CN108359014A - 含有dhav-1 2a1-p的多肽及其介导的多蛋白共表达方法 - Google Patents

含有dhav-1 2a1-p的多肽及其介导的多蛋白共表达方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含有DHAV‑1 2A1‑P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV‑1 2A1‑P氨基酸序列，该多肽的氨基酸序列从C端起计数，氨基酸数量大于10。多蛋白共表达方法，包括以下步骤：合成编码上述多肽的基因片段以及所要共表达的基因片段，将这些基因片段通过重叠PCR技术进行重叠，得到基因大片段，再将该基因大片段和载体质粒通过酶切、连接，得重组质粒，将重组质粒转化感受态细胞进行表达，获得独立的多种蛋白。此方法不需要插入额外的蛋白酶位点，在翻译过程中自动进行断裂，翻译完成后形成独立的蛋白，同时不会影响所需蛋白的功能。

Description

含有DHAV-1 2A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种含有DHAV-1 2A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由小RNA病毒科中的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus I，DHAV-1)引起的雏鸭的一种急性，出血性，高度致死性疾病。鸭病毒性肝炎主要以雏鸭发生肝炎，肝脏肿大及出血，质度脆，脾脏肿胀坏死和肾肿胀为病理特征，具有高度传染性和接触性，发病迅速，死亡率高，日龄越小，发病率和死亡率越高，呈世界性分布。临床表现为发病初期病鸭精神萎靡，食欲减退，废绝，眼半闭呈昏睡状，以头触地，半天至一天后出现神经症状，运动失调，身体倒向一侧，两脚痉挛，死鸭呈现角弓反张状，两脚伸直向后张开呈特殊姿势。最急性病毒，可不见任何异常而突然抽搐痉挛死亡。该病一年四季均可爆发，对养殖业造成了巨大的经济损失。
鸭甲肝病毒属于单股正链RNA病毒，其基因组结构由5’非编码区(5’untranslation region，5’UTR)、一个大的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)、3’非编码区(3’UTR)和poly(A)尾组成，当ORF在宿主细胞中表达出多聚蛋白后，被病毒自身编码的蛋白酶切割为成熟蛋白。多聚蛋白首先分解成P1、P2和P3产物，其次，P1、P2和P3又进一步分别分解为VP0、VP1和VP3，2A1、2A2、2A3、2B、2C和3A、3B、3C和3D蛋白。P1编码结构蛋白(VP0、VP1和VP3)，P2和P3区编码非结构蛋白(2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C和3D)，因此，DHAV-1基因组结构为：5’UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR-poly(A)。
传统的用于多蛋白共表达策略主要有：(1)多启动表达载体：在同一个载体中插入多个独立的转录单元，每个转录单元有自己的启动子和ORF，其缺点是基因表达水平不平衡，在某些细胞系中，启动子之间产生干扰，甚至发生基因重排，而且转录单元数有限制。(2)剪切载体：利用同一个启动子，形成一个完整的转录本；初级转录本在剪切信号处断裂形成独立的次级mRNA，分别翻译成不同的蛋白。缺点是剪切信号机制不清楚，很难控制。(3)融合蛋白：将多个蛋白顺序连接，在同一个启动子的转录下，形成一个完整的转录本，翻译成一个融合蛋白。因为产物是融合蛋白，蛋白不会分离，可能会影响某个蛋白的功能，且达不到获得某种蛋白的目的。(4)插入蛋白酶切位点：Furin是真核细胞中高度保守的一种蛋白酶，定位在高尔基体上，能特异性识别Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg位点。利用这个特性，可以在蛋白连接处加入这个蛋白酶识别位点，这样融合蛋白翻译后在高尔基体处被Furin所切割。由于Furin定位在高尔基体上，内质网和高尔基体加工的蛋白通常是分泌蛋白和膜结合蛋白，生物体中还有相当数量的蛋白存在细胞质中的，并不都需要内质网和高尔基体加工，这极大的限制了该方法的应用。(5)加入内部核糖体进入位点IRES：IRES能独立地起始翻译。IRES可以用于连接多个ORF，每个ORF翻译是独立的，其优点在于翻译后的蛋白是分开的。但是其缺点是序列较长结构较大，一般有几百个碱基，容易影响表达蛋白的结构和功能。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种含有DHAV-1 2A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV-1 2A1-P氨基酸序列，多蛋白共表达方法是在编码2A1-P氨基酸的基因片段上连接2个或2个以上的基因片段，然后进行表达，表达后的蛋白各自独立，且不会影响表达蛋白的功能。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种含有DHAV-1 2A1-P的多肽，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV-1 2A1-P氨基酸序列，该多肽的氨基酸序列从C端起计数，氨基酸数量大于10。
进一步地，该多肽的氨基酸序列还包括向DHAV-1 2A1的上游VP1延伸的氨基酸序列。
一种多蛋白共表达方法，包括以下步骤：
(1)合成编码上述含有DHAV-1 2A1-P的多肽的基因片段并进行PCR扩增；
(2)合成编码所要共表达的基因片段并进行PCR扩增；
(3)将步骤(1)所得基因片段与步骤(2)所得基因片段通过重叠PCR技术进行基因片段的重叠，得到所要表达的基因大片段；
(4)将步骤(3)所得基因大片段和载体质粒通过酶切、连接，得重组质粒；
(5)将重组质粒转化感受态细胞进行表达，获得独立的多种蛋白。
进一步地，步骤(2)中所要共表达的基因片段为2个或2个以上。
进一步地，步骤(1)和步骤(2)中PCR扩增体系为：DMA 2μL，高保真酶25μL，20mmol/L的上游和下游引物各2μL，然后用ddH2O补足至50μL。
进一步地，步骤(1)和步骤(2)中PCR扩增程序为：98℃预变性2min，98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
