CN105385693B - 一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，通过在其基因片段的上游及下游引入限制酶酶切位点，经酶切、连接，得到人表皮生长因子成熟肽基因的串联重复序列，克服人表皮生长因子分子量小，表达量不够的问题，同时在人表皮生长因子基因片段的上游引入kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点，以保证重组表达的目的蛋白经由酵母固有的kex2酶切割为单体，显著提高表达量，并具有天然的N末端，C端只有一个氨基酸残基的差异却没有冗余氨基酸，而活性却没改变，因其在毕赤酵母中自然合成，可以保持蛋白质原有的天然状态的空间构象，进而实现了人表皮生长因子的高效规模化制备。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术，具体涉及一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法。
背景技术
随着基因工程技术的发展，一些具有生物活性的小分子多肽受到高度重视。人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)，又称尿抑胃素，是一种由53个氨基酸组成的约6kD的多肽，主要在十二指肠Brunner氏腺中产生。hEGF在临床医学领域的应用主要是：(1)促进外科手术伤口及难愈合创面的愈合。近年来，hEGF在人体烧伤、创伤、糖尿病性皮肤溃疡、褥疮、静脉曲张性皮肤溃疡上的应用较为广泛，并获得良好效果。(2)促进眼角膜创伤的愈合。EGF能促进角膜上皮细胞的增殖以用来治疗角膜损伤、溃疡、酸碱烧伤以及促进移植角膜的存活。(3)对胃肠道溃疡的治疗作用。hEGF有抑制胃酸分泌，防止胃、十二指肠粘膜损伤及促进胃、十二指肠溃疡愈合的作用。(4)抗肿瘤作用。此外，hEGF在化妆品领域也有很宽广的应用前景。
目前，作为活性多肽的人表皮生长因子的制备多采用生物提取、化学合成或者基因重组的方法。应用基因工程方法制备重组人表皮生长因子已有大量报道，但以往的表达都是单拷贝，即使在拷贝丰富的菌株中，由于人表皮生长因子分子量很小，表达量也不能达到满意的效果，造成宿主表达潜能浪费，产量较低。
将多肽基因进行串联表达可解决单拷贝表达产量低的原因：(1)串联增加了多肽基因数量，有利于提高表达量；(2)串联多聚体形式的表达可有效屏蔽宿主毒性；(3)多聚体表达产物更稳定。因此，对人表皮生长因子采用构建多聚体的方法对于提高表达量具有突出的优势。
发明内容
本发明的目的就在于为解决现有技术的不足而提供一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法。
本发明的目的是以下述技术方案实现的：
一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，包括以下步骤：
（1）人表皮生长因子基因片段的获得：设计引物，在人表皮生长因子基因上游引入限制性内切酶酶切位点和酵母菌kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR，并引入限制性内切酶酶切位点，PCR扩增出目的片段；
（2）人表皮生长因子定向多拷贝克隆：步骤（1）中扩增出的目的片段经限制性内切酶酶切、连接，得到目的基因的定向多拷贝克隆；
（3）人表皮生长因子定向多拷贝克隆的酵母表达：将步骤（2）得到的定向多拷贝克隆转化至毕赤酵母中培养，经酵母菌本身的kex2酶自剪切，获得重组的目的蛋白单体。
步骤（1）中人表皮生长因子基因上游引入的限制性内切酶酶切位点为EcoR I和Bg1 II；下游引入的限制性内切酶酶切位点为BamH I、Not I、Sal I。
所述步骤（1）中的引物为：
所述步骤（1）为：将引物通过SOE法获得人表皮生长因子基因片段。
所述步骤（2）为：将步骤（1）获得的目的片段经EcoR I和Sal I双酶切，与同样双酶切的质粒PUC57连接，构建的质粒记作PUC57-hEGF，PUC57-hEGF经Bgl II/ NotI双酶切后回收hEGF片段；同时经BamH I/ NotI，双酶切后回收PUC57-hEGF片段，将回收的目的片段经T4连接酶连接，连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中，筛选得到2拷贝人表皮生长因子串联基因；在此基础上，继续进行酶切、连接可分别得到3拷贝、4拷贝、5拷贝的人表皮生长因子串联基因。
步骤（3）为：将步骤（2）获得的含有人表皮生长因子1-5串联基因的质粒分别经EcoR I/Not I双酶切，与同样双酶切的pPIC9K载体连接，经电转化至毕赤酵母GS115，筛选得到阳性重组子，然后进行诱导表达，获得重组的目的蛋白单体。
