JPH0630612B2 - 蛋白質の製造方法 - Google Patents
蛋白質の製造方法Info
- Publication number
- JPH0630612B2 JPH0630612B2 JP1166479A JP16647989A JPH0630612B2 JP H0630612 B2 JPH0630612 B2 JP H0630612B2 JP 1166479 A JP1166479 A JP 1166479A JP 16647989 A JP16647989 A JP 16647989A JP H0630612 B2 JPH0630612 B2 JP H0630612B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- expression
- dna
- plasmid
- sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 148
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 74
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 21
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 31
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 52
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 52
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 32
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 30
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 7
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 claims description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 103
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 71
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 19
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 105
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 97
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 32
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 28
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 16
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 16
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 15
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 15
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 13
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 13
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 12
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 11
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 11
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 10
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 244000309466 calf Species 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 8
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 7
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 7
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 7
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150108727 trpl gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101150084418 EGF gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 2
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088237 ATCGAT-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000914195 Homo sapiens Cerberus Proteins 0.000 description 1
- 101000887051 Homo sapiens Ubiquitin-like-conjugating enzyme ATG3 Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 101000851196 Mus musculus Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000030538 Thecla Species 0.000 description 1
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 102100039930 Ubiquitin-like-conjugating enzyme ATG3 Human genes 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Inorganic materials [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Lubricants (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の利用分野 本発明は細菌において外来蛋白質を発現せしめるための
組換えＤＮＡ技術に関する。より詳しくは、大腸菌（Es
cherichia coli）においてプロキモシン及び哺乳類の成
長ホルモンの有効な直接的発現方法及びそのための手段
に関する。
組換えＤＮＡ技術に関する。より詳しくは、大腸菌（Es
cherichia coli）においてプロキモシン及び哺乳類の成
長ホルモンの有効な直接的発現方法及びそのための手段
に関する。
従来の技術 子牛レンニン（キモシン）、すなわちチーズ製造に使用
するための好適な牛乳凝固プロテアーゼは供給が不足し
ている。他の牛乳凝固剤、すなわちカビの蛋白分解酵素
が開発研究されてきた。しかし、これらの蛋白分解活性
が大きいのでチーズの収量を低下させ、しばしば苦味を
与える。
するための好適な牛乳凝固プロテアーゼは供給が不足し
ている。他の牛乳凝固剤、すなわちカビの蛋白分解酵素
が開発研究されてきた。しかし、これらの蛋白分解活性
が大きいのでチーズの収量を低下させ、しばしば苦味を
与える。
牛乳凝固プロテアーゼの安定且つ充分な供給は経済的に
有利なので何人かの研究者がこの問題に組換えＤＮＡ技
術を適用してきた。Beppu et al,J.Biochem.９０：９０
１−９０４（１９８１）は大腸菌（E.coli）のプロレン
ニン（プロキモシン）の構造遺伝子のクローニングを報
告している。続く文献として、Beppu et al,J.Biochem.
91：１０８５−１０８８（１９８２）は大腸菌（Ｅ．co
li）の中でクローンされた子牛プロレンニンｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列を報告している。lacUV5プロモーター
を有する発現プラスミドの構成及びその大腸菌（E.col
i）β−ガラクトシダーゼの短いＮ−末端ペプチドに結
合されたプロキモシンペプチドのほとんどすべてを含有
する融合蛋白質を産生する能力はBeppu et al.,Gene１
９：３３７−３４４（１９８２）によつて記載されてい
る。
有利なので何人かの研究者がこの問題に組換えＤＮＡ技
術を適用してきた。Beppu et al,J.Biochem.９０：９０
１−９０４（１９８１）は大腸菌（E.coli）のプロレン
ニン（プロキモシン）の構造遺伝子のクローニングを報
告している。続く文献として、Beppu et al,J.Biochem.
91：１０８５−１０８８（１９８２）は大腸菌（Ｅ．co
li）の中でクローンされた子牛プロレンニンｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列を報告している。lacUV5プロモーター
を有する発現プラスミドの構成及びその大腸菌（E.col
i）β−ガラクトシダーゼの短いＮ−末端ペプチドに結
合されたプロキモシンペプチドのほとんどすべてを含有
する融合蛋白質を産生する能力はBeppu et al.,Gene１
９：３３７−３４４（１９８２）によつて記載されてい
る。
１９８３年３月２日に公開されたヨーロツパ特許出願第
73,029号は子牛プロレンニンＤＮＡ含有プラスミド、該
プラスミドで形質転換された微生物（E.coli）及びそれ
らによるプロレンニンの発現を記載している。
73,029号は子牛プロレンニンＤＮＡ含有プラスミド、該
プラスミドで形質転換された微生物（E.coli）及びそれ
らによるプロレンニンの発現を記載している。
１９８２年７月２８日に公開された英国特許出願第2,09
1,271Ａ号は種々のプロモーター（lac,trp,ura３，等）
を使用して発現させることからなるレンニン、プロレン
ニン及びプレプロレンニンを製造する方法及び薬剤を開
示している。プレプロレンニンをコードしている開示さ
れたＤＮＡ配列の１つには５′−末端に転写プロモータ
ーとリボゾーム結合部位が付加している。プレプロレン
ニンをコードしているＤＮＡの開始部位と転写プロモー
ターとリボゾーム結合部位を有するＤＮＡ断片との間の
距離は変化する。
1,271Ａ号は種々のプロモーター（lac,trp,ura３，等）
を使用して発現させることからなるレンニン、プロレン
ニン及びプレプロレンニンを製造する方法及び薬剤を開
示している。プレプロレンニンをコードしている開示さ
れたＤＮＡ配列の１つには５′−末端に転写プロモータ
ーとリボゾーム結合部位が付加している。プレプロレン
ニンをコードしているＤＮＡの開始部位と転写プロモー
ターとリボゾーム結合部位を有するＤＮＡ断片との間の
距離は変化する。
１９８３年１月６日に公開された英国特許出願第2,100,
737Ａ号はキモシン、メチオニンキモシン、プロキモシ
ン、メチオニンプロキモシン、プレプロキモシンを製造
する組換えＤＮＡ技術を記載している。大腸菌（E.col
i)trpプロモーター−オペレーター断片及び転写ターミ
ネーター、開始コドン、及びリボゾーム結合部位として
働くシン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）（ＳＤ）配列
を有するベクターが開示されている。ＳＤ配列とＡＴＧ
配列との間隔の効果についての研究も示されている。
737Ａ号はキモシン、メチオニンキモシン、プロキモシ
ン、メチオニンプロキモシン、プレプロキモシンを製造
する組換えＤＮＡ技術を記載している。大腸菌（E.col
i)trpプロモーター−オペレーター断片及び転写ターミ
ネーター、開始コドン、及びリボゾーム結合部位として
働くシン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）（ＳＤ）配列
を有するベクターが開示されている。ＳＤ配列とＡＴＧ
配列との間隔の効果についての研究も示されている。
１９８３年４月２０日に公開されたヨーロッパ特許出願
第77,109号は、プレプロキモシンのための遺伝子及び二
重lacUV5または修飾されたtrp系のような特異的ＣＮＡ
配列からなるＣＮＡ分子、すなわちプラスミド、及びそ
れらを使用して微生物（ラクトバチリ（lactobacill
i）、ストレプトコツキ（streptococci）、バチルス（b
acillus）または酵母）を形質転換させてその対立形質
又は成熟形としてプレプロキモシンを生成する形質転換
体を形成することを記載している。
第77,109号は、プレプロキモシンのための遺伝子及び二
重lacUV5または修飾されたtrp系のような特異的ＣＮＡ
配列からなるＣＮＡ分子、すなわちプラスミド、及びそ
れらを使用して微生物（ラクトバチリ（lactobacill
i）、ストレプトコツキ（streptococci）、バチルス（b
acillus）または酵母）を形質転換させてその対立形質
又は成熟形としてプレプロキモシンを生成する形質転換
体を形成することを記載している。
ヨーロツパ特許出願第36,776号（１９８１年９月３０日
公開）は、減衰領域が削除されたtrpプロモーター−オ
ペレーターを有する発現ベクター、及びその製造方法を
記載している。このベクターを有する形質転換体はトリ
プトフアンに富んだ培地で生育し得、菌体の生育は、tr
pプロモーター−オペレーター系の制御の下で他の挿入
物によつてコード化された外来ペプチドの早熟発現によ
つて阻害されることなく進行する。
公開）は、減衰領域が削除されたtrpプロモーター−オ
ペレーターを有する発現ベクター、及びその製造方法を
記載している。このベクターを有する形質転換体はトリ
プトフアンに富んだ培地で生育し得、菌体の生育は、tr
pプロモーター−オペレーター系の制御の下で他の挿入
物によつてコード化された外来ペプチドの早熟発現によ
つて阻害されることなく進行する。
Emtage et al.,Proc.Natl.Acad.SCi.80：３６７１−３
６７５、１９８３および日本特願昭５８−38,439号（１
９８３年３月９日出願）はプロキモシンｃＤＮＡ及び大
腸菌（E.coli）trpオペロンを有するハイブリツドプラ
スミドの構成、及び前記研究者による報告例より多くプ
ロレンニンを発現させるための用法を開示している。さ
らに上記日本出願の１９８３年１１月１５日付手続補正
書によるとＳＤ配列とプロキモシンの開始コドンとの間
隔を変化させることによる効果及びプロキモシンのＮ−
末端アミノ酸を長さの異なるペプチドに換えることによ
る効果に部分的に言及している。
６７５、１９８３および日本特願昭５８−38,439号（１
９８３年３月９日出願）はプロキモシンｃＤＮＡ及び大
腸菌（E.coli）trpオペロンを有するハイブリツドプラ
スミドの構成、及び前記研究者による報告例より多くプ
ロレンニンを発現させるための用法を開示している。さ
らに上記日本出願の１９８３年１１月１５日付手続補正
書によるとＳＤ配列とプロキモシンの開始コドンとの間
隔を変化させることによる効果及びプロキモシンのＮ−
末端アミノ酸を長さの異なるペプチドに換えることによ
る効果に部分的に言及している。
Harris et al.Nucleic Acids Research１０：２１７７
−２１８７（１９８２）はプレプロキモシンのためのｃ
ＤＮＡコードのクローニング及びヌクレオチド配列を報
告している。Goff et al,Gene ２７，３５〜４６（１９
８４）は酵母であるサツカロマイセス・セレビシアエ
（Saccharomyces cerevisiae）における子牛プロキモシ
ンの発現を記載している。プレプロキモシンｃＤＮＡの
制限エンドヌクレアーゼ開裂地図及びＤＮＡ配列は出版
されており〔Beppu et al.,J.Biochem.９１：１０８５
−１０８８（１９８２）〕、本明細書にも参考のため図
面として添付している。
−２１８７（１９８２）はプレプロキモシンのためのｃ
ＤＮＡコードのクローニング及びヌクレオチド配列を報
告している。Goff et al,Gene ２７，３５〜４６（１９
８４）は酵母であるサツカロマイセス・セレビシアエ
（Saccharomyces cerevisiae）における子牛プロキモシ
ンの発現を記載している。プレプロキモシンｃＤＮＡの
制限エンドヌクレアーゼ開裂地図及びＤＮＡ配列は出版
されており〔Beppu et al.,J.Biochem.９１：１０８５
−１０８８（１９８２）〕、本明細書にも参考のため図
面として添付している。
哺乳類の成長ホルモン（ヒト上皮生長因子（h-EGF）を
含む）は動物の代謝を改善する効力があるのでかなり重
要である。それらの一般的な使用は、非常に入手源が限
られているため制限されてきた。上記ホルモンを適当に
供給すれば経済上の利益があるので数人の研究者が組換
えＤＮＡ技術をこの問題に適用してきた。
含む）は動物の代謝を改善する効力があるのでかなり重
要である。それらの一般的な使用は、非常に入手源が限
られているため制限されてきた。上記ホルモンを適当に
供給すれば経済上の利益があるので数人の研究者が組換
えＤＮＡ技術をこの問題に適用してきた。
ヒト上皮成長因子（EGF）すなわちウロガストロンは上
皮組織成長の促進剤であるだけでなく胃酸分泌の有効な
阻害剤でもある。ＥＧＦの効力全体については主として
充分な材料がないので研究されていなかつた。
皮組織成長の促進剤であるだけでなく胃酸分泌の有効な
阻害剤でもある。ＥＧＦの効力全体については主として
充分な材料がないので研究されていなかつた。
ウロガストロンの構造遺伝子及びそのポリペプチド同族
体の遺伝子の製造、クローニング及び発現のために組換
えＤＮＡ技術を使用することは国際特許出願No.８３／
０４０３０（１９８３年１１月２４日公開）に記載され
ている。
体の遺伝子の製造、クローニング及び発現のために組換
えＤＮＡ技術を使用することは国際特許出願No.８３／
０４０３０（１９８３年１１月２４日公開）に記載され
ている。
ウシ生長ホルモンｍＲＮＡに相補性のＤＮＡのクローニ
ング、そのヌクレオチド配列及び該配列から予測される
相当するアミノ酸配列がMillerらのヨーロツパ特許出願
第47,600号（１９８３年３月１７日公開）およびJ.Bioc
hem.２５５，７５２１−７５２４（１９８０）、及びWo
ychikらのNucleic Acids Research１０，７１９７−７
２１０（１９８２）に報告されている。英国特許出願第
2,073,245Ａ号（１９８１年１０月１４日公開）及びKes
ketら、Nucleic acids Research９，１９−３０（１９
８１）にはウシ生長ホルモンのクローニング及び大腸菌
（E.coli）ＨＢ１０１の中で融合したベーターラクタマ
ーゼ−ウシ成長ホルモン蛋白質として発現させることを
述べている。
ング、そのヌクレオチド配列及び該配列から予測される
相当するアミノ酸配列がMillerらのヨーロツパ特許出願
第47,600号（１９８３年３月１７日公開）およびJ.Bioc
hem.２５５，７５２１−７５２４（１９８０）、及びWo
ychikらのNucleic Acids Research１０，７１９７−７
２１０（１９８２）に報告されている。英国特許出願第
2,073,245Ａ号（１９８１年１０月１４日公開）及びKes
ketら、Nucleic acids Research９，１９−３０（１９
８１）にはウシ生長ホルモンのクローニング及び大腸菌
（E.coli）ＨＢ１０１の中で融合したベーターラクタマ
ーゼ−ウシ成長ホルモン蛋白質として発現させることを
述べている。
ウシ生長ホルモン遺伝子を発現させる方法、プラスミド
及びそれを使用するためのプラスミド宿主がヨーロツパ
特許出願第67,026号及び第68,646号（各々１９８２年１
２月１５日、１９８３年１月５日に公開）に記載されて
いる。各々の出願には宿主微生物として大腸菌（E.col
i）が開示されている。後者の出願、すなわち米国特許
第4,443,539号（１９８４年４月１７日発行）のヨーロ
ツパ特許出願はサツカロミセス・セレビシアエ（Saccha
romyces cerevisiae）を宿主微生物として開示してい
る。
及びそれを使用するためのプラスミド宿主がヨーロツパ
特許出願第67,026号及び第68,646号（各々１９８２年１
２月１５日、１９８３年１月５日に公開）に記載されて
いる。各々の出願には宿主微生物として大腸菌（E.col
i）が開示されている。後者の出願、すなわち米国特許
第4,443,539号（１９８４年４月１７日発行）のヨーロ
ツパ特許出願はサツカロミセス・セレビシアエ（Saccha
romyces cerevisiae）を宿主微生物として開示してい
る。
Seeburgら、ＤＮＡ，２ ３７−４５（１９８３）はウ
シまたはブタ脳下垂体からのポリ（Ａ）mＲＮＡを使用
して製造されたｃＤＮＡの細菌におけるクローニング及
び成熟動物（ウシまたはブタ）の生長ホルモンの有効な
細菌での産生を達成する発現ベクターの構成を報告して
いる。採用される技術は、Goeddelら、Nature，２８
１，５４４−５４８（１９７９）において大腸菌（E.co
li）においてヒト成長ホルモンの直接発現について記載
された方法と類似のものである。各々の場合、使用され
る細菌の発現ベクターは大腸菌（E.coli）trpプロモー
ターの制御下に使用された。ヨーロツパ特許出願第103,
395及び104,920号（１９８４年３月２１日及び４月４日
公開）にはウシ生長ホルモン様ポリペプチド及びブタ成
長ホルモン様ポリペプチドを各々組換えＤＮＡ技術で生
産したことを記載している。
シまたはブタ脳下垂体からのポリ（Ａ）mＲＮＡを使用
して製造されたｃＤＮＡの細菌におけるクローニング及
び成熟動物（ウシまたはブタ）の生長ホルモンの有効な
細菌での産生を達成する発現ベクターの構成を報告して
いる。採用される技術は、Goeddelら、Nature，２８
１，５４４−５４８（１９７９）において大腸菌（E.co
li）においてヒト成長ホルモンの直接発現について記載
