胞的增殖和活化。结果在实施例4中讨论。
实施例2：通过体外CRISPR/CAS9功能基因组筛选对TREG细胞免疫调节靶标的鉴定
进行实验以鉴定在体外扩增期间调节Treg适应度(fitness)的靶标。进行合并的全基因组CRISPR筛选，其中将sgRNA池(每个sgRNA靶向单个基因)引入人Treg细胞或供体匹配的Teff细胞群体中，使得群体中的每个细胞均包含靶向单个基因的单个sgRNA。为了确定特定基因在离体扩增期间对Treg(或Teff细胞)的影响，在实验开始时测定Treg(或Teff细胞)群体中每个sgRNA的频率，并将其与实验中稍后时间点的同一sgRNA的频率进行比较。预期靶向正调控Treg(或Teff细胞)体外扩增的基因(例如，正调控Treg(或Teff细胞)增殖或存活力的基因)的sgRNA的频率随时间推移而增加，而预期靶向负调控Treg(或Teff细胞)体外扩增的基因(例如，负调控Treg(或Teff细胞)增殖或存活力的基因)的sgRNA的频率随时间推移而减少。
分析在体外扩增期间不同的时间点所取的等分试样中每种sgRNA的分布和/或频率，并将其与初始编辑的Treg(或Teff细胞)群体中每种sgRNA的分布和/或频率进行比较。对每个单独的sgRNA进行统计分析，以鉴定在体外扩增后在Treg(或Teff细胞)群体中显著富集的sgRNA，并为每个指导物分配富集得分。对于我们的筛选文库中的每个单独的sgRNA，通过取在筛选终点观察到的指导物计数的比率并除以在筛选开始时观察到的该指导物的读取数来计算富集得分。为了计算基因水平富集得分，计算集合(aggregate)富集得分作为中位sgRNA富集得分。为了计算基因水平富集的统计显著性，计算每个指导物的名义p值作为该指导物相对于文库中所有其他指导物富集的百分位数。使用logit p值合并方法(Mudholkar 1977)合并这些p值，从而生成用于靶富集的集合基因水平p值。使用Benjamini-Hochberg程序对基因水平p值进行多重检测校正。为了鉴定在体外多个sgRNA中对Treg(或Teff细胞)积累具有一致且可重复性影响的靶基因，设置等于或小于0.2的错误发现率(FDR)截止值。这些实验的结果在下表2和图1中示出。表2中的基因是具有前10基因水平富集得分的基因；PRDM1和TNFRSF4是通过了FDR标准的两种基因。
表2：通过百分位数得分鉴定的靶基因
靶名称 富集 FDR
PRDM1 6.84 4.5E-7
TNFRSF4 5.34 1.3E-3
REEP3 3.53 0.43
MRPL32 3.27 0.47
FSCN3 3.26 0.46
KLC3 2.75 0.48
C4BPA 2.67 0.48
LZTS1 2.64 0.43
CDK16 2.60 0.43
ADNP 2.56 0.43
实施例3：TREG细胞免疫调节靶标的验证
选择FDR截止值等于小于0.2的靶标，以单指导的形式进行进一步评估，以确定编辑Treg细胞中的靶基因是否改变这些细胞的稳定性和/或功能。本文描述了示例性靶标的评估，然而这些方法可用于评估上述任何潜在靶标。
编辑的人Treg细胞的免疫分型：如上所述，将人Treg细胞离体分离和扩增，并通过使用以RNP形式与Cas9复合的指导RNA对单独的靶基因进行电穿孔来编辑。如图2所示，使用所述的方法可以实现靶基因的高编辑效率。通过我们的体外CRISPR/Cas9功能基因组学筛选在人Treg细胞中鉴定的单独靶基因的编辑结果通过流式细胞术来确定，以在每个细胞的基础上定量增殖能力上以及已知对Treg稳定性和功能重要的特定转录因子和细胞因子的频率和大小上的任何改变。
用抗CD3/CD28 Treg扩增珠再刺激编辑的Treg细胞，并在第4天评估增殖能力、转录因子表达和细胞因子产生。如图3所示，与对照的CD45编辑的Treg细胞相比，PRDM1编辑的和TNFRSF4编辑的Treg显示CTV染色的平均荧光强度(MFI)分别降低40％和30％。CTV染色减少发生在每一轮细胞分裂期间，因此在编辑的Treg细胞中观察到的CTV染色减少表明PRDM1编辑的和TNFRSF4编辑的Treg细胞的增殖增加。
已知Treg细胞中的转录因子Helios对Treg细胞的稳定性至关重要(Kim HJ,Barnitz RA,Kreslavsky T等人Stable inhibitory activity of regulatory T cellsrequires the transcription factor Helios.Science.2015；350(6258):334-9.)。此外，Helios与Treg谱系决定转录因子Foxp3的结合与核心Treg签名基因的表达密切相关(KwonHK,Chen HM,Mathis D,Benoist C.Different molecular complexes that mediatetranscriptional induction and repression by FoxP3.Nat Immunol.2017；18(11):1238-1248)。因此，Helios和Foxp3在Treg细胞中的共表达与改善的稳定性和增加的免疫抑制功能有关。如图4所示，在Treg细胞中编辑PRDM1导致共表达Foxp3和Helios的Treg细胞比例增加2.6倍，这表明编辑PRDM1导致Treg细胞中与Treg细胞改善的稳定性和免疫抑制功能相关的表型改变。
另外，一些研究表明，Foxp3基因座中名称为Treg特异性去甲基化区域(TSDR)的保守区域的去甲基化是维持在分裂的Treg细胞的后代中的Foxp3表达所需要的(Zheng等人“Role of conserved non-coding DNA elements in the Foxp3 gene in regulatory T-cell fate,”Nature 463:808-12(2010)；Polansky JK等人,“DNA methylation controlsFoxp3 gene expression,”Eur.J.Immunol.38:1654-1663(2008))。如图5所示，编辑TNFRSF4不影响Treg细胞中TSDR的甲基化状态，并且编辑PRDM1增加TSDR的去甲基化(与CD45编辑的对照T reg细胞相比增加27％)。这些数据表明，编辑PRDM1驱动稳定的Treg细胞的积累。
由Treg细胞产生免疫抑制性细胞因子诸如IL-10是Treg细胞能够介导其抑制功能的主要机制。实际上，不能产生IL-10的Treg细胞不能预防效应T细胞介导的炎症(AssemanC,Mauze S,Leach MW,Coffman RL,Powrie F.An essential role for interleukin 10inthe function of regulatory T cells that inhibit intestinal inflammation.J ExpMed.1999；190(7):995-1004)。如图6所示，与CD45编辑的对照Treg细胞相比，在Treg细胞中编辑TNFRSF4导致Treg细胞产生IL-10的能力增加40％。编辑PRDM1导致Treg细胞中IL-10的产生增加10％。类似的实验表明，编辑TNFRSF4不影响促炎症细胞因子，包括IL-17A和IFNγ。
