JP2001514510A - 細胞表現型に影響を与える因子をコードする核酸配列を同定するための方法 - Google Patents
細胞表現型に影響を与える因子をコードする核酸配列を同定するための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
細胞表現型に影響を与える核酸配列を同定するための方法が開示される。この方法は、レポーター遺伝子の発現レベルが、レポーター発現のレベルを測定するための方法またはデバイスと関連して表現型と相関するレポーター遺伝子を用いる。発現ライブラリーは、細胞に導入され、そしてレポーター発現レベルにおける変化を示す細胞が選択される。選択された細胞から発現ライブラリーインサートが単離されて、これによって、レポーターによって反映される表現型に影響を与える配列について富化されたサブライブラリーを提供する。さらなる回のサブライブラリー導入および細胞選択を実施して、さらに富化されたサブライブラリーを提供し得る。この方法を用いて同定された配列は、細胞表現型の生成に関与するさらなる分子の同一性を確認にするために用いられ得る。
Description
【発明の詳細な説明】
細胞表現型に影響を与える因子をコードする核酸配列を同定するための方法
関連米国出願のデータ
1997年2月14日に出願された一部継続出願、出願番号08/800,664(「細胞型特
異的シス調節エレメントを同定、特徴付け、および進化させるための方法」、発
明者:Carl Alexander Kamb、およびGiordano M.Caponigro)。
発明の分野
本発明は、実質的に任意の細胞型において、細胞中の特定の生化学経路を撹乱
する核酸配列の同定に適用可能な一般手順を含む。
発明の背景
遺伝的方法は、生物学的現象についての分子的基礎を理解するための努力にお
いて主要な役割を演じてきた。例えば、ショウジョウバエD.melanogastorの遺伝
的分析によって、このハエの身体の形成を調節する多数の遺伝子の単離について
の入門点が提供されてきた。ついで、これらの遺伝子は、脊椎動物の発生の分子
的研究において主要な道具である、哺乳動物ホモログの単離のためのプローブと
して貢献した。
種々の遺伝的研究および生化学的研究によって、実質的に任意の生物学的プロ
セス(すなわち、細胞の挙動など)が成分に分割され得るということが証明され
た。生物学的な探求に対する還元主義的アプローチは、分子間相互作用という相
対的に単純な化学的観点から、生命の複雑さの多くの部分を理解することを目的
とする。20世紀の中頃において、何人かの科学者、おそらくもっとも著名にはGe
orge Beadleは、代謝が、前駆体化合物を最終代謝産物へと変換するために連続
して作用する、一連の酵素として理解され得ることを示した。この洞察は、細胞
プロセスを制御する遺伝的経路または生化学的経路への注目をもたらした。分化
のようなより複雑な細胞の挙動は、最近、遺伝的プログラムおよび経路の観点か
ら規定されてきている。疾患のプロセスでさえ、このような観点で考えられ得る
。例えば、ガンは、細胞増殖制御の欠失によって特徴付けられる疾患である。ガ
ンを研究するための効果的なストラテジーには、細胞増殖調節経路の解明が含ま
れる。増殖制御に関与する多くの遺伝子が規定され、そしてこれらの成分遺伝子
の遺伝的/生化学的回路の理解において実質的な進歩がなされてきた。
いくつかの生物は、遺伝的研究で特に扱いやすい(tractable)。これらの生
物は、代表的に、単細胞性であるか、または短い生活環、小さなゲノム、および
種々の他の有用な特徴を有するかのいずれかである。他の生物(例えば、ヒト)
は、あまり扱いやすくない。扱いやすい実験生物について、変異体の単離に対し
て、2つの基本的なアプローチが利用可能である。第一の方法は、スクリーニン
グと呼ばれ、時に何千もの個々の生物または細胞のクローンの骨の折れる調査を
含む。適切な変異体表現系を有するものが他のものから分離され、そして単離状
態で増殖させる。この様式で、変異体の同質集団が増殖され得、そして分析され
得る。第二のアプローチは、野生型表現型に対して改変体表現型の生存に好まし
い条件下での生物の増殖を含む。微生物の場合、選択条件は、しばしば、栄養要
求性または薬物に対する耐性を含む。
遺伝的研究についての古典的モデルは、E.coli、S.cerevislae、D.melanogast
or、およびM.musculusを含む。これらの生物は、遺伝的研究を容易にする特定の
特徴を共有する。第一に、それらは、対象の表現型改変体(変異体)についてス
クリーニングおよび/または選択するために使用され得る。第二に、それらは、
特定の変異体の表現型を担う根底にある遺伝子が位置付けされ得、そして分子的
クローニング法によって単離され得るように操作され得る。これらの特徴によっ
て、研究中のプロセスについての詳細な生化学的な情報が利用可能ではない場合
における遺伝子の分析が可能になる。手始めに必要なのは、扱いやすい実験生物
および評価または選択され得る表現型ですべてである。
非常に興味深いが、選択的交配という古典的な遺伝的方法が適用され得ない、
ヒトのような特定の生物においてもなお、遺伝的分析を使用して遺伝子を同定す
ることが可能である。この技術は、いくらか異なり、そして対象の形質を分離す
る家系の、遡及的な表現型分析および遺伝型分析を含む。このような家系は、対
象の形質に影響を与える遺伝子のおよその位置を決定するために使用され得る。
このアプローチは、有性生殖、分離、および組換えを含む遺伝の局面に多大に依
存する。おおよそのマッピングの情報から、原因遺伝子がしばしば単離され得る
(Miki Y.、SwensenJ.ら、Science 266:66−71(1994))。
多細胞生物に由来する培養細胞、および単細胞生物は、遺伝的研究が最も単純
な生命単位である細胞において実施されうるという多大な利点を提供する。多く
の微生物において、遺伝的方法は、適切に進歩し、その結果、広範な種々の表現
型形質の詳細な遺伝的分析が可能となる。しかし、ヒトのような他の生物におい
てはなお、培養細胞における遺伝的研究は、非常に困難である。培養された体細
胞は、いくつかの重要なヒト遺伝子の同定に対する経路を提供してきたが、体細
胞は、それらの有用性を重篤に制限する形質を有する。体細胞は、二倍体である
。それゆえ、劣性の表現型を有する変異体は、まれにしか観察されない。体細胞
は、クローン的に再生産される。それゆえ、対象となる変異をマッピングするこ
とが一般には不可能である。体細胞はしばしば不均質である。それゆえ、同一で
あると仮定される細胞集団における各々の細胞は、種々の遺伝的理由および後成
的な理由のために、表現系において別の細胞とはわずかに異なり得る。体細胞は
、それら自身では非常に種々の選択スキームには役立たない。ヒト細胞における
これらの問題を軽減し得る遺伝的方法は特に価値がある。
遺伝子は、生物学において、医学的および商業的に最も重要な過程のいくつか
を調節する。長いリストのヒト疾患は、特定の遺伝子の変異または機能不全によ
って引き起こされる。ガンが最も慣れ親しんだ例であり得る。なぜなら、ガンは
、腫瘍が悪性の段階へ進行するに従って、前がん遺伝子および腫瘍サプレッサー
遺伝子の連続的な変化を含むからである(Fearon E.R.およびVogelstein B.Cel
l 61:759-767(1990))。従って、腫瘍の進行のような重要な生物学的プロセ
スを調節する根底にある遺伝子を同定し得る方法は、非常に価値がある。
上記の理由によって、培養細胞における遺伝的分析の一般的な方法が必要であ
る。この方法は、単純、迅速であるべきであり、そして対象の形質を調節する遺
伝的経路の成分の同定を可能にする。この方法は、特定の細胞および生物におい
て遺伝的分析を阻害してきた障害の多くを回避するはずである。この方法は、特
定の表現型、または特定の細胞の挙動の根底にある機構の詳細な基礎の理解は必
要としないはずである。この方法は、非常に種々の細胞(多細胞生物の体細胞性
組織から培養された細胞を含む)に一般的に適用可能であるはずであり、そして
この方法は、ほとんどの細胞の二倍体の特性、一旦変異が誘導された場合の変異
遺伝子の単離の困難性、および多くの細胞集団の不均質性を含む、体細胞遺伝学
の特定の不利な点を回避するはずである。
発明の要旨
本発明は、対象の形質を調節する遺伝的経路の成分を同定するための、単純、
迅速かつ一般的な方法に対する需要を満たす遺伝的分析の方法に関する。この方
法は、3つの基本的な道具の使用を含む:(1)特定の細胞の表現型の状態を反
映するレポーター遺伝子;(2)細胞ごとに基づいたレポーター分子の発現レベ
ルの迅速な定量測定を可能にする選択デバイスまたは方法;(および(3)発現
ライブラリ、好ましくはタンパク質、タンパク質フラグメント、またはペプチド
のライブラリー(「撹乱原(perturbagen)」)であって、選択した細胞集団(
宿主細胞)へと導入され得る。レポーター遺伝子は、代表的には、特定のシス調
節性エレメント(この活性が、対象の形質と相関する)の制御下にこれを配置す
る構築物中に含まれる。この構築物は、これが安定に維持され、そして発現され
るように、宿主細胞の集団へと導入される。第二の発現ベクター中に構築された
遺伝子ライブラリーは、レポーター遺伝子構築物を有する宿主細胞中へと導入さ
れる。この第二の発現ライブラリーは、宿主細胞中で撹乱原を生成する。宿主細
胞は、レポーター発現レベルを定量的に検出する方法またはデバイスを用いて分
析される。安定に発現されるレポーターのみを撹乱原なしに含む細胞中に観察さ
れる発現と比較して、減少するかまたは増加するレベルのレポーター遺伝子発現
を有する細胞が選択され、そしてそれらのライブラリーインサートが単離される
。
レポーターは細胞の表現型の代理として作用し、従って、可能な限り近い関連
する表現型の状態を反映するように注意深く選択されねばならない。レポーター
は、内因性遺伝子(好ましくは、細胞表面マーカーをコードし、対象の表現型を
有する細胞によって発現される)であり得るか、またはそれは、研究中の細胞に
おいて活性である細胞型特異的プロモーターまたは細胞状態特異的プロモーター
の制御下に配置された外来遺伝子であり得る。レポーターは、宿主細胞中で、そ
の迅速および定量的な決定を可能にするに充分なレベルで発現される。
撹乱原は、トランス優性(transdominant)な様式において、内因性細胞成分
の機能を阻害するように作用する分子である。本発明において、撹乱原は、代表
的にタンパク質性(proteinacious):タンパク質、タンパク質フラグメント、
またはペプチドであるが、撹乱原はまた、核酸であり得る。細胞において撹乱原
を発現させることによって、特定の正常な相互作用を破壊し、従って、変異体表
現型の「表現型模写(phenocopy)」を生成する(すなわち、この方法によって
変異が作製されないが、これらのタンパク質をコードする遺伝子が変異によって
変更されたかのように特定の細胞成分の機能が影響を受ける)ことが可能である
。撹乱原の遺伝子ライブラリーは、単一の型の撹乱原の各々(または、少数の異
なる撹乱原)が宿主細胞中で発現される様式でレポーター発現構築物を有する宿
主細胞中へと導入される。
この選択デバイスまたは方法を使用して、レポーター遺伝子構築物を有する何
百万もの細胞を、変化したレベルのレポーターを発現する改変体について、迅速
にスクリーニングすること、およびこれらの改変体細胞を、正常レベルを発現す
る大部分の細胞から分けて選別(選択)し得る。ついで、変化したレベルのレポ
ーターを発現する、この選択された集団は、例えば、PCR(Ausubel F.M.、Brent
R.ら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、New
York(1996))によって、内在性(resldent)撹乱原を単離するのに使用される
。選択手順によって、レポーター遺伝子発現に影響を与える撹乱原のフラグメン
トを含む細胞についての撹乱原ライブラリーを有する細胞の初期集団の富化がも
たらされる。レポーター遺伝子発現に影響する撹乱原フラグメントのサブライブ
ラリーは、宿主細胞へと再び導入され得、そしてスクリーニング/選択のプロセ
スが繰り返され得る。サイクル全体を、撹乱原コードインサートの比較的純粋な