进一步地，步骤(3)中重叠PCR第一轮体系为：报告基因2pmol，所要连接的基因片段1pmol，高保真酶10μL，然后用ddH2O补足至20μL；重叠PCR第一轮反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火5s、72℃延伸2min，共6个循环；
重叠PCR第二轮体系：在第一轮体系基础上加入最上游引物和最下游引物各0.5μl；反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火5s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
进一步地，步骤(4)中酶切体系：BamHI 1.0μL，XhoⅠ1.0μL，10×Quick Buffer 5.0μL，质粒/基因大片段1.0μg，然后用ddH2O补足至50μL。
本发明提供的一种含有DHAV-1 2A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法，具有以下
有益效果：
DHAV-1中2A1与2A2之间肽键的断裂是基于核糖体跳跃机制，在病毒翻译完2A1后，2A1和2A2之间不形成肽键，核糖体在没有肽键的情况下继续翻译后面的2A2氨基酸，从而形成分开的2A1和2A2蛋白。因此，将所要表达的基因片段与含有DHAV-1 2A1-P的片段利用重叠PCR技术进行片段的重叠，便可得到所要表达的基因大片段，将该基因大片段再连接到表达载体上，最后转染到细胞内进行表达，便可得到所要的表达蛋白。此方法不需要插入额外的蛋白酶位点，也就不需要额外的蛋白酶进行加工，此方法是在翻译过程中自动进行断裂，翻译完成后形成独立的蛋白。因2A1-P序列很短，翻译后的蛋白质量小，因此，不会影响所需蛋白的功能；同时，可以在2A1-P两边连接多个所要表达的基因片段，表达后的每种蛋白都是分离且独立的，可以将其应用于多介菌苗生产时，不会对免疫效果造成影响，对细胞和物种也没有特异性。
附图说明
图1为用含有2A1-P的序列的6种DHAV-1基因片段连接EGFP和RFP报告基因的展示图。
图2为7种载体种的EGFP基因扩增图。
图3为含有2A1-P的6种基因序列的扩增图。
图4为7种载体中RFP的扩增图。
图5为含有连接序列的基因片段重叠图。
图6为E-R片段的重叠图。
图7为pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R的菌落PCR鉴定图。
图8为pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R的菌落PCR鉴定图。
图9为pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R的菌落PCR鉴定图。
图10为pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R的菌落PCR鉴定图。
图11为pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R的菌落PCR鉴定图。
图12为pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R的菌落PCR鉴定图。
图13为pcDNA3.1-E-R的菌落PCR鉴定图。
图14为pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R的双酶切鉴定图。
图15为pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R的双酶切鉴定图。
图16为pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R的双酶切鉴定图。
图17为pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R和pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R的双酶切鉴定图。
图18为pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R的双酶切鉴定图。
图19为pcDNA3.1-E-R的双酶切鉴定图。
图20为Western Blot观察表达图。
具体实施方式
本发明提供的多蛋白共表达方法可用于真核表达多个蛋白，可用于开发多介菌苗及提高多介菌苗的效率和免疫效果，还可以应用于病毒载体中进行的多蛋白表达，同时不限物种和细胞类型。现以含有2A1-P的序列连接双报告基因EGFP和RFP的真核共表达为例，具体操作如下：
一、准备材料
真核表达质粒pcDNA3.1(+)，购自invitrogen公司；质粒pEGFP-N1和pDsRed-Express-C1，均购自Clontech；pMD19-DHAV-1，由四川农业大学禽病研究中心提供。
二、真核表达载体的构建
选择5条含有2A1-P(此处P是指脯氨酸)的氨基酸序列，用这5条序列连接EGFP和RFP两种报告基因(图1)，然后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中；其中，2A1-P的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第一条除2A1-P序列外，向VP1片段延伸10个氨基酸序列，用此序列连接的片段命名为E-VP1(10)-2A1-P-R，此载体命名为pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R；第二条除2A1-P序列外，向VP1片段延伸5个氨基酸序列，用此序列连接的片段命名为E-VP1(5)-2A1-P-R，此载体命名为pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R；第三条只含有完整的2A1-P序列，用此序列连接的片段命名为E-2A1(20)-P-R，此载体命名为pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R；第四条是只含有2A1的C端18个氨基酸的2A1-P序列，用此序列连接的片段命名为E-2A1(18)-P-R，此载体命名为pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R；第5条是只含有2A1的C端12个氨基酸的2A1-P序列，用此序列连接的片段命名为E-2A1(12)-P-R，此载体命名为pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R。除上述载体5个载体之外，还构建了一个只含有2A1的C端10个氨基酸的2A1-P序列连接重组蛋白的对照载体，用此序列连接的片段命名为E-2A1(10)-P-R，此载体命名为pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R；一个不含有任何连接序列的EGFP-RFP载体，此片段命名为E-R，此载体命名为pcDNA3.1-E-R。
