JP2002514054A - ウイルスベクターおよびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳類遺伝子機能を解明する方法および組成物に関する。特に、本発明は、改良された哺乳類相補性スクリーニング、特定の必須または可欠哺乳類遺伝子の機能的不活化、および特定の刺激に応答して変調される哺乳類遺伝子の同定を行う方法および組成物に関する。特に、本発明の組成物としては、限定するものではないが、複製欠損レトロウイルスベクター、そのようなベクターを含むライブラリー、レトロウイルスパッケージング細胞系統とともにそのようなベクターにより産生されるレトロウイルス粒子、本発明のレトロウイルス粒子由来の組み込まれたプロウイルス配列および本発明の組み込まれたプロウイルス配列から切除された環状化プロウイルス配列が挙げられる。本発明の組成物はさらに、新たなレトロウイルスパッケージング細胞系統を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルスベクターおよびそれらの使用 資金供給 ここに記載された研究は、合衆国国立衛生研究所からの資金供給により援助さ れたものである。合衆国政府は、本発明における確かな権利を有する。導入 本発明は、哺乳類の遺伝子機能を解明する方法および組成物に関するものであ る。特に、本発明は、哺乳類の相補性スクリーニング、特定の必須または可欠哺 乳類遺伝子の機能不活化、特定の刺激に応答して変調された哺乳類遺伝子の同定 、分泌タンパク質の同定および細胞パッケージング(packaging)を改良する方法 および組成物に関するものである。発明の背景 酵母遺伝系において、宿主細胞に表現型を与える目的で、遺伝子配列を供給す るのに多くの選択肢が利用できる。例えば、ある一般的な供給系として、内因性 酵母２ミクロンプラスミドに基づく高コピープラスミド系がある。この起点から のプラスミドは、細胞当たりおおよそ100のコピー数を達成し、分裂の際に無作 為に娘細胞に分離する。別の系には、ＣＥＮ系がある。ＣＥＮプラスミドは、低 コピー数（細胞当たり約１から２）で維持され、宿主染色体の分離に使用された 同じ機構により娘細胞に分離される。 さらに、遺伝子の単離および遺伝子機能の発見の問題を効率的に取り扱うこと のできる方法が、酵母において発明されてきた。例えば、酵母において、それら の特定の表現型を相補する能力により、遺伝子を単離することができる。さらに 、酵母において、標的挿入突然変異誘発技術を酵母に用いて、遺伝子活性を不活 化または「ノックアウト(knock out)」しても差し支えない。しかしながら、哺 乳類系においては、そのような方法は、実際的な条件において不十分であり、こ のために、哺乳類の遺伝子機能の解明が困難になっている。 例えば、哺乳類細胞における遺伝子不活化技術に関して、哺乳類細胞は、二倍 体であり、複雑な遺伝子を有しているという事実のために、哺乳類系における挿 入突然変異誘発技術が、骨の折れ、時間のかかる長ったらしい方法となっている 。 さらに、哺乳類細胞における相補性スクリーニングのような能力の開発に対す る主な障壁は、従来の技術では、ほとんどの細胞における遺伝子転移効率（0.01 ％−0.1％）が、高度に複雑なライブラリーのスクリーニングを実施不可能にす るようなものであることであった。報告書には、組換え体である、複製欠損レト ロウイルスにより、哺乳類細胞における遺伝子転移効率を増大させることができ ることが示されているが（Rayner & Gonda，1994，Mol．Cell．Biol．14:880-88 7;Whitehead et al.，1995，Mol．Cell．Biol．15:704-710）、レトロウイルス をベースとする機能性哺乳類クローニング系は、不便であり、したがって、幅広 い用途に使用することができない。 現在のレトロウイルスをベースとするクローニング系の不便さと実行不可能性 としては、例えば、高度に複雑なライブラリーの製造が、既知のレトロウイルス パッケージング細胞系統の形質移入効率が低いことにより制限されているという 事実が挙げられる。さらに、どの系も、陽性のクローンのゲノムからの組込みレ トロウイルス性プロウイルスの、規定の容易な回収を与えていない。例えば、現 在用いられている系においては、レトロウイルス挿入物の回収は、ポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）技術により行ってもよいが、これは、極めて時間がかかり、 異なる挿入物に関して変動する。さらに、ＰＣＲの使用に関して、続いてのスク リーニングのためのウイルスベクターを産生するためには、まだ、追加のクロー ニング工程が必要である。さらに、復帰突然変異体を、偽の陽性の主な原因であ る、プロウイルス依存性レスキュー(rescues)から区別する機構が得られていな い。 さらに、哺乳類系における効率的な幅広いスペクトルの用途に、酵母中に見ら れる系のようなエピソーム系が存在すれば都合よい。例えば、ウシの乳頭腫ウイ ルス（ＢＰＶ）が染色体外エピソームとして細胞分裂するけれども、エピソーム ベクターを開発する上でのそれらの使用は限られている。 特に、ＢＰＶのエピソームとして細胞分裂する能力が過去に活用されて、いわ ゆる69％断片（Ｔ６９）を用いて、エピソームベクターを産生してきた。Ｔ６９ に基づくベクターは、あるマウス細胞系統中で細胞分裂して、その細胞系統に依 存して、一倍体ゲノム当たり15から500コピーまでに亘るコピー数を与える。し かしながら、Ｔ６９ベクターは狭い宿主域を示す。さらに、そのＴ６９断片は、 ＳＶ４０のように腫瘍遺伝子である。実際、Ｔ６９を担持する細胞を同定する方 法の一つには、特に、形質転換されたＣ１２７細胞のスクリーニングが含まれて いる。発明の概要 本発明は、哺乳類遺伝子機能を解明する方法および組成物に関するものである 。そのような方法では、新しい組込みおよび／またはエピソーム遺伝子供給系を 用い、それによって、ヒト細胞を含む哺乳類細胞の幅広いスペクトルに使用する 、柔軟性のある代替の遺伝子プラットフォームを提供しても差し支えない。特に 、本発明は、哺乳類の相補性スクリーニング、特定の必須または可欠哺乳類遺伝 子の機能不活化、特定の刺激に応答して変調された哺乳類遺伝子の同定、分泌産 生物をコード化する哺乳類遺伝子の同定、並びに新しいレトロウイルスパッケー ジング細胞系統の産生および選択を改良する方法および組成物に関するものであ る。 特に、本発明の組成物の例としては、以下に限定されるものではないが、複製 欠損レトロウイルスベクター、そのようなベクターを含むライブラリー、レトロ ウイルスパッケージング細胞系統と協同してそのようなベクターにより産生され たレトロウイルス粒子、本発明のレトロウイルス粒子由来の組込みプロウイルス 配列および本発明の組込みプロウイルス配列から切除された環状化プロウイルス 配列が挙げられる。 本発明の組成物はさらに、改良された哺乳類エピソームベクターに関連するも のを含む。特に、これらの組成物としては、限定されるものではないが、拡大さ れた宿主域ベクター（ｐＥＨＲＥ）、並びにそのようなベクターを含むライブラ リー、細胞および動物が挙げられる。本発明のこのｐＥＨＲＥベクターは、哺乳 類細胞の広いスペクトルの範囲内で、遺伝子配列の一貫した安定な高レベルのエ ピソーム発現を提供する。本発明のｐＥＨＲＥベクターは、第一に、乳頭腫ウイ ルス（ＰＶ）Ｅ１およびＥ２タンパク質が構成性転写調節配列から発現される複 製カセットと、第二に、複製および安定なエピソーム維持のための最小シス作用 性要素とを含んでいる。 本発明のｐＥＨＲＥベクターは、限定されるものではないが、センスおよびア ンチセンス発現カセット、調節された発現カセット、大きな染色体断片、および ｃＤＮＡライブラリーを、幅広い哺乳類細胞に供給するためのベクターを含む。 例示したｐＥＨＲＥベクターの中には、さらに、組換えタンパク質の大規模産生 に使用できるもの、および高力価ウイルスを安定に産生する細胞系統の構成に使 用できるものがある。 本発明の組成物はさらに、新しいウイルスパッケージング細胞系統を含む。特 に、ここには、レトロウイルス由来核酸を、適切な哺乳類細胞を感染できる複製 欠損レトロウイルス粒子に効率的にパッケージする新しい安定なレトロウイルス パッケージング細胞系統が記載されている。そのようなパッケージング細胞系統 は、望ましいウイルスタンパク質の発現を選択可能マーカーの発現に直接的に連 結する新しい方法により産生される。 本発明のレトロウイルスパッケージング細胞系統は、そのようなウイルス機能 の発現を直接選択することができ、さらに、所望の配列の最高発現に関する定量 的な選択を可能にする多シストロン性伝令ＲＮＡ(polycistronic message)の一 部としてのレトロウイルスパッケージング機能を提供する。 特に、本発明の方法は、限定されるものではないが、哺乳類細胞表現型を相補 するそれらの能力に基づいて、核酸分子を同定し、単離する方法；哺乳類遺伝子 の機能を阻害する核酸配列を同定し、単離するアンチセンスベースの方法；特定 の刺激に応答して変調される哺乳類遺伝子を同定し、単離する遺伝子捕捉方法； 大規模の組換えタンパク質の発現を効率的に行う方法；および既知の遺伝子の発 現を変調する方法を含む。図面の簡単な説明 図１：複製欠損レトロウイルスベクターを含むＤＮＡ要素であるＭａＲＸＩＩ ．ｐｓｉの配列が、パッケージング信号を示す。 図２：切除の際に環状化される切除プロウイルスを産生する、ｌｏｘＰ部位の Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素による開裂を示す図。 図３：発現／センス相補性スクリーニングのためのレトロウイルスを含むＤＮ Ａ要素であるｐ．ｈｙｇｒｏ．ＭａＲＸＩＩ−ＬＩの配列。 図４：ペプチドを示すレトロウイルスベクターを含むＤＮＡ要素であるｐＭＯ Ｄｉｓ−Ｉの配列。 図５：ペプチドを示すレトロウイルスベクターを含むＤＮＡ要素であるｐＭＯ Ｄｉｓ−ＩＩの配列。 図６：遺伝子を捕捉するレトロウイルスベクターを含むＤＮＡ要素であるｐＴ ＲＡＰＩＩの配列。 図７：アンチセンス相補性スクリーニングのためのレトロウイルスベクターを 含むＤＮＡ要素であるｐＭａＲＸＩＩｇの配列。 図８：アンチセンス相補性スクリーニングのためのレトロウイルスベクターを 含むＤＮＡ要素であるｐＭａＲＸＩＩｇ−ｄｅｍＶの配列。 図９：アンチセンス相補性スクリーニングのためのレトロウイルスベクターを 含むＤＮＡ要素であるｐＭａＲＸＩＩｇ−ｖａの配列。 図１０：発現／センス相補性スクリーニングのためのｐＥＨＲＥベクターを含 むＤＮＡ要素であるｐＥＨＲＥ−Ｅ−Ｈの配列。 図１１：大規模タンパク質産生のためのｐＥＨＲＥベクターを含むＤＮＡ要素 であるｐＥＨＲＥ−Ｈの配列。 図１２：ｐＥＨＲＥ／ＢＡＣハイブリッド構築物の産生に使用するｐＥＨＲＥ ベクターを含むＤＮＡ要素であるｐＢＰＶ−ＢａｃＤｏｎｏｒの配列。 図１３：ＢＡＣクローニングベクターとして使用するｐＥＨＲＥベクターを含 むＤＮＡ要素の配列。 図１４：ｐＥＨＲＥアンチセンスＧＳＥベクターを含むＤＮＡ要素であるｐＥ ＨＲＥ−ＧＳＥ−Ｈの配列。 図１５：ｐＥＨＲＥアンチセンスＧＳＥベクターを含むＤＮＡ要素であるｐＥ ＨＲＥ−ＧＳＥＶＡ−Ｈの配列。 図１６：ｐＥＨＲＥアンチセンスＧＳＥベクターを含むＤＮＡ要素であるｐＥ ＨＲＥ−ＧＳＥＵ６−Ｈの配列。 図１７：パッケージング細胞系統に使用するｐＥＨＲＥベクターを含むＤＮＡ 要素であるΨ_cＩＨの配列。 図１８：パッケージング細胞系統に使用するｐＥＨＲＥベクターを含むＤＮＡ 要素であるｐＥＨＲＥ−Ψ_cＩＨの配列。 図１９：パッケージング細胞系統に使用するｐＥＨＲＥベクターを含むＤＮＡ 要素であるΨ_envＩＨの配列。 図２０：パッケージング細胞系統に使用するｐＥＨＲＥベクターを含むＤＮＡ 要素であるｐＥＨＲＥ−Ψ_envＩＨの配列。 図２１：パッケージング細胞系統に使用するｐＥＨＲＥベクターを含むＤＮＡ 要素であるΨ_g/pＩＨの配列。 図２２：パッケージング細胞系統に使用するｐＥＨＲＥベクターを含むＤＮＡ 要素であるｐＥＨＲＥ−Ψ_g/pＩＨの配列。 図２３：代表的なレトロウイルス分泌捕捉ベクターを含むＤＮＡ要素の配列。 図２４：フェニックス(Phoenix)およびｂｏｓｃ２３細胞系統と比較した、ｌ ｉｎＸパッケージング細胞系統の相対的な安定度を示すグラフ。 図２５：切除プロウイルスベクターに対してＬＴＲ要素を復元するための再統 合プラスミドの模範的使用。発明の詳細な説明 哺乳類細胞を用いたｃＤＮＡの発現クローニングが、分子生物学において長い 間求められてきた目標となっている。これは、タンパク質の表現型機能が知られ ているが、そのアミノ酸配列が知られていない環境下において、ｃＤＮＡのよう な関心のある核酸をそれによって単離する、潜在的に強力なツールである。例え ば、多くの成長因子およびサイトカイン遺伝子が、ｃＤＮＡライブラリーにより 操作された発現ベクターによって一時的に形質移入されたＣＯＳ細胞の培養上澄 みの成長促進活性に関するスコアリングによりクローニングされた。 従来技術の多くの発現クローニング系が、Ｔ抗原を安定に発現する哺乳類細胞 （すなわち、形質転換されたアフリカミドリザル肝臓細胞系統、ＣＯＳ）内にＳ Ｖ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）を担持する増幅発現ベクターの本質に取り組 んでいる。ＣＯＳ細胞中にＳＶ４０大型Ｔ抗原が存在することにより、ＳＶ４０ ｏｒｉ含有プラスミドを複製でき、したがって、そのプラスミド上でｃＤＮＡの 発現が増幅される。 多くの成功した用途にも拘わらず、従来の発現クローニング系にはまだ、プラ スミド、特に、ＳＶ４０（またはポリオーマ）大型Ｔ抗原を発現する細胞系統の 一時的増幅が必要とされている。最初に、標的遺伝子の機能が、一時的検出に適 していなければならない。さらに、標的細胞は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ベースの増 幅を行うことができるものおよび形質移入効率が高い（例えば、10％より大きい ）細胞の種類に制限される。ＣＯＳ細胞または繊維芽細胞中で一時的発現系を用 いる方法には、様々な種類の細胞内の様々な機能によりタンパク質を研究するの には明らかな制限がある。Ｉ．概要 これらの制限を克服するために、本発明のある態様は、高効率のウイルス発現 クローニング系に関するものである。ある実施の形態において、主題の発現構築 物が、後生動物宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞のゲノム中に安定して組み込める ウイルスベクターを用いて産生される。これを説明すると、ある実施の形態にお いて、好ましいウイルス発現構築物が、前記宿主細胞中に組み込まれたときに異 種遺伝子を発現できることに加えて、例えば、宿主細胞のゲノムからレトロウイ ルスベクターを切除する手段、切除したベクターを回収する手段、および／また は原核細胞内でベクターを増幅またはそれ以外で操作する手段を含む、一つ以上 の様々な他の特性を備えたレトロウイルスベクターから由来している。他の変更 例が以下詳細に記載されている。 さらに説明するために、主題のウイルスベクターを、関心のある核酸ライブラ リー、および適切なものとして、産生された感染粒子により操作することができ る。ウイルス粒子中にパッケージングするために、この業界で知られているウイ ルスパッケージング系を用いることもでき、またはより好ましくは、ウイルスベ クターを、ここに記載する新しい一時的パッケージング系によりパッケージング することもできる。そして、操作したウイルスを用いて、選択された宿主細胞を 感染させる。その後、感染細胞を、例えば、細胞中の表現型の変化に基づいて、 関心のある核酸の発現に関してスクリーニングすることができる。 本発明によれば、非常に複雑なウイルスライブラリーに基づく発現クローニン グ系により、多くの重要な細胞種類および従来技術では以前にアクセスできなか った細胞信号系に調査のためにアクセスできる。主題のウイルスｃＤＮＡライブ ラリー転移方法は、例えば、哺乳類細胞内の相補性クローニングに関心のあるも のにとって多くの利点を提供する。例えば、プラスミドの一時的形質移入とは反 対に、例えば、典型的なレトロウイルスおよびアデノ関連性ウイルスとしてその ようなウイルスベクターによる遺伝子移入により、遺伝子を幅広い標的細胞中に 安定に供給することができる。この特性は、表現型の変更が観察される時間を延 長させることにより、表現型の選択に関する従来の一時的遺伝子発現の欠陥を克 服するのに役立つ。 さらに、主題のウイルスベクターを使用することにより、従来技術における別 の主要な制限、複雑な核酸ライブラリー内の遺伝子の適切な提示をそうでなけれ ば困難にする、一般的に低形質移入率の制限を克服することもできる。形質移入 とは反対に、主題のウイルスは、幅広い細胞に効率的に感染させ、細胞を転移さ せることができる。 このように、細菌および酵母遺伝系において長い間認識されてきた相補性クロ ーニングの力がここで、ここに記載するウイルスベースの方法により、哺乳類お よび他の後生動物細胞により十分にアクセスされるであろう。 以下に詳細に記載するように、本発明のそのような組成物の例としては、限定 されるものではないが、複製欠損レトロウイルスベクター、そのようなベクター を含むライブラリー、レトロウイルスパッケージング細胞系統と協同してそのよ うなベクターにより産生されるレトロウイルス粒子、本発明のレトロウイルス粒 子由来の組み込まれたプロウイルス配列および本発明の組み込まれたプロウイル ス配列から切除された環状化プロウイルス配列が挙げられる。アデノ関連性ウイ ルス（ＡＡＶ）に基づくベクターを含む、他のゲノム的に含まれるウイルスに関 するウイルス配列を用いて由来される同様の組成物もまた考慮される。 本発明のさらに別の態様は、従来技術の哺乳類発現クローニング系における上 述した特定の欠損を克服するのに用いることもできるエピソーム発現ベクターに 関するものである。特に、ここに記載した本発明の組成物はさらに、改良された 哺乳類エピソームベクター並びにそのようなベクターを含有するライブラリー、 細胞および動物を含む。ここに記載した本発明の組成物はさらにまた、レトロウ イルスパッケージング細胞系統を含む新しいウイルスを含む。 第二に、本発明の方法を記載する。そのような方法は、限定されるものではな いが、哺乳類細胞表現型を相補する核酸分子を同定し、単離する方法；哺乳類遺 伝子の機能を阻害する核酸配列を同定し、単離するアンチセンスベースの方法； 特定の刺激に対応して変調される哺乳類遺伝子を同定し、単離する遺伝子捕捉方 法；分泌されたタンパク質をコード化する哺乳類遺伝子を同定する方法；新しい ウイルスパッケージング細胞系統を選択し、産生する方法；および大規模で組換 えタンパク質を効率的に発現する方法を含む。 本発明の方法はまた、限定されるものではないが、特定の細胞またはウイルス 機能にとって重要なタンパク質と相互作用する任意または半任意ペプチド配列を 示すことのできるベクターを用いて、相補型スクリーンによりペプチド配列を同 定し、単離する方法を含む。この相互作用により、例えば、選択可能表現型を形 成することができる。II ．定義 便宜上、明細書、実施例、および請求の範囲に用いた用語のいくつかをここに まとめる。 ここに用いたように、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、 および適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味す る。この用語はまた、同等物として、ヌクレオチド類似体から作成されたＲＮＡ またはＤＮＡいずれかの類似体、および記載された実施の形態に適用されるもの として、一本（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含 むものと理解すべきである。 ここに用いたように、「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、転写 され、（必要に応じて）翻訳された核酸を意味する。したがって、組換え遺伝子 は、エキソンおよび（必要に応じて）イントロン配列を含む、ポリペプチドをコ ード化するオープンリーディングフレームを含んでも差し支えない。他の実施の 形態において、組換え遺伝子は、単に、転写の際に、アンチセンストランスクリ プト(transcript)、リボザイム、または細胞の表現型に転写の効果を与えるべき 他のＲＮＡ分子を提供しても差し支えない。 「組換えウイルス」は、例えば、粒子中に異種核酸構築物を添加または挿入す ることにより、遺伝子的に変更されたウイルスを意味する。 遺伝子配列に関する「発現」という用語は、遺伝子の転写および、適切な場合 には、得られたｍＲＮＡトランスクリプトのタンパク質への翻訳を意味する。し たがって、文脈から明らかとなるように、タンパク質暗号配列の発現は、その暗 号配列の転写および翻訳から生じる。一方で、アンチセンス配列またはリボザイ ムの「発現」は、組換え遺伝子配列の転写を意味するものと理解されよう。 ここに用いたように、「形質導入」および「形質移入」は、この業界で認識さ れており、核酸、例えば、ウイルス発現ベクターを核酸媒介遺伝子転移による受 容体細胞中への導入を意味する。「形質転換」は、ここで用いたように、細胞の 遺伝子型が、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取込みの結果として変化し、例え ば、形質転換された細胞がポリペプチドの組換え体の形態を発現する、または転 移された遺伝子からアンチセンス発現が生じた場合には、タンパク質の自然に生 じる形態の発現が分断される工程を意味する。 「一時的形質移入」は、外因性ＤＮＡが形質移入された細胞のゲノム中に組み 込まれない場合、例えば、エピソームＤＮＡがｍＲＮＡ中に転写され、タンパク 質に翻訳される場合を意味する。 細胞は、核酸構築物が細胞膜の内側に導入され、ウイルス暗号領域が娘細胞に より遺伝されることのできるときに、ウイルス暗号領域を含む核酸構築物により 「安定に形質転換」される。 ここに用いたように、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ハイブ リダイゼーションが、他の細胞またはウイルス核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲ ノムＤＮＡ）に対して15％未満、好ましくは、10％未満、そしてより好ましくは ５％未満のバックグラウンドハイブリダイゼーションだけ達成されるような、内 因性遺伝子または遺伝子トランスクリプトのような第二の核酸の少なくとも15連 続のヌクレオチドまでハイブリダイズする第一の核酸の能力を意味する。 ここに用いたように、「ベクター」という用語は、それが結合される別の核酸 を移送できる核酸分子を意味する。ある種のベクターは、宿主細胞の染色体ＤＮ Ａ中に組み込むことのできる、ゲノム組込みベクター、または「組込みベクター 」である。別の種類のベクターは、エピソームベクター、すなわち、染色体外複 製のできる核酸である。それらが操作により結合される遺伝子の発現を方向付け ることのできるベクターが、ここでは、「発現ベクター」と称されている。本明 細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、分脈から明らかなように 、別記しない限り、相互に交換可能に用いられている。 「転写調節配列」は、それらが操作可能に結合されている遺伝子の転写を誘発 または制御する、阻害信号、エンハンサ、およびプロモータのようなＤＮＡ配列 を意味するように、本明細書全体に亘り用いられている一般用語である。 ここに用いたように、「組織特異的プロモータ」という用語は、プロモータと して機能する、すなわち、プロモータに操作可能に結合した選択されたＤＮＡ配 列の発現を調節し、神経または造血起点の細胞のような組織の特異的細胞内で該 選択されたＤＮＡ配列の発現を行うＤＮＡ配列を意味する。この用語はまた、選 択されたＤＮＡの発現を主に一つの組織内で調節するが、同様に他の組織内で少 なくとも低レベルの発現を行わせるいわゆる「漏出」プロモータをも網羅する。 ここに用いたように、「遺伝子導入動物」は、動物の一つ以上の細胞が、この 業界でよく知られている遺伝子導入技術のような、人間の介在により導入された 異種核酸を含有する、あらゆる動物、好ましくは人間ではない哺乳動物、トリま たは両性動物である。この核酸は、マイクロインジェクションまたは組換えウイ ルスの感染のような計画的な遺伝子操作によって、細胞の前駆体中に直接的また は間接的に導入することにより、細胞中に導入される。遺伝子操作という用語は 、伝統的な雑種育種、または生体外受精は含まないが、むしろ、組換えＤＮＡ分 子の導入に関するものである。 本発明の「人間ではない動物」は、げっ歯類、人間ではない霊長類、家畜、鳥 類、両生動物、爬虫類等のような脊椎動物を含む。「キメラ動物」という用語は 、組換え遺伝子が発見されている動物を意味するためにここでは用いられている 。 「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、ここでは相互に交換可 能に用いられている用語である。そのような用語は、特別な手段の細胞だけでは なく、そのような細胞の後代または潜在的な後代を意味することも理解されよう 。突然変異誘発または環境の影響のいずれかにより、後の世代にある変調が生じ るかもしれないので、そのような後代は、実際に、親細胞とは同一ではないかも しれないが、ここに用いている用語の範囲内にまだ含まれる。 ここに用いたように、「細胞系統」という用語は、生体外で、連続または長期 間の増殖および分裂を行える一群の細胞を意味する。しばしば、細胞系統は、一 つの始原細胞から由来したクローン個体群である。さらに、そのようなクローン 個体群の貯蔵または転移中に核型内に自然または誘発変化が生じる場合があるこ とがこの業界で知られている。したがって、言及される細胞系統から由来の細胞 は、祖先の細胞または培地と正確に同一ではないかもしれず、この言及される細 胞系統はそのような変種をも含むものである。 「パッケージング細胞」は、異種ヌクレオチド配列による安定なまたは一時的 な形質移入により、パッケージング機能の一時的発現を提供できるウイルスヘル パー構築物、例えば、複製およびカプシドに含めることに必要なタンパク質、を 含む核酸分子を宿し、感染ウイルス粒子の産生のために途中で提供され得る宿主 細胞を称する。ウイルスヘルパー機能の発現は、ヘルパー機能が誘発性プロモー タの制御下にある場合のような、誘発性、または構築性のいずれであっても差し 支えない。 「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、第一と第二のポリペプチ ドの暗号配列が、最初の翻訳の際に一つのポリペプチド鎖を形成するようにフレ ーム内で融合されるキメラ暗号配列を形成することにより、異種起点の二つのア ミノ酸配列の融合である。 ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸に関してここで用いられている「単離された 」という用語は、巨大分子の自然のソース中に存在する、それぞれ他のＤＮＡま たはＲＮＡから分離された分子を意味する。ここで用いられている単離されたと いう用語は、また、細胞物質、または組換えＤＮＡ技術により産生された場合に は培地、または化学的に合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質が 実質的に含まれない核酸またはペプチドを意味する。さらに、「単離された核酸 」は、断片として自然には生じず、自然の状態では発見されない核酸断片を含む ことを意味するものである。 「異種」という用語は、暗号配列および対照配列のような核酸配列に関連する ので、通常は互いに接続されておらず、および／または特定の細胞に通常は関連 していない配列を示す。したがって、核酸構築物の「異種」領域は、別の核酸分 子内のまたはこれに結合した、実在する他の分子と関連しては見つからない核酸 の断片である。例えば、ある構築物の異種領域が、実在する暗号配列と関連して 見つからない配列を端部に有する暗号配列を含んでいても差し支えない。異種暗 号配列の別の実施例は、暗号配列自体が実在しない構築物（例えば、天然遺伝子 とは異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、細胞中に通常は存在しな い構築物により形質転換された宿主細胞は、本発明の目的に関しては異種である と考えられる。対立変種または自然に生じる突然変異の出来事によっては、ここ で用いたような異種ＤＮＡは生じない。 「暗号配列」または特定のペプチドを「コード化」する配列は、適切な調節配 列の制御下に置かれたときに、転写され（ＤＮＡの場合）、生体内または生体外 でポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。その暗号配列 の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’（カルボキシ）端末で の翻訳終止コドンにより決定される。暗号配列としては、限定されるものではな いが、原核または真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核または真核ＤＮＡからのゲ ノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が挙げられる。転写終結配列は通常、そ の暗号配列に対して３’に位置する。 「ＤＮＡ結合領域」または「ＤＢＤ」は、特定のＤＮＡ配列（すなわち、ＤＢ Ｄ認識要素）に結合した特定のポリペプチドを方向付けることのできるポリペプ チド配列を意味する。この文脈における「領域」という用語は、孤立した折り畳 み領域に限定することを意図するものではない。むしろ、単にポリペプチドが特 定のＤＮＡ結合活性を有することを観察することにより、ベイト(bait)融合タン パク質内に使用するＤＢＤとしてのポリペプチドが考えられる。ＤＮＡ結合領域 は、活性化タッグ(tag)のように、自然に生じるタンパク質から完全に人工的な 配列までに亘るタンパク質から由来し得る。 本出願全体に亘り、特定の転写調節配列、複製の起点、分泌信号配列、ウイル スベクター等が参照されている。しかしながら、文脈から明らかに反しない限り 、これら多くのの特定の引用は、単に、同等物として使用しても差し支えない要 素の広い群を説明することを意図するものである。 III．相補性スクリーニングおよび発現ベクター 本発明に繋がる我々の研究の主な目的は、哺乳類および他の後生動物の細胞に 用いられる従来のクローニングおよび他の遺伝子操作系の決定の多くに取り組む ことにあった。この点に関して、主題のウイルス発現ベクターは、高効率遺伝子 転移；予測可能な発現レベル；遺伝子転移と発現の同時発生；復帰突然変異体を 同定する能力；発現された核酸の比較的容易な回収；都合のよい二次スクリーニ ング；および例えば、ライブラリー構築における異種ＤＮＡの容易な添加のよう な特性を有するように設計されている。他の多くの通常の哺乳類クローニングベ クターと比較して、主題のウイルス発現ベクターは、例えば、機能喪失型および ／または機能獲得型の構築物を生物学的に同等の細胞型内で調査できるように形 質導入に関して広い宿主域の特異性を示す。 ある態様において、本発明の発現クローニング系は、宿主細胞、特に哺乳類の 宿主細胞のゲノム中に組み込むことのできるベクターに基づくものである。この 種の典型的なベクターは、例えば、レトロウイルス、アデノ関連性ウイルスまた は染色体組込みのための適切な転位要素を有する他のウイルス由来ベクターから 由来する。レトロウイルスベクターおよびアデノ関連性ウイルスベクターは、一 般的に、特に哺乳類細胞に使用するための、主題のベクターを選択する組換え遺 伝子供給系であると考えられている。これらのベクターは細胞中に遺伝子を効率 的に供給し、転位された核酸は宿主の染色体ＤＮＡ中に安定に組み込まれる。さ らに、主題のベクターはまた、例えば、宿主細胞のゲノムからレトロウイルスベ クターを切除するためのプロウイルス切除要素、切除されたベクターを回収する ためのプロウイルス回収要素、および／または原核細胞中でベクターを増幅また は他の様式で操作する複製の起点を含む一つ以上の他の特性を備えている。好ま しくは、形成されたウイルスベクターは複製欠損であり、そのウイルスは向性を 有していても差し支えないが、それらはまた好ましくは人間に関しては両栄養性 である。該主題のベクターのこれらと他の態様が、以下詳細に記載されている。 他の実施の形態において、本発明の発現クローニング系は、宿主細胞中で高い が安定したコピー数に維持することができ、異種核酸の均一な高レベルの転写を 提供できるエピソームベクターに基づくものである。従来技術の系においては、 上述したＣＯＳ細胞系のようなエピソーム複製は、無拘束様式で行うことができ 、例えば、形質移入から48時間後には10⁴までのエピソームコピーとなる。その ような一時的形質移入物(transfectant)における効率的なエピソーム複製にも拘 わらず、おそらく、ほとんどの形質移入物がエピソーム媒介毒性の結果として死 ぬので、低安定形質移入効率が示された（例えば、Chittenden等，（1991）J Vi rol 65:5944）。しかしながら、本発明のエピソームベクターは、多くの世代の 後代細胞に亘って持続できるエピソームコピー数を産生するように無拘束複製を 制御する方法を提供する。好ましい実施の形態において、本発明のエピソームベ クターは、他の必要な複製制御領域とともに、複製のウイルス起点、およびベク ターの安定のコピー数への複製を促進させるようにウイルス起点をトランス活性 化する(transactivate)一つ以上のウイルス遺伝子を含む。しかしながら、その ウイルストランス活性化遺伝子を、細胞中の別々のベクターに提供できることも 認識されよう。本発明の典型的なエピソーム発現ベクターとしては、乳頭腫ウイ ルス（ＰＶ）由来ベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来ベクタ ーおよびＢＫウイルス（ＢＫＶ）由来ベクターが挙げられる。 発現クローニングは、関心のある核酸を同定するのに用いられる検出様式に依 存して様々な形態をとる（前出の議論を参照のこと）。しかしながら、組込みベ クターまたはエピソームベクターが用いられるか否かに拘わらず、最初の段階は 、ｍＲＮＡを単離し、そのｍＲＮＡ個体群の二本鎖デオキシリボ核酸コピー（ｃ ＤＮＡ）を合成するようなことにより、核酸ライブラリーを産生することを含む 。次いで、核酸の変化に富んだ個体群を、本発明のベクターに効率的に連結し、 ライブラリースクリーニングおよび分析の前に適切な宿主細胞に転移させなけれ ばならない。主題のベクターは一連の制限部位を含み、ｃＤＮＡおよび他の核酸 をベクター配列中にライゲーションさせる「アダプター」リンカー方法にサマメ ナブル(themamenable)にする。また、関心のある核酸配列の転写を促進させるの に用いることのできる様々な転写調節配列が以下に記載されている。 Ａ）レトロウイルス相補性スクリーニングおよび発現ベクター レトロウイルスはＲＮＡである。すなわち、ウイルスゲノムはＲＮＡである。 しかしながら、このゲノムＲＮＡは、感染細胞の染色体ＤＮＡ中に非常に効率的 に組み込まれるＤＮＡ中間体中に転写されるリバース(reverse)である。組み込 まれたＤＮＡ中間体は、プロウイルスと称される。レトロウイルスゲノムおよび プロウイルスＤＮＡは、ウイルスの生活環にとって重要な三つの遺伝子：ｇａｇ 、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含んでいる。ウイルスのゲノムは、ＬＴＲ配列を 各々の端部に備えている。ｇａｇ遺伝子は内部構造（ヌクレオカプシド）タンパ ク質をコード化し、ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ方向性(directed)ＤＮＡポリメラーゼ （逆転写酵素）をコード化し、ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク 質をコード化する。５’と３’のＬＴＲは、ウイルス粒子ＲＮＡの転写およびポ リアデニル化を促進させるように機能する。 ５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位 ）およびウイルスＲＮＡの粒子中への効率的なカプシド包含に必要な配列（Ｐｓ ｉ部位）が隣接している。