CN112513279A - 用于在重组酶介导的核酸序列向工程化的接受细胞发生盒交换整合期间追踪和操纵细胞的细胞表面标签交换(cste)系统 - Google Patents

用于在重组酶介导的核酸序列向工程化的接受细胞发生盒交换整合期间追踪和操纵细胞的细胞表面标签交换(cste)系统 Download PDF

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Abstract

一种组合型系统，包含两个独立组件，其中第一组件是编码旁侧有3’内含子片段的第一细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)的标签‑交换供体载体(TEDV)，并且第二组件是工程化细胞，所述的工程化细胞在其基因组内部含有标签‑交换接受位点(TERS)，其编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的第二CST外显子，并且所述标签‑交换接受位点(TERS)还编码处于反义方向的报告基因，其中配对的重组酶介导盒交换(RMCE)元件如此纳入TEDV和TERS中，从而RMCE在TEDV和TERS之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的GOI，以及第一CST外显子交换成第二CST外显子，从而衍生性工程化细胞现在表达第一CST和GOI，替代第二CST和报告基因。

Description

用于在重组酶介导的核酸序列向工程化的接受细胞发生盒交 换整合期间追踪和操纵细胞的细胞表面标签交换(CSTE)系统
发明领域
本发明涉及细胞工程化和重组DNA技术领域。具体地说，本发明涉及在基于重组酶介导的盒交换(RMCE)的目的基因整合期间，生成、纯化、追踪和操纵工程化细胞的系统和方法。
背景技术
在遗传操作和免疫学领域内，重组酶介导的盒交换(RMCE)已经变成定向基因修饰的有用工具，参见，例如Turan等人,Gene(2013):515:1-27。通常，确认目的基因(GOI)整合于正确位置中的RMCE后方法需要破碎细胞和处理样品。一种最近描述的方法克服了这类细胞破碎需求并且表明，可以通过追踪荧光标记蛋白表达监测和分离重组事件(Phan等人,Sci Rep.(2017):7(1):17771)。尽管Phan等人的方法避免了细胞破碎需求，但由于它依赖于胞内蛋白荧光，故该技术不适用于整合构建体的高内涵筛选，原因在于荧光蛋白提供的独特光谱属性集合有限；因而仅可以使用所述策略同时标记并检测有限数目的基因。另外，胞内荧光蛋白不可用于借助基材亲和法(如磁力激活细胞分选法(MACS))划分细胞的物理操作，而基材亲和法为细胞工程化作业流程期间的高通量和平行化提供可能性或为增加高内涵细胞文库工程化的效率提供可能性。
目前，借助手头的RMCE技术，需要在高通量应用和高内涵应用中均进行快速和稳健细胞工程化的工具，尤其在其中已经用含有各个目的基因的汇集物的载体汇集物同时转染细胞的情况下或在其中想要通过基材亲和法选择细胞的情况下如此。因此明确需要提供有效和改进的方法。
发明概述
本发明涉及为在基于重组酶介导的盒交换(RMCE)的目的基因(GOI)整合期间追踪和操纵工程化细胞提供双组件细胞表面标签交换(CSTE)系统。CSTE系统的第一部分代表标签-交换供体载体(TEDV)，所述载体编码用于整合的GOI，连同旁侧有包含剪接受体位点的内含子序列3’片段的第一细胞表面标签(CST)。TEDV构建体旁侧有RMCE元件。CSTE的第二部分代表了包含于工程化靶细胞的基因组内部的标签-交换接受位点(TERS)，所述标签-交换接受位点编码由完整内含子序列毗连的选定基因和具有符合可读框跨膜结构域的第二CST，所述的完整内含子序列编码RMCE元件和侧置于GOI编码序列的第二RMCE元件。TERS编码的CST实质上编码为单个内含子毗连的两个外显子。如此设计纳入TEDV和TERS的配对RMCE元件，从而RMCE在两个构建体之间的执行导致将CST和GOI从TEDV交换入TERS，相应失去TERS编码的TERS CST和选择基因。TEDV递送的CST利用TERS编码的跨膜结构域，其中RMCE的执行导致交换独特的CST外显子序列。从TERS驱动CST和选择基因/GOI表达的启动子元件相对于交换过RMCE的构建体是外来的，因此TEDV递送的序列通常将仅在可靠地执行RMCE时才表达。这种CSTE系统使得通过检测CST在细胞表面呈递的亲和力表位有条件报告的快速和稳健的RMCE成为可能，并且还使得借助基材固定的亲和力方法物理划分细胞成为可能。通过使用多价亲和力表位作为CST元件，这种CSTE系统还使得GOI整合过程的多路复合和谱系追踪成为可能。CSTE系统代表一种在高通量应用和高内涵应用中进行快速和稳健细胞工程化的强有力工具。
在第一方面，本发明提供一种包含两个独立组件的组合型系统，其中第一组件是编码旁侧有3’内含子片段的第一细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)的标签-交换供体载体(TEDV)，并且第二组件是工程化细胞，所述的工程化细胞在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)，其编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的第二CST外显子，并且其还编码处于反义方向的报告基因，其中配对的重组酶介导盒交换(RMCE)元件如此纳入TEDV和TERS中，从而RMCE在TEDV和TERS之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的GOI，以及第一CST外显子交换成第二CST外显子，从而衍生性工程化细胞现在表达第一CST和GOI，替代第二CST和报告基因。
在一个实施方案中，第一组件是一种TEDV，其包含
a.在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的第一RMCE元件–5’RMCE元件
b.3’内含子片段，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点
c.外显子，其包含处于5’至3’方向的TEDV所编码的CST
d.按5’至3’方向的，编码的CST的第一转录终止子序列
e.3’至5’编码的GOI的第二转录终止子
f.按3’至5’方向的，编码GOI的序列
g.Kozak序列
h.5’RMCE元件
其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。
在另一个实施方案中，第二组件是一种TERS，其包含
a.转录启动子元件
b.Kozak序列
c.2型膜蛋白跨膜结构域外显子
d.5’内含子剪接供体位点
e.在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的5’RMCE元件，且其与TEDV的5’RMCE元件作为等同物并配对
f.3’内含子片段的有功能序列，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点
g.包含处于5’至3’方向TERS所编码的CST(其异于TEDV所编码CST)的外显子
h.按5’至3’方向的，编码的CST的转录终止子序列
i.用于3’至5’方向的转录终止子序列
j.按3’至5’方向的，编码选择基因的序列
k.用于选择基因转录物高效翻译起始的Kozak序列
l.3’RMCE元件
m.负责调节CST转录物表达及其追踪的3’基因组元件，其中跨膜结构域外显子和CST外显子以从报告基因的反义方向如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。
在第二方面，本发明提供一种从TERS基因座生成表达TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞的方法，所述方法包括，
a.生成编码GOI的TEDV
b.向含有配对TERS的工程化细胞系递送所述TEDV，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶
c.使细胞与两种或更多种对TEDV所编码CST和TERS所编码CST均特异的亲和试剂接触
d.基于报告基因和TERS所编码CST的表达削弱和TEDV所编码CST的表达增加，选择衍生性工程化细胞，作为选择GOI已整合的细胞的代理(proxy)。
在第三方面，本发明提供一种标签-交换供体载体(TEDV)，其编码旁侧有3’内含子片段的细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)。
在第四方面，本发明提供一种在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)的工程化细胞，所述标签-交换接受位点编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的细胞表面标签(CST)外显子，并且还编码处于反义方向的报告基因，其中重组酶介导的盒交换(RMCE)元件如此纳入TERS中，从而RMCE在TERS和标签-交换供体载体(TEDV)之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的目的基因(GOI)。
本发明提供一个借助RMCE，使GOI整合入工程化细胞系的系统，其中通过分析共整合的细胞表面标签(CST)，有条件地检出所述整合过程的报告。另外，一旦GOI整合，则从工程化细胞系中随之失去独特的CST，而允许对表达GOI表达的衍生性工程化细胞的双正向/负向选择。这种‘标签-交换’高度地稳健并且是由CSTE系统所赋予的严格正向/负向选择的基础。第二选择基因也从TERS位点丢失，这使得产生表达GOI的衍生性工程化细胞期间高度稳健的双重负向选择和单一正向选择成为可能。重要地，CST系统的性质意味着，这些标志物不仅是有条件的，需要选择性添加相应的(cognate)亲和试剂以检测，而且通过使用基材固定化的亲和试剂法，它们还可以被用于物理地划分靶细胞群体。这使得通过使用诸如磁力激活细胞分选法(MACS)等方法划分细胞，产生衍生性工程化细胞的高效高通量方法成为可能，相比于更费时和更难以平行化的诸如荧光激活细胞分选法(FACS)等方法。最后，CSTE系统，替荧光蛋白和抗生素耐药基因的胞内表达代作为整合过程标志物，提供大得多的选择标记空间。特别地，与具有宽光谱重叠的荧光蛋白或高度有限的抗生素耐药基因集合对比，为条件性选择产生大量的独特CST表位是可以轻易地实现的。这种更宽的选择标记可及性使得成效率增加的不同形式高通量衍生细胞产生过程为可能，并且进一步使得用于细胞工程化、通路工程化和实验作业流程中产生细胞文库和细胞谱系跟踪的高内涵方法成为可能。
发明详述
图1中描述CSTE系统的总体架构和操作。CSTE系统作为供体/受体对运行，其中标签-交换供体载体(TEDV)的作用是递送GOI序列和细胞表面标签(CST)外显子至配对的标签-交换接受位点(TERS)，后者通常包含于工程化细胞系的基因组内部。TERS编码一个独特的CST外显子和一个选择基因，它们分别与TEDV所编码CST和GOI交换。
TEDV编码的CST外显子按有义(5’至3’)方向编码并且与包含剪接受体位点、多聚嘧啶串和分支点序列的3’内含子片段符合可读框。直到在‘无功能’内含子序列内部这些有功能内含子序列的5’，编码为第一RMCE元件。GOI按反义(3’至5’)方向编码。直到与GOI转录起始位点毗邻的构建体的3’末端，编码了第二RMCE元件。
工程化细胞系携带的配对TERS构建体编码这样的CST外显子，其与完整内含子序列符合可读框、与‘无功能’内含子序列内部的第一RMCE元件符合可读框、与TEDV的第一RMCE元件配对并且处于TEDV的第一RMCE元件的等同背景下。其中编码这个第一RMCE位点的完整内含子序列包含了本身与跨膜结构域(TD)外显子符合可读框方式编码的5’剪接供体位点。这个TD含有转录起始位点和驱动转录至TERS构建体5’的启动子序列。因此，一旦从剪接的转录物中翻译出来，TERS编码的CST就在细胞表面表达。类似地，一旦RMCE在TEDV和TERS之间执行，TEDV编码的CST外显子就与TERS编码的CST外显子交换。这导致执行‘标签-交换’，其中衍生性工程化细胞系目前在细胞表面表达TEDV编码的CST，并且不表达TERS编码的CST。在这个过程中，TEDV编码的CST外显子从TERS构建体‘获得’5’剪接供体位点、TD结构域、转录起始位点和启动子序列，以使得表达TEDV编码的CST成为可能，对TEDV所编码序列的整合提供严格的位点特异性控制。