第一步、设计引物
1、pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R的引物设计
(1)克隆EGFP基因的引物设计
根据EGFP基因序列如SEQ ID NO:3所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-cgcggatcccgccaccatggtgagcaagg-3’(SEQ ID NO:4，划线部分为BamHⅠ酶切位点，酶切位点前的三个碱基为保护性碱基)；下游引物：5’-agatcgagttcaaatgctagcttgtacagctcgtccatgc-3’(SEQ ID NO:5，划线部分为往VP1方向延伸10个氨基酸后的DNA序列的前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(2)克隆DHAV-1VP1(10)-2A1-P基因的引物设计
根据VP1(10)-2A1-P基因序列如SEQ ID NO:6所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-gcatggacgagctgtacaagctagcatttgaactcgatct-3’(SEQ ID NO:7，划线部分为EGFP基因序列的后20个碱基)；下游引物：5’-acgtcctcggaggaggccataggtcctgggttcggttcca-3’(SEQ ID NO:8，划线部分为RFP基因前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(3)克隆RFP基因的引物设计
根据RFP基因序列SEQ ID NO:9，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-tggaaccgaacccaggacctatggcctcctccgaggacgt-3’(SEQ ID NO:10，划线部分为2A1-P基因序列的后20个碱基)；下游引物：5’-ccgctcgagctacaggaacaggtggtggcggc-3’(SEQ ID NO:11，划线部分为XhoI酶切位点，酶切位点前三个碱基为保护性碱基)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
2、pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R的引物设计
(1)克隆EGFP基因的引物设计
根据EGFP基因序列如SEQ ID NO:3所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-cgcggatcccgccaccatggtgagcaagg-3’(SEQ ID NO:4，划线部分为BamHⅠ酶切位点，酶切位点前的三个碱基为保护性碱基)；下游引物：5’-tcagattcaatttccagatccttgtacagctcgtccatgc-3’(SEQ ID NO:12，划线部分为往VP1方向延伸5个氨基酸后的DNA序列的前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(2)克隆DHAV-1VP1(5)-2A1-P基因的引物设计
根据VP1(5)-2A1-P基因序列如SEQ ID NO:6所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-gcatggacgagctgtacaaggatctggaaattgaatctga-3’(SEQ ID NO:13，划线部分为EGFP基因序列的后20个碱基)；下游引物：5’-acgtcctcggaggaggccataggtcctgggttcggttcca-3’(SEQ ID NO:8，划线部分为RFP基因前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(3)克隆RFP基因的引物设计
根据RFP基因序列SEQ ID NO:9，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，上游引物如SEQ ID NO:10所示，下游引物如SEQ ID NO:11所示，引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
3、pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R的引物设计
(1)克隆EGFP基因的引物设计
根据EGFP基因序列如SEQ ID NO:3所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-cgcggatcccgccaccatggtgagcaagg-3’(SEQ ID NO:4，划线部分为BamHⅠ酶切位点，酶切位点前的三个碱基为保护性碱基)；下游引物：5’-ttgtttctaatttggtcagacttgtacagctcgtccatgc-3’(SEQ ID NO:14，划线部分为2A1基因前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(2)克隆DHAV-1 2A1(20)-P基因的引物设计
根据2A1(20)-P基因序列如SEQ ID NO:6所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-gcatggacgagctgtacaagtctgaccaaattagaaacaa-3’(SEQID NO:15，划线部分为EGFP基因序列的后20个碱基)；下游引物：5’-acgtcctcggaggaggccataggtcctgggttcggttcca-3’(SEQ ID NO:8，划线部分为RFP基因前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(3)克隆RFP基因的引物设计
根据RFP基因序列SEQ ID NO:9，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，上游引物如SEQ ID NO:10所示，下游引物如SEQ ID NO:11所示，引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
