DK173028B1 - Nucleotidsekvens, ekspressionsplasmid indeholdende nucleotidsekvensen til forbedret produktion af heterologt protein i bakt - Google Patents

Description

i DK 173028 B1

Den foreliggende opfindelse angår rekombinant DNA teknologi til ekspression af heterologe proteiner i bakterier. Mere specifikt angår opfindelsen en hidtil ukendt nukleotidsekvens, bakterielt ekspressionsplasmid, 5 E. coli indeholdende et sådant plasmid og fremgangsmåder til fremstilling af proteiner ved hjælp af en E. coli stamme omfattende et sådant plasmid samt fremgangsmåder til fremstilling af plasmider ifølge opfindelsen.

10 Nukleotid-sekvensen, ekspressionsplasmidet, E. coli stammen og fremgangsmåderne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved det i krav 1, krav 2, krav 7, krav 9, krav 15 og krav 20, 15 Der er stadig stigende behov for kalve-rennin (chymosin), som er den foretrukne mælkekoagulerende protease til anvendelse i osteproduktionen. Der er blevet udviklet alternative mælkekoagulerende midler, nemlig proteolytiske enzymer fra svampe. Imidlertid har deres kraftige 20 proteolytiske virkning en tendens til at reducere udbyttet af ost, og giver ofte en bitter afsmag.

Det ville være økonomisk attraktivt at have en stabil og tilstrækkelig mængde mælkekoagulerende protease. Det 25 problem har adskillige opfindere søgt at løse, ved at anvende rekombinant DNA teknologi for at løse dette problem. Beppu et al-, J. Biochem. 90:901-904 (1981) omtaler kloning af det strukturelle gen af prorennin (prochymosin) i E. coli. I en senere artikel angiver Beppu 30 et al., J Biochem. 91:1085-1088 (1962) den nukleotide rækkefølge for kalve-prorennin cDNA, som de har klonet i E. coli. Konstruktion af et ekspressionsplasmid med lacUV5-promotoren og dennes evne til at frembringe et koblet protein indeholdende næsten al prochymosin-peptidet DK 173028 B1 la knyttet til det korte N-endes ti 1lede peptid af E. coli beta-galactosidase er beskrevet af Beppu et al., Gene 19:337-344 (1982).

5 Europæisk patentansøgning nr. 73 029 offentliggjort 2.

marts 1983, beskriver kalve-prorennin DNA-holdige plasmider, mikroorganismer (E. coli) transformeret med disse plasmider og deres ekspression af prorennin.

10 Engelsk patentansøgning nr. 2 091 271A, offentliggjort 28.

ju 15 2 DK 173028 B1 li 19S2 omhandler fremgangsmåder og anordninger til at frembringe rennin, prorennin og preprorennin, herunder anvendelsen af forskellige promotorer (lac, trp, ura 3 osv.) for at opnå ekspression. En af de .omhandlede DNA-5 sekvenser, der koder for preprorennin, har til sig knyttet en transskriptionel promotor og en ribo somal bindingsplads ved 5'-enden. Afstanden mellem begyndelsen af DNA'-en, der koder for preprorennin, og DNA-delen, der bærer den transskriptionelle promotor og den rib.osomale bin-10 dingsplads, er forskellig.

Engelsk patentansøgning 2 100 73 7A offentliggjort 6. januar 1983, beskriver rekombinant DNA teknologi til fremstilling af chymosin, methionin chymosin, prochymosin, methionin prochymosin og preprochymosin. Vektorer, der 15 bærer et E. coli trp-promotor-operator fragment og en transskriptionsterminator, en initiationscodon og en Shine-Dalgarno (SD) sekvens, der tjener som en ribosom bindingsplads, er også omhandlet. Undersøgelse af virkningen af afstandsdannelse mellem SD og ATG sekvenser 20 er også omhandlet.

Europæisk patentansøgning 77 109 offentliggjort 20. april 1983, beskriver DNA-molekyler, det vil sige plasmider, der omfatter gener for preprochymosin og specifikke DNA-sekvenser, som f.eks. et dobbelt lac UV5 eller et modi-25 ficeret trp-system og disses anvendelse til transformation af mikroorganismer (lactobaciller, streptococci, bacillus eller gær) for at frembringe transformanter, der producerer preprochymosin i dettes alleliske og modne former.

30 Europæisk patentansøgning 36 776 offentliggjort 30. september 1981, beskriver ekspressionsvektorer med trp-pro-motoren-operatoren, fra hvilken fortyndingsområdet er blevet fjernet, og fremgangsmåder til fremstilling heraf.

3 DK 173028 B1

Transformanter, der bærer vektorerne, kan dyrkes i tryp-tophan-berigede substrater, således at cellevæksten skrider fremaf uhæmmet ved prematur ekspression af heterologt peptid, der er kodet af et indskud, der i øvrigt 5 er under kontrol af trp-promotor-operator-systemet.

Emtage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:3671-3675, 1983 og japansk patentansøgning nr. SHO 58-38 439, indleveret 9. marts 1983 beskriver konstruktion af hybride plasmi-der, der bærer prochymosin cDNA og som indeholder E. co-10 li trp-operon'en, og anvendelsen heraf til ekspression af prorennin i mængder, der er større, end der tidligere er blevet omtalt i litteraturen. En yderligere oplysning fra Beppu omhandler en tilføjelse til den ovennævnte japanske patentansøgning, idet denne er indleveret 15 15· november 1983. Denne tilføjelse angår delvis effek ten af variation i den afstand, der adskiller SD-sekvensen fra initiationscodonen for prochymosin og virkningen af at ombytte N-stillede aminosyrer fra prochymosin med peptider af varierende længde.

20 Harris et al., Nucleic Acids Research 10:2177-2187 (1982) omhandler kloning og nukleotid sekvensen for cDNA, der koder for preprochymosin. Goff et al., Gene 27, 35-46 (1984) beskriver ekspressionen af kalve-prochymosin i Saccharomyces cerevisiae, en gærart. Restriktionsendo-25 nuklease-spaltningskortet og DNA-sekvensen for preprochymosin cDNA er blevet offentliggjort [Beppu et al.

J. Biochem. 91:1085-1088, (1982)], og der henvises til denne artikel.

Pattedyrs-væksthormoner, herunder den humane epiderme 30 vækstfaktor (h-EGF) er af betydelig Interesse, fordi de har en potentiel mulighed for at forbedre husdyrhol det. Deres almindelige anvendelse er begrænset, fordi de er begrænset tilgængelige. Det er økonomisk attrak- 4 DK 173028 B1 tivt at være i besiddelse af en tilstrækkelig mængde af disse hormoner, hvilket har ført til at adskillige opfindere har anvendt rekombinant DNA teknologi for at løse dette problem.

5 Den humane epiderme vækstfaktor (EGF) eller urogastron er ikke kun en stimulator for den epiderme vævvækst, men er også en kraftig inhibitor af mavesyresekretion.

De mange muligheder med EGF er ikke tidligere blevet undersøgt, fordi der har manglet tilstrækkeligt materiale.

10 Anvendelsen af rekombinant DNA metodologi til fremstilling, kloning og ekspression af et strukturelt gen for urogastron og af gener for polypeptid-analoge er beskrevet i international patentansøgning nr. 83/04030 offentliggjort 24. november 1983· 15 Kloning af DNA komplementært med bovin væksthormon mRNA, den nukleotide sekvens heraf og den tilsvarende aminosyresekvens forudsagt herudfra er angivet af Miller et al. i europæisk patentansøgning nr. 47 600, offentliggjort 17. maj 1983 og i J. Biochem. 255, 7521-7524 (1980), og 20 af Woychik et al. i Nucleic Acids Research 10, 7197-7210 (1982). Engelsk patentansøgning 2 073 245A, offentliggjort 14. oktober 1981 og Kesket et al., Nucleic Acids Research 9, 19-30 (1981) beskriver kloningen af bovin væksthormon og dettes ekspression i E. coli HB101 som et 25 koblet beta-lactamase-bovint væksthormonprotein.

Fremgangsmåder til ekspression af bovint væksthormongen, plasmider og plasmid-værter til anvendelse herved er omhandlet i europæisk patentansøgning 67 026 og 68 646, offentliggjort henholdsvis 15. december 1982 og 5. ja-30 nuar 1983. Hver ansøgning omhandler E. coli som værtsorganisme. Sidstnævnte ansøgning, der svarer til USA patent nr. 4 443 539» udstedt 17. april 1984, omhandler 5 DK 173028 B1 også Saccharomyces cerevisiae som værtsorganisme.

Seeburg et al., DNA, 2 37-45 (1983) angiver kloning i bakterier af cDNA fremstillet under anvendelse af poly (A)mRNA ud fra kvæg- eller svine-hypofyser og konstruk-5 tionen af ekspressionsvektorer herudfra, som giver effektiv bakteriel produktion af det fuldstændige animale (kvæg eller svin) væksthormon. Den anvendte metode var analog med den, der tidligere er beskrevet af Goeddel et al., Nature, 281, 544-548 (1979) til direkte ekspres-10 sion af humant væksthormon i E. coli. I hvert tilfælde var de anvendte bakterielle ekspressionsvektorer under kontrol af E. coli trp-promotoren. Europæisk patentansøgning nr. 103 395 og 104 920, offentliggjort henholdsvis 21. marts 1984 og 4. april 1984, beskriver produk-15 tion af bovint væksthormonlignende polypeptid og fremstilling af: svlnevæksthormonlignende polypeptider via rekombinant DNA metodologi.

Administrering af bovint væksthormon til malkekvæg forøger mælkeproduktionen og forbedrer forholdet mellem fø-20 deoptagelse og mælkeproduktion [Macklin, J. Dairy Science 56, 575-580 (1973)]· Europæisk patentansøgning 85 036A, · offentliggjort 3. august 1983, omhandler, at biosyntetisk frembragt (ved hjælp af rDNA) bovint væksthormon og/eller fragmenter heraf også forøger mælkeproduktionen 25 hos køer og produktionen af kød, uld, æg og pelsen hos svin og andre husdyr.

Engelsk patentansøgning 1 565 190, offentliggjort 16. april 1980, omhandler rekomblnante plasmidvektorer, der er i stand til at transformere mikroorganismer, og som 30 i deres nukleotide sekvenser indeholder subsekvenser, der koder for væksthormon af en dyreart. USA patent nr.

4 237 224 beskriver plasmidvektorer til indførsel af fremmed DNA i encellede organismer.

6 DK 173028 B1

Plasmider, der har en Hindlll-indskudsplads for et udvalgt eukaryotisk DNA-fragment, idet denne plads er nabostillet til en bakteriel promotor, som f.eks. trp-pro-motoren, hvori transskriptionen og translationen af DNA-5 fragmentet er kontrolleret ved hjælp af promotoren, er beskrevet i USA patentskrift nr. 4 349 629.

Niveauet for ekspression af et klonet gen er under indflydelse af en række faktorer, som f.eks. antallet af genkopier og effektiviteten af transskription og trans-10 lation. Effektiv transskription af et indskudt gen kræver tilstedeværelsen af en stærk promotor, og effektiv translation kræver tilstedeværelsen af en passende rl-bosom bindingsplads i mRNA og passende afstand mellem rbs og translationsinitiationscodonen. Promotoren går 15 forud for den del af DNA'en (strukturelt gen), der koder for et protein. Ribosom-bindingspladsen (rbs) eller ribosom-genkendelsessekvensen antages at bestå af en sekvens, der er mindst 3-9 bp lang, betegnet Shine-Dal-garno (SD) sekvensen. Den begynder 3-11 bp oven for 20 AUG, der koder det aminoendestillede methionin af proteinet [Guarante et al., Cell 20:543-553, (1980)], og er komplementær til 3'-slutsekvensen af 16S RNA.

