JP2022519070A - 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法 - Google Patents

免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、Ｔｒｅｇを改変して、治療有効性を向上させることに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させるか、または内在性タンパク質の１つ以上の機能を低下させて、免疫細胞の免疫抑制機能が増強されるように改変したＴｒｅｇを提供する。いくつかの実施形態では、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のように、抗原特異性を付与する導入遺伝子を導入することによってさらに改変したＴｒｅｇを提供する。本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇを用いて、自己免疫疾患を治療する方法も提供する。【選択図】図１

Description

本開示は、標的核酸配列を編集するか、または標的核酸配列の発現を調節するための方法、組成物及び構成成分、ならびに、自己免疫疾患の治療において、Ｔ調節細胞（任意に、受容体導入調節因子Ｔ細胞）とともに使用する用途を含め、それらの免疫療法関連用途に関するものである。
免疫系の応答が不適切または過剰であると、自己免疫疾患を含めて様々な症状が罹患生物に生じる。遺伝子改変Ｔ細胞、特にＣＡＲ－Ｔ細胞を利用する養子細胞移入は、固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍に対する療法として臨床試験段階に入っている。また、養子細胞移入は、がん以外の疾患、例えば、自己免疫障害においても有用である可能性がある。しかし、遺伝子改変免疫細胞の効果を制限する因子には、（１）細胞増殖（例えば、養子移入後のＴ細胞増殖の制限）、（２）細胞生存（例えば、Ｔ細胞アポトーシスの誘導）、ならびに（３）細胞機能（例えば、製造プロセス中及び／または移入後の阻害因子によるＴ細胞機能の阻害及び免疫細胞の疲弊）が含まれる。養子Ｔ細胞の利用は、特に自己免疫障害の治療においては、かなりの成長の余地があり、自己免疫障害治療における改変免疫細胞の養子移入の効果を改善する必要性が存在する。
本明細書で開示する本発明の一態様は、ＴＮＦＲＳＦ４を含む１つ以上の内在標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含むＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）であって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強されるＴｒｅｇに関するものである。本明細書で開示する本発明の一態様は、ＴＮＦＲＳＦ４を含む１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、遺伝子調節系によって低下し、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、改変Ｔｒｅｇに関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、ＰＲＤＭ１を含む１つ以上の内在標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変Ｔｒｅｇであって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強される改変Ｔｒｅｇに関するものである。本明細書で開示する本発明の一態様は、ＰＲＤＭ１を含む１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、遺伝子調節系によって低下し、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、改変Ｔｒｅｇに関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した１つ以上の内在標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変Ｔｒｅｇであって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強される改変Ｔｒｅｇに関するものである。本明細書で開示する本発明の一態様は、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、遺伝子調節系によって低下し、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、改変Ｔｒｅｇに関するものである。
ある特定の実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む。一実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択した核酸分子を含む。一実施形態では、その遺伝子調節システムは、酵素タンパク質を含み、その酵素タンパク質は、その内在性遺伝子うちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである。
一実施形態では、その遺伝子調節システムは、核酸分子及び酵素タンパク質を含み、その核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、その酵素タンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである。一実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である。諸実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である。一実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、不活性化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している。諸実施形態では、その異種タンパク質は、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている。
諸実施形態では、その遺伝子調節システムは、内在性標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。
諸実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した内在性標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。
一実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＲＳＦ４であり、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている。一実施形態では、その複数の標的遺伝子のうちの１つは、ＴＮＦＲＳＦ４であり、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子は、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている。
一実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＰＲＤＭ１であり、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている。一実施形態では、その複数の標的遺伝子のうちの１つは、ＰＲＤＭ１であり、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子は、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節系は、複数のｇＲＮＡ分子を含む。他の実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのＴｒｅｇに、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入されている。諸実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている。
ある特定の実施形態では、その免疫抑制機能は、Ｔｒｅｇ増殖性、Ｔｒｅｇ生存能、Ｔｒｅｇ安定性、免疫抑制性サイトカインの発現または分泌の増加（任意に、その免疫抑制性サイトカインはＩＬ－１０である）、Ｆｏｘｐ３及びＨｅｌｉｏｓの共発現の増加、及び／または疲弊耐性から選択されている。一実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、細胞表面上に提示された操作免疫受容体をさらに含む。諸実施形態では、その操作免疫受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
ある特定の実施形態では、その操作免疫受容体は、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。一実施形態では、その操作免疫受容体は、標的細胞上に発現する抗原に特異的に結合する。
本明細書で開示する本発明の一態様は、非改変Ｔｒｅｇにおける１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能と比較して、１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変Ｔｒｅｇであって、その１つ以上の内在性遺伝子がＴＮＦＲＳＦ４を含み、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強される改変Ｔｒｅｇに関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、非改変Ｔｒｅｇにおける１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能と比較して、１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変Ｔｒｅｇであって、その１つ以上の内在性遺伝子がＰＲＤＭ１を含み、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強される改変Ｔｒｅｇに関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、非改変Ｔｒｅｇにおける１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能と比較して、１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変Ｔｒｅｇであって、その１つ以上の内在性遺伝子がＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択されており、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、そのＴｒｅｇの免疫抑制機能が増強される改変Ｔｒｅｇに関するものである。
いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、細胞表面上に提示された操作免疫受容体をさらに含む。諸実施形態では、その操作免疫受容体は、ＣＡＲまたは操作ＴＣＲである。一実施形態では、その操作免疫受容体は、標的細胞上に発現する抗原に特異的に結合する。
一実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＴＮＦＲＳＦ４の発現低下をさらに含む。一実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＴＮＦＲＳＦ４の発現及び／または機能の低下、ならびにＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択した少なくとも１つの標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。一実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＴＮＦＲＳＦ４の発現及び／または機能の低下、ならびにＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。
一実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＰＲＤＭ１の発現低下をさらに含む。一実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＰＲＤＭ１の発現及び／または機能の低下、ならびにＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択した少なくとも１つの標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。一実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＰＲＤＭ１の発現及び／または機能の低下、ならびにＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。
諸実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡから選択した核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、その遺伝子調節システムはさらに、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる。一実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み、少なくとも１つの内在性標的遺伝子は、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択されている。
ある特定の実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した内在性標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。一実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＲＳＦ４であり、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰ２から選択されている。ある特定の実施形態では、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＲＳＦ４であり、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子は、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている。別の実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＰＲＤＭ１であり、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰ２から選択されている。一実施形態では、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＰＲＤＭ１であり、その複数の標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子は、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている。
本明細書で開示する本発明の一態様は、本明細書で開示する改変Ｔｒｅｇを含む組成物に関するものである。一実施形態では、その組成物は、少なくとも１ｘ１０４個、１ｘ１０５個、１ｘ１０６個、１ｘ１０７個、１ｘ１０８個、１ｘ１０９個または１ｘ１０１０個の改変Ｔｒｅｇを含む。ある特定の実施形態では、その組成物は、その組成物が必要な対象に投与するのに適している。いくつかの実施形態では、その組成物は、その組成物が必要な対象に由来する自家Ｔｒｅｇを含む。一実施形態では、その組成物は、ドナー対象に由来する同種異系Ｔｒｅｇを含む。
本明細書で開示する本発明の一態様は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含み、その１つ以上の内因性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む遺伝子調節システムに関するものである。諸実施形態では、そのシステムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。
本明細書で開示する本発明の一態様は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含み、その１つ以上の内因性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む遺伝子調節システムに関するものである。いくつかの実施形態では、そのシステムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。
本明細書で開示する本発明の一態様は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含み、その１つ以上の内因性標的遺伝子が、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰ２からなる群から選択されている遺伝子調節システムに関するものである。諸実施形態では、そのシステムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。
いずれのＣａｓタンパク質も、本明細書で提供されるものを含めて、使用することができる。諸実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である。ある特定の実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、不活性化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している。
一実施形態では、その異種タンパク質は、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている。
一実施形態では、そのシステムは、核酸分子を含み、その核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、そのシステムは、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている。
本明細書で開示する本発明の一態様は、本明細書で開示する遺伝子調節システムを含むキットに関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、内在性標的遺伝子内の標的配列と相補的であるターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子であって、その内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４である、ｇＲＮＡ核酸分子に関するものである。本明細書で開示する本発明の一態様は、内在性標的遺伝子内の標的配列と相補的であるターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子であって、その内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１である、ｇＲＮＡ核酸分子に関するものである。本明細書で開示する本発明の一態様は、内在性標的遺伝子内の標的配列と相補的であるターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子であって、その内在性標的遺伝子が、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６、及びＡＤＮＰ２から選択されている、ｇＲＮＡ核酸分子に関するものである。
諸実施形態では、その標的配列は、ＰＡＭ配列を含む。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、モジュラーｇＲＮＡ分子である。一実施形態では、ｇＲＮＡは、デュアルｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメインは、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である。一実施形態では、そのｇＲＮＡは、その５’末端もしくはその５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変、及び／またはその３’末端もしくはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変を含む。
いくつかの実施形態では、その改変ｇＲＮＡをＴ細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する安定性が向上する。いくつかの実施形態では、その改変ｇＲＮＡをＴ細胞に導入すると、自然免疫応答が軽減される。
本明細書で開示する本発明の一態様は、本明細書で開示するｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子に関するものである。本明細書で開示する本発明の一態様は、本明細書で開示する複数のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子に関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、本明細書で開示する１つ以上のｇＲＮＡ分子または本明細書で開示するポリヌクレオチドを含む組成物に関するものである。本明細書で開示する本発明の一態様は、本明細書で開示するｇＲＮＡ分子または本明細書で開示するポリヌクレオチドを含むキットに関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、Ｔｒｅｇを対象から採取すること、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、導入すること、ならびにそのＴｒｅｇを培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて低下するようにすることを含む方法に関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、Ｔｒｅｇを対象から採取すること、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、導入すること、ならびにそのＴｒｅｇを培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて低下するようにすることを含む方法に関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、導入することを含む方法に関するものである。本明細書で開示する本発明の一態様は、改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、導入することを含む方法に関するものである。
諸実施形態では、その遺伝子調節システムは、本明細書で開示するいずれかのシステムである。諸実施形態では、その方法は、ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む。諸実施形態では、その遺伝子調節システム及び／またはその操作免疫受容体をコードするそのポリヌクレオチドは、そのＴｒｅｇに、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディスクデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入されている。一実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている。
本明細書で開示する本発明の一態様は、改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、Ｔｒｅｇ集団を採取すること、そのＴｒｅｇ集団を増殖させること、及び遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇ集団に導入することを含み、その遺伝子調節システムが、ＴＮＦＲＳＦ４を含む１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる方法に関するものである。諸実施形態では、増殖前に、その遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇ集団に導入する。一実施形態では、増殖後に、その遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇ集団に導入する。
本明細書で開示する本発明の一態様は、改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、Ｔｒｅｇ集団を採取すること、そのＴｒｅｇ集団を増殖させること、及び遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇ集団に導入することを含み、その遺伝子調節システムが、ＰＲＤＭ１を含む１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる方法に関するものである。一実施形態では、増殖前に、その遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇ集団に導入する。諸実施形態では、増殖後に、その遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇ集団に導入する。
本明細書で開示する本発明の一態様は、治療の必要な対象における疾患または障害の治療方法であって、本明細書で開示する改変Ｔｒｅｇまたは本明細書で開示する組成物を有効量投与することを含む方法に関するものである。
諸実施形態では、その疾患または状態は、自己免疫障害である。諸実施形態では、その自己免疫障害は、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭関節炎、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または乾癬である。ある特定の実施形態では、その自己免疫障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎である。ある特定の実施形態では、その自己免疫障害は、全身性エリテマトーデスである。ある特定の実施形態では、その自己免疫障害は、固形臓器移植、例えば、ＧＶＨＤに関連する自己免疫応答である。ある特定の実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、その対象に対して自家である。一実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、その対象に対し同種異系である。
本明細書で開示する本発明の一態様は、Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、導入すること、ならびにそのＴｒｅｇを培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて低下するようにすることを含み、その改変Ｔｒｅｇにおいて、１つ以上の免疫抑制機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて増強される、方法に関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、導入すること、ならびにそのＴｒｅｇを培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて低下するようにすることを含み、その改変Ｔｒｅｇにおいて、１つ以上の免疫抑制機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて増強される、方法に関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、導入することを含む方法に関するものである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、導入することを含む方法に関するものである。
諸実施形態では、その１つ以上の免疫抑制機能は、Ｔｒｅｇ増殖性、Ｔｒｅｇ生存能、Ｔｒｅｇ安定性、免疫抑制性サイトカインの発現または分泌の増加（任意に、その免疫抑制性サイトカインはＩＬ－１０である）、Ｆｏｘｐ３及びＨｅｌｉｏｓの共発現の増加、及び／または疲弊耐性から選択されている。
本明細書で開示する本発明の一態様は、Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、導入することを含み、その遺伝子調節システムを導入することによって、そのＴｒｅｇの安定性が減少しない、方法に関するものである。そのＴｒｅｇの安定性は、例えば、Ｆｏｘｐ３ ＴＳＤＲのメチル化を測定することによって評価することができる。
本明細書で開示する本発明の一態様は、Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、遺伝子調節システムをそのＴｒｅｇに導入することであって、その遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、導入することを含み、その遺伝子調節システムを導入することによって、そのＴｒｅｇの安定性が向上する、方法に関するものである。そのＴｒｅｇの安定性は、例えば、Ｆｏｘｐ３ ＴＳＤＲのメチル化を測定することによって評価することができる。
したがって、例えば、その遺伝子調節系を導入することによって、脱メチル化Ｆｏｘｐ３ ＴＳＤＲの割合（％）を、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％増加させることができる。その遺伝子調節系を導入することによって、脱メチル化Ｆｏｘｐ３ ＴＳＤＲの割合を、１０～５０％、１０～３０％、１５～５０％、１５～３０％、２０～５０％、２０～３０％、２５～５０％、または２５～３０％増加させることができる。
本明細書で開示する本発明の一態様は、治療の必要な対象における自己免疫疾患の治療方法であって、本明細書で開示する改変Ｔｒｅｇまたは本明細書で開示する組成物を有効量投与することを含む方法に関するものである。諸実施形態では、その自己免疫疾患は、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭関節炎、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び乾癬からなる群から選択されている。ある特定の実施形態では、その自己免疫障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎である。ある特定の実施形態では、その自己免疫障害は、全身性エリテマトーデスである。
本明細書で開示する本発明の一態様は、治療の必要な対象における固形臓器移植（例えば、ＧＶＨＤ）に関連する自己免疫応答の治療方法であって、本明細書で開示する改変Ｔｒｅｇまたは本明細書で開示する組成物を有効量投与することを含む方法に関するものである。
いくつかの態様では、その改変Ｔｒｅｇは、組織常在性Ｔｒｅｇである。いくつかの態様では、そのＴｒｅｇは、組織常在性Ｔｒｅｇである。
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機能的ゲノムスクリーニングによって同定されたＴｒｅｇ選択的標的をまとめたものである。 本明細書に記載されている方法を用いたヒトＴｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３及びＣＤ４５遺伝子の編集を示している。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系における、ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ編集Ｔｒｅｇ細胞の増殖能力の改善を示している。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系における、ＰＲＤＭ１編集Ｔｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋細胞の割合の増加を示している。 Ｔｒｅｇの安定性の尺度であるＦｏｘｐ３ Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）の脱メチル化が、ＴＮＦＲＳＦ４編集Ｔｒｅｇ細胞で維持され、ＰＲＤＭ１編集Ｔｒｅｇ細胞で増加することを示している。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系における、ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ編集Ｔｒｅｇ細胞における免疫抑制性サイトカインであるインターロイキン－１０の産生の増加を示している。 ＰＲＤＭ１編集Ｔｒｅｇ細胞が、炎症条件下で持続することを示している。 ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ４編集Ｔｒｅｇの抑制能力が、コントロール編集Ｔｒｅｇと同程度であることを示している。 ＧｖＨＤモデルにおいて、マウスをＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ４編集Ｔｒｅｇで処置すると、コントロール編集Ｔｒｅｇで処置したマウスと比べて生存期間が延長することを示している。 Ｔｒｅｇ処置の結果としてのＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞の増殖能力の低下を示している。
