JP2019506173A - レトロウイルスベクターを産生するための核酸構築物 - Google Patents

レトロウイルスベクターを産生するための核酸構築物 Download PDF

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Abstract

本発明は、（ｉ）レトロウイルス移入ベクターを含むか、またはレトロウイルスタンパク質をコードする、第１の核酸配列と、（ｉｉ）細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である検出可能なマーカーをコードする、第２の核酸配列とを含む、核酸構築物に関する。本発明者らは、ウイルスタンパク質と、単一細胞のレベルで数量化され得る検出可能なマーカータンパク質との共発現に基づく、レトロウイルス産生系を提供する。特にこの系は、パッケージング細胞内の異なるレトロウイルスタンパク質の発現レベルを追跡すること、および異なるレトロウイルス成分の理想的な発現比を有するパッケージング細胞を選択することを可能にする。例えば、検出可能なマーカーの発現レベルは、パッケージング細胞を同定および選択するためにフローサイトメトリーを使用することで決定され得る。

Description

本発明は、レトロウイルスベクターの分野に関する。特に、本発明は、レトロウイルスベクターを産生するための核酸構築物および方法、ならびにそのような方法において使用するためのパッケージング細胞およびプロデューサー細胞に関する。
レトロウイルスベクターは、遺伝子療法を含む様々な用途に関連している。しかしながら、例えば、レンチウイルス遺伝子療法の進展は、力価の高い精製されたレンチウイルスベクターの産生に関する要件によって妨げられてきた。
レトロウイルスパッケージング細胞株を生成するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、ＷＯ９２／０５２６６を参照されたい）。そのようなパッケージング細胞株を使用して、レトロウイルスベクター粒子の産生のためのプロデューサー細胞株を作製することができる。
レンチウイルス産生は、４つのプラスミド、すなわちウイルスゲノムベクタープラスミドと、Ｇａｇｐｏｌ、Ｒｅｖ、およびＥｎｖ糖タンパク質を供給する３つのヘルパープラスミドとを用いた、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションを使用して実施され得る。しかしながら、非常に大規模なトランスフェクションは実施可能でないため、一過性トランスフェクション技術は、臨床用途に適切な規模でウイルスを生成するために使用することができない。
安定なレンチウイルスパッケージング細胞株は、一過性トランスフェクション後の偶然の組み込み事象により上述のプラスミドの４つすべてを細胞株（例えば２９３Ｔ細胞株）に安定に組み込むことによって生成され得る。プラスミドを組み込んだ細胞は、組み込まれたプラスミドからの抗生物質耐性遺伝子の共発現によって選択される。このアプローチは、いくつかの理由で限定される。第１に、一過性トランスフェクション後の安定な組み込みは非常に非効率的である。第２に、抗生物質選択は、限定された範囲の抗生物質、例えばＺｅｏｃｉｎ（商標）およびピューロマイシンに関しては良好に機能するが、４つの異なる遺伝子の組み込みの選択を試みる際の選択肢は限定され、利用可能な選択系は最適ではない。第３に、各個別の組み込み事象から得られた相対発現を決定することは困難である。
国際公開第９２／０５２６６号
したがって、上記に概説した不利点に関連しない、レトロウイルスの、特にレンチウイルスの産生方法が必要とされている。
本発明者らは、ウイルスタンパク質と、単一細胞のレベルで数量化され得る検出可能なマーカータンパク質との共発現に基づく、レトロウイルス産生系を提供する。特にこの系は、パッケージング細胞内の異なるレトロウイルスタンパク質の発現レベルを追跡すること、および異なるレトロウイルス成分の理想的な発現比を有するパッケージング細胞を選択することを可能にする。例えば、検出可能なマーカーの発現レベルは、パッケージング細胞を同定および選択するためにフローサイトメトリーを使用することで決定され得る。マーカータンパク質はウイルスタンパク質と共発現されるため、特定のウイルスタンパク質またはウイルスタンパク質の組合せをレトロウイルス産生系に有利なレベルまたは比で発現するパッケージング細胞を同定し、選択することができる。
第一の態様では本発明は、（ｉ）レトロウイルス移入ベクターを含むか、またはレトロウイルスタンパク質をコードする、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である検出可能なマーカーをコードする、第２の核酸配列と
を含む、核酸構築物を提供する。
核酸構築物は、次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含んでよく、
式中
Ａは、レトロウイルス移入ベクターを含むか、またはレトロウイルスタンパク質をコードする、核酸配列であり、
Ｂは、細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である検出可能なマーカーをコードする、核酸配列であり、
Ｘは、レトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーが別々のポリペプチドとして発現されることを可能にする共発現配列である。
共発現配列は、ＩＲＥＳ配列または自己切断ペプチドをコードする配列を含んでもよい。
共発現配列は、アフトウイルスもしくはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチド、２Ａ様ペプチド、内部リボソーム進入部位、フューリン切断部位、またはタバコエッチウイルス切断部位から選択されてよい。
共発現配列は、アフトウイルスもしくはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドであってよい。
レトロウイルスタンパク質は、ｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ、またはｒｅｖから選択されてもよい。
細胞表面タンパク質は、２００未満のアミノ酸であってよい。
細胞表面タンパク質の膜標的化ドメインは、（ｉ）膜貫通ドメインおよびエンドドメイン、または（ｉｉ）ＧＰＩアンカーを含んでよい。膜貫通ドメインは、ＣＤ８ストークまたはその一部を含んでよい。
細胞表面タンパク質の細胞外ドメインは、ＨＡ、Ｖ５、ＲＱＲ８、またはＭＹＣを含んでよい。
細胞表面タンパク質は、配列番号２１〜２６として示されるアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含んでよい。
核酸構築物は、Ａ−Ｘ−Ｂ核酸配列に隣接するトランスポゾン配列をさらに含んでよい。トランスポゾン配列は、配列番号６０および６１として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を共有するそのバリアントを含んでよい。
第二の態様では本発明は、本発明による複数の核酸構築物を含むキットを提供する。
キットは、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
を含んでよく、
第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーは、細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質であり、かつ互いと異なる。
キットは、
（ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、ならびに細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
をさらに含んでよく、
第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、および第３の検出可能なマーカーはすべて互いと異なる。
キットは、
（ｉｖ）レトロウイルス移入ベクター、ならびに細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物
をさらに含んでよく、
第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、第３の検出可能なマーカー（存在する場合）、および第４の検出可能なマーカーはすべて互いと異なる。
第三の態様では本発明は、本発明の核酸構築物を含むプラスミドを提供する。
第四の態様では本発明は、細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である少なくとも１つの検出可能なマーカーを発現する本発明の核酸配列を含む、パッケージング細胞を提供する。
用語「共発現する」は、レトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーが一緒にまたは同時に発現されることを意味する。結果として、レトロウイルスタンパク質の発現レベルは、それが共に共発現される検出可能なマーカーの発現レベルをアッセイすることによって間接的に決定され得る。
パッケージング細胞は、ｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ、および任意選択でｒｅｖのそれぞれを、異なる検出可能なマーカーと共に共発現してもよい。
パッケージング細胞は、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
を含んでよく、
第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する。
パッケージング細胞は、
（ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
をさらに含んでよく、
第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、および第３の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する。
第四の態様では本発明は、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と、
（ｉｉｉ）任意選択で、ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物と、
（ｉｉｉ）レトロウイルス移入ベクター、および第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物と
を含み、
第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、第３の検出可能なマーカー（存在する場合）、および第４の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する、
プロデューサー細胞を提供する。
核酸構築物は、細胞ゲノム内に安定に組み込まれていてよい。
パッケージング細胞またはプロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０、３Ｔ３、またはＫ５６２細胞であってよい。
別の態様では本発明は、本発明の１つもしくは複数の核酸構築物、本発明の１つもしくは複数のプラスミド、本発明の核酸構築物のキット、または本発明のプラスミドのキットを細胞に導入するステップを含む、本発明のパッケージング細胞またはプロデューサー細胞を作製するための方法を提供する。
別の態様では本発明は、核酸構築物またはそれぞれの核酸構築物によってコードされる検出可能なマーカーまたはそれぞれの検出可能なマーカーの発現について選択することにより、本発明のパッケージング細胞またはプロデューサー細胞を選択するための方法を提供する。
細胞は複数の検出可能なマーカーを発現してもよく、マルチパラメータフローサイトメトリーを使用して選択されてもよい。
方法は、
（ａ）複数の細胞に、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
を導入するステップと、
（ｂ）第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択するステップと
を含んでよい。
ステップ（ａ）は、複数の細胞に、
（ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
を導入することをさらに含んでよく、