Mμlligan，R.C.，In:Experimental Manipμlation o f Gene Expression，M.Inouye(ed)，155-173(1983);Mann等（1983）Cell 33:153 -159;Cone等（1984）PNAS，81:6349-6353。 カプシド包含（またはレトロウイルスＲＮＡの感染ウイルス粒子中へのパッケ ージング）に必要な配列がウイルスゲノムから失われた場合には、その結果、ゲ ノムＲＮＡのカプシド包含を妨げるｃｉｓ欠陥が生じる。しかしながら、形成さ れた突然変異体である「複製欠損」レトロウイルスはまだ、全てのウイルス粒子 タンパク質の合成を指示することができる。 レトロウイルスベクターを選択する際に、ほとんどのレトロウイルスによる標 的細胞の満足な感染、したがって、主題の発現構築物の安定な導入の必要条件は 、標的細胞が分裂していなければならないことに注意することが重要である。し かしながら、ほとんどのレトロウイルスベクターには細胞分裂が必要であるけれ ども、ＨＩＶまたはＥＩＡＶのようなレンチウイルスに基づくベクターには必要 がない。 第一に、哺乳類細胞ないで実際的で効率的な相補性スクリーニングを可能にす る特性の組合せを含む、複製欠損レトロウイルスベクター組成物がここに記載さ れている。そのようなベクターはまた、効率的な発現ベクターとしても機能でき る。 そのようなレトロウイルスベクターは、多シストロン性伝令ＲＮＡカセット、 受容体細胞のゲノムからレトロウイルスプロウイルスを切除するためのプロウイ ルス切除要素および核酸の複雑な混合物から切除したプロウイルスを回収するプ ロウイルス回収要素のような一つ以上の特性を備えた複製欠損レトロウイルスゲ ノムを含む。そのベクターは、例えば、哺乳類細胞中のｃＤＮＡまたはゲノムＤ ＮＡ（ｇＤＮＡ）配列の発現を促進させるように設計されている。 説明のための実施の形態において、レトロウイルスベクターは、以下の要素： (a)５’レトロウイルスＬＴＲ；(b)３’レトロウイルスＬＴＲ；(c)パッケージ ング信号；(d)複製の細菌起点；および(e)選択可能細菌マーカーを含んでいても よい。多シストロン性伝令ＲＮＡカセット、プロウイルス回収要素、パッケージ ング信号、複製の細菌起点および選択可能細菌マーカーは、５’ＬＴＲおよび３ ’ＬＴＲの間の位置でレトロウイルスベクター内に位置している。プロウイルス 切除要素は、以下に論じるように、好ましくは、３’ＬＴＲ内に位置している。 別の実施の形態において、プロウイルス切除要素は、レトロウイルス内に位置し ていてもよい。しかしながら、以下に考えるように、本発明の目的の一つは、回 収したプラスミドを用いて、続いての感染用のウイルスを直接的に産生すること のできる構築物を提供することにあるので、このことは好ましくない。 様々な異なるレトロウイルスがこの業界で知られており、本発明に容易に使用 することができる。両栄養性または環境栄養性パッケージング細胞系統を適切に 選択することにより、主題のベクターを、所望の宿主細胞を感染させる適切な特 異性を備えたウイルス粒子としてパッケージングすることができる。さらに、そ のウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を修飾することに より、レトロウイルスと、その結果としてのレトロウイルスベースのベクターの 感染スペクトルを制御することもできる（例えば、ＰＣＴ公報第WO93/25234号、 第WO94/06920号、および第WO94/11524号を参照のこと）。例えば、レトロウイル スベクターの感染スペクトルを変調させる方法としては、細胞表面抗原に特異的 な抗体をウイルスｅｎｖタンパク質に結合させること（Roux等（1989）PNAS 86: 9079-9083;Jμl an等（1992）J.Gen Virol 73:3251-3255;およびGoud等（1983） Virology 163:251-254）；または細胞表面リガンドをウイルスｅｎｖタンパク質 に結合させること（Neda等（1991）J Biol Chem 266:14143-14146）が挙げられ る。結合は、タンパク質または他の変種（例えば、ｅｎｖタンパク質をアシアロ 糖タンパク質に転換させるラクトース）による化学的架橋の形態、並びに融合タ ンパク質を産生することによるもの（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク 質）であっても差し支えない。この技術は、環境栄養性ベクターを両栄養性ベク ターに転換させるのに有用であるけれども、動物の異なる細胞種に関して、感染 性粒子の特異性を制限または拡張させるのに用いても差し支えない。 主題のウイルスベクターを産生するのに使用しても差し支えない適切なレトロ ウイルスの例としては、ｐＢＡＢＥ、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが 挙げられ、これらの各々は、当業者によく知られている。ある実施の形態におい て、ウイルスベクターは、ＨＩＶまたはＥＩＡＶウイルスのようなレンチウイル ス由来である。 例えば、ｐＺｉｐベクターは、Cepko等（1984）Cell 37:1053に記載されてい る。手短に言うと、このベクターは、二つの遺伝子：関心のある遺伝子および選 択可能マーカーとしてのネオジーン(Neogene)を発現することができる。 ｐＬＪベクターは、Korman等，（1987）PNAS 84:2150に記載されている。この ベクターは、二つの遺伝子：関心のある遺伝子およびネオジーンのような選択可 能優位マーカーを発現することができる。関心のある遺伝子は、定方向で５’Ｌ ＴＲに対して末端のＢａｍＨＩ／Ｓｍａｌ／Ｓａｌｌクローニング部位にクロー ニングされ、一方で、ネオジーンは、クローニング部位よりも遠い３’である（ クローニング部位の３’に位置する）内部プロモータ（ＳＶ４０からの）の末端 に配置されている。ＰＬＪからの転写は、二つの部位：1)関心のある遺伝子の発 現の原因となる５’ＬＴＲおよび2)ネオジーンの発現の原因となる内部ＳＶ４０ プロモータで開始される。 ｐＷｅベクターが、Choudory等（1986）CSH Symposia Quantitative Biology 1047に記載されている。手短に言うと、このベクターは、二つの遺伝子：５’Ｌ ＴＲから下流にあるネオのような選択可能優位マーカーおよび高レベルの構成性 発現を行える内部プロモータから下流にあるＢａｍＨＩ部位中にクローニングで きる関心のある遺伝子の発現を行うことができる。ニワトリからのベータアクチ ンプロモータ（Choudory，P.V.等CSH Symposia Quantitative Biology，L.I．10 47(1986)）のようないくつかの異なる内部プロモータ、および人間からのヒスト ンＨ４プロモータ（Hanly,S.M.等，Molecμlar and Cell μlar Biology 5:380( 1985)）が用いられている。ネオジーンの発現は、５’ＬＴＲで開始されたトラ ンスクリプトからであり、関心のある遺伝子は内部プロモータで開始されたトラ ンスクリプトからである。 ｐＥｍベクターは、野生型ウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの全暗号配 列が、発現される唯一の遺伝子である関心のある遺伝子と置き換えられた単純な ベクターである。ｐＥｍの成分が以下に記載されている。５’隣接配列、５’Ｌ ＴＲおよび400ｂｐの近接配列（ＢＡＭＨＩ部位まで）がｐＺＩＰからである。 ３’隣接配列およびＬＴＲもまたｐＺＩＰからである。しかしながら、３’ＬＴ Ｒから上流のＣｌａ部位150ｂｐは、ＢａｍＨＩと連結され、ベクター中に存在 するＢａｍＨＩクローニング部位の他の半分を形成する。ｐＢＲ３２２のＨｉｎ ｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片がプラスミドのバックボーンを形成する。このベクタ ーは、モロニーマウス白血病ウイルスの菌株からクローンされた配列に由来する 。類似体ベクターは、骨髄増殖性肉腫ウイルス由来の配列から構築された。 ｐＩｐベクターは、内部プロモータから由来の一つの遺伝子を発現することが できる。これらのベクターの構成が以下に要約されている。５’隣接配列、５’ ＬＴＲ、および1400ｂｐの近接配列（ｇａｇ領域におけるｘｈｏ部位まで）を含 むベクターの５’部分が、野生型モロニー白血病ウイルス配列から由来する。Sh innick等（1981）Nature 293:543。二つの間の差は、ＳａｃＩＩリンカーがｇａ ｇ遺伝子のＡＴＧに隣接するＨａｅＩＩＩ制限部位中にクローニングされること である。３’隣接配列、３’ＬＴＲおよび３’近接配列（ｅｎｖ暗号領域内のＣ ｌａＩ部位まで）を含む、ベクターの３’部分は、ｐＺＩＰからである。しかし ながら、これには二つの修飾がある：1)ＣｌａＩ部位がＢａｍＨＩに結合してお り、2)エンハンサに及ぶ（ＰｖｕＩＩからＸｂａＩまで）３’ＬＴＲ内の小さな 配列が欠失している。ベクターの５’および３’部分の架橋は、いくつかのプロ モータの内の一つであり、各々はＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片上に含まれており、 各々はほとんどの組織内で高レベルの構成性発現を行うことができる。これらの プロモータは、β−アクチンプロモータ（Choudory等、前出）、および単純ヘル ペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモータ（Hanly等，（1985）Mol Cell Biol 5:380）を含んでいる。このベクターのバックボーンは、ｐＢＲ３２２から のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片である。 ＲＯベクターは、関心のある遺伝子が転写に必要な配列の全て（すなわち、プ ロモータ／エンハンサ、イントロン有無に拘わらない暗号配列、およびポリアデ ニル化信号）を含有し、その転写が通常のレトロウイルス転写の方向と反対の方 向である方向にレトロウイルスベクター中に導入される異種群のベクターを示す 。このことによって、導入された遺伝子の調節に含まれるシス作用要素を含むこ とができる。実際に、上述したどの遺伝子も、ＲＯベクターであると適用するこ とができる。 さらに別の実施の形態において、細胞に、他の種内のウイルスによる感染を媒 介するウイルス受容体（例えば、細胞表面タンパク質）を発現させることにより 、ウイルスの感染性スペクトルを変更することができる。したがって、例えば、 ヒト宿主細胞に鳥類ウイルスの受容体をコード化する鳥類遺伝子を発現させるこ とにより、ヒト細胞を、そうでなければ環境栄養性である鳥類ウイルスに感染し やすくすることができる。 これが含まれる実施の形態に関して、多シストロン性伝令ＲＮＡカセットによ り、選択可能マーカーの発現を、関心のある核酸配列の転写に直接的に結びつけ る選択計画が可能になる。そのような多シストロン性伝令ＲＮＡカセットは、典 型的な実施の形態において、５’から３’まで、以下の要素：ヌクレオチドポリ リンカー、（必要に応じての）内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）および選択 可能哺乳類マーカーを含むことができる。この多シストロン性カセットは、好ま しくは、５’ＬＴＲプロモータまたは他の転写調節配列からの転写が多シストロ ン性伝令ＲＮＡカセットを転写するような位置で５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの 間のレトロウイルスベクター内に位置する。後者の例において、多シストロン性 伝令ＲＮＡカセットの転写は、例えば、内部サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ ロモータにより駆動される構成性調節要素、または使用する発現スクリーンに依 存して好ましいかもしれない、誘発性調節要素の転写制御下にあってもよい。多 シストロン性伝令ＲＮＡカセットはさらに、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ ）またはポリリンカー内で有効に関連する他の核酸配列を含んでいても差し支え ない。 主題の構築物において、ＩＲＥＳ要素により、一つのメッセンジャーＲＮＡか ら二つ以上のオープンリーディングフレームを効率的に翻訳することができる： 例えば、一つの読み取り枠は、関心のある組換えタンパク質（ｃＤＮＡライブラ リーからのような）をコード化するものであり、もう一方は、ある程度多シスト ロン性伝令ＲＮＡを発現する細胞を選択する選択可能マーカー（例えば、ヒグロ マイシン）である。 異なるトランスクリプトのｍＲＮＡの安定性に関連する問題を避けるために、 二シストロン性または多シストロン性ベクターを開発した。この目的のために、 各々のトランスクリプト（例えば、タンパク質のコード化、アンチセンストラン スクリプトの提供等）に関する個々の読み取り枠を一つの転写ユニット（発現ユ ニット）内に提供する。多シストロン性遺伝子の発現は、一つのプロモータまた は調節配列を用いて行われる。そのようなベクター内の第一のシストロンが通常 非常に効率的に翻訳されるけれども、続いてのシストロンの翻訳はインターシス トロン性(intercistron)配列に依存する。内部リボソーム入口配列すなわちＩＲ ＥＳのような翻訳を内部で開始できる特定の細胞配列およびウイルス配列の発見 および使用により、第一と続いてのシストロンの間の翻訳比を３：１にすること が可能となった。 近年発見された内部に翻訳を開始する機構では、特定の核酸配列を使用してい る。これらの配列は、個々のピコルナウイルス、例えば、ポリオウイルスおよび 脳心筋炎ウイルス、（PelletierおよびSonenberg，（1988）Nature 334:230;Jan g等，（1988）J.Virol．62:2636;Jang等，（1989）J.Virol．63:1641）並びにい くつかの細胞タンパク質、例えば、ＢｉＰ（MacejakおよびSarnow（1991）Natur e 353:90-94）の非翻訳領域を含んでいる。ピコルナウイルスにおいて、５’非翻 訳領域の短い断片（いわゆる、ＩＲＥＳすなわち内部リボソーム入口部位）が、 プレイニシエーション(preinitiation)複合体の内部結合の原因である。ＩＲＥ Ｓ要素は、並んで結合した読み取り枠の効率的な翻訳の開始暗号として機能でき る。選択的なマーカーの発現の発現すべき遺伝子のものとの密接な結合は、高レ ベルの発現に関して選択するときに、特に、事前遺伝子増幅が必要とされる場合 に特に有利である。 内部リボソーム入口部位配列は、当業者によく知られており、例えば、口蹄疫 ウイルス（ＥＤＶ）、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルスおよびＲＤＶ由来の内 部リボソーム入口部位を含んでも差し支えない（Schepre，1994，Biochemic 76: 801-809;Meyre，1995，J.Virol．69:2819-2824;Jang，1988，J.Virol．62:2636- 2643;Haller，1992，J.Virol．66:5075-5086）。主題のベクターの別の典型的な 二シストロン性トランスクリプトは、インターシストロン性スペーサとして古典 的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）ゲノムの373-ヌクレオチド長５’非翻訳領域（Ｎ ＴＲ）を含んでいる（Rijnbrand等（1997）J Virol 71:451）。ＨＴＬＶ−１か らの’Ｒ’領域もまた、ピコルナウイルス中に元々は見つかった内部リボソーム 入口部位（ＩＲＥＳ）と同様の特性を有しており（Attal等（1996）FEBS Lett 3 92:220）、そのウイルスのＩＲＥＳを主題の発言構築物に使用することもできる 。アフソウイルス(aphthovirus)ＲＮＡの翻訳は、主題のベクター内に用いても 差し支えない内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）要素で開始される。 この主題のベクターもまた、一つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含むべきで ある。好ましくは、選択可能マーカー遺伝子の少なくとも一つが、関心のある遺 伝子に関する多シストロン性トランスクリプトにおいて提供される。どのような 選択可能哺乳類マーカーを用いても差し支えない。このマーカー遺伝子は、一般 的に、ベクターにより形質転換される宿主細胞の生存または増殖に必要な産生物 、および／または選択可能マーカーの発現に基づいて細胞を分離でき、生存度を 維持する技術により評価できる産生物をコード化するものである。この遺伝子産 生物の発現により、ベクターにより形質転換されない、またはベクターを欠失す るかそうでなければ選択可能マーカーの発現を損失するいかなる宿主細胞も、機 能的ベクターを維持する細胞に亘り、増殖等の利点が得られないことが確実とな る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えば、アミピシリ ン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を与 える、(b)栄養要求性欠乏症を補う、または(c)天然培地からは得られない重要な 栄養素を供給するタンパク質をコード化するかもしれない。 哺乳類細胞にとって適切な薬物選択可能マーカーの例としては、ジヒドロフオ レートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼおよびカナマイシン／Ｇ４ １８、ヒグロマイシン、マイコヘノレイン酸(mycohenolic acid)またはネオマイ シンに対する耐性をコード化する遺伝子が挙げられる。そのようなマーカーによ り、主題の発言ベクターを吸収し、長時間に亘り維持できた細胞を同定すること が可能になる。哺乳類細胞の形質転換体は、これら形質転換体のみが、ベクター を吸収し、マーカー遺伝子を発現したことにより、生存するように特異的に適用 される選択的な条件下に配置しても差し支えない。選択的な圧力は、例えば、培 地中の選択剤の濃度が連続的に変更され、それによって、選択遺伝子の増幅され た発現により、そして多シストロン性の実施の形態においては、他の結合された 暗号配列の増幅された発現により、形質転換体の選択が導かれる条件下で形質転 換体を培養することにより与えられる。 説明のために、ＤＨＦＲ選択遺伝子を含むウイルスベクターにより満足に形質 転換されたＤＨＦＲ^-細胞は、形質転換体を、ヒポキサンチン、グリシン、およ びチミジンを有さない培地中で培養することにより同定することができる。その ような条件下で増殖できる細胞は、おそらく、ウイルスベクター中に提供された ＤＨＦＲ選択遺伝子を発現する。 本発明の実施の形態において、マーカー遺伝子は、ＦＡＣＳ選別により検出可 能なタンパク質をコード化できる。例えば、マーカー遺伝子は、ＦＡＣＳ検出可 能遺伝子産生物をコード化できるどのような遺伝子であっても差し支えなく、そ の産生物はＲＮＡまたはタンパク質であってもよい。そのようなマーカー遺伝子 には、少なくとも二つの基本設計がある。「直接検出系」において、マーカー遺 伝子は、それ自体の蛍光活性（「直接ＦＡＣＳタグ」）によるフロー・サイトメ トリーにより容易に検出できる産生物をコード化する。別の系において、マーカ ー遺伝子は、「間接検出系」、例えば、マーカー遺伝子産生物が、このマーカー 遺伝子産生物に特異的に結合するおよび／またはそれにより修飾される蛍光活性 剤との結合の際にＦＡＣＳにより検出される系に用いられる。したがって、マー カー遺伝子は、「直接ＦＡＣＳタグ」、例えば、蛍光ポリペプチドまたは酵素作 用により蛍光信号を発生するかもしれないポリペプチド、もしくは、「間接ＦＡ ＣＳタグ」、例えば、蛍光活性分子に結合するおよび／またはこれを修飾して、 蛍光信号を発生するポリペプチドをコード化してもよい。読み易くするためにこ こでは蛍光群と称される、ケミルミネッセンスレポーター(chemiluminescent re porter)群は、それらを光が放出される形態のエネルギーが生じる反応、例えば 、酵素反応に参加させることにより検出される。 ある実施の形態において、マーカー遺伝子は、蛍光活性ポリペプチドをコード 化する。そのようなマーカー遺伝子の例としては、限定されるものではないが、 ホタルルシフェラーゼ（de Wet等(1987),Mol.Cell.Biol.7:725-737）；細菌ルシ フェラーゼ（EngebrechtおよびSilverman(1984)，PNAS 1:4154-4158;Baldwin等( 1984)，Biochemistry 23:3663-3667）；フィコビリタンパク質（特に、フィコエ リトリン）；緑蛍光タンパク質(GFP:Valdivia等（1996）Mol Microbiol 22:367- 78;Cormack等（1996）Gene 173（1 Spec No):33-8;およびFey等（1995）Gene 16 5:127-130を参照のこと）が挙げられる。ＧＦＰおよびフィコビリタンパク質の 両方は、一般的にそれらの高吸光率および高量子収量のために、ＦＡＣＳ選別に おいて重要に寄与しており、したがって、マーカー遺伝子の好ましい産生物であ る。 好ましい実施の形態では、野生型ＧＦＰに対して、変更された励起スペクトル および／またはより高い（より明るい）量子収量を有するように操作されたＧＦ Ｐを使用する。一般的に、細胞内野生型ＧＦＰの蛍光レベルは、フロー・サイト メトリーにとっては十分に明るくない。しかしながら、改良された明るさおよび 信号対雑音比の両方を示す様々な操作されたＧＦＰがこの業界で知られている。 例えば、主題のレポーター遺伝子は、ＧＦＰ−Ｂｅｘｌ（Ｓ６５Ｔ、Ｖ１６３Ａ ）またはＧＦＰ−Ｖｅｘｌ（Ｓ２０２Ｆ、Ｔ２０３Ｉ、Ｖ１６３Ａ）をコード化 することができる。Anderson等の（1996）Genetics 93:8508を参照のこと。他の 修 飾ＧＦＰが、例えば、生物蛍光の増大したアポエクオリンの修飾形態を記載して いる米国特許第5,360,728号および同第5,541,309号に記載されている。 別の実施の形態において、マーカー遺伝子は、基質に作用することにより、蛍 光活性産生物を産生する酵素をコード化する。例えば、フルオロセイン−ジ−β −Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）は、フロー・サイトメトリーによる検出に おいて、β−ガラクトシダーゼをコード化するマーカー遺伝子の有用な基質であ る。Plovins等（1994）Applied Envir Micro 60:4638;およびAlvarez等（1993） Biotechniques 15:974を参照のこと。 さらに他の実施の形態において、マーカー遺伝子産生物はそれ自体、ＦＡＣＳ 目的にとって十分には蛍光活性ではない。むしろ、このマーカー遺伝子産生物は 、ここでは「二次蛍光タグ」と称される、ＦＡＣＳによる検出にとっての蛍光活 性成分を提供する分子（または分子の複合体）に結合できるものである。これら の実施の形態におけるマーカー遺伝子産生物の選択の好ましい基準は、マーカー 遺伝子産生物を除いて、宿主細胞が、他のタンパク質、例えば、宿主細胞のＦＡ ＣＳ選別を混同するであろ感知可能なレベルで二次蛍光タグに結合するタンパク 質を産生しないことでかる。 間接検出系の好ましい実施の形態において、マーカー遺伝子は、細胞膜に関連 し、少なくとも部分的に細胞外環境に露出されたタンパク質をコード化する。例 えば、間接ＦＡＣＳタグは、細胞外領域を有する膜内外タンパク質、または例え ば、ミリストル(myristol)、ファーネシル(farnesyl)または他のプレニル(preny l)基のような宿主細胞の表面に封鎖されたタグを保持する膜局在信号の他の形態 を有する細胞外タンパク質であって差し支えない。間接ＦＡＣＳタグは、宿主細 胞に特有であるが、選択が行われる条件またはその菌株のいずれかのために細胞 中では通常発現されないタンパク質であって差し支えない。他の実施の形態にお いて、間接ＦＡＣＳタグは、宿主細胞に特有ではないタンパク質を含むタンパク 質であり、例えば、それは、別の種からの自然に生じるポリペプチド配列である 、または人工のポリペプチド配列であり、それは、二次蛍光タグが結合した融合 タンパク質の異種部分である。 マーカーが間接ＦＡＣＳタグを使用する場合には、ＦＡＣＳの細胞を標識付け るために、二次蛍光タグを提供しなければならない。この二次蛍光タグは、蛍光 標識抗体またはＩＴＳ細胞の表面にある間接ＦＡＣＳタグに特異的に結合する他 の結合成分であって差し支えない。間接ＦＡＣＳタグが受容体、または少なくと もそのリガンド結合領域である場合には、二次蛍光タグは、その受容体の蛍光標 識リガンドであっても差し支えない。そのようなリガンドは、ポリペプチドまた は小さな分子であっても差し支えない。 一般的に、フロー・サイトメトリーに使用するためには、蛍光活性タグは、好 ましくは、以下の特性を有するべきである： (i) 二次蛍光タグの分子は、適切な蛍光染料に結合するのに十分な大きさで 、十分な化学反応性のものでなければならなか、または二次蛍光タグはそれ自体 が蛍光性でなければならない。 (ii) 必要な蛍光標識付けの後、二次蛍光タグは好ましくは水と反応しない。 (iii) 必要な蛍光標識付けの後、二次蛍光タグは好ましくは非特異的様式で タンパク質と結合またはタンパク質を分解しない。 (iv) 二次蛍光タグの分子は、適切な染料に結合することにより、細胞上の間 接ＦＡＣＳタグに結合するための変更されていない十分な表面積（リンカーに結 合した分子を除いて、少なくとも500平方オングストローム）となるように十分 に大きくなければならない。 本発明の方法を用いても差し支えない蛍光基の例としては、フルオレセイン誘導 体（フルオレセインイソチオシアネートのような）、クマリン誘導体（アミノメ チルクマリンのような）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミンまたはテ キサスレッドのような）、ペリジニンクロロフィル複合体（米国特許第4,876,19 0号に記載されているもののような）、およびフィコビリタンパク質（特に、フ ィコエリトリン）が挙げられる。 本発明の方法の好ましい実施の形態の一つにおいて、マーカー基がフルオレセ インである場合には、ＦＡＣＳによる細胞の検出は、約520ｎｍおよび約560ｎｍ の間の波長（特に約520ｎｍで）、最も好ましくは励起波長が約520ｎｍ以下であ る波長で放出される光を測定することにより行われる。 主題の二次蛍光タグを生成できるケミルミネッセンス基としては、イソルミノ ール（または４−アミノフタルヒドラジド）が挙げられる。 他の例において、マーカー遺伝子は、ＦＡＣＳ標識との相互作用の際にフロー ・サイトメトリーにより検出できる核酸をコード化することができる。ある実施 の形態において、マーカー遺伝子は、リボザイムを「コード化」でき、蛍光活性 核酸断片の検出は、リボザイムにとって適切な標識基質を加える際にフロー選別 に関して検出することができる。例えば、基質核酸は、蛍光原(fluorogenic)供 与体ラジカル、例えば、蛍光蛍光ラジカル、および受容体ラジカル、例えば、受 容体ラジカルおよび蛍光原供与体ラジカルが近くに共有的に保持されている場合 に蛍光原供与体ラジカルの蛍光エネルギーを吸収する芳香族ラジカルを含んでも 差し支えない。例えば、米国特許第5,527,681号、同第5,506,115号、同第5,429, 186号、および同第5,316,691号；およびCapobiance等（1992）Anal Biochem 204 :96-102を参照のこと。例えば、基質核酸は、プリマー(plymer)の一つの位置に 位置する１−アミノ安息香酸（アントラニル酸またはＡＢＺ）またはアミノメチ ルクマリン（ＡＭＣ）のような蛍光供与体基および異なる位置にあるルシファー イエロー、メチルレッドまたはニトロベンゾ−２−オキソ−１，３−ジアゾール （ＮＢＤ）のような蛍光消光基を有する。リボザイムの開裂部位は、供与体基お よび受容体基の部位の各々の間に位置する。蛍光供与体分子から消光体への分子 内共鳴エネルギーの転移により、それら二者が空間で十分に近接しているとき、 例えば、基質が影響を受けていないときに、供与体分子の蛍光を消光する。しか しながら、基質の開裂の際に、消光体は供与体基から引き離されて、後に蛍光断 片を残す。したがって、リボザイムの発現により、基質核酸が開裂し、蛍光基が 蛍光(dequenching)する。ペプチドベースの酵素の基質に関して同様の実施の形 態を構成することができる。 レトロウイルスベクターのプロウイルス切除要素により、受容体細胞のゲノム からレトロウイルスプロウイルス（以下参照）を切除することができる。この要 素は、リコンビナーゼ酵素、制限酵素、または配列依存様式でゲノムＤＮＡを選 択的に開裂できる他の酵素または因子により特異的に認識されるヌクレオチド配 列を含んでいる。このリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ作用による切除に よって、切除された核酸分子が環状化されるような様式によりその認識部位で核 酸を開裂する。制限酵素の場合には、切除されたレトロウイルス配列は、線状の ままであっても、または再度ライゲーションによって環状化されても差し支えな い。 酵素補助部位特異的組込系が、この業界で知られており、本発明のベクター系 に適用して、ウイルスＤＮＡを切除することができる。そのような酵素補助組込 系の例としては、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘ標的系（例えば、Baubonis,W. およびSauer,B.（1993）Nucl.Acids Res.21:2025-2029;およびFukushige,S.およ びSauer,B.（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:7905-7909に記載されている ような）およびＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えば、Dang,D.T.およ びPerrimon,N.（1992）Dev.Genet.13:367-375;およびFieing,S.等（1993）Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:8469-8473に記載されているような）；モラ・アクセン フェルド菌からのＰｉｖ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ（例えば、Lenich等（ 1994）J Bacteriol 176）4160に記載されているような）；ラムダインテグラー ゼ（例えば、Kwon等（1997）Science 276:126）が挙げられる。 「リコンビナーゼ標的部位」（ＲＴＳ）はここでは、介在配列の切除のために リコンビナーゼにより認識される核酸配列を意味する。二つのＲＴＳが切除に必 要とされていることが理解されている。したがって、ｃｒｅリコンビナーゼを用 いる場合、各々のＲＴＳはｌｏｘＰ部位を含み；ｌｏｘＰ部位が用いられる場合 、対応するリコンビナーゼはｃｒｅリコンビナーゼである。すなわち、リコンビ ナーゼは、ＲＴＳに対応するか、またはそれらを認識しなければならない。ＦＬ Ｐリコンビナーゼを使用する場合、各々のＲＴＳはＦＬＰ組換え標的部位（ＦＲ Ｔ）を含み；ＦＲＴ部位を使用する場合、対応するリコンビナーゼはＦＬＰリコ ンビナーゼである。 制限するものではないが、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、酵母 のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ、大腸菌のＰｉｎリ コンビナーゼ、およびｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系を含む、様々な異なる部 位特異的リコンビナーゼ系を使用することができる。二つの好ましい部位特異的 リコンビナーゼ系は、バクテリオファージＰ１Ｃｒｅ／ｌｏｘ系および酵母ＦＬ Ｐ／ＦＲＴ系である。これらの系において、リコンビナーゼ（ＣｒｅまたはＦＬ Ｐ）は、それぞれの部位特異的組換え配列（それぞれ、ｌｏｘまたはＦＲＴ）と 特異的に相互作用して、介在配列を切除または転移(invert)させる。これら二つ の系の各々の配列は比較的短い（ｌｏｘは34ｂｐであり、ＦＲＴは47ｂｐである ）。現在、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系が、真核生物（酵母）内で正常に機能し、よ く特徴付けられているので、好ましい部位特異的リコンビナーゼ系である。 好ましい実施の形態において、リコンビナーゼ認識部位は、プロウイルスの組 込みの際に重複される位置で３’ＬＴＲ内に位置する。このために、リコンビナ ーゼ部位と隣接したプロウイルスが得られる。 典型的な実施の形態において、プロウイルス切除要素は、ＬＴＲ内に位置する ｌｏｘＰ組換え部位を含んでいる。Ｃｒｅリコンビナーゼをレトロウイルスベク ター由来の組み込まれたプロウイルスに接触させることにより、プロウイルス核 酸が切除される。別の形態において、同一の突然変異体部位によってのみ組み換 えられる突然変異体ｌｏｘＰ組換え部位を用いてもよい（例えば、ｌｏｘＰ５１ １（Hoess等，1986，Nucleic Acid Research 14:2287-2300））。 さらに別の好ましい実施の形態において、ｆｌｐリコンビナーゼ酵素により開 裂可能なｆｒｔ組換え部位を、ｌｏｘＰ／Ｃｒｅの実施の形態に関して上述した ように、ｆｌｐリコンビナーゼ酵素と協同して用いる。「Ｆｌｉｐ組換え標的部 位」（ＦＲＴ）は、部位特異的酵母ｆｌｉｐリコンビナーゼ系内で基質として機 能するヌクレオチド配列を意味する。ＦＲＴ組換え領域を、２−ｍｕ ｍ環（サ ッカロミセス セレビシアエ内で通常生じるプラスミド）の599ｂｐ長の逆反復 部内の約65塩基対（ｂｐ）断片にマッピングした。組換えの原因である酵素（Ｆ ＬＰ）は、２−ｍｕ ｍ環によりコード化され、ヒト細胞中で高レベルで発現さ れた。ＦＬＰは、分子の逆反復部内で組換えに触媒作用を生じさせて、分子内逆 転を生じさせる。ＦＬＰは、非常に高い効率および特異性を有する２−ｍｕ ｍ 環反復部を含有するプラスミド間の効率的な組換えを促進することもできる。例 えば、Jayaram（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:5875-5879;およびO'Gor man（1991）Science 251:1351-1355を参照のこと。「最小ＦＲＴ部位」（例えば 、最小ＦＬＰ基質）が、従来技術において記載されており、ここで、65ｂｐのＦ ＲＴ領域内に位置する８ｂｐコアの加わった13ｂｐの二分子対称体として定義さ れ ている。Jayaram等、前出。ＦＲＴ部位およびＦＬＰ発現プラスミドの両方が、 ストラタジーン（カリフォルニア州、サンディエゴ）より販売されている。 さらに別の実施の形態において、Ｒリコンビナーゼ部位およびZygosaccharomy ces rouxiiからのＲリコンビナーゼをｌｏｘＰ／Ｃｒｅの実施の形態の代わりに 上述したように用いることができる。ＥＣ２．７．７．−（Ｒリコンビナーゼ） 。Chen等（1991）PNAS 88:5944を参照のこと。 別の実施の形態において、レアカッティング(rare-cutting)制限酵素（例えば 、Ｎｏｔ１）をリコンビナーゼ酵素の代わりに用いてもよい。回収したＤＮＡを 、Ｎｏｔ１で消化し、次いで、リガーゼで再度環状化させる。この実施の形態に おいて、Ｎｏｔ１部位は、ｌｏｘＰの隣のベクター内に含まれる。他の実施の形 態において、制限酵素は、８以上の塩基カッターであっても差し支えなく、例え ば、特異性に関して少なくとも８塩基対が必要である。 以下に記載する本発明の相補性スクリーニング系において、そのような切除系 は、ウイルス依存性レスキュー事(rescue event)から復帰突然変異体を識別する ように機能することもできる。 レトロウイルスベクターのプロウイルス回収要素により、核酸の複合混合物か ら切除されたプロウイルスを回収することができ、したがって、受容体細胞ゲノ ムからプロウイルスを選択的に回収および切除することができる。