如上文提到，TERS编码处于反义(3’至5’)方向的选择基因，以及一个启动子序列，其能够驱动这种选择基因转录，直至TERS构建体3’末端。在选择基因的转录起始位点和TERS的3’启动子序列之间，编码第二RMCE元件，其与TEDV中编码的第二5’RMCE元件配对。因此，当RMCE在TEDV和TERS之间执行，TEDV编码的GOI就与TERS编码的选择基因交换。
重要的是注意，TEDV不含启动子序列，并且因此TEDV编码的CST外显子和GOI必须用启动子序列补足以使其转录。重要地，如上文概述，纳入针对CST外显子的内含子和TD外显子互补作用为TEDV编码的序列整合提供甚至更严格的位点选择性。在CSTE中使用内含子元件提供以下的额外保证水平：构建体的随机整合将不在细胞表面上提供可表达的TEDV所编码CST。与将递送完整CST ORF的包含TD的供体载体相反，CSTE系统仅提供CST表位外显子和剪接受体位点。因此，供体构建体的异常随机整合将不仅需要毗邻有效启动子整合，而且还将需要获得II型跨膜结构域或等同物，附带适宜的5’剪接供体序列。这导致随机整合的构建体极不可能表达TEDV编码的CST，从而在表达已递送GOI的衍生性工程化细胞生成期间最大限度减少对这类随机和不利事件的选择。
下文详细描述包含TEDV和TERS的CSTE系统组成部分的具体架构。
TERS架构
包含于工程化细胞系内部的TERS以组成型方式表达TERS编码的CST和选择基因，一旦用配对的TEDV执行RMCE，则前述二者分别与TEDV编码的CST和GOI交换。图3中描述TERS的通用架构。
TERS一般包含：
a)Kozak序列
b)编码2型膜蛋白跨膜结构域的外显子。
c)5’内含子剪接供体位点。
d)在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的5’RMCE元件，与TEDV的5’RMCE元件作为等同物且配对。
e)3’内含子片段的有功能序列，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点。
f)包含处于5’至3’方向的，TERS所编码的CST的外显子。
g)按5’至3’方向的，编码的CST的转录终止子序列
h)用于3’至5’编码的选择基因的转录终止子序列。
i)按3’至5’方向编码选择基因的序列
j)用于选择基因转录物高效翻译起始的Kozak序列
k)3’RMCE元件
x)负责调节CST转录物表达及其追踪的5’基因组元件。这种基因组元件最少包含驱动CST转录的启动子序列。
y)负责调节选择基因转录物表达及其追踪的3’基因组元件。这种基因组元件最少包含驱动选择基因转录的启动子序列；
其中；提供a)以确保TERS编码的CST在执行RMCE之前和TEDV编码的CST在执行RMCE之后从TERS驱动的的来自毗邻的TD/CST转录物的高效翻译起始；b)代表通过转录物剪接与CST外显子毗连并且介导翻译的蛋白质构建体插入细胞胞质膜中并将CST呈递给胞外空间的TD；c)是位于TERS构建体的内含子序列内部并且与TEDV的5’RMCE元件等同的RMCE元件，其介导CSTE系统内部执行RMCE时的CST外显子交换；e)是内含子的剪接受体位点和相关的有功能序列，其使得从从TERS驱动的TD/CST转录物上剪接含有RMCE元件的内含子成为可能；f)是外显子，其编码TERS位点内部的CST表位，从而表达的TD/CST蛋白将所述表位呈递给胞外空间，并且可以用相应的(cognate)亲和试剂有条件地检出所述表位；g)代表按5’至3’方向编码的TD/CST可读框的转录终止子；h)代表TERS内部按3’至5’方向编码的选择基因可读框的转录终止子；i)代表可读框，其编码工程化细胞系中从TERS表达的选择基因；j)是为确保执行RMCE之前从从TERS驱动的选择基因转录物中的高效翻译起始所提供的Kozak序列；k)是位于选择基因的转录起始位点和驱动这个可读框转录的启动子序列之间并且与TEDV的3’RMCE元件等同的RMCE元件，其介导CSTE系统内部执行RMCE时选择基因与TEDV编码的GOI交换；x)最低限度代表在RMCE之前驱动TERS所编码TD/CST可读框转录并且在执行RMCE之后驱动TEDV所编码TD/CST转录的启动子序列；y)最低限度代表在RMCE之前驱动TERS所编码选择基因可读框转录和在执行RMCE之后驱动TEDV所编码GOI转录的启动子序列。
图3中展示TERS克隆性片段的示意图。
TERS基本上编码含有5’RMCE位点的有完整功能的内含子序列。这种序列可以代表使得宿主工程化细胞背景下高效剪接TD/CST转录物成为可能的任何内含子。要求TEDV的剪接受体位点配合TERS的剪接供体位点发挥功能。因此，TEDV编码的和TERS编码的剪接接纳体序列应当是相同或等同的。
其中编码RMCE位点的非编码和‘无功能’内含子序列还可以编码其他遗传元件如转录增强子、转录绝缘体、为工程化细胞内部TERS构建体的功能或报告作用编码所需独立组件的独特的可读框，或用于转录物和/或构建体追踪和定量的其他独特序列。
在TERS的情况下，例如，编码的TD/CST和选择基因可以含有5’和3'非翻译区(UTR)，所述非翻译区编码用于转录物和/或构建体追踪和定量或赋予转录物稳定性调节作用的独特序列。
选择基因可以选自
a.抗生素耐药基因，
b.报告基因
c.营养缺陷型互补基因，
d.诱导型自杀基因
其中本领域技术人员熟知选择、设计和应用这类正向选择标记。可以在产生表达GOI的衍生性工程化细胞中执行RMCE后，使用诱导性自杀基因消除亲本工程化细胞。报告基因可以代表在细胞表面有条件或组成性做出报告的独特TD/CST构建体。多个选择基因可以纳入TERS的这种部分，以使得生成工程化细胞系期间的正向选择和生成衍生性工程化细胞系期间的负向选择成为可能。
5’和3’基因组元件最低限度编码介导TD/CST和选择基因转录的启动子序列。这类启动子可以代表诱导型启动子的组成。这些基因组元件还可以编码其他遗传元件如转录增强子、转录绝缘体、为工程化细胞内部TERS构建体的功能或报告作用编码所需独立组件的迥异可读框或用于构建体追踪和定量的其他独特序列。
重要的是注意，在本说明书中，TD/CST按有义(5’至3’)方向编码，并且选择基因按反义(3’至5’)方向编码(如图3中所示)。这是为了描述清晰性起见。不存在这些取向为何不能在TERS/TEDV背景中翻转的实际理由，前提是TD/CST构建体可以并入有功能的内含子序列，所述内含子序列还编码RMCE位点，其与TEDV的3’内含子片段内部等同RMCE位点配对。
对于CSTE系统运行，纳入选择基因并非绝对要求，然而就执行RMCE时辅助GOI表达的三重选择而言，是合乎需要的。另外，使用处于有义和反义方向的报告分子生成和维持工程化细胞系确保了包含于5’和3’基因组元件内部的启动子序列在执行RMCE之前有完整功能，以生成表达TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞。
细胞表面标签(CST)架构
CSTE系统的关键功能性特征之一是使用多个独特的CST构建体有条件地报告一旦RMCE执行后并入TEDV编码的序列的已交换的构建体和初始TERS构建体的存在。
为了在CSTE系统内部实现TD补足排列，仅某些类型的TD外显子是合适的。即，可以随同位于其3’的CST外显子一起剪接，同时还允许CST蛋白质片段向胞外暴露的那些。
为了简化呈递已表达CST表位的蛋白质产物并且为了使TD外显子的尺寸和复杂性最小化，来自II型膜蛋白的TD最合适。II型TD是单次跨膜的，并且位于蛋白质的N末端，该末端面向质膜的胞质侧面，允许C末端CST表位向胞外暴露。可以使用其他TD，包括多次跨膜TD，前提是剪接的CST转录物使CST表位暴露于胞外空间。
在剪接的转录物中与TD毗连的CST外显子具有胞外单纯呈递独特表位的功能，其中可以过使用相应的(cognate)亲和试剂，有条件地检出所述独特表位。通常，这类表位包含合成性序列、与宿主工程化细胞的生物不同的生物所编码的序列或来自与宿主工程化细胞相同但不胞外表达的序列。
在TD和CST表位之间纳入接头结构域通常是合乎需要的。由于CST表位可能包含少至数个氨基酸，故这种接头区确保CST在细胞表面处可用于亲和试剂接合。这类接头区域可以包括柔性的‘非结构化’区域，或结构上充分折叠的蛋白质结构域。
由CST外显子编码的表位的性质仅反映在含有TERS的工程化细胞的细胞表面另外表达的表位的背景下的独特性，并且因此可以代表可以对其生成特异性亲和试剂的任何蛋白质序列。
通常而言，CST构建体作为一个整体应当在功能上相对于细胞功能为中性。优选与无外部功能性结构域的惰性表位结构单纯融合、往往借助接头序列融合的跨膜结构域。
在本发明语境下，亲和试剂定义为与较大靶分子特异性结合以便鉴定、追踪、捕获CST表位或影响其活性的任何抗体、肽、核酸或其他小分子。这类亲和试剂往往将以荧光标签、比色标签、放射计量标签或其他可检测标签标记以追踪表达相应的(cognate)CST的细胞。备选地，这类亲和试剂可以官能化到基材上，以使得划分表达CST的工程化细胞的基材亲和力富集法成为可能。
含有TERS的工程化细胞系
鉴于已经插入合成的TERS构建体，含有TERS的细胞系必然是工程化的。通常，这意味着TERS构建体整合至工程化细胞的基因组，但还可能包括用于在核中维持TERS构建体的其他方法，如用于附加体维持遗传构建体的方法。
将构建体整合至目标哺乳动物细胞的基因组中的方法是本领域技术人员熟知的，并且可以经由同源定向重组(HDR)法和/或随机整合法实现，其中HDR可以通过在有待发生HDR的基因组座位处进行定向突变而促进，并且可以通过不同手段实现，所述手段包括但不限于借助以下方式的位点定向诱变
i.锌指核酸酶
ii.CRISPR/Cas9介导的打靶
iii.合成的转录激活物样效应核酸酶(TALEN)
其中所述位点定向核酸酶通过HDR在靶基因座处诱导位点特异性DNA-修复。在这类事件后，一定比例的细胞将已经并入HDR载体，可以通过以下各项的任何组合来选择和/或确定，
iv.非破坏性表型表达分析
v.破坏性表型表达分析
vi.遗传分析
其中iv和vi是选择和确定成功基因组整合事件的优选方法。
备选地，病毒载体可以用来按位点定向或非定向方式递送所需组件。
TERS构建体整合方法对TERS运作不重要，前提是细胞表面处有可检测的TERS所编码CST和存在已表达的选择基因，这表明对于所含的编码性序列转录而言该构建体起了作用。实际上，TERS编码的CST和选择基因是用于生成含有TERS的工程化细胞系的便利选择标记。
一个待注意的重要方面是对于一些应用，要求控制整合的TERS构建体的拷贝数，尤其是那些利用这种能力从TEDV构建体文库产生基于细胞的表达单一GOI的衍生性工程化细胞系阵列的应用和相似的‘多重’方法。指出这点，TERS构建体的附加体维持大体上将不相容于生成衍生性工程化细胞系的这类多重方法。本领域技术人员熟知用于阐明工程化细胞的基因组内部构建体拷贝数的方法。
TEDV架构
TEDV编码当执行RMCE时与TERS编码的CST外显子和选择基因分待别交换的CST外显子和GOI，其中TERS包含于工程化细胞系内部。图2中描述TEDV的通用架构。
TEDV一般包含
1)在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的5’RMCE元件。
2)3’内含子片段，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点。
3)包含处于5’至3’方向TEDV所编码CST的外显子。
4)按5’至3’方向的，编码的CST的转录终止子序列。
5)用于3’至5’编码的GOI的转录终止子序列。
6)按3’至5’方向的，编码GOI的序列。
7)Kozak序列。
8)3’RMCE元件。