本发明通过在人表皮生长因子基因片段的上游及下游引入限制酶酶切位点，经酶切、连接，得到人表皮生长因子成熟肽基因的串联重复序列，克服人表皮生长因子分子量小，表达量不够的问题，同时在人表皮生长因子基因片段的上游引入kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点(EKR)，由于kex2酶切位点为酵母本身的蛋白酶kex2裂解位点，以保证重组表达的目的蛋白经由酵母固有的kex2酶切割为单体，显著提高表达量，而无需其它酶的切割处理，并具有天然的N末端， C端只有一个氨基酸残基的差异却没有冗余氨基酸，而活性却没改变，因其在毕赤酵母中自然合成，可以保持蛋白质原有的天然状态的空间构象，进而实现了人表皮生长因子的高效规模化制备。
附图说明
图1是人表皮生长因子基因克隆至pMD19-T载体的检测结果；M：DNA marker；1-5：随即挑选的阳性克隆子菌液PCR结果；
图2是人表皮生长因子基因2-4拷贝串联序列的克隆的检测结果；M：DNA marker；1：PUC57-2hEGF质粒PCR结果；2-3：PUC57-3hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；4-7：PUC57-4hEGF阳性克隆子菌液PCR结果。
图3是hEGF基因5拷贝串联序列的克隆的检测结果；M：DNA marker；1：PUC57-4hEGF质粒PCR结果；2-4：PUC57-5hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；
图4是hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果；M：DNA marker；1-5：随即挑选的阳性克隆子菌液PCR结果；6：空载pPIC9K载体PCR结果；
图5是2拷贝hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果；M：DNA marker；1-6：随即挑选的pPIC9K-2hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；7：pPIC9K-hEGF质粒PCR结果；
图6是3-4拷贝hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果；
M：DNA marker；1-4：随即挑选的pPIC9K-3hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；5-9：随即挑选的pPIC9K-4hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；
图7是hEGF基因5拷贝串联序列的克隆检测结果；M：DNA marker；1-4：pPIC9K-5hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；
图8是EGF1-5串联表达载体EcoR I/Not I双酶切鉴定；M：DNA marker；1-5：1-5串联表达载体双酶切结果；
图9是单拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M：Proteinmolecular marker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果；
图10是2拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M：Proteinmolecular marker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果；
图11是3拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；
M：Protein molecular marker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果；
图12是4拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M：Proteinmolecular marker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果；
图13是5拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；
M：Protein molecular marker；1-4：菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果。
具体实施方式
本发明提供的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法具有普遍应用性，其具有如下设计方案：
1、根据基因组数据库获得编码人表皮生长因子的基因编码区碱基序列，并商业化合成模板链和编码链寡核苷酸链。
2、合成的寡核苷酸链具有如下特征：编码链的5’端依次具有限制性内切酶EcoRI、Bgl II酶切位点序列、酵母kex2酶切位点序列，3’端依次修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR，并引入BamH I、Not I、SalI酶切位点序列。