Adskillelsen af promotoren fra det translationelle startsignal (AUG) for et gen kan i vid udstrækning påvirke 25 mængden af frembragt protein (Guarante et al. angivet ovenfor og andre henvisninger i foreliggende beskrivelse). Denne artikel og Ptashne et al., USA patentskrift nr. 4 332 892, udstedt 1. juni 1982, beskriver virkningen af at anbringe et "bærbart promotor"-fragment i for-30 skellig afstand fra 5'-enden af et gen ved ekspression.

Andre henvisninger, der er relevante for virkningen af definerede ændringer af nukleotid-sekvenser og specielt for variationer mellem SD-regionen og startcodonen er: 7 DK 173028 B1

Scherer et al., Nucl. Acids Res. 8:3895-3907 (1980);

Shepard et al., DNA 1:125-131 (1982); Windass et al.,

Nucl. Acids Res. 10:6639-6657 (1982); De Boer et al., DNA 2:231-235 (1983); Tacon et al., Molec. gen. Genet.

5 177, 427-438 (1980) og Itbh et al., DNA 3, 157-165 (1984).

Den foreliggende opfindelse angår et promotor-rbs-eks-pressionselement til almindelig anvendelse til opnåelse af heterolog genekspression i stor mængde, ekspressions-10 plasmider, der bærer ekspressionselementet til direkte ekspression af heterologe proteiner (prokaryotiske eller eukaryotiske) og som., når de indføres i kompetente bakterier, frembringer rekombinante mikroorganismer, der er i stand til uventet og i store mængder at udtryk-15 ke proteinerne; og fremgangsmåder til fremstilling heraf; rekombinant E. coli, specielt transformanter, der omfatter plasmiderne og anvendelse af de rekombinante mikroorganismer til fremstilling af de heterologe proteiner.

Mere specielt angår opfindelsen kraftig ekspression ved 20 hjælp af E. coli af heterologe gener, der koder for proteiner, som f.eks. prochymosin og pattedyrs væksthormoner, som f.eks. væksthormoner fra kvæg og'svin, og humane epiderme vækstfaktorer og specielt ekspressionen af plasmider, der kan anvendes hertil. Plasmiderne omfat-25 ter en selekterbar markør; en replikon, dvs. en DNA-se-kvens, der omfatter en region til at kontrollere autonom replikation i værtscellen, og E. coli trp-promotoren knyttet til den heterologe protein cDNA-sekvens (gen) ved hjælp af en syntetisk DNA-sammenbinder, idet plasmi-30 det omfatter en hidtil ukendt ribosom bindingsregion, der kan være af varierende længde. Et specielt træk ved de omhandlede plasmider er tilstedeværelsen af i ribosombindingsregionen oven for ATG-initiationscodonen af nu-kleotid-sekvenserne 5f TAAAAAGGAGAATTC ATG 3’ eller 5’ 35 TAAAAAGGGTATCGAGAATTC ATG 3’. Et foretrukkent omhandlet 8 DK 173028 B1 ekspressionsplasmid har yderligere og signifikante træk af en translationsstop-codon (TAA) i samme aflæsningsramme som det protein, der koder sekvensen lige inden Shine-Dalgarno-sekvensen.

5 Den molekylære biologi er nu så vidt fremskreden, at den er i stand til in vitro at opbygge hybride plasmider, der vil udtrykke et givent protein eller polypep-tid ud fra kendskabet til en cDNA-sekvens, der koder for polypeptidet og ud fra restriktionsendonuklease-spalt-10 ningskortet over sekvensen. Imidlertid er der på trods af dette ingen basis inden for fagområdet til at antyde, at et særligt eller endog kritisk arrangement af DNA-sekvensen inden i et plasmid vil, dersom den på passende måde indføres i en mikroorganisme, give sigfikant 15 og uventet høj ekspression af polypeptidet.

De i foreliggende ansøgning beskrevne rekombinante mikroorganismer udtrykker heterologe proteiner i betydeligt større udbytter end tidligere beskrevne mikroorganismer har opnået, og opfindelsen opnår for første gang økono-20 mi sk fremstilling af disse ved hjælp af rekombinant DNA

teknologi.

For fagmanden er det klart, at rekombinante mikroorganismer kan fremstilles pft en hel række måder, f.eks. ved transformation, transduction, konjugation eller trans-25 feotion. Ved udtrykket "rekombinante mikroorganismer'' i den foreliggende beskrivelse med krav skal derfor forstås mikroorganismer, der er i stand til at udtrykke de heri beskrevne heterologe proteiner, når som helst disse mikroorganismer er fremstillet ved en vilkårlig af 30 de ovennævnte metoder. Sagt på en anden måde omfatter definitionen af rekombinante mikroorganismer i foreliggende beskrivelse med krav en hvilken som helst mikroorganisme, der er i stand til at udtrykke det heterologe 9 DK 173028 B1 protein af en heterogen eller xenogen sekvens, når som helst mikroorganismen er fremstillet ved hjælp af rekom-binant-teknikker.

Herudover omfatter opfindelsen nukleotid-sekvenserne be-5 skrevet i foreliggende beskrivelse med krav for ribosombindingspladsen af et gen, der koder for et prokaryotisk eller eukaryotisk protein, der, når det er indført i et bakterielt plasmid neden for en transskriptionel promotor-sekvens, giver effektiv ekspression i E. coli.

10 De beskrevne ribosom-bindingspladsregioner indeholder en bekvem EcoRI-restriktionsendonuklease-spalt.ningsplads lige oven for ATG-initiationscodonen, giver en fremgangsmåde til indførsel af et vilkårligt DNA-fr gment indeholdende en pro.tein-translationel startcodon i ekspres-15 sionsvektorerne bag ved SD-sekvensen. Med andre ord, genet i ekspressionsplasmiderne beskrevet i foreliggende beskrivelse med krav kan være et hvilket som helst gen, der koder for et prokaryotisk eller eukaryotisk protein. F.eks. giver de heri beskrevne nukleotide se-20 kvenser mellem ribosom-bindingspladsen og ATG-initiationscodonen høj ekspression af cDNA-sekvenser, som f.eks. prochymosin (prorennin)", bovint væksthormon, porcint væksthormon og human epiderm vækstfaktor (urogastron). Proteinerne, de bovine og porcine væksthormoner og den 25 humane epiderme vækstfaktor betegnes kollektivt i foreliggende beskrivelse med krav som pattedyrs vækstfaktorer.

Bakteriel produktion af et specielt heterologt gen kan resultere i et polypeptid, der kan eller som ikke inde-30 holder en methionin-rest ved aminoenden af polypeptidet.

Derfor omfatter udtrykket "prochymosin’' (prorennin) anvendt i foreliggende beskrivelse med krav methionin prochymosin (prorennin) og prochymosin (prorennin). Det samme gælder for de andre polypeptider beskrevet i forelig- 10 DK 173028 B1 gende beskrivelse med krav. Yderligere skal, når der omtales "chymosin" (rennin) dette udtryk omfatte de kendte alleliske former heraf (f.eks. A, B osv·.).

Følgende eksempler illustrerer opfindelsen nærmere uden 5 at begrænse denne.

Fig, 1 viser en total oversigt over konstruktion af plas-mider pPFZ-R2 og R4 (pPFZ-R), herunder restriktionskortet over plasmiderne, der er fælles for hver af pPFZ-R2 og R4. Pilen angiver retningen for ekspression fra trp-10 promotor-sekvensen ind i prochymosin (prorennin) genet (repræsenteret ved den fuldt optrukne del). Syntetisk indskud er repræsenteret med den åbne del.

Fig. 2 viser skemaet for konstruktion af plasmiderne ptrpLI-R2 og R4.

15 Fig. 3 viser skemaet for konstruktion af plasmider ptrpLI-R2-B48 og ptrpLI-R4-B48.

Fig. 4 viser nukleotid-sekvensen og afstanden mellem ribosom-bindingspladsen og initiationscodonen (ATG) af prochymosin (prorennin) genet for hver af plasmiderne pPFZ-20 R2 og pPFZ-R4. Dette er den eneste region, hvori plasmiderne er forskellige med hensyn til nukleotid-sekvens.

Fig. 5. Skema for opbygning af plasmider indeholdende bGH-genet i fuld udstrækning og ekspressionssekvenserne. Plasmid pBGH-102 indeholder bGH cDNA sekvenser (mørkt 25 område)’ klonet i det ampicillin-resistente gen i pBR322.

Det syntetiske DNA, der koder for en ny aminoende af bGH, indførtes i EcoRI og Hindlll pladser af pBR322 (skraveret område). Forskellige in vitro manipulationer udførtes for at opbygge et plasmid pBGH-212, der inde-30 holder det fuldstændige modificerede bGH-gen. Plasmid 11 DK 173028 B1 pBGH-212 spaltedes med EcoRI, og DNA-fragmenter indeholdende forskellige variationer af trp-promotor-operatorsekvensen indførtes. Pilen viser 5'_» 3' retningen af kodesekvensen eller retningen for transskription.

5 Fig. 6. Konstruktion af et bakterielt ekspressionsplas-mid til bGH-produktion. Plasmider pBGH-212-R bærer et gen for direkte ekspression af modent bGH komplet med trp-promotor-sekvens (se fig. 5). Disse plasmider spaltedes med Hindlll efterfulgt af delvis nedbrydning med 10 PvuII, og to fragmenter på omtrent 920 bp Hindlll-PvuII isoleredes. Et syntetisk DNA-fragment, der koder for C-endestillingen af bGH, indførtes i EcoRI og Hindlll pladser af pBR322 (hvidt område). Denne subklon spaltedes med PvuII og BamHI, og 365 bp DNA-fragmentet isole-15 redes. Det store vektorfragment (3995 bp) isoleredes fra pBR322 efter spaltning med Hindlll og BamHI. De to promotor-bGH-genholdige fragmenter (920 bp) blandedes hver for sig med det syntetisk DNA-holdige fragment (365 bp) og vektorfragmentet (3995 bp). Blandingerne 20 ligeredes med T4-ligase og anvendtes til transformation af kompetent E. coli HB101. De forskellige bGH ekspres-sionsplasmider omtales som pBGH-301 og pBGH-375· Pilene angiver retningen for transskription fra trp-promotor-sekvensen og 5'-*3' retningen i kodesekvensen.

25 Fig. 7. Konstruktionsskema for plasmider indeholdende pGH-genet af fuld længde og ekspressi onssekvenser. Plasmid pGH-24 indeholder pGH cDNA sekvenser (mørkt område) klonet i ampicillin-resistent-genet i pBR322. Det syntetiske DNA, der koder for en ny aminoendestilling af 30 pGH, indførtes i EcoRI og Hindlll pladserne af pBR322 (skraveret område). Forskellige in vitro manipulationer blev udført for at konstruere et plasmid, der bærer det fuldstændigt modificerede pGH-gen. Dette plasmid spaltedes med EcoRI, og DNA-fragmenter indeholdende forskel- 12 DK 173028 B1 lige variationer af trp-promotor-operator-sekvensen blev indført. Pilene viser 5' til 3’ retning for kodesekvens eller retning for transskription.

Mikroorganismerne 3 Mikroorganismerne og de rekombinante mikroorganismer anvendt og/eller frembragt ved den omhandlede fremgangsmåde og deponeringerne, hvorfra de er tilgængelige, er angivet nedenfor: E. coli C600, også kendt som CR34, ATCC 23724, 10 E. coli HB101 NRRLB-11371, ATCC-33694, E. coli MM294 ATCC-33625, E. coli ¥3110 ATCC-27325 E. coli HB101 omfattende pPFZ-R2 ATCC-39544 E. coli HB101 omfattende pPPZ-R4 ATCC-39543.