其中；1)代表位于TEDV构建体的3’内含子片段的内含子非编码和无功能序列内部的RMCE元件，并且其与TERS的5’RMCE元件等同，在CSTE系统内部介导执行RMCE时的CST外显子交换；2)3’内含子片段，所述片段为TEDV和TERS之间执行RMCE后对已整合TEDV编码的CST外显子的TD/CST转录物执行高效剪接提供分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点，以生成表达GOI的衍生性工程化细胞；3)是在TEDV构建体内部编码CST表位的外显子，从而在TEDV和TERS之间执行RMCE之后补足的表达的TD/CST蛋白将所述表位呈递给胞外空间，可以用相应的(cognate)亲和试剂有条件地检出所述表位；4)代表按5’至3’方向的编码的CST外显子的转录终止子，所述转录终止子作为执行RMCE时用TEDV编码的CST补足的TD/CST的转录终止子发挥作用；5)代表在TEDV内部按5’至3’方向编码的GOI可读框的转录终止子，其中执行RMCE时一旦整合至TERS位点，所述转录终止子就作为编码的GOI的转录终止子发挥作用；6)代表编码GOI的可读框，所述GOI待整合至工程化细胞以生成表达GOI的衍生性工程化细胞；7)为确保执行RMCE之后从TERS驱动的的GOI转录物的高效翻译起始而提供；8)是在TEDV构建体3'端的RMCE元件，并且等同位于选择基因的转录起始位点和驱动这个可读框转录的启动子序列之间的TERS的3’RMCE位点。
图2中展示TEDV克隆性片段的示意图。
TEDV可以代表如通过本领域技术人员熟知方法产生的合成的DNA构建体或克隆的构建体。为了辅助克隆方法，TEDV可以纳入将不同CST外显子和/或GOI序列插入构建体中的限制性核酸内切酶序列。本领域技术人员熟知纳入使用这类克隆位点。
在本发明语境下，TEDV通常将是细菌中扩增的质粒构建体，并且因此还可以包含复制起点和选择基因。
TEDV还可以代表具有下述序列基序的构建体，所述序列基序使得所述构建体包装成特定递送载体如本领域技术人员熟知的病毒载体成为可能。使用病毒载体转导含有TERS的工程化细胞将对否则难以转染的细胞中使用CSTE系统有益。
TEDV可以代表提供适宜逆转录酶时可以逆转录的RNA构建体。
在本发明语境下，GOI由任何编码性或非编码性目的核酸序列限定。它可以包含任何编码蛋白质或编码多肽的可读框、不编码蛋白质的RNA如微小RNA(microRNA)、短发夹RNA、tRNA或rRNA。
重要地，GOI可以代表单一可读框的变体的文库，并且可以将编码这种GOI的TEDV编纂入汇集的TEDV文库。归因于借助CSTE系统实现精确控制拷贝数和GOI整合的可靠多因素及有条件报告，可以产生衍生性工程化细胞的高内涵文库，所述文库仅在靶细胞汇集物中的每个衍生性工程化细胞内表达单一GOI。这可以用于活细胞背景下的一系列细胞、途径、蛋白质和特定GOI工程化(参见下文)。
RMCE元件和酶
已经证明，使用位点特异性重组酶(SSR)是一种修饰细胞基因组的可预测工具。存在两个主要类别的SSR：Ser整合酶和Tyr重组酶，前者包括但不限于ΦC31、γδ-res、ParA、Tn3、Gin、ΦBT1、R4、Bxb1、TP901-1，后者包括但不限于Flp、Cre、R。尽管两个类别均能够进行RMCE，但Ser整合酶具有依赖初始交叉互换的限制作用，因此引入任一者，TEDV编码的所需CST和GOI或TEDV载体骨架将出现。尽管尚未全面地实验地评价全部Tyr重组酶，但Cre和Flp已经广泛地用来进行RMCE。为了整合TEDV编码的CST和GOI遗传元件的单个拷贝，结合充分表征的异特异性FRT位点一起使用Flp是最合适的，原因是人类基因组中缺少编码的假FRT位点。针对LoxP基因组假位点显示杂乱活性的Cre则不是这种情况。
用于产生衍生性工程化细胞的方法
本领域技术人员熟知RMCE在哺乳动物细胞中的用途，其中可以通过一系列方法，包括但不限于化学转染法、电穿孔法或病毒载体递送法，将供体构建体递送至靶细胞。除提供供体构建体之外，还必须提供特异性重组酶。这种重组酶将通常作为随供体构建体一起共递送至靶细胞的独立表达构建体提供。在一些情况下，可能想要修饰表达TERS的工程化细胞，以有条件地表达需要的重组酶，增加整个过程的效率。
在CSTE系统的情况下，一旦已经通过递送TEDV至含有TERS的工程化细胞执行RMCE，并且接着是一个生长阶段，则可以为了生成表达TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞，而分析和或选择靶细胞群体。这可以按照CSTE系统固有且与检测GOI表达无关的三种方式实施。
作为成功标签-交换的反映，可以基于负向选择TERS编码的CST和/或正向选择TEDV编码的CST，选择衍生性工程化细胞系。这些CST被有条件地报告，并且需要添加针对每个CST的相应的(cognate)亲和试剂。通过添加荧光标记的亲和试剂并选择所需的CST表达谱，这类选择方法可以利用FACS。由于向胞外呈递CST表位，也可以通过基于基材的富集方案，如MACS，实现细胞划分。
可以基于TERS编码的选择基因，实现进一步的负向选择，其中所述的选择基因代表报告基因或诱导性型自杀基因。例如，在荧光报告分子基因情况下，报告基因可以利用FACS，或如果报告基因本身代表独特CST，则利用FACS和/或MACS。诱导性型自杀基因可以用来从培养物负向选择亲本工程化细胞；例如，用来富集表达GOI的衍生性工程化细胞。
总之，双重正向选择和单一负向选择提供对衍生性工程化细胞的高度稳健选择，所述选择可以被有条件地报告并且可以用来以基材所固定的亲和试剂划分细胞。如果TEDV所编码GOI的性质可用于衍生性工程化细胞内部的非破坏性检测，这种选择还可以包括基于所述GOI的正向选择。上述的选择可以串联或平行地用来得到高通量或精确高内涵衍生性工程化细胞群体。
通常将使用本领域技术人员熟知的方法，通过基因型确认衍生性工程化细胞中TEDV序列的拷贝数，支持上述这些表型分析。考虑到高度标准化的CST表达背景，其中TEDV构建体异常整合导致TEDV所编码CST在细胞表面表达的情形非常罕见，这种基因型确认也可以在一定程度上表型地实现，可以通过排除高表达TEDV所编码CST的细胞来负向选择，尤其当使用FACS选择方法时如此。在表达多个TERS位点的工程化细胞(参见下文)情况下，可以基于TEDV所编码CST在细胞表面的表达程度，类似地实现拷贝数控制。
用于基材所固定的亲和试剂划分细胞的方法
CSTE系统的关键优点是细胞表面暴露CST表位，及因此基于固定的基材亲和方法划分细胞的能力。这特别可用于高通量方法，或生成高内涵衍生性工程化细胞文库时逐步选择。本领域技术人员熟知的方法是基于铁磁珠的MACS法，连同多种基于表面表位特异性表达捕获和物理划分细胞的其他亲和试剂官能化基材。这类基于细胞表面CST表达的快速和条件性正向和/或负向选择是高度平行的并且因此可用于高通量方法，相比现有抗生素耐药性选择法，速度和精度高得多，并且与限于胞内荧光蛋白的FACS选择法相比，速度快得多且费用降低。另外，正向和负向选择亲本工程化细胞和衍生性工程化细胞的能力导致表达一个或多个GOI的衍生性工程化细胞的精确高内涵文库产生。
用于带多种和多价CST的细胞表面‘条形码’的方法
CSTE系统的优点是可获得增加量的选择标记空间。与仅限于屈指可数的可平行标志物的标准荧光蛋白报告分子和抗生素耐药基因系统相反，可以通过使用简单表位配合相应的(cognate)亲和试剂，快速地产生许多独特标志物。不仅仅受限于可用CST表位和相应的(cognate)试剂的数目，因为可以轻易地为可用CST表位和相应的(cognate)检测试剂的全部独特组合构建多表位CST结构域。扩大的和可平行的有条件报告分子空间使得多种高通量方法和高内涵方法成为可能。
可以使用多个TEDV所编码CST表位(各自与不同的GOI连接)或GOI变体序列在高通量细胞工程化中增加效率。例如，这类独特载体的汇集物可以整合入表达TERS的工程化细胞的汇集物。这些细胞可以通过如上文概述的负向选择受到大量操纵并且稍后基于TEDV所编码独特CST表达来划分。
类似地，使用多个TEDV所编码CST表位使得产生中等内涵文库用于追踪和选择活细胞谱系成为可能。例如，与独特CST相关的GOI文库可以整合入衍生性工程化细胞的汇集物中，并且可以跨时间追踪表达特定GOI的那些细胞谱系的持久性或功能。这可以适用于培养系统中蛋白质、通路或细胞工程化的选择或分析，或可以类似地用于其中将细胞移植到活动物中并稍后作为活细胞回收用于分析的情形。
高内涵文库和多TERS工程化细胞
稳健地正向和负向选择表达GOI的衍生性工程化细胞，可以按多种模式生成精确的高内涵文库，以支持蛋白质、通路和细胞工程化作业流程。
在最简单的构思中，编码单一CST表位但多个GOI的TEDV文库可以整合入细胞汇集物中。例如配合TERS编码的和TEDV编码的CST表位应用标准正向/负向CST选择，将衍生在选定群体的每个细胞中表达单一GOI变体的衍生性工程化细胞群体。这些高内涵细胞文库随后可以在作业流程中经受功能性选择，以基于并入的变体GOI，使蛋白质、细胞通路或更一般地使细胞功能工程化。
向单个工程化的细胞添加具有独特CST表位的多个TERS和具有独特CST表位的多个TEDV文库，则可以将多个变体GOI家族并入这类工程化作业流程，例如，将生物合成途径中的酶作为组合性变体GOI处理。这种其中工程化细胞含有多个TERS的情形可以用来增强单一GOI的总体表达。多重TERS工程化细胞通常将要求独特的异特异性重组酶位点用于每个TERS/TEDV对，以确保GOI整合和选择的效率和稳定性。
附图说明
图1.细胞表面标签交换(CSTE)系统的组成和的操作
CSTE系统示意图。顶部小图描述系统组件，标签交换供体载体(TEDV)居右，且含有标签交换接受位点(TERS)的工程化细胞居左。
TEDV在构建体的任意末端编码RMCE元件(空心三角形和实心三角形)，后者与包含于TERS内部的RMCE位点配对。在代表3’内含子片段的序列内部TEDV构建体的5'端处编码RMCE元件(实心三角形)，其中包含分支点序列、多聚嘧啶串和剪接受体位点的内含子的3’元件(空心圆圈)与RMCE元件的3’紧邻。因此，RMCE包含于‘无功能’和非编码性内含子序列内部，并其中包含于TEDV内部的3’内含子片段缺少5’剪接供体位点。紧邻剪接受体位点的3’，TEDV编码细胞表面标签(CST)的3’外显子，这意味着该外显子编码含有独特分子结合基序(灰色矩形)的CST部分。CST序列是按5’至3’方向编码的，而此TEDV还编码了待按3’至5’方向编码整合到TERS上的目的基因(GOI)(阴影线矩形)。
包含于工程化细胞内部的TERS中央部分编码与TEDV的那些元件区别的元件，尽管架构相同。即，在RMCE元件之间，与TEDV的那些元件(空心三角形和实心三角形)配对，TERS编码与TEDV所编码CST外显子(花格矩形)不同的CST外显子，附带与这个CST(空心圆圈)的5’紧邻的剪接受体位点和相关的3’内含子序列。类似地，选择基因(实心矩形)按反义方向编码于TERS内部，GOI也如此编码于TEDV中。在构建体的5'端纳入启动子序列(向右箭头)，以驱动CST转录。相对于这个启动子序列的3’，编码一个跨膜结构域(TD)外显子(空心矩形)，5’内含子序列紧邻3’(实心圆形)。这意味着与含有RMCE元件的内含子符合可读框编码的TD外显子和CST外显子作为连续转录物产生，所述连续转录物经剪接将外显子毗连成单一的编码mRNA。TERS编码的TD-CST产物(空心/花格哑铃形)表达于细胞表面上。在TERS构建体的3’末端是一个独立启动子元件，其驱动选择基因(实心矩形)按3’至5’方向转录，导致选择基因(实心正方形)表达。
向含有TERS工程化细胞引入TEDV，连同对TEDV/TERS中的配对RMCE元件特异的重组酶的适宜表达构建体，导致执行RMCE，及生成表达GOI的衍生性工程化细胞(底部小图)。TERS编码的元件已经与TEDV编码的元件交换。衍生性细胞系因此在细胞表面表达TEDV编码的CST，作为带有最初TERS所编码TD的TD-CST产物(空心/灰色哑铃形)，并表达GOI(阴影线矩形)。
总之，TEDV和TERS之间执行RMCE导致衍生性工程化细胞生成，所述细胞已经丢失选择基因表达和TERS所编码CST的表达，并且已经获得TEDV所编码CST和GOI的表达。
图2.标签交换递送载体(TEDV)架构
作为线性构建体描述的TEDV示意图，每个编号的方框代表构建体架构的关键元件。构建体含有TEDV所编码CST和目的基因(GOI)。
1)代表在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的5’RMCE元件。
2)代表3’内含子片段的有功能序列，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点。
3)代表按5’至3’方向编码TEDV所编码CST的外显子。
4)代表转录终止子序列，其用于按5’至3’方向的编码的CST。
5)代表转录终止子序列，其用于3’至5’编码的GOI。
6)代表按3’至5’方向编码GOI的序列。
7)代表用于GOI转录物高效翻译起始的Kozak序列。
8)代表3’RMCE元件
图3.标签-交换接受位点(TERS)开放式架构-在标签交换之前