3、上述编码链克隆至PUC57载体中，依次经Bgl II/Not I、BamH I/Not I双酶切，回收目的片段，连接，依次进行，从而获得含有高拷贝的人表皮生长因子基因片段定向连接单元。
4、所获得的高拷贝的人表皮生长因子基因片段定向连接序列经EcoR I/Not I双酶切后回收目的片段连接到pPIC9K载体上，经电转化至毕赤酵母GS115。
5、所述切割位点序列被毕赤酵母内kex2酶自剪切形成活性单体，得到的重组目的多肽N端为天然末端，C末端与天然多肽只有一个氨基酸差异。
6、所述多肽单体混合物经高效液相色谱（HPLC）方法进行深度纯化。
7、所述纯化后的感兴趣多肽单体产物的活性测定。
在本发明中，术语“定向”是指感兴趣多肽基因DNA片段按照编码链5’-3’方向相互连接，还指表达多肽产物按氨基端-羧基端方向相互连接。
在本发明中，术语“多拷贝”是指感兴趣多肽基因DNA片段大于或等于两个拷贝数。
本发明具体制备方法如下：
一、人表皮生长因子成熟肽基因的克隆
1商业化合成人表皮生长因子成熟肽基因寡核苷酸片段
根据毕赤酵母对密码子的偏好性，对人表皮生长因子成熟肽编码基因进行优化，在不改变氨基酸序列的情况下，用毕赤酵母使用频率较高的密码子代替稀有密码子，设计了6条Oligo，其中每相邻的Oligo有15-16个碱基互补。Oligo由Invitrogen生物科技有限公司合成。
人表皮生长因子成熟肽基因的克隆
上述合成的核苷酸片段通过SOE(Splicing by Overlap Extension)法获得人表皮生长因子的编码基因。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液(购于宝生物工程有限公司)5μL，dNTP(购于宝生物工程有限公司)4μL，TaqDNA聚合酶(购于宝生物工程有限公司)0.25μL，Oligo1(10μmol/L)和Oligo6(10μmol/L)各5μL，Oligo2-Oligo5(10μmol/L)各0.2μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，70℃变性30s；30℃退火30s，37℃延伸30s，70℃保持60s；其后94℃预变性5min，然后进行33个循环的60℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后再72℃保持5min，冷却4℃。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果正确的，进行凝胶回收纯化后连接到pMD19T(购于宝生物工程有限公司)，鉴定结果见图1，图1中泳道M为DNA marker(购于宝生物工程有限公司)；泳道1-3为随即挑选的阳性克隆子菌液PCR结果，从图1可以看出，3个克隆子皆为阳性克隆子。再将阳性克隆转化到菌株大肠杆菌DH5α(购于北京全式金生物技术有限公司)，制备新鲜菌液，并由Invitrogen生物科技有限公司测序，测序结果表明为正确的人表皮生长因子编码基因。
编码链的5’端依次具有限制性内切酶端依次具有限制性内切酶EcoR I(gaattc)、Bgl II(agatct)酶切位点序列、酵母kex2酶切位点序列(gagaaaaga)，3’端依次具有酵母kex2酶切位点序列(gagaagaga)、BamH I(ggatcc)、Not I(gcggccgc)Sal I(gtcgac)酶切位点序列。
修改优化后人表皮生长因子的基因序列为：（划线部分为与原来的人表皮生长因子不同的序列）
5-aactctgactctgagtgtccattgtcccacgacggttactgtttgcacgacggtgtctgtatgtacatcgaagctttggacaagtacgcttgtaactgtgtcgttggttacatcggtgagagatgtcaatacagagacttgaagtggtgggagaagaga-3（SEQ ID NO:7）；
3 人表皮生长因子基因片段多拷贝定向克隆
将步骤2所得测序正确的人表皮生长因子编码基因用EcoR I(购于宝生物工程有限公司)和Sal I(购于宝生物工程有限公司)双酶切凝胶回收纯化后连接到同样双酶切的载体PUC57（购于杭州百细生物工程公司）上，构建的质粒记作PUC57-hEGF，进行人表皮生长因子多拷贝串联基因的拼接。经测序正确的质粒PUC57-hEGF经Bgl II/ Not I(购于宝生物工程有限公司)双酶切后回收hEGF片段；同时经BamH I/ Not I(购于宝生物工程有限公司双酶切后回收PUC57-hEGF片段，将回收的目的片段经T4连接酶(购于宝生物工程有限公司)连接，连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中，转化的菌液涂布于含Amp(生工生物工程股份有限公司)的LB平板上37℃培养14-16h进行筛选。筛选到的阳性克隆子经PCR检测，PCR产物电泳结果见图2。