サブライブラリー(これは、宿主細胞に導入される場合、変化したレポーター遺
伝子発現を生じる)を得るのに必要なだけ多くの回数繰り返す。これらの撹乱原
フ
ラグメントの各々は単離され得、そして個々に研究され得る。
選択は、集団レベルで起こり、そしてさらなる富化サイクルは実施するのに単
純であるので、遺伝子単離に関連する時間が非常に短縮される。さらに、このア
プローチは、本明細書中に記載される方法に従って単離された特定の撹乱原が少
数派の宿主細胞において特有に作用する機会を減少させる。実質的に任意の表現
型についてのスクリーニング/選択が可能であり、これは、レポーターが対象の
細胞表現型をあらわす信頼度によってのみ制限される。
この様式で単離された撹乱原フラグメントは、表現型模写を生成する。すなわ
ち、それらは、遺伝的変異の等価物を生成する。各フラグメントは、レポーター
の発現に影響を与える撹乱原をコードする。原理的には、レポーター遺伝子発現
へと導く遺伝的経路の任意の成分は、撹乱原破壊に対して脆弱である。例えば、
レポーター遺伝子は、特定の転写因子の存在下でのみ発現され得る。撹乱原がこ
の因子を隔離するか、または因子の上流でその活性を減少させるように作用する
場合、レポーター遺伝子発現が減少する。本発明はまた、もとの細胞型が、この
レポーター遺伝子が発現されない異なる細胞型へと変換されるように、表現型の
形質転換を生じる撹乱原破壊が起こるように使用され得る。このような撹乱原は
、マスタースイッチ(細胞の表現型を指令し得る単一の分子)を同定する。
クローニングされた撹乱原をコードする配列は、それが影響を与える経路につ
いての直接および間接の情報を迅速に与え得る。撹乱原が遺伝子または遺伝子フ
ラグメントに由来する場合、それまでに同定された経路の成分に関連し得、そし
てその配列は、その同一性を明らかにし得る。撹乱原の標的は、その経路の第二
の成分(この正体が推測され得る)であり得る。あるいは、標的分子は、酵母の
2ハイブリッドスクリーニング(Fields S.およびSong.O.-K.、米国特許第5,283
,173号を参照のこと)または以下に概説した「サプレッサー」撹乱原方法(Jarv
ik J.およびBotstein、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)72:2738-2742(1975))によっ
てのような当該分野で公知の技術によって同定され得る。従って、何百万もの細
胞について実施されるいくつかの選択実験は、この型の破壊に対して脆弱な特定
の経路の成分のほとんどまたはすべての同定を可能にするはずである。最後に、
これらの成分が商業的に意義深いプロセスに関与する場合、撹乱原は、直接また
は、
スクリーニングのための基質として価値がある試薬を開発する道具を提供する。
本発明の、これらおよび他の特徴、局面、および利点は、以下の説明、添付の
請求の範囲、および添付の図面を参照してより良好に理解される。
図面の説明
図1:撹乱原の図。分子間相互作用の3つの例を示す:第1番目は、細胞内の
2つのネイティブなタンパク質間の複合体;第2番目は、ネイティブなタンパク
質間の相互作用の小分子インヒビターとの間の複合体;および第3番目は、他の
正常な結合パートナーであるネイティブなタンパク質由来のタンパク質フラグメ
ント撹乱原との間の複合体。この撹乱原は、小分子インヒビターに類似した様式
で挙動することが期待される。さらに、撹乱原/標的複合体は、小分子模倣物を
同定するためのスクリーニングを基準として作用する。
図2:発現タンパク質のために、自己蛍光タンパク質(GFPまたはBFP)を融合
パートナーとして使用する、哺乳動物撹乱原発現ベクター。MCSは、個々の配列
または遺伝子ライブラリーの挿入のための複数クローニング部位である。図示さ
れたベクターのいずれも、撹乱原発現ライブラリー構築に使用され得る。
図3:CMVプロモーターからのTATAボックスのみを含み、そしてエンハンサー
を欠如する、「不自由な」プロモーターを有する、哺乳動物細胞のレポーター遺
伝子発現ベクター;シス調節エレメントは、BglIIまたはBamHI部位においてTATA
ボックスの上流に挿入され得る。
図4:本発明に開示される遺伝子分析のプロセスのフローチャート。レポータ
ー発現構築物(この場合、GFP遺伝子)(1)を、選択された宿主細胞に導入し、
そして安定な発現体を選択する(2)。このレポーター発現系列をクローンに拡
大し、集団(この場合、明緑色である)(4)を生成する。撹乱原ライブラリー
(3)を、宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子含有細胞の集団(この多くもま
た、撹乱原を発現する)(5)を生成する。この集団を、フローソーター装置(6
)を使用して試験し、そして細胞を2つの集団に分類する:#4中の細胞に類似
したレポータータンパク質レベルを発現し続ける細胞(7);および、この場合
、減少したレベルのレポーターを発現する細胞(8)。このような「かすか
な」細胞からの撹乱原インサート(9)を単離し、そしてそのDNA配列を決定する
ために用いるか(10)、または、分泌および富化の別のサイクルのために、レポ
ーター含有宿主細胞に再導入する(11)。
図5:フローソータープロフィール図。選択前の撹乱原を含有する宿主細胞集
団の蛍光強度分布を示す図。この予め分類された集団は、分布の左テイル(黒で
塗りつぶした)において、または右テイル(灰色で塗りつぶした)において、細
胞を選択するために使用される。例えば、左のかすかな細胞が選択され、そして
これらの細胞からの撹乱原が本来の宿主細胞に再導入された場合、このようなサ
ブライブラリーの配列を有する細胞から生じる蛍光強度分布は、左に曲がる(す
なわち、平均蛍光強度が減少する)。
図6:S.cerevisiae a細胞のα因子アレストに関与する遺伝子経路。細胞膜
および核膜を、灰色の丸で示す;経路のタンパク質成分を、長方形および三角形
を含む種々のタイプの端を丸くした形状で示す。α因子は、a細胞の外側の「α
」を表記した三角形である。活性化を導く成分の間での相互作用を、矢印で示す
;阻害を導く相互作用を、末端を平らにした線で示す。
図7:α因子応答性に影響を及ぼす撹乱原を同定するために、レポーターとし
て酵母中で使用される発現ベクター。GFP遺伝子の上流の3つの可能性のあるイ
ンサートを示す。これは、使用されるストラテジーに依存する。第1のストラテ
ジーは、4つのタンデムに並んだα因子応答エレメントの使用を包含し;第2の
ストラテジーは、FUS1遺伝子のプロモーターを使用し;第3のストラテジーは
、α因子応答性を付与するために選択されるゲノムDNAを使用する。
図8:酵母において撹乱原を発現するための発現ベクター。「ゲノムDNA」は
、撹乱原コードインサートをいう。4つのストラテジーは、撹乱原インサートと
の融合タンパク質を生成するために使用される:1.青色蛍光タンパク質(BFP
);2.GAL4配列;3.インベルターゼ配列;4.融合パートナー配列なし。
定義
用語「遺伝子ライブラリー」または「ライブラリー」は、互換可能に使用され
、それぞれ、約2、3の塩基対〜約100万塩基対の範囲のサイズであり得る核酸
フ
ラグメントの収集物をいう。これらのフラグメントは、特定の宿主細胞(例えば
、細菌、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物細胞)中で増殖し得るベクター中に
インサートとして含まれる。
用語「サブライブラリー」は、特定のスクリーニングまたは選択手順の適用に
よって単離されている遺伝子ライブラリーの一部をいう。
遺伝子ライブラリーの文脈における用語「カバー率(coverage)」は、ライブ
ラリーの重複性のレベルをいう。この重複性は、次いで、ライブラリーが表する
ことが意図される核酸配列内の特定の配列が、実際に存在する可能性に関係する
。カバー率は、ライブラリーが表す核酸配列の全体の複雑性に対する、平均イン
サートサイズを乗じたライブラリーインサートの数の比である。
用語「ベクター」は、特定の宿主細胞中で増殖し得、そして外来核酸のインサ
ートを適応させ得る核酸配列をいう。代表的には、ベクターは、外来核酸を挿入
するためにインビトロで操作され得、そしてベクターは、挿入された核酸が一過
性にまたは安定に宿主細胞中で存在するように宿主細胞に導入され得る。
用語「発現ベクター」は、挿入された核酸配列を発現するように設計されたべ
クターをいう。このようなベクターは、挿入部位の上流に位置する強力なプロモ
ーターを含み得る。
核酸の文脈における用語「発現」は、核酸の、mRNAおよび/またはタンパク質
産物への転写および/または翻訳をいう。
用語「発現ライブラリー」は、発現ベクターにおいてインサートとして含まれ
る核酸フラグメントのライブラリーをいう。
用語「安定な発現」は、本発明の方法を実施するのに少なくとも必要とされる
程度の時間の、宿主細胞における核酸配列の継続した存在および発現をいう。安
定な発現は、構築物の宿主細胞染色体への組込み、または宿主内のその継続した
複製および分離を確実にするエレメントを構築物が有するように構築物を操作す
ること(すなわち、人工的な染色体)によって達成されえるか、または代替的に
、構築物は、構築物の安定な発現が選択条件下(例えば、薬物含有培地における
)での宿主細胞の増殖によって確認されるように選択マーカー(例えば、薬物耐
性遺伝子)を含み得る。
用語「核酸フラグメントの収集物」は、任意の供給源からの核酸分子のセット
をいう。例えば、核酸フラグメントの収集物は、全ゲノムDNA、1つ以上の染色
体からのゲノムDNA、全細胞RNAまたはメッセンジャーRNA(mRNA)から逆転写さ
れるcDNA、全細胞RNA、mRNA、または個々にもしくは組合わせ方法を使用しての
いずれかでインビトロで合成される核酸分子のセットを含み得る。他に限定され
なければ、この用語は、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で機能し得
る天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸分子を含む。
ライブラリーの文脈における用語「インサート」は、ライブラリーの単一のメ
ンバーを構成する個々のDNAフラグメントをいう。
用語「宿主細胞」は、いくつかの手順のいずれか1つによって導入されるベク
ターのための受容体として作用し得る、真核生物、古細菌、または真核生物起源
の細胞をいう。宿主細胞は、しばしば、その中に存在するベクターの複製および
分離を許容する。しかし、特定の場合、複製および/または分離は無関係である
;ベクターまたはインサートDNAの発現が対象である。代表的な細菌宿主細胞に
は、E.coliおよびB.subtilisが含まれ;古細菌宿主細胞には、S.acidocald a
riusおよびH.salinariumが含まれ;真菌宿主細胞には、S.cerevisiaeおよびS
.pombeが含まれ;植物細胞には、A.thalianaおよびZ.maizeから単離された細
胞が含まれ;昆虫宿主細胞には、D.melanogastor、A.aegypti、およびS.frug
iperdaから単離された細胞が含まれ;ならびに、哺乳動物細胞には、ヒト組織、
およびメラノサイト(メラノーマ)、結腸(ガン)、前立腺(ガン)、および脳
(神経膠腫、神経芽腫、星状細胞腫)を含むガンから単離された細胞が含まれる
。
用語「レポーター遺伝子」は、スクリーニングおよび選択が考案され得る核酸
配列をいう。レポーター遺伝子は、GFP(Chalfie M.,Tu Y.ら、Science Feb.1
1;263:802-805(1994))、またはルシフェラーゼ(Gould S.J.,およびSubramani
S.,Anal.Biochem.Nov.15;175:5-13(1988))のような発光可能なタンパク質
(「レポーター」)をコードし得る、またはCD20(Koh J.,Enders G.H.,ら、N
ature 375:506-510(1995))のような抗体によって検出可能な細胞内もしくは細
胞表面タンパク質をコードする遺伝子である。好ましくは、レポーターにより、
シス調節配列の活性が定量的様式でモニターされ得る。あるいは、レポー
ター遺伝子は、ハイグロマイシンまたはネオマイシン耐性のような抗生物質耐性
を与え得る(Santerre R.F.ら、Gene30:147-156(1984))。