4、pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R的引物设计
(1)克隆EGFP基因的引物设计
根据EGFP基因序列如SEQ ID NO:3所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：
上游引物：5’-cgcggatcccgccaccatggtgagcaagg-3’(SEQ ID NO:4，划线部分为BamHⅠ酶切位点，酶切位点前的三个碱基为保护性碱基)；
下游引物：5’-tctttcttgtttctaatttgcttgtacagctcgtccatgc-3’(SEQ ID NO:16，划线部分为2A1只含有C端18个氨基酸时的前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(2)克隆DHAV-1 2A1(18)-P基因的引物设计
根据2A1(18)-P基因序列如SEQ ID NO:6所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-gcatggacgagctgtacaagcaaattagaaacaagaaaga-3’(SEQID NO:17，划线部分为EGFP基因序列的后20个碱基)；下游引物：5’-acgtcctcggaggaggccataggtcctgggttcggttcca-3’(SEQ ID NO:8，划线部分为RFP基因前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(3)克隆RFP基因的引物设计
根据RFP基因序列SEQ ID NO:9，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，上游引物如SEQ ID NO:10所示，下游引物如SEQ ID NO:11所示，引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
5、pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R的引物设计
(1)克隆EGFP基因的引物设计
根据EGFP基因序列如SEQ ID NO:3所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-cgcggatcccgccaccatggtgagcaagg-3’(SEQ ID NO:4，划线部分为BamHⅠ酶切位点，酶切位点前的三个碱基为保护性碱基)；下游引物：5’-actccttcagtagtgagatccttgtacagctcgtccatgc-3’(SEQ ID NO:18，划线部分为2A1只含有C端12个氨基酸时的前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(2)克隆2A1(12)-P基因的引物设计
根据2A1(12)-P基因序列如SEQ ID NO:6所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-gcatggacgagctgtacaaggatctcactactgaaggagt-3’(SEQID NO:19，划线部分为EGFP基因序列的后20个碱基)；下游引物：5’-acgtcctcggaggaggccataggtcctgggttcggttcca-3’(SEQ ID NO:8，划线部分为RFP基因前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(3)克隆RFP基因的引物设计
根据RFP基因序列SEQ ID NO:9，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，上游引物如SEQ ID NO:10所示，下游引物如SEQ ID NO:11所示，引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
6、pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R的引物设计
(1)克隆EGFP基因的引物设计
根据EGFP基因序列如SEQ ID NO:3所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-cgcggatcccgccaccatggtgagcaagg-3’(SEQ ID NO:4，划线部分为BamHⅠ酶切位点，酶切位点前的三个碱基为保护性碱基)；下游引物：5’-ggttccactccttcagtagtcttgtacagctcgtccatgc-3’(SEQ ID NO:20，划线部分为2A1只含有C端10个氨基酸时的前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(2)克隆2A1(10)-P的引物设计
根据2A1(10)-P基因序列如SEQ ID NO:6所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物引物序列为：上游引物：5’-gcatggacgagctgtacaagactactgaaggagtggaacc-3’(SEQID NO:21，划线部分为EGFP基因序列的后20个碱基)；下游引物：5’-acgtcctcggaggaggccataggtcctgggttcggttcca-3’(SEQ ID NO:8，划线部分为RFP基因前20个碱基的反向互补序列)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(3)克隆RFP基因的引物设计
根据RFP基因序列SEQ ID NO:9，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，上游引物如SEQ ID NO:10所示，下游引物如SEQ ID NO:11所示，引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
7、pcDNA3.1-E-R的引物设计
(1)克隆EGFP基因的引物设计
根据EGFP基因序列如SEQ ID NO:3所示，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-cgcggatcccgccaccatggtgagcaagg-3’(SEQ ID NO:4，划线部分为BamHⅠ酶切位点，酶切位点前的三个碱基为保护性碱基)；下游引物：5’-gaggaggccatggtggcgttcttgtacagctcgtccatgc-3’(SEQ ID NO:22，划线部分为RFP前20个碱基的反向互补序列)。引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