从图2可以看出，阳性克隆子1的PCR产物的大小与2拷贝人表皮生长因子串联基因理论值相符，然后制备新鲜菌液经Invitrogen公司测序鉴定，完成人表皮生长因子的2拷贝串联基因的构建，质粒记作PUC57-2hEGF。经测序正确的质粒PUC57-2EGF经Bgl II/Not I双酶切后回收2hEGF片段；同时经BamH I/ Not I双酶切后回收PUC57-2hEGF片段，将回收的PUC57-2hEGF片段分别与hEGF和2hEGF经T4连接酶连接，完成人表皮生长因子的3、4拷贝串联基因的构建，质粒分别记作PUC57-3hEGF和PUC57-4hEGF ，其鉴定结果见图2。图2中的阳性克隆子2、3的PCR产物的大小与3拷贝人表皮生长因子串联基因理论值相符，图2中的阳性克隆子4-6的PCR产物的大小与4拷贝人表皮生长因子串联基因理论值相符，然后制备新鲜菌液经Invitrogen公司测序鉴定，完成人表皮生长因子的3、4拷贝串联基因的构建。图2中泳道M为DNA marker；泳道1为PUC57-2hEGF阳性克隆子菌液PCR结果，泳道2-3为PUC57-3hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；泳道4-6为PUC57-4hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；泳道7为PUC57-1hEGF阳性克隆子菌液PCR结果。经测序正确的质粒PUC57-3hEGF经BamH I/NotI双酶切后回收PUC57-3hEGF片段，将回收的PUC57-3hEGF片段与2hEGF经T4连接酶连接，进行人表皮生长因子的5拷贝串联基因的构建，质粒记作PUC57-5hEGF(图3)。图3的泳道M为DNA marker；泳道1为PUC57-4hEGF的PCR结果；泳道2-4为随机挑选的PUC57-5hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；图3中的阳性克隆子2-4的PCR产物的大小与5拷贝人表皮生长因子串联基因理论值相符，然后制备新鲜菌液经Invitrogen公司测序鉴定，完成人表皮生长因子的5拷贝串联基因的构建。
二、人表皮生长因子编码基因多拷贝定向克隆构建体真核表达与纯化
1人表皮生长因子编码基因多拷贝定向克隆构建体的酵母表达
含有人表皮生长因子1-5串联基因的质粒PUC57-hEGF至PUC57-5hEGF分别经EcoRI/Not I双酶切后回收人表皮生长因子1-5串联基因，回收的片段经T4连接酶连接到经EcoRI/Not I双酶切后回收的pPIC9K载体(购于Invitrogen生物科技有限公司)上，连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中，转化的菌液涂布于含卡那霉素(生工生物工程股份有限公司)的LB平板上，37℃培养14-16h进行培养筛选。对筛选到的阳性克隆子首先进行PCR检测，结果见图4-7。其中图4的泳道M为DNA marker；泳道6为空载pPIC9K；泳道1-5为随机挑选的阳性克隆子菌液PCR结果；从图4可以看出，阳性克隆子1-5的PCR产物的大小与单拷贝人表皮生长因子表达载体理论值相符。图5的泳道M为DNA marker；泳道1-6为pPIC9K-2hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；泳道7为pPIC9K-hEGF质粒PCR结果；从图5可以看出，阳性克隆子1-5的PCR产物的大小与2拷贝人表皮生长因子表达载体理论值相符。图6中的泳道M为DNA marker；泳道1-4为pPIC9K-3hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；泳道5-9为pPIC9K-4hEGF阳性克隆子菌液PCR结果。从图6可以看出，阳性克隆子2、3的PCR产物的大小与3拷贝人表皮生长因子表达载体理论值相符；阳性克隆子5-7、9的PCR产物的大小与4拷贝人表皮生长因子表达载体理论值相符。图7中的泳道M为DNA marker；泳道1-4为pPIC9K-5hEGF阳性克隆子菌液PCR结果。从图7可以看出，阳性克隆子1、2、4、5的PCR产物的大小与5拷贝人表皮生长因子表达载体理论值相符。
再对能够检测出目的条带的菌株摇菌提取质粒，再进行EcoR I/Not I双酶切鉴定，酶切鉴定图谱如图8，泳道M为DNA marker；泳道1-5为1-5拷贝串联表达载体双酶切结果；从图8可以看出，每个质粒都被酶切出两条明显的条带，人表皮生长因子1-5拷贝基因片段明显，且大小与理论值相符。对双酶切鉴定正确的菌株制备新鲜菌液由Invitrogen生物科技有限公司测序。至此1-5拷贝人表皮生长因子串联编码基因毕赤酵母表达载体构建成功。