炎症细胞因子诸如IL-6会使Treg去稳定，并削弱其抑制功能(Yang等人,“Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cellprograms,”Immunity 29:44-56(2008))。在小鼠中，IL-6对Treg的去稳定作用在PRDM1不存在的情况下加速(Garg等人,“Blimp1 Prevents Methylation of Foxp3 and Loss ofRegulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation,”Cell Reports 26:1854-1868(2019))。为了确定IL-6是否驱动PRDM1缺陷的人Treg的去稳定作用，在存在或不存在50ng/ml IL-6的情况下培养PRDM1编辑的和对照编辑的Treg。图7A和图7B所示的结果表明，与小鼠Treg相比，PRDM1编辑的人Treg保持稳定性，如通过Helios的高表达所指示，即使在存在大量IL-6的情况下也是如此。
Treg的抑制功能依赖于多种代谢过程，其中一些代谢过程随着Treg在体外的增殖而下调(Thornton AM等人,“CD4+CD25+immunoregulatory T cells suppress polyclonalT cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2production,”J ExpMed.188:287–96(1998)；Kuniyasu Y等人,“Naturally anergic and suppressive CD25(+)CD4(+)T cells as a functionally and phenotypically distinctimmunoregulatory T cell subpopulation,”Int Immunol.12:1145-55(2000))。鉴于编辑PRDM1和TNFRSF4导致Treg的增殖增加，评估此类Treg抑制效应T细胞增殖的能力。在体外共培养系统(参见方法)中，将Treg与标记的效应T细胞以1:2至1:32的比率一起培养4天，PRDM1编辑的和TNFRSF4编辑的Treg都能够抑制效应T细胞的增殖，并且它们的抑制功能与对照编辑的Treg相当(图8)。
综上所述，这些数据表明，采用针对通过我们的CRISPR/Cas9功能基因组筛选所鉴定的基因的单独指导序列来对Treg细胞进行编辑导致了增殖能力上以及已知对Treg稳定性和功能重要的特定转录因子和细胞因子的频率和大小上的明显改变。
实施例4：TREG细胞免疫调节靶标的验证
图9A中的数据显示，与未治疗的小鼠相比，经人Treg治疗的经历GvHD的小鼠的存活有所提高。所有5只未治疗的小鼠体重下降到初始体重以下的时间为25天，而对照编辑的Treg治疗的小鼠为32天。TNFRSF4-/-Treg治疗的组的小鼠到Treg转移后第58天(PBMC转移后72天)保持高于初始测量值的体重。图9B显示了Treg转移后第15天小鼠外周血的流式细胞术数据。Ki67染色强度已被证明是定量细胞增殖能力的替代标记(Miller等人(“Ki67 isa Graded Rather than a Binary Marker of Proliferation versus Quiescence,”CellRep.24(5):1105-1112.e5(2018))。在转移了Treg的所有组中，人CD8细胞的Ki67染色强度均降低，表明Treg能够抑制炎症。此外，发现用TNFRSF4编辑的Treg治疗的小鼠在其CD8+T细胞群体中的Ki67染色强度进一步降低，表明TNFRSF4的丧失导致体内更有效的Treg(图9B)。
序列表
<110> KSQ治疗公司
<120> 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法
<130> 4195.008PC02/EKS/CLD/EJH
<150> US 62/800,121
<151> 2019-02-01
<150> US 62/916,988
<151> 2019-10-18
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OR1A1 gRNA
<400> 1
gctgaccagt aactcccagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PRDM1 gRNA
<400> 2
ttggacagat ctattccaga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFRSF4 gRNA
<400> 3
ggatgtgcgt gggggctcgg 20

Claims (134)

1.一种修饰的调节性T细胞(Treg)，其包含能够降低包含TNFRSF4的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统，
其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述Treg的免疫抑制功能。
2.如权利要求1所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白。
3.如权利要求2所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA的核酸分子。
4.如权利要求2所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含酶蛋白，并且其中所述酶蛋白已经被工程化以与所述内源基因中的一种或多种中的靶序列特异性结合。
5.如权利要求4所述的修饰的Treg，其中所述蛋白质是转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或大范围核酸酶。
6.如权利要求2所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。
7.如权利要求6所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
8.如权利要求6所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂。
9.如权利要求6所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂。
10.如权利要求6所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节所述一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。
11.如权利要求10所述的修饰的Treg，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)和四个串联的mSin3结构域(SID4X)。
12.一种修饰的Treg，其包含能够降低包含PRDM1的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统，
其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述Treg的免疫抑制功能。
13.如权利要求12所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白。
14.如权利要求13所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA的核酸分子。