(2)克隆RFP基因的引物设计
根据RFP基因序列SEQ ID NO:9，利用Primer Premier5.0软件设计一对引物，引物序列为：上游引物：5’-gcatggacgagctgtacaagaacgccaccatggcctcctc-3’(SEQ ID NO:23，划线部分为EGFP基因序列的后20个碱基)；下游引物：5’-ccgctcgagctacaggaacaggtggtggcggc-3’(SEQ ID NO:11，划线部分为XhoI酶切位点，酶切位点前三个碱基为保护性碱基)。
引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。
第二步、抽提克隆EGFP基因、含有2A1-P序列的6种基因片段和RFP基因的模板质粒
将pEGFP-N1，pDsRed-Express-C1和pMD19-DHAV-1菌种划板复苏过夜，次日分别挑取单克隆接种于含有抗性的LB中，在37℃空气摇床中震荡培养16h后进行质粒抽提。质粒抽提按OMEGA公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。
第三步、PCR扩增EGFP基因、含有2A1-P序列的6种基因片段、RFP基因和PCR产物回收
1、PCR扩增EGFP、含有2A1-P序列的6种基因片段、RFP基因，PCR反应体系为：
将上述反应体系轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR反应，反应程序为：98℃预变性2min，然后98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min，于4℃保存备用。取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片段的长度，其结果见图2-4。
图2中1为pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R中的EGFP片段，2为pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R中的EGFP片段，3为pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R中的EGFP片段，4为pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R中的EGFP片段，5为pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R中的EGFP片段，6为pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R中的EGFP片段，7为pcDNA3.1-E-R中的EGFP片段，M为marker。
图3中1为pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R中的VP1(10)-2A1-P片段，2为pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R中的VP1(5)-2A1-P片段，3为pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R中的2A1(20)-P片段，4为pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R中的2A1(18)-P片段，5为pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R中的2A1(12)-P片段，6为pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R中的2A1(10)-P片段，M为marker。
2、EGFP基因，含有2A1-P序列的6种基因片段，RFP基因PCR产物的回收按Clontech技术有限公司DNA回收纯化试剂盒说明书进行，回收后的DNA贮存于-20℃保存备用。
第四步、EGFP-X-RFP的重叠和重叠产物回收(X为连接的序列)
1、EGFP-X-RFP基因片段的重叠
重叠PCR第一轮体系：
将上述反应体系轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火5s、72℃延伸2min，共6个循环。
重叠PCR第二轮体系：在上一轮体系中加入最上游引物和最下游引物各0.5μl，轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。反应参数：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火5s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用。取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片段的长度，结果见图5-6。
图5为含有连接序列的基因片段重叠图，其中，0为空白对照，1为E-VP1(10)-2A1-P-R片段，2为E-VP1(5)-2A1-P-R片段，3为E-2A1(20)-P-R片段，4为E-2A1(18)-P-R片段，5为E-2A1(12)-P-R片段，6为E-2A1(10)-P-R片段，M为marker；1500bp位置左右的条带为重叠条带。
图6为E-R片段的重叠图；M为marker；1500bp左右的条带为重叠条带。
2、EGFP-X-RFP重叠产物回收按Clontech技术有限公司DNA回收纯化试剂盒说明书进行，回收后的DNA贮存于-20℃保存备用。
第五步、真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒的抽提
将pcDNA3.1(+)菌种划板复苏过夜，次日分别挑取单克隆接种于含有抗性的LB中，在37℃空气摇床中震荡培养16h后进行质粒抽提。质粒抽提按OMEGA公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。
第六步、质粒和重叠基因片段的双酶切和酶切产物回收
1、质粒和重叠基因片段的双酶切
将第四步中回收的产物和第五步中的质粒分别用BamH I/XhoI双酶切进行消化，酶切体系如下：
2、质粒和重叠基因片段的双酶切产物回收
按Clontech技术有限公司DNA回收纯化试剂盒说明书进行，回收后的DNA贮存于-20℃保存备用。
第七步、重叠片段EGFP-X-RFP与pcDNA3.1(+)的连接
