DE68915841T2

DE68915841T2 - Verfahren zur Herstellung von Epidermal-Wachstumsfaktor durch genetische Transformation.

Info

Publication number: DE68915841T2
Application number: DE1989615841
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Fujimori; Shinichi Fukuzono; Yoshinori Harada; Norio Shimizu
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd; Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd; Resonac Corp
Priority date: 1988-03-30
Filing date: 1989-03-30
Publication date: 1995-02-02
Anticipated expiration: 2009-03-31
Also published as: EP0335400A3; EP0335400B1; DE68915841D1; EP0335400A2

Description

I. Hintergrund der Erfindung

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von humanem Epidermis-Wachstumsfaktor (nachstehend einfach als "hEGF" bezeichnet) mittels gentechnologischer Methoden. Sie betrifft insbesondere eine neue DNA-Sequenz, die ein chemisch synthetisiertes Gen enthält, das hEGF und einen Teil der Gene des Tryptophan-Operons codiert, ein Plasmid, das die DNA- Sequenz enthält, E.coli, die das Plasmid enthalten und Verfahren zur Herstellung von hEGF unter deren Verwendung.

2. STAND DER TECHNIK

Es wird angenommen, daß hEGF mit Urogastron identisch ist und daß er ein aus 53 Aminosäuren bestehendes Polypeptid ist, das im menschlichen Zwölffingerdarm, der Speicheldrüse usw. synthetisiert wird [H. Gregory und B.M. Preston: Int. J. Peptide Protein Res. 9 (1977), 107-118]. Dieses Polypeptid bewirkt sowohl die Inhibierung der Magensaftsekretion als auch eine Beschleunigung des Wachstums von Epithelzellen. Aus diesem Grund wäre hEGF wahrscheinlich bei der Behandlung von Magengeschwüren oder Wunden einsetzbar. hEGF ist im Urin im allgemeinen in einer Konzentration von 25 bis 250 ng/ml vorhanden und wurde daher bis jetzt durch Aufreinigen desselben aus Urin isoliert. Dieses Reinigungsverfahren birgt jedoch den Nachteil, daß die Ausbeute gering ist.
Kürzlich wurden Versuche unternommen, hEGF unter Verwendung gentechnologischer Methoden mittels E.coli zu synthetisieren. Diese Methoden sind beispielsweise in JP-A-57-122096, 60-28994, 61-15691 und 61-88881 (offengelegt) beschrieben. Bei diesen Methoden, die Einbringen eines chemisch synthetisierten hEGF-Gens in einen Expressionsvektor und Züchten von E.coli, die diesen Vektor enthalten, beinhalten, sollten (1) die Verwendung einer das chemisch synthetisierte hEGF codierenden DNA- Sequenz, (2) die Verwendung eines Expressionsvektors mit hoher Expressionseffiezienz, (3) Bedingungen zum Züchten von E.coli, die den Expressionsvektor enthalten und dergleichen berücksichtigt werden.
In den vorstehend beschriebenen Methoden des Standes der Technik wurde die Anordnung der hEGF codierenden DNA-Sequenz, um damit eine hohe Translationseffizienz zu erhalten, und die Verwendung eines Expressionsvektors mit hoher Expressionseffiezienz nicht ausreichend berücksichtigt. Die Methoden des Standes der Technik wiesen daher das Problem auf, daß es schwierig war hEGF mittels rekombinanten E.coli einfach in großen Mengen zu synthetisieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verfahren zur Herstellung von hEGF mittels gentechnologischer Methoden zur Verfügung zu stellen, welche umfassen: chemisches Synthetisieren eines hEGF-Gens, das eine hohe Translationseffizienz zum hEGF-Polypeptid aufweist, Inserieren des chemisch synthetisierten hEGF-Gens in einen in E.coli stabilen Expressionsvektor, der eine hohe Expressionseffizienz aufweist, Transformieren von E.coli mit dem Vektor und anschließendes Züchten von E.coli, die den Expressionsvektor enthalten, wobei hEGF effizient synthetisiert wird.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue DNA-Sequenz, die das chemisch synthetisierte, hEGF codierende Gen und einen Teil der Gene des Tryptophan-Operons enthält, ein Plasmid, das eine derartige DNA-Sequenz enthält und rekombinante E.coli, die das Plasmid enthalten zur Verfügung zu stellen.
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von humanem Epidermis- Wachstumsfaktor mittels gentechnologischer Methoden, welches umfaßt:
Züchten von rekombinanten E.coli, welche einen Plasmidvektor enthalten, der eine rekombinante DNA-Sequenz beinhaltet, die ein Tryptophan-Regulatorgen, ein den N-terminalen Bereich des trpE-Polypeptids stromabwärts des Regulatorgens codierendes Gen in dem Tryptophan-Operon und ein durch die folgende Formel (I) dargestelltes, 53 Aminosäuren des humanen Epidermis- Wachstumsfaktors codierendes Gen, das mit dem den N-terminalen Bereich codierenden Gen durch einen Linker verknüpft ist enthält, und Gewinnen des so exprimierten humanen Epidermis-Wachstumsfaktors,
und betrifft die rekombinante DNA-Sequenz und den Plasmidvektor, sowie die für das Verfahren verwendeten rekombinanten E.coli.
Formel (I):
In einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von humanem Epidermis- Wachstumsfaktor mittels gentechnologischer Methoden, welches umfaßt:
Züchten von rekombinanten E.coli, welche einen Plasmidvektor enthalten, der eine rekombinante DNA-Sequenz beinhaltet, die ein Tryptophan-Regulatorgen, ein den N-terminalen Bereich des trpL-Polypeptids stromabwärts des Regulatorgens codierendes Gen in dem Tryptophan-Operon und ein durch die Formel (I) dargestelltes, 53 Aminosäuren des humanen Epidermis-Wachstumsfaktors codierendes Gen, das mit dem den N-terminalen Bereich codierenden Gen durch einen Linker verknüpft ist, und
Gewinnen des so exprimierten humanen Epidermis-Wachstumsfaktors,
und betrifft die rekombinante DNA-Sequenz und den Plasmidvektor sowie die für das Verfahren verwendeten rekombinanten E.coli.
Gemäß den vorstehend beschriebenen ersten und zweiten Verfahren wird hEGF als Fusionsprotein exprimiert.
In einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von humanem Epidermis- Wachstumsfaktor mittels gentechnologischer Methoden welches umfaßt:
Züchten von rekombinanten E.coli, welche einen Plasmidvektor enthalten, der eine rekombinante DNA-Sequenz beinhaltet, die umfaßt:
ein Tryptophan-Regulatorgen,
eine DNA-Sequenz zur Regulierung der Translation des trpL- Polypeptids in dem Tryptophan-Operon stromabwärts des Tryptophan-Regulatorgens, und