15.如权利要求13所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含酶蛋白，并且其中所述酶蛋白已经被工程化以与所述内源基因中的一种或多种中的靶序列特异性结合。
16.如权利要求15所述的修饰的Treg，其中所述蛋白质是转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或大范围核酸酶。
17.如权利要求13所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。
18.如权利要求17所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
19.如权利要求17所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂。
20.如权利要求17所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂。
21.如权利要求17所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节所述一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。
22.如权利要求21所述的修饰的Treg，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)和四个串联的mSin3结构域(SID4X)。
23.如权利要求1至22中任一项所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低至少2、3、4、5、6或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
24.一种修饰的Treg，其包含能够降低选自由以下组成的组的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP，
其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述Treg的免疫抑制功能。
25.如权利要求24所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白。
26.如权利要求24所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA的核酸分子。
27.如权利要求24所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含酶蛋白，并且其中所述酶蛋白已经被工程化以与所述内源基因中的一种或多种中的靶序列特异性结合。
28.如权利要求27所述的修饰的Treg，其中所述蛋白质是转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或大范围核酸酶。
29.如权利要求24所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。
30.如权利要求29所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
31.如权利要求29所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂。
32.如权利要求29所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂。
33.如权利要求29所述的修饰的Treg，其中所述Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节所述一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。
34.如权利要求33所述的修饰的Treg，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)或四个串联的mSin3结构域(SID4X)。
35.如权利要求24至34中任一项所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低选自由以下组成的组的多种内源靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
36.如权利要求35所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低选自由以下组成的组的至少2、3、4、5、6或更多种内源靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
37.如权利要求1所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能，其中所述多种靶基因中的至少一种为TNFRSF4，并且其中所述多种靶基因中的至少一种选自PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
38.如权利要求37所述的修饰的Treg，其中所述多种靶基因中的一种为TNFRSF4，并且其中所述多种靶基因中的至少2、3、4、5、6或更多种选自PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
39.如权利要求12所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能，其中所述多种靶基因中的至少一种为PRDM1，并且其中所述多种靶基因中的至少一种选自TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
40.如权利要求39所述的修饰的Treg，其中所述多种靶基因中的一种为PRDM1，并且其中所述多种靶基因中的至少2、3、4、5、6或更多种选自TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
41.如权利要求37至40中任一项所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含多种gRNA分子。
42.如权利要求1至41中任一项所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏引入所述Treg中。
43.如权利要求42所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统以编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。
44.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的Treg，其中所述免疫抑制功能选自Treg增殖、Treg存活力、Treg稳定性、增加的免疫抑制细胞因子的表达或分泌，任选地其中所述免疫抑制细胞因子是IL-10，增加的Foxp3和Helios的共表达和/或对耗竭的抗性。
45.如权利要求44所述的修饰的Treg，其中在用IL-6进行体外培养期间评估Treg稳定性。
46.如权利要求1至45中任一项所述的修饰的Treg，其还包含展示在所述细胞表面上的工程化免疫受体。