连接反应体系如下：
将上述试剂加入PCR管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接过夜。
第八步、DH5α感受态细胞的制备
采用氯化钙法制备新鲜的DH5α株大肠杆菌感受态细胞，具体过程如下：(1)无菌挑取平板上新鲜培养的DH5α单克隆菌落接种于5mL LB培养液中，于37℃振荡培养过夜；(2)取1mL上述培养液接种于100mL LB培养液中，37℃200r/min振荡培养2.5～3h，使OD600＝0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴10min；(4)于4℃4000r/min离心8min，弃上清；(5)加10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2，温和悬起细菌沉淀，冰浴30min；(6)于4℃4000r/min离心8min，弃上清，加4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为200μL/管，-4℃冰箱中保存过夜以提高转化效率。
第九步、转化感受态细胞
将15μL连接体系全部取出加到100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；再置于42℃温浴90s，之后再冰浴2min；然后立即加入0.8mL LB培养基，37℃水浴振荡培养45min，取200μL涂于含Amp的培养基上，置37℃培养箱中培养过夜，次日观察菌落生长情况。
第十步、重组质粒的PCR鉴定
将第九步中长出的菌落挑取进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系如下
轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。
反应参数：98℃2min，然后进入98℃15s、55℃15s、72℃10s，共30个循环，最后72℃延伸7min，于4℃保存备用。取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片段的长度，其结果见图7-13。
图7为pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R的菌落PCR鉴定图，其中1，3，4，5为阳性结果，M为Marker。图8为pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R的菌落PCR鉴定图，其中0为阴性对照，1，4，6为阳性结果，M为Marker。图9为pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R的菌落PCR鉴定图，其中0为阴性对照，4，8，10为阳性结果，M为Marker。图10为pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R的菌落PCR鉴定图，其中3，5，7，8，9，10为阳性结果，M为Marker。图11为pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R的菌落PCR鉴定图，其中0为阴性对照，1为阳性结果，M为Marker。图12为pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R的菌落PCR鉴定图，其中0为阴性对照，4为阳性结果，M为Marker。图13为pcDNA3.1-E-R的菌落PCR鉴定图，其中0为阴性对照，15为阳性结果，M为Marker。
第十一步、重组质粒的酶切鉴定
将十步中鉴定正确的菌落在含Amp的LB中进行振荡培养，37℃空气摇床培养16h后抽质粒。将抽取的质粒以BamHⅠ/XhoⅠ双酶切消化后，1.0％凝胶电泳观察结果。
其中，双酶切体系为：
双酶切鉴定结果如图14-19所示。图14为pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R的双酶切鉴定图，其中，2，4为阳性结果，M1和M2为2种不同的Marker。图15为pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R的双酶切鉴定图，其中，2为阳性结果，M1和M2为2种不同的Marker。图16为pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R的双酶切鉴定图，其中，1，2，3，4为阳性结果，M1和M2为2种不同的Marker。图17为pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R和pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R的双酶切鉴定图，其中，M1和M2为2种不同的Marker。图18为pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R的双酶切鉴定图，其中，1，2，3，4为阳性结果，M1和M2为2种不同的Marker。图19为pcDNA3.1-E-R的双酶切鉴定图，其中，3，5为阳性结果，M1和M2为2种不同的Marker。
第十二步、pcDNA3.1-EGFP-X-RFP质粒测定
将鉴定正确的质粒寄送擎科生物有限公司进行测序。测序正确的质粒进行保种。
三、pcDNA3.1-EGFP-X-RFP的真核表达
第一步、pcDNA3.1-EGFP-X-RFP去内毒素质粒的抽提
将上述测序后保存的菌种划线过夜复苏，挑取单菌落接种在含Amp的LB中，37℃空气摇床振荡培养16后抽取无内毒素质粒。质粒抽提按OMEGA公司无内毒素质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。
第二步、正常鸭胚成纤维细胞(DEF)的制作方法
取10d日龄健康鸭胚，分别用体积分数为5％碘酒和体积分数为75％酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成1mm3大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(体积分数为2.5％胰蛋白酶)150μL/胚，于37℃水浴中消化3min。立即将细胞悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用6层纱布过滤，向滤液中加入体积分数为10％小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于6孔细胞板中，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。