された方法と類似のものである。各々の場合、使用され
る細菌の発現ベクターは大腸菌（E.coli）trpプロモー
ターの制御下に使用された。ヨーロツパ特許出願第103,
395及び104,920号（１９８４年３月２１日及び４月４日
公開）にはウシ生長ホルモン様ポリペプチド及びブタ成
長ホルモン様ポリペプチドを各々組換えＤＮＡ技術で生
産したことを記載している。
ウシ成長ホルモンを酪農用の牛に投与すると乳の量が増
加し、飼料摂取対乳量の比を改善する〔Macklin,J.Dair
y Science 56,575-580(1973)〕。１９８３年８月３日に
公開されたヨーロツパ特許出願第85,036Ａ号は生合成さ
れた（ｒＤＮＡによる）ウシ成長ホルモンおよび／また
はその断片もウシの乳量を増し、ブタや他の畜産用動物
の肉、毛、卵、毛皮の生産を増加することを開示してい
る。
加し、飼料摂取対乳量の比を改善する〔Macklin,J.Dair
y Science 56,575-580(1973)〕。１９８３年８月３日に
公開されたヨーロツパ特許出願第85,036Ａ号は生合成さ
れた（ｒＤＮＡによる）ウシ成長ホルモンおよび／また
はその断片もウシの乳量を増し、ブタや他の畜産用動物
の肉、毛、卵、毛皮の生産を増加することを開示してい
る。
１９８０年４月１６日に公開された英国特許明細書第1,
565,190号は微生物を形質転換できる組換えプラスミド
ベクターであつてそのヌクレオチド配列の中にある動物
種の成長ホルモンをコードしているサブ配列を有するも
のを開示している。米国特許第4,237,224号は外来ＤＮ
Ａを単細胞微生物に導入するためのプラスミドベクター
を記載している。
565,190号は微生物を形質転換できる組換えプラスミド
ベクターであつてそのヌクレオチド配列の中にある動物
種の成長ホルモンをコードしているサブ配列を有するも
のを開示している。米国特許第4,237,224号は外来ＤＮ
Ａを単細胞微生物に導入するためのプラスミドベクター
を記載している。
選択された真核生物のＤＮＡ断片のためのHindIII挿入
部位を有し、該部位がtrpプロモーターのような細菌の
プロモーターに隣接しており、該ＤＮＡ断片の転写及び
翻訳が上記プロモーターによつて制御されるプラスミド
が米国特許第4,349,629号に記載されている。
部位を有し、該部位がtrpプロモーターのような細菌の
プロモーターに隣接しており、該ＤＮＡ断片の転写及び
翻訳が上記プロモーターによつて制御されるプラスミド
が米国特許第4,349,629号に記載されている。
クローン化された遺伝子の発現のレベルは遺伝子複写の
数及び転写と翻訳の効率のような因子の数によつて影響
される。挿入された遺伝子の効率的な転写を行うには強
力なプロモーターを必要とし、効率的な翻訳を行うには
ｍＲＮＡの中の適当なリボゾーム結合部位及びrbsと翻
訳開始コドンとの間の適当な間隔を必要とする。プロモ
ーターは蛋白質をコードしているＤＮＡ（構造遺伝子）
のその部分より先に位置する。リボゾーム結合部位（rb
s）、すなわちリボゾーム確認配列は少くとも３〜９bp
の長さのシン−ダルガルノ（Shi-ne-Dalgarno)(SD)配列
として知られる配列からなると信じられている。蛋白質
のアミノ末端メチオニンをコード化しているＡＵＧより
３〜１１bp上流から始まり、１６Ｓ ＲＮＡの３′−末
端配列に対して相補性である。１つの遺伝子に対する翻
訳開始信号（ＡＵＧ）からプロモーターが分離すると産
生される蛋白質の量に影響する（Guaranteら、上記文
献、および本明細書中で引用の文献）。この文献及び１
９８２年６月１日に発行のPtashneらの米国特許第4,33
2,892号には、発現に際して遺伝子の５′−末端からの
種々の距離に“移動性プロモーター”断片を置く効果を
記載している。
数及び転写と翻訳の効率のような因子の数によつて影響
される。挿入された遺伝子の効率的な転写を行うには強
力なプロモーターを必要とし、効率的な翻訳を行うには
ｍＲＮＡの中の適当なリボゾーム結合部位及びrbsと翻
訳開始コドンとの間の適当な間隔を必要とする。プロモ
ーターは蛋白質をコードしているＤＮＡ（構造遺伝子）
のその部分より先に位置する。リボゾーム結合部位（rb
s）、すなわちリボゾーム確認配列は少くとも３〜９bp
の長さのシン−ダルガルノ（Shi-ne-Dalgarno)(SD)配列
として知られる配列からなると信じられている。蛋白質
のアミノ末端メチオニンをコード化しているＡＵＧより
３〜１１bp上流から始まり、１６Ｓ ＲＮＡの３′−末
端配列に対して相補性である。１つの遺伝子に対する翻
訳開始信号（ＡＵＧ）からプロモーターが分離すると産
生される蛋白質の量に影響する（Guaranteら、上記文
献、および本明細書中で引用の文献）。この文献及び１
９８２年６月１日に発行のPtashneらの米国特許第4,33
2,892号には、発現に際して遺伝子の５′−末端からの
種々の距離に“移動性プロモーター”断片を置く効果を
記載している。
ヌクレオチド配列の明確な変形、特にＳＤ領域と開始コ
ドンの間の変化についての効果に関する他の参考文献は
以下の如くである： Scherer et al.,Nucl.Acids Res.８：３８９５−３９０
７（１９８０）；Shepard et al.,ＤＮＡ １：１２５
−１３１（１９８２）；Windass et al.,Nucl.Acids Re
s.１０：６６３９−６６５７（１９８２）；De Boer et
al.,ＤＮＡ ２：２３１−２３５（１９８３）；Tacon
et al.,Molec.gen.Genet.１７７，４２７−４３８（１
９８０）；およびItoh et al.,ＤＮＡ ３，１５７−１
６５（１９８４）。
ドンの間の変化についての効果に関する他の参考文献は
以下の如くである： Scherer et al.,Nucl.Acids Res.８：３８９５−３９０
７（１９８０）；Shepard et al.,ＤＮＡ １：１２５
−１３１（１９８２）；Windass et al.,Nucl.Acids Re
s.１０：６６３９−６６５７（１９８２）；De Boer et
al.,ＤＮＡ ２：２３１−２３５（１９８３）；Tacon
et al.,Molec.gen.Genet.１７７，４２７−４３８（１
９８０）；およびItoh et al.,ＤＮＡ ３，１５７−１
６５（１９８４）。
問題を解決するための手段 本発明は、高レベル外来遺伝子発現のために一般的に有
用なプロモーターrbs発現要素；外来蛋白質（原核また
は真核）の直接発現のための発現要素を有する発現プラ
スミドを含む組換え大腸菌（E.coli）形質転換体を使用
して外来蛋白質を産生する方法に関する。より詳細に
は、本発明は、プロキモシンのような蛋白質およびウシ
とブタの成長ホルモン及びヒト上皮成長因子のような哺
乳類の成長ホルモンをコード化している外来遺伝子の大
腸菌（E.coli）による高度のレベルの発現のために有用
な発現プラスミドを大腸菌に組込んで外来蛋白質を産生
させる方法に関する。上記プラスミドは、選択できるマ
ーカー；レプリコン、すなわち宿主細胞における自律的
な複写をコントロールする領域からなるＤＮＡ配列；お
よび合成ＤＮＡリンカーによつて上記外来蛋白質ｃＤＮ
Ａ配列（遺伝子）に結合されている大腸菌（E.coli）tr
pプロモーターからなり、長さを変化させることができ
る新規なリボゾーム結合領域からなる。本発明のプラス
ミドの特徴はＡＴＧ開始コドンを含めてその上流方向に
あるリボゾーム結合領域にヌクレオチド配列５′ＴＡＡ
ＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ３′または５′ＴＡ
ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ３′
が存在することである。一好適発現プラスミドはシン−
ダルガルノ配列の直前の蛋白質をコードしている配列と
して同じ読み取り枠内に翻訳停止コドン（ＴＡＡ）をさ
らに有意な特徴として有している。
用なプロモーターrbs発現要素；外来蛋白質（原核また
は真核）の直接発現のための発現要素を有する発現プラ
スミドを含む組換え大腸菌（E.coli）形質転換体を使用
して外来蛋白質を産生する方法に関する。より詳細に
は、本発明は、プロキモシンのような蛋白質およびウシ
とブタの成長ホルモン及びヒト上皮成長因子のような哺
乳類の成長ホルモンをコード化している外来遺伝子の大
腸菌（E.coli）による高度のレベルの発現のために有用
な発現プラスミドを大腸菌に組込んで外来蛋白質を産生
させる方法に関する。上記プラスミドは、選択できるマ
ーカー；レプリコン、すなわち宿主細胞における自律的
な複写をコントロールする領域からなるＤＮＡ配列；お
よび合成ＤＮＡリンカーによつて上記外来蛋白質ｃＤＮ
Ａ配列（遺伝子）に結合されている大腸菌（E.coli）tr
pプロモーターからなり、長さを変化させることができ
る新規なリボゾーム結合領域からなる。本発明のプラス
ミドの特徴はＡＴＧ開始コドンを含めてその上流方向に
あるリボゾーム結合領域にヌクレオチド配列５′ＴＡＡ
ＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ３′または５′ＴＡ
ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ３′
が存在することである。一好適発現プラスミドはシン−
ダルガルノ配列の直前の蛋白質をコードしている配列と
して同じ読み取り枠内に翻訳停止コドン（ＴＡＡ）をさ
らに有意な特徴として有している。
分子生物学の技術の状態では、充分に開発されたレベル
である蛋白質またはポリペプチドを発現すべきハイブリ
ツドプラスミドのインビトロでの形成は、上記ポリペプ
チドをコード化しているｃＤＮＡ配列および該配列の制
限エンドヌクレアーゼ開裂地図の知識から可能である。
しかし、これにもかかわらず、プラスミド内に特定の臨
界的でさえある配置で上記ＤＮＡ配列を適当に微生物に
導入すると、ポリペプチドを有意且つ予期し得ない程高
度に発現させるであろうということを示唆する根拠は当
分野において何ら存在しない。
である蛋白質またはポリペプチドを発現すべきハイブリ
ツドプラスミドのインビトロでの形成は、上記ポリペプ
チドをコード化しているｃＤＮＡ配列および該配列の制
限エンドヌクレアーゼ開裂地図の知識から可能である。
しかし、これにもかかわらず、プラスミド内に特定の臨
界的でさえある配置で上記ＤＮＡ配列を適当に微生物に
導入すると、ポリペプチドを有意且つ予期し得ない程高
度に発現させるであろうということを示唆する根拠は当
分野において何ら存在しない。
ここに記載の組換え微生物は、以前に報告されている微
生物が産生し、初期に組換えＤＮＡ技術によつて経済的
規模で産生したよりも有意に大きな収量で外来蛋白質を
発現する。
生物が産生し、初期に組換えＤＮＡ技術によつて経済的
規模で産生したよりも有意に大きな収量で外来蛋白質を
発現する。
当業者は知つているとおり、組換え微生物は多くの方
法、たとえば形質転換、形質導入、接合、トランスフエ
クシヨンによつて製造によつて製造できる。したがつ
て、“組換え微生物”という用語には、上記いずれの方
法によつて製造されようが外来蛋白質を産生し得る微生
物を含める。別法として、本明細書で使用する組換え微
生物の定義にはその微生物が組換え技術により製造され
た場合外来または外因性配列の外来蛋白質を発現せしめ
ることができる微生物を含める。
法、たとえば形質転換、形質導入、接合、トランスフエ
クシヨンによつて製造によつて製造できる。したがつ
て、“組換え微生物”という用語には、上記いずれの方
法によつて製造されようが外来蛋白質を産生し得る微生
物を含める。別法として、本明細書で使用する組換え微
生物の定義にはその微生物が組換え技術により製造され
た場合外来または外因性配列の外来蛋白質を発現せしめ
ることができる微生物を含める。
転写プロモーター配列より下流に細菌のプラスミドに挿
入した場合大腸菌（E.coli）において効率のよい発現を
行なわせる原核生物または真核生物の蛋白質をコード化
している遺伝子のリボゾーム結合部位について本明細書
で記載したヌクレオチド配列を得ることが重要である。
記載されたリボゾーム結合部位領域はＡＴＧ開始コドン
のすぐ上流の都合の良いEco RI制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位を含み、これによつて、蛋白質翻訳開始コドン
を含むＤＮＡ断片を発現ベクターのＳＤ配列の後に挿入
する方法を提供する。換言すれば、ここで述べる発現プ
ラスミドの遺伝子は原核生物の蛋白質か真核生物の蛋白
質をコード化している遺伝子ならよい。たとえば、ここ
で記載する、リボゾーム結合部位とＡＴＧ開始コドンと
の間のヌクレオチド配列は、プロキモシン（プロレンニ
ン）、ウシ成長ホルモン、ブタ生長ホルモン、ヒト上皮
成長因子（ウロガストロン）のようなｃＤＮＡ配列の高
度の発現を可能にする。これらの蛋白質、すなわちウシ
およびブタ成長ホルモン及びヒト上皮成長因子は一括し
て哺乳類成長因子と称されている。
入した場合大腸菌（E.coli）において効率のよい発現を
行なわせる原核生物または真核生物の蛋白質をコード化
している遺伝子のリボゾーム結合部位について本明細書
で記載したヌクレオチド配列を得ることが重要である。
記載されたリボゾーム結合部位領域はＡＴＧ開始コドン
のすぐ上流の都合の良いEco RI制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位を含み、これによつて、蛋白質翻訳開始コドン
を含むＤＮＡ断片を発現ベクターのＳＤ配列の後に挿入
する方法を提供する。換言すれば、ここで述べる発現プ
ラスミドの遺伝子は原核生物の蛋白質か真核生物の蛋白
質をコード化している遺伝子ならよい。たとえば、ここ
で記載する、リボゾーム結合部位とＡＴＧ開始コドンと
の間のヌクレオチド配列は、プロキモシン（プロレンニ
ン）、ウシ成長ホルモン、ブタ生長ホルモン、ヒト上皮
成長因子（ウロガストロン）のようなｃＤＮＡ配列の高
度の発現を可能にする。これらの蛋白質、すなわちウシ
およびブタ成長ホルモン及びヒト上皮成長因子は一括し
て哺乳類成長因子と称されている。
特定の外来遺伝子を細菌によつて生産するとアミノ末端
にメチオニン残基を有するかあるいは有しないポリペプ
チドを産生できる。したがつて、“プロキモシン”（プ
ロレンニン）なる用語はメチオニンプロキモシン（プロ
レンニン）及びポリキモシン（プロレンニン）を含むも
のとする。同じことは本明細書で述べる他のポリペプチ
ドについてもいえる。さらに、“キモシン”（レンニ
ン）というときは、その既知の対立形質（たとえば、
Ａ、Ｂ、など）も含めるものとする。
にメチオニン残基を有するかあるいは有しないポリペプ
チドを産生できる。したがつて、“プロキモシン”（プ
ロレンニン）なる用語はメチオニンプロキモシン（プロ
レンニン）及びポリキモシン（プロレンニン）を含むも
のとする。同じことは本明細書で述べる他のポリペプチ
ドについてもいえる。さらに、“キモシン”（レンニ
ン）というときは、その既知の対立形質（たとえば、
Ａ、Ｂ、など）も含めるものとする。
本発明は下記例及び添付図面によりさらに詳しく説明さ
れるが本発明の範囲を限定するものではない。
れるが本発明の範囲を限定するものではない。
第１図はプラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４（ｐＰＦ
Ｚ−Ｒ）の構成を示すｐＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４の各々
に共通の制限地図を含む概略図である。図中矢印はtrp
プロモーター配列からプロキモシン（プロレンニン）遺
伝子（太い断片として表わした）へと発現する方向を示
している。合成挿入物は空白の箱状の形で表わした。
Ｚ−Ｒ）の構成を示すｐＰＦＺ−Ｒ２およびＲ４の各々
に共通の制限地図を含む概略図である。図中矢印はtrp
プロモーター配列からプロキモシン（プロレンニン）遺
伝子（太い断片として表わした）へと発現する方向を示
している。合成挿入物は空白の箱状の形で表わした。
第２図はプラスミドptrpL1-R2およびR4の構成のための
手順を示す概略図である。
手順を示す概略図である。
第３図はプラスミドptrpL1-R2-R48及びptrpL1-R4-R48の
構成のための手順を示す概略図である。
構成のための手順を示す概略図である。
第４図はプラスミドpPFZ-R2およびpPFZ-R4の各々につい
てのプロキモシン（プロレンニン）遺伝子のリボゾーム
結合部位と開始コドン（ATG）との間のヌクレオチド配
列と間隔を示す概略図である。これは上記プラスミドが
ヌクレオチド配列において異なる領域のみを示す。
てのプロキモシン（プロレンニン）遺伝子のリボゾーム
結合部位と開始コドン（ATG）との間のヌクレオチド配
列と間隔を示す概略図である。これは上記プラスミドが
ヌクレオチド配列において異なる領域のみを示す。
第５−１及び５−２図は、全長のｂＧＨ遺伝子及び発現
配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略図
である。プラスミドpBGH-102はpBR322のアンピシリン耐
性遺伝子にクローンされたbGH cDNA配列（黒く塗つた箱
形）を含む。ｂＧＨの新しいアミノ末端をコードしてい
る合成ＤＮＡをｂＢＲ３２２（点線の箱形）のEco R1部
位とHindIII部位に挿入した。種々のインビトロでの複
製を行つて完全な修飾されたｂＧＨ遺伝子を担持するプ
ラスミドpBGH-212を構成した。プラスミドpBGH-212はEc
o R1によつて開裂され、trpプロモーター−オペレータ
ー配列の異なる変化したものを有するDNA断片を挿入し
た。矢印は配列解読の５′→３′方向、すなわち転写の
方向を示す。
配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略図
である。プラスミドpBGH-102はpBR322のアンピシリン耐
性遺伝子にクローンされたbGH cDNA配列（黒く塗つた箱
形）を含む。ｂＧＨの新しいアミノ末端をコードしてい
る合成ＤＮＡをｂＢＲ３２２（点線の箱形）のEco R1部
位とHindIII部位に挿入した。種々のインビトロでの複
製を行つて完全な修飾されたｂＧＨ遺伝子を担持するプ
ラスミドpBGH-212を構成した。プラスミドpBGH-212はEc
o R1によつて開裂され、trpプロモーター−オペレータ
ー配列の異なる変化したものを有するDNA断片を挿入し
た。矢印は配列解読の５′→３′方向、すなわち転写の
方向を示す。
第６−１及び６−２図はｂＧＨ産生のための細菌の発現
プラスミドの構成を示す概略図である。プラスミドbBGH
-212-Rはtrpプロモーター配列（第５図参照）によつて
成熟ｂＧＨを完全に直接発現させる遺伝子を担持してい
る。これらのプラスミドはHind IIIによつて開裂され、
PvuIIによつて部分的に切断され、２つの約９２０bp Hi
nd III-Pvu II断片を単離した。ｂＧＨのＣ−末端をコ
ードする合成ＤＮＡ断片がｐＢＲ３２２（空白の箱形）
のEco R1部位およびHind III部位に挿入された。このサ
ブクローンはPvu IIおよびBam H1で開裂され、３６５bp
DNA断片を単離した。Hind IIIとBamH1で開裂後大きいベ
クター断片（３９９５bp）をpBR ３２２から単離し
た。これら２つのプロモーターｂＧＨ遺伝子含有断片
（９２０ｂｐ）を別々に合成ＤＮＡ含有断片（３６５ｂ
ｐ）およびベクター断片（3995bp）と混合した。この混
合物をＴＡリガーゼでつなげて適当な大腸菌（E.coli）
ＨＢ１０１の形質転換に使用された。異なるｂＧＨ発現
プラスミドはbBGH-301およびpBGH-375と称される。矢印
はtrpプロモーター配列からの転写の方向及び配列解読
における５′→３′の方向を示している。
プラスミドの構成を示す概略図である。プラスミドbBGH
-212-Rはtrpプロモーター配列（第５図参照）によつて
成熟ｂＧＨを完全に直接発現させる遺伝子を担持してい
る。これらのプラスミドはHind IIIによつて開裂され、
PvuIIによつて部分的に切断され、２つの約９２０bp Hi
nd III-Pvu II断片を単離した。ｂＧＨのＣ−末端をコ
ードする合成ＤＮＡ断片がｐＢＲ３２２（空白の箱形）
のEco R1部位およびHind III部位に挿入された。このサ
ブクローンはPvu IIおよびBam H1で開裂され、３６５bp
DNA断片を単離した。Hind IIIとBamH1で開裂後大きいベ
クター断片（３９９５bp）をpBR ３２２から単離し
た。これら２つのプロモーターｂＧＨ遺伝子含有断片
（９２０ｂｐ）を別々に合成ＤＮＡ含有断片（３６５ｂ
ｐ）およびベクター断片（3995bp）と混合した。この混
合物をＴＡリガーゼでつなげて適当な大腸菌（E.coli）
ＨＢ１０１の形質転換に使用された。異なるｂＧＨ発現
プラスミドはbBGH-301およびpBGH-375と称される。矢印
はtrpプロモーター配列からの転写の方向及び配列解読
における５′→３′の方向を示している。
第７−１および７−２図はｐＧＨ遺伝子と発現配列の全
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドpGH-24はpBR３２２のアンピシリン耐性
遺伝子の中にクローンされたｐＧＨ ｃＤＮＡ配列（黒
く塗つた箱形）を有する。ｐＧＨの新しいアミノ末端を
コードしている合成ＤＮＡはｐＢＲ３２２（点線の箱
形）のEco RI部位とHind III部位に挿入された。インビ
トロで種々の複製を行い完成した修飾されたｐＧＨ遺伝
子を担持するプラスミドを構成した。このプラスミドは
Eco RIによつて開裂され、いろいろに変化させたtrpプ
ロモーター−オペレーター配列を含むＤＮＡ断片を挿入
した。矢印は配列解読の５′→３′の方向、すなわち転
写の方向を示す。
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドpGH-24はpBR３２２のアンピシリン耐性
遺伝子の中にクローンされたｐＧＨ ｃＤＮＡ配列（黒
く塗つた箱形）を有する。ｐＧＨの新しいアミノ末端を
コードしている合成ＤＮＡはｐＢＲ３２２（点線の箱
形）のEco RI部位とHind III部位に挿入された。インビ
トロで種々の複製を行い完成した修飾されたｐＧＨ遺伝
子を担持するプラスミドを構成した。このプラスミドは
Eco RIによつて開裂され、いろいろに変化させたtrpプ
ロモーター−オペレーター配列を含むＤＮＡ断片を挿入
した。矢印は配列解読の５′→３′の方向、すなわち転
写の方向を示す。
実施例 微生物 本発明において使用されまたは製造された微生物及び組
換え微生物ならびにそれらが入手された寄託機関は下記
のとおりである： 大腸菌（E.coli）Ｃ６００，ＤＲ３４としても公知、Ａ