このプロウイ ルス回収要素は、核酸／タンパク質対を結合させる親和性の高い核酸部分に対応 する核酸配列を含んでいる。 その核酸は、限定するものではないが、高親和性でｌａｃ抑制因子、ｔｅｔ抑 制因子またはラムダ抑制タンパク質と結合する核酸が挙げられる。例えば、ある 実施の形態において、プロウイルス回収要素は、ｌａｃオペレータ核酸配列を含 み、この配列はｌａｃ抑制因子ペプチド配列と結合する。そのようなプロウイル ス回収要素は、マトリクス（例えば、磁気ビーズまたはセファロース）に結合し たｌａｃ抑制因子を用いて、親和性精製しても差し支えない。本発明のレトロウ イルスベクター由来の切除されたプロウイルスはまた、レトロウイルス回収要素 を含んでおり、親和性精製することができる。 当業者には、自然に生じるＤＮＡ結合タンパク質由来のポリペプチド、並びに 特定のＤＮＡ配列と相互作用するように人工的に操作されたタンパク質由来のポ リペプチドを含む様々な他のＤＮＡ結合タンパク質があり、これら配列は、適切 なプロウイルス回収要素とともに用いても差し支えないことが認識される。ＤＮ Ａ結合タンパク質に関する基本的な必要条件としては、所定のヌクレオチド配列 に特異的に結合する能力が挙げられる。 ある好ましい実施の形態において、例えば、特定のヌクレオチド配列に選択的 に結合する能力を維持している、転写活性化因子または転写抑制因子のいずれか の転写調節タンパク質の全て、またはＤＮＡ結合部分を用いて、ＤＮＡ結合タン パク質を誘導する。バクテリオファージλｃＩタンパク質のＤＮＡ結合領域（以 後「λｃＩ」と称する）および大腸菌ＬｅｘＡ抑制因子（以後「ＬｅｘＡ」と称 する）が、そのようなＤＮＡ結合領域の例を示している。 しかしながら、他の転写不活性または実質的に転写不活性のＤＮＡ結合領域を 用いてもよく、そのようなＤＮＡ結合領域は、よく知られており、制限するもの ではないが、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ（λｃＩ中に見られるよ うな）、翼状ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ（ある熱衝撃転写因子中 に見られるような）、および／または亜鉛指／亜鉛クラスターのようなモチーフ を含んでいる。説明のみを目的として、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写調節因子 のＬｙｓＲ群のＤＮＡ結合部分、例えば、Ｔｒｐｌ、ＨｖＹ、ＯｃｃＲ、Ｏｘｙ Ｒ、ＣａｔＲ、ＮａｈＲ、ＭｅｔＲ、ＣｙｓＢ、ＮｏｄＤまたはＳｙｒＭ（Shel l等（1993）Annu Rev Microbiol 47:597）、またはＰｈｏＢ／ＯｍｐＲ関連タン パク質のＤＮＡ結合部分、例えば、ＰｈｏＢ、ＯｍｐＲ、ＣａｃＣ、ＰｈｏＭ、 ＰｈｏＰ、ＴｏｘＲ、ＶｉｒＧまたはＳｆｒＡ（Makino等（1996）J Mol Biol 2 59:15）、またはヒストンＨ１またはＨ５のＤＮＡ結合部分（Suzuki等（1995）F EBS Lett 372:215）を用いて構築することができる。他の例としては、Ｐ２２Ａ ｒｃ抑制因子のＤＮＡ結合部分、ＭｅｔＪ、ＣＥＮＰ−Ｂ、Ｒａｐｌ、ＸｙｌＳ ／Ａｄａ／ＡｒａＣ、Ｂｉｒ５またはＤｔｘＲが挙げられる。さらに、ＤＮＡ結 合領域は、原核生物のタンパク質から得る必要がない。例えば、ＤＮＡ結合活性 を有するポリペプチドは、酵母を含む真核起点のタンパク質から誘導することが できる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質は、ｐ５３、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、ＧＣＮ４ 、またはＧＡＬ４のような真核ＤＮＡ結合タンパク質からのポリペプチド配列を 含んでいても差し支えない。同様に、ＤＮＡ結合タンパク質は、乳頭腫ウイルス Ｅ２タンパク質のようなウイルスタンパク質から産生することができる（ＰＣＴ 公報第WO96/19566号参照）。 さらに他の実施の形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は、組合せ突然変異誘 発技術により産生することができ、どのような生物において自然に生じないＤＮ Ａ結合領域を示す。すなわち、構築において、完全に任意のプロウイルス回収(r eceogery)要素を提供でき、そのような組合せ手を用いて、その要素のヌクレオ チド配列に関して十分な特異性を有する新たなタンパク質を産生する。特定のＤ ＮＡ配列に選択的に結合できる新たなＤＮＡ結合タンパク質を産生する様々な技 術が従来技術において記載されている（「Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptide」と題する米国特許第5,198,346号を参 照のこと）。 このように、プロウイルス回収要素の選択は、その回収要素の配列を認識し、 宿主細胞およびベクターがシャトルされる(shutled)／増幅されるあらゆる細菌 細胞中のベクターとの適合性を有するＤＮＡ結合タンパク質の有用性のみにより 制限される。 一般的に、５’ＬＴＲは、限定するものではないが、ＬＴＲプロモータを含む プロモータ、Ｒ領域、Ｕ５領域およびプライマー結合部位を、好ましくはこの順 香で含む。これらのＬＴＲ要素のヌクレオチド配列は、当業者によく知られてい る。 ３’ＬＴＲは、プロウイルス切除要素を含むＵ３領域、プロモータ、Ｒ領域お よびポリアデニル化信号を含んでいる。そのような要素のヌクレオチド配列は、 当業者によく知られている。 しかしながら、ＬＴＲの内因性プロモータを異種転写調節配列と置き換えられ 、３’ＬＴＲをその制御に影響を与えずに異種ポリアデニル化信号と置き換えら れることも特に考えられる。例えば、米国特許第5,591,624号に記載されている ように、５’ＬＴＲ中のＵ３領域は、異種プロモータ／エンハンサにより置き換 えることができる。 使用される複製の細菌起点（Ｏｒｉ）は好ましくは、感染細胞中でウイルス産 生または遺伝子発現に悪影響を及ぼさないものである。それ自体で、細菌Ｏｒｉ は非−ｐＵＣＯｒｉ類縁（例えば、ｐＵＣ、ｃｏｌＥＩ、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ Ａ等）であることが好ましい。さらに、細菌ＯｒｉがｐＵＣ細菌Ｏｒｉに対して 90％未満の全体のヌクレオチド類似性を示すことが好ましい。好ましい実施の形 態において、複製の細菌起点はＲＫ２ ＯｒｉＶまたはｆｌファージＯｒｉであ る。 好ましい実施の形態において、レトロウイルスベクターはさらに、一本鎖複製 起点、好ましくは、ｆｌ−本鎖複製起点を含んでも差し支えない。この一本鎖複 製起点により、本発明のレトロウイルスベクター由来の標準化された一本鎖レト ロウイルスライブラリーを産生することができる。標準化ライブラリーは、稀な クローンの発生する相対的頻度を増大させると同時に、豊富なクローンの発生す る相対的頻度を減少させる様式で構築されるものである。標準化ライブラリーの 産生に関する教示については、例えば、Soares等を参照のこと（Soares,M.B.等 ，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:9228-9232を参照のこと、これを全て ここに引用する）。ビオチニル化ヌクレオチドに基づく別の標準化方法を用いて もよく、これが以下詳細に記載されている。 どのような細菌選択可能マーカーを用いても差し支えない。上述したように、 マーカーは好ましくは、細胞を、薬物処理耐性にして、栄養要求性表現型を克服 する、もしくは直接的または間接的に測定し、プロウイルスベクターを宿す細菌 細胞を選択する手段として使用できる他の信号を提供するものであって差し支え ない。細菌選択可能マーカーは、当業者によく知られており、限定するものでは ないが、カナマイシン／Ｇ４１８、ゼオシン(zeocin)、アクチノマイシン(actin omycin)、アンピシリン、ゲンタマイシン(gentamycin)、テトラサイクリン、ク ロラムフェニコールまたはペニシリン抵抗性マーカーを含む。 さらに別の実施の形態において、レトロウイルスベクターはさらに、例えば、 本発明のレトロウイルスベクターを含むライブラリーの構築中に、ｃＤＮＡまた はｇＤＮＡ挿入物を含有するベクターを選択するのに用いることができるリーサ ルスタファ(lethal stuffer)断片をさらに含んでも差し支えない。リーサルスタ ファ断片は当業者によく知られている（例えば、Bernord等，1994，Gene 148:71 -74を参照のこと、この全てをここに引用する）。リーサルスタファ断片は、そ の発現が細胞増殖を条件的で阻害する遺伝子配列を含んでいる。したがって、例 えば、核酸ライブラリーのスタファ断片の暗号配列中への挿入によって、リーサ ルスタファの発現を分断することにより、試験している核酸がうまくライゲーシ ョンされるベクターがもはや、スタファ断片の細胞毒／細胞増殖抑制形態を発現 しなくなる。したがって、これらの細胞は、単に、スタファ断片の阻害効果から のレリーフが、異種核酸配列を含むことによりスタファ断片遺伝子への機能消失 突然変異誘発により与えられるという事実により、培地中で増殖させることがで きる。 ある実施の形態において、スタファ断片は、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列のポ リリンカー中への挿入がスタファ断片を置き換えるように多シストロン性伝令Ｒ ＮＡカセットポリリンカー内の本発明のレトロウイルスベクター中に存在する。 あるいは、多シストロン性伝令ＲＮＡカセットポリリンカーは、ｃＤＮＡまたは ｇＤＮＡ配列のポリリンカー中への挿入の際に、リーサルスタファ断片暗号領域 が分断されるように、リーサルスタファ断片暗号配列内に位置する。これらの実 施の形態の各々を用いて、ポリリンカー挿入物を含まないレトロウイルスベクタ ーを対抗選択することができる。 Ｂ）アデノ関連性ウイルス相補性スクリーニングおよび発現ベクター 主題のベクターの開発に有用なさらに別のウイルスベクター系はアデノ関連性 ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連性ウイルスは、アデノウイルスまたはヘ ルペスウイルスのような別のウイルスを、効率的な複製および生産生活周期のた めのヘルパーウイルスとして必要とする自然に生じる欠損ウイルスである（Muzy czka等Curr．Topics in MIcro．and Immunol．（1992）158:97-129を参照のこと ）。これは、そのＤＮＡを非分裂細胞中に組み込んでもよく、安定な組込みの高 頻度を示す数少ないウイルスのうちの一つである（例えば、Flotte等（1992）Am ．J．Respir．Cell．Mol．Biol．7:349-356;Samμlski等（1989）J．Virol．63: 3822-3828;およびMcLaμghlin等（1989）J．Virol．62:1963-1973を参照のこと ）。ウイルスＤＮＡ複製（ｏｒｉ）、エンカプシデーション／パッケージング （ｐｋｇ）および宿主細胞染色体組込み（ｉｎｔ）を指示するシス作用性配列が ＩＴＲ内に含まれている。300塩基対のＡＡＶを含むベクターをパッケージング し、組み込むことができる。外因性ＤＮＡの空間は、約4.5ｋｂに制限されてい る。 アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）はレトロウイルス群の欠損員である。ＡＡＶ ゲノムは、プラスまたはマイナスの極性を有する一本鎖ＤＮＡ分子としてカプシ ド中に包含されている（BernsおよびRose，1970，J．Virol．5:693-699;Blacklo w等，1967，J．Exp．Med．115:755-763）。両極性の鎖が別々のウイルス粒子中 であるがパッケージされ（BernsおよびAdler，1972，Virology 9:394-396）、両 鎖が感染性である（Samμl ski等，1987，J．Virol．61:3096-3101）。 ＡＡＶには、本発明のベクターを設計する基礎としてこれを魅力的にしている 独特の性質がある。培養している細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、人間お よび他の動物の自然感染は無症状で無症候である。さらに、ＡＡＶは、ほとんど の（全てではないにしろ）哺乳類細胞に感染し、生体内の多くの異なる組織を標 的とする可能性が生じる。Kotin等，（1992）EMBO J．11:5071-5078には、ＡＡ ＶのＤＮＡゲノムは、感染の際に染色体19上の標的組込を経験すると報告されて いる。ウイルスＤＮＡの複製は、組込みに必要とされず、したがって、ヘルパー ウイルスはこの目的には必要とされない。このＡＡＶプロウイルスゲノムは、組 換えゲノムの構築を実施できるようにするプラスミド中のクローンされたＤＮＡ として感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムエンカプシデーションおよび 組込みを指示する信号がＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、したがって、 このゲノムの内部の約4.3ｋｂ（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ− ｃａｐをコード化する）が、ここに記載するような、例えば、転写調節配列、関 心のあるＤＮＡおよびポリアデニル化信号を含む、遺伝子カセットのような異種 ＤＮＡと置き換えられてもよい。ＡＡＶの別の重要な特性は、これが非常に安定 で、旺盛なウイルスであることである。このウイルスは、アデノウイルスを不活 化させるのに使用する条件に容易に耐え（数時間に亘り560℃から650℃）、ｒＡ ＡＶベースのワクチンを危なげなく低温貯蔵することができる。最後に、ＡＡＶ 感染細胞は、重感染に対しては耐性ではない。 ヒトの２型アデノ関連性ウイルスの一本鎖ＤＮＡゲノム（ＡＡＶ２）は、長さ が4681塩基対であり、各々145塩基対の逆転末端反復配列と隣接している（Lusby 等，1982，J．Virol．41:518-526）。最初の125のヌクレオチドは、それ自体で 折り曲がって「Ｔ」型ヘアピン構造を形成し、二つの方向のいずれかに存在する ことができ（ｆｌｉｐまたはｆｌｏｐ）、ＡＡＶの末端ヘアピンがＤＮＡ複製を 開始するプライマーとして用いられている線状染色体ＤＮＡに関してCavalier-S mith（1974，Nature 250:467-470）により提案されている第一モデルにしたがっ てＡＡＶが自己分裂するかもしれないという示唆（BernsおよびHauswirth，1979 ，Adv．Virus Res．25:407-449）に導かれる回帰性配列を形成する。ウイルスＤ ＮＡのパッケージング、組込み／救助、および複製に関してシスに必要とされる ＡＡＶ配列は、末端反復配列を含む284塩基対（ｂｐ）配列内に位置するように 思われる（McLaμghlin等，1988，J．Virol．62:1963-1973）。突然変異したと きに、表現型的に別個のウイルスを生じる少なくとも三つの領域がＡＡＶゲノム 中で同定されている（Hermonat等，1984，J．Virol．51:329-339）。ｒｅｐ領域 は、ＤＮＡ複製および組換えプラスミドからの救助に必要とされる少なくとも四 つのタンパク質をコード化する（Mendelson等，1986，J．Virol．60:823-832） 。ｃａｐおよびｌｉｐ領域は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコード化するように 思われ、これらの領域内に損傷を含む突然変異体はＤＮＡ複製を行うことができ る（Hermonat等，1984，J．Virol．51:329-339）。ＡＡＶは三つの転写プロモー タを含んでいる（Carter等，1983，in”The Parvoviruses”K．Bernsed.，Plenu m Publishing Corp.，N.Y．pp.153-207;GreenおよびRoeder，1980，Cell 22:231 -242;Laμghlin等，1979，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．76:5567-5571;Lusbyお よびBerns，1982，J．Virol．41:518-526;Marcus等，1981，Eur．J．Biochem．1 21:147-154）。ウイルスＤＮＡ配列は二つの主要なオープンリーディングフレー ムを示しており、一方は従来のＡＡＶマップの左半分であり、他方はその右半分 である（Srivastava等，1985，J．Virol．45:555-564）。 ＡＡＶ−２は、溶菌ウイルスとして伝搬され、またはプロウイルスとして維持 され、宿主細胞ＤＮＡ中に組み込むことができる（Cukor等，1984，in”The Par voviruses,”Berns ed.，Plenum Publishing Corp.，N.Y．pp.33-66）。ある条 件下でＡＡＶはヘルパーウイルスがなくても複製できるけれども（Yakobson等， 1987，J．Virol．61:972-981）、効率的な複製には、アデノウイルス（Atchinso n等，1965，Science 194:754-756;Hoggan，1965，Fed．Proc．Am．Soc．Exp．Bi ol．24:248;Parks等，1967，J．Virol．1:171-180）；単純ヘルペスウイルス（B μller等，1981，J．Virol．40:241-247）またはサイトメガロウイルス、エプス タインバーウイルス、またはワクシニアウイルスのいずれかによる共感染が必要 である。したがって、ＡＡＶの分類は「欠損」ウイルスである。 ヘルパーウイルスを利用できない場合には、ＡＡＶは、組込みプロウイルスと して宿主細胞ゲノムＤＮＡ中で残存することができる（Berns等，1975，Virolog 68:556-560;Cheung等，1980，J．Virol．33:739-748）。ウイルス組込みは、細 胞の増殖または形態学には影響がないように思われる（Handa等,1977,Virology 82:84-92;Hoggan等,1972,in”Proceedings of the Fourth Lepetit Colloquium, ”North Holl and Publishing Co.,Amsterdam pp.243-249）。組込みＡＡＶゲノ ムの物理的構造の研究（Cheung等，1980，前出;Berns等，1982，in”Virus Pers istence”Mahy等，eds.，Cambridge University Press，N.Y．pp.249-265）は、 ウイルス挿入が、宿主染色体の任意の位置で生じるが、ＡＡＶ ＤＮＡに関して は、末端反復配列内の特有の位置で生じることが示唆されている。組み込まれた ＡＡＶゲノムは、実質的に安定であり、100継代より多い組織培養においても存 続することが分かった（Cheung等，1980前出）。 挿入された非ＡＡＶまたは異種ＤＮＡの所望のサイズは、ｒＡＡＶベクターの ウイルス粒子中へのパッケージングを可能にし、得られたＡＡＶ配列のサイズに 依存するものに制限される。主題の構築物の産生において、挿人された異種核酸 配列の発現を最大にするために、ｒＡＡＶベクター中のＡＡＶゲノムの部分を排 除することが望ましいかもしれない。 好ましい実施の形態において、主題のベクターは、複製欠損ＡＡＶを用いて誘 導される。例えば、ここでは、ＩＴＲと自然に隣接しているウイルス配列の全て のまたはほとんどの部分が、ここに記載されたレトロウイルスベクターに関して 記載されているように、例えば、多シストロン性発現カセット、複製の細菌起点 、プロウイルス回収要素等と置き換えられる。このＩＴＲはまた、好ましくは、 上述したように、プロウイルス切除要素を含むように操作される。維持する必要 のある全ては、ウイルスベクターの染色体組込みおよびその安定性の維持に関し て必要な配列とともに、ヘルパー細胞系統中の効率的なパッケージングに必要な ＡＡＶ配列である。 この点に関して、「ヘルパーウイルス」という用語は、アデノウイルス、ヘル ペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、またはワク シニアウイルスのような、ＡＡＶと共感染されたときに、適切な真核細胞を生産 的にＡＡＶ感染するウイルスを称する。同様に、ヘルパーＡＡＶ ＤＮＡは、Ｄ ＮＡのウイルス粒子中への複製および／または包含に必要な機能が欠如している 組換えＡＡＶウイルスにＡＡＶ機能を提供するのに用いられるＡＡＶ ＤＮＡ配 列を称する。ヘルパーＡＡＶ ＤＮＡはそれ自体では、感染性ウイルス粒子を産 生できず、プラスミド、バクテリオファージまたは染色体ＤＮＡ中に含まれてい てもよい。最後に、ヘルパーを含まない組換えＡＡＶのウイルス株は、測定可能 な量の野生型ＡＡＶまたは望ましくない組換えＡＡＶを含まない組換えＡＡＶウ イルス粒子の株を称する。 Ｃ．エピソーム相補性および発現ベクター 上述したように、本発明の別の態様は、ここに記載するようなｐＥＨＲＥベク ターのような、哺乳類エピソームベクター、哺乳類発現クローニング系として、 初めて、哺乳類細胞の広いスペクトル範囲内で、安定で、効率的で、高レベルの エピソーム発現を可能にできるエピソーム発現ベクターに関するものである。そ のようなベクターはまた、例えば、本発明の相補性スクリーニング方法の一部と して用いることもできる。主題のエピソームベクターは、高エピソームコピー数 を提供するが、例えば、細胞の死亡に繋がり得る制御できない(runaway)複製と はならないように設定されている。 ｐＥＨＲＥベクターのような主題のエピソーム発現ベクターは、複製カセット 、発現カセットおよび複製と安定なエピソーム維持に必要な最小のシス作用性要 素を含んでいる。 本発明のエピソームベクターはさらに、複製および／または組換え部位の少な くとも１つの細菌起点を含んでも差し支えない。これらの組換え部位は、好まし くは、複製カセットに隣接し、限定するものではないが、上述したいずれの組換 え部位を含んでいても差し支えない。 発現ベクター中に提供される暗号配列の発現に悪影響を与えない複製のどの細 菌起点（Ｏｒｉ）を用いても差し支えない。例えば、細菌Ｏｒｉは、ｐＵＣ細菌 Ｏｒｉ類縁（例えば、ｐＵＣ、ｃｏｌＥＩ、ｐＳＣ１０１、Ｐ１５Ａ等）であっ ても差し支えない。複製の細菌起点はまた、例えば、ＲＫ２ ＯｒｉＶまたはｆ １ファージＯｒｉであっても差し支えない。ｐＥＨＲＥベクターはさらに、一本 鎖複製起点、好ましくは、ｆ１−本鎖複製起点を含んでいても差し支えない。こ の一本鎖複製起点により、本発明のｐＥＨＲＥベクター由来の標準化された一本 鎖ライブラリーを産生することができる。標準化ライブラリーは、稀なクローン の発生する相対的頻度を増大させると同時に、豊富なクローンの発生する相対的 頻度を減少させるような様式で構築されたものである。標準化ライブラリーの産 生に関する教示については、例えば、Soare等（Soares,M.B.等，1994，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 91:9228-9232、この全てをここに引用する）を参照のこと 。ビオチニル化ヌクレオチドに基づく別の標準化方法を用いてもよい。 複製のｆ１起点を用いた例において、ｐＥＨＲＥベクターはさらに、核酸／タ ンパク質対に結合する高親和性を備えた核酸部分に対応する核酸配列を含んでい ても差し支えない。そのような核酸／タンパク質対は、上述したように、限定す るものではないが、その核酸部分がｌａｃＯ部位を含むようなものであって差し 支えない。その核酸としては、限定するものではないが、高親和性で、ｌａｃ抑 制、ｔｅｔ抑制またはラムダ抑制タンパク質に結合する核酸が挙げられる。例え ば、ある実施の形態において、プロウイルス回収要素は、ｌａｃオペレータ核酸 配列を含み、この配列はｌａｃ抑制因子ペプチド配列と結合している。 そのようなプロウイルス回収要素は、マトリクス（例えば、磁気ビーズまたは セファロース）に結合したｌａｃ抑制因子を用いて親和性精製することができる 。本発明のレトロウイルスベクタ一由来の切除されたプロウイルスはまた、レト ロウイルス回収要素を含み、親和性精製することができる。 典型的な実施の形態において、ｐＥＨＲＥベクター複製カセットは、乳頭腫ウ イルス（ＰＶ）Ｅ１およびＥ２タンパク質をコード化する核酸配列を含み、ここ で、そのような核酸配列は、構成性または誘導性転写調節配列に作用的に付着し 、それによって転写されているが、構成性配列が好ましい。代表的なＥ１および Ｅ２アミノ酸配列が当業者によく知られている。例えば、Ｇｅｎｂａｋのような データベースで得られる配列を参照のこと。そのＥ１およびＥ２暗号配列は、第 一に、限定するものではないが、ＢＰＶ−１ Ｅ１またはＥ２遺伝子産生物のよ うなウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）を含む、内因性ＰＶをコード化するいかなる ヌクレオチド配列を含んでいても差し支えない。 ここに用いているように、「Ｅ１」という用語は、内因性Ｅ１タンパク質と同 様な様式でＰＶ中で機能できる、すなわち、Ｅ１突然変異誘発を補足できるどの ようなタンパク質をも称する。ＢＰＶを例にとると、ここに記載したＥ１タンパ ク質は、ＢＰＶ Ｅ１突然変異誘発を補足できるものである。同様に、「Ｅ２」 という用語は、内因性Ｅ２タンパク質と同様な様式でＰＶ中で機能できる、すな わち、Ｅ２突然変異誘発を補足できるどのようなタンパク質をも称する。ＢＰＶ を例にとると、ここに記載したＥ２タンパク質は、ＢＰＶ Ｅ２突然変異誘発を 補足できるものである。 複製カセット転写調節配列としては、限定するものではないが、ＳＶ４０、Ｃ ＭＶまたはＰＧＫプロモータのようなｐｏｌＩＩプロモータが挙げられ、それら のヌクレオチド配列は当業者によく知られている。 Ｅ１およびＥ２暗号配列は、別々の転写調節配列に作用的に結合し、それによ って転写することができる。しかしながら、多シストロン性配列において、少な くとも１つの選択可能マーカーと、単独でまたは互いに、Ｅ１およびＥ２配列の 少なくとも一つ、好ましくは両方を提供することが好ましい。ある実施の形態に おいて、少なくとも１つのＥ１またはＥ２暗号配列を、多シストロン性伝令ＲＮ Ａとしての選択可能マーカーとともに転写しても差し支えない。そのような多シ ストロン性伝令ＲＮＡ構築物により、選択可能マーカー、好ましくは哺乳類選択 可能マーカーの発現を、エピソーム維持および複製に必要な配列の転写に直接的 に連結する選択計画が可能になる。例えば、そのような多シストロン性伝令ＲＮ Ａをコード化する複製カセットの部分は、５’から３’に、構成性転写調節配列 、Ｅ２（またはＥ１）暗号配列、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）、および 選択可能マーカーを含んでいても差し支えない。 別の実施の形態において、Ｅ１およびＥ２暗号配列は、多シストロン性伝令Ｒ ＮＡの一部として互いに転写できる。すなわち、内部リボソーム入口部位により 隔てられている、Ｅ１およびＥ２暗号配列の両方を一つの転写調節配列により転 写することができる。 さらに別の実施の形態において、Ｅ１、Ｅ２および選択可能マーカー配列を多 シストロン性伝令ＲＮＡとして転写することができる。例えば、複製カセットは 、５’から３’に、構成性転写調節配列、Ｅ２（またはＥ１）暗号配列、ＩＲＥ Ｓ、Ｅ１（またはＥ２）暗号配列、ＩＲＥＳおよび選択可能マーカーを含んでい ても差し支えない。 Ｅ１およびＥ２暗号配列が多シストロン性伝令ＲＮＡの一部として転写されて いる例において、５’から３’に順番が、Ｅ２で、次にＥ１であることが好まし い。このことにより、可能性のある稀な望ましくないＲＮＡスプライシングが確 実に生じなくなる。 本発明のエピソーム発現構築物を誘導して、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮ Ａ）または他の核酸配列を高レベルで発現させる。そのようなｐＥＨＲＥベクタ ー発現カセットは、５’から３’に、転写調節配列、ヌクレオチドポリリンカー 、内部リボソーム入口部位、哺乳類選択可能マーカーおよび、好ましくは、使用 する転写調節配列に依存して、ポリＡ部位または転写終止配列を含む（以下参照 ）。ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列は、ポリリンカー内の操作的結合により発現し ても差し支えない。ｐＥＨＲＥ発現ベクターは、一つのｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ 配列よりも大きなものが同一のｐＥＨＲＥ発現ベクターから発現されるように、 一つまたは多数の発現カセットを含んでも差し支えない。 ｐＥＨＲＥ発現カセット転写調節配列は、構成性または誘導性いずれであって も差し支えなく、細胞またはウイルス源から由来していても差し支えない。例え ば、そのような転写調節配列としては、限定するものではないが、レトロウイル ス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｖａ−１ ＲＮＡ またはＵ６ ｓｎＲＮＡプロモータ配列が挙げられ、それらのヌクレオチド配列 が当業者によく知られている。選択された転写調節配列に依存して、発現カセッ トは、ポリ−Ａ部位（ｐＡ）または転写終止配列のいずれかを含有していても差 し支えない。当業者は、不必要な実験を行わずに、所定の転写調節配列に使用す べき適切な配列を容易に選択することができる。一般的に、例えば、ｐｏｌＩＩ 型転写調節配列をｐＡ部位で結合し、ｐｏｌＩＩＩ型転写調節配列を転写終止配 列と結合させることができる。 転写調節配列の発現により、関心のあるｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列、ＩＲＥ Ｓおよび哺乳類選択可能マーカーを含む多シストロン性伝令ＲＮＡが産生される 。そのような多シストロン性伝令ＲＮＡ手法により、関心のあるｃＤＮＡまたは ｇＤＮＡが発現されることを確実にする選択を計画することができる。 ｐＥＨＲＥベクターはさらに、複製および安定なエピソーム維持において機能 するシス作用性要素を含んでいる。そのような配列は、複製のＰＶ最小起点（Ｍ Ｏ）およびＰＶ小染色体(minichromosomal)維持要素（ＭＭＥ）を含む。代表的 なＭＯおよびＭＭＥ配列は当業者によく知られている。例えば、Piirson,M.等， 1996，EMBO J．15:1-11を参照のこと。この全てをここに引用する。 ここで用いているように、「ＭＯ」という用語は、内因性ＭＯと同様な様式で ＰＶ内で機能できる、すなわち、ＭＯ突然変異誘発を補足できるいかなるヌクレ オチド配列をも称する。ＢＰＶを例にとると、ここに記載したように、ＭＯ配列 は、ＢＰＶ ＭＯ配列を補足または置き換えることのできるものである。同様に 、「ＭＭＥ」という用語は、内因性ＭＭＥと同様な様式でＰＶ内で機能できる、 すなわち、ＭＭＥ突然変異誘発を補足できるいかなるヌクレオチド配列をも称す る。例えば、ＭＭＥ配列は、多数のＥ２結合部位を含むものであって差し支えな い。ＢＰＶを例にとると、ここに記載したように、ＭＭＥ配列は、ＢＰＶ ＭＭ Ｅ配列を補足または置き換えることのできるものである。 ｐＥＨＲＥ ＩＲＥＳ並びに哺乳類および細菌選択可能マーカーは、例えば、 上述したようなものであって差し支えない。 図１０には、ｐＥＨＲＥ−Ｅ−Ｈと称されるあるｐＥＨＲＥベクター実施の形 態の例が示されている。このベクターにおいて、Ｅ１およびＥ２暗号配列は、Ｂ ＰＶ配列であり、個々のＳＶ４０プロモーターと操作的結合されている。Ｅ１は 、選択可能マーカーであるｈｙｇｒｏとともに多シストロン性伝令ＲＮＡの一部 として転写されている。この実施の形態において、複製カセットはさらに、ＩＲ ＥＳマーカーの下流のＳＶ４０ｐＡ部位を含んでいる。さらに、ＭＯおよびＭＭ Ｅ配列はＢＰＶ由来である（この図において、これらの配列の両方が「ＢＰＶ起 点」として示されている）。ベクターの発現カセットは、発現すべき配列（「産 生物」）と作用的に結合したＣＭＶプロモータを含み、この配列は、ＩＲＥＳ− マーカー（発現すべき配列およびＩＲＥＳ−マーカーは、この図では「マーカー 」として示されている）と作用的に結合し、次いで、このマーカーは、ｂｇＨポ リ−Ａ部位と作用的に結合している。最後に、そのベクターは、複製のｐＵＣ細 菌起点（Ｏｒｉ）、ｆ１ Ｏｒｉおよびアンピシリン細菌選択可能マーカーを含 んでいる。 ｐＥＨＲＥのような本発明のエピソーム発現ベクターを、組換えタンパク質の 、大規模製造を含む製造に用いることができる。ベクターの望ましい特性により 、実際に、大規模製造に特に適している。特に、哺乳類細胞中で組換えタンパク 質を製造する現在の方法には、細胞（例えば、ＣＨＯ、ＮＳ／０細胞）の形質転 換および薬物（例えば、メトトレキセートまたはグルタミンシンセターゼの阻害 因子）を用いた形質転換された細胞の続いての増幅が含まれる。そのような手法 は、アンプリコン(amplicon)にそれらのゲノム組込み座に応じて統計的変動を加 えるという事実、およびアンプリコンは連続選択（製造規模では実施不可能）な くしては不安定であることを含む様々な理由により好ましくない。主題のベクタ ーは、これらの自然の、すなわち、外側の選択のないものよりも等しいまたはそ れ以上のレベルを達成することを指摘する。 したがって、本発明は、ヒト血清アルブミン；ヒトインターフェロン；ヒト抗 体；ヒトインシュリン；エリスロポイエチン(erythropoietin)、スチール因子お よび他の造血因子；血液凝固因子、特に第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子のよう な微量ヒト血液凝固因子；組織プラスミノーゲン活性化因子のような血栓(throm bolytics)因子；ヒト成長因子；脳ペプチド；インターロイキン；エンドルフィ ン；酵素；プロラクチン；ウイルス抗原；および植物性タンパク質のようなタン パク質を産生する方法を提供する。 これとは反対に、本発明のｐＨＲＥＲベクターは、絶えず高エピソーム発現を 与え、それらベクターがゲノム組込み独立性となる。さらに、エピソームｐＥＨ ＲＥベクターは、選択的圧力の不在下でさえも安定な核プラスミドとして保持さ れる。 さらに、そのような内部または自己選択（すなわち、例えば、薬物のような外 部の選択的圧力の付加に依存しない選択）の追加のレベルを用いたｐＥＨＲＥベ クターを使用しても差し支えない。例えば、発現に用いられた特異的生産者細胞 系統の検出を補足するｐＥＨＲＥベクターを用いても差し支えない。例としてで あって、限定するものではなく、そのようなｐＥＨＲＥ選択要素は、栄養要求性 突然変異誘発を補足できる、または細胞培地からの成長因子必要条件（例えば、 それぞれ、プロリンまたはインシュリン）を回避できる。好ましくは、マーカー の暗号配列は、組換え発現されるタンパク質の暗号配列とともに多シストロン性 伝令ＲＮＡの一部として転写される。例えば、そのような発現／選択カセットは 、５’から３’まで、転写調節配列、組換えタンパク質暗号配列、ＩＲＥＳ、選 択マーカー、ポリＡ部位を含んでも差し支えない。 ｐＥＨＲＥ−Ｈと称される、図１１に示されたベクターは、大規模製造に使用 できるｐＥＨＲＥベクターの一つの実施の形態を示している。この「マーカー」 要素は、上述したようにＩＲＥＳに作用的に結合した「自己選択」マーカーを示 している。図の「産生物」は、発現される組換えタンパク質の暗号配列を称する 。ベクターの要素の残りは、上述した図１０に示したベクターに関して記載され たようなものである。 本発明のエピソームｐＥＨＲＥベクターはさらに、例えば、大型核酸断片、例 えば、染色体断片の提供に用いることができる。そのような実施の形態の一つに おいて、ｐＥＨＲＥベクターを細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体 （ＹＡＣ）配列とともに用いて、大型ゲノム断片（例えば、長さでキロ塩基から メガ塩基までに亘る断片）を提供することができる。明確にするために、以下の 議論では、ＢＡＣ配列を用いたベクターについて記載するが、ここに記載した種 類のベクターがＹＡＣ配列を用いても差し支えないことが理解されよう。 