本開示は、Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）細胞を改変して、自己免疫疾患に対する免疫療法との関連において、その細胞の治療有効性を向上させることに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇを本開示の方法によって改変して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させるか、または内在性タンパク質の１つ以上の機能を低下させて、その免疫細胞の１つ以上の免疫抑制機能が増強されるようにする。いくつかの実施形態では、そのＴｒｅｇは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）発現コンストラクトまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクトの導入のように、抗原特異性を付与する導入遺伝子の導入によって、さらに改変する。いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子調節システムの組成物のように、Ｔｒｅｇを改変するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、自己免疫障害の治療方法であって、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇを、治療の必要な対象に投与することを含む方法を提供する。
Ｉ．定義
本明細書及び添付の請求項で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数の言及物が含まれる。
本明細書で使用する場合、「及び／または」という用語は、本開示では、別段に示されていない限り、「及び」または「または」のいずれかを意味する目的で使用する。
本明細書の全体を通じて、文脈上別段に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形表現は、示されている要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群が含まれるが、いずれの他の要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群も排除されないことを示唆していると理解するものとする。
本願で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、同義語として使用する。本願で用いられている数字であって、約／およそが付されているかまたは付されていないいずれの数字も、当業者によって認識されるあらゆる通常の変動を網羅するように意図されている。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載のない限り、または文脈から別段に明らかでない限り、いずれかの方向（示されている言及値を上回るかまたは下回る方向）で、示されている言及値から２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれらを下回る割合以内に入る値の範囲を指す（ただし、その数が、考え得る値の１００％を上回る場合を除く）。
「減少する」または「低下する」とは、特定の値が少なくとも５％減少または低下すること、例えば、参照値と比べて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％減少することを指す。特定の値の減少または低下は、その値を参照値と比較した場合の変化倍率として、例えば、参照値と比べて、少なくとも１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、２００分の１、５００分の１、１０００分の１またはそれを上回る割合に減少するとして表されることもある。
「増加する」とは、特定の値が少なくとも５％増加すること、例えば、参照値と比べて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれを上回る割合増加することを指す。特定の値の増加は、その値を参照値と比較した場合の変化倍率として、例えば、参照値のレベルと比べて、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、またはそれを上回る割合で増加するとして表されることもある。
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、その形態としては、コードアミノ酸、非コードアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、及び改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基、その他の天然の塩基、化学的に改変された塩基、生化学的に改変された塩基、非天然塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限らない。「オリゴヌクレオチド」とは概して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的では、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離しても、当該技術分野において知られている方法によって化学的に合成してもよい。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語には、記載されている実施形態に適用可能なように、一本鎖ポリヌクレオチド（センス鎖またはアンチセンス鎖など）及び二本鎖ポリヌクレオチドが含まれると理解すべきである。
「断片」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の全体よりも少ない配列を含むポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子の部分を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの断片は、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片またはポリヌクレオチド断片は、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個またはこれを上回る数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間で、同じであるとともに、同じ相対的位置にある塩基またはアミノ酸の割合（％）を指す。したがって、一方のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対する配列同一性が、ある特定の割合（％）である。配列比較の際には、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較する参照配列としての役割を果たす。「参照配列」という用語は、試験配列と比較する分子を指す。
「相補的」とは、天然の塩基もしくは非天然の塩基、またはそのアナログを含む２つの配列間で、塩基スタッキング及び特異的水素結合を通じて対合する能力を指す。例えば、核酸のある１つの位置の塩基が、標的の対応する位置の塩基と水素結合できる場合には、それらの塩基は、その位置において、互いに相補的であるとみなす。核酸は、ユニバーサル塩基、または水素結合に対してプラスまたはマイナスに寄与しない不活性な無塩基スペーサーを含むことができる。塩基対形成には、カノニカルなワトソン－クリック塩基対形成及び非ワトソン－クリック型塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成及びフーグスティーン塩基対形成）の両方を含めてよい。相補的塩基対合では、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）と相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）と相補的であり、３－ニトロピロールまたは５－ニトロインドールのようなユニバーサル塩基は、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれともハイブリダイズでき、これらと相補的であるとみなすことができることが分かる。Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２－４９３及びＬｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４；２２：４０３９－４０４３。イノシン（Ｉ）も、当該技術分野において、ユニバーサル塩基であるとみなされてきており、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれとも相補的であるとみなされている。Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５；３３（１９）：６２５８－６２６７を参照されたい。
本明細書で言及されている場合、「相補的核酸配列」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでの適切な温度条件及び溶液イオン強度条件下で、配列特異的かつ逆平行な形で、その配列が別の核酸に非共有結合する（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ようにできるヌクレオチド配列を含む核酸配列である。
比較するとともに、配列同一性パーセント及び相補性パーセントを求めるための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のために、配列を最適にアラインメントするのは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法によって、コンピューターによる、これらのアルゴリズムの実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、マニュアルアラインメント及び目視確認（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されているＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含め、当該技術分野において知られているアルゴリズムを用いることによって行うことができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて、公的に入手可能である。
本明細書では、「ハイブリダイズする」という用語は、相補的ヌクレオチド塩基間が対合して（例えば、アデニン（Ａ）は、ＤＮＡ分子ではチミン（Ｔ）と、ＲＮＡ分子ではウラシル（Ｕ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方で、シトシン（Ｃ）と塩基対を形成する）、二本鎖核酸分子を形成することを指す（例えば、Ｗａｈｌ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。加えて、当該技術分野においては、２つのＲＮＡ分子のハイブリダイゼーション（例えばｄｓＲＮＡ）では、グアニン（Ｇ）が、ウラシル（Ｕ）と塩基対を形成することも知られている。例えば、Ｇ／Ｕという塩基対の形成は、ｍＲＮＡ内のコドンとのｔＲＮＡのアンチコドンの塩基対の形成に関しては、遺伝暗号の縮退（すなわち冗長性）の部分的な要因となっている。本開示との関連においては、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（二本鎖ｄｓＲＮＡ）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）と相補的であるとみなされ、Ｕは、そのＧと相補的であるとみなされる。したがって、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（二本鎖ｄｓＲＮＡ）の所定のヌクレオチド位置で、Ｇ／Ｕ塩基対を形成できるときには、その位置は、非相補的であるとはみなされず、むしろ相補的であるとみなされる。当該技術分野では、ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるには、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないと理解されている。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズして、介在セグメントまたは隣接セグメントが、ハイブリダイゼーション事象に関与しないようにし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチドは、その標的となる標的核酸配列内の標的領域との配列相補性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％であることができる。
「改変」という用語は、対応する非改変物質または化合物と比べて、変質または変更された物質または化合物（例えば、細胞、ポリヌクレオチド配列及び／またはポリペプチド配列）を指す。
「天然の」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸、ポリペプチド、細胞または生物に適用されている際には、自然界で見られる核酸、ポリペプチド、細胞または生物を指す。例えば、天然の供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列であって、実験室において人間が意図的に改変していないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然のものである。
「単離」とは、天然の状態で見られる場合には通常、その物質に付随している構成成分から、様々な程度で遊離されている物質を指す。
「発現カセット」または「発現コンストラクト」とは、プロモーターに機能可能に連結されたＤＮＡポリヌクレオチド配列を指す。「機能可能に連結された」とは、機能可能に連結されていると記載されている構成成分が、意図した形で機能できる関係にある並置状態を指す。例えば、プロモーターが、ポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターは、そのポリヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。
「組み換えベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、そのベクターに挿入された別のポリヌクレオチドを移入または輸送できるポリヌクレオチド分子を指す。その挿入されたポリヌクレオチドは、発現カセットであってよい。いくつかの実施形態では、組み換えベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（例えばプラスミド）であってよい。
「試料」という用語は、解析及び／または遺伝子改変を行う生物学的組成物（例えば、細胞、または組織の一部）を指す。いくつかの実施形態では、試料は、対象から直接採取するという点で、「一次試料」であり、いくつかの実施形態では、「試料」は、例えば、ある特定の構成成分を除去し、及び／または対象とする、ある特定の構成成分を単離もしくは精製する目的で、一次試料を処理して得られたものである。
「対象」という用語には、例えば哺乳動物のような動物が含まれる。いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、霊長類動物である。いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタなどのような家畜、またはイヌ及びネコのような飼育動物である。いくつかの実施形態では（例えば、特に研究環境では）、対象は、齧歯類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類動物、または近交系ブタのようなブタなどである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義的に用いられている。
「投与」とは、本明細書では、薬剤または組成物を対象に導入することを指す。
「治療」とは、本明細書で使用する場合、生理学的転帰に影響を及ぼすために、薬剤または組成物を対象に送達することを指す。
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、特定の生理作用をもたらすのに必要な薬剤または組成物の最小量を指す。特定の薬剤の有効量は、その薬剤の性質に基づき、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）といった様々な方法で表してよい。特定の薬剤の有効量は、半最大効果濃度（ＥＣ５０）として表してもよく、この値は、基準レベルと最大応答レベルの中間の、特定の生理応答をもたらす薬剤濃度を指す。
細胞の「集団」は、２個以上のいずれの数の細胞も指すが、好ましくは、少なくとも１×１０３個の細胞、少なくとも１×１０４個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも１×１０１０個の細胞、またはこれを上回る数の細胞である。細胞集団とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ集団（例えば、培養液中の細胞集団）またはｉｎ ｖｉｖｏ集団（例えば、特定の組織に存在する細胞集団）を指してよい。
分子細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）のような標準的な教科書に見ることができ、その開示内容は、参照により、本明細書に援用される。
ＩＩ．改変Ｔ調節細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、改変Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。本明細書では、「改変Ｔｒｅｇ」という用語には、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上のゲノム改変を含むＴｒｅｇ細胞、ならびに１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含むＴｒｅｇが含まれる。本明細書では、「非改変Ｔｒｅｇ」または「コントロールのＴｒｅｇ」は、ゲノムが改変されておらず、遺伝子調節システムを含まないか、またはコントロール遺伝子調節システム（例えば、空ベクターコントロール、非ターゲティングｇＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡなど）を含む細胞または細胞集団を指す。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇまたは改変Ｔｒｅｇは、組織常在性Ｔｒｅｇである。
いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、動物細胞であるか、または、無脊椎動物及び脊椎動物を含む動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥または哺乳動物）の細胞に由来するものである。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、哺乳動物細胞であるか、または哺乳動物細胞に由来するものである（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類動物、ヒト以外の霊長類動物、ヒトなど）。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、齧歯類動物細胞であるか、または齧歯類動物細胞に由来するものである（例えば、ラットまたはマウス）。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来するものである。
いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に、その内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上の改変（例えば、１つ以上の核酸の挿入、欠失または変異）を含む。このような実施形態では、改変Ｔｒｅｇは、「改変内在性標的遺伝子」を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ配列内の改変は、ｍＲＮＡの転写を減少させるかまたは阻害することによって、コードされるｍＲＮＡ転写物及びタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ配列内の改変は、ｍＲＮＡの翻訳を減少させるかまたは阻害することによって、コードされるタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ配列内の改変は、非改変型（すなわち野生型）の内在性タンパク質と比べて、機能が低下または変更された改変内在性タンパク質（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）をコードする。
いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、内在性標的遺伝子以外のゲノム位置に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させるか、あるいは改変型の内在性タンパク質を発現させる１つ以上のゲノム改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムをコードするポリヌクレオチド配列をゲノム内の１つ以上の位置に挿入することによって、その遺伝子調節システムの発現の際に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。いくつかの実施形態では、改変型の内在性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、ゲノム内の１つ以上の位置に挿入されており、その改変型のタンパク質の機能が、非改変型または野生型のタンパク質と比べて低下する（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、改変された内在性標的遺伝子を１つ以上含み、その１つ以上の改変によって、その内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質）の発現及び／または機能が、非改変Ｔｒｅｇと比べて低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇは、ｍＲＮＡ転写物の発現が低下し、及び／またはタンパク質の発現が低下する。いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇにおけるその遺伝子産物の発現は、非改変Ｔｒｅｇにおけるその遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも５％低下する。いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇにおけるその遺伝子産物の発現は、非改変Ｔｒｅｇにおけるその遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを上回る程度低下する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、複数（例えば２つ以上）の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現及び／または機能が、非改変Ｔｒｅｇにおけるその遺伝子産物の発現と比べて低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子に由来する遺伝子産物の発現及び／または機能が、非改変Ｔｒｅｇにおけるその遺伝子産物の発現と比べて低下する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変Ｔｒｅｇであって、１つ以上の内在性標的遺伝子またはその一部が欠失（すなわち「ノックアウト」）されており、そのｍＲＮＡ転写物またはタンパク質を発現しないようになっている改変Ｔｒｅｇを提供する。いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇは、複数の内在性標的遺伝子またはその一部の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、１つ以上の改変内在性標的遺伝子を含み、その標的ＤＮＡ配列に対する１つ以上の改変によって、非改変Ｔｒｅｇで発現する対応するタンパク質（例えば「非改変内在性タンパク質」）の機能と比べて、機能が低下または変更されたタンパク質（例えば「改変内在性タンパク質」）が発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の改変内在性タンパク質をコードする２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の改変内在性標的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、その改変内在性タンパク質では、その改変Ｔｒｅｇによって発現されるかもしくは別の細胞によって発現される別のタンパク質に対する結合親和性が低下もしくは変化するか、シグナル伝達能が低下もしくは変化するか、酵素活性が低下もしくは変化するか、ＤＮＡ結合活性が低下もしくは変化するか、または足場タンパク質として機能する能力が低下もしくは変化する。
いくつかの実施形態では、その改変内在性標的遺伝子は、１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む。本明細書で使用する場合、「ドミナントネガティブ変異」とは、標的遺伝子の１つ以上のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されていて、そのコードされたタンパク質が、非改変標的遺伝子によってコードされるタンパク質に対して拮抗的に作用するようになっていることを指す。このネガティブな表現型は、対応する非改変遺伝子のポジティブな表現型に対して、遺伝的に優位となるので、その変異は、ドミナントネガティブである。１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む遺伝子、及びその遺伝子によってコードされるタンパク質は、「ドミナントネガティブ変異体」、例えば、ドミナントネガティブ遺伝子及びドミナントネガティブタンパク質という。いくつかの実施形態では、そのドミナントネガティブ変異体タンパク質は、そのＴｒｅｇのゲノム内の１つ以上の位置に挿入した外因性導入遺伝子によってコードされる。
ドミナントネガティブの機序は、様々なものが知られている。典型的には、ドミナントネガティブ変異体の遺伝子産物は、非改変遺伝子産物の機能をいくつか保持しているが、非改変遺伝子産物の他の重要な機能を１つ以上欠損している。これにより、ドミナントネガティブ変異体は、非改変遺伝子産物を拮抗阻害する。例えば、例示的な実施形態として、転写因子のドミナントネガティブ変異体は、機能活性化ドメインを欠損しているが、機能性ＤＮＡ結合ドメインを保持し得る。この例では、ドミナントネガティブ転写因子は、非改変転写因子のようにＤＮＡの転写を活性化することはできず、ドミナントネガティブ転写因子は、非改変転写因子の転写因子結合部位への結合を阻止することによって、遺伝子の発現を間接的に阻害できる。別の例示的な実施形態として、二量体として機能するタンパク質のドミナントネガティブ変異が知られている。このような二量体タンパク質のドミナントネガティブ変異体は、非改変タンパク質と二量体を形成する能力を保持し得るが、それ以外は機能できないことがある。ドミナントネガティブ単量体は、非改変単量体と二量体を形成することによって、ヘテロ二量体を形成し、非改変単量体の機能的なホモ二量体の形成を阻止する。
いくつかの実施形態では、本発明の改変Ｔｒｅｇは、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む。その遺伝子調節システムは、（例えば、ゲノムＤＮＡ配列内の１つ以上の核酸の挿入、欠失もしくは変異によって）内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を改変すること、内在性標的遺伝子の転写を調節すること（例えば、ｍＲＮＡの転写の阻害もしくは抑制）、及び／または（例えば、ｍＲＮＡの分解によって）内在性標的遺伝子の翻訳を調節することによる機序を含む様々な機序によって、内在性標的遺伝子改変部の発現及び／または機能を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、遺伝子調節システム（例えば、核酸ベースの遺伝子調節システム、タンパク質ベースの遺伝子調節システム、またはタンパク質／核酸複合ベースの遺伝子調節システム）を含む。このような実施形態では、その改変Ｔｒｅｇに含まれる遺伝子調節システムは、１つ以上の内在性標的遺伝子を改変することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、
（ａ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
（ｂ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｃ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
（ｄ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができるタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
（ｆ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｈ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｉ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
（ｊ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｋ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｌ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｍ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｎ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｏ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｐ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または
（ｑ）上記をいずれかに組み合わせたものを含む遺伝子調節システム、