ＴＣＣ２３７２４ 大腸菌（E.coli）NRRLB-11371、ATCC３３６９４ 大腸菌（E.coli）MM294 ＡＴＣＣ３３６２５ 大腸菌（E.coli）W3110 ＡＴＣＣ２７３２５ pPFZ-R2を有する大腸菌（E.coli）ＨＢ１０１ ＡＴＣ
Ｃ３９５４４ pPFZ-R4を有する大腸菌（E.coli）ＨＢ１０１ ＡＴＣ
Ｃ３９５４３ 当業者は知るとおり、上記宿主の代りにいかなる形質転
換可能な大腸菌（E.coli）Ｋ−１２株も本発明において
使用できる。さらに、プロテアーゼを有しない大腸菌株
は当業者も認めるとおり上記大腸菌株と同等あるいはそ
れより良好な結果をもたらす。
換え微生物ならびにそれらが入手された寄託機関は下記
のとおりである： 大腸菌（E.coli）Ｃ６００，ＤＲ３４としても公知、Ａ
ＴＣＣ２３７２４ 大腸菌（E.coli）NRRLB-11371、ATCC３３６９４ 大腸菌（E.coli）MM294 ＡＴＣＣ３３６２５ 大腸菌（E.coli）W3110 ＡＴＣＣ２７３２５ pPFZ-R2を有する大腸菌（E.coli）ＨＢ１０１ ＡＴＣ
Ｃ３９５４４ pPFZ-R4を有する大腸菌（E.coli）ＨＢ１０１ ＡＴＣ
Ｃ３９５４３ 当業者は知るとおり、上記宿主の代りにいかなる形質転
換可能な大腸菌（E.coli）Ｋ−１２株も本発明において
使用できる。さらに、プロテアーゼを有しない大腸菌株
は当業者も認めるとおり上記大腸菌株と同等あるいはそ
れより良好な結果をもたらす。
上記組換え微生物ＡＴＣＣ３９５４３及び３９５４４は
１９８３年１２月１４日にブタペスト条約の下でアメリ
カ合衆国メリーランド州ロツクビルのアメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨン、すなわち寄託を永久的
に維持し特許出願が特許になつたら一般公衆に分譲する
公認の寄託機関に寄託された。これらの菌株には上記受
託番号が与えられた。これらの寄託物は本願が３７CER1
14および35USC122の下に適格性ありと合衆国特許商標庁
の長官によつて決定されるものとして係属している間本
願の相当する出願またその関連出願が出願された国の外
国特許法により入手できる。寄託された微生物の公衆へ
の分譲に対するすべての制限は特許の許可と同時に不可
逆的に取り除かれる。
１９８３年１２月１４日にブタペスト条約の下でアメリ
カ合衆国メリーランド州ロツクビルのアメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨン、すなわち寄託を永久的
に維持し特許出願が特許になつたら一般公衆に分譲する
公認の寄託機関に寄託された。これらの菌株には上記受
託番号が与えられた。これらの寄託物は本願が３７CER1
14および35USC122の下に適格性ありと合衆国特許商標庁
の長官によつて決定されるものとして係属している間本
願の相当する出願またその関連出願が出願された国の外
国特許法により入手できる。寄託された微生物の公衆へ
の分譲に対するすべての制限は特許の許可と同時に不可
逆的に取り除かれる。
ＲＮＡの製造及びｃＤＮＡのクローニング 地方の畜殺場から動物の脳下垂体を得、そこから総ＲＮ
ＡをUllrichら、Science １９６、１３１３−１３１９
（１９７７）の方法により単離した。ポリアデニル化Ｒ
ＮＡをオリゴ（dT）セルロース上のクロマトグラフイー
により総ＲＮＡから得た。二本鎖ｃＤＮＡをこのＲＮＡ
から製造し、ｃＤＮＡのサイズフラクシヨンをプラスミ
ドｐＢＲ３２２を使用して大腸菌（E.coli）中で標準的
方法及び従来のホモポリマー方法でクローン化した。
（Miller,W.,et al.1980,J.Biochem.,２５５，７５２
１，Goeddel et al.,１９７９；Nature２８１，５４４
−５４８；Seebury et al.,１９８３，ＤＮＡ２，３７
−４５） プラスミドを有する、ｃＤＮＡで形質転換されたコロニ
ーをニトロセルロースフイルター上にレプリカ平板法に
より移植した。形質転換体コロニーを有するフイルター
をGrunsteinおよびHog-nessの方法（１９７５，Proc.Na
tl.Acad.Sci．７２，３９６１−３９６５）によつてハ
イブリダイゼーシヨンのために処理した。公開されたｃ
ＤＮＡ配列から誘導された配列を有する放射性同位元素
標識合成オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して
クローン化ｃＤＮＡを検出した。ハイブリツド化してい
るコロニーを５mlＬＢ中で生育させ、製造されたプラス
ミドＤＮＡおよびクローン化された配列は制限エンドヌ
クレアーゼによる開裂に続いてＤＮＡ断片のゲル中での
電気泳動によつて特性をしらべた。
ＡをUllrichら、Science １９６、１３１３−１３１９
（１９７７）の方法により単離した。ポリアデニル化Ｒ
ＮＡをオリゴ（dT）セルロース上のクロマトグラフイー
により総ＲＮＡから得た。二本鎖ｃＤＮＡをこのＲＮＡ
から製造し、ｃＤＮＡのサイズフラクシヨンをプラスミ
ドｐＢＲ３２２を使用して大腸菌（E.coli）中で標準的
方法及び従来のホモポリマー方法でクローン化した。
（Miller,W.,et al.1980,J.Biochem.,２５５，７５２
１，Goeddel et al.,１９７９；Nature２８１，５４４
−５４８；Seebury et al.,１９８３，ＤＮＡ２，３７
−４５） プラスミドを有する、ｃＤＮＡで形質転換されたコロニ
ーをニトロセルロースフイルター上にレプリカ平板法に
より移植した。形質転換体コロニーを有するフイルター
をGrunsteinおよびHog-nessの方法（１９７５，Proc.Na
tl.Acad.Sci．７２，３９６１−３９６５）によつてハ
イブリダイゼーシヨンのために処理した。公開されたｃ
ＤＮＡ配列から誘導された配列を有する放射性同位元素
標識合成オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して
クローン化ｃＤＮＡを検出した。ハイブリツド化してい
るコロニーを５mlＬＢ中で生育させ、製造されたプラス
ミドＤＮＡおよびクローン化された配列は制限エンドヌ
クレアーゼによる開裂に続いてＤＮＡ断片のゲル中での
電気泳動によつて特性をしらべた。
出発プラスミド プラスミドｐＣＲ１０１はNishimoriら、Gene,１９：３
３７−３４４（１９８２）によつて記載されている。こ
のプラスミドはプロキモシンの全長ｃＤＮＡ、すなわち
アンピシリン耐性のための遺伝子を有し、５６７８ｂｐ
からなる。このプラスミドはHindIIIの開裂部位といく
つかのBamHI部位を有する。
３７−３４４（１９８２）によつて記載されている。こ
のプラスミドはプロキモシンの全長ｃＤＮＡ、すなわち
アンピシリン耐性のための遺伝子を有し、５６７８ｂｐ
からなる。このプラスミドはHindIIIの開裂部位といく
つかのBamHI部位を有する。
プラスミドｐｔｒｐＬＩはEdmanら、Nature２９１；５
０３−５０６（１９８１）に記載され、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２はBolivarら、Gene２：９５−１１３（１９７
７）によつて報告されている。
０３−５０６（１９８１）に記載され、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２はBolivarら、Gene２：９５−１１３（１９７
７）によつて報告されている。
材料 制限エンドヌクレアーゼ（AsuI、BamHI、EcoRI、HindII
I、ClaI、HinfI、KpnI、pstI、PvuII、RsaI、SalI）、
Ｔ４リガーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断
片）をニユーイングランド・バイオラブズ（New Englan
d Biolabs）から購入し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼはＰＬバイオケミカルズ（Biochemicals）より得、細
菌のアルカリ性ホスフアターゼはベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）
（ＢＲＬ）より入手、子牛小腸アルカリ性ホスフアター
ゼはベーリンガー・コープ（Boehringer Corp）より入
手した。すべての酵素は上記製造元が推める条件下に使
用した。放射性化学物質はニユーイングランド・ヌクレ
アー（New England Nuclear）（ＮＥＮ）から購入し
た。蛋白質分子量の標準物はＢＲＬより入手し、精製さ
れた子牛キモシンはシグマ・ケミカル・カンパニー（Si
gma Chemical Company）より入手し、精製ｂＧＨはマイ
ルス（Miles）より入手した。
I、ClaI、HinfI、KpnI、pstI、PvuII、RsaI、SalI）、
Ｔ４リガーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断
片）をニユーイングランド・バイオラブズ（New Englan
d Biolabs）から購入し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼはＰＬバイオケミカルズ（Biochemicals）より得、細
菌のアルカリ性ホスフアターゼはベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）
（ＢＲＬ）より入手、子牛小腸アルカリ性ホスフアター
ゼはベーリンガー・コープ（Boehringer Corp）より入
手した。すべての酵素は上記製造元が推める条件下に使
用した。放射性化学物質はニユーイングランド・ヌクレ
アー（New England Nuclear）（ＮＥＮ）から購入し
た。蛋白質分子量の標準物はＢＲＬより入手し、精製さ
れた子牛キモシンはシグマ・ケミカル・カンパニー（Si
gma Chemical Company）より入手し、精製ｂＧＨはマイ
ルス（Miles）より入手した。
細菌はアンピシリン（２５μｇ／ml）またはテトラサイ
クリン（１０μｇ／ml）を含有するＬブロス（Broth）
中またはＬ寒天プレート上（Miller,J.Experiments in
Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Labratory,Ne
w York,p433,1972）で３７℃で常法どおり生育させた。
大規模にプラスミドを製造するためには、対数期の培養
物をクロラムフエニコール（１７０μｇ／ml）の添加に
よつて増大させた〔Clewell and Helsinki,J.Bacterio
l.１１０：１１３５（１９７２）〕。
クリン（１０μｇ／ml）を含有するＬブロス（Broth）
中またはＬ寒天プレート上（Miller,J.Experiments in
Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Labratory,Ne
w York,p433,1972）で３７℃で常法どおり生育させた。
大規模にプラスミドを製造するためには、対数期の培養
物をクロラムフエニコール（１７０μｇ／ml）の添加に
よつて増大させた〔Clewell and Helsinki,J.Bacterio
l.１１０：１１３５（１９７２）〕。
プラスミドｐＢＧＨ−７は、PstI部位にクローンさせた
ｂＧＨの全長cDNAを含むpBR-322からなり、Miller,W.
ら、Biochem.２５５，７５２１（１９８０）によつて記
載されたようにして製造された。クローン化されたｃＤ
ＮＡは３１ｂｐの５′未翻訳配列、全プレホルモン構造
配列（６５１ｂｐ）、全３′未翻訳領域（１０４ｂ
ｐ）、短いポリ(A)、およびdC-dG尾部を有する約８３０
pbの長さである。プラスミドpGH−２４はそのPstI部位
にクローン化された全長cDNAを含むpBR３２２からな
り、Seeburgら、ＤＮＡ２、３７−４５（１９８３）に
よつて記載された方法と類似の方法で製造された。pGH
−２５プラスミドＤＮＡはデニス・ペレイラ８Dennis P
ereira）によつて構成され提供された。プラスミドpBR
−３２２はすでにBolivarら、Gene２，９５−１１３
（１９７７）によつて報告されている。
ｂＧＨの全長cDNAを含むpBR-322からなり、Miller,W.
ら、Biochem.２５５，７５２１（１９８０）によつて記
載されたようにして製造された。クローン化されたｃＤ
ＮＡは３１ｂｐの５′未翻訳配列、全プレホルモン構造
配列（６５１ｂｐ）、全３′未翻訳領域（１０４ｂ
ｐ）、短いポリ(A)、およびdC-dG尾部を有する約８３０
pbの長さである。プラスミドpGH−２４はそのPstI部位
にクローン化された全長cDNAを含むpBR３２２からな
り、Seeburgら、ＤＮＡ２、３７−４５（１９８３）に
よつて記載された方法と類似の方法で製造された。pGH
−２５プラスミドＤＮＡはデニス・ペレイラ８Dennis P
ereira）によつて構成され提供された。プラスミドpBR
−３２２はすでにBolivarら、Gene２，９５−１１３
（１９７７）によつて報告されている。
オリゴヌクレオチド類の合成 合成オリゴヌクレオチド５′．AGAATTCATGG.３′(I)お
よび５′.CCATGAATTCT.３′(II)をホスフアイト法〔Car
uthers,J.Am.Chem.Soc.１０３，１３８５（１９８
１）〕によつて化学合成し、６Ｍ尿素−２０％ポリアク
リルアミドゲルから精製した。
よび５′.CCATGAATTCT.３′(II)をホスフアイト法〔Car
uthers,J.Am.Chem.Soc.１０３，１３８５（１９８
１）〕によつて化学合成し、６Ｍ尿素−２０％ポリアク
リルアミドゲルから精製した。
１８−bpおよび２２bp−本鎖オリゴマーを本明細書記載
の方法で合成し、本明細書記載の方法で４０−merアダ
プターに形質転換した。二本鎖４０−merは一本鎖１８
−および２２−merを公知方法によりアニーリングし、
結合（ligate）することによつて生成した。
の方法で合成し、本明細書記載の方法で４０−merアダ
プターに形質転換した。二本鎖４０−merは一本鎖１８
−および２２−merを公知方法によりアニーリングし、
結合（ligate）することによつて生成した。
pGH′およびbGHのために使用されたジゴヌクレオチドは
Caruthersら、Tetrahedron Lett.２４，２４５（１９８
３）のホスホラミダイト法により合成され、断片は１１
〜１６塩基の長さの一本鎖オリゴマーから合成した。
Caruthersら、Tetrahedron Lett.２４，２４５（１９８
３）のホスホラミダイト法により合成され、断片は１１
〜１６塩基の長さの一本鎖オリゴマーから合成した。
分子クローニング反応 大腸菌（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ（Kl
enow）断片を使用して二本鎖ＤＮＡの隠された３′末端
の空白を満たす反応は本質的にManiatisら、Molewlar C
loning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labo
ratory p.１１３（１９８２）の方法に依つた。
enow）断片を使用して二本鎖ＤＮＡの隠された３′末端
の空白を満たす反応は本質的にManiatisら、Molewlar C
loning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labo
ratory p.１１３（１９８２）の方法に依つた。
ＡＴＰのガンマホスフエートをＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによつて合成リンカーＤＮＡの５′−ＯＨ末端へ
転移させることは上記Maniatisの文献に示されている。
約２０μｇの二本鎖リンカーＤＮＡを、７０mMトリス
（pH 7.6）、１０mM MgCl2、５mMジチオスレイトール
（DTT）、２０μCi〔ガンマ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（５００
０Ciミリモル-1；ＮＥＮ）を含有する２０μlの反応混
合物中でホスホリル化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（１０単位）を加えて、反応を３７℃で１５分間行
い、１μlの１０mM ATPおよび１０単位のＴ４キナーゼ
を加え、反応をさらに３０分間３７℃で行なつた。キナ
ーゼ処理したリンカーは−２０℃で貯蔵した。
ナーゼによつて合成リンカーＤＮＡの５′−ＯＨ末端へ
転移させることは上記Maniatisの文献に示されている。
約２０μｇの二本鎖リンカーＤＮＡを、７０mMトリス
（pH 7.6）、１０mM MgCl2、５mMジチオスレイトール
（DTT）、２０μCi〔ガンマ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（５００
０Ciミリモル-1；ＮＥＮ）を含有する２０μlの反応混
合物中でホスホリル化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（１０単位）を加えて、反応を３７℃で１５分間行
い、１μlの１０mM ATPおよび１０単位のＴ４キナーゼ
を加え、反応をさらに３０分間３７℃で行なつた。キナ
ーゼ処理したリンカーは−２０℃で貯蔵した。
必要ならば、末端の５′ホスフエートを細菌のアルカリ
性ホスフアターゼ（ＢＡＰ）あるいは子牛腸アルカリ性
ホスフアターゼ（ＣＩＰ）のいずれかにより処理してＤ
ＮＡから除去した。〔Chaconasら、Methods Enzymol.６
５：７５（１９８０）〕。簡単に言えば、ＣＩＰによる
処理においては、プラスミドＤＮＡは適当な制限酵素に
よつて切断を完了させエタノール中に沈殿させた。ＤＮ
ＡのペレツトをＣＩＰ反応緩衝液（0.1Ｍグリシン、１m
M MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH 10.4）中に最終濃度１μｇ
／１０μl緩衝液で再懸濁した。資料を６５℃に１０分
間加熱し、氷上で５分間冷却した。子牛腸アルカリ性ホ
スフアターゼを最終濃度0.5単位／ＤＮＡ １μｇとな
るまで加えた。この混合物を３７℃で３０分間インキユ
ベートし、続いてフエノール−クロロホルムにより抽出
し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた。これらのＤ
ＮＡペレツトを蒸留水に再懸濁し、最終濃度１００μｇ
／mlとした。
性ホスフアターゼ（ＢＡＰ）あるいは子牛腸アルカリ性
ホスフアターゼ（ＣＩＰ）のいずれかにより処理してＤ
ＮＡから除去した。〔Chaconasら、Methods Enzymol.６
５：７５（１９８０）〕。簡単に言えば、ＣＩＰによる
処理においては、プラスミドＤＮＡは適当な制限酵素に
よつて切断を完了させエタノール中に沈殿させた。ＤＮ
ＡのペレツトをＣＩＰ反応緩衝液（0.1Ｍグリシン、１m
M MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH 10.4）中に最終濃度１μｇ
／１０μl緩衝液で再懸濁した。資料を６５℃に１０分
間加熱し、氷上で５分間冷却した。子牛腸アルカリ性ホ
スフアターゼを最終濃度0.5単位／ＤＮＡ １μｇとな
るまで加えた。この混合物を３７℃で３０分間インキユ
ベートし、続いてフエノール−クロロホルムにより抽出
し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた。これらのＤ
ＮＡペレツトを蒸留水に再懸濁し、最終濃度１００μｇ
／mlとした。
ＢＡＰ処理の場合は、プラスミドＤＮＡを選択した制限
エンドヌクレアーゼで開裂し、エタノール中で沈殿させ
た。ＤＮＡペレツトを緩衝液（５０ｍＭ NaCl、１０ｍ
Ｍ MgCl2、１０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＤＴＴ）中に
再懸濁した（最終濃度１μｇ／１０μlの緩衝液）。こ
の反応混合物を６５℃に１０分間加熱し氷上で反応停止
した。細菌のアルカリ性ホスフアターゼを最終濃度５０
単位／ＤＮＡ １μｇまで添加した。この反応混合物を
６５℃で２時間インキユベートしフエノール−クロロホ
ルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノール中に沈殿させ
た。
エンドヌクレアーゼで開裂し、エタノール中で沈殿させ
た。ＤＮＡペレツトを緩衝液（５０ｍＭ NaCl、１０ｍ
Ｍ MgCl2、１０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＤＴＴ）中に
再懸濁した（最終濃度１μｇ／１０μlの緩衝液）。こ
の反応混合物を６５℃に１０分間加熱し氷上で反応停止
した。細菌のアルカリ性ホスフアターゼを最終濃度５０
単位／ＤＮＡ １μｇまで添加した。この反応混合物を
６５℃で２時間インキユベートしフエノール−クロロホ
ルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノール中に沈殿させ
た。
細胞の発現プラスミドの構成は種々のプラスミドからの
ＤＮＡ断片を結合する操作からなる。すべての段階は添
付図面に示されている。一般に、ＤＮＡ断片はゲルから
単離後精製され、２０〜５０μlの６６mMトリス−HCl
（pH 7.6）、５ｍＭ MgCl2、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍ
Ｍ ＤＴＴおよび１μlのＴ４リガーゼ（４００単位）
中で他の断片またはプラスミドＤＮＡに結合した。大腸
菌（E.coli）の能力細胞を標準的方法〔Mandelら、J.Mo
l.Biol.５３，１５４３（１９７０）〕で調製し、上記
配位結合混合物の半分で形質転換した。
ＤＮＡ断片を結合する操作からなる。すべての段階は添
付図面に示されている。一般に、ＤＮＡ断片はゲルから
単離後精製され、２０〜５０μlの６６mMトリス−HCl
（pH 7.6）、５ｍＭ MgCl2、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍ
Ｍ ＤＴＴおよび１μlのＴ４リガーゼ（４００単位）
中で他の断片またはプラスミドＤＮＡに結合した。大腸
菌（E.coli）の能力細胞を標準的方法〔Mandelら、J.Mo
l.Biol.５３，１５４３（１９７０）〕で調製し、上記
配位結合混合物の半分で形質転換した。
ＤＮＡ配列決定 ＤＮＡ配列は化学的減成方法〔Maxam A and Gilbert,W.