大量提取构建好、测序正确的表达载体质粒，用Sal Ⅰ单酶切过夜使其线性化，用等体积的酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次，再加入1/10体积的3M pH5.2醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，12000rpm离心5min，用70%乙醇洗涤2次，在超净台上吹干，用灭菌双蒸水溶解后稀释为终浓度为1μg/μL，取10μL以2kV，25μF，200Ω的条件下电转化至毕赤酵母GS115(购于Invitrogen生物科技有限公司)。电击转化后，转化产物转移到5ml离心管于30℃静置2h，取0.3ml 均匀涂布于含0.25mg/mL G418(购于Invitrogen生物科技有限公司)的YPD选择平板上，30℃培养5天。
将具有G418抗性的最初转化子菌落，通过影印法克隆到MM平板(1.34%YNB，购于Invitrogen生物科技有限公司，4×10-5%biotin，生工生物工程股份有限公司，0.5%methanol购于生工生物工程股份有限公司，1.5%agar，购于生工生物工程股份有限公司)和MD平板(1.34%YNB，4×10-5%biotin，2%dextrose，购于生工生物工程股份有限公司，1.5%agar)上，30℃培养3d，挑选在两种培养基上都生长良好的Mut+菌落。将筛选到的阳性重组子先经BMGY(2%蛋白胨，购于英国Oxoid公司、1%酵母浸出物，购于英国Oxoid公司、1.34% 酵母氮源YNB、0.4mg/L生物素、1%甘油、100mmol/L磷酸盐缓冲液)培养基培养至A600达到3-6，利用通用鉴定引物α-Factor和3’AOX进行菌液PCR鉴定。
其中通用鉴定引物α-Factor和3’AOX序列（Invitrogen公司合成）分别如下：
α-Factor：TACTATTGCCAGCATTGCTGC（SEQ ID NO:8）
3’AOX ：GGCAAATGGCATTCTGACATCCT（SEQ ID NO:9）
PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，α-Factor和3’AOX引物(10μmol/L)各2μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，然后进行35个循环的94℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后再72℃保持5min，冷却4℃。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。对检测出目的条带的菌株离心收集菌体重悬于BMMY(2%蛋白胨、1%酵母浸出物、1.34%YNB、0.4mg/L生物素、0.5%甲醇、100mmol/L磷酸盐缓冲液)培养基中进行28℃，250rpm诱导表达96小时，分别于24、48、72和96小时取2mL菌液，10000rpm 4℃离心5min，取上清离心进行Tricine-SDS-PAGE分析，结果显示(图9-13箭头所示)酵母诱导表达上清里面成分单一，分子量与人表皮生长因子的理论值大小相符。诱导表达结束后离心收集培养上清，-20℃冻存，用于纯化分析。
表达产物的初步纯化
所述培养上清经阳离子交换层析、脱盐后得到纯化产物。所述初步纯化的产物用BCA法测定蛋白含量。
三、重组人表皮生长因子单体产物活性研究
Balb/c3T3细胞(购于南京三生生物技术有限公司)用含l0%小牛血清(购于Invitrogen生物科技有限公司)的DMEM培养基(完全培养基) (购于Invitrogen生物科技有限公司)传代培养，用完全培养基稀释至5×104/ml，以每孔100ul加入到96孔细胞培养板中，37℃培养24 h，用含1％小牛血清的DMEM培养基(基础培养基)饥饿培养12 h，加入系列稀释的含纯化的hEGF样品和hEGF标准品的培养基(每个浓度水平做4个重复) (购于Sigma公司)，37℃继续培养48 h，加10ul的CCK-8(购于北京拜尔迪诊断技术有限公司)溶液，37℃作用2 h 后测定600 nm波长的吸收度值(OD)。结果显示重组的hEGF与标准品活性相当。
本发明所述技术方法还可用于其他感兴趣多肽基因的高效生产。
SEQUENCE LISTING
<110> 安阳工学院
<120> 一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 1
tagaattcag atctgagaaa agaaactctg actctgagtg 40
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 引物
<400> 2
aactctgact ctgagtgtcc attgtcccac gacggttact gtttgcac 48
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 引物
<400> 3
agcgtacttg tccaaagctt cgatgtacat acagacaccg tcgtgcaaac agtaaccgt 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 引物