を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、そのＴｒｅｇのゲノムに挿入されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソーマルに発現され、そのＴｒｅｇのゲノムに挿入されていない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されており、１つ以上のゲノム遺伝子座に挿入された１つ以上の外因性導入遺伝子をさらに含む（例えば遺伝子「ノックイン」）。いくつかの実施形態では、その１つ以上の外因性導入遺伝子は、検出可能なタグ、安全スイッチシステム、キメラスイッチ受容体及び／または操作型抗原特異的受容体をコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、検出可能なタグをコードする外因性導入遺伝子をさらに含む。検出可能なタグの例としては、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ（例えば６×Ｈｉｓ）、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ｃＭｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ、アビジン、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、化学発光タンパク質、生物発光タンパク質及びリン光タンパク質が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その蛍光タンパク質は、青色／ＵＶタンパク質（ＢＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅなど）、シアンタンパク質（ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ及びｍＴＦＰ１など）、緑色タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍｅＧＦＰ（Ａ２０８Ｋ変異）、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎなど）、黄色タンパク質（ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２及びＴａｇＹＦＰなど）、オレンジ色タンパク質（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ及びｍＯｒａｎｇｅ２など）、赤色タンパク質（ＲＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ及びｍＲｕｂｙ２など）、遠赤色タンパク質（ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ及びＮｉｒＦＰなど）、近赤外蛍光タンパク質（ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４及びｉＲＦＰなど）、ストークスシフトの長いタンパク質（ｍＫｅｉｍａ Ｒｅｄ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２及びｍＢｅＲＦＰなど）、光活性化可能なタンパク質（ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１及びＰＡＴａｇＲＦＰなど）、光変換可能なタンパク質（Ｋａｅｄｅ（ｇｒｅｅｎ）、Ｋａｅｄｅ（ｒｅｄ）、ＫｉｋＧＲ１（ｇｒｅｅｎ）、ＫｉｋＧＲ１（ｒｅｄ）、ＰＳ－ＣＦＰ２、ＰＳ－ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ２（ｒｅｄ）、ｍＥｏｓ３．２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ３．２（ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ及びＰＳｍＯｒａｎｇｅなど）、ならびに光で切り替え可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａなど）からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その検出可能なタグは、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＨｃＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ Ｍｏｎｏｍｅｒ及び／またはＡｃＧＦＰから選択でき、これらはいずれも、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、安全スイッチシステムをコードする外因性導入遺伝子をさらに含む。安全スイッチシステム（当該技術分野においては、自殺遺伝子システムともいう）は、改変Ｔｒｅｇを対象に投与した後に、その細胞を除去可能にする１つ以上のタンパク質をコードする外因性導入遺伝子を含む。安全スイッチシステムの例は、当該技術分野において知られている。例えば、安全スイッチシステムは、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｈｓｖ－ｔｋ）及びガンシクロビル（ＧＣＶ）システム（Ｈｓｖ－ｔｋ／ＧＣＶ）のような、非傷害性のプロドラッグを傷害性化合物に変換するタンパク質をコードする遺伝子を含む。Ｈｓｖ－ｔｋは、非傷害性のＧＣＶを、細胞アポトーシスに導く傷害性化合物に変換する。したがって、Ｈｓｖ－ｔｋタンパク質をコードする導入遺伝子を含む改変Ｔｒｅｇで治療した対象にＧＣＶを投与すると、その改変Ｔｒｅｇを選択的に除去できる一方で、内在性Ｔｒｅｇは影響を受けない。（例えば、Ｂｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６（５３１９）：１７１９－１７２４、Ｃｉｃｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００７，１０９（１１）：１８２８－１８３６、Ｂｏｎｄａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００６，１０７（５）：１８２８－１８３６を参照されたい）。
追加の安全スイッチシステムは、細胞表面マーカーをコードする遺伝子を含み、その細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体の投与によって、ＡＤＣＣを介して、改変Ｔｒｅｇを除去できるようになっている。いくつかの実施形態では、その細胞表面マーカーは、ＣＤ２０であり、その改変Ｔｒｅｇは、リツキシマブのような抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の投与によって除去できる（例えば、Ｉｎｔｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０００，１１（４）：６１１－６２０、Ｓｅｒａｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４，１４，６３－７６、ｖａｎ Ｍｅｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００６，１３，７８９－７９７を参照されたい）。ＥＧＦ－Ｒ及びセツキシマブまたはパニツムマブを用いる同様のシステムが、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号に記載されている。追加の安全スイッチシステムは、二量化の化学誘導物質（ＣＩＤ）に対する結合部位を１つ以上含むプロアポトーシス分子をコードする導入遺伝子を含み、そのプロアポトーシス分子のオリゴマー化及びアポトーシス経路の活性化を誘導するＣＩＤの投与によって、改変Ｔｒｅｇを除去できるようになっている。いくつかの実施形態では、そのプロアポトーシス分子は、Ｆａｓ（ＣＤ９５としても知られている）である（Ｔｈｏｍｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００１，９７（５），１２４９－１２５７）。いくつかの実施形態では、そのプロアポトーシス分子は、カスパーゼ－９である（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（１１），４２４７－４２５４）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、キメラスイッチ受容体をコードする外因性導入遺伝子をさらに含む。キメラスイッチ受容体は、内在性細胞表面受容体に由来する細胞外ドメイン、及び異種の細胞内シグナル伝達ドメインを含む操作型細胞表面受容体であり、その細胞外ドメインによってリガンドが認識されると、野生型の細胞表面受容体によって活性化されるシグナル伝達カスケードとは異なるシグナル伝達カスケードが活性化されるようになっている。いくつかの実施形態では、そのキメラスイッチ受容体は、細胞内ドメインに融合された抑制性の細胞表面受容体の細胞外ドメインを含み、その細胞内ドメインは、その抑制性の細胞表面受容体によって通常伝達される阻害シグナルではなく、活性化シグナルを伝達させるものである。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇの活性化を阻害することが知られている細胞表面受容体に由来する細胞外ドメインは、細胞内の活性化ドメインに融合できる。そして、対応するリガンドが結合すると、そのＴｒｅｇの活性化を阻害するのではなく、その活性化を増大させるシグナル伝達カスケードが活性化することになる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、標的細胞によって発現されるタンパク質標的を認識する操作型抗原特異的受容体をさらに含む（本明細書では「改変受容体導入細胞」または「改変ＲＥ細胞」という）。「操作抗原受容体」という用語は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような非天然の抗原特異的受容体を指す。いくつかの実施形態では、その操作抗原受容体は、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを介して、シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、標的細胞によって発現される抗原に、ＭＨＣに依存しない形で結合し、ＲＥ細胞を活性化及び増殖させる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合断片に融合されたタグを認識する。このような実施形態では、ＣＡＲの抗原特異性は、標識抗体の抗原特異性に依存しており、その結果、ある１つの抗体を別の抗体に置き換えることによって、単一のＣＡＲコンストラクトを用いて、複数の異なる抗原を標的とすることができる（例えば、米国特許第９，２３３，１２５号及び同第９，６２４，２７９号、米国特許出願公開第２０１５０２３８６３１号及び同第２０１８０１０４３５４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体に由来する抗原結合断片を含んでよい。本開示において有用である抗原結合ドメインとしては、例えば、ｓｃＦｖ、抗体、抗体の抗原結合領域、重鎖／軽鎖の可変領域、及び一本鎖抗体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体ζ鎖ドメイン（ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインなど）、ＦｃγＲＩＩＩドメイン、ＦｃεＲＩドメインまたはＴリンパ球活性化ドメインに由来してよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメインまたはＣＤ７０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメインまたはＣＤ７０ドメインのうちのいずれか２つを含む。例示的なＣＡＲの構造及び細胞内シグナル伝達ドメインは、当該技術分野において知られている（例えば、ＷＯ２００９／０９１８２６、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＷＯ２０１５／１４２６７５、ＷＯ２０１４／０５５６５７及びＷＯ２０１５／０９０２２９（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）。
自己免疫疾患（例えば、ＧＶＨＤ、大腸炎、及び多発性硬化症）に関連する抗原に特異的なＣＡＲについては、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：１－８（２０１８）、国際公開第ＷＯ２０１７２１８８５０Ａ１号、及びＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ ２０１６；１２６（４）：１４１３－１４２４で論じられており、これらの各々は、参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、操作抗原受容体は、操作ＴＣＲである。操作ＴＣＲは、特定の標的抗原を認識するＴ細胞集団から単離及びクローニングしたＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖を含む。例えば、ＴＣＲα遺伝子及び／またはＴＣＲβ遺伝子（すなわち、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ）は、特定の疾患を有する個体から単離したＴ細胞集団、または細胞タイプで免疫したヒト化マウスから単離したＴ細胞集団からクローニングできる。操作ＴＣＲは、その内在性対応物と同じ機序を通じて（例えば、標的細胞の表面に発現した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質との関連において提示されたその同種抗原を認識することによって）、抗原を認識する。この抗原と結合すると、内在性シグナル伝達経路が刺激され、それにより、ＴＣＲ操作細胞が活性化及び増殖する。
Ａ．免疫抑制機能
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇにおいて、免疫抑制機能の生成、維持及び／または増強を含めて、１つ以上の免疫抑制機能が増強される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇにおいて、非改変Ｔｒｅｇと比べて、以下の特徴のうちの１つ以上が示される：増殖の増加、細胞生存能の増加もしくは延長、安定性の改善、免疫抑制機能の改善、または免疫抑制免疫因子（例えば、抗炎症性サイトカイン）の産生の増加。
本明細書に記載されているＴｒｅｇは、細胞増殖性が、非改変Ｔｒｅｇと比べて向上する。これらの実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変Ｔｒｅｇの数が、非改変Ｔｒｅｇと比べて増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇは、増殖速度が、非改変Ｔｒｅｇと比べて上昇し、この場合、改変Ｔｒｅｇは、非改変Ｔｒｅｇよりも速い速度で分裂する。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、増殖速度が、非改変Ｔｒｅｇと比べて１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度上昇する。いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇは、増殖期間が、非改変Ｔｒｅｇと比べて長く、この場合、その改変Ｔｒｅｇ及び非改変Ｔｒｅｇは、同じ速度で分裂するが、改変Ｔｒｅｇの方が、長い期間にわたって増殖状態を維持する。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、非改変免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度長い時間、増殖状態を維持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、細胞生存能が、非改変Ｔｒｅｇと比べて向上するかまたは延長される。このような実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変Ｔｒｅｇの数が、非改変Ｔｒｅｇと比べて増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、非改変免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度長い時間、生存状態を維持して存続する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、Ｔｒｅｇ疲弊に対する耐性が、非改変Ｔｒｅｇと比べて向上する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞によるサイトカインの産生が、コントロールの免疫細胞集団によるサイトカインの産生と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度増加することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞の増殖性が、コントロールの免疫細胞集団で観察される増殖性と比べて向上することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の増殖性が、コントロールの免疫細胞集団の増殖性と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度向上したことによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。
いくつかの実施形態では、コントロールの免疫細胞集団と比較した場合の改変Ｔｒｅｇの疲弊は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの製造プロセス中に測定する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇにおいて、抗炎症性免疫因子の発現または産生が、非改変Ｔｒｅｇと比べて増加する。抗炎症または免疫抑制免疫因子の例としては、ＩＬ－１０のような抗炎症性または免疫抑制性サイトカインが挙げられる。諸実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、安定性が改善する。諸実施形態では、安定性は、例えば、Ｆｏｘｐ３ ＴＳＤＲのメチル化を測定することによって評価することができる。諸実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、免疫抑制機能が改善する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、ＩＬ－１７Ａ及びＩＦＮγを含む炎症促進性サイトカインに影響を及ぼさない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇにおいて、Ｆｏｘｐ３及び／またはＨｅｌｉｏｓの発現が、非改変Ｔｒｅｇと比べて増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇにおいて、Ｆｏｘｐ３及びＨｅｌｉｏｓの共発現が、非改変Ｔｒｅｇと比べて増加する。
免疫抑制機能を測定するためのアッセイは、当該技術分野において知られている。細胞表面受容体の発現は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット及び／またはｑＰＣＲによって求めることができる。サイトカイン及びケモカインの発現及び産生は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及び／またはｑＰＣＲによって測定できる。細胞外の刺激（例えば、サイトカイン、抑制性リガンドまたは抗原）に対する応答性または感受性は、その刺激に応答する細胞増殖及び／または下流のシグナル伝達経路の活性化（例えば、下流のシグナル伝達中間体のリン酸化）をアッセイすることによって測定できる。
Ｂ．内在性の経路及び遺伝子の調節
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現もしくは機能が低下される。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、免疫抑制機能の向上に関連する経路に存在する。このような実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能の低下により、その免疫細胞の１つ以上の免疫抑制機能が増強される。
本明細書に記載されている方法によって調節するのに適する例示的な経路としては、例えば、Ｔｒｅｇ増殖、Ｔｒｅｇ生存能、Ｔｒｅｇ安定性及び/またはＴｒｅｇ免疫抑制活性経路が挙げられる。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇにおいて、特定の経路内の内在性標的遺伝子の発現が低下する。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇにおいて、特定の経路内の複数（例えば２つ以上）の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、特定の経路における２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下し得る。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇにおいて、ある１つの経路内の内在性標的遺伝子の発現、及び別の経路内の内在性標的遺伝子の発現が低下する。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇにおいて、ある１つの経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現、及び別の経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、ある１つの経路内の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下してよく、別の特定の経路内の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下してよい。
いくつかの実施形態では、複数の経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、複数の経路（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の経路）のそれぞれに由来する１つの内在性遺伝子が低下してよい。追加の態様では、複数の経路（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の経路）のそれぞれに由来する複数の内在性遺伝子（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の遺伝子）が低下してよい。
例示的な内在性標的遺伝子は、下記の表１に示されている。
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦ４の発現が低下する。ＴＮＦＲＳＦ４は、「腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー４」、「ＡＣＴ３５抗原」、「ＴＮＦＲＳＦ４Ｌ受容体」、「ＣＤ１３４」、「ＯＸ４０」及び「ＴＡＸ転写活性化糖タンパク質１受容体」としても知られている。ＴＮＦＲＳＦ４は、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ及びＧＰ３４としても知られている）の受容体である。ヒトＴＮＦＲＳＦ４の可溶性アイソフォームも報告されている（Ｔａｙｌｏｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５５：６７－７２）。
いくつかの実施形態では、ＰＲＤＭ１の発現が低下する。ＰＲＤＭ１は、「ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１」、「ＢＬＩＭＰ１」、「ＰＲＤＩ－ＢＦ１」及び「ベータ－インターフェロン遺伝子陽性調節ドメインＩ結合因子」としても知られている。ＰＲＤＭ１は、転写因子である。
いくつかの実施形態では、改変エフェクター細胞は、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６またはＡＤＮＰのうちの１つ以上の発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、表１から選択される遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、表１から選択した少なくとも２つの遺伝子（例えば、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択した少なくとも２つの遺伝子）の発現及び／または機能の低下を含む。ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰの発現を改変するための例示的な方法が本明細書に記載されているが、これらの内在性標的遺伝子の発現は、当該技術分野において知られている方法によって改変することもできる。
いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＴＮＦＲＳＦ４の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＰＲＤＭ１の発現低下を含む。
いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＴＮＦＲＳＦ４、ならびにＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰのうちの１つ以上の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、表１から選択した遺伝子の発現低下及びＴＮＦＲＳＦ４の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＰＲＤＭ１、ならびにＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰのうちの１つ以上の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、表１から選択した遺伝子の発現低下及びＰＲＤＭ１の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＴＮＦＲＳＦ４の発現低下及び表１から選択した２つの遺伝子の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＰＲＤＭ１の発現低下及び表１から選択した２つの遺伝子の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、表１から選択した複数の遺伝子の発現低下及びＴＮＦＲＳＦ４の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、表１から選択した複数の遺伝子の発現低下及びＰＲＤＭ１の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、表１から選択した２つの遺伝子の発現低下及びＴＮＦＲＳＦ４の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、表１から選択した２つの遺伝子の発現低下及びＰＲＤＭ１の発現低下を含む。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰのうちの３つ以上の発現低下、ならびにＴＮＦＲＳＦ４の発現低下を含むことができる。いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰのうちの３つ以上の発現低下、ならびにＰＲＤＭ１の発現低下を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦ４の発現は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムによって低下する。いくつかの実施形態では、ＰＲＤＭ１の発現は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムによって低下する。
Figure 2022519070000002
Figure 2022519070000003
ＩＩＩ．遺伝子調節システム
本明細書では、「遺伝子調節システム」という用語は、細胞に導入したときに、内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、コードされる遺伝子産物の発現または機能を調節することができるタンパク質、核酸またはそれらを組み合わせたものを指す。本開示の方法で使用するのに適する多くの遺伝子編集システムが、当該技術分野において知られており、そのシステムとしては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、遺伝子調節システムが内在性標的遺伝子に及ぼす作用に関連して「調節する」を使用するときには、「調節する」には、その内在性標的遺伝子の配列のいずれの変化、その内在性標的遺伝子のエピジェネティックな状態のいずれの変化、及び／またはその内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは機能のいずれの変化も含まれる。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、例えば、内在性標的配列において１つ以上の核酸を挿入するかまたは欠失させることによるなど、１つ以上の変異をその内在性標的配列に導入することによって、その内在性標的遺伝子の配列の変化を媒介し得る。その内在性標的配列の変化を媒介できる例示的な機序としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（例えば古典的または代替的）、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）、相同配向型修復（例えば内在性ドナーテンプレート媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存的一本鎖アニーリング）、一本鎖アニーリングまたは一本鎖侵入が挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的配列のエピジェネティックな状態の変化を媒介し得る。例えば、いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的遺伝子のＤＮＡの共有結合の改変（例えば、シトシンのメチル化及びヒドロキシメチル化）、または関連ヒストンタンパク質の改変（例えば、リシンのアセチル化、リシン及びアルギニンのメチル化、セリン及びトレオニンのリン酸化、ならびにリシンのユビキチン化及びＳＵＭＯ化）を媒介し得る。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化を媒介し得る。このような実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、またはそのＤＮＡ配列によってコードされるｍＲＮＡ産物に作用することによって、そのコードタンパク質の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムによって、改変内在性タンパク質を発現させ得る。このような実施形態では、その遺伝子調節システムの媒介により、内在性ＤＮＡ配列が改変されると、非改変Ｔｒｅｇにおける対応する内在性タンパク質と比べて機能が低下した内在性タンパク質が発現される。このような実施形態では、その改変内在性タンパク質の発現レベルは、非改変免疫細胞における対応する内在性タンパク質の発現レベルよりも上昇しても低下してもよく、あるいは、その対応する内在性タンパク質の発現レベルと同じであっても実質的に同程度であってもよい。
Ａ．核酸ベースの遺伝子調節システム
本明細書で使用する場合、核酸ベースの遺伝子調節システムは、外因性タンパク質を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を調節できる１つ以上の核酸分子を含むシステムである。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、標的核酸配列と相補的であるＲＮＡ干渉分子またはアンチセンスＲＮＡ分子を含む。
「アンチセンスＲＮＡ分子」とは、長さを問わず、ｍＲＮＡ転写物と相補的であるＲＮＡ分子を指す。アンチセンスＲＮＡ分子とは、細胞、組織または対象に導入でき、内在性遺伝子のサイレンシング経路に依存するのではなく、ＲＮａｓｅＨの媒介による、標的ｍＲＮＡ転写物の分解に依存する機序を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現を低下させる、一本鎖ＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、改変された主鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは当該技術分野において知られているその他の主鎖を含み、あるいは、非天然のヌクレオシド間結合を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、ロックト核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。
「ＲＮＡ干渉分子」とは、本明細書で使用する場合、内在性遺伝子のサイレンシング経路（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を通じて、標的ｍＲＮＡを分解することによって、内在性標的遺伝子産物の発現の低下を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉剤としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」ともいう）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー及びモルホリノが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。ｍｉＲＮＡとは、約２１～２５ヌクレオチド長で天然の、小分子の非コードＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、１つ以上の標的ｍＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡは、翻訳の抑制、ｍＲＮＡの切断及び／または脱アデニル化を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現をダウンレギュレートする（例えば低下させる）ことができる。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｓｈＲＮＡを含む。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成するとともに、相補的なｍＲＮＡ配列を分解させる約５０～７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されるプラスミドまたは非複製型の組み換えウイルスベクターにクローニングして、ｓｈＲＮＡコード配列がゲノムに組み込まれるようにできる。したがって、ｓｈＲＮＡは、内在性標的遺伝子の翻訳及び発現を安定的かつ着実に抑制させることができる。