15 For fagmanden vil det være klart, at en hvilken som helst transformerbar E. coli K-12 stamme kan anvendes ved den foreliggende opfindelse som værtsorganisme i stedet for de ovenfor angivne. Yderligere vil, hvilket vil være klart for fagmanden, protease negative stammer af E.

20 coli give lige så gode eller bedre resultater end de ovenfor angivne E. coli stammer.

De ovenfor identificerede rekombinante mikroorganismer ATCC 39543 og 39544 deponeredes den 14. december 1983 under de ved Budapest-traktaten opstillede betingelser 25 i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, en anerkendt deponeringsform, der giver stadig mulighed for at opnå. deponeringerne,. o,g som vil være offentligt tilgængelige, dersom patentet udstedes. Organismerne fik de ovenfor angivne registreringsnumre. Deponeringer-30 ne er tilgængelige under denne ansøgning under numrene 37 CFR 1.14 og 35 USC 122 i overensstemmelse med patent- 13 DK 173028 B1 lovene i de pågældende lande, hvor ansøgningen er indleveret. Alle restriktioner med hensyn til tilgængeligheden af mikroorganismen for offentligheden vil blive kaldt tilbage, når patentet er udstedt.

5 Fremstilling af RNA og kloning af cDNA

Helt RNA fra dyre-hypofyser blev fremskaffet fra et lokalt slagteri og isoleret som beskrevet af Ullrich et al.,

Science 196, 1313-1319 (1977). Polyadenyleret RNA blev opnået ud fra det fulde RNA ved chromatografi på oligo-10 (dT)cellulose. Dobbeltstrenget cDNA fremstilledes ud fra dette RNA, og en vis fraktion af cDNA blev klonet ved hjælp af standardmetoder ind i E. coli under anvendelse af plasmid pBR322 og den homopolymere metode som tidligere beskrevet (Miller, W. et al. 1980, J. Biochem., 15 255, 7521, Goeddel et al., 1979; Nature 281, 544-548;

Seeburg et al., 1983, DNA 2, 37-45).

Kolonier transformeret med cDNA-holdige plasmider blev ved replikationsteknik overført på nitrocellulosefiltre.

Filtre indeholdende transformante kolonier blev bearbej-20 det til hybridisering som beskrevet af Grunstein og Hog-ness (1975, Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961-3965). Radioaktivt mærkede syntetiske oligonukleotider, hvis sekvens stammede fra offentliggjorte cDNA-sekvenser, anvendtes som prober til afsløring af klonede cDNA-styk-25 ker. Hybridiserede kolonier dyrkedes i 5 ml LB og plasmid DNA fremstillet, og klonede sekvenser blev karakteriseret ved spaltning med restriktionsendonukleaser efterfulgt af elektroforese af DNA-fragmenter i geler.

Udgangspia smider 30 Plasmid pCRIOl er beskrevet af Nishimori et al., Gene, 14 DK 173028 B1 19:337-344 (1982). Begge indeholder det fuldstændige cDNA for prochymosin, genet for ampicillin-resistens, og består af 5678 bp. Det indeholder en spaltningsplads for Hindlll og adskillige BamHI pladser.

5 Plasmid ptrpLI er beskrevet af Edman et al., Nature 291: 503-506 (1981) og plasmid pBR322 af Bolivar et al., Gene 2:95-113 (1977).

Materialer

Restriktionsendonukleaserne (Asul, BamHI, EcoRI, Hindlll, 10 Clal, HinfI, Kpnl, PstI, PvuII, Rsal, Sall), T4-ligase og DNA-polymerase I (stort fragment) blev opnået fra New England Biolabs, T4-polynukleotid-kinase fra PL Biochemicals, bakteriel alkalisk phosphatase fra Bethes-da Research Laboratories (BRL), kalvetarm alkalisk phos-15 phatase fra Boehringer Corp. Alle enzymer anvendtes under de betingelser, der var anbefalet af fabrikanten. Radiokemikalier blev indkøbt .fra New England Nuclear (NEN). Proteinmolekylvagt-standarder blev indkøbt fra BRL, renset bovin chymosin blev opnået fra Sigma Chemi-20 cal Company (Sigma) og renset pGH fra Miles.

Bakterier dyrkedes rutinemæssigt ved 37°C i L-bouillon eller på L-agarplader (Miller, J. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, s. 433, 1972) indeholdende enten ampicillin (25 jag/ml) 25 eller tetracyclin (10 jig/ml). Til fremstilling af plas-mider i stor målestok forstærkedes log-fase-kulturer ved tilsætning af chloramphenicol (170 μg/ml) [Clewell og Helsinki, J. Bacteriol. 110:1135 (1972)].

Plasmidet pBGH-7 omfatter en pBR-322, der indeholder 30 en fuld længde af cDNA af bGH klonet ind i Pstl-pladsen, og som var fremstillet som beskrevet af Miller, W. et al., 15 DK 173028 B1 J. Biochera. 255» 7521 (1980). Det klonede cDNA indeholder omtrent 830 bp omfattende 31 bp 5', ikke-translateret sekvens, hele pre-hormonstruktur-sekvensen (651 bp), hele 3', ikke-translateret region (104 bp), en kort stræk-5 ning poly(A) og dC-dG-afslutninger. Plasmidet pGH-24 omfatter en pBR322, der indeholder en fuld længde cDNA af pGH klonet ind i den PstI-plads, :og som var fremstillet ved metoder, der er lig med de, der er beskrevet af Seeburg et al., DNA 2, 37-45 (1983). pGH-24 plasmid DNA 10 var opbygget og fremskaffet fra Dennis Pereira. Plasmid pBR-322 er tidligere beskrevet af Bolivar et al., Gene 2, 95-115 (1977).

Syntese af oligonukleotider

De syntetiske oligonukleotider 5'.AGAATTCATGG.3'^^ og 15 5'.CCATGAATTCT. 3' var kemisk syntetiserede ved hjælp af phosphit-metoden [Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 1585 (1981)] og blev renset ved hjælp af 6M urinstof-20% polyacrylamidgeler.

De 18-bp og 22-bp enkeltstrengede oligomere blev synte-20 tiserede ved hjælp af fremgangsmåder beskrevet i foreliggende beskrivelse med krav og transformerede til en 40-mer adapter, der også er nærmere beskrevet. Dobbeltstrenget 40-roer er fremstillet ved at sammenbinde og ligere enkelt strengede 18- og 22-mer ved velkendte metoder.

25 Digonukleotiderne, der anvendtes til pGH og bGH, syntetiseredes via phosphoramidit-metoden beskrevet af Caruthers et al., Tetrahedron Lett. 24, 245 (1983), og fragmenter syntetiseredes ud fra enkeltstrengede oligomere 11-16 baser lange 16 DK 173028 B1

Molekylære kloningsreaktioner

Opfyldningsreaktionen af tilbageblevne 3’-ender af dobbeltstrenget DNA under anvendelse af Klenow-fragment af E. coli DNA-polymerase I var i det væsentlige som be-5 skrevet af Maniatis et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 113 (1982)]. Overførslen af gamma-phcsphatet af ATP til 5'-OH-endestillingen af den syntetiske linker DNA ved hjælp af T4-polynukleotid-kinase var som beskrevet af Mania-10 tis (ibid.). Ca. 2 pg dobbeltstrenget linker DNA phos-phoryleredes i en 20 filter reaktionsblanding indeholdende 70 mM Tris (pH 7*6), 10 mM MgClg* 5 mM dithio-threitol (DTT), 20 pCi [gamma-32P]ATP (5000 Ci mmol"1; NEN), T4-polynukleotid-kinase (10 enheder) sattes til, 15 og reaktionen forløb ved 37°C i 15 minutter; 1 pliter 10 mM ATP og 10 enheder T4-kinase tilsattes herefter, og reaktionen foregik yderligere i 30 minutter ved 37°C.

De kinase-behandlede linker-forbindelser lagredes ved -20°C.

20 Dersom det var nødvendigt fjernedes de endestillede 5'-phosphater fra DNA ved behandling enten med bakteriel alkalisk phosphatase (BAP) eller med alkalisk phosphatase fra kalvetarm (CIP) [Chaconas et al., Methods En-zymol. 65:75 (1980)]. Kort fortalt blev ved CIP-behand-25 lingen plasmid DNA nedbrudt fuldstændigt med passende restriktionsenzym/enzymer og udfældet i ethanol. DNA-pillen blev atter opslæmmet i CIP reaktionspuffer (0,1M glycin, 1 mM MgCl2* 0,1 mM ZnClg, pH 10,4) til en slut-koncentration på 1 pg per 10 pliter puffer. Prøven op-30 varmedes til 65°C i 10 minutter, hvorefter der afkøledes på is i 5 minutter. Den alkaliske phosphatase fra kalvetarme tilsattes herefter til en slutkoncentration på 0,5 enheder enzym per 1 pg DNA. Blandingen inkuberedes 30 minutter ved 37eC efterfulgt af phenol-chloroform- 17 DK 173028 B1 ekstraktion og ethanoludfældning af DNA-fragmenter.

DNA-pillen blev atter opslæmmet i destilleret vand til en slutkoncentration på 100 pg/ml.

Når det drejede sig om BAP-behandling,. :spaltedes plas-5 mid DNA med den/de udvalgte restriktionsendonuklease/en-donukleaser og udfældedes i ethanol. DNA-pillen blev atter opslæmmet i puffer (50 mM NaCl, 10 mM MgClgi 10 mM Tris, 10 mM DTT) til en slutkoncentration på 1 μg per 10 filter puffer. Reaktionsblandingen opvarroedes til 10 65°C i 10 minutter og bratkøledes på is. Bakteriel alka lisk phosphatase tilsattes til en slutkoncentration på 50 enheder enzym per 1 ;ug DNA. Reaktionsblandingen inkuberedes 2 timer ved 65°C efterfulgt af phenol-chloroform-ekstraktioner og ethanoludfældning af DNA-fragmenterne.

15 Konstruktionen af de bakterielle ekspressionsplasmider indebærer manipulationer, der sammenknytter DNA-fragmen-ter fra forskellige plasmider. Alle trinene er vist i de medfølgende tegninger. Generelt rensedes DNA-fragmen-ter efter: isolering fra geler og ligeredes til andre 20 fragmenter eller plasmid DNA i 20-50 eliter 66 mM Tris-HCL (pH 7,6), 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT og 1 μϋ-ter T4-ligase (400 enheder). Kompetente celler af E. co- 11 fremstilledes og transformeredes med halvdelen af ligationsblandingen under anvendelse af standardmetoder 25 [Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 1543 (1970)].

DNA-sekvensbestemmelse DNA-sekvenser blev bestemt ved hjælp af den kemiske nedbrydning smetode [Maxam, A. and Gilbert, W. Methods En-zymol. 65:499-560 (1980)], under anvendelse af ende-30 mærkede. DNA-fragmenter. Hvert ribosomt bindingspladsområde blev uafhængigt sekvensbestemt adskillige gange på begge strenge.

18 DK 173028 B1

Fremstilling af plasmid DNA

Fremstilling i stor målestok af plasmid DNA blev foretaget ved hjælp af den alkaliske SDS-metode, der er beskrevet tidligere [Birnboim, et al., Nucleic Acid Res.

