JP7101419B2 - 内因性ｔ細胞受容体の標的置換 - Google Patents

内因性ｔ細胞受容体の標的置換 Download PDF

Info

Publication number
JP7101419B2
JP7101419B2 JP2020523254A JP2020523254A JP7101419B2 JP 7101419 B2 JP7101419 B2 JP 7101419B2 JP 2020523254 A JP2020523254 A JP 2020523254A JP 2020523254 A JP2020523254 A JP 2020523254A JP 7101419 B2 JP7101419 B2 JP 7101419B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tcr
heterologous
cell
cells
chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020523254A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2021500889A (ja
JP2021500889A5 (ja
Inventor
セオドア リー ロス
エリック シフルット
アレクサンダー マーソン
サウス クリスティーナ プイグ
アントニ リバス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California San Diego UCSD filed Critical University of California San Diego UCSD
Publication of JP2021500889A publication Critical patent/JP2021500889A/ja
Publication of JP2021500889A5 publication Critical patent/JP2021500889A5/ja
Priority to JP2022103225A priority Critical patent/JP2022137112A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7101419B2 publication Critical patent/JP7101419B2/ja
Priority to JP2024152864A priority patent/JP2024174943A/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/32—T-cell receptors [TCR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4267—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K40/4269—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/428—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