セルソーターの文脈における用語「明るい」および「かすかな」は、特定の細
胞によって示される蛍光(または発光の他のモデル)の強度レベルをいう。明る
い細胞は、細胞の大容量集団と比較して高い強度の発光、および推測による、高
レベルのレポーター遺伝子発現を有し;かすかな細胞は、大容量の集団と比較し
て低い強度の発光を有する。
用語「遺伝子経路」は、特異的な生化学的機能または細胞挙動を達成するよう
に一斉にまたは連続して作用するするタンパク質(またはそれらをコードする遺
伝子)のセットをいう。
用語「シス調節配列」「シス配列」「調節配列」、または「調節エレメント」
は、それ自体、または同じ核酸分子に物理的に連結する他の配列の発現に影響を
及ぼす核酸配列をいうために、互換的に使用される。このような配列は、転写、
翻訳、またはRNA安定性のような事柄に影響を及ぼすことによって遺伝子発現を
変化させ得る。シス調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、またはネ
ガティブ調節配列が含まれる(Alberts B.,Bray D.ら編、Molecular Biology o
f the Cell、第2版、Garland Publishing,Inc.,New York and London,(1989)
;Lewin B.Gene V,Oxford University Press,Oxford,U.K.(1994))。
用語「撹乱原」は、細胞において特異的な生化学的プロセスを妨害するトラン
ス優性モデルにおいて作用する因子をいう。本発明の文脈において、撹乱原は、
代表的には、タンパク質、タンパク質フラグメント、またはペプチドのいずれか
であるが、この用語はまた、核酸および同様の特性を有する他の有機分子を含む
。
用語「トランス優性」は、これによって、因子(最も代表的には撹乱原)が溶
液中でその標的に結合し得る散在性の物質である、相互作用のタイプを記載する
。従って、トランス優性因子は、例えば、それが遺伝子産物において作用し、お
よび遺伝子の対立遺伝子において作用しないことから、遺伝的な意味においては
劣性に対して優性である。撹乱原の効果は、その標的の野生型対立遺伝子の存在
において可視性である。
用語「表現型模写(phenocopy)」は、特定の遺伝子の変異によって誘導される
状態を模倣(mimic)または模倣(resemble)する表現型状態または外観をいう
。この状態は、例えば、特定の宿主細胞内での撹乱原の発現によって誘導され得
る。
撹乱原の文脈における用語「標的」は、撹乱原が、その細胞表現型に対する効
果を発揮するために結合する、細胞内の分子(代表的には、タンパク質)をいう
。
用語「フローソーター」は、細胞または他の対象物からの発光強度を分析し、
そしてこれらの細胞または他の物体を発光強度のようなパラメーターに従って分
離する装置をいう。
好ましい実施態様の詳細な説明
概説
本発明は、植物および動物、または酵母、細菌、および真菌のような単細胞生
物に由来する培養細胞において遺伝子経路の構成要素を同定するための方法を包
含する。3つの基本的な道具は、(1)特定の細胞の表現型状態を反映する特定
のシス調節エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子;(2)細胞1つ1つに
関してレポーター分子の発現レベルの迅速な定量的測定を可能にする選択デバイ
スまたは方法;および(3)選択された細胞集団に導入され得るタンパク質、タ
ンパク質フラグメント、またはペプチド(「撹乱原」)の発現ライブラリー、を
含む。配列は、レポーター発現レベルによって読みとられる、シス調節配列の活
性を変えるその能力に基づいて発現ライブラリーから単離される。従って、本方
法は、疑似遺伝子アプローチを使用して、一緒になって遺伝子経路の構成要素の
同定を可能にする道具および技術のセットを含む。本発明の方法は、ヒト細胞に
おいて使用され得るが、また他の哺乳動物細胞、植物細胞、節足動物細胞、なら
びに真菌、古細菌、および細菌での使用のために容易に改変され得る。
レポーター遺伝子
多くのレポーター遺伝子が、発現のモニタリングおよびプロモーター/エンハ
ンサー補足における使用に割り当てられてきた。レポーターは、スクリーニング
または選択が適用され得る任意の遺伝子産物を含む。当該分野で使用されるレポ
ーター遺伝子には、E.coli由来のLacZ遺伝子(Shapiro S.K.,Chou J.ら、Gene
Nov.;25:71-82(1983))、細菌由来のCAT遺伝子(Thiel G.,Petersohn D.およびS
choch S.,Gene Feb.12;168:173-176(1996))、ホタル由来のルシフェラーゼ遺
伝子(Gould S.J.およびSubramani S.,1988)、ならびにクラゲ由来のGFP遺伝子
(Chalfie M.およびPrashner D.C.,米国特許第5,491,084号)が含まれる。こ
のセットは、主に細胞質における遺伝子発現をモニターするために使用されてき
た。異なるファミリーの遺伝子(例えば、リンパ球抗原CD20についての遺伝子)
が、細胞表面での発現をモニターするために使用されてきた。通常、細胞表面マ
ーカー(例えば、CD20)に結合する標識された抗体が、レポーターのレベルを定
量するために使用される(Koh J.,Enders G.H.ら、1995)。
これらのレポーターのうち、自己蛍光タンパク質(例えば、GFP)および細胞
表面レポーターが、生細胞をモニターする場合に最も多く使用される可能性があ
る。なぜなら、それらは、「生細胞色素」として働くからである。それらの発現
は、生細胞において評価され得、そしてその細胞は、その後の分析のために無傷
で回復され得る。しかし、生細胞色素は、本発明の方法によって特別に必要とさ
れるわけではない。発現が迅速に、そして高感度で定量され得るレポーターを利
用することもまた非常に有用である。従って、蛍光レポーター(すなわち直接的
または間接的に蛍光団で標識され得るレポーター)が特に好ましい。この特徴に
より、蛍光細胞分析分離装置(FACS)のようなフローソーター機械での高処理能
カスクリーニングが可能になる。
GFPは、天然に存在する蛍光タンパク質のファミリーのメンバーであり、その
蛍光は、主にスペクトルの緑の領域にある。GFPは、レポーターとしての使用の
ために広範に開発されており、そして改変されたスペクトル特性を有するそのタ
ンパク質のいくつかの変異体形態が特徴づけられている(Cormack B.P.,Valdiv
ia R.H.およびFalkow S.,Gene 173:33-38(1996))。高レベルのGFP発現が、酵
母からヒト細胞の範囲におよぶ細胞において得られている。GFPは、細胞質内で
のその発現が、FACSのようなフローソーター装置を使用して定量的に測定され得
る頑強な多目的レポーターである。
遺伝子ライブラリー
代表的に、遺伝子ライブラリーは、DNAフラグメントの収集物を含み、これら
は通常ゲノムDNAまたはcDNAであるが、ときどき合成DNAまたはRNAである。これ
らはあわせて、ゲノムの全てもしくはいくつかの部分、mRNAの集団、または目的
の配列を含む核酸の他のセットを表す。代表的には、遺伝子ライブラリーは、操
作され得る形態の配列を表す。ゲノムDNA総ライブラリーは、原則として、増殖
されたクローン化配列の収集物として生物のゲノムに存在する全ての配列を含む
。核酸のインプット集団のできるだけ代表的であるライブラリーを生成すること
がしばしば望ましい。例えば、インプット集団(例えば、ゲノム)において1対
1の比で存在する配列は、ライブラリー中で同じ比率で存在する。ライブラリー
が含有することを意図される核酸配列の合理的な代表(例えば、〉99%予想)を
達成するために、ライブラリーは少なくとも5倍のカバー率を有するべきである
;すなわち、ライブラリーは、一度に核酸配列の収集物を理論的にカバーするた
め、必要とされる総数を超える少なくとも5倍過剰の全インサートを含むべきで
ある。例えば、ライブラリーが生物のゲノムの代理を勤めることを意図される場
合、達成範囲(すなわち、インサートの総数×平均のインサートサイズ÷ゲノム
の複雑性)は、少なくとも5でなければならない。代表的には、ライブラリーは
、細菌細胞において増殖するベクターにおいて増殖されるが、酵母のような真核
生物細胞およびヒト細胞でさえもまた、宿主として働き得る。
ライブラリーの平均のインサートサイズは、とりわけ、ベクターおよび細胞型
に依存するかなり広い限界内にて操作し得る変量である。例えば、細菌プラスミ
ドのようないくつかのベクターは、数ヌクレオチドから数キロ塩基対までにおよ
ぶ小さいインサートを適合させるのに対し、酵母の人工的な染色体のような他の
ものは、1,000キロ塩基対を超えるインサートサイズを適合させ得る。
本発明は、好ましくは、範囲(spectrum)のより小さい端にあるインサートを
含有する遺伝子ライブラリーを使用する。これらのインサートは、最も代表的に
は、特定の生物のゲノムまたは転写物、または合成DNAに由来し、そして例えば
、10塩基対から10キロ塩基対までの範囲である。ライブラリーは、最も代表的に
は、可能ならば、5倍を超える達成範囲を有する。ライブラリー構築、操作、お
よび維持の詳細は、当該分野で公知である(Ausubel F.,Brent R.ら、1996;Samb
ro
ok J.,Fritsch E.F.、およびManiatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,第二版,CHSL Press,New York(1989))。本発明の1つの実施態様にお
いて、ライブラリーは、当該分野で周知の方法を使用して、以下の手順に従って
作製される。二本鎖cDNAは、特定の細胞型または組織から単離されたランダムプ
ライム化mRNAから調製される。これらのフラグメントは、その末端を修復するた
めに酵素で処理され、そして前述の発現ベクター中に連結される。連結された物
質は、E.coli中に導入され、そしてクローンが選択される。mRNA集団の合理的な
達成範囲を達成するのに十分な多数の個々のクローン(例えば、百万クローン)
は回収され、そして内在するベクターおよびそのインサートの単離のための大量
培養において培養される。このプロセスにより、大量のライブラリーDNAが、前
述の引き続く手順の準備のために得られることが可能になる。
本発明の特定の実施態様において、ライブラリーの開始物質として非天然の核
酸を使用することが好ましい。例えば、合成オリゴヌクレオチドの集団(例えば
、長さNの全ての可能な配列、または全ての可能な配列のサブセットを代表する
)を、ライブラリーのためのインプット核酸として使用することが望ましくあり
得る。さらに、ライブラリーインサートのための天然および非天然の核酸の混合
物を使用することが望ましくあり得る。
核酸移入
過去20年の間、いくつかの基本的な方法が、外因性核酸を培養された宿主細胞
中に移入するために進展されてきた。これらの方法は、当該分野で周知である(
Ausubel F.,Brent R.ら、1996;Sambrook J.ら、1989)。いくつかの方法は、主
に宿主細胞において一過性発現を生じる;すなわち、発現が徐々に細胞集団から
失われる。他の方法はまた、移入された核酸を安定に発現する細胞を生成し得る
が、安定な発現物(expresser)の割合は、代表的には、一過性の発現物よりも
低い。このような方法には、核酸移入のためのウイルス性および非ウイルス性機
構が含まれる。
ウイルス移入の場合には、ウイルスベクターが、核酸インサートを宿主細胞に
運ぶために使用される。特定のウイルス型に依存して、導入された核酸は、染色
体外エレメントとして残存し得る(例えば、アデノウイルス、AmalfitanoA.、Be
gy C.R.、およびChamberlain J.S.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)93:3352-335
6(1996))か、または宿主染色体中に組み込まれ得る(例えば、レトロウイルス、I
ida A.,Chen S.T.ら、J.Virol.70:6054-6059(1996))。
非ウイルス性核酸移入の場合には、多くの方法が利用可能である(Ausubel F.