いくつかの実施形態では、核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡとは、典型的には約２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）という複数タンパク質複合体と会合し、その会合の際に、「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。そして、活性化ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、配列相同性によって、対応するｍＲＮＡにＲＩＳＣを導き、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断し、その結果、特異的な遺伝子サイレンシングが行われる。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に、２塩基のオーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞及び／または培養系に導入して、標的ｍＲＮＡ配列を分解させることができる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡについては、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：１９，１９９８、ならびに米国特許第７，７３２，４１７号、同第８，２０２，８４６号及び同第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のモルホリノを含む。「モルホリノ」は、本明細書で使用する場合、標準的な核酸塩基がモルホリン環に結合しているとともに、ホスホロジアミデート結合を通じて連結されている改変核酸オリゴマーを指す。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列を分解させるために標的とするのではなく、ｍＲＮＡの翻訳を立体的に阻害し、ｍＲＮＡスプライシングを変化させることを通じて機能する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡと少なくとも９０％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡと１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒなどのような市販業者から入手可能なｓｉＲＮＡコンストラクト及びｓｈＲＮＡコンストラクトなど、当該技術分野において知られているｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子から選択したｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子（例えば、２つ以上のｓｉＲＮＡ、２つ以上のｓｈＲＮＡ、２つ以上のＲＮＡアプタマーまたは２つ以上のモルホリノ）を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子（例えば、２つ以上のｓｉＲＮＡ、２つ以上のｓｈＲＮＡ、２つ以上のＲＮＡアプタマーまたは２つ以上のモルホリノ）を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子（例えば、２つ以上のｓｉＲＮＡ、２つ以上のｓｈＲＮＡ、２つ以上のＲＮＡアプタマーまたは２つ以上のモルホリノ）を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
Ｂ．タンパク質ベースの遺伝子調節システム
いくつかの実施形態では、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、核酸ガイド分子を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を配列特異的な形で調節することができる１つ以上のタンパク質を含むシステムである。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このような実施形態は、本明細書では「ＴＡＬＥＮ」という。
１．ジンクフィンガーシステム
ジンクフィンガーベースのシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインという２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、１つ以上のジンクフィンガーを通じて、ＤＮＡと配列特異的な形で結合するタンパク質、またはより巨大なタンパク質内のドメインであり、その結合ドメイン内のアミノ酸配列領域のうち、亜鉛イオンへの配位を通じて構造が安定化している領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、その配列近傍の酵素ドメインの活性を誘導し、その結果、標的配列近傍の内在性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にいずれの所望の配列にも結合するように操作できる。したがって、切断または組み換えを行いたい標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座（例えば、表１で言及されている標的遺伝子内の標的座位）を特定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、その標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列に結合するようにできる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質が細胞内で発現すると、その標的遺伝子座で改変が行われる。
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：１６０９－１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｂｕａｒｙ：５６－６５、米国特許第６，４５３，２４２号。典型的には、単一のジンクフィンガードメインは、約３０個のアミノ酸の長さである。個々のジンクフィンガーは、３つのヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの４つのヌクレオチド結合部位と、１つのヌクレオチドが重複し得る４つのヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインを操作して、結合するようにする配列（例えば標的配列）の長さによって、操作ジンクフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの数が決まることになる。例えば、フィンガーモチーフが、重複するサブ部位には結合しないＺＦＰの場合には、６個のヌクレオチド標的配列には、２つのフィンガー結合ドメインが結合し、９個のヌクレオチド標的配列には、３つの結合ドメインが結合するなどである。標的部位における、個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわちサブ部位）は、マルチフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間（すなわち、フィンガー間のリンカー）のアミノ酸配列の長さ及び性質に応じて、連続している必要はなく、１つまたは数個のヌクレオチドによって隔てられていることができる。いくつかの実施形態では、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、個別のジンクフィンガーリピートを３～６個含み、それぞれ、９～１８塩基対を認識できる。
ジンクフィンガー結合ドメインは、所定の配列に結合するように操作できる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照されたい。操作ジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比べて、新規な結合特異性を有することができる。操作方法としては、合理的設計及び様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限らない。
ジンクフィンガードメインによる結合について標的ＤＮＡ配列を選択することは、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って行うことができる。標的ＤＮＡ配列の選択を行うために、ヌクレオチド配列を単に目視確認することも利用できることは、当業者には明らかであろう。したがって、本明細書に記載されている方法では、標的ＤＮＡ配列を選択するためのいずれの手段も用いることができる。標的部位は概して、少なくとも９ヌクレオチドの長さであるので、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインと結合する。しかしながら、例えば、４つのフィンガーの結合ドメインと１２ヌクレオチドの標的部位との結合、５つのフィンガーの結合ドメインと１５ヌクレオチドの標的部位との結合、または６つのフィンガーの結合ドメインと１８ヌクレオチドの標的部位との結合も可能である。明らかなように、上記よりも大きい結合ドメイン（例えば、７個、８個、９個以上のフィンガー）と、上記よりも長い標的部位との結合も可能である。
いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガーシステムは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈのような市販業者から入手可能なジンクフィンガーシステムなど、当該技術分野において知られているジンクフィンガーシステムから選択する。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
そのジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、いずれのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼからも得ることができる。酵素ドメインの由来元とし得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限らない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインの供給源として用いることができる。
本明細書に記載されているＺＦＰの酵素ドメインとして用いるのに適する例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合して、結合部位でまたは結合部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えばタイプＩＩＳ）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、離れていることのできる結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖では、その認識部位から９ヌクレオチドの位置で、もう一方の鎖では、その認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素に由来する酵素ドメイン、及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
切断ドメインが結合ドメインから離れていることのできる例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特有の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合体を用いて、二本鎖ＤＮＡの標的切断を行うには、ＦｏｋＩ酵素ドメインをそれぞれ含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性を持つ切断ドメインを再構成できる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。
２．ＴＡＬＥＮシステム
ＴＡＬＥＮベースのシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製する。上記のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子調節システムで用いるのに適する例示的な酵素ドメインである。
ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌が植物に感染する時に、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌によって、そのタイプＩＩＩ分泌システムを介して分泌されるタンパク質である。上記のＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３～３４個のアミノ酸の反復配列を含むが、１２番目と１３番目のアミノ酸は異なる。これらの２つの位置は、反復可変二残基（ＲＶＤ）といい、可変性が高く、特異的なヌクレオチドの認識と密接に相関する。したがって、適切なＲＶＤを含む反復セグメントの組み合わせを選択することによって、ＴＡＬエフェクタードメインを操作して、特定の標的ＤＮＡ配列と結合するようにできる。ＲＶＤの組み合わせの核酸特異性は、以下のとおりである。すなわち、ＨＤは、シトシンを標的とし、ＮＩは、アデニンを標的とし、ＮＧは、チミンを標的とし、ＮＮは、グアニンを標的とする（ただし、いくつかの実施形態では、ＮＮは、グアニンよりも低い特異性で、アデニンとも結合し得る）。
いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列挙されている遺伝子から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
ＴＡＬエフェクターリピートをアセンブルするための方法及び組成物は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：１２，２０１１，ｅ８２を参照されたい。ＴＡＬエフェクターリピートを構築するためのプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから市販されている。
Ｃ．核酸／タンパク質複合体ベースの遺伝子調節システム
複合型遺伝子調節システムは、部位特異的改変ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的改変ポリペプチド」とは、核酸ガイド分子に結合し、標的核酸配列（例えば、内在性標的ＤＮＡ配列または内在性標的ＲＮＡ配列）に結合するその核酸ガイド分子によってその標的核酸配列に導かれ、（例えば、標的核酸配列の切断、変異またはメチル化によって）その標的核酸配列を改変するポリペプチドを指す。
部位特異的改変ポリペプチドは、核酸ガイドと結合する部分及び活性部分という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、部位特異的な酵素活性（例えば、ＤＮＡのメチル化、ＤＮＡまたはＲＮＡの切断、ヒストンのアセチル化、ヒストンのメチル化など）を呈する活性部分を含み、その酵素活性の部位は、ガイド核酸によって決定される。いくつかの場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列を改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する活性部分を含む。別の場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列と関連するポリペプチド（例えばヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボース化活性、脱リボース化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列の転写を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＲＮＡ配列の発現または翻訳を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。
その核酸ガイドは、内在性標的核酸配列と相補的であり、内在性標的核酸配列と結合できる第１の部分（本明細書では「核酸結合セグメント」という）、及び部位特異的改変ポリペプチドと相互作用できる第２の部分（本明細書では「タンパク質結合セグメント」という）という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントは、単一のポリヌクレオチド分子内に含まれている。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントはそれぞれ、別々のポリヌクレオチド分子内に含まれており、その核酸ガイドは、会合し合って機能的ガイドを形成する２つのポリヌクレオチド分子を含むようになっている。
その核酸ガイドは、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズすることによって、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節システムの標的特異性を媒介する。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物内に含まれるＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、標的遺伝子のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列である。本明細書で標的遺伝子に言及する場合には、複数の標的遺伝子座（すなわち、特定の標的遺伝子配列の一部（例えば、エキソンまたはイントロン））を含むその特定の遺伝子の完全長ＤＮＡ配列が含まれる。各標的遺伝子座内にあるのは、本明細書に記載されている遺伝子調節システムによって改変できる、より短い領域のＤＮＡ配列（本明細書では「標的ＤＮＡ配列」という）である。さらに、各標的遺伝子座は、「標的改変部位」を含み、その標的改変部位とは、遺伝子調節システムによって誘導される改変の正確な位置（例えば、挿入、欠失もしくは変異の位置、ＤＮＡ切断の位置、またはエピジェネティックな改変の位置）を指す。
本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、単一の核酸ガイドを含んでも、複数の核酸ガイド（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の核酸ガイド）を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節システムは、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ａｇｏ、すなわちＴｔＡｇｏ）に由来する部位特異的改変ポリペプチドを含む。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ａｇｏ ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、その核酸ガイドは、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０７（２０１４），２５８－２６１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＤＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス２システムである。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型システム、Ｖ型システム及びＶＩ型システムという３つの型に分類される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９タンパク質を用いるクラス２ ＩＩ型システムである。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ９（またはそのバリアント）であり、その核酸ガイド分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３としても知られている）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹとしても知られている）及びＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸとしても知られている））を用いるクラス２ Ｖ型システムである。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１２（またはそのバリアント）であり、その核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１３タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２としても知られている）、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ）を用いるクラス２のＶＩ型システムである。（Ｐｙｚｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（２），３４７－３５６を参照されたい。）このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＲＮＡリボエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１３であり、その核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。
Ｃａｓポリペプチドとは、ｇＲＮＡ分子と相互作用するとともに、ｇＲＮＡ分子に呼応して、標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列に誘導または局在化されることができるポリペプチドを指す。Ｃａｓポリペプチドには、天然のＣａｓタンパク質、及び操作、変更または別段に改変されたＣａｓタンパク質であって、天然のＣａｓ配列とは１つ以上のアミノ酸残基が異なるＣａｓタンパク質が含まれる。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡ結合セグメント及びタンパク質結合セグメントという２つのセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、１つのＲＮＡ分子に含まれ、そのＤＮＡ結合セグメントは、別の異なるＲＮＡ分子に含まれる。このような実施形態は、本明細書では、「二重分子ｇＲＮＡ」、「二分子ｇＲＮＡ」または「デュアルｇＲＮＡ」という。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子であり、本明細書では、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、包括的な用語であり、二分子ガイドＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの両方を指す。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的に、ハイブリダイズし合って二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する２つの相補的ヌクレオチド領域を含み、そのｄｓＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質への結合を促す。ｇＲＮＡの核酸結合セグメント（または「核酸結合配列」）は、特異的な標的核酸配列と相補的であり、その配列に結合できるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓポリペプチドと相互作用し、ｇＲＮＡ分子と部位特異的改変ポリペプチドとの相互作用によって、Ｃａｓが内在性核酸配列に結合し、標的核酸配列内または標的核酸配列内周辺で、１つ以上の改変が行われる。標的改変部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的核酸配列との塩基対形成の相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）という短いモチーフの位置（標的ＲＮＡ配列内では、プロトスペーサー隣接配列（ＰＦＳ）という）の両方によって決定される。Ｃａｓが標的核酸配列に結合するには、ＰＡＭ／ＰＦＳ配列が必要となる。様々なＰＡＭ／ＰＦＳ配列が当該技術分野において知られており、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）とともに使用するのに適する（例えば、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６－１１２１及びＳｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から５０塩基対以内に位置する。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から１０塩基対以内に位置する。本発明の方法によって標的にすることができるＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列と標的改変部位との相対的な距離、及び配列特異的かつｇＲＮＡ媒介性のＣａｓ結合を媒介するための特有の２０塩基対の配列の存在によってのみ制限される。いくつかの実施形態では、そのＰＦＳ配列は、標的ＲＮＡ配列の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位のイントロンまたはエキソン内に位置する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。
１．Ｃａｓタンパク質
いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質である。本明細書で提供されるものを含めて、任意のＣａｓタンパク質を使用することができる。本明細書に記載されている方法及び組成物では、様々な種のＣａｓ分子を使用でき、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅに由来するＣａｓ分子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、天然のＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａともいう）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３及びＣｓｆ４からなる群から選択する。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質のようなエンドリボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａタンパク質（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０ （２０１７），２８０－２８４）、Ｃａｓ１３ｂタンパク質（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）、Ｃａｓ１３ｃタンパク質（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）またはＣａｓ１３ｄタンパク質（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７５（２０１８），２１２－２２３）である。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、本明細書で具体的に提供されるいずれかのＣａｓ９タンパク質を含めて、任意のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型または天然のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログである。野生型Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するためのＨＮＨヌクレアーゼドメイン、及び非標的鎖を切断するためのＲｕｖＣ様ドメインを用いるマルチドメイン酵素である。ｇＲＮＡの特異性に基づき、野生型Ｃａｓ９がＤＮＡに結合すると、二本鎖ＤＮＡが切断され、この切断部は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）によって修復できる。例示的な天然のＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されており、追加のＣａｓ９オルソログは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号に記載されている。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１５細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリーまたはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、天然のＣａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９及びＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３，１－６に記載されているＣａｓ９アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、
（ａ）ニッカーゼ活性、すなわち、一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
（ｂ）二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を起こす能力（一実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である）、
（ｃ）エンドヌクレアーゼ活性、
（ｄ）エキソヌクレアーゼ活性及び／または
（ｅ）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力、
という活性のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、様々な修復機序による、標的配列の修復の可能性または修復率をさらに向上させるために、ＤＮＡ損傷シグナル伝達タンパク質、エキソヌクレアーゼまたはホスファターゼを動員する異種タンパク質に融合されている。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、野生型Ｃａｓポリペプチドを核酸修復鋳型と共発現させる。
いくつかの実施形態では、（例えば、それぞれに異なるＰＡＭ配列選択性、酵素活性の向上または低下、細胞傷害性レベルの上昇または低下、ＮＨＥＪ、相同配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断などのバランスの変更のために）それぞれに異なるＣａｓタンパク質の様々な酵素特性を活用するためには、それぞれに異なるＣａｓタンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣａｓ９タンパク質）が、提供する各種方法で用いるものとして有益である場合がある。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡというＰＡＭ配列モチーフを認識する（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３；３３９（６１２１）：８２３－８２６）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧＮＧ及び／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２７（５９６２）：１６７－１７０及びＤｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ及び／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＡＴＴまたはＮＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｈ，ＰＮＡＳ ２０１３，１－６を参照されたい）。上記の実施形態では、Ｎは、いずれのヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれであることもできる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉに由来するＣａｓ１３ａタンパク質であり、３’の単一のＡ、ＵまたはＣというＰＦＳ配列モチーフを認識する
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９０％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と１００％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。
２．Ｃａｓ変異体