ステップ（ｂ）は、第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、および第３の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択することをさらに含む。
ステップ（ａ）は、複数の細胞に、
（ｉｖ）レトロウイルス移入ベクター、および第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物
を導入することをさらに含んでよく、
ステップ（ｂ）は、第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、第４の検出可能なマーカー、および任意選択で第３の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択することをさらに含む。
ステップ（ａ）はまた、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼをコードする核酸配列を導入することをさらに含んでもよい。
別の態様では本発明は、本発明のプロデューサー細胞を培養するステップと、レトロウイルスベクターを単離するステップとを含む、レトロウイルスベクターを産生するための方法を提供する。
レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターであってよい。
図１は、安定なレンチウイルスプロデューサー株の生成のためのスキームを示す。ｇａｇｐｏｌ、エンベロープ（この場合ではＲＤ−Ｐｒｏ）、およびｒｅｖを供給するヘルパープラスミドは、表面発現エピトープタグ（それぞれ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、およびＶ５タグ）も共発現する。移入ベクター導入遺伝子のうちの１つはＲＱＲ８であり、これは、タグと同様にパッケージング細胞の表面上で容易に検出される。さらに、これらの発現カセットの４つすべてに、ｐｉｇｇｙＢＡＣ末端反復が隣接している。プラスミドは、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼを供給する発現プラスミドと併せて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされる。よって、移入カセットおよびヘルパーカセットが２９３Ｔ細胞内に転位される。ある期間の培養後、ヘルパーカセットおよび導入遺伝子カセットの永久発現がフローサイトメトリーによって容易に検出され得る。多数のこれら「バルク」転位細胞がフローサイトメトリーソーティングによってソーティングされ、高い導入遺伝子および最適な相対発現を有する細胞集団（複数可）が正確に選択される。これらは、フローソーターによって単一細胞として直接ソーティングされる。これらは９６ウェルプレートまたは３８５ウェルプレートのウェルを満たすように増やされ、上清が力価測定される。力価の最も高いクローンがウイルス産生のために選択される。
図２は、生成されるコンパクトな表面マーカー遺伝子のタイプを示す。（ａ）Ｖ５タグ、ＨＡタグ、およびＭＹＣタグが、ＣＤ８ストークおよび膜貫通ドメイン上で発現される。膜貫通タンパク質をアンカリングし、それが膜から分泌されることを防止する極性残基を含有する、ＣＤ８のエンドドメインの小さな一部分が保持される。代替的なストラテジーは、タグをＧＰＩアンカーで固定することである。Ｖ５タグ、ＨＡタグ、およびＭＹＣタグは、ＧＰＩアンカーに結合した状態で示されている。ここでタグはＧＰＩアンカーシグナルに結合しており、これが、細胞表面上のＧＰＩアンカーに対するタグの表面酵素による結合をもたらす。両方のストラテジーが、非常にコンパクトなコード配列で高レベルの表面発現をもたらす。（ｂ）表面発現を検査するため、６つの異なるタイプの表面エピトープタグを、増強青色蛍光タンパク質２（ｅＢＦＰ２）と共発現させた。（ｃ）２９３Ｔ細胞にこれらのプラスミドをトランスフェクトし、細胞を抗タグ抗体および蛍光二次抗体で染色した。次いで細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タグの発現をｅＢＦＰ２の蛍光シグナルと比較した。 図２は、生成されるコンパクトな表面マーカー遺伝子のタイプを示す。（ａ）Ｖ５タグ、ＨＡタグ、およびＭＹＣタグが、ＣＤ８ストークおよび膜貫通ドメイン上で発現される。膜貫通タンパク質をアンカリングし、それが膜から分泌されることを防止する極性残基を含有する、ＣＤ８のエンドドメインの小さな一部分が保持される。代替的なストラテジーは、タグをＧＰＩアンカーで固定することである。Ｖ５タグ、ＨＡタグ、およびＭＹＣタグは、ＧＰＩアンカーに結合した状態で示されている。ここでタグはＧＰＩアンカーシグナルに結合しており、これが、細胞表面上のＧＰＩアンカーに対するタグの表面酵素による結合をもたらす。両方のストラテジーが、非常にコンパクトなコード配列で高レベルの表面発現をもたらす。（ｂ）表面発現を検査するため、６つの異なるタイプの表面エピトープタグを、増強青色蛍光タンパク質２（ｅＢＦＰ２）と共発現させた。（ｃ）２９３Ｔ細胞にこれらのプラスミドをトランスフェクトし、細胞を抗タグ抗体および蛍光二次抗体で染色した。次いで細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タグの発現をｅＢＦＰ２の蛍光シグナルと比較した。
図３は、９５日までのヘルパー導入遺伝子の永久発現を示す。（ａ）ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼ発現プラスミドと、Ｖ５−８マーカー遺伝子も共発現したレンチウイルスｒｅｖ発現プラスミドとを、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。また一部の２９３Ｔ細胞には、ｒｅｖ発現プラスミド単独のみをトランスフェクトして、永久挿入と対比した一過性トランスフェクションからの発現への寄与を決定した。１０日で、トランスポサーゼをコトランスフェクトした細胞においては安定なＶ５−８発現細胞集団が見られたが、ｒｅｖ発現単独の２９３Ｔ細胞における発現はわずかである。（ｂ）これらの両２９３Ｔ細胞集団に関する、培養下の９５日までの経時的なＶ５−８発現。
図４は、ｇａｇｐｏｌとの正しい共発現機構を選択することの重要性を示す。（ａ）３つのレンチウイルスｇａｇｐｏｌ発現カセットを検査した。３つすべてにｐｉｇｇｙＢＡＣ末端反復（ｐＢ−ＴＲ）が隣接していた。発現はＣＭＶプロモーターによって駆動された。第１のプラスミド（ＷＴ）は、エピトープタグ共発現を有しなかった。第２のプラスミド（タグ２Ａ）は、ＦＭＤ疾患２Ａ様ペプチドコード配列で隔てられたｇａｇｐｏｌオープンリーディングフレームの５’側にコードされたＨＡ−８タグを有した。第３のプラスミド（ＩＲＥＳタグ）では、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）がｇａｇｐｏｌフレームの３’側に挿入され、ＨＡ−８をコードする配列がＩＲＥＳに続いた。（ｂ）これらのプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を抗ＨＡ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。このタグは、タグ２ＡおよびＩＲＥＳタグの両構築物で容易に検出することができた。（ｃ）ヘルパープラスミドおよび移入ベクターを一過的にトランスフェクトすることによってレンチウイルス上清を生成し、ここでｇａｇｐｏｌは、上記の３つのプラスミドのうちのいずれか１つによって供給された。タグ２Ａ構築物は、より低いウイルス力価をもたらした。
図５は、最適なレンチウイルスヘルパー発現カセットの設計を示す。これらのカセットは、ｒｅｖ、ＲＤ−ＰＲＯ、およびｇａｇｐｏｌを供給する。それぞれにｐｉｇｇｙＢＡＣ末端反復（ｐＢ−ＴＲ）が隣接している。プロモーター、ポリアデニル化配列は、相同組換えの確率を低減するために異なっている。各レンチウイルスエレメントは、表面エピトープマーカーと共発現される。ＲｅｖおよびＲＤ−ＰＲＯカセットにおける共発現は、ＦＭＤ様２Ａペプチドを用いて達成される。ｇａｇｐｏｌカセットにおける共発現は、ＩＲＥＳを用いて達成される。ＲＤ−ＰＲＯは、最も効率的な発現のためにイントロンを必要とする。これは、マウスＥＦアルファ５’ＵＴＲによって提供される。ｇａｇｐｏｌカセットはまた、足場付着領域（ＳＡＲ）を含有する。
図６は、レンチウイルスヘルパーカセットおよび移入ベクターが安定に転位した２９３Ｔ細胞を示す。ヘルパーカセットはＨＡタグ、Ｖ５タグ、およびＭＹＣタグを共発現するが、移入ベクターはＲＱＲ８を発現する。４つすべてのタグを独立して検出することができ、異なるエレメントを所望の量で発現する細胞の集団にゲーティング（一例のゲートが示されている）およびフローソーティングを行うことができる。
図７は、タグ付きｇａｇｐｏｌ発現カセットで転位された細胞からのレンチウイルスベクター産生を示す。（ａ）２９３Ｔ細胞に転位を行った。発現が安定化した後、タグ発現のフローソーティングを使用して、２９３Ｔ細胞を低発現、中発現、および高発現の集団にソーティングした。（ｂ）ソーティング直後に発現を確認した。（ｃ）次いで、２９３Ｔ細胞にＲＤ１１４エンベロープ、移入ベクター、およびＲＥＶをトランスフェクトした。上清を採取し、２９３Ｔ細胞において力価測定した。最も低発現の細胞が最も高い力価を有する。
図８は、タグ付き移入ベクターで転位された細胞からのレンチウイルスベクター産生を示す。表面マーカーも発現するレンチウイルス移入ベクターを用いて、２９３Ｔ細胞に転位を行った。発現が安定化したら（Ｏｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈａｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）、マーカー遺伝子に対するフローソーティングを使用して、２９３Ｔ細胞を高発現および低発現の集団にフローソーティングした。
図９は、転位可能なタグ付き移入ベクターカセットのマップを示す。５’末端は、ｐｉｇｇｙＢＡＣ ５’末端反復（５ＴＲ）で始まる。次に、５’レンチウイルス長鎖末端反復に融合したＣＭＶプロモーターが発現を駆動する。次に、レンチウイルスパッケージングシグナル（ＰＳＩ）にレンチウイルスＲＥＶ応答エレメント（ＲＲＥ）が続く。これに続くのは、表面マーカー遺伝子ＲＱＲ８とＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との融合物である導入遺伝子の発現を駆動するＥＦ１アルファプロモーターを有する成熟レンチウイルス発現カセットである。最適化されたウッドチャックプレプロセシングエレメント（ｍｔＰＲＥ）が続き、自己不活性化するようにトランケートされたレンチウイルス３’ＬＴＲにつながる。転写終結がＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）によって再実行される。最後に、この哺乳動物カセットはＰｉｇｇｙＢＡＣ ３’末端反復で終わる。プラスミドの残部は、細菌増殖のためのエレメントを含有する。
図１０は、転位可能なｇａｇｐｏｌ発現カセットのマップを示す。５’末端は、ｐｉｇｇｙＢＡＣ ５’末端反復（５ＴＲ）で始まる。これには、ユビキチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）が続く。これには、ＣＭＶプロモーターおよびイントロンが続く。次は、ねじれ型のレンチウイルスｇａｇｐｏｌオープンリーディングフレームである。この末端には、２ＡペプチドおよびＣＤ８ストーク（ＣＤ８ＳＴＫ）上のエピトープタグがインフレームでクローニングされている。次は、足場付着領域（ＳＡＲ）、プレプロセシングエレメント（ＰＲＥ）、およびウサギベータグロビン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル（ＲＧＢｐＡ）である。この哺乳動物カセットは、ｐｉｇｇｙＢＡＣ ３’末端反復（３ＴＲ）で終わる。プラスミドの残部は、細菌増殖のためのエレメントを含有する。
本発明は、（ｉ）レトロウイルス移入ベクターを含むか、またはレトロウイルスタンパク質をコードする、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である検出可能なマーカーをコードする、第２の核酸配列と
を含む、核酸構築物を提供する。
核酸構築物は、次の構造：Ａ−Ｘ−Ｂを含んでよく、式中、Ａは、第１の核酸配列であり、Ｂは、第２の核酸配列であり、Ｘは、共発現配列である。
核酸配列は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ配列またはそれらのバリアントであってもよい。