47.如权利要求46所述的修饰的Treg，其中所述工程化免疫受体是包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)。
48.如权利要求47所述的修饰的Treg，其中所述工程化免疫受体是工程化T细胞受体(TCR)。
49.如权利要求46至48中任一项所述的修饰的Treg，其中所述工程化免疫受体与靶细胞上表达的抗原特异性结合。
50.如权利要求1至49中任一项所述的修饰的Treg，其中所述Treg是人Treg。
51.一种修饰的Treg，其包含相对于未修饰的Treg中的一种或多种内源基因的表达和/或功能而降低的所述一种或多种内源基因的表达和/或功能，其中所述一种或多种内源基因包含TNFRSF4，并且其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述Treg的免疫抑制功能。
52.一种修饰的Treg，其包含相对于未修饰的Treg中的一种或多种内源基因的表达和/或功能而降低的所述一种或多种内源基因的表达和/或功能，其中所述一种或多种内源基因包含PRDM1，并且其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述Treg的免疫抑制功能。
53.一种修饰的Treg，其包含相对于未修饰的Treg中的一种或多种内源基因的表达和/或功能而降低的所述一种或多种内源基因的表达和/或功能，其中所述一种或多种内源基因选自由以下组成的组：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP，并且其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述Treg的免疫抑制功能。
54.如权利要求51至53中任一项所述的修饰的Treg，其还包含展示在所述细胞表面上的工程化免疫受体。
55.如权利要求54所述的修饰的Treg，其中所述工程化免疫受体是CAR或工程化TCR。
56.如权利要求54或55所述的修饰的Treg，其中所述工程化免疫受体与靶细胞上表达的抗原特异性结合。
57.如权利要求53至56中任一项所述的修饰的Treg，其还包含降低的TNFRSF4的表达。
58.如权利要求57所述的修饰的Treg，其包含降低的TNFRSF4的表达和/或功能以及降低的选自以下的至少一种靶基因的表达和/或功能：PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3,KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
59.如权利要求58所述的修饰的Treg，其包含降低的TNFRSF4的表达和/或功能以及降低的选自由以下组成的组的至少2、3、4、5、6或更多种靶基因的表达和/或功能：PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
60.如权利要求53至56中任一项所述的修饰的Treg，其还包含降低的PRDM1的表达。
61.如权利要求60所述的修饰的Treg，其包含降低的PRDM1的表达和/或功能以及降低的选自以下的至少一种靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
62.如权利要求61所述的修饰的Treg，其包含降低的PRDM1的表达和/或功能以及降低的选自由以下组成的组的至少2、3、4、5、6或更多种靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
63.如权利要求1或权利要求13所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统包含选自siRNA和shRNA的核酸分子。
64.如权利要求63所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统还能够降低选自由以下组成的组的一种或多种内源靶基因的表达：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
65.如权利要求63所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能并且包含多种siRNA或shRNA，其中至少一种内源靶基因选自由以下组成的组：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
66.如权利要求65所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低选自由以下组成的组的至少2、3、4、5、6或更多种内源靶基因的表达和/或功能：TNFRSF4、PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
67.如权利要求63所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能并且包含多种siRNA或shRNA，其中所述多种靶基因中的至少一种为TNFRSF4，并且所述多种靶基因中的至少一种选自PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP2。
68.如权利要求63所述的修饰的Treg，其中所述多种靶基因中的至少一种为TNFRSF4，并且所述多种靶基因中的至少2、3、4、5、6或更多种选自PRDM1、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
69.如权利要求63所述的修饰的Treg，其中所述基因调控系统能够降低多种内源靶基因的表达和/或功能并且包含多种siRNA或shRNA，其中所述多种靶基因中的至少一种为PRDM1，并且所述多种靶基因中的至少一种选自TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP2。
70.如权利要求69所述的修饰的Treg，其中所述多种靶基因中的至少一种为PRDM1，并且所述多种靶基因中的至少2、3、4、5、6或更多种选自TNFRSF4、REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP。
71.如权利要求51至70中任一项所述的修饰的Treg，其中所述Treg是人Teg。
72.一种组合物，其包含如权利要求1至71中任一项所述的修饰的Treg。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述组合物包含至少1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109或1x1010个修饰的Treg。
74.如权利要求72或73所述的组合物，其适合施用于有需要的受试者。
75.如权利要求72至74中任一项所述的组合物，其包含来源于所述有需要的受试者的自体Treg。
76.如权利要求72至74中任一项所述的组合物，其包含来源于供体受试者的同种异体Treg。
77.一种基因调控系统，所述系统能够降低细胞中一种或多种内源靶基因的表达，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白，并且其中所述一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4。