Methods Enzymol.６５：４９９−５６０（１９８０）〕
により末端標識ＤＮＡ断片を使用することによつて決定
した。核リボゾーム結合部位領域は各々独立して二本鎖
の両方に数回配列されていた。
Methods Enzymol.６５：４９９−５６０（１９８０）〕
により末端標識ＤＮＡ断片を使用することによつて決定
した。核リボゾーム結合部位領域は各々独立して二本鎖
の両方に数回配列されていた。
プラスミドＤＮＡの製造 プラスミドＤＮＡの大規模な製造は先行文献に記載のア
ルカリ性−ＳＤＳ法〔Birnboimら、Nucleic Acid Res.
７：１５１３（１９７９）〕、続いてエチジウムプロミ
ド−CsCl浮遊密度遠心分離あるいは分画をバイオゲル
（Biogel）Ａ-50（バイオラド（Bio Rad製）カラムを使
用してEl-Gewelyら、Anal,Biochem.１０２：４２３−４
２８（１９８０）の方法により行つた。小標品としての
ＤＮＡをアルカリ製ＳＤＳ法（Birnboimら上記文献）の
迅速にできる変法によつて調製した。
ルカリ性−ＳＤＳ法〔Birnboimら、Nucleic Acid Res.
７：１５１３（１９７９）〕、続いてエチジウムプロミ
ド−CsCl浮遊密度遠心分離あるいは分画をバイオゲル
（Biogel）Ａ-50（バイオラド（Bio Rad製）カラムを使
用してEl-Gewelyら、Anal,Biochem.１０２：４２３−４
２８（１９８０）の方法により行つた。小標品としての
ＤＮＡをアルカリ製ＳＤＳ法（Birnboimら上記文献）の
迅速にできる変法によつて調製した。
ゲル電気泳動 アガロース平板ゲル0.7〜１％をManiatisら、上記文献
ｐ１５０〜１６４の条件下に使用した。ゲルを１５分間
１μｇ／mlのエチジウムプロミドで染色し、ポラロイド
フイルム（タイプ５７、ＡＳＡ３０００）をコダツク・
ラツテン（Kodak Wratten）フイルタとともに使用して
２６６nmの紫外線の照明で写真をとつた。
ｐ１５０〜１６４の条件下に使用した。ゲルを１５分間
１μｇ／mlのエチジウムプロミドで染色し、ポラロイド
フイルム（タイプ５７、ＡＳＡ３０００）をコダツク・
ラツテン（Kodak Wratten）フイルタとともに使用して
２６６nmの紫外線の照明で写真をとつた。
５〜12.5％のアクリルアミドゲル（２０×１５×0.15c
m）を使用してManiatisら、Biochemistry １４：３７
８７−３７９４（１９７５）の方法により小さな（1.5k
b未満）制限断片を同定した。アガロースゲルと同様に
ゲルを染色し、写真をとつた。
m）を使用してManiatisら、Biochemistry １４：３７
８７−３７９４（１９７５）の方法により小さな（1.5k
b未満）制限断片を同定した。アガロースゲルと同様に
ゲルを染色し、写真をとつた。
ＤＮＡ断片を、ゲル切片から0.1ＸＴＢＥ18.9mMトリス
−ホウ酸塩、8.9mMホウ酸、0.2mM ＥＤＴＡ）を含有す
る透析バツグ中で電気的に溶出することによつて精製し
た。
−ホウ酸塩、8.9mMホウ酸、0.2mM ＥＤＴＡ）を含有す
る透析バツグ中で電気的に溶出することによつて精製し
た。
大腸菌（E.coli）中に生成した外来蛋白質の同定 ｐＢＲ３２２または発現プラスミド（ｐＰＦＺ−Ｒ２ま
たはｐＰＦＺ−Ｒ４）を含有する細菌培養物を４μｇ／
mlチアミン、２５μｇ／mlアンピシリンおよび１００μ
ｇ／mlトリプトフアンを含有するＬＢブロスまたはＭ９
ＣＡ培地（Maniatisら、上記文献）中で一晩生育させ
た。これらの培養物をＭ９ＣＡ培地中に１：２５に希釈
し（Maniatisらの上記文献、トリプトフアンなしでtrp
プロモーターの完全導入を行なわせる）、またはＭ９Ｃ
Ａ培地＋１００μ／mlのトリプトフアンに１：２５に希
釈し（trpプロモーターの導入を阻害し）、あるいはＬ
Ｂ培地（ネガチブコントロールとして）に１：２５に希
釈し、振とうフラスコ中で細胞密度Ａ560＝1.0となるま
で生育させた。全細胞蛋白質抽出のために、２００μｌ
の培養物に等しい細胞ペレツトを２％ドデシル硫酸ナト
リウム、１％β−メルカプトエタノール中で溶解させ、
蛋白質を１０容量部の冷アセトン中に沈殿させた。沈殿
させた蛋白質をＳＤＳ試料緩衝液中に再溶解し、アリコ
ツトを１０％または12.5％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル〔Laemmli,Nature ２２７：６８０−６８５（１９
７０）〕上で電気泳動にかけた。標識された蛋白質の製
造のためには発現培養物の１mlアリコツトからの細胞ペ
レツトを１mlのＭ９ＣＡ添加培地（Ｍ９ＣＡ塩、0.2％
グリコース、４μｇ／mlチアミン、２０μｇ／ml標準ア
ミノ酸（メチオニンとトリプトフアンを除く））＋２５
μｇ／mlアンピシリンおよび７５Ci35Sメチオニン（Ｎ
ＥＮ；９７０Ci／ミリモル）中に懸濁した。１時間３７
℃でインキユベートした後、細胞をペレツト化し、２０
０μlの１０ｍＭトリス（pH8.0）、１ｍＭ ＮａＥＤＴ
Ａに再懸濁し、氷上に１０分間置き、最終濃度としてリ
ゾゾームを１mg／mlまで、ＮＰ４０を0.2％まで、NaCl
を0.35Ｍまで添加した。溶解物を１０mM MgCl2に調節
し、氷上で３０分間５０μｇ／mlのＤＮＡ分解酵素（DN
ase）Ｉ（シグマ（Sigma）製）とインキユベートした。
不溶物を緩やかな遠心分離で除き、このペレツトフラク
シヨンをＳＤＳ試料緩衝液中に溶解した。上清試料をウ
サギ抗プロレンニン抗体（Beppu,Gene １９，３３７−
３３４）およびブドウ球菌吸着剤（Pansorbin,Cal Bioc
hem）でKessler,J.Immunology１１７：１４８２−１４
９０の方法により免疫沈殿させた。試料をＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Laemmliの上記文献）し、
−７５℃でコダツク（Kodak）ＸＡＲ−２フイルムとコ
ルネツクス（Cornex）ライトニングプラス（Lightning
Plus）強化スクリーンで螢光写真法を行う前に強化した
（エントライトニング（Enlightning：ＮＥＮ））。
たはｐＰＦＺ−Ｒ４）を含有する細菌培養物を４μｇ／
mlチアミン、２５μｇ／mlアンピシリンおよび１００μ
ｇ／mlトリプトフアンを含有するＬＢブロスまたはＭ９
ＣＡ培地（Maniatisら、上記文献）中で一晩生育させ
た。これらの培養物をＭ９ＣＡ培地中に１：２５に希釈
し（Maniatisらの上記文献、トリプトフアンなしでtrp
プロモーターの完全導入を行なわせる）、またはＭ９Ｃ
Ａ培地＋１００μ／mlのトリプトフアンに１：２５に希
釈し（trpプロモーターの導入を阻害し）、あるいはＬ
Ｂ培地（ネガチブコントロールとして）に１：２５に希
釈し、振とうフラスコ中で細胞密度Ａ560＝1.0となるま
で生育させた。全細胞蛋白質抽出のために、２００μｌ
の培養物に等しい細胞ペレツトを２％ドデシル硫酸ナト
リウム、１％β−メルカプトエタノール中で溶解させ、
蛋白質を１０容量部の冷アセトン中に沈殿させた。沈殿
させた蛋白質をＳＤＳ試料緩衝液中に再溶解し、アリコ
ツトを１０％または12.5％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル〔Laemmli,Nature ２２７：６８０−６８５（１９
７０）〕上で電気泳動にかけた。標識された蛋白質の製
造のためには発現培養物の１mlアリコツトからの細胞ペ
レツトを１mlのＭ９ＣＡ添加培地（Ｍ９ＣＡ塩、0.2％
グリコース、４μｇ／mlチアミン、２０μｇ／ml標準ア
ミノ酸（メチオニンとトリプトフアンを除く））＋２５
μｇ／mlアンピシリンおよび７５Ci35Sメチオニン（Ｎ
ＥＮ；９７０Ci／ミリモル）中に懸濁した。１時間３７
℃でインキユベートした後、細胞をペレツト化し、２０
０μlの１０ｍＭトリス（pH8.0）、１ｍＭ ＮａＥＤＴ
Ａに再懸濁し、氷上に１０分間置き、最終濃度としてリ
ゾゾームを１mg／mlまで、ＮＰ４０を0.2％まで、NaCl
を0.35Ｍまで添加した。溶解物を１０mM MgCl2に調節
し、氷上で３０分間５０μｇ／mlのＤＮＡ分解酵素（DN
ase）Ｉ（シグマ（Sigma）製）とインキユベートした。
不溶物を緩やかな遠心分離で除き、このペレツトフラク
シヨンをＳＤＳ試料緩衝液中に溶解した。上清試料をウ
サギ抗プロレンニン抗体（Beppu,Gene １９，３３７−
３３４）およびブドウ球菌吸着剤（Pansorbin,Cal Bioc
hem）でKessler,J.Immunology１１７：１４８２−１４
９０の方法により免疫沈殿させた。試料をＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Laemmliの上記文献）し、
−７５℃でコダツク（Kodak）ＸＡＲ−２フイルムとコ
ルネツクス（Cornex）ライトニングプラス（Lightning
Plus）強化スクリーンで螢光写真法を行う前に強化した
（エントライトニング（Enlightning：ＮＥＮ））。
発現レベルの定量化 発現培養物によつて産生された外来蛋白質の量の測定は
細菌培養物からの全蛋白質抽出物を含有する蛋白質ゲル
をデンシトメーターによつて走査することにより測定し
た。総細胞蛋白質抽出物のＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルの個々のレーンをベツクマン（Beckman）ＤＵ−８
Ｂデンシトメーターを使用して分析した。乾燥したコー
マシー青染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを各レー
ンにおいて走査して外来蛋白質帯における総細胞蛋白質
のパーセントを測定した。対照培養物（pBR３２２ベク
ター含有）からの総細胞蛋白質の走査図を使用して組換
生成物のサイズに一致するゲルの領域における生来の蛋
白質含量を測定した。対照培養物中の見かけ上のバツク
グラウンドピークを補正後、発現レベルを総細胞蛋白質
のパーセントとして測定した。蛋白質ゲルは５７９nmで
走査した。
細菌培養物からの全蛋白質抽出物を含有する蛋白質ゲル
をデンシトメーターによつて走査することにより測定し
た。総細胞蛋白質抽出物のＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルの個々のレーンをベツクマン（Beckman）ＤＵ−８
Ｂデンシトメーターを使用して分析した。乾燥したコー
マシー青染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを各レー
ンにおいて走査して外来蛋白質帯における総細胞蛋白質
のパーセントを測定した。対照培養物（pBR３２２ベク
ター含有）からの総細胞蛋白質の走査図を使用して組換
生成物のサイズに一致するゲルの領域における生来の蛋
白質含量を測定した。対照培養物中の見かけ上のバツク
グラウンドピークを補正後、発現レベルを総細胞蛋白質
のパーセントとして測定した。蛋白質ゲルは５７９nmで
走査した。
結果 ptrpＬＩ−Ｒ２およびptrpＬＩ−Ｒ４の構成 プラスミドptrpＬＩはHindIII−ClaＩ断片（３６０bp以
下）上に大腸菌（E.coli）trpプロモーター−オペレー
ターの一部およびtrpＬのシン−ダルガルノ（ＳＤ）配
列を含んでいるｐＢＲ３２２誘導体である。〔Edman
ら、Nature２９１：５０３−５０６（１９８１）〕した
がつて、このベクターはtrp調節領域に隣接して特有のC
laＩクローニング部位を有する発現プラスミドである。
挿入されるＤＮＡは、その配列内に、ptrpＬＩに挿入さ
れた場合trpＬリボゾーム結合部位配列に対して適当に
間隔を空けられるであろう遺伝子コード配列の前にＡＴ
Ｇ翻訳開始コドンを含まなければならない。この発現ベ
クターは適当な合成ＤＮＡリンカーを第２図に図示され
たようにClaＩ部位に挿入することによつて修飾され
た。
下）上に大腸菌（E.coli）trpプロモーター−オペレー
ターの一部およびtrpＬのシン−ダルガルノ（ＳＤ）配
列を含んでいるｐＢＲ３２２誘導体である。〔Edman
ら、Nature２９１：５０３−５０６（１９８１）〕した
がつて、このベクターはtrp調節領域に隣接して特有のC
laＩクローニング部位を有する発現プラスミドである。
挿入されるＤＮＡは、その配列内に、ptrpＬＩに挿入さ
れた場合trpＬリボゾーム結合部位配列に対して適当に
間隔を空けられるであろう遺伝子コード配列の前にＡＴ
Ｇ翻訳開始コドンを含まなければならない。この発現ベ
クターは適当な合成ＤＮＡリンカーを第２図に図示され
たようにClaＩ部位に挿入することによつて修飾され
た。
特異的二本鎖合成ＤＮＡリンカーを使用してptrpＬＩの
ClaＩ制限部位の周囲のヌクレオチド含量を変えた。約
１０μｇのptrpＬＩＤＮＡを１６単位の制限エンドヌク
レアーゼClaＩで９０分間３７℃で切断した。ClaＩによ
る開裂によつて生じた接着末端を５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（pH 7.2）、１０ｍＭ MgSO4、0.1ｍＭジチオスレイ
トール、0.2ｍＭ dGTP、0.2ｍＭ dCTPを含有する１０
０μlの反応混合物中で鈍化した。ＤＮＡポリメラーゼ
（３０単位）のクレナウ断片を加え、反応を２０℃で４
５分間行なわせた。フエノールとクロロホルムで抽出
後、示されたホスホリル化されたデオキシオリゴヌクレ
オチドリンカー（６０ｐモル以下）（５′AGAATTCATGG
３′）（３′TCTTAAGTACC５′）を１μｇ以下（0.6ｐモ
ル以下）の挿入ベクター断片といつしよにしてエタノー
ルで沈殿させた。これらの断片を４℃で１８時間３０μ
ｌの６６ｍＭトリス−HCl(pH 7.6）、５０ｍＭ MgC
l2、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭジチオスレイトールおよ
び８００単位のＴＡＤＮＡリガーゼ中で結合させた。こ
の混合物を９０分間３単位のEcoＲＩで９０分間切断し
た。EcoＲＩで開裂したプラスミドＤＮＡを４℃で４時
間１００μｌの６６ｍＭトリス−HCl(pH 7.6）、５ｍＭ
MgCl2、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＤＴＴ、および
４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの中で再び結合させ
た。大腸菌（E.coli）菌株ＨＢ１０１の能力細胞を２０
μｌの上記結合混合物で形質転換した。〔Mandel et a
l.J.Mol.Biol.５３：１５４（１９７０）〕プラスミド
ＤＮＡを上記形質転換体のうちの１２のものから調製
し、EcoRIとHindIIIで切断した。これらのプラスミドの
うち１０のものが所望の３６０−bp以下のEco RI−Hind
III断片を含有していた。ＤＮＡ配列を分析したとこ
ろ、これらのプラスミドのうち１つ（ptrpＬＩ−Ｒ４）
は合成リンカーの所望の配向およびtrpプロモーターと
合成ＤＮＡとの間の接合部に所望の配列を有していた。
ClaＩ制限部位の周囲のヌクレオチド含量を変えた。約
１０μｇのptrpＬＩＤＮＡを１６単位の制限エンドヌク
レアーゼClaＩで９０分間３７℃で切断した。ClaＩによ
る開裂によつて生じた接着末端を５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（pH 7.2）、１０ｍＭ MgSO4、0.1ｍＭジチオスレイ
トール、0.2ｍＭ dGTP、0.2ｍＭ dCTPを含有する１０
０μlの反応混合物中で鈍化した。ＤＮＡポリメラーゼ
（３０単位）のクレナウ断片を加え、反応を２０℃で４
５分間行なわせた。フエノールとクロロホルムで抽出
後、示されたホスホリル化されたデオキシオリゴヌクレ
オチドリンカー（６０ｐモル以下）（５′AGAATTCATGG
３′）（３′TCTTAAGTACC５′）を１μｇ以下（0.6ｐモ
ル以下）の挿入ベクター断片といつしよにしてエタノー
ルで沈殿させた。これらの断片を４℃で１８時間３０μ
ｌの６６ｍＭトリス−HCl(pH 7.6）、５０ｍＭ MgC
l2、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭジチオスレイトールおよ
び８００単位のＴＡＤＮＡリガーゼ中で結合させた。こ
の混合物を９０分間３単位のEcoＲＩで９０分間切断し
た。EcoＲＩで開裂したプラスミドＤＮＡを４℃で４時
間１００μｌの６６ｍＭトリス−HCl(pH 7.6）、５ｍＭ
MgCl2、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＤＴＴ、および
４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの中で再び結合させ
た。大腸菌（E.coli）菌株ＨＢ１０１の能力細胞を２０
μｌの上記結合混合物で形質転換した。〔Mandel et a
l.J.Mol.Biol.５３：１５４（１９７０）〕プラスミド
ＤＮＡを上記形質転換体のうちの１２のものから調製
し、EcoRIとHindIIIで切断した。これらのプラスミドの
うち１０のものが所望の３６０−bp以下のEco RI−Hind
III断片を含有していた。ＤＮＡ配列を分析したとこ
ろ、これらのプラスミドのうち１つ（ptrpＬＩ−Ｒ４）
は合成リンカーの所望の配向およびtrpプロモーターと
合成ＤＮＡとの間の接合部に所望の配列を有していた。
種々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列
を分析している間に、上記プラスミドのうちの１つ（pt
rpLI-R2）がリボゾーム結合部位の領域において６bp削
除されていることが発見された。この削除は、リンカー
配列がすべて存在するのでＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ナウ断片の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性から生じ
たものとされている。この誘導体はptrpＬＩ−Ｒ４に含
まれている生来のtrpＳＤ配列に比較して変化したリボ
ゾーム結合部位を有する。
を分析している間に、上記プラスミドのうちの１つ（pt
rpLI-R2）がリボゾーム結合部位の領域において６bp削
除されていることが発見された。この削除は、リンカー
配列がすべて存在するのでＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ナウ断片の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性から生じ
たものとされている。この誘導体はptrpＬＩ−Ｒ４に含
まれている生来のtrpＳＤ配列に比較して変化したリボ
ゾーム結合部位を有する。
合成プロレンニンアダプターのクローニング プロレンニンのアミノ末端を修飾するのに使用される合
成二本鎖ＤＮＡの配列は下記のとおりである。
成二本鎖ＤＮＡの配列は下記のとおりである。
この断片は２本の一本鎖オリゴマー（１８−bpと２２−
bpの長さ）から組み立てられた。この合成ＤＮＡは蛋白
質合成のための人工的なＡＴＧ開始コドン及びプロレン
ニン配列〔Nishimoriら、J.Biochem.９１：１０８５−
１０８８（１９８２）〕の最終のいくつかのコドンをBa
mHI部位の周囲に変化して繰り返された形でコードして
いる。この合成ＤＮＡは、すでにＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレナウ断片で処理して接着末端に挿入されているpB
R322のEco RI制限部位にサブクローンされた。サブクロ
ーンは放射性同位元素で標識された２２−merをプロー
ブとして使用する組換え微生物のその場でのコロニーハ
イブリダイゼーシヨンによつて同定された。〔Grunstei
n,Mand Hogness,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.７２：３９６
１（１９７５）〕。プラスミドＤＮＡは２０個のハイブ
リダイゼーシヨン陽性コロニーから調製され、Bam HIま
たはEco RIで開裂されて所望のプラスミドを含有するサ
ブクローンを同定した。組換え微生物＃１７からの約１
００μｇのプラスミドＤＮＡをEco RIで開裂して４０bp
断片を12.5％ポリアクリルアミドゲル上で単離した。精
製された４０bp Eco RI断片を、すでにEco RIで開裂し
子牛腸アルカリ性ホスフアターゼで処理して脱ホスホリ
ル化してある２発現プラスミド誘導体（ptrpLI-R2およ
びptrpLI-R4）のEco RI部位に挿入した。各結合物のい
くつかの組換え微生物からのプラスミドＤＮＡを調製
し、Bam HI制限エンドヌクレアーゼで切断した。trp発
現配列より下流に挿入された４０bpプロレンニンアダプ
ターを有するプラスミドを約７００bp離れた２つのBam