レトロウイルス
遺伝子療法のためにウイルスベクターを使用する概念は周知である（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ、３８９巻：２３９〜２４２頁）。本明細書で使用される用語「レトロウイルスベクター」は、レトロウイルスベクター系を指すとき、受容細胞に目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を形質導入することができるレトロウイルスベクター粒子も含む。
レトロウイルスベクター粒子は、次の成分：１つまたは複数のＮＯＩを含有してよいベクターゲノム、核酸をカプシド封入するヌクレオカプシド、およびヌクレオカプシドを囲む膜を含む。
用語「ヌクレオカプシド」は、レトロウイルスゲノムの少なくとも群特異的ウイルスコアタンパク質（ｇａｇ）およびウイルスポリメラーゼ（ｐｏｌ）を指す。これらのタンパク質はパッケージング可能な配列をカプシド封入し、エンベロープ糖タンパク質を含有する膜によってそれら自体がさらに囲まれている。
用語「ベクターゲノム」は、レトロウイルスベクター粒子内に存在するＲＮＡ構築物と、組み込まれたＤＮＡ構築物との両方を指す。この用語は、そのようなＲＮＡゲノムをコードすることができる別々のまたは単離されたＤＮＡ構築物も包含する。レトロウイルスゲノムは、レトロウイルスに由来する少なくとも１つの構成部分を含む必要がある。用語「由来する」は、レンチウイルスなどのウイルスから得られる必要は必ずしもないが、その代わりそれに由来してもよいヌクレオチド配列またはその一部を意味するものとして、その通常の意味で使用される。例として、その配列は、合成的に、または組換えＤＮＡ技術の使用によって調製されてよい。
多くのレトロウイルスが存在する。本出願において、用語「レトロウイルス」としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｆｕｊｉｎａｍｉ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄細胞腫症ウイルス２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、ならびにレンチウイルスを含むすべての他のレトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、１９９７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、編者：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁）に見出すことができる。
好ましい実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。
レンチウイルスベクターは、造血幹細胞、ニューロン、および内皮細胞などの幅広い細胞型への効率的な形質導入を行う、遺伝子送達のための主要なツールである。他の系と比べたレンチウイルスベクターの利点は、分裂細胞と非分裂細胞との両方にｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで感染する能力、ならびに、より大きなＲＮＡ転写物の発現を可能にする、より大きなパッケージング容量である。
レンチウイルス群は、「霊長類」および「非霊長類」に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ「遅発性ウイルス」のビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびより最近になって記述されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
一部のレンチウイルスのゲノム構造に関する詳細は、当技術分野において見出すことができる。例として、ＨＩＶおよびＥＩＡＶに関する詳細は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（すなわち、それぞれゲノム受託番号ＡＦ０３３８１９およびＡＦ０３３８２０）から見出すことができる。ＨＩＶバリアントの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖにおいても見出すことができる。ＥＩＡＶバリアントの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからも見出すことができる。
レンチウイルスは、５’−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−３’の順でウイルスタンパク質をコードする３つの主要な遺伝子を有する。２つの制御遺伝子、ｔａｔおよびｒｅｖが存在する。ウイルスに応じてさらなるアクセサリー遺伝子が存在し（例えば、ＨＩＶ−１についてはｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ）、その産物は、ウイルスＲＮＡの合成およびプロセシングならびに他の複製機能の制御に関与している。長鎖末端反復（ＬＴＲ）は約６００ｎｔの長さであり、そのうちＵ３領域が４５０、Ｒ配列が１００、そしてＵ５領域がおよそ７０ｎｔの長さである。
複製の早期段階に関与するウイルスタンパク質としては、逆転写酵素およびインテグラーゼが挙げられる。逆転写酵素は、ウイルスにコードされるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、相補的ＤＮＡコピーの合成のための鋳型としてウイルスＲＮＡゲノムを使用する。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型の破壊のためのＲＮアーゼＨ活性も有する。インテグラーゼは、逆転写酵素により生成されるウイルスｃＤＮＡと宿主ＤＮＡとの両方に結合する。インテグラーゼは、ウイルスゲノムを宿主ＤＮＡに挿入する前にＬＴＲをプロセシングする。Ｔａｔは、転写中にトランス活性化因子として作用して開始および伸長を向上させる。Ｒｅｖ応答エレメントは転写後に作用し、ｍＲＮＡのスプライシングおよび細胞質への輸送を制御する。
レトロウイルスタンパク質
レトロウイルスタンパク質は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、またはＲｅｖであってよい。
群特異的抗原（ｇａｇ：ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）タンパク質は、ビリオン当たり約２０００〜４０００のコピー数である、ウイルスカプシドの主要な成分である。Ｐｏｌタンパク質は、ウイルスＤＮＡの合成および感染後の宿主ＤＮＡへの組み込みに関わる。Ｅｎｖタンパク質は、ビリオンの宿主細胞への会合および進入に関係する。ｅｎｖ遺伝子の機能的コピーは、レトロウイルスをレトロエレメントと区別するものである。レトロウイルスが特異的な細胞表面受容体を使用してその標的宿主細胞に結合する能力はＥｎｖタンパク質の表面成分（ＳＵ）によって与えられるが、レトロウイルスが膜融合を介して細胞に進入する能力は、膜アンカー型膜貫通成分（ＴＭ）によって付与される。したがって、Ｅｎｖタンパク質は、レトロウイルスが感染性であるようにするものである。
レトロウイルスタンパク質は、ｇａｇｐｏｌであってよい。ｇａｇｐｏｌをコードする核酸配列は、配列番号９に示される核酸配列を含んでよい。ｇａｇｐｏｌをコードする核酸配列は、配列番号９と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、機能的ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードする配列番号９のバリアントを含んでよい。
レトロウイルスｅｎｖタンパク質は、ＲＤ１１４ ＳＵもしくはＴＭタンパク質またはＲＤＰＲＯ ＳＵもしくはＴＭタンパク質であってよい。一実施形態では、ｅｎｖタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質Ｇ）である。ＶＳＶ−Ｇは、すべての細胞型への形質導入が可能であるため、レンチウイルスシュードタイピングのために通常使用されるｅｎｖタンパク質である。
レトロウイルスｅｎｖタンパク質は、配列番号１０に示される配列を含んでよい。レトロウイルスｅｎｖタンパク質は、機能的ｅｎｖタンパク質を提供する能力を保持する配列番号１０のバリアントを含んでよい。バリアントは、配列番号１０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。
好適には、「レトロウイルスエンベロープタンパク質」は、レンチウイルスとの関連で上述したように、ＳＵおよび／またはＴＭタンパク質を指す。
一実施形態では、パッケージング細胞またはプロデューサー細胞は、レンチウイルスベクターを産生するために使用され、レトロウイルスタンパク質は、Ｒｅｖであってよい。Ｒｅｖは、レンチウイルスによって特異的に発現され、転写後に作用し、ｍＲＮＡのスプライシングおよび細胞質への輸送を制御する。
検出可能なマーカー
検出可能なマーカーは、細胞表面タンパク質である。細胞表面タンパク質は、パッケージング細胞またはプロデューサー細胞として使用される細胞型の表面で天然に発現されない任意の細胞表面タンパク質であってよい。
細胞表面タンパク質は、膜標的化ドメインおよび細胞外ドメインを含む。細胞表面で発現される場合、細胞表面タンパク質の少なくとも１つのドメインは外細胞質（すなわち細胞の外部）にある。したがって、細胞表面タンパク質のこのドメインは、抗体結合のためにアクセス可能である。
一実施形態では、検出可能なマーカーは、発現レベルが単一細胞レベルで決定され得る細胞表面タンパク質である。特に、検出可能なマーカーは、細胞を破損させること（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）なく検出され得る。検出可能なマーカーの発現レベルが単一細胞レベルで決定され得るため、レトロウイルスタンパク質と検出可能なマーカーの共発現は、パッケージング細胞内のレトロウイルスタンパク質の発現レベルも決定され得ることを意味する。
これは、レトロウイルスタンパク質を発現するパッケージング細胞を同定するために以前から使用されている選択可能な抗生物質耐性マーカーとは対照的である。特に、選択可能な抗生物質耐性マーカーの使用は、耐性マーカーひいてはレトロウイルスタンパク質を発現する細胞の選択を可能にするものの、各個別の組み込み事象から得られた相対発現、そして特定の細胞内の各レトロウイルスタンパク質の発現レベルを決定することは困難である。
したがって、本発明の検出可能なマーカーは、抗生物質耐性マーカーではない。
例えば、検出可能なマーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーを使用することで決定され得る。フローサイトメトリーなどの技術を使用してタンパク質の発現レベルを決定するための方法は当技術分野で周知である。したがって、検出可能なマーカーは、細胞表面タンパク質の発現の決定を可能にする試薬（複数可）を使用することによりフローサイトメトリーを使用して検出され得る細胞表面タンパク質であってよい。例えば試薬は、抗体、例えば細胞表面タンパク質に特異的に結合する蛍光標識抗体などの標識抗体であってよい。検出可能なマーカーは、その蛍光の特徴のためフローサイトメトリーによって固有に検出可能な蛍光タンパク質であってよい。
一実施形態では、細胞表面タンパク質は、２００アミノ酸長未満である。２００アミノ酸未満の細胞表面タンパク質の使用が有利であるのは、そのようなタンパク質をコードする核酸配列がより小さければ、細胞へのトランスフェクションおよび安定な組み込みがより容易であるためである。
膜標的化ドメイン
「膜標的化ドメイン」とは、膜に優先的に局在化し、したがって例えばパッケージング細胞の膜に細胞表面タンパク質をアンカリングする実体である。
膜貫通ドメインは、細胞膜に広がり、典型的には膜貫通タンパク質内に見出される、疎水性アルファヘリックスである。これは疎水性アルファヘリックスを含んでよい。膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、またはヒトＩｇＧに由来し得る。
膜貫通ドメインは、任意のＩ型膜貫通タンパク質に由来してよい。膜貫通ドメインは、疎水性ヘリックスを形成すると予測される合成配列であってもよい。
膜貫通ドメインは、配列番号１２として示される配列を含んでよい。
膜標的化ドメインは、膜貫通ドメイン、およびパッケージング細胞の内部に配向するエンドドメインであってもよい。エンドドメインは、細胞表面タンパク質を膜にアンカリングする極性残基を含んでよい。