先行する関連出願
本出願は、2017年10月27日付で出願された米国仮特許出願第62/578,153号の恩典を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
発明の背景
T細胞は、養子細胞療法の成長分野で最も活発に研究されている細胞型である。T細胞はそのT細胞受容体(TCR)の標的と特異的に相互作用し、最小限の副作用で非常に特異的な応答を可能にする。これらの非常に効果的かつ特異的な応答は、T細胞に所望の特異性を有する新しい受容体を挿入することにより、新規の抗原および標的に向けて操作することができる。しかしながら、全く新しいタイプの受容体の開発は時間がかかり、費用がかかり、身体が、内因性T細胞レパートリーの発達を通じて、ほとんどの存在し得る抗原標的に結合するTCRを自然に産生するという事実を活用することができない。ヒトT細胞を取得し、その内因性TCRを、所望の抗原特異性を有するTCRで置き換える能力は、養子T細胞療法の開発および適用において斬新でありうる。
本開示は、ヒトT細胞のゲノムを編集するための組成物および方法を対象にする。本発明者らは、異種TCRが内因性TCRプロモーターの制御下にあるように、異種TCRをT細胞のゲノムにおける標的領域に挿入できることを発見した。本明細書において提供される方法および組成物は、ヒトT細胞における内因性TCRを、所望の抗原特異性を有する異種TCRで置き換えるために用いることができる。いくつかの態様において、T細胞のゲノムにおける標的領域は、天然のT細胞受容体遺伝子座である。
いくつかの態様において、本開示は、ヒトT細胞のゲノムを編集する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) TCRサブユニットの可変領域および定常領域を含む、第1の異種TCRサブユニット鎖、(iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 第2の異種TCRサブユニット鎖の可変領域; ならびに(v) 内因性TCRサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列を、ヒトT細胞におけるT細胞受容体(TCR)サブユニット定常遺伝子のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含み、内因性TCRサブユニットがTCR-アルファ(TCR-α)サブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-ベータ(TCR-β)サブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、内因性TCRサブユニットがTCR-βサブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-βサブユニット鎖である。いくつかの態様において、本方法は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-β鎖; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-α鎖の可変領域; および(v) 内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列を、ヒトT細胞におけるTCRアルファサブユニット定常遺伝子(TRAC)のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含む。
いくつかの態様において、本方法は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-α鎖; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-β鎖の可変領域; および(v) 内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列を、ヒトT細胞におけるTCR-ベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含む。
いくつかの態様において、核酸は、核酸を含むウイルスベクターをT細胞に導入することによって挿入される。いくつかの態様において、核酸は、核酸を含む非ウイルスベクターをT細胞に導入することによって挿入される。いくつかの態様において、核酸は、(a) TCR-αサブユニット定常遺伝子(TRAC)のエクソン1中の標的領域を切断してT細胞のゲノム中に挿入部位を作り出す標的指向型ヌクレアーゼ; および(b) 相同組み換え修復(HDR)によって挿入部位に組み入れられる、核酸配列をT細胞に導入することによってT細胞に挿入される。いくつかの態様において、核酸は、(a) TCR-βサブユニット定常遺伝子(TRBC)のエクソン1中の標的領域を切断してT細胞のゲノム中に挿入部位を作り出す標的指向型ヌクレアーゼ; および(b) 相同組み換え修復(HDR)によって挿入部位に組み入れられる核酸配列を、T細胞に導入することによってT細胞に挿入される。いくつかの態様において、核酸の5'末端および3'末端は、標的領域に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸の5'末端および3'末端は、挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、標的指向型ヌクレアーゼは、挿入部位に二本鎖切断を導入する。いくつかの態様において、核酸配列は、二本鎖または一本鎖核酸として細胞に導入される。いくつかの態様において、核酸は、二本鎖または一本鎖DNA鋳型として細胞に導入される。いくつかの態様において、核酸配列は、線状核酸として細胞に導入される。
いくつかの態様において、第1の自己切断ペプチドおよび第2の自己切断ペプチドは、同じまたは異なるウイルス2Aペプチドである。
いくつかの態様において、標的指向型ヌクレアーゼは、RNAガイドヌクレアーゼドメイン、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)およびmegaTALからなる群より選択される。いくつかの態様において、RNAガイドヌクレアーゼは、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、本方法は、TRACのエクソン1中の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む。いくつかの態様において、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、ガイドRNA、および核酸は、(i) Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、およびガイドRNAを含む、リボ核タンパク質複合体(RNP); ならびに(ii) DNA鋳型を含む、リボ核タンパク質複合体(RNP)-DNA鋳型複合体として細胞に導入される。
いくつかの態様において、複合体中のRNPとDNA鋳型とのモル比は、約3:1～約100:1である。いくつかの態様において、RNP-DNA鋳型複合体は、約20℃～25℃の温度で、約10分間～約30分間、RNPをDNA鋳型とともにインキュベートすることによって形成される。いくつかの態様において、RNP-DNA鋳型複合体および細胞は、RNP-DNA鋳型複合体を細胞に導入する前に混合される。いくつかの態様において、RNP-DNA鋳型複合体は、少なくとも2つの構造的に異なるRNP複合体を含む。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なるRNP複合体は、構造的に異なるガイドRNAを含む。いくつかの態様において、構造的に異なるRNP複合体の各々は、Cas9ニッカーゼを含み、かつ構造的に異なるガイドRNAは、標的領域の反対の鎖にハイブリダイズする。
いくつかの態様において、導入はエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様において、核酸は約1×105～約2×106個のT細胞の集団に導入される。いくつかの例では、標的指向型ヌクレアーゼおよびDNA鋳型は、約1×105～約2×106個のT細胞の集団に導入される。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なるDNA鋳型が細胞に導入される。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なるDNA鋳型は、非ウイルス鋳型である。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なるDNA鋳型の各々は、抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-β鎖の可変領域および抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-α鎖の可変領域の固有の組み合わせをコードする。いくつかの態様において、T細胞は、調節性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である。いくつかの態様において、T細胞はエフェクターT細胞であり、かつエフェクターT細胞はCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はエフェクターT細胞であり、かつエフェクターT細胞はCD4+ T細胞である。いくつかの態様において、エフェクターT細胞はCD4+CD8+ T細胞である。
いくつかの態様において、本方法はさらに、抗原特異的T細胞受容体を形成させるために異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖の発現を可能にする条件下でT細胞を培養する段階を含む。いくつかの態様において、本方法はさらに、改変細胞の集団を増大するのに有効な条件下で改変T細胞を培養する段階を含む。いくつかの態様において、本方法はさらに、抗原特異的T細胞受容体を発現するT細胞を精製する段階を含む。
いくつかの態様において、本開示は、(a) N末端からC末端に向かって、(i) 自己切断ペプチド配列; (ii) 抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-α鎖; および(iii) 内因性TCRアルファサブユニットのエクソン1のN末端の部分をコードする第1の核酸配列を、ヒトT細胞におけるTCRアルファサブユニット定常遺伝子(TRAC)のエクソン1中の標的領域に挿入する段階; ならびに(b) N末端からC末端に向かって、(i) 第2の自己切断ペプチド配列; (ii) 抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-β鎖; および(iii) 内因性TCRベータサブユニットのエクソン1のN末端の部分をコードする第2の核酸配列を、ヒトT細胞におけるTCRベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含む、ヒトT細胞のゲノムを編集する方法を提供する。
いくつかの態様において、第1および/または第2の核酸配列は、第1および/または第2の核酸を含むウイルスベクターをT細胞に導入することによって挿入される。いくつかの態様において、第1および/または第2の核酸配列は、第1および/または第2の核酸を含む非ウイルスベクターをT細胞に導入することによって挿入される。いくつかの態様において、第1および第2の核酸は、(a) TRACのエクソン1中に第1の挿入部位およびTCRベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)のエクソン1中に第2の挿入部位を作り出す1つまたは複数の標的指向型ヌクレアーゼ; および(b) 第1の核酸配列; ならびに(c) 第2の核酸配列を導入することによってT細胞に挿入され、ここで相同組み換え修復(HDR)によって第1の核酸配列がTRACのエクソン1中の第1の挿入部位に挿入され、第2の核酸配列がTRBCのエクソン1中の第2の挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、核酸配列は、二本鎖または一本鎖DNA鋳型として細胞に導入される。いくつかの態様において、核酸配列は、線状DNA鋳型として細胞に導入される。
いくつかの態様において、第1の核酸配列の5'末端および3'末端は、TRAC遺伝子のエクソン1中の標的領域に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、第1の核酸配列の5'末端および3'末端は、TRAC遺伝子のエクソン1中の第1の挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、第2の核酸配列の5'末端および3'末端は、TRBC遺伝子のエクソン1中の標的領域に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、第2の核酸配列の5'末端および3'末端は、TRBC遺伝子のエクソン1中の第2の挿入に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数の標的指向型ヌクレアーゼは、第1および第2の挿入部位に二本鎖切断を導入する。いくつかの態様において、第1の自己切断ペプチドおよび第2の自己切断ペプチドは、同じまたは異なるウイルス2Aペプチドである。いくつかの態様において、1つまたは複数の標的指向型ヌクレアーゼは、RNAガイドヌクレアーゼドメイン、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、またはmegaTALからなる群より選択される。
いくつかの態様において、RNAガイドヌクレアーゼは、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、かつ本方法は、TRACのエクソン1中の標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のガイドRNA、およびTRBCのエクソン1中の標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む。いくつかの態様において、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、第1のガイドRNA、および第1の核酸は、(i) Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、および第1のガイドRNAを含む、リボ核タンパク質複合体(RNP); ならびに(ii) 第1のDNA鋳型を含む、リボ核タンパク質複合体(RNP)-DNA鋳型複合体として細胞に導入される。いくつかの態様において、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、第2のガイドRNA、および第2の核酸は、(i) Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、および第2のガイドRNAを含む、RNP; ならびに(ii) 第2のDNA鋳型を含む、RNP-DNA鋳型複合体として細胞に導入される。
いくつかの態様において、複合体中のRNPとDNA鋳型とのモル比は、約3:1～約100:1である。いくつかの態様において、RNP-DNA鋳型複合体は、約20℃～25℃の温度で、約10分間～約30分間、RNPをDNA鋳型とともにインキュベートすることによって形成される。いくつかの態様において、RNP-DNA鋳型複合体は、少なくとも2つの構造的に異なるRNP複合体を含む。いくつかの態様において、構造的に異なるRNP複合体の各々は、Cas9ニッカーゼを含み、かつ構造的に異なるガイドRNAは、標的領域の反対の鎖にハイブリダイズする。いくつかの態様において、導入はエレクトロポレーションを含む。
いくつかの態様において、第1および第2の核酸は約1×105～約2×106個のT細胞に導入される。いくつかの態様において、1つまたは複数の標的指向型ヌクレアーゼならびに第1および第2の核酸は、約1×105～約2×106個のT細胞に導入される。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なる第1のDNA鋳型が細胞に導入される。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なる第1のDNA鋳型は、抗原特異的T細胞受容体のTCR-α鎖の異なる可変領域を含む。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なる第2のDNA鋳型が細胞に導入される。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なる第2のDNA鋳型は、抗原特異的T細胞受容体のTCR-β鎖の異なる可変領域を含む。
いくつかの態様において、T細胞は、調節性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である。いくつかの態様において、T細胞はエフェクターT細胞であり、エフェクターT細胞はCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はエフェクターT細胞であり、エフェクターT細胞はCD4+ T細胞である。いくつかの態様において、エフェクターT細胞はCD4+CD8+ T細胞である。
いくつかの態様において、本方法は、抗原特異的T細胞受容体を形成させるために異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖の発現を可能にする条件下でT細胞を培養する段階をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、抗原特異的T細胞受容体を形成させるために異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖の発現を可能にする条件下でT細胞を培養する段階をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、改変細胞の集団を増大するのに有効な条件下で改変T細胞を培養する段階をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、抗原特異的T細胞受容体を発現するT細胞を精製する段階をさらに含む。
他の態様において、本開示は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種T細胞受容体(TCR)-β鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-α鎖の可変領域; および(v) 内因性TCRアルファサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列であって、TRAC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、核酸配列を含む改変T細胞を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、(a) N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断配列; (ii) 異種TCR-α鎖の可変領域、および(iii) 内因性TCR-α鎖のN末端の部分をコードし、TRAC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、第1の核酸配列; ならびに(b) N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断配列; (ii) 異種TCR-β鎖の可変領域、および(iii) 内因性TCR-β鎖のN末端の部分をコードし、TRBC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、第2の核酸配列をさらに含む改変T細胞を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、(a) 対象からT細胞を得る段階; (b)腫瘍特異的抗原を認識する異種の抗原特異的T細胞受容体を発現するようにT細胞を改変する段階; および(c) 改変されたT細胞を対象に投与する段階をさらに含む、ヒト対象におけるがんを治療する方法を提供する。
T細胞を改変して異種TCR-α鎖および異種TCR-β鎖を発現させるための本明細書において記述される方法および組成物を用いて、ヒトガンマデルタ(γδ) T細胞を編集することもできる。例えば、いくつかの態様において、本方法は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-β鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-α鎖の可変領域; および(v) 内因性TCR-αのN末端の部分をコードする核酸配列を、ヒトT細胞におけるT細胞受容体ガンマサブユニット定常(TRGC)遺伝子のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含む。
他の態様において、本方法は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-β鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 完全長異種TCR-α鎖; および(v)停止コドンをコードする核酸配列を、核酸が挿入された場合に、異種TCR-βおよびTCR-α配列をコードする核酸が内因性TCR-γプロモーターの制御下にあるように、ヒトT細胞におけるT細胞受容体ガンマサブユニット定常(TRGC)遺伝子のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含む。
他の態様において、本方法は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-δ鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-γ鎖の可変領域; および(v) 内因性TCR-γサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列を、ヒトT細胞におけるT細胞受容体ガンマサブユニット定常(TRGC)遺伝子のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含む。N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-γ鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-δ鎖の可変領域; および(v) 内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列を、ヒトT細胞におけるTRAC遺伝子のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含む、ヒトT細胞のゲノムを編集する方法も提供される。他の態様において、本方法は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-γ鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 完全長異種TCR-δ鎖; および(v)停止コドンをコードする核酸配列を、核酸が挿入された場合に、異種TCR-γおよびTCR-δ配列が内因性TCR-αプロモーターの制御下にあるように、ヒトT細胞におけるT細胞受容体ガンマサブユニット定常(TRAC)遺伝子のエクソン1中の標的領域に挿入する段階を含む。
[本発明1001]
ヒトT細胞におけるT細胞受容体(TCR)サブユニット定常遺伝子のエクソン1中の標的領域に核酸配列を挿入する段階を含む、ヒトT細胞のゲノムを編集する方法であって、
核酸配列が、N末端からC末端に向かって、
(i) 第1の自己切断ペプチド配列、
(ii) TCRサブユニットの可変領域および定常領域を含む、第1の異種TCRサブユニット鎖、
(iii) 第2の自己切断ペプチド配列、
(iv) 第2の異種TCRサブユニット鎖の可変領域、ならびに
(v) 内因性TCRサブユニットのN末端の部分
をコードし、
内因性TCRサブユニットがTCR-アルファ(TCR-α)サブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-ベータ(TCR-β)サブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、内因性TCRサブユニットがTCR-βサブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-βサブユニット鎖である、
方法。
[本発明1002]
N末端からC末端に向かって、
(i) 第1の自己切断ペプチド配列、
(ii) 異種TCR-β鎖、
(iii) 第2の自己切断ペプチド配列、
(iv) 異種TCR-α鎖の可変領域、および
(v) 内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分
をコードする核酸配列が、ヒトT細胞におけるTCR-アルファサブユニット定常遺伝子(TRAC)のエクソン1に挿入される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
N末端からC末端に向かって、
(i) 第1の自己切断ペプチド配列、
(ii) 異種TCR-α鎖、
(iii) 第2の自己切断ペプチド配列、
(iv) 異種TCR-β鎖の可変領域、および
(v) 内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分
をコードする核酸配列が、ヒトT細胞におけるTCR-ベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)のエクソン1に挿入される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
核酸配列が二本鎖または一本鎖核酸配列であり、かつ核酸配列がT細胞に核酸配列を導入することによって挿入される、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
核酸が、核酸を含むウイルスベクターをT細胞に導入することによって挿入される、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
核酸が、
(a) TRAC遺伝子のエクソン1中の標的領域を切断してT細胞のゲノム中に挿入部位を作り出す標的指向型ヌクレアーゼ、および
(b) 相同組み換え修復(HDR)によって該挿入部位に挿入される核酸配列
をT細胞に導入することによってT細胞に挿入される、本発明1001、1002、1004または1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
核酸が、
(a) TRBC遺伝子のエクソン1中の標的領域を切断してT細胞のゲノム中に挿入部位を作り出す標的指向型ヌクレアーゼ、および
(b) 相同組み換え修復(HDR)によって該挿入部位に挿入される核酸配列
をT細胞に導入することによってT細胞に挿入される、本発明1001、1003、1004または1005のいずれかの方法。
[本発明1008]
核酸配列の5'末端および3'末端が、標的領域に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
核酸配列の5'末端および3'末端が、挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
標的指向型ヌクレアーゼが、挿入部位に二本鎖切断を導入する、本発明1006～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
核酸配列が、一本鎖DNA鋳型である、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
核酸配列が、線状DNA鋳型である、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
第1の自己切断ペプチドおよび第2の自己切断ペプチドが、同じまたは異なるウイルス2Aペプチドである、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
標的指向型ヌクレアーゼが、RNAガイドヌクレアーゼドメイン、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびmegaTALからなる群より選択される、本発明1006～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
RNAガイドヌクレアーゼが、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、前記方法が、TRACのエクソン1中の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
RNAガイドヌクレアーゼが、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、前記方法が、TRBCのエクソン1中の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1017]
Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、ガイドRNA、および核酸が、
(i) Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、およびガイドRNAを含む、リボ核タンパク質複合体(RNP)、ならびに
(ii) DNA鋳型
を含むリボ核タンパク質複合体(RNP)-DNA鋳型複合体として細胞に導入される、本発明1015または1016の方法。
[本発明1018]
複合体中のRNPとDNA鋳型とのモル比が、約3:1～約100:1である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