,Brent R.ら、1996)。核酸移入のための1つの技術は、核酸のCaPO4共沈澱であ
る。この方法は、カルシウムイオンおよびリン酸イオンと一緒に、比較的不溶性
のCaPO4,沈砂(grit)(これは、培養ディッシュの底の接着細胞の表面に沈降する)
へと共沈する核酸の能力に依存する。沈澱は、明確には理解されていない理由に
より、いくつかの細胞によって吸収され、共沈した核酸は、細胞内で遊離され、
そして発現される。第二のクラスの方法は、電荷の相互作用によってDNAに結合
し得る一方、脂質ミセルを形成し得る親油性のカチオンを利用する。これらのミ
セルは、細胞膜と融合し得、そのDNA荷物を宿主細胞中に廃棄し、そこでDNAが発
現される。核酸移入の第三の方法は、エレクトロポレーションであり、これは、
DNAおよび宿主細胞を含有する緩衝液を介してキャパシターのプレートから電圧
を放電することを含む技術である。このプロセスによって二重層を十分に破壊し
、浴溶液中に含まれるDNAは細胞膜を貫通し得る。第四の方法は、DNAの進入およ
び培養された細胞における発現を媒介するDEAEデキストランのようなカチオン性
ポリマーを含む。第5の方法は、氷結晶中に含まれるか、または細胞中に発射さ
れるミニプロジェクタイルの表面に吸収されたDNAの衝撃的送達を利用する。最
後に、DNAのマイクロインジェクションが、代表的には極めて遅くそして重労働
であるが、使用され得る。
これらの方法のいくつかは、しばしば複数のDNAフラグメントの個々の細胞へ
の移入を生じる。1つの細胞によって取り込まれるDNAの量を1つのフラグメン
トに制限することはしばしば困難なことである。しかし、複数のフラグメントの
移入を最小化する方法が当該分野で公知である。例えば、「キャリア」核酸(例
えば、実験に関連する配列を含まないニシンの精子DNAのようなDNA)の使用によ
り、または宿主細胞に適用されるDNAの全量を減少させることにより、複数のフ
ラグメントが進入する問題が減少され得る。さらに、本発明は、それぞれのレシ
ピエント細胞が単一の型のライブラリー配列を有することを特に必要としない。
宿主細胞を介したライブラリーの複数の継代(以下を参照のこと)は、目的の配
列が、混合物(bystander)として最初に存在し得る配列から最終的に分離される
ことを可能にする。あるいは、遺伝子を体細胞へ移入させる多くの方法が複数の
コピーを送達する特徴を利用することは有用であり得る。この形質は、より多く
のライブラリー配列が少数の細胞でスクリーニングされることを可能にし得る。
なぜなら、とりわけ錯乱原がトランス優性様式で作用するからである。すなわち
、特定の細胞がいくつかの異なる撹乱原を含み、そのうち1つが、レポーターの
発現を変化させる場合、この細胞はスクリーニングの間に採取されるはずであり
、そして活性撹乱原は(影響のない他のものと一緒に)回収されるはずであるか
らである。
細菌細胞または真菌細胞での遺伝的実験の実施を所望する場合、遺伝子の移入
のための種々の技術もまた、利用可能である。エレクトロポレーションは、大半
の細胞型(原核生物細胞、真菌細胞、植物細胞および動物細胞を含む)に適用可
能な核酸送達のために特に柔軟性のある方法である。さらに、特定塩類の特定の
混合物をいくつかの細胞に使用して、DNAの進入を容易にし得る。例えば、CaCl2
はE.coliで良好に機能し、そしてLiOAcはS.cerevisiaeで良好に機能する。
撹乱原
体細胞遺伝学の最大の弱点の1つは、劣性変異が観察され得ることが困難であ
ることを含む。問題は統計学的用語で定式化され得る。変異が、1つの対立遺伝
子において、例えば100万分の1の頻度で生じる場合、2つの独立した変異がそ
れぞれの対立遺伝子で1つずつ生じる機会は、積:1兆分の1である。従って、
優性変異または相互優性変異が、一般にはるかにより容易に観察される。大部分
の変異の劣性性質のため、体細胞遺伝学は、過剰発現のような優性変化の研究に
大きく制限される。
撹乱原は、代表的にはタンパク質、タンパク質フラグメント、またはペプチド
(しかしそれらは核酸であり得る)であり、これらは細胞中で他のタンパク質と
結合し、それによって特定の生化学的経路を破壊する(図1を参照のこと)。自
然は、優性の機能獲得変異特定のクラスのの場合に偶然に撹乱原様分子を生成し
、そして特定の場合では優性ネガティブ変異遺伝子が設計されている(Herskowit
z I.,Nature 329:219-222(1987))。本発明において、この生化学的/遺伝学的破
壊の様式は、重要な遺伝子の同定および回収を指向する様式において利用および
適用される。
撹乱原は種々の方法で構築され得る。これらはランダムにプライムされ、サイ
ズで選択されたcDNA、剪断もしくは消化されたゲノムDNA、合成DNA、または他の
核酸供給源から生成され得る。これらは、これらに結合されるさらなるタンパク
質配列が全く無しで細胞中で発現され得る。あるいは、これらは分子クローニン
グの標準的方法(Ausubelら、1996)により他のタンパク質(例えば、GFPまたは
酵母GAL4)と融合され得る。さらに、これらは特定のタンパク質内部の挿入配列
として存在し得る。
撹乱原ライブラリーは、前述に記載されるような通常の遺伝子および発現ライ
ブラリーの構築に類似する技術を使用して構築され得る。このようなライブラリ
ーは、標準的なベクター(例えば、ウイルス)を使用してまたは他の方法により
細胞に導入される場合、変異誘発物質に類似する様式で機能する。すなわち、撹
乱原は、変異の状態を模倣する宿主細胞中での表現型模写の状態を誘導するが宿
主細胞のDNA配列の変化を直接含まない。撹乱原の価値は、それらが生成および
スクリーニンされ得る容易さ、ならびに撹乱原配列が回収され得、そして目的の
遺伝的経路の要素を同定するために使用され得る容易さに基づく。さらに、これ
らは低分子の治療法と類似する様式で作用する。実際に、これらは単なる低分子
のタンパク質等価物であり、そしてこれらは元のタンパク質撹乱原に類似の様式
で細胞に影響する低分子模倣物についてスクリーニングするためのこれらの標的
(結合パートナー)と組み合わせて使用され得る。
本発明において、例えば、フラグメント化ゲノムDNA、ランダムにプライム化
されたcDNA、またはランダム配列の合成DNAを含む撹乱原発現ライブラリーは、
細胞型特異的シス調節配列の制御下にレポーター遺伝子を含むように操作された
宿主細胞中に導入される。あるいは、良好な特異的な抗体が利用可能な膜タンパ
ク質(または細胞内タンパク質)からなる天然のレポーターは、このタンパク質
の発現が目的の表現型と相関する場合、使用され得る。撹乱原を有する細胞は、
迅速かつ定量的な方法またはデバイス(例えば、フローソーター(例えば、FACS))
によりスクリーニングして、レポーターの発現が変化した細胞の集団を同定する
。これらは以下に記載される分析について収集される。
シス調節エレメント
特定の型の宿主細胞における撹乱原発現を行うために、強固で、高いまたは中
程度に高い発現を付与し得る一般的なプロモーターが必要とされる。これらのプ
ロモーターは、代表的には、生物において大半または全ての細胞型で合理的に高
レベルで発現されるハウスキーピング(house keeping)遺伝子由来またはウイル
ス由来のプロモーターである。多数のこのようなシス調節配列は当該分野で公知
であり、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、または細菌で発現を駆動す
るために適切である(Ausubelら、1996;ベクターデータベースはhttp://www.atcg
.com/vectordb/に位置する)。例えば、真核生物では、βアクチンについてのプ
ロモーターが有用であり(Qin Z.,Kruger-Krasagakes S,ら、J.Exp.Med.178:355-
360);植物では、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター(Goddijn O.J
.,Pennings E.J.ら、Transgenic Res.4:315-323(1995));および一般には、例え
ば、ハウスキーピング遺伝子またはウイルス遺伝子の高レベルの発現を駆動する
プロモーターが、現在の分子遺伝学的方法を使用して比較的容易に同定され得る
。
レポーター遺伝子の発現を駆動するシス調節配列を同定するために、以下の適
切な特徴を有する配列を選択(choose)、または選抜(select)することが必要で
ある;すなわち、レポーターは、研究中の表現型の形質についての代替として作
用することが意図されるので、表現型を可能な限り密接に隣接させる様式で調節
されなければならない。多くのこのような配列は、組織特異的調節エレメントと
して当該分野で公知である(LewinB.,(1994))。あるいは、このような調節配列は
以下を含む標準的手順によって同定され得る:第一に、ディファレンシャルディ
スプレー、差し引きハイブリダイゼーション、代表的な差異分析、など(Ausube
lら、1996;およびKamb A.,Feldhaus M.J.,「Method for the comparative ass
essment of relative amounts of nucleic acids,」、米国特許出願代理人整
理番号第8835-0005-999の考察について参照のこと)の手順を用いる細胞特異的
または組織特異的な遺伝子の単離;第二に、遺伝子発現のパターンを担うシス調
節エレメントは、プロモーター/エンハンサー分析の標準的方法(欠失およびリ
ンカーでスキャンされた変異体の生成、ならびに細胞での発現アッセイを含む(L
ewin B.,1994;Latchman D.S.Eukaryotic Transcription Factors,第二版、Acad
emic Press,London(1996);McKnight S.L.およびYamamoto K.R.,Transcriptional
Regulation,CHSL Press,New York(1992)))の適用により明らかにされ得る。さ
らに、エンハンサー/プロモーター捕捉との一般名称で分類される遺伝学的方法