5 7:1513 (1979)] efterfulgt af enten ethidium-bromid-CsCl- opdriftsmassefylde-centrifugerlng eller fraktionering på en Biogel A-50 (BioRad) søjle, som beskrevet af El-Gewely et al., [Anal. Biochem. 102:423-428 (1980)]. Minipræparationsmængder af DNA fremstilledes ved en hur-10 tig modifikation af den alkaliske SDS-metode [Birnboim et al., Ibid.].

Gel-elektroforese

Agarose-gelstrimler, 0,796 til 196, blev foretaget som beskrevet af Maniatis et al. (loc. cit., s. 150-164).

15 Gelerne blev farvet i 15 minutter med 1 pg/ml ethidium-bromid og fotograferet under belysning fra 266 nm U.V.-lys under anvendelse af en polaroidfilm (type 57, ASA 3000) med et Kodak Vratten filter (23 A).

Acrylamid-geler (20 x 15 x 0,15 cm) på 596 til 12,596 blev 20 anvendt til at identificere små (mindre end 1,5 kb) restriktionsfragmenter som beskrevet af Maniatis et al., [Biochemistry 14:3787-3794 (1975)]· Gelerne blev farvet og fotograferet som beskrevet for agarose-geler.

DNA-fragmenter rensedes fra gelstrimler ved elektroelu-25 ering i en dialysesæk Indeholdende Ο,ΙΧ TBE (8,9 mM Tris-borat, 8,9 mM borsyre, 0,2 mM EDTA).

Identifikation af heterologt protein fremstillet i E. coli

Bakteriekulturer indeholdende pBR322 eller ekspressions-plasmiderne (pPFZ-R2 eller pPFZ-R4) blev dyrket natten 19 DK 173028 B1 over i LB-bouillon eller M9CA-substrat (Maniatis et al., angivet ovenfor) indeholdende 4 /ig/ml thiamin, 25 fig/ml ampicillin og 100 pg/ml tryptophan. Disse kulturer fortyndedes 1:25 i M9CA-substrat (Maniatis et al., angivet 5 ovenfor, uden tryptophan for at muliggøre fuldstændig Induktion af trp-promotoren) eller M9CA-substrat plus 100 jig/ml tryptophan (for at hæmme induktion af trp-promotoren) eller LB-substrat (til negativ kontrol) og dyrket i rystekolber til en celletæthed på A^gg = 1,0.

10 For at opnå total celleproteinekstraktion lyseredes cellepiller svarende til 200 eliter kultur i 2% natriumdo-decylsulfat (SDS), 1% beta-mercaptoethanol, og proteinet udfældedes med 10 rumfang kold acetone. Udfældet protein blev atter opløst i SDS-prøvepuffer, og små prøver blev 15 elektroforesebehandlet på 10% eller 12,5% SDS-polyacryl-amid-geler [Laemmli, Nature 227:680-685 (1970)]. Til fremstilling af mærket protein opslæmmedes cellepiller fra 1 ml prøver af ekspressionskulturer i 1 ml suppleret M9CA-substrat (M9CA-salte, 0,2% glucose, 4 pg/ml 20 thiamin, 20 ;jg/ml standard-arainosyrer, bortset fra me-thionin og tryptophan) plus 25 pg/ml ampicillin og 75 Ci^S methionin (NEN; 970 Ci/mmol). Efter 1 times inkubation ved 37°C pelleteredes cellerne og genopslæmmedes i 200 ^liter 10 mM Tris (pH 8,0) 1 mM NaEDTA, anbragtes 25 herefter på is i 10 minutter efter tilsætninger af ly- sozym til 1 mg/ml, NP40 til 0,2% og NaCl til 0,35M slut-koncentration. Lysatet indstilledes til 10 mM MgClg og inkuberedes på is i 30 minutter med 50 pg/ml DNase I (Sigma). Uopløseligt materiale fjernedes ved forsigtig 30 centrifugering, og denne pillefraktion: opløstes i SDS-prøvepuffer. Supernatante prøver immunoprecipiteredes med kanin-anti-prorennin antistof (Beppu, Gene 19, 337-344) og stafylokok adsorbent (Pansorbin; Cal Biochem) som beskrevet af Kessler [J. Immunology 117:1482-1490 35 (1976)]. Prøverne underkastedes SDS-polyacrylamid-gel- elektroforese (Laemmli, angivet ovenfor) og forstærke- 20 DK 173028 B1 des (Enlightning; NEN) inden fluorografi ved -75°C med Kodak XAR-2 film og et Cornex Lightning Plus forstærkende skærm.

Bestemmelse af eksnressionsniveauer 5 Bestemmelser af mængden af heterologt protein frembragt af ekspressionskulturer blev foretaget ved densitometerscanning af protein-geler indeholdende total protein-ekstrakter fra bakteriekulturer. Enkelte baner af SDS-polyacrylamid-gelen af total celleproteinekstrakter ana-10 lyseredes under anvendelse af en Beckman DU-8B densitometer gel-scanner. Den tørrede Coomasie-blåfarvede SDS-polyacrylamid-gel scannedes i hver bane for at bestemme procentdelen af det totale celleprotein i det heterologe proteinbånd. En undersøgelse af total celleproteinet 15 fra en kontrolkultur (indeholdende pBR322-vektoren) anvendtes til at bestemme det oprindelige proteinindhold i det området af gelen, der svarede til størrelsen af den rekombinante slutforbindelse. Efter at have korrigeret for baggrundstoppene, der er synlige i kontrolkul-20 turen, bestemtes ekspressionsniveauet som en procent af det totale celleprotein. Protein-gelen blev scannet ved 579 nm.

Resultater

Konstruktion af ptmLI-R2 og ntrpLI-R4 25 Plasmidet ptrpLI er et pBR322-derivat, der indeholder en del af E. coli trp-promotor-operatoren og Shine-Dal-garno (SD) sekvensen af trpL på en (/-^, 360 bp) Hindlll-Clal-fragment. [Edman et al., Nature 291:503-506 (1981)].

Denne vektor er derfor et ekspressionsplasmid med en spe-30 ciel Clal-kloningsplads nabostillet til trp-regulerings- 21 DK 173028 B1 regionen. Indført DNA-materiale skal indeholde inden for sekvensen en ATG-translationel initiationscodon inden det gen, der koder sekvensen, der, når det er indført i ptrpLI, vil være i korrekt afstand i forhold til 5 trpL ribosom-bindingspladssekvensen. Denne ekspressions-vektor modificeredes ved indførsel af passende syntetiske DNA linkers i Clal-pladsen som angivet i:.fig. 2.

En særlig dobbeltstrenget syntetisk DNA linker anvendtes til at ændre nukleotid-indholdet rundt om Clal-re-10 striktionspladsen på ptrpLI. Ca. 10 μξ ptrpLI^DNA blev nedbrudt med 16 enheder restriktionsendonuklease Clal i 90 minutter ved 37°C. De klæbende ender opstået ved Clal-spaltningen blev bluntafsluttet i en 100 eliter reaktionsblanding indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7*2),

15 10 mM MgSO^, 0,1 mM dithiothreitol, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM

dCTP. Klenow-fragment af DNA-polymerase (30 enheder) blev tilsat, og reaktionen skred frem i 45 minutter ved 20°C. Efter phenol og chloroform-ekstraktion kombineredes den angivne phosphorylerede deoxyoligo-nukleotid (5' AGAATTCATGG 3') 20 linker (~ 60 pmol) (3* TCTTAAGTACC 5') med ~ 1 μ& (^ 0,6 pmol) af det udfyldte vektorf ragment, og ethanol udfældedes. Disse fragmenter blev ligeret ved 4°C i 18 timer i 30 >iliter 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM dithiothreitol og 800 enheder T4-DNA-25 ligase. Blandingen blev nedbrudt i 90 minutter med 3 enheder EcoRI i 90 minutter. Det EcoRl-spaltede plasmid DNA blev atter ligeret ved 4°C i 4 timer i 100 /jliter 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT og 400 enheder T4-DNA-ligase. Kompetente celler af E.

30 coli stamme HB101 transformeredes med 25 ;uliter af ligationsblandingen. [Mandel et al., J. Mol. Biol. 53:154 (1970)]. Plasmid DNA blev fremstillet ud fra 12 af transformanterne og nedbrudt med EcoRI og Hindlll. Ti af dis- 22 DK 173028 B1 se plasmider indeholdt det ønskede ru 36Ο bp EcoRI-Hindlll-fragment. DNA-sekvensanalysen fastslog, at en af disse plasmider (ptrpLI-R4) havde den ønskede orientering af den syntetiske linker og den ønskede sekvens 5 ved sammenbindingerne mellem trp-promotoren og det syntetiske DNA.

Under DNA-sekvensanalysen af plasmid DNA fra forskellige transformanter blev det fundet, at en af plasmiderne (ptrpLI-R2) havde en 6-bp deletion i området af den ri-10 bosome bindingsplads. Denne deletion skyldtes sandsynligvis 3' til 5' exonuklease-aktiviteten af Klenow-fragmen-tet af DNA-polymerase I, fordi linker-sekvenserne alle er tilstede. Det blev fundet, at dette derivat havde en forandret ribosom bindingsplads i forhold til den oprin-15 delige trp SD-sekvens indeholdt i ptrpLI-R4.

Kloning af den syntetiske prorennin-adaoter

Sekvensen af det syntetiske dobbeltstrengede DNA, der anvendes til at modificere aminoendestillingen af proren-nin, er angivet nedenfor: __18_? BamHI 22_> CATGGCTGAGATCACTAGGATCCTAGTGATCTCAGCCATG GTACCGACTCTAGTGATCCTAGGATCACTAGAGTCGGTAC <-<- 20 Dette fragment blev samlet ud fra to enkeltstrengede oligomere, 18-bp og 22-bp lange. Dette syntetiske DNA koder den kunstige ATG-initiationscodon for proteinsyntese og de første adskillige codoner af pr or ennln-sekvens (som angivet af Nishimori et al., J. Biochem. 91:1085-25 1088 (19S2) i en omvendt gentagelse rundt om BamHI-plad- sen. Dette syntetiske DNA subklonedes i EcoRI-restrik-tionspladsen af pBR322, der forud var behandlet med Kle- 23 DK 173028 B1 now-fragmentet af DNA-polymerase I for at udfylde de klæbende ender. Subkloner identificeredes ved in situ koloni-hybridisering af rekombinante mikroorganismer under anvendelse af radioaktivt mærkede 22-mer som pro-5 be [Grunstein, M. and Hogness, D., Proc. Natl. Acad.

Sci. 72:3961 (1975)]. Plasmid DNA fremstilledes ud fra 20 hybridiseringspositive kolonier og spaltedes med BamHI eller EcoRI for at identificere subklonen indeholdende det ønskede plasmid. Omtrent 100 ;ug plasmid DNA 10 fra rekombinant mikroorganisme nr. 17 spaltedes med

EcoRI, og 40 bp fragmentet isoleredes på en 12,5 % po-lyacrylamid-gel. Det rensede 40 bp EcoRI-fragment blev indført i EcoRI-pladserne af de 2 ekspressionsplasmid-derivater (ptrpLI-R2 og ptrpLI-R4), der forud var spal-15 tet med EcoRI og dephosphoryleret ved behandling med alkalisk phosphatase fra kalvetarme. Plasmid DNA fra adskillige rekombinante mikroorganismer af hver ligation fremstilledes og blev nedbrudt med BamHI-restriktions-endonuklease. Plasmider indeholdende 40 bp prorennin-20 adapteren indført neden for trp-ekspressionssekvensen identificeredes ved tilstedeværelsen af to BamHI-pladser omtrent 700 bp fra hinanden. Dette konstruktionsskema er angivet i fig. 3· Disse ekspressionsplasmider blev omtalt som ptrpLI-R2-B48 og ptrpLI-R4-B48.

25 Disse rekombinante mikroorganismer anvendtes som kilden for et omtrent 370 bp Hindlll-BamHI DNA-fragment indeholdende trp-promotor-operator-sekvensen, ribosom-bin-dingspladsen, den kunstige ATG-initiationscodon og den kemisk afledte sekvens, der koder for de første fem ami-30 nosyregrupper i prorennin. Nukleotid-sekvenser neden for promotoren, i området for ribosom-bindingspladsen, er forskellig på grund af den tidligere indførsel af en anden kemisk syntetiseret deoxyolinukleotid linker ved Clal-restriktionspladsen i plasmid-vektoren ptrpLI som 24 DK 173028 B1 beskrevet ovenfor. Det fremkomne nukleotid-indhold og afstanden mellem ribosom-bindingsplads (rbs) sekvensen og ATG af prorennin-genet og for andre protein-kodende gener omhandlet heri blev påvist ved DNA-sekvensanalyse 5 og at være som følger for hver af ekspressionskonstruktionerne : pPFZ(R) 5’—^3' Afstand (bp) R2 AAGGAGAATTC ATG 5 R4 AAGGGTATCGAGAATTC ATG 11

Hver ribosom-bindingsplads variation anvendtes til at fremstille prorennin-ekspressionsplasmider for senere at undersøge de mulige virkninger, som er rbs-nukleotid-10 sekvensindhold og afstand har på protein-ekspressionsniveauer.

Konstruktion af prorennin-ekspressionsplasmiderne

Forsøgstrinnene anvendt til at opbygge prorennin-ekspres-sionsplasmiderne er illustreret i fig. 1. Først fremstil-15 ledes 4772 bp vektor-fragmentet indeholdende plasmid-repliconen, ampicillin-resistens-markøren og den ønskede prorennin-kodesekvens (fra aminosyre codon 83 til stop (TGA) codonen) ved at nedbryde 30 /ug pCRIOl plasmid DNA med Hindlll og KpnI-restriktionsendonukleaser.

20 Restriktionsreaktionen elektroforesebehandledes på en 1% agaro se-gel og begge DNA-fragmenter i soleredes fra gel-skiver ved elektroeluering. 906-bp Hindlll-Kpnl-fragmentet indeholdende den aminoendestillede del af proren-nin cDNA-sekvensen blev yderligere nedbrudt med BamHI 25 efterfulgt af elektroforese på en 5# polyacrylamid-gel.

235-bp BamHI-KpnI-fragmentet (der koder aminosyre-codoner 6 til 83) elektroelueredes fra en gelstrimmel.

25 DK 173028 B1

Hindlll-BamHI DNA-fragmenterne indeholdende ekspressionssekvenserne fra de forskellige ptrpLI-R-B48-derivater blandedes hver for sig i omtrent lige molære forhold med de to restriktionsfragmenter stammende fra pCRIOl 5 (4772 bp og 235 bp). Blandingerne ligeredes ved tilsæt ning af T4-DNA-ligase, og en del af hver ligationsblanding anvendtes til indførsel i kompetente HB101 celler.

Kolonier opnåedes i hvert tilfælde, dersom celler selekteredes på LB-agar-plader indeholdende ampicillin (25 10 jjg/ml). Adskillige antibiotika-resistente kolonier fra de tidligere nævnte kolonier blev taget over i 5 ml LB-kulturer, og plasmid DNA underkastedes restriktionsenzym-analyse. I hver gruppe viste de fleste rekombinante mikroorganismer sig at indeholde det komplette prorennin-15 gen rekombineret nabostillet til trp-promotor-rbs-sekven-sen.

Restriktionsendonuklease-analyse af disse ekspressions-plasmider viste, at de indeholdt hele prorennin-kodesekvens en korrekt anbragt til direkte ekspression af pro-20 rennin. DNA-sekvensanalyse ved hjælp af den kemiske nedbrydningsmetode beskrevet af Maxam og Gilbert som ovenfor af det meste af prorennin-genet, in vitro tilknytningsområdet og trp-promotor-operator-området bekræftede, at den kunstige initiationscodon og prochymosin-ko-25 desekvensen direkte følger E. coli trp-promotor-opera-toren og tjener til at etablere den særskilte identitet for de to ekspressionsplasmider på nukleotid-niveauet.

De to konstruerede prorennin-plasmider er blevet betegnet pPFZ-R2 og pPFZ-R4. Yderligere følger ATG-initiations-30 codonen E. coli ribosomal-bindingspladsen af trp-fører-peptidet med 5 og 11 nukleotider i henholdsvis ekspressionsplasmider pPFZ-R2 og pPFZ-R4.

Translation af DNA-sekvensen af disse ekspressionspias- 26 DK 173028 B1 mider forudsiger et prorennin-protein på 366 aminosyrer.

Den bestemte molekylvægt af dette polypeptid er ca. 41000.

Dersom E. coli indeholdende et ekspressionsplasmid dyrkes i minimalt substrat, der mangler tryptophan, frem-5 bringer cellerne et protein, der vandrer lidt større end det modne chymosin (ca. 36000 dalton) ved SDS-poly-acrylamid-gelelektroforese [Laemmli, U.K. Nature 227: 680 (1970)]. Intet sådant protein er frembragt af E. co- li-celler indeholdende vektor-plasmidet pBR322 dyrket 10 under samme betingelser. Kun meget lidt prorennin-protein er produceret af identiske ekspressions-rekombinanter dyrket i M9CA-substrater indeholdende meget tryptophan (100 pg/ml), hvilket tyder på, at produktionen i E. coli af formodet prochymosin-protein er under kontrol af 15 trp-promotor-operatoren, således som den er bygget op.

Bedømmelse af prorennin-syntese ved hjælp af ekspressions-kulturer E. coli-transformanter, der indeholder prorennin-ekspres-sionsplasmiderne pPFZ-R2 og pPFZ-R4 dyrkedes i M9CA-20 substrater, der manglede tryptophan, til induktion af trp-promotoren. Celler dyrkedes i rystekolber til en ODjjjq på 1,0. Celle-piller fra disse kulturer lyseredes i 2% SDS, 19é beta-mercaptoethanol, og proteiner udfældedes med acetone. Udfældede proteiner blev atter opløst 25 i SDS-prøvepuffer, og analyseprøver elektroforeredes på 10% SDS-polyacrylamid-geler [Laemmli, Nature 227:680 (1970)]. Prorennin-mængder blev bestemt ved densitome-ter-gelscannlng af Coomassie-blåfarvet gel med 579 nm.

Man fandt ved fasekontrast-mikroskopi, at refraktile 30 inklusionslegemer findes i E. coli-celler indeholdende prochymosin-ekspressionsplasmiderne. Kontrolceller indeholdende plasmid-vektor pBR322, der dyrkedes under samme 27 DK 173028 B1 betingelser, afslørede ingen sådanne refraktile inklusionslegemer. Analoge observationer er blevet rapporteret med hensyn til genetisk manipulerede mikroorganismer, der frembringer exogene genprodukter [Carrier et 5 al., Trends in BioTechnology 1:109 (1983)], som f.eks.

Insulin og thymosin. De refraktile legemer antages at være opsamlingssteder for udtrykt fremmed protein.

Tilstedeværelsen af refraktile inklusionslegemer synes at være direkte korreleret med en stor produktion af pro-10 rennin.

Ovenfor beskrevne bakterielle syntetiserede prochymosin reagerer specifikt med prorennin-antistoffer.

Bedømmelsen af væksten af rekombinanter af E. coli HB101 indeholdende plasmider pPFZ-R2 og pPFZ-R4 under identis-15 te rystekolbe-dyrkningsbetingelser viste, at plasmid pPFZ-R2 reproducerbart producerede prorennin-mængder, der lå fra 10 til 15%, og pPFZ-R4 frembragte prorennin-mængder, der lå fra 5 til 7%.

Ekspressions- Procent af totalt Kultur Stamme plasmid celle-protein1 O.D. 550 HB101 pPFZ-R2 13,1 0,5 pPFZ-R4 7,1 0,5 HB101 pPFZ-R2 11,6 0,1 10,2 0,6 HB101 pPFZ-R2 15,4 0,3 11,7 0,5 pPFZ-R4 7,0 1,0

Baseret på densitometer-undersøgelser af SDS-polyacryl-amid-geler.

28 DK 173028 B1

Den eneste forskel mellem de to prorennin-ekspressions-konstruktioner (pPFZ-R2 og pPFZ-R4) udtrykt som nukleo-tid-sammensætning forekommer i sekvenserne omkring ribo-som-bindingspladsen og initiator-codonen af prarennin-5 genet. Dog er der signifikant variation i mængderne af prorennin-ekspression mellem kulturer indeholdende de forskellige plasmider. Den observerede forskel i prorennin-ekspression kan skyldes forskellene i den primære DNA-sekvens omkring ribosom-bindingspladsen. Som først 10 bemærket af Shine og Dalgarno (1974, PNAS 71:1342-1342), er der en purin-rig sekvens centreret omkring 10 nukleo-tider oven for initiator-codonen, der er komplementær til 3' -endesekvensen af 16S ribosomal RNA. Et sikkert bevis understøtter nu rollen af mRNA til rRNA baseparring 15 ved selektionen af proteinsyntese-initiationspladser af E. coli ribosomer. Ribosom-bindingspladser fra mange bakterielle og phag mRNA-materialer er blevet sekvensbestemt, og en consensus Shine-Dalgarno-sekvens er blevet bestemt som værende: TAAGGAGGT. Tre parametre har indflydelse 20 på effektiviteten af Shine-Dalgarno-interaktion: 1) længden af komplementaritet; 2) afstanden mellem Shine-Dalgarno- sekvensen og initiator-codonen og 3) den grad, til hvilken Shine-Dalgarno-sekvensen er maskeret af sekundær opbygning.

25 Undersøgelse af området rundt om S.D.-sekvensen for hver af de ovennævnte to ekspressionspiasmider viste følgende:

Afstand •DNA (Consensus) sekvens- (bp)

S.D. TAAGGAGGT

trpL AAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACA ATG 7 pPFZ—R2 AAGTTCACGTAAAAAGGAGAATTC ATG 5 PPFZ-R4 AAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGAGAATTC ATG 11 29 DK 173028 B1 det vil sige, at mængden af komplementariteten i pPFZ-R2 er 6 tilstødende nukleotider, medens den anden kun har 3 tilstødende nukleotider. Skønt afstanden mellem ribosom-bindingspladsen og initiator-codonen er 5 nukleo-5 tider i pPFZ-R2, der er meget tæt på afstanden i det na-' turlige trpL-gen-initiatorområde, hvor der ligger 7 nukleotider imellem, medens pPFZ-R4 har 11 nukleotider mellem ribosom-bindingspladsen og initiator-codonen.

Et andet vigtigt træk på effektive ribosom-bindingsplad-10 ser genkendt i pPFZ-R2 er en translationel stop-codon (TAA) i samme aflæsningsramme som prorennin kodesekvensen lige inden Shine-Dalgarno-sekvensen. Alle disse træk ved pPFZ-R2 DNA-sekvensen spiller en rolle ved dens høje effektive prorennin-ekspression.