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドの１つ以上の特性を改変させるために操作されている。例えば、いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、酵素特性が改変されており、例えば、（天然のＣａｓ分子もしくは他の参照Ｃａｓ分子と比べて）ヌクレアーゼ活性が改変されているか、またはヘリカーゼ活性が改変されている。いくつかの実施形態では、操作Ｃａｓポリペプチドは、その大きさを改変させる改変、例えば、そのＣａｓポリペプチドの別の特性に有意な影響を及ぼさずに、その大きさを縮小させる、アミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作Ｃａｓポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含む。例えば、操作Ｃａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように改変させることができる。
所望の特性を有するＣａｓポリペプチドは、いくつかの方法で作製することができ、その方法としては、所望の特性を有する変異体または改変型のＣａｓポリペプチドを得られるように、天然のＣａｓポリペプチドまたは親Ｃａｓポリペプチドを改変することが挙げられる。例えば、１つ以上の変異を親Ｃａｓポリペプチド（例えば、天然のＣａｓポリペプチドまたは操作Ｃａｓポリペプチド）の配列に導入できる。このような変異及び相違は、置換（例えば、保存的置換もしくは重要ではないアミノ酸の置換）、挿入または欠失を含んでよい。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、親Ｃａｓポリペプチドに対して１個以上の変異（例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個または５０個の変異）を含む。
一実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、天然のＣａｓポリペプチドとは異なる切断特性を含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓは、不活性型Ｃａｓ（ｄＣａｓ）変異体である。このような実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、いずれの内在性酵素活性も含まず、標的核酸切断を媒介できない。このような実施形態では、そのｄＣａｓは、非切断ベースの形式で標的核酸を改変できる異種タンパク質と融合してよい。例えば、いくつかの実施形態では、ｄＣａｓタンパク質は、転写活性化因子または転写抑制因子のドメイン（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘ）、ＥＲＦ抑制ドメイン（ＥＲＤ）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）など）に融合されている。いくつかのこのような場合では、そのｄＣａｓ融合タンパク質は、ｇＲＮＡによって、標的核酸における所定の位置（すなわち配列）に導かれて、座位特異的な調節（ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合のブロック（それにより、転写活性化因子の機能を選択的に阻害する）及び／または局在的なクロマチンの状態の改変（例えば、標的ＤＮＡを改変するか、もしくは標的ＤＮＡと関連するポリペプチドを改変する融合配列を用いる場合）など）を行う。いくつかのケースでは、その変化は、一過性である（例えば、転写の抑制または活性化）。いくつかのケースでは、その変化は、遺伝性である（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡと関連するタンパク質、例えばヌクレオソームヒストンに、エピジェネティックな改変を加える場合）。
いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓは、ｄＣａｓ１３変異体である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７３（２０１８），６６５－６７６）。そして、これらのｄＣａｓ１３変異体は、ＲＮＡを改変する酵素に融合でき、その酵素としては、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２）が挙げられる。アデノシンデアミナーゼは、アデニンをイノシンに変換し、そのイノシンを翻訳機構がグアニンのように扱うことにより、ＲＮＡ配列において、機能上はＡ→Ｇという変更が行われる。いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓは、ｄＣａｓ９変異体である。
いくつかの実施形態では、その変異体のＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体である。Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体は、触媒活性を持つドメインを１つだけ含む（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）。このＣａｓ９ニッカーゼ変異体は、ｇＲＮＡ特異性に基づくＤＮＡ結合性を保持するが、切断できるのは、ＤＮＡの一方の鎖のみであることから、一本鎖切断（例えば「ニック」）が生じる。いくつかの実施形態では、同じ細胞内で、２つの相補的Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（例えば、ＲｕｖＣドメインが不活化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体、及びＨＮＨドメインが不活化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体）が、２つのそれぞれの標的配列（ＤＮＡセンス鎖上の１つの標的配列、及びＤＮＡアンチセンス鎖上の１つの標的配列）に対応する２つのｇＲＮＡとともに発現する。このデュアルニッカーゼシステムにより、ずれた位置で二本鎖切断が行われ、二本鎖切断を起こすのに充分なほど近くで２つのオフターゲットニックが生じる可能性が低くなるので、標的特異性を向上させることができる。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体を核酸修復鋳型と共発現させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣａｓポリペプチドを操作して、そのＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を改変できる。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、ＰＡＭ／ＰＦＳ特異性が、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性とは異なる。例えば、オフターゲット部位を減少させるか、特異性を向上させるか、またはＰＡＭ／ＰＦＳ認識要件を排除するために、天然のＣａｓタンパク質を改変して、その変異体Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ／ＰＦＳ配列を改変できる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を改変して、ＰＡＭ／ＰＦＳ認識配列の長さを長くできる。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１５個のアミノ酸の長さである。指向性進化法を用いて、異なるＰＡＭ／ＰＦＳ配列を認識する、及び／またはオフターゲット活性が低減されたＣａｓポリペプチドを作製できる。Ｃａｓポリペプチドの指向性進化法で使用できる例示的な方法及びシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１１，４７２（７３４４）：４９９－５０３に記載されている。
例示的なＣａｓ変異体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６１２７６号及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７３（２０１８），６６５－６７６に記載されており、これらは、参照により、その全体が本明細書に援用される。
３．ｇＲＮＡ
本開示は、部位特異的改変ポリペプチドを所定の標的核酸配列に誘導するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、核酸ターゲティングセグメント及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの核酸ターゲティングセグメントは、標的核酸配列内の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、ｇＲＮＡの核酸ターゲティングセグメントは、配列特異的な形で、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対形成）によって標的核酸と相互作用し、核酸ターゲティングセグメントのヌクレオチド配列は、ｇＲＮＡが結合する、標的核酸内の位置を決定する。ｇＲＮＡの核酸ターゲティングセグメントを（例えば遺伝子操作によって）改変して、標的核酸配列内の任意の所望の配列にハイブリダイズさせることができる。
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的改変ポリペプチド（例えばＣａｓタンパク質）と相互作用して複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、結合したポリペプチドを、上記の核酸ターゲティングセグメントによって、標的核酸内の所定のヌクレオチド配列に導く。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるとともに、二本鎖ＲＮＡを形成する２つのひと続きのヌクレオチド領域を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む。このような実施形態では、２つのＲＮＡ分子の各々は、２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドがハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡを形成するように、互いに相補的なひと続きのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を含む。
標的座位に対するｇＲＮＡの特異性は、標的座位内の標的核酸配列に相補的である約２０ヌクレオチドを含む核酸結合セグメントの配列によって媒介される。いくつかの実施形態では、その対応する標的核酸配列は、約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と１００％相補的である。
いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、ＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、ＤＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、表１に列挙されているものから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、表１に列挙されているものから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、表１に列挙されているものから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、各々がＤＮＡ結合セグメントを含む２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、ここで、その核酸結合セグメントのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、各々が核酸結合セグメントを含む２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、ここで、その核酸結合セグメントのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、各々が核酸結合セグメントを含む２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、ここで、その核酸結合セグメントのうちの少なくとも１つは、表１から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、特定の標的座位または標的遺伝子に特有である標的配列を特定するための、当該技術分野において知られているアルゴリズム（例えばＣａｓ－ＯＦＦ ｆｉｎｄｅｒ）を用いて、オフターゲット結合を最小限にするように設計されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を付与する１つ以上の改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドを含むことができる。このような実施形態では、これらの改変ｇＲＮＡは、非改変ｇＲＮＡと比べて、自然免疫応答の低下を誘発し得る。「自然免疫応答」という用語には、概ねウイルスまたは細菌由来の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答が含まれ、その応答には、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、ならびに細胞死の誘導が伴う。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、５’末端または５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）が改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核ｍＲＮＡのキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログまたは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））を含めることによって改変されている。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させたｇＲＮＡが、ホスファターゼ（例えば仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）で処理して５’三リン酸基を除去することによって改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）に改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つ以上（例えば、２５～２００個）のアデニン（Ａ）残基を付加することによって改変されている。
いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、ｇＲＮＡに存在できるが、他の遺伝子調節システム、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡベースのシステムにも存在し得る。いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、
（ａ）結合していないリン酸酸素及び／またはホスホジエステル骨格結合において結合しているリン酸酸素のうちの１つ以上のうちの一方または両方の改変、例えば置換、
（ｂ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば置換、
（ｃ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーへの大幅な置換、
（ｄ）天然の核酸塩基の改変または置換、
（ｅ）リボース－リン酸骨格の置換または改変、
（ｆ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変、例えば、末端のリン酸基の除去、改変もしくは置換、またはある部分のコジュゲーション、ならびに
（ｇ）糖の改変、
のうちの１つ以上を含むことができる。
いくつかの実施形態では、上に列挙した改変を組み合わせて、改変を２個、３個、４個または５個以上有し得る改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドをもたらすことができる。例えば、いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドは、改変糖及び改変核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのすべての塩基が改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基のすべてが、それぞれホスホロチオエート基に置き換わっている。
いくつかの実施形態では、例えば、ゲノム全体における総オフターゲット活性を最小限にするために、ソフトウェアツールを用いて、ユーザーの標的配列内におけるｇＲＮＡの選択を最適化することができる。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を用いる場合の考え得る各ｇＲＮＡの選択を行う際には、ソフトウェアツールによって、ゲノム全体において、ある特定の数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）以下のミスマッチ塩基対を含むすべての潜在的オフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧのいずれかのＰＡＭの直前に位置する）を特定できる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験によって導出した重み付けスキームを用いて予測することができる。そして、考え得る各ｇＲＮＡをオフターゲット切断の総予測数によってランク付けし、上位のｇＲＮＡは、オンターゲット切断の可能性が最も高く、オフターゲット切断の可能性が最も低いｇＲＮＡとなる。そのツールには、他の機能、例えば、ｇＲＮＡベクターの構築用試薬の自動設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用プライマーの設計、次世代シーケンシングによってオフターゲット切断のハイスループットの検出及び定量を行うためのプライマーの設計の機能も含まれていることがある。
ＩＶ．改変Ｔ調節細胞の作製方法
いくつかの実施形態では、本開示は、改変Ｔｒｅｇの作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、遺伝子調節システムをＴｒｅｇ集団に導入することを含み、ここで、その遺伝子調節システムは、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。
本明細書に記載されている遺伝子調節システム、例えば、核酸ベース、タンパク質ベース、または核酸／タンパク質ベースのシステムの構成成分は、様々な送達方法及び製剤を用いて、様々な形態で標的細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを組換えベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド）によって送達する。いくつかの実施形態では、そのシステムが２つ以上の構成成分を含む場合には、ベクターは、そのシステムの構成成分をコードする複数のポリヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、そのシステムが、２つ以上の構成成分を含む場合には、複数のベクターを用いてもよく、その各ベクターは、そのシステムの特定の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合された、（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列も含んでよい。例えば、ベクターは、システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合された（例えば、ＳＶ４０に由来する）核局在配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎ ｖｉｖｏで行う。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｅｘ ｖｉｖｏで行う。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、ウイルスベクターである。好適なウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４及びＷＯ９５／００６５５を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、ＳｒｉｖａｓｔａｖａによるＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照されたい）をベースとするウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス及び乳癌ウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクター）などが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、プラスミドである。数多くの好適なプラスミド発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例えば、真核宿主細胞用では、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）というベクターが供給されている。しかしながら、宿主細胞と適合するものであれば、いずれの他のプラスミドベクターも使用し得る。使用する細胞の種類及び遺伝子調節システムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写制御エレメント及び翻訳制御エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターのような転写制御エレメントに機能可能に連結されている。この転写制御エレメントは、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または原核細胞（例えば、細菌細胞もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能するものであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方でポリヌクレオチドの発現を可能にする複数の制御エレメントに機能可能に連結されている。使用する細胞の種類及び遺伝子調節システムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写制御エレメント及び翻訳制御エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい）。
好適な真核生物プロモーター（真核細胞で機能するプロモーターを含む）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーター及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスに由来する長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターならびにマウスメタロチオネイン－１プロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は充分に、当業者のレベルの範囲内である。その発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターも含んでよい。その発現ベクターは、発現を増幅させるための適切な配列も含んでよい。その発現ベクターは、部位特異的改変ポリペプチドに融合されるタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列も含み、それにより、キメラポリペプチドが得られるようになっていてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに機能可能に連結されている。
ポリヌクレオチド及び組み換えベクターを宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において知られており、いずれかの既知の方法を用いて、遺伝子調節システムの構成成分を細胞に導入できる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、バクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子仲介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９を参照されたい）、マイクロフルイディクス送達方法（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５９３４３号を参照されたい）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションによる送達は、細胞と、遺伝子調節システムの構成成分とをカートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で混合すること、ならびに電気的刺激を所定の期間及び振幅で１回以上加えることを含む。いくつかの実施形態では、細胞と、遺伝子調節システムの構成成分との混合物をカートリッジ、チャンバーまたはキュベットに送る装置（例えばポンプ）に連結した反応容器で、細胞を遺伝子調節システムの構成成分と混合し、電気的刺激を１回以上、所定の期間及び振幅で加えた後、その細胞を第２の反応容器に送る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分または遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、トランスポゾン、ナノ粒子（例えば脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、弱毒化細菌またはウイルス様粒子のようなウイルス以外の送達ビヒクルで、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、弱毒化細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ある特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ及び改変Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含め、天然の細菌または人工的に操作されて、侵襲性であるが、発病を防ぐように弱毒化されている細菌）、標的特異的な細胞に対して栄養特異的及び組織特異的なトロピズムを有する細菌、標的細胞特異性を変化させるために、表面タンパク質が改変された細菌である。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、遺伝子改変バクテリオファージ（例えば、パッケージング能が大きく、免疫原性が小さめであり、哺乳動物のプラスミド保持配列を含み、ターゲティングリガンドが組み込まれた操作ファージ）である。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、哺乳動物のウイルス様粒子である。例えば、（例えば、「空の」粒子を精製してから、ｅｘ ｖｉｖｏでウイルスを所望のカーゴとともにアセンブルすることによって）改変ウイルス粒子を作製できる。そのビヒクルを操作して、ターゲティングリガンドを組み込んで、標的組織特異性を改変することもできる。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、生体リポソームである。例えば、その生体リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、赤血球ゴースト（対象に由来する赤血球を溶血させ、球体構造にしたものであり、組織ターゲティングは、様々な組織特異的または細胞特異的リガンドの結合によって実現できる））、分泌エクソソーム、すなわち、対象から得られる、エンドサイトーシス由来の膜結合型ナノベシクル（３０～１００ｎｍ）（例えば、様々な種類の細胞から産生され得るので、ターゲティングリガンドを必要とすることなく、細胞に取り込ませることができる）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇの方法は、試料からＴｒｅｇ集団を採取することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、組織試料、流体試料、細胞試料、タンパク質試料、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ試料を含む。いくつかの実施形態において、組織試料は、体内のいずれの組織タイプに由来してもよく、その組織としては、腸、皮膚、肺、肝臓、脾臓、リンパ節、及び１つ以上の細胞集団を含む脂肪組織細胞培養培地、１つ以上の細胞集団を含む緩衝化液などが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、その試料を処理して、Ｔｒｅｇのような特定の細胞タイプをその試料の残部から濃縮または単離する。
いくつかの実施形態では、単離したＴｒｅｇを培養で増殖させて、増殖したＴｒｅｇ集団を作製する。増殖プロセス中に、１つ以上の活性化因子または成長因子を培養系に加えることができる。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＴＧＦ－β及び／またはＩＬ－２）を培養系に加えて、細胞増殖を増強または促進することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）を培養系に加えて、細胞増殖を増強または促進することができる。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇは、増殖プロセス中にフィーダー細胞と共培養してよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、１つ以上の増殖フェーズを含む。免疫細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１８０２８２６９４号及び同第２０１７０１５２４７８号、ならびに米国特許第８，３８３，０９９号及び同第８，０３４，３３４号に記載されているように、当該技術分野において知られている。
培養プロセス及び増殖プロセスのいずれかの時点に、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをＴｒｅｇに導入して、改変Ｔｒｅｇを作製できる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、試料からＴｒｅｇを濃縮した直後に、Ｔｒｅｇ集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、１つ以上の増殖プロセスの前、そのプロセスの最中またはそのプロセスの後に、Ｔｒｅｇ集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、Ｔｒｅｇを試料から濃縮するかまたは対象から採取するかした直後、かつあらゆる増殖ラウンドの前に、Ｔｒｅｇ集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、増殖の後に、Ｔｒｅｇ集団に導入する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法によって作製した改変Ｔｒｅｇは、直ちに使用することができる。代替的に、その細胞は、液体窒素温度で凍結し長期間保存することができ、これを解凍し再利用することができる。このような場合、その細胞は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝化媒体、または細胞を同様の凍結温度で保存する目的で当該技術分野において一般的に用いられているような何らかの他のこのような溶液で凍結させ、凍結した培養細胞を解凍するためのものとして当該技術分野において一般的に知られている方式で解凍する。
いくつかの実施形態では、その改変Ｔｒｅｇは、様々な培養条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる。その細胞は、培養で増殖させることができ、すなわち、それらの増殖を促進する条件下で成長させることができる。培養培地は、液体または半固体、例えば、寒天、メチルセルロースなどを含むものであってよい。細胞集団は、Ｉｓｃｏｖｅの変法ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０のような適切な栄養培地中に懸濁させることができ、通常、これにウシ胎児血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、ならびに抗生物質（例えば、ペニシリン及びストレプトマイシン）を補充する。培養物は、Ｔ調節細胞が応答する成長因子を含むことができる。本明細書で定義するような成長因子は、膜貫通受容体に対する特異的作用を介して、培養またはインタクトな組織のいずれかで、細胞の生存、成長及び／または分化を促進することができる分子である。成長因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子が含まれる。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた、改変Ｔ調節細胞の作製
いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇ細胞の作製方法は、標的ＤＮＡ配列と、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを含む複合体とを接触させることを伴う。上で論じたように、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドが複合体を形成し、そのｇＲＮＡのＤＮＡ結合ドメインが、その複合体を標的ＤＮＡ配列に導き、そのＣａｓタンパク質（または酵素活性が不活性なＣａｓタンパク質に融合された異種タンパク質）が、標的ＤＮＡ配列を改変する。いくつかの実施形態では、この複合体は、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（またはｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を細胞に導入した後に、細胞内で形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ核酸であり、細胞にトランスダクションによって導入する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムのＣａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分は、単一のポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡの構成成分をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターに含まれており、ウイルストランスダクションによって細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムのＣａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分は、異なるポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第１のウイルスベクターに含まれ、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、第２のウイルスベクターに含まれる。この実施形態のいくつかの態様では、第２のウイルスベクターよりも前に、第１のウイルスベクターを細胞に導入する。この実施形態のいくつかの態様では、第１のウイルスベクターよりも前に、第２のウイルスベクターを細胞に導入する。このような実施形態では、それらのベクターが組み込まれることにより、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分の発現が持続する。しかしながら、一部の種類の細胞では、Ｃａｓ９の発現の持続により、オフターゲット変異及びオフターゲット切断が増加し得る。したがって、いくつかの実施形態では、トランスフェクションによって、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ核酸配列を細胞集団に導入してもよい。このような実施形態では、Ｃａｓ９の発現は、時間とともに減少することになり、オフターゲット変異部位またはオフターゲット切断部位の数を減少し得る。
いくつかの実施形態では、この複合体は、ｇＲＮＡ分子及びＣａｓタンパク質を一緒に混合し、複合体を形成させるのに充分な期間にわたってインキュベートすることによって、無細胞システムで形成させる。続いて、標的ＤＮＡ配列を改変する目的で、予め形成したこの複合体であって、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む複合体（本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ－リボ核タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ）という）を細胞に導入できる。いくつかの実施形態では、
Ｂ．ｓｈＲＮＡシステムを用いた、改変Ｔ調節細胞の作製
いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇの作製方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物と相補的である配列を有する１つ以上のｓｈＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。小さな遺伝子カセットを介して、所定のＤＮＡ配列を細胞核に導入することによって、Ｔｒｅｇを改変して、ｓｈＲＮＡを作製することができる。レトロウイルス及びレンチウイルスの両方を用いて、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡをＴｒｅｇに導入することができる。導入されたＤＮＡは、細胞自体のＤＮＡの一部となることも、または核内に存続することもでき、その細胞機構に対して、ｓｈＲＮＡを産生するように命令する。ｓｈＲＮＡは、その細胞内のダイサーまたはＡｇｏ２の媒介によるスライサー活性によって処理して、ＲＮＡｉの媒介による遺伝子ノックダウンを誘導し得る。
Ｖ．組成物及びキット
「組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されている遺伝子調節システムまたは改変Ｔｒｅｇの製剤であって、対象または細胞に投与または送達できる製剤を指す。典型的には、製剤は、あらゆる生理学的に許容可能な組成物（その誘導体及び／またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体もしくは互変異性体を含む）を、いずれかの生理学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤とともに含む。「治療用組成物」または「医薬組成物」（本明細書では同義的に用いられている）は、特定の疾患もしくは障害を治療するために、対象に投与するか、または１つ以上の内在性標的遺伝子を改変するために、細胞と接触させることができる、遺伝子調節システムまたは改変Ｔｒｅｇの組成物である。
「薬学的に許容可能な」という表現は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を引き起こさずに、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適するとともに、合理的な効果／リスク比に釣り合う化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す目的で使用する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている方法を行うためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、
（ａ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
（ｂ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｃ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
（ｄ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる改変タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｆ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｈ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｉ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
（ｊ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｋ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｌ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｍ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｎ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｏ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｐ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｑ）本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇ、または
（ｒ）上記をいずれかに組み合わせたもの
を含むことができる。
いくつかの実施形態では、そのキットは、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、ならびにその構成成分を再構成及び／または希釈するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）を含むキットは、１つ以上の追加の試薬をさらに含み、その追加の試薬は、その遺伝子調節システムを細胞に導入するための緩衝剤、洗浄緩衝液、コントロール試薬、コントロールの発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、その遺伝子調節システムをＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏで作製するための試薬などから選択できる。キットの構成成分は、別々の容器に入れることも、単一の容器内で組み合わせることもできる。
上記の構成成分に加えて、いくつかの実施形態では、キットは、そのキットの構成成分を用いて、本開示の方法を実施するための説明書をさらに含む。本開示の方法を実施するための説明書は概して、好適な記録媒体に記録されている。例えば、その説明書は、紙またはプラスチックなどのような基材に印刷されていてもよい。したがって、その説明書は、添付文書としてキット内に存在しても、キットまたはその構成成分の容器のラベルに存在してもよい（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付随していてもよい）。別の実施形態では、その説明書は、好適なコンピューター可読記憶媒体、例えばＣＲ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに別の実施形態では、実際の説明書は、キット内には存在しないが、その説明書をリモートソース、例えばインターネットから得る手段が供給されている。この実施形態の例は、その説明書を閲覧でき及び／またはその説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書に関しては、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録されている。
ＶＩ．治療方法及び用途
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇ及び遺伝子調節システムは、様々な治療用途で用いてよい。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇ及び／または遺伝子調節システムは、例えば疾患を治療するための遺伝子療法を目的として、自己免疫疾患治療薬して使用するため、または生物学的研究のために、対象に投与してよい。
いくつかの実施形態では、その対象は、新生体、幼若体または成体であってよい。特に対象となるのは、哺乳動物の対象である。本発明の方法で治療し得る哺乳動物種としては、イヌ科及びネコ科の動物、ウマ科の動物、ウシ亜科の動物、ヒツジなど、ならびに霊長類動物、特にヒトが挙げられる。動物モデル、特に、小型の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなど）を実験的研究に用いてよい。
本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇ、その集団及びその組成物の投与は、注射、灌注、吸入、摂食、電気浸透、血液透析、イオントフォレシス、及び当該技術分野において知られているその他の方法によって行うことができる。いくつかの実施形態では、投与経路は、局所経路または全身経路である。いくつかの実施形態では、投与経路は、動脈内経路、頭蓋内経路、皮内経路、十二指腸内経路、乳房内経路、髄膜内経路、腹腔内経路、髄腔内経路、腫瘍内経路、静脈内経路、硝子体内経路、眼内経路、非経口経路、脊髄経路、皮下経路、尿管経路、尿道経路、膣経路または子宮内経路である。
いくつかの実施形態では、投与経路は、注入（例えば、持続注入またはボーラス）による経路である。局所投与の方法、すなわち、損傷部位または疾患部位への送達方法の例としては、例えば髄腔内送達用のオンマイヤーリザーバーによる方法（例えば、米国特許第５，２２２，９８２号、同第５，３８５，５８２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、例えばシリンジによって、例えば関節にボーラス注射する方法、持続注入、例えば、対流を伴うような挿管による方法（例えば、米国特許出願公開第２００７－０２５４８４２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、またはその細胞が可逆的に添加されたデバイスを埋め込むことによる方法（例えば米国特許出願公開第２００８－００８１０６４号及び同第２００９－０１９６９０３号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）が挙げられる。いくつかの実施形態では、その投与経路は、局所投与または直接注射による経路である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、単独で、あるいは例えば、それらの細胞が移植される組織内でのその細胞の成長及び／または組織化を補助するための好適な基材またはマトリックスとともに、対象に供給してよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１×１０３個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも５×１０３個の細胞、１×１０４個の細胞、５×１０４個の細胞、１×１０５個の細胞、５×１０５個の細胞、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、５×１０１１個、１×１０１２個、５×１０１２個、またはこれを超える数の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０８～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０９～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０１０～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０１１～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０１１個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０１０個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０９個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０８個の細胞を対象に投与する。対象に対する、治療のための投与数は、変動し得る。いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇの対象への導入は、１回限りであってよい。いくつかの実施形態では、このような治療には、継続的な一連の反復処置が必要となり得る。いくつかの実施形態では、効果が観察されるまでには、改変Ｔｒｅｇの投与が複数回必要となり得る。厳密なプロトコールは、治療を受ける個々の対象の疾患または状態、病期、及びパラメーターに左右される。
いくつかの実施形態では、遺伝子療法または生物学的研究などのために、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを用いて、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで改変する。このような実施形態では、遺伝子調節システムは、上記の方法によるなどして、対象に直接投与してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、Ｔｒｅｇ集団のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの改変に用いる。このような実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、Ｔｒｅｇを含む試料に投与する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇを対象に投与する。いくつかの実施形態では、対象に投与する、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、自己Ｔｒｅｇである。この関連における「自己」という用語は、投与される同じ対象から得た細胞を指す。例えば、Ｔｒｅｇは、対象から採取して、本明細書に記載されている方法に従って、ｅｘ ｖｉｖｏで改変してから、疾患を治療する目的で同じ対象に投与し得る。このような実施形態では、その対象に投与する細胞は、自己Ｔｒｅｇである。いくつかの実施形態では、対象に投与する改変Ｔｒｅｇまたはその組成物は、同種異系Ｔｒｅｇである。この関連における「同種異系」という用語は、ある対象から採取して、別の対象に投与する細胞を指す。例えば、Ｔｒｅｇは、第１の対象から採取して、本明細書に記載されている方法に従って、ｅｘ ｖｉｖｏで改変してから、疾患を治療する目的で第２の対象に投与し得る。このような実施形態では、その対象に投与する細胞は、同種異系Ｔｒｅｇである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇは、疾患を治療する目的で、対象に投与する。いくつかの実施形態では、治療は、細胞集団（例えば、改変Ｔｒｅｇ集団）またはその組成物を有効量、治療の必要な対象に送達することを含む。いくつかの実施形態では、治療とは、哺乳動物、例えばヒトの疾患の治療を指し、その治療には、（ａ）疾患を抑制すること、すなわち、疾患の発症を抑止するか、または疾患の進行を防止すること、（ｂ）疾患を軽減させること、すなわち、病態を好転させるか、または疾患の１つ以上の症状を軽減させること、及び（ｃ）疾患を治癒させること、すなわち、１つ以上の疾患症状を寛解させることが含まれる。いくつかの実施形態では、治療とは、１つ以上の疾患症状を短期的に（例えば、一時的に及び／または短時間）、及び／または長期的に（例えば持続的に）軽減することを指してよい。いくつかの実施形態では、治療によって、疾患の症状が改善または軽快する。この改善は、観察可能もしくは測定可能な改善であり得、または対象の体調的な感覚の改善であってもよい。
特定の対象に投与する改変Ｔｒｅｇの有効量は、様々な要因によって決定されることになり、その要因のうちのいくつかは、患者によって異なり、その要因としては、治療する障害及びその障害の重症度、用いる具体的な薬剤（複数可）の活性、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食生活、投与のタイミング、投与経路、治療期間、併用する薬物、処方医の判断、ならびに医療技術分野において知られている類似の要因が挙げられる。
いくつかの実施形態では、改変Ｔｒｅｇの有効量は、少なくとも１×１０３個の細胞、例えば、５×１０３個の細胞、１×１０４個の細胞、５×１０４個の細胞、１×１０５個の細胞、５×１０５個の細胞、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、５×１０１１個、１×１０１２個、５×１０１２個またはこれを上回る数の細胞となる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔｒｅｇ及び遺伝子調節システムは、自己免疫疾患の治療に使用することができる。別段の記載のない限り、「障害」及び「疾患」という用語は、本明細書では互換的に使用する。本明細書で使用する場合、「自己免疫障害」という用語は、個体自身の組織もしくは臓器から生じ、それに対して向けられる疾患または障害、あるいはそれらの共分離もしくは発現、またはそれらから生じる状態である。自己免疫疾患は、主に適応免疫応答の調節異常によって引き起こされ、自己構造に対する自己抗体または自己反応性Ｔ細胞が形成される。
例示的な自己免疫障害としては、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭関節炎、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び乾癬が挙げられる。
参照による援用
本明細書に引用されている参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願はいずれも、参照により、あらゆる目的でその全体が本明細書に援用される。しかしながら、本明細書に引用されているいずれの参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願に言及する際も、それらが、世界のいずれの国においても、正当な先行技術を構成したり、または技術常識の一部を形成すると解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりするものでないとともに、そのように解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりすべきでもない。
実施例１：材料及び方法
本明細書に記載されている実験では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、自己免疫疾患治療用の免疫療法としての臨床使用のために、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）における内在性標的遺伝子の発現を調節する。
Ｉ．材料
ｇＲＮＡ：別段に示されていない限り、いずれの実験でも、単分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用する。示されているように、デュアルｇＲＮＡ分子を使用したが、そのデュアルｇＲＮＡ分子は、２００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５３４）と２００μＭの標的特異的ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）をＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１１－０１－０３－０１）中で５分、９５℃で複合化して、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡが１：１の比率で存在する）を形成することによって形成した。
Ｃａｓ９：Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質のいずれかを導入することによって、標的細胞内で発現させた。別段に示されていない限り、下記の実験では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、核局在化配列を含むＣａｓ９コードｍＲＮＡ（Ｃａｓ９－ＮＬＳ ｍＲＮＡ）（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｌ－７２０６）、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴカタログ番号１０７４１８２）を使用した。
ＲＮＰ：ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体１．２μＬと、２０μＭのＣａｓ９タンパク質１μＬ及びＰＢＳ０．８μＬとを混ぜ合わせることによって形成した。混合物を室温で２０分インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。
レンチウイルス発現コンストラクト：ヒトゲノム内の単一の遺伝子を各々標的とする５６，４０８種のｓｇＲＮＡライブラリーを、ヒトＵ６プロモーターを含む発現ベクターにクローニングした。合計で５，１３７種の遺伝子を、このｇＲＮＡライブラリーの標的とした。プラスミドにはさらに、ＲＦＰの発現を駆動するＥＦ１Ｌプロモーター、Ｔ２Ａ配列及びピューロマイシン耐性カセットを含ませた。
上記のｓｇＲＮＡライブラリーをコードするレンチウイルスは、以下のようにして作製した。簡潔に述べると、トランスフェクションの２４時間前に、５７８×１０６個のＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ細胞を１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫに播種した。無血清ＯｐｔｉＭＥＭ、ＴｒａｎｓＩＴ－２９３及びヘルパープラスミド（ＶＳＶＧを１１６μｇ及びＰＡＸ２－Ｇａｇ－Ｐｏｌを２３１μｇ）を、上記のｓｇＲＮＡ発現プラスミド４６２μｇと合わせ、５分インキュベートした。この混合物を上記のＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ細胞に、新鮮な培地とともに加えた。トランスフェクションの１８時間後に、培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に、ウイルス上清を回収した。上清をヌクレアーゼＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で処理し、０．４５μｍのフィルターにかけて、ウイルス粒子を単離した。続いて、ウイルス粒子をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し、小分けし、力価の測定を行い、－８０℃で保存した。
ＩＩ．方法
ヒトＴｒｅｇ細胞の単離：健康なボランティア血液ドナー由来の新鮮なロイコパックまたは全血から、末梢血Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞を、段階的な方法で単離した。最初に、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール勾配遠心法によって得た。次に、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５２）を用いて、陰性免疫磁気選択によってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。Ｔｒｅｇを濃縮するために、単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ２５－ＰＥに対するモノクローナル抗体でさらに標識し、続いて、ＥａｓｙＳｅｐヒトＰＥ陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８５６１）を用いて正の選択を行った。続いて、濃縮したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞をＣＤ４及びＣＤ１２７に特異的なモノクローナル抗体で標識してから、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を行って、純粋なＴｒｅｇ集団を得た。Ｔｒｅｇは、以下のパラメーター：ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｄｉｍに基づいて選別した。
ヒトＴｒｅｇ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖：ヒト不活化血清ＡＢ（１０％）及びヒトＩＬ－２（６０ｎｇ／ｍｌまたは３００単位／ｍｌ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５Ｔ細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ）において、単離したＴｒｅｇを２×１０６細胞／ｍＬで平板培養した。培養０日目及び１０日目に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＴｒｅｇエキスパンダービーズまたはＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子（四量体）を、それぞれ１：４もしくは１：１細胞：ビーズ比で、またはアクチベーターの場合は１×様式で、培養物に加えた。追加のヒトＩＬ－２を、２～３日ごとに培養物に補充した。
Ｔｒｅｇ細胞のレンチウイルストランスダクション：１０日間の増殖後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔｒｅｇエキスパンダービーズを用いてＴｒｅｇを１８時間再活性化した後、６ウェルプレートに、ウェル当たり５×１０６細胞で、体積１．５ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ１５培地、６ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－２中に播種した。同じ増殖を行った後、ＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を用いてＴｅｆｆを１８時間再活性化した後、６ウェルプレートに、ウェル当たり５×１０６細胞で、体積１．５ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ１５培地、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２中に播種した。ｓｇＲＮＡライブラリーを発現するレンチウイルスを、全細胞の８０％に感染することができるＭＯＩにおいて、両方の細胞タイプに別個に加えた。各ウェルに２０μＬのレトロネクチン（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。ウェル当たり２．０ｍＬの最終体積にＸ－ＶＩＶＯ１５培地を加えた。プレートを６００×ｇで１．５時間、室温で回転させた。１８時間後（２日目）に、細胞を洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬで、Ｘ－ＶＩＶＯ１５中に播種した。Ｔｒｅｇ培養物には、６０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２を加え、Ｔｅｆｆ培養物には、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２及びＴ細胞活性化因子を加えた。
Ｔ細胞のエレクトロポレーション：示されている場合、エレクトロポレーションによってｇＲＮＡ及び／またはＣａｓ９をＴｒｅｇ細胞に導入した。例えば、Ｔｒｅｇ細胞に特定のｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスをトランスダクションした場合、トランスダクション後にＣａｓ９ ｍＲＮＡを細胞にエレクトロポレーションすることができる。代替的に、二本鎖ｇＲＮＡをＣａｓ９タンパク質と複合体化させてＲＮＰを形成することができ、次いでこれを、Ｔｒｅｇ細胞にエレクトロポレーションすることができる。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＲＮＰのエレクトロポレーションプロトコールは以下の通りである。
Ｔｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞の再活性化から３日後（増殖の１３日目）、特異的ｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスでトランスダクションしたＴｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞を回収し、１００×１０６細胞／ｍＬの濃度でヌクレオフェクション緩衝液（１８％補充１、Ａｍａｘａ Ｐ３初代細胞４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ ＸキットＳ（カタログ番号Ｖ４ＸＰ－３０３２）からの８２％ Ｐ３緩衝液）に再懸濁させた。２０μＬの細胞溶液当たりに４μｇ（１ｍｇ／ｍＬ当たり４μＬ）のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９－ＮＬＳ ｍＲＮＡを細胞混合物に加え、次いで２４μＬの細胞／ｍＲＮＡ混合物を各反応ウェルに加えた。「Ｔ ｃｅｌｌ，ｈｕｍａｎ，Ｓｔｉｍ」プログラム（ＥＯ－１１５）に従って細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、８０μＬの温かいＸ－ＶＩＶＯ１５培地を各ウェルに加え、細胞を培養フラスコに、ＩＬ－２（Ｔｒｅｇ：６０ｎｇ／ｍＬ；Ｔｅｆｆ：１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５培地に、２×１０６細胞／ｍＬの密度でプールした。再活性化後４日目に、以下に記載されるように、細胞を洗浄し、計数し、機能アッセイに利用した。標的遺伝子の編集効率を、表面または細胞内タンパク質（例えば、ＣＤ４５、Ｆｏｘｐ３）のＦＡＣＳ解析及び／またはゲノム切断部位のＴＩＤＥ／ＮＧＳ解析によって測定した。
遺伝子の編集は、次世代シーケンシングによって評価する。この方法では、Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号１３３２３）を業者推奨のプロトコールに従って用いて、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、編集されたＴ細胞から単離し、定量した。ｇＤＮＡの単離後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングアダプターの付加に必要なオーバーハングを含む遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲを行って、編集されたゲノムＤＮＡの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流して、ゲノム座位の特異的かつ充分な増幅が行われるようにしてから、業者推奨のプロトコールに従ってＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（カタログ番号：Ｔ１０３０Ｓ）を用いて、ＰＣＲクリーンアップを行った。続いて、精製ＰＣＲ産物を定量し、２回目のＰＣＲを行って、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプター、及びマルチプレックスに必要な試料特異的なインデックス付与配列をアニールした。この後、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流し、サイズを評価してから、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（内部で作製）を用いて精製した。続いて、Ｋａｐａ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号：ＫＫ４９２３）及びＫａｐａ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（カタログ番号：ＫＫ４９０３）を用いたｑＰＣＲによって、精製ＰＣＲ産物を定量した。続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｍｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｖ２（カタログ番号：ＦＣ－４０４－２００３）を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００システムに、定量した産物を充填した。生成されたシーケンシングデータの解析を行って、編集されたＴ細胞のプールのＤＮＡにおいて、予測切断部位での挿入及び欠失（インデル）を評価した。
編集Ｔｒｅｇ細胞の免疫表現型検査及びＴＳＤＲ解析：Ｔｒｅｇ細胞編集の４日後、細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ試薬で標識して細胞分裂を追跡し、ヒトＩＬ－２（５００単位／ｍｌ）の存在下、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔｒｅｇエキスパンダービーズで刺激した。４日間の刺激の後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（プラスタンパク質輸送阻害剤）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：００－４９７５－０３）で細胞を５時間再刺激した。以下の抗体：抗ＣＤ４（ＳＫ３）、－ＣＤ２５（ＭＡ－２５１）、－ＴＮＦＲＳＦ４（Ｂｅｒ－ＡＣＴ３５）及びＣＤ４５（ＨＩ３０）を用いて、細胞表面染色を行った。染色は、ヒトＦｃＢｌｏｃｋ試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：５６４２１９）の存在下、４℃で２０分間行った。細胞内タンパク質を検出するために、表面染色後、細胞を固定し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：００－５５２３－００）を用いて透過処理し、以下の抗体：抗Ｆｏｘｐ３（２５９Ｄ／Ｃ７）、Ｈｅｌｉｏｓ（２２Ｆ６）及びＩＬ－１０（ＪＥＳ３－９Ｄ７）で染色した。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をデータの収集に使用し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて解析を行った。ＴＳＤＲ解析のために、ベンダー推奨のプロトコールに従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号：１３３２３）を用いて、先に記載されているように、編集ＴｒｅｇからゲノムＤＮＡを単離した。ＥｐｉｇｅｎＤｘ（アッセイＩＤ ＡＤＳ７８３－ＦＳ２）によって、ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩変換及びパイロシーケンシングを行って、ＦＯＸＰ３遺伝子領域のメチル化状態を測定した。
編集Ｔｒｅｇによる同種異系Ｔエフェクター細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制：Ｃｏｌｌｉｓｏｎらによって開発された方法（“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒｅｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．７０７：２１－３７（２０１１））の修正版を用いてＴｒｅｇの抑制機能を測定した。凍結ｓｇＲＮＡ編集Ｔｒｅｇ及び非編集同種異系Ｔエフェクター細胞（以下、Ｔレスポンダー細胞と称する）を解凍し、１０％不活性化男性ヒト血清及び６００単位／ｍｌのＩＬ－２を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５Ｔ細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ）中に一晩静置した。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中でＴレスポンダー細胞及びＴｒｅｇを洗浄し、次いで、それぞれ１０μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔまたは４μＭ ＣＦＳＥを含む同じ緩衝液中で、室温で１０分インキュベートした。標識したＴレスポンダー細胞をＴ細胞増殖培地中に再懸濁させ、９６ウェルＵ底プレートに、ウェル当たり５０，０００細胞（５０μｌ）で播種した。別個のプレートに、Ｔ細胞増殖培地中に再懸濁させた標識Ｔｒｅｇを、ウェル当たり５０，０００細胞（５０μｌ）で播種し、系列希釈し、次いで１：２～１：３２の比率でＴレスポンダー細胞と混合した。最後に、１００μｌの０．５μｌ／ｍｌ ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞活性化因子を各ウェルに添加した。ＴｒｅｇまたはＣＤ３／２８四量体を伴わないウェルは、それぞれ陽性コントロール及び陰性コントロールとして機能した。３７℃で４日インキュベートした後、細胞をＣＤ４、ＣＤ３、Ｆｏｘｐ３及びＨｅｌｉｏｓ（上記）に対する抗体で染色した。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いてＴレスポンダー細胞の増殖を解析した。Ｔｒｅｇ抑制は、抑制（％）：１００－［１００×（Ｔｒｅｇを伴う増殖細胞の％）／（Ｔｒｅｇを伴わない増殖細胞の％）として測定した。
編集Ｔｒｅｇ機能のｉｎ ｖｉｖｏでの評価：ＣＲＩＳＰＲ編集ヒトＴｒｅｇの自己免疫応答を低下させる能力を、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のＮＳＧ－ヒトＰＢＭＣ異種マウスモデルにおいて評価した。Ｃｕｅｎｄｅらによって過去に説明されたモデル（“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＧＡＲＰ／ＴＧＦ－β１ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ，”Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．７（２８４）：２８４ｒａ５６（２０１５））を、ヒトＴｒｅｇの移入によって調節されるように適合させた。雌のＮＣＧマウス（８～１２週齢）に、２０×１０６個のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を静脈内注射した。１４日後、マウスを体重によって４群（群当たり５頭）に無作為に分け、３群に２×１０６個の編集ヒトＴｒｅｇを静脈内投与した。１群を非処置コントロールとして機能させ、Ｔｒｅｇ処置を行わなかった。処置する前に、（１）ＯＲ１Ａ１遺伝子を標的とするコントロールｇＲＮＡ（配列番号１ ＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧ）、（２）ＰＲＤＭ１遺伝子を標的とする単一ｇＲＮＡ（配列番号２ ＴＴＧＧＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡ）、及び（３）ＴＮＦＲＳＦ４遺伝子を標的とする単一ｇＲＮＡ（配列番号３ ＧＧＡＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＧ）を含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を用いたエレクトロポレーションによってヒトＴｒｅｇを編集した。ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ４遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を次世代シーケンシングによって評価し、それぞれ９９％及び８３％と測定された。体重及びＧｖＨＤスコア（体重減少、活動、姿勢、毛の質感及び皮膚統合性に関して与えられたスコアの合計）を、Ｔｒｅｇを移入した後週３回測定した。ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞の増殖及び活性化を追跡するために、Ｔｒｅｇの転写から１５日後に採取した末梢血試料についてもフローサイトメトリーを行った。結果を実施例４で論じる。
実施例２：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機能的ゲノムスクリーニングによるＴｒｅｇ細胞の免疫調節の標的の同定
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖中にＴｒｅｇの適合性を調節する標的を同定するために実験を行った。プールされたゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングを行い、その際に、それぞれ単一の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのプールを集団ヒトＴｒｅｇ細胞またはドナー適合Ｔｅｆｆ細胞に導入し、その集団内の各細胞が単一の遺伝子を標的とする単一のｓｇＲＮＡを含むようにした。ｅｘ ｖｉｖｏ増殖中のＴｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）に対する特定の遺伝子の効果を測定するため、実験の開始時にＴｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）の集団における各ｓｇＲＮＡの頻度を測定し、実験の後の時点における同じｓｇＲＮＡの頻度と比較した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）の増殖を正に調節する遺伝子（例えば、Ｔｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）の増殖または生存能を正に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、経時的に増加すると予想され、一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）の増殖を負に調節する遺伝子（例えば、Ｔｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）の増殖または生存能を負に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、経時的に減少すると予想される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖中の様々な時点で採取したアリコートにおける各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度を解析し、最初の編集Ｔｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）集団における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度と比較した。各個々のｓｇＲＮＡに対し統計解析を行って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖後にＴｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）集団において有意に濃縮されたｓｇＲＮＡを同定し、各ガイドに濃縮スコアを割り当てた。スクリーニングライブラリー内の各個々のｓｇＲＮＡについて、スクリーニングエンドポイントで観察されたガイドカウントの比を得、スクリーニングの開始時にそのガイドで観察されたリード数で割ることにより、濃縮スコアを計算した。遺伝子レベル濃縮スコアを計算するために、総濃縮スコアをｓｇＲＮＡ濃縮スコアの中央値として計算した。遺伝子レベル濃縮の統計的有意性を計算するために、各ガイドについてライブラリー内の他のすべてのガイドに対するそのガイドの濃縮のパーセンタイルとして名目上のｐ値を計算した。ロジットｐ値結合法（Ｍｕｄｈｏｌｋａｒ １９７７）を用いてこれらのｐ値を結合し、標的濃縮のための総遺伝子レベルｐ値を生成した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて遺伝子レベルｐ値を多重検定用に補正した。複数のｓｇＲＮＡにわたりｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ（またはＴｅｆｆ細胞）の蓄積に一貫した再現可能な効果を及ぼす標的遺伝子を同定するため、０．２以下の偽発見率（ＦＤＲ）カットオフ値を設定した。これらの実験の結果は、以下の表２及び図１に示されている。表２の遺伝子は、遺伝子レベル濃縮スコアがトップ１０の遺伝子であり、ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ４は、ＦＤＲ基準に合格した２つの遺伝子であった。
Figure 2022519070000004
実施例３：Ｔｒｅｇ細胞の免疫調節の標的の検証
０．２以下のＦＤＲカットオフを有する標的を単一ガイド形式でのさらなる評価のために選択して、Ｔｒｅｇ細胞における標的遺伝子の編集が、これらの細胞の安定性及び／または機能を変化させるかどうかを判定した。例示的な標的の評価が本明細書に記載されているが、これらの方法は、上記の有望な標的のいずれかを評価するために使用することができる。
編集ヒトＴｒｅｇ細胞の免疫表現型検査：ヒトＴｒｅｇ細胞を上記のようにｅｘ ｖｉｖｏで単離し、増殖させ、個々の標的遺伝子に対し、ＲＮＰ形式でＣａｓ９に複合体化されたガイドＲＮＡを用いたエレクトロポレーションによって編集した。図２に示されているように、高効率の標的遺伝子編集は、記載されている方法を用いて達成することができた。ヒトＴｒｅｇ細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機能ゲノミクススクリーニングによって同定した個々の標的遺伝子の編集の結果をフローサイトメトリーによって測定し、Ｔｒｅｇの安定性及び機能にとって重要であることが知られている特定の転写因子及びサイトカインの増殖能力ならびに頻度及び程度における任意の変化を細胞ごとに定量化した。
編集Ｔｒｅｇ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔｒｅｇエキスパンダービーズで再刺激し、４日目に増殖能力、転写因子発現、及びサイトカイン産生を評価した。図３に示されているように、ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ４編集Ｔｒｅｇ細胞は、コントロールのＣＤ４５編集Ｔｒｅｇ細胞と比べて、ＣＴＶ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）がそれぞれ４０％及び３０％減少することが示された。ＣＴＶ染色の低下は細胞分裂の各ラウンド中に起こるため、編集Ｔｒｅｇ細胞で観察されるＣＴＶ染色の低下は、ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ４編集Ｔｒｅｇ細胞の増殖の向上を示すものである。
Ｔｒｅｇ細胞における転写因子Ｈｅｌｉｏｓは、Ｔｒｅｇ細胞の安定性に不可欠であることが知られている（Ｋｉｍ ＨＪ，Ｂａｒｎｉｔｚ ＲＡ，Ｋｒｅｓｌａｖｓｋｙ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｈｅｌｉｏｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３５０（６２５８）：３３４－９．）。さらに、ＨｅｌｉｏｓとＴｒｅｇ細胞系列決定転写因子ＦｏｘＰ３との結合は、コアＴｒｅｇシグネチャー遺伝子の発現と強く関連付けられている（Ｋｗｏｎ ＨＫ，Ｃｈｅｎ ＨＭ，Ｍａｔｈｉｓ Ｄ，Ｂｅｎｏｉｓｔ Ｃ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＦｏｘＰ３．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；１８（１１）：１２３８－１２４８）。したがって、Ｔｒｅｇ細胞におけるＨｅｌｉｏｓ及びＦｏｘｐ３の共発現は、安定性の改善及び免疫抑制機能の向上と関連付けられている。図４に示されているように、Ｔｒｅｇ細胞におけるＰＲＤＭ１の編集は、Ｆｏｘｐ３及びＨｅｌｉｏｓの両方を共発現するＴｒｅｇ細胞の割合を２．６倍増加させ、ＰＲＤＭ１の編集は、Ｔｒｅｇ細胞の安定性及び免疫抑制機能の改善と関連するＴｒｅｇ細胞の表現型の変化をもたらすことが示された。
加えて、いくつかの研究では、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）と名付けられたＦｏｘｐ３座位内の保存領域の脱メチル化が、分裂するＴｒｅｇ細胞の子孫におけるＦｏｘｐ３の発現を維持するために必要とされることが示されている（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｏｘｐ３ ｇｅｎｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｆａｔｅ，”Ｎａｔｕｒｅ ４６３：８０８－１２（２０１０）；Ｐｏｌａｎｓｋｙ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｆｏｘｐ３ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１６５４－１６６３（２００８））。図５に示されているように、ＴＮＦＲＳＦ４の編集は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＴＳＤＲのメチル化状態に影響を及ぼさず、ＰＲＤＭ１の編集は、ＴＳＤＲの脱メチル化を増加させた（コントロールのＣＤ４５編集Ｔｒｅｇ細胞と比べて２７％の増加）。これらのデータは、ＰＲＤＭ１の編集が、安定したＴｒｅｇ細胞の蓄積を促進することを示している。
Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ－１０のような免疫抑制性サイトカインの産生は、Ｔｒｅｇ細胞がその抑制機能を媒介することができる主要な機構である。実際、ＩＬ－１０を産生することができないＴｒｅｇ細胞は、Ｔエフェクター細胞媒介の炎症を予防することができない（Ａｓｓｅｍａｎ Ｃ，Ｍａｕｚｅ Ｓ，Ｌｅａｃｈ ＭＷ，Ｃｏｆｆｍａｎ ＲＬ，Ｐｏｗｒｉｅ Ｆ．Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９９；１９０（７）：９９５－１００４）。図６に示されているように、Ｔｒｅｇ細胞におけるＴＮＦＲＳＦ４の編集は、コントロールのＣＤ４５編集Ｔｒｅｇ細胞と比べて、Ｔｒｅｇ細胞のＩＬ－１０産生能力を４０％増加させた。ＰＲＤＭ１の編集は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ－１０産生を１０％増加させた。同様の実験により、ＴＮＦＲＳＦ４の編集は、ＩＬ－１７Ａ及びＩＦＮγを含む炎症促進性サイトカインに影響を及ぼさないことが示された。
ＩＬ－６のような炎症性サイトカインは、Ｔｒｅｇを不安定化し、その抑制機能を弱める可能性がある（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９：４４－５６（２００８））。マウスでは、ＩＬ－６によるＴｒｅｇの不安定化は、ＰＲＤＭ１の非存在下で促進される（Ｇａｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｌｉｍｐ１ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｘｐ３ ａｎｄ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｔ Ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２６：１８５４－１８６８（２０１９））。ＩＬ－６がＰＲＤＭ１欠損ヒトＴｒｅｇの不安定化を促進するかどうかを判定するために、ＰＲＤＭ１及びコントロール編集Ｔｒｅｇを、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６の存在下または非存在下で培養した。図７Ａ及びＢに示されている結果は、マウスＴｒｅｇとは対照的に、ＰＲＤＭ１編集ヒトＴｒｅｇは、Ｈｅｌｉｏｓの高い発現によって示されるように、大量のＩＬ－６の存在下においてさえも安定性を維持することを示している。
Ｔｒｅｇの抑制機能は様々な代謝過程に依存しており、その一部はＴｒｅｇがｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を経るにつれて下方調節される（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．，“ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８８：２８７－９６（１９９８）；Ｋｕｎｉｙａｓｕ Ｙ， ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＣＤ２５（＋）ＣＤ４（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，”Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１１４５－５５（２０００））。ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ４の編集がＴｒｅｇの増殖の向上をもたらしたことを鑑みて、このようなＴｒｅｇのＴエフェクター細胞の増殖を抑制する能力について評価した。Ｔｒｅｇを１：２～１：３２の比率で標識Ｔエフェクター細胞とともに４日間培養するｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系（方法参照）では、ＰＲＤＭ１及びＴＮＦＲＳＦ４編集Ｔｒｅｇはいずれも、Ｔエフェクター細胞の増殖を抑制することができ、その抑制機能はコントロール編集Ｔｒｅｇと同程度であった（図８）。
まとめると、これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機能的ゲノムスクリーニングを介して同定した遺伝子に対する個々のガイド配列を用いたＴｒｅｇ細胞の編集が、Ｔｒｅｇの安定性及び機能にとって重要であることが知られている特異的転写因子及びサイトカインの増殖能力ならびに頻度及び程度に明確な変化をもたらすことを示している。
実施例４：Ｔｒｅｇ細胞の免疫調節の標的の検証
図９Ａのデータは、ＧｖＨＤを発症したヒトＴｒｅｇ処置マウスが、非処置マウスと比べて生存期間が長いことを示している。５頭すべての非処置マウスが最初の体重を下回るまでに要した期間が２５日であったのに対し、コントロールの編集Ｔｒｅｇ処置マウスでは３２日であった。ＴＮＦＲＳＦ４－／－Ｔｒｅｇ処置群のマウスは、Ｔｒｅｇ移入後５８日目（ＰＢＭＣ移入後７２日目）まで初回測定値を上回った体重を維持している。図９Ｂは、Ｔｒｅｇ移入後１５日目のマウスの末梢血におけるフローサイトメトリーデータを示している。Ｋｉ６７染色強度は、細胞の増殖能力を定量化するための代理マーカーであることが示されている（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（“Ｋｉ６７ ｉｓ ａ Ｇｒａｄｅｄ Ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ａ Ｂｉｎａｒｙ Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ，”Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２４（５）：１１０５－１１１２．ｅ５（２０１８））。Ｔｒｅｇを移入したすべての群のヒトＣＤ８細胞でＫｉ６７染色強度が低下しており、Ｔｒｅｇが炎症を抑制できることが示された。さらに、ＴＮＦＲＳＦ４編集Ｔｒｅｇで処置したマウスでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内のＫｉ６７染色強度がさらに低下することが明らかになり、ＴＮＦＲＳＦ４の喪失がｉｎ ｖｉｖｏでより強力なＴｒｅｇをもたらすことが示された（図９Ｂ）。

Claims (134)

  1. ＴＮＦＲＳＦ４を含む１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）であって、
    前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記Ｔｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、前記改変Ｔｒｅｇ。
  2. 前記遺伝子調節システムが、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む、請求項１に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  3. 前記遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択した核酸分子を含む、請求項２に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  4. 前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、請求項２に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  5. 前記タンパク質が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、請求項４に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  6. 前記遺伝子調節システムが、核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、前記酵素タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである、請求項２に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  7. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  8. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である、請求項６に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  9. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である、請求項６に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  10. 前記Ｃａｓタンパク質が、不活性化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している、請求項６に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  11. 前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、請求項１０に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  12. ＰＲＤＭ１を含む１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変Ｔｒｅｇであって、
    前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記Ｔｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、前記改変Ｔｒｅｇ。
  13. 前記遺伝子調節システムが、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む、請求項１２に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  14. 前記遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択した核酸分子を含む、請求項１３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  15. 前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、請求項１３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  16. 前記タンパク質が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、請求項１５に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  17. 前記遺伝子調節システムが、核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、前記酵素タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである、請求項１３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  18. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  19. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である、請求項１７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  20. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である、請求項１７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  21. 前記Ｃａｓタンパク質が、不活性化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している、請求項１７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  22. 前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、請求項２１に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  23. 前記遺伝子調節システムが、内在性標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１～２２のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  24. ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変Ｔｒｅｇであって、
    前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記Ｔｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、前記改変Ｔｒｅｇ。