が特定の特徴を有するシス配列を見出すために使用され得る(Ruleyおよびvon M
elchner、米国特許第5,364,783号;Bellen H.J.,O'Kane C.Jら、Genes Dev.3:12
88-1300(1989)での議論を参照のこと)。最後に、同時係属中のKamb C.A.および
Caponigro G.M.の「Methods for identifying,characterizing,and evolving ce
ll-type specific cis regulatory elements」(代理人整理番号第20410-701)
と称される米国特許出願に記載されるように、所定の特徴を有する調節配列の遺
伝的選択のための方法もまた、レポーター遺伝子の発現を駆動するための有用な
シス配列を同定するために適用され得る。目標は、目的の条件下で活性であるシ
ス調節配列を、遺伝的方法、生化学的方法、または所望の発現の特徴を有する公
知の遺伝子を参照するかのいずれかで選択する。例えば、特定の病原生物での病
原性のプロセスを研究することが所望される場合、宿主の病原性浸潤について適
格である細胞においてのみ活性であるプロモーターを利用することが有用であり
得る。
発現ベクター
発現ベクターは、本発明において宿主細胞中に導入された配列遺伝子および遺
伝子フラグメント由来のRNA、タンパク質、タンパク質フラグメント、またはペ
プチドを生成するために使用される。この配列は、細胞の表現型状態についての
代替として使用されるレポーター遺伝子、および撹乱原をコードする配列を含む
。
多くの発現ベクターが当該分野で公知であり、これらは本発明での使用におい
て容易に利用可能である(Ausubel F.M.,Brent Rら、1996;Sambrook Jら、198
9)。これらのいくつかは特定の細胞型での使用について改造されるが、しかし
大半は広範な種々の細胞型で使用されるように設計される。哺乳動物細胞では、
ウイルス性の転写調節エレメントが外因性遺伝子の発現を駆動するために代表的
に選択される。哺乳動物宿主細胞での撹乱原の発現を含む本発明の目的において
、ポリ(A)付加配列(例えば、SV40TAg遺伝子由来)が下流に隣接するレポー
ター遺伝子を含む発現ベクターが、使用され得る。この型の発現ベクターは、図
2に例示する。撹乱原コード配列は、その開始コドンの上流にRNAポリメラーゼI
I(PolII)と結合し得るTATAボックスが隣接され得、および好ましくは連結された
撹乱原コード配列における高発現を付与するエンハンサーに隣接し得る。構成的
に活性であるシス調節配列(例えば、強力なウイルス性プロモーター中のシス調
節配列)において、発現ベクターは、好ましくは撹乱原コードライブラリー配列
の挿入について適切である部位を含む。このようなライブラリー配列は、好まし
くは、例えばBFPとの融合タンパク質の生成を含むが、ネイティブなタンパク質
ドメインまたはタンパク質フラグメントもまた、使用され得る。もしあれば、ど
の撹乱原融合パートナーを使用するかの選択は、例えば、撹乱原の細胞質発現、
核発現、または細胞外発現が所望されるかどうかに依存する。ベクターは、ウイ
ルス起源である場合は、微生物宿主での増殖を必要でないかもしれない。しかし
、より代表的には、ベクターは、例えばE.coliにおいて増殖を必要とし、そして
E.coliにおける複製および選択について必要な配列(例えば、colElレプリコン
および抗生物質耐性遺伝子)を含む。
原核生物宿主細胞および古細菌宿主細胞について、シス調節配列は上記で議論
したような類似の判定基準に従って選択される。撹乱原発現ベクターについては
、シス調節配列は強固で、好ましくは高発現レベルを生じる撹乱原コード配列の
上流に含まれる。従って、これらの配列は、好ましくは、ハウスキーピング遺伝
子の、例えば、上流に存在する一般的な型のものである。例えば、E.coliにおい
ては、適切な配列は、-10ボックスおよび-35ボックスからなるコンセンサスプロ
モーターである(Alberts B.,Bray D.ら、1989;Lewin B.,1994)。
撹乱原発現ベクターと対照的に、レポーターベクターは、レポーター発現が研
究対象の宿主細胞の表現型状態をできる限り厳密に反映するようにカスタマイズ
される。従って、発現ベクターは、レポーター遺伝子(例えば、GFP)が細胞型
特異的発現を与える、および/または細胞内の特定の生化学的経路の活性化を反
映するシス調節配列の制御下に配置されるように設計される。例えば、図3は、
CMVプロモーター由来のTATA配列の上流に、外来シス調節配列を挿入するために
用いられ得る哺乳動物発現ベクター(選択した調節エレメントの制御下でGFP発
現を生じる)を示す。このような調節配列は当該分野で公知である(Lewin B.、
1994および前出を参照のこと)、またはCarl Alexander KambおよびGiordano M.
Caponigroが1997年2月14日出願の「Methods for identifylng,characterizing,
and evolving cell-type specific cis regulatory elements」という名の同時
係属米国特許出願、代理人整理番号20410-701に開示される方法を用いて同定さ
れ得る。
撹乱原発現により誘導される表現型模写改変体の濃縮
遺伝子ライブラリー技術および遺伝子選択技術または遺伝子スクリーニング技
術の組み合わせは、生細胞中の機能に基づき、特定の配列をライブラリーより同
定することを可能にする。この戦略は、分子生物学において発現に基づく遺伝子
のクローン化(例えば、変異発現型の相補性による)のために頻繁に用いられて
きた(例えば、Yocum R.R.およびJohnston M.、Gene 32:75-82(1984))。この戦
略の前提は、適切に構築されたライブラリーは適切な宿主細胞に導入され得、そ
してライブラリー配列の効果がモニターされ得ることである。例えば、特定の宿
主細胞は、特定の遺伝子の非存在下の特定の環境下で死滅し得;宿主細胞は遺伝
子を含むライブラリーインサートが存在する場合にのみ増殖し得る。あるいは、
特定の表現型を与えるライブラリー配列を拾い上げるスクリーニングを用い得る
。例えば、T8(Leu-2)遺伝子は、培養細胞での発現工程、蛍光抗体による標識工
程、およびT8発現細胞のFACSによる濃縮工程を含む手順で単離された(Kavanthe
s P.,Sukhatme V.P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:7688-7692(1984))
。
本発明は、撹乱原ライブラリーインサートを有する多量の宿主細胞よりスクリ
ニングし、特定の表現型を有する細胞(すなわち減少したまたは増加したレポー
ター分子の発現レベルを有する細胞)を同定するために、FACSまたは同等の装
置のようなフローソーターを使用し得る。撹乱原ライブラリーがレポーター(例
えば、GFP)を安定な状況で発現するように操作された宿主細胞に導入される場
合、FACSで分析される大多数の細胞は通常の(例えば、高い)レベルのレポータ
ー発現を有することが予想される。しかし、少数は、減少した発現を示し、細胞
の蛍光分布でのよりかすかな側にある細胞としてFACS上で検出される。これらの
かすかな細胞は、収集され、そして他より離れて増殖される。図3および図4を
参照のこと。このような手順は、撹乱原を含む細胞の開始集団からレポーター発
現のレベルを減少する撹乱原を含む細胞の濃縮を生じる。これらの選択された、
かすかな細胞は、減少したレポーター発現を生ずるものについて濃縮された撹乱
原フラグメントの部分ライブラリーを構築するように、例えば、ライブラリーイ
ンサートに隣接するプライマー部位を用いたPCRによって、撹乱原フラグメント
の再単離のために用いられ得る。フラグメントの部分ライブラリーは再クローン
化され得(例えば、同一の発現ベクターを用いる)、そして宿主細胞へ再導入さ
れ得、そしてスクリーニング/選択プロセスは必要な回数繰り返され得る。
十分なサイクル数の後、最初のレポーター含有宿主細胞の蛍光強度分布の、濃
縮した撹乱原部分ライブラリーインサートを有する宿主細胞のものとの比較にお
いて、実質的な差が認められるべきである。好ましくは、これら2つの蛍光強度
分布間で、最小の重なりが認められるまで、手順は繰り返されるべきである。究
極的には、FACS分類のプロセスおよびサイクルは、例えば、レポーターの発現を
阻害する撹乱原フラグメントの集団を生じるべきである。これらフラグメントは
、分子クローニングおよびDNA配列決定分析により、単離され、そして個々に研
究され得る。十分な数のサイクルが行われる場合、多くの、好ましくはほとんど
の、分離フラグメントは、概略的には、フラグメントを単離した濃縮された集団
より生じる効果と同一の宿主細胞におけるレポーター発現への効果を生じるべき
である。
撹乱原標的
細胞における撹乱原の標的は、撹乱原自体と同様に興味深い。ほとんどの撹乱
原は、別の特異的なタンパク質と結合し、そしてその機能を阻害することにより
、
その細胞上の表現型の効果を発揮することが予測される。他のタンパク質は、撹
乱原の野生型対応物であり得る(例えば、タンパク質のホモ多量体の場合)、ま
たは別の無関係なタンパク質であり得る。いずれの場合も、撹乱原は標的タンパ
ク質単離のための重要なプローブを提供する。
当該分野で公知の現在の技術(例えば、公知の酵母ツーハイブリッドシステム
または他の遺伝学的もしくは生化学的アプローチ)を用い、細胞内の関連する標
的分子の同定が可能である(Fields S.およびSong O.-K.、米国特許第5,283,173
号;Serrano M.,Hannon G.J.ら、Nature 366,704-707(1993);Ausubelら、199
6)。現在の生化学的経路の知識および配列データベースとの比較に基づき、撹
乱原配列が標的の可能な同一性を明らかにし得ることもまた可能である;例えば
、特定の撹乱原の配列は、GeneBankのような公共データベースを検索するために
用いられ得る。統計学的に有意に閾値を越える相同性を伴うデータベース配列を
明らかにする、いくつかの「ヒット」は注意深く研究され得、そしてその生物学