ein durch die Formel (I) dargestelltes Gen, das 53 Aminosäuren des humanen Epidermis-Wachstumsfaktor codiert, unmittelbar stromabwärts eines Methionin am N-Terminus des trpL- Polypeptids codierenden genetischen Codons, und
Gewinnen des so exprimierten humanen Epidermis-Wachstumsfaktors,
und betrifft die rekombinante DNA-Sequenz und den Plasmidvektor sowie die für das Verfahren verwendeten rekombinanten E.coli.
In einer vierten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von humanem Epidermis- Wachstumsfaktor mittels gentechnologischer Methoden, welches umfaßt:
Züchten von rekombinanten E.coli, welche einen Plasmidvektor enthalten, der eine rekombinante DNA-Sequenz beinhaltet, die umfaßt:
ein Tryptophan-Regulatorgen,
ein trpL-Polypeptid-Strukturgen in dem Tryptophan-Operon stromabwärts des Tryptophan-Regulatorgens,
eine DNA-Sequenz zur Regulierung der Translation des trpE- Polypeptids, und
ein durch die Formel (I) dargestelltes Gen, das 53 Aminosäuren des humanen Epidermis-Wachstumsfaktor codiert, unmittelbar stromabwärts eines Methionin am N-Terminus des trpE- Polypeptids codierenden genetischen Codons, und
Gewinnen des so exprimierten humanen Epidermis-Wachstumsfaktors,
und betrifft die rekombinante DNA-Sequenz und den Plasmidvektor, sowie die für das Verfahren verwendeten rekombinanten E.coli.
In einer fünften Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von humanem Epidermis- Wachstumsfaktor mittels gentechnologischer Methoden, welches umfaßt
Züchten von rekombinanten E.coli, welche einen Plasmidvektor enthalten, der eine rekombinante DNA-Sequenz beinhaltet, die umfaßt:
ein Tryptophan-Regulatorgen,
eine DNA-Sequenz zur Regulierung der Translation des trpE- Polypeptids in dem Tryptophan-Operon stromabwärts des Tryptophan-Regulatorgens, und
ein durch die Formel (I) dargestelltes Gen, das 53 Aminosäuren des humanen Epidermis-Wachstumsfaktor codiert, unmittelbar stromabwärts eines Methionin am N-Terminus des trpE- Polypeptids codierenden genetischen Codons, und
Gewinnen des so exprimierten humanen Epidermis- Wachstumsfaktors,
und betrifft die rekombinante DNA-Sequenz und den Plasmidvektor, sowie die für das Verfahren verwendeten rekombinanten E.coli.
In den vorstehend beschriebenen Verfahren 3 bis 5 wird hEGF als reifes Protein exprimiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die gesamte, mittels organochemischer Methoden synthetisierte DNA-Sequenz des hEGF-Gens und die Sequenzen der Linkerbereiche stromaufwärts und stromabwärts des hEGF-Gens und die dem hEGF entsprechende Aminosäuresequenz, worin A, C, G und T ein Adeninnucleotid, ein Cytosinnucleotid, ein Guaninnucleotid bzw. ein Thymidinnucleotid darstellen.
Fig. 2 zeigt eine DNA-Sequenz, die den Promotor/Operator (trp P/O) dem Tryptophan-Operons und den 5'-Terminus des trpL- Leaderpeptid-Gens in dem Expressionsvektor pTRL2 umfaßt, worin PB und SD die Pribnow-Box bzw. die Shine-Dalgarno-Sequenz kennzeichnen.
Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz, die den Promotor/Operator (trp P/O) des Tryptophan-Operons, das trpL-Strukturgen und den 5'-Terminus des trpE-Strukturgens in dem Expressionsvektor pTRE2 umfaßt.
Fig. 4 zeigt die gesamte DNA-Sequenz des synthetisierten hEGF-Strukturgens, das durch Unterteilung in 28 Oligonucleotid- Blöcke dargestellt ist.
Fig. 5 zeigt ein Schema zur Synthese von Oligonucleotiden.
Fig. 6 zeigt das Verfahren zum Ligieren der Oligonucleotidblöcke.
Fig. 7 zeigt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pBREGF, worin Apr und Tcr das Ampicillin-Resistenzgen bzw. das Tetracyclin-Resistenzgen darstellen.
Fig. 8 zeigt die Struktur des zur Konstruktion des Plasmids pTRLBT2 verwendeten DNA-Fragments.
Fig. 9 zeigt die Struktur des zur Konstruktion des Plasmids pTREBT2 verwendeten DNA-Fragments.
Fig. 10 zeigt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pTRLBT1.
Fig. 11 zeigt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pTREBT1.
Fig. 12 zeigt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pTRLBT2.
Fig. 13 zeigt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pTREBT2.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Chemisch synthetisiertes, hEGF codierendes Gen:
Um das Strukturgen zu erhalten, das die Aminosäuresequenz- Information des aus 53 Aminosäuren bestehenden hEGF beinhaltet, muß berücksichtigt werden, ob unter der Vielzahl von DNA- Sequenzen, die von der hEGF-Aminosäuresequenz abgeleitet werden können, die dabei verwendeten genetischen Codons in E.coli häufig vorkommen. Weiterhin muß berücksichtigt werden, ob die Struktur bei der Konstruktion des ganzen Gens aus den organochemisch synthetisierten Gen-Fragmenten ein falsches Ligieren nur unter Schwierigkeiten zuläßt, und weiter, ob bei der Translation am Ribosom die Translationseffizienz dadurch vermindert werden könnte, daß die von der DNA transkribierte mRNA möglicherweise eine Sekundärstruktur, wie eine Haarnadelschleife usw. ausbildet. Daher wurde eine als sehr zweckmäßig angesehene DNA-Sequenz gewählt und mittels organochemischer Verfahren synthetisiert. Die organochemisch synthetisierte, hEGF-codierende Sequenz ist in Fig. 1 gezeigt.
ATG (entspricht Formylmethionin), das ein Translations- Startcodon darstellt, ist unmittelbar stromaufwärts der DNA- Sequenz&sub1; die den 53 Aminosäuren von hEGF entspricht, vorgesehen, und die Erkennungsstelle des Restriktonsenzyms EcoRI wird stromaufwärts von ATG als Linker zum Ligieren mit dem Plasmid pBR322 [Bolivar et al., Gene 2 (1977), 95] vorgesehen. Andererseits werden sowohl TAA als auch TAG, die Translations- Stopcodons darstellen, unmittelbar stromabwärts der DNA-Sequenz ligiert. Zum Ligieren mit dem Plasmid pBR322 wird weiterhin die Restriktionsschnittstelle BamHI vorgesehen.
Die DNA-Sequenz, die das so chemisch synthetisierte hEGF- Strukturgen enthält, wird in die durch Behandeln des Plasmids pBR322 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI zur Verfügung gestellten Schnittstellen inseriert, wobei das Plasmid pBREGF (4,8 Kilo Basenpaare (Kb), Fig. 7) erhalten wird. E.coli wird mit diesem Plasmid pBREGF transformiert, um die Gewinnung von großen Mengen des hEGF-Strukturgens in stabiler Weise zu ermöglichen.