  25. 前記遺伝子調節システムが、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む、請求項２４に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  26. 前記遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択した核酸分子を含む、請求項２４に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  27. 前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、請求項２４に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  28. 前記タンパク質が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、請求項２７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  29. 前記遺伝子調節システムが、核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、前記酵素タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである、請求項２４に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  30. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２９に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  31. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である、請求項２９に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  32. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である、請求項２９に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  33. 前記Ｃａｓタンパク質が、不活性化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している、請求項２９に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  34. 前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）またはｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  35. 前記遺伝子調節システムが、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項２４～３４のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  36. 前記遺伝子調節システムが、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した内在性標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項３５に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  37. 前記遺伝子調節システムが、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＲＳＦ４であり、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている、請求項１に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  38. 前記複数の標的遺伝子のうちの１つが、ＴＮＦＲＳＦ４であり、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている、請求項３７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  39. 前記遺伝子調節システムが、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＰＲＤＭ１であり、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている、請求項１２に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  40. 前記複数の標的遺伝子のうちの１つが、ＰＲＤＭ１であり、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている、請求項３９に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  41. 前記遺伝子調節システムが、複数のｇＲＮＡ分子を含む、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ細胞。
  42. 前記遺伝子調節システムが、前記Ｔｒｅｇに、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入されている、請求項１～４１のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  43. 前記遺伝子調節システムが、前記システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている、請求項４２に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  44. 前記免疫抑制機能が、Ｔｒｅｇ増殖性、Ｔｒｅｇ生存能、Ｔｒｅｇ安定性、免疫抑制性サイトカインの発現または分泌の増加（任意に、前記免疫抑制性サイトカインはＩＬ－１０である）、Ｆｏｘｐ３及びＨｅｌｉｏｓの共発現の増加、及び／または疲弊耐性から選択されている、請求項１～４３のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  45. ＩＬ－６を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中にＴｒｅｇ安定性を評価する、請求項４４に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  46. 細胞表面上に提示された操作免疫受容体をさらに含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  47. 前記操作免疫受容体が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項４６に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  48. 前記操作免疫受容体が、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項４７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  49. 前記操作免疫受容体が、標的細胞上に発現する抗原に特異的に結合する、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  50. 前記Ｔｒｅｇが、ヒトＴｒｅｇである、請求項１～４９のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  51. 非改変Ｔｒｅｇにおける１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能と比較して、１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変Ｔｒｅｇであって、前記１つ以上の内在性遺伝子がＴＮＦＲＳＦ４を含み、前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記Ｔｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、前記改変Ｔｒｅｇ。
  52. 非改変Ｔｒｅｇにおける１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能と比較して、１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変Ｔｒｅｇであって、前記１つ以上の内在性遺伝子がＰＲＤＭ１を含み、前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記Ｔｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、前記改変Ｔｒｅｇ。
  53. 非改変Ｔｒｅｇにおける１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能と比較して、１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変Ｔｒｅｇであって、前記１つ以上の内在性遺伝子がＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択されており、前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記Ｔｒｅｇの免疫抑制機能が増強される、前記改変Ｔｒｅｇ。
  54. 細胞表面上に提示された操作免疫受容体をさらに含む、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  55. 前記操作免疫受容体が、ＣＡＲまたは操作ＴＣＲである、請求項５４に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  56. 前記操作免疫受容体が、標的細胞上に発現する抗原に特異的に結合する、請求項５４または５５に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  57. ＴＮＦＲＳＦ４の発現の低下をさらに含む、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  58. ＴＮＦＲＳＦ４の発現及び／または機能の低下、ならびにＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択した少なくとも１つの標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む、請求項５７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  59. ＴＮＦＲＳＦ４の発現及び／または機能の低下、ならびにＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む、請求項５８に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  60. ＰＲＤＭ１の発現の低下をさらに含む、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  61. ＰＲＤＭ１の発現及び／または機能の低下、ならびにＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択した少なくとも１つの標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む、請求項６０に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  62. ＰＲＤＭ１の発現及び／または機能の低下、ならびにＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む、請求項６１に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  63. 前記遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡから選択した核酸分子を含む、請求項１または請求項１３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  64. 前記遺伝子調節システムがさらに、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる、請求項６３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  65. 前記遺伝子調節システムが、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み、少なくとも１つの内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択されている、請求項６３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  66. 前記遺伝子調節システムが、ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰからなる群から選択した内在性標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項６５に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  67. 前記遺伝子調節システムが、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＲＳＦ４であり、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰ２から選択されている、請求項６３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  68. 前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＲＳＦ４であり、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている、請求項６７に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  69. 前記遺伝子調節システムが、複数の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＰＲＤＭ１であり、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰ２から選択されている、請求項６３に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  70. 前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＰＲＤＭ１であり、前記複数の標的遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを上回る標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰから選択されている、請求項６９に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  71. 前記Ｔｒｅｇが、ヒトＴｒｅｇである、請求項５１～７０のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  72. 請求項１～７１のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇを含む組成物。
  73. 少なくとも１ｘ１０４個、１ｘ１０５個、１ｘ１０６個、１ｘ１０７個、１ｘ１０８個、１ｘ１０９個または１ｘ１０１０個の改変Ｔｒｅｇを含む、請求項７２に記載の組成物。
  74. 前記組成物が必要な対象に投与するのに適している、請求項７２または７３に記載の組成物。
  75. 前記組成物が必要な前記対象に由来する自家Ｔｒｅｇを含む、請求項７２～７４のいずれか１項に記載の組成物。
  76. ドナー対象に由来する同種異系Ｔｒｅｇを含む、請求項７２～７４のいずれか１項に記載の組成物。
  77. 細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記１つ以上の内因性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、前記遺伝子調節システム。
  78. 前記システムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項７７に記載の遺伝子調節システム。
  79. 細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記１つ以上の内因性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、前記遺伝子調節システム。
  80. 前記システムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項７９に記載の遺伝子調節システム。
  81. 細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記１つ以上の内因性標的遺伝子が、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６及びＡＤＮＰ２からなる群から選択されている、前記遺伝子調節システム。
  82. 前記システムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項８１に記載の遺伝子調節システム。
  83. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項７８～８２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  84. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である、請求項７８～８２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  85. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である、請求項７８～８２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  86. 前記Ｃａｓタンパク質が、不活性化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している、請求項７８～８２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  87. 前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン－及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、請求項８６に記載の遺伝子調節システム。
  88. 前記システムが、核酸分子を含み、前記核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡである、請求項７７、７９または８１に記載の遺伝子調節システム。
  89. 前記システムが、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている、請求項７７、７９または８１に記載の遺伝子調節システム。
  90. 請求項７７～８９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを含むキット。
  91. 内在性標的遺伝子内の標的配列と相補的であるターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子であって、前記内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４である、前記ｇＲＮＡ核酸分子。
  92. 内在性標的遺伝子内の標的配列と相補的であるターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子であって、前記内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１である、前記ｇＲＮＡ核酸分子。
  93. 内在性標的遺伝子内の標的配列と相補的であるターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子であって、前記内在性標的遺伝子が、ＲＥＥＰ３、ＭＲＰＬ３２、ＦＳＣＮ３、ＫＬＣ３、Ｃ４ＢＰＡ、ＬＺＴＳ１、ＣＤＫ１６、及びＡＤＮＰ２から選択されている、前記ｇＲＮＡ核酸分子。
  94. 前記標的配列が、ＰＡＭ化配列を含む、請求項９１～９３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
  95. 前記ｇＲＮＡが、モジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項９１～９４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
  96. 前記ｇＲＮＡが、デュアルｇＲＮＡ分子である、請求項９１～９４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
  97. 前記ターゲティングドメインが、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である、請求項９１～９６のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
  98. その５’末端もしくはその５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変、及び／またはその３’末端もしくはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変を含む、請求項９１～９７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
  99. 前記改変ｇＲＮＡをＴ細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する安定性が向上する、請求項９８に記載のｇＲＮＡ分子。
  100. 前記改変ｇＲＮＡをＴ細胞に導入すると、自然免疫応答が軽減される、請求項９８または９９に記載のｇＲＮＡ分子。
  101. 請求項９１～１００のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子。
  102. 請求項９１～１００のいずれか１項から選択した複数のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子。
  103. 請求項９１～１００のいずれか１項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子、または請求項１０１または１０２に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
  104. 請求項９１～１００のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子、または請求項１０１または１０２に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
  105. 改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、
    Ｔｒｅｇを対象から採取すること、
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇに導入することであって、前記遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、前記導入すること、ならびに
    前記Ｔｒｅｇを培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて低下するようにすること、
    を含む、前記方法。
  106. 改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、
    Ｔｒｅｇを対象から採取すること、
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇに導入することであって、前記遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、前記導入すること、ならびに
    前記Ｔｒｅｇを培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて低下するようにすること、
    を含む、前記方法。
  107. 改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇに導入することであって、前記遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、前記導入することを含む、前記方法。
  108. 改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇに導入することであって、前記遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、前記導入することを含む、前記方法。
  109. 前記遺伝子調節システムが、請求項７４～８６から選択したものである、請求項１０５～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、請求項１０５～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  111. 前記遺伝子調節システム及び／または前記操作免疫受容体をコードする前記ポリヌクレオチドを、前記Ｔｒｅｇに、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディスクデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として、前記遺伝子調節システムを導入する、請求項１０７～１１１のいずれか１項に記載の方法。
  113. 改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、
    Ｔｒｅｇ集団を採取すること、
    前記Ｔｒｅｇ集団を増殖させること、及び
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇ集団に導入することを含み、前記遺伝子調節システムが、ＴＮＦＲＳＦ４を含む１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、前記方法。
  114. 前記増殖の前に、前記遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇ集団に導入する、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記増殖の後に、前記遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇ集団に導入する、請求項１１３に記載の方法。
  116. 改変Ｔｒｅｇの作製方法であって、
    Ｔｒｅｇ集団を採取すること、
    前記Ｔｒｅｇ集団を増殖させること、及び
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇ集団に導入することを含み、前記遺伝子調節システムが、ＰＲＤＭ１を含む１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、前記方法。
  117. 前記増殖の前に、前記遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇ集団に導入する、請求項１１３に記載の方法。
  118. 前記増殖の後に、前記遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇ集団に導入する、請求項１１３に記載の方法。
  119. 前記Ｔｒｅｇが、ヒトＴｒｅｇである、請求項１０５～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 治療の必要な対象における疾患または障害の治療方法であって、請求項１～７１のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ、または請求項７２～７６のいずれか１項に記載の組成物を有効量投与することを含む、前記方法。
  121. 前記疾患または障害が、自己免疫障害である、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記自己免疫障害が、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭関節炎、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び乾癬である、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記改変Ｔｒｅｇが、前記対象に対して自家である、請求項１２０～１２２のいずれか１項に記載の方法。
  124. 前記改変Ｔｒｅｇが、前記対象に対して同種異系である、請求項１２０～１２２のいずれか１項に記載の方法。
  125. Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇに導入することであって、前記遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、前記導入すること、ならびに
    前記Ｔｒｅｇを培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて低下するようにすることを含み、
    前記改変Ｔｒｅｇにおいて、１つ以上の免疫抑制機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて増強される、前記方法。
  126. Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇに導入することであって、前記遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、前記導入すること、ならびに
    前記Ｔｒｅｇを培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて低下するようにすることを含み、
    前記改変Ｔｒｅｇにおいて、１つ以上の免疫抑制機能が、改変していないＴｒｅｇと比べて増強される、前記方法。
  127. Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇに導入することであって、前記遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ４を含む、前記導入することを含む、前記方法。
  128. Ｔｒｅｇの１つ以上の免疫抑制機能の増強方法であって、
    遺伝子調節システムを前記Ｔｒｅｇに導入することであって、前記遺伝子調節システムが、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができ、前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＰＲＤＭ１を含む、前記導入することを含む、前記方法。
  129. 前記１つ以上の免疫抑制機能が、Ｔｒｅｇ増殖性、Ｔｒｅｇ生存能、Ｔｒｅｇ安定性、免疫抑制性サイトカインの発現または分泌の増加（任意に、前記免疫抑制性サイトカインはＩＬ－１０である）、Ｆｏｘｐ３及びＨｅｌｉｏｓの共発現の増加、及び／または疲弊耐性から選択されている、請求項１２５～１２８のいずれか１項に記載の方法。
  130. ＩＬ－６を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中にＴｒｅｇ安定性を評価する、請求項１２９に記載の方法。
  131. 治療の必要な対象における自己免疫疾患の治療方法であって、請求項１～７１のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ、または請求項７２～７６のいずれか１項に記載の組成物を有効量投与することを含む、前記方法。
  132. 前記自己免疫疾患が、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭関節炎、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び乾癬からなる群から選択されている、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記改変Ｔｒｅｇが、組織常在性Ｔｒｅｇである、請求項１～７１のいずれか１項に記載の改変Ｔｒｅｇ。
  134. 前記Ｔｒｅｇが、組織常在性Ｔｒｅｇである、請求項１０５～１３２のいずれか１項に記載の方法。
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