膜標的化ドメインは、ＧＰＩアンカーであってよい。
ＧＰＩアンカーリングは、小胞体において起こる翻訳後修飾である。組み立て済みのＧＰＩアンカー前駆体は、Ｃ末端ＧＰＩシグナル配列（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ； １２２， ２５１−２５７ （１９９７）を参照のこと）を持つタンパク質に導入される。処理中、ＧＰＩアンカーはＧＰＩシグナル配列を置き換え、アミド結合を介して標的タンパク質に連結される。ＧＰＩアンカーは、成熟タンパク質を膜に標的化する。
本発明のタグ化タンパク質は、ＧＰＩシグナル配列を含んでもよい。例えば、タグ化タンパク質は、配列番号１３として示される配列を含み得る。
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、細胞表面タンパク質が細胞表面で発現される場合に外細胞質（すなわち細胞の外部）にある細胞表面タンパク質の一部である。
細胞外ドメインは、抗体が特異的に結合し得るエピトープを含む任意のポリペプチド配列であってよい。
一実施形態では、細胞外ドメインは、２００アミノ酸長未満である。
細胞外ドメインは、ＨＡ、Ｖ５、ＲＱＲ−８、またはＭＹＣタグを含み得る。
ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）は、このヒトウイルスの感染力に必要とされる表面糖タンパク質である。ＨＡタグは、アミノ酸９８〜１０６に対応するＨＡ分子に由来する。これは、発現ベクターにおける一般的なエピトープタグとして広く使用されてきた。ＨＡタグは、配列番号１４として示される配列を含んでよい。
Ｖ５エピトープタグ（Ｖ５）は、サルウイルス５（ＳＶ５）のパラミクソウイルスのＰおよびＶタンパク質上に存在する小さなエピトープ（Ｐｋ）に由来する。Ｖ５タグは、配列番号１５または１６として示される配列を含んでよい。
ｍｙｃタグ（ＭＹＣ）は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子産物に由来するポリペプチドタンパク質タグである。ＭＹＣタグは、配列番号１７として示される配列を含んでよい。
細胞外ドメインは、リツキシマブ結合エピトープ（Ｒエピトープ）および／またはＱｂｅｎｄ１０エピトープ（Ｑエピトープ）を含むドメインを含んでもよい。リツキシマブ結合エピトープは、リツキシマブに特異的に結合するエピトープを指す。例えば、リツキシマブ結合エピトープは、ＣＤ２０ Ｂ細胞抗原に基づくものであってもよい。
ＣＤ２０からのリツキシマブ結合エピトープ配列は、ＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣ（配列番号１８）である。
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ３４選択システムは、細胞選択を達成するためにＱＢＥｎｄ１０モノクローナル抗体を利用する。本発明者らは、以前にＣＤ３４抗原内からＱＢＥｎｄ１０結合エピトープをマッピングし（国際公開第２０１３／１５３３９１号参照）、それが配列番号１９として示されるようなアミノ酸配列を有することを決定した。
細胞表面タンパク質の結合ドメインは、配列番号１９として示されるようなアミノ酸配列を有するＱＢＥｎｄ１０結合エピトープまたはＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するその変異体を含んでもよい。
細胞外ドメインは、配列番号２０として示されるような１３６アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる結合ドメインを含んでもよい。
細胞表面マーカータンパク質は、配列番号２１〜２６として示される配列を含むか、またはそれからなっていてよい。
細胞表面タンパク質は、本明細書に記載される細胞外ドメインまたは細胞表面マーカータンパク質のバリアントを含んでもよい。例えば、細胞外ドメインは、本明細書に提供される配列に基づき得るが、基となる実体またはエピトープの結合活性をエピトープが保持する限り、アミノ酸挿入、置換、または欠失などの１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。特に、その配列は、一方または両方の末端において、例えば１つまたは２つのアミノ酸だけトランケートされていてもよい。
エピトープの結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質における類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ；類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
保存的置換を、例えば、以下の表に従って行うことができる。２番目の列の同じブロック中のアミノ酸、および３番目の列の同じ並びのアミノ酸は、互いに置換され得る：
結合ドメインは、例えば、本明細書において示される結合ドメイン配列と比較して５つもしくはそれより少ない、４つもしくはそれより少ない、３つもしくはそれより少ない、２つもしくはそれより少ない、または１つのアミノ酸変異を含有してよい。
細胞外ドメインは、本明細書において示されるドメイン配列、または基となるドメインに結合する抗体に結合する能力を保持するそのバリアントから本質的になっていてもよい。細胞外ドメインは、本明細書において示される配列、または基となるドメインに結合する抗体に結合する能力を保持するそのバリアントからなっていてもよい。
細胞表面タンパク質は、配列番号１４〜２６として示される配列、または、それと８０％の同一性を有し、細胞表面で発現され、試薬、例えば配列番号１４〜２６のうちの１つに結合する抗体によって認識される能力を保持する、そのバリアントを含んでもよい。
細胞表面タンパク質は、配列番号１４〜２６として示される配列、または、それと８５％の同一性を有し、細胞表面で発現され、配列番号１４〜２６のうちの１つに結合する抗体またはリガンドによって認識される能力を保持する、そのバリアントを含んでもよい。
細胞表面タンパク質は、配列番号１４〜２６として示される配列、または、それと９０％の同一性を有し、細胞表面で発現され、配列番号１４〜２６のうちの１つに結合する抗体またはリガンドによって認識される能力を保持する、そのバリアントを含んでもよい。
細胞表面タンパク質は、配列番号１４〜２６として示される配列、または、それと９５％の同一性を有し、細胞表面で発現され、配列番号１４〜２６のうちの１つに結合する抗体またはリガンドによって認識される能力を保持する、そのバリアントを含んでもよい。
細胞表面タンパク質は、配列番号１４〜２６として示される配列、または、それと９９％の同一性を有し、細胞表面で発現され、配列番号１４〜２６のうちの１つに結合する抗体またはリガンドによって認識される能力を保持する、そのバリアントを含んでもよい。
シグナル配列
細胞表面タンパク質は、タンパク質が細胞内で発現される場合に新生タンパク質が小胞体（ＥＲ）へと方向付けられるように、シグナル配列もまた含んでよい。
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含有し得る。シグナルペプチドは、トランスロケーションの際にポリペプチドの適切なトポロジーを強化することに役立つ正に荷電したアミノ酸の短いストレッチで始まる場合がある。シグナルペプチドの末端にシグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸のストレッチが典型的にはある。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーションの際またはその完了後のいずれかで切断し、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成することができる。次いで遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼによって消化される。
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあってもよい。
シグナルペプチドは、配列番号１もしくは２、または５つ、４つ、３つ、２つ、もしくは１つのアミノ酸変異（挿入、置換、または付加）を有するそのバリアントを含んでもよいが、シグナルペプチドがそれでも二重特異性分子の分泌をもたらすよう機能することを条件とする。
配列番号１および２のシグナルペプチドは、コンパクトかつ高効率である。これらは、末端グリシン後の約９５％の切断をもたらし、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらすと予測される。
本明細書に記載の細胞表面マーカータンパク質は、シグナル配列を欠いていてもよい。例えば、配列番号２１〜２６として示される細胞表面マーカーは、シグナル配列と注記された配列を含まなくてもよい。特に、細胞表面マーカータンパク質は、このタンパク質が細胞表面に存在する場合、シグナル配列を含まない。
共発現配列
一実施形態では、レトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーは、レトロウイルス移入ベクターまたはレトロウイルスタンパク質をコードする核酸配列と、共発現配列と、検出可能なマーカーをコードする核酸配列とを含む核酸として転写され、共発現配列は、レトロウイルス移入ベクターまたはレトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーが別々のポリペプチドとして発現されることを可能にする。
共発現配列は、アフトウイルスもしくはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチド、２Ａ様ペプチド、内部リボソーム進入部位、自己切断ペプチド、フューリン切断部位、またはタバコエッチウイルス切断部位であってよい。
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の中央における翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。
共発現配列は、レトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーが別々の実体として発現され得るように、レトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーをコードする核酸配列の間に位置する切断部位をコードする配列であり得る。
切断部位は、レトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーを含むポリペプチドが分離され得るようにする任意の配列であってよい。
用語「切断」は本明細書において便宜的に使用されるが、切断部位は古典的切断以外の機序によってレトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーを個々の実体に分離させることができる。例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（下記を参照されたい）について、種々のモデルが、「切断」活性：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解（ａｕｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）または翻訳効果の原因を説明するために提案されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１年）Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８２巻：１０２７〜１０４１頁）。そのような「切断」の正確な機序は、切断部位がレトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーをコードする核酸配列間に位置する場合に、レトロウイルスタンパク質および検出可能なマーカーが別々の実体として発現されるようにする限り、本発明の目的のために重要ではない。
切断部位はフューリン切断部位であってよい。