15 Degeneration af den genetiske kode giver naturligvis en vis grad af variation i sammensætningen af en given nu-kleotid-sekvens, uden at forandre aminosyre-sekvensen af proteinet kodet af denne sekvens. Således kan to eller flere forskellige base-sekvenser (synonyme codoner) 20 blive substitueret i en givet nukleotid-sekvens uden at forandre identiteten af de aminosyrer, der er specificeret heraf. Yderligere er det muligt at udtage codoner eller at substituere en eller flere codoner med codoner, der er forskellige fra de degenererede codoner, for at 25 fremstille et strukturelt modificeret polypeptid med et, der i det væsentlige har samme anvendelse eller aktivitet som polypeptidet produceret af det ^modificerede DNA-molekyle. Disse to polypeptider er funktionelt ækvivalente ligesom de to DNA-molekyler, der bevirker deres 30 frembringelse, selvom forskellene mellem DNA-molekylerne ikke er relaterede til degeneration af den genetiske kode.

Codonen for nr. 4 aminosyren, threonin, er ACT i stedet 30 DK 173028 B1 for ACC. På grund af overskuddet af den genetiske kode, forandrer dette ikke aminosyren ved denne stilling. Da dette skema anvender konstruktionen af et hybrid gen, hvori den sektion, der koder for den N-endestillede del 5 af hormonet, er foretaget syntetisk, muliggør den syntetiske DNA for opbygningen af en ny kodesekvens for den del af prorenninet. Fordi aminosyre-sekvensen for prorennin er nøjagtigt opretholdt på grund af overskud af genetisk kode, er disse slags sekvensforandringer u-10 den betydning, og genet frembringer et ækvivalent poly-peptid til det, der frembringes i naturen (bortset fra det N-endestillede met).

Isoleringen af methionin-prorennin udtrykt ved hjælp af de omhandlede bakterielle (E. coli) transformanter, om-15 dannelsen heraf til rennin og den mælke-koagulerende virkning af dette rennin blev demonstreret ved hjælp af den metode, der er beskrevet i engelsk patentansøgning 2 100 737A og af Emtage et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 80:3671-3675 (1983).

20 Plasmider, der indeholder et E. coli trp-promotor-opera-tor-fragment, en ATG-initiationscodon, enten ribosom-bin-dingspladsen omfattende R2 eller R4, og cDNA-gen-sekvenser, der koder for bovint væksthormon, porcint væksthormon eller human epiderm vækstfaktor, er også blevet kon-25 strueret, og har, når de er indført i E. coli, resulteret i særdeles effektiv ekspression af de heterologe proteiner. Nukleotid-sekvensen af vektoren, promotoren og ribosom-bindingspladsen indtil ATG-lnitiationscodonen var i det væsentlige det samme som beskrevet ovenfor for 30 prorennin-ekspressionsplasmideme. Ekspressionsniveauerne for det heterologe protein frembragt af disse forskellige konstruktioner bestemtes ved hjælp af SDS-polyacryl-amid-gelelektroforese efterfulgt af scannings-densitome-tri. De relative niveauer for opnået ekspression med dis- 31 DK 173028 B1 se kulturer var som de, der er observeret for prorennin-ekspression. Dvs. animale væksthormon-ekspressionsplas-mider indeholdende R2-versionen af ribosom-bindingsplad-sen overskrider ekspressionsniveauerne for R4-versionen 5 med omtrent 4 til 5 gange; det endelige ekspressionsniveau i E. coli-celler var omkring 25% til 30% af det totale cellulære protein.

Det skema, der anvendtes til at opnå ekspression af bGH og pGH-gener,var væsentligt det samme som fremgangsmåden 10 beskrevet af P. Seeburg et al., (1983, DNA 2137-45) for ekspression af animalske væksthormoner. Det bekræftede konstruktionen af et sammensat gen bestående af et klonet syntetisk DNA og klonet cDNA-sekvenser. Denne kon-struktionsopbygning muliggør direkte ekspression i E.

15 coli af bGH og pGH uden signal-sekvensen ved at indføre en translations-initiationscodon for den første aminosyre af det modne hormon. Anvendelsen af syntetisk DNA muliggør også opbygningen af en ny kodesekvens for det aminoendestillede område af bGH og pGH-generne. Amino-20 syre-sekvenserne kodet af de syntetiske dele af vækst hormon-generne blev nøjagtigt bibeholdt på grund af overskuddet af den genetiske kode.

Plasmidet indeholdende bGH cDNA blev opnået som beskrevet af Miller et al., J. Biochem. 255, 7521 (1980) og 25 blev betegnet pBGH-102. Det er ækvivalent med plasmid BP348 beskrevet af Miller et al. Nukleotid-sekvensen af bGH mRNA og dens tilsvarende aminosyre-sekvens som forud-sagt ved hjælp af nukleotid-sekvensen er tidligere offentliggjort (Miller, W., et al., angivet ovenfor). Restrik-30 tionsfragmentet indeholdende tryptophan-promotor-opera- tor og ribosom-bindingsplads-sekvenserne opnåedes ud fra ptrpLI-R2 og -R4. Sekvenserne for det syntetiske dobbeltstrengede DNA, der anvendtes til at modificere amino-og carboxyendestillingerne i væksthormon-generne, blev 32 DK 173028 B1 udledt af artiklen af Seeburg et al. (1983» DNA 2; 37-45). Oligonukleotiderne syntetiseredes som angivet ovenfor under anvendelse af phosphoramidit-kemi (Caruthers et al.), og fragmenterne samledes ud fra enkeltstrenge-5 de oligomere, .11-16 baser lange. N-endestillet syntetisk DNA koder for den kunstige ATG-initiationscodon for proteinsyntese og de første 23 aminosyre-codoner i bGH.

For at lette indførslen heraf i pBR322 DNA, omfatter dette syntetiske fragment også 4-base enkeltstrengede 10 klæbende ender på 5'-enderne svarende i sekvens til de cohesive ender opstået ved restriktionsnukleaserne EcoRI og Hindlll. Det ønskede ligationsprodukt isolere-des fra en 3% polyacrylamid-gel som et bånd på omtrent 80 bp. Det rensede DNA ligeredes herefter med pBR322 15 DNA, der forud var nedbrudt med restriktionsendonukle-aser EcoRI og Hindlll og transformeret i kompetente E. coli-celler. Det klonede syntetiske DNA underkastedes DNA-sekvensanalyse under anvendelse af den kemiske nedbrydningsmetode (Maxam og Gilbert, 1980, Methods Enzy-20 mol 65; 499) for at sikre integriteten af den modificerede bGH-sekvens.

Ekspressionsvektorer lig med plasmiderne beskrevet af Seeburg et al. konstrueredes for både bGH og pGH for at sammenligne virkningen af den forandrede ribosom-bin-25 dingsplads på ekspressionen af pattedyrs gener forskellig fra prorennin. De eksperimentelle trin anvendt til opbygning af bGH-ekspressionsplasmiderne er angivet i fig. 5 og 6.

Først isoleredes regionen fra cDNA-klonen, pBGH-102, 30 der koder sekvenser for aminosyrer 23 til 86, på en 5% polyacrylamid-gel og ligeredes til det klonede syntetiske 75 bp EcoRI-PvuII-fragment isoleret fra pBR322-sub-klonen, der koder for rækkefølgen for ATG-initiationsco-donen og de første 22 aminosyrer af bGH. Ligationsblan- 33 DK 173028 B1 dingen spaltedes med restriktionsendonukleaser EcoRI og PstI, og et 270 bp fragment isoleredes fra en 5Jé po-lyacrylamid-gel og indførtes i passende spaltede pBR322 DNA. Under anvendelse af disse to pladser kan EcoRI-5 PstI DNA-fragmentét af modificeret pGH-gensekvens indføres i pBR322 plasmidet, således at kun en orientering af indskuddet er mulig. Plasmid DNA isoleret fra trans-formanter opnået i ligationen spaltedes med EcoRI og PstI for at verificere indførslen af 270 bp bGH-gen-10 fragmentet i vektoren. Herefter indførtes 440 bp PstI DNA-fragmentet fra pBGH-102 indeholdende kodesekvensen af bGH-aminosyrer 91 til 191 (plus det 3'-ikke-transla-terede område af bGH cDNA) i Pstl-pladsen af dette plasmid DNA for at fuldende opbygningen af bGH-genet i fuld 15 længde. Dette Pstl-fragment kunne indføres i to mulige orienteringer i forhold til resten af bGH-genet. Ifølge restriktionskortet ville den ønskede orientering af indskuddet fremkalde et omtrent 490 bp PvuII-fragment (fuldstændigt inden i bGH-genet), medens den gale orién-20 tering ville resultere i et 350 bp PvuII DNA-fragment.

Adskillige isolater af begge orienteringer blev identificeret efter: spaltning af plasmid DNA fra tetracyclinresistente transformanter med restriktionsendonuklease PvuII. En af plasmiderne identificeret på denne måde 25 betegnedes pBGH-212, og det fuldstændige bGH-gen analyseredes yderligere ved restriktionskortlægning og DNA-sekvensbehandling for at sikre korrektheden af plasmid-opbygningen.

Det næste trin ved opbygningen af bGH-ekspressionsplas-30 miderne indebærer indførslen af EcoRI-DNA-fragmenter indeholdende E. coli trp-promotor og ribosom-bindings-sekvenser. bGH-klonen i fuld længde, pBGH-212, spaltedes med restriktionsendonuklease EcoRI, behandledes med bakteriel alkalisk phosphatase og ligeredes med to for- 34 DK 173028 B1 skellige omtrent 370 bp EcoRI-fragmenter indeholdende de nødvendige sekvenser for bakteriel ekspression af bGH. To forskellige ligationer blev foretaget for at indføre trp-promotor-rbs-fragmenterne, hver med lidt for-5 skellige nukleotid-sekvenser i gen-initiationsregionen, i pBGH-212. Kompetente celler af stamme HB101 transformeredes med hver ligationsreaktionsblanding. Adskillige tetracyclin-resistente kolonier fra hver transformation blev udtaget og isoleret plasmid DNA underkastedes re-10 striktionsendonuklease-nedbrydningsanalyse. Det trp-pro- motor-rbs-holdige fragment kunne indføres i pBGH-212 DNA i to mulige orienteringer i forhold til retningen for transskription fra promotoren. Orienteringen af pro-motor-rbs-indekuddet, der ville resultere i transskrip-15 tion af bGH-genet, frembringer et 60 bp Hindlll DNA-fragment, medens den uønskede orientering frembringer et 400 bp fragment. Adskillige rekombinante mikroorganismer for hver ligationsblanding identificeredes med plasmi-der indeholdende det komplette bGH-gen nabostillet til 20 trp-promotor-rbs-sekvensen i den ønskede opbygning for direkte ekspression.

Opbygningen af ekspressionsplasmider påbegyndtes ved isolering af et omtrent 920 bp Hindlll-PvuII (partielt) DNA-fragment fra plasmiderne pBGH-212-R2 og pBGH-212-25 R4. Dette fragment indeholder trp-promotor-rbs-sekven sen og næsten hele bGH-kodesekvensen (alle bortset fra de sidste 4 aminosyregrupper og stop-codonen). For at udtrykke hele hormonet klonedes et fragment af syntetisk DNA, der koder C-endestillingen af bGH ind i pBR-322.

30 Dette 20 bp DNA-fragment syntetiseredes som to adskilte oligomere, blev sammenbundet til dannelse af et dobbeltstrenget fragment og indførtes i pBR322 DNA nedbrudt med restriktionsendonukleaser EcoRI og Hindlll. Efter nedbrydning af plasmid DNA fra denne suhklon med restrik-35 tionsendonukleaser PvuII og BamHI, isoleredes et 365 bp 35 DK 173028 B1

PvuII-BamHI DNA-fragment på en gel og rensedes ved e-lektroeluering. De endelige ekspressionsplasmider samledes ved ligering af det klonede syntetiske C-endestil-leholdige fragment (365 bp) med både trp-promotor-rbs-5 ' bGH DNA-fragmentet (920 bp) og det pBR322-afledte vektorfragment (3995 bp) som angivet i fig. 6. De fuldstændige bGH-ekspressionsplasmider identificeredes ved re-striktionsendonuklease-spaltning med PvuII. Disse bGH-ekspressionsplasmider karakteriseredes yderligere ved 10 mere nøjagtig bestemmelse af restriktionsenzym-spaltningskortet. Yderligere karakterisering af disse ekspres-sionsplasmider ved hjælp af DNA-sekvensanalyse verifi-cerede den modificerede bGH-gensekvens og fastlagde den særlige identitet af de to forskellige vektorer betegnet 15 pBGH-301 og pBGH-375.