<400> 4
ctttggacaa gtacgcttgt aactgtgtcg ttggttacat cggtgagaga tgtcaatac 59
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 引物
<400> 5
tctcttctcc caccacttca agtctctgta ttgacatctc tcac 44
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 引物
<400> 6
atgtcgacgc ggccgcctag gatcctctct tctcccacca cttcaagt 48
<210> 7
<211> 159
<212> DNA
<213> hEGF
<400> 7
aactctgact ctgagtgtcc attgtcccac gacggttact gtttgcacga cggtgtctgt 60
atgtacatcg aagctttgga caagtacgct tgtaactgtg tcgttggtta catcggtgag 120
agatgtcaat acagagactt gaagtggtgg gagaagaga 159
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物
<400> 8
tactattgcc agcattgctg c 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 9
ggcaaatggc attctgacat cct 23
Claims (4)
1.一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）人表皮生长因子基因片段的获得：设计引物，在人表皮生长因子基因上游引入限制性内切酶酶切位点和酵母菌kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR，并引入限制性内切酶酶切位点，PCR扩增出目的片段；
（2）人表皮生长因子定向多拷贝克隆：步骤（1）中扩增出的目的片段经限制性内切酶酶切、连接，得到目的基因的定向多拷贝克隆；
（3）人表皮生长因子定向多拷贝克隆的酵母表达：将步骤（2）得到的定向多拷贝克隆转化至毕赤酵母中培养，经酵母菌本身的kex2酶自剪切，获得重组的目的蛋白单体；
步骤（1）中人表皮生长因子基因上游引入的限制性内切酶酶切位点为EcoR I和Bg1II；下游引入的限制性内切酶酶切位点为BamH I、Not I、Sal I；
所述步骤（1）中的引物为：
Oligo1：tagaattcagatctgagaaaagaaactctgactctgagtg；
Oligo2：aactctgactctgagtgtccattgtcccacgacggttactgtttgcac；
Oligo3：agcgtacttgtccaaagcttcgatgtacatacagacaccgtcgtgcaaacagtaaccgt；
Oligo4：ctttggacaagtacgcttgtaactgtgtcgttggttacatcggtgagagatgtcaatac；
Oligo5：tctcttctcccaccacttcaagtctctgtattgacatctctcac；
Oligo6：atgtcgacgcggccgcctaggatcctctcttctcccaccacttcaagt。
2.如权利要求1所述的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，其特征在于所述步骤（1）为：将引物通过SOE法获得人表皮生长因子基因片段。
3.如权利要求1所述的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，其特征在于所述步骤（2）为：将步骤（1）获得的目的片段经EcoR I和Sal I双酶切，与同样双酶切的质粒PUC57连接，构建的质粒记作PUC57-hEGF，PUC57-hEGF经Bgl II/ NotI双酶切后回收hEGF片段；同时经BamH I/ NotI，双酶切后回收PUC57-hEGF片段，将回收的目的片段经T4连接酶连接，连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中，筛选得到2拷贝人表皮生长因子串联基因；在此基础上，继续进行酶切、连接可分别得到3拷贝、4拷贝、5拷贝的人表皮生长因子串联基因。
4.如权利要求3所述的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，其特征在于步骤（3）为：将步骤（2）获得的含有人表皮生长因子1-5串联基因的质粒分别经EcoR I/Not I双酶切，与同样双酶切的pPIC9K载体连接，经电转化至毕赤酵母GS115，筛选得到阳性重组子，然后进行诱导表达，获得重组的目的蛋白单体。
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