Plasmidvektoren pTREBT1 und pTRLBT1:

Die Plasmidvektoren pTREBT1 und pTRLBT1 sind zur Expression von hEGF als Fusionsprotein befähigt und werden in der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen ersten und zweiten Ausführungsform verwendet. Diese Plasmidvektoren werden wie folgt konstruiert.
Ein etwa 500 Bp (Basenpaare) langes DNA-Fragment, das den Promotor/Operator, ein Tryptophan-Regulatorgen im Tryptophan- Operon von E.coli, das Gen für das trpL-Leaderpeptid-Gen und den 5'-Terminus des trpE-Gens (Anthranilat-Synthetase) enthält, wird in die EcoRI-Schnittstelle des Plasmids pBR322 inseriert, wobei der Expressionsvektor pTRE2 erhalten wird, der den Promotor/Operator (P/O), welcher ein Tryptophan-Regulatorgen ist, und ein den N-Terminus des trpE-Polypeptids (Fig. 11) codierendes Gen enthält. In dem Vektor pTRE2 ist der trp-Promotor in der gleichen Richtung ausgerichtet wie das Tcr (Tetracyclin- Resistenzgen) in pBR322. Der Vektor pTRE2 ist in solch einer Art und Weise modifiziert, daß die EcoRI-Schnittstelle stromaufwärts des trp-Promotors unter deren Beseitigung mit DNA- Polymerase aufgefüllt wird und daß stromabwärts des Promotors die einzige EcoRI-Schnittstelle vorhanden ist. In Fig. 3 ist eine DNA-Sequenz gezeigt, die den trp-Promotor/Operator, das trpL-Strukturgen und den 5'-Terminus des trpE-Strukturgens in dem Expressionsvektor pTRE2 enthält. Durch Inserieren eines fremden Gens in die EcoRI-Schnittstelle des Gens für das trpE- Polypeptid kann das fremde Gen als Fusionsprotein mit 8 Aminosäuren des N-Terminus des trpE-Polypeptids exprimiert werden. Nach Entfernen der Restriktionsschnittstelle für das Enzym RsaI am 5'-Terminus des Gens für das trpL-Peptid und der ges amten Sequenz stromabwärts dieser Schnittstelle in dem Vektor pTRE2 wird die Rsal-Schnittstelle in eine EcoRI-Schnittstelle umgewandelt, wobei der Expressionsvektor pTRL2 (Fig. 10) konstruiert wird. Der Expressionsvektor pTRL2 enthält den trp-Promotor/Operator, der ein Tryptophan-Regulatorgen ist, und das Gen, welches den N-Terminus des trpL-Polypeptids codiert.
In Fig. 2 ist eine DNA-Sequenz gezeigt, die den trp-Promotor/Operator und das Gen für den 5'-Terminus des trpL-Peptids in dem Expressionsvektor pTRL2 umfaßt. Durch Inserieren eines fremden Gens in die EcoRI-Schnittstelle des Gens für das trpL- Polypeptid kann das fremde Gen als Fusionsprotein mit 6 Aminosäuren des N-Terminus des trpL-Polypeptids exprimiert werden. Durch Inserieren der DNA-Sequenz, die das in Fig. 1 gezeigte hEGF-Gen enthält, in die EcoRI-Schnittstellen der vorstehend genannten Expressionsvektoren pTRE2 und pTRL2 können die Plasmidvektoren pTREBT1 (Fig. 11) bzw. pTRLBT1 (Fig. 10), welche zur Expression des hEGF-Gens befähigt sind, konstruiert werden. Der Plasmidvektor pTREBT1 enthält die durch Ligieren der folgenden DNA-Sequenz mit dem hEGF-Strukturgen erhaltene DNA- Sequenz:
ATGCAAACACAAAAACCGACT GGGGAATTCGGATCCAGGAAT CTAGAAATG
Der Plasmidvektor pTRLBT1 enthält die durch Ligieren der folgenden DNA-Sequenz mit dem hEGF-Strukturgen erhaltene DNA- Sequenz:
ATGAAAGCAATTTTCGTGGAA TTCGGATCCAGGAATCTAGAA ATG
Die so konstruierten Vektoren pTREBT1 und pTRLBT1 exprimieren hEGF als Fusionsproteine, wobei 17 bzw. 15 Aminosäuren, einschließlich der aus den Linkern translatierten Aminosäuren an den N-Terminus des hEGF-Polypeptids gebunden sind. Um das reife hEGF frei von überflüssigen Aminosäuren zu erhalten kann ein Verfahren angewendet werden, bei dem die überzähligen Aminosäuren durch Behandeln mit CNBr (Bromcyan) entfernt werden. Dabei wird bei Methionin (Met) gespalten. Da jedoch die 21. Aminosäure innerhalb hEGF Met ist, könnte diese Stelle ebenfalls gespalten werden. Es ist jedoch bekannt, daß dieses Met durch Behandeln mit CNBr nur unter Schwierigkeiten gespalten wird [H. Gregory und B.M. Preston: Int. J. Peptide Protein Res., 9 (1977), 107-118]. Es ist daher möglich, reifes hEGF unter zweckmäßig gewählten Behandlungsbedingungen zu erhalten.