RNP-DNA鋳型複合体が、約20℃～25℃の温度で、約10分間～約30分間、RNPをDNA鋳型とともにインキュベートすることによって形成される、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
RNP-DNA鋳型複合体および細胞が、RNP-DNA鋳型複合体を細胞に導入する前に混合される、本発明1017～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
RNP-DNA鋳型複合体が、少なくとも2つの構造的に異なるRNP複合体を含む、本発明1017～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
少なくとも2つの構造的に異なるRNP複合体が、構造的に異なるガイドRNAを含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
構造的に異なるRNP複合体の各々が、Cas9ニッカーゼを含み、かつ構造的に異なるガイドRNAが、標的領域の対向する鎖にハイブリダイズする、本発明1022の方法。
[本発明1024]
導入がエレクトロポレーションを含む、本発明1004～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
核酸またはRNP:DNA鋳型複合体が、約1×10 5 ～約2×10 6 個のT細胞の集団に導入される、本発明1004～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
少なくとも2つの構造的に異なるDNA鋳型が細胞に導入される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
少なくとも2つの構造的に異なるDNA鋳型の各々が、抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-β鎖の可変領域および抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-α鎖の可変領域の固有の組み合わせをコードする、本発明1026の方法。
[本発明1028]
T細胞が、調節性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
T細胞がエフェクターT細胞であり、かつエフェクターT細胞がCD8 + T細胞またはCD4+細胞である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
エフェクターT細胞がCD4 + CD8 + T細胞である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
抗原特異的T細胞受容体を形成させるために異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖の発現を可能にする条件下でT細胞を培養する段階をさらに含む、本発明1001～1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
改変細胞の集団を増大するのに有効な条件下で改変T細胞を培養する段階をさらに含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
抗原特異的T細胞受容体を発現するT細胞を精製する段階をさらに含む、本発明1031または1032の方法。
[本発明1034]
本発明1001～1033の方法のいずれか1つによって産生された改変T細胞。
[本発明1035]
核酸配列を含む改変T細胞であって、
核酸配列が、N末端からC末端に向かって、
(i) 第1の自己切断ペプチド配列、
(ii) 第1の異種TCRサブユニット鎖、
(iii) 第2の自己切断ペプチド配列、
(iv) 第2の異種TCRサブユニット鎖の可変領域、および
(v) 内因性TCRサブユニットのN末端の部分
をコードし、
内因性TCRサブユニットがTCR-アルファ(TCR-α)サブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-ベータ(TCR-β)サブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、内因性TCRサブユニットがTCR-βサブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-βサブユニット鎖である、
改変T細胞。
[本発明1036]
核酸配列が、N末端からC末端に向かって、
(i) 第1の自己切断ペプチド配列、
(ii) 異種T細胞受容体(TCR)-β鎖、
(iii) 第2の自己切断ペプチド配列、
(iv) 異種TCR-α鎖の可変領域、および
(v) 内因性TCRアルファサブユニットのN末端の部分
をコードし、
核酸配列が、TRAC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、
本発明1035の改変T細胞。
[本発明1037]
核酸配列が、N末端からC末端に向かって、
(i) 第1の自己切断ペプチド配列、
(ii) 異種T細胞受容体(TCR)-α鎖、
(iii) 第2の自己切断ペプチド配列、
(iv) 内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分
をコードし、
核酸配列が、TRBC1またはTRBC2遺伝子のエクソン1に組み込まれている、
本発明1035の改変T細胞。
[本発明1038]
N末端からC末端に向かって
(i) 第1の自己切断ペプチド配列、
(ii) 異種T細胞受容体(TCR)-α鎖の可変領域、
(iii) 第2の自己切断ペプチド配列、
(iv) 異種TCR-β鎖の可変領域、および
(v) 内因性TCRベータサブユニットのN末端の部分
をコードする核酸配列であって、TRBC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、核酸配列
を含む改変T細胞。
[本発明1039]
以下の段階を含む、T細胞のゲノムを編集する方法：
(a) N末端からC末端に向かって、
(i) 自己切断ペプチド配列、
(ii) 抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-α鎖、および
(iii) 内因性TCRアルファサブユニットのエクソン1のN末端の部分
をコードする第1の核酸配列を、ヒトT細胞におけるTCRアルファサブユニット定常遺伝子(TRAC)のエクソン1中の標的領域に挿入する段階；ならびに
(b) N末端からC末端に向かって、
(i) 第2の自己切断ペプチド配列、
(ii) 抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-β鎖、および
(iii) 内因性TCRベータサブユニットのエクソン1のN末端の部分
をコードする核酸配列を、ヒトT細胞におけるTCRベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)のエクソン1中の標的領域に挿入する段階。
[本発明1040]
第1および/または第2の核酸配列が、二本鎖または一本鎖核酸であり、第1および/または第2の核酸が、第1および/または第2の核酸をT細胞に導入することによって挿入される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
第1および/または第2の核酸配列が、第1および/または第2の核酸を含むウイルスベクターをT細胞に導入することによって挿入される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
第1および第2の核酸が、
(a) TRAC遺伝子のエクソン1中に第1の挿入部位およびTRBC遺伝子のエクソン1中に第2の挿入部位を作り出す1つまたは複数の標的指向型ヌクレアーゼ、
(b) 第1の核酸配列、ならびに
(c) 第2の核酸配列
をT細胞に導入することによってT細胞に挿入される、本発明1040または1041の方法。
[本発明1043]
第1の核酸配列の5'および3'末端が、TRACのエクソン1中の第1の標的領域に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、本発明1039～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
第2のDNA鋳型の5'および3'末端が、TRBCのエクソン1中の第2の標的領域に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
1つまたは複数の標的指向型ヌクレアーゼが、第1および第2の挿入部位に二本鎖切断を導入する、本発明1042～1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
第1および/または第2の核酸配列が、一本鎖DNA鋳型である、本発明1039～1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
第1および/または第2の核酸が、線状DNA鋳型である、本発明1039～1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
第1の自己切断ペプチドおよび第2の自己切断ペプチドが、同じまたは異なるウイルス2Aペプチドである、本発明1039～1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
1つまたは複数の標的指向型ヌクレアーゼが、RNAガイドヌクレアーゼドメイン、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、またはmegaTALからなる群より選択される、本発明1042～1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
RNAガイドヌクレアーゼが、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、かつ前記方法が、TRACのエクソン1中の標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のガイドRNA、およびTRBCのエクソン1中の標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む、本発明1049の方法。
[本発明1051]
Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、第1のガイドRNA、および核酸配列が、
(i) Cas9ヌクレアーゼまたはCpf1ヌクレアーゼ、および第1のガイドRNAを含む、リボ核タンパク質複合体(RNP)、ならびに
(ii) 第1のDNA鋳型
を含むリボ核タンパク質複合体(RNP)-DNA鋳型複合体として細胞に導入される、本発明1050の方法。
[本発明1052]
Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、第2のガイドRNA、および第2の核酸配列が、
(i) Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、および第2のガイドRNAを含む、RNP、ならびに
(ii) 第2のDNA鋳型
を含むRNP-DNA鋳型複合体として細胞に導入される、本発明1050の方法。
[本発明1053]
複合体中のRNPとDNA鋳型とのモル比が、約3:1～約100:1である、本発明1051または1052の方法。
[本発明1054]
RNP-DNA鋳型複合体が、約20℃～約25℃の温度で、約10分間～約30分間、RNPをDNA鋳型とともにインキュベートすることによって形成される、本発明1051～1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
RNP-DNA鋳型複合体が、少なくとも2つの構造的に異なるRNP複合体を含む、本発明1051～1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
構造的に異なるRNP複合体の各々が、Cas9ニッカーゼを含み、かつ構造的に異なるガイドRNAが、標的領域の対向する鎖にハイブリダイズする、本発明1055の方法。
[本発明1057]
導入がエレクトロポレーションを含む、本発明1039～1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
核酸配列またはRNP:DNA鋳型複合体が、約1×10 5 ～約2×10 6 個のT細胞に導入される、本発明1039～1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
少なくとも2つの構造的に異なる第1のDNA鋳型が細胞に導入される、本発明1058の方法。
[本発明1060]
少なくとも2つの構造的に異なる第1のDNA鋳型が、抗原特異的T細胞受容体のTCR-α鎖の異なる可変領域を含む、本発明1059の方法。
[本発明1061]
少なくとも2つの構造的に異なる第2のDNA鋳型が細胞に導入される、本発明1060の方法。
[本発明1062]
少なくとも2つの構造的に異なる第2のDNA鋳型が、抗原特異的T細胞受容体のTCR-β鎖の異なる可変領域を含む、本発明1061の方法。
[本発明1063]
T細胞が、調節性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である、本発明1039～1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
T細胞がエフェクターT細胞であり、かつエフェクターT細胞がCD8 + T細胞またはCD4+細胞である、本発明1063の方法。
[本発明1065]
エフェクターT細胞がCD4 + CD8 + T細胞である、本発明1064の方法。
[本発明1066]
抗原特異的T細胞受容体を形成させるために異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖の発現を可能にする条件下でT細胞を培養する段階をさらに含む、本発明1039～1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
抗原特異的T細胞受容体を形成させるために異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖の発現を可能にする条件下でT細胞を培養する段階をさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
改変細胞の集団を増大するのに有効な条件下で改変T細胞を培養する段階をさらに含む、本発明1067の方法。
[本発明1069]
抗原特異的T細胞受容体を発現するT細胞を精製する段階をさらに含む、本発明1067または1068の方法。
[本発明1070]
本発明1039～1069の方法のいずれか1つによって産生された改変T細胞。
[本発明1071]
(a) N末端からC末端に向かって、
(i) 第1の自己切断配列、
(ii) 異種TCR-α鎖の可変領域、および
(iii) 内因性TCR-α鎖のN末端の部分
をコードし、TRAC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、第1の核酸配列、ならびに
(b) N末端からC末端に向かって、
(i) 第1の自己切断配列、
(ii) 異種TCR-β鎖の可変領域、および
(iii) 内因性TCR-β鎖のN末端の部分
をコードし、TRBC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、第2の核酸配列
を含む改変T細胞。
[本発明1072]
(a) 対象における腫瘍特異的抗原を認識する抗原特異的T細胞受容体を発現するように、本発明1001～1033または1039～1069のいずれかの方法を用いて対象のT細胞を改変する段階
を含む、ヒト対象におけるがんを治療する方法。
[本発明1073]
対象のT細胞がインビボで改変される、本発明1072の方法。
[本発明1074]
(a) 対象からT細胞を得る段階、
(b) 対象における腫瘍特異的抗原を認識する抗原特異的T細胞受容体を発現するように、本発明1001～1033または1039～1069のいずれかの方法を用いてT細胞を改変する段階、および
(c) 改変されたT細胞を対象に投与する段階
を含む、本発明1072の方法。
本出願は以下の図を含む。図は、組成物および方法のある種の態様および/または特徴を例示すること、ならびに組成物および方法の任意の記述を補足することを意図している。記述がそうであることを明示的に示さない限り、図は組成物および方法の範囲を限定しない。
N末端からC末端に向かって、(i) T2A自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-β鎖(NYESO-β)の完全長(すなわち、可変領域および定常領域); (iii) P2A自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-α鎖(NYESO-α)の可変領域; および(v) 内因性TCRアルファサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列を含む単一の非ウイルスDNA鋳型の、相同組み換え修復によるT細胞への挿入を描く略図である。相同組み換え修復によるTRAC遺伝子のエクソン1におけるDNA鋳型の挿入後、DNA鋳型を転写および翻訳して、NY-ESO-1黒色腫新生抗原を認識する抗原特異的TCRを形成する完全長NYESO-β鎖および完全長NYESO-α鎖を産生した。 TCR-β遺伝子座(TRBC1またはTRBC2)での単一の非ウイルスDNA鋳型の挿入を描く略図である。鋳型は、相同組み換え修復によりT細胞中に、N末端からC末端に向かって、(i) T2A自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-α鎖(NYESO-α)の完全長(すなわち、可変領域および定常領域); (iii) P2A自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-β鎖(NYESO-β)の可変領域; および(v) 内因性TCRベータサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列を含む。 (a) N末端からC末端に向かって、(i) P2A自己切断ペプチド配列; (ii) 抗原特異的T細胞受容体のTCR-α鎖(NYESO-α)の可変領域; および(iii) 内因性TCR-αサブユニットのエクソン1のN末端の部分をコードする核酸配列を含む非ウイルスDNA鋳型; ならびに(b) N末端からC末端に向かって、(i) T2A自己切断ペプチド配列; (ii) 抗原特異的T細胞受容体のTCR-β鎖の可変領域; および(iii) 内因性TCR-βサブユニットのエクソン1のN末端の部分をコードする核酸配列を含むDNA鋳型を挿入することによる内因性T細胞αおよびT細胞β受容体鎖の両方の同時置換を描く略図である。 T細胞受容体のポリクローナルライブラリーを形成するためのT細胞における異種(TCR)-β鎖およびTCR-α鎖の挿入を描く略図である。N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 完全長(例えば可変領域および定常領域)異種T細胞受容体(TCR)-β鎖; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-α鎖の可変領域; ならびに(v) 内因性TCRアルファサブユニットのN末端の部分をコードする核酸配列を含む、複数の異なるDNA鋳型、例えば、非ウイルスDNA鋳型を同時にエレクトロポレーションして、所望のTCR配列の合成T細胞レパートリーを有するT細胞の集団を産生した。 既知のTCR配列由来のT細胞レパートリー、または関心対象の内因性T細胞集団における天然レパートリー由来の、例えば、対象由来のT細胞レパートリーのデザインを示す略図である。例えば、TCRは、腫瘍浸潤リンパ球により発現されるTCR、自己免疫疾患部位の自己反応性T細胞により発現されるTCR、または病原体応答性T細胞由来のTCRとすることができるが、これらに限定されることはない。 異種NYESO TCRをエレクトロポレーションしたCD4+およびCD8+ T細胞のFACS分析を示す。本明細書において記述されるように、2名の健常ヒト血液ドナーからのCD4+およびCD8+ T細胞に、異種NYESO-αおよび異種NYESO-βを含む非ウイルスコンストラクトをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの4日後、組み込まれたNYESO特異的TCRによって認識されるペプチドを含む、蛍光標識されたMHC-デキストラマーで細胞を染色した。 異種NYESO TCRをエレクトロポレーションしたCD8+ T細胞のFACS分析を示す。本明細書において記述されるように、健常ヒト血液ドナーからのCD8+ T細胞に、異種NYESO-αおよび異種NYESO-βを含む非ウイルスDNAコンストラクトをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの4日後、組み込まれたNYESO特異的TCRによって認識されるペプチドを含む、蛍光標識されたMHC-デキストラマーで細胞を染色した。 異種NYESO TCRをエレクトロポレーションしたCD8+細胞のFACS分析である。NYESO MHC-デキストラマーによる抗原特異的染色に対するTCR発現についての(全ての潜在的なヒトTCRに結合する抗体による)染色を付け加えて、細胞を図3および4における場合と同じように処理した。内因性TCRの相同組み換え置換がなかった、大部分のT細胞では、内因性TCRをTRACエクソン1 gRNAによる切断および非相同末端結合による小さな挿入欠失変異(挿入欠失(indel))の導入によりノックアウトした。予想通り、ほとんど全てのNYESO陽性細胞はTCR発現も陽性であった。 異種NYESO TCRを含む初代ヒトT細胞がインビトロでの細胞死滅アッセイ法においてがん細胞を死滅させることを示す。 異種NYESO TCR死滅を含むヒトT細胞を用いたインビトロでの細胞死滅アッセイ法の1つの時点からの結果を示す。 図7a～fは、非ウイルスTCR置換によるT細胞のインビボ機能性を示す。(a) インビボヒト抗原特異的腫瘍異種移植片モデルの略図。(b) 5×106個のバルク非ウイルス標的指向型T細胞(約10% TCR+ NYESO-1+、約10% TCR+ NYESO-1-、および約80% TCR- NYESO-1-)の移入から2日後、NY-ESO-1+非ウイルス編集T細胞は脾臓と比べて腫瘍に選択的に蓄積していた。4名のヒトT細胞ドナーごとにn=5のマウス。(c) 5×106個のバルク非ウイルス標的指向型CFSE標識T細胞の移入から10日後、NYESO-1 TCR+細胞はTCR-またはTCR+ NYESO-1-T細胞よりも高い増殖を示し、脾臓中よりも腫瘍中で高い増殖(CFSE低)を示した。移入後10日の時点で、TCR-およびTCR+NYESO- T細胞を腫瘍内で見つけることは困難であった。(d) 図8fに要約されたデータの個々の縦方向の腫瘍体積の軌跡。(e,f) これらの実験では、T細胞移入の17日後(d)、非ウイルス性TCR置換細胞は、より高いNY-ESO-1 TCR発現およびより低い疲弊マーカー発現を示すように見えた。レンチウイルス形質導入細胞と非ウイルスTCR置換細胞の両方の移入により、24日目に腫瘍負荷の有意な低減が示された。この実験モデルでは、非ウイルスTCR置換により、レンチウイルス形質導入と比較してさらなる低減が示された(図8f)。 TCR置換によるCD8+ T細胞における抗原特異的なサイトカイン産生および脱顆粒を示す。 TCR置換でのCD8+ T細胞による抗原特異的標的細胞死滅を示す。 腫瘍マウス異種移植片モデルの略図である。 養子細胞療法のための内因性TCRの非ウイルス置換の拡張可能性を示す。 腫瘍に対するNY-ESO-1 TCR+ T細胞の選択的なインビボ局在化を示す。 NY-ESO-1 TCR+非ウイルスもしくはレンチウイルス改変または媒体のみ(生理食塩水)の養子移入後の腫瘍成長を示す。技術的な3つ組の平均および標準偏差(a,b)有りのn=2 (a,b)の独立した健常ドナー。平均および標準偏差(d～f)有りのマウス5匹(e)または7匹(f)でのn=6 (d)またはn=2 (e,f)の個々の健常ドナー。**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 (Holm-Sidakの多重比較検定による2元配置分散分析(Two Way ANOVA))。 図9aは、ゲートされたCD4+またはCD8+ T細胞におけるNY-ESO-1特異的TCRのレトロウイルス送達または非ウイルスTCR置換後のTCR誤対合分析を示す。非ウイルスTCR置換により、レトロウイルスによるTCR送達と比較してTCRの誤対合が少なくなる。新しいTCRのウイルス導入により、感染した細胞は少なくとも4つの異なるTCR (新しいTCR-α + 新しいTCR-β; 新しいTCR-α + 内因性TCR-β; 内因性TCR-αおよび新しいTCR-β; 内因性TCR-α + 内因性TCR-β)を発現するであろう。MHC-ペプチド多量体(NYESO)とともに新たに導入されたTCR (VB13.1)における特異的β鎖の染色は、導入されたTCR (VB13.1+ NYESO+; 新しいTCR-α + 新しいTCR-β)を主に発現した細胞 vs 潜在的な誤対合TCR (VB13.1+ NYESO-; 内因性TCR-α + 新しいTCR-β)の1つを主に発現した細胞を区別することによりTCR誤対合のおおよその推定を提供することができる。 図9b～9cは、新しいTCR全体をTRAC (図9b、TCR-βの多重ノックアウトでも可能)に、新しいTCR全体をTRBC1/2 (図9c)にターゲッティングすることによるTCR置換、またはTRACへの新しいTCR-αおよびTRBC1/2への新しいTCR-βでの多重置換を示す。 図9dは、機能的サイトカイン産生は、ゲートされたCD8+ T細胞(図8a)と同様に、ゲートされたCD4+ T細胞における抗原曝露後に選択的に観察されたことを示す。 図9eは、非ウイルスTCR置換は、6名の健常血液ドナーのコホート全体でCD8+およびCD4+ T細胞の両方においてエレクトロポレーション後4日の時点で一貫して観察されたことを示す。図9fは、6名のさらなる健常血液ドナーの第2のコホートにおいて、各ドナーからの1億個のT細胞にNY-ESO-1 TCR置換HDR鋳型およびオンターゲットのgRNA/Cas9をエレクトロポレーションしたことを示す(図8d)。NY-ESO-1 TCR+であるCD4+およびCD8+ T細胞の割合は、エレクトロポレーション後の増大10日間にわたり一貫していた。図9gは、非ウイルスゲノムターゲッティング後の増大10日間にわたり、CD8+ T細胞はCD4+ T細胞よりもわずかに優位な増殖を示したことを示す。 図9hは、1:5のT細胞とがん細胞の比率での、表示された黒色腫細胞株と表示された選別T細胞集団との共インキュベーションの結果を示す。共インキュベーション後72時間の時点で、がん細胞密集度の比率は(核RFPががん細胞をマークする)自動顕微鏡検査で記録された。NY-ESO-1抗原特異的TCRを発現するT細胞は、レトロウイルス形質導入または非ウイルスノックイン内因性TCR置換のどちらによっても、NY-ESO-1とHLA-A*0201クラスI MHC対立遺伝子の両方を発現する標的がん細胞株でのみ堅牢な標的細胞死滅を示した。 図9iは、NY-ESO-1+ HLA-A*0201+ A375がん細胞株の標的細胞死滅のためにオン/オフターゲットgRNAおよびオン/オフターゲットHDR鋳型のマトリックスを用いた結果を示す(オフターゲットgRNAおよびHDRTはRAB11A-GFP融合タンパク質ノックインに特異的であった)。オンターゲットgRNAおよびオンターゲットHDR鋳型の両方を有する細胞のみが、標的細胞死滅を実証した。 図9jは、バルクT細胞編集集団からの選別NY-ESO-1+ TCR+細胞(オンターゲットgRNA、オンターゲットHDR鋳型)が、標的がん細胞の死滅に対して強力な用量応答効果を示したことを示す。2:1およびそれ以上のT細胞とがん細胞の比率では、48時間以内に、標的がん細胞のほぼ完全な死滅が示された。1:16未満のT細胞とがん細胞の比率では、144時間までに、堅牢な標的細胞死滅の証拠が示された。 図9kは、非ウイルスTCR置換T細胞による標的細胞死滅が、非ウイルスTCR置換後にフローサイトメトリーで観察されたNY-ESO-1認識TCR+細胞集団に特に起因していたことを示す。バルク編集されたT細胞集団(全てオンターゲットgRNAおよびHDR鋳型でエレクトロポレーションされていた)から始めて、本発明者らは、3つの細胞集団: NY-ESO-1+TCR+ 細胞(非ウイルス置換TCR)、NY-ESO-1-TCR- 細胞(TCRノックアウト) (灰色)、およびNY-ESO-1-TCR+ 細胞(その天然TCRを保持していたが、NY-ESO特異的ノックインTCRを持たなかった細胞)を個別に選別した。選別されたNY-ESO-1+ TCR+集団のみが標的細胞死滅を実証した(4:1のT細胞とがん細胞の比率)。技術的な3つ組の平均および標準偏差(d)有りのn=2 (a,d)またはn=3 (b,c)の独立した健常ドナーからの1名の代表的なドナー。n=6の独立した健常ドナー(e,f)のまたはn=2の独立した健常ドナー(i～k)の4つの技術的複製の平均および標準偏差が示されている。n=2の独立した健常ドナーの平均および個々の値(h)。
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。
「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)およびそれらの重合体をいう。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に指示されない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたその変種(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルソログ、SNPおよび相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成されうる(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成またはコード化に関与するDNAのセグメントをいうことができる。これは、コード領域(リーダーおよびトレーラー)の前後の領域、ならびに個々のコードセグメント(エクソン)間の介在配列(イントロン)を含みうる。あるいは、「遺伝子」という用語は、rRNA、tRNA、ガイドRNA (例えば、単一ガイドRNA)、またはマイクロRNAのような、非翻訳RNAの生成またはコード化に関与するDNAのセグメントをいうことができる。
「治療すること」は、減退; 寛解; 症状の軽減もしくは患者にとって疾患状態を許容しやすくさせること; 変性もしくは衰退の速度の緩徐化; または変性の最終ポイントの衰弱を少なくさせることのような、任意の客観的または主観的パラメータを含む、疾患、状態、または障害の治療または改善または予防における成功のいずれかの兆候をいう。
「プロモーター」は、核酸の転写を指令する核酸制御配列の1つまたは複数と定義される。本明細書において用いられる場合、プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATA要素のような、転写の開始部位の近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を任意で含んでもよい。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合に「機能的に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合にコード配列に機能的に連結されている; またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合にコード配列に機能的に連結されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書において互換的に用いられて、アミノ酸残基の重合体をいう。本明細書において用いられる場合、これらの用語は、全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結されている。
本明細書において用いられる場合、「相補的」または「相補性」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間の特定の塩基対合をいう。いくつかの態様において、例えば、限定するものではないが、TRAC遺伝子のエクソン1中の標的領域とガイドRNAとの間の塩基対合が記述されている。相補的ヌクレオチドは、一般的に、AおよびT (またはAおよびU)、ならびにGおよびCである。本明細書において記述されるガイドRNAは、T細胞におけるTRAC遺伝子のエクソン1中のゲノム配列と完全に相補的または実質的に相補的である(例えば、1～4個のミスマッチを有する)配列、例えば、DNAターゲッティング配列を含むことができる。
全体を通して用いられる場合、対象とは個体を意味する。例えば、対象は哺乳類、例えば霊長類、より具体的には、ヒトである。この用語は特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、成人および新生児の対象は、男性であれ女性であれ、網羅されることが意図される。本明細書において用いられる場合、患者または対象は、互換的に用いられることがあり、疾患または障害に罹患している対象をいうことができる。
「CRISPR/Cas」システムとは、外来核酸に対する防御のための広範なクラスの細菌システムをいう。CRISPR/Casシステムは、幅広い真正細菌および古細菌生物に見出される。CRISPR/Casシステムは、I型、II型、およびIII型のサブタイプを含む。野生型II型CRISPR/Casシステムは、ガイドおよび活性化RNAと複合したRNA媒介性ヌクレアーゼ、例えばCas9を利用して、外来核酸を認識および切断する。ガイドRNAおよび活性化RNAの両方の活性を有するガイドRNAも、当技術分野において公知である。場合によっては、そのような二重活性ガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA)といわれる。
Cas9相同体は、以下の分類群の細菌を含むが、これらに限定されない、多種多様な真正細菌に見出される: アクチノバクテリア(Actinobacteria)、アクウィフェクス門(Aquificae)、バクテリオデテス・クロロビ(Bacteroidetes-Chlorobi)、クラミジア・ヴェルコミクロビア(Chlamydiae-Verrucomicrobia)、クロロフレキシ(Chlroflexi)、シアノバクテリア(Cyanobacteria)、フィルミキューテス(Firmicutes)、プロテオバクテリア(Proteobacteria)、スピロケテス(Spirochaetes)、およびテルモトガ門(Thermotogae)。例示的なCas9タンパク質は化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9タンパク質である。さらなるCas9タンパク質およびその相同体は、例えば、Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737 ; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7; およびJinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21に記述されている。本明細書において提供されるいずれかのCas9ヌクレアーゼの変種は、宿主細胞における効率的な活性または増強された安定性のために最適化することができる。したがって、操作されたCas9ヌクレアーゼも企図される。
本明細書において用いられる場合、「Cas9」という用語は、RNA媒介性ヌクレアーゼ(例えば、細菌もしくは古細菌起源の、またはそれらに由来する)をいう。例示的なRNA媒介性ヌクレアーゼは、前記のCas9タンパク質およびその相同体を含む。他のRNA媒介性ヌクレアーゼはCpf1(例えば、Zetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p759-771, 22 October 2015を参照のこと)およびその相同体を含む。同様に、本明細書において用いられる場合、「Cas9リボ核タンパク質」複合体などの用語は、Cas9タンパク質とcrRNA(例えば、ガイドRNAもしくは単一ガイドRNA)、Cas9タンパク質とトランス活性化crRNA (tracrRNA)、Cas9タンパク質とガイドRNAとの間の複合体、またはそれらの組み合わせ(例えば、Cas9タンパク質、tracrRNA、およびcrRNAガイドRNAを含む複合体)をいう。本明細書において記述される態様のいずれにおいても、Cas9ヌクレアーゼはCpf1ヌクレアーゼで置換できることが理解される。
本明細書において用いられる場合、細胞のゲノムの編集という文脈での「編集する」という語句は、標的ゲノム領域でゲノムの配列に構造変化を誘導することをいう。例えば、編集は、ヌクレオチド配列を細胞のゲノムに挿入するという形をとることができる。ヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはその断片をコードすることができる。そのような編集は、例えば、二本鎖切断を標的ゲノム領域内に誘導することにより、または一対の一本鎖ニックを対向する鎖上に誘導し、標的ゲノム領域に隣接させることにより実施することができる。標的ゲノム領域の位置にまたは標的ゲノム領域内に一本鎖または二本鎖切断を誘導するための方法は、標的ゲノム領域に向けられた、Cas9ヌクレアーゼドメインまたはその誘導体、およびガイドRNAまたはガイドRNAの対の使用を含む。
本明細書において用いられる場合、核酸または核酸を含む複合体、例えばRNP-DNA鋳型複合体を導入するという文脈での「導入する」という語句は、細胞の外側から細胞の内側への核酸配列またはRNP-DNA鋳型複合体の移行をいう。場合によっては、導入することは、細胞の外側から細胞の核の内側への核酸または複合体の移行をいう。エレクトロポレーション、ナノワイヤまたはナノチューブとの接触、受容体媒介性の内部移行、細胞透過性ペプチドを介した移行、リポソーム媒介性の移行などを含むが、これらに限定されない、そのような移行のさまざまな方法が企図される。
本明細書において用いられる場合、「異種の」という語句は、ヒトT細胞において天然には見られない核酸配列またはポリペプチドをいう。「異種配列」という用語は、天然の所与のT細胞では通常見られない配列をいう。したがって、異種ヌクレオチドまたはタンパク質配列は、以下でありうる: (a) その宿主細胞にとって外来性である(すなわち、細胞にとって外因性である); (b) 宿主細胞において天然に見られる(すなわち、内因性である)が、細胞において不自然な量(すなわち、宿主細胞において天然に見られるよりも多いもしくは少ない量)で存在する; または(c) 宿主細胞において天然に見られるが、その天然の遺伝子座の外側に位置する。
本明細書において用いられる場合、初代細胞という文脈での「初代」という語句は、形質転換または不死化されていない細胞である。そのような初代細胞は限られた回数、培養、継代培養、または継代する(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回培養する)ことができる。場合によっては、初代細胞はインビトロでの培養条件に適合される。場合によっては、初代細胞は、生物、系、臓器、または組織から単離され、任意で選別され、培養または継代培養することなく直接利用されてもよい。場合によっては、初代細胞は、刺激、活性化、または分化される。例えば、初代T細胞は、CD3、CD28アゴニスト、IL-2、IFN-γ、またはそれらの組み合わせとの接触(例えば、その存在下で培養すること)により活性化することができる。
本明細書において用いられる場合、「T細胞」という語句は、T細胞受容体分子を発現するリンパ系細胞をいう。T細胞は、ヒトアルファベータ(αβ)T細胞およびヒトガンマデルタ(γδ)T細胞を含む。T細胞は、ナイーブT細胞、刺激T細胞、初代T細胞(例えば、無培養の)、培養T細胞、不死化T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、それらの組み合わせ、またはそれらの亜集団を含むが、これらに限定されることはない。T細胞は、CD4+、CD8+、またはCD4+およびCD8+とすることができる。T細胞はヘルパー細胞、例えばTH1、TH2、TH3、TH9、TH17またはTFH型のヘルパー細胞とすることができる。T細胞は細胞傷害性T細胞とすることができる。調節性T細胞はFOXP3+またはFOXP3-とすることができる。T細胞は、アルファ/ベータT細胞またはガンマ/デルタT細胞とすることができる。場合によっては、T細胞はCD4+CD25高CD127低調節性T細胞である。場合によっては、T細胞は、1型調節性(Tr1)、TH3、CD8+CD28-、Treg17、およびQa-1拘束性T細胞、またはそれらの組み合わせもしくは亜集団からなる群より選択される調節性T細胞である。場合によっては、T細胞はFOXP3+ T細胞である。場合によっては、T細胞はCD4+CD25低CD127高エフェクターT細胞である。場合によっては、T細胞はCD4+CD25低CD127高CD45RA高CD45RO-ナイーブT細胞である。T細胞は、遺伝子操作された組み換えT細胞とすることができる。場合によっては、組み換えT細胞は組み換え(例えば、異種) T細胞受容体を有する。
本明細書において用いられる場合、「TCR受容体」という用語は、抗原に応答してT細胞の活性化において機能する2つのTCRサブユニット鎖(例えば、TCR-αおよびTCR-β、TCRγおよびTCRδ)からなるヘテロ二量体である。T細胞において発現されると、TCR受容体の各TCRサブユニット鎖は、例えば、第1のTCRサブユニット鎖(例えば、TCR-α)および第2のTCRサブユニット鎖(例えば、TCR-β)鎖がヘテロ二量体TCR受容体を形成する場合に、TCRサブユニット鎖を細胞膜に固定する定常領域ならびに抗原認識および結合において機能する可変領域を含む。
本明細書において用いられる場合、「非相同末端結合」またはNHEJという用語は、相同な鋳型核酸を必要とせずに、DNA鎖の切断またはニックの入った末端が直接ライゲーションされる細胞プロセスをいう。NHEJは、修復部位での1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせをもたらすことができる。
本明細書において用いられる場合、「相同組み換え修復」またはHDRという用語は、DNA鎖の切断またはニックの入った末端が、相同な鋳型核酸からの重合によって修復される細胞プロセスをいう。したがって、元の配列が鋳型の配列に置き換えられる。相同な鋳型核酸は、ゲノムの他の場所にある相同配列(姉妹染色分体、相同染色体、または同じもしくは異なる染色体上の反復領域)によって提供されることができる。あるいは、外因性鋳型核酸を導入して、標的部位での配列の特異的HDR誘導性変化を得ることができる。このようにして、特異的変異を切断部位に導入することができる。
本明細書において用いられる場合、一本鎖DNA鋳型または二本鎖DNA鋳型は、例えばHDRにより、T細胞のゲノムを編集するための鋳型として細胞により用いられうるDNAオリゴヌクレオチドをいう。一般に、一本鎖DNA鋳型または二本鎖DNA鋳型は、標的部位に対して少なくとも1つの相同領域を有する。場合によっては、一本鎖DNA鋳型または二本鎖DNA鋳型は、標的の切断部位または挿入部位に挿入される異種配列を含む領域に隣接している2つの相同領域、例えば、5'末端および3'末端を有する。
発明の詳細な説明
以下の記述は、本組成物および方法のさまざまな局面および態様を列挙している。特定の態様は、組成物および方法の範囲を定義することを意図していない。むしろ、態様は、開示された組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれるさまざまな組成物および方法の非限定的な例を単に提供するだけである。記述は、当業者の観点から読まれるべきであり、それゆえ、当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。
ヒトT細胞のゲノムを編集するための組成物および方法が本明細書において提供される。本発明者らは、異種TCRが内因性TCRプロモーターの制御下にあるように、異種TCRをT細胞のゲノム中の標的領域に挿入しうることを発見した。本明細書において提供される方法および組成物は、所望の抗原特異性を有する改変されたT細胞を作り出すために用いることができる。これらの改変されたT細胞は、例えば、対象におけるがん、自己免疫疾患、または感染を治療するために用いることができる。
いくつかの態様において、異種TCR-β鎖の可変領域および異種TCR-α鎖の可変領域をコードする核酸配列が、T細胞のゲノムにおけるTRAC遺伝子のエクソン1に挿入される。いくつかの態様において、異種TCR-α鎖の可変領域および異種TCR-β鎖の可変領域をコードする核酸配列は、T細胞のゲノムにおける、TRBC遺伝子のエクソン1に、例えばTRBC1またはTRBC2のエクソン1に挿入される。いくつかの態様において、核酸配列は、相同組み換え修復を介してまたは本明細書においてそれ以外に記述されるように導入される。
いくつかの態様において、(a) T細胞受容体の異種TCR-α鎖の可変領域をコードする第1の核酸配列; (b) 抗原特異的T細胞受容体の異種TCR-β鎖の可変領域をコードする第2の核酸配列は、それぞれTRAC遺伝子のエクソン1およびTRBC遺伝子のエクソン1に挿入される。いくつかの態様において、核酸配列は、相同組み換え修復を介してまたは本明細書においてそれ以外に記述されるように導入される。
改変されたヒトT細胞を作り出す方法
T細胞のゲノムを編集するための方法は、ヒトT細胞におけるT細胞受容体(TCR)サブユニット定常遺伝子のエクソン1中の標的領域に核酸配列またはコンストラクトを挿入する段階を含む、ヒトT細胞のゲノムを編集する方法を含む。核酸コンストラクトは、N末端からC末端に向かって、TCRサブユニット鎖の可変領域および定常領域を含む、第1の異種TCRサブユニット鎖、ならびに第2の異種TCRサブユニット鎖の可変領域を連続的にコードする。コンストラクトはさらに、第1の異種TCRサブユニット鎖の可変領域に先行する第1の自己切断ペプチド、および第1の異種TCRサブユニット鎖と第2の異種TCRサブユニット鎖の間の第2の自己切断ペプチドをコードする。いくつかの方法において、内因性TCRサブユニットがTCR-アルファ(TCR-α)サブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-ベータ(TCR-β)サブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖である。いくつかの方法において、内因性TCRサブユニットがTCR-βサブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-βサブユニット鎖である。
いくつかの態様において、TCRサブユニット鎖の可変領域をコードする核酸コンストラクトまたは配列は、TCRサブユニット鎖をコードする核酸コンストラクトまたは配列、すなわち、TCRサブユニット鎖、例えば、完全長TCRサブユニット鎖の可変領域および定常領域をコードする核酸である。いくつかの例において、核酸は、完全長TCR-α、TCR-β、TCR-γ、またはTCR-δサブユニット鎖をコードする。いくつかの例において、核酸コンストラクトまたは配列は、第1の異種TCRサブユニット鎖(例えば、完全長TCRサブユニット鎖)および第2の異種TCRサブユニット鎖の可変領域をコードする。いくつかの例において、第1および第2の異種TCRサブユニット鎖は異なる。いくつかの例において、核酸コンストラクトは、N末端からC末端に向かって、異種の完全長TCR-βサブユニット鎖および異種TCR-αサブユニット鎖の可変領域をコードする。他の例において、核酸コンストラクトは、N末端からC末端に向かって、異種の完全長TCR-αサブユニット鎖および異種TCR-βサブユニット鎖の可変領域をコードする。
T細胞のゲノムを編集するための方法は、ヒトT細胞におけるTCR-αサブユニット(TRAC)遺伝子のエクソン1中の標的領域に核酸配列またはコンストラクトを挿入する段階を含む、ヒトT細胞のゲノムを編集する方法を含む。いくつかの態様において、標的領域はTRAC遺伝子の定常ドメインのエクソン1にある。他の態様において、標的領域はTCR-α膜貫通ドメインをコードする配列の開始前の、エクソン1、エクソン2、またはエクソン3にある。核酸コンストラクトは、N末端からC末端に向かって、異種T細胞受容体(TCR)-β鎖の可変領域、その後に異種TCR-α鎖の可変領域を連続的にコードする。コンストラクトはさらに、異種TCR-β鎖の可変領域に先行する第1の自己切断ペプチド、および異種TCR-β鎖の可変領域と異種TCR-α鎖の可変領域の間の第2の自己切断ペプチドをコードする。コンストラクトはさらに、異種TCR-α鎖の可変領域の後の内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分をコードする。TRAC遺伝子中の挿入部位に応じて、内因性TCR-αサブユニットのN末端部分をコードする核酸のサイズは異なることができる。内因性TCR-αサブユニットのN末端部分をコードする核酸のサイズは、TRACエクソン1の開始部位と標的挿入部位の間の内因性TRAC核酸配列におけるヌクレオチド数に依存するであろう。例えば、TRACエクソン1の開始部位と挿入部位の間のヌクレオチド数が25ヌクレオチドであったことから、内因性TCR-αサブユニットのN末端をコードする25ヌクレオチドがコンストラクトに含まれた、図1aを参照されたい。同様に、TRACエクソン1の開始部位と挿入部位の間のヌクレオチド数が25ヌクレオチド未満または25ヌクレオチド超である場合、内因性TCR-αサブユニットのN末端部分をコードする25ヌクレオチド未満または25ヌクレオチド超の核酸がコンストラクト内にあってもよい。いくつかの例において、核酸コンストラクトは、N末端からC末端に向かって、第1の自己切断ペプチド配列、異種(すなわち、可変領域および定常領域)TCR-βサブユニット鎖(例えば、完全長TCR-βサブユニット鎖)、第2の自己切断ペプチド配列、異種TCR-αサブユニット鎖の可変領域、および内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分をコードする。例示的なコンストラクトは、図1aに記載されるものを含む。
T細胞のゲノムを編集するための方法は、ヒトT細胞におけるTCR-βサブユニット(TRBC)遺伝子のエクソン1中の標的領域に核酸配列またはコンストラクトを挿入する段階を含む、ヒトT細胞のゲノムを編集する方法も含む。いくつかの態様において、標的領域はTRBC1またはTRBC2遺伝子のエクソン1にある。核酸コンストラクトは、N末端からC末端に向かって、異種T細胞受容体(TCR)-α鎖の可変領域、その後に異種TCR-β鎖の可変領域を連続的にコードする。コンストラクトはさらに、異種TCR-α鎖の可変領域に先行する第1の自己切断ペプチド、および異種TCR-α鎖の可変領域と異種TCR-β鎖の可変領域の間の第2の自己切断ペプチドをコードする。コンストラクトはさらに、異種TCR-β鎖の可変領域の後の内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分をコードする。TRBC1またはTRBC2中の挿入部位に応じて、内因性TCR-βサブユニットのN末端部分をコードする核酸のサイズは異なることができる。内因性TCR-αサブユニットのN末端部分をコードする核酸のサイズは、TRBC1またはTRBC2 TRBCのエクソン1の開始部位と標的挿入部位の間の内因性TRBC核酸配列におけるヌクレオチド数に依存するであろう。例えば、TRBCエクソン1の開始部位と挿入部位の間のヌクレオチド数が25ヌクレオチドであったことから、内因性TCR-βサブユニットのN末端をコードする25ヌクレオチドがコンストラクトに含まれた、図1bを参照されたい。同様に、TRBC1またはTRBC2エクソン1の開始部位と挿入部位の間のヌクレオチド数が25ヌクレオチド未満または25ヌクレオチド超である場合、内因性TCR-βサブユニットのN末端部分をコードする25ヌクレオチド未満または25ヌクレオチド超の核酸がコンストラクト内にあってもよい。いくつかの例において、核酸コンストラクトは、N末端からC末端に向かって、第1の自己切断ペプチド配列、異種(すなわち、可変領域および定常領域)TCR-αサブユニット鎖(例えば、完全長TCR-αサブユニット鎖)、第2の自己切断ペプチド配列、異種TCR-βサブユニット鎖の可変領域、および内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分をコードする。例示的なコンストラクトは、図1bに記載されるものを含む。
自己切断ペプチドの例としては、自己切断ウイルス2Aペプチド、例えば、ブタテッショウウイルス-1(P2A)ペプチド、ゾーシーアシグナ(Thosea asigna)ウイルス(T2A)ペプチド、ウマ鼻炎Aウイルス(E2A)ペプチド、または口蹄疫ウイルス(F2A)ペプチドが挙げられるが、これらに限定されることはない。自己切断2Aペプチドは、単一のコンストラクトからの複数の遺伝子産物の発現を可能にする。(例えば、Chng et al. 「Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonal antibody expression in CHO cells」, MAbs 7(2): 403-412 (2015)を参照のこと)。いくつかの態様において、第1および第2の自己切断ペプチドは同じものである。他の態様において、第1および第2の自己切断ペプチドは異なるものである。
挿入された場合、第1の自己切断ペプチド、異種完全長TCR-β鎖、第2の自己切断ペプチド、TCR-α鎖の可変領域、および内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分を、その順序でコードするコンストラクトは、内因性TCR-αプロモーターおよびTCR-α調節要素の制御下にある。コンストラクトがT細胞のゲノム中に組み込まれ、内因性TCR-αプロモーターの制御下に置かれると、挿入されたコンストラクトから、融合ポリペプチドをコードする単一のmRNA配列の転写を可能にする条件の下でT細胞を培養することができる。融合ポリペプチドは、第1の自己切断ペプチド、異種完全長TCR-β鎖、第2の自己切断ペプチド、異種完全長TCR-α鎖、および内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分を、その順序で含む。
同様に、TRBC1またはTRBC2に挿入された場合、第1の自己切断ペプチド、異種完全長TCR-α鎖、第2の自己切断ペプチド、TCR-β鎖の可変領域、および内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分を、その順序でコードするコンストラクトは、内因性TCR-βプロモーターおよびTCR-β調節要素の制御下にある。コンストラクトがT細胞のゲノム中に組み込まれ、内因性TCR-βプロモーターの制御下に置かれると、挿入されたコンストラクトから、融合ポリペプチドをコードする単一のmRNA配列の転写を可能にする条件の下でT細胞を培養することができる。融合ポリペプチドは、第1の自己切断ペプチド、異種完全長TCR-α鎖、第2の自己切断ペプチド、異種完全長TCR-β鎖、および内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分を、その順序で含む。
TRAC遺伝子のエクソン1にコンストラクトを挿入することにより、TRAC遺伝子の残りのエクソン(エクソン2および3)がエクソン1と一緒にスプライシングされて、最終的なmRNA配列になる。このmRNA配列の翻訳は、3つの別々のポリペプチド配列、すなわち、膜貫通ドメインを欠く不活性な内因性可変領域ペプチド(これは、例えば、小胞体で分解され、または翻訳後に分泌されうる)、完全長異種抗原特異的TCR-β鎖、および完全長異種抗原特異的TCR-α鎖に自己切断される1つのタンパク質の発現を引き起こす(図1a参照)。完全長の抗原特異的TCR-β鎖および完全長の抗原特異的TCR-α鎖は、所望の抗原特異性を有するTCRを形成する。
同様に、TRBC1/2遺伝子のエクソン1にコンストラクトを挿入することにより、TRBC1/2遺伝子の残りのエクソン(エクソン2～4)がエクソン1と一緒にスプライシングされて、最終的なmRNA配列になる。このmRNA配列の翻訳は、3つの別々のポリペプチド配列、すなわち、膜貫通ドメインを欠く不活性な内因性可変領域ペプチド(これは、例えば、小胞体で分解され、または翻訳後に分泌されうる)、完全長異種抗原特異的TCR-β鎖、および完全長異種抗原特異的TCR-α鎖に自己切断される1つのタンパク質の発現を引き起こす。完全長の抗原特異的TCR-β鎖および完全長の抗原特異的TCR-α鎖は、所望の抗原特異性を有するTCRを形成する。
あるいは、異種TCR-α鎖コード配列、例えば、TCR-α鎖の可変領域をコードする配列、および異種TCR-β鎖コード配列、例えば、TCR-β鎖の可変領域をコードする配列はT細胞のゲノムに挿入され、ここで異種TCR-α鎖がTRAC遺伝子のエクソン1に挿入され、異種TCR-β鎖がTRBC遺伝子のエクソン1に挿入される。いくつかの態様において、異種TCR-α鎖をコードする第1の核酸配列またはコンストラクトおよび異種TCR-β鎖をコードする第2の核酸配列またはコンストラクトは、それぞれ、TRAC遺伝子のエクソン1に異種TCR-α鎖をおよびTRBC遺伝子のエクソン1に異種TCR-β鎖を挿入するために用いられる。
第1および第2の核酸コンストラクトを用いる方法では、異種TCR-α鎖をコードする核酸の挿入のための標的領域は、TRAC遺伝子のエクソン1にある。いくつかの態様において、異種TCR-β鎖をコードする核酸の挿入のための標的領域は、内因性TRBC1またはTRBC2プロモーターの下流にあり、TRBC1またはTRBC2遺伝子のエクソン1に位置する。第1の核酸は、N末端からC末端に向かって、第1の自己切断ペプチド、続いて異種TCR-α鎖、続いて内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分を連続的にコードする。第2の核酸コンストラクトは、N末端からC末端に向かって、第2の自己切断ペプチド、続いて異種TCR-β鎖をコードする核酸、続いて内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分を連続的にコードする。例示的なコンストラクトは、図2に記載されるものを含む。
挿入された場合、第1の自己切断ペプチドおよび異種TCR-α鎖を、その順序でコードする第1のコンストラクトは、内因性TCR-αプロモーターおよびTCR-α調節要素の制御下にある。第2の自己切断ペプチドおよび異種TCR-β鎖を、その順序でコードする第2のコンストラクトは、内因性TCR-βプロモーターおよびTCR-β調節要素の制御下にある。コンストラクトがT細胞のゲノム中に組み込まれ、内因性TCR-αおよびTCR-βプロモーターの制御下に置かれると、第1のコンストラクトおよび第2のコンストラクトから、別々のmRNA配列の転写を可能にする条件の下でT細胞は培養される。TRAC遺伝子のエクソン1に第1のコンストラクトを挿入することにより、TRAC遺伝子の残りのエクソン(エクソン2および3)がエクソン1と一緒にスプライシングされて、完全長異種TCR-α鎖をコードする最終的なmRNA配列になる。同様に、TRBC遺伝子のエクソン1に第2のコンストラクトを挿入することにより、TRBC遺伝子の残りのエクソン(エクソン2および3)がエクソン1と一緒にスプライシングされて、完全長異種TCR-β鎖をコードするmRNA配列になる。
第1の自己切断ペプチドおよび完全長異種TCR-α鎖をコードするmRNA配列の翻訳は、膜貫通ドメインを欠く不活性な内因性可変領域ペプチド(これは、例えば、小胞体で分解され、または翻訳後に分泌されうる)、および完全長異種抗原特異的TCR-α鎖の発現を引き起こす。第2の自己切断ペプチドおよび完全長異種TCR-β鎖をコードするmRNA配列の翻訳は、膜貫通ドメインを欠く不活性な内因性可変領域ペプチド(これは、例えば、小胞体で分解され、または翻訳後に分泌されうる)、および完全長異種抗原特異的TCR-β鎖の発現を引き起こす。完全長異種抗原特異的TCR-β鎖および完全長異種抗原特異的TCR-α鎖は、所望の抗原特異性を有するTCRを形成する。
本明細書において提供される方法では、異種TCR-β鎖の可変領域は、可変(V)、多様性(D)、および連結(J)対立遺伝子を含む。本明細書において提供される方法では、異種TCR-α鎖の可変領域はVおよびJ対立遺伝子を含む。例えば、Kuby, J., Immunology, 7th Ed., W.H. Freeman & Co., New York (2013)を参照されたい。
いくつかの態様において、核酸配列は、核酸を含むベクター、例えばウイルスベクターを導入することにより、T細胞のゲノムに挿入される。ウイルスベクターの例としては、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターである。
いくつかの態様において、核酸配列は、非ウイルス送達を介してT細胞のゲノムに挿入される。非ウイルス送達法では、核酸は裸のDNAであってもよく、または非ウイルスプラスミドもしくはベクター中であってもよい。
いくつかの態様において、核酸はT細胞に、(a) TRAC遺伝子のエクソン1における標的領域を切断してT細胞のゲノムに挿入部位を作り出す標的指向型ヌクレアーゼ; および(b) HDRにより挿入部位に組み込まれる核酸配列を導入することによってT細胞に挿入される。いくつかの態様において、核酸はT細胞に、(a) TRBC遺伝子のエクソン1における標的領域を切断してT細胞のゲノムに挿入部位を作り出す標的指向型ヌクレアーゼ; および(b) HDRにより挿入部位に組み込まれる核酸配列を導入することによってT細胞に挿入される。
いくつかの態様において、本方法は、TRAC遺伝子のエクソン1の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、TRBC遺伝子のエクソン1の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む。
第1および第2の核酸配列を用いて異種TCR-α鎖および異種TCR-β鎖をそれぞれTRAC遺伝子のエクソン1およびTRBC遺伝子のエクソン1に挿入する態様において、第1および第2の核酸はT細胞に、(a) TRAC遺伝子のエクソン1に第1の挿入部位およびTRBC遺伝子のエクソン1に第2の挿入部位を作り出す1つまたは複数の標的指向型ヌクレアーゼ; (b) 第1の核酸配列; および(c) 第2の核酸配列を導入することによってT細胞に挿入される。いくつかの態様において、本方法は、TRAC遺伝子のエクソン1の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAおよびTRBC遺伝子のエクソン1の標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む。
いくつかの態様において、核酸配列の5'末端および3'末端の各々は、T細胞のゲノムにおける標的領域、例えば、TRAC遺伝子のエクソン1における標的領域またはTRBC遺伝子のエクソン1における標的領域に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列は、長さが約50～300ヌクレオチドである。場合によっては、ゲノム配列またはその部分と相同であるヌクレオチド配列は、ゲノム配列と少なくとも80%、90%、95%相補的である。いくつかの態様において、核酸配列の5'末端および3'末端は、TRAC遺伝子のエクソン1における挿入部位でゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸配列の5'末端および3'末端は、TRBC遺伝子のエクソン1における挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。
場合によっては、核酸配列は線状DNA鋳型として細胞に導入される。場合によっては、核酸配列は二本鎖DNA鋳型として細胞に導入される。場合によっては、DNA鋳型は一本鎖DNA鋳型である。場合によっては、一本鎖DNA鋳型は純粋な一本鎖DNA鋳型である。本明細書において用いられる場合、「純粋な一本鎖DNA」とは、DNAの他鎖または反対の鎖を実質的に欠く一本鎖DNAを意味する。「実質的に欠く」とは、純粋な一本鎖DNAがDNAの別の鎖よりも1つの鎖を少なくとも100倍多くを欠くことを意味する。場合によっては、DNA鋳型は、二本鎖または一本鎖のプラスミドまたはミニサークルである。
いくつかの態様において、標的指向型ヌクレアーゼは、RNAガイドヌクレアーゼドメイン、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびmegaTALからなる群より選択される(例えば、Merkert and Martin 「Site-Specific Genome Engineering in Human Pluripotent Stem Cells」, Int. J. Mol. Sci. 18(7): 1000 (2016)を参照のこと)。いくつかの態様において、RNAガイドヌクレアーゼはCas9ヌクレアーゼであり、本方法は、T細胞のゲノムにおける標的領域、例えば、TRAC遺伝子のエクソン1における標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む。他の態様において、RNAガイドヌクレアーゼはCas9ヌクレアーゼであり、本方法は、TRBC遺伝子のエクソン1における標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAを細胞に導入する段階をさらに含む。
全体を通して用いられるガイドRNA(gRNA)配列は、部位特異的または標的指向型ヌクレアーゼと相互作用し、細胞のゲノム内の標的核酸に特異的に結合またはハイブリダイズする配列であり、したがってgRNAおよび標的指向型ヌクレアーゼは細胞のゲノムにおける標的核酸と共局在化する。各gRNAは、ゲノムにおける標的DNA配列に特異的に結合またはハイブリダイズする、長さが約10～50ヌクレオチドのDNAターゲッティング配列またはプロトスペーサー配列を含む。例えば、DNAターゲッティング配列は、長さが約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、gRNAは、crRNA配列およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)配列を含む。いくつかの態様において、gRNAは、tracrRNA配列を含まない。
一般に、DNAターゲッティング配列は、標的DNA配列を相補する(例えば、完全に相補する)または実質的に相補するようにデザインされる。場合によっては、DNAターゲッティング配列は揺らぎ塩基または縮重塩基を組み込んで、複数の遺伝要素を結合させることができる。場合によっては、結合領域の3'末端または5'末端にある19ヌクレオチドは、標的の遺伝要素と完全に相補的である。場合によっては、安定性を高めるために結合領域を改変することができる。例えば、非天然ヌクレオチドを組み込んで、分解に対するRNA耐性を増加させることができる。場合によっては、結合領域は、結合領域における二次構造の形成を回避または低減するように改変またはデザインすることができる。場合によっては、結合領域はG-C含量を最適化するようにデザインすることができる。場合によっては、G-C含量は、好ましくは約40%～約60%(例えば、40%、45%、50%、55%、60%)である。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は活性なエンドヌクレアーゼ型であってもよく、したがってガイドRNAとの複合体の一部またはDNA鋳型との複合体の一部として標的核酸への結合時に、二本鎖切断が標的核酸に導入される。本明細書において提供される方法では、Cas9ポリペプチドまたはCas9ポリペプチドをコードする核酸をT細胞に導入することができる。二本鎖切断はHDRにより修復されて、T細胞のゲノムにDNA鋳型を挿入することができる。本明細書において記述される方法ではさまざまなCas9ヌクレアーゼを利用することができる。例えば、ガイドRNAが標的とする領域のすぐ3'側のNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とするCas9ヌクレアーゼを利用することができる。そのようなCas9ヌクレアーゼは、NGG配列を含むTRACのエクソン1またはTRBCのエクソン1中の領域を標的とすることができる。別の例として、直交PAMモチーフの要件を有するCas9タンパク質を用いて、隣接するNGG PAM配列を有しない配列を標的にすることができる。直交PAM配列特異性を有する例示的なCas9タンパク質は、Esvelt et al., Nature Methods 10: 1116-1121 (2013)に記述されているものを含むが、これらに限定されることはない。
場合によっては、Cas9タンパク質はニッカーゼであり、したがってガイドRNAとの複合体の一部として標的核酸へ結合した時に、一本鎖切断またはニックが標的核酸に導入される。構造的に異なるガイドRNAに各々が結合した一対のCas9ニッカーゼは、標的ゲノム領域の2つの近位部位を標的とすることができ、かくして標的ゲノム領域、例えばTRAC遺伝子のエクソン1またはTRBC遺伝子のエクソン1に一対の近位一本鎖切断を導入することができる。オフターゲット効果は、塩基除去修復機構によって損傷なしに一般的に修復される単一のニックをもたらす可能性が高いため、ニッカーゼ対は特異性の増強を提供することができる。例示的なCas9ニッカーゼは、D10AまたはH840A変異を有するCas9ヌクレアーゼを含む(例えば、Ran et al. 「Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity」, Cell 154(6): 1380-1389 (2013)を参照のこと)。
いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼ、ガイドRNA、および核酸配列は、リボ核タンパク質複合体(RNP)-DNA鋳型複合体として細胞に導入され、ここでRNP-DNA鋳型複合体は、(i) Cas9ヌクレアーゼおよびガイドRNAを含む、RNP; ならびに(ii) HDRによってTRAC遺伝子のエクソン1に挿入される、異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖をコードするDNA鋳型を含む。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼ、ガイドRNA、および核酸配列は、リボ核タンパク質複合体(RNP)-DNA鋳型複合体として細胞に導入され、ここでRNP-DNA鋳型複合体は、(i) Cas9ヌクレアーゼおよびガイドRNAを含む、RNP; ならびに(ii) HDRによってTRBC遺伝子のエクソン1に挿入される、異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖をコードするDNA鋳型を含む。
いくつかの態様において、別々の構築物を用いて、T細胞におけるTRAC遺伝子のエクソン1に異種TCR-α鎖を、およびT細胞におけるTRBC遺伝子のエクソン1に異種TCR-β鎖を挿入する場合、(a) (i) Cas9ヌクレアーゼおよびTRAC遺伝子のエクソン1における標的領域に特異的にハイブリダイズする第1のガイドRNAを含む、第1のRNP; ならびに(ii) 異種TCRαサブユニットをコードするDNA鋳型を含む、第1の(RNP)-DNA鋳型複合体; ならびに(b) (i) Cas9ヌクレアーゼおよびTRBC遺伝子のエクソン1における標的領域に特異的にハイブリダイズする第2のガイドRNAを含む、第2のRNP; ならびに(ii) 異種TCRβサブユニットをコードするDNA鋳型を含む、第2の(RNP)-DNA鋳型複合体が細胞に導入される。いくつかの態様において、第1のRNP-DNA鋳型複合体におけるCas9ヌクレアーゼおよび第2のRNP-DNA鋳型複合体におけるCas9ヌクレアーゼは同じものである。いくつかの態様において、第1のRNP-DNA鋳型複合体におけるCas9ヌクレアーゼおよび第2のRNP-DNA鋳型複合体におけるCas9ヌクレアーゼは異なる。
いくつかの態様において、RNPとDNA鋳型とのモル比は、約3:1～約100:1とすることができる。例えば、モル比は、約5:1～10:1、約5:1～約15:1、5:1～約20:1; 5:1～約25:1; 約8:1～約12:1; 約8:1～約15:1、約8:1～約20:1、または約8:1～約25:1とすることができる。
いくつかの態様において、RNP-DNA鋳型複合体におけるDNA鋳型は、約2.5 pM～約25 pMの濃度である。いくつかの態様において、DNA鋳型の量は約1 μg～約10 μgである。
場合によっては、RNP-DNA鋳型複合体は、約20℃～約25℃の温度で、約1分間未満～約30分間RNPをDNA鋳型とともにインキュベートすることにより形成される。いくつかの態様において、RNP-DNA鋳型複合体および細胞は、RNP-DNA鋳型複合体を細胞に導入する前に混合される。
いくつかの態様において、核酸配列またはRNP-DNA鋳型複合体は、エレクトロポレーションによってT細胞に導入される。細胞をエレクトロポレーションしてRNP-DNA鋳型複合体を導入するための方法、組成物、および装置は、本明細書の実施例に記述されているものを含むことができる。細胞をエレクトロポレーションしてRNP-DNA鋳型複合体を導入するための追加または代替の方法、組成物、および装置は、WO/2006/001614またはKim, J.A. et al. Biosens. Bioelectron. 23, 1353-1360 (2008)に記述されているものを含むことができる。細胞をエレクトロポレーションしてRNP-DNA鋳型複合体を導入するための追加または代替の方法、組成物、および装置は、米国特許出願公開第2006/0094095号; 同第2005/0064596号; または同第2006/0087522号に記述されているものを含むことができる。細胞をエレクトロポレーションしてRNP-DNA鋳型複合体を導入するための追加または代替の方法、組成物、および装置は、Li, L.H. et al. Cancer Res. Treat. 1, 341-350 (2002); 米国特許第6,773,669号; 同第7,186,559号; 同第7,771,984号; 同第7,991,559号; 同第6485961号; 同第7029916号; ならびに米国特許出願公開第2014/0017213号; および同第2012/0088842号に記述されているものを含むことができる。細胞をエレクトロポレーションしてRNP-DNA鋳型複合体を導入するための追加または代替の方法、組成物、および装置は、Geng, T. et al.. J. Control Release 144, 91-100 (2010); およびWang, J., et al. Lab. Chip 10, 2057-2061 (2010)に記述されているものを含むことができる。
いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なるRNP-DNA鋳型複合体を含む複数のRNP-DNA鋳型複合体が細胞に導入される。全体を通して用いられる「複数」という語句は、2つまたはそれ以上を意味する。いくつかの態様において、少なくとも2つの構造的に異なるRNP-DNA鋳型複合体は、構造的に異なるガイドRNAを含む。少なくとも2つの構造的に異なるRNP複合体が構造的に異なるガイドRNAを含むいくつかの態様において、構造的に異なるRNP複合体の各々はCas9ニッカーゼを含み、構造的に異なるガイドRNAは標的領域の対向する鎖にハイブリダイズする。
いくつかの態様において、異種TCR-β鎖の可変領域および異種TCR-α鎖の可変領域をコードする少なくとも2つの構造的に異なる核酸が、T細胞の集団におけるTRAC遺伝子のエクソン1に導入される。このようにして、各核酸配列が異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖の固有の組み合わせをコードする複数の核酸配列を、T細胞の集団に導入することができる。核酸配列の各々を、RNP-DNA鋳型複合体の一部として細胞に導入することができる。
例えば、標的指向型ヌクレアーゼは、異種TCR-β鎖の可変領域および異種TCR-α鎖の可変領域をコードする複数(例えば、2、3、4、5またはそれ以上、例えば、2～10、5～100、20～100)の固有のDNA鋳型と複合体化することができる。異種TCR-β鎖の可変領域および異種TCR-α鎖の可変領域の固有の組み合わせをコードする単一のDNA鋳型を、個々のT細胞におけるTRAC遺伝子のエクソン1に挿入するために、複数の複合体をT細胞の集団に同時に導入することができる。各T細胞は単一のDNA鋳型のみを取得するが、細胞の集団全体で、多くの固有の、構造的に異なるDNA鋳型がT細胞に組み込まれて、異種TCR配列のライブラリーを作り出すであろう。
別々のコンストラクトを用いてTRAC遺伝子のエクソン1に異種TCR-α鎖を、およびTRBC遺伝子のエクソン1に異種TCR-β鎖を挿入するいくつかの態様において、第1の標的指向型ヌクレアーゼは、異種TCR-β鎖の可変領域をコードする複数の固有のDNA鋳型と複合体化されて、複数の第1のRNP-DNA鋳型複合体を形成することができ、第2の標的指向型ヌクレアーゼは、異種TCR-α鎖の可変領域をコードする複数の固有のDNA鋳型と複合体化されて、複数の第2のRNP-DNA鋳型複合体を形成することができる。第1および第2の複数の複合体をT細胞の集団に同時に導入して、異種TCR配列のライブラリーを作り出すことができる。
異種T細胞レパートリーは、関心対象の内因性T細胞集団に見られる天然レパートリーからだけではなく、既知のTCR配列からデザインおよび作り出すことができる。例えば、TCR配列は、腫瘍浸潤リンパ球から、自己免疫疾患部位の自己反応性T細胞から、または病原体応答性T細胞から得られたTCR配列とすることができる。
いくつかの態様において、核酸配列またはRNP-DNA鋳型複合体は、約1×105～約2×106個細胞のT細胞に導入される。例えば、核酸配列またはRNP-DNA鋳型複合体は、約1×105個の細胞～約5×105個の細胞、約1×105個の細胞～約1×106個の細胞、1×105個の細胞～約1.5×106個の細胞、1×105個の細胞～約2×106個の細胞、約1×106個の細胞～約1.5×106個の細胞、または約1×106個の細胞～約2×106個の細胞に導入することができる。
本明細書において提供される方法および組成物において、ヒトT細胞は初代T細胞とすることができる。いくつかの態様において、T細胞は調節性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である。いくつかの態様において、エフェクターT細胞はCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD4+CD8+ T細胞である。本明細書において記述される方法のいずれかによって改変された細胞のいずれかの集団も提供される。細胞はインビトロ、エクスビボ、またはインビボであることができる。場合によっては、T細胞は対象から取り出され、本明細書において記述される方法のいずれかを用いて改変され、患者に投与される。
いくつかの態様において、改変T細胞は、異種抗原特異的T細胞受容体を形成させるために異種TCR-β鎖および異種TCR-α鎖の発現を可能にする条件下で培養される。他の態様において、T細胞は、改変細胞の集団を増大するために有効な条件下で培養される。いくつかの態様において、抗原特異的T細胞受容体を発現するT細胞は精製される。
組成物
本明細書において提供される方法のいずれかによって産生されるヒトT細胞も提供される。本明細書において提供される方法のいずれかによって産生されるヒトT細胞の集団も提供される。細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%またはそれ以上のゲノムが、TRACのエクソン1またはTRBCのエクソン1に挿入される異種核酸のターゲッティングされた挿入を含む、複数のヒトT細胞がさらに提供される。いくつかの態様において、T細胞は、調節性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である。いくつかの態様において、エフェクターT細胞はCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、エフェクターT細胞はCD4+CD8+ T細胞である。
核酸配列を含むT細胞であって、核酸配列が、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) TCRサブユニット鎖の定常領域および可変領域を含む、第1の異種TCRサブユニット鎖、(iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 第2の異種TCRサブユニット鎖の可変領域; ならびに(v) 内因性TCRサブユニットのN末端の部分をコードし、内因性TCRサブユニットがTCR-アルファ(TCR-α)サブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-ベータ(TCR-β)サブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、内因性TCRサブユニットがTCR-βサブユニットである場合、第1の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-αサブユニット鎖であり、第2の異種TCRサブユニット鎖は異種TCR-βサブユニット鎖である、T細胞も提供される。いくつかの態様において、核酸配列は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列、(ii) 異種TCR-βサブユニット鎖、(iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-αサブユニット鎖の可変領域、および(v) 内因性TCR-αサブユニット鎖のN末端の部分をコードする。いくつかの例において、核酸は、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列、(ii) 異種TCR-αサブユニット鎖、(iii) 第2の自己切断ペプチド配列、(iv) 異種TCR-βサブユニット鎖の可変領域、および(v) 内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分をコードする。
核酸配列を含む改変T細胞であって、核酸配列が、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-β鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-α鎖の可変領域、および(v) 内因性TCR-αサブユニットのN末端の部分をコードし、核酸配列がTRAC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、改変T細胞も提供される。いくつかの例において、核酸は、N末端からC末端に向かって、第1の自己切断ペプチド配列、異種(例えば、完全長) TCR-βサブユニット鎖、第2の自己切断ペプチド配列、および異種TCR-αサブユニット鎖の可変領域をコードする。
核酸配列を含む改変T細胞であって、核酸配列が、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-α鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-β鎖の可変領域、および(v) 内因性TCR-βサブユニットのN末端の部分をコードし、核酸配列がTRBC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、改変T細胞も提供される。他の例において、核酸は、N末端からC末端に向かって、第1の自己切断ペプチド配列、異種(例えば、完全長) TCR-αサブユニット鎖、第2の自己切断ペプチド配列、および異種TCR-βサブユニット鎖の可変領域をコードする。
核酸配列を含む改変T細胞であって、核酸配列が、N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断ペプチド配列; (ii) 異種TCR-β鎖の可変領域; (iii) 第2の自己切断ペプチド配列; (iv) 異種TCR-α鎖の可変領域、および(v) 内因性TCR-γサブユニットのN末端の部分をコードし、核酸配列がTRGC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、改変T細胞も提供される。
(a) N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断配列; (ii) 異種TCR-α鎖の可変領域、および(iii) 内因性TCR-α鎖のN末端の部分をコードし、TRAC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、第1の核酸配列; ならびに(b) N末端からC末端に向かって、(i) 第1の自己切断配列; (ii) 異種TCR-β鎖の可変領域、および(iii) 内因性TCR-β鎖のN末端の部分をコードし、TRBC遺伝子のエクソン1に組み込まれている、第2の核酸配列を含む改変T細胞がさらに提供される。
治療方法
本明細書において記述される方法および組成物のいずれかを用いて、疾患(例えば、対象におけるがん、感染病、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病、または他の炎症性障害)を治療または予防することができる。本明細書において提供される治療方法では、例えば、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶の可能性、移植片対宿主病、または他の炎症性障害を有する対象におけるTCRのTCR-αまたはTCR-β鎖を含む核酸配列を、対象におけるT細胞から得ることができる。例えば、腫瘍浸潤リンパ球、自己免疫部位のT細胞、または病原体応答性リンパ球からのT細胞を対象から単離して、TCRのTCR-αまたはTCR-β鎖を含む核酸配列を得ることができる。いくつかの態様において、患者サンプルから同定されたモノクローナルまたはポリクローナルTCR配列を用いることができる。例えば、腫瘍または炎症部位からのTCRレパートリーを得ることができ、これらの抗原特異性を有する細胞は、TCR配列を合成し、それらをDNA鋳型として用いることにより作り出すことができる。あるいは、対象からのクローン/単一細胞から配列を増幅、例えば、PCR増幅することができ、増幅された配列をDNA鋳型として用いることができる。TCRのTCR-αおよびTCR-β鎖の配列が得られたら、これらの配列を対象中のまたは対象由来のT細胞の集団に挿入して、対象でのT細胞の内因性TCRを、所望の抗原特異性の異種TCRと置き換えることができる。いくつかの態様において、改変されたT細胞の集団を対象に投与して、疾患を治療することができる。例えば、図3Bを参照されたい。
対象における腫瘍特異的抗原を認識する抗原特異的T細胞受容体を発現するように、本明細書において記述される方法のいずれかを用いて対象のT細胞を改変する段階を含む、ヒト対象におけるがんを治療する方法が本明細書において提供される。
いくつかの態様において、治療されるがんは、B細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、結腸がん、慢性骨髄性がん、白血病(例えば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病(CLL)または急性リンパ球性白血病(ALL))、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、肝臓がん、腎臓がん、卵巣がん、胃がん、精巣がん、横紋筋肉腫、およびホジキンリンパ腫から選択される。いくつかの態様において、B細胞起源のがんは、B系統急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、およびB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。
本明細書において記述される治療、例えば、がん、感染性疾患、または自己免疫障害の治療の方法のいくつかの態様において、T細胞はインビボで改変される。本明細書において記述されるコンストラクトのいずれも、インビボで患者に送達される。例えば、米国特許第9737604号およびZhang et al. 「Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy」, NPG Asia Materials Volume 9, page e441 (2017)を参照されたい。
いくつかの態様において、ヒト対象におけるがんを治療する方法は、(a) 対象からT細胞を得る段階; (b) 対象における腫瘍特異的抗原を認識する異種の抗原特異的T細胞受容体を発現するように、本明細書において提供される方法のいずれかを用いてT細胞を改変する段階; および(c) 改変されたT細胞を対象に投与する段階を含む。全体を通して用いられる「腫瘍特異的抗原」という語句は、がん細胞に固有であるか、または非がん細胞におけるよりもがん細胞において豊富に発現される抗原を意味する。
自己免疫障害に関連する抗原を認識する異種の抗原特異的T細胞受容体を発現するように、本明細書において記述される方法のいずれかを用いて対象のT細胞を改変する段階を含む、ヒト対象における自己免疫疾患を治療する方法が本明細書においてさらに提供される。
いくつかの態様において、ヒト対象における自己免疫疾患を治療する方法は、(a) 対象からT細胞を得る段階; (b)対象における自己免疫障害に関連する抗原を認識する異種の抗原特異的T細胞受容体を発現するように本明細書において提供される方法のいずれかを用いてT細胞を改変する段階; および(c) 改変されたT細胞を対象に投与する段階を含む。いくつかの態様において、T細胞は調節性T細胞である。
T細胞受容体が対象における感染に関連する抗原を認識する、異種の抗原特異的T細胞受容体を発現するように本明細書において記述される方法のいずれかを用いて対象のT細胞を改変する段階を含む、ヒト対象における感染を治療する方法が本明細書においてさらに提供される。
いくつかの態様において、ヒト対象における感染を治療する方法は、(a) 対象からT細胞を得る段階; (b) 対象における感染に関連する抗原を認識する異種の抗原特異的T細胞受容体を発現するように、本明細書において提供される方法のいずれかを用いてT細胞を改変する段階; および(c) 改変されたT細胞を対象に投与する段階を含む。
本明細書において提供される治療方法のいずれも、内因性TCRが異種TCRで置き換えられる前に、T細胞の集団を増大する段階をさらに含むことができる。本明細書において提供される治療方法のいずれも、内因性TCRが異種TCRで置き換えられた後にかつ対象への投与前に、T細胞の集団を増大する段階をさらに含むことができる。
開示される方法および組成物のために使用できる、開示される方法および組成物と併せて使用できる、開示される方法および組成物の調製において使用できる、または開示される方法および組成物の生成物である材料、組成物、および成分が開示される。これらの材料およびその他の材料が本明細書において開示され、これらの材料の組み合わせ、小集団、相互作用、群などが開示される場合には、これらの化合物の各さまざまな個別のおよび集団の組み合わせおよび順列の特定の言及が、明確に開示されない場合もあるものの、各々が具体的に企図され、本明細書において記述されることを理解されたい。例えば、方法が開示かつ考察され、その方法中を含めて1つまたは複数の分子に対して行うことができるいくつかの修飾が考察される場合に、その方法のありとあらゆる組み合わせおよび順列、ならびに可能である修飾は、特にそれとは反対の指示がない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意の小集団または組み合わせも具体的に企図され、開示される。この概念は、開示された組成物を用いる方法における段階を含むが、これに限定されない、本開示の全ての局面に当てはまる。したがって、実施できる種々のさらなる段階がある場合、これらのさらなる段階の各々は、開示される方法の任意の特定の方法段階または方法段階の組み合わせで実施できること、および各そのような組み合わせまたは組み合わせの小集団が具体的に企図され、開示されたと見なされるべきであると理解されたい。
本明細書において引用される刊行物およびそれらが引用されている資料は、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる。
以下の例は、実例としてのみ提供されており、限定のためではない。当業者は、本質的に同じまたは類似の結果をもたらすように変更または修正されうる種々の重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
遺伝子ターゲッティングのためのヒト初代T細胞の単離
初代ヒトT細胞は健常ヒトドナーから、新鮮な全血サンプル、Trima Apheresis後の白血球除去チャンバからの残留物(Blood Centers of the Pacific)または白血球除去輸血製品(StemCell)のいずれかより単離された。末梢血単核細胞(PBMC)は、SepMate管(STEMCELL, 製造元の指示に従って)を用いてフィコール遠心分離により全血サンプルから単離された。T細胞は、EasySep Human T Cell Isolation Kit (STEMCELL, 製造元の指示に従って)を用いて磁気陰性選択により全細胞供給源のPBMCから単離された。特に断りのない限り、単離されたT細胞を刺激し直接使用した(新鮮)。凍結細胞を使用した場合、製造元の指示に従ってBambanker凍結培地(Bulldog Bio)中で凍結されていた以前に単離されたT細胞を融解し、刺激なしの培地中で1日間培養した後、新鮮単離されたサンプルについて記述したように刺激および処理した。新鮮な健常ヒト血液ドナーは、UCSFヒト研究委員会(CHR)によって承認されたプロトコルに基づいて同意された。遺伝子編集のための患者サンプルは、Yale Internal Review Board (IRB)によって承認されたプロトコルの下で得られた。
初代T細胞培養
特に断りのない限り、バルクT細胞は、5%ウシ胎児血清、50 mM 2-メルカプトエタノール、および10 mM N-アセチルL-シスチンを有するXVivo(商標) 15培地(STEMCELL)中で培養された。添加物を有しない無血清培地(ImmunoCult XF T細胞増殖(expansion)培地, STEMCELL)、およびRPMI + 10% FBSを、表示された実験において用いた(図15)。単離直後、T細胞を、200 U/mLのIL-2 (UCSF Pharmacy)、5 ng/mLのIL-7 (ThermoFisher)、および5 ng/mLのIL-15 (Life Tech)のサイトカインカクテルとともに、ビーズと細胞の濃度1:1で抗ヒトCD3/CD28磁気ダイナビーズ(ThermoFisher)によって2日間刺激した。エレクトロポレーションに続いて、500 U/mLのIL-2を有する培地中でT細胞を培養した。培養の間中ずっと、T細胞は培地1 mLあたりおよそ100万個の細胞密度で維持された。エレクトロポレーション後2～3日ごとに、追加の新鮮IL-2とともに、追加の培地を添加して終濃度を500 U/mLにし、必要に応じて細胞をさらに大きな培養容器に移して、100万個の細胞/mLの密度を維持した。
RNP産生
既述(Schumann et al. PNAS 112: 10437-10442 (2015); およびHultquist et al. Cell Rep. 17: 1438-1452 (2016))のように、Cas9への2成分gRNAのアニーリングによってRNPが生成された。手短に言えば、crRNAsおよびtracrRNAを化学的に合成し(Dharmacon, IDT)、組み換えCas9-NLS、D10A-NLS、またはdCas9-NLSを組み換えによって産生し、精製(QB3 Macrolab)した。凍結乾燥されたRNAを、160 μMの濃度で150 mM KClを有するTris-HCL (7.4 pH)中に再懸濁し、-80℃にてアリコートで貯蔵した。crRNAおよびtracrRNAアリコートを融解し、容量で1:1に混合し、37℃で30分間インキュベートして、80 μM gRNA溶液を形成させた。次に、20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM KCl, 10%グリセロール, 1 mM DTT中40 uMで貯蔵された、組み換えCas9および変種を、37℃で15分間、80 μM gRNAと容量で1:1 (2:1のgRNA対Cas9モル比)に混合して、20 μMのRNPを形成させた。RNPは通常、複合体化の直後にエレクトロポレーションされた。
dsDNA HDRT産生
二本鎖DNA HDRT配列は、PCR産物から作り出された。新規のHDR配列は、Gibson Assembliesを用いて構築され、相同性アーム(通常IDTからgBlocksとして合成される)および所望の挿入断片(GFPのような)からなるHDR鋳型配列を配列確認および後の増殖(propagation)用のクローニングベクターに配置した。これらのプラスミドを、高出力PCR増幅(Kapa Hotstartポリメラーゼ)用の鋳型として用いた。PCRアンプリコン(dsDNA HDRT)をSPRI精製(1.0×)し、PCR反応投入量100 μLあたり3 μL H2Oの最終容量に溶出した。HDRTの濃度を20分の1希釈でnanodropにより分析した。増幅されたHDRTのサイズは、1.0%アガロースゲルでのゲル電気泳動によって確認された。
エキソヌクレアーゼ消化によるssDNA HDRT産生
HDRドナーとして長いssDNAを産生するために、関心対象のDNAは、1つの通常の非修飾PCRプライマーともう1つのリン酸化PCRプライマーを用いてPCRにより増幅された。リン酸化プライマーを用いて増幅されるDNA鎖は、この方法を用いて分解される鎖であろう。これにより、各リン酸化PCRプライマーを用いて一本鎖センスDNAまたは一本鎖アンチセンスDNAを調製することが可能とされる。関心対象のssDNA鎖を産生するために、PCR産物のリン酸化鎖を、2つの酵素Strandase Mix AおよびStrandase Mix Bでのその後の処理により、それぞれ37℃で5分間(1 kbあたり)分解した。酵素を80℃で5分間のインキュベーションにより不活性化した。結果的に得られたssDNA HDR鋳型をSPRI精製(1.0×)し、H2O中に溶出した。Guide-it(商標) Long ssDNA Production System (Takara Bio USA, Inc. #632644)のさらに詳細なプロトコルは、製造元のウェブサイトにおいて見出すことができる。
逆合成によるssDNA HDRT産生
Leonettiらhttp://www.biorxiv.org/content/early/2017/08/21/178905)に記述されているように、ssDNAドナーは、RNA中間体の逆転写と、それに引き続いて得られたRNA:DNAハイブリッド産物におけるRNA鎖の加水分解により合成された。手短に言えば、所望のHDRドナーを最初に、T7プロモーターの下流にクローニングし、T7-HDRドナー配列をPCRによって増幅した。HiScribe T7 RNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いてインビトロでの転写によりRNAを合成し、TGIRT-III (InGex)を用いて逆転写した。逆転写後、NaOHおよびEDTAをそれぞれ0.2 Mおよび0.1 Mまで添加し、RNA加水分解を95℃で10分間実行した。反応をHClで反応停止し、最終的なssDNA産物を、Ampure XP磁気ビーズ(Beckman Coulter)を用いて精製し、無菌のRNAse不含H2O中に溶出した。ssDNAの品質をキャピラリー電気泳動(Bioanalyzer, Agilent)により分析した。
初代T細胞エレクトロポレーション
RNPおよびHDR鋳型を、最初のT細胞刺激から2日後にエレクトロポレーションした。T細胞をその培養容器から収集し、細胞を磁石上に2分間置くことによって磁気CD3/CD28ダイナビーズを除去した。エレクトロポレーションの直前に、ビーズを除去した細胞を90×gで10分間遠心分離し、吸引し、Lonzaエレクトロポレーション緩衝液P3中に、100万個の細胞あたり20 μLの緩衝液となるように再懸濁した。最適な編集のため、パルスコードEH115を備えたLonza 4D 96ウェルエレクトロポレーションシステムを用いて1ウェルあたり100万個のT細胞をエレクトロポレーションした。1ウェルあたり200,000～最大200万個までの細胞の代替細胞濃度では、より低い効率が示された。代替のエレクトロポレーション緩衝液を表示のように用いたが、最適なパルス設定が異なっていた(OMEM緩衝液の場合EO155)。別段の指示がない限り、RNP 2.5 μL (計50 pmol)を2 μg/μLのHDR鋳型2 μL (計4 μg HDR鋳型)とともにエレクトロポレーションした。
96ウェル実験の場合、最初にHDRTを96ウェルポリプロピレンV底プレートのウェルに等分した。次にRNPをHDRTに添加し、RTで少なくとも30秒間一緒にインキュベートさせた。最後に、エレクトロポレーション緩衝液に再懸濁された細胞を添加し、ピペッティングすることによってHDRTおよびRNPと簡単に混合し、24 μLの総容量(細胞 + RNP + HDRT)を96ウェルエレクトロポレーションキュベットプレートに移入した。エレクトロポレーションの直後に、予め加温された培地(サイトカインを有しない)80 μLを各ウェルに添加し、エレクトロポレーションキュベットに残したまま、細胞培養インキュベーター内で37℃にて15分間細胞を静置した。15分後、細胞を最終培養容器に移した。
単一HDR鋳型による内因性T細胞受容体の非ウイルス置換
TCR-α鎖とTCR-β鎖の両方を、単一の多重ラウンド編集で同時にノックインすることができる(図2)。これは、TCR-αとTCR-βの両方の定常遺伝子座の位置に、所望の抗原特異的TCRの可変領域のみが挿入されることを除いて、図1aおよび図1bにおけるターゲッティング戦略と同様である。これには、挿入の合計サイズがともに(1つの1.5 kbpの挿入から2つの500 bpの挿入に)低減されるという利点があるが、所望の抗原特異的TCRの両方の鎖を発現するいずれのT細胞も以前に再結合されたその内因性TCR-α鎖およびTCR-β鎖の両方がノックアウトされており、例えば、挿入された抗原特異的TCR-α鎖と内因性TCR-β鎖との潜在的に望ましくない対合が抑止されることも意味している。
T細胞受容体のポリクローナルライブラリーによる内因性TCR置換
gRNAおよび相同性アームは、内因性TCRと任意の所望の新しい異種TCR配列との置換に関して同じであるため、種々の所望のTCRを含む複数の異なるDNA鋳型を同時にエレクトロポレーションすることができる。任意の特定のT細胞は、種々の所望のTCR群から単一のTCRを取得するだけであるが、TCR DNA鋳型の多くは、エレクトロポレーションされた細胞の集団全体に組み込まれるため、所望の配列の合成T細胞レパートリーが作り出されよう(図3a)。
合成T細胞レパートリーは、既知のTCR配列から、または関心対象の内因性T細胞集団に見られる天然レパートリーからデザインおよび作り出すことができる(図3b)。いくつかの例としては、腫瘍浸潤リンパ球によって発現されるTCR(CD8+もしくはCD4+ T細胞エフェクターの新しい集団に挿入される)、自己免疫疾患の部位で自己反応性T細胞によって発現されるTCR(調節性T細胞の集団に挿入される)、または病原体応答性T細胞からのTCR(CD8+もしくはCD4+ T細胞エフェクターに挿入される)が挙げられる。
単一HDR鋳型による内因性T細胞受容体の非ウイルス置換
T細胞受容体のゲノム遺伝子座は極めて複雑であり、機能的なT細胞受容体を産生するためにT細胞発生中に体細胞の遺伝子再構成を受ける多種多様な可変対立遺伝子(TCR-α鎖の場合にはVおよびJ対立遺伝子ならびにTCR-β鎖の場合にはV、D、およびJ対立遺伝子と呼ばれる)を有する。TCRレパートリーの多様性にとって重要であるが、これらの組み換えられた配列はT細胞のポリクローナル集団全体で異なっており、(ノックアウトであれノックインであれ)TCR遺伝子座でのターゲッティングされたゲノム編集は困難である。TCR-α鎖およびTCR-β鎖の両方に対しての、ターゲッティングの適用の場合、どのV-JまたはV-D-Jセグメントが再配置されようとも、全てのT細胞によって共有されるタンパク質のC末端に定常ドメインがある。図1bに示されるように、TCR-β遺伝子座には、ターゲッティングされうる2つの定常領域(TRBC1およびTRBC2)がある。この定常配列(TRACまたはTRBCエクソン1、エクソン2などとラベル付けされた定常エクソン)により、あらゆるT細胞を修飾するために単一セットのゲノムターゲッティング試薬(この用途ではCRISPR/Cas9システム、すなわち、単一のgRNA配列)を、それらが発現する再配置TCRが何であろうと、使用することが可能になる。
上記の方法を用いて、腫瘍抗原に特異的に結合する異種TCRをコードするDNA鋳型を作り出しかつ使用して、ヒトT細胞における内因性TCRを置き換えた。内因性TCRを置き換えるために用いられる相同組み換え修復鋳型(PCRによって産生されたdsDNAまたは本明細書において記述される種々の方法によって産生されたssDNA)は、gRNA切断部位に隣接するゲノム配列と相同である5'および3'相同性アーム(約300 bp)を含む、約2.1 kb長である(図1a)。これらの相同性アームの間には、相同組み換え修復によってgRNA切断部位に挿入された約1.5 kbの配列がある。この挿入された配列は、マルチシストロニック要素(T2A自己切除ペプチド)で始まり、その後に所望の抗原特異的T細胞受容体(この例では、NY-ESO-1黒色腫新生抗原に特異的なTCR)のTCR-β鎖の全長配列が続く。第2のマルチシストロニック要素(P2A自己切除ペプチド)がTCR-β鎖に続き、それを所望の抗原特異的TCR-α鎖の可変(組み換えVおよびJ対立遺伝子)配列から分離する。残りのTRACエクソンは最終的なmRNA配列に一緒にスプライシングされたため、TCR-α鎖およびTRACエクソン1の配列からgRNA切断部位の前(5'末端)までの可変領域のみが挿入された。DNA鋳型は、上記のRNP:DNA鋳型複合体の一部としてT細胞に導入された。
HDRが成功した細胞での転写により、TCR-βとTCR-αの両方をコードするポリシストロン性mRNAが得られた。このターゲッティング戦略により3つのペプチド鎖が得られた- (1) 膜貫通パスを保有しない(したがって、細胞表面に発現されないはずの)、かつ小胞体で分解されたかまたは転写後に分泌された残りの内因性可変領域ペプチド; (2) 完全長の所望の抗原特異的TCR-β鎖; および(3) 完全長の所望の抗原特異的TCR-α鎖。この結果は、内因性TCRプロモーターの制御下で所望の抗原特異的TCRの両方の鎖を発現するT細胞であった。両方の鎖がT細胞により発現されて、NY-ESO-1黒色腫新生抗原を特異的に認識する異種TCRを形成した。
図4aに示されるように、上記のコンストラクトのエレクトロポレーションの4日後に、2名の健常ヒト血液ドナーからのCD4+およびCD8+ T細胞を、組み込まれたNY-ESO-1特異的TCR (NYESO)によって認識されるペプチドを含む蛍光標識MHC-デキストラマーで染色した。図4bは、他の健常ヒトドナーにおける同様の結果を示す第2の実験であり、かくして非ウイルス内因性TCR置換の堅牢性および再現性を実証するものである。
TCRの置換は、TCR-αをターゲッティングするのと同様の戦略でTCR-β遺伝子座でも達成されたが、互いに相同性の高い2つの定常領域(TRBC1およびTRBC2)があるため、β遺伝子座はより複雑である。HDR鋳型は、TRBC1とTRBC2の両方に見られる配列をターゲッティングするgRNAを用いて、最初のTRBC1エクソンの5'末端に新しい完全長TCR-αおよび新しいTCR-βのVDJ領域を挿入した。TRBC1とTRBC2のゲノム領域間の配列の類似性により、このコンストラクトの3'相同性アームはTRBC2における同等の領域とほぼ完全に相同であったが、5'相同性アームは挿入部位に最も近い150 bpにおけるTRBC2ゲノム領域と約85%の相同性を有していた。したがって挿入はTRBC1の位置で優位である可能性が高いが、TRBC2の位置で生じる場合、またはTRBC1とTRBC2の間に介在する欠失がある場合も可能でありうる。両方をターゲッティングするgRNAの代わりに、TRBC1またはTRBC2の位置で特異的に切断するgRNAを用いることもできる。
図9aは、ゲートされたCD4+またはCD8+ T細胞におけるNY-ESO-1特異的TCRのレトロウイルス送達または非ウイルスTCR置換後のTCR誤対合分析を示す。非ウイルスTCR置換により、レトロウイルスによるTCR送達と比較してTCRの誤対合が少なくなる。TRACにターゲッティングされる新しいTCR-α VJドメインおよびTRBC1にターゲッティングされる新しいTRB-β VDJドメインによる、TCRの多重置換も可能であり、TCR誤対合をさらに低減する戦略を提示することができた(図9b～c)。
デキストラマーによるTCR置換およびTCR染色
上記のように、2名の健常ヒト血液ドナーからのCD4+およびCD8+ T細胞に単一のコンストラクトをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの4日後に、NYESO MHC-デキストラマーによる抗原特異的染色に対するTCR発現についての(全ての潜在的なヒトTCRに結合する抗体での)染色を実施した。内因性TCRの相同組み換え置換(homology directed replacement)がないT細胞の大部分(図5)では、内因性TCRはTRACエクソン1 gRNAによる切断および非相同末端結合による小さな挿入欠失の導入によりノックアウトされる。予想通り、ほとんど全てのNYESO陽性細胞はTCR発現も陽性である。
TCRノックイン初代ヒトT細胞によるインビトロでのがん細胞死滅
インビトロのがん細胞死滅アッセイ法により、TCRノックイン細胞の機能的な標的細胞死滅能が実証された。上記のように、1G4 (NYESO特異的) TCR配列は、健常ヒトドナーからのCD3+初代T細胞における内因性TCRα遺伝子座に挿入された。エレクトロポレーション後7日の時点で、細胞を蛍光NYESOペプチド-MHCデキストラマーで染色し、NYESO+細胞を蛍光活性化細胞選別により選別して、純粋な集団を達成した。この集団をさらに5日間、標準的なT細胞培養条件(培地およびIL-2)でさらに培養した。エレクトロポレーションの12日後、内因性TCRが1G4 TCRに置き換わった選別済みT細胞を、MHC上にNYESO抗原を提示しているがん細胞株(黒色腫に由来し、NYESO抗原と、1G4 TCRによって認識されるMHC対立遺伝子MHC-A2とを内因的に発現している、A375細胞)と共培養した。12時間ごとに、定量的蛍光画像化によってがん細胞の数をカウントした(A375細胞は赤色蛍光タンパク質を発現しているため、T細胞とは別に明確にカウントすることができる)。Incucyte自動蛍光顕微鏡を用いて蛍光カウントを自動化した。培養物に3,000個のがん細胞、および表示された比率の1G4+ T細胞を播種した(図4a参照)。2名の健常ヒトドナーから編集されたT細胞において、標的がん細胞の堅牢な用量および時間依存性の死滅が観察され、1G4 TCRノックインT細胞の機能性を示すものであった。がん細胞の死滅率は、T細胞が存在しない対照ウェル中の生存がん細胞の数で、所与のウェル中の生存がん細胞の数を割ることによって決定された。T細胞のがん細胞に対する比率が高い(約10:1)場合、ほぼ全てのがん細胞の急速な(24時間未満)死滅が示されたが、T細胞のがん細胞に対する比率が非常に低い場合(約0.1:1)であっても、培養時間の追加により堅牢な死滅が示された(図6a参照)。
単一の時点での1G4 TCRノックインT細胞によるインビトロでのがん死滅が実証された(図6b参照)。要約データは、上記の細胞死滅アッセイ法における単一の時点(共インキュベーション後36時間)から取得された。NYESOデキストラマー+ (1G4+) T細胞を上記のように選別して100% 1G4陽性集団を作り出し、これを次に、同じドナーからのNYESOデキストラマー- (1G4-) T細胞で希釈して、示された割合のNYESO+染色T細胞を得た(10%、1%、または0%)。これらの集団の各々を次に、上記のように、1個のがん細胞に対して8個のT細胞の比率で、インビトロでのがん死滅アッセイ法においてがん細胞と共培養した(100%、10%、1%、および0% NYESO+ T細胞集団に対してそれぞれ8:1、0.8:1、0.08:1、および0:1の1G4+ T細胞:がん細胞の比率を得た)。がん細胞死滅の陽性対照として、さらなる健常ドナーからの細胞を、1G4 TCR発現カセットをT細胞のゲノムにランダムに組み込むレンチウイルスで形質導入した(この場合、1G4 TCRが、内因性TCRプロモーターから発現され、同時に内因性TCRをノックアウトするように、内因性TCR遺伝子座に置き換わる1G4 TCRノックインT細胞とは対照的に、TCRがランダムに組み込まれ、発現されることに留意されたい)。このさらなるドナーからの、レンチウイルスによって形質導入されたT細胞を同様に選別し100% 1G4+集団を得て、標的A375がん細胞株と共に8;1のT細胞とがん細胞との比率で同様に共培養した。
インビボマウス固形腫瘍モデル
全てのマウス実験は、UCSF施設内動物管理および使用委員会プロトコルの下で完了した。全ての実験に8～12週齢のNOD/SCID/IL-2Rγヌル(NSG)雄性マウス(Jackson Laboratory)を用いた。剃毛した右脇腹への1×106個のA375ヒト黒色腫細胞(ATCC CRL-1619)の皮下注射によりマウスに腫瘍を播種した。腫瘍播種後7日の時点で、腫瘍サイズを評価し、15～30 mm3の腫瘍体積を有するマウスを実験および対照の処置群にランダムに割り当てた。表示された数のT細胞を無血清RPMI 100 μlに再懸濁し、眼窩後方に注射した。腫瘍サイズ計測実験の場合、腫瘍の長さおよび幅を、電子ノギスを用いて測定し、体積をv = 1/6 *π* 長さ * 幅 * (長さ + 幅)/2として計算した。治験責任医師はサイズ測定の間に、実験治療群を知らされていなかった。図と凡例に示されているように、バルク編集されたT細胞集団(5×106)または選別されたNY-ESO-1 TCR+集団(3×106)を移入した。バルク編集されたT細胞の移入の場合、レンチウイルスで編集された細胞は一般にNY-ESO-1陽性細胞の割合が高かったため、偽感染細胞を添加して全T細胞NY-ESO-1+の割合を、ウイルスで編集されていないT細胞のバルク集団の割合(約10% NY-ESO-1+)と等しくなるように正規化した。選別されたT細胞の移入の場合、エレクトロポレーションの8日後にNY-ESO-1+ T細胞をFACS選別し、さらに2日間増大させ、凍結した(Bambanker凍結用培地, Bulldog Bio)。非ウイルス的にまたはレンチウイルス的に改変されたヒトT細胞をその後、養子移入の前に融解し、培地中に終夜置いた。養子移入されたT細胞のフローサイトメトリー分析の場合、腫瘍および脾臓からの単一細胞懸濁液を、70 μmのフィルタを通じた組織の機械的解離によって作り出した。全ての動物実験はどの次元においても2.0 cmの腫瘍サイズの制限を含めて、承認されたIACUCプロトコル(UCSF)に従い、関連する倫理的規制を順守して実施された。
非ウイルスTCR置換によるT細胞のインビボ機能性
ヒト抗原特異的腫瘍異種移植片モデルを用いて(図7a)、非ウイルスTCR置換によるT細胞のインビボ機能性を評価した。8～12週齢NSGマウスに1×106個のA375細胞（ヒト黒色腫細胞株; NY-ESO-1抗原+およびHLA-A＊0201+)を、剃毛した脇腹の皮下に播種した。NY-ESO-1抗原特異的TCRを発現するように編集された初代ヒトT細胞を作り出し(レンチウイルス形質導入または非ウイルスTCR置換のいずれかを通じて)、形質導入またはエレクトロポレーション後に10日間増大させ、凍結した。バルク編集された集団を用い(図7b～c)、またはNY-ESO-1 TCR+で選別された集団(図7d～f)を用いた。腫瘍播種後7日の時点で、T細胞を融解し、眼窩後部注射により養子移入した。図7Bに示されるように、5×106個のバルクの非ウイルス標的指向型T細胞(約10%のTCR+ NYESO-1+(赤色)、約10%のTCR+ NYESO-1-(橙色)、および約80%のTCR- NYESO-1-(緑色)、図7bを参照のこと)の移入から2日後、NY-ESO-1+非ウイルス編集T細胞は脾臓と比べて腫瘍に選択的に蓄積していた。4名のヒトT細胞ドナーごとにn=5のマウス。5×106個のバルク非ウイルス標的指向型CFSE標識T細胞の移入から10日後、NYESO-1 TCR+細胞はTCR-またはTCR+ NYESO-1-T細胞よりも高い増殖を示し、脾臓中よりも腫瘍中で高い増殖(CFSE低)を示した(図7c)。移入後10日の時点で、TCR-およびTCR+NYESO- T細胞を腫瘍内で見つけることは困難であった(図7d)。図7dは、図8fに要約されたデータの縦方向の腫瘍体積の軌跡を示す。レンチウイルス形質導入または非ウイルスTCR置換のいずれかによって作り出された3×106個の選別されたNY-ESO-1 TCR+ T細胞は、腫瘍播種後7日目に移入され、腫瘍播種後24日まで媒体のみの注射と比較された。媒体対照データと同じデータが、レンチウイルス送達(上)および非ウイルスTCR置換(下)と比較して、ドナーごとに示されていることに留意されたい。これらの実験(図7e～f)では、T細胞移入の17日後に、非ウイルス性TCR置換細胞は、より高いNY-ESO-1 TCR発現およびより低い疲弊(exhaustion)マーカー発現を示すように見えた。レンチウイルス形質導入細胞と非ウイルスTCR置換細胞の両方の移入により、24日目に腫瘍負荷の有意な低減が示された。この実験モデルでは、非ウイルスTCR置換により、レンチウイルス形質導入と比較してさらなる低減が示された(図8f)。平均(図7b、7e、7f)および標準偏差(図7b)有りのドナーあたりマウス5匹(図7b、7c)または7匹(図7d～f)でのn=4 (図7b)、n=2 (図7d～f)、またはn=1 (図7c)の独立した健常ドナー。
腫瘍抗原特異的機能
標的指向型ヒトT細胞の腫瘍抗原特異的機能も評価した。標的指向型T細胞を2つの異なるNY-ESO-1+黒色腫細胞株M257およびM407と共培養した場合に、改変されたT細胞はIFN-γおよびTNF-αを強力かつ特異的に産生し、T細胞脱顆粒を誘導した(CD107a表面発現によって測定された)(図8a)。サイトカイン産生および脱顆粒は、NY-ESO-1 TCR T細胞が同族のNY-ESO-1ペプチドを提示するために必要とされる適切なHLA-A＊0201クラスI MHC対立遺伝子を発現する細胞株に曝露された場合にのみ発生した。CD8+およびCD4+ T細胞応答は両方とも健常なドナー間で一貫しており、NY-ESO-1 TCRがガンマレトロウイルスにより形質導入され、ウイルスプロモーターを用いて異種発現された同じ健常ドナーからのT細胞の応答に匹敵していた(図8aおよび図9d)。NY-ESO-1 TCRノックインT細胞は陽性対照のレトロウイルスで形質導入されたT細胞と同様の速度で、インビトロにおいて標的M257-HLA-A＊0201がん細胞を急速に死滅させた(図8b)。死滅は、NY-ESO-1抗原およびHLA-A＊0201対立遺伝子を発現する標的細胞に対して選択的であり、ドナー間で一貫しており、的確なgRNAおよびHDR鋳型の両方を用いて改変されたT細胞に依存していた(図9h～k)。
最後に、非ウイルスゲノムターゲッティングを用いて、大きな規模でNY-ESO-1 TCR細胞を作り出せること、およびこれらの細胞がインビボ抗腫瘍機能を有することが確認された(図8cおよび図7a)。ノックイン効率は、同等のサイズのAAV鋳型におけるよりも非ウイルスターゲッティングにおいて低かったことを考慮して、養子細胞療法のためにNY-ESO-1陽性細胞の数が十分かどうかを確認した。6名の健常ドナーからの1億個のT細胞は、10日間の増大後に、ドナーあたり平均3億8500万個のNY-ESO-1 TCR T細胞をもたらした(図8d)。NY-ESO-1 TCRノックインT細胞は、陽性対照のレンチウイルス形質導入T細胞と同様に、脾臓ではなく腫瘍内に選択的に局在化し、存続し、増殖した(図8eおよび図7b～f)。選別されたNY-ESO-1 TCR T細胞の養子移入も、処置された動物の腫瘍負荷を低減した(図8f)。

Claims (36)

  1. 内因性T細胞受容体アルファサブユニット定常遺伝子(TRAC)、および
    内因性T細胞受容体ベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)
    の一方または両方に非ウイルス的に挿入された、少なくとも1つの異種遺伝子を含む少なくとも1つの核酸配列
    を含む、単離された初代ヒトT細胞であって、
    該少なくとも1つの異種遺伝子が、(1)異種ヒトT細胞受容体アルファ(TCR-α)鎖遺伝子の可変領域、および(2)異種ヒトT細胞受容体ベータ(TCR-β)鎖遺伝子の可変領域の少なくとも1つを含む、
    単離された初代ヒトT細胞。
  2. 前記少なくとも1つの核酸配列をT細胞に導入するためのウイルスベクターを含まない、請求項1記載のT細胞。
  3. 内因性T細胞受容体アルファサブユニット定常遺伝子(TRAC)、および
    内因性T細胞受容体ベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)
    の一方または両方に挿入された、少なくとも1つの異種遺伝子を含む少なくとも1つの核酸配列
    を含む、単離された初代ヒトT細胞であって、
    該少なくとも1つの異種遺伝子が、(1)異種ヒトT細胞受容体アルファ(TCR-α)鎖遺伝子の可変領域、および(2)異種ヒトT細胞受容体ベータ(TCR-β)鎖遺伝子の可変領域の少なくとも1つを含み、かつ
    該T細胞が、該少なくとも1つの核酸配列をT細胞に導入するためのウイルスベクターを含まない、
    単離された初代ヒトT細胞。
  4. 前記少なくとも1つの核酸配列が、少なくとも1.5 kbのサイズである、請求項1～3のいずれか一項記載のT細胞。
  5. 前記少なくとも1つの核酸配列が、少なくとも500 bpのサイズである、請求項1～4のいずれか一項記載のT細胞。
  6. 前記少なくとも1つの核酸配列が、TRACのエクソン1、エクソン2、またはエクソン3中に挿入されている、請求項1～5のいずれか一項記載のT細胞。
  7. 前記少なくとも1つの核酸配列が、TRBCのエクソン1、エクソン2、またはエクソン3中に挿入されている、請求項1～6のいずれか一項記載のT細胞。
  8. CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞である、請求項1～7のいずれか一項記載のT細胞。
  9. 前記少なくとも1つの異種遺伝子が、
    (1)(a)異種T細胞受容体アルファ(TCR-α)鎖遺伝子の可変領域、または(b)異種T細胞受容体アルファ(TCR-α)鎖遺伝子の可変領域および定常領域、ならびに
    (2)(a)異種T細胞受容体ベータ(TCR-β)鎖遺伝子の可変領域、または(b)異種T細胞受容体ベータ(TCR-β)鎖遺伝子の可変領域および定常領域
    の少なくとも一方を含む、請求項1～8のいずれか一項記載のT細胞。
  10. 前記少なくとも1つの異種遺伝子が、
    (1)(a)異種T細胞受容体アルファ(TCR-α)鎖遺伝子の可変領域、または(b)異種T細胞受容体アルファ(TCR-α)鎖遺伝子の可変領域および定常領域、ならびに
    (2)(a)異種T細胞受容体ベータ(TCR-β)鎖遺伝子の可変領域、または(b)異種T細胞受容体ベータ(TCR-β)鎖遺伝子の可変領域および定常領域
    のそれぞれを含む、請求項9記載のT細胞。
  11. (1)(a)異種TCR-α鎖遺伝子の可変領域、または(b)異種TCR-α鎖遺伝子の可変領域および定常領域、ならびに
    (2)(a)異種TCR-β鎖遺伝子の可変領域、または(b)異種TCR-β鎖遺伝子の可変領域および定常領域
    のそれぞれを含む、請求項1～10のいずれか一項記載のT細胞。
  12. 発現された場合に、異種TCR-α鎖と異種TCR-βが抗原特異的T細胞受容体(TCR)を形成する、請求項11記載のT細胞。
  13. 異種TCR-α鎖遺伝子と異種TCR-β鎖遺伝子とが、リンカー配列によって機能的に連結されている、請求項11または12記載のT細胞。
  14. 前記リンカー配列が、切断可能なリンカー配列またはマルチシストロニック要素である、請求項13記載のT細胞。
  15. 異種TCR-α鎖遺伝子および異種TCR-β鎖遺伝子が、TRACに挿入されている、請求項13または14記載のT細胞。
  16. 前記少なくとも1つの異種遺伝子の発現が、内因性プロモーターによって制御される、請求項1～15のいずれか一項記載のT細胞。
  17. 細胞における内因性TRACおよび内因性TRBCの一方または両方の発現が、対照T細胞と比べて低減されており、該対照T細胞が、非ウイルス挿入がない初代ヒトT細胞である、請求項1～16のいずれか一項記載のT細胞。
  18. 請求項1～17のいずれか一項記載の初代ヒトT細胞の単離された集団であって、該集団中の初代ヒトT細胞の少なくとも20%のゲノムが、前記少なくとも1つの核酸配列を含む、単離された集団。
  19. 内因性T細胞受容体アルファサブユニット定常遺伝子(TRAC)、および
    内因性T細胞受容体ベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)
    の一方または両方に非ウイルス的に挿入された、少なくとも1つの異種遺伝子を含む少なくとも1つの核酸配列
    を含む、改変初代ヒトT細胞であって、該少なくとも1つの異種遺伝子が、癌に発現されている標的抗原に特異的に結合する少なくとも1つの抗原特異的受容体をコードし、かつ該少なくとも1つの異種遺伝子が、(1)異種ヒトT細胞受容体アルファ(TCR-α)鎖遺伝子の可変領域、および(2)異種ヒトT細胞受容体ベータ(TCR-β)鎖遺伝子の可変領域の少なくとも1つを含む、改変初代ヒトT細胞
    を含む、標的抗原を発現する癌を有する対象を治療するための医薬。
  20. 前記改変ヒトT細胞が、ウイルスベクターを含まない、請求項19記載の医薬。
  21. 前記少なくとも1つの核酸配列が、少なくとも1.5 kbのサイズである、請求項19または20記載の医薬。
  22. 前記少なくとも1つの核酸配列が、T細胞受容体アルファサブユニット定常遺伝子(TRAC)のエクソンまたはT細胞受容体ベータサブユニット定常遺伝子(TRBC)のエクソンに非ウイルス的に挿入されている、請求項19～21のいずれか一項記載の医薬。
  23. 前記少なくとも1つの核酸配列が、少なくとも500 bpのサイズである、請求項19～22のいずれか一項記載の医薬。
  24. 前記少なくとも1つの異種遺伝子が、
    (1)(a)異種T細胞受容体アルファ(TCR-α)鎖の可変領域、または(b)異種TCR-α鎖の可変領域および定常領域、ならびに
    (2)(a)異種T細胞受容体ベータ(TCR-β)鎖の可変領域、または(b)異種TCR-β鎖の可変領域および定常領域
    の少なくとも一方を含む、請求項19～23のいずれか一項記載の医薬。
  25. 前記少なくとも1つの異種遺伝子が、
    (1)(a)異種TCR-α鎖の可変領域、または(b)異種TCR-α鎖の可変領域および定常領域、ならびに
    (2)(a)異種TCR-β鎖の可変領域、または(b)異種TCR-β鎖の可変領域および定常領域
    のそれぞれを含む、請求項24記載の医薬。
  26. 異種TCR-α鎖および異種TCR-β鎖の1つまたは複数のコード配列が、リンカー配列またはマルチシストロニック要素によって連結されている、請求項25記載の医薬。
  27. 前記リンカー配列が、切断されて異種TCR-α鎖遺伝子および異種TCR-β鎖遺伝子を生じる切断可能なリンカー配列である、請求項26記載の医薬。
  28. 前記異種遺伝子が、TCR-α鎖および異種TCR-β鎖をコードし、該異種遺伝子がTRACに挿入されている、請求項26または27記載の医薬。
  29. 前記少なくとも1つの異種遺伝子が非ウイルス的に内因性TRACに挿入されており、該少なくとも1つの異種遺伝子が、
    (1)(a)異種TCR-α鎖の可変領域、または(b)異種TCR-α鎖の可変領域および定常領域、ならびに
    (2)(a)異種TCR-β鎖の可変領域、または(b)異種TCR-β鎖の可変領域および定常領域
    のそれぞれを含み、
    該異種TCR-α鎖および異種TCR-β鎖が、切断されて異種TCR-α鎖および異種TCR-β鎖を生じる切断可能なリンカー配列によって機能的に連結されており、かつ
    該異種TCR-α鎖および異種TCR-βが、癌に発現されている標的抗原を認識する抗原特異的T細胞受容体(TCR)を形成する、
    請求項19～28のいずれか一項記載の医薬。
  30. 前記少なくとも1つの異種遺伝子の発現が、内因性プロモーターの制御下にある、請求項19～29のいずれか一項記載の医薬。
  31. 前記改変ヒトT細胞が、CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞である、請求項19～30のいずれか一項記載の医薬。
  32. 前記CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞が、エフェクターT細胞またはナイーブT細胞である、請求項31記載の医薬。
  33. 初代ヒトT細胞が、癌を有する対象から得られたものであり、かつ対象への改変初代ヒトT細胞の投与前に、少なくとも1つの異種遺伝子を含む少なくとも1つの核酸配列を含むように改変されたものである、請求項19～32のいずれか一項記載の医薬。
  34. 前記改変ヒトT細胞が、癌に発現されている標的抗原に特異的に結合する受容体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子の発現を可能にする条件下で培養されたものである、請求項19～33のいずれか一項記載の医薬。
  35. 前記改変ヒトT細胞が、該改変ヒトT細胞を増殖させるのに有効な条件下で培養されたものである、請求項34記載の医薬。
  36. 前記受容体を発現する改変ヒトT細胞が、精製されたものである、請求項19～35のいずれか一項記載の医薬。
JP2020523254A 2017-10-27 2018-10-29 内因性ｔ細胞受容体の標的置換 Active JP7101419B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022103225A JP2022137112A (ja) 2017-10-27 2022-06-28 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
JP2024152864A JP2024174943A (ja) 2017-10-27 2024-09-05 内因性ｔ細胞受容体の標的置換

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762578153P 2017-10-27 2017-10-27
US62/578,153 2017-10-27
PCT/US2018/058026 WO2019084552A1 (en) 2017-10-27 2018-10-29 TARGETED REPLACEMENT OF ENDOGENIC T CELL RECEPTORS

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022103225A Division JP2022137112A (ja) 2017-10-27 2022-06-28 内因性ｔ細胞受容体の標的置換

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2021500889A JP2021500889A (ja) 2021-01-14
JP2021500889A5 JP2021500889A5 (ja) 2021-12-09
JP7101419B2 true JP7101419B2 (ja) 2022-07-15

Family

ID=66247037

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020523254A Active JP7101419B2 (ja) 2017-10-27 2018-10-29 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
JP2022103225A Ceased JP2022137112A (ja) 2017-10-27 2022-06-28 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
JP2024152864A Pending JP2024174943A (ja) 2017-10-27 2024-09-05 内因性ｔ細胞受容体の標的置換

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022103225A Ceased JP2022137112A (ja) 2017-10-27 2022-06-28 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
JP2024152864A Pending JP2024174943A (ja) 2017-10-27 2024-09-05 内因性ｔ細胞受容体の標的置換

Country Status (13)

Country Link
US (6) US11033584B2 (ja)
EP (1) EP3700924A4 (ja)
JP (3) JP7101419B2 (ja)
KR (2) KR102770787B1 (ja)
CN (2) CN118581047A (ja)
AU (2) AU2018355587B2 (ja)
CA (1) CA3080415A1 (ja)
EA (1) EA202091056A1 (ja)
IL (2) IL305485B2 (ja)
MX (1) MX2020004325A (ja)
MY (1) MY201694A (ja)
SG (1) SG11202003798TA (ja)
WO (1) WO2019084552A1 (ja)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019015188A (es) 2017-06-15 2020-08-03 Univ California Inserciones de adn no virales orientadas.
JP7101419B2 (ja) 2017-10-27 2022-07-15 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
CN117904055A (zh) 2017-10-30 2024-04-19 派克特制药公司 原代细胞基因编辑
SG11202009761YA (en) 2018-04-02 2020-10-29 Pact Pharma Inc Peptide-mhc compacts
EP3775237A1 (en) * 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics, Inc. T cells expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
US20210207174A1 (en) * 2018-05-25 2021-07-08 The Regents Of The University Of California Genetic engineering of endogenous proteins
SG11202108613RA (en) 2019-02-12 2021-09-29 Pact Pharma Inc Compositions and methods for identification of antigen specific t cells
EP4010463A4 (en) * 2019-08-05 2024-05-08 Cartherics Pty. Ltd. IMMUNE CELLS EXPRESSING MODIFIED CELL RECEPTORS AND METHOD FOR THE PRODUCTION
EP3808765A1 (en) * 2019-10-14 2021-04-21 ETH Zurich Cell line for tcr discovery and engineering and methods of use thereof
CN114901812A (zh) * 2019-11-14 2022-08-12 国立大学法人广岛大学 使用环状dna将抗原特异性受体基因导入至t细胞基因组的方法
BR112022018218A2 (pt) * 2020-03-13 2022-12-20 Univ California Composições e métodos para modificar um ácido nucleico alvo
US20240060089A1 (en) * 2020-08-27 2024-02-22 Tmunity Therapeutics Inc. Vector-free process for manufacture of engineered immune cells
CA3179545A1 (en) * 2020-10-02 2022-04-07 The Regents Of The University Of California Dna constructs for improved t cell immunotherapy of cancer
KR20240099259A (ko) 2021-10-14 2024-06-28 아스널 바이오사이언시스, 인크. 공동 발현된 shrna 및 논리 게이트 시스템을 갖는 면역 세포
EP4479067A2 (en) * 2022-02-14 2024-12-25 The Regents Of The University Of California Dna constructs for improved t cell immunotherapy
TW202417626A (zh) 2022-09-13 2024-05-01 美商亞森諾生物科學公司 具有共表現的ｔｇｆｂｒ ｓｈｒｎａ之免疫細胞
WO2024059824A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations
AU2023395989A1 (en) 2022-12-16 2025-07-24 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptors binding hpv-16 epitopes
JP2026504480A (ja) * 2023-02-03 2026-02-05 アフィニ‐ティ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｋｒａｓ結合タンパク質と内在性ｔｃｒのノックアウトとを有する宿主細胞、およびその使用方法
WO2024182219A1 (en) 2023-02-27 2024-09-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Therapeutic t cell receptors targeting kras g12d
JP2026507228A (ja) 2023-03-03 2026-02-27 アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｐｓｍａ及びｃａ９を標的とするシステム
TW202436346A (zh) 2023-03-13 2024-09-16 美商亞森諾生物科學公司 合成路徑活化劑
WO2025193663A2 (en) * 2024-03-11 2025-09-18 Affini-T Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating neoplasia
WO2025199346A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Arsenal Biosciences, Inc. Antigen binding proteins that bind tmprss4 and methods of use thereof
TW202544044A (zh) 2024-03-20 2025-11-16 美商亞森諾生物科學公司 靶向ｓｌｃ３４ａ２及ｔｍｐｒｓｓ４之系統及其使用方法
WO2026055342A1 (en) 2024-09-04 2026-03-12 Arsenal Biosciences, Inc. Synthetic pathway activators

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014153470A2 (en) 2013-03-21 2014-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
WO2017106528A2 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6773669B1 (en) 1995-03-10 2004-08-10 Maxcyte, Inc. Flow electroporation chamber and method
US6090617A (en) 1996-12-05 2000-07-18 Entremed, Inc. Flow electroporation chamber with electrodes having a crystalline metal nitride coating
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
WO2001083751A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for binding an exogenous molecule to cellular chromatin
US7029916B2 (en) 2001-02-21 2006-04-18 Maxcyte, Inc. Apparatus and method for flow electroporation of biological samples
MXPA03009622A (es) 2001-04-23 2005-03-07 Amaxa Gmbh Solucion amortiguadora para electroporacion y metodo que comprende el uso de la misma.
WO2003018751A2 (en) 2001-08-22 2003-03-06 Maxcyte, Inc. Apparatus and method for electroporation of biological samples
US20050136040A1 (en) 2001-10-11 2005-06-23 Imperial College Innovations Limited Control of gene expression using a complex of an oligonucleotide and a regulatory peptide
GB0124391D0 (en) 2001-10-11 2001-11-28 Gene Expression Technologies L Control of gene expression
EP1504092B2 (en) 2002-03-21 2014-06-25 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
ITMI20030821A1 (it) 2003-04-18 2004-10-19 Internat Ct For Genetic En Gineering And Polipeptidi chimerici e loro uso.
US20060182736A1 (en) 2003-06-10 2006-08-17 Kim Jin-Soo Transducible dna-binding proteins
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
ES2294757T3 (es) 2004-03-15 2008-04-01 Amaxa Ag Recipiente y dispositivo para generar campos electricos en espacios de reaccion individuales.
KR101301929B1 (ko) 2004-05-12 2013-09-02 맥스시티 인코포레이티드 조절된 유동 전기 천공 챔버에 관한 방법 및 장치
EP1766004B1 (en) 2004-06-12 2016-08-31 Invitrogen Singapore Pte. Ltd. Electroporator having an elongated hollow member
EP1607484B1 (de) 2004-06-14 2014-04-02 Lonza Cologne GmbH Verfahren und Schaltungsanordnung zur Behandlung von biologischem Material
EP1774036A4 (en) 2004-06-14 2008-10-15 Univ Texas At Austin GEN-TARGETING IN EUKARYOTIC CELLS BY GROUP II INTRON-RIBONUCLEOPROTEIN PARTICLES
US7991559B2 (en) 2004-11-30 2011-08-02 Maxcyte Inc. Computerized electroporation
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
CA2619833C (en) 2005-08-26 2017-05-09 Danisco A/S Use of crispr associated genes (cas)
CA2660485C (en) 2006-08-11 2016-04-12 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
JP5779090B2 (ja) 2008-04-09 2015-09-16 マックスサイト インコーポレーティッド 新規に単離された細胞の治療組成物の操作および送達
EP2310500B1 (en) 2008-07-18 2015-03-11 Maxcyte, Inc. Methods for optimizing electroporation
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US9221886B2 (en) 2009-04-28 2015-12-29 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
US8956828B2 (en) * 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
EP3456826B1 (en) 2009-12-10 2023-06-28 Regents of the University of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
KR101880536B1 (ko) 2010-04-26 2018-07-23 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 로사 좌위의 게놈 편집
US8876458B2 (en) 2011-01-25 2014-11-04 United Technologies Corporation Blade outer air seal assembly and support
WO2013074916A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US20130236504A1 (en) 2012-03-06 2013-09-12 Medical University Of South Carolina Delivery System for Enhancing Drug Efficacy
PL4289948T3 (pl) 2012-05-25 2025-06-02 The Regents Of The University Of California Sposoby i kompozycje do modyfikacji kierowanego na rna docelowego dna i do nakierowanej na rna modulacji transkrypcji
EP2912175B1 (en) 2012-10-23 2018-08-22 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
CN105142669B (zh) 2012-12-06 2018-07-03 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基于crispr的基因组修饰和调控
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN105658796B (zh) 2012-12-12 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP4282970A3 (en) 2012-12-17 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
IL289396B2 (en) 2013-03-15 2023-12-01 The General Hospital Coporation Using truncated guide rnas (tru-grnas) to increase specificity for rna-guided genome editing
SG11201506991VA (en) * 2013-03-15 2015-10-29 Adaptive Biotechnologies Corp Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
WO2014161821A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in eukaryotes
ES2883131T3 (es) 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
US9890393B2 (en) * 2013-05-29 2018-02-13 Cellectis Methods for engineering T cells for immunotherapy by using RNA-guided CAS nuclease system
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US10822606B2 (en) 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
CN105899665B (zh) 2013-10-17 2019-10-22 桑格摩生物科学股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物
CA2930590C (en) 2013-11-15 2021-02-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineering neural stem cells using homologous recombination
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
JP2017501149A (ja) 2013-12-12 2017-01-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 粒子送達構成成分を用いた障害及び疾患の標的化のためのｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
EP3653229A1 (en) 2013-12-12 2020-05-20 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
WO2015086795A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Cellectis Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering
JP2017510542A (ja) 2014-01-31 2017-04-13 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 核酸生成及び送達のための方法及び製品
WO2015115903A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Site-specific dna break-induced genome editing using engineered nucleases
US20170175128A1 (en) 2014-04-18 2017-06-22 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
US10570418B2 (en) 2014-09-02 2020-02-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification
WO2016044745A1 (en) * 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
US9879283B2 (en) 2014-10-09 2018-01-30 Life Technologies Corporation CRISPR oligonucleotides and gene editing
AU2015339743C1 (en) 2014-10-31 2021-04-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Altering gene expression in modified T cells and uses thereof
WO2016097751A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
JP2018509387A (ja) 2015-01-21 2018-04-05 フェーズアールエックス インコーポレイテッド 細胞に治療および診断剤を送達するための方法、組成物、ならびにシステム
JP6886404B2 (ja) 2015-01-30 2021-06-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 初代造血細胞におけるタンパク質送達
US12129471B2 (en) 2015-02-23 2024-10-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
WO2016172359A2 (en) 2015-04-24 2016-10-27 The Regents Of The University Of California Systems for detecting, monitoring or treating diseases or conditions using engineered cells and methods for making and using them
MX2017015239A (es) 2015-05-29 2018-02-19 Juno Therapeutics Inc Composicion y metodos para regular interacciones inhibitorias en celulas geneticamente modificadas.
AU2016278959A1 (en) 2015-06-17 2018-01-18 The Uab Research Foundation CRISPR/Cas9 complex for introducing a functional polypeptide into cells of blood cell lineage
JP2018518182A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
US20170000743A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Vindico NanoBio Technology Inc. Compositions and Methods for Delivery of Gene Editing Tools Using Polymeric Vesicles
AU2016291778B2 (en) 2015-07-13 2021-05-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017035659A1 (en) 2015-09-01 2017-03-09 The Hospital For Sick Children Method and compositions for removing duplicated copy number variations (cnvs) for genetic disorders and related uses
EP3347374A1 (en) * 2015-09-09 2018-07-18 Immune Design Corp. Ny-eso-1 specific tcrs and methods of use thereof
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
WO2017058751A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
DK3359660T3 (en) * 2015-10-05 2020-02-17 Prec Biosciences Inc Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human t cell receptor alpha constant region gene
DK3359184T3 (da) * 2015-10-05 2020-06-15 Prec Biosciences Inc Genetisk modificerede celler, der omfatter et modificeret gen fra konstant alfaregion i human t-cellereceptor
US20180327706A1 (en) 2015-10-19 2018-11-15 The Methodist Hospital Crispr-cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation
CN108368522A (zh) 2015-10-20 2018-08-03 10X 基因组学有限公司 用于高通量单细胞遗传操作的方法和系统
WO2017070429A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Regents Of The University Of Minnesota Methods involving editing polynucleotides that encode t cell receptor
AU2016349504B2 (en) 2015-11-04 2023-02-09 Fate Therapeutics, Inc. Genomic engineering of pluripotent cells
EP4163374A1 (en) 2015-11-23 2023-04-12 The Regents of the University of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
EP3397760A2 (en) 2015-12-30 2018-11-07 Avectas Limited Vector-free delivery of gene editing proteins and compositions to cells and tissues
RU2018135819A (ru) * 2016-03-11 2020-04-13 Блубёрд Био, Инк. Иммунные эффекторные клетки с отредактированным геномом
CA3020330A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor t cell compositions
EP4711465A2 (en) 2016-04-14 2026-03-18 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
US10188749B2 (en) 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
SG11201808831TA (en) * 2016-04-15 2018-11-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
US11248216B2 (en) 2016-04-25 2022-02-15 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for genomic editing
IL262409B2 (en) 2016-04-29 2025-12-01 Basf Plant Science Co Gmbh Improved methods for modification of target nucleic acids
US20190136224A1 (en) 2016-05-31 2019-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Hydrodynamically Controlled Electric Fields for High Throughput Transformation & High Throughput Parallel Transformation Platform
US11713458B2 (en) 2016-06-20 2023-08-01 Octapharma Ag Means and methods for modifying multiple alleles
CN110312799A (zh) 2016-08-17 2019-10-08 博德研究所 新型crispr酶和系统
US11999931B2 (en) 2016-08-20 2024-06-04 The Regents Of The University Of California High-throughput system and method for the temporary permeabilization of cells
CN118909050A (zh) 2016-10-12 2024-11-08 费尔丹生物公司 用于将多肽负荷递送至靶真核细胞的合理设计的合成肽穿梭剂，其用途、方法和试剂盒
WO2018073393A2 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Tal-effector nuclease (talen) -modified allogenic cells suitable for therapy
WO2018073391A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Targeted gene insertion for improved immune cells therapy
EP3541937A4 (en) 2016-11-18 2020-06-24 Christopher Bradley REPAIR OF MASSIVELY MULTIPLEXED HOMOLOGICAL TEMPLATE FOR FULL GENERATION
CA3045134A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery
AU2017388874A1 (en) 2016-12-30 2019-07-18 Berkeley Lights, Inc. Methods for selection and generation of genome edited T cells
MX2019015188A (es) 2017-06-15 2020-08-03 Univ California Inserciones de adn no virales orientadas.
JP7101419B2 (ja) * 2017-10-27 2022-07-15 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
CN117904055A (zh) 2017-10-30 2024-04-19 派克特制药公司 原代细胞基因编辑

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014153470A2 (en) 2013-03-21 2014-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
WO2017106528A2 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NATURE，2021年03月02日，Vol.543，p.113-117
PNAS，2015年，Vol.112，p.10437-10442

Also Published As

Publication number Publication date
IL305485A (en) 2023-10-01
JP2021500889A (ja) 2021-01-14
KR20200088348A (ko) 2020-07-22
BR112020008201A2 (pt) 2020-10-06
KR102770787B1 (ko) 2025-02-19
KR20230034416A (ko) 2023-03-09
US20220241336A1 (en) 2022-08-04
JP2022137112A (ja) 2022-09-21
AU2023202582A1 (en) 2023-05-18
US11033584B2 (en) 2021-06-15
KR102503130B1 (ko) 2023-02-24
IL305485B1 (en) 2025-06-01
WO2019084552A1 (en) 2019-05-02
MX2020004325A (es) 2020-11-09
AU2018355587B2 (en) 2023-02-02
US20210228631A1 (en) 2021-07-29
SG11202003798TA (en) 2020-05-28
IL274179B1 (en) 2023-10-01
IL274179A (en) 2020-06-30
IL274179B2 (en) 2024-02-01
US20210353678A1 (en) 2021-11-18
EP3700924A1 (en) 2020-09-02
CA3080415A1 (en) 2019-05-02
MY201694A (en) 2024-03-13
EA202091056A1 (ru) 2020-09-17
US11590171B2 (en) 2023-02-28
AU2023202582B2 (en) 2026-01-08
US20230310502A1 (en) 2023-10-05
US20200000851A1 (en) 2020-01-02
AU2018355587A1 (en) 2020-06-18
CN118581047A (zh) 2024-09-03
JP2024174943A (ja) 2024-12-17
IL305485B2 (en) 2025-10-01
EP3700924A4 (en) 2021-11-03
US12398193B2 (en) 2025-08-26
CN111655719A (zh) 2020-09-11
US20250361287A1 (en) 2025-11-27
US11083753B1 (en) 2021-08-10
US11331346B2 (en) 2022-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7101419B2 (ja) 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
JP2022519595A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子標的の組み合わせ
JP2021518162A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
JP2021518161A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
JP2021518161A6 (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
JP2021518160A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
CN111093679A (zh) 用于条件调控基因表达的方法和系统
KR20190075019A (ko) 조작된 면역조절요소 및 이에 의해 변형된 면역 활성
KR20200018645A (ko) 표적화된 비-바이러스 dna 삽입
KR20170106486A (ko) 일차 조혈 세포에서의 단백질 전달
JP2022519070A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
EA050071B1 (ru) Направленная замена эндогенных т-клеточных рецепторов
HK40115874A (zh) 内源性t细胞受体的靶向置换
TW202542303A (zh) 經工程改造之ｔ細胞
HK40037128A (en) Targeted replacement of endogenous t cell receptors
BR112020008201B1 (pt) Método in vitro ou ex vivo para edição do genoma de uma célula t humana primária, composição, população de células t, e uso de uma célula t

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200629

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200608

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211028

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20211028

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20211028

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20211206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220307

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220520

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220530

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220628

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7101419

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250