ある実施の形態において、ｐＥＨＲＥベクターを存在するＢＡＣクローンと組 み合わせて、ｐＥＨＲＥベクター配列が挿入されるＢＡＣを含む、ｐＥＨＲＥ／ ＢＡＣハイブリッド構築物を産生することができる。そのようなｐＥＨＲＥ／Ｂ ＡＣハイブリッドは、ヒト細胞を含む様々な哺乳類中で複製できるＢＡＣを示す 。 一般的に、ＢＡＣに要素を与えるのに用いることのできるｐＥＨＲＥベクター は、ｐＥＨＲＥ複製カセット、ＭＯとＭＭＥ配列、および細菌選択可能マーカー を含み、それら全てがＢＡＣ組換え配列に隣接している。そのベクターの残りは さらに、複製の少なくとも１つの細菌起点および第二の細菌選択可能マーカーを 含んでも差し支えない。 ＢＡＣ組換え配列ｃａＮは、上述した必要なｐＥＨＲＥ配列を含むように開裂 し、ＢＡＣ要素との組換えに用いられるいかなるヌクレオチド配列をも含む。受 容体ＢＡＣ中において、適合する組換え部位の存在する、または存在するように 操作されるいかなる組換え部位を用いても差し支えない。例えば、そのようなＮ ＡＣ組換え要素は、限定するものではないが、セクション５．１．１において記 載した、ｌｏｘＰ、突然変異体ｌｏｘＰまたはｆｒｔ部位を含んでも差し支えな い。 あるいは、ヌクレオチド配列が当業者によく知られているＣｏｓＮ部位を用い ても差し支えない。組換え酵素よりもむしろ、そのようなＣｏｓＮ部位はラムダ ターミナーゼ酵素により開裂される。（ＣｏｓＮの教示を含む一般的にＢＡＣの 教示に関しては、例えば、Shizuay,H.等，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 9:8794-8797;およびKim,U.-J.等，1996，Genomics 34:213-218を参照のこと。そ れらの全てをここに引用する。） ｐＥＨＲＥおよびＢＡＣ配列を組み換えるために、ｐＥＨＲＥベクターおよび ＢＡＣ（選択されたｐＥＨＲＥベクターに適合する組換え部位を含む）を適切な リコンビナーゼまたはターミナーゼ酵素により互いに処理する。ＣｏｓＮ／ター ミナーゼ系を用いる場合には、続いてのライゲーション工程が含まれる。 この処理により、低レベルのコンカタマライゼーション(concatamerization) となる。所望のｐＥＨＲＥ／ＢＡＣハイブリッドを示すコンカタマー(concatame r)は、与えようとするｐＥＨＲＥ領域内のｐＥＨＲＥベクター選択可能マーカー およびＢＡＣ選択可能マーカー（通常クロラムフェニコール）の両方に対する抵 抗性に基づいて選択することができる。したがって、ＢＡＣおよびｐＥＨＲＥ選 択 可能マーカーが異なることが望ましい。好ましい実施の形態において、得られた 構築物をさらに、第二のｐＥＨＲＥ細菌選択可能マーカーをもはや存在しないこ とを確認するために試験する。所望のＢＡＣおよびｐＥＨＲＥ要素を組み換えた プラスミドは、大腸菌、並びにヒト細胞を含む幅広い範囲の哺乳類細胞内で複製 することができる。 ｐＢＰＶ−ＢａｃＤｏｎｏｒと称される図１２に示したベクターは、受容体こ ちそクローンに必須のｐＥＨＲＥ配列を与えるように設計されたｐＥＨＲＥベク ターの一つの実施の形態を示している。このベクターの組換え要素は、ｌｏｘＰ および／またはＣｏｓＮ部位を含有するものとして示されている。ｐＥＨＲＥ／ ＢＡＣハイブリッド中に組み込むべき細菌マーカーは、テトラサイクリンまたは カナマイシンとして示されている。最後に、そのベクターは、複製のｐＵＣ細菌 起点（Ｏｒｉ）、ｆｌ Ｏｒｉおよび第二の細菌選択可能マーカーであるアンピ シリンを含んでいる。 別の実施の形態において、ｐＥＨＲＥ／ＢＡＣクローニングベクターを産生し 、使用することができる。そのようなベクターは、ｐＥＨＲＥ複製カセット、上 述したＭＯとＭＭＥ配列、大腸菌中でのＢＡＣの維持に必要なヌクレオチド配列 （そのような配列は当業者に知られている。例えば、上述したShizuyaおよびKim を参照のこと）、およびポリリンカー部位を含んでいる。 ｐＢＰＶ−ＢｌｕｅＢＡＣと称する図１３に示したベクターは、そのようなｐ ＥＨＲＥ／ＢＡＣクローニングベクターの一つの実施の形態を示している。この ベクターにおいて、Ｅ１およびＥ２暗号配列は、ＢＰＶ配列であり、個々のＳＶ ４０プロモータと作用的に結合している。Ｅ１は、選択可能マーカーであるｈｙ ｇｒｏとともに多シストロン性伝令ＲＮＡの一部として転写されている。この実 施の形態において、複製カセットはさらに、ＩＲＥＳマーカーの下流にあるＳＶ ４０ｐＡ部位を含んでいる。さらに、ＭＯおよびＭＭＥ配列は、ＢＰＶ由来であ る（図において、これらの配列の両方が「ＢＰＶ起点」として示されている）。 そのクローニング部位は、ｌａｃＺのアルファ相補性断片内に埋め込まれたポリ リンカーを含み、この断片により、組換え体の青／白を選択することができる。 Ｔ７およびＳＰ６プロモータはｌａｃＺ配列に隣接し、そのベクターはさらに、 線状化のためにｃｏｓＮおよびｌｏｘＰ部位を含んでいる。図示した要素の残り は、大腸菌におけるＢＡＣ維持のために存在している。 ＩＶ．アンチセンス遺伝子抑制要素（ｇｓｅ）ベクター Ａ）アンチセンスｇｓｅレトロウイルスベクター 遺伝子抑制要素（ＧＳＥ）産生複製欠損レトロウイルスベクターがここに記載 されている。そのようなベクターは、哺乳類細胞中でアンチセンスＧＳＥ一本鎖 核酸配列の発現を促進させるように設計されており、例えば、本発明のアンチセ ンスベースの機能遺伝子不活化方法とともに使用することができる。このＧＳＥ 要素は、例えば、標的遺伝子の発現を阻害するように設計されている、リボザイ ム、例えば、ハンマーヘッドリボザイム等であって差し支えない。 本発明のＧＳＥ産生レトロウイルスベクターは、プロウイルス切除要素、プロ ウイルス回収要素および遺伝子抑制要素（ＧＳＥ）カセットを含む複製欠損レト ロウイルスゲノムを含んでいても差し支えない。 そのＧＳＥ産生レトロウイルスベクターはさらに、(a)５’ＬＴＲ；（ｂ）３ ’ＬＴＲ；(c)細菌Ｏｒｉ；(d)哺乳類選択可能マーカー；(e)細菌選択可能マー カー；および(f)パッケージング信号を含んでいても差し支えない。 プロウイルス回収要素、ＧＳＥカセット、細菌Ｏｒｉ、哺乳類選択可能マーカ ーおよび細菌選択可能マーカーは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に位置して いる。プロウイルス切除要素は、３’ＬＴＲ内に位置している。このプロウイル ス切除要素はまた、３’ＬＴＲ内に存在せずに、機能カセットに隣接していても 差し支えない。 ５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ、プロウイルス切除要素、細菌選択可能マーカー、哺 乳類選択可能マーカーおよびプロウイルス回収要素は、上述したようなものであ る。 以下に記載するＧＳＥカセットの実施の形態の各々はさらに、センスまたはア ンチセンスｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片またはポリリンカー内に作用的に結合し た全長配列を含んでいても差し支えない。さらに、このＧＳＥカセットを、その 転写を駆動するＬＴＲに関して同一または反対いずれかの方向で転写するように 配列されていても差し支えない。このＬＴＲはまた、無傷ＬＴＲ、または自己不 活化（ＳＩＮ）ＬＴＲであっても差し支えない。 ＧＳＥカセットは、例えば、５’から３’に、(a)転写調節配列；(b)ポリリン カー；および(c)ポリアデニル化信号を含んでも差し支えない。ある実施の形態 において、ＧＳＥカセットポリアデニル化信号は、３’レトロウイルス長末端反 復内に位置している。 あるいは、ＧＳＥカセットは、５’から３’に、(a)転写調節配列；(b)ポリリ ンカー；(c)シス作用性リボザイム配列；(d)内部リボソーム入口部位；(e)哺乳 類選択可能マーカー；および(f)ポリアデニル化信号を含んでいても差し支えな い。 さらなる実施の形態において、センスＧＳＥを構築しても差し支えなく、この 場合には、ＧＳＥカセットはさらに、センス配向断片の前にＫｏｚａｋコンセン サスメチオニンを含むポリリンカーを含んで、領域および断片の発現に関する「 領域ライブラリー」を形成しても差し支えない。 そのような実施の形態において、転写調節配列からの転写により、二機能性ト ランスクリプトが産生される。最初の半分（すなわち、リボザイム配列の上流部 分）は核を残しやすく、ＧＳＥを示す。リボザイム配列の下流部分（すなわち、 選択可能マーカーを含む部分）は、細胞質に移動され、翻訳される。したがって 、そのような二シストロン性形状は、その選択可能マーカーの選択をＧＳＥの発 現に直接的に結びつける。 別の実施の形態において、ＧＳＥカセットは、５’から３’に、(a)ＲＮＡポ リメラーゼＩＩＩ転写調節配列；(b)ポリリンカー；(c)転写終止配列を含むこと ができる。特別な実施の形態においては、この転写調節配列および転写終止配列 は、アデノウイルスＡｄ２ ＶＡ ＲＮＡＩ転写調節および終止配列である。 Ｂ）ｐＥＨＲＥアンチセンス遺伝子抑制要素ベクター 遺伝子抑制因子（ＧＳＥ）産生のｐＥＨＲＥベクターをここに記載する。その ようなベクターは、哺乳類細胞中でのアンチセンスＧＳＥ一本鎖核酸配列の発現 を促進させるように設計されており、例えば、本発明のアンチセンスベースの機 能遺伝子不活化方法とともに用いても差し支えない。 本発明のＧＳＥ産生ｐＥＨＲＥベクターは、複製カセット、遺伝子抑制要素（ ＧＳＥ）カセットおよび複製と安定なエピソーム維持に必要な最小シス作用性要 素を含むことができる。 そのＧＳＥ産生ｐＥＨＲＥベクターはさらに、複製の少なくとも一つの細菌起 点および少なくとも一つの細菌選択可能マーカーを含んでいても差し支えない。 複製カセット、最小シス作用性要素、複製の細菌起点および細菌選択可能マー カーは、上述したセクション５．１．１に記載されたようなものである。 以下に記載するＧＳＥカセットの実施の形態の各々はさらに、センスまたはア ンチセンスｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片またはポリリンカー内に作用的に結合し た全長配列を含んでいても差し支えない。 ＧＳＥカセットは、例えば、５’から３’に、(a)転写調節配列；(b)ポリリン カー；(c)ポリアデニル化信号を含んでいても差し支えない。このＧＳＥ転写調 節配列は、構成性または誘導性のものであっても差し支えなく、例えば、レトロ ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｖａ−１ ＲＮＡまたはＵ６ｓｎＲＮＡプロモータ配列を示していても差し支えなく、それ らの全てが当業者によく知られている。 図１４に示したベクターは、そのようなｐＥＨＲＥ ＧＳＥベクターの例を示 すものである。このベクターにおいて、Ｅ１およびＥ２暗号配列は、ＢＰＶ配列 であり、個々のＳＶ４０プロモータと操作的結合している。Ｅ１は、選択可能マ ーカーであるｈｙｇｒｏとともに多シストロン性伝性ＲＮＡの一部として転写さ れている。この実施の形態において、複製カセットはさらに、ＩＲＥＳマーカー の下流のＳＶ４０ ｐＡ部位を含んでいても差し支えない。さらに、ＭＯおよび ＭＭＥ配列は、ＢＰＶ由来である（図においては、これらの配列の両方が「ＢＰ Ｖ起点」として示されている）。このベクターのＧＳＥカセットは、ＧＳＥとし て発現すべき配列に作用的に結合したＣＭＶプロモータを含み、これは、ｂｇＨ ポリＡ部位に作用的に結合している。最後に、そのベクターは、複製のｐＵＣ細 菌起点（Ｏｒｉ）、ｆｌ Ｏｒｉおよびアンピシリン細菌選択可能マーカーを含 んでいる。 あるいは、ＧＳＥカセットは、５’から３’に、(a)転写調節配列；(b)ポリリ ンカー；(c)シス作用性リボザイム配列；(d)内部リボソーム入口部位；(e)哺乳 類選択可能マーカー；および(f)ポリアデニル化信号を含むことができる。 別の実施の形態において、センスＧＳＥを構築しても差し支えなく、この場合 、そのＧＳＥカセットはさらに、センス指向断片の前にＫｏｚａｋコンセンサス メチオニンを含むポリリンカーを含んで、領域および断片の発現のための「領域 ライブラリー」を形成することができる。 そのような実施の形態において、転写調節配列からの転写により、二機能性ト ランスクリプトが産生される。最初の半分（すなわち、リボザイムの上流部分） は核を残しやすく、ＧＳＥを示す。リボザイム配列の下流部分（すなわち、選択 可能マーカーを含む部分）は、細胞質に移動され、翻訳される。したがって、そ のような二機能性形状は、選択可能マーカーの選択をＧＳＥの発現に直接的に結 びつける。 別の実施の形態において、ＧＳＥカセットは、５’から３’に、(a)ＲＮＡポ リメラーゼＩＩＩ転写調節配列；(b)ポリリンカー；(c)転写終止配列を含むこと ができる。 図１５および１６に示したベクターは、この種のｐＥＨＲＥ ＧＳＥベクター の例を示している。図１５に示したベクターのＧＳＥカセットは、ＧＳＥとして 発現すべき配列に作用的に結合したＶａ−１プロモータを含み、これは、Ｖａ− １終止配列に作用的に結合している。図１６に示したベクターのＧＳＥカセット は、ＧＳＥとして発現すべき配列に作用的に結合したＵ６プロモータを含み、こ れは、Ｕ６終止配列に作用的に結合している。図１５および１６のベクターに示 した要素の残りは、図１４に示したベクターに関して記載したようなものである 。 特別な実施の形態において、転写調節配列および転写終止配列は、アデノウイ ルスＡｄ２ ＶＡ ＲＮＡ転写調節および終止配列である。 Ｃ）アンチセンス開発のために結合マーカー アンチセンスライブラリーの重要な用途の一つが、遺伝子の発現、または構造 ＲＮＡ要素の機能を効果的に阻害するのに用いられるアンチセンスの洗練／最適 化である。効果的なアンチセンス配列を検出するハイスルー(high throμgh)ス クリーニング技術を提供するために、本発明はまた、標的遺伝子の発現レベルに いて都合のよい読出しを提供する結合マーカー構築物を提供する。特に、結合マ ーカーは、アンチセンス構築物が求められる暗号または非暗号配列を含む融合遺 伝子である。例えば、そのマーカーは、標的タンパク質の暗号配列を含んでいて も差し支えない。この融合遺伝子はまた、マーカータンパク質の暗号配列を含み 、例えば、そのタンパク質の発現は、検出し、好ましくは定量することができる 。様々なマーカー遺伝子が選択に関して上述されているが、それらの多くを、主 題の結合マーカーを産生するのに使用することができる。例えば、そのマーカー は、細胞表現マーカー、検出可能酵素、宿主細胞の状態を細くする遺伝子産生物 、転写因子等であって差し支えない。好ましい実施の形態において、標的配列お よび結合マーカーは、マーカータンパク質を含む融合タンパク質をコード化する 。標的タンパク質の発現を阻害するのに効果的なアンチセンスがない場合には、 結合マーカーが発現され、検出される。しかしながら、例えば、融合遺伝子また はそのトランスクリプトにハイブリダイゼーションすることにより、標的タンパ ク質の発現を阻害できるアンチセンスが、検出可能マーカーのレベルを減少させ る。標的遺伝子の発現を阻害できるリボザイムを同定するために、この方法を用 いて、リボザイム、例えば、ハンマーヘッドリボザイムのライブラリーをスクリ ーニングすることができる。 本発明のある態様によれば、転写の際に、遺伝子、例えば、哺乳類遺伝子の潜 在的なアンチセンストランスクリプトの個体群を提供する転写性遺伝子配列の様 々な個体群を含む本発明のベクターのライブラリが提供される。 主題の方法で同定した後に、同定された一つ以上のアンチセンス配列を、アン チセンス治療に適した製剤試料に提供することができる。ここで用いたように、 「アンチセンス」治療は、細胞条件下で細胞ｍＲＮＡおよび／または標的タンパ ク質をコード化するゲノムＤＮＡにより特異的にハイブリダイズ（例えば、結合 ）するオリゴヌクレオチドプローブまたはそれらの誘導体の投与またはその場で の産生を称する。ハイブリダイゼーションは、例えば、転写および／または翻訳 を阻害することにより、そのタンパク質の発現を阻害すべきである。結合は、従 来の塩基対相補性により、または、例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合する場合には、 二重鎖螺旋の主な溝における特定の相互作用によるものであってもよい。一般的 に、「アンチセンス」治療は、一般的にこの業界で用いられる技術の範囲を称し 、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依存するいかなる治療をも含む。 本発明の方法により同定されるアンチセンス構築物は、生体内供給に関して、 例えば、細胞中で転写される場合には、標的細胞ｍＲＮＡの少なくとも毒結うな 部分に相補的なＲＮＡを産生する発現プラスミドとして調製しても差し支えない 。あるいは、アンチセンス構築物は、半ビボで産生され、細胞中に導入されると きに、ｍＲＮＡおよび／または標的遺伝子のゲノム配列によるハイブリダイゼー ションにより発現を阻害するオリゴヌクレオチドプローブである。そのようなオ リゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキ ソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに対して耐性であり、したが って、生体内で安定な修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌク レオチドとして使用する典型的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホアミデート、ホス ホチオエートおよびメチルホスホネート類似物である（米国特許第5,176,996号 、同第5,264,564号、および同第5,256,775号も参照のこと）。さらに、アンチセ ンス治療に有用なオリゴマーを構築する一般的な手法が、例えば、Van der Krol 等（1988）Biotechniques 6:958-976;およびStein等（1988）Cancer Res 48:265 9-2668に検討されている。 Ｖ．任意ペプチド配列を示すベクター ここには、拘束(constrained)および非拘束任意ペプチド配列を示すのに有用 なベクターが記載されている。そのようなベクターは、関心のあるタンパク質に 結合する任意ペプチド配列の選択および同定を促進させるように設計されている 。 本発明の組込みおよびエピソームベクターは、任意ペプチド配列を示すように 操作することができる。本発明のそのようなベクターは、説明するために、(a) スプライス供与体部位またはＬｏｘＰ部位（例えば、ＬｏｘＰ５１１部位）；(b )細菌プロモータ（例えば、ｐＴａｃ）およびシャイン−ダルガーノ配列；(c)ｐ ｅｌ Ｂまたは融合ペプチドを周縁質に標的付ける他の分泌信号配列；(d)スプ ライス−受容体部位または別のＬｏｘＰ５１１部位（ＬｏｘＰ５１１部位は、互 いに組み換えられるが、３’ＬＴＲ内のＬｏｘＰ部位とは組換えられない）；(e )ペプチド表示カセットまたはビヒクル；(f)アンバー停止コドン；(g)Ｍ１３バ クテリオファージ遺伝子１１１タンパク質Ｃ末端（アミノ酸198-406）を含んで いても差し 支えなく；必要に応じて、そのベクターは、柔軟性ポリグリシンリンカーを含ん でいてもよい。 ペプチド表示カセットまたはビヒクルは、ポリリンカーが、自然または合成タ ンパク質の一つの柔軟ループに挿入された、自然または合成いずれかのベクター タンパク質からなる。任意ペプチドをコード化する任意オリゴヌクレオチドのラ イブラリーは、ペプチドが細胞表面上で発現されるように、ポリリンカー中に挿 入されていてもよい。 そのベクターの表示ビヒクルは、限定するものではないが、哺乳類細胞中の細 胞内ペプチド表示のためのチオレドキシン(thioredoxin)であってもよく（Colas 等，1996，Nature 380:548-550）、または哺乳類細胞表面のペプチド表示のため の微小体(minibody)であってもよい（Tramonteno，1994，J．Mol．Recognit．7: 9-24）。これらの各々は、上述の特定の位置で任意ペプチドをコード化する任意 オリゴヌクレオチドのライブラリーを挿入するためのポリリンカーを含んでいる であろう。別の実施の形態において、表示ビヒクルは、細胞外であってもよく、 この場合には、微小体は、分泌信号で始まり、ＤＡＦ−１の最後の37のアミノ酸 によりコード化されたもののような膜アンカーが続く（Rice等，1992，Proc．Na tl．Acad．Sci．89:5467-5471）。これは、リコンビナーゼ部位（例えば、ＦＲ Ｔ部位）と隣接し、宿主を発現するリコンビナーゼによるライブラリーの継代後 に分泌タンパク質を産生することができる。 本発明のある実施の形態において、これらのカセットは、通常は、上述したセ ンス発現ベクター中のｃＤＮＡにより占められている位置にある。細菌のアンバ ー抑制株内において、かつヘルパーファージの存在下において、これらのベクタ ーは、従来のファージ表示ベクターに関して以前に記載したように正確に用いる ことのできる比較的慣習的なファージ表示ライブラリーを産生する。選択された 標的に関する親和性を表示する回収されたファージを用いて、適切な遺伝子型（ すなわち、特定の用途に関しては除去しなければならないカセットに依存して所 望のリコンビナーゼを発現する）の細菌宿主を感染させる。例えば、細胞内ペプ チド表示に関しては、どのような細菌宿主も適切である（スプライス部位を用い て哺乳類宿主内のｐｅｌＢを除去する場合）。分泌表示に関しては、微小体ベク ターが、ＤＡＦアンカー配列の除去に触媒作用を及ぼす細菌細胞を通過させられ る。これらの細菌宿主から調製したプラスミドを用いて、哺乳類細胞中の特定の 表現型のアッセイ用のウイルスを産生する。 ある場合には、標的が知られていなければ、ファージ表示段階を飛び越して、 細胞内または細胞外の任意ペプチド表示について、直接的にベクターを用いても 差し支えない。これらのベクターの従来の手法より優れた利点は、それらの柔軟 性である。追加のクローニングまたは塩基配列決定の段階を必要とせずに哺乳類 細胞中のペプチド配列を機能的に試験する能力により、ファージ表示に関して、 より雑な結合標的（例えば、全固定細胞）を使用することができる。これは、哺 乳類細胞を感染させられるレトロウイルスへの転化により、結合したファージの 豊富なプールで迅速な機能選択を行う能力により可能となる。 ＶＩ．遺伝子捕捉ベクター ここには、遺伝子捕捉ベクターとして操作することのできる、複製欠損レトロ ウイルス遺伝子のような組込みウイルスベクターの形態が記載されている。その ような遺伝子捕捉ベクターは、発現遺伝子中に組み込まれたときに、発現された 遺伝子を「タグを付け」、例えば、関心のある刺激に応答して、遺伝子の発現を モニタすることのできるレポーター配列を含んでいる。本発明の遺伝子捕捉ベク ターは、例えば、特定の刺激に応答して変調された哺乳類遺伝子を同定する本発 明の遺伝子捕捉に基づく方法とともに、使用することができる。 本発明の複製欠損レトロウイルス遺伝子捕捉ベクターは：(a)５’ＬＴＲ；(b) プロモータを含まない３’ＬＴＲ（ＳＩＮ ＬＴＲ）；(c)細菌Ｏｒｉ；(d)細菌 選択可能マーカー；(e)核酸の複合混合物から核酸配列を含む核酸を回収する選 択可能核酸回収要素；(f)ポリリンカー；(g)哺乳類選択可能マーカー；および(h )遺伝子捕捉カセットを含むことができる。さらに、高力価のウイルスを産生す るのに必要な要素が必要とされる。そのような要素は、当業者によく知られてお り、例えば、パッケージング信号を含む。 細菌Ｏｒｉ、細菌選択可能マーカー、選択可能核酸回収要素、ポリリンカー、 および哺乳類選択可能マーカーは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に位置して いる。細菌選択可能マーカーおよび細菌Ｏｒｉは、以下に記載するように、核酸 回収を促進させるために、密接に作用的に結合して位置している。この遺伝子捕 捉カセット要素は、３’ＬＴＲ内に位置している。 ５’ＬＴＲ、細菌選択可能マーカーおよび哺乳類選択可能マーカーは、上述し たセクション５．１に記載したようなものである。選択可能核酸回収要素は、上 述したセクション５．１に記載されたプロウイルス回収要素のようなものである 。 ３’ＬＴＲは、遺伝子捕捉カセットを含み、機能ＬＴＲ転写プロモータを含ん でいない。 遺伝子捕捉カセットは、５’から３’に、(a)各々の読み取り枠中で少なくと も一つの終止コドンをコード化する核酸配列；(b)内部リボソーム入口部位；お よび(c)レポーター配列を含むことができる。遺伝子捕捉カセットはさらに、こ の終止コドン配列の上流に、転写スプライス受容体核酸配列を含むことができる 。 本発明の遺伝子捕捉ベクター中にＩＲＥＳ配列を含むことにより、従来の遺伝 子捕捉ベクターより優れた鍵となる改良が提供される。このＩＲＥＳ配列により 、そのベクターは、成熟伝令ＲＮＡ中のどこにでも着地して、二シストロン性ト ランスクリプトを形成することができ、このことによっと、少なくとも10倍プロ モータを報告する組込み部位の数が効果的に増大する。 ＶＩＩ．レトロウイルスおよびｐＥＨＲＥベクター誘導体 ここには、ライブラリー、レトロウイルス粒子、組込みプロウイルスおよび切 徐されたプロウイルスを含む、本発明のレトロウイルスベクターの誘導体が記載 されている。またここには、ライブラリー、細胞およびそのようなエピソームベ クターを含有する動物を含む、本発明のｐＥＨＲＥベクターの誘導体も記載され ている。 本発明の組成物はさらに、本発明の多数のレトロウイルスおよび／またはｐＥ ＨＲＥベクターを含むライブラリーを含み、該ベクターはさらにｃＤＮＡまたは ｇＤＮＡ配列を含んでいる。限定するものではないが、センスおよびアンチセン ス発現に関する標準化および非標準化ライブラリー；ｆ１領域を含めることによ り可能となるであろう、特異的染色体または染色体の領域（例えば、ＹＡＣまた はＢＡＣ中に含まれるような）に対して選択されたライブラリー；いかなる組織 源由来のライブラリー；および本発明のＢＡＣ／ｐＥＨＲＥベクターを用いて構 築されたゲノムライブラリーを含む多数のライブラリーを本発明にしたがって使 用してもよい。 本発明の組成物はさらに、本発明のレトロウイルスベクター由来のレトロウイ ルス粒子を含んでいる。そのようなレトロウイルス粒子は、限定するものではな いが、本発明の新たなレトロウイルスパッケージング細胞系統を含むレトロウイ ルスパッケージング細胞系統中への本発明のレトロウイルスベクターの形質移入 により産生される。 本発明の組成物はさらに、本発明のレトロウイルス粒子由来のプロウイルス配 列を含む。本発明のプロウイルス配列は、受容体哺乳類細胞のゲノム内に結合形 態で存在していても差し支えなく、または遊離した環状化形態で存在していても よい。 結合プロウイルスは、本発明のレトロウイルス粒子による哺乳類受容体細胞の 感染の際に産生され、ここで、この感染により、プロウイルス核酸配列が産生さ れ、哺乳類細胞ゲノム中に組み込まれる。 本発明の環状化プロウイルス配列は、一般的に、受容体細胞ゲノムからの結合 プロウイルスの切除の際に産生される。 本発明の組成物はさらに、本発明のレトロウイルスまたはｐＥＨＲＥベクター を含有する細胞を含む。そのような細胞としては、限定するものではないが、以 下に記載するパッケージング細胞系統が挙げられる。さらに、本発明の組成物は 、好ましくは、配列（センスまたはアンチセンスいずれかの）が動物の一つ以上 の細胞中で発現されるベクターを含有する動物を含む、本発明のレトロウイルス またはｐＥＨＲＥベクターを含有する遺伝子導入動物を含む。 ＶＩＩＩ．パッケージング細胞系統 レトロウイルスを使用するための主な前提条件は、特に細胞個体群中の野生型 ウイルスの拡散する可能性に関して、それらの使用の安全性を確認することであ る。 レトロウイルスパッケージング機能は、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖパッケー ジング機能を含む。ｇａｇおよびｐｏｌはウイルス構造成分を提供し、ｅｎｖは ウイルスをその受容体に標的付けるように機能する。Ｅｎｖ機能は、限定するも のではないが、ＭμｌＶ（例えば、ＭμｌＶ ４０７０Ａのような）またはＭｏ ＭμｌＶを含む、両栄養性、環境栄養性または異種栄養性ウイルスからのエンベ ロープタンパク質を含んでも差し支えない。Ｅｎｖはさらに、別のウイルスから の外皮タンパク質を含んでいても差し支えなく（例えば、ｅｎｖはＶＳＶ Ｇタ ンパク質を含んでいても差し支えない）、またはｅｎｖは特定の細胞表面受容体 を標的付けるいかなる分子を含んでいても差し支えない。 複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊細胞系統（「パッケージング細胞 」と称される）の開発により、遺伝子治療にとってのレトロウイルスの有用性が 増大し、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療を目的とした遺伝子移植への用途に 関して良好に特徴付けられている（再検討のために、Miller,A.D.（1990）Blood 76:271を参照のこと）。このように、レトロウイルス暗号配列（ｇａｇ、ｐｏ ｌ、ｅｎｖ）が主題のＣＣＲ−タンパク質の一つをコード化する核酸により置き 換えられ、そのプロウイルスを複製欠損にしている組換えレトロウイルスを構築 することができる。次いで、複製欠損レトロウイルスを、標準的な技術によりヘ ルパーウイルスを使用することによって、標的細胞を感染させるのに使用するこ とができるウイルス粒子中にパッケージングする。 組換えレトロウイルスを酸性紙、そのようなウイルスにより生体外または生体 内で細胞を感染させるプロトコルは、Current Protocols in Molecμlar Biolog y，Ausubel,F.M.等（eds.）Geene Publlshing Associates，(1989)，Sections 9 .10-9.14および他の標準的な研究所のマニュアルで見つけることができる。適切 なレトロウイルスの例としては、当業者によく知られている、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ 、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。環境栄養性および両栄養性両方のレトロウ イルス系を調製する適切なパッケージングウイルス系統の例としては、ΨＣｒｉ ｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。例えば、Eglitis等（1985）Sci ence 230:1395-1398;DanosおよびMμlligan（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．US A 85:6460-6464;Wilson等（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:3014-3018;A rmentano等（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6141-6145;Huber等（1991 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8039-8043;Ferry等（1991）Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 88:8377-8381;Chowdhury等（1991）Science 254:1802-1805;v an Beusecem等（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7640-7644;Kay等（1992 ）Human Gene Therapy 3:641-647;Dai等（1992）Proc．Natμl．Acad．Sci．USA 89:10892-10895;Hwu等（1993）J．Immunol．150:4104-4115;米国特許第4,868,1 16号;米国特許第4,980,286号;ＰＣＴ出願公開第WO89/07136号;ＰＣＴ出願公開第 WO/89/02468号;ＰＣＴ出願公開第WO89/05345号;およびＰＣＴ出願公開第WO92/07 573号を参照のこと。そのような従来技術の系を用いて、上述したレトロウイル スベースのベクターをパッケージングしても差し支えない。 しかしながら、ヘルパーを含まない環境栄養性および両栄養性レトロウイルス を産生するために、第二世代のレトロウイルス産生体系統を産生した。この系統 は、複製欠損レトロウイルスベクターをパッケージングするのに必要とされる様 々なパッケージング機能を提供する安定なエピソーム発現系を産生するのに上述 したエピソームベクターを使用することに基づくものである。形成されたパッケ ージング細胞系統の重要な特性が、以下詳細に記載され、その系統の長期安定性 、その細胞系統の高力価産生、およびリン酸カルシウム媒介形質移入または脂質 ベースの形質移入プロトコルのような標準的な技術により非常に形質移入可能な 細胞系統を使用する可能性が挙げられ、例えば、その細胞は、プロウイルスベク ターにより非常に形質移入しやすい。 以前、第一世代の生産体系が、ヘルパーを含まないレトロウイルス産生のため のパッケージング系として２９３Ｔ細胞を用いて構成された。２９３Ｔ細胞中に は、ｇａｇ−ｐｏｌ、および環境栄養性および両栄養性ウイルスに関するエンベ ロープタンパク質を三省できる欠損構築物を配置した。これらの系統は、それぞ れ、ＢＯＳＣ２３およびＢｉｎｇと呼ばれた。例えば、Pear等（1993）PNAS 90: 8392を参照のこと。これらの系統の有用性は、小規模の実験に一時的に使用する ために少量の組換えウイルスを産生できることにあった。この系統により、ウイ ルスが数ヶ月ではなくむしろ数日で産生できるという点で、以前に安定であった 系よりも優れた利点が得られる。しかしながら、使用されているこれらと他のパ ッケージング細胞系統に関して、二つの問題点が現れた。 第一に、これらの細胞はしばしば、不安定であり、レトロウイルス産生容量に 関して絶えず注意して検査する必要がある。第二に、タンパク質の産生に使用す るベクターの構造は、ヘルパーウイルスの産生にとって完全には安全であると考 えられておらず、パッケージング細胞系統の発現ベクターとレトロウイルスベク ターとの間の同種組換えを可能にしていない。 これらの障害を克服するために、いつくかの改良を行った。第一に、ｇａｇ− ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ暗号配列を有する多シストロン性構築物の一部とし てＩＲＥＳマーカー遺伝子を導入することにより、細胞ごとをベースとしてｇａ ｇ−ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ産生をモニタする設備を加えた。したがって、 マーカー遺伝子発現は、多シストロン、したがって、ｇａｇ−ｐｏｌおよび／ま たはｅｎｖ遺伝子の発現を直接反映している。パッケージング細胞の早期の継代 にとって価値のある選択ツールであることに加えて、このマーカー系はまた、特 にそのウイルス粒子タンパク質を産生する能力に関して、長時間に亘り産生体細 胞個体群の安定性をモニタするのに使用することもできる。以下に記載するよう に、マーカー遺伝子を適切に選択することにより、細胞内のその発現は、容易に モニタでき、フロー・サイトメトリーにより、細胞を選択するのに用いることが できる。 第二に、ウイルス粒子タンパク質暗号配列、例えば、ｇａｇ−ｐｏｌおよびエ ンベロープ構築物の両方に関して、非レトロウイルスプロモータを用いて、組換 え電位を最小にした。好ましい実施の形態において、それらの相互組換え電位を さらに最小にするために、ｇａｇ−ｐｏｌおよびエンベロープに関して異なるプ ロモータを使用しても差し支えない。 この技術によって、いくつかのパッケージング細胞系統を産生した。実施例に 記載したように、Ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖの各々を、薬物選択マーカー（ヒ グロマイシンのような）および共選択可能マーカーとしてのＦＡＣＳタグを有す る三シストロン性伝令ＲＮＡの一部として個々に導入した。説明のための系統Ｌ ｉｎＸは、レトロウイルスの長期安定性産生のためにそのようなエピソームを担 持することができる。これらの系統は、ＦＡＣＳタグにより、エンベロープ発現 の安定性に関して、フロー・サイトメトリーにより容易に試験することができる 。