フューリンは、サブチリシン様プロプロテインコンバターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な産生物にプロセシングするプロプロテインコンバターゼである。フューリンは、対合した塩基性アミノ酸プロセシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断できるカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリン基質の例として、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータセクレターゼ、膜１型マトリクスメタロプロテイナーゼ、プロ神経増殖因子のベータサブユニットおよびフォン・ビルブランド因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列のすぐ下流（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）（配列番号３）でタンパク質を切断し、ゴルジ装置で豊富である。
切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であってよい。
ＴＥＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって融合タンパク質の制御された切断のためにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（配列番号４）（式中「＼」は切断されるペプチド結合を示す）である。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼも哺乳動物細胞において発現されなければならない。
切断部位は、自己切断ペプチドをコードしてよい。
「自己切断ペプチド」は、レトロウイルスタンパク質および検出可能マーカーを含むポリペプチドおよび自己切断ペプチドが産生されると、それがいかなる外部の切断活性も必要とすることなく別個の分離したレトロウイルスタンパク質および検出可能マーカーに直ちに「切断される」または分離されるように機能するペプチドを指す。
自己切断ペプチドは、アフトまたはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドであってよい。アフト（ａｐｔｈｏ）およびカルジオウイルスの主な２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスでは、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短いセクションであり、これは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共にそれ自体のＣ末端での「切断」を媒介できる自律的エレメントを表す。
長いカルジオウイルスタンパク質のＣ末端１９アミノ酸は、２ＢのＮ末端プロリンと共に、アフトウイルスＦＭＤＶ２ａ配列とほぼ等しい効率で「切断」を媒介する。カルジオウイルスは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）およびタイラーマウス脳炎ウイルス（ＴＭＥＶ）を含む。
ＥＭＣＶおよびＦＭＤＶ２Ａの変異解析は、モチーフＤｘＥｘＮＰＧＰ（配列番号５）が「切断」活性に本質的に関与していることを明らかにした（Ｄｏｎｅｌｌｙら（２００１年）上記）。
本発明の切断部位は、アミノ酸配列：
Ｄｘ１Ｅｘ２ＮＰＧＰ、を含んでよく、式中ｘ１およびｘ２は任意のアミノ酸である（配列番号５）。好適には、Ｘ１は次の群：Ｉ、Ｖ、ＭおよびＳから選択されてよい。Ｘ２は次の群：Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、ＱおよびＦから選択されてよい（配列番号８に示されるように）。
例えば切断部位は、表１に示すアミノ酸配列の１つを含んでよい。
２Ａ配列に基づく切断部位は、例えば長さ１５〜２２アミノ酸であってよい。配列は、２Ａタンパク質のＣ末端を含んでよく、プロリン残基（２ＢのＮ末端プロリンに相当する）が続く。
変異研究は、天然に存在する２Ａ配列に加えて一部の改変体も活性であることを示した。切断部位は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有し、２つまたはそれを超える別々のタンパク質へのポリタンパク質配列の「切断」を誘導する能力を保持している、天然に存在する２Ａポリペプチド由来の改変体配列に相当する場合がある。
切断配列は、全てある程度活性であることが示されている次のものから選択されてよい（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１年）上記）：
ＤｘＥｘＮＰＧＰの配列に基づいて「モチーフ、「２Ａ様」配列は、アフトまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスならびにトリパノソーマ種および細菌性配列内の反復配列において見出された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１年）上記）。切断部位は：
などのこれらの２Ａ様配列の１つを含んでよい。
切断部位は、配列番号５５
として示す２Ａ様配列を含んでよい。
５から３９アミノ酸の間のＮ末端「伸長」を含むことが活性を増加させることができることが示された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１年）上記）。具体的には切断配列は、次の配列の１つ、または例えば切断部位活性を保持して５つまでのアミノ酸変更を有するその改変体を含んでよい：
トランスポゾンエレメント
種々のトランスポゾンエレメントが当技術分野で周知である。本発明では、任意の好適なトランスポゾンを使用することができる。
ＤＮＡトランスポゾンは、宿主ゲノム内の１つの位置から別の位置に移動することができる遺伝子エレメントである。哺乳動物細胞の操作におけるそれらの使用は、初期には哺乳動物における活性トランスポゾンの欠如によって妨げられていた。１０年超前、哺乳動物における初めての活性ＤＮＡトランスポゾンであるＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙが、サケ科の魚類のゲノム内に見出された化石化したトランスポゾン配列から再構築された。この発見は、哺乳動物細胞のトランスポゾン媒介性遺伝子改変を可能にした。この方法は、ゲノムが改変された細胞株の生成において単純なトランスフェクションと比べてはるかに効率的である。
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンの生成以来、異なるファミリー由来のいくつかのトランスポゾンが哺乳動物細胞において活性転位を示すことが報告されている（Ｓｋｉｐｐｅｒら、Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ、２０１３年、２０巻：９２頁）。現在、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙと併せて、ヤガ科の蛾であるＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉから単離されたｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンが、多様な独特の特徴、すなわち哺乳動物細胞における最も効率的な転位、機能的タンパク質融合物を形成するトランスポサーゼの能力、大きなカーゴ容量、および痕跡のない切除を呈することから最も有望である。より重要なことには、ＰＢには単回のトランスフェクション後にヒト細胞において同時に最大４つの独立したトランスポゾンの安定な組み込みを媒介する能力があることが見出されている。ｐｉｇｇｙｂａｃｋのより活性な形態が記述されている（Ｙｕｓａら、ＰＮＡＳ、２０１１年、１０８巻、４号）。
本発明の一実施形態では、トランスポゾンエレメントまたは配列は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含む（またはそれからなる）。転位中、ＰＢトランスポサーゼは、トランスポゾンベクターの両末端に位置するトランスポゾン特異的な逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、元の部位から内容物を効率的に移動させ、それらをＴＴＡＡ染色体部位に組み込む。
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの独特な特色は、最大１４ｋｂｐの導入遺伝子を保有し得るためカーゴの限界が比較的なく、また、可逆的であることである：挿入されたＰｉｇｇｙＢａｃベクターを含有するゲノムには、ＰＢトランスポサーゼ（ｔｒａｎｐｏｓａｓｅ）発現ベクターを一過的に再トランスフェクトすることができ、トランスポサーゼは、トランスポゾンをフットプリントなしでゲノムから除去する。
一実施形態では、核酸構築物は、構築物が宿主ゲノムに挿入され得るように、ＰｉｇｇｙＢＡＣ ５’末端反復およびＰｉｇｇｙＢＡＣ ３’末端反復を含み得る。ＰｉｇｇｙＢＡＣ ５’および３’末端反復は、宿主ゲノムに挿入されることになる配列に隣接していてもよい。
ＰｉｇｇｙＢＡＣ ５’末端反復は、配列番号６０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、かつＲｄＲｐを動員する能力を保持するバリアントを含むか、またはそれからなっていてもよい。ＰｉｇｇｙＢＡＣ ５’末端反復は、配列番号６０を含むか、またはそれからなっていてもよい。
ＰｉｇｇｙＢＡＣ ５’末端反復は、宿主ゲノムへの挿入を促進する能力を保持する配列番号６０のトランケートバージョンまたは配列番号６０のバリアントのトランケートバージョンを含むか、またはそれからなっていてもよい。
ＰｉｇｇｙＢＡＣ ３’末端反復は、配列番号６１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、かつＲｄＲｐを動員する能力を保持するバリアントを含むか、またはそれからなっていてもよい。ＰｉｇｇｙＢＡＣ ３’末端反復は、配列番号６１を含むか、またはそれからなっていてもよい。
ＰｉｇｇｙＢＡＣ ３’末端反復は、宿主ゲノムへの挿入を促進する能力を保持する配列番号６１のトランケートバージョンまたは配列番号６１のバリアントのトランケートバージョンを含むか、またはそれからなっていてもよい。
プラスミド
一態様では、本発明は、本発明の核酸構築物を含むプラスミドを提供する。
プラスミドという用語には、本発明による核酸構築物および所望の細胞におけるそのｉｎ ｖｉｖｏ発現に必要なエレメントを含む任意のＤＮＡ転写ユニットが含まれ、この点に関し、線状形態のみならず、スーパーコイルまたは非スーパーコイルの環状プラスミドも本発明の範囲内にあるよう意図されることが留意される。
プラスミドは、プロモーターに作動可能に連結した、またはプロモーターの制御下にある、またはプロモーターに依存する、本発明による核酸構築物を含んでもよい。一般的には、真核細胞内で機能的な強力なプロモーターを用いることが有利である。強力なプロモーターは、ヒトもしくはマウス起源の最初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、または任意選択でラットもしくはモルモットなどの別の起源を有するものであってよいが、これらに限定されない。
より一般的には、プロモーターは、ウイルス起源または細胞起源のいずれかを有する。本発明の実践において有用に用いることのできるＣＭＶ−ＩＥ以外の強力なウイルスプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの初期／後期プロモーターまたはＲｏｕｓ肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実践において有用に用いることのできる強力な細胞プロモーターは、例えばデスミンプロモーター（Ｋｗｉｓｓａら、２０００年）またはアクチンプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９８９年）などの細胞骨格遺伝子のプロモーターである。
プラスミドのポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）に関しては、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子のｐｏｌｙ（Ａ）シグナル（Ｕ．Ｓ．５，１２２，４５８を参照されたい）、またはウサギβグロビン遺伝子のｐｏｌｙ（Ａ）シグナル、またはＳＶ４０ウイルスのｐｏｌｙ（Ａ）シグナルを使用することができる。
キット
本発明は、本発明の複数の核酸構築物を含むキットをさらに提供する。
一実施形態では、キットは、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
を含んでよく、