78.如权利要求77所述的基因调控系统，其中所述系统包含指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
79.一种基因调控系统，所述系统能够降低细胞中一种或多种内源靶基因的表达，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白，并且其中所述一种或多种内源靶基因包含PRDM1。
80.如权利要求79所述的基因调控系统，其中所述系统包含指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
81.一种基因调控系统，所述系统能够降低细胞中一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶蛋白；或(iii)核酸分子和酶蛋白，并且其中所述一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP2。
82.如权利要求81所述的基因调控系统，其中所述系统包含指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
83.如权利要求78至82中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
84.如权利要求78至82中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂。
85.如权利要求78至82中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂。
86.如权利要求78至82中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节所述一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。
87.如权利要求86所述的基因调控系统，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域和四个串联的mSin3结构域(SID4X)。
88.如权利要求77、79或81所述的基因调控系统，其中所述系统包含核酸分子，并且其中所述核酸分子是siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA。
89.如权利要求77、79或81所述的基因调控系统，其中所述系统包含蛋白质，所述蛋白质含有DNA结合结构域和酶结构域，并且选自锌指核酸酶和转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。
90.一种试剂盒，其包含如权利要求77至89中任一项所述的基因调控系统。
91.一种gRNA核酸分子，其包含与内源靶基因中的靶序列互补的靶向结构域核酸序列，其中所述内源靶基因是TNFRSF4。
92.一种gRNA核酸分子，其包含与内源靶基因中的靶序列互补的靶向结构域核酸序列，其中所述内源靶基因是PRDM1。
93.一种gRNA核酸分子，其包含与内源靶基因中的靶序列互补的靶向结构域核酸序列，其中所述内源靶基因选自REEP3、MRPL32、FSCN3、KLC3、C4BPA、LZTS1、CDK16和ADNP2。
94.如权利要求91至93中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶序列包含PAM序列。
95.如权利要求91至94中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA是模块化gRNA分子。
96.如权利要求91至94中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA是双gRNA分子。
97.如权利要求91至96中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域的长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多个核苷酸。
98.如权利要求91至97中任一项所述的gRNA分子，其包含在其5'末端处或附近(例如，在其5'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰和/或在其3'末端处或附近(例如，在其3'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰。
99.如权利要求98所述的gRNA分子，其中所述修饰的gRNA在引入T细胞中时表现出增加的对核酸酶的稳定性。
100.如权利要求98或99所述的gRNA分子，其中所述修饰的gRNA在引入T细胞中时表现出降低的先天性免疫应答。
101.一种多核苷酸分子，其编码如权利要求91至100中任一项所述的gRNA分子。
102.一种多核苷酸分子，其编码选自如权利要求91至100中任一项所述的多种gRNA分子。
103.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求91至100中任一项所述的gRNA分子或如权利要求101或102所述的多核苷酸。
104.一种试剂盒，其包含如权利要求91至100中任一项所述的gRNA分子或如权利要求101或102所述的多核苷酸。
105.一种产生修饰的Treg的方法，其包括：
从受试者获得Treg；
将基因调控系统引入所述Treg，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且其中所述一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4；以及
培养所述Treg，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的Treg相比降低。
106.一种产生修饰的Treg的方法，其包括：
从受试者获得Treg；
将基因调控系统引入所述Treg，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且其中所述一种或多种内源靶基因包含PRDM1；以及
培养所述Treg，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的Treg相比降低。
107.一种产生修饰的Treg的方法，其包括：
将基因调控系统引入所述Treg，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中所述一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4。
108.一种产生修饰的Treg的方法，其包括：
将基因调控系统引入所述Treg，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中所述一种或多种内源靶基因包含PRDM1。
109.如权利要求105至108中任一项所述的方法，其中所述基因调控系统是选自权利要求74至86的基因调控系统。
110.如权利要求105至108中任一项所述的方法，其还包括引入编码选自CAR和TCR的工程化免疫受体的多核苷酸序列。