実際に、60週間後でも、ｌｉｎＸ系統は、第一世代の系統ＢＯＳＣよりも安定 であるように思われる。さらに、主題のパッケージング系統を、数日間ウイルス を一時的に産生するのに用いても差し支えない。したがって、これらの新しい系 統は、レトロウイルス遺伝子移植実験のための一時的で、エピソーム安定性であ るライブラリーの産生と完全に適合している。それゆえ、レトロウイルスの大き なライブラリーをほとんどの種類の哺乳類細胞、例えば、マウスまたはヒト中に 提供する手段を提供する。ウイルスの力価は、標準まで、例えば、10５-10７／ ｍｌ以上の範囲の感染力価であって差し支えなく、これによって、ライブラリー において比較的微量の種でさえも、感染細胞において発現される適当な機会を有 するほど十分な活動範囲を有する複合核酸ライブラリーをサンプリングすること ができる。 このように、精製ウイルス、調整培地、および／または感染ウイルスを産生す るパッケージング細胞系統としてそのようなウイルス試料を提供する。非粘着細 胞について研究する場合には、その細胞に直接的にレトロウイルス上澄みを加え ることによる、または非粘着細胞をレトロウイルス産生体細胞とともに共培養す ることによる感染の選択がある。後者の利点は、継続するレトロウイルス産生で あるが、これについては、産生体細胞を標的細胞とともに収穫するという欠点と 比較検討しなければならない。 したがって、好ましい実施の形態においては、三シストロン性発現カセットを 含むレトロウイルスパッケージング細胞系統を、新たな効率的で安定なレトロウ イルスパッケージング細胞系統の選択に関する創立系統として使用する。この三 シストロン性伝令ＲＮＡカセットは、レトロウイルス由来核酸を、選択可能マー カーおよび定量可能マーカーと作用的に結合した機能レトロウイルス粒子中に効 率的パッケージングするのに重要な遺伝子配列を含んでいる。この遺伝子配列、 選択可能マーカーおよび定量可能マーカーは、その発現が一組の調節配列により 制御される一つの伝令ＲＮＡ上に転写される。そのような実施の形態において、 パッケージにとって重要な遺伝子配列は、例えば、ｇａｌ／ｐｏｌまたはｅｎｖ 遺伝子配列を示すことができる。 別の実施の形態において、レトロウイルスパッケージング細胞系統は、レトロ ウイルス由来核酸を、選択可能マーカーおよび定量可能マーカーと作用的に結合 した機能レトロウイルス粒子中に効率的にパッケージングするのに重要な少なく とも二つの遺伝子配列を含む多シストロン性発現カセットを含んでいる。この遺 伝子配列、選択可能マーカーおよび定量可能マーカーは、その発現が一組の調節 遺伝子により制御されている一つの伝令ＲＮＡ上に転写される。例えば、そのよ うな実施の形態において、パッケージングに重要な遺伝子配列は、ｇａｇ／ｐｏ ｌおよびｅｎｖ遺伝子配列を示すことができる。 例えば、三シストロン性のような多シストロン性伝令ＲＮＡ手法により、所望 のパッケージング細胞系統を二重選択することができる。第一に、選択可能マー カーの選択により、パッケージングにとって重要な遺伝子配列を発現する細胞の みが選択されることを確実にする。第二に、最高レベルの定量可能マーカーを示 す（したがって、パッケージングにとって重要な遺伝子配列の最高レベルの発現 を示す）細胞を選択することができる。 上述した実施の形態の変更例において、複数の多シストロン性、例えば、三シ ストロン性の伝令ＲＮＡカセットを含む細胞系統を使用することができる。例え ば、レトロウイルスパッケージングにとって重要な第一の遺伝子配列、第一の選 択可能マーカーおよび第一の定量可能マーカーを含む一つの伝令ＲＮＡカセット を用いて、その第一の遺伝子配列の最高の発現を選択することができる一方で、 効率的なレトロウイルスパッケージングにとって重要な第二の遺伝子、第二の選 択可能マーカーおよび第二の定量可能マーカーを含む第二の伝令ＲＮＡカセット を用いて、第二の遺伝子配列の最高の発現を選択することができ、それによって 、パッケージングにとって重要な第一と第二の遺伝子配列の両方に関して最適化 されたパッケージング細胞系統が産生される。 定量可能マーカーは、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法、例えば、 ＦＡＣＳタグにより定量できる上述したマーカー遺伝子である。そのような定量 可能マーカーの例としては、限定するものではないが、合成または異種細胞表面 マーカーに加えて、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２０のような細胞表面マ ーカーが挙げられる。さらに、そのような定量可能マーカーとしては、例えば、 緑蛍光タンパク質のような細胞内蛍光マーカーが挙げられる。さらに、定量可能 マーカーとしては、例えば、ベータガラクトシダーゼマーカーのような、その発 現が測定できる他のマーカーが挙げられる。 選択された選択可能マーカーとしては、例えば、限定するものではないが、ヒ グロマイシン、ブラスチシジン(blasticidin)、ネオマイシン、ピューロマイシ ン、ヒスチジノール、ゼオシン(zeocin)等を含む上述したような選択可能薬物マ ーカーが挙げられる。 当業者によく知られている様々な手段により高レベルの発現を行うことができ る。例えば、ウイルス機能をコード化する配列の発現は、限定するものではない が、ＣＭＶプロモータを含む誘導性で強力なプロモータを含む調節配列により調 節し、駆動することができる。 あるいは、高コピー数の多シストロン性カセットを様々な方法により実施する ことができる。例えば、高コピー数の多シストロン性カセットの安定なゲノム挿 入を行うことができる。ある方法において、染色体外カセットコピー数を最初に 達成し、続いて、安定な高コピー数の挿入を選択することができる。例えば、当 業者によく知られている標準的な技術とともに複製のＳＶ４０起点およびＳＶ４ Ｏ Ｔ光源を使用することにより、染色体外コピー数を増大させることができる 。 高安定性染色体外カセットコピー数を達成することもできる。例えば、多シス トロン性カセットを、例えば、従来の形質移入により達成される細胞当たり5-10 のコピー数に対して高コピー数（例えば、ＢＰＶに関しては、細胞当たり1000ま で）で安定なエピソームプラスミドを維持する、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ） 、ヒトパポバウイルス（ＢＫ）またはエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）よ り由来の染色体外レプリコンにすることにより、安定な染色体外コピー数を増大 させることができる。この方法において、このカセットはエピソームを維持して いる、すなわち、組込みの選択は行われていない。 そのような高レベルで安定の染色体外コピー数を達成し、それを用いる好まし い実施の形態では、本発明のｐＥＨＲＥベクターを使用する。図１７−２２は、 そのようなパッケージング細胞系統に使用するように設計されたｐＥＨＲＥベク ターを示している。これらのベクターの各々において、Ｅ１およびＥ２暗号配列 は、ＢＰＶ配列であり、個々のＳＶ４０プロモータと作用的に結合している。Ｅ １は、選択可能マーカーであるｈｙｇｒｏとともに多シストロン性伝令ＲＮＡの 一部とて転写されている。この実施の形態において、複製カセットはさらに、Ｉ ＲＥＳマーカーの下流にＳＶ４０ｐＡ部位を含んでいる。さらに、ＭＯおよびＭ ＭＥ配列はＢＰＶ由来である（図においては、これらの配列の両方が「ＢＰＶ起 点」として示されている）。 それぞれ、Ψ_cＩＨおよびｐＥＨＲＥ−Ψ_cＩＨと称される、図１７および１８ に示されたｐＥＨＲＥベクターは、その発現カセットが多シストロン性ｇａｇ／ ｐｏｌ ｅｎｖ伝令ＲＮＡを発現するｐＥＨＲＥベクターの二つの異なる実施の 形態を示している。図１７の発現カセットは、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｅｎｖ暗号配列 に作用的に結合したＣＭＶプロモータを含み、これらの配列は、ＩＲＥＳ−ｈｙ ｇｒｏ構築物に作用的に結合し、これは、ｂＧＨポリＡ部位に作用的に結合して いる。図１８の発現カセットは、使用したプロモータがＬＴＲプロモータである ことを除いて、図１７のものと同一である。 それぞれ、Ψ_envＩＨおよびｐＥＨＲＥΨ_envＩＨと称される、図１９および２ ０に示されたｐＥＨＲＥベクターは、その発現カセットがｅｎｖ伝令ＲＮＡを発 現するｐＥＨＲＥベクターの二つの異なる実施の形態を示している。図１９の発 現カセットは、ｅｎｖ暗号配列に作用的に結合したＣＭＶプロモータを含み、ｅ ｎｖ暗号配列はＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏ構築物と作用的に結合し、この構築物はｂ ＧＨポリＡ部位に作用的に結合している。図２０の発現カセットは、使用された プロモータがＬＴＲプロモータであることを除いて、図１９のものと同一である 。 それぞれ、Ψ_g/pＩＨおよびｐＥＨＲＥΨ_g/pＩＨと称される、図２１および２ ２に示されたｐＥＨＲＥベクターは、その発現カセットが多シストロン性ｇａｇ ／ｐｏｌ伝令ＲＮＡを発現するｐＥＨＲＥベクターの二つの異なる実施の形態を 示している。図２１の発現カセットは、ｇａｇ／ｐｏｌ暗号配列に作用的に結合 したＣＭＶプロモータを含み、ｇａｇ／ｐｏｌ暗号配列はＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏ 構築物と作用的に結合し、この構築物はｂＧＨポリＡ部位に作用的に結合してい る。図２２の発現カセットは、使用されたプロモータがＬＴＲプロモータである ことを除いて、図２１のものと同一である。 ｐＥＨＲＥベクターとともに用いて、パッケージング細胞系統を三省できる細 胞系統の中には、例えば、ＣＯＳ細胞のような、複製コンピテントＴ抗原を発現 する細胞がある。ＣＯＳ細胞は、ＳＶ４０起点からの複製を促進させることので きるＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する。パッケージ細胞系統に関して、このことを利 用して、最初に、複製欠損レトロウイルスベクターを増幅することができる。こ のようにして、レトロウイルスＲＮＡの発現が増大し、より高い力価により、レ トロウイルスＲＮＡの過多がほとんどのパッケージング細胞系統における力価に 関する制限要因であるように思われることとなる。レベルを増大させる別の機構 により、本発明のｐＥＨＲＥベクターに関して記載したように、ＰＶ、好ましく は、ＢＰＶ Ｏｒｉを、ここに記載したレトロウイルスベクター中に導入する。 Ｔ抗原の存在を用いて、ヘルパー機能を増幅することもできる。このことは、 複製のＳＶ４０起点をｐＥＨＲＥベクター内に含めて、細胞を発現する複製コン ピテントＴ抗原内でヘルパー機能のより高いレベルの発現を達成することにより 行うことができる。 したがって、ＣＯＳ細胞中にＴ抗原が存在することを利用して、ウイルスゲノ ムＤＮＡのレベルを増大させ、ヘルパー機能のレベルも増大させることができる 。ウイルスゲノムＲＮＡの制御できない複製が毒性である、またはパッケージン グ系を飽和させる場合には、レトロウイルスベクターのコピー数は、ヘルパー機 能を担持するベクターのコピー数のように、ＢＰＶ配列を含めることにより抑制 することができる。 高カセットコピー数は、遺伝子増幅技術によっても達成することができる。そ のような技術としては、限定するものではないが、上述したような、ＢＰＶ、Ｂ Ｋ、またはＥＢＶ由来の染色体外レプリコンにより駆動される遺伝子増幅が挙げ られる。あるいは、多シストロン性の、例えば、三シストロン性の伝令ＲＮＡカ セットはさらに、限定するものではないが、当業者によく知られた標準的な増幅 技術により結合されたときに、伝令ＲＮＡカセットコピー数をうまく増幅できる 、ＤＮＦＲまたはＡＤＡ断片を含む遺伝子増幅断片を含んでいても差し支えない 。 本発明の新たなレトロウイルスパッケージング細胞系統はさらに、レトロウイ ルスＬＴＲプロモータからの発現を最適化する修飾を含んでいても差し支えない 。ある実施の形態において、その細胞系統は、マウスＴ細胞内でレトロウイルス ＬＴＲ駆動発現を活性化させることが知られている転写因子の強化された発現を 示す。そのような転写因子は、限定するものではないが、ｅｔｓ群の構成物、ｃ ｂｆ（例えば、ｃｂｆ−ａおよびｃｂｆ−ｂ）、ＣＴＦ／ＮＦ−１ｃ、グルココ ルチコイド受容体、ＧＲＥ、ＮＦ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＬＶａ、ＬＶｂ、およびＬＶ ｃが挙げられる。この実施の形態のレトロウイルスパッケージング細胞系統は、 例えば、限定するものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭμｌ Ｖ）由来レトロウイルス粒子を含む、マウス白血病ウイルス由来レトロウイルス 粒子より効率的に産生するように設計されている。 ＭｕＭｏＬｖＬＴＲからの増大した転写の能力を有するパッケージング細胞系 統もまた、以下のセクション５．７に記載されるように実施される遺伝的スクリ ーニングにおいて選択することもできる。代表的な選択計画は、その発現がＭｏ ＭμｌＶＬＴＲに繋がっている定量可能マーカーを含む前駆体細胞系統で始まる 。好ましくは、そのようなＬＴＲ／定量可能マーカー構築物は切除可能である。 それ自体で、その構築物はさらに、セクション５．１に上述したプロウイルス切 除要素と同様な切除要素を含んでいても差し支えない。 前駆体細胞をマウスＴ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーに感染させる。次いで 、前記定量可能マーカーの発現によりアッセイされるように、発現の増大した細 胞を同定する。次に、そのような細胞からライブラリーＤＮＡを回収することに より、そのような増大した発現速度の原因である遺伝子配列を同定する。 そのような選択計画により産生されたパッケージング細胞系統は、そのような 因子に関する発現のマウスＴ細胞パターンに非常に似たレトロウイルス調節因子 をコード化する遺伝子の発現パターンを示している。 増大したウイルスカ価および／または感染性範囲を促進させる方法で収縮した ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖタンパク質を発現するパッケージング細胞 系統を開発することができる。例えば、ＭμｌＶベースのウイルスは、増殖細胞 の感染に制限されている。ＭμｌＶ感染に対するブロックは、前組込み(preinte gration)複合体の核中への入口のレベルにある。この複合体は、細胞分裂中に核 エンベロープが溶解するまで細胞質のままである。レンチウイルスは、核標的信 号をウイルスカプシド中に含めることにより、このブロックを逃れる。しかしな がら、この信号により、カプシドタンパク質の標的が、ウイルス構築および発芽 中の細胞膜の細胞質面で構築することができなければならない。この問題は、レ ンチウイルスカプシドの核標的信号が条件的であるという事実により解決される 。 非増殖細胞のＭμｌｖ感染に対するブロックを克服するために、核標的信号を 本発明のパッケージング細胞系統内の構築中にＭμｌｖウイルス粒子中に含めて も差し支えない。例えば、修飾ｇａｇタンパク質は、低レベルで、構築中にウイ ルス粒子カプシド中に含まれるようになるパッケージング細胞系統により発現す ることができる。核標的信号配列は当業者によく知られており、そのような修飾 ｇａｇタンパク質の発現は、例えば、本発明のｐＥＨＲＥベクターによるもので あって差し支えない。 非増殖細胞を感染させられるＭμｌｖウイルス粒子を産生する目的をうまく達 成するために、標的信号を担持するｇａｇ融合タンパク質は、少数種としてこの ウイルス粒子カプシド中に含めるべきである。さらに、核標的信号は、融合が、 感染細胞中の核のみに標的付けられているように条件付けられたものであるべき である。 そのような修飾ｇａｇ融合タンパク質のある実施の形態において、核標的信号 は、核の位置確認のためにリガンド結合を必要とするものである。例えば、グル ココルチコイド群の受容体は、そのようなリガンド依存性核標的特性を有してい る。 あるいは、感染細胞の核標的付けは、その感染細胞中に、レトロウイルスカプ シド（またはタグ付きレトロウイルスカプシド）に関する親和性を有し、核標的 付け能力も有するタンパク質を提供し、それによって、その感染細胞の核にウイ ルス粒子を運搬することにより達成される。例えば、カプシドまたはカプシドタ グを認識する一本鎖抗体を発現または導入することができ、この抗体は、核位置 確認信号に融合されている。 類似のパッケージング系統をアデノ関連性ウイルスベクターに関して誘導する ことも考えられる。例えば、ＡＡＶベクターの複製およびエンカプシデーション に関する機能を提供するためのトランスには、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が必要 とされ、したがって、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ暗号領域を、レトロウイルスｇ ａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子と同様な様式でエピソームベクターに設けるこ とができる。 ＩＸ．相補性スクリーニング方法 ここには、哺乳類細胞相補性スクリーニング方法が記載されている。そのよう な方法は、例えば、(a)細胞表現型を有する哺乳類細胞を、本発明のｃＤＮＡま たはｇＤＮＡ含有レトロウイルスベクター由来のレトロウイルス粒子に感染させ 、またはそのような細胞を、ベクターに依存して、感染の際に組込みレトロウイ ルスプロウイルスが産生されるまたは形質転換の際にエピソーム配列が確立され 、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列が発現される本発明のｐＥＨＲＥベクターで形質 転換させ；(b)表現型に関して細胞を分析し、したがって、該表現型の抑制がそ の細胞表現型を補足する核酸配列を同定する工程を含む、その発現が細胞表現型 を補足する核酸配列を同定する方法を含むことができる。 「抑制」という用語は、ここで用いたように、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列を 発現する細胞中において、そのような発現が存在しない細胞により示される表現 型と比較して、それほど存在が顕著ではない表現型を称する。この抑制は、定量 的または定性的なものであってもよく、関心のある特定の表現型に精通した当業 者にとっては明らかである。 本発明はまた、本発明の相補性スクリーニング方法により同定される核酸分子 を単離する方法をも含むものである。そのような方法では、上述した５．５．１ に記載したプロウイルス切除およびプロウイルス回収要素を使用する。 そのような方法のある実施の形態において、プロウイルス切除要素は組込みプ ロウイルス内の二つのコピー内に存在するｌｏｘＰ組換え部位を含み、プロウイ ルス回収要素は、二つのｌｏｘＰ部位の間のプロウイルス中に存在するｌａｃＯ 部位を含む。この実施の形態において、ｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼ 酵素により開裂され、切除の際に、環状化される切除プロウイルスが産生される 。ｌａｃＯ部位を含む、切除された環状プロウイルスは、ｌａｃ抑制親和性精製 により受容体細胞ゲノム核酸の複合体混合物から回収される。そのような親和性 精製は、ｌａｃＯ核酸がｌａｃ抑制タンパク質に特異的に結合するという事実に より可能となる。 別の実施の形態において、切除プロウイルスは、レスキュー効率を増大させる ために増幅される。例えば、切除プロウイルスはさらに、切除プロウイルスの生 体内増幅が大きなＴ抗原の供給により行われるように複製のＳＶ４０起点を含む こともできる。この供給は、例えば、リコンビナーゼの投与のときに行っても差 し支えない。 別の実施の形態において、切除プロウイルスは、Ｃｒｅリコンビナーゼを用い て回収してもよい。例えば、単離したＤＮＡは、制御されたサイズに断片化され る。断片を含むプロウイルスは、ＬａｃＯ／ＬａｃＩにより単離される。ＩＰＴ Ｇ溶離に続いて、プロウイルスの環状化を、精製したリコンビナーゼによる処理 により行っても差し支えない。 Ｘ．アンチセンス方法 ここには、特定の必須または可欠哺乳類細胞の機能的に不活化させるアンチセ ンス遺伝子抑制要素（ＧＳＥ）ベースの方法が記載されている。そのような方法 としては、哺乳類遺伝子機能を阻害する核酸配列を同定し、単離する方法が挙げ られる。この方法として、遺伝子の機能を直接的に評価するものも挙げられ、さ らに重要なことには、遺伝子の機能の直接選択に依存しない方法も含まれる。こ れらの後者の方法をうまく用いて、そのような機能に関する知識のない場合でさ えも、例えば、遺伝子内の機能損失突然変異誘発の表現型が知られていない場合 、遺伝子機能に影響を与える配列を同定することができる。 ここに記載されているような遺伝子機能の阻害は、そのようなＧＳＥが存在し ない遺伝子発現に対する、ＧＳＥが存在する遺伝子発現の阻害を称する。好まし くは、そのような阻害により遺伝子の活性が失われるが、定性的または定量的い ずれの阻害であっても差し支えない。特定の機構により拘束することを意図する ものではないが、ＧＳＥ阻害は、関心のある遺伝子により産生されるトランスク リプトの翻訳の阻害により生じると考えられる。 そのような方法により同定される核酸配列を用いて、哺乳類細胞の機能大打撃 (knockout)を生じることもできる。「機能的大打撃」は、ここで用いたように、 ＧＳＥが関心のある遺伝子の機能を阻害するように機能する状況を称し、機能的 大打撃細胞または遺伝子導入動物を称するのに用いることもできる。 ある実施の形態において、関心のある哺乳類遺伝子の機能を阻害する核酸配列 を同定する方法は、例えば、(a)哺乳類細胞を、関心のある遺伝子からの核酸配 列を含むＧＳＥ産生レトロウイルスベクター由来のレトロウイルスに感染させ、 あるいは、そのような細胞を、関心のある遺伝子からの核酸配列を含む本発明の ｐＥＨＲＥ−ＧＳＥベクターで形質転換し、ここで、この細胞は、その遺伝子に よりコード化されたアミノ酸配列由来のＮ末端部分および選択可能マーカー、好 ましくは、定量可能マーカーを含むＣ末端部分を含む融合タンパク質を発現し、 組込みレトロウイルスプロウイルスが産生され、またはベクターに応じて、ｃＤ ＮＡまたはｇＤＮＡ配列を発現するエピソームが確立され；(b)選択可能マーカ ーを選択し；(c)定量可能または選択可能マーカーをアッセイし、したがって、 選択可能マーカーが阻害されている場合には、哺乳類細胞の機能を阻害する核酸 配列が同定されする各工程を含む、選択可能マーカーが阻害されている場合には 、哺乳類細胞の機能を阻害する核酸配列が同定されんでも差し支えない。 この同定方法のある好ましい実施の形態において、融合タンパク質は、その転 写が融合タンパク質の発現が条件的であるように誘導性調節配列により制御され ている核酸によりコード化されている。この同定方法の別の好ましい実施の形態 において、哺乳類細胞は第一の哺乳類種から誘導され、遺伝子は、実際的に遠縁 で関連する異なる種である第二の種から誘導される。 融合タンパク質独立実施の形態においては、選択可能マーカーをコード化する 核酸を、遺伝子の開始コドンの部位で関心のある遺伝子中に挿入することができ 、したがって、この選択可能マーカーは、関心のある遺伝子の代わりに翻訳され る。この実施の形態は、例えば、融合タンパク質が、発現されるべき細胞に対し て有害であるかもしれない場合、または融合タンパク質を産生できない場合に有 用である。 哺乳類遺伝子の機能を阻害する核酸配列を同定する方法は、(a)そのような様 式で選択可能マーカーを発現する哺乳類細胞を、関心のある遺伝子から由来の核 酸 配列を含むＧＳＥ産生レトロウイルスベクターで感染させ、あるいは、そのよう な細胞を、関心のある遺伝子から由来の核酸配列を含む本発明のｐＥＨＲＥ−Ｇ ＳＥベクターで形質転換し、感染の際に、組込みプロウイルスが形成され、また はベクターに応じて、エピソーム配列が確立させ、核酸配列が発現され；(b)選 択可能マーカーを選択し；(c)その選択可能マーカーをアッセイし、したがって 、選択可能マーカーが阻害されている場合には、哺乳類遺伝子の機能を阻害する 核酸配列が同定される各工程を含んでいる。マーカーの選択は、例えば、ＦＡＣ Ｓにより定量的であるべきである。 さらなる実施の形態において、関心のある遺伝子および選択可能マーカーを、 内部リボソーム入口部位により隔てられた、二シストロン性伝令ＲＮＡカセット 内に互いに作用的に結合して配置することができ、それによって、５’から３’ に、関心のある遺伝子産生物および次いで選択可能マーカーをコード化する一つ のトランスクリプトが産生される。好ましくは、関心のある遺伝子から由来する 二シストロン性伝令ＲＮＡ内の配列は、暗号だけでなく、５’と３’の非翻訳配 列も含む。 哺乳類遺伝子の機能を阻害する核酸配列を同定する方法は、この例において、 (a)そのような二シストロン性伝令ＲＮＡの一部として選択可能マーカーを発現 する哺乳類細胞を、関心のある遺伝子由来の核酸配列を含むＧＳＥ産生レトロウ イルスベクター由来のレトロウイルスに感染させ、あるいは、そのような細胞を 、関心のある遺伝子由来の核酸配列を含む本発明のｐＥＨＲＥ−ＧＳＥベクター で形質転換させ、ここで、ベクターに応じて、感染の際に、組込みプロウイルス が形成され、またはエピソーム配列が確立され、前記核酸配列が発現され；(b) 該選択可能マーカーを選択し；(c)該選択可能マーカーをアッセイし、したがっ て、その選択可能マーカーが阻害されている場合には、前記哺乳類細胞の機能を 阻害する核酸配列が同定される各工程を含んでいる。 別の実施の形態において、そのような方法は、哺乳類細胞機能に影響を与える 核酸を同定する方法を含んでも差し支えなく、例えば、(a)関心のある機能に依 存した表現型を示す細胞を、試験核酸配列を含むＧＳＥ産生レトロウイルスベク ター由来のレトロウイルスに感染させ、あるいは、そのような細胞を、試験核酸 配 列を含む本発明のｐＥＨＲＥ−ＧＳＥベクターで形質転換させ、感染の際に、組 込みプロウイルスが形成され、またはベクターに応じて、エピソーム配列が確立 され、該試験核酸が発現され；(b)該表現型に関して感染細胞をアッセイし、し たがって、該表現型が抑制されている場合には、試験核酸が、前記哺乳類細胞機 能に影響を与える核酸を示している各工程を含んでいても差し支えない。そのよ うなアッセイは、この場合、表現型が機能の損失の際にのみ表されていることを 除いて、センス発現相補性スクリーニングと同一である。 上述した方法は、関心のある遺伝子の機能には依存しない。本発明の方法はま た、クローンすべき遺伝子の機能に基づく、遺伝子クローニングを行うアンチセ ンス方法をも含む。そのような方法は、未知の遺伝子の損失により、特定の表現 型が産生されるという観察に基づいて新しい核酸配列を同定する方法を含むこと ができ、例えば、(a)細胞を、試験核酸配列を含むＧＳＥ産生レトロウイルスベ クター由来のレトロウイルスに感染させ、あるいは、そのような細胞を、試験核 酸配列を含む本発明のｐＥＨＲＥ−ＧＳＥベクターで形質転換させ、ここで、感 染の際に、組込みプロウイルスが形成され、または、ベクターに応じて、エピソ ーム配列が確立され、該試験核酸が発現され；(b)前記表現型の変化に関して該 感染細胞をアッセイし、したがって、新しい核酸配列が、未知の遺伝子の損失に より特定の表現型が産生されるという観察に基づいて単離されるかもしれない各 工程を含むことができる。そのようなアッセイは、この場合は、表現型が機能の 損失に基づいてのみ示されることを除いて、センス発現相補性スクリーニングと 同様である。 本発明の方法はまた、上述した機能ベースの方法の一部として用いることので きる非指向性の任意に感化されたｃＤＮＡライブラリーを構築する新たな方法も 含む。そのようなｃＤＮＡ構築方法は、(a)制限部位をコード化するヌクレアー ゼ耐性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて第一の鎖を感化させることを含む 第一の鎖ｃＤＮＡ合成；および(b)エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを用い て、第二の鎖を合成することを含む第二の鎖ｃＤＮＡ合成を含んでも差し支えな い。このヌクレアーゼ耐性キメラオリゴヌクレオチドにより、指向に印付ける制 限部位の除去が避けられ、それによって、非指向性ｃＤＮＡ任意感化ｃＤＮＡラ イブ ラリーを構築することができる。 例えば、ヌクレアーゼ耐性キメラオリゴヌクレオチドは、一般構造：５’−Ｇ ＣＧ ＧＣＧ ｇｇａ ｔｃｃ ｇａａ ｔｔｃ ｎｎｎ ｎｎｎ ｎｎｎ−３ ’のものであってもよい。修飾バックボーンヌクレオチドが、上部に示されてお り、一般的に４−６塩基であり、これに、通常のＤＮＡおよび９の変質ヌクレオ チドからなる一つまたは二つの制限部位が続いている。バクテリオファージｐｈ ｉ−２９からのポリメラーゼのようなヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを用いても 差し支えない。 本発明はまた、本発明のアンチセンススクリーニング方法により同定された核 酸分子を単離する方法も含むものである。そのような方法では、上述したような プロウイルス切除およびプロウイルス回収要素を用いる。 そのような方法のある実施の形態において、プロウイルス切除要素は、組込み プロウイルス内の二つのコピー中に存在するｌｏｘＰ組換え部位を含み、プロウ イルス回収要素はその二つのｌｏｘＰ部位の間のプロウイルス中に存在するｌａ ｃＯ部位を含んでいる。この実施の形態において、ｌｏｘＰ部位はＣｒｅリコン ビナーゼ酵素により開裂され、切除の際に環状化される切除プロウイルスが産生 される。ｌａｃＯ部位を含む、切除環状プロウイルスは、ｌａｃ抑制親和性精製 により受容体細胞ゲノム核酸の複合混合物から回収される。そのような親和性精 製は、ｌａｃＯ核酸がｌａｃ抑制タンパク質に特異的に結合するという事実によ り可能となる。 別の実施の形態において、切除プロウイルスは、レスキュー効率を増大するた めに増幅される。例えば、切除プロウイルスは、切除プロウイルスの生体内増幅 が、大きなＴ抗原の供給により達成できるように複製のＳＶ４０起点を含んでも 差し支えない。この供給は、例えば、リコンビナーゼの投与のときに行っても差 し支えない。 ＸＩ．遺伝子捕捉方法 本発明はさらに、特定の刺激に応答して変調される哺乳類遺伝子を同定し、単 離する、遺伝子捕捉ベースの方法に関するものである。これらの方法では、本発 明のレトロウイルス粒子を用いて細胞を感染させ、これにより、受容体の哺乳類 細胞ゲノム内に任意に組み込まれたプロウイルス配列が産生される。組込みが遺 伝子内で行われる場合、遺伝子はプロウイルスレポーター配列により「タグ付け 」され、その発現が遺伝子の調節配列により制御される。レポーター配列の発現 をアッセイすることにより、遺伝子自体の発現をモニターすることができる。 本発明の遺伝子捕捉ベース方法には、限定するものではないが、(1)プロウイ ルスの宿主ゲノム中への組込みの際に重複される遺伝子捕捉カセットの３’ＬＴ Ｒ中の存在を含む、いくつかの主要な利点がある。この重複により、隣接する遺 伝子からウイルスに進入するポリメラーゼが、ＬＴＲ中に存在するポリアデニル 化信号と遭遇する前に遺伝子捕捉カセットを転写するように、ゲノムＤＮＡに隣 接して遺伝子捕捉カセットが配置される。遺伝子捕捉カセット中にＩＲＥＳ配列 が含まれることにより、成熟ｍＲＮＡ内のどの地点でも細胞およびウイルス配列 の間で融合することができ、機能的に「タグ付け」されたトランスクリプトが得 られる可能性のある組込み部位の数が効果的に増加する；(2)ＦＡＣＳ中のライ ブ選別により評価することのできる定量可能選択可能マーカーを使用することに より、誘発されるクローンだけでなく、抑制される遺伝子にタグ付けするクロー ンも単離することができる。 「変調」という用語は、ここで用いたように、細胞中の特定の刺激に応答した 遺伝子発現の上方または下方(up-or down-)調節を称する。この変調は、定量的 または定性的いずれのものであっても差し支えない。 本発明の遺伝子捕捉方法は、例えば、(a)哺乳類細胞を、本発明の遺伝子捕捉 ベクター由来のレトロウイルスに感染させ、ここで、感染の際に、組込みプロウ イルスが形成され；(b)この細胞に関心のある刺激を施し、レポーター配列が発 現される場合には、それが、前記刺激の存在下で発現される遺伝子内に組み込ま れ、したがって、同定するように、レポーター配列の発現に関して前記細胞をア ッセイする各工程を含む方法を含むことができる。 遺伝子が発現されない、刺激のないときに異なるレベルで発現される場合には 、そのような方法により、特定の刺激に応答して発現された遺伝子が同定される 。 本発明はまた、特定の刺激の存在下で、またはそれに応答して、発現される核 酸配列を単離する方法を含むものである。そのような方法は、例えば、関心のあ る刺激の存在下で、またはそれに応答して、発現される遺伝子中に組み込まれた プロウイルスを含む細胞のゲノム核を消化し、核酸の複合体混合物から核酸配列 を回収する手段を用いて、遺伝子の配列を含む核酸を回収する各工程を含む。 ある実施の形態において、回収する手段は、組込みプロウイルス中に存在する ｌａｃＯ部位である。ｌａｃＯ部位を含む切断断片は、ｌａｃ抑制因子親和性精 製により受容体細胞ゲノム核酸の複合体混合物から回収される。そのような親和 性精製は、ｌａｃＯ核酸がｌａｃ抑制タンパク質と特異的に結合するという事実 により可能になる。 そのような方法は、隣接するゲノム配列（すなわち、関心のある遺伝子内に含 まれる配列）とともにプロウイルス核酸配列を回収するように機能する。単離し た配列を環状化して、細菌中で複製できるプラスミドを産生することができる。 このことは、単離配列内に複製の細菌起点および細菌選択可能マーカーが存在す ることにより可能となる。 隣接する遺伝子配列の単離の際に、その配列を標準的なクローニング技術とと もに用いて、関心のある全長遺伝子に対応する核酸配列を単離することができる 。 ＸＩＩ．スクリーニングアッセイの実施の形態 上述したように、本発明の方法は、哺乳類細胞の機能を阻害する核酸配列を同 定し、単離する哺乳類細胞表現型のアンチセンスベースの方法を補足する能力に 基づいて、核酸分子を同定し、単離する方法、および特定の刺激に応答して変調 される哺乳類遺伝子を同定し、単離する遺伝子捕捉方法を含むものである。 本発明の組成物の例としては、相補性スクリーニングレトロウイルスベクター 、アンチセンス遺伝子抑制要素（ＧＳＥ）ベクター、任意ペプチド配列を示すベ クター、遺伝子捕捉ベクター、そのようなベクターを含むライブラリー、そのよ うなベクターにより産生されるレトロウイルス粒子および新たなパッケージング 細胞系統のような、複製欠損レトロウイルスベクターが挙げられる。以下に、哺 乳類遺伝子機能を説明するための、そのような方法、ベクターおよび組成物を使 用する特定の実施の形態を示す。 本発明の組成物としてさらに、相補性スクリーニングレトロウイルスベクター 、アンチセンス遺伝子抑制要素（ＧＳＥ）ベクター、任意ペプチド配列を示すベ クターのようなｐＥＨＲＥベクター、そのようなベクターを含むライブラリ、細 胞および動物、並びに新たなパッケージング細胞系統が挙げられる。以下に、そ のような方法、ベクターおよび組成物を使用して、哺乳類遺伝子機能を説明する 特定の実施の形態を提供する。 Ａ）条件表現型のバイパス 多くの表現型は、既知の遺伝子の条件過剰発現（例えば、増殖停止、分化）に より培養中の哺乳類細胞に与えることができる。そのような表現型との干渉は、 センス指向性遺伝子遺伝子または機能ノックアウト（ＧＳＥ発現を介して）によ り調査することができる。この種のスクリーニングの例を以下に示す。 ｉ．ｐ５３媒介増殖停止およびアポプトシスのバイパス ｐ５３のレベルが増大すると、増殖停止（一般的にＧ１における細胞周期停止 による）またはプログラムされた細胞死のいずれかが生じ得る。条件的でｐ５３ を過剰発現し、ｐ５３機能ノックアウトを含む細胞系統により、これらの工程の 両方を分析することができる。第一のケースにおいて、内因性ｐ５３遺伝子（ｐ ５３ノックアウトマウスからの）が欠如したマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を操 作して、蛍光タグ付けしたｐ５３タンパク質を条件的で発現させる。