第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーは、細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質であり、かつ互いと異なる。
キットは、
（ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、ならびに細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
をさらに含んでよく、
第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、および第３の検出可能なマーカーはすべて互いと異なる。
キットはまた、
（ｉｖ）レトロウイルス移入ベクター、ならびに細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物
をさらに含んでよく、
第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、第３の検出可能なマーカー（存在する場合）、および第４の検出可能なマーカーはすべて互いと異なる。
別の態様では、本発明は、本発明による複数のプラスミドを含むキットを提供する。
パッケージング細胞およびプロデューサー細胞
本明細書で使用される用語「パッケージング細胞」は、ＲＮＡゲノムを欠いている感染性組換えウイルスの産生に必要なエレメントを含有する細胞を指す。そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（例えば、コドン最適化されていてもよいｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ）を発現することができるが、パッケージングシグナルを含有しない。
「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」と互換的に称される用語「パッケージングシグナル」は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド封入に必要とされる、非コードシス作用性配列に関して使用される。ＨＩＶ−１においてこの配列は、主要なスプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで延びる遺伝子座にマッピングされている。
本明細書で使用される用語「プロデューサー細胞」は、レトロウイルスベクター粒子の産生に必要なすべてのエレメントを含有する細胞を指す。
本発明のプロデューサー細胞／パッケージング細胞は、任意の好適な細胞型であってよい。プロデューサー細胞は、一般的には哺乳動物細胞であるが、例えば昆虫細胞であってもよい。
プロデューサー／パッケージング細胞株を使用することにより、後に目的の部位に形質導入するために多量のレトロウイルスベクター粒子を増殖させ単離すること（例えば、好適な力価のレトロウイルスベクター粒子を調製すること）が可能である。
パッケージング細胞株は、高力価ベクター粒子産生のための膜タンパク質をカプシド封入し用意するのに必要な遺伝子産物を用意するために有用である。パッケージング細胞は、組織培養細胞株などのｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞であってよい。好適な細胞株としては、マウス線維芽細胞由来細胞株またはヒト細胞株などの哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。パッケージング細胞株は、例えばＨＥＫ２９３、２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０などのヒト細胞株であってよい。
プロデューサー細胞を生成するには、２つの一般的な手順がある。その１つでは、レトロウイルスＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質をコードする配列が細胞に導入され、細胞ゲノムに安定に組み込まれる。安定な細胞株が産生され、これはパッケージング細胞株と称される。本明細書で使用される用語「安定に組み込まれる」は、外来遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれることを意味する。パッケージング細胞株は、レトロウイルスＲＮＡをパッケージングするために必要とされるタンパク質を産生するが、ｐｓｉ領域の欠如が原因でカプシド封入をもたらすことができない。
しかしながら、ベクターゲノム（ｐｓｉ領域を有するもの）がパッケージング細胞株に導入されると、ヘルパータンパク質がｐｓｉ陽性組換えベクターＲＮＡをパッケージングして組換えウイルスストックを産生することができる。これを使用して、受容細胞への形質導入を行うことができる。ゲノムがウイルスタンパク質を作製するのに必要とされるすべての遺伝子を欠いている組換えウイルスは、１回しか感染することができず、増殖することができない。よって、潜在的に有害なレトロウイルスを生成することなく、核酸配列を宿主細胞ゲノムに導入することができる。
第２のアプローチは、レトロウイルスベクター粒子を産生するために必要とされる３つの異なるＤＮＡ配列（すなわち、ｅｎｖコード配列、ｇａｇ−ｐｏｌコード配列、および１つまたは複数のＮＯＩを含有する欠損レトロウイルスゲノム）を一過性トランスフェクションによって同時に細胞に導入することであり、この手順は、一過性三重トランスフェクションと称される。ＷＯ９４／２９４３８は、この多重ＤＮＡ一過性トランスフェクション法を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロデューサー細胞の産生を記載している。ＷＯ９７／２７３１０は、再移植のためにｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかでレトロウイルスプロデューサー細胞を作製するための一式のＤＮＡ配列を記載している。ベクターゲノムを補完するのに必要とされるウイルス系の成分は、細胞にトランスフェクトするための１つまたは複数の「プロデューサープラスミド」上に存在してもよい。
本発明は、本発明による核酸構築物を含み、細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である少なくとも１つの検出可能なマーカーを発現する、パッケージング細胞を提供する。
一実施形態では、パッケージング細胞は、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
を含んでよく、
第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する。
パッケージング細胞は、
（ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
をさらに含んでよく、
第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、および第３の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する。
本発明は、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と、
（ｉｉｉ）任意選択で、ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物と、
（ｉｉｉ）レトロウイルス移入ベクター、および第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物と
を含み、
第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、第３の検出可能なマーカー（存在する場合）、および第４の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する、
プロデューサー細胞をさらに提供する。
核酸構築物は、細胞ゲノム内に安定に組み込まれていてよい。
パッケージング細胞またはプロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０、３Ｔ３、またはＫ５６２細胞であってよい。
方法
一態様では本発明は、本発明の１つもしくは複数の核酸構築物、本発明の１つもしくは複数のプラスミド、本発明の核酸構築物のキット、または本発明のプラスミドのキットを細胞に導入するステップを含む、本発明のパッケージング細胞またはプロデューサー細胞を作製するための方法を提供する。
核酸構築物は、当技術分野で公知の多様な方法によって、例えば電気穿孔またはリポフェクションなどの標準的なトランスフェクション法を使用して、細胞に導入されてよい。
核酸構築物は、この方法の同じステップ中に細胞に導入されても（例えば同時にトランスフェクトされても）、またはこの方法の異なるステップにおいて細胞に導入されても（例えば異なる時点でトランスフェクトされても）よい。
別の態様では本発明は、核酸構築物またはそれぞれの核酸構築物によってコードされる検出可能なマーカーまたはそれぞれの検出可能なマーカーの発現について選択することにより、本発明のパッケージング細胞またはプロデューサー細胞を選択するための方法を提供する。
方法は、
（ａ）複数の細胞に、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
を導入するステップと、
（ｂ）第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択するステップと
を含んでよい。
ステップ（ａ）は、複数の細胞に、
（ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
を導入することをさらに含んでよく、
ステップ（ｂ）は、第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、および第３の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択することをさらに含む。
ステップ（ａ）は、複数の細胞に、
（ｉｖ）レトロウイルス移入ベクター、および第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物
を導入することをさらに含んでよく、
ステップ（ｂ）は、第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、第４の検出可能なマーカー、および任意選択で第３の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択することをさらに含む。
ステップ（ａ）はまた、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼをコードする核酸配列を導入することをさらに含んでもよい。
別の態様では、本発明は、そのまたはそれぞれの核酸構築物によってコードされるそのまたはそれぞれの検出可能なマーカーの発現について選択することにより、本発明によるパッケージング細胞またはプロデューサー細胞を選択するための方法を提供する。
一実施形態では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングが実施される。
例えば、フローサイトメトリーを使用してベクター、ｇａｇｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｒｅｖ発現細胞をソーティングすることにより、異なるレトロウイルス成分の発現レベルを監視し、より生産的なレトロウイルス産生のために各成分の最適な発現比を有する細胞を選択することが可能である。
細胞は複数の検出可能なマーカーを発現してもよく、マルチパラメータフローサイトメトリーを使用して選択されてもよい。
方法は、
（ａ）複数の細胞に、
（ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
（ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
を導入するステップと、
（ｂ）第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択するステップと
を含んでよい。
ステップ（ａ）は、複数の細胞に、
（ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
を導入することをさらに含んでよく、
ステップ（ｂ）は、第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、および第３の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択することをさらに含む。