作为线性构建体描述的TERS示意图，每个编号的字母代表构建体架构的关键元件。构建体含有TERS所编码CST和目的基因(GOI)。
a)代表用于毗连的跨膜结构域(TD)/CST转录物高效翻译起始的Kozak序列。
b)代表编码2型膜支架蛋白结构域的外显子。
c)代表5’内含子剪接供体位点。
d)代表在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的5’RMCE元件，其与TEDV的5’RMCE元件作为等同物且与其配对。
e)代表3’内含子片段的有功能序列，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点。
f)代表外显子，其按5’至3’方向编码TERS所编码的CST。
g)代表转录终止子序列，用于按5’至3’方向的编码的CST。
h)代表转录终止子序列，用于3’至5’编码的选择基因。
i)代表按3’至5’方向编码选择基因的序列
j)代表用于选择基因转录物高效翻译起始的Kozak序列
k)代表3’RMCE元件
x)代表负责调节CST转录物表达及其追踪的5’基因组元件。这种基因组元件最少包含驱动CST表达的启动子序列。
y)代表负责调节CST转录物表达及其追踪的5’基因组元件。这种基因组元件最少包含驱动CST表达的启动子序列。
图4.衍生性工程化细胞的已交换TERS
RMCE介导的与TEDV所编码元件交换后的TERS基因座的示意图。如图1中所示，在TEDV的侧翼RMCE位点之间编码的元件与TERS的侧翼RMCE位点之间编码的等同性架构序列交换。这在衍生性工程化细胞系内部产生交换的TERS。字母编号和数字编号的方框分别代表如图2和图3中详述的关键遗传元件。
图5.交换后的TEDV副产物
RMCE介导的与TERS所编码元件交换后的TEDV副产物的示意图。如图1中所示，在TEDV的侧翼RMCE位点之间编码的元件与TERS的侧翼RMCE位点之间编码的等同性架构序列交换。这在衍生性工程化细胞系生成期间产生交换的不稳定TEDV副产物。字母和编号的方框分别代表如图2和图3中详述的关键遗传元件。
图6.TERS整合入工程化细胞
a)通过同源定向重组方式，将编码Myc表位CST和RFP选择基因的TERS盒整合入亲本细胞系ACL-128，产生了工程化细胞系群体ACL-1163。电穿孔后10天，将细胞用抗Myc抗体染色并通过流式细胞术对其分析TERS编码的选择标记，即Myc表位CST和RFP。该图将单一活细胞显示为RFP对比Myc，表明在转染的细胞当中，与亲本细胞(Q2右小图)相比，存在对RFP和Myc均显示高信号的转染子群体(Q2左小图)。
b)选择具有高RFP和Myc信号的细胞并使其生长，并且通过流式细胞术分析代表性工程化单克隆ACL-1163。点图显示设门的单一活细胞的RFP对Myc参数。单克隆ACL-1163具有如预期那样的高RFP和Myc信号(Q2)。
图7.用TEDV连同标签-交换执行RMCE并递送GOI以生成衍生性工程化细胞
在ACL-1163工程化细胞中进行Flp重组酶介导的标签-交换。用编码SBP表位CST和GOI的TEDV连同编码flp重组酶的构建体一起转染携带编码RFP选择基因和Myc表位CST的TERS的ACL-1163细胞。电穿孔后7天，将细胞用抗Myc抗体和抗SBP抗体染色并通过流式细胞术对其分析RFP信号、Myc信号和SBP信号。分选出显示RFP降低和Myc信号降低、但SBP表面表达信号高的细胞并且作为单克隆扩充。a和b)等值线图显示与亲本细胞(右)相比的代表性衍生性工程化细胞单克隆ACL-3426(左)。衍生细胞显示与亲本细胞(Q4右上小图)相比，RFP信号和Myc信号丢失(Q4左上方小图)。衍生性工程化细胞单克隆ACL-3426成功地表达TEDV编码的SBP表位CST，如当抗SBP抗体染色时信号增加所示(Q5底部右小图)。这些结果提示成功地进行Flp重组酶介导的标签-交换，因为ACL-3426细胞已经如预期那样丢失RFP标志物和Myc标志物的信号并且获得SBP表面表达，如同所预期的由于TERS和TEDV之间CST的标签-交换。c)免疫印迹显示了带C端FLAG-标签的已整合GOI表达的三个实例。使用针对Flag标签的抗体通过免疫印迹法实现对GOI(RSV-1ORF)表达的检测。纳入亲本单克隆系ACL-1163作为对照。在三个独立实验中进行CSTE，因而将细胞用编码flp重组酶的构建体转染及用编码SBP表位CST和RSV-1P基因的TEDV转染(所得的细胞系单克隆是ACL-3374)；或用编码SBP表位CST和RSV-1N基因的TEDV转染(所得的细胞系单克隆是ACL-3386)；或用编码SBP表位CST和RSV-1M2长基因的TEDV转染(所得的细胞系单克隆是ACL-3433)。从单克隆提取蛋白质，使用小鼠抗Flag抗体，进行免疫印迹法。蛋白质印迹法结果显示，表达每个RSV-1ORF，如每种相应细胞中存在与每个GOI的预期分子量相对应的单一条带并且亲本细胞系中不存在信号所佐证。
图8.在成功的标签交换事件后，磁力亲和力细胞分选法(MACS)从混合的细胞群体中富集标签2(SBP)或耗尽标签1(Myc)
该图表明表面标签技术可以用于成功的标签交换事件后，从混合的细胞群体中MACS富集携带标签2的细胞或耗尽携带标签1的细胞。在成功的标签交换事件后，通过使用MACS，两种工程化单克隆细胞系APL-4535和APL-3015的起始混合群体用来富集表达标签2(SBP)的细胞或耗尽标签1(Myc)。APL-4535细胞内部的TERS编码SBP表位CST和编码胞内蛋白的全长FLAG标签GOI；而APL-3015细胞内部的TERS编码Myc表位CST和RFP选择基因。将两个细胞群体按90％(APL-3015)对10％(APL-4535)细胞的百分数混合在一起，并且使用MACS富集SBP阳性细胞(a)或在单独的实验中耗尽Myc阳性细胞(b)。a)将全部细胞均用抗SBP-Alexa 488荧光团标记并且与抗小鼠IgG铁珠温育。使样品经历MACS，并且在三个实验时间点–富集前、通流和结合收集级分。用抗c-Myc-Alexa 405复染全部三个级分，并且在BD内流仪上获得数据。该图显示全部三个实验性级分中SBP阳性细胞和Myc阳性细胞的百分数。MACS前级分表明，起始细胞群体由90％的Myc阳性细胞和10％的SBP阳性细胞组成。依据通流级分中缺少SBP信号(>0.01％SBP阳性细胞)展示成功地富集SBP阳性细胞，而SBP定向富集后，95％的结合型细胞是SBP阳性。b)在独立的实验中，将全部细胞均用抗c-Myc-Alexa405荧光团标记并且与抗小鼠IgG铁珠温育。利用MACS，耗尽标记的细胞，并且在如上文所示的三个实验时间点收集级分。用抗SBP-Alexa 488复染全部三个级分，并且在BD内流仪上获得数据。该图显示全部三个实验性级分中Myc定向耗尽后SBP阳性细胞和Myc阳性细胞的百分数。MACS前级分再次表明，起始细胞群体由90％的Myc阳性细胞和10％的SBP阳性细胞组成。依据通流级分Myc阳性细胞数目减少(25％)和SBP阳性细胞数目增加(75％)，展示成功耗尽Myc阳性细胞。另外，结合型级分含有>90％的Myc阳性细胞和<5％的SBP阳性细胞。c)总计对546个SBP阳性染色的独立单克隆评估它们是否编码SBP连接的GOI。该图显示96.52％的SBP阳性细胞的确整合了GOI，而3.48％的SBP阳性细胞不编码GOI。
结果显示，MACS可以用来从混合的细胞群体富集标签2(SBP)阳性细胞或耗尽标签1(Myc)阳性细胞。另外，标签2(SBP)的存在可以作为成功标签交换和GOI基因组整合的指标使用。
图9.使用条形码的细胞表面标签交换(CSTE)系统的组成和操作
使用条形码的CSTE系统示意图。a)描述标签交换供体载体(TEDV)的组件。每个TEDV在构建体的任意末端编码RMCE元件(空心三角形和实心三角形)，后者与包含于TERS内部的RMCE位点配对。在代表3’内含子片段的序列内部编码TEDV构建体的5'端RMCE元件(实心三角形)，其中包含分支点序列、多聚嘧啶串和剪接受体位点的内含子的3’元件(空心圆圈)与RMCE元件的3’紧邻。紧邻剪接受体位点的3’，TEDV编码细胞表面标签(CST)的3’外显子，这意味着该外显子编码含有独特分子结合基序(灰色矩形)的CST部分。按5’至3’方向编码CST序列，其中TEDV还编码待按3’至5’方向整合到编码的TERS(阴影线矩形)上的目的基因(GOI)。
这个实例中每种CST由选自3个潜在独特表位(A、B、C)的两个不同表位组成，所述表位可以组合成6个可能的独特组合。AB有效地等同于BA。在这个实例中，AX组合已经分派给有三个变体(GOI a-i、a-ii和a-iii)的GOI家族，并且BX组合已经分派给有三个变体(GOIb-i、b-ii、b-iii)的第二GOI家族。汇集这个实例中各个TEDV。b)描述标签交换接受位点(TERS)的组件。TERS RMCE元件与TEDV的那些元件(空心三角形和实心三角形)配对。TERS编码与TEDV所编码CST外显子(花格矩形)不同的CST外显子，附带与这个CST(空心圆圈)的5’紧邻的剪接受体位点和相关的3’内含子序列。类似地，选择基因(实心矩形)按反义方向编码于TERS内部，GOI也如此编码于TEDV中。在构建体的5'端纳入启动子序列(向右箭头)，以驱动CST转录。相对于这个启动子序列的3’，编码一个跨膜结构域(TD)外显子(空心矩形)，5’内含子序列紧邻其3’(实心圆圈)。TERS编码的TD-CST产物(空心/花格哑铃形)表达于细胞表面上。在TERS构建体的3’末端是一个独立启动子元件，其驱动选择基因(实心矩形)按3’至5’方向转录，导致选择基因(实心正方形)表达。c)描述向含有TERS工程化细胞群体引入TEDV汇集物，连同对TEDV/TERS中的配对RMCE元件特异的重组酶的适宜表达构建体，从而导致执行RMCE，及生成表达多种GOI的衍生性工程化细胞群体。在RMCE期间，TERS编码的元件与TEDV编码的元件交换。衍生性细胞系群体因此在细胞表面表达TEDV编码的CST，作为带有最初TERS所编码TD的TD-CST产物(空心/灰色哑铃形)，并表达GOI(阴影线矩形)。d)在RMCE后，可以基于独特CST条形码的表达，借助FACS，将表达GOI的工程化细胞汇集物进一步分离成其独立成员。借助单细胞分选方法，这可以作为具有所需条形码的巨大群体或独立细胞分离物而实现。备选地，可以使用条形码作为鉴定数字数据集内部目的群体的手段，在不分选的情况下借助FAC实施汇集物分析。e)作为使用CSTE系统对工程化细胞加条形码的原理验证，采用编码CST的质粒或无CST的对照质粒，使用本领域技术人员已知的标准方法，使用化学转染法(ACL-5)或电穿孔法(ACL-1)，转染ACL-5和ACL-1细胞。CST含有3个独特表位：FLAG、MYC和HA(如SEQ ID 20所代表)。转染后48小时，收获细胞并用荧光团缀合的相应的(cognate)抗体：抗FLAG-PE、抗MYC-AF647和抗HA-AF488染色。通过流式细胞术分析细胞；将活细胞依据前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)设门。对3个表位的每一者测定活细胞的平均荧光强度(MFI)和表达相应表位的活细胞的百分数。与空载体相比，编码条码化CST的质粒转染的细胞中以高的比例和强度检出全部三个表位，因而显示CST由多个表位组成的能力。
以下系列的非限制性实施方案进一步说明本发明：
1.一种组合型系统，包含两个独立组件，其中第一组件是编码旁侧有3’内含子片段的第一细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)的标签-交换供体载体(TEDV)，并且第二组件是工程化细胞，所述的工程化细胞在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)，其编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的第二CST外显子并且还编码处于反义方向的报告基因，其中配对的重组酶介导盒交换(RMCE)元件如此纳入TEDV和TERS中，从而RMCE在TEDV和TERS之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的GOI，以及第一CST外显子交换成第二CST外显子，从而衍生性工程化细胞现在表达第一CST和GOI，替代第二CST和报告基因。
2.根据实施方案1的组合型系统，其中所述第一细胞表面标签(CST)外显子与所述第二CST不同。
3.根据实施方案1-2中任一者的组合型系统，其中第一组件是TEDV，其包含
a.第一RMCE元件
b.3’内含子片段
c.CST外显子
d.第一转录终止子
e.第二转录终止子
f.GOI
g.Kozak序列
h.第二RMCE元件
其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。
4.根据实施方案1-3中任一者的组合型系统，其中第一组件是TEDV，其包含
a.第一RMCE元件–在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的5’RMCE元件
b.3’内含子片段，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点
c.包含处于5’至3’方向的TEDV所编码的CST的外显子
d.按5’至3’方向的，用于编码的CST的第一转录终止子序列
e.第二转录终止子，用于3’至5’编码的GOI
f.按3’至5’方向编码GOI的序列
g.Kozak序列
h.5’RMCE元件
其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。
5.根据实施方案1-3中任一者的组合型系统，其中第一组件是TEDV，其含有
a.第一RMCE元件
b.3’内含子片段
c.CST外显子
d.第一转录终止子
e.第二转录终止子
f.GOI
g.Kozak序列
h.第二RMCE元件
其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。
6.根据实施方案1-5中任一者的组合型系统，其中第二组件是TERS，其包含
a.转录启动子元件
b.Kozak序列
c.跨膜结构域外显子
d.内含子
e.第一RMCE元件
f.CST外显子
g.第一转录终止子
h.第二转录终止子
i.报告基因
j.Kozak序列
k.第二RMCE元件
l.第二转录启动子元件
其中跨膜结构域外显子和CST外显子以从报告基因的反义方向如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。
7.根据实施方案1-6中任一者的组合型系统，其中第二组件是TERS，其包含
a.转录启动子元件
b.Kozak序列
c.2型膜蛋白跨膜结构域外显子
d.5’内含子剪接供体位点
e.在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的5’RMCE元件，且其作为TEDV的5’RMCE元件的等同物并与其配对，
f.3’内含子片段的有功能序列，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点
g.包含处于5’至3’方向TERS所编码的CST(其异于TEDV所编码CST)的外显子
h.按5’至3’方向的，编码的CST的转录终止子序列
i.用于3’至5’方向的转录终止子序列
j.按3’至5’方向编码选择基因的序列
k.用于选择基因转录物高效翻译起始的Kozak序列
l.3’RMCE元件
m.负责调节CST转录物表达及其追踪的3’基因组元件，
其中跨膜结构域外显子和CST外显子以从报告基因的反义方向如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。
8.根据实施方案1-6中任一者的组合型系统，其中第二组件是TERS，其含有
a.转录启动子元件
b.Kozak序列
c.跨膜结构域外显子
d.内含子
e.第一RMCE元件
f.CST外显子
g.第一转录终止子
h.第二转录终止子
i.报告基因
j.Kozak序列
k.第二RMCE元件
l.第二转录启动子元件
其中跨膜结构域外显子和CST外显子以从报告基因的反义方向如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。
9.根据实施方案1-8中任一者的组合型系统，其中TEDV的第一RMCE元件与TERS的第一RMCE元件配对，并且TEDV的第二RMCE元件与TERS的第二RMCE元件配对。
10.根据实施方案1-9中任一者的组合型系统，其中每个CST外显子包含了编码一个或多个分子亲和标签的序列并且由TEDV和TERS的编码的CST是不同的。
11.根据实施方案1-10中任一者的组合型系统，其中工程化细胞在其基因组中含有单个TERS。
12.从TERS基因座生成表达TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞的方法，所述方法包括，
a.生成编码GOI的TEDV
b.向含有配对TERS的工程化细胞系递送所述TEDV，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶
c.使细胞与对TEDV所编码CST和TERS所编码CST都特异的两种或更多种亲和试剂接触
d.基于报告基因和TERS所编码CST的表达削弱和TEDV所编码CST的表达增加，选择衍生性工程化细胞，作为选择GOI已整合的细胞的代替物。
13.根据实施方案12的方法，其中用于步骤c.的亲和试剂是荧光标记的，从而检测削弱的TERS编码的CST表达和增加的TEDV编码的CST表达，从而使得基于所述表达，通过荧光激活细胞分选法划分和选择细胞成为可能。
14.根据实施方案12的方法，其中用于步骤c.的亲和试剂是如此固定至基材上，从而在靶细胞群体中使用基材亲和法，如磁力激活细胞分选法，可以耗尽表达TERS所编码CST的细胞或可以富集表达TEDV所编码CST的细胞。
15.从TEDV的汇集物生成表达一系列TEDV所编码GOI的多个衍生性工程化细胞的方法，所述方法包括，
a.生成两种或更多种TEDV的文库，每种编码独特的GOI序列，并且每种具有独特的TEDV所编码CST
b.向含有配对TERS的工程化细胞系递送作为汇集物的所述TEDV文库，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶
c.使细胞与对TEDV所编码多重CST和TERS所编码多重CST都特异的三种或更多种亲和试剂接触
d.基于报告基因和TERS所编码CST的表达削弱和每个TEDV所编码独特CST的表达增加，选择衍生性工程化细胞。
16.一种在如通过实施方案15的步骤a.和b.产生的细胞汇集物内部，对表达一系列TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞做细胞谱系追踪的方法，所述方法包括，
a.使细胞与对多重TEDV所编码CST特异的两种或更多种亲和试剂接触
b.基于每个独特的TEDV所编码CST的表达，分析衍生性工程化细胞的含量。
17.在如通过以下步骤产生的细胞汇集物内部，对表达一系列TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞做细胞谱系追踪的方法，
-生成两种或更多种TEDV的文库，每种编码独特的GOI序列，并且每种具有独特的TEDV所编码CST
-向含有配对TERS的工程化细胞系递送作为汇集物的所述TEDV文库，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶，
所述方法包括，
a.使细胞与对多重TEDV所编码CST特异的两种或更多种亲和试剂接触
b.基于每个独特的TEDV所编码CST的表达，分析衍生性工程化细胞的含量。
18.标签-交换供体载体(TEDV)，其编码旁侧有3’内含子片段的细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)。
19.根据实施方案18的标签-交换供体载体(TEDV)，其包含
a.第一RMCE元件
b.3’内含子片段
c.CST外显子
d.第一转录终止子
e.第二转录终止子
f.GOI
g.Kozak序列
h.第二RMCE元件
其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。
20.工程化细胞，在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)，编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的细胞表面标签(CST)外显子，并且还编码处于反义方向的报告基因，其中重组酶介导的盒交换(RMCE)元件如此纳入TERS中，从而RMCE在TERS和标签-交换供体载体(TEDV)之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的目的基因(GOI)。
21.根据实施方案20的工程化细胞，其中所述TERS包含：
a.转录启动子元件
b.Kozak序列
c.跨膜结构域外显子
d.内含子
e.第一RMCE元件
f.CST外显子
g.第一转录终止子
h.第二转录终止子
i.报告基因
j.Kozak序列
k.第二RMCE元件
l.第二转录启动子元件，
其中跨膜结构域外显子和CST外显子按反义方向从报告基因如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。
材料和方法
向工程化细胞系整合TERS
电使用穿孔递送需要的DNA构建体，以产生通过同源定向重组方式使单个TERS位点整合入AAVS1位点的工程化细胞。
每个反应，使用Gene Pulser XcellTM(Bio-Rad)连同以下设定：方波285V，脉冲时长12.5毫秒和2次脉冲及1秒间隔时间，在500ul含Glutamax-I的RPMI 1640(LifeTechnologies)中电穿孔4x106个细胞。对于TERS整合载体(V9.F.5)，所用的DNA浓度是15ug/ul，对于编码Cas9-P2A-GFP的质粒(V1.A.8)，是10ug/ml，并且对于编码靶向整合位点AAVS1位点的gRNA的载体(V2.J.6)，是7.5ug/ml(表3)。
在电穿孔后，将细胞在含Glutamax-I+10％FBS的培养基RPMI 1640中温育(37℃，5％CO2)二天，随后分析。
分选表达GFP的多克隆转染子细胞
使用FACSJAzzTM细胞分选仪(BD biosciences)，针对经Cas9-P2A-GFP(V1.A.8)或编码GFP选择标记的质粒(V1.A.4)电穿孔的细胞分选GFP瞬时表达。将细胞洗涤并重悬于足够体积的DPBS中，之后在含Glutamax-I连同20％HI-FBS和Anti-Anti100 X的RPMI 1640(Life Technologies)中分选。
分选稳定表达TERS的单克隆细胞
FACS用来获得组成型表达从TERS接收盒表达的Myc表位CST和RFP选择基因的单一细胞。为了检测Myc CST，将细胞用抗Myc抗体(抗c-Myc-Alexa 647，SantaCruz)染色，之后分选。将细胞在DPBS中洗涤，之后在含Glutamax-I连同20％HI-FBS和Anti-Anti100 X的RPMI 1640(Life Technologies)中分选。
Figure BDA0002890275040000341
Figure BDA0002890275040000351
在InfluxTM(BD Biosciences)FACS上针对表4中列出的滤光片组检测GFP和RFP荧光。将表达Myc和RFP的单一细胞分选入含有200ul生长培养基的96孔板，以培育一组单克隆。
Figure BDA0002890275040000352
单克隆群体的表型筛选
将已长成单克隆群体的20,000个细胞的样品转移入微量滴定板供分析，将细胞重悬于250ul DPBS 1X(Life Technologies)中并在LRSFortessaTM(BD biosciences)上分析。对单克隆群体(ACL-1163)筛选Myc表位CST和RFP的存在。使用Alexa Fluor 647荧光团标记的抗Myc抗体，检测Myc表达。使用稀释于100ul染色缓冲液(DPBS+2％FBS)中的推荐抗体体积，配制染色液。将细胞在4℃温育1小时并且随后用500ul染色缓冲液洗涤两次，之后分析。
单克隆的基因型筛选-确认在正确基因组位置中整合
将ACL-1163细胞在含Glutamax-I+10％HI-FBS的正常生长培养基RPMI 1640中维持。每日监测细胞汇合度，直至它们达到10-12x106。使用QIAamp DNA Minikit(Qiagen)，从5x106个细胞提取DNA。将剩余的细胞进一步扩充并且以3x106个细胞/ml密度低温保存于70％生长培养基+20％HI-FBS+10％DMSO中。
在分子水平筛选和评估ACL-1163单克隆，在20ul反应中，使用表5和表6中分别列出的组分和反应条件，使用
Figure BDA0002890275040000361
热启动高保真DNA聚合酶(NEB)通过PCR来完成这点。为了确定TERS整合盒是否整合入AACS1基因座，使用别靶向在同源性左臂和跨膜结构域之前区域的引物15.F.9和19.E.7(表7)。依据2.1kb扩增子指示左同源臂正确重组。首先，用全部组分(
Figure BDA0002890275040000362
反应缓冲液，dNTP，热启动
Figure BDA0002890275040000363
DNA聚合酶，正向和反向引物，100ng DNA模板和H2O)配制PCR主混合物。使用C1000TouchTM热循环仪(Bio-Rad)运行PCR反应。使用PowerPacBasic(Bio-Rad)，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上1XTAE缓冲剂中走胶，用10,000稀释度的sybersafe染色并用Fusion SL(Vilber Lourmat)分析。
Figure BDA0002890275040000364
Figure BDA0002890275040000371
表6：PCR循环条件
Figure BDA0002890275040000372
表7.引物
Figure BDA0002890275040000373
Figure BDA0002890275040000381
鉴定基因拷贝数
就细胞基因组内部整合的众多TERS盒评价选定单克隆的DNA。为实现这种评价，使用对TERS盒和参比基因(TRAC)特异的引物和探针(表8)，进行微滴式数字PCR(ddPCR)。TERS特异性探针与FAM缀合，并且参比基因特异性探针与HEX缀合。认为ACL-1163细胞对参比基因(TRAC)为二倍体的整合拷贝数。在ddPCR之前，用MfeI(NEB)消化DNA以分离串联整合。使用QX200TM微滴式读数仪和微滴式发生器及C1000 TouchTM深孔热循环仪(Bio-Rad)，根据探针用ddPCRTM Supermix(无dUTP)的方案(Bio-Rad)，遵循反应设置和循环条件。使用检测FAM的Ch1和针对HEX的Ch2，使用QuantaSoftTM软件获得数据。
Figure BDA0002890275040000382
Figure BDA0002890275040000391
Flp-介导的GOI序列整合于衍生性工程化细胞系中
使用电穿孔法递送需要的DNA构建体以促进Flp重组酶介导的标签交换。每个反应，使用Gene Pulser XcellTM(Bio-Rad)以下列设定：方波285V，脉冲时长12.5毫秒和2次脉冲及1秒间隔时间，在500ul含Glutamax-I的RPMI 1640(Life Technologies)中电穿孔4x106个细胞。对于TEDV载体(V9.F.5)，所用的DNA浓度是7.5μg/ml，对于编码FLPO的质粒(V12.A.8)，是10ug/ml，并且对于编码GFP以追踪DNA递送的载体(V1.A.4)，是7.5μg/ml(表3)。
在电穿孔后，将细胞在含Glutamax-I+10％FBS的培养基RPMI 1640中温育(37℃，5％CO2)二天，随后分析及进行GFP阳性细胞的细胞分选。
标签交换的表型分型
为确定是否出现Flp重组酶介导的标签交换，对细胞就Myc和SBP的表面表达染色并测量RFP荧光强度。
电穿孔后7-10天，收获细胞并且使用以下抗体(抗SBP-Alexa647和抗c-Myc-AlexaPE，SantaCruz)，对SBP和Myc作表面染色。在InfluxTM(BD Biosciences)FACS上针对表4中列出的滤光片组检出GFP和RFP荧光。
将表达SBP但不表达Myc和RFP的单一细胞分选入含有200ul生长培养基的96孔板，以培育一组单克隆。
单一细胞分选后20-24天，进行单克隆的表型分型。为了流式细胞分析，从孔转移出细胞并且每管添加300μl RPMI。将细胞在4℃以400g离心3分钟，吸出上清液并且将细胞沉淀物重悬于25μl染色混合物或RPMI(未染色的对照)(染液混合物：抗SBP-Alexa647和抗c-Myc-AlexaPE)中并在4℃温育30分钟。将细胞用染色缓冲液(SB)(DBPS+2％FBS)洗涤两次并且以400g离心3分钟。将细胞重悬于200ul SB中并转移至96孔板，以便在LSRFortessa上采集数据。使用FlowJo进行分析。
确认GOI表达
培育细胞并且在收获后，将细胞用150mM NaCl、50mM Tris pH 8、1％CHAPS、5mM咪唑、1mM PMSF、1x蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo)在4℃在摇床上裂解20分钟。通过在4℃以17000g离心10分钟，净化裂解物并使其在10％丙烯酰胺预制凝胶(Biorad)上按140V接受十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶电泳1小时。将凝胶半干转印到PVDF膜(Biorad)上，随后将所述膜在Tris缓冲盐水/tween 20(TBST)1x中的Sea封闭液1x(Thermo)内封闭15分钟并且在室温与小鼠抗flag抗体(Sigma)温育2小时。将膜在TBST 1x中持续5分钟洗去未结合的第一抗体，3次，并且在室温与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠抗体温育1小时。将膜在TBST 1x中持续5分钟最终洗去未结合的第二抗体，3次，用ECL底物(Biorad)实现HRP信号并Fusion SL Vilber系统采集该信号。
确认GOI基因组整合
在分子水平就GOI编码序列的共整合评估表达细胞表面标签2(SBP)的单克隆细胞系。在30ul反应中，使用表9和表10中分别列出的组分和反应条件，使用
Figure BDA0002890275040000401
热启动高保真DNA聚合酶(NEB)通过PCR来完成这点。为了确定GOI是否整合入基因组，使用靶向GOI的3′UTR区域的引物12.G.5和21.G.8(表7)。首先，用全部组分(
Figure BDA0002890275040000402
反应缓冲液，dNTP，热启动
Figure BDA0002890275040000403
DNA聚合酶，正向和反向引物，100ng DNA模板和H2O)配制PCR主混合物。使用C1000TouchTM热循环仪(Bio-Rad)运行PCR反应。使用PowerPac Basic(Bio-Rad)，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上1XTAE缓冲剂中走胶，用10,000稀释度的sybersafe染色并用Fusion SL(Vilber Lourmat)分析。通过sanger测序法确认一个大小正确的条带编码GOI 3′UTR序列。
表9：PCR混合物
Figure BDA0002890275040000411
表10：PCR条件
Figure BDA0002890275040000412
MACS富集/耗尽表达表面标签的细胞
总体上遵循生产商的MACS富集/耗尽方案(Miltenyi Biotec,#130-047-101,IM0001377.PDF)。
样品准备
将细胞收获并通过在染色缓冲液-M(SB-M–冷Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)，2％FBS，2mM EDTA)中离心(在4℃，300xg，3分钟)来洗涤1次。经40-μm细胞滤网过滤SB-M重悬的细胞，以获得单细胞悬液。用3ml冷SB-M洗涤细胞并且收集细胞沉淀物。每1千万个细胞使用80μl含有适宜抗体或死细胞移除试剂的染色液，并且将样品在4℃温育30分钟。将细胞用3ml SB-M缓冲液洗涤两次并沉淀。
磁珠标记
通过在160μl SB-M中重悬细胞并添加抗小鼠IgG1 MACS微珠(Miltenyi)(每1千万个细胞添加40μl MACS微珠)，用磁珠标记沉淀的细胞。在4℃温育20分钟后，将细胞用3mlSB-M洗涤并且最终重悬于500ul SB-M中。
磁力分离
将LS柱(Miltenyi)置于合适MACS分离器(Miltenyi)的磁场中并用3ml SB-M淋洗。还收集MACS前级分。向该柱添加细胞悬液，并将含有未标记细胞的通流级分收集入15ml锥形管(这称作通流级分)。从分离器取下该柱并置于合适的采集管中。向含有磁力标记的细胞的色谱柱加入5ml SB-M。使用供应的柱塞，施加压力直至柱塞达到柱底部。从色谱柱洗脱磁力标记的细胞(这称作结合的级分)并且该级分用于下游应用中。
实施例1-TERS整合入工程化细胞系
这个实施例描述了TERS稳定整合入细胞系，以产生在基因组中含有单个TERS的工程化细胞系单克隆ACL-1163。
在这个实施例中，作为SEQ ID 1展示的TERS包含以下编码两个基因的选定遗传元件。按有义方向编码的第一基因包含在跨两个外显子编码的ORF上游的EF1a启动子。第一外显子编码跨膜II型蛋白质结构域(TD)并且第二个外显子编码Myc表位标签。两个外显子之间的内含子衍生自人GAPDH基因，并且经修饰以编码在5’内含子剪接供体位点和内含子分支点序列之间的第一异特异性FRT位点(FRT)。该ORF的3’末端编码SV40多聚腺苷化信号终止子。按反义方向编码的第二基因包含在编码荧光报告分子RFP的ORF上游的EF1a启动子。Kozak序列和启动子之间的区域编码第二异特异性FRT位点(F3)。RFP ORF的3’末端编码bGHpA多聚腺苷化信号终止子。
为促进TERS稳定基因组整合入基因组安全港基因座，构建了质粒AAVS1，其中TERS的DNA元件旁侧有AAVS1左同源臂和右同源臂。每条臂包含>500bp与AAVS1基因组座位同源的序列。通过AAVS1基因组安全港基因座处的同源定向重组(HDR)过程，实现TERS稳定整合。
用编码旁侧有AAVS1左同源臂和右同源臂的TERS遗传元件的质粒、编码靶向AAVS1基因座的最佳gRNA的质粒和编码Cas9-P2A-GFP的质粒转染ACL-128细胞系。2天后，基于GFP荧光，FACS分选Cas9-P2A-GFP质粒摄取呈阳性的细胞。进一步扩增GFP分选的细胞超过7天。将TERS转染的细胞用抗Myc抗体染色并且通过流式细胞术对分其析RFP和Myc表位CST的存在(图6a)。已经使TERS整合入其基因组的细胞显示RFP信号和Myc信号升高。分选并扩增这些细胞以代表一批单克隆。图6b中显示一个代表性单克隆ACL-1163，其展示恒定和强烈的RFP和Myc表面表达。为确定基因组受体盒整合入靶向的AAVS1位点，从选择的ACL-1163细胞系提取基因组DNA，并且用相对于TERS接收盒为内部的引物和AAVS1基因座特异性引物(15.F.9和19.E.7，参见表7)进行PCR反应。检测到具有预期大小的PCR扩增子(数据未显示)。另外，采用引物和探针(正向引物1.I.7，反向引物1.I.8，探针1.I.9，参见表8)的ddPCR确认，仅整合了单拷贝的TERS接收盒(数据未显示)。
所得的工程化细胞系ACL-1163含有为了与合适的配对TEDV发生RMCE所设计的单拷贝TERS。
实施例2-用TEDV连同标签-交换执行RMCE并递送GOI以生成衍生性工程化细胞
这个实施例展示了，作为在TEDV所编码序列和TERS之间的RMCE驱动型反应的CSTE系统的执行，在细胞表面上导致CST切换，因此报告了纳入TEDV编码的序列和载货GOI的构建体发生了交换。在本实施例中，使用上述ACL-1163作为靶工程化细胞系。
当前实施例中的TEDV按有义方向编码第一异特异性FRT位点(FRT)、含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点的3’内含子片段；编码链霉亲和素结合肽(SBP)和SV40多聚腺苷化信号终止子的外显子。源自呼吸道合胞体病毒(RSV)的三个独立GOI按反义方向在独立的TEDV中编码，每个GOI ORF位于第二异特异性FRT位点(F3)和3’bGHpA多聚腺苷化信号终止子之间。SEQ ID 3-SEQ ID 5的序列代表三个独立SBP表位CST和编码所用TEDV构建体的GOI。
在本实施例中，将实施例1中构建的工程化细胞系ACL-1163用TEDV(选自序列SEQID 3-SEQ ID 5)和用编码RMCE重组酶(FLPO，V4.1.8，表3，SEQ ID 2)表达的载体电穿孔。将细胞温育7-10天以允许整合偶联发生并且随后用抗Myc抗体和抗SBP抗体染色并通过流式细胞术对其分析RFP、Myc和SBP报告分子信号。分选和扩增了展现出RFP信号和Myc信号降低、但SBP信号升高(表明‘标签交换’)的细胞，以代表一批单克隆。图7a和图7b中描述对代表性单克隆ACL-3426的表征。为了确认表面标签交换成功，将单克隆性ACL-3426用针对Myc的抗体和针对SBP的抗体染色并通过流式细胞术对其分析RFP和表面Myc表达的丢失(图7a)和SBP信号获得(图7b)。实际上，实施了CSTE的细胞通过展示SBP信号且不展示Myc信号或RFP信号，显示标签-交换成功。平行分析亲本细胞并且显示其有持续的高RFP和Myc信号(图7a右小图)并且显示低SBP信号(图7b右小图)。
为了展示在CSTE后，GOI ORF整合并且一直表达，通过免疫印迹法评估来自使用上述每种编码独特的RSV-1GOI的TEDV的独立实验中的三个单克隆(图7c)。GOI ORF是3个来自RSV-1的基因：P、N基因和M2基因(长)，每个都编码来自TEDV的Flag标签。进行CSTE，因而将细胞用编码flp重组酶的构建体转染及用编码SBP表位CST和RSV-1P基因的TEDV(所得的细胞系单克隆是ACL-3374)转染；或用编码SBP表位CST和RSV-1N基因的TEDV(所得的细胞系单克隆是ACL-3386)转染；或用编码SBP表位CST和RSV-1M2长基因的TEDV(所得的细胞系单克隆是ACL-3433)转染。从单克隆提取蛋白质，对样品进行免疫印迹，使用小鼠抗Flag一抗，随后与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠抗体温育。用ECL底物产生HRP信号。依据每个GOI的预期分子量的flag阳性单一条带(图7c，泳道2-4)的存在，表明了成功进行的CSTE。平行分析亲本细胞并且显示不存在Flag标签信号(图7c泳道5)。
总之，这个实施例表明细胞表面标签-交换可以用来有条件地报告存在初始TERS构建体，和存在经过RMCE的执行后已交换的并入TEDV编码的序列的构建体，并且报告了GOI整合和表达，与检测GOI本身无关。
实施例3–在成功的标签交换事件后，磁力亲和细胞分选法(MACS)从混合的工程化细胞群体中富集标签2(SBP)或耗尽标签1(Myc)
这个实施例表明，表面标签技术可以用于MACS富集标签2(SBP)或耗尽标签1(Myc)。另外，标签2(SBP)的存在可以用来在标签交换事件成功后监测目的基因(GOI)的并入。使用两个工程化单克隆细胞系APL–3015和APL–4535的初始混合群体。这些细胞群体按90％Myc阳性APL-3015细胞和10％SBP阳性APL-4535细胞混合。APL-4535细胞内部的标签交换接受位点(TERS)编码SBP表位CST和编码胞内蛋白的全长的带FLAG标签的GOI，而APL-3015细胞内部的TERS编码Myc表位CST和RFP选择基因。磁力亲和细胞分选法(MACS)用来从混合的群体富集SBP阳性APL-4535细胞。在一个独立实验中，MACS用来从混合的群体耗尽Myc阳性APL-3015细胞。
在第一情况下，将混合的细胞群体用抗SBP-Alexa 488荧光团标记并且随后与抗小鼠IgG铁珠温育。使用MACS，富集SBP标记细胞并且用抗c-Myc-Alexa 405荧光团复染。图8a描述三个实验步骤中SBP阳性细胞和Myc阳性细胞的百分数：1)MACS前，以确认混合的细胞群体中SBP阳性细胞和Myc阳性细胞的起始比率；2)通流，以评估当柱置入磁场时MACS柱未捕获的SBP阳性细胞和Myc阳性细胞的百分数；以及3)结合的级分，用来评估被MACS柱捕获的SBP阳性细胞和Myc阳性细胞的百分数。用抗c-Myc Alexa 405荧光团复染全部三个级分，并且在BD内流仪上获得数据。图8b依据通流级分中缺少SBP阳性细胞(<0.01)，展示了成功地富集了SBP阳性细胞，而SBP定向富集后，95％的结合的细胞是SBP阳性。
为了展示表面标签技术从混合细胞群体MACS法耗尽表达标签1(Myc)的基础细胞系的用途，将全部细胞均用抗c-Myc-Alexa 405荧光团标记并且与抗小鼠IgG铁珠温育。利用MACS，耗尽标记的细胞，并且在如同前述那样收集级分。用抗SBP-Alexa 488复染全部三个级分，并且在BD内流仪上获得数据。依据通流级分Myc阳性细胞数目减少(25％)和SBP阳性细胞数目增加(75％)，展示了成功耗尽了Myc阳性细胞。
另外，为了展示可能使用标签2(SBP)的存在作为报告物在标签交换事件成功后监测GOI的并入，对总计546个SBP阳性独立单克隆评估它们是否编码SBP连接的GOI。图8c中的图显示96.52％的SBP阳性细胞的确编码GOI，而3.48％的SBP阳性细胞不表达GOI。
结果表明，表面标签技术适合于在成功的标签交换后，从混合的细胞群体中富集表达标签2(SBP)的单克隆或耗尽未修饰的基线(表达标签1(Myc)的单克隆)。另外，标签2(SBP)的存在与成功的标签交换事件后GOI的并入相关并且因此细胞表面上标签2(SBP)的存在可以用作已经将GOI成功递送入工程化细胞系内部TERS中的指标。
实施例4–使用条形码的细胞表面标签交换(CSTE)系统的组成和操作
这个实施例描述了使用CSTE系统对表达GOI的工程化细胞加条形码的构思示意图。
图9是使用CSTE系统对表达GOI的细胞加条形码的示意图。小图a和b分别描述系统组件，连同标签交换供体载体(TEDV)的汇集物和含有标签交换接受位点(TERS)的工程化细胞。
每个TEDV在构建体的5’和3’末端编码RMCE元件，后者与包含于TERS内部的RMCE位点配对。位于TEDV构建体的5'端的RMCE元件被编码在代表3’内含子片段的序列内部，其中与RMCE元件的3'端紧邻的是内含子的3’元件，包含分支点序列、多聚嘧啶串和剪接受体位点的。因此，RMCE包含于‘无功能’和非编码性内含子序列内部，并其中包含于TEDV内部的3’内含子片段缺少5’剪接供体位点。紧邻剪接受体位点的3’，TEDV编码了细胞表面标签(CST)的3’外显子，这意味着该外显子编码含有独特分子结合基序的CST部分。按5’至3’方向编码CST序列，而TEDV还编码待按3’至5’方向编码整合入TERS中的目的基因(GOI)。
这个实例中每种CST由选自3个潜在独特表位(A、B、C)的两个不同表位组成，所述表位可以组合成6个可能的独特组合。由于难以借助现有技术区分每个表位的排列，故AB有效地等同于BA。在这个实例中，AX组合已经分派给有三个变体(GOI a-i、a-ii和a-iii)的GOI家族，并且BX组合已经分派给有三个变体(GOI b-i、b-ii、b-iii)的第二GOI家族。汇集这个实例中各个TEDV(图9a)。
包含于工程化细胞内部的TERS中央部分编码与TEDV的那些元件区别的元件，尽管架构相同。即，在RMCE元件之间，与TEDV的那些元件配对的是，TERS编码CST外显子(区别于TEDV编码的CST)，并附带与这个CST的5’紧邻的剪接受体位点和相关的3’内含子序列。类似地，选择基因按反义方向编码于TERS内部，如同也如此编码于TEDV中的GOI。在构建体的5'端纳入启动子序列，以驱动CST转录。相对于这个启动子序列的3’，编码一个跨膜结构域(TD)外显子，并具有紧邻其3’端的5’内含子序列。这意味着与含有RMCE元件的内含子符合可读框编码的TD外显子和CST外显子作为连续转录物产生，所述连续转录物经剪接将外显子毗连成单一的编码mRNA。TERS编码的TD-CST产物表达于细胞表面上。在TERS构建体的3’末端是一个独立启动子元件，其驱动选择基因按3’至5’方向转录，导致选择基因表达(图9b)。
向含有TERS工程化细胞群体引入TEDV汇集物，连同对TEDV/TERS中的配对RMCE元件特异的重组酶的适宜表达构建体，导致RMCE的执行，及生成表达GOI的衍生性工程化细胞群体(图9c)。TERS编码的元件已经与TEDV编码的元件交换。衍生性工程化细胞因此在细胞表面表达TEDV编码的CST，作为带有最初TERS所编码TD的TD-CST产物，并表达GOI。
总之，TEDV和TERS的汇集物之间执行RMCE导致衍生性工程化细胞汇集物生成，所述细胞汇集物已经失去TERS编码的原始CST和选择基因的表达，并且汇集物中的每个细胞已经从TEDV汇集物获得TEDV所编码的CST和GOI成员之一的表达。可以借助FACS，将表达GOI的工程化细胞汇集物进一步分析/分离成其独立成员，例如，基于独特CST条形码的表达来分离(图9d)。例如，借助单细胞分选方法，这可以作为具有所需条形码的巨大群体或独立细胞分离物实现。备选地，可以使用条形码作为鉴定数字数据集内部目的群体的手段，在不分选的情况下借助FAC实施汇集物分析，例如二次分析细胞功能，例如，以关联变体GOI表达或细胞功能。
为展示CST可以由多个表位组成的构思，用编码CST的质粒或无CST的对照质粒转染ACL-1和ACL-5细胞(图9e)。CST包含3个独特表位：FLAG、MYC和HA，并且由序列SEQ ID 20代表。使用本领域技术人员已知的标准方法，使用化学转染法(ACL-5)或电穿孔法(ACL-1)，转染细胞。48小时后，收获细胞并用荧光团缀合的相应的(cognate)抗体：抗FLAG-PE、抗MYC-AF647和抗HA-AF488染色。通过流式细胞术分析细胞，将活细胞依据前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)设门。对3个表位的每一者测定活细胞的平均荧光强度(MFI)和表达相应表位的活细胞的百分数。与空载体相比，编码条码化CST的质粒转染的样品中细胞以高的比例和强度检出全部三个表位，因而显示由多个表位组成的CST。
结果显示表面标签技术适合给细胞系加条形码，因为CST可以由多个表位组成。
缩略语列表
AAVS1 腺相关病毒整合位点1
APC 抗原呈递细胞
Cas9 CRISPR相关基因9
CMV 巨细胞病毒
cre Cre重组酶
CRISPR 规律间隔成簇短回文重复序列
CST 细胞表面标签
CSTE 细胞表面标签交换
DMSO 二甲亚砜
DNA 脱氧核糖核酸
DPBS Dulbecco’s磷酸缓冲盐水
DSB 双链断裂(Double-strand break)
dUTP 脱氧尿嘧啶核苷三磷酸
EDTA 乙二胺四乙酸
EF1 alpha 延伸因子1alpha(用于真核翻译)
FACS 荧光激活的细胞分选
FAM Fluorescein amidite
FBS 胎牛血清
FLP 翻转酶
FRT 翻转酶识别靶标
GFP 绿色荧光蛋白
GOI 目的基因
gRNA 指导核糖核酸
HLA 人白细胞抗原
IRES 内部核糖体进入位点
MACS 磁激活的细胞分选
NEB New England biolabs
NHEJ 非同源末端接合
ORF 可读框
PCR 聚合酶链反应
RFP 红色荧光蛋白
RMCE 重组酶介导的盒交换
RPMI 罗斯维尔公园纪念学院
RSV 呼吸道合胞体病毒
RT 逆转录
RNA 核糖核酸
SBP 链霉亲和素结合肽
SSR 位点特异性重组酶
SV40 猴病毒40
SV40pA 猴病毒40聚(A)
TAA 肿瘤相关抗原
TALEN 转录样效应子核酸酶
TAE Tris-乙酸盐-EDTA
T细胞 T淋巴细胞
TCR T细胞受体
TCS 靶编码性序列
TD 跨膜结构域
TEDV 标签交换供体载体
TERS 标签交换接受位点
rRNA 核糖体RNA
tRNA 转运RNA
UTR 非翻译区
ZNF 锌指核酸酶
定义列表
扩增子：使用多种方法(包括PCR)时作为人工扩增的来源和/或产物的一段DNA或RNA。
抗体：由免疫系统的特化细胞(称作B细胞)表达和含有两条链的亲和分子。B细胞表达非常庞大和非常多样的抗体组库，所述抗体通常不结合自身蛋白，而可以结合并中和将威胁宿主的病原体或毒素。经常使用天然的或人工工程化的抗体作为亲和试剂。
营养缺陷型：需要正常株系不需要的特定附加养分的突变体生物(尤其细菌或真菌)。
顺式作用元件：调节附近ORF转录的非编码性DNA区域。
CST：允许报告目的基因整合的共整合的细胞表面标签
CSTE系统：一个作为供体/受体对运行的系统，其中标签-交换供体载体的作用是将目的基因序列和细胞表面标签外显子递送至配对的标签-交换接受位点，所述标签-交换接受位点包含于工程化细胞系的基因组内部。
衍生性工程化细胞：已经过进一步基因修饰以交换CST并整合GOI的工程化细胞
DNA：脱氧核糖核酸。形成编码基因和蛋白质的遗传物质的分子的化学名称。
工程化细胞：基因组已经通过基因修饰作用工程化的细胞。
表位：抗体靶上为抗体或其他亲和试剂结合的区域。
真核条件性调节元件：可以影响启动子的活性的DNA序列，所述启动子在限定条件下可能被诱导或阻遏。
真核启动子：编码RNA聚合酶结合位点及反应元件的DNA序列。启动子区的序列控制RNA聚合酶和转录因子结合，因此启动子在确定何处和何时您的目的基因将表达方面发挥巨大作用。
真核终止子/信号终止子：与RNA聚合酶II结合并触发转录过程终止的蛋白质因子识别的DNA序列。它还编码聚腺苷酸信号。
FACS/流式细胞术：荧光激活细胞分选法。流式细胞术是籍此可以对独立细胞分析特定细胞表面标记和胞内标记表达的技术该技术的变型，细胞分选，允许取回携带限定标记集合的细胞供进一步分析。
翻转酶：衍生自面包酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))2μm质粒的重组酶(翻转酶，Flp)。
荧光(蛋白)标志物：具有特定消光特征和发射特征并且可以用显微术、FACS和相关技术检测到的分子。
基因顺式作用元件：存在于它们调节的基因的相同DNA分子上，而反式调节元件可以调节与这些元件转录自其中的基因相距一段距离的基因。顺式调节元件经常是一种或多种反式作用因子的结合位点。
遗传条形码：DNA条形码是使用某生物的DNA中的短遗传标记物鉴定该生物属于特定物种的分类学方法。
GOI：作为编码或不编码目的序列的任何核酸定义的目的基因。
异特异性重组酶位点：由重组酶识别以促进两个DNA分子交叉互换的DNA序列。
同源臂：一段DNA，其与互补性同源臂具有几乎相同序列同一性并因此通过细胞过程(同源性指导的修复)促进两个DNA分子发生交换。
绝缘子：防止基因受附近基因激活或阻遏过程影响的DNA序列。绝缘子还防止异染色质从沉默的基因扩散至活跃转录的基因。
整合：DNA序列物理连接入细胞的染色体
内部核糖体进入位点(IRES)：一旦转录则编码允许翻译以非帽依赖性方式起始的RNA元件的DNA序列
内含子：RNA转录物的非编码部分，或编码它的DNA，所述非编码部分在RNA分子翻译成蛋白质之前剪出
内含子分支点序列：启动对供体剪接位点5′的亲核攻击的分支点核苷酸。上游内含子的游离末端随后启动对剪接接受位点3′的第二亲核攻击，释放作为RNA套索的内含子且共价地组合两个显子
K是表示酮的核苷酸代码(K＝G或T)
Kozak序列：高效翻译起始所要求的短序列
M是表示氨基的核苷酸代码(M＝A或C)
MACS：磁力激活细胞分选法：其中用含有磁性粒子的亲和分子标记细胞以使用磁场分离的细胞分离技术。
匹配：此时，两种组件编码了指导并限制互补的组件之间相互作用的遗传元件
单克隆细胞系：通过反复的细胞复制从单一祖先细胞产生的限定细胞群体。N是表示任何核苷酸的核苷酸代码(N＝A、T、C或G)
先天：对细胞而言天然存在的实体
负向选择标记：向载体和/或携带所述标记携带载体的宿主生物赋予负向选择作用的选择标记
非编码性基因：转录成有功能的非编码性RNA分子的不编码蛋白质的DNA序列
复制起点：载体、质粒或基因组中引发复制的特定序列。
ORF：可读框(开放读码框)。一段编码翻译框架以借助核糖体合成蛋白质(多肽)的遗传物质
突出端：在双链核酸分子末端处的单链序列。经常称作粘性末端或粘末端。
PCR：其中指数扩增特定靶DNA分子的聚合酶链反应
肽：短的、一般在6-30个氨基酸长度之间的氨基酸串
表型分析：细胞可观测特征的分析。
质粒：可以在细菌或原生动物的细胞质中独立于染色体发生复制的遗传构建体，一般为小型环状DNA链。
多肽：由一段肽组成，形成三维结构的蛋白质。
聚嘧啶基序：(CnTn)基序富含嘧啶并且存在于CAG内含子3’末端上游。
正向选择标记：向载体和/或携带所述标记携带载体的宿主生物赋予正向选择作用的选择标记
引物：允许例如在PCR期间特异性识别靶DNA序列的短DNA序列。
启动子：用于基因表达受控起始的调节性DNA元件
重组酶：介导遗传重组、催化RMCE的酶。
报告元件：遗传元件，其在携带所述元件的生物或载体中介导报告的信号。可以用作正向或负向选择标记。
限制性酶切割序列：由限制性酶切割的基因序列，可以相对于所述限制性酶的识别序列为外来或固有。
限制性酶识别序列：限制性酶识别和接合的基因序列。
RMCE：重组酶介导盒的交换。重组酶催化在基因组接受位点处交换遗传物质。
剪接受体位点：在内含子AM、APX CM或亲和试剂3'端与表面上具有TCRsp的细胞或基于TCRsp的试剂相互作用的DNA序列
剪接供体位点：在内含子5'末端的DNA序列
自杀基因：一种基因，其将会在携带所述基因的宿主生物内部介导细胞死亡。可以用作正向或负向选择标记。
合成的：人工产生的实体。
TEDV：与包含工程化细胞的基因组内部的标签-交换接受位点配对的标签-交换供体载体。用它来递送目的基因和细胞表面标签外显子
TERS：包含于工程化细胞系的基因组内部的配对标签-交换接受位点
II型跨膜结构域：接近于N末端的疏水性残基单一不可切割性跨膜段，其充当合并信号/锚序列，附带在膜的内部上的N端部分和暴露在细胞外部上或ER管腔中的C端部分。
载体：载体是携带遗传信息的遗传构建体。在本发明语境下，载体通常描述质粒型DNA载体。载体可以代表在宿主生物中可以扩增并选择的任何这类构建体。
W是表示弱的核苷酸代码(W＝A或T)。
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Claims (15)

1.一种组合型系统，包含两个独立组件，其中第一组件是编码旁侧有3’内含子片段的第一细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)的标签-交换供体载体(TEDV)，并且第二组件是工程化细胞，所述的工程化细胞在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)，其编码与第一CST不同的、由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的第二CST外显子，并且还编码处于反义方向的报告基因，其中配对的重组酶介导盒交换(RMCE)元件如此纳入TEDV和TERS中，从而RMCE在TEDV和TERS之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的GOI，以及第一CST外显子交换成第二CST外显子，从而衍生性工程化细胞现在表达第一CST和GOI，替代第二CST和报告基因。
2.根据根据权利要求1所述的组合型系统，其中第一组件是TEDV，其包含
a.第一RMCE元件
b.3’内含子片段
c.CST外显子
d.第一转录终止子
e.第二转录终止子
f.GOI
g.Kozak序列
h.第二RMCE元件
其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。
3.根据权利要求1或2所述的组合型系统，其中第二组件是TERS，其包含
a.转录启动子元件
b.Kozak序列
c.跨膜结构域外显子
d.内含子
e.内含子序列内部编码的第一RMCE元件
f.CST外显子
g.第一转录终止子
h.第二转录终止子
i.报告基因
j.Kozak序列
k.第二RMCE元件
l.第二转录启动子元件
其中跨膜结构域外显子和CST外显子以从报告基因的反义方向如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合型系统，其中TEDV的第一RMCE元件与TERS的第一RMCE元件配对，并且TEDV的第二RMCE元件与TERS的第二RMCE元件配对。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合型系统，其中每个CST外显子包含了编码一个或多个分子亲和标签的序列并且由TEDV和TERS编码的CST是不同的。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的组合型系统，其中工程化细胞在其基因组中含有单个TERS。
7.从TERS基因座生成表达TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞的方法，所述方法包括，
a.生成编码GOI的TEDV
b.向含有配对TERS的工程化细胞系递送所述TEDV，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶
c.使细胞与对TEDV编码的CST和TERS编码的CST都特异的两种或更多种亲和试剂接触
d.基于报告基因和TERS所编码CST的表达削弱和TEDV编码的CST表达增加，选择衍生性工程化细胞，作为选择整合有GOI的细胞的代理。
8.根据权利要求7所述的方法，其中用于步骤c.的亲和试剂是荧光标记的，从而检测削弱的TERS编码的CST表达和增加的TEDV编码的CST表达，从而使得基于所述表达，通过荧光激活细胞分选法划分和选择细胞成为可能。
9.根据权利要求7所述的方法，其中用于步骤c.的亲和试剂如此固定至基材上，从而在靶细胞群体中使用基材亲和法，如磁力激活细胞分选法，可以耗尽表达TERS所编码CST的细胞或可以富集表达TEDV所编码CST的细胞。
10.从TEDV的汇集物生成表达一系列TEDV所编码GOI的多个衍生性工程化细胞的方法，所述方法包括，
a.生成两种或更多种TEDV的文库，其中每种编码独特的GOI序列，并且每种具有独特的TEDV所编码的CST
b.向含有配对TERS的工程化细胞系递送作为汇集物的所述TEDV文库，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶
c.使细胞与对TEDV所编码多重CST和TERS所编码多重CST都特异的三种或更多种亲和试剂接触
d.基于报告基因和TERS所编码CST的表达削弱和每个TEDV所编码独特CST的表达增加，选择衍生性工程化细胞。
11.在如通过以下步骤产生的细胞汇集物内部，对表达一系列TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞做细胞谱系追踪的方法，
-生成两种或更多种TEDV文库，每种编码独特的GOI序列，每种具有独特的TEDV所编码的CST
-向含有配对TERS的工程化细胞系递送作为汇集物的所述TEDV文库，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶，
所述方法包括，
a.使细胞与对多重TEDV所编码CST特异的两种或更多种亲和试剂接触
b.基于每个独特的TEDV所编码CST的表达，分析衍生性工程化细胞的含量。
12.标签-交换供体载体(TEDV)，其编码旁侧有3’内含子片段的细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)。
13.根据权利要求12所述的标签-交换供体载体(TEDV)，包含
a.第一RMCE元件
b.3’内含子片段
c.CST外显子
d.第一转录终止子
e.第二转录终止子
f.GOI
g.Kozak序列
h.第二RMCE元件
其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。
14.工程化细胞，在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)，编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的细胞表面标签(CST)外显子，并且还编码处于反义方向的报告基因，其中重组酶介导的盒交换(RMCE)元件如此纳入TERS中，从而RMCE在TERS和标签-交换供体载体(TEDV)之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的目的基因(GOI)。
15.根据权利要求14所述的工程化细胞，其中所述TERS包含：
a.转录启动子元件
b.Kozak序列
c.跨膜结构域外显子
d.内含子
e.第一RMCE元件
f.CST外显子
g.第一转录终止子
h.第二转录终止子
i.报告基因
j.Kozak序列
k.第二RMCE元件
l.第二转录启动子元件，
其中跨膜结构域外显子和CST外显子按反义方向从报告基因如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。
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