的役割は、公開された文献において調査され得る。いくつかの場合において、撹
乱原は十分に確立された生化学的経路の成分由来であり、そして撹乱原の標的と
しての強力な候補は、撹乱原自体の同一性から推測され得る。
特定の場合には、さらなる撹乱原実験は、標的の同一性を明らかにし得る。例
えば、レポーター遺伝子の発現を阻害する撹乱原を発現する細胞を用いる第2の
撹乱原実験は、手がかりを提供し得る。レポーター構築物に加え最初の撹乱原(
ここで、最初のレポーター含有宿主細胞を産生するために用いられる方法と類似
の方法を用い安定に発現される)を有する細胞が撹乱原遺伝学の別のラウンドの
ための宿主細胞として用いられる場合、時としてレポーターをもう一度高レベル
で発現する復帰変異体を選択することが可能である。この復帰変異体表現型は、
他の原因もある中で、第1の撹乱原標的の挙動を模倣する細胞中の第2の撹乱原
の存在により生じ得る;すなわち、標的または標的フラグメントの過剰発現を含
む代償的な効果。従って、復帰変異体撹乱原(「抗撹乱原」)のセットは、撹乱
原標的の性質に関する手がかりを提供し得る。
遺伝学的経路
本発明で用いられる撹乱原アプローチは、1つの選択実験における特定の遺伝
学的経路のいくつかの成分を同定する能力を有する。これは、個々の変異体を単
離し増殖させる必要なく、アッセイが細胞の集団を用いて行われるからである。
レポーター遺伝子発現を増加または減少し得る撹乱原を有する全ての細胞は、と
もに収集され、そして内在の撹乱原のファミリーは、これに続く分析のために例
えばPCRにより増幅され得る。個々の核酸フラグメントのクローニングは個々の
細胞のクローン化および細胞中の染色体変異の位置決定より十分速い。ある意味
で、遺伝学は宿主細胞自体についてではなく撹乱原ライブラリーについて行われ
る。
個々の撹乱原をコードするフラグメントは、単離に用いられたレポーター遺伝
子発現アッセイ以外のアッセイを用い、さらに詳細に調べられ得る。撹乱原活性
機構の基礎は、かなり興味深いようである。例えば、撹乱原は、レポーター遺伝
子発現に必要な転写因子の活性を阻害することにより、レポーター遺伝子発現を
妨害し得る。あるいは、レポーター遺伝子発現に必要な転写因子のセットの活性
化をもたらす生化学的経路における転写因子の上流を妨害し得る。最後に、撹乱
原は、宿主細胞がもはや最初の親細胞型に類似しないが、その代わりに異なる細
胞型に保存されるような、細胞の運命における形質転換を生じ得る。レポーター
遺伝子発現の増加または減少をもたらす撹乱原破壊の他の可能な様式は、想像さ
れ得る。これらは、当該分野で公知の細胞生物学的手法、遺伝学的手法、および
生化学的手法を用い、後に分類され得る(Ausubelら、1994;Sambrookら、1989
)。
特定の実験の過程の間、レポーター遺伝子発現に影響するいくつかの撹乱原イ
ンサートが単離され得る。撹乱原選択のさらなるラウンドを用い、撹乱原が影響
する経路中の工程に基づき、撹乱原を群に分け(古典的な「相補群」に類似)、
そしてそれらの工程を並べることすら可能である。このプロセスの第一段階は、
レポーター発現を増加させるよう作用する新規の抗撹乱原のセットの生成を含む
。例えば、最初のレポーター遺伝子が撹乱原非存在下で構成的に発現する場合、
抗撹乱原は前記の選択実験の第1ラウンド中に単離される撹乱原を含むかすかな
細胞の明るい復帰変異体として選択され得る。最初のレポーター遺伝子が誘導性
で
ある場合(下記実施例1を参照のこと)、誘導シグナルの非存在下(すなわち、
構成的活性化を促進する)において明るい撹乱原を選択するのはより簡単であり
得る。いずれかの場合において、反対の表現型を伴う撹乱原の2つのセットがこ
こで存在する;1つのクラスは細胞をかすかにし、他はこの表現型を反転する。
宿主細胞中で撹乱原を誘導する「かすかな」および「明るい」全ての可能な組み
合わせの導入、そして生じるレポーター発現レベルを調べることにより、共通の
応答による撹乱原(従って、撹乱原の細胞標的)を分類することが可能である。
詳細に経路を並べることが所望される場合、条件的撹乱原(熱感受性および冷温
感受性)を用いる方法がJaRvik J.およびBotstein D.により記載される戦略(Pr
oc.Natl.Acad.Sci.(USA)70:2046-2050(1973);Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A)72:2738-2742(1975))に従い用いられ得る。
本明細書中に記載される様式で単離された撹乱原は、直接的に新規の治療用分
子をもたらし得ることが注目される。目的は、必ずしもレポーター遺伝子の発現
に1つの特定の効果(例えば、レポーター自体の機能を妨害することによる)を
有する撹乱原の同定である必要はない。むしろ、目的は細胞生理学に対するより
一般的な効果(細胞型の形質転換を含むが、これに限定されない)を有する撹乱
原を同定するこの手段を経ることである。このような撹乱原は疾患治療と関連し
得る。なぜなら、これら撹乱原は、十分な表現型と生理学的な結果を有する細胞
における特定の経路を破壊するからである。これら撹乱原およびその関連する細
胞標的は、医薬領域において非常に価値のある物品である、細胞における新規の
治療標的を同定するのに役立ち得る。
撹乱原特異性を改善するように設計されたさらなる操作
上記の手順を用いて単離された撹乱原は、2つの意味でさらに洗練され得る。
第1に、元の撹乱原ライブラリーのメンバーの改善された改変体である撹乱原は
、選択および富化のプロセスの間の偶発的なまたは計画的な変異または組換えに
より単離され得る。第2に、撹乱原は、細胞特異的活性に関して、より所望の特
性を有する撹乱原を富化するさらなる遺伝的スクリーニングおよび選択を通過さ
せられ得る。
第1の場合、例えば、PCRによるDNAの増幅は、複製プロセスの間に配列の変化
を導入することが公知である(Cline J.,Braman J.C.ら,Nucleic Acids Res.
24,3546-3551(1996))。これは、続いての実験において配列改変体を導き得、こ
れらのうちのいくつかは、有用な特性を有し得る。例えば、これらは、ライブラ
リーにおける元の撹乱原よりも効率的にレポーター遺伝子発現を妨害し得る。こ
れらの撹乱原は、例えば、さらにより低いレポーター発現の表現型を付与するこ
とにより同定される。あるいは、増幅プロセスを、例えば,インビトロ変異誘発
、誤りがちなPCR、または組換えPCR(Stemmer W.P.,Nature 370,389-391(1994
))により、核酸の変異および/または組換えを増強する条件に計画的に供する
ことにより、存在する撹乱原の改善された改変体を進化させることが所望され得
る。このような条件は、当該分野で公知(Ausubelら,1994)であり、そして例
えば、元のライブラリーにより発現される撹乱原と比較して低濃度で活性である
かおよび/または細胞において増加した選択性を示す(従って、これらは撹乱原
としてさらに良好に機能する)撹乱原を進化させる手段を提供する。
第2の場合、特定の生化学経路についての選択性が改善された撹乱原を富化す
るためのさらなるスクリーニングを介した上記の原則の適用により単離された撹
乱原フラグメントのサブライブラリーを通過させることが所望され得る。例えば
、レポーター発現に対する平凡な効果、または遺伝子発現および/もしくは細胞
生存率に対する一般的な効果は、適切な二次スクリーニングにより検出または除
去され得る。所望により、例えば、第1のレポーター遺伝子プロモーターと類似
の様式で宿主細胞において挙動する、第2の組織特異的プロモーターまたは細胞
型特異的プロモーターに連結されたレポーターを用いて、レポーター特異的様式
またはプロモーター特異的様式で宿主細胞に影響を与え、そして細胞の状態には
それほど大きな効果を有さない撹乱原を拒否し得る。あるいは、第1のプロモー
ターに連結された異なるレポーターが用いられ得る。さらに、遺伝子発現に対し
て一般的な非特異的効果を有する撹乱原が、撹乱原サブライブラリーまたは個々
の撹乱原コード配列を、第1の宿主細胞に関連しない、異なる宿主細胞特異的プ
ロモーターを有する異なる宿主細胞を通して通過させることにより同定および/
または除去され得る。
撹乱原-標的相互作用に基く低分子置換スクリーニング
上記の通りに単離される撹乱原は、伝統的な低分子薬学的化合物と類似のトラ
ンス優性態様で挙動する。従って、特定の場合には、これらは、低分子治療とほ
とんど同じ機能を果たし得るが、これは遺伝子治療技術による細胞内送達および
発現を確実にすることが必要であり得る。さらに、細胞標的と会合した撹乱原は
、元の撹乱原と類似の特性を有する低分子模倣物(すなわち、これらは、撹乱原
標的に特異的に結合し、そして標的の機能をインビボで破壊する)についての高
処理能力のインビトロスクリーニングのための基礎を提供する。このような分子
は、細胞に対してスクリーニングにおいて用いられる撹乱原と類似の効果を有し
得る。
本発明の特定の実施態様では、系が、インビボまたはインビトロでの細胞にお
ける(例えば、細菌、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物細胞における)タンパ
ク質−タンパク質相互作用およびそれらの阻害を評価するために用いられる。低
分子置換アッセイと呼ばれるこの系は、撹乱原/標的相互作用を破壊する特定の
化合物を同定するために低分子のライブラリーをスクリーニングするために用い
られ得る。撹乱原およびそれらのコグネイト標的のこの使用は、同時係属中のKa
mb,C.A.の米国特許出願(整理番号8835-004-999)に詳細に記載される。
実施例1
酵母a細胞におけるα因子シグナル伝達経路を調節する撹乱原の同定
a接合型の酵母細胞の表面上の特定の7回膜貫通型ドメインを含有するGタン
パク質共役レセプター(STE2遺伝子の産物)に対する酵母接合フェロモンα因子
の結合は、細胞周期の停止において頂点に達するシグナル伝達経路およびα細胞
に対して接合する細胞の準備を活性化する(図6)。この充分に特徴付けられた
シグナル伝達経路(Bardwell L.,Cook J.G.,Inouye C.J.,Thorner J.,Dev.
Biol.166:2,363-379(1994);Herskowitz I.,Cell 80:2,187-197,(1995)に
概説される)は、MAPキナーゼカスケードの活性化および少なくとも6個の遺伝
子の転写誘導に関与する。これらの遺伝子のうちのいくつかのプロモーターの分
析により、誘導に必要かつ充分である配列エレメントが同定されている。本発明
の方法を、α因子シグナル伝達経路をブロックし、従って特定の遺伝子のα因子
依存性誘導を防止する撹乱原を同定するために適用し得る。
α因子応答性GFPレポータープラスミドの構築
プロモーターレス(promoterless)の酵母プラスミドpRS416-GFP(1997年2月1
4日に出願され、「Methods for identifying,characterizing,and evolving c
ell-type specific cis regulatory elements」と題された、Carl Alexander Ka
mbおよびGiordano M.Caponigroによる同時係属中の出願に開示される)は、酵
母中で充分に発現するGFP改変体のコード配列の上流のGALl TATAボックス(GAL
上流活性化配列UASを除く)を含む。このプラスミドは、酵母(CENおよびARS、U
RA3)およびE.coli(ColEl、AmpR)において複製し得、そして選択され得、そし
てDNAプロモーター含有フラグメントを挿入するための、GALl TATAボックスの上
流の独特のBglII部位を有する。4コピーのα因子応答性エレメント(合成オリ
ゴとして)、Fusl遺伝子(Hagen D.C.,McCaffrey G.,Sprague G.F.Jr.,Mol
.Cell Biol.11:6,2952-61(1991))の上流に対して塩基-259を含むPCRフラグ
メント、あるいは1997年2月14日に出願され、「Methods for identifying,char
acterizing,and evolving cell-type specificcls regulatory elements」と題
された、Carl Alexander KambおよびGiordanoM.Caponigroによる同時係属中の
米国特許出願(代理人整理番号20410-701)に記載される方法に従ってこのよう
なエレメントを同定するためにスクリーニングしたゲノムライブラリーから単離
された任意の他のα因子応答性シス調節エレメントをBglII部位にクローニング
することにより、GFP発現をα因子応答性にする(図7を参照のこと)。この構
築物が酵母に導入され、そしてこの細胞がα因子に曝露される場合、これらは、
顕微鏡検査またはFACS分析のいずれかにより、α因子の非存在下において増殖し
た同じ細胞と比較して増加した蛍光を示す。従って、この構築物は、本明細書中
に開示される発明で用いられ得るレポーターに必要な条件を満たす;すなわち、
レポーターは、関連する細胞表現型状態および/または細胞環境を反映する様式
で応答する。
酵母における動原体含有プラスミド上にレポーター遺伝子を保有することの代
わりとして、構築物を、当該分野で公知の技術(Ausubelら,1996;Rothstein R.
J.,Methods Enzymol.101:202-211,(1983))を用いて酵母ゲノムに導入し得る
。手短に言えば、相同組換えの内因性経路を、インビボで、ARS/CENを欠くがレ
ポーター発現カセットに加えて選択マーカーを含む発現ベクターを挿入するため
に用いる。酵母DNAの相同性の領域を、ベクターに導入し、そしてベクターを、
直鎖状分子を生成する制限酵素で切断し、この末端は、酵母染色体領域との相同
性を含む。この直鎖状物質での形質転換は、相同組換え機構の補充をもたらし、
そして相同性の染色体領域に挿入される発現ベクターを含む多数の形質転換体を
生成する。このような発現ベクターは、発現ベクターが存在する染色体とともに
安定に遺伝する。個々の形質転換体を試験して、これらが、意図されたようにレ
ポーターを発現し続けることを確実にし得る。
酵母ゲノムDNA撹乱原ライブラリーの構築
標準技術を用いて、pRS315(Sikorski R.S.,Hieter P.,Genetics 122:1,19
-27(1989))のような酵母/E.coliシャトルベクター中に、酵母ゲノムDNAフラグ
メントのライブラリーを構築する。このベクターは、LEU2を酵母における選択マ
ーカーとして含む。4つの別々のライブラリーを、異なる状況または細胞区画に
おいて撹乱原を提示するように作製し得る。4つ全ての場合で、ガラクトース依
存性様式でその発現を駆動するように、挿入されるゲノムフラグメントの上流に
GALlプロモーターが存在する。
1つのベクターでは、Blue Fluorescent Protein(BFP)のコード配列(Quant
um Biotechnologies,Inc.,I,aval,Canada;Anderson M.T.,Tjioe I.M.,Lori
ncz M.C.,Parks D.R.,Herzenberg L.A.,Nolan G.P.,Herzenberg L.A.,Proc
.Natl.Acad.Sci.(USA)93:16,8508-8511(1996))を、BFPと挿入されるコー
ド配列との間の翻訳融合を可能にするように、GALプロモーターの下流でかつ挿
入部位の上流に配置する(図8を参照のこと)。第2の場合、分泌形態のインベ
ルターゼが融合パートナーである;これは、分泌経路への撹乱原の搬出を可能に
し、そして細胞の外側に分泌された場合、さもなければ分泌経路に引き渡される
場合に活性を有する撹乱原を単離するための機構を提供し得る。第3の場合、GA
L4タンパク質(確立された融合パートナー(Fields S.およびSong O.-K.,米国
特許第5,283,173号))を、撹乱原に融合する;これは、核への撹乱原の移入を容
易にする。第4の場合、撹乱原配列の融合パートナーは存在しない;これは、「
孤立している」撹乱原の生成を可能にする。
(α因子応答性)GFPレポーターを保有するa細胞におけるライブラリーの分
析
上記の撹乱原ライブラリーの各々を、α因子応答性GFPベクターを含有する別
々の細胞集団に導入する。撹乱原およびレポータープラスミドにおいて使用され
る選択マーカーは、両方が同じ細胞において保持され得るように異なる(例えば
、URA3およびLEU2)。あるいは、レポーター構築物を、染色体に組込み得る(こ
れは、細胞集団における、より均一なレベルのレポーター遺伝子発現に起因する
利点を有する)。
α因子シグナル伝達経路を特異的にブロックする撹乱原は、これらの細胞の蛍
光を、ガラクトース依存性様式で減少させるべきである。撹乱原サブライブラリ
ーは、例えば、特定の撹乱原の発現が、単純には細胞を殺傷しないことを確実に
するために、さらに試験し得る。この操作は、撹乱原が、α因子停止(α-facto
r arrest)を包含する標的化された生化学的経路に特異的であるh]能性を増加さ
せるための便利な逆スクリーニングを提供する。
選択プロセスを逆にし、そして反対の効果を有する撹乱原(すなわち、これら
は、α因子の非存在下およびガラクトースの存在下でレポーター発現を増加させ
る)を同定することもまた可能である。このような撹乱原を、ガラクトースの存
在下およびα因子の非存在下で明るい撹乱原含有細胞をスクリーニングすること
により単離し得る。
この分類(上記の第2の場合)においてBFP撹乱原ライブラリーを使用するこ
とが可能であることに留意されたい。なぜなら、細胞におけるGFP発現のレベル
を、FACS機械における帯域フィルターの適切な使用により、同じ細胞におけるBF
P発現のレベルとは独立してモニタリングし得るからである。GFPの最大励起およ
び最大発光はBFPの最大励起および最大発光とは異なるので、適切なフィルター
およびレーザーを用いることが必要である(Andersonら,1996)。
実施例2
メラノーマ細胞におけるチロシナーゼ遺伝子の発現を導く経路
多様なヒトメラノーマ特異的遺伝子が同定されており、これには、DOPAクロム
タトメラーゼ(tautomerase)/チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)(Yokoyama K
.,Yasumoto.Kら、J.Biol.Chem.269:27080-27087(1994),メラノトランスフェ
リン(Mtf)(Duchange N.,Ochoa A.ら、Nucleic Acids Res.20:2853-2859(1992)
)、小眼球症関連転写因子(MITF)(Fuse N.、Yasumoto K.ら、Biochem.Biophys.
Res.Commun.219:702-707(1996)、およびチロシナーゼ(Shibata K.、Muraosa Y
.ら、J.Biol.Chem.267:20584-20588(1992)が含まれる。これらの遺伝子の関
連調節エレメントは、メラノーマ特異的遺伝子のシス調節配列へのレポーター遺
伝子の融合に関与するメラノーマ細胞特異的レポーターを設計するための基礎を
提供する。
チロシナーゼ調節エレメントを有するGFP発現ベクターの構築
チロシナーゼは、重合体の光吸収メラニン色素へのチロシンの変換に関与する
酵素をコードする。ヒトチロシナーゼ遺伝子における調節配列は、特に良く特徴
付けられている。トランスフェクション実験は、チロシナーゼ転写開始部位の1.
8〜2.7キロベースペアの上流に位置するプロモーターフラグメントが、メラノー
マ色素産生細胞において特異的な発現を与えるために十分であることを決定した
(Shibata Kら、Muraosa Y.ら、1992)。さらなる欠損分析は、200塩基対フラグメ
ントにおいて含まれる、色素細胞特異的エンハンサーが、開始部位の上流の1.8
〜2.0キロベースペアに位置することを同定した。39塩基対コアエレメントは、
メラノーマ細胞特異的発現を与えるために十分であった。
前述される一連の実験において定義されるプロモーター領域は、ヒトメラノー
マ細胞に特異的なレポーター遺伝子(この場合、GFP)の発現に指向させるため
に使用される。多数のこのような培養細胞株は利用可能であり(Satyamoorthy K
.、DeJesus E.ら、Melanoma Res.(印刷中))、この多く(例えば、HS294T)は、
培地中で良好に増殖し、そして本実施例に記載される実験で使用され得る。プロ
モーター領域は、ヒトチロシナーゼ遺伝子の上流の全2.7キロベースペア、また
はTATAボックス配列の下流に位置する200ベースペアフラグメントを含み得る(
図3)。公開された文献に基づいて、このような構築物は、メラノーマ細胞にお
いて選択的に活性であるべきであり、そして例えば、繊維芽細胞においては活性
でない。
GFPレポーターに連結されるチロシナーゼ調節配列からなる融合構築物は、GFP
が宿主細胞中で高レベルで発現されるような発現ベクターに導入される。安定な
発現体の選択は、例えば、図3に示されるような発現ベクターに維持されるネオ
マオシン耐性キャリアについて優先的に選択性のマーカーを使用して適用される
。安定な発現体は、当該分野で公知の技術(Ausubelら、1996)を使用して選択さ
れ、そしてGFP発現細胞集団はフローサイトメトリーによって変化される。高度
で安定なGFPの発現によって特徴付けられる適切なクローンは、次の実験におい
て使用される。
チロシナーゼ発現を抑制する撹乱原のためのスクリーニング
この宿主細胞株を、上記の型の撹乱原ライブラリーの移入のための受容体とし
て使用する。簡単に言うと、ライブラリーは、cDNAフラグメント(例えば、不規
則に初回抗原剌激を受けたヒト胎児脳mRNA由来)、または発現ベクター(例えば
、図1に示されるような代表的な哺乳動物発現ベクター由来であり得るベクター
)に維持されるランダムなペプチドコード配列からなる。この場合、ライブラリ
ーはCMV配列の制御下にある。ライブラリーは、エレクトロポレーションの標準
的なプロトコルを使用して宿主細胞内へ導入される(Ausebelら、1996)。特定の
条件を核酸移入を最適化するために選択する(実施例3を参照のこと)。次いで
、細胞を、フローソーター装置(例えば、FACS)を通して、かすかな(すなわち
、撹乱原を欠損する宿主細胞におけるGFP発現の平均レベルよりも低い、または
撹乱原を発現する多くの宿主細胞の大容量集団によって阻害されるGFP発現の平
均レベルよりも低い、GFPの発現レベル)細胞を採集する。かすかな細胞内に含
まれる常在性撹乱原コードDNAインサートを、例えば、撹乱原インサート配列
に隣接するプライマー部位を使用するPCR増幅によって回復させる。これらの撹
乱原フラグメントを発現ベクター中で再クローン化して、そしてサブライブラリ
ーをレポーター保有宿主細胞中へ再導入する。この循環プロセスを十分な回数続
けて、宿主細胞中に単一で導入する場合、GFP発現の抑圧効果を有する、かなり
純粋なセットの撹乱原フラグメントを産生する。このようなフラグメントは、そ
れらのDNA配列および真の表現型細胞へのそれらの影響の試験を含み、さらに特
徴付けられ得る。
実施例3
転移性メラノーマにおけるβ3インテグリンの発現を導く経路
改良されたメラノーマの一般的な特徴は、接着分子β3インテグリンの高レベ
ルな発現である(Varner J.A.およびCheresh D.A.、Curr.Opin.Cell Biol.8:7
24-730(1996))。これは、本明細書中で開示された発明が、特定の細胞表面分子
の発現に関与する撹乱原(および撹乱原標的)を同定するために使用され得る方
法の例を提供する。
メラノーマ細胞への撹乱原ライブラリーの移入
β3インテグリンを過剰発現するメラノーマ細胞を、これらの実験のための出
発点として使用する。β3インテグリンに結合するモノクローナル抗体で染色す
る場合、これらの細胞は、低レベルのβ3インテグリンを発現するか、まったく
発現しない(例えば、正常なメラノサイト形成細胞)かのどちらかの種々の他の
細胞型とは、定量的に異なる再生産可能な高レベルの発現を明らかにする。Saty
amoorthy K.,DeJesus E.ら、Melanoma Res.(印刷中)に記載される高β3インテ
グリン発現株のセットから選択される細胞株を最初に試験して、例えば、エレク
トロポレーションを使用して、核酸移入を最適化する。Clontech(Palo Alto CA)
により購入されるベクターのような標準的なGFP発現ベクターは、異なるエレク
トロポレーション条件の結果を評価するための日常的な方法を提供する。GFP発
現ベクターを多種の電圧およびキャピラリーを使用して細胞中へ導入し、そして
細胞を戻し、細胞の回復および移入されたDNAの発現を可能にするために十分
な期間(代表的には1日)の間培養する。次いで細胞を、明るい細胞のパーセン
ト(すなわち、移入したDNAを受容する割合)を決定するためにFACSのようなフ
ローソーターによって分析する。条件を、さらなる実験のためにこの数を最大化
するように選択する。
フローソーター分析およびかすかな細胞の選択
実施例2に記載されるタイプの撹乱原発現ライブラリーを、上記で定義される
条件を使用してメラノーマ宿主細胞へ導入する。1〜3日後、細胞を採集し、β
3インテグリンに対して指向されるモノクローナル抗体で染色し、そして1次抗
体のFcドメインに結合することによって細胞上のβ3インテグリンの間接的な可
視化を可能にする2次蛍光標識抗体で標識する(Robinson J.P.,Darzynkiewicz
Z.ら(編),Current Protocols in Flow Cytometry,John Wiley and Sons,New
York(1997);Ausubelら、1996)。これらの染色された細胞は、フローソーター(
例えば、FACS)を通過し、そして細胞のかすかな画分を採集する。採集した細胞
を溶解し、そしてそれらの撹乱原インサートを別のサイクルの濃縮ために、また
は配列分析PCRのいずれかのために、PCRによって回復させる。いずれかの場合に
おいて、挿入物を、処置前にE.coliにおいて再クローン化する。上記の手順を通
して同定された個々の撹乱原フラグメントを、単独で試験する場合、多く(好ま
しくは、大多数)が、予想した特性(集団の一部であるのに対して)を有するこ
とを確実にするためにさらに分析する。大多数のこのようなフラグメント(メラ
ノーマ細胞へ単独で導入する場合)は、細胞表面で発現されるβ3インテグリン
タンパク質のレベルの減少を引き起こすべきである。これらのフラグメントのDN
A配列は決定され、そしてそれらが公知のタンパク質に適合するかを調査するた
めに、一般の配列データベースを検索するために使用され得る。このような検索
の結果は、細胞における撹乱原相互作用の性質(すなわち、その効果の機構)に
ついての価値ある情報を提供し得、そしてインビボにおける撹乱原標的を示し得
る。撹乱原標的はまた、(FieldsS.およびSong O.-K.,米国特許第5,283,173号;S
erranoら、1993)に記載されるS.cerevisiaeにおけるツーハイブリッド分析の方
法を使用して見い出され得る。
上記の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、その範囲に限定され
ない。本発明の他の変更は当業者に容易に明らかであり、そして添付のクレーム
によって包含される。全ての刊行物、特許、および本明細書に引用される特許出
願は、参考として本明細書中に援用される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M
W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM
,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,
CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E
S,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU,ID
,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,
LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M
G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT
,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,
TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ,VN,Y
U,ZW
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下を含む目的の表現型を改変する因子をコードする核酸配列を同定するた めの方法であって: (a)複数の宿主細胞でレポーター遺伝子を維持する工程であって、該宿主細 胞中のレポーター遺伝子発現のレベルが目的の表現型と相関する、工程; (b)発現ライブラリーを該宿主細胞に導入する工程; (c)該複数の宿主細胞から、予め決定された特性を有する1つ以上のライブ ラリーを含む宿主細胞を選択する工程;および (d)選択されたライブラリーを含む宿主細胞から、該宿主細胞中のレポータ ー発現のレベルを改変し得る1つ以上のフラグメントを含む核酸フラグメントの サブライブラリーを回収する工程、 を包含する、方法。 2.請求項1に記載の方法であって、工程(d)で回収された前記フラグメント のサブライブラリーを前記複数の宿主細胞中に再導入する工程、ならびに工程( c)および(d)を反復する工程をさらに包含する、方法。 3.前記回収されたサブライブラリーのフラグメントが、前記再導入する工程の 前にインビトロで操作される、請求項2に記載の方法。 4.前記発現ライブラリーが、約10塩基対〜約10,000塩基対の範囲のサイズを有 するインサートを含む、請求項1に記載の方法。 5.前記選択する工程が、フローソーターの使用を包含する、請求項1に記載の 方法。 6.前記レポーターが発光し得る分子をコードする、請求項1に記載の方法。 7.前記レポーターが蛍光を発し得る分子をコードする、請求項1に記載の方法 。 8.前記レポーターが、宿主細胞膜に挿入し得る分子をコードする、請求項1に 記載の方法。 9.前記レポーターが細胞内分子をコードする、請求項1に記載の方法。 10.前記発現ライブラリーが選択マーカー配列を含む、請求項1に記載の方法 。 11.前記選択マーカー配列が前記宿主細胞に抗生物質耐性を付与する、請求項 10に記載の方法。 12.前記宿主細胞が細菌である、請求項1に記載の方法。 13.前記宿主細胞が古細菌である、請求項1に記載の方法。 14.前記宿主細胞が真菌である、請求項1に記載の方法。 15.前記宿主細胞が植物由来である、請求項1に記載の方法。 16.前記宿主細胞が昆虫由来である、請求項1に記載の方法。 17.前記宿主細胞が哺乳動物由来である、請求項1に記載の方法。 18.前記発現ライブラリーが、前記ライブラリーインサートと予め決定された 特性を有する配列との間の融合産物または挿入産物をコードする配列を含む、請 求項1に記載の方法。 19.前記予め決定された特性を有する配列が第2のレポーター分子をコードす る、請求項18に記載の方法。 20.前記予め決定された特性を有する配列が、前記宿主細胞から、または分泌 経路への前記融合産物の搬出を促進する、請求項18に記載の方法。 21.前記予め決定された特性を有する配列が、前記宿主細胞の核への前記融合 産物の移入を促進する、請求項18に記載の方法。 22.請求項1に記載の方法であって、前記レポーター遺伝子発現が、以下の工 程: (a)複数の第2の宿主細胞に、第2のレポーター分子の発現に影響し得るシ ス配列に作動可能に連結された該第2のレポーター分子を含む核酸フラグメント の第2の発現ライブラリーを導入する工程; (b)該複数の第2の宿主細胞から、予め決定された特性を有する、1つ以上 のライブラリーを含む第2の宿主細胞を選択する工程; (c)該選択されたライブラリーを含む第2の宿主細胞から核酸フラグメント のサブライブラリーを回収する工程; (d)該サブライブラリーを複数の第3の宿主細胞に導入する工程; (e)該複数の第3の宿主細胞から、予め決定された特性を有する1つ以上の サブライブラリーを含む第3の宿主細胞を選択する工程;および (f)サブライブラリーフラグメントを該選択された第3の宿主細胞から回収 する工程、 を包含するプロセスにより単離された、細胞型特異的または細胞状態特異的シス 制御エレメントにより駆動される、方法。 23.目的の表現型を改変する因子をコードする核酸配列を同定するための方法 であって: (a)複数の宿主細胞でレポーター遺伝子を維持する工程であって、該宿主細 胞中のレポーター遺伝子発現のレベルが、目的の表現型と相関する、工程 (b)該複数の宿主細胞において第1の核酸配列を発現させる工程であって、 該第1の核酸配列の発現が該宿主細胞中のレポーター遺伝子発現のレベルに影響 する、工程; (c)該宿主細胞に発現ライブラリーを導入する工程; (d)該複数の宿主細胞から、予め決定された特性を有する、1つ以上のライ ブラリーを含む宿主細胞を選択する工程;および (e)該選択されたライブラリーを含む宿主細胞から、該宿主細胞中のレポー ター発現のレベルに対する該第1の核酸配列の影響を少なくとも部分的に反転さ せ得るかまたは増強させ得る1つ以上のフラグメントを含む第2の核酸フラグメ ントのサブライブラリーを回収する工程、 を包含する、方法。 24.工程(e)で回収されたフラグメントのサブライブラリーを前記複数の宿 主細胞中に再導入する工程、ならびに工程(d)および(e)を反復する工程を さらに包含する、請求項23に記載の方法。 25.前記回収されたサブライブラリーフラグメントが、前記再導入する工程の 前にインビトロで操作される、請求項24に記載の方法。 26.前記選択工程が、フローソーターの使用を包含する、請求項23に記載の 方法。 27.工程(d)で回収したフラグメントのサブライブラリーを複数の第2の宿 主細胞に再導入する工程、ならびに工程(c)および(d)を反復する工程をさ らに包含する、請求項1に記載の方法。 28.前記回収されたサブライブラリーフラグメントが、再導入する工程の前に インビトロで操作される、請求項27に記載の方法。
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