111.如权利要求110所述的方法，其中通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏将所述基因调控系统和/或编码所述工程化免疫受体的所述多核苷酸引入所述Treg中。
112.如权利要求107至111中任一项所述的方法，其中所述基因调控系统以编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸序列、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。
113.一种产生修饰的Treg的方法，其包括：
获得Treg群体；
扩增所述Treg群体；以及
将基因调控系统引入所述Treg群体中，其中所述基因调控系统能够降低包含TNFRSF4的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能。
114.如权利要求113所述的方法，其中在所述扩增之前将所述基因调控系统引入所述Treg群体中。
115.如权利要求113所述的方法，其中在所述扩增之后将所述基因调控系统引入所述Treg群体中。
116.一种产生修饰的Treg的方法，其包括：
获得Treg群体；
扩增所述Treg群体；以及
将基因调控系统引入所述Treg群体中，其中所述基因调控系统能够降低包含PRDM1的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能。
117.如权利要求113所述的方法，其中在所述扩增之前将所述基因调控系统引入所述Treg群体中。
118.如权利要求113所述的方法，其中在所述扩增之后将所述基因调控系统引入所述Treg群体中。
119.如权利要求105至118中任一项所述的方法，其中所述Treg是人Treg。
120.一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的如权利要求1至71中任一项所述的修饰的Treg或如权利要求72至76中任一项所述的组合物。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫性病症。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述自身免疫性病症是自身免疫性肝炎、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病、结肠炎、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、斑秃、血管炎、颞关节炎、狼疮、腹腔疾病、休格连氏综合征、风湿性多肌痛、多发性硬化、关节炎、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)和牛皮癣。
123.如权利要求120至122中任一项所述的方法，其中所述修饰的Treg对于所述受试者是自体的。
124.如权利要求120至122中任一项所述的方法，其中所述修饰的Treg对于所述受试者是同种异体的。
125.一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：
将基因调控系统引入所述Treg，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且其中所述一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4；以及
培养所述Treg，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的Treg相比降低，
其中所述修饰的Treg表现出一种或多种与所述未修饰的Treg相比增强的免疫抑制功能。
126.一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：
将基因调控系统引入所述Treg，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且其中所述一种或多种内源靶基因包含PRDM1；以及
培养所述Treg，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的Treg相比降低，
其中所述修饰的Treg表现出一种或多种与所述未修饰的Treg相比增强的免疫抑制功能。
127.一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：
将基因调控系统引入所述Treg，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中所述一种或多种内源靶基因包含TNFRSF4。
128.一种增强Treg的一种或多种免疫抑制功能的方法，其包括：
将基因调控系统引入所述Treg，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，其中所述一种或多种内源靶基因包含PRDM1。
129.如权利要求125至128中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制功能选自Treg增殖、Treg存活力、Treg稳定性、增加的免疫抑制细胞因子的表达或分泌，任选地其中所述免疫抑制细胞因子是IL-10，增加的Foxp3和Helios的共表达和/或对耗竭的抗性。
130.如权利要求129所述的方法，其中在用IL-6进行体外培养期间评估Treg稳定性。
131.一种治疗有需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法，其包括施用有效量的如权利要求1至71中任一项所述的修饰的Treg或如权利要求72至76中任一项所述的组合物。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：自身免疫性肝炎、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病、结肠炎、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、斑秃、血管炎、颞关节炎、狼疮、腹腔疾病、休格连氏综合征、风湿性多肌痛、多发性硬化、关节炎、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)和牛皮癣。
133.如权利要求1至71中任一项所述的修饰的Treg，其中所述修饰的Treg是组织驻留Treg。
134.如权利要求105至132中任一项所述的修饰的Treg，其中所述Treg是组织驻留Treg。
CN202080011978.1A 2019-02-01 2020-01-31 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 Pending CN113874027A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962800121P 2019-02-01 2019-02-01
US62/800,121 2019-02-01
US201962916988P 2019-10-18 2019-10-18
US62/916,988 2019-10-18