Translation af disse DNA-sekvenser af ekspressionsplas-miderne forudsiger et hormon-polypeptid på 191 aminosyregrupper. Den beregnede molekylvægt af et sådant protein vil være omtrent 22000. Dersom celler indeholdende 20 bGH-ekspressionsplasmiderne pBGH-301 og pBGH-375 dyrke des under sådanne betingelser, der er kendt for at inducere trp-promotor dirigeret ekspression, producerer cellerne et samtidigt vandrende protein på størrelse af det rensede bGH-protein (opnået fra Miles), dersom to-25 tal-proteinekstrakter undersøgtes på SDS-polyacrylamid-gel (Laemmli, U. 1970, Nature 277, 680). Dette bånd var ikke synligt i proteinekstrakter fra celler indeholdende vektor-plasmid pBR322 dyrket under samme betingelser. bGH-niveauerne bestemtes ved densitometer-gelscanning 30 ved 579 nm. Kulturerne indeholdende ekspressionsplasmi-det med R2-versionen af rbs (pBGH-301) frembragte bGH-i en mængde på ca. 20% til ca. 25% af det totale cellulære protein. Derimod frembragte cellerne indeholdende pBGH-375 ekspressionsplasmidet med RA-versionen af rbs 35 bGH i en mængde på ca. 5% til 7% af det totale cellulære 36 DK 173028 B1 protein.

Når det drejer sig om pGH-ekspression, anvendtes et skema analogt med det, der anvendtes for bGH-ekspression.

Sekvensen af det dobbeltstrengede DNA anvendt til at mo-5 dificere aminoendestillingsdelen af pGH-genet var i det væsentlige som beskrevet af Seeburg et al. (omtalt ovenfor). De eksperimentelle trin, der anvendtes til at opbygge pGH-ekspressionsplasmiderne, er vist i fig. 7.

Først erstattedes området fra cDNA-klonen (pGH 24) med 10 den syntetiske del af pGH-gen. Fordi området kodende for amino syregrupperne 22 og 23 af pGH manglede en-PvuII-plads, blev den syntetiske 5*-del af pGH-hybridgenet sammenbundet med kodesekvenserne stammende fra det klonede cDNA ved en Asul-plads, der forekommer ved amino-15 syre-codonerne 16 og 17 i pGH-24. En Asul-plads var også tilstede ved den samme stilling i det syntetiske DNA, der koder for aminoendedelen af pGH. På grund af tilstedeværelsen af yderligere Asul-pladser i det klonede cDNA, opbyggedes pGH-genet af tre forskellige DNA-fragmenter.

20 635 bp Pstl-PvuII-fragmentet isoleret fra pGH-24 blev nedbrudt med Rsal, og det fremstillede 200 bp Pstl-Rsal-fragment blev yderligere spaltet med Asul. Det modificerede gen blev opbygget ved at ligere det klonede syntetiske EcoRI-Asul 53 bp fragment, 75 bp AsuI-Rsal-frag-25 mentet og 480 bp Rsal-PvuII-fragmentet sammen. Slutfor-bindelsen af denne ligering blev nedbrudt med EcoRI og PvuII, og et DNA-fragment svarende til 570 bp i størrelse isoleredes fra en 5% polyacrylamid-gel. Dette fragment ligeredes med EcoRI-PvuII (partiel) vektorfragmen-30 tet fra pGH-ekspres si onsplasmidet pBGH-375 og transformeret til kompetente celler af E. coli stammen MM294 (ATCC 33625) og selekteredes på plader indeholdende am-picillin. Dette pre-ekspressionsplasmid (identificeret 37 DK 173028 B1 ved tilstedeværelsen af et 910 bp EcoRI-BamHI-fragment) indeholder det fuldstændige pGH, da pGH og bGH-proteinerne har samme C-afslutnings-aminosyresekvens.

Det næste trin i opbygningen af pGH-ekspressionsplasmi-5 derne indebærer indførelse af de omtrent 390 bp EcoRI DNA-fragmenter indeholdende E. coli trp-operon-promotor-sekvensen og modificerede ribosom-bindingspladser. Det fuldstændige pGH-plasmid blev spaltet med restriktions-endonuklease EcoRI og ligeret med adskilte versioner af 10 EcoRI-fragmenter indeholdende den nødvendige sekvens for bakteriel ekspression af pGH. To forskellige ligationsreaktioner blev foretaget under anvendelse af ekspressionsfragmenter med lidt forskellige nukleotid-sekvenser i området omkring ribosom-bindingspladsen. Kompetente cel-15 ler af stamme C600 transformeredes med hver ligationsreaktion. Plasmid DNA isoleredes fra adskillige antibiotika-resistente kolonier fra hver transformation og underkastedes restriktionsendonuklease-nedbrydningsanaly-se. Det trp-promotor-holdige fragment kunne Indskydes i 20 pre-ekspressionsplasmidet i to mulige orienteringer i forhold til transskriptionsretningen fra trp-promotoren. Orienteringen af promotor-indskudsfragmentet, der ville resultere i transskriptionen af pGH-genet frembringer et 920 bp Hindlll DNA-fragment, medens den uønskede ori-25 entering frembringer et 600 bp DNA-fragment. Adskillige isolater fra hver ligationsreaktion identificeredes med plasmider, der indeholdt det fuldstændige pGH-gen nabostillet til trp-promotoren og rbs-sekvensen i den opbygning, der er nødvendig for direkte ekspression.

30 Yderligere karakterisering af disse ekspressionsopbygninger opnåedes ved fysisk kortlægning med yderligere restriktionsendonukleaser. Yderligere karakterisering af disse pGH-ekspressionsplasmider ved DNA-sekvénsana-lyse har angivet deres specielle identitet på nukleotid- 38 DK 173028 B1 niveauet. De to pGH-ekspressionsplasmider blev betegnet pGH-101 og pGH-107.

Translation af DNA-sekvensen af disse pGH-ekspressions-plasmider forudsiger et hormon-polypeptid på 191 amino-5 syrer. Den skønnede molekylvægt af sådant et protein vil være ca. 22000. Dersom rekombinante mikroorganismer omfattende plasmider pGH-101 eller pGH-107 dyrkedes under betingelser, der er kendte for at inducere trp-pro-motor-dirigeret ekspression, ville cellerne frembringe 10 et protein med en størrelse på ca. 22000 dalton. Dette bånd fandtes ikke i proteinekstrakter fremstillet ud fra celler indeholdende vektor-plasmidet pBR322 dyrket under samme betingelser. Mængden af pGH-produktion blev bestemt under anvendelse af densitometer-scanning af de enkelte 15 baner af SDS-polyacrylamid-geler. Adskillige E. coli proteiner falder inden for 22000 dalton størrelsesområde og udgør ca. 296 til 5# af det totale celleprotein i kontrol-celleekstrakter. Idet der korrigeres for bidraget fra disse oprindelige proteiner, repræsenterer pGH-bånde-20 ne synlige i ekspressionskultur-proteinekstraktet ca.

596 og 1596 af det totale celleprotein .for henholdsvis pGH-101 og pGH-107. Kvantificering af pGH-niveauerne i kulturer dyrket i nærværelse af tryptophan (100 ug/ml) viste reducerede mængder af pGH-ekspression. Denne kends-25 gerning vil indebære, at produktionen i E. coli af pGH-proteinet faktisk er under kontrol af trp-promotor-ope-ratoren, sådan som det er opbygget. Forskellen i ekspressionsmængder, når det drejer sig om pGH, var som den, der er observeret i prorennin og bGH-ekspression under 30 anvendelse af den samme ribosom-bindingspladssekvens.

Et andet eksempel på effektiv ekspression af et heterologt gen under anvendelse af ."Jte" trp-promotor-rbs er fremstillingen af human urogastron eller epiderm vækst- 39 DK 173028 B1 faktor (hEGF) ud fra en syntetisk DNA-sekvens. Planen, der er opbygget for at opnå effektiv bakteriel produktion af hEGF, anvender den kemiske opbygning af et DNA-fragment indeholdende kodesekvensen for fuldstændig 5 hEGF. Dette approach muliggør den direkte ekspression af det fuldstændige hormon ved at indføre en ATG-initia-tionscodon for proteinsyntese foran den codon, der koder for den første aminosyrerest af det fuldstændige EGF-polypeptid. Det syntetiske gen består af 15 oligonu-10 kleotider, 12-^5 baser i længde. Tre adskilte lig^tio-ner blev udført, og de mellemliggende ligationsprodukter blev isoleret på en polyacrylamid-gel. De rensede mellemliggende ligationsprodukter ligeredes herefter til endelig samling af hEGF-genet. For at lette dettes ind-15 førsel i plasmid pBR322 DNA udformedes det syntetiske hEGF-gen til at indeholde EcoRI og Hindlll-restriktions-nuklease-klæbende ender ved endestillingerne. hEGF-syn-tetisk DNA ligeredes med pBR322 DNA spaltet med EcoRI og Hindlll, og den syntetisk afledte region af plasmidet 20 analyseredes ved DNA-sekvensanalyse (Maxam og Gilbert, angivet ovenfor) for at sikre, at det var korrekt.

Vektorer for ekspressionen af hEGF i E. coli opbyggedes under anvendelse af trp-promotor-rbs-fragmentet, tidligere anvendt til ekspression i stor målestok af proren-25 nin, bGH og pGH. Opbygningen af EGF-ekspressionsplasmi-derne påbegyndtes ved spaltning af pBR322-EGF-subklonen med restriktionsendonukleasen EcoRI og efterfølgende de-phosphorylering med bakteriel alkalisk phosphatase. Eks-pressionsplasmiderne blev opbygget under anvendelse af 30 EcoRI-fragmenterne indeholdende trp-promotor-rbs-sekven-sen. To forskellige ligationer blev foretaget under anvendelse af trp-promotor-rbs-fragmenterne med lidt forskellig nukleotid-sekvens i området omkring ribosom-bin-dingspladsen. Kompetente celler af E. coli stammen HB101 40 DK 173028 B1 transformeredes med hver ligationsreaktion. Adskillige antibiotika-resistente kolonier fra hver transformation blev udtaget, og isoleret plasmid DNA underkastedes re-striktionsendonuklease-spaltningsanalyse. Det trp-promo-5 tor-rbs-holdige fragment kunne Indføres i EGF-subklonen i to mulige orienteringer i forhold til transskriptionsretningen fra promotoren. Orienteringen af promotor-indskud sfragmentet, der ville bevirke ekspression af det syntetiske EGF-gen, frembringer et 510 bp Hindlll DNA-10 fragment, medens den uønskede orientering frembringer et 200 bp Hindlll DNA-fragment. Adskillige isolater fra hver ligationsreaktion identificeredes med plasmider indeholdende EGF-genet nabostillet til den bakterielle promotor-rbs-sekvens i den udformning, der er nødvendig 15 for direkte ekspression. DNA-sekvensanalyse af ekspres-sionsplasmiderne bekræftede, at EGF-kodesekvensen direkte følger E. coli trp-promotor-rbs som ønsket. ATG-ini-tiationscodonen følger ribosom-bindingspladssekvensen med 5 og 11 nukleotider i EGF-ekspressionsplasmiderne 20 betegnet henholdsvis pEGF-R2 og pEGF-R4.