Plasmidvektoren pTREBT2 und pTRLBT2:

Die Plasmidvektoren pTRLBT2 und pTREBT2 sind in der Lage hEGF als reifes Protein zu exprimieren und werden in den vorstehend beschriebenen dritten und vierten Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung eingesetzt. Diese Plasmidvektoren werden wie folgt konstruiert.
Der Plasmidvektor pTRLBT2 wird unter Verwendung des trp- Promotors/Operators und der Shine-Dalgarno-Sequenz (SD), die eine Translations-Regulatorregion des trpL-Polypeptids in dem Plasmidvektor pTRLBT1 darstellt, konstruiert. Das heißt, pTRLBT2 wird so konstruiert, daß folgende Anordnung entsteht:
der trp-Promotor/Operator, die SD-Sequenz von trpL stromabwärts des Promotors/Operators, das Methionin am N-Terminus des trpL- Polypeptids codierende genetische Codon (d. h. das Translations- Startcodon) unmittelbar stromabwärts der SD-Sequenz und anschließend das hEGF-Strukturgen, das direkt mit dem genetischen Codon ligiert ist. In der Praxis wird, wie in Fig. 12 gezeigt, die DNA-Sequenz, die den trp-Promotor/Operator, die SD-Sequenz, das ATG und einen Teil des hEGF-Strukturgens enthält (Fig. 8), chemisch synthetisiert. Der Plasmidvektor pTRLBT2 kann unter Verwendung dieser DNA-Sequenz konstruiert werden.
Der Plasmidvektor pTRLBT2 enthält die DNA-Sequenz, die durch Ligieren der folgenden DNA-Sequenz mit dem hEGF- Strukturgen erhalten wird:
TTAACTAGTACGCAAGTTCAC GTAAAAAGGGTATCGACAATG
Der Plasmidvektor pTREBT2 wird unter Verwendung des trp- Promotors/Operators, des Strukturgens für das trpL-Polypeptid und der SD-Sequenz von trpE des Plasmids pTREBT1 konstruiert. In der Praxis wird, wie in Fig 13. gezeigt, die DNA-Sequenz (Fig. 9), die den trp-Promotor/Operator, das Strukturgen für das trpL-Polypeptid, die SD-Sequenz von trpE, ATG und einen Teil des hEGF-Strukturgens enthält, chemisch synthetisiert. Der Plasmidvektor pTREBT2 kann unter Verwendung dieser DNA-Sequenz konstruiert werden.
Der Plasmidvektor pTREBT2 enthält die DNA-Sequenz, die durch Ligieren der folgenden DNA-Sequenz mit dem hEGF- Strukturgen erhalten wird:
TTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACAA TGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTGGTGGCGCACTTC CTGAAACGGGCAGTGTATTCACCATGCGTAAAGCAATCAG ATACCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAA AATTAAGAGAATAACAATG
Darüberhinaus kann ein Plasmid, das eine DNA-Sequenz enthält, die, in dieser Anordnung den trp-Promotor/Operator, die SD-Sequenz von trpE, ATG und das hEGF-Strukturgen umfaßt, ebenfalls gemäß vorstehender Beschreibung konstruiert werden. Dieser Plasmidvektor kann in dem vorstehend beschriebenen fünften Gesichtspunkt eingesetzt werden. Insbesondere kann der Plasmidvektor die DNA-Sequenz, die durch Ligieren der folgenden DNA- Sequenz mit dem hEGF-Strukturgen erhalten wird, enthalten:
AGAGAATAACAATG
Die vorstehend beschriebenen Plasmidvektoren können alle reifes hEGF-Polypeptid, an das keine überflüssigen Aminosäuren gebunden sind, exprimieren.

Expression des hEGF-Polypeptids in E.coli:

Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Plasmidvektoren pTREBT1, pTRLBT1, pTREBT2, pTRLBT2 usw. werden E.coli nach herkömmlichen Verfahren [Maniatis et al., Molecular cloning (1982), 249] transformiert, wobei rekombinante E.coli, die diese Plasmidvektoren enthalten, erhalten werden.
Die rekombinanten E.coli werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, wobei das hEGF-Polypeptid exprimiert wird. Das Züchten wird vorzugsweise in Gegenwart von 3-β-Indolylacrylsäure (IA) als die Expression induzierende Substanz durchgeführt. Es ist ferner bevorzugt, daß das Züchten in Tryptophan-freiem Medium durchgeführt wird.
Das so exprimierte hEGF-Protein wird in herkömmlicher Art und Weise gewonnen, wobei das gewünschte hEGF-Polypeptid erhalten wird.
Das hEGF-Strukturgen und die rekombinante DNA-Sequenz, sowie Plasmidvektoren, die diese enthalten, welche(s) hier vorstehend beschrieben wurde(n) sind nicht auf die hier explizit offenbarten beschränkt. Vielmehr sind Äquivalente des hEGF- Strukturgens, der rekombinanten DNA-Sequenz und der Plasmidvektoren, die in ähnlicher Art und Weise wirken, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit Bezug zu den Beispielen ausführlicher beschrieben, soll jedoch nicht auf diese beschränkt sein.

Beispiel 1

Die Konstruktion der DNA-Sequenz des hEGF-Strukturgens und seine chemische Synthese werden nachstehend beschrieben. Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von hEGF und die entsprechende DNA-Sequenz. Da die Aminosäuresequenz von hEGF durch H. Gregory et al. bestimmt wurde, kann ihr Strukturgen von der wohlbekannten Tabelle für genetische Codons von Aminosäuren abgeleitet werden. Ein genetisches Codon ist jedoch nicht definitiv bestimmt, da gewöhnlich degenerierte Codons existieren. Daher wurde für die jeweilige Aminosäure das genetische Codon ausgewählt, das in E.coli mit großer Häufigkeit auftritt, auf der Grundlage der Tabelle, die zeigt, mit welcher Häufigkeit ein genetisches Codon im jeweiligen Wirt vorkommt [Ikemura, Cell Engineering 2(13) (1983), 78-89). Mit Hilfe des so bestimmten Strukturgens aus 159 Nucleotiden wurde eine DNA-Sequenz aus 191 Nucleotiden, die Linker zu deren Klonierung in ein Plasmid und ein Translations-Stopcodon enthält, konstruiert. Eine derartig lange DNA-Sequenz, wie in Fig. 1 gezeigt, kann jedoch nicht auf einmal mittels einer Reihe von DNA- Kettenverlängerungsschritten (Fig. 5) gemäß der zur Synthese von DNA als zweckmäßig bekannten Phosphorsäuretriestermethode synthetisiert werden. D.h. trotz hypothetischer Ausbeute von 90% pro Verlängerung um ein Nucleotid würden 20 Wiederholungen eine Gesamtausbeute von 12% bedeuten, was die Reinigung schwierig machen würde. In der Praxis wurde die in Fig. 1 gezeigte langkettige doppelsträngige DNA in 28 einzelne Oligonucleotidblöcke (A-1 bis A-14 und B-1 bis B-14) unterteilt (siehe Fig. 4), wobei jeder Block durch die DNA-Kettenverlängerungsreaktion gemäß der Phosphotriestermethode synthetisiert wurde. Bei der Aufteilung in Blöcke wurde die DNA-Sequenz in jedem Block möglichst zweckentsprechend angeordnet, so daß keine unzweckmäßige Wechselwirkung innerhalb der Blöcke und zwischen den Blöcken erfolgt und sich kein Gen mit unerwünschter Struktur bildet.
Fig. 5 zeigt das Verfahren der Phosphotriestermethode, das Kondensationspolymerisierung eines Mononucleotids (a), das an Polystyrolharz gebunden ist mit einem anderen Mononucleotid (b) unter Bildung eines Dinucleotids (c) umfaßt. Zur Synthese eines Oligonucleotids aus n Nucleotiden kann dieses Verfahren (n-1) mal wiederholt werden. Die Reaktion wurde nach einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
Fig. 6 zeigt das Verfahren Rum Ligieren von in Blöcken vorliegenden Oligonucleotiden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase. Werden die 28 Blöcke auf einmal ligiert, besteht die Möglichkeit, daß unerwünschte Kombinationen auftreten. Daher wurde ein Zwei-Stufen Ligierungsverfahren entwickelt. Die Reaktion wurde nach einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
Das so, mittels organochemischer Methoden hergestellte hEGF-Gen wurde in den gespaltenen Teil des mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI gespaltenen Plasmids pBR322 inseriert, wobei das Plasmid pBREGF (4,18 Kilobasenpaare (Kb), Fig. 7), das das hEGF-Gen enthält, gebildet wurde. E.coli wurden mit dem so erhaltenen Plasmid transformiert, wobei das hEGF-Gen in großen Mengen stabil hergestellt werden konnte.

Beispiel 2

Die Konstruktion des Plasmids pTREBT1 ist nachfolgend beschrieben (Fig. 11).
Etwa 3 ug von pTRE2 und etwa 5 ug pBREGF wurden mit 56 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI und 60 Einheiten SalI gespalten und nachfolgend einer Agarose-Elektrophorese unterworfen. Ein 4,21 Kb (Kilobasenpaare) DNA-Fragment, das den trp-Promoter enthielt und das 0,47 Kb DNA-Fragment, das das hEGF-Gen enthielt, wurde aus pTRE2 bzw. pBREGF gewonnen. Nach Auflösen der gewonnenen DNA-Fragmente in TEN-Puffer (0,02 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,02 M NaCl, pH 8,0) wurde 1/3 der Menge der gewonnenen hEGF-DNA zu 1/6 der Menge der gewonnenen trp- Promotor-DNA gegeben. Die DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von 1500 Einheiten (20 ul im Ganzen) T&sub4;-DNA-Ligase miteinander ligiert. Der E.coli Stamm C600 wurde mit dem ligierten Plasmid transformiert, wobei zwei Tranformanten erhalten wurden. Die so erhaltenen Transformanten wurden gezüchtet, wobei das Plasmid pTREBT1 erhalten wurde. Der E.coli Stamm HB101 wurde mit dem so erhaltenen Plasmid pTREBT1 transformiert, wobei E.coli HB101 [pTREBT1] erhalten wurden, die das Plasmid pTREBT1 enthielten. Die rekombinanten E.coli wurden beim Fermentation Research Institute (FRI, in der Ibaragi Präfektur in Japan) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer FERM BP-2349.

Beispiel 3

Die Konstruktion des Plasmids pTRLBT1 wird nachstehend beschrieben (Fig. 10)
pBREGF wurde mit jeweils 16 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI und SalI gespalten und anschließend einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Als Folge wurde ein 0,47 Kb DNA-Fragment, das das hEGF-Gen enthielt, gewonnen. Nach Aufreinigen durch Phenol-Behandlung wurde die DNA in 20 ul DNA- Ligasepuffer (0,1 M Tris-HCl, 5 mM MgCl&sub2;, pH 7,6) gelöst. Andererseits wurde etwa 1 ug pTRL2 mit jeweils 8 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI und SalI geschnitten und nachfolgend mit 1,2 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Anschließend wurde die Phenol-Behandlung dreimal wiederholt und dann in 20 ul DNA-Ligasepuffer gelöst. Zu 5 ul der hEGF- DNA-Lösung wurden 2 ul der vorstehend beschriebenen pTRL2- Lösung und 30 ul der Lösung A und 5 ul der Lösung B des DNA- Ligierungs-Kits, hergestellt von Takara Shuzo Co. Ltd., gegeben, wobei das Gesamtvolumen auf 42 ul eingestellt wurde. Das Ligieren der DNA wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Der E.coli Stamm HB101 wurde mit dem so ligierten Plasmid transformiert, wobei mehr als 5000 Transformanten erhalten wurden. Die erhaltenen Transformanten wurden gezüchtet und das so erhaltene Plasmid wurde mit Restriktionsenzymen gespalten. Die Untersuchung der so erhaltenen DNA-Fragmente zeigt, daß das Plasmid das gewünschte pTRLBT1 ist. Folglich konnten E.coli HB101 [pTRLBT1], die das Plasmid pTRLBT1 enthielten, erhalten werden. Die rekombinanten E.coli wurden beim FRI gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-2348.

Beispiel 4

Die Herstellung von hEGF wird nachfolgend beschrieben.
E.coli HB101 [pTREBT1] bzw. E.coli HB101 [pTRLBT1] wurden zur Synthese von hEGF unter den folgenden Bedingungen gezüchtet.
Eine Platinöse des Vorratsstamms E.coli HB101 [pTREBT1] oder E.coli HB101 [pTRLBT1] wurde in 10 ml L-Medium (10 g Pepton, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl, 1 g Glucose, 50 mg Ampicillin, 1 Liter Wasser; pH 7,2) angeimpft und anschließend über Nacht bei 37ºC kultiviert. 1 ml der vorinkubierten Lösung wurde abgenommen und 1 Minute bei 15000 Upm zentrifugiert wobei die Zellen gewonnen wurden. Die Zellen wurden dann mit 1 ml M9-Medium (1 g NH&sub4;Cl, 6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g NaCl, 0,015 g CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 0,1 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 2,5 g Casaminosäure, 5 g Glucose, 0,1 g Thiamin, 50 mg Ampicillin, 1 Liter Wasser, pH 7,4) gewaschen. Die Zellen wurden in 1 ml M9-Medium resuspendiert. Mit der gesamten Menge wurden 10 ml M9-Medium angeimpft und nachfolgend 7 Stunden bei 37ºC inkubiert. Um die Expression des Gens zu induzieren, wurden nach einer Stunde Inkubation 15 ug/ml IAA (3-β-Indolylacrylsäure) zugesetzt. Nach Beendigung der Inkubation wurden die die Zellen gesammelt. Nach Waschen mit 2 ml 50 mM Tris-HCl Puffer, (pH 7,5) wurden die Zellen in 1 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Zu der Zellsuspension wurden 18 ul Phenylmethylsulfonylfluorid (in einer Konzentration von 10 mg/ml), 10 ul Lysozym (in einer Konzentration von 10 mg/ml) und 20 ul 0,25 mM EDTA zugesetzt. Nach Schütteln wurde das Gemisch 30 min. in Eiswasser stehen gelassen. Anschließend wurde die Suspension 3 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterzogen, wobei sie durchsichtig wurde. Der Lösung wurde 0,05 ml einer 8M Harnstofflösung zugesetzt. Nach einstündigem Schütteln bei 37ºC wurde das Gemisch 30 Minuten bei 30000 Upm zentrifugiert und die Ausfällungen wurden entfernt. Nachfolgend wurde dreimal gegen 50 mM Tris-HCl-Puffer dialysiert und das Dialysat für eine Radiorezeptor-Untersuchung (RRA) zur Verfügung gestellt.
Die RRA wurde wie folgt durchgeführt. Die hEGF-Aktivität wurde als Maus-EGF-Standardgewicht, das zum Erbringen der gleichen Aktivität erforderlich ist, angegeben. 0,1 ml markierter Maus-EGF oder 0,1 ml der Probe und 0,1 ml ¹³¹I-markierter Maus- EGF wurden zu 0,2 ml einer Maus-Mikrosomen-Fraktion gegeben. Nach Schütteln wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 90 Minuten umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten bei 4ºC und 60000 g zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes durch Absaugen wurde die Radioaktivität der Ausfällung gemessen. Die so gemessene hEGF-Aktivität pro ml der Kultur-Lösung ist in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Herstellung von hEGF in E.coli

E.coli hergestellte Menge (ng/ml)
HB101 [pTREBT1] 1100
HB101 [pTRLBT1] 900

Beispiel 5

Unter Verwendung von HB101 [pTREBT1] wurde eine Fed-batch- Kultur durchgeführt. Das Verfahren und die Ergebnisse sind nachfolgend gezeigt.
In einem kleinen Fermenter von 5 Litern wurden 1,8 l M9- Kulturmedium (das 1 g/l Glucose und 20 mg/l Tryptophan enthielt) vorgelegt und zum Starten der Kultur mit 200 ml der vorinkubierten Lösung angeimpft. Fed-batch-Medium (200 g Glucose, 100 g Casaminsäure, 0,1 g Ampicillin, 1 l Wasser; pH 7,0) wurde 1,5 Stunden, nachdem die Glucose aufgebraucht war, zugeführt, wobei die Acetat-Konzentration als Kennzeichen für die Zufuhr verwendet wurde. Das heißt, bei Ansteigen der Acetat- Konzentration der Kultur-Lösung über 2 g/l wurde die Zufuhrmenge vermindert und bei Sinken der Acetat-Konzentration auf 1 g/l oder weniger wurde die Zufuhrmenge erhöht. In der Folge konnten 8 Stunden nach Inkubation 6000 ng/ml hEGF produziert werden.

Beispiel 6

Die Herstellung eines DNA-Fragments zur Konstruktion der Plasmid-Vektoren pTRLBT2 und pTREBT2 werden nachstehend beschrieben.
Erfindungsgemäß wird die DNA-Sequenz der Linkerregion zuerst bestimmt, da sie zur Expression von reifem hEGF verwendet werden soll, wobei der von E.coli abgeleitete trp P/O und die die Translation regulierende Region (SD-Sequenz) von trpL oder trp P/O und die die Translation regulierende Region (SD Sequenz) von trpE verwendet werden. Das heißt, das Startcodon ATG des hEGF-Gens wird so angeordnet, daß es an der Startcodon-ATG- Stelle von trpL, unmittelbar stromabwärts von trp P/O liegt. Alternativ wird das Startcodon ATG so angeordnet, daß es an der Startcodon-ATG-Stelle von trpE liegt. Unter Verwendung der Schnittstelle des Restriktionsenzyms HinfI (Fig. 1) am 15ten Nucleotid ausgehend vom ATG des hEGF-Gens wurden, um das bereits chemisch synthetisierte hEGF-Gen, das in das Plasmid pBREGF cloniert worden war, in den richtigen Leseraster zu bringen, ein 50 Bp DNA-Fragment von der Hpal-Schnittstelle stromaufwärts vom trp P/O bis zur HinfI-Schnittstelle in dem hEGF-Gen und ein 186 Bp DNA-Fragment (C1-C8) synthetisiert. DNA-Sequenzen dieser Fragmente sind in den Fig. 8 und 9 gezeigt. Organochemische Syntheseverfahren wurden ähnlich wie im Fall des hEGF-Gens durchgeführt.

Beispiel 7

Die Konstruktion des Plasmids pTRLBT2 wird nachstehend mit Bezug zu Fig. 12 erläutert.
Nachdem etwa 30 ug pTRLBT1 mit den Restriktionsenzymen HpaI und SphI geschnitten worden waren, wurde eine 0,8% Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, wobei ein 4 Kb DNA-Fragment isoliert wurde und ein 570 Bp Hpal/Sphl-Fragment, das das hEGF- Gen, das zur Konstruktion des Vektors pTRLBT2 verwendet werden soll, enthielt. Nach weiterem Spalten des letztgenannten Fragmentes mit dem Restriktionsenzym HinfI wurde eine 6% Acrylamid- Gelektrophorese durchgeführt, wobei ein 340 Bp langes HinfI/SphI-Fragment, das den größten Teil des hEGF-Gens enthielt, erhalten wurde.
Andererseits wurde ein 50 Bp HpaI/HinfI-Fragment (Fig. 8), das den trp P/O, das die Translation regulierende Gen von trpL und genetische Codons, die 3 Aminosäuren am N-Terminus von hEGF entsprechen, enthielt, mittels Elektrophorese auf einem 8 M Harnstoff enthaltenden, 20%igen Acrylamidgel gereinigt. Nach Gewinnen aus dem Gel wurde das Fragment in DNA-Ligasepuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl&sub2;] gelöst. Die Lösung wurde einmal auf 70ºC erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, wobei das Annealen vollzogen wurde.
Anschließend wurden 300 ng des vorstehend genannten 340 Bp Fragmentes und 100 ng des 50 Bp Fragmentes in dem Reaktionspuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl&sub2;] gelöst und unter Verwendung von 700 Einheiten T&sub4;-Ligase miteinander ligiert. Um das an der SphI-Schnittstelle mit sich selbst ligierte DNA- Fragment zu entfernen, wurde die DNA-Lösung zur Inaktivierung der T&sub4; DNA-Ligase mit Phenol behandelt. Nach erneutem Spalten mit dem Restriktionsenzym SphI wurde eine Elektrophorese auf einem 5%igen Acrylamidgel durchgeführt. Auf diese Weise wurde ein 390 Bp HpaI/SphI-Fragment, das den trp P/O und das gesamte hEGF Gen beginnend mit dem ATG enthielt, erhalten.
Anschließend wurde T&sub4;-Polynucleotidkinase mit diesem Fragment umgesetzt, wobei die Hpal-Schnittstelle phosphoryliert wurde, die dann in einen Vektor kloniert werden konnte. Das phosphorylierte Fragment wurde dann mit 400 ng des Vektors (4Kb), der gemäß dem vorstehenden Herstellungsverfahren hergestellt wurde, ligiert, wobei 500 Einheiten T&sub4; DNA-Ligase verwendet wurden. E.coli HB101 wurden mit dem so erhaltenen DNA- Gemisch transformiert, wobei E.coli HB101 [pTRLBT2] erhalten wurden, die das Plasmid pTRLBT2 enthalten, die gemäß dem Budapester Vertrag beim FRI hinterlegt wurden und die Hinterlegungsnummer FERM BP-2351 erhielten.

Beispiel 8

Die Konstruktion des Plasmids pTREBT2, eines Vektors, der in der Lage ist, reifen hEGF (Fig. 13) zu exprimieren, wird nachstehend beschrieben. Zuerst wurde ein 340 Bp HinfI/SphI- Fragment, das den größten Teil des hEGF-Gens enthält, gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren erhalten.
Andererseits wurde ein 186 Bp HpaI/HinfI-Fragment (Fig. 9), das den trp P/O, das trpL-Strukturgen und das die Translation regulierende Gen von trpE und genetische Codons für 3 Aminosäuren am N-Terminus von hEGF enthält, mittels Elektrophorese auf einem 8 M Harnstoff enthaltenden 20%igen Acrylamidgel aufgereinigt. Nach Gewinnen aus dem Gel wurde das Fragment in DNA- Ligasepuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl&sub2;] gelöst. Die Lösung wurde einmal auf 70ºC erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, wobei das Annealen bewirkt wurde. Anschließend wurden 300 ng des vorstehend genannten 340 Bp Fragmentes und 300 ng des vorstehend genannten 186 Bp Fragmentes in dem Reaktionspuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl&sub2;] gelöst und unter Verwendung von 700 Einheiten T&sub4; DNA- Ligase miteinander ligiert. Um das an der SphI-Schnittstelle mit sich selbst ligierte DNA-Fragment zu entfernen wurde die DNA-Lösung zur Inaktivierung der T&sub4; DNA-Ligase mit Phenol behandelt. Mit dem Restriktionsenzym SphI wurde erneut gespalten und dann eine 5% Acrylamid-Gelektrophorese durchgeführt. Auf diese Weise wurde ein 526 Bp HpaI/SphI-Fragment, das den trp P/O und das gesamte hEGF Gen beginnend mit dem ATG enthielt, erhalten.
Anschließend wurde dieses Fragment mit T&sub4; Polynucleotidkinase umgesetzt, wobei die HpaI-Schnittstelle phosphoryliert wurde, und dann in einen Vektor kloniert werden konnte. Das phophorylierte Fragment wurde dann unter Verwendung von 500 Einheiten T&sub4; DNA-Ligase mit 400 ng des in Beispiel 7 hergestellten Vektors (4 Kb) ligiert. E.coli HB101 wurden mit dem so erhaltenen DNA-Gemisch transformiert, wobei E.coli HB101 [pTREBT2] erhalten wurden, die das Plasmid pTREBT2 enthalten, die gemäß dem Budapester Vertrag unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2350 hinterlegt wurden.

Beispiel 9

Die Herstellung von hEGF in E.coli wird nachstehend beschrieben.
Eine Platinöse des Vorratsstammes E.coli HB101 [pTRLBT2] oder HB101 [pTREBT2] wurde in 3 ml M9 Medium (1 g NH&sub4;Cl, 6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g NaCl, 0,015 g CaCl&sub2;·H&sub2;O, 0,1 g MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 2,5 g Casaminosäure, 5 g Glucose, 0,1 g Thiamin, 1 g Prolin, 50 mg Ampicillin, 1 l Wasser, pH 7,4) angeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 37ºC kultiviert. Anschließend wurden 38 ml M9 Medium der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung mit 2 ml der Kulturlösung angeimpft und 4 Stunden bei 37ºC unter Schütteln kultiviert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Zellen gesammelt, mit 2 ml 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5) gewaschen und in 1 ml des gleichen Puffers suspendiert. Der Zellsuspension wurden 18 ul Phenylmethylsulfonylfluorid in einer Konzentration von 10 mg/ml, 10 ul Lysozym in einer Konzentration von 10 mg/ml und 20 ul 250 mM EDTA zugesetzt. Nach Schütteln wurde das Gemisch 30 Minuten in Eiswasser gehalten. Anschließend wurde die Suspension 3 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterworfen, wobei die Zellen homogenisiert wurden. Anschließend wurden 960 mg Harnstoff und etwa 0,7 ml 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5) zugesetzt, wobei das Volumen auf insgesamt 2 ml aufgefüllt wurde. Nach einstündigem Schütteln bei 37ºC wurde das Gemisch 30 Minuten bei 70000 g zentrifugiert und die Ausfällungen wurden entfernt. Der Überstand, der das denaturierte Protein enthielt, wurde anschließend zur Entfernung des Harnstoffes 3 mal gegen 50 mM Tris-HCl Puffer dialysiert und dann als Probe für eine Radiorezeptoruntersuchung (RRA) verwendet.
Die RRA wurde wie folgt durchgeführt.
Zu 0,2 ml Maus-Leber-Mikrosomenfragmenten wurde 0,1 ml Standard EGF oder 0,1 ml einer Probe und 0,1 ml mit ¹³¹I markierter Maus-EGF gegeben. Nach Schütteln wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 90 Minuten zur vollständigen kompetitiven Bindungsreaktion des Standard EGF oder der Probe mit dem mit ¹³¹I markierten Maus-EGF am EGF-Rezeptor umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei 4ºC 5 Minuten bei 6000 g zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes durch Absaugen wurde die Radioaktivität des an den Rezeptor gebundenen, mit ¹³¹I markierten Maus-EGF in der Ausfällung gemessen, wobei hEGF in der Probe quantitativ bestimmt wurde. Die Differenz der spezifischen Aktivität zwischen dem Maus-EGF und hEGF wurde berichtigt. Die hEGF-Aktivität pro 1 ml der Kulturlösung HB101 [pTRLBT2] und HB101 [pTREBT2] betrug jeweils 24 ng.
Obwohl die Erfindung ausführlich und in Bezug auf deren spezifische Ausführungsformen beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von dem Prinzip und Bereich der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von humanem Epidermis- Wachstumsfaktor, umfassend

Züchten von recombinantem E.coli, welches einen Plasmidvektor enthält, der eine recombinante DNA-Sequenz beinhaltet, die ein Tryptophan-Regulatorgen, ein den N-terminalen Bereich des trpL-Polypeptids in dem Tryptophan-Operon stromabwärts des Regulatorgens codierendes Gen und ein durch die Formel (I) dargestelltes, 53 Aminosäuren des humanen Epidermis-Wachstumsfaktor codierendes Gen, das mit dem den N-terminalen Bereich codierenden Gen durch einen Linker verknüpft ist, umfaßt, und

Gewinnen des so exprimierten, humanen Epidermis- Wachstumsfaktors.

Formel (I)

2. Verfahren zur Herstellung von humanem Epidermis- Wachstumsfaktor nach Anspruch 1, umfassend

Züchten von recombinantem E.coli, welches einen Plasmidvektor enthält, der eine recombinante DNA-Sequenz beinhaltet,

die ein Tryptophan-Regulatorgen, ein den N-terminalen Bereich des trpE-Polypeptids in dem Tryptophan-Operon stromabwärts des Regulatorgens codierendes Gen und ein durch die Formel (I) dargestelltes, 53 Aminosäuren des humanen Epidermis-Wachstumsfaktor codierendes Gen, das mit dem den N-terminalen Bereich codierenden Gen durch einen Linker verknüpft ist, umfaßt, und

Gewinnen des so exprimierten, humanen Epidermis- Wachstumsfaktors.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das recombinante E.coli in Anwesenheit von 3-β-Indolylacrylsäure (IAA) gezüchtet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das recombinante E.coli in einem Tryptophan-freien Medium gezüchtet wird.

5. DNA-Sequenz, die ein den N-terminalen Bereich des trpL-Polypeptids codierendes Gen umfaßt, das mit einem durch die Formel (I) dargestellten Gen durch einen Linker verknüpft ist.

6. DNA-Sequenz, die ein den N-terminalen Bereich des trpE-Polypeptids codierendes Gen umfaßt, das mit einem durch die Formel (I) dargestellten Gen durch einen Linker verknüpft ist.

7. DNA-Sequenz nach Anspruch 5, worin eine nachstehend beschriebene DNA-Sequenz mit einem Gen der Formel (I) ligiert ist.

ATGAAAGCAATTTTCGTGGAA TTCGGATCCAGGAATCTAGAA ATG

8. DNA-Sequenz nach Anspruch 6, worin eine nachstehend beschriebene DNA-Sequenz mit einem Gen der Formel (I) verknüpft ist.

ATGCAAACACAAAAACCGACT GGGGAATTCGGATCCAGGAAT CTAGAAATG

9. Plasmidvektor, der ein Tryptophan-Regulatorgen und eine recombinante DNA nach Anspruch 5 enthält.

10. Plasmidvektor, der ein Tryptophan-Regulatorgen und eine recombinante DNA nach Anspruch 6 enthält.

11. Plasmidvektor nach Anspruch 9, der pTRLBT1 (FERM BP-2348) ist.

12. Plasmidvektor nach Anspruch 10, der pTREBT1 (FRM BP-2349) ist.

13. Recombinantes E.coli, das einen Plasmidvektor gemäß den Ansprüchen 9 oder 10 enthält.

14. Recombinantes E.coli nach Anspruch 13, das [FERM BP 2348] ist.

15. Recombinantes E.coli nach Anspruch 13, das [FERN BP 2349] ist.