第三步、真核表达质粒pcDNA3.1-EGFP-X-RFP的转染
取刚刚长成致密单层的DEF，用Transgen生物技术有限公司的转染试剂按照说明书进行转染。
第四步、转染后进行荧光观察
转染48h后将细胞置于荧光显微镜下进行观察，可以分别看见绿色荧光和红色荧光。
第五步、转染后收集细胞蛋白
将观察到荧光的细胞进行蛋白收集，弃掉细胞培养液，用PBS冲洗细胞两遍，加入蛋白裂解液(事先已加入蛋白抑制剂PMSF)，用细胞刮刮下细胞收集细胞于1.5mL的EP管中，于-80℃保存备用。
第六步、Western Blot检测蛋白表达情况
将第五步中收集的细胞蛋白于8000r/min离心后，弃掉细胞碎片，取上清制作蛋白样。SDS-PAGE电泳后转膜，然后将膜置于5％脱脂奶粉中，在室温进行封闭，然后分别用EGFP鼠单抗和RFP兔多抗进行一抗孵育。一抗4℃孵育过夜，完成后用TBST洗涤，洗涤完成后分别用HRP偶联的山羊抗鼠和山羊抗兔进行二抗孵育。二抗室温孵育1h，完成后用TBTS洗涤。洗涤完成后将膜置于成像仪下照相，观察蛋白表达情况，其结果见图20，其中1为pcDNA3.1-E-VP1(10)-2A1-P-R的表达，2为pcDNA3.1-E-VP1(5)-2A1-P-R中的表达，3为pcDNA3.1-E-2A1(20)-P-R中的表达，4为pcDNA3.1-E-2A1(18)-P-R中的表达，5为pcDNA3.1-E-2A1(12)-P-R中的表达，6为pcDNA3.1-E-2A1(10)-P-R中的表达，7为pcDNA3.1-E-R中的表达。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 含有DHAV-1 2A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Duck
<400> 1
Ser Asp Gln Ile Arg Asn Lys Lys Asp Leu Thr Thr Glu Gly Val Glu
1 5 10 15
Pro Asn Pro Gly Pro
20
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> Duck
<400> 2
tctgaccaaa ttagaaacaa gaaagatctc actactgaag gagtggaacc gaacccagga 60
cct 63
<210> 3
<211> 724
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 60
gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 120
cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 180
gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 240
catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 300
catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 360
caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 420
ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 480
gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 540
gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 600
caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 660
catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 720
caag 724
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcggatccc gccaccatgg tgagcaagg 29
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agatcgagtt caaatgctag cttgtacagc tcgtccatgc 40
<210> 6
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctagcatttg aactcgatct ggaaattgaa tctgaccaaa ttagaaacaa gaaagatctc 60
actactgaag gagtggaacc gaacccagga cct 93
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcatggacga gctgtacaag ctagcatttg aactcgatct 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgtcctcgg aggaggccat aggtcctggg ttcggttcca 40
<210> 9
<211> 678
<212> DNA
<213> Lentinus edodes
<400> 9
atggcctcct ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60
tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120
acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180
ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240
gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300
gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctc cttcatctac 360
aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagact 420
atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480
atccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540
tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggactc caagctggac 600
atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcgc cgagggccgc 660
caccacctgt tcctgtag 678
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggaaccgaa cccaggacct atggcctcct ccgaggacgt 40
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgctcgagc tacaggaaca ggtggtggcg gc 32
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcagattcaa tttccagatc cttgtacagc tcgtccatgc 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcatggacga gctgtacaag gatctggaaa ttgaatctga 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttgtttctaa tttggtcaga cttgtacagc tcgtccatgc 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcatggacga gctgtacaag tctgaccaaa ttagaaacaa 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctttcttgt ttctaatttg cttgtacagc tcgtccatgc 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcatggacga gctgtacaag caaattagaa acaagaaaga 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
actccttcag tagtgagatc cttgtacagc tcgtccatgc 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcatggacga gctgtacaag gatctcacta ctgaaggagt 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggttccactc cttcagtagt cttgtacagc tcgtccatgc 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcatggacga gctgtacaag actactgaag gagtggaacc 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaggaggcca tggtggcgtt cttgtacagc tcgtccatgc 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcatggacga gctgtacaag aacgccacca tggcctcctc 40

Claims (8)

1.一种含有DHAV-1 2A1-P的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV-1 2A1-P氨基酸序列，该多肽的氨基酸序列从C端起计数，氨基酸数量大于10。
2.根据权利要求1所述的含有DHAV-1 2A1-P的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列还包括向DHAV-1 2A1的上游VP1延伸的氨基酸序列。
3.一种多蛋白共表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成编码权利要求1或2所述多肽的基因片段并进行PCR扩增；
(2)合成编码所要共表达的基因片段并进行PCR扩增；
(3)将步骤(1)所得基因片段与步骤(2)所得基因片段通过重叠PCR技术进行基因片段的重叠，得到所要表达的基因大片段；
(4)将步骤(3)所得基因大片段和载体质粒通过酶切、连接，得重组质粒；
(5)将重组质粒转化感受态细胞进行表达，获得独立的多种蛋白。
4.根据权利要求3所述的多蛋白共表达方法，其特征在于，步骤(2)中所要共表达的基因片段为2个或2个以上。
5.根据权利要求3所述的多蛋白共表达方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中PCR扩增体系为：DMA 2μL，高保真酶25μL，20mmol/L的上游和下游引物各2μL，然后用ddH2O补足至50μL。
6.根据权利要求3所述的多蛋白共表达方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中PCR扩增程序为：98℃预变性2min，98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
7.根据权利要求3所述的多蛋白共表达方法，其特征在于，步骤(3)中重叠PCR第一轮体系为：报告基因2pmol，所要连接的基因片段1pmol，高保真酶10μL，然后用ddH2O补足至20μL；重叠PCR第一轮反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火5s、72℃延伸2min，共6个循环；
重叠PCR第二轮体系：在第一轮体系基础上加入最上游引物和最下游引物各0.5μl；反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火5s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
8.根据权利要求3所述的多蛋白共表达方法，其特征在于，步骤(4)中酶切体系：BamHI1.0μL，XhoⅠ1.0μL，10×Quick Buffer 5.0μL，质粒/基因大片段1.0μg，然后用ddH2O补足至50μL。
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