ステップ（ａ）は、複数の細胞に、
（ｉｖ）レトロウイルス移入ベクター、および第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物
を導入することをさらに含んでよく、
ステップ（ｂ）は、第１の検出可能なマーカー、第２の検出可能なマーカー、第４の検出可能なマーカー、および任意選択で第３の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択することをさらに含む。
ステップ（ａ）はまた、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼをコードする核酸配列を導入することをさらに含んでもよい。
別の態様では本発明は、本発明のプロデューサー細胞を培養するステップと、レトロウイルスベクターを単離するステップとを含む、レトロウイルスベクターを産生するための方法を提供する。
プロデューサー細胞は、プロデューサー細胞を作製するために使用される特定の細胞型に好適な標準培養条件を使用して培養され得る。培養中、レトロウイルスベクター粒子は培養上清中に放出される。レトロウイルスベクターは、標準的技術、例えば超遠心分離、限外濾過、または親和性精製を使用して単離され得る。
レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターであってよい。
用語の定義は本明細書全体を通して記載されている。例示的な実施形態をより詳細に記載する前に、本開示は記載される特定の実施形態に限定されず、したがって当然ながら様々であることを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語法は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第２０版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４年）、ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１年）は、本開示で使用されている用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法および材料に限定されず、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を本開示の実施形態の実践または検査に使用してよい。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。
値の範囲が提供されている場合、文脈による明確な別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在値も、下限の単位の１０分の１に至るまで明確に開示されることが理解される。規定範囲（ｓｔａｔｅｄ ｒａｎｇｅ）内のいずれかの規定値または介在値と、その規定範囲内のいずれかの他の規定値または介在値との間の、より小さな範囲はそれぞれ、本開示内に包含されている。これらのより小さな範囲の上限および下限は、その範囲内に独立して含まれていても、または除外されてもよく、より小さな範囲内に限界のいずれかもしくは両方が含まれている各範囲、または限界のいずれも含まれていない各範囲も、規定範囲内になんらかの明確に除外される限界がない限り、本開示内に包含されている。規定範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれている限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本開示に含まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の指示がない限り、複数の参照対照を含むことが留意されるべきである。したがって、例えば、「１つの酵素（ａｎ ｅｎｚｙｍｅ）」への言及は、当業者に公知である複数のそのような候補薬剤およびその均等物を含むなどということである。
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的または無制限であり、さらなる列挙されていないメンバー、要素、または方法ステップを除外しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」には、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含まれる。
本発明は、本発明を実施する当業者を支援するように役立つことが目的とされ、本発明の範囲を限定することをいかなる方法でも意図しない実施例の方法によってここにさらに記載される。
（実施例１）
細胞表面マーカータンパク質の構築
可能性のあるコンパクトな表面マーカー遺伝子が図２に詳解されている。よく特徴付けられているエピトープタグ（Ｖ５タグ、ＨＡタグ、およびＭＹＣタグ）のコード配列を、シグナルペプチドのコード配列の３’側にクローニングした。これらを次にＣＤ８アルファのストーク、ＴＭ、およびエンドドメインの一部分にクローニングした。あるいは、ＣＤ５２のＧＰＩアンカーシグナルを用い、インフレームでこれらをクローニングした。これは、細胞の表面上にエピトープを提示する一式の高度にコンパクトな表面マーカータンパク質をもたらした。これにより、蛍光コンジュゲート抗体で染色することによる容易な検出が可能になる。これらのマーカーのコンパクトなサイズは、マーカー遺伝子を発現することの転写負荷を最小限に抑える。表面発現は、検出を可能にするために細胞が溶解される必要がないことを意味する。
（実施例２）
２９３Ｔ細胞における細胞表面マーカータンパク質の発現
ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼ発現プラスミドと、Ｖ５−８マーカー遺伝子も共発現したレンチウイルスｒｅｖ発現プラスミドとを、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。また一部の２９３Ｔ細胞には、対照としてｒｅｖ発現プラスミド単独のみをトランスフェクトした。これらの後者の細胞は、永久挿入と対比した一過性トランスフェクションからの発現への寄与の決定を可能にする。１０日で、細胞の両集団ならびにトランスフェクトされていない対照を、Ｖ５エピトープタグを認識する蛍光抗体で染色した。次いでこれらの細胞をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙ）によって分析した。トランスポサーゼをコトランスフェクトした細胞においては明らかなＶ５−８発現細胞集団が見られたが、ｒｅｖ発現単独の２９３Ｔ細胞における発現はより低かった（図３）。これらの細胞培養物を９５日間維持し、ｖ５エピトープ発現について定期的に分析した。これは、ｐｉｇｇｙＢＡＣ媒介性転位の安定性、およびレンチウイルスエレメントの安定性を示すことにおけるマーカー遺伝子の利便性を示す。
（実施例３）
異なるレンチウイルスタンパク質の細胞表面マーカータンパク質との共発現
異なるレンチウイルスエレメントは、マーカー遺伝子を最適に共発現するために異なる手段を必要とする。レンチウイルスｇａｇｐｏｌを、次の２つの異なる方法でタグ付けした：ＨＡ−８タグマーカー遺伝子を、ＦＭＤ−２Ａ様ペプチドと、またはＩＲＥＳ配列と共発現させた（図４）。タグなしの対照、２Ａタグ付きバージョン、およびＩＲＥＳタグ付きバージョンの、３つのレンチウイルスｇａｇｐｏｌ発現カセットを検査した。これらのプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を抗ＨＡ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。このタグは、タグ２ＡおよびＩＲＥＳタグの両構築物で容易に検出することができた。ヘルパープラスミドおよび移入ベクターを一過的にトランスフェクトすることによってレンチウイルス上清を生成し、ここでｇａｇｐｏｌは、上記の３つのプラスミドのうちのいずれか１つによって供給された。タグ２Ａ構築物の使用は、より低いウイルス力価をもたらした。これにより、ＩＲＥＳがこの実験においてｇａｇｐｏｌをタグ付けする最適な方法であったことが示された。
（実施例４）
最適なレンチウイルスヘルパー発現カセット設計
ヘルパーカセットは、ｒｅｖ、ＲＤ−ＰＲＯ、およびｇａｇｐｏｌを供給しなければならない。提案される最適なカセットを図５に示す。安定発現のためのパッケージング細胞ゲノムへの挿入を補助するため、各カセットにはｐｉｇｇｙＢＡＣ末端反復（ｐＢ−ＴＲ）が隣接している。プロモーター、ポリアデニル化配列、およびイントロンは、相同組換えの確率を低減するために可能な限り異なるように選択される。この場合では、ｒｅｖカセットはＲＳＶプロモーターを含有し、ＲＤ−ＰＲＯカセットはＳＶ４０／フェリチン重鎖複合プロモーターを含有し、ｇａｇｐｏｌカセットはＣＭＶ／βアクチン複合プロモーターを含有する。各レンチウイルスエレメントは、表面エピトープマーカーと共発現される。ＲｅｖおよびＲＤ−ＰＲＯカセットにおける共発現は、ＦＭＤ様２Ａペプチドを用いて達成される。ｇａｇｐｏｌカセットにおける共発現は、ＩＲＥＳを用いて達成される。ＲＤ−ＰＲＯは、効率的な発現のためにイントロンを必要とする。これは、マウスＥＦアルファ５’ＵＴＲによって提供される。ｇａｇｐｏｌカセットは、発現を向上させるため、ウサギβグロビン由来のイントロンならびに足場付着領域（ＳＡＲ）を含有する。
（実施例５）
最適なレンチウイルスプロデューサー細胞の選択
図１は、安定なレンチウイルスプロデューサー株の生成のためのスキームを示す。上述のように、２９３Ｔ細胞にレンチウイルスヘルパープラスミドをコトランスフェクトする。レンチウイルス移入ベクターもコトランスフェクトする。移入ベクター導入遺伝子のうちの１つはＲＱＲ８であり、これは、タグと同様にパッケージング細胞の表面上で容易に検出される。ヘルパープラスミドと同様、移入ベクターにはｐｉｇｇｙＢＡＣ末端反復が隣接している。ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼを供給する発現プラスミドもコトランスフェクトする。ある期間の培養後、ヘルパーカセットおよび導入遺伝子カセットの永久発現がフローサイトメトリーによって容易に検出され得る。図６は、レンチウイルスヘルパーカセットおよび移入ベクターが安定に転位した２９３Ｔを示す。４つすべてのタグを独立して検出することができ、異なるエレメントを所望の量で発現する細胞の集団にゲーティング（一例のゲートは図６に示されている）およびフローソーティングを行うことができる。多数のこれら「バルク」転位細胞がフローサイトメトリーソーティングによってソーティングされ、高い導入遺伝子および最適な相対発現を有する細胞集団（複数可）が正確に選択される。これらは、フローソーターによって単一細胞として直接ソーティングされる。これらは９６ウェルプレートまたは３８５ウェルプレートのウェルを満たすように増やされ、上清が力価測定される。力価の最も高いクローンがウイルス産生のために選択される。
（実施例６）
安定に転位したタグ付きｇａｇｐｏｌ発現カセットからのレンチウイルスベクター産生
レンチウイルスｇａｇｐｏｌが転位され得る発現カセットを生成した（カセットにはｐｉｇｇｙＢＡＣ末端反復が隣接していた。図１０を参照されたい）。さらに、ｇａｇｐｏｌを表面発現マーカー遺伝子と共発現させた。このプラスミドと、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼを提供した発現プラスミドとを、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞を１０日間培養して、発現を安定化させた（すなわち、トランスフェクションからの一過性発現を失わせ、安定に転位した細胞からの発現のみを残した）。マーカー遺伝子について染色することにより、２９３Ｔ細胞をフローサイトメトリーソーティングによって低発現、中発現、および高発現の細胞にソーティングした。これらの２９３Ｔ細胞集団をソーティング後に増やし、次いでＲＤ１１４エンベロープ、ＲＥＶ、および移入ベクターをトランスフェクトした。上清を採取し、２９３Ｔ細胞において力価測定した。
安定な転位したｇａｇｐｏｌは、ベクター産生をもたらすことができた。低発現細胞は、より高い力価を生じた。このことは、フローソーティング中に可能な細胞集団の慎重なゲーティングが、特に生産的な細胞集団またはクローンの同定に役立ち得ることを示唆する（図７）。
（実施例７）
安定に転位したタグ付き移入ベクターカセットからのレンチウイルスベクター産生