活性化され たときに、蛍光ｐ５３は核に局在化され、細胞周期停止を強化する。この停止の バイパスは、センスｃＤＮＡの過剰発現により、またはＧＳＥ断片の発現により 行うことができる。そのようなスクリーンにより、ｐ５３分解経路の成分、ｐ５ ３に影響を与えないが、ｐ５３の存在下でさえ細胞周期を進行させる遺伝子およ びｐ５３の局在化に影響を与える（ｐ５３は、突然変異誘発されないが、胸腫瘍 および神経芽細胞腫の大部分に誤って局在化される）遺伝子が同定されるであろ う。したがって、蛍光ｐ５３タンパク質を使用することにより、バイパスの機構 に関する情報が得られる。 非常に似た細胞系統を用いて、ｐ５３媒介細胞死を分析することもできる。ｐ ５３のみでほとんどの繊維芽細胞において増殖停止を誘発するが、ある癌遺伝子 （特に、ｍｙｃ）との組合せにより、細胞死をまねく。ｍｙｃおよびｐ５３両方 を条件的で過剰発現するＭＥＦ細胞が操作されている。組み合わせて活性化され ると、これらの遺伝子は、細胞の大部分で細胞死を誘発させる。センス指向性ｃ ＤＮＡの過剰発現によるこの細胞死からのレスキューを用いて、抗アポプトシス 遺伝子（および可能性のある上述したｐ５３調節因子）を同定することができる 。ＧＳＥ発現によるレスキューは、ｍｙｃおよびｐ５３が細胞死（下流の標的） またはアポプトシスプログラムに必要とされる細胞遺伝子を誘発する経路の成分 を同定するかもしれない。 ｉｉ．細胞不死化のＭ１成分のバイパス 哺乳類細胞の不死化は、二つの機能的段階Ｍ１およびＭ２に分割することがで きる。Ｍ１（配列）は、腫瘍抑制因子ｐ５３およびｐＲＢを不活化するウイルス オンコタンパク質により繊維芽細胞中で克服することができる。ＳＶ４０大型Ｔ 抗原はそのようなタンパク質のうちの一つである。条件的不死細胞は、Ｔ抗原の 温度感受性または誘導性のものを用いて誘発した。Ｔ不活化の際に、これらの細 胞は老化し、増殖を停止する。そのような細胞の増殖は、センスおよびアンチセ ンスライブラリーの導入によりレスキューしてもよい。 同様のスクリーニングを、過剰発現の際に表現型を与える遺伝子に関して行っ ても差し支えない。増殖停止またはアポプトシスを誘発するサイトカイン（例え ば、それぞれ、ＨＭＥＣまたはＨｅｐ３Ｂ細胞中のＴＧＦ−ベータ）を用いて実 質的に同一の増殖レスキュースクリーニングを行っても差し支えない。 Ｂ）シスおよびトランスにおけるサイトカインの同定 歴史的に、いくつかのサイトカインが哺乳類系における産生により機能的に同 定されてきた。特に、形質移入されたｃＤＮＡのプールを発現するＣＯＳ細胞を 用いて、次に因子感受性細胞の増殖を誘発する能力に関して試験された条件的培 地を調製してきた。増殖調節サイトカイン（または細胞死を抑制する生存因子） は、標的細胞中のｃＤＮＡライブラリーの直接的な発現により同定してもよい。 そのような手法は、その標的細胞の種類が低形質移入効率であることにより阻止 されてきた。例えば、造血幹細胞の生存は、様々な既知と未知の因子により促進 される。したがって、そのような細胞の、幹細胞個体群の増殖および生存を促進 させる間質細胞由来のｃＤＮＡライブラリーによる感染の際に、感染細胞を生存 させる選択により、必要な因子をコード化するｃＤＮＡを担持するものを同定し てもよい。そのような因子は、オートクライン様式で産生されるかもしれない。 この手法によりトランス作用性因子を同定するけれども、シスにおいても作用す るｃＤＮＡ（例えば、増殖調節信号形質導入経路を短絡することにより）も同定 される。これらは、二細胞系を用いて分泌増殖調節因子を調査することにより除 いても差し支えない。この場合、ある細胞種類をあるライブラリーに感染させ、 ある因子として用いて、ｃＤＮＡ産生物を産生する。そのうちのいくつかは、分 泌タンパク質である。次いで、因子応答性である第二の細胞種類を、拡散を制限 する培地（例えば、軟寒天）中のｃＤＮＡ発現細胞上に平板培養する。必要とさ れる因子を同化する産生細胞の上に平板培養された応答細胞は増殖し、応答細胞 のコロニーの外観は、特定の因子を同化する下にある細胞に印を付ける。二細胞 系の利点は、細胞外因子が増殖停止または末端分化を誘発する場合にはより明ら かである。そのような場合において、シスにおける発現は、選択が所望の遺伝子 を発現する個体群に対抗しているので、実際的ではない。しかしながら、トラン スにおいて、受容体細胞の変化は、視覚的に採点することができ、下にある発現 細胞は、所望の遺伝子の単離に関してレスキューすることができる。細胞移動ま たは細胞接着を促進させる因子に関してスクリーニングする本発明の方法を用い て、同様の二細胞スクリーンを開発しても差し支えない。 Ｃ）細胞工程に影響を与えうる合成ペプチドの同定 本発明は、哺乳類細胞中で、関心のあるタンパク質と相互作用する任意合成ペ プチド配列を示すことのできるベクターを用いて、相補性型スクリーンによりペ プチド配列を同定および単離する方法を提供する。関心のあるタンパク質を同定 する従来のスクリーニング方法は、酵母内においてファージ系および二つのハイ ブリッドスクリーンを用いて行われてきた。本発明は、この凡例を哺乳類細胞に も拡張する新たなスクリーニング方法を提供するものである。 ｉ．細胞内ペプチド表示 上述したように、本発明の別の態様において、主題のベクターを、ペプチド表 示ライブラリーを産生するのに用いることができる。細胞内ペプチドライブラリ ーを特徴とする実施の形態に関して、特に、ペプチドが比較的短い、例えば、5- 30アミノ酸残基である場合、融合タンパク質の一部としてのそのペプチドに、構 造拘束タンパク質（すなわち、タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端の 柔軟性を減少させるタンパク質）が提供することができる。一般的に、構造拘束 タンパク質は、足場またはプラットホームとして機能し、これは、関心のあるペ プチドまたはタンパク質が自由に採用する可能性のある三次元構造の数を制限す る。構造拘束タンパク質の好ましい例は、チオレドキシンまたはチオレドキシン 様配列であるが、他の多くのタンパク質もまたこの目的にとって有用である。好 ましくは、構造拘束タンパク質は、サイズが小さく（一般的に、200以下のアミ ノ酸）、既知の三次元構造の剛性であり、それらの構造を過度に分断せずに関心 のあるタンパク質の挿入物を収容することができる。そのようなタンパク質の主 な特性は、それら溶剤露出表面での利用可能性であり、その位置でペプチド挿入 物を作成することができる（例えば、チオレドキシン活性部位ループ）。 上述したように、本発明による好ましい構造拘束タンパク質の一つはチオレド キシンまたは他のチオレドキシン様タンパク質である。大腸菌チオレドキシンの 三次元構造が知られており、タンパク質の本体から突出する残基Ｃｙｓ３３およ びＣｙｓ３６の間にある特有なＣｙｓ−Ｃｙｓ活性部位ループを含むいくつかの 表面ループを含んでいる。このＣｙｓ−Ｃｙｓ活性部位ループは、同定可能でア クセス可能な表面ループ領域であり、全体の構造安定度に寄与するタンパク質の 残りの部分との相互作用には含まれない。したがって、これは、犠牲(prey)タン パク質挿入物の部位としての良好候補である。大腸菌チオレドキシンのアミノ末 端およびカルボキシ末端は、タンパク質の表面にあり、融合構造にとっても容易 にアクセス可能である。 様々な理由のために、試験ペプチドをチオレドキシンまたはチオレドキシン様 分子の活性部位ループ内で融合することが好ましいかもしれない。その活性部位 ループを囲むチオレドキシンの面が、非特異的タンパク質ジスルヒドオキシド− レダクターゼとしてのタンパク質の主要な機能を保持しながら発生して、様々な タンパク質表面と相互作用できる。この活性部位ループ領域は、強力な二次構造 の断片の間に見つかり、これにより、犠牡タンパク質をつなげてもよい剛性のプ ラットホームが得られる。チオレドキシン様タンパク質の活性部位ループ中に挿 入される小さな異種ペプチドが、三次構造を維持するのに含まれていないタンパ ク質のある領域内に存在する。したがって、そのような融合タンパク質の構造は 安定である。 任意ペプチド配列のそのようなライブラリーは、哺乳類細胞中の主題のベクタ ーから発現することができる。特定の表現型を与える発現されたペプチドは、上 述したものと類似の遺伝子スクリーンにおいて単離することができる。次いで、 これらのペプチドの細胞標的を、生体外または生体内ペプチド結合に基づいて単 離することができる。 ｉｉ．細胞外ペプチド表示 細胞外信号系分子（例えば、成長因子）およびそれらの受容体の間の相互作用 が大きなタンパク質表面上で生じることが立証されている。本発明は、受容体担 持細胞の表面上に拘束ペプチドを発現させ、生物機能に関して直接的に選択する ことにより、哺乳類細胞中でペプチドを迅速に同定できる新たなスクリーンを提 供する。合成ペプチド表示ビヒクルまたはカセットの一つの柔軟性ループを、任 意ペプチドをコード化する任意オリゴヌクレオチドのライブラリーが挿入される ポリリンカーと置き換えることにより合成ペプチドを哺乳類系に表示することが できる。形成された合成キメラは、c.clegans崩壊加速因子（ＤＡＦ）由来のも ののような異種膜アンカーを提供することにより、細胞表面に現れるように膜に つなげことができる。次いで、このキメラタンパク質は、細胞外ペプチド表示ビ ヒクルとして機能できる。レトロウイルスベクター中のペプチドライブラリーは 、受容体を活性化させる能力に関して直接的にスクリーニングしても差し支えな く、またはファージ表示によるミニライブラリーの予備選択後に生体内のスクリ ーニングを行っても差し支えない。 さらに詳細に述べるために、膜アンカー領域は、細胞表面に取り付けることの できるどのような成分であってもよい。様々なそのような成分がこの業界で知ら れおり、限定するものではないが、既知タンパク質由来の膜内外領域、膜内外ス パニングを行うのに十分な長さの疎水性アミノ酸、脂質分子の供給結合により後 翻訳修飾に関して標的付けられたアミノ酸配列およびその分子を細胞膜の表面に 結合させる膜内外タンパク質に関して十分な親和性を有するポリペプチドを含む 。膜内外領域は、天然および人工の両方が、この業界で知られており、十分な数 のアミノ酸残基により隔てられた多数のコピー中に存在し、それら領域による多 重膜スパニングを行ってもよい。典型的に、膜内外領域は、膜に及ぶのに十分な 数の疎水性アミノ酸残基を含み、それら疎水性アミノ酸に対してＣ末端の、少な くとも１つの、通常はいくつかの正に荷電したアミノ酸残基を含んでいる。これ ら正に荷電したアミノ酸はさらに、膜を通る未完成タンパク質の移動を妨げる。 脂質修飾により機能する適切な膜付着領域は、限定するものではないが、グリコ シルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）への共有結合により修飾された崩壊 加速因子（ＤＡＦ）を含む。それらは好ましい実施の形態であり、細胞表面から タンパク質が続いて特異的に開裂することができる。 Ｄ）寄生体およびウイルス感染に対する耐性 ウイルスおよび多数の寄生生物は、増殖のために細胞内環境を必要とする。本 発明のスクリーンを用いて（例えば、センス過剰発現、ＧＳＥ発現、細胞内ペプ チド表示、細胞外ペプチド表示）、ウイルスおよび寄生体耐性に対する経路を同 定してもよい。 例えば、特定の突然変異体遺伝子の発現によりＨＩＶ感染に対する耐性が与え られることが最近示された。本発明の方法を、ＨＩＶ感染に対する耐性を与える またはウイルス生命周期に干渉する他の遺伝子（天然、突然変異体または合成） に関するスクリーンを開発するのに適用してもよい。 本発明の方法は、細胞内寄生体、例えば、マラリア原虫のウイルス生命周期に 干渉する遺伝子に関するスクリーンを提供するのに適用してもよい。 Ｅ）特異的腫瘍抑制因子の欠如した腫瘍細胞に関する薬物スクリーニング標的の 同定 多数の研究により、ヒト腫瘍の大部分で失われる二つの主要な腫瘍抑制因子経 路が同定されている。ｐ５３タンパク質は全ての腫瘍の約50％が機能的に不活化 されており、ｐ１６／Ｒｂ経路はより高い頻度でさえも影響を受ける。増殖制御 に関するこれらの経路の損失は、正常な細胞と腫瘍細胞との間の最も明確な違い のうちの一つである。細胞死を誘発することによる多くの化学療法薬物の作用、 およびそれらの選択性は、腫瘍細胞は増殖するが、体内の正常な細胞のほとんど は無活動であるという事実に基づいている。本発明の方法は、特に、二つの主要 な腫瘍抑制経路のうちの一つまたは両方が欠如した細胞において、不活化が細胞 死を誘発する遺伝子産生物を同定するスクリーンを開発するのに適用してもよい 。これにより、増殖指数に基づかず、それらの遺伝子型に基づいて細胞を区別す る化合物に導かれる薬物スクリーニング標的が提供される。 そのような薬物スクリーニング標的の同定は、特にｐ５３の不在下またはｐ１ ６／Ｒｂの不在下もしくはそれら両方の不在かでアポプトシスを誘発できるＧＳ Ｅ配列の単離に依存する。ｐ５３、ｐ１６／Ｒｂいずれかまたはそれら両方が条 件的に欠如した細胞は、条件的ウイルス癌タンパク質を用いて調製することがで きる。例えば、ｐ５３は、誘導性Ｅ６タンパク質を用いて、またはＲｂに結合す る能力も失った温度感受性Ｔ抗原を用いて、条件的に不活化することができる。 ｐ１６／Ｒｂの条件的損失は、条件的に発現されたＥ７を用いて、またはｐ５３ 結合に関して突然変異体であるｔｓ−Ｔ抗原により実施することができる。その ような細胞を、ＧＳＥライブラリーに感染させ、ｐ５３またはｐ１６／Ｒｂ調節 が無傷な条件下で継代する。正常な細胞において死を誘発するそれらの配列は自 然に対抗選択される。次いで、所望の腫瘍抑制経路を特異的に不活化し、アポプ トシス細胞を、アポプトシス細胞の膜に結合するアネクシングＶの能力に依存す る磁気分離技術により精製する。次いで、アポプトシス個体群から調製したＤＮ Ａを用いて、ウイルスライブラリーをレスキューする。そのようなスクリーニン グを何周期か行うことにより、腫瘍抑制機能の損失に応答して細胞死を誘発する ＧＳＥ配列の個体群が増加する。 Ｆ）転移に含まれる遺伝子の同定（生体内選択） 本発明の方法を、転移に含まれる遺伝子を同定するスクリーンを開発するのに 適用してもよい。腫瘍細胞の転移する能力を生体内で研究できるよく特徴付けら れた系が数多くある。最も普及しているのが、マウス足せき微量注射アッセイで ある。非転移細胞の個体群にセンスおよびアンチセンスライブラリーを感染させ ることができる。これらを、マウスの足せき中に注射して、離れた腫瘍の外殖後 、転移細胞を単離することができる。そのような細胞からのウイルスのレスキュ ー用いて、腫瘍細胞の転移する能力を調節する遺伝子を同定することができる。 実施例１：レトロウイルスＭａＲＸＩＩベクターの構築 以下の実施例により、複製欠損レトロウイルスｐＭａＲＸＩＩを構築する方法 を提供する。出発ベクターはｐＢＡＢＥｐｕｒｏ（Morgenstern，1990，Nucleid Acids Res．18:3587-3596）であり、これを以下のように修飾する： ｌｏｘＰ部位を含む合成リンカーをＮｈｅＩ部位に挿入した。ｌｏｘＰ部位を 含むリンカーの配列は以下のとおりである： この合成リンカーの挿入により、ｌｏｘＰ部位を産生する一方で、３’ＮｈｅＩ 部位を破壊すると同時に、独特のＮｈｅＩ部位を残す。 普遍（-20）塩基配列決定プライマーおよびｌａｃオペレータ配列のプライマ ー結合部位を含むｐＢＡＢＥｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位の間にポ リリンカーを挿入する。このポリリンカーの上側鎖の配列は以下のとおりである ： ＰＣＲ断片の挿入物は細菌ＥＭ７プロモータを含み、ゼオシン抵抗性遺伝子を 、ＳａｌＩおよびＳｔｕＩ部位がその断片の５’末端に含まれ、ＢｓｐＥＩおよ びＣｌａＩ部位がその断片の３’末端に含まれるように、ｐＺＥＯ ＳＶ（イン ビトロゲン）から増幅した。修飾したｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターをＳａｌＩお よびＣｌａＩで消化し、ＰＣＲ断片とライゲートした。このＰＣＲ断片の上側鎖 の配列は以下のとおりである： プラスミドｐＭＹＣ３から増幅したＲＫ２ＯｒｉＶを含むＰＣＲ断片を挿入し た（Shah等，1995，J．Mol．Biol．254:608-622）。最小ｏｒｉＶは、Shah等に 定義されたように選択した。このＰＣＲ断片は、５’末端でＢｓｐＥＩ部位を、 ３’末端でＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩ部位を有していた。修飾ｐＢＡＢＥｐｕｒ ｏベクターおよびＰＣＲ断片の両方を、ＢｓｐＥＩおよびＣｌａＩで消化し、互 いにライゲートした。このＰＣＲ断片の上側鎖の配列は以下のとおりである： いずれかの方向にＲＫ２ＯｒｉＶと同等の位置に複製のｐＵＣ起点を含むことが 、感染細胞においてウイルス力価および発現レベルの両方を減少させることが分 かった。 複製のＦ１起点もまた、修飾ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクター中に挿入した。この 複製Ｆ１起点はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Stratagene）から増幅し、Ｎｏ ｔｌ制限部位を５’および３’部位に加えた。この断片を、修飾ｐＢＡＢＥｐｕ ｒｏベクターおよび前記断片両方のＮｏｔｌでの消化後に、修飾ベクター中に挿 入した。ヘルパーレスキューの際に、ｃＤＮＡのセンス鎖を産生するＦ１起点の 方向を選択した。増幅したＦ１断片の配列は以下のとおりである： このベクターを、以下の合成断片： を用いて、修飾ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターのＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩ部位の 間にＰａｃＩ部位を挿入することによりさらに修飾した。 このベクターを、以下の合成断片： を用いて、修飾ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターのＢｓｐＥＩ部位にＰｍｅＩ部位を 挿入することによりさらに修飾した。この断片の挿入により、一つのＢｓｐＥＩ 部位を破壊し、第二の部位を無傷のままにする。 このベクターを、ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）−ヒグロマイシン抵抗性マーカーを含 む断片を挿入することによりさらに修飾した。このＩＲＥＳヒグロマイシン抵抗 性カセットは、ヒグロマイシン暗号配列の第一のメチオニンが欠如するように、 そして、ＣａｌＩおよびＳａｌＩ部位が停止コドンの後に加えられるようにｐＢ ａｂｅ−Ｈｙｇｒｏ（Morgenstern等，1990，Nucl．Acids Res．18:3587-3596） からのヒグロマイシン配列の増幅により産生した。これを、ヒグロマイシンタン パク質の第一のメチオニンがベクターにより与えられるように、ＩＲＥＳ−含有 ベクターであるｐＣＩＴＩＥ（ＭｃｓＩ−ＳａｌＩ切断された）中に挿入した。 メチオニンの置換は、ＩＲＥＳの効率的な機能にとって重要である。このカセッ トを、ＳａｌＩ部位が機能ＩＲＥＳの上流に加えられ、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ の両方での切断後にｐＢａｂｅ−Ｈｙｇｒｏ中に再挿入されるように、ＰＣＲに より増幅した。この断片を切除し、ＳａｌＩ部位が両側に再形成されるように修 飾ベクターのＳａｌＩ部位中に挿入した。 形成されたベクターはＭａＲＸＩＩバックボーンである（図１）。ＭａＲＺＩ Ｉバックボーンからの特定の目的のベクターの誘導が以下に記載されている。 図示したＭａＲＸＩＩベクターにおいて、リコンビナーゼ処理等によるプロウ イルスの切除により、ＬＴＲ配列におけるリコンビナーゼ部位の位置のために、 一つのＬＴＲのみを有する閉じられた環状ベクターが得られる。図示した実施の 形態において、欠損ＬＴＲは、ウイルスを作成するのには使用できない。しかし ながら、本発明の別の態様により、感染性（まだ複製欠損）レトロウイルスベク ターを産生するのに必要なバックＬＴＲ要素を加える都合のよい手段が提供され る。図２５に示したように、いわゆる再一体化(reunification)ベクターを誘導 して、リコンビナーゼ媒介ライゲーションにより、ＬＴＲ配列が復元され、形成 されたベクターを、例えば、パッケージング細胞系統の一時的形質移入および感 染性ウイルス粒子の二回目の産生の際に増幅してもよい細菌細胞からの単離の際 に用いても差し支えないベクターが提供される。最も単純な形態において、主題 の方法により、５’および３’末端にＬＴＲ配列と隣接している元のレトロウイ ルス配列を含むベクターを反復発生させるように、レトロウイルスベクターを備 えた第二の構築物の交差ライゲーションを実施できる組換え部位を有するＬＴＲ を備えた第二の構築物を提供する。 実施例２：センス相補性スクリーニングのためのレトロウイルスベクターの構築 この実施例により、センス発現相補性スクリーニングベクターであるｐＭａＲ ＸＩＩ誘導体ベクターのｐＨｙｇｒｏ ＭａＲＸＩＩ−ＬＩを構築する方法提供 する（図３）。このベクターを構築は、上述したようにＭａＲＸＩＩベクターか ら始める。 このベクターを、一つのＮｈｅＩ部位のみが無傷で残るようにＮｈｅＩ部位に ライゲートされた合成ＮｏｔＩリンカーを挿入することによりさらに修飾する。 このＮｏｔＩリンカーの配列は以下のとおりである： 複製切除を考慮して、ＳＶ４０起点を含むＰＣＲ断片（以下）をＰｍｅＩ部位 （いずれかの方向で）中にライゲートした。この断片の配列は以下のとおりであ る： ＮｓｉＩ−ＮｓｉＩ断片がｐＺｅｒｏ（インビトロゲン）から欠失され、これ が、ｐＴａｃプロモータの５’末端およびｃｃｄＢ暗号配列の３’末端を認識し たプライマーによる、致死挿入物の増幅のためのテンプレートとして機能した。 これらのプライマーはそれぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位を加えた。この 断片を、プラスミドおよびＰＣＲ産生物両方のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩによる 消化後に挿入した。 これにより、塩基性センス発現ベクターが形成された。他のマーカーにより、 ＩＲＥＳ−ヒグロマイシン耐性カセット（例えば、ＩＲＥＳ−ピューロマイシン 耐性、ＩＲＥＳ−ネオマイシン耐性、ＩＲＥＳ−ブラスチシジン耐性等）を置き 換えても差し支えない。このベクターを用いて、10⁶粒子／ｍｌ（ＮＩＨ ３Ｔ ３細胞について測定した）を越える力価のウイルス個体群を産生した。これは、 元のｐＢａｂｅベクターから得られた力価と同等である。したがって、修飾は、 そのベクターのウイルスを産生する能力を損なっていない。さらに、ｐ．Ｈｙｇ ｒｏ．ＭａＲＸＩＩベクターから得られた発現レベルは、他のレトロウイルスベ クター（例えば、ｐＢａｂｅ）について得られたものとほぼ同一である。このベ クターは、高効率で、限定するものではないが、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＭｖｌＬｕ、 ＩＭＲ−９０、ＷＩ３８、Ｈｅｐ３Ｂ、正常なヒト哺乳類上皮細胞（一次培養） 、ＨＴ１０８０、ＨＳ５７８ｔを含む様々な組織培養細胞に感染する。このベク ターを用いて、復帰突然変異／切除を試験したところ、Ｃｒｅ−コード化ウイル スの感染後に、99％より多い細胞が、ＭａＲＸＩＩプロウイルスにより与えられ た表現型を失うという結果が得られた。以下に詳述する回収方法にしたがって、 １×10³より多い独立群体を、そのプロウイルスを含むゲノムＤＮＡ100μｇから 規定どおりに回収することができる（Ｔ抗原駆動増幅なしに）。 実施例３：アンチセンス相補性スクリーニングのためのレトロウイルスベクター の構築 この実施例により、アンチセンススクリーニングベクターであるＭａＲＸＩＩ ｇ系のｐＭａＲＸＩＩ誘導体ベクターを構築する方法が提供される。 ＭａＲＸＩＩｇ系の構築を、ＰａｃＩ部位が欠如していることを除いて、上述 したようにＭａＸＩＩベクターから開始する。ほとんどの場合にヒグロマイシン 耐性であるマーカーを形成した特有のＳａｌＩ部位に挿入する。 ＭａＲＸＩＩｇ ｐＭＡＲＸＩＩベクターを以下の工程により修飾した： 以下の配列の合成ポリリンカーを、ＭａＲＸＩＩのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ 部位の間に挿入した。 以下の配列の合成ＮｏｔＩリンカーを、一つのＮｈｅＩ部位のみが無傷で残さ れるようにＮｈｅＩ部位にライゲーションした。 ＣＭＶプロモータを以下のように修飾したｐＭＡＲＸＩＩベクター中に挿入し た。ＣＭＶプロモータ配列がｐｃＤＢＡ３（インビトロゲン）から増幅され、こ れが、以下のオリゴヌクレオチド： を用いた致死挿入物のプライマーにより増幅のためのテンプレートとして機能し た。 この増幅産生物をＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩで消化し、同様に消化したＭａＲ ＸＩＩ誘導体中に挿入した。次いで、このポリリンカーを、修飾したベクターの ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位の間へのＭａＲＸＩＩポリリンカーのＥｃｏＲＩ −ＸｈｏＩ断片の挿入により変更した。これにより、ＣＭＶプロモータが、３’ ＬＴＲポリアデニル化信号を用いてトランスクリプトを停止させるＧＳＥ発現を 駆動するＭａＲＸＩＩｇベクターが形成された（図３）。 ＭａＲＸＩＩｇ−ｄｃｃｍｖ 上記からのＭａＲＸＩＩ誘導体をＮｈｅＩで消化した。ＣＭＶプロモータ断片 を、ｐＨＭ．３−ＣＭＶの以下のオリゴヌクレオチド： による増幅により調製した。 このＣＭＶ断片をＮｈｅＩおよびＸｂａＩで消化し、ＭａＲＸＩＩ誘導体にラ イゲートした。その方向は、転写が、ＬＴＲプロモータからの転写と同一の方向 で行われるように選択した（図８）。 ＭａＲＸＩＩｇ−ＶＡ 上述（ＭａＲＺＩＩｇ部分）からのＭａＲＸＩＩ誘導体をＮｈｅＩで消化した 。アデノウイルスＶＡ ＲＮＡカセットを、修飾ＶＡ ＲＮＡ遺伝子（Gunnery ，1995 Mol Cell Biol 15，3697-3607(1995)を参照のこと）の以下のオリゴヌク レオチド： による増幅により調製した。 この断片をＮｈｅＩおよびＸｂａＩで消化し、消化したＭａＲＸＩＩ誘導体中 にライゲートした。方向は、転写がＬＴＲプロモータからの転写と同一の方向で 行われるように選択した（図９）。 三つの種類全てのアンチセンスベクターを用いて、ｐ．ｈｙｇｒｏ．ＭａＲＸ ＩＩと同等に機能する高力価のレトロウイルスを産生した。 実施例４：遺伝子捕捉のためのレトロウイルスベクターの構築 この実施例により、遺伝子捕捉ベクターであるｐＴＲＡＰのｐＭａＲＸＩＩ誘 導体ベクターを構築する方法が提供される（図６）。 ｐＭａＲＸＩＩベクターを以下の工程により修飾した： 合成ポリリンカーを、以下の配列： を有するＭａＲＸＩＩのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位の間に加えた。 第二の合成ポリリンカーをＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩ部位の間に加えた。この リンカーの上側の鎖は以下のとおりである： これは、ゲノムから切除するための制限部位、並びに塩基配列決定プライマー 結合部位およびｌａｃＯ回収要素を含んでいる。 ３’ＬＴＲおよびそれに伴う配列を、ＣｌａＩおよびＮｏｔＩを用いてｐＢａ ｂｅ−Ｐｕｒｏから除去した。これらを、ＣａｌＩおよびＮｏｔＩで消化したｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中に挿入した。部位指向性突然変異誘発を用いて 、３’ＬＴＲの断片を欠失した。これに、小さな挿入物が伴った。この欠失部を 囲い、したがって、定義する配列は以下のとおりである： この断片を、ＣｌａＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ中に再度挿入して 、ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏＳＩＮを形成した。このプラスミドは、特有のＮｈｅＩ およびＳａｐＩ制限部位を用いて遺伝子捕捉ベクター中に挿入された自己不活化 ＬＴＲのソースであった。 プラスミドｐＰＮＴ（Brμgarolas等，1995参照）を、ネオマイシン暗号配列 のヒグロマイシンの暗号配列（ｐＢａｂｅ−Ｈｔｇｒｏからの）による置換によ り修飾した。これによって、ＰＧＫプロモータおよびＰＧＫポリアデニル化信号 が隣接したヒグロマイシン耐性遺伝子が形成された。このカセットをＰＣＲによ り増幅し、ＰＧＫプロモータからの転写が、５’ＬＴＲからの転写と反対になる ように遺伝子捕捉ベクターのＣｌａＩ部位中に挿入した。 遺伝子捕捉カセットを３’ＬＴＲ内のＮｈｅＩ部位中に挿入した。この遺伝子 捕捉カセットは、その発現がＩＲＥＳ配列により促進される定量可能マーカーか らなる。ほとんどの場合、ＩＲＥＳ配列はＥＭＶＣから誘導されるが、他のソー スからのＩＲＥＳ配列も同様に適している。これまでのところ、ＩＲＥＳ結合ベ ータ−ガラクトシダーゼおよびＩＲＥＳ結合緑蛍光タンパク質マーカーが含まれ ている。 実施例５：多重生物表示ベクターのためのレトロウイルスベクターの構築 この実施例により、多重生物表示またはペプチド表示ベクター−−ｐＭＯＤｉ ｓｌおよびｐＭＯＤｉｓＩＩ、ｐＭａＲＸＩＩ誘導体ベクターを構築する方法が 提供される（図４および５）。 ｐＭＯＤｉｓベクターは、哺乳類系において機能的スクリーニングとファージ 表示手法を組み合わせることのできる二重目的のベクターとして機能するように 設計されている。これらは、糸状バクテリオファージの表面に任意ペプチド断片 を表示できるように設計されている。この表示されたペプチドは、既知のリガン ドまたはリガンドの複合混合物（例えば、固定細胞）との親和性手法によりスク リーニングすることができる。次いで、所望の基質と結合するファージのプール を用いて、哺乳類細胞を感染させるのに使用できるレトロウイルスを産生するこ とができる。次いで、ファージの大きなプールを、表現型を誘発する能力に関し て個々に試験することができる。ｐＭＯＤｉｓＩは、ファージの表面と哺乳類細 胞の表面に表示できるように設計されている。さらに、継代により、特定の宿主 株ｐＭＯＤｉｓＩを用いて、噛乳類細胞から表示されたペプチドの分泌を方向付 けることができる。ｐＭＯＤｉｓＩは細胞内表示ベクターである。両者は、ｐ． Ｈｙｇｒｏ．ＭａＲＸＩＩのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位の間のカセットの挿 入により（これらの部位を破壊する）形成される。個々のカセットの設計は以下 のとおりである。 ｐＭＯＤｉｓＩカセット ｐＭＯＤｉｓＩカセットは以下の要素を順番に含んでいる １． ベータ−グロブリン最小スプライス供与体部位 ２． ｐＴＡＣプロモータ ３． 合成リボソーム結合部位 ４． ｐｅｌＢ分泌信号 ５． ベータグロブリン最小スプライス受容体部位 ６． 哺乳類分泌信号（例えば、マウスＩｇカッパー鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域から の） ７． ミニボデイ61残基ペプチド表示ビヒクル配列（Tramontano，J．Mol．Reco gnit．7:9-24(1994)） ８． ＦＲＴリコンビナーゼ部位 ９． 37アミノ酸ＤＡＦ−１ ＧＰＩアンカー（Rice等，PNAS 89:5467-5471(19 92)参照） 10． ＦＲＴリコンビナーゼ部位 11． アンバー停止コドン 12． ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質、アミノ酸198-406のＣ末端 13． 非アンバー停止コドン。 アンバー抑制鎖において、ヘルパーファージの存在下では、ｇｅｎｅＩＩＩ融 合タンパク質が産生され、Ｍ１３型ファージの表面に表示される。このことによ り、ファージ表面に表示すべきミニボディの二つの拘束ループのうちの一つまた は両方にクローニングされた任意ペプチド配列を表示することができる。ＭＯＤ ｉｓＩゲノムレトロウイルスＲＮＡのパッケージング細胞中の発現により、ｐｒ ｅ−ｍＲＮＡスプライシングによる分泌配列および細菌プロモータを除去するこ とができ、哺乳類細胞中の翻訳がミニボディ配列の最初のメチオニンで開始され る。さらに、哺乳類細胞において、アンバーコドンが、任意ペプチド配列を表示 する膜結合細胞外ミニボディを形成するｇｅｎｅＩＩＩ配列の前に翻訳を終止さ せるであろう。このミニボディは、細菌のＦＬＰ発現株による継代により分泌タ ンパク質に転化させても差し支えない。これにより、ＦＲＴ部位で部位特異的組 換えおよび膜アンカー配列の欠失が行われる。 ｐＭＯＤｉｓＩＩカセット ｐＭＯＤｉｓＩＩカセットは以下の要素を順番に含んでいる １． ベータ−グロブリン最小スプライス供与体部位 ２． ｐＴＡＣプロモータ ３． 合成リボソーム結合部位 ４． ｐｅｌＢ分泌信号 ５． ベータグロブリン最小スプライス受容体部位 ６． 哺乳類分泌信号（例えば、マウスＩｇカッパー鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域から の） ７． チオレドキシンペプチド表示ビヒクル配列（Colas等，Nature 380:548-55 0（1996)） 11． アンバー停止コドン 12． ｇｅｎｅＩＩＩタンパク質、アミノ酸198-406のＣ末端 13． 非アンバー停止コドン。 このベクターは、細胞内ペプチド表示のために設計されている。ｐＭＯＤｉｓ Ｉに関しては、細菌プロモータおよび信号配列は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシ ングによるレトロウイルスの産生の際に除去されている。 両方のｐＭＯＤｉｓベクターを、哺乳類系におけるペプチド表示に関して直接 的に使用することもできる。 実施例６：ライブラリーの調製 以下の実施例は、本発明のライブラリーを構築する方法を提供するものである 。 ｐ．Ｈｙｇｒｏ．ＭａＲＸＩＩ−ＬＩ中のセンス発現ライブラリーの構築 ライブラリーベクターの調製は以下のとおりである。 ライブラリーベクターを調製するために、10-20μｇの二回ＣｓＣｌ精製した ベクターを37℃で90分間に亘り５Ｕ／μｇのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化す る。この消化物を１％のアガロースゲル（SeaKem GTG）上に直接装填し、切断さ れたベクターをＴＡＥ緩衝液中の電気泳動により分離する。ベクターバンドを、 長波長紫外線による視覚化の後に切除する。切断されたベクターを、透析管中の 電気泳動によりアガロースから溶出する。このベクターをさらに、フェノール／ クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製する。ライブラリー調製に適 したベクターは、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化された試験挿入物とのライゲーシ ョンの際に、バックグラウンドが10％未満で５×10⁶／0.5μｇより多い群体を産 生できると予測されている。ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡの合成を、ｍＲＮＡが＞10-20倍豊富な（全ＲＮＡと比較して）ＲＮ Ａ個体群から開始する。第一鎖ｃＤＮＡ合成を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆 転写酵素を用いた標準的な実験計画により実施する。第一鎖合成反応において５ −ｍｅ−ｄＣＴＰによりｄＣＴＰを置き換えて、新たに合成されたｃＤＮＡのＸ ｈｏｌによる切断を遮断する。第一鎖ｃＤＮＡプライマーは以下のとおりである ： 最初の９のヌクレオチドは、ＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）のヌクレアーゼ分 解を防ぐ修飾されたバックボーン（ホスホチオエート）である。このバックボー ンへの他の修飾（例えば、ｐ−エトキシ、ペプチド−核酸−−ＰＮＡ）も機能す る。合成は、飽和量のプライマーの存在下で、長いオリゴｄＴ尾の合成を防ぐた めに37℃で制御されたハイブリダイゼーション後に、逆転写酵素の添加により開 始する。 第二鎖合成は、ＲＮＡａｓｅ Ｈおよび大腸菌ＤＮＡリガーゼの存在下で大腸 菌ＤＮＡポリメラーゼＩにより実施する。第二鎖合成により形成された末端は、 Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの作用により平滑にされる。 二本鎖ｃＤＮＡは、Soaresにより記載されたように（Soares等，1994，Natl． Acad．Sci．91:9228-9232）、Ｂｉｏｇｅｌ Ａ５０Ｍ上のゲル濾過クロマトグ ラフィーによりサイズ分画する。 サイズ分画されたｃＤＮＡを市販のＥｃｏＲＩアダプター（Stratagene）にラ イゲーションし、次いで、ＸｈｏＩで処理して、ＥｃｏＲＩ（５’）およびＸｈ ｏＩ（３’）末端を有するｃＤＮＡ断片を形成する。ライゲーションされなかっ たアダプターは、セフアロースＣＬ４Ｂ（Pharmacia）上のクロマトグラフィー により除去する。アダプター担持ｃＤＮＡをポリヌクレオチドキナーゼを用いて ホスホリル化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、二日間までに亘り16℃で、Ｅ ｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ消化されたライブラリーベクターにライゲーションする（10 -20μｇの容量において、600ｎｇのベクターと250ｎｇの挿入物）。このライブ ラリーを、100の150ｍｍ ＬＢ＋アンピシリン＋ＩＰＴＧ平板上で平板培養され るＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１２Ｓ（Gibco-BRL）中にエレクトロポレーショ ンにより増幅させる。あるいは、そのライブラリーを、アンピシリンおよびＩＰ ＴＧを含む液体培地中で増幅して（非組換えクローンに対抗して選択して）もよ い。最小で、＞５×10⁶クローンのライブラリーが必要とされる。これは、我々 の実験計画を用いて日常的に行われている。ｃＤＮＡライブラリーの規格化 ｃＤＮＡライブラリーの規格化のために二つの実験計画を用いる。両方とも、 Soares等、1994により報告されたものに基づいている。この正確な方法を用いた が、ビオチニル化されたオリゴヌクレオチドを用いて工程の数を減少させること により、改良し、合理化したものを開発した。一本鎖ＤＮＡのレスキュー 大腸菌ＤＨ１２Ｓ中のレトロウイルスライブラリーを、100ｍｌの培養容積中 で ミッドログフェースまで増殖させ、次いで、10の感染多重度でヘルパーファージ （例えば、Ｍ１３Ｋ０７またはＶＣＳ−Ｍ１３＋）に感染させる。この培養物を 37℃で２−４時間に亘り保温し、その後、一本鎖ＤＮＡを標準的な実験計画を用 いて上澄みから精製する。一本鎖ライブラリーＤＮＡの精製 上述したように調製したＤＮＡは、一本鎖ライブラリーＤＮＡ、ヘルパーファ ージからのｓｓＤＮＡおよび培養物中の溶解細菌からの二本鎖ＤＮＡを含む混合 物である。このＤＮＡ混合物を、レトロウイルスＬＴＲ内の二本鎖ＤＮＡのみを 切断するＸｂａＩで最初に消化する。次いで、この混合物を、ｄＡＴＰ、ｄＧＴ Ｐ、ｄＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ｄＵＴＰの存在下でクレノーＤＮＡポリメラ ーゼで処理する。この処理により、各々の断片の両末端にビオチン残基を組み込 む。次いで、ＤＮＡ個体群を、ヘルパーファージに対して相補性である過剰の４ ０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドとなるまでアニールする。このオリゴヌクレオチ ドは、その５’末端でビオチン残基（Ｃ１６−ビオチン、Peninsμla Labs）を 担持している。組み込まれていないヌクレオチドおよび一本鎖のビオチニル化オ リゴヌクレオチドは、セファロースＣＬ−４Ｂ上でクロマトグラフィーにより除 去する。このビオチニル化ＤＮＡ断片およびオリゴ結合ヘルパーファージＤＮＡ は、磁気ストレプトアビジンビーズ（Dynal）とのインキュベーションにより個 体群から除去する。これにより、一本鎖ライブラリーから実質的になるｃＤＮＡ 個体群が産生される。ライブラリーの規格化 ｃＤＮＡライブラリーの規格化を再結合反応速度論により行う（Ｃ０ｔ）。精 製した一本鎖ＤＮＡを最初に共通のプライマーにアニールする。我々の実験計画 において、これはビオチニル化オリゴｄＴ１８プライマーであるが、Soaresの実 験計画においてはプライマーはビオチニル化されていない。このプライマーを、 ｄＮＴＰおよびジデオキシＮＴＰの混合物の存在下でクレノーポリメラーゼによ り延長し、我々のｃＤＮＡ個体群の３’末端に対して相補的な断片（サイズで平 均約200ｎｔ．）を合成する。再度、組み込まれなかったプライマーおよびヌク レオチドをＣＬ４Ｂ上のクロマトグラフィーにより除去する。精製したＤＮＡを エ タノール沈殿により濃縮する。 再結合反応速度論に関して、100-200ｎｇの精製した、部分的に二重のＤＮＡ を、2.5μｌのホルムアミド中に再懸濁させ、数分間に亘り80℃で加熱する。各 々のクローンの末端に存在するオリゴｄＴが伸張しているが、過剰の（約５μｇ ）のオリゴｄＴ２５を加えて、一本鎖ライブラリーを有する延長産生物（上述） の相互作用を遮断する。0.5μｌの0.5Ｍ ＮａＣｌを0.5μｌの100ｍＭ トリス −ＨＣｌ、100ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ8.0および0.5μｌの水とともに加える。こ の混合物を12-24時間に亘り42℃で保温し、5-20のＣ０ｔを産生する。 再アニールされた複式は、磁気ストレプトアビジンビーズとのインキュベーシ ョンにより混合物から除去された（結合緩衝液中の希釈後）豊富なクローンを示 す。非結合分画は、規格化ライブラリーを示し、特有の配列が豊富になっている 。この一本鎖ライブラリーを、沈殿により濃縮し、ＸｈｏＩクローニング部位の 下流にある過剰のベクタープライマー（ｌａｃＯプライマー）にアニールする。 このプライマーのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（等）による延長によって、エレク トロコンピテントＤＨ１２Ｓ細菌を形質転換して、規格化ライブラリーを産生す るのに用いられる部分的に二本鎖の環が形成される。 形質転換された個体群は、標準的な実験計画による高品質ＤＮＡの調製に使用 される。 レトロウイルスサブライブラリーの選択ゲノム内の所定の位置に対して特異的 所定のゲノム内の特異的座由来の配列を含むサブライブラリーを、上述したよ うに調製した一本鎖ＤＮＡから選択することができる。遺伝地図が作成されてい るが、まだ知られていない遺伝子を含む座特異的ＤＮＡ配列を、ＹＡＣまたはＢ ＡＣベクター上で形成された断片または分類された染色体として得ることができ る。これらの配列は、純粋な形態で得られるか、または標準的な方法により精製 される。精製されたＤＮＡを、四塩基の認識配列を有する制限酵素で消化する。 二本鎖オリゴヌクレオチドをこれらの断片の端部にライゲートする。過剰の二本 鎖オリゴヌクレオチドはカラムクロマトグラフィーにより除去し、断片は、二本 鎖オリゴヌクレオチドの一つの鎖に対応するビオチニル化プライマーとともにＰ ＣＲにより増幅する。これにより、特定のゲノム座由来のビオチニル化ＤＮＡ断 片の個体群が産生される。次いで、この個体群を、上述したように調製した一本 鎖レトロウイルスｃＤＮＡライブラリーに対して適切な競合ＤＮＡ配列（例えば 、酵母ゲノムＤＮＡ、高反復ヒトＤＮＡ）の存在下でアニールする。次いで、関 心のある領域由来のｃＤＮＡを、磁気ストレプトアビジンビーズを用いて精製し 、上述したように細菌中でレスキューすることができる。得られたレトロウイル スサブライブラリーは、元の分類された染色体、ＹＡＣまたはＢＡＣに含まれる 配列が非常に豊富である。このサブライブラリー内の配列の既知の表現型を生じ る能力を、適切な細胞種のパッケージングおよび感染後に試験することができる 。 一方向性アンチセンスライブラリーの調製 一方向性アンチセンスライブラリーを、センス指向ライブラリー（上述）に関 して記載したように実質的に調製する。例外は以下のとおりである： 第一鎖合成は、制限部位を組み込んだ修飾バックボーン任意プライマーを用い て行う。我々の目的のために、オリゴヌクレオチド： を用いる。 センス指向ライブラリーに関しては、最初の六つのヌクレオチドは、それらを ヌクレアーゼ耐性にする修飾バックボーンを含んでいる。 第二鎖合成の後に、ライブラリーＤＮＡを平滑末端とし、ＸｈｏＩリンカーに ライゲートする。これらは、以下の構造を有している： これらのリンカーをライゲートすると、ＰＣＲによるライブラリーの増幅が行 える。この場合、精製ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの両方で消化しなけ ればならない。あるいは、市販のＸｈｏＩアダプターをｃＤＮＡにライゲートす る。この場合、そのライブラリーは、ＰＣＲにより増幅することができず、リン カーにライゲートされたｃＤＮＡの消化は、ＥｃｏＲＩで行う。ｃＤＮＡのサイ ズの選択は、200-500ヌクレオチドの平均サイズを有する断片を単離することが 目的であるので、ゲル電気泳動により行う。次いで、この単離されたＤＮＡを上 述したようにＭａＲＸＩＩｇ（またはＩＩｇ−ＶＡもしくはＩＩｇ−ｄｃｃｍｖ ）中にライゲートする。規格化は、ライブラリー環の延長に使用するプライマー がベクター（ｌａｃＯ部位）とポリリンカーとの組合せ由来であり、それは、こ れらのクローンがオリゴｄＴ配列を有さないためであることを除いて、センス発 現ライブラリーに関して記載したように行う。これには、過剰の非ビオチニル化 プライマーを再度アニール（Ｃ０ｔ）する工程の最中に添加して、プライマー配 列によるハイブリダイゼーションを抑制する必要も生じた。 単遺伝子一方向性アンチセンスライブラリー 単遺伝子アンチセンスライブラリー（標的とされた機能ノックアウトに使用す るための）を、第一鎖合成のテンプレートがバクテリオファージＲＮＡポリメラ ーゼ（典型的に、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼ）を用いてクローンｃＤ ＮＡから産生したトランスクリプトであることを除いて、上述したように実質的 に調製する。第二のデビエーション(deviation)は、ライブラリーの種類が規格 化されていないものである。 実施例７：ウイルスの調製および感染並びに回収 以下の実施例は、ウイルスの調製およびそのウイルスによる細胞の感染、並び にプロウイルスの回収を実施するのに必要な実験計画を提供するものである。 パッケージング細胞の形質移入およびウイルスによる感染 １． ６×10⁶パッケージング細胞／10ｃｍ平板を平板培養する。37℃で一晩放 置する。細胞は約70-80％融合性であるべきである。 ２． 培地（10ｍｌ）を取り替える。37℃で1-4時間放置する。 ３． 二つのエッペンドルフ管(eppendorf tube)中での各々の形質移入のために ２ｍｌのＤＮＡｐｐｔ溶液を調製する。 15μｇのＤＮＡ＋Ｘμｌの水＝450μｌの合計容積を50μｌの2.5Ｍ ＣａＣｌ₂ ／0.01Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ5.5）に加える。500μｌの２×ＢＢＳ（50ｍＭの ＢＥＳ、280ｍＭのＮａＣｌ、1.5ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ6.95）を、ＤＮＡ／ ＣａＣｌ₂混合物中で穏やかに泡立てながらＤＮＡ／ＣａＣｌ₂混合物に滴下しな が ら混合して加え、パスチャーピペット(pasture pipette)でＤＮＡｐｐｔ溶液を 、平板（２ｍｌのＤＮＡ溶液／10ｃｍ平板）を穏やかに渦巻きながら細胞に直ち に滴下しながら加える。 ４． 37℃で一晩放置する。 ５． 培地を取り替える。（オプション：この段階で、デキソアメサソン(dexoa methasone)および酪酸ナトリウムを、それぞれ、１μＭおよび500μＭの最終濃 度で培地に加えても差し支えない。これにより、ウイルス力価が2-10倍増加する 。） ６． 32℃で48時間保温する。 ７． ウイルス上澄みを採集し、これを0.45ｕＭのシリンジ型フィルタ装置に通 して濾過する。（必要に応じて、このウイルス上澄みを５分間に亘り１Ｋで回転 させることにより、パッケージング細胞を除去しても差し支えない。） ８． ウイルス上澄みを新鮮な増殖培地で希釈し、８μｇ／ｍｌの最終濃度まで ポリブレン(polybrene)を加える。この混合物を細胞に加える。 ９． 室温で１時間に亘り1.8Ｋで平板を回転させる。 10． 32℃で一晩保温する。 この時点で、多重感染周期を、産生体細胞上の培地を取り替え、工程７−10を ６時間の間隔で繰り返すことにより行うことができる。 11． 培地を取り替える。37℃で保温する。 12． 細胞を分析する、または２日後に薬物選択を適用する。 ウイルス切除および回収ＣｒｅおよびＣｒｅＴウイルスの構造 ＬＴＲプロモータからのＣｒｅリコンビナーゼの発現を指示するウイルスを用 いて、表現型の復帰突然変異のためにウイルスプラスミドを切除する。このウイ ルスは、ｐＭＭ２３からのＣｒｅ配列（Qin等，1994，PNAS 91:1706-1710を参照 ）を切除し、その断片をｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ中に挿入することにより調製した 。他のマーカーを有する誘導体も構築した。複製切除に関して、ＥＭＣＶ（ｐＣ ＩＴＥ由来の）からのＩＲＥＳ配列に融合した大型Ｔ抗原（ｐＡＴ．−ｔから（ 小型ｔではなく大型Ｔをコード化できるＴ抗原クローン））の暗号配列からなる カセットをＣｒｅ配列の下流に挿入した。生体内切除 細胞が10ｃｍで40-80％の融合性にある場合、８ｍｌのウイルス（上述したよ うに産生した）＋２ｍｌの培地＋10μｌ ８ｍｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、 ＭａＲＸウイルス含有細胞をｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−Ｃｒｅウイルスに感染させ る（上述したように）。 復帰突然変異のために、細胞を一晩32℃に保持し、次いで、37℃に移した。次 いで、これらの細胞を、選択培地（例えば、ピューロマイシンを含有する）内で のインキュベーションによりＣｒｅウイルスの存在に関して選択する。一回また は二回の継代後、表現型の損失に関して、それら細胞を分析してもよい。 ウイルスプラスミドを回収するための生体内切除のために、細胞をＣｒｅまた はＣｒｅ−Ｔウイルスのいずれかに感染させ、次いで、32℃で一晩保温する。続 いて、これらの細胞を37℃に移して、さらに6-24時間に亘り維持する。ＤＮＡを 調製し、プロウイルスプラスミドを以下に記載する方法のうちの一つにより回収 する。親和性回収のためのＤＮＡの調製 親和性精製によりプロウイルスを回収するために、融合性の10ｃｍの皿を以下 に記載するように溶解させる。生体内で切除されたプロウイルスに関して、細胞 を上述したように処理する。精製後にプロウイルスを回収するために、80-100％ の融合性の感染細胞を使用する。 10ｍＭのトリス、ｐＨ8.0、150ｍＭのＮａＣｌ、10ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳ ＤＳ、500μｇ／ｍｌのｐｒｏｔＫ、120μｇ／ｍｌのＲＮｅｓｅＡ中の溶解緩衝 液。 １． 細胞を10ｍｌの溶解緩衝液／10ｃｍの皿中に溶解させる。 ２． 55℃で３時間保温する。 ３． 等容積のフェノール／クロロホルムを加え、10分間回転させ、分離する。 ４． 1/5容積の８Ｍ Ｋａｃおよび１容積のクロロホルムを加え、10分間回転 させ、分離する。 ５． ２容積のエタノールを加え、ガラスロッド上に巻き付ける。 ６． 70％のエタノール中で３回ゲノム洗浄する。 ７． ペレットを空気乾燥させ、ＴＥ中に再懸濁させる。ｌａｃＩ親和性ビーズの調製 親和性精製のためのＬａｃＩビーズを二つの方法のうちの一つで調製した。ｌ ａｃＩ−タンパク質Ａ融合物を担持する磁気ビーズを調製する方法が公表されて いる。これらを、Landerberg等，Genet．Anal．Tech．Appl．7:47-52(1990)によ り記載されたように正確に調製した。ｌａｃＩビーズ上のＤＮＡの回収 上述したように調製したＬａｃＩビーズ上でプロウイルスＤＮＡを回収するこ とができる。生体内で切除されたプロウイルスを回収するために、または生体外 での切除のためのプロウイルスを回収するために、ＤＮＡ試料をわずかに剪断し て、粘度を減少させなければならない。これは、短時間の音波破砕、狭いゲージ 針を繰り返し通過させることにより、または噴霧化により行うことができる。 １． 1-50μｇのＤＮＡを58μｇのｄｄＨ２Ｏまで希釈する。 ２． 15μｌの５×結合緩衝液を加える。 ３． 磁気コンセントレータ上で60μｌのｌａｃＩビーズをペレット化する。 ４． 上澄みを除去し、ＤＮＡ溶液中で再懸濁させる。 ５． 37℃で60分間に亘り回転させる。 ６． ビーズをペレット化し、250μｌの１×結合緩衝液で一回洗浄する。 ７． 75μｌのＩＰＴＧ溶出緩衝液に５μｌの25ｍｇ／ｍｌのＩＰＴＧを加えた 中に再懸濁させる。 ８． 37℃で30分間に亘り回転させる。 ９． 30μｇのグリコーゲンを加え、エタノール沈殿させる。 生体内で切除したプロウイルスに関して、回収したＤＮＡをＤＨ１２Ｓ／ｔｒ ｆＡ中にエレクトロポレーションさせる。 生体外の切除／再環状化に関して： 生体外の切除／再環状化は、いくつかの方法のうちの一つで行う。ＤＮＡを、 製造業者の指示にしたがって、市販のＣｒｅリコンビナーゼで処理することがで きる。次いで、再環状化したプラスミドを用いて、エレクトロポレーションによ り大腸菌を形質転換することができる。あるいは、ほとんどのＭａＲＸ由来ベク ターは、ｌｏｘＰ部位に隣接した特有のレア切断(rare-cutting)制限酵素部位を 有している。これらの酵素（例えば、ｐ．Ｈｙｇｒｏ．ＭａＲＸ ＩＩ中のＮｏ ｔＩ）は、プロウイルスＤＮＡの消化、それに続くＴ４ ＤＮＡリガーゼを用い た再環状化に使用して、細菌中で伝搬でき、続いてのレトロウイルスの産生に使 用できるプラスミドを形成することができる。別の回収方法：Ｈｉｒｔ抽出 生体内切除の後に、プロウイルスプラスミドをＨｉｒｔ方法（Hirt,B.，Ｊ．M ol．Biol．26:365-369(1967)）により回収することができる。この方法は、一種 類のクローンの回収に使用することができるが、比較的非効率的であり、したが って、豊富なサブライブラリーを高効率で回収するのには使用することができな い。 １． 生体内切除後に、10ｍｌのＰＢＳで細胞を二回洗浄する。 ２． ３ｍｌの0.6％ ＳＤＳ／10ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ7.5)／10ｃｍ平板を加 える。15分間に亘り室温でインキュベーションして、細胞を溶解させる。 ３． 溶解産物を、スクレーパおよび端部が広く切断された（ゲノムＤＮＡの剪 断を避けるために）ブルーチップ(blue tip)を備えた15ｍｌの管に移す。 ４． 750μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加える。穏やかに管を反転させることにより 混合する。 ５． ８時間以上に亘り４℃でインキュベーションする。 ６． ４℃のＪＡ２０中で20分間に亘り15Ｋで回転させ、上澄みを保持する。 ７． １容積のフェノール／クロロホルム、次いでクロロホルムで抽出する。 ８． 20μｇのグリコーゲンおよび2.5容積のＥｔＯＨを加えることにより、Ｄ ＮＡをｐｐｔする。 ９． 200μｌの水中でＤＮＡを溶解させる。１容積のフェノール／クロロホル ム、次いでクロロホルムで抽出する。 10． 10μｌの水中でＤＮＡを溶解させる。 11． ＤＨ１２Ｓ／ｔｒｆＡ中にＤＮＡをエレクトロポレーションさせる（以下 参照）。 ５μｌの回収したＤＮＡ＋50μｌの細胞を氷上に配置する。 0.1ｃｍのキュベット中で1.8ｋＶ×25ｕＦＤ×200Ω（BioRAD） １ｍｌの２ＸＹＴを加える。 37℃で１時間回収する。 200μｌをＬＢ（1/2ＮａＣｌ、ｐＨ7.5）−ゼオシン（25μｇ／ｍｌ）上 で平板培養する。 37℃で一晩放置する。 この方法により、一般的に、数百のプロウイルス群体が産生される。 プロウイルス宿主株：ＤＨ１２Ｓ／ｔｒｆＡ ＲＫ２複製起点（ｏｒｉＶ）には、機能に関する複製タンパク質であるｔｒｆ Ａが必要である。そうでなければ、これは、沈黙ＤＮＡ要素であり、したがって 、同一のプラスミド上のｐＵＣ複製起点と共存できる。切除されたプロウイルス は、複製に関してＲＫ２起点に依存し、したがって、このプラスミドの増殖に関 して、ｔｒｆＡがトランスに提供されなければならない。したがって、創始株と してＤＨ１２Ｓを用いて、ｔｒｆＡ−ヘルパー株を構築した。ＤＨ１２Ｓのいく つかの特性により、ヘルパー株の構築に関する選択が誘発された。第一に、それ は、メチル化ＤＮＡの分解を生じる制限系が欠損している。第二に、それは、ｒ ｅｃＡ、ｒｅｃＢＣであり、したがって、より安定にプラスミドを維持する。第 三に、それは、一本鎖ＤＮＡの産生に使用することができる。最後に、ＤＨ１２ Ｓは、高効率エレクトロコンピテント細胞を生じさせる。 ｏｒｉＶ−ベースプラスミドは一般的に低コピー数に維持されるので、複製タ ンパク質のコピーアップ(copy-up)突然変異体（trrA-267L;Blasina，1996．プラ スミドＲＫ２複製開始タンパク質のコピーアップ突然変異体は、ＲＫ２複製起点 の結合に欠損している。Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:3559-3564(1996)）を 株の調製に使用した。この突然変異体を最初にｐＪＥＨ１１８（Fabry等，1988 ，FES Letters 237:213-217）中にクローニングして、ｐＴａｃプロモータの制 御下に配置した。これにより、一つで染色体中に組み込まれるｔｒｆＡとして生 じる発現レベルの損失を相殺するのに役立つ誘発性高レベル発現が行われる。次 いで、カナマイシン耐性マーカーをｔｒｆＡカセットの下流にクローニングした 。 この全カセットを切除し、生体外でパッケージングされ、ＤＨ１２Ｓ溶原の調製 使用したラムダファージベクター（ラムダ−ＮＭ５４０）中に挿入した。いくつ かの溶原を、ｏｒｉＶプラスミドを増殖させる能力に関して試験し、一つをＤＨ １２Ｓ／ｔｒｆＡとして選択した。 実施例８：パッケージング細胞系統の産生 ウイルス機能を提供するカセットの形成 パッケージング細胞系統により、トランスに三つのウイルス機能を提供する。 これらは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖである。一般的に、三つ全てを一つのカ セットまたはｇａｇ／ｐｏｌにより提供し、ｅｎｖ機能は二つのカセットに分け られる。トランスでウイルス機能を提供できる直接的に選択可能なカセットを形 成するために、ウイルスタンパク質をコード化する遺伝子を、欠損プロウイルス （psi^-e;Mann等，Cell 33:153-9(1983)）からなるヘルパープラスミドからｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔに二つのフォーマットで移した。 一重遺伝子ヘルパーカセット 環境栄養性一重遺伝子ヘルパーカセットを産生するために、ＸｈｏＩ−Ｃｌａ Ｉ断片をｐｓｉ^-ｅから精製し、同様に消化したｐＢＳ−ＳＫ＋に移して、ｐＢ Ｓ＋ｐｓｉｘｃを形成した。エンベロープ遺伝子の端部を、エンベロープタンパ ク質のＣｌａＩ部位から停止コドンまでの配列に亘る約100ntのＰＣＲ産生物を 加えることにより再形成した。この方法により、ヘルパーカセットの３’末端に 独特なＥｃｏＲＩ部位が加えられた。このＰＣＲ産生物を、両方のＤＮＡをＥｃ ｏＲＩおよびＣｌａＩで消化した後に、ｐＢＳ−ｐｓｉＸＣ中に挿入した。ヘル パーカセットの５’末端は、パッケージング信号の５’末端のレトロウイルスス プライス供与体部位からＭｏＭｕＬｖの独特なＸｈｏＩ部位までに亘るＰＣＲ産 生物を挿入することにより形成した。このＰＣＲ産生物を、独特のＳｓｐＩ部位 がカセットの５’末端に存在するような方法でＸｈｏＩ消化したｐＢＳ−ｐｓｉ ＸＥ中に挿入した。これにより、ｐＢＳ−ｐｓｉＣＯＭＰが形成された。このヘ ルパーカセットは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコード化できるが、複製コン ピテントウイルスを産生するのに必要なｔＲＮＡプライマー結合配列およびＬＴ Ｒ要素が欠如していた。ウイルス機能に関して直接選択するために、エンベロー プ 配列の端部から下流に二つの縦列ＩＲＥＳ結合マーカーを挿入することにより、 三シストロン性伝令ＲＮＡカセットを形成した。この場合、このカセットは、ヒ グロマイシン耐性遺伝子に結合した別のＥＭＣＶ ＩＲＥＳに結合したヒトＣＤ ８タンパク質（細胞表面マーカー）に結合したＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含んでいた 。これをｐＢＳ−ｐｓｉＣＯＭＰ中のＥｃｏＲＩからＮｏｔＩに挿入して、ｐＢ Ｓ−ｐｓｉＣＤ８Ｈを形成した。このプラスミドからのカセットを、ＳｓｐＩお よびＮｏｔＩによる切除後にどのような発現ビヒクル中に挿入しても差し支えな い。 二つのカセット上のヘルパー機能の分離は、ｐＢＳ−ｐｓｉＣＯＭＰの欠失を 形成することにより行った。ｅｎｖ機能をＸｈｏＩおよびＸｂａＩでのｐＢＳ− ｐｓｉＸＥの消化により単離し、その後、両方の制限部位を再形成したリンカー 配列を挿入した。ｐＢＳ−ｐｓｉＣＯＭＰからのｅｎｖの除去は、ＨｐａＩおよ びＥｃｏＲＩでの消化により行い、その後、ｐｏｌの３’末端を修復し、Ｈｐａ ＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位両方を再形成した合成断片とライゲーションした。 一つのカセット両栄養性エンベロープ（Ott,D.E.等，J．Virol．64，757-766(19 90)）をＰＣＲにより形成し、それに続いて、ｐＢＳ中に挿入した。これらのプ ラスミドの各々を用いて、三シストロン性ヘルパーカセットを産生した。各々の エンベローププラスミドは、上述したＣＤ８−ヒグロマイシンカセットを受け入 れた。ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドは、二つのカセットのいずれかを受け入れた。 一方のカセットは、ヒスチジノール耐性に関する遺伝子に結合したＥＭＣＶ Ｉ ＲＥＳに結合した細胞質領域欠損ＣＤ４（別の細胞表面マーカー）をコード化す る遺伝子に結合したＥＭＣＶ ＩＲＥＳからなった。第二のカセットは、ピュー ロマイシン耐性をコード化する遺伝子に結合したＦＤＶ ＩＲＥＳおよび緑蛍光 タンパク質をコード化する遺伝子に結合したＥＭＣＶ ＩＲＥＳからなった。 これら三シストロン性カセットの全てを同様に用いてパッケージング機能を細 胞中に導入するので、一重遺伝子ヘルパーカセットの導入について記載する。分 離されたヘルパー機能の導入には、単に追加の定量的および定性的選択工程が必 要である。 発現ビヒクル 上述したヘルパーカセットは、哺乳類細胞中の発現を促進させる配列に機能的 に結合されていなければならない。次いで、これらの構築物を細胞系統中に導入 して、機能的パッケージング系を形成することができる。一般的に、二つのオプ ションが利用できる。一つのヘルパーカセットを、ＳＶ４０ Ｔ抗原の存在下で 複製できるプラスミド中で、強力なプロモータ（例えば、ＣＭＶ）と機能的結合 して、クローニングすることができる。これにより、プラスミドをエピソーム的 に増幅できる。ある場合には、この後に、ゲノム中への高コピー組込みが行われ る。そのようなプラスミドをＳＶ４０ Ｔ抗原の不在下で用いて、いくぶん低い コピー数を達成することもできる。この目的のために、一つのヘルパーカセット がｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）中に挿入されている。あるいは、ヘルパーカ セットを、安定なエピソームとして複製するベクター上で強力プロモータに関連 して配置することもできる。第一のものは、エプスタイン−バーウイルスに基づ くものである。ＥＢＶベースのベクターは、機能のためにＥＢＮＡを必要とする ｏｒｉＰを介して複製する。特に有用なベクターがインビトロゲン（ｐＣＥＰ− ４）により導入されている。このベクターはヒグロマイシン耐性カセットを除去 するように修飾されており、ヘルパーカセットはＣＭＶプロモータの下流に挿入 されている。我々が選択した宿主細胞系統中への形質移入の際に、このベクター は、＞20／細胞の安定なコピー数を達成することができる。最後の選択は、ウシ 乳頭腫ウイルスに基づく一連のベクターである。残念ながら、これらのベクター は我々の選択した宿主細胞中では複製せず、したがって、ウイルス機能が我々の 選択した種類の細胞中で機能する構成性プロモータから発現される修飾ＢＰＶベ クターを得なければならない。これらの修飾ＢＰＶベクターは、100-1000／細胞 の範囲のコピー数を達成することができる。 パッケージング細胞系統を産生するための細胞 パッケージング細胞系統を産生するために、ヒト２９３細胞を選択した。これ らの細胞はＳＶ４０ベースの系およびＥＢＶベースの系からの複製を支持するこ とができる。これらはまた、高コピー数の修飾ＢＰＶ系について使用することも できる。特に、ヒト２９３細胞（２９３Ｔ）のサブ系統は、非常に高い形質移入 効率（これは、高複雑度のライブラリーの産生にとって重要である）を示し、Ｓ Ｖ４０ベースのベクターの条件的複製を支持できる温度感受性ＳＶ４０大型Ｔ抗 原を含んでいる。 パッケージング細胞クローンの選択 ヒト２９３Ｔ細胞は、上述したベクター中の二つの別々のヘルパープラスミド または一つのヘルパープラスミドいずれかにより形質移入される。形質移入され た細胞は、標準的な濃度のヒグロマイシン（75μｇ／ｍｌ）またはヒグロマイシ ンとピューロマイシン（1.5μｇ／ｍｌ）を含有する選択培地中に配置する。安 定に形質移入されたクローンをうまく選択した後、高発現細胞を、細胞表面マー カーに対して方向付けられた抗体で染色した後のＦＡＣＳ分析により、またはｇ ｆｐの直接検出により選択する。最高の発現レベルを示すクローンの５％を回収 し、選択培地中で再度平板培養する。細胞を、50％より高い濃度の各々の薬物を 含有する培地に通過させ、最高のマーカー発現を示す生存細胞の５％を、この方 法の別の周期に通過させる。各々の周期で、作成された逆転写酵素および形質移 入のレベルを評価する。何回かの周期の後、次の周期が逆転社酵素の発現を増加 できなかったとき、または高薬物濃度のために形質移入レベルが減少したときに 、一つの細胞クローンを選択し、高力価ウイルスを産生する能力について分析す る。ウイルスヘルパーカセットに関する直接選択を強化する能力により、最も効 率的なパッケージング細胞を選択できるだけでなく、高効率のパッケージング機 能を維持する連続選択を考慮にいれるべきである。 最初の設定中に、使用者は、ｌａｃＺまたは細胞表面タンパク質のような容易 にアッセイできるマーカーを発現するレトロウイルスベクターを用いることによ り系を最適化することが推奨される。最適化の最中に、産生体細胞の形質移入頻 度および標的細胞の試験感染率を調査すべきである。βｇａｌ−ベースの系等を 用いた形質移入および感染頻度の試験は、βｇａｌ活性に関するＦＡＣＳ染色ま たはβｇａｌ染色により容易に測定することができる。使用者が形質移入条件お よび感染率について満足しているときだけ、容易にアッセイできないマーカーを 有するベクターを使用すべきである。その実験計画を拡大することもできる。 さらに、ある場合には、細胞の最初の平板培養が、高レトロウイルス力価を満 足に得る上で最も重要な段階であるかもしれない。それら細胞は、過度に凝集し ていず、正確な密度にあることが非常に重要である。ＮＩＨ３Ｔ３由来細胞系統 とは異なり、２９３由来パッケージング細胞系統等は、良好に拡散した単層を容 易には形成しない。その代わりに、それらはコンフルエンス(confluence)の前に 凝集する傾向にあり、そして、その凝集が過度な場合には、細胞は、形質移入後 から48-72時間の期間には決してコンフルエンスには到達しない。凝集を避ける ために、細胞が平板培養の前に非常に健康的であることが必須である。それら細 胞が過度に凝集している場合、形質移入のための平板培養の前に、いくつかの継 代のためにそれらを１：２または１：３に分割することが必要であるかもしれな い。さらに、細胞は、マウス繊維芽細胞よりもかなり粘着性が弱く、洗浄し、培 地を取り替えるときに非常に優しく取り扱うべきである。コンシステンシーに関 しては、その分割を評価するよりもむしろ、細胞を計数することが重要である。 上記細胞数は、ＭＦＧ−ｌａｃＺに関して最適化されている。他の挿入物の発現 は、細胞の増殖に対して有害であるかもしれない。この影響は、パッケージング 細胞系統が形質移入後48-72時間後にコンフルエンスに到達できないことにより 示されるかもしれない。そうなれば、形質移入の前により多くの細胞を平板培養 する必要があるかもしれない。 さらに、培地にクロロキンを添加することにより、レトロウイルス力価を増大 させられるように思われる。この影響はおそらく、クロロキンのリソソーム中和 活性によるものである。多くの場合には、クロロキン処理の長さが約12時間を越 えないことが重要である。クロロキン処理の期間が長くなると、レトロウイルス 力価を減少させる、細胞への毒性効果が生じてしまう。異なる構築物の相対的力 価を比較する場合のような、最大のレトロウイルスカ価を達成する必要ない場合 には、クロロキン処理を省くことが好ましいかもしれない。クロロキンを使用し ない場合には、形質移入の前に培地を取り替える必要はない。 さらに典型的に実施の形態を説明するために、レトロウイルスの上澄みが収穫 の準備ができたときに、その上澄みを静かに除去し、45μＭのフィルタに通して 濾過するかまたは４℃、500×ｇで５分間に亘り遠心分離して、生存している細 胞を除去する。レトロウイルス上澄みを数時間以内に使用すべき場合には、使用 するまで、氷上に保持する。 実施例９：ｐＥＨＲＥベースのパッケージング細胞系統 上述したセクション１３に示した実施例に記載した技術を用いて、ｐＥＨＲＥ 群のベクターを用いて、複製欠損レトロウイルスベクターによる一時的または安 定いずれかの形質移入後にレトロウイルスを産生するためのパッケージング細胞 系統をうまく産生した。 特に、ここではＬｉｎＸ ＩおよびＬｉｎＸ ＩＩと称される二つの環境栄養 性２９３Ｔベースのパッケージング系統を産生した。 ＬｉｎＸ ＩＩにおいては、ヘルパー機能が、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを コード化する一つの発現カセットを含むｐＥＨＲＥベクター上に提供されている 。ＬｉｎＸ ＩＩにおいては、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ機能が、別々のｐＥ ＨＲＥベクター上に提供されている。両方の細胞系統が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で測 定したような10⁶ｐｆｕ／ｍｌの力価を有するウイルスを産生する。この点に関 して、ＬｉｎＸ ＩおよびＬｉｎＸ ＩＩは、利用できる最良のパッケージング 細胞に相当する。しかしながら、ＬｉｎＸ ＩおよびＬｉｎＸ ＩＩには、追加 の特異で有益な特性が二つある。 第一に、パッケージング細胞系統が誘導される薬物選択性プールは、パッケー ジング細胞系統として最終的に選択されたクローンにほぼ相当する効率でウイル スをパッケージングすることができた。これは、形質移入プールの効率が、数百 の細胞クローンの分析から最後に導かれる、細胞系統の効率より２−３ｌｏｇ低 いという、標準的な方法により構築された細胞系統とは対照的である。したがっ て、ｐＥＨＲＥ多重コピーエピソーム系のウイルスヘルパー機能を提供する能力 により、特定の目的のパッケージング系統（例えば、交代または突然変異体ｇａ ｇまたはエンベロープタンパク質を有する細胞系統）の迅速な構築にとって、そ の系が理想的となる。 ＬｉｎＸ ＩおよびＬｉｎＸ ＩＩ細胞系統の第二の特異な特性は、その細胞 が、高力価ウイルスを産生する著しく安定な能力を示すことである。標準的なパ ッケージング細胞系統（例えば、Ｂｏｓｃ）の高力価ウイルスまを産生する能力 は、非常に急速に崩壊する。例えば、ウイルス力価は、一ヶ月当たりで１ｌｏｇ 以上減少することがある。それに比べて、ＬｉｎＸ細胞は、ウイルス力価が検出 可能なほど損失せずに、培地中で六ヶ月以上も維持された。 この安定性は、二つの要因の組合せから生じたものであろう。第一に、ｐＥＨ ＲＥエピソームは、構造体およびコピー数の両方において非常に安定である。第 二に、ウイルスヘルパー機能が、ヘルパー機能および薬物耐性マーカーを含む多 シストロン性ｍＲＮＡの一つの断片としてこれらのエピソーム上に存在する。し たがって、薬物マーカーを選択することにより、ヘルパー機能をコード化するｍ ＲＮＡを直接的に選択することができる。 実施例１０：機能的ノックアウトの標的アンチセンス発現誘導 ＭａＲＸＩＩｇベクター中の単遺伝子アンチセンスライブラリーを用いて、個 々の遺伝子の標的とする機能的ノックアウトを形成することができる。これは、 遺伝子機能の損失に関する間接的な選択を行うことによるノックアウトの表現型 の以前の知識に拘わらず行うことができる。これは、特定の遺伝子の発現レベル を報告するように機能する定量可能マーカーを形成することにより行われる。こ れは、本出願の明細書に記載されたような様々な方法のいずれにより形成しても 差し支えない。最も単純なものは融合タンパク質を形成することであり、これが 実施例に示されている。 関心のあるタンパク質の暗号配列をレポーター、この場合には、緑蛍光タンパ ク質に融合させる。この融合物は、５’および３’の非翻訳配列が構築物中に存 在するように調製すべきである。非翻訳配列を含む全体のカセットを、構成性発 現を促進させるレトロウイルスベクター内に配置する。融合タンパク質の発現が 有害である場合には、誘導性ベクターを用いても差し支えない。このベクターを 、ノックアウト標的が誘導される種とは異なる種の細胞中に挿入する。例えば、 ミンク細胞は、ヒトタンパク質にとって適当なスクリーニング宿主となる。均一 な蛍光を示す細胞の個体群を単細胞クローニングまたはＦＡＣＳにより選択する 。単遺伝子の一方向性アンチセンスライブラリーを、ＭａＲＸＩＩｇベクターの うちの一つにおいて標的遺伝子（上述）をコード化するトランスクリプトから構 築する。このライブラリーを用いて、蛍光融合を発現する細胞を感染させる。Ｆ ＡＣＳ選別により、もはや融合を発現しない細胞を同定する。これらは、単細胞 としてクローニングされる。これらのうちのあるサブセットは、蛍光融合タンパ ク質の発現を効果的に阻害するアンチセンストランスクリプトを発現し、またあ るサブセットは単に、導入されたアンチセンス（復帰突然変異体）とは独立して 、融合タンパク質発現を失う。効果的なアンチセンスは、Ｃｒｅリコンビナーゼ の蛍光タンパク質発現をレスキューする能力により、復帰突然変異体から区別す ることができる。蛍光がＣｒｅによりレスキューされる細胞クローンは、いかな る所望の細胞系統において機能的ノックアウトを形成するのに使用できるアンチ センス断片を担持するウイルスを回収するソースとして機能する。この方法は定 量的および定性的であることに注目すべきである。ＦＡＣＳ選別により、最も効 果的な断片を、蛍光を最大程度に定量的に減少させられるものとして同定するこ とができる。さらに、ＭａｒｘＩＩｇおよびＭＲＸＩＩｇ−ｄｃｃｍｖ中のＣＭ Ｖプロモータを誘導性プロモータ（自己不活化ＬＴＲとともに）と置き換えるこ とにより、条件的ノックアウトを形成することができる。 実施例１１：テロメラーゼ酵素の活性化 テロメラーゼは、腫瘍形成に関してほとんど万能なマーカーである。しかしな がら、正常な細胞中では活性がない。活性は、ＨＰＶ−１６からのＥ６タンパク 質の導入により、正常な細胞のサブセット（例えば、上皮細胞およびケラチノサ イト）中で誘発させることができる。この誘発は、Ｅ６のｐ５３の分解を支持す る能力とは独立している。腫瘍内のテロメラーゼの誘発を導く過程を調査するた めに、正常なヒト哺乳類上皮細胞（ＨＭＥＣ）中でテロメラーゼ活性を誘発でき る遺伝子に関する生体外スクリーンを考案した。 各々100-100クローン（ＭａＲＸＩＩｇベクター群においてセンス方向または アンチセンス方向のいずれか）を含むｃＤＮＡのプールをＨＭＥＣ細胞中に導入 する。これらを、ｃＤＮＡの発現に関して選択し、次いで、テロメラーゼ活性の アッセイのための溶解産物を調製するのに使用する。20,000テロメラーゼ陰性細 胞の中から二つのテロメラーゼ陽性細胞を検出できる高感度テロメラーゼアッセ イを用いて、細胞溶解産物を試験する。感染の際にＨＭＥＣ細胞中でテロメラー ゼ活性を誘発するそれらのプールをより小さなプールにさらに分割する。サブプ ールを、テロメラーゼ活性についてその後アッセイするＨＭＥＣ細胞の感染に再 度使用する。この方法の連続周期により、テロメラーゼ酵素の誘発体として機能 す る個々のクローンを同定することができる。 そのようなクローンは、その酵素の成分の発現または酵素自体の直接的な調製 因子を示す。あるいは、そのようなクローンは、細胞死亡率の調節因子として機 能する。そのようなクローンの発現により誘発される変化は、細胞挙動における より全体的な変化のたった一つの態様してテロメラーゼ酵素を誘発する。 実施例１２：分泌スクリーニング 本発明のレトロウイルスおよびｐＥＨＲＥベクターを分泌捕捉構築物とともに 用いて、分泌タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を同定することができ る。そのような同定実験計画は、様々な目的を満たすことができる。例えば、分 泌タンパク質はしばしば治療として有用であるので、それらの同定の後に、新た な治療剤を同定する方法の一部として追加の生物学的スクリーニングを行うこと ができる。さらに、例えば、癌のような疾患において特異的に発現される分泌タ ンパク質の同定は、その疾患の存在を診断する都合のよい血液担持(borne)マー カーとして機能できる。さらに、分泌タンパク質の同定は、非常に稀な配列また は出来事を検出できるかもしれないサブ分画として機能でき、そのような配列ま たは出来事は、配列がそのような様式でライブラリーから豊富な第一のものでは なかったときに検出されない。 試験すべきヌクレオチド配列を分泌捕捉レトロウイルスまたはｐＥＨＲＥベク ターのクローニング部位に導入する。ヌクレオチド挿入物を含み、分泌スクリー ニングライブラリーを構成する複数の分泌スクリーニングベクターを産生すると 同時にスクリーニングすることができる。一方向センスおよびアンチセンスライ ブラリーの産生に関して上述したように、一方向任意プライミング方法を用いて い、そのようなライブラリーを産生することができる。 ある実施の形態において、分泌捕捉カセットは、５’から３’に、転写調節配 列、ポリリンカー、プロテアーゼ認識部位が隣接したプロテアーゼ暗号配列、細 胞表面マーカー暗号配列（信号配列を欠如した）および細胞表面膜付着配列（好 ましくは、その付着活性が、以下に記載するように、バックグランドが減少する ように、信号配列に存在に依存するもの）、ＩＲＥＳおよび選択可能マーカーを 含んでいる。代表的なレトロウイルス分泌スクリーニングベクターが図２３に記 載されている。 細胞表面マーカーの例としては、限定するものではないが、合成または異種細 胞表面マーカーに加えて、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２０が挙げられる。プロテ アーゼおよびプロテアーゼ認識配列の例としては、限定するものではないが、レ トロウイルスプロテアーゼ配列、ＨＩＶ、ＭｕＬｖ、ＲＳＶまたはＡＳＶプロテ アーゼ配列が挙げられる。 試験すべきヌクレオチド配列をポリリンカー中に導入する。そのような配列を 含むベクターを、使用するベクターに依存して、細胞中に形質移入または形質転 換する。ベクターの選択可能マーカーを用いて、ベクターを吸収した細胞を選択 する。 次いで、分泌タンパク質の暗号配列（すなわち、信号配列をコード化する配列 ）を、これらの細胞のうち融合タンパク質細胞表面マーカーを示すものを測定す ることにより同定する。これは、そのマーカーが一部となる融合タンパク質が信 号配列を含む場合に、マーカーが最後に細胞表面に移送され、付着するからであ る。 外来性バックグラウンド細胞表面標的化を減少させるために、融合タンパク質 の膜標的化部分は、好ましくは、標的化活性が信号配列の存在に依存しているも のである。例えば、ＧＰＩ膜付着／標的化配列のみが、最初に細胞の小胞体（Ｅ Ｒ）を通過する場合には、細胞膜上につながれる。信号配列の存在により、タン パク質がＥＲを標的とし、次いで、ＧＰＩの膜繋がり能力を活性化させるように 機能する。 融合タンパク質のプロテアーゼ要素は、一般的に、一つのポリペプチド翻訳ユ ニットからの多重機能ユニットを形成するのに用いても差し支えない。融合タン パク質のプロテアーゼ要素は、この特別な例において、細胞表面マーカーを示す それらの細胞の同定を容易にするのに用いられている。特に、プロテアーゼおよ びプロテアーゼ認識配列を融合タンパク質とともに適切な位置に配置することに より、プロテアーゼの活性化および自己開裂が、細胞表面抗体に対して容易に得 られる細胞表面マーカーを形成するのに機能する。ＦＡＣＳのような標準的な抗 体関連単離技術または磁気ビーズ単離技術を用いても差し支えない。 図２３のベクターを用いると、百万のうち一つの陽性の細胞を、たった四周期 のスクリーニングで、約40％の純度までうまく精製した。 微生物の寄託 プラスミドｐＭａＲＸＩＩを担持する大腸菌株ＸＬ−１を、特許手続きの目的 のために微生物の寄託の国際承認についてのブダペスト条約の規定の元で、農業 研究事業団微生物株保存機関(the Agricultural Research Service Culture Col lection)（ＮＲＲＬ）に1996年9月20日に寄託し、受入番号B-21625が割り当てら れた。 本発明は、ここに記載された特定の実施の形態により範囲が限定されるもので はない。実際に、ここに記載した本発明の変更例に加えて、様々な変更例が、前 述した説明と、添付した図面とから当業者には明らかである。そのような変更は 、添付の請求の範囲内に包含されることを意図したものである。 様々な公報および出版物がこの中に挙げられており、それらの開示の全てをこ こに引用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＺＷ (72)発明者 ハノン，グレゴリー ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11743 ハンティントン サミス ストリート 92 (72)発明者 コンクリン，ダグラス エス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11721 ハンティントン ベイ アーサー スト リート 414 (72)発明者 サン，ペイクィン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11743 ハンティントン オークウッド ロード 40 アパートメント ナンバー25

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ベクターであって、 (i) 該ベクターを後生動物宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込むための一つ以 上の転位要素； (ii) 該宿主細胞中に転写されるべき異種核酸配列、または該異種核酸配列を前 記ベクター中にクローニングする一つ以上の制限クローニング部位； (iii) 少なくとも１つの複製の起点；および (iv) 該ベクターの組み込まれた形態の全てまたは少なくとも一部を染色体ＤＮ Ａから除去する切除要素であって、少なくとも前記異種核酸配列の複製の起点ま たはそのためのクローニング部位に隣接した切除要素を含むことを特徴とするベ クター。 ２．前記異種核酸配列の転写を指示する転写調節配列を含むことを特徴とする請 求の範囲第１項記載のベクター。 ３．前記転位要素がウイルス転位要素であることを特徴とする請求の範囲第１項 記載のベクター。 ４．前記転位要素がレトロウイルスまたはレンチウイルス転位要素であることを 特徴とする請求の範囲第３項記載のベクター。 ５．前記ベクターが複製欠損ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項 、第３項または第４項記載のベクター。 ６．前記ベクターが、該ベクターを感染性ウイルス粒子内にパッケージングする パッケージング信号を含むことを特徴とする請求の範囲第１項、第３項、第４項 または第５項記載のベクター。 ７．前記切除要素が、酵素補助部位特異的組込配列を含むことを特徴とする請求 の範囲第１項記載のベクター。 ８．前記切除要素がリコンビナーゼ標的部位を含むことを特徴とする請求の範囲 第７項記載のベクター。 ９．前記リコンビナーゼ標的部位が、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナ ーゼ、Ｐｉｎリコンビナーゼ、ラムダリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼま たはＲリコンビナーゼの標的部位であることを特徴とする請求の範囲第８項記載 のベクター。 10．前記切除要素が制限酵素部位を含むことを特徴とする請求の範囲第７項記載 のベクター。 11．前記切除要素が、前記ベクターの染色体ＤＮＡからの切除の際に、切除され たベクターを直接的に用いて、感染の後の周期のためのウイルスを産生すること ができるように該ベクター内に位置していることを特徴とする請求の範囲第７項 から第10項いずれかに記載のベクター。 12．前記異種核酸配列を多シストロン性伝令ＲＮＡとして転写する多シストロン 性伝令ＲＮＡカセットを含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター 。 13．前記異種核酸配列、または該異種核酸配列をクローニングする前記制限クロ ーニング部位が、該異種核酸配列およびマーカー遺伝子が多シストロン性伝令Ｒ ＮＡとして転写されるように、一つ以上のマーカー遺伝子に近接して前記ベクタ ー内に配置されていることを特徴とする請求の範囲第１項または第12項記載のベ クター。 14．前記多シストロン性伝令ＲＮＡが、該伝令ＲＮＡの暗号配列の間に内部リボ ソーム入口部位（ＩＲＥＳ）を含むことを特徴とする請求の範囲第12項または第 13項記載のベクター。 15．前記ベクターを核酸の混合物から単離するためのプロウイルス回収要素を含 むことを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 16．前記プロウイルス回収要素が、ＤＮＡ結合ポリペプチドと特異的に結合した 核酸配列を含むことを特徴とする請求の範囲第15項記載のベクター。 17．細菌の前記複製の起点が非ｐＵＣ ｏｒｉであることを特徴とする請求の範 囲第１項記載のベクター。 18．細菌の前記複製の起点が一本鎖の複製の起点であることを特徴とする請求の 範囲第１項記載のベクター。 19．細菌の前記複製の起点が、ＲＫ２ ＯｒｉＶおよびｆｌファージＯｒｉから なる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 20．選択可能な細菌マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第１項ま たは第17項記載のベクター。 21．前記選択可能な細菌マーカー遺伝子が、細菌宿主細胞を薬物耐性にする、ま たは栄養要求性表現型を補足することを特徴とする請求の範囲第20項記載のベク ター。 22．前記選択可能な細菌マーカー遺伝子が、細菌宿主細胞を、カナマイシン／Ｇ ４１８、ゼオシン、アクチノマイシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラ サイクリン、クロラムフェニコルおよびペニシリンからなる群より選択される薬 物に対して耐性にすることを特徴とする請求の範囲第20項記載のベクター。 23．マーカー遺伝子を含み、その発現により、前記宿主細胞中に検出可能な表現 型を提供することを特徴とする請求の範囲第１項、第12項、第13項または第14項 記載のベクター。 24．前記マーカー遺伝子の発現が、前記宿主細胞を薬物耐性にする、または栄養 要求性表現型を補足することを特徴とする請求の範囲第23項記載のベクター。 25．前記マーカー遺伝子がジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）または チミジンキナーゼをコード化する、またはカナマイシン／Ｇ４１８、ヒグロマイ シン、ミコフェノール酸またはネオマイシンに対する耐性を提供するタンパク質 をコード化することを特徴とする請求の範囲第24項記載のベクター。 26．前記マーカー遺伝子が、蛍光または化学発光タンパク質、もしくは前記宿主 細胞の蛍光または化学発光を変更できる酵素をコード化ことを特徴とする請求の 範囲第23項記載のベクター。 27．前記マーカー遺伝子が、ルシフェラーゼ、フィコビリタンパク質、または緑 蛍光タンパク質をコード化することを特徴とする請求の範囲第26項記載のベクタ ー。 28．致死スタファ断片を含み、その発現が前記宿主細胞中に検出可能な表現型を 提供し、該質スタファ断片の発現が、前記異種核酸配列の前記ベクター中の存在 または不在に依存することを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 29．前記異種核酸配列が、ポリペプチドの暗号配列を含むことを特徴とする請求 の範囲第１項から第28項いずれかに記載のベクター。 30．前記異種核酸配列がポリペプチドのゲノムＤＮＡ暗号配列またはｃＤＮＡを 含むことを特徴とする請求の範囲第29項記載のベクター。 31．前記暗号配列が細胞内ポリペプチドをコード化することを特徴とする請求の 範囲第29項記載のベクター。 32．前記暗号配列が分泌または細胞表面ポリペプチドをコード化することを特徴 とする請求の範囲第29項記載のベクター。 33．前記異種核酸配列が遺伝子抑制要素を含むことを特徴とする請求の範囲第１ 項から第28項いずれかに記載のベクター。 34．前記遺伝子抑制要素が、アンチセンス構築物、優性陰性突然変異体またはタ ンパク質の断片の暗号配列、およびリボザイムからなる群より選択されることを 特徴とする請求の範囲第33項記載のベクター。 35．前記異種核酸の前記宿主細胞内での転写を調節する構成性転写調節配列を含 むことを特徴とする請求の範囲第１項から第34項いずれかに記載のベクター。 36．前記異種核酸の前記宿主細胞内での転写を調節する誘導性転写調節配列を含 むことを特徴とする請求の範囲第１項から第34項いずれかに記載のベクター。 37．前記ベクターが人工染色体中に組み込まれていることを特徴とする請求の範 囲第１項から第36項いずれかに記載のベクター。 38．前記ベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求の範囲 第１項から第37項いずれかに記載のベクター。 39．前記レトロウイルスベクターが、レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌおよび／ま たはｅｎｖ遺伝子の全てまたは一部を欠如した複製欠損レトロウイルスであるこ とを特徴とする請求の範囲第38項記載のベクター。 40．前記レトロウイルスベクターが、ｐＢＡＢＥ、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥま たはｐＥＭ由来であることを特徴とする請求の範囲第38項また第39項記載のベク ター。 41．前記ベクターが、少なくとも前記異種核酸配列に隣接した二つの長い末端反 復配列（ＬＴＲ）を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第40項いずれか に記載のベクター。 42．前記ＬＴＲが前記切除要素を含み、前記切除されたベクターが、パッケージ ングされたレトロウイルスベクターを産生するのに直接的に使用できることを特 徴とする請求の範囲第41項記載のベクター。 43．前記ベクターが自己不活化ＬＴＲを含むことを特徴とする請求の範囲第41項 記載のベクター。 44．前記ベクターがパルボウイルスベクターであることを特徴とする請求の範囲 第１項から第43項いずれかに記載のベクター。 45．前記ベクターがアデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであることを特徴 とする請求の範囲第44項記載のベクター。 46．前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）の間に自然に生じ るＡＡＶ配列の全て、または実質的に全てを欠如していることを特徴とする請求 の範囲第45項記載のベクター。 47．前記ＩＴＲが前記切除要素を含み、切除されたベクターが、パッケージされ たＡＡＶベクターを産生するのに直接的に使用できることを特徴とする請求の範 囲第45項または第46項記載のベクター。 48．前記ベクターが共有結合により閉じた環状核酸であることを特徴とする請求 の範囲第１項から第47項いずれかに記載のベクター。 49．前記ベクターが線状核酸であることを特徴とする請求の範囲第１項から第47 項いずれかに記載のベクター。 50．前記ベクターがＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項から第49項 いずれかに記載のベクター。 51．前記ベクターがＲＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項から第49項 いずれかに記載のベクター。 52．請求の範囲第１項から第51項いずれかに記載のベクターを含むウイルス粒子 。 53．請求の範囲第１項から第51項いずれかに記載のベクターの様々な個体群を含 むベクターライブラリーであって、異なる異種核酸配列を有するベクターを含む ことを特徴とするベクターライブラリー。 54．前記ライブラリーが、前記異種核酸配列として、ｃＤＮＡ配列の様々な個体 群を含むことを特徴とする請求の範囲第53項記載のベクターライブラリー。 55．前記ｃＤＮＡライブラリーが規格化されたｃＤＮＡライブラリーであること を特徴とする請求の範囲第54項記載のベクターライブラリー。 56．前記ライブラリーが、前記異種核酸配列として、ペプチドライブラリーの暗 号配列の様々な個体群を含むことを特徴とする請求の範囲第53項記載のベクター ライブラリー。 57．前記ペプチドライブラリーが、例えば、融合タンパク質の一部としての拘束 ペプチドライブラリーであることを特徴とする請求の範囲第56項記載のベクター ライブラリー。 58．前記ライブラリーが、前記異種核酸配列として、遺伝子抑制要素の様々な個 体群を含むことを特徴とする請求の範囲第53項記載のベクターライブラリー。 59．前記遺伝子抑制要素が、アンチセンス構築物、優性陰性突然変異体またはタ ンパク質の断片の暗号配列、およびリボザイムからなる群より選択されることを 特徴とする請求の範囲第58項記載のベクターライブラリー。 60．その発現が咄乳類細胞の表現型を変更する核酸配列を同定する方法であって 、 (i) 細胞表現型を示す哺乳類宿主細胞を請求の範囲第１項から第51項いずれ かに記載のベクターで形質移入し、 (ii) 該ベクターの異種核酸配列の転写に特異的に依存する前記宿主細胞の表 現型の変化を検出する各工程を含むことを特徴とする方法。 61．前記細胞表現型が内因性遺伝子または前記宿主細胞の遺伝子の機能損失の結 果であり、検出される表現型の変化が、該機能損失を補足する核酸配列を同定す ることを特徴とする請求の範囲第60項記載の方法。 62．前記細胞表現型が内因性遺伝子または前記宿主細胞の遺伝子の発現の結果で あり、検出される表現型の変化が、該内因性遺伝子の機能または発現を阻害する 核酸配列を同定することを特徴とする請求の範囲第60項記載の方法。 63．遺伝子抑制要素を最適化する方法であって、 (i) 哺乳類細胞を請求の範囲第58項または第59項記載のベクターライブラリ ーで変質移入し、該哺乳類細胞が標的ｍＲＮＡを転写し、 (ii) 該遺伝子抑制要素の発現の際に、標的ｍＲＮＡ、またはその翻訳産生物 のレベルを検出し、 (iii) 前記ベクターライブラリーから遺伝子抑制要素を、それらの標的ｍＲ ＮＡまたは翻訳産生物のレベルを減少させる能力に基づいて選択する各工程を含 むことを特徴とする方法。 64．前記標的ｍＲＮＡが、結合したマーカーの暗号配列を含むキメラＲＮＡであ り、発現された結合マーカーのレベルが検出されることを特徴とする請求の範囲 第63項記載の方法。 65．その発現が特定の刺激に応答して変調される哺乳類遺伝子を同定する方法で あって、 (i) 哺乳類細胞を請求の範囲第89項記載の遺伝子捕捉ベクターで、該細胞中 にゲノム的に組み込まれたウイルスベクターが産生されるように形質移入し、 (ii) 該細胞を異所性刺激に曝し、 (iii) 該細胞を、遺伝子捕捉カセットレポター配列に関してアッセイし、前 記異所性刺激に依存する該レポーター配列の発現における変化が、前記ベクター の組込み部位に近接した遺伝子が前記刺激に応答して変調されていることを示す 各工程を含むことを特徴とする方法。 66．エピソーム発現ベクターであって、 (i) ウイルスタンパク質によりトランス活性化された複製のウイルス起点を 含む複製カセットであって、該ウイルス起点およびトランス活性化タンパク質が 宿主細胞中の該ベクターおよびその後代を安定に維持でき、 (ii) 発現カセットを含むことを特徴とするベクター。 67．前記複製カセットが、複製の乳頭腫ウイルス最小起点（ＭＯ）および乳頭腫 ミニクロモソーム維持要素（ＭＭＥ）を含むことを特徴とする請求の範囲第66項 記載のベクター。 68．前記ウイルス起点をトランス活性化させる一つ以上の前記ウイルスタンパク 質の暗号配列を含むことを特徴とする請求の範囲第66項または第67項記載のベク ター。 69．乳頭腫ウイルスＥ１およびＥ２タンパク質のうちの一方または両方の暗号配 列を含むことを特徴とする請求の範囲第67項または第68項記載のベクター。 70．前記複製カセットが、乳頭腫ウイルス（ＰＶ）、エプスタイン−バーウイル ス（ＥＢＶ）またはＢＫウイルス（ＢＫＶ）配列を含むことを特徴とする請求の 範囲第66項記載のベクター。 71．前記発現カセットが、多シストロン性伝令ＲＮＡとして異種核酸配列を転写 するための多シストロン性伝令ＲＮＡカセットを含むことを特徴とする請求の範 囲第66項記載のベクター。 72．前記多シストロン性伝令ＲＮＡが、該伝令ＲＮＡの暗号配列の間に内部リボ ソーム入口部位（ＩＲＥＳ）を含むことを特徴とする請求の範囲第71項記載のベ クター。 73．少なくとも１つの複製の細菌起点を含むことを特徴とする請求の範囲第66項 記載のベクター。 74．選択可能な細菌マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第66項ま たは第73項記載のベクター。 75．マーカー遺伝子を含み、その発現が哺乳類細胞中に検出可能な表現型を提供 することを特徴とする請求の範囲第66項記載のベクター。 76．前記発現カセットが、前記宿主細胞中のポリペプチドとして発現のためのゲ ノムＤＮＡ暗号配列またはｃＤＮＡを含むことを特徴とする請求の範囲第66項記 載のベクター。 77．前記発現カセットが細胞内ペプチドに関する暗号配列を含むことを特徴とす る請求の範囲第66項記載のベクター。 78．前記発現カセットが、分泌または細胞表面ポリペプチドに関する暗号配列を 含むことを特徴とする請求の範囲第66項記載のベクター。 79．前記発現カセットが遺伝子抑制要素を含むことを特徴とする請求の範囲第66 項記載のベクター。 80．前記発現カセットが、前記宿主細胞内の異種核酸の転写を調節するための構 成性転写調節配列を含むことを特徴とする請求の範囲第66項記載のベクター。 81．前記発現カセットが、前記宿主細胞内の異種核酸の転写を調節するための誘 導性転写調節配列を含むことを特徴とする請求の範囲第66項記載のベクター。 82．請求の範囲第66項から第81項いずれかに記載のベクターの様々な個体群を含 むベクターライブラリーであって、該ライブラリーが、転写のための異なる異種 核酸配列を含む発現カセットを有するベクター含むことを特徴とするベクターラ イブラリー。 83．前記発現カセットが、複製欠損ウイルスベクターの複製および／またはパッ ケージングに関する一つ以上のウイルス遺伝子を含むことを特徴とする請求の範 囲第66項から第81項いずれかに記載のベクター。 84．前記発現カセットが、インターフェロン、抗体、インシュリン、造血因子、 血液凝固因子、血栓因子、成長因子、インターロイキン、エンドルフィン、酵素 およびウイルス抗原からなる群より選択されたタンパク質に関する暗号配列を含 むことを特徴とする請求の範囲第76項から第78項いずれかに記載のベクター。 85．請求の範囲第83項記載のベクターを含むことを特徴とするパッケージング細 胞系統。 86．レトロウイルスベクターであって、 (i) 好ましくは５’から３’に、ポリリンカーまたは第一のポリペプチドの 暗号配列、内部リボソーム入口部位および選択可能なマーカーの暗号配列を含む 多シストロン性伝令ＲＮＡカセット、および （ii） 該多シストロン性伝令ＲＮＡカセットに隣接した酵素補助部位特異的 組込み配列を含むことを特徴とするレトロウイルスベクター。 87．(i) ５’から３’に、ポリリンカー、内部リボソーム入口部位および哺乳 類選択可能マーカーを含む多シストロン性伝令ＲＮＡカセット、 (ii) プロウイルス切除要素、 (iii) プロウイルス回収要素、および (iv) 細菌複製／選択カセットを含むことを特徴とする複製欠損レトロウイル スベクター。 88．(i) 遺伝子抑制要素カセット、 (ii) プロウイルス切除要素、 (iii) プロウイルス回収要素、および (iv) 細菌複製／選択カセットを含むことを特徴とする遺伝子抑制要素産生レ トロウイルスベクター。 89．(i) 内部リボソーム入口部位に結合したレポーター配列を含む遺伝子捕捉 カセット、 (ii) 選択性核酸回収要素、および (iii) 細菌複製／選択カセットを含むことを特徴とする遺伝子捕捉ベクター 。 90．(i) ５’から３’に、ペプチド表示カセット、内部リボソーム入口部位お よび哺乳類選択可能マーカーを含む多シストロン性伝令ＲＮＡカセット、 (ii) プロウイルス切除要素、 (iii) プロウイルス回収要素、および (iv) 細菌複製／選択カセットを含むことを特徴とするペプチド表示レトロウ イルスベクター。 91．(i) 哺乳類分泌信号、および (ii) 膜アンカーを含むことを特徴とする請求の範囲第90項記載のペプチド表 示レトロウイルスベクター。 92．前記膜アンカーが切除可能であることを特徴とする請求の範囲第91項記載の ペプチド表示レトロウイルスベクター。 93．細菌プロモータに隣接したスプライス受容体およびスプライス供与体をコー ド化するヌクレオチド配列、リボソーム結合部位、細菌分泌信号並びにＭ１３バ クテリオファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質カルボキシ末端の全てまたは一部を含 む請求の範囲第90項記載のペプチド表示レトロウイルスベクター。 94．その発現が哺乳類細胞表現型を補足する核酸配列を同定する方法であって、 (i) 該細胞表現型を示す哺乳類細胞を、請求の範囲第86項記載のレトロウイ ルスベクターを含み、定量可能なまたは選択可能なマーカーに結合したｃＤＮＡ またはｇＤＮＡ配列を含むレトロウイルスに感染させ、感染の際に、組込みレト ロウイルスプロウイルスが産生され、該ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列が発現され 、 （ii） 前記表現型について前記細胞を分析し、そして、該表現型の変更によ り、該細胞表現型を補足する核酸配列を同定する各工程を含むことを特徴とする 方法。 95．その発現が既知の哺乳類遺伝子の機能を抑制する核酸配列を同定する方法で あって、 (i) 哺乳類細胞を定量可能なまたは選択可能なマーカーに結合したｃＤＮＡ またはｇＤＮＡに感染させ、 (ii) (i)からの哺乳類細胞を、請求の範囲第88項記載の遺伝子抑制要素産生 レトロウイルスを含み、定量可能で選択可能なマーカーに結合した、ヒト遺伝子 のｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列またはその断片を含むレトロウイルスに感染させ 、感染の際に、組み込まれたレトロウイルスプロウイルスが産生され、該ｃＤＮ ＡまたはｇＤＮＡが発現され、 (iii) 該結合した定量可能なまたは選択可能なマーカーの発現に関して、前 記細胞を分析して、そして、該結合したマーカー発現の抑制により、前記哺乳類 遺伝子の機能を抑制する核酸配列を同定する各工程を含むことを特徴とする方法 。 96．その発現が細胞表現型に影響を与える核酸配列を同定する方法であって、 (i) 哺乳類細胞を、請求の範囲第88項記載の遺伝子抑制要素レトロウイルス ベクターを含み、定量可能なまたは選択可能なマーカーに結合したｃＤＮＡまた はｇＤＮＡ配列を含むレトロウイルスに感染させ、感染の際に、組み込まれたレ トロウイルスプロウイルスが産生され、該ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列が表現さ れ、 (ii) 遺伝子型の抑制に関して前記細胞を分析して、そして、未知の哺乳類遺 伝子の発現の抑制により、その発現が前記細胞表現型に影響を与える核酸配列を 同定する各工程を含むことを特徴とする方法。 97．その発現が細胞表現型に影響を与えるペプチドをコード化する核酸配列同定 する方法であって、 (i) 哺乳類細胞を、請求の範囲第89項から第92項いずれかに記載のベクター を表示するペプチドを含み、任意ペプチド配列を含むレトロウイルスに感染させ 、感染の際に、組み込まれたレトロウイルスプロウイルスが産生され、該任意ペ プチド配列が発現され、 (ii) 表現型の抑制に関して前記細胞を分析して、そして、該表現型に影響を 与えるタンパク質をコード化する核酸を、任意ペプチド配列の該タンパク質との 相互作用により同定する各工程を含むことを特徴とする方法。 98．その発現が特定の刺激に応答して変調される哺乳類遺伝子を同定する方法で あって、 (i) 細胞表現型を示す哺乳類細胞を、請求の範囲第89項記載の遺伝子捕捉レ トロウイルスベクターを含むレトロウイルスに感染させ、それによって、組み込 まれたレトロウイルスプロウイルスが産生され、 (ii) 前記細胞をある刺激に曝し、 (iii) 該細胞を前記遺伝子捕捉カセットレポーター配列の発現に関してアッ セイし、そして、該レポーター配列の発現が変化した場合には、その配列が中に 組み込まれ、前記刺激に応答して誘導または変調された遺伝子を同定する各工程 を含むことを特徴とする方法。 99．前記レトロウイルスベクターがｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ挿入配列を含むこと を特徴とする請求の範囲第86項または第87項記載のレトロウイルスベクター。 100．請求の範囲第86項から第93項いずれかに記載のレトロウイルスベクターを 多数含むことを特徴とするレトロウイルスライブラリー。 101．請求の範囲第86項から第93項いずれかに記載のレトロウイルスベクターを 含むことを特徴とするレトロウイルス。 102．請求の範囲第86項から第93項いずれかに記載のレトロウイルスベクターを 含むことを特徴とする組み込まれたプロウイルス。 103．請求の範囲第86項から第93項いずれかに記載のレトロウイルスベクターを 含むことを特徴とする切除されたプロウイルス。 104．(i) Ｅ１暗号配列およびＥ２暗号配列を含む複製カセット、 (ii) 発現カセット、 (iii) 複製のＰＶ最小起点（ＭＯ）配列、および (iv) ＰＶミニクロモソーム維持要素（ＭＭＥ）配列を含むことを特徴とする エピソーム発現ベクター。 105．(i) Ｅ１暗号配列およびＥ２暗号配列を含む複製カセット、 (ii) 遺伝子抑制カセット、 (iii) 複製のＰＶ最小起点（ＭＯ）配列、および (iv) ＰＶミニクロモソーム維持要素（ＭＭＥ）配列を含むことを特徴とする エピソーム遺伝子抑制ベクター。