PCT/US2020/016240 WO2020160489A1 (en) 2019-02-01 2020-01-31 Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113874027A true CN113874027A (zh) 2021-12-31

Family

ID=71841677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080011978.1A Pending CN113874027A (zh) 2019-02-01 2020-01-31 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220110974A1 (zh)
EP (1) EP3917546A4 (zh)
JP (1) JP2022519070A (zh)
KR (1) KR20210125509A (zh)
CN (1) CN113874027A (zh)
AU (1) AU2020215725A1 (zh)
BR (1) BR112021014442A2 (zh)
CA (1) CA3128216A1 (zh)
WO (1) WO2020160489A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116897201A (zh) * 2021-02-23 2023-10-17 Ksq治疗公司 用于扩增调节性t细胞的方法
WO2022198055A1 (en) * 2021-03-19 2022-09-22 KSQ Therapeutics, Inc. Uses of antagonist, non-depleting ox40 antibodies
WO2023141531A2 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Orthobio Therapeutics, Inc. Transmembrane receptor gene editing
WO2024036287A1 (en) * 2022-08-12 2024-02-15 Abata Therapeutics, Inc. Stable regulatory t cells and methods of production

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016183041A2 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
WO2017180989A2 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
WO2018089628A1 (en) * 2016-11-09 2018-05-17 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies, anti-gitr antibodies, and methods of use thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100014588A (ko) * 2007-02-27 2010-02-10 제넨테크, 인크. 길항제 ｏｘ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도
WO2018112470A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
AU2018288863A1 (en) * 2017-06-22 2020-01-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof
EP3790962A1 (en) * 2018-05-07 2021-03-17 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modifying regulatory t cells
WO2019237391A1 (zh) * 2018-06-16 2019-12-19 深圳市博奥康生物科技有限公司 CRISPR/Cas9 靶向敲除人 TXGP1 基因及其特异性 gRNA

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016183041A2 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
WO2017180989A2 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
WO2018089628A1 (en) * 2016-11-09 2018-05-17 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies, anti-gitr antibodies, and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20220110974A1 (en) 2022-04-14
EP3917546A4 (en) 2023-03-08
CA3128216A1 (en) 2020-08-06
JP2022519070A (ja) 2022-03-18
EP3917546A1 (en) 2021-12-08
WO2020160489A1 (en) 2020-08-06
AU2020215725A1 (en) 2021-09-23
BR112021014442A2 (pt) 2021-09-21
KR20210125509A (ko) 2021-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230088186A1 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
US11590171B2 (en) Targeted replacement of endogenous T cell receptors
US20200347386A1 (en) Combination gene targets for improved immunotherapy
US20220267727A1 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
JP2022512703A (ja) 免疫療法のための組成物および方法
US20220110974A1 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
CN112040987A (zh) 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法
US11332713B2 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
CN111107856A (zh) 增强基于t细胞的免疫疗法的效力的组合物和方法
TW202235617A (zh) 用於減少細胞中ii類mhc之組合物及方法
CN116802274A (zh) 用于减少细胞中ii类mhc的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination