CN108368522A - 用于高通量单细胞遗传操作的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本文提供用于将核酸操作剂引入到单细胞中的方法和系统。核酸操作试剂到单细胞中的这种高通量递送和随后对此类细胞的遗传操作允许大规模遗传分析，所述大规模遗传分析可用于例如研究生物途径和药物靶标发现。

Description

用于高通量单细胞遗传操作的方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年10月20日提交的美国临时申请号62/243,917的权益，所述临时申请特此出于所有目的以引用的方式整体并入。

发明背景

开发核酸操作试剂的进展已经允许靶细胞中的核酸(例如，DNA和RNA)的简单且有效的操作。诸如单干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)的RNA干扰(RNAi)试剂允许具有适当互补序列的靶RNA的裂解、降解和/或翻译阻抑。CRISPR试剂的开发提供了DNA编码的、RNA介导的DNA或RNA靶向序列特异性靶向。CRISPR系统可用于产生小插入或缺失，所述插入或缺失在靶核酸中引起有效和失活性突变。此外，CRISPR试剂也被用于将供体DNA精确插入到靶细胞基因组中。这种核酸操作试剂使研究人员能够精确地操作特定基因组元件，并且有助于生物学和疾病中靶核酸的功能阐明。

核酸操作试剂对于在高通量应用如全基因组突变筛选、药物靶标发现以及用于研究和商业目的的转基因细胞和生物体的大规模生产中使用具有巨大潜力。然而，随着开发用于高通量目的的新型核酸操作试剂，还需要开发用于将这些试剂高通量引入到细胞中的系统和方法。标准阵列筛选方法需要将细胞和核酸操作试剂以每孔单一试剂排列到多孔板中。这种筛选通常需要使用自动化处理许多板的特殊设施。因此，这些核酸操作试剂的大规模应用可能是昂贵且耗时的过程。因此，需要用于高通量递送核酸操作试剂的新的系统和方法。

发明概述

本文提供用于将试剂递送到个别细胞中的组合物、系统和方法。

在第一方面，本文提供一种将试剂递送到个别细胞中的方法。这种方法包括但不限于以下步骤：(a)提供多个胶囊，其中所述胶囊包含用于改变细胞中的至少一种基因产物的表达的试剂；(b)将所述胶囊递送到离散分区中，其中所述离散分区还包括个别细胞；以及(c)引起所述胶囊在使所述个别细胞能够摄取所述试剂的条件下将所述胶囊的内容物释放到所述离散分区中，从而将所述试剂递送到所述个别细胞中。

在一些实施方案中并且根据上文，所述用于改变至少一种基因产物的表达的试剂包含：(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR系统引导RNA与所述个别细胞内的DNA分子中的靶序列杂交；以及(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶或RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组分(i)和(ii)位于相同或不同的载体上，并且所述RNA引导的核酸酶和所述引导RNA不一起天然存在。

在一个示例性实施方案中，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶的核苷酸序列。在这样的实施方案中，所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子，由此改变所述至少一种基因产物的表达。在一些实施方案中，所述用于改变基因表达的试剂还包含在由所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子后插入到所述DNA分子中的供体核酸。

在另一个示例性实施方案中，所述第二调控元件可操作地连接至编码去活化的RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述去活化的RNA引导的核酸酶干扰编码所述至少一种基因产物的核酸的转录，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

在又一个示例性实施方案中，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述RNA引导的核酸酶融合蛋白干扰所述至少一种基因产物的表达，由此改变所述至少一种基因产物的表达。在一些情况下，所述RNA引导的核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和转录活化因子或转录阻抑物。在一些情况下，所述核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和表观遗传修饰因子。

在某些实施方案中并且根据上文，所述RNA引导的核酸酶是Cas9蛋白或Cpf1蛋白。

在某些实施方案中并且根据上文，所述胶囊被配置为在施加刺激时释放其内容物。在一些实施方案中，所述刺激是选自化学刺激、电刺激、热刺激、磁刺激、pH值的变化、离子浓度的变化、二硫键的还原、光刺激以及其组合。在一些实施方案中，所述刺激是热刺激。

在其他实施方案中并且根据上文中的任一项，所述多个胶囊包含约100至100,000种用于改变至少一种基因产物的表达的不同的试剂，以使得不同的个别细胞接受不同的试剂。

在其他实施方案中并且根据上文中的任一项，所述胶囊还包含一种或多种用于所述胶囊或其内容物与所述个别细胞的相容性的添加剂。在一些实施方案中，所述一种或多种添加剂包括转染剂。

在某些实施方案中并且根据上文中的任一项，所述用于改变至少一种基因产物的表达的试剂还包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含核酸条形码序列。在这些实施方案的一些中，不同的个体细胞接收不同的核酸条形码序列。

在一些实施方案中，所述用于改变上文所述的至少一种基因产物的表达的试剂还包含一对Cas9切口酶或Cas9融合蛋白，与当使用RNA引导的核酸酶时相比，所述Cas9切口酶或Cas9融合蛋白改善所述CRISPR系统的特异性。

在某些实施方案中并且根据上文中的任一项，所述靶序列在所述细胞基因组内具有很少或没有亲缘关系。

在其他实施方案中并且根据上文中的任一项，所述用于改变至少一种基因产物的表达的试剂还包含通过抑制参与非同源末端连接(NHEJ)途径的基因来增加所述细胞中同源重组的频率的试剂。在一些实施方案中，这些试剂包含用所述编码CRISPR系统引导RNA的至少一个核苷酸序列编码的Cas9核酸酶或无核酸酶的Cas9蛋白。

在其他实施方案中并且根据上文中的任一项，所述引导RNA还包含与所述细胞基因组内的靶向原型间隔区序列相同的间隔区。

在另一个示例性实施方案中并且根据上文中的任一项，所述第一和第二调控元件中的一个或两个是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是选自由以下各项组成的组：光诱导型启动子、热诱导型启动子和化学诱导型启动子。

在第二方面，本文提供一种用于将试剂递送至细胞的方法。这种方法包括但不限于以下步骤：(a)提供可释放地偶联至微胶囊的所述试剂；(b)将所述微胶囊分离成离散分区，其中所述离散分区还包括个别细胞；以及(c)在使所述试剂能够摄取到所述细胞中的条件下释放所述试剂。

在此第二方面的一些实施方案中，所述试剂包含编码RNA引导的核酸酶、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)或能够与所述细胞的DNA分子中的一个或多个靶序列杂交的CRISPR引导RNA中的至少一种的载体，以及一种或多种条件诱导型启动子。在某些实施方案中，所述试剂包含：(i)在真核细胞中可操作的第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR系统引导RNA与所述细胞内的靶序列杂交；以及(ii)可在真核细胞中操作的第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，组分(i)和(ii)位于相同或不同的载体上，并且所述RNA引导的核酸酶和所述引导RNA不一起天然存在。

在此第二方面的示例性实施方案中，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子，由此改变所述至少一种基因产物的表达。在一些实施方案中，所述用于改变基因表达的试剂还包含在由所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子后插入到所述DNA分子中的供体核酸。

在此第二方面的另一个示例性实施方案中，所述第二调控元件可操作地连接至编码去活化的RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述去活化的RNA引导的核酸酶干扰编码所述至少一种基因产物的核酸的转录，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

在此第二方面的又一个示例性实施方案中，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述RNA引导的核酸酶融合蛋白干扰所述至少一种基因产物的表达，由此改变所述至少一种基因产物的表达。在一些实施方案中，所述RNA引导的核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和转录活化因子或转录阻抑物。在某些实施方案中，所述核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和表观遗传修饰因子。

在此第二方面的一些实施方案中，所述RNA引导的核酸酶是Cas9蛋白。在其他实施方案中，所述RNA引导的核酸酶是Cpfl蛋白。在一些实施方案中，所述载体能够稳定整合到所述细胞的基因组中。

在其他实施方案中，所述释放步骤包括向所述微胶囊施加刺激以释放所述试剂。在一些实施方案中，所述刺激是选自化学刺激、电刺激、热刺激、磁刺激、pH值的变化、离子浓度的变化、二硫键的还原、光刺激以及其组合。

在一些实施方案中，通过电穿孔促进所述试剂摄取到所述细胞中。

在其他实施方案中，所述微胶囊还包含一种或多种添加剂以改善所述试剂摄取到所述细胞中的相容性。在一些实施方案中，所述一种或多种添加剂包括转染剂。

在一些实施方案中，所述微胶囊包含选自乳液中的微滴和交联聚合物的成员。

在其他实施方案中，所述微胶囊包含珠粒。在某些实施方案中，所述珠粒是凝胶珠粒。

在其他实施方案中，所述微胶囊还包含可释放地与其偶联的核酸条形码序列的群体，其中所述条形码序列基本上全部包含相同的条形码序列。在一些实施方案中，所述条形码序列还包含发夹序列。

在其他实施方案中，所述试剂还包含一对Cas9切口酶或Cas9融合蛋白，与当使用RNA引导的核酸酶时相比，所述Cas9切口酶或Cas9融合蛋白改善所述CRISPR系统的特异性。

在第三方面，本文提供一种用于改变多个细胞中的基因表达的方法。所述方法包括但不限于以下步骤：(a)提供多个胶囊，其中胶囊包含用于改变至少一种基因产物的表达的试剂，所述试剂包含工程化的、非天然存在的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统；(b)将所述胶囊递送到含有个别细胞的离散分区中；(c)提供刺激以引起所述胶囊在使得试剂被递送到所述个别细胞中的条件下释放其内容物。在一些实施方案中，所述CRISPR系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR-Cas系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR-Cas系统引导RNA能够与所述细胞的DNA分子中的靶序列杂交；以及(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，其中组分(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上。在此方面，继施加所述刺激之后，所述引导RNA与所述靶序列杂交，并且所述RNA引导的核酸酶裂解含有所述靶序列的所述DNA分子，由此改变所述至少一种基因产物的表达。在此方面的一些实施方案中，所述用于改变基因表达的试剂还包含在由所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子后插入到所述DNA分子中的供体核酸。

在第四方面，本文提供一种用于改变多个细胞中的基因表达的方法。所述方法包括但不限于以下步骤：(a)提供多个胶囊，其中胶囊包含用于改变至少一种基因产物的表达的试剂，所述试剂包含工程化的、非天然存在的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统；(b)将所述胶囊递送到含有个别细胞的离散分区中；(c)提供刺激以引起所述胶囊在使得试剂被递送到所述个别细胞中的条件下释放其内容物。在一些实施方案中，所述CRISPR系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR-Cas系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR-Cas系统引导RNA能够与所述细胞的DNA分子中的靶序列杂交；以及(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码去活化的RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，其中组分(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上。在此方面，继施加所述刺激之后，所述引导RNA与所述靶序列杂交，并且所述去活化的RNA引导的核酸酶干扰编码所述至少一种基因产物的核酸的转录，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

在第五方面，本文提供一种用于改变多个细胞中的基因表达的方法。所述方法包括但不限于以下步骤：(a)提供多个胶囊，其中胶囊包含用于改变至少一种基因产物的表达的试剂，所述试剂包含工程化的、非天然存在的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统；(b)将所述胶囊递送到含有个别细胞的离散分区中；(c)提供刺激以引起所述胶囊在使得试剂被递送到所述个别细胞中的条件下释放其内容物。在一些实施方案中，所述CRISPR系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR-Cas系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR-Cas系统引导RNA能够与所述细胞的DNA分子中的靶序列杂交；以及(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列，其中组分(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上。在此方面，继施加所述刺激之后，所述引导RNA与所述靶序列杂交，并且所述RNA引导的核酸酶融合蛋白干扰所述至少一种基因产物的表达，由此改变所述至少一种基因产物的表达。在一些实施方案中，所述RNA引导的核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和转录活化因子或转录阻抑物。在某些实施方案中，所述核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和表观遗传修饰因子。

在第三、第四和第五方面的一些实施方案中，所述RNA引导的核酸酶是Cas9蛋白或Cpf1蛋白。

在第三、第四和第五方面的一些实施方案中，所述不同的胶囊包含能够与所述个别细胞内的不同靶序列杂交的引导RNA，以使得不同基因产物的表达在不同细胞中改变。

在其他实施方案中，所述多个胶囊包括约500至约100,000个胶囊。在一些实施方案中，所述多个胶囊包括约10,000至约50,000个胶囊。在其他实施方案中，所述多个胶囊包括约15,000至约30,000个胶囊，其中仅将单个胶囊递送到每个离散分区中。

在其他实施方案中，所述胶囊包含乳液中的微滴。在其他实施方案中，所述胶囊包含聚合物凝胶。在一些实施方案中，所述聚合物凝胶是聚丙烯酰胺。在其他实施方案中，所述胶囊包含凝胶珠粒。

附图简述

图1提供用于将核酸操作试剂递送到包含单细胞的分区中的微流体装置的示意性图示，如本文所描述。

I.综述

本公开提供适用于将试剂递送到单细胞中的方法、组合物和系统。具体地说，本文提供的方法、组合物和系统允许高通量递送用于操作个别细胞中的一种或多种靶核酸的试剂。在一些情况下，此类核酸操作试剂改变由靶核酸编码的基因产物的表达。核酸操作试剂到单细胞中的这种高通量递送和随后对此类细胞的遗传操作允许大规模遗传分析，所述大规模遗传分析可用于例如研究生物途径和药物靶标发现。此外，这种高通量基因编辑可促进遗传植物和动物的生产以及基于细胞的治疗剂的开发。

一般来说，本文提供一种用于将核酸操作试剂递送到个别细胞中的方法。所述方法包括提供多个胶囊的步骤，每个胶囊携带用于个别细胞中的核酸操作的试剂。所提供的胶囊被递送到包括一种或多种细胞的离散分区中。在将胶囊递送到包括细胞的分区中之后，通常通过使用刺激来使所述胶囊将其内容物释放到所述离散分区中。在摄取试剂(例如，转染试剂或电穿孔缓冲液)存在下，核酸操作试剂被细胞吸收。

在从胶囊中释放后，核酸操作试剂可使用任何合适的方法被单细胞吸收。例如，细胞可进行电穿孔，其中电穿孔的细胞能够在电穿孔缓冲液存在下吸收用于改变基因产物表达的试剂。在另一种情况下，可使用转染试剂来允许转染用于改变基因产物表达的试剂。基于病毒的系统也可用于将核酸操作试剂引入单细胞中。

本文描述的胶囊充当用于将用于靶核酸的核酸操作的合适试剂递送到分区中的细胞(例如，单细胞)的载体。此类试剂适用于例如改变基因产物的表达。改变基因产物的表达的试剂可通过作用于目标基因的编码区或通过作用于目标基因的非编码调控区(例如，增强子或启动子)而改变表达。此类试剂可通过增加或减少基因产物的表达来改变基因产物的表达。

在主题方法中使用的试剂可允许一种特定靶核酸(即DNA或RNA)的高通量操作或允许高通量改变单细胞中的多种不同靶核酸的表达。在需要改变多种不同靶核酸的情况下，多种不同的靶核酸可在单细胞内改变，或者单一靶核酸可在单细胞内改变，这取决于每个胶囊所包含的试剂。例如，与主题方法一起使用的多个胶囊可含有约100至10,000种用于改变至少一种基因产物的表达的不同的试剂，以使得不同的个别细胞接受不同的试剂。

用于操作靶核酸的任何合适的试剂可与本文提供的系统和方法一起使用。示例性试剂包括但不限于锌指核酸酶；转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)；重新工程化的归巢核酸酶；RNA干扰(RNAi)试剂和成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas核酸酶系统。

在一些情况下，与主题方法和系统一起使用的核酸操作试剂包括CRISPR系统试剂。此类试剂包括例如，编码核酸酶的核酸，如RNA引导的核酸酶(例如，Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶)；以及编码指导RNA(gRNA)的核酸。用于主题方法和系统中的示例性CRISPR系统试剂和方法在本文中进一步详细地描述，并且也是本领域中已知的，例如在Shalem等人，Nature Reviews Genetics 16：299-311(2013)；Zhang等人，Human Molecular Genetics23(R1)：R40-6(2014)；以及Zhu等人Cell 157：1262-1278(2014)中，所述文献出于所有目的并且特别是关于与CRISPR系统试剂相关的所有教义以引用的方式整体并入本文。

在示例性CRISPR系统中，通过gRNA序列与基因组靶序列的互补序列之间的碱基配对来将gRNA/RNA引导的核酸酶复合物募集至基因组靶序列。为了成功结合RNA引导的核酸酶，基因组靶序列通常必须在靶序列之后紧接着含有正确的原型间隔子邻近基序(PAM)序列(了解更多关于PAM序列的信息)。gRNA/RNA引导的核酸酶复合物的结合将RNA引导的核酸酶定位于基因组靶序列，以使得RNA引导的核酸酶可在靶序列处裂解两条DNA链，从而导致双链断裂(DSB)。可与本文提供的方法和系统一起使用的RNA引导的核酸酶包括但不限于Cas9核酸酶和Cpfl核酸酶。

这种DSB随后可通过(1)非同源末端连接(NHEJ)DNA修复途径或(2)同源性定向修复(HDR)途径来修复。NHEJ修复途径通常在DSB位点处产生插入/缺失(插入缺失)，所述插入/缺失导致移码和/或提前终止密码子，从而有效地破坏靶基因的开放阅读框(ORF)。例如，这种类型的基因组改变例如对于功能缺失基因功能研究是有用的。HDR路径需要存在修复模板，所述修复模板用于修复DSB。可通过使用具有修复核酸模板的HDR将特定核苷酸变化引入到靶基因中。例如，可使用HDR途径来引入功能获得突变或修饰调控元件。

与主题系统和方法一起使用的RNA引导的核酸酶取决于所需的基因改变的特定类型。例如，RNA引导的核酸酶可以是诱导型RNA引导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)，所述核酸酶被优化用于以时间或细胞类型依赖性方式表达。也可以使用表现出提高特异性的突变型Cas9核酸酶(参见，例如，Ann Ran等人Cell 154(6)1380-89(2013)，所述文献出于所有目的并且特别是关于与突变型Cas核酸酶有关的所有教义以引用的方式整体并入本文)。此外，去活化的RNA引导的核酸酶(即，无核酸酶的)可用作影响靶位点处的基因表达的其他蛋白质的归槽装置(例如，转录阻抑物或活化因子)。

与主题系统和方法一起使用的引导RNA(gRNA)可靶向编码区或调控性非编码区(例如，增强子和启动子)。所使用的gRNA的数量和类型取决于本文所述的系统和方法的应用。例如，所述系统和方法可用于大规模诱变，其使用含有靶向多个不同的靶序列的多个引导RNA的引导RNA文库。所述系统和方法还可用于使用一种特异性gRNA在大量的一种特定细胞类型或许多不同类型的细胞中引入一种特定改变。例如，可使用特定gRNA来校正疾病功能缺失基因或使与显性阴性病症相关的疾病基因失活。

在需要引入特定等位基因或突变的应用中，核酸操作试剂还包括包含所述特定等位基因突变的同源修复模板核酸。同源修复模板核酸在通过HDR途径修复Cas诱导的DSB时将特定等位基因突变引入细胞的基因组中。在一些情况下，同源修复模板用于将特异性突变引入野生型细胞中。在其他情况下，同源修复模板用于将野生型等位基因引入突变细胞(例如，含有与特定疾病相关的突变的细胞)中。同源修复模板还可包括用于鉴定和分选含有特异性突变的细胞的标记，例如如本文所述的核酸或荧光条形码标记。在需要经由同源修复模板核酸引入特异性突变的这类应用中，所述试剂还可包括一种或多种促进HDR途径超过HNEJ修复DSB的试剂。此类试剂包括但不限于抑制参与HNEJ修复的基因的试剂，例如DNA连接酶IV(参见例如，Maruyana等人Nat Biotechnol.33(5)：538-42(2015)，所述文献出于所有目的并且特别是关于与抑制参与HNEJ修复的基因的试剂有关的所有教义以引用的方式整体并入本文。

主题胶囊可以各种不同的方式充当核酸操作试剂的载体。例如，所述试剂可用胶囊包封。此类胶囊可具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障，例如乳液中的微滴。在其他情况下，胶囊可包含交联聚合物或能够夹带和/或保留其基质内的材料的多孔基质。与主题系统和方法一起使用的胶囊还可包含珠粒(例如，凝胶珠粒)，其中本文所述的试剂附着至所述珠粒。

与本文提供的方法和系统一起使用的胶囊被配置为在胶囊被递送或分离到含有个别细胞的离散分区中后施加刺激时释放其内容物(例如，试剂)。个别胶囊可含有用于改变一种基因产物(例如，一种引导RNA)或多于一种基因产物(例如，多于一种引导RNA)的表达的试剂。另外，主题胶囊还可含有有助于将核酸操作试剂递送到细胞中的其他试剂，例如转染试剂。

每个胶囊还可包括允许鉴定和/或分类胶囊的标记。例如，在使用多种不同的试剂和/或细胞类型的应用中，此类标记适用于例如分配或引入含有用于编辑具有特定细胞类型的特定靶序列的试剂的胶囊。合适的标记包括例如本文所述的荧光标记和独特的核酸条形码。

根据主题方法，含有本文所述的试剂的胶囊被“递送"或“分离”到含有个别细胞的离散分区中。如本文所用，“递送"和“分离到......”中可互换使用以描述将含有试剂的胶囊引入含有需要改变基因表达的细胞的分区中的过程。

任何合适的细胞可与本文所述的主题方法和系统一起使用。示例性细胞包括但不限于细菌、植物、酵母和哺乳动物细胞，包括人细胞。取决于主题方法的应用，可使用单细胞类型或多细胞类型。在某些情况下，细胞(例如，干细胞)用于制造基于细胞的疗法。在其他情况下，单细胞阶段的受精胚胎可用于产生转基因动物。

在一些方面，含有进行核酸操作的细胞的隔室或分区包括可在流体流内流动的分区。这些分区可包括例如具有包围内部流体中心或核心的外部屏障的微胶囊或微囊泡，或它们可以是能够夹带和/或保留其基质内的材料的多孔基质。然而，在一些方面，这些分区包括非水连续相(例如油相)内的水性流体的微滴。各种不同的容器在例如美国专利公布号2014/0155295中进行了描述，所述专利的全部公开内容出于所有目的并且特别是关于与根据本发明使用的分区和微滴有关的所有教义以引用的方式整体并入本文。同样地，用于形成非水性或油性连续相中的稳定微滴的乳液系统详细描述于例如美国专利公布号2010/0105112中。

在乳液中的微滴的情况下，将个别细胞分派至离散分区通常可通过以下方式来实现：将细胞于水性流体中的流动流引入非水性流体的流动流中，以使得在两种流的接点处产生微滴。通过以某一细胞浓度水平提供水性含细胞流，可控制所得分区就细胞数目来说的占用水平。在一些情况下，在需要单细胞分区的情况下，可能需要控制流体的相对流速，以使得所述分区平均每个分区含有少于一个细胞，以便确保那些被占用的分区主要是单一占用的。同样地，可能希望控制流速以使得更高百分比的分区被占用，从而例如仅允许较小百分比的未占用分区。在一些方面，控制流量和通道结构以确保所需数目的单一占用分区、低于某一水平的未占用分区以及低于某一水平的多重占用分区。在许多情况下，使用所述系统和方法来确保绝大多数的被占用的分区(含有一个或多个胶囊的分区)每个被占用的分区包括不超过1个细胞。在一些情况下，控制分配过程，以使得少于25％的被占用的分区含有超过一个细胞，并且在许多情况下，少于20％的被占用的分区具有超过一个细胞，而在一些情况下，少于10％或甚至少于5％的被占用的分区每个分区包括超过一个细胞。

在某些情况下，微流体通道网络特别适合用于产生如本文所描述的分区。此类微流体装置的实例包括详细描述于2014年4月4日提交的临时美国专利申请号61/977,804中的那些，所述专利申请的全部公开内容出于所有目的并且特别是关于与微流体装置有关的全部教义以引用的方式整体并入本文。在分配个别细胞时还可采用替代机制，包括多孔膜，细胞的水性混合物穿过所述多孔膜被挤压至非水性流体中。此类系统通常可自例如Nanomi，Inc.获得。

在乳液中的微滴的情况下，将个别细胞分派至离散分区通常可通过以下方式来实现：将细胞于水性流体中的流动流引入非水性流体的流动流中，以使得在两种流的接点处产生微滴。通过以某一细胞浓度水平提供水性含细胞流，可控制所得分区就细胞数目来说的占用水平。在一些情况下，在需要单细胞分区的情况下，可能需要控制流体的相对流速，以使得所述分区平均每个分区含有少于一个细胞，以便确保那些被占用的分区主要是单一占用的。同样地，可能希望控制流速以使得更高百分比的分区被占用，从而例如仅允许较小百分比的未占用分区。在一些方面，控制流量和通道结构以确保所需数目的单一占用分区、低于某一水平的未占用分区以及低于某一水平的多重占用分区。

每个含有细胞的分区还可包括鉴定标记，所述鉴定标记有利地允许鉴定、追踪和分选特定细胞和/或试剂。例如，在采用CRISPR系统和多种细胞类型的系统和方法中，此类鉴定标记可允许某些引导RNA与多种不同细胞类型中的特定细胞类型一起分选并分配。合适的标记可包括例如本文所述的荧光标记和核酸条形码标记。例如，在诱变筛选中，此类条形码也可有助于鉴定与特定表型相关的特定突变。

在将含有试剂的胶囊分离或递送到含有个别细胞的分区中之后，使所述胶囊在使所述细胞能够摄取所述试剂的条件下将其内容物释放到分区中。在一些情况下，使用递送至胶囊的刺激来使所述胶囊释放其内容物。可使用任何合适的刺激来使胶囊释放其内容物。示例性刺激包括但不限于化学刺激、电刺激、热刺激、磁刺激、pH值的变化、离子浓度的变化、二硫键的还原以及光刺激。

一旦试剂从胶囊中释放出来，细胞就吸收核酸操作试剂。通过在分区中包含摄取试剂，例如转染试剂或电穿孔缓冲液，可促进细胞进行的摄取。

含有已经历核酸操作事件的细胞的个别胶囊然后可根据应用进一步分选和分析。例如，在表型筛选中，可将此类细胞置于特定表型的选择条件下，并且可使用任何合适的技术(包括例如荧光、发光和高含量成像技术)来表征具有特定表型的细胞。参见例如，Hasson等人，Nature 504：291-295(2013)；Neumann等人，Nature Methods 3：385-390(2006)；以及Moffat等人，Cell 124：1283-1298(2006)。也可使用合适的测序技术(包括例如下一代测序技术)来分析已经针对特定表型进行选择的细胞中的核酸操作。

在一些情况下，将已经针对特定表型进行选择的个别细胞溶解。这种溶解可在含有具有特定表型的个别细胞的分区内发生，或者可在溶解之前将含有相同表型的细胞合并。在溶解之后，可在本文所述的分区中进行来自所选细胞的mRNA的逆转录以产生单细胞转录组谱。在个别细胞在分区内溶解的情况下，可将用于逆转录的试剂随后引入每个分区中。在逆转录后，对cDNA转录物进行测序以鉴定随时间推移或在暴露于特定条件后与未表现出所需表型的细胞相比，在特定细胞中差异表达的特定转录物。这种差异表达暗示促成特定表型的基因。参见例如，美国专利申请公布号2014/0227684，所述专利申请的全部公开内容出于所有目的并且特别是关于与分配的个别细胞中的逆转录的方法有关的全部教义以引用的方式整体并入本文。

本文提供的主题方法和系统可用于需要高通量改变细胞中的至少一种基因产物的多种应用中。例如，主题方法和系统可用于大规模诱变。例如，对于药物开发、生物途径研究和基因功能研究而言，大规模诱变是有用的。主题方法和系统可用于大量产生转基因植物和动物。主题方法和系统也可用于基于细胞的治疗剂的大规模生产。例如，主题方法可用于产生适用于治疗癌症的具有修饰的嵌合抗原T细胞受体的T细胞。

本文还提供用于递送如上所述的试剂(例如，用于改变至少一种基因产物的表达的试剂)的微流体装置。此类微流体装置可包括用于进行递送过程(如图1中所陈述的那些)的通道网络。

II.工作流程概述

在一个示例性方面，本文所述的方法和系统提供试剂在靶细胞中的高通量递送。具体地说，本文提供的方法和系统用于递送核酸操作试剂。此类核酸操作试剂可用于例如改变由靶核酸编码的基因产物的表达。核酸操作试剂还可用于在特定靶核酸中引入特异性突变，由此产生与野生型对应物不同功能的突变基因产物。

在第一步骤中，提供包括用于编辑靶细胞中的靶核酸的试剂的多个胶囊。用于编辑靶核酸的任何合适的试剂可与本文提供的系统和方法一起使用。

本文提供的系统和方法允许靶细胞中至少一种靶核酸的高通量改变。选择用于修饰的靶核酸在一些情况下可以是在靶细胞基因组内具有很少或没有亲缘关系的序列。不同的靶核酸可位于相同的基因内或位于不同的基因上。另外，靶核酸可涵盖整个基因或基因的部分。在一些情况下，本文提供的主题方法用于多个靶细胞的高通量核酸操作，其中在每个细胞中对一种靶核酸进行操作。在某些情况下，本文提供的主题方法用于操作多个靶细胞，其中每个单细胞操作一种基因产物的表达。在此类实施方案中，在主题方法用于每个单细胞操作一种基因产物的表达的情况下，可在每个单细胞中操作编码基因产物的基因中的多于一种靶核酸。例如，每个单细胞可与靶向同一基因内的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种不同的靶核酸的核酸操作试剂一起分配。

在其他情况下，本文所述的方法用于单细胞中2，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000种或更多种不同靶核酸的高通量改变。在一些情况下，本文描述的方法用于单细胞中2至10、15至25、20至30、35至40、45至55、50至60、65至75、70至80、75至85、80至90、85至95或90至100种不同的靶核酸的高通量改变。

在某些情况下，本文所述的方法用于至少50，100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、1000,000、2000,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、100万、150百万、200万、300万、400万、500万、600万、700万、800万、900万或1000万或更多个单细胞的高通量改变。在某些实施方案中，所述方法用于50至1,000、1,000至5,000、5,000至10,000、10,000至50,000、50,000至100,000、100,00至200,000、200,000至300,000、300,000至400,000、400,000至500,000、500,000至100万、100万至200万、200万至300万、300万至400万、400万至500万、500万至600万、600万至700万、700万至800万、800万至900万或900万至1000万个单细胞或更多的高通量改变。

核酸操作试剂可作用于DNA(例如，CRISPR系统试剂)和/或RNA(例如，RNAi试剂)核酸靶标。本文所述的核酸操作试剂可用于以使得由靶核酸编码的一种或多种基因产物的表达改变的方式改变靶核酸。例如，在一些情况下，核酸操作试剂降低一种或多种基因产物的表达和/或功能。在此类情况下，核酸操作试剂可靶向编码基因产物的区域或控制核酸转录的调控区域。在一些情况下，核酸操作试剂增加一种或多种基因产物的表达。可用于增加基因产物的表达的核酸操作试剂包括靶向影响靶核酸的转录的调控区的那些。在一些情况下，核酸操作试剂通过募集转录阻抑物、活化因子和/或募集结构域起作用，所述转录阻抑物、活化因子和/或募集结构域影响靶位点处的基因表达而不会将不可逆的突变引入靶核酸。在其他情况下，核酸操作试剂用于将新突变引入目标靶基因，以使得与野生型基因产物相比，突变赋予新功能(即功能获得性突变)。本文所述的核酸操作试剂也可用于引入对基因产物的野生型型式有拮抗作用的突变(即，显性失活突变)。

与所提供的主题系统和方法一起使用的合适的试剂核酸操作试剂包括但不限于锌指核酸酶；转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)；重新工程化的归巢核酸酶；RNAi试剂，如小干扰RNA(siRNA)和小发夹RNA(shRNA)；以及成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/RNA引导核酸酶系统。核酸操作试剂可例如以编码试剂的表达质粒、编码试剂的mRNA或编码试剂的病毒载体的形式递送至单细胞的分区。

在一些情况下，与主题方法和系统一起使用的靶核酸操作试剂包括CRISPR系统试剂。此类试剂包括例如，编码RNA引导的核酸酶(例如，Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶)的核酸和编码引导RNA(gRNA)的核酸，所述引导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)与反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)的组合。编码RNA引导的核酸酶和引导RNA的核酸可各自可操作地连接至调控元件并且可包含在单一载体上或不同的载体上。所选载体可能能够稳定整合到细胞基因组中。在一些实例中，RNA引导的核酸酶(例如，Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶)和引导RNA不会一起出现在自然界中。用于本发明中的示例性CRISPR系统试剂和方法在本文中进一步详细地描述，例如在Shalem等人，Nature Reviews Genetics 16：299-311(2013)；Zhang等人，，HumanMolecular Genetics 23(R1)：R40-6(2014)；Zetche等人，http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038以及Zhu等人Cell 157：1262-1278(2014)中，所述文献出于所有目的并且特别是关于与CRISPR系统试剂有关的所有教义以引用的方式整体并入本文。

在CRISPR系统中，通过gRNA序列与靶核酸的互补序列之间的碱基配对来将gRNA/RNA引导的核酸酶复合物募集至基因组靶序列。gRNA/RNA引导的核酸酶复合物的结合将RNA引导的核酸酶(例如，Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶)定位于基因组靶序列，以使得野生型核酸酶可切割两条DNA链，从而导致双链断裂(DSB)。

所述DSB可通过(1)非同源末端连接(NHEJ)DNA修复途径或(2)同源性定向修复(HDR)途径来修复。NHEJ修复途径通常在DSB位点处产生插入/缺失(插入缺失)，所述插入/缺失导致移码和/或提前终止密码子，从而有效地破坏靶核酸的开放阅读框(ORF)，从而降低由靶核酸编码的基因产物的表达。此类基因改变例如对于基因功能研究是有用的。HDR路径需要存在修复模板，所述修复模板用于修复DSB。可通过使用具有修复模板的HDR将特定核苷酸变化引入到靶基因中。例如，可使用HDR途径来将功能获得突变或特定点突变引入靶单细胞中。与本文提供的主题方法一起使用的RNA引导的核酸酶可包括与CRIPSR系统相容的任何合适的核酸酶。合适的核酸酶包括但不限于Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas1O、Cbf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb 1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx1O、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、C2c1、C2c2、C2c3、其同源物以及其修饰型式。

与主题系统和方法一起使用的RNA引导的核酸酶取决于所需的基因操作的特定类型。例如，RNA引导的核酸酶可以是诱导型RNA引导的核酸酶，所述核酸酶被优化用于以时间或细胞类型依赖性方式表达。可连接至RNA引导的核酸酶的合适的诱导型启动子包括但不限于光(例如，绿光或蓝光诱导型启动子)、热诱导型启动子(例如，HSP启动子)和化学诱导型启动子(例如，抗生素、铜、醇和类固醇诱导型启动子)。参见例如，Papatriantafyllou等人，Nature Reviews Molecular Cell Biology 13，210(2012)；Yu等人，Protist 163(2)：284-95(2012)；以及Lee等人，Appl Environ Microbiol 76(10)：3089-3096(2010)，所述文献出于所有目的并且特别是关于与诱导型启动子有关的所有教义以引用的方式整体并入本文。示例性启动子包括例如四环素诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、甲硫氨酸诱导型启动子(例如，MET25、MET3启动子)；以及半乳糖诱导型启动子(GAL1、GAL7和GAL 10启动子)。其他合适的启动子包括ADH1和ADH2醇脱氢酶启动子(在葡萄糖中被抑制，当葡萄糖耗尽并且制备乙醇时诱导)、CUP1金属硫蛋白启动子(在Cu²⁺、Zn²⁺存在下诱导)、PHO5启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子以及AOX1启动子。

也可以使用表现出提高特异性的突变型RNA引导的核酸酶(参见，例如，Ann Ran等人Cell 154(6)1380-89(2013)，所述文献出于所有目的并且特别是关于与对靶核酸具有提高的特异性的突变型RNA引导的核酸酶有关的所有教义以引用的方式整体并入本文)。核酸操作试剂还可包括去活化的RNA引导的核酸酶(例，如Cas9(dCas9))。本文提供的去活化的RNA引导的核酸酶可用于不希望在特定靶核酸处切割的应用中。去活化的Cas9与单独的核酸元件的结合可通过空间位阻阻碍RNA聚合酶机制并阻止转录延伸而抑制转录。此外，去活化的Cas可用作其他蛋白的归巢装置(例如，转录阻抑物、活化因子和募集结构域)，所述蛋白质影响靶位点处的基因表达而不会将不可逆的突变引入靶核酸。例如，dCas9可与转录阻抑物结构域如KRAB或SID效应物融合以促进靶位点处的表观遗传沉默。通过与VP16/VP64或p64活化结构域融合，Cas9也可转化为合成转录活化因子。

此类去活化的RNA引导的核酸酶(例如，dCas9)也可用作表观遗传修饰工具的归巢装置。与表观遗传修饰工具融合的去活化的RNA引导的核酸酶可用于修饰组蛋白尾和DNA分子，如组蛋白甲基化和去甲基化、组蛋白乙酰化、胞嘧啶甲基化和羟甲基化。例如，去活化的RNA引导的核酸酶可与DNA甲基转移酶的功能结构域融合以用于靶向CpG启动子位点甲基化。去活化的核酸酶可与表观遗传修饰工具融合以从关键启动子CpG(例如，TET1的氢化酶催化结构域)除去甲基化。参见例如，Falahi等人，Mol.Cancer Res.11：1029-1039(2013)；Mendenhall等人，Nat.Biotechnol.31：1133-1136(2013)；以及Hilton等人，Nat.Biotechnol.33：510-517(2015)，所述文献出于所有目的并且特别是关于与表观遗传修饰工具有关的所有教义以引用的方式整体并入本文。

在使用CRISPR系统试剂的某些情况下，将引导RNA连接至珠粒胶囊(例如，凝胶珠粒)，并且编码RNA引导的核酸酶的核酸以微滴形式携带。在这种情况下，可在与靶细胞一起分配之前将引导RNA和核酸酶分配在一起。或者，可将引导RNA和RNA引导的核酸酶各自直接与靶细胞一起分配。在一些实施方案中，在与靶细胞一起分配之前，将引导RNA和RNA引导的核酸酶分配在一起。在某些实施方案中，在分配RNA引导的核酸酶与靶细胞之前分配引导RNA与靶细胞。在其他实施方案中，在分配引导RNA与靶细胞之前，分配RNA引导的核酸酶与靶细胞。在主题方法的一些情况下，使用珠粒胶囊将引导RNA和RNA引导的核酸酶各自递送至靶细胞。

与主题系统和方法一起使用的引导RNA(gRNA)可使核酸靶向编码区或调控性非编码区(例如，增强子和启动子)。所使用的gRNA的数量和类型取决于本文所述的系统和方法的应用。例如，所述系统和方法可用于大规模诱变，其使用含有靶向多个不同的靶序列的多个gRNA的引导RNA文库。所述系统和方法还可用于使用特异性gRNA在大量的一种特定细胞类型或许多不同类型的细胞中引入一种特定改变。例如，可使用特定gRNA来校正疾病功能缺失基因或使与显性阴性病症相关的疾病基因失活。在一些情况下，仅使用一种特定引导RNA。在一些情况下，使用至少2，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000种不同的引导RNA，每种不同的引导RNA对应于用于改变的不同靶核酸。在一些情况下，使用2至50、50至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、450至500、500至550、550至600、600至650、650至700、700至750、750至800、850至900、900至950以及950至1,000种不同的引导RNA。在其他情况下，使用至少2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000种不同的引导RNA。在一些情况下，使用2,000至3,000、2,500至3,000、3,000至4,000、3,500至4,500、4,000至5,000、4,500至5,500、5,000至6,000、5,500至6,500、6,000至7,000、6,500至7,500、7,000至8,000、7,500至8,500、8,000至9,000、8,500至9,500或9,000至10,000种不同的引导RNA。在使用超过一种引导RNA的情况下，每种不同的引导RNA可与允许鉴定和分类如下所述的引导RNA的不同条形码标签相关联。例如，荧光标记可允许通过荧光细胞分选技术分配特定gRNA与特定单细胞。此类条形码可作为引导RNA的一部分包括或作为携带如下所述的引导RNA的胶囊的一部分包括。在一些情况下，其中细胞与超过一种引导RNA一起分配，待与特定细胞一起分配的所有引导RNA含有相同的条形码。在这类情况下，与不同细胞一起分配的引导RNA含有不同的条形码。此类配置有利地允许引导RNA与特定细胞的分选和分配。此外，此类配置还可有利地允许在核酸操作事件之后追踪和鉴定含有特定核酸操作的细胞。

修复由RNA引导的核酸酶产生的双链断裂可通过易错非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来修复。NHEJ通常产生本质上不可预测的小插入或缺失(插入缺失)，但经常引起靶核酸中有效和失活性突变。相反，HDR途径适用于将供体DNA精确插入到靶核酸中。

在需要使用CRISPR系统引入特异性等位基因(例如，用野生型等位基因替代突变型等位基因或用突变型等位基因替代野生型等位基因)的应用中，核酸操作试剂还可包括含有所述特异性等位基因的同源修复模板核酸。同源修复模板核酸在通过HDR途径修复RNA引导的核酸酶诱导的DSB时将特异性等位基因引入靶细胞的基因组中。同源修复模板还可包括用于鉴定和分选含有特异性突变或等位基因的细胞的标记。在需要经由同源修复模板核酸引入特异性等位基因的这类应用中，所述试剂还可包括一种或多种促进HDR途径超过HNEJ修复DSB的试剂。此类试剂包括但不限于抑制参与HNEJ修复的基因的试剂，例如DNA连接酶IV。参见例如，Maruyana等人Nat Biotechnol.33(5)：538-42(2015)，所述文献出于所有目的并且特别是关于与抑制参与DSB的HNEJ修复的基因的试剂相关的所有教义以引用的方式整体并入本文。

可与本文提供的系统和方法一起使用的其他示例性核酸操作试剂包括通过RNA干扰(RNAi)途径使一种或多种靶基因的表达沉默的试剂，包括但不限于小发夹RNA(shRNA)、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)以及嵌入微小RNA(miRNA)前体中的shRNA(shRNAmir)。

在一些情况下，核酸操作试剂用于在靶核酸中引入可检测标记。所包括的可检测标记的数量取决于方法的应用。如上所述，可检测标记可例如包含于同源修复模板核酸中。在一些情况下，可检测标记用于监测引入靶细胞的基因组中的特定核酸改变。在这类情况下，可使用不同的可检测标记来区分不同的改变(例如，不同的荧光团或核酸序列)。在一些情况下，可能存在超过一种靶向特定靶核酸的试剂(例如，靶向特定基因的重叠区域的多个“分块"gRNA)。在这种情况下，相同的可检测标记可用于靶向相同基因的所有gRNA。可检测标记包括允许非侵入性检测细胞中的特定核酸改变的标记。例如，当用作大规模筛选时，此类可检测标记可有利地允许鉴定与特定目标表型相关的核酸操作。

可检测标记的检测可通过任何合适的方法，包括荧光光谱法或通过其他光学手段进行。在某些情况下，可检测标记是荧光团，所述荧光团在吸收能量之后以限定的波长发射辐射。荧光可检测标记包括例如丹磺酰基官能化的荧光部分(参见例如，Welch等人，Chem.Eur.J.5(3)：951-960(1999))；荧光标记Cy3和Cy5(参见例如，Zhu等人，Cytometry28：206-211(1997))。合适的可检测标记还公开于Prober等人，Science 238：336-341(1987)；Connell等人，BioTechniques5(4)：342-384(1987)；Ansorge等人，Nucl.AcidsRes.15(11)：4593-4602(1987)以及Smith等人，Nature 321：674(1986)中。其他可商购的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明(包括TMR、德克萨斯红和Rox)、alexa、bodipy、吖啶、香豆素、芘、苯并蒽以及花青。

本文所述的核酸操作试剂由胶囊(例如，微胶囊)携带至含有靶细胞的分区。如本文所用，胶囊包括用于携带一种或多种核酸操作试剂的任何合适的容器或固体基质。胶囊包括但不限于孔、微孔、洞、微滴(例如，乳液中的微滴)、斑点和珠粒。在一些情况下，胶囊包括围绕内部流体中心或核心的外部屏障，例如乳液中的微滴。在其他情况下，胶囊可包含交联聚合物或能够夹带和/或保留其基质内的材料的多孔基质。在一些情况下，胶囊是珠粒。合适的珠粒包括例如凝胶珠粒、石蜡珠粒和蜡珠粒。在一些情况下，胶囊是凝胶珠粒。在胶囊是珠粒的一些情况下，核酸操作试剂可释放地偶联至胶囊。例如，在一些情况下，诸如shRNA、siRNA或引导RNA寡核苷酸的核酸操作试剂附着至珠粒。在一些情况下，胶囊是微滴，其中核酸操作试剂被包封在微滴中。

可使用任何合适的方法将核酸操作试剂偶联或固定在珠粒胶囊上。例如，偶联/固定可经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)进行。在一些情况下，将核酸操作试剂偶联/固定至本文所述的凝胶珠粒或任何其他胶囊可以是可逆的，例如像经由不稳定部分(例如，经由化学交联剂，包括本文所述的化学交联剂)。在施加刺激时，不稳定部分可裂解并且固定的试剂释放。在一些情况下，不稳定部分是二硫键。例如，在核酸操作试剂(例如，引导RNA)经由二硫键固定至凝胶珠粒的情况下，使二硫键暴露于还原剂可裂解二硫键并从珠粒中释放核酸操作试剂。

在一些实例中，用于改变一种或多种特定靶核酸(即，核酸操作试剂“组”)的所有核酸操作试剂携带在同一胶囊中。例如，在CRISPR系统与珠粒胶囊结合使用的情况下，编码对特定靶核酸具有特异性的CRISPR引导RNA的寡核苷酸和编码RNA引导的核酸酶的管核苷酸可以可释放地连接至同一殊粒。在一些情况下，可使用多于一种核酸操作试剂来改变由靶核酸编码的产物的表达。例如，可使用“分块"方法，所述方法包括靶向靶核酸长度上的重叠区域的多种试剂(例如，靶向靶核酸中的不同序列的多种gRNA)。在此类实例中，靶向一种特定靶核酸的不同区域的所有不同试剂可由同一胶囊携带。

在一些情况下，一组核酸操作试剂的每种组分(例如，CRISPR引导RNA和RNA引导的核酸酶寡核苷酸)由不同的胶囊携带。在此类方法和系统中，携带不同组分的个别胶囊各自被引入或分离到含有靶细胞的同一分区中，由此分配具有全套“核酸操作试剂”的靶标与靶细胞以允许操作特定靶核酸。在某些实施方案中，引导RNA由珠粒(例如，凝胶珠粒)携带，并且RNA引导的核酸酶使用微滴胶囊携带。

本文提供的主题系统和方法的胶囊还可包括标记以允许在所述方法的一个或多个步骤中鉴定、隔离和分离胶囊。标记包括但不限于荧光标记和寡核苷酸“条形码”。在使用寡核苷酸条形码的情况下，条形码可包含在与编码一种或多种用于改变基因产物表达的试剂(例如，shRNA、siRNA或gRNA)的寡核苷酸相同的寡核苷酸上或在不同的寡核苷酸上。在使用珠粒胶囊的情况下，条形码可直接附着于胶囊。附着于胶囊的条形码(例如，珠粒)可以可释放地连接。各珠粒通常可具备所连接的大量寡核苷酸分子。具体地说，单个珠粒上的条形码分子的数量可以是至少约10,000个条形码分子、至少100,000个条形码分子、至少1,000,000个条形码分子、至少100,000,000个条形码分子、以及在一些情况下至少10亿个条形码分子。

试剂和标记可在向胶囊施加特定刺激之后从胶囊(例如，珠粒)释放。在一些情况下，刺激可以是光刺激，例如通过可释放寡核苷酸的光不稳定性键的裂解。在一些情况下，可使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高可能会导致键联的裂解或寡核苷酸从珠粒的其他释放。在一些情况下，可使用化学刺激，从而裂解寡核苷酸与珠粒的键联，或以其他方式可使得寡核苷酸从珠粒释放。这种类型的系统的实例描述于美国专利公布号2014/0155295，以及2014年2月7日提交的美国临时申请号61/940,318、2014年5月9日提交的美国临时申请号61/991,018、和美国专利公布号2014/0378345，所述专利的全部公开内容出于所有目的并且特别是关于与将寡核苷酸可释放地连接至珠粒的方法有关的全部教义以引用的方式整体并入本文。在一种情况下，此类组合物包括上文关于细胞封装所描述的聚丙烯酰胺基质，并且可通过暴露于还原剂(诸如DTT)而降解以释放所连接的寡核苷酸。在一些情况下，以某种方式和在使胶囊溶解的条件下施加刺激，从而从胶囊释放试剂。

根据本文所述的方法和系统，将包含核酸操作试剂的胶囊递送到或分离到含有个别细胞的离散分区中。如所使用的“递送到......中”和“分离到......中"可互换地用于描述产生包括至少一个细胞和至少一组核酸操作试剂的分区的过程。如本文所用，一“组”核酸操作试剂是指执行细胞中的一种或多种特定靶核酸的编辑所必需的核酸操作试剂。例如，CRISPR系统中的一组核酸操作试剂包括至少一种编码RNA引导的核酸酶的核酸和用于将RNA引导的核酸酶定位至所需靶核酸的引导RNA。一组核酸操作试剂中的试剂可包含在同一胶囊或不同的胶囊中。在一些情况下，核酸操作试剂(例如，shRNA、siRNA或gRNA)连接至珠粒胶囊，其中珠粒被递送到分区中，以使得单个珠子和单个细胞包含在单独的分区内。当单细胞/单组核酸操作试剂占用是最需要的状态时，应了解，经常会存在多重占用分区(就细胞、珠粒或两者来说)，或未占用分区(就细胞、珠粒或两者来说)。在一些情况下，单一分区中携带核酸试剂的细胞与胶囊的比例是10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10。

在使用CRISPR系统核酸操作试剂的一些情况下，引导RNA和RNA引导的核酸酶组分可包含在单独的珠粒上。在这种配置的一些情况下，在特定分区中携带引导RNA的珠粒与携带RNA引导的核酸酶的珠粒的比例是10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10。在这种配置的一些情况下，细胞、携带引导RNA的珠粒和携带RNA引导的核酸酶的珠粒以1∶1∶1的比例存在于分区中。

如本文中所用，分区是指器皿或容器，其可包括多种不同形式，例如孔、管、微孔或纳米孔、通孔等。然而，在优选的方面，分区可在流体流内流动。这些容器可包含例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微胶囊或微囊泡，或它们可以是能够夹带和/或保留其基质内的材料的多孔基质。在一些方面，这些分区可包括非水性连续相(例如油相)内的水性流体的微滴。多种不同的容器例如描述于美国专利公布号2014/0155295中。同样地，用于形成非水性或油性连续相中的稳定微滴的乳液系统详细描述于例如美国专利公布号2010/0105112中。在某些情况下，微流体通道网络特别适合用于产生如本文所描述的分区。此类微流体装置的实例包括详细描述于2014年4月4日提交的临时美国专利申请号61/977,804中的那些，所述专利申请的全部公开内容出于所有目的并且特别是关于与微流体装置有关的全部教义以引用的方式整体并入本文。在分配个别细胞时还可采用替代机制，包括多孔膜，细胞的水性混合物穿过所述多孔膜被挤压至非水性流体中。此类系统通常可自例如Nanomi，Inc.获得。

在乳液中的微滴的情况下，将细胞和携带核酸操作试剂的胶囊分配到离散分区中通常可通过以下方式完成：使水性的含有样品的流流动至接点中，也使分配流体(例如氟化油)的非水性流流动至所述接点中，以使得在流动的流分配流体内形成水性微滴，其中此类微滴包括样品材料。在任何特定分区内细胞和携带核酸操作试剂的胶囊的相对量可通过控制系统的各种不同的参数来调整，所述参数包括例如细胞或携带核酸操作试剂的胶囊在水性流中的浓度、水性流和/或非水性流的流速等。

微流体装置可用于提供细胞和含核酸试剂的胶囊的受控分配。在一些情况下，包括微流体通道结构网络的微流体装置用于将核酸操作试剂和细胞递送到同一分区中。此类微流体装置的实例包括详细描述于2014年4月4日提交的临时美国专利申请号61/977,804中的那些，所述专利申请的全部公开内容出于所有目的并且特别是关于与微流体装置有关的全部教义以引用的方式整体并入本文。

图1中示意性地说明了用于对细胞和包含改变基因表达的试剂寡核苷酸的珠粒进行共分配的微流体通道结构的实例。如本文中所描述，在一些方面，全部被占用的分区中相当大百分比将包括珠粒与细胞两者，并且在一些情况下，所产生的分区中的一些将未被占用。在一些情况下，分区中的一些可具有不是1∶1分配的珠粒和细胞。在一些情况下，可能需要提供多重占用分区，例如在单一分区内含有两个、三个、四个或更多个细胞和/或珠粒。如所示，通道区段102、104、106、108和110在通道接点112处流体连通地设置。使包含个别细胞114的水性流通过通道区段102流向通道接点112。如上文所描述，这些细胞可悬浮于水性流体内，或可在分配过程之前已被预封装。

参考图1，细胞114的水性流通过通道区段102流向通道接点112。同时，包含携带核酸操作试剂的珠粒116的水性流通过通道区段104流向通道接点112。非水性分配流体116从每个侧通道106和108引入通道接点112中，并且合并的流流动到出口通道110中。在通道接点112内，将来自通道区段102和104的两种组合水性流合并在一起，并且分配至微滴218中，所述微滴包括共分配的细胞114和珠粒116。如先前所提到，通过控制在通道接点112处合并的流体中的每一者的流动特征以及控制通道接点的几何结构，可优化组合和分配以在所产生的分区118内实现所需的珠粒、细胞或两者的占用水平。

在一些情况下，在需要单一细胞和/或珠粒分区的情况下，可能需要控制流体的相对流速，以使得分区平均每个分区含有少于一个细胞和/或珠粒，以便确保那些被占用的分区主要是单一占用的。同样地，可能希望控制流速以使得更高百分比的分区被占用，从而例如仅允许较小百分比的未占用分区。在优选的方面，控制流量和通道结构以确保所需数目的单一占用分区、低于某一水平的未占用分区以及低于某一水平的多重占用分区。

微流体通道的数量可取决于特定应用中使用的不同试剂的数量。在用单独胶囊上的两种或更多种核酸操作试剂进行所述方法的一些情况下，所述两种或更多种核酸操作试剂中的每种均经由单独的微流体通道携带于单独的水性流中。这种配置允许控制与每个细胞一起分配的每种单独试剂的量。例如，在使用CRISPR系统的情况下，经由第一通道将引导RNA以第一水性流引入分区中，并经由第二通道将RNA引导的核酸酶(例如，Cas9核酸酶或CpfI核酸酶)以第二水性流引入分区中。在另一个实例中，在使用CRISPR系统的情况下，通过经由同一通道以同一水性流将引导RNA和RNA引导的核酸酶引入到分区中。在一些情况下，携带两种或更多种核酸操作试剂中的每一种的流被合并到分区中，并且携带全套核酸操作试剂的流被递送至含有靶细胞的分区。在其他情况下，携带两种或更多种核酸操作试剂中的流各自被分别递送至含有靶细胞的分区。虽然本文在CRISPR系统的背景下描述了主题系统和方法的某些方面，但本领域技术人员将认识到，其他核酸操作试剂(包括本文所述的那些核酸操作试剂)也可与主题系统和方法结合使用。

例如如本文所描述的通道网络可流体联接至适当的流体部件。例如，入口通道区段(例如通道区段102、104、106以及108)流体联接至它们要递送至通道接点112的适当的材料来源。例如，通道区段102将流体联接至待分析的细胞114的水性悬浮液的来源，而通道区段104将流体联接至携带核酸操作试剂的珠粒116的水性悬浮液的来源。然后，通道区段106和108将流体连接至非水性流体的一个或多个来源。这些来源可包括从微流体装置的本体结构中所限定或与微流体装置的本体结构连接的简单储库到递送来自装置外来源、歧管的流体的流体导管等多种不同流体部件中的任一种。同样地，出口通道区段110可流体联接至所分配的细胞的接收容器或导管。再次，这可以是微流体装置的本体中所限定的储库，或其可以是用于将所分配的细胞递送至后续工艺操作、仪器或部件的流体导管。

在许多情况下，使用所述系统和方法来确保绝大多数的被占用的分区(含有一个或多个微胶囊的分区)每个被占用的分区包括不超过1个靶细胞。在一些情况下，控制分配过程，以使得少于25％的被占用的分区含有超过一个靶细胞，并且在许多情况下，少于20％的被占用的分区具有超过一个靶细胞，而在一些情况下，少于10％或甚至少于5％的被占用的分区每个分区包括超过一个细胞。

另外或或者，在许多情况下，希望避免形成数目过多的空分区。虽然这可通过将足够数目的靶细胞提供至分配区中来实现，但泊松分布(poissonian distribution)预期会增加将包括多个细胞的分区的数目。因此，根据本文所描述的方面，控制被定向至分配区中的一个或多个细胞或其他流体的流量，以使得在许多情况下，不超过50％的所产生的分区未被占用，即包括少于1个靶细胞，不超过25％的所产生的分区、不超过10％的所产生的分区可未被占用。此外，在一些方面，控制这些流量以呈现单一占用分区的非泊松分布，同时提供较低水平的未占用分区。再次陈述，在一些方面，可实现上文所提到的范围的未占用分区，同时仍提供上文所描述的单一占用率中的任一种。举例来说，在许多情况下，使用本文所描述的系统和方法形成具有低于25％、低于20％、低于15％、低于10％并且在许多情况下低于5％的多重占用率的所得分区，同时具有低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％并且在一些情况下低于5％的未占用分区。

如将认识到的，上述占用率也适用于包括靶细胞和携带核酸操作试剂的胶囊两者的分区。具体地说，在一些方面，全部被占用的分区中相当大比例将包括胶囊和细胞两者。具体地说，可能希望使得至少50％的分区被至少一个细胞和至少一组核酸操作试剂占用，或至少75％的分区可被如此占用，或甚至至少80％或至少90％的分区可被如此占用。此外，在需要在分区内提供单一细胞和单组核酸操作试剂的那些情况下，至少50％的分区可被如此占用，至少60％、至少70％、至少80％或甚至至少90％的分区可被如此占用。

虽然上文就提供大体上单一占用的分区进行了描述，但在某些情况下，可能需要提供例如在单一分区内含有两个、三个、四个或更多个细胞和/或胶囊(例如，珠粒)的多重占用分区，所述胶囊包含所述组核酸操作试剂。因此，如上文所提到，可控制含有细胞和/或胶囊(例如，珠粒)的流体和分配流体的流动特征以提供此类多重占用分区。具体地说，可控制流动参数以提供占分区的大于50％、大于75％并且在一些情况下大于80％、90％、95％或更高的占用率。在具体实施方案中，控制流动参数以提供单一细胞和一组用于核酸操作的试剂占分区的大于50％、大于75％并且在一些情况下大于80％、90％、95％或更高的所需多重占用率。

另外，在许多情况下，单个分区内的胶囊可包含与其缔合的不同的核酸操作试剂。例如，在采用CRISPR系统的方法和系统中，第一胶囊可包含第一引导RNA，第二胶囊可包含编码RNA引导的核酸酶的寡核苷酸。在编辑两种或更多种靶核酸的一些情况下，第三胶囊可包含靶所与第一引导RNA不同的核酸的第二引导RNA。在此类情况下，可能有利的是从不同胶囊来源(即含有不同的所缔合的试剂)通过进入共同的通道或微滴产生接点的不同通道入口将不同胶囊引入此类共同的通道或微滴产生接点中。在此类情况下，可控制不同胶囊进入通道或接点的流量和频率以从各来源提供所需比率的微胶囊，同时确保所需配对或组合的此类胶囊进入具有所需数目的细胞的分区。在一个示例性实施方案中，包含不同核酸操作试剂的胶囊以1∶1的比例递送到含有细胞的分区中。

本文所描述的分区的特征经常为具有极小的体积，例如小于10μL、小于5μL、小于1μL、小于900皮升(pL)、小于800pL、小于700pL、小于600pL、小于500pL、小于400pL、小于300pL、小于200pL、小于100pL、小于50pL、小于20pL、小于10pL、小于1pL、小于500纳升(nL)或甚至小于100nL、50nL或甚至更小。

例如，在基于微滴的分区的情况下，微滴可具有小于1000pL、小于900pL、小于800pL、小于700pL、小于600pL、小于500pL、小于400pL、小于300pL、小于200pL、小于100pL、小于50pL、小于20pL、小于10pL或甚至小于1pL的总体积。在与珠粒共分配的情况下，应了解，分区内例如包括共分配的细胞的样品流体体积可以是上文所描述的体积的少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％或甚至为上文所描述的体积的少于10％。

如本文中别处所描述，分配物质可产生分区群体。在此类情况下，可产生任何适当数目的分区以产生分区群体。例如，在本文所描述的方法中，可产生包含至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区或至少约1,000,000,000个分区的分区群体。此外，分区群体可包含未占用的分区(例如空分区)与被占用的分区两者。

除了包含至少一种核酸操作试剂的胶囊之外，还可将一种或多种其他试剂与经历核酸编辑的细胞一起分配。例如，用于辅助将至少一种核酸操作试剂摄取到细胞中的一种或多种试剂。在一些情况下，一种或多种转染试剂与细胞和核酸操作试剂一起分配。在电穿孔用于核酸操作试剂的摄取的情况下，电穿孔缓冲液可包含在经历核酸编辑的细胞分区中。此类另外的试剂可与包含全套核酸操作试剂的胶囊一起分配至细胞或者可与包含核酸操作试剂的胶囊分开递送至细胞。

在分配细胞和含有至少一种核酸操作试剂的胶囊后，使所述胶囊释放核酸操作试剂，从而使个别细胞能够摄取所述试剂。在一些情况下，刺激可以是光刺激，例如通过可释放寡核苷酸的光不稳定性键的裂解。在一些情况下，可使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高可能会导致键联的裂解或寡核苷酸从珠粒的其他释放。在一些情况下，可使用化学刺激，从而裂解寡核苷酸与珠粒的键联，或以其他方式可使得寡核苷酸从珠粒释放。在光或热刺激的情况下，刺激可通过热或光源通过携带分区的微流体通道中的开口引入至含有细胞和核酸操作试剂的分区中。化学刺激可在分配靶细胞和携带核酸操作试剂的胶囊之前与靶细胞一起分配。在这个实例中，核酸操作试剂将仅在靶细胞和化学刺激存在下从胶囊释放。

在从胶囊中释放核酸操作试剂时，细胞对核酸操作试剂的摄取可使用任何合适的方法进行。如本文所提及，可包含一种或多种细胞摄取试剂以有助于将核酸操作试剂摄取到细胞中。在一些情况下，所述一种或多种细胞摄取试剂是转染试剂，包括例如基于聚合物(例如DEAE葡聚糖)的转染试剂和阳离子脂质体介导的转染试剂。细胞的电穿孔也可用于促进核酸操作试剂的摄取。通过施加外部场，诱导细胞中改变的跨膜电位，并且当跨膜电位净值(施加电位差和静息电位差之和)大于阈值时，在膜中产生瞬时渗透结构，并且电穿孔得以实现。参见例如，Gehl等人，Acta Physiol.Scand.177：437-447(2003)。与主题系统和方法一起使用的细胞可在递送核酸操作试剂之前或在分配核酸操作试剂与细胞之后进行电穿孔。在一些情况下，可将电穿孔缓冲液递送到含有核酸操作试剂和靶细胞的分区中以允许靶细胞的电穿孔和核酸试剂的摄取。核酸操作试剂也可通过病毒转导递送到靶细胞中。合适的病毒递送系统包括但不限于腺相关病毒(AAV)逆转录病毒和慢病毒递送系统。此类病毒递送系统在细胞对转染具有抗性的情况下特别有用。在使用病毒传递送系统的情况下，携带试剂(例如，编码所述试剂的核苷酸)的病毒(例如，腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒)可被封装在胶囊中，所述胶囊随后被递送至含有细胞的分区。所述病毒进而在从所述胶囊释放时将试剂从试剂引入单细胞中。使用病毒介导的递送系统的方法还可包括制备编码核酸操作试剂的病毒载体并将所述载体包装到病毒颗粒中的步骤。核酸试剂的其他递送方法包括脂转染、核转染、微注射、基因枪、病毒小体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒颗粒以及核酸的试剂增强摄取。也参见Neiwoehner等人，Nucleic Acids Res.42：1341-1353(2014)，所述文献出于所有目的并且特别是关于与试剂递送系统有关的所有教义以引用的方式整体并入本文。

取决于所需的应用，主题方法的每个分区可包括一种特定细胞类型或不同的细胞类型。例如，主题方法可用于一种特定细胞类型的高通量遗传筛选或含有特定等位基因(例如用野生型等位基因替代特定基因中的突变型等位基因或用突变型等位基因替代野生型等位基因)的细胞类型的大量生产。在一些情况下，主题方法用于表征跨不同细胞类型的基因功能。在一些情况下，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100种或更多种不同的细胞类型与主题方法一起使用。在使用多于一种细胞类型的应用中，单个分区可含有单个细胞、多个相同细胞类型的细胞或多个不同细胞类型的细胞。

本文提供的方法和系统可用于改变真核细胞或原核细胞。真核细胞可以是特定生物体例如哺乳动物(包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类动物)的细胞或来源于它们的细胞。此类细胞可作为来自生物体的血液或组织样品分离，或者可以是建立的细胞系。可与主题系统和方法一起使用的细胞系的实例包括但不限于C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panel、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bc1-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3Swiss、3T3-L1、132-d5胚胎成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1 cells、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHODhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY cells、K562cells、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-MeI 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT细胞系、Peer、PNT-1A/PNT2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2cells、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1细胞系、U373、U87、U937、VCaP、Vero cells、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR以及其转基因品种。细胞系可从本领域技术人员已知的各种来源获得(参见例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassus，Va.))。

取决于方法的应用，已经经历核酸操作事件的细胞可进行进一步加工。在针对特定表型的筛选中，可将细胞置于针对特定表型的筛选条件下并筛选表型。例如，在用于生长突变体的筛选中，可将细胞转移到允许细胞生长的微孔或合适的分区中，并且在确定的一段时间后测定生长的存在或不存在。表型的筛选可使用任何合适的技术进行，所述技术包括例如荧光、发光和高含量成像技术。参见例如，Hasson等人，Nature504：291-295(2013)；Neumann等人，Nature Methods 3：385-390(2006)；以及Moffat等人，Cell 124：1283-1298(2006)。在表型是细胞自主性表型的情况下，可通过细胞分选将表型选择为荧光或细胞表面标记。可归因于所需表型的核酸突变可通过任何合适的方法鉴定。在一些情况下，新一代测序技术可用于确定核酸操作。如本文所讨论的，可检测标记也可用于追踪特定核酸突变。例如，荧光或寡核苷酸“条形码”标签可用于追踪与特定目标表型相关的特定核酸操作。

III.装置、系统和试剂盒

本文还提供用于分配靶细胞与如上所述携带核酸操作试剂的胶囊的微流体装置。此类微流体装置可包括用于进行分配过程(如图1中所陈述的那些)的通道网络。特别有用的微流体装置的实例描述于2014年4月4日提交的美国临时专利申请号61/977,804中。简言之，这些微流体装置可包括用于将细胞分配至单独分区中并且将此类细胞与例如设置于珠粒上的核酸操作试剂共分配的通道网络(诸如本文所描述的那些)。可将这些通道网络设置于固体本体(例如其中限定所述通道的玻璃、半导体或聚合物本体结构)内，其中那些通道在其末端与用于接收各种输入流体以及用于从通道网络的输出最终沉积所分配的细胞等的储库连通。举例来说，并且参考图1，可为流体联接至通道102的储库提供细胞的水性悬浮液114，同时可为联接至通道104的储库提供携带核酸操作试剂的珠粒116的水性悬浮液。可为通道区段106和108提供非水性溶液(例如油)，在通道接点112处将水性流体以微滴形式分配至所述非水性溶液中。最后，可将出口储库流体联接至通道110，可将所分配的细胞和珠粒递送至所述通道中以及从其中收获它们。如应了解，虽然以储库形式进行了描述，但应了解，可将通道区段联接至多种不同流体来源或接收部件(包括管道、歧管)或其他系统的流体部件中的任一种。

还提供通过通道网络例如通过所施加的压力差、离心力、电动泵送、毛细管或重力流等来控制这些流体的流动的系统。

本文还提供用于高通量改变多个靶细胞中的核酸的试剂盒。所述试剂盒可包括一种、两种、三种、四种、五种或更多种直至所有的分配流体，包括水性缓冲液与非水性分配流体或油；如本文所描述可释放地与胶囊(例如，珠粒)缔合的核酸操作试剂；微流体装置；用于核酸操作试剂的细胞摄取的另外试剂；以及关于在本文所描述的方法中使用前述各项中的任一种的说明书。

IV.应用

本文提供的主题系统和方法可用于生产单个细胞的较大群体，所述单个细胞各自携带相同的突变或不同的突变。例如，所述系统和方法可用于进行高通量基因组规模的筛选。此类筛选可用能够干扰靶细胞基因组中的多种靶核酸的文库进行。在使用CRISPR系统的一些情况下，核酸操作试剂包含跨越靶细胞基因组的引导RNA文库。在一些情况下，核酸操作试剂包含10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰或更多种不同的靶向靶细胞基因组中相同数目的不同靶核酸的引导RNA。此类方法可用于例如阳性筛选中以鉴定赋予对药物、毒素或病原体的抗性的微扰。在这类情况下，在细胞经历靶核酸改变后，将药物、毒素或病原体引入到每个含有细胞的分区中。在药物、毒素或病原体存在下继续生长的细胞被归类为含有可归因于靶核酸的改变的保护性突变。鉴定并进一步表征可归因于目标表型的此类靶核酸，例如，使用高通量测序技术(例如，下一代测序技术)，如上文所讨论。

在一些情况下，主题系统和方法用于在选择的压力下进行阴性选择。例如，在一些应用中，针对目标细胞功能，例如延长的生长选择已经经历核酸编辑的细胞。在这类情况下，不能生长的耗竭细胞被分类为携带靶向细胞增殖所必需的核酸的试剂。此类阴性筛选可鉴定选择性地靶向具有已知致癌突变的癌细胞的基因扰动。在这种阴性筛选中鉴定的基因可充当可能的癌症药物靶标。

主题系统和方法也可用于大规模生产含有目标基因改变的细胞。例如，可使用主题系统和方法来高效地创建大量含有已知致癌基因的改变的细胞。随后可使用此类突变细胞来筛选可抑制生长的其他基因。鉴定关键生长的基因是推定药物靶点。在一些情况下，所述方法用于生产在靶核酸中含有影响目标生物途径的突变的细胞。此类细胞随后可用于鉴定生物途径中的其他基因。所述方法也可用于修复目标突变基因。例如，所述方法可用于在从患有与突变型等位基因相关的疾病的受试者分离的细胞中用野生型等位基因替代突变型等位基因。然后可将修复的细胞移植回受试者体内作为用于疾病的治疗的一部分。

主题系统和方法也可用于大规模生产非人转基因动物或植物。在一些情况下，主题方法可用于产生为哺乳动物的转基因动物，如小鼠、大鼠或兔。主题方法还可用于大规模生产含有目标核酸突变的作物，例如抗旱作物。参见例如，Lawlor，64(1)：83-108(2013)，所述文献出于所有目的并且特别是关于与赋予抗旱性的突变有关的所有教义以引用的方式整体并入本文。

本文提供的系统和方法可用于创建可用作疾病模型的植物、动物或细胞。例如，本文提供的主题方法可用于产生可包含与疾病相关的一种或多种靶核酸的修饰的动物或细胞，或其中与疾病相关的一种或多种靶核酸的表达被改变的动物或细胞。此类靶核酸序列可编码疾病相关的蛋白质序列或可以是疾病相关的控制序列。此类疾病模型可用于使用通常用于研究疾病的标准来研究疾病的发展和/或进展。这种疾病模型对于研究药物活性化合物对疾病的影响也是有用的。

实施例

针对肿瘤增强子和抑制基因的全基因组筛选

使用本文提供的系统和方法以及CRISPR/Cas9试剂筛选人KBM7CML细胞的在DNA错配修复(MMR)中起作用的突变。在存在核苷酸类似物6-硫鸟嘌呤(6-TG)的情况下，MMR熟练细胞不能修复6-TG诱导的损伤并停留在G2-M细胞周期检查点处，而MMR缺陷型细胞不能识别损伤并继续分裂。

构建了用于产生全基因组突变的CRISPR/Cas9试剂。构建了含有50,000种不同gRNA的引导RNA(gRNA)文库，所述gRNA靶向超过5,000种不同的KBM7基因。所述gRNA文库对于5,000种基因中的每一种含有10种gRNA。每种gRNA还包括用于鉴定的寡核苷酸条形码序列：靶向相同基因的gRNA具有相同的条形码序列，而靶向不同基因的gRNA具有不同的序列。来自gRNA文库的gRNA化学交联至凝胶珠粒，以使得每个珠粒含有靶向相同基因的gRNA。

使用如在图1中示意性地示出的微流体装置将携带gRNA和Cas9核酸酶的凝胶珠粒引入含有KBM7CML细胞的微滴分区中。产生含有全套CRISPR/Cas9试剂的第一分区，每个第一分区是含有Cas9核酸酶和携带引导RNA的凝胶珠粒的微滴。然后将每个第一分区分配到含有转染试剂的第二分区中。然后将每个第二分区分配到含有单个细胞和溶解凝胶珠粒的化学试剂的第三分区中。在第三分区中，CRISPR/Cas9试剂从珠粒释放并被KBM7细胞吸收，从而允许在KBM7细胞中编辑基因。

然后将来自每个分区的细胞合并并在6-TG存在下生长。在这些条件下能够增殖的细胞可能含有影响MMR的基因的破坏。将这些细胞分离并进行测序以鉴定参与MMR的基因。每个gRNA中包含的独特条形码标识符有助于测序。

本说明书在目前描述的技术的实施例方面提供方法、系统和/或结构以及其用途的完整描述。虽然这种技术的多种方面已经如上在一定程度的具体性上或参考一个或多个独特的方面作了描述，但是本领域技术人员不脱离此技术的精神或范围就能够对公开的方面做大量的改变。因为可以不脱离目前描述的技术的精神和范围而产生许多方面，适当的范围存在于下文附加的权利要求书中。因此涵盖其他方面。此外，应理解的是，除非另外明确地要求或要求语言本身需要特定的顺序，否则任何操作可以以任何顺序进行。希望包括于以上描述和在附图中示出的所有事物只解释为特定方面的说明性的并且不限于示出的实施方案。除非另外从上下文清晰可见或明确说明，否则本文中提供的任何浓度值通常就混合物值或百分数给出，而不考虑添加混合物的特定组分时或之后发生的任何转化。如果尚未明确地并入本文中，那么在本公开中涉及的所有公开的参考文献和专利文件均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。如在以下权利要求书中定义，可进行不脱离本技术的基本要素的细节或结构上的改变。

Claims (60)

1.一种将试剂递送到个别细胞中的方法，所述方法包括：

(a)提供多个胶囊，其中所述胶囊包含用于改变细胞中的至少一种基因产物的表达的试剂；

(b)将所述胶囊递送到离散分区中，其中所述离散分区还包括个别细胞；

(c)引起所述胶囊在使所述个别细胞能够摄取所述试剂的条件下将所述胶囊的内容物释放到所述离散分区中，

从而将所述试剂递送到所述个别细胞中。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述用于改变由DNA分子编码的至少一种基因产物的表达的试剂包含：

(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR系统引导RNA与所述个别细胞内的所述DNA分子中的靶序列杂交，

(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶或RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列。

其中组分(i)和(ii)位于相同或不同的载体上，并且，其中所述RNA引导的核酸酶和所述引导RNA不一起天然存在。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述用于改变基因表达的试剂还包含在由所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子后插入到所述DNA分子中的供体核酸。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述第二调控元件可操作地连接至编码去活化的RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述去活化的RNA引导的核酸酶干扰编码所述至少一种基因产物的核酸的转录，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

6.如权利要求2所述的方法，其中所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述RNA引导的核酸酶融合蛋白干扰所述至少一种基因产物的表达，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和转录活化因子或转录阻抑物。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和表观遗传修饰因子。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas9蛋白或Cpf1蛋白。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述胶囊被配置为在施加刺激时释放其内容物。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述刺激是选自化学刺激、电刺激、热刺激、磁刺激、pH值的变化、离子浓度的变化、二硫键的还原、光刺激以及其组合。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述刺激是热刺激。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述多个胶囊包含约100至100,000种用于改变至少一种基因产物的表达的不同的试剂，以使得不同的个别细胞接受不同的试剂。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述胶囊还包含一种或多种用于所述胶囊或其内容物与所述个别细胞的相容性的添加剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种添加剂包括转染剂。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述用于改变至少一种基因产物的表达的试剂还包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含核酸条形码序列，并且其中不同的个体细胞接收不同的核酸条形码序列。

17.如权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述用于改变至少一种基因产物的表达的试剂还包含一对Cas9切口酶或Cas9融合蛋白，与当使用RNA引导的核酸酶时相比，所述Cas9切口酶或Cas9融合蛋白改善所述CRISPR系统的特异性。

18.如权利要求2至17中任一项所述的方法，其中所述靶序列在所述细胞基因组内具有很少或没有亲缘关系。

19.如权利要求2至18中任一项所述的方法，其中所述用于改变至少一种基因产物的表达的试剂还包含通过抑制参与非同源末端连接(NHEJ)途径的基因来增加所述细胞中同源重组的频率的试剂。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述试剂包含用所述编码CRISPR系统引导RNA的至少一个核苷酸序列编码的Cas9核酸酶或无核酸酶的Cas9蛋白。

21.如权利要求2至20中任一项所述的方法，其中所述引导RNA还包含与所述细胞基因组内的靶向原型间隔区序列相同的间隔区。

22.如权利要求2至21中任一项所述的方法，其中所述第二调控元件是诱导型启动子。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述诱导型启动子是选自由以下各项组成的组：光诱导型启动子、热诱导型启动子和化学诱导型启动子。

24.一种用于将试剂递送至细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供可释放地偶联至微胶囊的所述试剂；

(b)将所述微胶囊分离成离散分区，其中所述离散分区还包括个别细胞；以及

(c)在使所述试剂能够摄取到所述细胞中的条件下释放所述试剂。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述试剂包含编码RNA引导的核酸酶、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)或能够与所述细胞的DNA分子中的一个或多个靶序列杂交的CRISPR引导RNA中的至少一种的载体，以及一种或多种条件诱导型启动子。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述试剂包含：

(i)在真核细胞中可操作的第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR系统引导RNA与所述细胞内的靶序列杂交，

(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶或RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列。

其中组分(i)和(ii)位于相同或不同的载体上，并且，其中所述RNA引导的核酸酶和所述引导RNA不一起天然存在。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述第二调控元件可操作地连接至编码去活化的RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述去活化的RNA引导的核酸酶干扰编码所述至少一种基因产物的核酸的转录，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

29.如权利要求26所述的方法，其中所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列，由此所述引导RNA靶向所述靶序列并且所述RNA引导的核酸酶融合蛋白干扰所述至少一种基因产物的表达，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和转录活化因子或转录阻抑物。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和表观遗传修饰因子。

32.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas9蛋白或Cpf1蛋白。

33.如权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述一种或多种载体能够稳定整合到所述细胞的基因组中。

34.如权利要求24至33所述的方法，其中所述释放步骤包括向所述微胶囊施加刺激以释放所述试剂。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述刺激是选自化学刺激、电刺激、热刺激、磁刺激、pH值的变化、离子浓度的变化、二硫键的还原、光刺激以及其组合。

36.如权利要求24至35中任一项所述的方法，其中通过电穿孔促进所述试剂摄取到所述细胞中。

37.如权利要求24至36中任一项所述的方法，其中所述微胶囊还包含一种或多种添加剂以改善所述试剂摄取到所述细胞中的相容性。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述一种或多种添加剂包括转染试剂。

39.如权利要求24至38中任一项所述的方法，其中所述微胶囊包含选自乳液中的微滴和交联聚合物的成员。

40.如权利要求24至39中任一项所述的方法，其中所述微胶囊包含珠粒。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述珠粒是凝胶珠粒。

42.如权利要求24至42中任一项所述的方法，其中所述微胶囊还包含可释放地与其偶联的核酸条形码序列的群体，其中所述条形码序列基本上全部包含相同的条形码序列。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述条形码序列还包含发夹序列。

44.如权利要求25至43所述的方法，其中所述试剂还包含一对Cas9切口酶或Cas9融合蛋白，与当使用RNA引导的核酸酶时相比，所述Cas9切口酶或Cas9融合蛋白改善所述CRISPR系统的特异性。

45.一种用于改变多个细胞中的基因表达的方法，所述方法包括：

(a)提供多个胶囊，其中胶囊包含用于改变至少一种基因产物的表达的试剂，所述试剂包含工程化的、非天然存在的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统，所述系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：

(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR-Cas系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR-Cas系统引导RNA能够与所述细胞的DNA分子中的靶序列杂交，以及

(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶蛋白的核苷酸序列，其中组分(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上，

(b)将所述胶囊递送到含有个别细胞的离散分区中；

(c)提供刺激以引起所述胶囊在使得试剂被递送到所述个别细胞中的条件下释放其内容物，

其中继施加所述刺激之后，所述引导RNA与所述靶序列杂交，并且所述RNA引导的核酸酶蛋白裂解含有所述靶序列的所述DNA分子，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述用于改变基因表达的试剂还包含在由所述RNA引导的核酸酶裂解所述DNA分子后插入到所述DNA分子中的供体核酸。

47.一种用于改变多个细胞中的基因表达的方法，所述方法包括：

(a)提供多个胶囊，其中胶囊包含用于改变至少一种基因产物的表达的试剂，所述试剂包含工程化的、非天然存在的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统，所述系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：

(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR-Cas系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR-Cas系统引导RNA能够与所述细胞的DNA分子中的靶序列杂交，以及

(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码去活化的RNA引导的核酸酶的核苷酸序列，其中组分(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上，

(b)将所述胶囊递送到含有个别细胞的离散分区中；

(c)提供刺激以引起所述胶囊在使得试剂被递送到所述个别细胞中的条件下释放其内容物，

其中继施加所述刺激之后，所述引导RNA与所述靶序列杂交，并且所述去活化的RNA引导的核酸酶干扰编码所述至少一种基因产物的核酸的转录，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

48.一种用于改变多个细胞中的基因表达的方法，所述方法包括：

(a)提供多个胶囊，其中胶囊包含用于改变至少一种基因产物的表达的试剂，所述试剂包含工程化的、非天然存在的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统，所述系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：

(i)第一调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至至少一个编码CRISPR-Cas系统引导RNA的核苷酸序列，所述CRISPR-Cas系统引导RNA能够与所述细胞的DNA分子中的靶序列杂交，以及

(ii)第二调控元件，所述第二调控元件可操作地连接至编码RNA引导的核酸酶融合蛋白的核苷酸序列，其中组分(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上，

(b)将所述胶囊递送到含有个别细胞的离散分区中；

(c)提供刺激以引起所述胶囊在使得试剂被递送到所述个别细胞中的条件下释放其内容物，

其中继施加所述刺激之后，所述引导RNA与所述靶序列杂交，并且所述RNA引导的核酸酶融合蛋白干扰所述至少一种基因产物的表达，由此改变所述至少一种基因产物的表达。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和转录活化因子或转录阻抑物。

50.如权利要求48所述的方法，其中所述核酸酶融合蛋白包含去活化的RNA引导的核酸酶和表观遗传修饰因子。

51.如权利要求45至50中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas9蛋白或Cpf1蛋白。

52.如权利要求45至51中任一项所述的方法，其中不同的胶囊包含能够与所述个别细胞内的不同靶序列杂交的引导RNA，以使得不同基因产物的表达在不同细胞中改变。

53.如权利要求45至53中任一项所述的方法，其中所述多个胶囊包括约500至约100,000个胶囊。

54.如权利要求45至53中任一项所述的方法，其中所述多个胶囊包括约10,000至约50,000个胶囊。

55.如权利要求45至53中任一项所述的方法，其中所述多个胶囊包括约15,000至约30,000个胶囊。

56.如权利要求45至53中任一项所述的方法，其中仅将单个胶囊递送到每个离散分区中。

57.如权利要求45至56中任一项所述的方法，其中所述胶囊包含乳液中的微滴。

58.如权利要求45至56中任一项所述的方法，其中所述胶囊包含聚合物凝胶。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述聚合物凝胶是聚丙烯酰胺。

60.如权利要求45至56中任一项所述的方法，其中所述胶囊包含凝胶珠粒。