Translation af DNA-sekvensen af EGF-ekspressionsplasmiderne forudsiger et 54 aminosyrepolypeptid indeholdende seks cysteinrester, der antages at danne tre indre di-sulfid-bindinger. Den skønnede molekylvægt for et sådant 25 hormon ville være ca. 6353. Kulturer af en mutant stamme af E. coli betegnet Ion (Gottesman et al., J. Bacte-riol. 148, 265, 1981), der kan fås fra E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut, som stamme nr. ECGSC-6436, transformeredes med EGF-eks-30 pressionsplasmider og dyrkedes under betingelser, der er velkendte for at inducere trp-promotor-dirigeret ekspression. Denne mutante stamme, der mangler en af de adskillige proteaser, der findes i vild-type celler, anvendtes for at formindske proteolysen af det bakterielt 35 frembragte hEGF.

41 DK 173028 B1

Totale proteinekstrakter af disse ekspressionskulturer undersøgtes på SDS-polyacrylamid-geler i et forsøg på at bestemme mængden af EGF-produktion. Skønt der var forholdsvis dårlig opløsning af de lav-molekylære poly-5 peptider (herunder renset muse-EGF, fremskaffet fra en kommerciel kilde), forekom der mere protein i det EGF-molekylære vægtområde i ekstrakterne fra ekspressionskulturerne i forhold til kontrolekstrakterne. Densito-meter-scanninger af de enkelte bånd af SDS-polyacrylamid-10 gelen blev foretaget. Cellulære proteiner på mindre end 10000 dalton i størrelse udgjorde ca. 1% af det totale cellulære protein i kontrolekstrakter. Idet der korrigeres for bidraget fra disse oprindelige proteiner, svarer de formodede EGF-niveauer i ekspressionskultur-protein-15 ekstrakterne til ca. 3 til 5% af det totale cellulære protein.

Claims (3)

1. Nukleotid-sekvens, kendetegnet ved, at den omfatter DNA-sekvensen (a) TAAAAAGGAGAATTC ATG og/eller

5 DNA-sekvensen (b) TAAAAAGGGTATCGAGAATTCC ATG.

2. Bakterielt ekspressionsplasmid, kendetegnet ved, at det omfatter en af de i krav 1 angivne DNA-sekvenser samt en med foranstående promotor.

3. Bakterielt ekspressionsplasmid ifølge krav 2, 10 kendetegnet ved, at det omfatter en replicon, en selekterbar markør og en E. coli trp-promotor knyttet til et gen, der koder for et heterologt protein, over en syntetisk linker, idet ekspressionsplasmidet omfatter en DNA-sekvens som angivet i krav 1 på ribosom-bindings-15 pladsen af det gen, der skal udtrykkes.

4. Ekspressionsplasmid ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der er en 5 bp eller en 11 bp afstand mellem ribosom-bindingspladsen og ATG-initiationskodonen af det gen, der skal udtrykkes; idet 5 bp afstandsstykket 20 har nukleotid-sekvensen -AATTC-, og 11 bp afstandsstykket har nukleotid-sekvensen -ATCGAGAATTC-.

5. Bakterielt ekspressionsplasmid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det gen, der koder for et heterologt protein, er prorennin-genet eller et mammalt 25 væksthormon-gen.

6. Bakterielt ekspressionsplasmid ifølge krav 5, hvor det mammale væksthormon-gen er bovint væksthormon-gen, por-cint væksthormon-gen, eller humant epidermalt væksthormon-gen. 2 DK 173028 B1

7. Ekspressionsplasmid ifølge krav 2 til fremstilling af et heterologt protein i E. coli, kendetegnet ved, at plasmidet omfatter: (i) en E. coli trp-promotor/ 5 (ii) nukleotid-sekvesen TAAAAAGGAGAATTC og/eller TAAAAAGGG TAT C GAGAAT TC; (iii) nukleotider, der koder for et translationsstartssignal for translation af element (iv); og (iv) et strukturelt gen, der koder for aminosyrese- 10 kvensen af det heterologe protein.

8. Ekspressionsplasmid ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det omfatter et translationelt stop-kodon i samme læseramme som det strukturelle gen af den heterologe protein DNA-sekvens, hvilket kondon er placeret for- 15 ud for Shine-Dalgarno-sekvensen.

9. Ekspressionsplasmid ifølge krav 2, kendetegnet ved en komplementaritetslængde på 6 tilstødende nukleotider med consensus Shine-Dalgarno-sekvensen TAAGGAGGT og en nukleotid-sekvens mellem kom- 20 plementaritetslængden og ATG-genet, der skal udtrykkes med nukleotid-sekvensen, der er -AATTC- eller -ATCGAGAATTC-.

10. Plasmid ifølge krav 2, valgt blandt pPFZ-R2 og pPFZ-R4, som har deponeringsnumrene ATCC 39544 og ATCC 39543.

11. Plasmid ifølge krav 2 ptrpLI-R2, kendeteg net ved, at det er et derivat af plasmid ptrpLI, der har nukleotid-sekvensen -AAGGAGAATTCATG- nedstrøms og i ribosombindingsregionen af trp promotor-operatoren af plasmidet ptrpLI. DK 173028 B1 3

12. Plasmid ifølge krav 2 pBGH-301, kendetegnet ved, at det er et derivat af plasmidet pBR322, der har trp promotor-operatoren af plasmidet ptrpLI, nukleotid-sekvensen -AAGGAGAATTCATG- nedstrøms og i ribosombin- 5 dingsregionen af trp promotor-operatoren og kodningssekvensen for bovint væksthormon operativt linket til nukleotidsekvensen.

13. Plasmid ifølge krav 2 pGH107, kendetegnet ved, at det er et derivat af plasmid pBR322, der har trp 10 promotor-operatoren af plasmidet ptrpLI, nukleotidsekvensen -AAGGAGAATTCATG- nedstrøms og i ribosombindingsregionen af trp promotor-operatoren og kodningssekvensen for porcint væksthormon operativt linket til nukleotidsekvensen.

14. Plasmid ifølge krav 2 EGF-R2, kendetegnet ved, det er et derivat af plasmid pBR322, der har trp promotor-operatoren af plasmidet ptrpLI, nukleotidsekvensen -AAGGAGAATTCATG- nedstrøms og i ribosombindingsregionen af trp promotor-operatoren og kodningssekvensen for 20 humant epidermalt væksthormon operativt linket til nukleotidsekvensen.

15. E. coli, kendetegnet ved, at den indeholder et plasmid ifølge et vilkårligt af kravene 2-7.

16. E. coli ifølge krav 15, kendetegnet ved, 25 at den omfatter pPFZ-R2 og med identifikationsegenskaberne af ATCC-39544.

17. E. coli ifølge krav 15, kendetegnet ved, at den omfatter pPFZ-R4 og med identifikationsegenskaberne af ATCC-39543.

18. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein, ken detegnet ved, at man i et vandigt substrat omfat- 4 DK 173028 B1 tende en assimilerbar kilde for carbon, nitrogen og uorganiske salte dyrker en mikroorganisme, der er en E. co-li, der omfatter et plasmid ifølge et vilkårligt af kravene 2-7, indtil en væsentlig mængde bakterielt produce-5 ret protein er udtrykt.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18 til fremstilling af pro-rennin, kendetegnet ved, at man i et vandigt næringssubstrat omfattende en assimilerbar kilde for carbon, nitrogen og uorganiske salte dyrker en mikroorganis-10 me, der omfatter en E. coli K-12 stamme omfattende plasmid pPFZ-R2 eller pPFZ-R4, idet mikroorganismerne har identifikationsegenskaberne for henholdsvis ATCC-39544 og ATCC-39543, indtil væsentlige mængder prorennin er udtrykt, og at man isolerer prorenninen.

20. Fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet pPFZ-R4, kendetegnet ved, at man (a) dyrker plasmidet ptrpLI-R4-B48, der er karakteriseret som et derivat af plasmidet ptrpLI, som har nukleotidse-kvensen 2 0 -AAGGGTATCGAGAATTCATGGCTGAGATCACTAGGATCCTAGTGATCTCAGCCATG- nedstrøms af trp promotor-operatoren af plasmidet ptrpLI, med restriktions endonukleaser Hindlll og BamHI til opnåelse af trp promotor indeholdende fragmenter/ (b) skærer plasmidet pCRIOl med restriktions endonuklea-25 ser Hindlll og Kpnl til opnåelse af fragmenteret linieært DNA-plasmid; (c) fra trin (b) isolerer det store vektor-fragment på 4772 bp og det lille fragment på 906 bp; 5 DK 173028 B1 (d) yderligere skærer det lille fragment med restriktions endonukleaser BamHI til dannelse af et BamHI-Kpnl fragment med 235 bp; (e) ligerer fragmentet fra trin (a) og (d) med det store 5 vektor-fragment fra trin (c) til opnåelse af plasmidet PPFZ-R4.

21. Fremgangsmåde til fremstilling af pPFZ-R2, kendetegnet ved, at man (a) skærer plasmidet ptrpLI-R2-B48, der er karakteriseret 10 som et derivat af plasmidet ptrpLI, som har nukleotidse- kvensen -AAGGGTATCGAGAATTCATGGCTGAGATCACTAGGATCCTAGTGATCTCAGCCATG- nedstrøms af trp promotor-operatoren af plasmidet ptrpLI, med restriktions endonukleaser Hindlll og BamHI til opnå-15 else af trp promotor indeholdende fragmenter; (b) skæring af plasmid pCRIOl med restriktions endonukleaser HindiII og Kpnl til opnåelse af fragmenteret lineært DNA-plasmid; (c) fra trin (b) isolerer det store vektor-fragment på 20 4772 bp og det lille fragment på 906 bp; (d) yderligere skærer det lille fragment med restriktions endonukleaser BamHI til dannelse af et BamHI-Kpnl-fragment med 235 bp; (e) ligerer fragmentet fra trin 8a) og (d) med det store 25 vektor-fragment fra trin (c) til opnåelse af plasmidet pPFZ-R2.

22. Fremgangsmåde til fremstilling af plasmid ptrpLI-R2, der er karakteriseret som et derivat af plasmid ptrpLI, 6 DK 173028 B1 som har nukleotid-sekvensen -AAGGAGAATTCATG- nedstrøms i ribosombindingsregionen af trp promotor-operatoren af plasmid ptrpLI og ptrpLI-R4, der er karakteriseret som et derivat af plasmidet ptrpLI, der har nukleotid-sekvensen 5 -AAGGGTATCGAGAATTCATG- nedstrøms og i ribosombindingsregionen af trp promotor-operatoren af plasmidet ptrpLI, kendetegnet ved, at man (a) skærer plasmidet ptrpLI med Clal til opnåelse af lineært DNA-plasmid; 10 (b) behandler det lineære DNA-plasmid med Klenow-polyme rase til opnåelse af lineært plasmid, der har blunt- ender; (c) ligerer det lineære DNA-plasmid med blunt-enderne fra ptrpLI og den syntetiske dobbeltstrengede EcoRI-linker 15 (i) 5’CCATGAATTCT 3’

3. GGTACTTAAGA5' (ii) 5'AGAATTCATGG3' 3'TCTTAAGTACC5' 20 til opnåelse af plasmiderne ptrpLI-R2 og ptrpLI-R4; (d) identificerer plasmiderne ved bestemmelse af DNA-sekvenser ved linker-bindingerne.