ｐｉｇｇｙＢＡＣ末端反復が隣接した表面発現エピトープマーカーでタグ付けされたレンチウイルス移入ベクターを生成した（図９を参照されたい）。このカセットと、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼを供給した第２の発現カセット（ｃａａｓｓｅｔｔｅ）とを、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞を１０日間培養して、発現を安定化させた（すなわち、一過性発現を消失させた）。マーカー遺伝子について染色することにより、高発現または低発現の細胞について２９３Ｔ細胞をソーティングすることができた。マーカーを発現していない細胞は除外することができた。これらの２９３Ｔ細胞を培養し、ｇａｇｐｏｌ、ＲＤ１１４エンベロープ、およびＲＥＶを供給するプラスミドをトランスフェクトした。上清を２９３Ｔ細胞において力価測定した。
力価測定は、ウイルスベクターが産生されたことを示した。生産性はマーカー遺伝子の高発現と相関しなかった（図８を参照されたい）。
上記明細書に述べるすべての刊行物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明の記載の方法および系の種々の改変および変法は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態と関連して記載されているが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際に、本発明を実行するために記載された様式の種々の改変は、当該技術分野の当業者に明らかであり、続く特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (34)

  1. （ｉ）レトロウイルス移入ベクターを含むか、またはレトロウイルスタンパク質をコードする、第１の核酸配列と、
    （ｉｉ）細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である検出可能なマーカーをコードする、第２の核酸配列と
    を含む、核酸構築物。
  2. Ａ−Ｘ−Ｂ
    の構造を有し、
    式中
    Ａは、前記第１の核酸配列であり、Ｂは、前記第２の核酸配列であり、Ｘは、共発現配列である、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. 前記共発現配列が、ＩＲＥＳ配列または自己切断ペプチドをコードする配列を含む、請求項２に記載の核酸構築物。
  4. 前記第１の核酸配列が、ｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ、またはｒｅｖから選択されるレトロウイルスタンパク質をコードする、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
  5. 前記細胞表面タンパク質が、２００未満のアミノ酸を有する、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
  6. 前記細胞表面タンパク質の前記膜標的化ドメインが、（ｉ）膜貫通ドメイン、または（ｉｉ）ＧＰＩアンカーを含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
  7. 前記膜標的化ドメインが、ＣＤ８ストークまたはその一部を含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
  8. 前記細胞外ドメインが、ＨＡ、Ｖ５、ＲＱＲ８、またはＭＹＣを含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
  9. 前記細胞表面タンパク質が、配列番号２１〜２６として示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
  10. 前記第１および第２の核酸配列に隣接するトランスポゾン配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
  11. Ｔ１−Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｔ２
    の構造を有し、
    式中、Ａ、Ｘ、およびＢは、請求項２に記載のとおりであり、
    Ｔ１は、第１のトランスポゾン配列であり、
    Ｔ２は、第２のトランスポゾン配列である、
    請求項１０に記載の核酸構築物。
  12. Ｔ１が、配列番号６０として示される配列を含むＰｉｇｇｙＢＡＣ ５’末端反復であり、Ｔ２が、配列番号６１として示される配列を含むＰｉｇｇｙＢＡＣ ３’末端反復である、請求項１１に記載の核酸構築物。
  13. 前記請求項のいずれかに記載の複数の核酸構築物を含むキット。
  14. （ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
    （ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
    を含み、
    該第１の検出可能なマーカーおよび該第２の検出可能なマーカーが、細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質であり、かつ互いと異なる、
    請求項１３に記載のキット。
  15. （ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、ならびに細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
    をさらに含み、
    前記第１の検出可能なマーカー、前記第２の検出可能なマーカー、および該第３の検出可能なマーカーがすべて互いと異なる、
    請求項１４に記載のキット。
  16. （ｉｖ）レトロウイルス移入ベクター、ならびに細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物
    をさらに含み、
    前記第１の検出可能なマーカー、前記第２の検出可能なマーカー、前記第３の検出可能なマーカー（存在する場合）、および第４の検出可能なマーカーがすべて互いと異なる、
    請求項１４または１５に記載のキット。
  17. 請求項１から１２のいずれかに記載の核酸構築物を含むプラスミド。
  18. 請求項１７に記載の複数のプラスミドを含む、請求項１３から１６のいずれかに記載のキット。
  19. 細胞外ドメインおよび膜標的化ドメインを含む細胞表面タンパク質である少なくとも１つの検出可能なマーカーを発現する請求項１から１２のいずれかに記載の核酸構築物を含む、パッケージング細胞。
  20. （ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
    （ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
    を含み、
    該第１の検出可能なマーカーおよび該第２の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する、
    請求項１９に記載のパッケージング細胞。
  21. （ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
    をさらに含み、
    前記第１の検出可能なマーカー、前記第２の検出可能なマーカー、および該第３の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する、
    請求項２０に記載のパッケージング細胞。
  22. 請求項２０に記載の第１および第２の核酸構築物と、任意選択で、請求項２１に記載の第３の核酸構築物とを含み、
    （ｉｉｉ）レトロウイルス移入ベクター、および第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物
    をさらに含み、
    前記第１の検出可能なマーカー、前記第２の検出可能なマーカー、前記第３の検出可能なマーカー（存在する場合）、および該第４の検出可能なマーカーを細胞表面で共発現する、
    プロデューサー細胞。
  23. 請求項１９から２１のいずれかに記載のパッケージング細胞または請求項２２に記載のプロデューサー細胞であって、前記核酸構築物またはそれぞれの核酸構築物が該細胞ゲノム内に安定に組み込まれている、パッケージング細胞またはプロデューサー細胞。
  24. ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０、３Ｔ３、またはＫ５６２細胞である、請求項１９から２３のいずれかの請求項に記載のパッケージング細胞またはプロデューサー細胞。
  25. 請求項１から１２のいずれかに記載の１つもしくは複数の核酸構築物、請求項１７に記載の１つもしくは複数のプラスミド、請求項１３から１６のいずれかに記載の核酸構築物のキット、または請求項１８に記載のプラスミドのキットを細胞に導入するステップを含む、請求項１９から２４のいずれかに記載のパッケージング細胞またはプロデューサー細胞を作製するための方法。
  26. 前記核酸構築物またはそれぞれの核酸構築物によってコードされる前記検出可能なマーカーまたはそれぞれの検出可能なマーカーの発現について選択することにより、請求項１９から２４のいずれかに記載のパッケージング細胞またはプロデューサー細胞を選択するための方法。
  27. 前記細胞が複数の検出可能なマーカーを発現し、該細胞がマルチパラメータフローサイトメトリーを使用して選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. （ａ）複数の細胞に、
    （ｉ）ｇａｇ−ｐｏｌ配列、および第１の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第１の核酸構築物と、
    （ｉｉ）ｅｎｖ配列、および第２の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第２の核酸構築物と
    を導入するステップと、
    （ｂ）該第１の検出可能なマーカーおよび該第２の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択するステップと
    を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. ステップ（ａ）が、前記複数の細胞に、
    （ｉｉｉ）ｒｅｖ配列、および第３の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第３の核酸構築物
    を導入することをさらに含み、
    ステップ（ｂ）が、前記第１の検出可能なマーカー、前記第２の検出可能なマーカー、および該第３の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択することをさらに含む、
    請求項２８に記載の方法。
  30. ステップ（ａ）が、前記複数の細胞に、
    （ｉｖ）レトロウイルス移入ベクター、および第４の検出可能なマーカーをコードする配列を含む、第４の核酸構築物
    を導入することをさらに含み、
    ステップ（ｂ）が、前記第１の検出可能なマーカー、前記第２の検出可能なマーカー、該第４の検出可能なマーカー、および任意選択で前記第３の検出可能なマーカーを共発現する細胞を選択することをさらに含む、
    請求項２８または２９に記載の方法。
  31. ステップ（ａ）が、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポサーゼをコードする核酸配列を導入することをさらに含む、請求項２８から３０のいずれかに記載の方法。
  32. 請求項２２に記載のプロデューサー細胞を培養するステップと、レトロウイルスベクターを単離するステップとを含む、該レトロウイルスベクターを産生するための方法。
  33. 請求項１９から２１、２３または２４のいずれかに記載のパッケージング細胞にレトロウイルスベクターゲノムを導入するステップと、レトロウイルスベクターを単離するステップとを含む、該レトロウイルスベクターを産生するための方法。
  34. 前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３２または３３に記載の方法。
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