HI部位の存在により同定した。この構成は第３図に示さ
れている。これらの発現プラスミドはptrpLI-Ｒ２−Ｂ
４８およびptrpLI-Ｒ４−Ｂ４８と称された。
bpの長さ）から組み立てられた。この合成ＤＮＡは蛋白
質合成のための人工的なＡＴＧ開始コドン及びプロレン
ニン配列〔Nishimoriら、J.Biochem.９１：１０８５−
１０８８（１９８２）〕の最終のいくつかのコドンをBa
mHI部位の周囲に変化して繰り返された形でコードして
いる。この合成ＤＮＡは、すでにＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレナウ断片で処理して接着末端に挿入されているpB
R322のEco RI制限部位にサブクローンされた。サブクロ
ーンは放射性同位元素で標識された２２−merをプロー
ブとして使用する組換え微生物のその場でのコロニーハ
イブリダイゼーシヨンによつて同定された。〔Grunstei
n,Mand Hogness,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.７２：３９６
１（１９７５）〕。プラスミドＤＮＡは２０個のハイブ
リダイゼーシヨン陽性コロニーから調製され、Bam HIま
たはEco RIで開裂されて所望のプラスミドを含有するサ
ブクローンを同定した。組換え微生物＃１７からの約１
００μｇのプラスミドＤＮＡをEco RIで開裂して４０bp
断片を12.5％ポリアクリルアミドゲル上で単離した。精
製された４０bp Eco RI断片を、すでにEco RIで開裂し
子牛腸アルカリ性ホスフアターゼで処理して脱ホスホリ
ル化してある２発現プラスミド誘導体（ptrpLI-R2およ
びptrpLI-R4）のEco RI部位に挿入した。各結合物のい
くつかの組換え微生物からのプラスミドＤＮＡを調製
し、Bam HI制限エンドヌクレアーゼで切断した。trp発
現配列より下流に挿入された４０bpプロレンニンアダプ
ターを有するプラスミドを約７００bp離れた２つのBam
HI部位の存在により同定した。この構成は第３図に示さ
れている。これらの発現プラスミドはptrpLI-Ｒ２−Ｂ
４８およびptrpLI-Ｒ４−Ｂ４８と称された。
これらの組換え微生物は、trpプロモーター−オペレー
ター配列、リボゾーム結合部位、人工ＡＴＧ開始コド
ン、及びプロレンニンの最初の５つのアミノ酸残基をコ
ードしている化学的に得られた配列を含む約３７０bpの
Hind III−Bam HIＤＮＡ断片のための源として使用し
た。プロモーターより下流のヌクレオチド配列は、上述
のプラスミドベクターptrpLIのCla I制限部位に異なる
化学合成されたデオキシオリゴヌクレオチドリンカーが
すでに挿入されていたのでリボゾーム結合部位の領域が
異なつている。リボゾーム結合部位（rbs）配列と、プ
ロレンニン遺伝子のＡＴＧおよび、他の蛋白質について
はコードしている遺伝子との間のヌクレオチドの内容お
よび間隔をＤＮＡ配列分析により下記の如く各発現の構
成について示した： 各リボゾーム結合部位の変化を使用してプロレンニン発
現プラスミドをつくつて、rbsヌクレオチド配列の内容
及び間隔が蛋白質発現レベルに対して有している可能性
ある効果を後でしらべた。
ター配列、リボゾーム結合部位、人工ＡＴＧ開始コド
ン、及びプロレンニンの最初の５つのアミノ酸残基をコ
ードしている化学的に得られた配列を含む約３７０bpの
Hind III−Bam HIＤＮＡ断片のための源として使用し
た。プロモーターより下流のヌクレオチド配列は、上述
のプラスミドベクターptrpLIのCla I制限部位に異なる
化学合成されたデオキシオリゴヌクレオチドリンカーが
すでに挿入されていたのでリボゾーム結合部位の領域が
異なつている。リボゾーム結合部位（rbs）配列と、プ
ロレンニン遺伝子のＡＴＧおよび、他の蛋白質について
はコードしている遺伝子との間のヌクレオチドの内容お
よび間隔をＤＮＡ配列分析により下記の如く各発現の構
成について示した： 各リボゾーム結合部位の変化を使用してプロレンニン発
現プラスミドをつくつて、rbsヌクレオチド配列の内容
及び間隔が蛋白質発現レベルに対して有している可能性
ある効果を後でしらべた。
プロレンニン発現プラスミドの構成 プロレンニン発現プラスミドを構成するために使用さ
れる実験段階は第１図に示されている。第一に、プラス
ミドレプリコン、アンピシリン耐性マーカー、及び所望
のプロレンニンをコードしている配列（アミノ酸コドン
８３から停止コドン（ＴＧＡ）まで）を含む４７７２bp
ベクター断片を、３０μｇのpCR101プラスミドＤＮＡを
Hind IIIおよびKpn I制限エンドヌクレアーゼで切断す
ることにより製造した。この制限反応物を１％アガロー
スゲル上で電気泳動にかけ、両方のＤＮＡ断片を電気溶
出によりゲルから切片から単離した。プロレンニンｃＤ
ＮＡ配列のアミノ末端部分を含む９０６−bp Hind III-
Kpn I断片をらにBam HIで切断し５％ポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動にかけた。２３５−bp Bam HI-Kpn
I断片（アミノ酸コドン６ないし８３をコードしてい
る）をゲルの切片から電気溶出した。
れる実験段階は第１図に示されている。第一に、プラス
ミドレプリコン、アンピシリン耐性マーカー、及び所望
のプロレンニンをコードしている配列（アミノ酸コドン
８３から停止コドン（ＴＧＡ）まで）を含む４７７２bp
ベクター断片を、３０μｇのpCR101プラスミドＤＮＡを
Hind IIIおよびKpn I制限エンドヌクレアーゼで切断す
ることにより製造した。この制限反応物を１％アガロー
スゲル上で電気泳動にかけ、両方のＤＮＡ断片を電気溶
出によりゲルから切片から単離した。プロレンニンｃＤ
ＮＡ配列のアミノ末端部分を含む９０６−bp Hind III-
Kpn I断片をらにBam HIで切断し５％ポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動にかけた。２３５−bp Bam HI-Kpn
I断片（アミノ酸コドン６ないし８３をコードしてい
る）をゲルの切片から電気溶出した。
異なるptrpLI-R-Ｂ４８誘導体からの発現配列を含むHin
dIII-BamHI ＤＮＡ断片をｐＣＲ１０１から２つの制限
断片（４７７２bpおよび２３５bp）と約等モル比で別々
に混合した。この混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼの添加に
より結合させ、各結合混合物の１部をＨＢ１０１能力細
胞に導入するのに使用した。細胞をアンピシリン（２５
μｇ／ml）を含有するＬＢ寒天プレート上で細胞を選択
した各場合についてコロニーが得られた。上述のコロニ
ーからいくつかの薬物耐性コロニーを５mlのＬＢ培養物
に採取して、プラスミドＤＮＡを制限酵素によつて分析
した。各場合について、ほとんどの組換え微生物はtrp
プロモーター−rbs配列に隣接して組換えられた完全な
プロレンニン遺伝子を含んでいることがわかつた。
dIII-BamHI ＤＮＡ断片をｐＣＲ１０１から２つの制限
断片（４７７２bpおよび２３５bp）と約等モル比で別々
に混合した。この混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼの添加に
より結合させ、各結合混合物の１部をＨＢ１０１能力細
胞に導入するのに使用した。細胞をアンピシリン（２５
μｇ／ml）を含有するＬＢ寒天プレート上で細胞を選択
した各場合についてコロニーが得られた。上述のコロニ
ーからいくつかの薬物耐性コロニーを５mlのＬＢ培養物
に採取して、プラスミドＤＮＡを制限酵素によつて分析
した。各場合について、ほとんどの組換え微生物はtrp
プロモーター−rbs配列に隣接して組換えられた完全な
プロレンニン遺伝子を含んでいることがわかつた。
これらの発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで分
析することにより、プロレンニンの直接的発現に適合し
た全プロレンニンコード化配列を含んでいることがわか
つた。上記プロレンニン遺伝子、インビトロ接合領域お
よびtrpプロモーター−オペレーターのほとんどをMaxam
およびGilbertの上記文献の化学的減成方法によつてＤ
ＮＡ配列を分析したとろ、上記人工の開始コドンおよび
プロキモシンをコードしている配列が大腸菌（E.coli）
trpプロモーター−オペレーターの直後に位置し、ヌク
レオチドレベルで２つの発現プラスミドの別々の特性を
確立する役割をしていることが確認された。ここで構成
されたこれらの２つのプロレンニンプラスミドはｐＰＦ
Ｚ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ４と称される。さらに、発
現プラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ４にお
いては、trpリーダーペプチドの大腸菌リボゾーム結合
部位の各々５および１１ヌクレオチド後にＡＴＧ開始コ
ドンが存在している。
析することにより、プロレンニンの直接的発現に適合し
た全プロレンニンコード化配列を含んでいることがわか
つた。上記プロレンニン遺伝子、インビトロ接合領域お
よびtrpプロモーター−オペレーターのほとんどをMaxam
およびGilbertの上記文献の化学的減成方法によつてＤ
ＮＡ配列を分析したとろ、上記人工の開始コドンおよび
プロキモシンをコードしている配列が大腸菌（E.coli）
trpプロモーター−オペレーターの直後に位置し、ヌク
レオチドレベルで２つの発現プラスミドの別々の特性を
確立する役割をしていることが確認された。ここで構成
されたこれらの２つのプロレンニンプラスミドはｐＰＦ
Ｚ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ４と称される。さらに、発
現プラスミドｐＰＦＺ−Ｒ２およびｐＰＦＺ−Ｒ４にお
いては、trpリーダーペプチドの大腸菌リボゾーム結合
部位の各々５および１１ヌクレオチド後にＡＴＧ開始コ
ドンが存在している。
これらの発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳すると３６
６個のアミノ酸で構成されたプロレンニン蛋白質を予測
する。そのようなポリペプチドの測定された分子量は約
41,000である。発現プラスミドを有する大腸菌をトリプ
トフアンを欠く最小限の培地中で生育させると、これら
の細胞はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
いて成熟キモシン（約36,000ダルトン）よりわずかに大
きいところに位置する蛋白質を産生する〔Laemmli,U.K.
Nature ２２７：６８０（１９７０）〕。そのような蛋
白質は同一条件下に生育させたベクタープラスミドpBR3
22を含む大腸菌によつては産生されない。トリプトフア
ン（１００μｇ／ml）を欠くＭ９ＣＡ培地中で生育され
た同一の発現組換え体によつてはプロレンニン蛋白質は
ほとんど産生されず、このことは推定されるプロキモシ
ン蛋白質の大腸菌による産生は意図されたようにtrpプ
ロモーター−オペレーターの制御下にあることを示す。
６個のアミノ酸で構成されたプロレンニン蛋白質を予測
する。そのようなポリペプチドの測定された分子量は約
41,000である。発現プラスミドを有する大腸菌をトリプ
トフアンを欠く最小限の培地中で生育させると、これら
の細胞はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
いて成熟キモシン（約36,000ダルトン）よりわずかに大
きいところに位置する蛋白質を産生する〔Laemmli,U.K.
Nature ２２７：６８０（１９７０）〕。そのような蛋
白質は同一条件下に生育させたベクタープラスミドpBR3
22を含む大腸菌によつては産生されない。トリプトフア
ン（１００μｇ／ml）を欠くＭ９ＣＡ培地中で生育され
た同一の発現組換え体によつてはプロレンニン蛋白質は
ほとんど産生されず、このことは推定されるプロキモシ
ン蛋白質の大腸菌による産生は意図されたようにtrpプ
ロモーター−オペレーターの制御下にあることを示す。
発現培養物によるプロレンニン合成の評価 プロレンニン発現プラスミドpPFZ-R2およびpPFZ-R4を有
する大腸菌形質転換体はtrpプロモーターの誘導のため
にトリプトフアンを欠くＭ９ＣＡ培地中で生育させた。
細胞を振とうフラスコ中で５５０nmにおける光学密度1.
0となるまで生育させた。これらの培養物からの細胞ペ
レツトを２％ＳＤＳ、１％ベータ−メルカプトエタノー
ル中で分解させて、蛋白質をアセトンで沈殿させた。沈
殿した蛋白質をＳＤＳ試料緩衝液中で再溶解し、アリコ
ツトを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動させた〔Laemm-li,Nature ２２７：６８０（１９
７０）〕。プロレンニンレベルはコーマシー青で染色し
たゲルを５７９nmでデンシトメーターによつてゲルを走
査することによつて測定した。
する大腸菌形質転換体はtrpプロモーターの誘導のため
にトリプトフアンを欠くＭ９ＣＡ培地中で生育させた。
細胞を振とうフラスコ中で５５０nmにおける光学密度1.
0となるまで生育させた。これらの培養物からの細胞ペ
レツトを２％ＳＤＳ、１％ベータ−メルカプトエタノー
ル中で分解させて、蛋白質をアセトンで沈殿させた。沈
殿した蛋白質をＳＤＳ試料緩衝液中で再溶解し、アリコ
ツトを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動させた〔Laemm-li,Nature ２２７：６８０（１９
７０）〕。プロレンニンレベルはコーマシー青で染色し
たゲルを５７９nmでデンシトメーターによつてゲルを走
査することによつて測定した。
プロキモシン発現プラスミドを含む大腸菌の菌体中に屈
折性の包摂物体が存在することが位相差顕微鏡によつて
観察された。プラスミドベクターpBR322を含む対照菌体
を同一の条件下に生育せしめても何らそのような屈折性
包摂物体は現われない。同様の観察はインシユリンやチ
モシンのような外来遺伝子の産物を産生する遺伝子操作
された微生物に関して報告されている〔Carrier et a
l.,Trends in BioTechnology １：１０９（１９８
３）〕。屈折性物体は発現された外来蛋白質がたまつた
ものであると考えられる。
折性の包摂物体が存在することが位相差顕微鏡によつて
観察された。プラスミドベクターpBR322を含む対照菌体
を同一の条件下に生育せしめても何らそのような屈折性
包摂物体は現われない。同様の観察はインシユリンやチ
モシンのような外来遺伝子の産物を産生する遺伝子操作
された微生物に関して報告されている〔Carrier et a
l.,Trends in BioTechnology １：１０９（１９８
３）〕。屈折性物体は発現された外来蛋白質がたまつた
ものであると考えられる。
屈折性包摂物の存在は高レベルでプロレンニンが産生さ
れたことと直接相関関係があるものと見られる。
れたことと直接相関関係があるものと見られる。
上記の細菌によつて合成されたプロキモシンはプロレン
ニン抗体と特異的に反応する。
ニン抗体と特異的に反応する。
同一の振とうフラスコでの生育条件下に、プラスミドpP
FZ-42およびpPFZ-R4を有する大腸菌（E.coli）HB101の
組換体の生育を評価したところ、プラスミドpPFZ-R2は
プロレンニンを１０〜１５％のレベル範囲で再現性を以
つて産生し、pPFZ-R4はプロレンニンを５〜７％のレベ
ル範囲で産生した： ヌクレオチドの組成に関してこれら２つのプロレンニン
発現構造物（pPFZ-R2およびpPFZ-R4）の間の相違点はプ
ロレンニン遺伝子のリボゾーム結合部位と開始コドンの
周囲の配列のみである。異なるプラスミドを含有する培
養物の間にはプロレンニン発現のレベルに有意の差もあ
る。プロレンニン発現において観察される相違は、リボ
ゾーム結合部位の周囲の一次ＤＮＡ配列の差異に帰因す
るといえる。ShineおよびDalgarnoによつて最初に注目
されたように（１９７４，ＰＮＡＳ７１：１３４２−１
３４２）、１６ＳリボゾームＲＮＡの３′−末端配列に
対して相補性の開始コドンより約１０ヌクレオチド上流
を中心とするプリンに富んだ配列がある。ほとんどの証
拠は大腸菌のリボゾームによる蛋白質合成開始部位の選
択におけるｒＲＮＡ塩基対形成に対するｍＲＮＡの役割
を証明している。多くの細菌およびフアージのmRNAから
のリボゾーム結合部位の配列がしらべられ、合致するシ
ン−ダルガルノ配列はTAAGGAGGTであることがわかつ
た。これらの３つのパラメーターはシン−ダルガルノ相
互作用：１）相補性の長さ；２）シン−ダルガルノ配列
と開始コドンとの間の距離；および３）シン−ダルガル
ノ配列が二次構造によつて遮へいされる程度に影響を与
える。
FZ-42およびpPFZ-R4を有する大腸菌（E.coli）HB101の
組換体の生育を評価したところ、プラスミドpPFZ-R2は
プロレンニンを１０〜１５％のレベル範囲で再現性を以
つて産生し、pPFZ-R4はプロレンニンを５〜７％のレベ
ル範囲で産生した： ヌクレオチドの組成に関してこれら２つのプロレンニン
発現構造物（pPFZ-R2およびpPFZ-R4）の間の相違点はプ
ロレンニン遺伝子のリボゾーム結合部位と開始コドンの
周囲の配列のみである。異なるプラスミドを含有する培
養物の間にはプロレンニン発現のレベルに有意の差もあ
る。プロレンニン発現において観察される相違は、リボ
ゾーム結合部位の周囲の一次ＤＮＡ配列の差異に帰因す
るといえる。ShineおよびDalgarnoによつて最初に注目
されたように（１９７４，ＰＮＡＳ７１：１３４２−１
３４２）、１６ＳリボゾームＲＮＡの３′−末端配列に
対して相補性の開始コドンより約１０ヌクレオチド上流
を中心とするプリンに富んだ配列がある。ほとんどの証
拠は大腸菌のリボゾームによる蛋白質合成開始部位の選
択におけるｒＲＮＡ塩基対形成に対するｍＲＮＡの役割
を証明している。多くの細菌およびフアージのmRNAから
のリボゾーム結合部位の配列がしらべられ、合致するシ
ン−ダルガルノ配列はTAAGGAGGTであることがわかつ
た。これらの３つのパラメーターはシン−ダルガルノ相
互作用：１）相補性の長さ；２）シン−ダルガルノ配列
と開始コドンとの間の距離；および３）シン−ダルガル
ノ配列が二次構造によつて遮へいされる程度に影響を与
える。
上記２つの発現プラスミドの各々のＳＤ配列の周囲の部
分をしらべるとpPFZ-R2における相補性の長さは６つの
隣接するヌクレオチドであり、他は３つの隣接するヌク
レオチドを有するのみであることがわかる： 又、リボゾーム結合部位と開始コドンとの間の間隔はpP
FZ−Ｒ２において５つのヌクレオチドであり、これは７
つのヌクレオチドが介在する天然のtrpＬ遺伝子開始領
域の間隔に非常に近似している。一方pPFZ−Ｒ４はリボ
ゾーム結合部位と開始コドンとの間に１１個のヌクレオ
チドを有している。pPFZ−Ｒ２に見られる効果的にリボ
ゾーム結合部位のもう１つの重要な特徴は、シン−ダル
ガルノ配列の直前のプロレンニンコード化配列と同じ読
み取り枠における翻訳停止コドン（ＴＡＡ）である。pP
FZ−Ｒ２ＤＮＡ配列のこれらすべての特徴はその高度に
効果的なプロレンニン発現においてある役割を演じてい
る。
分をしらべるとpPFZ-R2における相補性の長さは６つの
隣接するヌクレオチドであり、他は３つの隣接するヌク
レオチドを有するのみであることがわかる： 又、リボゾーム結合部位と開始コドンとの間の間隔はpP
FZ−Ｒ２において５つのヌクレオチドであり、これは７
つのヌクレオチドが介在する天然のtrpＬ遺伝子開始領
域の間隔に非常に近似している。一方pPFZ−Ｒ４はリボ
ゾーム結合部位と開始コドンとの間に１１個のヌクレオ
チドを有している。pPFZ−Ｒ２に見られる効果的にリボ
ゾーム結合部位のもう１つの重要な特徴は、シン−ダル
ガルノ配列の直前のプロレンニンコード化配列と同じ読
み取り枠における翻訳停止コドン（ＴＡＡ）である。pP
FZ−Ｒ２ＤＮＡ配列のこれらすべての特徴はその高度に
効果的なプロレンニン発現においてある役割を演じてい
る。
もちろん遺伝学的コードが退化すると、上記配列によつ
てコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変えることなし
に特定のヌクレオチド配列の組成をある程度変化させ
る。このようにして、２つ以上の異なる塩基配列（同意
義のコドン）を、それによつて特定化されるアミノ酸の
同一性を変化させることなく特定のヌクレオチド配列に
おいて置換することができる。さらに、コドンを除去
し、あるいは１つ以上のコドンを退化しているコドン以
外のコドンで置換して構造的に修飾されたポリペプチド
であるが修飾されていないＤＮＡ分子によつて生成され
るポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有す
るものを産生することは可能である。たとえ上記ＤＮＡ
分子の相異が上記遺伝学的コードの退化に無関係だとし
ても、上記ポリペプチドを生産する２つのＤＮＡ分子と
して見た場合、上記２つのポリペプチド類は機能的に均
等である。
てコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変えることなし
に特定のヌクレオチド配列の組成をある程度変化させ
る。このようにして、２つ以上の異なる塩基配列（同意
義のコドン）を、それによつて特定化されるアミノ酸の
同一性を変化させることなく特定のヌクレオチド配列に
おいて置換することができる。さらに、コドンを除去
し、あるいは１つ以上のコドンを退化しているコドン以
外のコドンで置換して構造的に修飾されたポリペプチド
であるが修飾されていないＤＮＡ分子によつて生成され
るポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有す
るものを産生することは可能である。たとえ上記ＤＮＡ
分子の相異が上記遺伝学的コードの退化に無関係だとし
ても、上記ポリペプチドを生産する２つのＤＮＡ分子と
して見た場合、上記２つのポリペプチド類は機能的に均
等である。
＃４アミノ酸、すなわちスレオニンのコドンはＡＣＣの
代りにＡＣＴである。遺伝学的コードの過剰によつて、
このコードはこの位置のアミノ酸を変化しない。この工
程では、上記ホルモンのＮ−末端部分をコードしている
部分が合成的につくられているハイブリツド遺伝子の構
成物を使用するので、合成ＤＮＡによつてプロレンニン
のその部分のための新しいコード化配列の設計を行うこ
とができる。プロレンニンのアミノ酸配列は実際には遺
伝学的コードの退化によつて維持されるので、これらの
種類の配列の変化は無意味であつて、この遺伝子は天然
で生産されるものと均等のポリペプチド（Ｎ末端metを
除く）を生成する。
代りにＡＣＴである。遺伝学的コードの過剰によつて、
このコードはこの位置のアミノ酸を変化しない。この工
程では、上記ホルモンのＮ−末端部分をコードしている
部分が合成的につくられているハイブリツド遺伝子の構
成物を使用するので、合成ＤＮＡによつてプロレンニン
のその部分のための新しいコード化配列の設計を行うこ
とができる。プロレンニンのアミノ酸配列は実際には遺
伝学的コードの退化によつて維持されるので、これらの
種類の配列の変化は無意味であつて、この遺伝子は天然
で生産されるものと均等のポリペプチド（Ｎ末端metを
除く）を生成する。
本発明の細菌（E.coli）形質転換体によつて発現された
メチオニンプロレンニンの単離、そのレニンへの転化お
よび該レニンの牛乳凝固活性は英国特許出願2,100,737
ＡおよびEmtageら、Proc.Natl.Acad.Sci.８０：３６７
１−３６７５（１９８３）に記載の方法によつて示され
た。
メチオニンプロレンニンの単離、そのレニンへの転化お
よび該レニンの牛乳凝固活性は英国特許出願2,100,737
ＡおよびEmtageら、Proc.Natl.Acad.Sci.８０：３６７
１−３６７５（１９８３）に記載の方法によつて示され
た。
大腸菌trpプロモーター−オペレーター断片ＡＴＧ開始
コドン、Ｒ２またはＲ４からなるリボゾーム結合部位、
およびウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモンまたはヒト
上皮成長因子をコード化しているｃＤＮＡ遺伝子配列を
有するプラスミドも構成され、大腸菌に導入されると、
上述の各外来蛋白質を高度に効率よく発現する。ＡＴＧ
開始コドン迄のベクター、プロモーターおよびリボゾー
ム結合部位のヌクレオチド配列は本質的にプロレンニン
発現プラスミドについて上述したものと同一である。こ
れらの種々の構成物により産生される外来蛋白質の発現
レベルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
い、続いてデンシトメーターで走査することによつて測
定された。これらの培養物によつて得られた発現の相対
的レベルはプロレンニンの発現について観察されるもの
と類似していた。すなわち、リボゾーム結合部位のＲ２
翻訳を含む動物の成長ホルモン発現プラスミドの発現レ
ベルはＲ４翻訳の発現レベルの約４〜５倍である。最終
的には、大腸菌細胞における発現レベルは全細胞蛋白質
の約２５〜３０％であつた。
コドン、Ｒ２またはＲ４からなるリボゾーム結合部位、
およびウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモンまたはヒト
上皮成長因子をコード化しているｃＤＮＡ遺伝子配列を
有するプラスミドも構成され、大腸菌に導入されると、
上述の各外来蛋白質を高度に効率よく発現する。ＡＴＧ
開始コドン迄のベクター、プロモーターおよびリボゾー
ム結合部位のヌクレオチド配列は本質的にプロレンニン
発現プラスミドについて上述したものと同一である。こ
れらの種々の構成物により産生される外来蛋白質の発現
レベルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
い、続いてデンシトメーターで走査することによつて測
定された。これらの培養物によつて得られた発現の相対
的レベルはプロレンニンの発現について観察されるもの
と類似していた。すなわち、リボゾーム結合部位のＲ２
翻訳を含む動物の成長ホルモン発現プラスミドの発現レ
ベルはＲ４翻訳の発現レベルの約４〜５倍である。最終
的には、大腸菌細胞における発現レベルは全細胞蛋白質
の約２５〜３０％であつた。
ｂＧＨおよびｐＧＨ遺伝子の発現を達成させるのに使用
される方法は動物の成長ホルモンの発現についてP.Seeb
urgら（１９８３、ＤＮＡ２１３７−４５）によつて報
告されている方法と本質的に同じである。この方法によ
りクローンされた合成ＤＮＡとクローンされたｃＤＮＡ
配列からなる混成遺伝子の構成を確認した。この構成設
計により、成熟ホルモンの最初のアミノ酸についての翻
訳開始コドンを導入することにより信号配列のないｂＧ
ＨおよびｐＧＨを大腸菌において直接発現させることが
できた。合成ＤＮＡの使用によつてｂＧＨおよびｐＧＨ
遺伝子のアミノ末端領域のための新しいコード化配列を
設計することもできた。成長ホルモン遺伝子の合成領域
によつてコード化されているアミノ酸配列は実際には遺
伝学的コードの過剰によつて維持された。
される方法は動物の成長ホルモンの発現についてP.Seeb
urgら（１９８３、ＤＮＡ２１３７−４５）によつて報
告されている方法と本質的に同じである。この方法によ
りクローンされた合成ＤＮＡとクローンされたｃＤＮＡ
配列からなる混成遺伝子の構成を確認した。この構成設
計により、成熟ホルモンの最初のアミノ酸についての翻
訳開始コドンを導入することにより信号配列のないｂＧ
ＨおよびｐＧＨを大腸菌において直接発現させることが
できた。合成ＤＮＡの使用によつてｂＧＨおよびｐＧＨ
遺伝子のアミノ末端領域のための新しいコード化配列を
設計することもできた。成長ホルモン遺伝子の合成領域
によつてコード化されているアミノ酸配列は実際には遺
伝学的コードの過剰によつて維持された。
bGH cDNAを有するプラスミドをMillerら、Ｊ．Biochem.
７５２１（１９８０）によつて報告されたようにして得
られｐＢＧＨ−１０２と称された。これはMillerらのプ
ラスミドＢＰ３４８と均等である。bGHmRNAのヌクレオ
チド配列とその相当するアミノ酸配列（該ヌクレオチド
配列により予測される）はすでに公開されている（Mill
er,Wら、上記文献）。トリプトフアンプロモーター−オ
ペレーターおよびリボゾーム結合部位配列を有する制限
断片をptrpＬ１−Ｒ２および−Ｒ４から得た。成長ホル
モン遺伝子のアミノおよびカルボキシ末端を修飾するの
に使用される合成二本鎖ＤＮＡの配列はSeeburgら（１
９８３、ＤＮＡ２；３７−４５）による報告から取り出
した。ホスホラミダイト化学（Caruthersら）を使用し
て上述の如くオリゴヌクレオチドを合成し、断片を一本
鎖オリゴマー（１１〜１６塩基）から組立てた。Ｎ−末
端合成ＤＮＡは蛋白質合成のための人工ＡＴＧ開始コド
ンおよびｂＧＨの最初の２３個のアミノ酸のコドンをコ
ード化している。pBR322ＤＮＡへの挿入を促進するため
に、この合成断片は、制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩ
とHindIIIによつて生じた接着末端に連続的に一致する
５′末端上に４塩基一本鎖接着末端をも有していた。所
望の配位結合生成物を５％ポリアクリルアミドゲルから
約８０ｂｐの帯状物として単離した。次いで精製された
ＤＮＡを、すでに制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩおよ
びHindIIIで切断されたpBR322ＤＮＡと配位結合して大
腸菌能力細胞の中に形質転換した。クローンされた合成
ＤＮＡを化学減成方法（MaxamおよびGilbert,１９８
０、Methods Enzymol ６５；４９９）を使用してＤＮ
Ａ配列を分析して修飾されたｂＧＨ配列の完全な配列を
確認した。
７５２１（１９８０）によつて報告されたようにして得
られｐＢＧＨ−１０２と称された。これはMillerらのプ
ラスミドＢＰ３４８と均等である。bGHmRNAのヌクレオ
チド配列とその相当するアミノ酸配列（該ヌクレオチド
配列により予測される）はすでに公開されている（Mill
er,Wら、上記文献）。トリプトフアンプロモーター−オ
ペレーターおよびリボゾーム結合部位配列を有する制限
断片をptrpＬ１−Ｒ２および−Ｒ４から得た。成長ホル
モン遺伝子のアミノおよびカルボキシ末端を修飾するの
に使用される合成二本鎖ＤＮＡの配列はSeeburgら（１
９８３、ＤＮＡ２；３７−４５）による報告から取り出
した。ホスホラミダイト化学（Caruthersら）を使用し
て上述の如くオリゴヌクレオチドを合成し、断片を一本
鎖オリゴマー（１１〜１６塩基）から組立てた。Ｎ−末
端合成ＤＮＡは蛋白質合成のための人工ＡＴＧ開始コド
ンおよびｂＧＨの最初の２３個のアミノ酸のコドンをコ
ード化している。pBR322ＤＮＡへの挿入を促進するため
に、この合成断片は、制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩ
とHindIIIによつて生じた接着末端に連続的に一致する
５′末端上に４塩基一本鎖接着末端をも有していた。所
望の配位結合生成物を５％ポリアクリルアミドゲルから
約８０ｂｐの帯状物として単離した。次いで精製された
ＤＮＡを、すでに制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩおよ
びHindIIIで切断されたpBR322ＤＮＡと配位結合して大
腸菌能力細胞の中に形質転換した。クローンされた合成
ＤＮＡを化学減成方法（MaxamおよびGilbert,１９８
０、Methods Enzymol ６５；４９９）を使用してＤＮ
Ａ配列を分析して修飾されたｂＧＨ配列の完全な配列を
確認した。
Seeburgらによつて記載されたプラスミドに類似の発現
ベクターをｂＧＨとｐＧＨの両者について構成して、リ
ボゾーム結合部位を変えた場合のプロレンニン以外の哺
乳類の遺伝子の発現を比較した。ｂＧＨ発現プラスミド
を構成するのに使用される実験工程は第５図と第６図に
示した。
ベクターをｂＧＨとｐＧＨの両者について構成して、リ
ボゾーム結合部位を変えた場合のプロレンニン以外の哺
乳類の遺伝子の発現を比較した。ｂＧＨ発現プラスミド
を構成するのに使用される実験工程は第５図と第６図に
示した。
まず、ｃＤＮＡクローンpBGH−１０２からの領域、すな
わちアミノ酸２３〜８６をコード化している配列を５％
ポリアクリルアミドゲル上で単離し、ＡＴＧ開始コドン
とｂＧＨの最初の２２個のアミノ酸のための配列をコー
ド化しているpBR322サブクローンが単離されたクローン
化合成７５bpEcoＲＩ−Pvu II断片に配位結合した。こ
の配位結合混合物を制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩお
よびPst Ｉで開裂し、２７０ｂｐ断片を５％ポリアク
リルアミドゲルから単離し、適当に開裂されたpBR322Ｄ
ＮＡに挿入した。これらの２つの部位を使用して、修飾
されたｂＧＨ遺伝子配列のEcoＲＩ−PstＩＤＮＡ断片を
pBR322プラスミドに挿入して挿入の単一の配向のみを可
能にした。この結合において得られた形質転換体から得
られたプラスミドＤＮＡをEcoＲＩとPstＩで開裂して２
７０bp ｂＧＨ遺伝子断片のベクターへの挿入を証明し
た。次に、ｂＧＨアミノ酸９１−１９１のコード化配列
（およびｂＧＨｃＤＮＡの３′未翻訳領域）を有するbB
GH−１０２からの４４０bpPstＩＤＮＡ断片をこのプラ
スミドＤＮＡのPstＩ部位に挿入して全長ｂＧＨ遺伝子
の再構成を完了した。このPstＩ断片はｂＧＨ遺伝子の
残部に対して２つの可能な方向で挿入された。制限地図
によると、挿入物を所望の方向に挿入すると約４９０bp
PvuII断片（上記ｂＧＨ遺伝子に対して完全に内部）を
生成するが、挿入する方向が悪いと３５０ｂｐPvuIIＤ
ＮＡ断片となる。制限エンドヌクレアーゼPvuIIでテト
ラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを
開裂後両方の方向の多重単離物を同定した。この方法で
同定されたプラスミドの１つはpBGH−２１２と称され、
この全長ｂＧＨ遺伝子をさらに制限エンドヌクレアーゼ
で開裂して制限地図を作成しＤＮＡ配列をしらべること
によつて分析して該プラスミドの構成を正確なものにし
た。
わちアミノ酸２３〜８６をコード化している配列を５％
ポリアクリルアミドゲル上で単離し、ＡＴＧ開始コドン
とｂＧＨの最初の２２個のアミノ酸のための配列をコー
ド化しているpBR322サブクローンが単離されたクローン
化合成７５bpEcoＲＩ−Pvu II断片に配位結合した。こ
の配位結合混合物を制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩお
よびPst Ｉで開裂し、２７０ｂｐ断片を５％ポリアク
リルアミドゲルから単離し、適当に開裂されたpBR322Ｄ
ＮＡに挿入した。これらの２つの部位を使用して、修飾
されたｂＧＨ遺伝子配列のEcoＲＩ−PstＩＤＮＡ断片を
pBR322プラスミドに挿入して挿入の単一の配向のみを可
能にした。この結合において得られた形質転換体から得
られたプラスミドＤＮＡをEcoＲＩとPstＩで開裂して２
７０bp ｂＧＨ遺伝子断片のベクターへの挿入を証明し
た。次に、ｂＧＨアミノ酸９１−１９１のコード化配列
（およびｂＧＨｃＤＮＡの３′未翻訳領域）を有するbB
GH−１０２からの４４０bpPstＩＤＮＡ断片をこのプラ
スミドＤＮＡのPstＩ部位に挿入して全長ｂＧＨ遺伝子
の再構成を完了した。このPstＩ断片はｂＧＨ遺伝子の
残部に対して２つの可能な方向で挿入された。制限地図
によると、挿入物を所望の方向に挿入すると約４９０bp
PvuII断片（上記ｂＧＨ遺伝子に対して完全に内部）を
生成するが、挿入する方向が悪いと３５０ｂｐPvuIIＤ
ＮＡ断片となる。制限エンドヌクレアーゼPvuIIでテト
ラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを
開裂後両方の方向の多重単離物を同定した。この方法で
同定されたプラスミドの１つはpBGH−２１２と称され、
この全長ｂＧＨ遺伝子をさらに制限エンドヌクレアーゼ
で開裂して制限地図を作成しＤＮＡ配列をしらべること
によつて分析して該プラスミドの構成を正確なものにし
た。
ｂＧＨ発現プラスミドを組立てるための次の段階は、大
腸菌trpプロモーターとリボゾーム結合部位配列を有す
るEcoＲＩＤＮＡ断片の挿入である。全長ｂＧＨクロー
ン、pBGH212を制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩで開裂
し、細菌のアルカリ性ホスフアターゼで処理して、２つ
の異なる約３９０bpのEcoＲＩ断片（ｂＧＨの細菌によ
る発現に要する配列を有する）と結合させた。２つの異
なる配位結合を行つて、遺伝子開始領域のヌクレオチド
配列がわずかに異なるtrpプロモーター−rbs断片をpBGH
−２１２に挿入した。菌株ＨＢ１０１の能力細胞を各配
位結合反応混合物で形質転換した。各形質転換物からい
くつかのテトラサイクリン耐性コロニーをとり出し、単
離されたプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼに
よる切断によつて分析した。trpプロモーター−rbs含有
断片を、該プロモーターからの転写の方向に対して可能
な２つの方向でpBGH−２１２ＤＮＡに挿入できた。プロ
モーター−rbs挿入物の方向をｂＧＨ遺伝子の転写を生
じる方向にすると６０bpHindIIIＤＮＡ断片を生成し、
望ましくない方向にすると４００ｂｐ断片を生成する。
各結合混合物からの倍数の組換え微生物を、直接の発現
に必要とされる配置でtrpプロモーター−rbs配列に隣接
する完全なｂＧＨ遺伝子を担持するプラスミドで同定し
た。
腸菌trpプロモーターとリボゾーム結合部位配列を有す
るEcoＲＩＤＮＡ断片の挿入である。全長ｂＧＨクロー
ン、pBGH212を制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩで開裂
し、細菌のアルカリ性ホスフアターゼで処理して、２つ
の異なる約３９０bpのEcoＲＩ断片（ｂＧＨの細菌によ
る発現に要する配列を有する）と結合させた。２つの異
なる配位結合を行つて、遺伝子開始領域のヌクレオチド
配列がわずかに異なるtrpプロモーター−rbs断片をpBGH
−２１２に挿入した。菌株ＨＢ１０１の能力細胞を各配
位結合反応混合物で形質転換した。各形質転換物からい
くつかのテトラサイクリン耐性コロニーをとり出し、単
離されたプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼに
よる切断によつて分析した。trpプロモーター−rbs含有
断片を、該プロモーターからの転写の方向に対して可能
な２つの方向でpBGH−２１２ＤＮＡに挿入できた。プロ
モーター−rbs挿入物の方向をｂＧＨ遺伝子の転写を生
じる方向にすると６０bpHindIIIＤＮＡ断片を生成し、
望ましくない方向にすると４００ｂｐ断片を生成する。
各結合混合物からの倍数の組換え微生物を、直接の発現
に必要とされる配置でtrpプロモーター−rbs配列に隣接
する完全なｂＧＨ遺伝子を担持するプラスミドで同定し
た。
発現プラスミドの構成は、プラスミドpBGH−２１２−Ｒ
２およびpBGH-212-R4からの約９２０bpHindIII−PruII
（パーシヤル）のＤＮＡ断片を単離することによつて開
始された。このＤＮＡ断片はtrpプロモーター−rbs配列
およびｂＧＨコード化配列のほとんど全体（最後の４個
のアミノ酸残基および停止コドン以外のすべて）を含
む。ホルモン全体を発現するために、ｂＧＨのＣ末端を
コード化している合成ＤＮＡの断片をpBR-322にクロー
ンした。この２０ｂｐＤＮＡ断片を２つの独立したオリ
ゴマーとして合成し、アニール化して二本鎖断片を形成
し、制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩおよびHindIIIで切
断されたpBR322ＤＮＡに挿入した。このサブクローンを
制限エンドヌクレアーゼPvuIIおよびBamHＩで切断後、
３６５ｂｐPvuII−BamＨＩＤＮＡ断片をゲルで単離し、
電気溶出により精製した。最終的な発現プラスミドは、
クローンされた合成Ｃ末端を有する断片（３６５bp）を
第６図に示すとおりに、各々、trpプロモーター−rbs-b
GH ＤＮＡ断片（９２０bp）とｐＢＲ３２２誘導ベクタ
ー断片（３９９５bp）と結合することによつて組み立て
られた。全長ｂＧＨ発現プラスミドをPvuIIによる制限
エンドヌクレアーゼ開裂によつて同定された。これらの
ｂＧＨ発現プラスミドはさらに制限酵素開裂地図のもつ
と正確な決定により特徴付けられた。ＤＮＡの配列をし
らべることによりこれらの発現プラスミドをさらにしら
べることにより、上記修飾されたｂＧＨ遺伝子配列を証
明し、pBGH-３０１とpBGH-３７５と称される２つの異な
るベクターが別個のものであることを確証した。
２およびpBGH-212-R4からの約９２０bpHindIII−PruII
（パーシヤル）のＤＮＡ断片を単離することによつて開
始された。このＤＮＡ断片はtrpプロモーター−rbs配列
およびｂＧＨコード化配列のほとんど全体（最後の４個
のアミノ酸残基および停止コドン以外のすべて）を含
む。ホルモン全体を発現するために、ｂＧＨのＣ末端を
コード化している合成ＤＮＡの断片をpBR-322にクロー
ンした。この２０ｂｐＤＮＡ断片を２つの独立したオリ
ゴマーとして合成し、アニール化して二本鎖断片を形成
し、制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩおよびHindIIIで切
断されたpBR322ＤＮＡに挿入した。このサブクローンを
制限エンドヌクレアーゼPvuIIおよびBamHＩで切断後、
３６５ｂｐPvuII−BamＨＩＤＮＡ断片をゲルで単離し、
電気溶出により精製した。最終的な発現プラスミドは、
クローンされた合成Ｃ末端を有する断片（３６５bp）を
第６図に示すとおりに、各々、trpプロモーター−rbs-b
GH ＤＮＡ断片（９２０bp）とｐＢＲ３２２誘導ベクタ
ー断片（３９９５bp）と結合することによつて組み立て
られた。全長ｂＧＨ発現プラスミドをPvuIIによる制限
エンドヌクレアーゼ開裂によつて同定された。これらの
ｂＧＨ発現プラスミドはさらに制限酵素開裂地図のもつ
と正確な決定により特徴付けられた。ＤＮＡの配列をし
らべることによりこれらの発現プラスミドをさらにしら
べることにより、上記修飾されたｂＧＨ遺伝子配列を証
明し、pBGH-３０１とpBGH-３７５と称される２つの異な
るベクターが別個のものであることを確証した。
これらの発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳することに
より１９１個のアミノ酸残渣のホルモンポリペプチドを
予測できる。そのような蛋白質の測定された分子量は約
22,000である。ｂＧＨ発現プラスミドpBGH-３０１とpBG
H-３７５を有する細胞をtrpプロモーターで司令される
発現を誘導するのに公知の条件下に生育させると、細胞
は、総蛋白抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
（Laemmli,J.１９７０，Nature２７７、６８０）上でし
らべたところ精製されたｂＧＨ蛋白（マイルス（Mile
s）より得た）のサイズに似た蛋白質を生産した。この
帯状物は同一条件下に生育させたベクタープラスミドｐ
ＢＲ３２２を有する細胞からの蛋白質抽出物中で可視で
はなかつた。ｂＧＨレベルを５７９ｎｍにおけるデンシ
トメーターゲル走査によりしらべた。rbsのＲ２を変え
た発現プラスミド（pBGH-３０１）を含む培養物は総細
胞蛋白質の約２０〜２５％のレベルでｂＧＨを生成し
た。一方、rbrのＲ４が変化したpBGA-３７５発現プラス
ミドを有する細胞は総細胞蛋白質の約５〜７％のレベル
でｐＧＨを生成した。
より１９１個のアミノ酸残渣のホルモンポリペプチドを
予測できる。そのような蛋白質の測定された分子量は約
22,000である。ｂＧＨ発現プラスミドpBGH-３０１とpBG
H-３７５を有する細胞をtrpプロモーターで司令される
発現を誘導するのに公知の条件下に生育させると、細胞
は、総蛋白抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
（Laemmli,J.１９７０，Nature２７７、６８０）上でし
らべたところ精製されたｂＧＨ蛋白（マイルス（Mile
s）より得た）のサイズに似た蛋白質を生産した。この
帯状物は同一条件下に生育させたベクタープラスミドｐ
ＢＲ３２２を有する細胞からの蛋白質抽出物中で可視で
はなかつた。ｂＧＨレベルを５７９ｎｍにおけるデンシ
トメーターゲル走査によりしらべた。rbsのＲ２を変え
た発現プラスミド（pBGH-３０１）を含む培養物は総細
胞蛋白質の約２０〜２５％のレベルでｂＧＨを生成し
た。一方、rbrのＲ４が変化したpBGA-３７５発現プラス
ミドを有する細胞は総細胞蛋白質の約５〜７％のレベル
でｐＧＨを生成した。
ｐＧＨ発現の場合、ｂＧＨ発現に使用されるものと類似
の方法が使用された。ｐＧＨ遺伝子のアミノ末端を修飾
するのに使用される二本鎖ＤＮＡの配列は本質的にSeeb
urgらの上記文献に記載のとおりである。ｐＧＨ発現プ
ラスミドを構成するのに使用される実験の工程は第７図
のとおりである。まず、ｃＤＮＡクローン（pGH２４）
からの領域をｐＧＨ遺伝子の合成領域で置換した。pGH
のアミノ酸残基２２と２３をコードしている領域はPvuI
I部位を欠いているので、ｐＧＨハイブリツド遺伝子の
合成５′部分を上記クローンされたｃＤＮＡから誘導さ
れたコード化配列にAsuＩ部位（ｐＧＨ−２４のアミノ
酸コドン１６および１７で生じる）において結合した。
AsuＩ部位もｐＧＨのアミノ末端をコードしている合成
ＤＮＡの同じ位置に挿入した。クローンされたｃＤＮＡ
にさらにAsuＩ部位が存在することにより、このｐＧＨ
遺伝子は３つの異なるＤＮＡ断片から再構成された。
の方法が使用された。ｐＧＨ遺伝子のアミノ末端を修飾
するのに使用される二本鎖ＤＮＡの配列は本質的にSeeb
urgらの上記文献に記載のとおりである。ｐＧＨ発現プ
ラスミドを構成するのに使用される実験の工程は第７図
のとおりである。まず、ｃＤＮＡクローン（pGH２４）
からの領域をｐＧＨ遺伝子の合成領域で置換した。pGH
のアミノ酸残基２２と２３をコードしている領域はPvuI
I部位を欠いているので、ｐＧＨハイブリツド遺伝子の
合成５′部分を上記クローンされたｃＤＮＡから誘導さ
れたコード化配列にAsuＩ部位（ｐＧＨ−２４のアミノ
酸コドン１６および１７で生じる）において結合した。
AsuＩ部位もｐＧＨのアミノ末端をコードしている合成
ＤＮＡの同じ位置に挿入した。クローンされたｃＤＮＡ
にさらにAsuＩ部位が存在することにより、このｐＧＨ
遺伝子は３つの異なるＤＮＡ断片から再構成された。
ｐＧＨ−２４から単離された６３５bpPstＩ−PvuII断片
はRsaＩによつて切断され、得られた２００bpPstI-RsaI
断片をさらにAsnIで開裂した。修飾された遺伝子はクロ
ーンされた合成EcoRI-AsuI53bp断片、７５ｂｐAsuI-Rsa
I断片および４８０bpRsaI-PvuII断片をいつしよに結合
することにより構成した。この結合の生成物をEeoRIお
よびRvuIIで切断し、５７０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片
を５％ポリアクリルアミドゲルから単離した。この断片
をｂＧＨ発現プラスミドpBGH-３７５からのEcoRI-PvuII
（パーシヤル）ベクター断片と結合して大腸菌菌株ＭＭ
２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）の能力細胞内に形質転換
し、アンピシリンを含有するプレート上で選択された。
このプレー発現プラスミド（９１０bpEcoＲＩ−BamＨＩ
断片の存在によつて同定された）は全長ｐＧＨ遺伝子を
有する。というのは、ｐＧＨおよびｂＧＨ蛋白質は同じ
Ｃ末端アミノ酸配列を有するからである。
はRsaＩによつて切断され、得られた２００bpPstI-RsaI
断片をさらにAsnIで開裂した。修飾された遺伝子はクロ
ーンされた合成EcoRI-AsuI53bp断片、７５ｂｐAsuI-Rsa
I断片および４８０bpRsaI-PvuII断片をいつしよに結合
することにより構成した。この結合の生成物をEeoRIお
よびRvuIIで切断し、５７０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片
を５％ポリアクリルアミドゲルから単離した。この断片
をｂＧＨ発現プラスミドpBGH-３７５からのEcoRI-PvuII
（パーシヤル）ベクター断片と結合して大腸菌菌株ＭＭ
２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）の能力細胞内に形質転換
し、アンピシリンを含有するプレート上で選択された。
このプレー発現プラスミド（９１０bpEcoＲＩ−BamＨＩ
断片の存在によつて同定された）は全長ｐＧＨ遺伝子を
有する。というのは、ｐＧＨおよびｂＧＨ蛋白質は同じ
Ｃ末端アミノ酸配列を有するからである。
ｐＧＨ発現プラスミドの構成における次の工程は、大腸
菌trpオペロンプロモーター配列と修飾されたリボゾー
ム結合部位を有する約３９０ｂｐEcoＲＩＤＮＡ断片の
挿入である。全長ｐＧＨプラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼEcoＲＩで開裂し、ｐＧＨの細菌による発現に必
要な配列を有するEcoＲＩ断片の別個のもの（separate
version）と結合した。発現断片をリボゾーム係合部位
の周囲の領域がわずかに異なるヌクレオチド配列ととも
に使用することにより２つの異なる結合反応物をつくつ
た。菌株Ｃ６００の能力細胞を各結合反応物で形質転換
した。プラスミドＤＮＡを各形質転換体からのいくつか
の薬剤耐性コロニーから単離し、制限エンドヌクレアー
ゼによつて切断して分析した。trpプロモーターを含む
断片をtrpプロモーターからの転写方向に対して可能な
２つの方向でプレ発現プラスミド中に挿入できた。上記
ｐＧＨ遺伝子の転写を生じるプロモーター挿入断片を所
望の方向に挿入すると９２０ｂｐHindIIIＤＮＡ断片を
産生し、一方望ましくない方向にすると６００ｂｐＤＮ
Ａ断片を生成する。各結合反応物からの多重単離物を直
接発現に必要とされる配置にあるtrpプロモーターとrbs
配列に隣接する完全なｐＧＨ遺伝子を有するプラスミド
で同定した。さらに、これらの発現構成物の特性は他の
制限エンドヌクレアーゼによる制限地図をつくることに
よりしらべられた。これらのpGH発現プラスミドの特徴
をＤＮＡ配列をしらべることによつてしらべてヌクレオ
チドのレベルでそれらが別個のものであることを確証し
た。これら２つのｐＧＨ発現プラスミドはpGH-１０１と
pGH-１０７と称された。
菌trpオペロンプロモーター配列と修飾されたリボゾー
ム結合部位を有する約３９０ｂｐEcoＲＩＤＮＡ断片の
挿入である。全長ｐＧＨプラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼEcoＲＩで開裂し、ｐＧＨの細菌による発現に必
要な配列を有するEcoＲＩ断片の別個のもの（separate
version）と結合した。発現断片をリボゾーム係合部位
の周囲の領域がわずかに異なるヌクレオチド配列ととも
に使用することにより２つの異なる結合反応物をつくつ
た。菌株Ｃ６００の能力細胞を各結合反応物で形質転換
した。プラスミドＤＮＡを各形質転換体からのいくつか
の薬剤耐性コロニーから単離し、制限エンドヌクレアー
ゼによつて切断して分析した。trpプロモーターを含む
断片をtrpプロモーターからの転写方向に対して可能な
２つの方向でプレ発現プラスミド中に挿入できた。上記
ｐＧＨ遺伝子の転写を生じるプロモーター挿入断片を所
望の方向に挿入すると９２０ｂｐHindIIIＤＮＡ断片を
産生し、一方望ましくない方向にすると６００ｂｐＤＮ
Ａ断片を生成する。各結合反応物からの多重単離物を直
接発現に必要とされる配置にあるtrpプロモーターとrbs
配列に隣接する完全なｐＧＨ遺伝子を有するプラスミド
で同定した。さらに、これらの発現構成物の特性は他の
制限エンドヌクレアーゼによる制限地図をつくることに
よりしらべられた。これらのpGH発現プラスミドの特徴
をＤＮＡ配列をしらべることによつてしらべてヌクレオ
チドのレベルでそれらが別個のものであることを確証し
た。これら２つのｐＧＨ発現プラスミドはpGH-１０１と
pGH-１０７と称された。
これらのｐＧＨ発現プラスミドのＤＮＡ配列を翻訳すれ
ば１９１個のアミノ酸のホルモンポリペプチドを予測し
得る。そのような蛋白質の測定された分子量は約22,000
となる。プラスミドｐＧＨ−１０１またはｐＧＨ−１０
７からなる組換え微生物をtrpプロモーターが司令する
発現を誘導させるに公知の条件下で生育させると、これ
らの細胞は約22,000ダルトンのサイズの蛋白質を生成し
た。この帯状物は同一の条件下に生育されたベクタープ
ラスミドｐＢＲ３２２を有する細胞からつくられた蛋白
質抽出物からは得られなかつた。ｐＧＨ産生のレベルは
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの個々のレーンをデン
シトメーターで走査することによつて決定された。いく
つかの大腸菌蛋白質は22,000ダルトンの大きいさにあて
はまり対照細胞抽出物中の総蛋白質の約２〜５％を占め
る。これらの生来の蛋白質の割合を補正すると、上記発
現培養物の蛋白質抽出物中に見られるｐＧＨ帯状物はｐ
ＧＨ−１０１とｐＧＨ−１０７の各々について総細胞蛋
白質の約５％および１５％である。トリプトフアン（１
００μg／ml）の存在下に生育させた培養物中のｐＧＨ
レベルを定量するとｐＧＨ発現のレベルが低下した。こ
の事実は、ｐＧＨ蛋白質の大腸菌内での産生が意図され
たtrpプロモーター−オペレーターの制御下で本当に行
なわれていることを意味する。ｐＧＨの場合の発現レベ
ルの相違は同じリボゾーム結合部位配列を使用してプロ
レンニンとｂＧＨを発現させるときに見られる相違と類
似していた。
ば１９１個のアミノ酸のホルモンポリペプチドを予測し
得る。そのような蛋白質の測定された分子量は約22,000
となる。プラスミドｐＧＨ−１０１またはｐＧＨ−１０
７からなる組換え微生物をtrpプロモーターが司令する
発現を誘導させるに公知の条件下で生育させると、これ
らの細胞は約22,000ダルトンのサイズの蛋白質を生成し
た。この帯状物は同一の条件下に生育されたベクタープ
ラスミドｐＢＲ３２２を有する細胞からつくられた蛋白
質抽出物からは得られなかつた。ｐＧＨ産生のレベルは
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの個々のレーンをデン
シトメーターで走査することによつて決定された。いく
つかの大腸菌蛋白質は22,000ダルトンの大きいさにあて
はまり対照細胞抽出物中の総蛋白質の約２〜５％を占め
る。これらの生来の蛋白質の割合を補正すると、上記発
現培養物の蛋白質抽出物中に見られるｐＧＨ帯状物はｐ
ＧＨ−１０１とｐＧＨ−１０７の各々について総細胞蛋
白質の約５％および１５％である。トリプトフアン（１
００μg／ml）の存在下に生育させた培養物中のｐＧＨ
レベルを定量するとｐＧＨ発現のレベルが低下した。こ
の事実は、ｐＧＨ蛋白質の大腸菌内での産生が意図され
たtrpプロモーター−オペレーターの制御下で本当に行
なわれていることを意味する。ｐＧＨの場合の発現レベ
ルの相違は同じリボゾーム結合部位配列を使用してプロ
レンニンとｂＧＨを発現させるときに見られる相違と類
似していた。
“Ｒ２”trpプロモーター−rbsを使用した外来遺伝子の
効率的発現のもう１つの例は、合成ＤＮＡ配列からのヒ
トウロガストロンすなわちヒト上皮成長因子（hEGF）の
産生である。hEGFの効率的な細菌による生産を達成する
のに工夫された計画においては成熟ｈＥＧＦのコード化
配列を含むＤＮＡ断片を化学的に合成した。この方法に
よつて、成熟ＥＧＦポリペプチドの最初のアミノ酸残基
をコードしているコドンの前に蛋白質合成のためのＡＴ
Ｇ開始コドンを導入することによつてこの成熟ホルモン
の直接発現が可能となつた。この合成遺伝子は１５個の
オリゴヌクレオチドからなり、長さは１２〜４５個の塩
基である。３つの別個の結合を行い、結合中間生成物を
ポリアクリルアミドゲル上で単離した。精製された結合
中間生成物を次いでｈＥＧＦ遺伝子の最終的組立てとし
て配位結合した。ｈＥＧＦ遺伝子をプラスミドpBR322Ｄ
ＮＡに挿入するのを促進するため、合成ｈＥＧＦ遺伝子
がその末端にEcoＲＩおよびHindIII制限エンドヌクレア
ーゼ接着末端を有するようにした。ｈＥＧＦ合成ＤＮＡ
をEcoＲＩおよびHindIII開裂したｐＢＲ３２２ＤＮＡと
結合させ、このプラスミドの合成的に誘導された領域を
ＤＮＡ配列により分析（MaxamおよびGilbertの上記文
献）して正確なものとした。
効率的発現のもう１つの例は、合成ＤＮＡ配列からのヒ
トウロガストロンすなわちヒト上皮成長因子（hEGF）の
産生である。hEGFの効率的な細菌による生産を達成する
のに工夫された計画においては成熟ｈＥＧＦのコード化
配列を含むＤＮＡ断片を化学的に合成した。この方法に
よつて、成熟ＥＧＦポリペプチドの最初のアミノ酸残基
をコードしているコドンの前に蛋白質合成のためのＡＴ
Ｇ開始コドンを導入することによつてこの成熟ホルモン
の直接発現が可能となつた。この合成遺伝子は１５個の
オリゴヌクレオチドからなり、長さは１２〜４５個の塩
基である。３つの別個の結合を行い、結合中間生成物を
ポリアクリルアミドゲル上で単離した。精製された結合
中間生成物を次いでｈＥＧＦ遺伝子の最終的組立てとし
て配位結合した。ｈＥＧＦ遺伝子をプラスミドpBR322Ｄ
ＮＡに挿入するのを促進するため、合成ｈＥＧＦ遺伝子
がその末端にEcoＲＩおよびHindIII制限エンドヌクレア
ーゼ接着末端を有するようにした。ｈＥＧＦ合成ＤＮＡ
をEcoＲＩおよびHindIII開裂したｐＢＲ３２２ＤＮＡと
結合させ、このプラスミドの合成的に誘導された領域を
ＤＮＡ配列により分析（MaxamおよびGilbertの上記文
献）して正確なものとした。
大腸菌のｈＥＧＦの発現のためのベクターは、プロレン
ニン、ｂＧＨおよびｐＧＨの高レベルの発現に使用され
たことのあるtrpプロモーター−rbs断片を使用して構成
された。ＥＧＦ発現プラスミドの構成はｐＢＲ３２２−
ＥＧＦサブクローンを制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩ
で開裂し、続いて細菌のアルカリ性ホスフアターゼで脱
ホスホリル化することにより開始された。これらの発現
プラスミドはtrpプロモーター−rbs配列を有するEcoＲ
Ｉ断片を使用して構成された。リボゾーム結合部位の周
囲の領域のヌクレオチド配列がわずかに異なるtrpプロ
モーター−rps断片を使用して２つの異なる結合を行な
つた。大腸菌菌株ＨＢ１０１の能力細胞を各結合反応物
で形質転換した。各形質転換物から得られたいくつかの
薬物耐性コロニーをとり出して単離したプラスミドＤＮ
Ａを制限エンドヌクレアーゼによつて開裂して分析し
た。trpプロモーター−rbsを有する断片をプロモーター
からの転写の方向に対して可能な２つの方向でＥＧＦサ
ブクローンの中に挿入できた。合成ＥＧＦ遺伝子の発現
を生じるプロモーター挿入断片の方向を望ましい方向に
すると510ｂｐのHindIII ＤＮＡ断片を生成するが、望
ましくない方向にすると２００ｂｐのHindIIIＤＮＡ断
片を生成する。各結合反応物からの多重単離物は、直接
発現に必要な配置で細菌のプロモーター−rbs配列に隣
接してＥＧＦ遺伝子を有するプラスミドで同定された。
ニン、ｂＧＨおよびｐＧＨの高レベルの発現に使用され
たことのあるtrpプロモーター−rbs断片を使用して構成
された。ＥＧＦ発現プラスミドの構成はｐＢＲ３２２−
ＥＧＦサブクローンを制限エンドヌクレアーゼEcoＲＩ
で開裂し、続いて細菌のアルカリ性ホスフアターゼで脱
ホスホリル化することにより開始された。これらの発現
プラスミドはtrpプロモーター−rbs配列を有するEcoＲ
Ｉ断片を使用して構成された。リボゾーム結合部位の周
囲の領域のヌクレオチド配列がわずかに異なるtrpプロ
モーター−rps断片を使用して２つの異なる結合を行な
つた。大腸菌菌株ＨＢ１０１の能力細胞を各結合反応物
で形質転換した。各形質転換物から得られたいくつかの
薬物耐性コロニーをとり出して単離したプラスミドＤＮ
Ａを制限エンドヌクレアーゼによつて開裂して分析し
た。trpプロモーター−rbsを有する断片をプロモーター
からの転写の方向に対して可能な２つの方向でＥＧＦサ
ブクローンの中に挿入できた。合成ＥＧＦ遺伝子の発現
を生じるプロモーター挿入断片の方向を望ましい方向に
すると510ｂｐのHindIII ＤＮＡ断片を生成するが、望
ましくない方向にすると２００ｂｐのHindIIIＤＮＡ断
片を生成する。各結合反応物からの多重単離物は、直接
発現に必要な配置で細菌のプロモーター−rbs配列に隣
接してＥＧＦ遺伝子を有するプラスミドで同定された。
発現プラスミドのＤＮＡ配列を分析することによりＥＧ
Ｆコード化配列が上述の如く大腸菌trpプロモーター−r
bsの直後にあることが確認された。ｐＥＧＦ−Ｒ２およ
びｐＥＧＦ−Ｒ４と称されるＥＧＦ発現プラスミドにお
いてはＡＴＧ開始コドンはリボゾーム結合部位配列の各
々５および１１個のヌクレオチドの後に存在する。
Ｆコード化配列が上述の如く大腸菌trpプロモーター−r
bsの直後にあることが確認された。ｐＥＧＦ−Ｒ２およ
びｐＥＧＦ−Ｒ４と称されるＥＧＦ発現プラスミドにお
いてはＡＴＧ開始コドンはリボゾーム結合部位配列の各
々５および１１個のヌクレオチドの後に存在する。
ＥＧＦ発現プラスミドのＤＮＡ配列の翻訳をすると、鎖
内に３つのジスルフイド結合を形成すると考えられる６
つのシステイン残基を有する５４個のアミノ酸ポリペプ
チドを予測できる。そのようなホルモンの測定された分
子量は約6,353となろう。lonと称される大腸菌の変異菌
株（Gottesmanら、J.Bacteriol.１４８、２６５、１９
８１）はコネチカツト州ニユーヘブンのエール大学の大
腸菌（E.coli）遺伝子ストツク・センターから菌株No.
ＥＣＧＳＣ−６４３６として入手し得、ＥＧＦ発現プラ
スミドで形質転換され、trpプロモーターによつて司令
された発現を誘導するのに公知の条件下で生育される。
野性型細胞に存するいくつかのプロテアーゼの１つを欠
くこの変異菌株を使用して細菌によつて生成したりＥＧ
Ｆの蛋白質分解を最小限にした。
内に３つのジスルフイド結合を形成すると考えられる６
つのシステイン残基を有する５４個のアミノ酸ポリペプ
チドを予測できる。そのようなホルモンの測定された分
子量は約6,353となろう。lonと称される大腸菌の変異菌
株（Gottesmanら、J.Bacteriol.１４８、２６５、１９
８１）はコネチカツト州ニユーヘブンのエール大学の大
腸菌（E.coli）遺伝子ストツク・センターから菌株No.
ＥＣＧＳＣ−６４３６として入手し得、ＥＧＦ発現プラ
スミドで形質転換され、trpプロモーターによつて司令
された発現を誘導するのに公知の条件下で生育される。
野性型細胞に存するいくつかのプロテアーゼの１つを欠
くこの変異菌株を使用して細菌によつて生成したりＥＧ
Ｆの蛋白質分解を最小限にした。
これらの発現培養物の総蛋白抽出物を１５％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上でしらべてＥＧＦ産生のレベル
を決定しようとした。低分子量のポリペプチド（市販の
ものから得られた精製マウス−ＥＧＦを含む）は比較的
分割しないが、対照の抽出物に比べて発現培養物からの
抽出物にはＥＧＦ分子量範囲の蛋白質がもつと多いよう
である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの個々のレー
ンをデンシトメーターで走査した。大きさが10,000ダル
トン未満の細胞蛋白質は対照抽出物においては総細胞蛋
白質の約１％を占めている。これらの生来の蛋白質の割
合を補正すると、発現培養蛋白抽出物中の推定ＥＧＦレ
ベルは総細胞蛋白質の約３〜５％に相当する。
リアクリルアミドゲル上でしらべてＥＧＦ産生のレベル
を決定しようとした。低分子量のポリペプチド（市販の
ものから得られた精製マウス−ＥＧＦを含む）は比較的
分割しないが、対照の抽出物に比べて発現培養物からの
抽出物にはＥＧＦ分子量範囲の蛋白質がもつと多いよう
である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの個々のレー
ンをデンシトメーターで走査した。大きさが10,000ダル
トン未満の細胞蛋白質は対照抽出物においては総細胞蛋
白質の約１％を占めている。これらの生来の蛋白質の割
合を補正すると、発現培養蛋白抽出物中の推定ＥＧＦレ
ベルは総細胞蛋白質の約３〜５％に相当する。
第１図はプラスミドpPFZ-Ｒ２およびＲ４（pPFZ-Ｒ）の
構成を示しpPFZ-Ｒ２およびＲ４の各々に共通の制限地
図を含む概略図である。図中矢印はtrpプロモーター配
列からプロキモシン（プロレンニン）遺伝子（太い断片
として表わした）へと発現する方向を示している。合成
挿入物は空白の箱状の形で表わした。 第２図は、プラスミドptrpＬＩ−Ｒ２およびＲ４の構成
のための手順を示す概略図である。 第３図はプラスミドptrpＬＩ−Ｒ２−Ｂ４８及びptrpＬ
Ｉ−Ｒ４−Ｂ４８の構成のための手順を示す概略図であ
る。 第４図はプラスミドpPFZ-Ｒ２およびpPFZ−Ｒ４の各々
についてのプロキモシン（プロレンニン）遺伝子のリボ
ゾームの結合部位と開始コドン（ＡＴＧ）との間のヌク
レオチド配列と間隔を示す概略図である。 第５−１および５−２図は、全長のｂＧＨ遺伝子及び発
現配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略
図である。プラスミドｐＢＧＨ−１０２はpBR322のアン
ピシリン耐性遺伝子にクローンされたbGHcＤＮＡ配列
（黒く塗つた箱形）を含む。ｂＧＨの新しいアミノ末端
コードしている合成ＤＮＡをpBR322（点線の箱形）のEc
oＲＩ部位とHindIII部位に挿入した。矢印は配列解読の
５′→３′方向、すなわち転写の方向を示す。 第６−１および６−２図はｂＧＨ産生のための細菌の発
現プラスミドの構成を示す概略図である。プラスミドpB
GH-212-Rはtrpプロモーター配列（第５図参照）によつ
て成熟ｂＧＨを完全に直接発現させる遺伝子を担持して
いる。これらのプラスミドはHindIIIによつて開裂さ
れ、PvuIIによつて部分的に切断され、２つの約920bpHi
ndIII-PvuII断片を単離した。ｂＧＨのＣ−末端をコー
ドする合成ＤＮＡ断片がｐＢＲ３２２（空白の箱形）の
EcoＲＩ部位およびHindIII部位に挿入された。矢印はtr
pプロモーター配列からの転写の方向及び配列解読にお
ける５′→３′の方向を示している。 第７−１および７−２図はｐＧＨ遺伝子と発現配列の全
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドpGH-24はpBR322のアンピシリン耐性遺伝
子の中にクローンされたpGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を有する。ｐＧＨの新しいアミノ末端をコードして
いる合成ＤＮＡはpBR322（点線の箱形）のEcoＲＩ部位
とHind III部位に挿入された。矢印は配列解読の５′→
３′の方向、すなわち転写の方向を示す。
構成を示しpPFZ-Ｒ２およびＲ４の各々に共通の制限地
図を含む概略図である。図中矢印はtrpプロモーター配
列からプロキモシン（プロレンニン）遺伝子（太い断片
として表わした）へと発現する方向を示している。合成
挿入物は空白の箱状の形で表わした。 第２図は、プラスミドptrpＬＩ−Ｒ２およびＲ４の構成
のための手順を示す概略図である。 第３図はプラスミドptrpＬＩ−Ｒ２−Ｂ４８及びptrpＬ
Ｉ−Ｒ４−Ｂ４８の構成のための手順を示す概略図であ
る。 第４図はプラスミドpPFZ-Ｒ２およびpPFZ−Ｒ４の各々
についてのプロキモシン（プロレンニン）遺伝子のリボ
ゾームの結合部位と開始コドン（ＡＴＧ）との間のヌク
レオチド配列と間隔を示す概略図である。 第５−１および５−２図は、全長のｂＧＨ遺伝子及び発
現配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略
図である。プラスミドｐＢＧＨ−１０２はpBR322のアン
ピシリン耐性遺伝子にクローンされたbGHcＤＮＡ配列
（黒く塗つた箱形）を含む。ｂＧＨの新しいアミノ末端
コードしている合成ＤＮＡをpBR322（点線の箱形）のEc
oＲＩ部位とHindIII部位に挿入した。矢印は配列解読の
５′→３′方向、すなわち転写の方向を示す。 第６−１および６−２図はｂＧＨ産生のための細菌の発
現プラスミドの構成を示す概略図である。プラスミドpB
GH-212-Rはtrpプロモーター配列（第５図参照）によつ
て成熟ｂＧＨを完全に直接発現させる遺伝子を担持して
いる。これらのプラスミドはHindIIIによつて開裂さ
れ、PvuIIによつて部分的に切断され、２つの約920bpHi
ndIII-PvuII断片を単離した。ｂＧＨのＣ−末端をコー
ドする合成ＤＮＡ断片がｐＢＲ３２２（空白の箱形）の
EcoＲＩ部位およびHindIII部位に挿入された。矢印はtr
pプロモーター配列からの転写の方向及び配列解読にお
ける５′→３′の方向を示している。 第７−１および７−２図はｐＧＨ遺伝子と発現配列の全
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドpGH-24はpBR322のアンピシリン耐性遺伝
子の中にクローンされたpGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を有する。ｐＧＨの新しいアミノ末端をコードして
いる合成ＤＮＡはpBR322（点線の箱形）のEcoＲＩ部位
とHind III部位に挿入された。矢印は配列解読の５′→
３′の方向、すなわち転写の方向を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (3)
- 【請求項１】同化性の炭素、窒素および無機塩源からな
る水性培地で、ヌクレオチド配列（ａ）ＴＡＡＡＡＡＧ
ＧＡＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ（ここでＡＴＧは翻訳開始コ
ドンである）またはヌクレオチド配列（ｂ）ＴＡＡＡＡ
ＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ（ここでＡ
ＴＧは翻訳開始コドンである）を含む細菌の発現プラス
ミドを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からなる微生物を
実質的量の細菌産生蛋白質が発現されるまで培養するこ
とからなる蛋白質の製造方法。 - 【請求項２】大腸菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌
株ＡＴＣＣ３９５４４またはＡＴＣＣ３９５４３であ
り、蛋白質がプロレンニンである特許請求の範囲第１項
の方法。 - 【請求項３】さらに該プロレンニンを単離することから
なる特許請求の範囲第２項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56496283A | 1983-12-23 | 1983-12-23 | |
| US564962 | 1983-12-23 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59272726A Division JP2532365B2 (ja) | 1983-12-23 | 1984-12-24 | 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0272892A JPH0272892A (ja) | 1990-03-13 |
| JPH0630612B2 true JPH0630612B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=24256628
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59272726A Expired - Lifetime JP2532365B2 (ja) | 1983-12-23 | 1984-12-24 | 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド |
| JP1166479A Expired - Lifetime JPH0630612B2 (ja) | 1983-12-23 | 1989-06-28 | 蛋白質の製造方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59272726A Expired - Lifetime JP2532365B2 (ja) | 1983-12-23 | 1984-12-24 | 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0147178B1 (ja) |
| JP (2) | JP2532365B2 (ja) |
| AT (1) | ATE66251T1 (ja) |
| BR (1) | BR8406680A (ja) |
| CA (1) | CA1340867C (ja) |
| DE (1) | DE3484926D1 (ja) |
| DK (1) | DK173028B1 (ja) |
| IE (1) | IE57651B1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US5222978A (en) | 1987-08-26 | 1993-06-29 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| US5472702A (en) * | 1987-08-26 | 1995-12-05 | United States Surgical Corporation | Sterilization of growth factors |
| US5366081A (en) | 1987-08-26 | 1994-11-22 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| EP0335400B1 (en) * | 1988-03-30 | 1994-06-08 | Hitachi, Ltd. | Processes for production of human epidermal growth factor by genetic engineering |
| US5359831A (en) | 1989-08-01 | 1994-11-01 | United States Surgical Corporation | Molded suture retainer |
| CA2059245C (en) * | 1991-02-08 | 2004-07-06 | Michael P. Chesterfield | Method and apparatus for calendering and coating/filling sutures |
| JP3550440B2 (ja) * | 1995-04-13 | 2004-08-04 | イーストマン・コダックジャパン株式会社 | オートホワイトバランス調整装置 |
| US5904716A (en) * | 1995-04-26 | 1999-05-18 | Gendler; El | Method for reconstituting cartilage tissue using demineralized bone and product thereof |
| US20090192554A1 (en) | 2008-01-29 | 2009-07-30 | Confluent Surgical, Inc. | Bioabsorbable block copolymer |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
| IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| DK489481A (da) * | 1980-11-10 | 1982-05-11 | Searle & Co | Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf |
| BR8108074A (pt) * | 1980-12-12 | 1982-09-21 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,ligadores de dna,cultura bacterial e processo para produzir taumatina |
| JPS589687A (ja) * | 1981-06-17 | 1983-01-20 | セルテク リミテッド | ポリペプチドの生産方法 |
| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| BR8205954A (pt) * | 1981-10-14 | 1983-09-13 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos |
| KR840004164A (ko) * | 1982-03-24 | 1984-10-10 | 구라바야시 이꾸시로 | Dna 및 그의 이용 |
| IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
| WO1983004030A1 (en) * | 1982-05-06 | 1983-11-24 | Applied Molecular Genetics, Inc. | The manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof |
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| AU575301B2 (en) * | 1982-10-08 | 1988-07-28 | Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research | Novel vector |
| IE56372B1 (en) * | 1982-12-22 | 1991-07-03 | Genentech Inc | Microbially produced rennet methods for its production and plasmids used for its production |
-
1984
- 1984-12-19 AT AT84308928T patent/ATE66251T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-12-19 EP EP84308928A patent/EP0147178B1/en not_active Expired
- 1984-12-19 DE DE8484308928T patent/DE3484926D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-20 IE IE3270/84A patent/IE57651B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-12-21 BR BR8406680A patent/BR8406680A/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-12-21 DK DK198406192A patent/DK173028B1/da active IP Right Grant
- 1984-12-21 CA CA000470825A patent/CA1340867C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-24 JP JP59272726A patent/JP2532365B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-28 JP JP1166479A patent/JPH0630612B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0147178A2 (en) | 1985-07-03 |
| EP0147178A3 (en) | 1987-06-03 |
| CA1340867C (en) | 2000-01-04 |
| DK173028B1 (da) | 1999-11-22 |
| ATE66251T1 (de) | 1991-08-15 |
| BR8406680A (pt) | 1985-10-22 |
| IE57651B1 (en) | 1993-02-10 |
| IE843270L (en) | 1985-06-23 |
| EP0147178B1 (en) | 1991-08-14 |
| DK619284A (da) | 1985-06-24 |
| DK619284D0 (da) | 1984-12-21 |
| DE3484926D1 (de) | 1991-09-19 |
| JP2532365B2 (ja) | 1996-09-11 |
| JPH0272892A (ja) | 1990-03-13 |
| JPS60227682A (ja) | 1985-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4727028A (en) | Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof | |
| EP0174367B1 (en) | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields | |
| US5292646A (en) | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules | |
| EP2088188B1 (en) | Direct expression of peptides into culture media | |
| US5270181A (en) | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules | |
| AU600949B2 (en) | Process for the production and secretion of polypeptides | |
| EP0075444A2 (en) | Methods and products for facile microbial expression of DNA sequences | |
| JP3878207B2 (ja) | ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド | |
| JPH09135691A (ja) | 牛のプレ成長および成長ホルモンの製造方法 | |
| JPH07106157B2 (ja) | ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター | |
| JP2532365B2 (ja) | 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド | |
| US4830962A (en) | Recombinant diphtheria toxin fragments | |
| JP2970811B2 (ja) | 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム | |
| CA1301096C (en) | High yield protein production system | |
| Cheah et al. | Secretion of eukaryotic growth hormones in Escherichia coli is influenced by the sequence of the mature proteins | |
| US5955297A (en) | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria | |
| IE67890B1 (en) | Enhanced Protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site | |
| US5037744A (en) | Process for the microbiological preparation of human serum albumin | |
| Vasil et al. | Regulation of exotoxin A synthesis in Pseudomonas aeruginosa: characterization of toxA‐lacZ fusions in wild‐type and mutant strains | |
| Ohsuye et al. | Expression of chemically synthesized α-neo-endorphin gene fused to E. coli alkaline phosphatase | |
| US5254463A (en) | Method for expression of bovine growth hormone | |
| Bekkers et al. | The use of genetic engineering to obtain efficient production of porcine pancreatic phospholipase A2 by Saccharomyces cerevisiae | |
| US6194200B1 (en) | Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells | |
| Rotman et al. | Identification of the mglA gene product in the beta-methylgalactoside transport system of Escherichia coli using plasmid DNA deletions generated in vitro. | |
| EP3904520A1 (en) | Gene expression cassette for expressing n-terminal methionine-truncated protein of interest and method for producing n-terminal methionine-truncated protein of interest by using same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |