DD212532A5 - Verfahren zur stabilisierung und selektion von wirtszellen, die rekombinierende dna enthalten - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Stabilisierung und Selektion von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten und Verfahren zur Herstellung von Plasmiden. Beschrieben wird ein Verfahren zur Stabilisierung und Selektion von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten, welche ein funktionelles Polypeptid exprimiert, das darin besteht, dass man a) die Wirtszellen mit einem rekombinierenden DNA Klonierungsvektor, der das den Pstl-Hincl cl Repressor enthaltene Restriktionsfragment des Bakteriophagen Lambda und ein Gen enthaelt, das ein funktionelles Polypeptid exprimiert, transformiert und b) die transformierten Wirtszellen nit einem lysogenen Organismus lysogenisiert, der einen Marker enthaelt, der in den Wirtszellen letal oder bedingt letal ist, in den transformierten Wirtszellen jedoch durch Repressorgen, das im rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthalten ist,repriniert wird.

Description

Aktenzeichen: »AP C12 N/245 256/7 · X-5739

Anmelder:

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A.

.

Vertreter:

Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Stabilisierung und Selektion von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein selektives System, das Mittel zur Stabilisierung und Selektion rekombinierender DNA-Wirtszellen durch Verwendung eines letalen chromosomalen Markers schafft, der durch ein an einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor geborenes Gen reprimiert wird. Dies ist besonders wichtig, weil rekombinierende DNA-Klonierungsvektoren, wie Plasmide, von Bakterienpopulationen oft rasch verloren gehen und großtechnische Fermentationen mehr als 10 Zellgenerationen erfordern können. Ist die rekombinierende DNA, die für das gewünschte.

Produkt codiert, daher einmal in ein Plasmid inseriert, dann ist es wünschenswert, wenn nicht sogar notwendig, daß die das Plasmid enthaltende Mikroorganismenkultur so stabilisiert wird, daß all die Zellen, die die Kultur bilden, das gewünschte Plasmid enthalten. Dies ist kritisch, weil rekombinierende Plasmide mit fremder DNA notorisch instabil sind und oft mehr als 90 % der Zellen in einer Population das rekombinierende Plasmid nicht enthalten können, nachdem eine Kultur über Nacht gewachsen ist. Eine Expression der gewünschten Gene ist jedoch nur in denjenigen Zellen möglich, die das rekombinierende Plasmid noch enthalten, so daß sich im soeben erwähnten Fall das Produktionsvermögen ganz wesentlich verringert.

Ziel der Erfindung:

Wirtszellen, die rekombinierende'DNA enthalten, lassen sich nun bisher unter Anwendung der bekannten Methoden leider nicht genügend stabilisieren, und Ziel der Erffindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Stabilisierung und auch Selektion von Wirtszellen, welche rekombinierende DNA enthalten, so daß sich eine entsprechende Kultur mit hoher und praktisch gleichbleibender. Produktionskapazität ergibt. 10

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Stabilisierung und Selektion von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten, welche ein funktionelles Polypeptid exprimiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a5 die Wirtszellen mit einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor, der das den Pstl-Hind el Repressor enthaltende Restriktionsfragment des Bakteriophagen λ. und ein Gen enthält, das ein funktionelles Polypeptid exprimiert,. transformiert und

b) die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus lysogenisiert, der einen Marker enthält, der in den Wirtszellen letal oder bedingt letal ist, in den transformierten Wirtszellen jedoch durch das Repressorgen, das im rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthalten ist, reprimiert wird,

mit der Maßgabe, daß der rekombinierende DNA-Klonierungsvektor ein Replikon und einen Promotor enthält, die gegenüber dem Repressor nicht sensitiv sind,, und mit der weiteren Maßgabe, daß, falls die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus, der ein Gen enthält, welches bedingt letal-ist, lysogenisiert werden, die erhaltenen Wirtszellen uann unter restriktiven Bedingungen gezüchtet werden- .

Es sind bisher nur sehr wenig wirksame Methoden zur Stabilisierung rekombinierender Plasmide beschrieben worden, und all diese Methoden haben ernsthafte Nachteile. Eine dieser bekannten Methoden besteht im Einbau antibiotikumresistenter Gene in rekombinierende Plasmide und in einem anschließenden Zusatz des jeweiligen Antibiotikums zum.

Kulturmedium- Die Zellen, welche das Plasmid mit dem antibiotikurnresistenten Gen beibehalten, werden als geeignet ausgewählt, während diejenigen Zellen, die das Plasmid verlieren, als ungeeignet ausgewählt und daher eliminiert werden. Diese Methode hat jedoch den Nachteil, daß man hierzu die antibiotikumresistenten Bakterien in einem großtechnischen Maßstab wachsen lassen muß, im Fermentationsmedium ein teures Antibiotikum braucht und eine abschließende Reinigung zur Entfernung des Antibiotikums vom gewünschten Produkt erforderlich ist.

Eine weitere bekannte Methode zur Stabilisierung rekombinierender Plasmide besteht in einer Komplementierung einer auxotropen Mutation am Chromosom. Bei dieser Methode sind der Zusammensetzung des Fermentationsmediums enge Grenzen gesetzt, wobei zudem eine Fermentation in einem Medium erforderlich ist, das die für die Wirtsbakterien erförderlichen Nährstoffe nicht enthält. Infolge von Syntropie kann es ferner auch dazu kommen, daß Zellen nach Verlust des Plasmids noch weiter wachsen. Beide Selek- .

tionsarten sind somit abhängig von einer besonderen Mani-. pulation der Medien. Dies führt zu einer Erhöhung der Kosten der Fermentation und einer Begrenzung der zur Verbesserung der Produktivität verfügbaren Möglichkeiten.

Die bekannten Selektionsmethoden haben obigen Angaben zufolge die verschiedensten Nachteile. Es besteht daher der dringende Bedarf an anderen Selektionsmethoden,, die von

der Zusammensetzung der Medien unabhängig sind, die Aufrechterhaltung des rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors unter allen Fermentationsbedingungen erlauben und eine verbesserte Biosynthese eines Polypeptidprodukts ermöglichen. Diesem Bedarf kann durch geeignete Anpassung des sogenannten Zellsuizids entsprochen werden, da sich suizide Zellen aufbauen lassen, die einen letalen Marker an einem Chromosom und einen Repressor oder ein komplementierendes Gen an einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthalten. Derart aufgebaute Zellen sterben ab, wenn sie den Vektor verlieren. Dieses Prinzip wird durch das erfindungsgemäße Verfahren nun verbessert, indem nicht nur sichergestellt wird, daß praktisch alle lebenden Zellen in einer Kultur den gewünschten rekombinierenden Klonierungsvektor enthalten, sondern daß auch die Expression von Genen, die im Klonierungsvektor enthalten sind, verbessert wird.

Die verbesserte Expression von Produktgenen und ferner auch das Fehlen von Plasmidsegregation stellen besondere Vorteile dar und dienen zur Unterscheidung der Erfindung von anderen selektiven Systemen, die ebenfalls Gebrauch machen vom Bakteriophagrepressor A. el. Es wurde demnach nun ein selektives System aus Klonierungsvektoren gefunden, das sowohl das cl_ Repressorgen, welches das ~2,5 kb BgIII Restriktionsfragment des Bakteriophagen A- enthält, als auch ein Gen enthält, das ein funktionelles Polypeptid exprimiert. Hierbei wird zwar das Gen exprimiert, das für das funktioneile Polypeptid codiert, doch zeigt der

^ darin beschriebene besondere Plasmidaufbau eine gewisse Segregation und ermöglicht- ferner auch keine verbesserte und optimale Bildung an gewünschtem Produkt. Diese Probleme werden lediglich durch das erfindungsgemäße verbesserte Verfahren gelöst, durch das sich rekombinierende DNA ent-

^OJ haltende Wirtszellen sowohl hervorragend stabilisieren und selektieren lassen, als auch gleichzeitig die Genexpression und Biosynthese eines funktionellen Polypeptids maximal gestalten läßt.

Unter einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor wird vorliegend jedes Mittel unter Einschluß von Plasmiden, Bakteriophagen und Viren verstanden, das aus einem DNA-iMolekül besteht, an welches ein oder mehr weitere DNA-Segmente gebunden sein, können.

Unter Transformation ist die Einführung von DNA in eine Rezipientenwirtszelle zu verstehen, die den Genotyp verändert und somit zu einer vererbbaren Veränderung in der RezipientenzelIe führt.

Ein Transformant stellt eine Rezipientenzelle dar, die eine Transformation erfahren hat.' '

T5 Ein Repressor ist ein Gen, das sich an einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor befindet und das eine Expression eines letalen oder bedingt letalen Gens in einem Chromosom einer Wirtszelle reprimiert und verhindert.

Unter einem funktioneilen Polypeptid versteht man ein gewinnbares bioaktives vollständig heterologes Polypeptid oder einen entsprechenden Vorläufer, ein gewinnbares bioaktives Polypeptid aus einem heterologen Polypeptid und einem Teil oder Gesamten eines homologen Polypeptids, ein gewinnbares bioaktives Fusionspolypeptid aus einem heterologen Polypeptid und einem bioinaktivierenden homologen Polypeptid, das spezifisch gespalten werden kann, oder ein bioaktives Polypeptid, dessen Anwesenheit feststellbar ist.

Ein verschmolzenes Genprodukt'ist. ein gewinnbares heterologes Polypeptid, das mit einem Teil oder Gesamten eines homologen Polypeptids verschmolzen ist.

Unter einem Marker versteht man ein Gen oder eine Kombination aus Genen bekannter Funktion und Stellung in einem Chromosom, einem rekombinierenden· DNA-Klonierungsvektor oder einem Virus.

Mit der Abkürzung Ap~ wird der ampicillinresistente Phenotyp bezeichnet.

Mit der Abkürzung Ap ist der ampicillinsensitive Phenotyp gemeint.

Unter der Abkürzung Tc^r wird der tetracyclinresistente Phenotyp verstanden.

"IO Mit der Abkürzung Tc^s ist der tetracyclinsensitive Phenotyp. gemeint.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann, wie bereits oben erwähnt, angewandt werden zum Wachsenlassen von Kulturen, die Produkte produzieren, welche von rekombinierender DNA codiert werden. Ohne ein wirksames selektives System verlieren viele Zellen in einer solchen Kultur das gewünschte Plasmid, wodurch sich, die Bildung des gewünschten Produkts wesentlich reduziert. Durch die Erfindung wird nicht nur sichergestellt, daß praktisch alle lebenden Zellen in einer. Kultur den rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor tragen, sondern es wird hierdurch auch die Genexpression derart verbessert, daß hierdurch durch Biosynthese größere Mengen eines funktioneilen Polypeptids gebildet werden. Im Vergleich zu den bekannten Verfahren kommt es beim erfindungsgemäßen Verfahren daher zu keiner Plasmidsegiegation, wobei das Ausmaß der Genexpression zudem verbessert ist und auch wesentlich höhere Mengen an funktionellem Poly- peptid gebildet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich auch durch eine besondere Vielseitigkeit aus, da es sich auf die Bildung irgendeiner Substanz anwenden läßt, deren Synthese von einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor bestimmt wird. Ein bevorzugter rekombinierender DNA-Klonierungsvektor ist das Plasmid, obwohl sich natürlich auch Bakteriophagen und sonstige Vektoren erfindungsgemäß eignen. Die Erfindung ist unabhängig von den Genen, die ein funktio-

nelles Polypeptid exprimieren, so daß sie sich auf rekombinierende Stämme anwenden läßt, die ein oder mehrere großtechnisch bedeutende Gene enthalten. Die bereits beschriebene Verbesserung der Genexpression ist weiter auch nicht auf irgendein bestimmtes Produktgen beschränkt. Das erfindungsgemäße verbesserte Verfahren eignet sich daher zur Herstellung irgendeines funktionellen Pölypeptids oder sonstigen Genprodukts unter Verwendung rekombinierender DNA.

Die.Anwendbarkeit des Zellsuizids zur Aufrechterhaltung, und Stabilisierung rekombinierender DNA-Wirtszellen wird anhand der Wechselwirkung zwischen dem Bakteriophag λ. und Escherichia coli K12 beschrieben. Das Bakteriophag Λ.

ist ein abgeschwächtes Bakteriophag, das bei der Infizierung von Escherichia coli K12 einem von zwei sich gegenseitig ausschließenden Zyklen folgt. In der lytischen Phase repliziert sich das Bakteriophag DNA autonom, lenkt die Synthese und Anordnung der Bakteriophagkomponenten und tötet die Zellen zugleich mit der Freisetzung von reifem Bakteriophag ab. In der lysogenen Phase ist das Bakteriophag in das Chromosom des Wirts als Prophag integriert, repliziert sich als Marker am Chromosom und blockiert eine Synthese der Bakteriophagkomponenten. Ein Bakteriophaggen, nämlich XcI, codiert für einen Repressor, der den lysogenen Zustand aufrechterhält und eine Expression von Genen für Bakteriophagkomponenten und eine Reifung blockiert. Wird der Repressor inaktiviert oder von der Zelle entfernt, dann tritt das Prophag aus dem Chromosom aus, geht in den lytischen Zyklus über und tötet die Zelle. Ein Bakteriophag mit einem schadhaften Gen XcI kann den lysogenen Zustand nicht aufrechterhalten und ist für die Zelle letal, sofern nicht von einer anderen Quelle für einen funktionellen Repressor gesorgt wird.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird X cI90 als repressorabhangiges Prophag und als funktioneller Repressor ein Gen c_I verwendet, das in einem Restriktionsfragment enthalten und in einen rekombinierenden DNA-Klo-

•-Ti D 9 " 5 β O ^> ° -> ? * *

- 8 ' nierungsvektor geklont ist.

Das verbesserte selektive System und die Brauchbarkeit der Erfindung lassen sich vor allem durch Klonierung des Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1 ^1.3 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragments, das das trpE-Insulin A Kettengen enthält, auf das neue Plasmid pPRl2 zeigen. Diese Klonierung wird so durchgeführt, daß es hierdurch zu einer Auslöschung des Plasmid pPRl2 ~0.4 kb EcoRI-BamHI Segments kommt, Das Plasmid

"Ό pPRl2 ist allgemein als Vektor brauchbar, weil anstelle des Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ ~>1.3 kb Restriktionsfragments jedes gewünschte DNA-Fragment verwendet werden kann. Das Plasmid. pPRl 2 wird aufgebaut durch Insertion des Plasmid pPR3 ^ 0.9 kb Pstl-HincII Restriktionsfragments, das den Bakterio-

'5 phag λ£ΐ857 Repressor enthält, in das Plasmid pBR3.22. Das Plasmid pPR3 wird aufgebaut durch Insertion des 2.5 kb BgIII Fragments des Bakteriophagen XcI857 in die alleinige BamHI Restriktionsstelle des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ. Das 2.5 kb BgIII Restriktionsfragment des Bakteriophagen λ£ΐ857 ent-

hält zusätzlich zum Repressorgen el auch noch das rex-Gen und einen Teil des cro-Gens. Die Auslöschung des cro-Gens und des Großteils des rex-Gens vom Restriktionsfragment, das das el-Repressorgen.enthält, führt überraschenderweise zu einer starken Erhöhung und Verbesserung der Genexpression und somit der Bildung an funktionellem Polypeptid. Ein besonders bevorzugtes XcI enthaltendes Restriktionsfragment mit ausgelöschtem cro-Gen und rex-Gen, das vorliegend zur Erläuterung der Erfindung verwendet wird, ist das "-Ό.9 kb Pstl-HincII Restriktionsfragment des Plas-

mids pPR3. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für die Plasmide ρΙΑ7Δ4/Μ, ρΙΒ7Δ4Δ.1, pPR3 und pPRl2 gehen im einzelnen aus den Fig. 1 bis 4 der Zeichnung hervor.

Das hierin ebenfalls beschriebene Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ ent--

hält den Escherichia coli-Tryptophanpromotor, Antibiotikumresistenzmarker und ein Gen, das ein verschmolzenes Genprodukt exprimiert, welches besteht aus einem Teil des Escherichia coli trp Ε-Proteins in Verschmelzung mit der

— ΟΙ A Polypeptidkette von Humaninsulin. Das Plasmid ρΙΒ7Δ.4Δΐ ist ähnlich aufgebaut, mit der Ausnahme, daß das Gen, das das verschmolzene Genprodukt exprimiert, aus einem Teil des trp Ε-Proteins in Verschmelzung mit der B-Polypeptidkette von Humaninsulin anstelle der A-Polypeptidkette von Humaninsulin besteht.

Das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ ist vom Plasmid pBR322 abgeleitet, und sein Aufbau erfolgt nach dein in Beispiel IA-I beschriebenen Verfahren. Mit dem Symbol "Δ" wird der üblichen Ausdrucksweise entsprechend eine Auslöschung bezeichnet. Die Bezugnahme auf ein Plasmid mit anschließender Anführung von 'AEcoRI-Xbal" beschreibt daher beispielsweise das Plasmid, von .welchem die Nucleotidsequenz zwischen den Restriktionsenzymstellen EcoRI und Xbal durch Verdauung mit diesen Enzymen entfernt worden ist.. Der Einfachheit halber werden bestimmte Auslöschungen auch durch Zahlen angegeben. Beginnend vom ersten Basenpaar (bp) der EcoRI-Erkennungsstelle, die dem Gen für die Tetracyclinresistenz im Stammplasmid pBR3 22 vorangeht, beinhaltet das Symbol

Δι daher eine Auslöschung von bp 1-30 (nämlich vonAEcoRI-Hindlll) und somit eine Außerkraftsetzung des Tetracyclinpromotor/Operatorsystems, das Symbol Δ2 eine Auslöschung - ·-· von bp 1-375 (nämlich AEcoRI-BamHI) und somit eine Entfernung von sowohl dem Tetracyclinpromotor/Operatorsystem als auch einem Teil des Strukturgens, das den Code für die Tetracyclinresistenz trägt, und das Symbol Δ4 eine Auslöschung von bp ^900 bis ^1500 vom trp Operonfragment unter Eliminierung des Strukturgens für das trp D Polypeptid.

Die Klonierung des Restriktionsfragments des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ, das das ^1.3 kb EcoRI-BamHI trp Ε-Insulin A-Kettengen enthält, in das --4.7 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pPR12, welches im folgenden als pPRl2A2 bezeichnet wird, führt zum neuen Plasmid pPRl7. Das Plasmid ρΙΑ7Δ4 Δ1 --^1.3 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragment enthält einen Teil von Δ 2, so daß dieser Aufbau

-ιοί von Δ2 zu ΔΙ führt. Das Plasmid pPRl7 enthält das ^0.9 kb Pstl-HincII Restriktionsfragment des Bakteriophags A-CI857 und blockiert daher die lytische Entwicklung des Bakteriophags TL in lysogenisierten Wirtszellen. Darüber hinaus ergibt das Plasmid pPR17 eine Codierung und Expression des oben erwähnten verschmolzenen Genprodukts trp E-Insulin A Kette in Mengen, die wesentlich über den Mengen liegen, die von anderen das Gen X₁Cl enthaltenden bekannten Plasmiden gebildet werden. Ein Restriktionsstellenplan und ein Funktionsplan für das Plasmid pPRl7 geht aus Fig, 5 der Zeichnung hervor.

Das neue rekombinierende Plasmid pPRl7 kann in Escherichia coli transformiert werden, beispielsweise in Escherichia coli K12 294 (Proc. Nat. Acad. Sei, U.S.A. 76: 106 (1979)), Escherichia coli K12 RV 308 ( J. Mol. Biol. 139:147 bis 161 (1980)), Escherichia coli Kl2 C600 (Bacteriol. Rev. 36: 526 bis 557 (1972)) oder Escherichia coli K12 C600R, M, (Proc. Nat. Acad. Sei. 71: 1030 bis 1034 (.1974)), und die erhaltenen Stämme lassen sich dann mit irgendeinem Bakteriophag Λ, lysogenisieren, das keinen funktioneilen c_I Represser bildet, wie beispielsweise das Bakteriophag X_cI90. Die aufgebauten Stämme Escherichia coli K12 294 XcI90/pPRl7, Escherichia coli Kl 2 RV308 ,lcI90/pPrl7, Escherichia coli K12 C600\cI90/pPrl7 und Escherichia coli K12· C600R, -M, -XcI90/pPRl7 erfordern daher eine Beibehaltung des Plasmids pPR17, während die aufgebauten Stämme Escherichia coli K12 294/pPRl7, Escherichia coli K12 RV308/ pPRl7, Escherichia coli K12 C600/pPR17 und Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pPRl7 gleich gut ohne dieses Plasmid überleben. Ein Vergleich der Plasmidretention in den Stämmen macht deutlich, daß praktisch alle lebenden Zellen in den erfindungsgemäßen Stämmen das gewünschte Plasmid haben. Die Stämme Escherichia coli Kl 2 2 9 4_XcI9 0/pPRl7, Escherichia coli K12 RV308_AcI9 0/pPRl7, Escherichia coli .Kl 2 C600Xcl90/pPRl7 und Escherichia coli -K12 C600R, -M, -XcI90/ pPRl7 behalten darüber hinaus das Plasmid pPRl7 nicht nur bei, sondern sie bilden ferner auch das gewünschte ver-

' schmolzene Genprodukt.

Das verbesserte selektive System und die Eignung der Erfindung lassen sich ferner auch zeigen, indem man das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ ^1.3 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragment, welches das trp Ε-Insulin B-Kettengen enthält, in der oben für das Plasmid pPRl7 beschriebenen Weise auf das Plasmid pPRl2 kloniert. Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 ist vom Plasmid pBR322 in analoger. Weise abgeleitet wie dies oben für ρΙΑ7Δ4Δΐ beschrieben worden ist. Der Aufbau des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ geht aus dem später folgenden Beispiel 2 hervor.

Die Klonung des Restriktionsfragme.nts"des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ, das das '—> 1 . 3 kb EcoRI-BamHI trp Ε-Insulin B-Kettengen enthält, auf das ^4.7 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pPRl2 führt zum neuen Plasmid pPR18. Das Plasmid pPRl8 enthält das. ^0.9kb- Pstl-HincII Restriktionsfragment des Bakteriophags Xc_l357 und blokkiert daher die lytische Entwicklung des Bakteriophags -71 in lysogenisierten Wirtszellen. Darüber hinaus codiert und exprimiert das Plasmid pBRl8 auch das oben erwähnte verschmolzene Genprodukt trp Ε-Insulin B-Kette in Mengen, die wesentlich über den Mengen liegen, wie sie von anderen, das Gen XcI enthaltenden bekannten Plasmiden gebildet werden. Ein Restriktionsstellenplan und ein Funktionsplan für das Plasmid pPRl8 geht aus Fig, .6 der Zeichnung hervor.

^OVJ Das neue rekombinierende Plasmid pPRl8 kann in Escherichia coli transformiert werden, beispielsweise in Escherichia coli K12 294, Escherichia coli Kl.2 RV308, Escherichia coli K12 C600 oder Escherichia coli K12 C600R, -M₁ ,

und die hierdurch erhaltenen Stämme lassen sich dann mit

irgendeinem Bakteriophag X lysogenisieren, das keinen funktionellen Repressor el bildet, beispielsweise mit dem Bakteriophag XcI90. Genauso wie oben für die lysogenisierten und da.s Plasmid pPRl7 enthaltenden Stämme beschrieben,

*> β * 4 <? "5 O O

ist auch für die in obiger Weise aufgebauten Stämme Escherichia coli K12 294_AcI90/pPRl8, Escherichia coIi K12 RV3082\£l90/pPRl8., Escherichia coli K12 C6Q0 XcI90/pPRl8 und Escherichia coli K12 C600R, -M, -XcI90/pPRl8 eine Beibehal-

κ κ —

tung des Plasmids pPRl8 erforderlich, während dies, für die aufgebauten Stämme Escherichia coli K12 294/pPRl8, Escherichia coli K12 RV308/pPR18, Escherichia coli K12 C600/ pPrlS und Escherichia coli K12 C600R, -M, -/pPRl8 nicht gilt, so daß diese genauso gut ohne das Plasmid überleben. Ein Vergleich der Plasmidretention in den Stämmen zeigt deutlich, daß praktisch alle lebenden Zellen in den erfindungsgemäßen Stämmen das gewünschte Plasmid enthalten. Darüber hinaus behalten die Stämme Escherichia coli K12 294Xcl90/ pPRlS, Escherichia coli K12 RV308Xcl90/pPRl8, Escherichia coli K12 C600A.cI90/pPRl8 und Escherichia coli K12 C600R,-M, -AcI90/pPRl8 ihre Plasmide nicht nur bei, sondern sie bilden auch das gewünschte verschmolzene Genprodukt.

Das neue Plasmid pPRl2 läßt sich ferner auch in eine Reihe von Wirtszellen transformieren, beispielsweise"in Escherichia coli K12 C600R,-M, -. Die hierdurch erhaltenen Stämme lassen sich genau so wie die Transformanten der Plasmide pPRl7 und pPRl8 lysogenisieren, wodurch man zu Stämmen gelangt, die ohne das Plasmid nicht überleben» Der aufgebaute Stamm Escherichia coli Kl2 C600R_v-tM, XcI90/pPR12 erfordert daher die Beibehaltung des Plasmids pPRl2, während der aufgebaute Stamm Escherichia coli K12 C600R, -M, -/pPRl2 auch ohne dieses Plasmid genau so gut überlebt. Ein Vergleich der Plasmidretention in den Stämmen zeigt deutlich, daß praktisch alle lebenden Zellen in den erfindungsgemäßen Stämmen das gewünschte Plasmid enthalten.

Das hierin zur Erläuterung der Erfindung verwendete Repressorgen λ_£ΐ857 ist temperaturempfindlich und wird bei Temperaturen von 38⁰C bis 44⁰C oder darüber inaktiviert. Eine Temperaturerhöhung auf 38 bis 4_0_°C führt daher zu einer Lyse der Zellen unter Einleitung des lytischen Zy-

' klus des λ. Prophags, das erfindungsgemäß in den Wirtszellenstamm eingebaut worden ist. Bei Verwendung eines temperaturempfindlichen Repressors, der einen letalen oder bedingt letalen Marker reprimiert, welcher eine Wirtszellenlyse verursacht, und bei Züchtung der Wirtszellen bei einer Temperatur, die zu einer Inaktivierung des Repressors führt, oder im Falle eines bedingt letalen Markers bei einer Temperatur, die nicht innerhalb des Temperaturbereichs für eine zulässige Züchtung der Wirtszellen liegt, ermöglicht die erfindungsgemäße verbesserte Selektionsmethode daher auch ein einfaches, bequemes und wohlfeiles Verfahren zur Lyse von Zellen zur Reinigung intrazellularer Produkte.

Die Erfindung macht von einem plasmidgeborenen Gen Gebrauch, um einen letalen chromosomalen Marker zu reprimieren. Die Selektion der Zellen ist unabhängig vom Replikon und auch von den anderen Genen am Plasmid, wobei - obwohl bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfin-

2" dung Gebrauch gemacht wird vom Bakteriophag XcI857, welches das ~Ό.9 kb Pstl-HincII c_I Restriktionsfragment enthält - allgemein auch ein ~0.9 kb Pstl-HincII el enthaltendes Restriktionsfragment irgendeines anderen Stammes eines Bakteriophags λ, verwendet werden kann, der einen funktionellen Repressor bildet. Das zur beispielsmäßigen Erläuterung der Erfindung verwendete Prophag trägt zwar eine XcI90 Mutation und bildet keinen funktioneilen XcI Repressor, doch können statt dessen auch andere Mutanten des Bakteriophags X verwendet werden, falls diese ebenfalls kein funktionelles c_I Repressorgen enthalten. Selbstverständlich braucht man für solche Mutanten eine andere Quelle für den Repressor, um den. lysogenen Zustand aufrechtzuerhalten.

Das erfindungsgemäße Selektionsverfahren ergibt eine verbesserte Expression eines funktioneilen Polypeptids und läßt sich auf Wirtszellen anwenden, die plasmidgeborene Gene enthalten, welche eine Reihe brauchbarer Produkte

exprimieren. Das plasmidgeborene Gen kann beispielsweise ein natürlich vorkommendes Gen, ein nicht in der Natur vorkommendes Gen oder ein Gen sein, das zum einen Teil natürlich vorkommt und zum anderen synthetisch oder nicht in der Natur vorkommend ist. Weiter läßt sich die Erfindung auch zur Selektion und Aufrechterhaltung von Zellen verwenden, die ein plasmidgeborenes Gen' enthalten, welches codiert für Humanpräproinsulin, Humanproinsulin, Humaninsulin-A-Kette, Humaninsulin-B-Kette, Humanwachstumshormon, Nichthumanwachstumshormon, Nichthumaninsulin, Humaninterferon, Nichthumaninterfer.on, virales Antigen, Urokinase, irgendein Peptidhormon, irgendein Enzym, irgendein PoIypeptid oder praktisch für irgendein sonstiges Gen, das in der Forschung und Technik Bedeutung hat.

Bei den hierin beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung werden Plasmidreplikation und Expression des Genprodukts bestimmt durch das Replikon von pMBl (Life Sei. 25: 807 bis 818 (1979)) oder den trp Promotor. Andere Replikone und Promotoren lassen sich ebenfalls verwenden, sofern sie in Escherichia coli K12 funktionell und gegenüber dem jeweils zu verwendenden Repressor nicht sensitiv sind. Selbstverständlich weiß der Fachmann oder kann der Fachmann ohne "weiteres bestimmen, welche Replikone und Promotoren in Escherichia coli K12 funktionell und welche gegenüber einem bestimmten Repressor nicht sensitiv sind. Zu Beispielen für solche andere Replikone gehören unter anderem die Replikone von CoIEl, NRl, RK2', RK6, pSClOl, RPl, RP4 oder F unter Einschluß von Bakteriophagen, die in Escherichia coli K12 replizieren. Zu Beispielen für andere Promotoren gehören Iac Promotor, Lipoproteinpromotor., ribosomale Proteinpromotoren, ribosomale RNA-Promotoren und praktisch irgendwelche sonstige Promotoren. Der. Aufbau sonstiger Replikone und Promotoren liegt selbstver-

^-- ständlich im Rahmen des fachmännischen Könnens.

Escherichia coli K12 ist nicht nur der bevorzugte Wirt für das Bakteriophag X, sondern stellt infolge seiner

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Wohlhabenheit der genetischen und biologischen Information auch eine bequeme Wirtszelle für die erfindungsgemäßen Zwecke dar. Der Stamm Escherichia coli K12 RV308 wird zwar am meisten bevorzugt, doch ist die Erfindung nicht auf irgendeinen Genus, eine Spezies oder einen Stamm beschränkt, sondern sie läßt sich auf irgendeinen Escherichia coli, irgendeine, Coli-Form oder irgendeine' sonstige Zelle anwenden, in welcher das Bakteriophag X lysogen ist und in die ein funktioneller Repressor geklont werden kann.

Allen Ausführungsformen der Erfindung ist das Merkmal gemeinsam, daß sie gegenüber der Zusammensetzung der jeweiligen Medien nicht sensitiv sind. Die Erfindung ermöglicht daher einen breiten Bereich an Fermentationsmanipulation zur Verbesserung der Produktivität.

Ausführungsbeispiele:

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter beschrieben. Darin werden erforderlichenfalls sowohl Erklärungen als'auch Erläuterungen über die tatsächlichen Verfahren zum Aufbau der Erfindung gemacht.

25'Beispiell

Aufbau des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ .

A. Aufbau des Plasmids pBRHtrp 30

Das Plasmid pGMl trägt das Escherichia coli Tryptophanoperon, welches die Auslöschung Δ]1Ε1413 (J. Bacteriology, 1457 bis 1466 (1978)) enthält und somit ein verschmolzenes Protein exprimiert, das aus den ersten sechs Aminosäuren des trp Führungsglieds und etwa dem letzten Drittel des trp E-Polypeptids (im folgenden als LE' bezeichnet) sowie dem gesamten trp D-Polypeptid besteht, und diese Expression erfolgt insgesamt unter der Steuerung durch

das trp Promotor-Operatorsystem. Escherichia coli K12 W31lQtna2trp-AlO2/pGMl wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC Nr. 31622) hinterlegt, und pGMl läßt sich in üblicher Weise vom Stamm unter Anwendung der im folgenden beschriebenen Maßnahmen entfernen.

Etwa 20 μg des Plasmids werden mit dem Restriktionsenzym* PvuII verdaut, das das Plasmid an fünf Stellen aufspaltet» Sodann werden die Genfragmente mit EcoRI-Verknüpferη (die

'" aus einem selbstkomplementären Oligonucleotid mit der Sequenz . pCATGAATTCATG bestehen) vereinigt, wodurch man eine EcoRI-Verknüpfungsstelle für die spätere Klonung in ein Plasmid erhält, welches eine EcoRI Stelle aufweist. Die aus pGMl erhaltenen 20 μg an DNA-Fragmenten behandelt man

'5 mit 10 Einheiten T. DNÄ-Ligase in Gegenwart von 200 pico-MoI des in Stellung 5' phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTCATG und in 20 μΐ T₄ DNA Ligasepuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl₃, 5 mM Dithiothreit) über Nacht bei einer Temperatur von 4⁰C.

^zu Die Lösung wird dann 10 Minuten auf 70⁰C erwärmt, um die Ligation zum Stillstand kommen zu lassen. Hierauf werden die Verknüpfer durch Verdauung mit EcoRI abgespalten und die erhaltenen Fragmente, welche nun Endstücke EcoRI aufweisen, durch Elektrophorese unter Verwendung von 5 %-igem

Polyacrylamidgel (dieses Verfahren wird später abgekürzt als PAGE bezeichnet) aufgetrennt. Die drei größten Fragmente werden vom Gel isoliert, indem man das Gel zuerst mit Ethidiumbromid anfärbt und dann die Fragmente mit Ultraviolettlicht sichtbar macht, worauf man die interessie-

renderi Teile vom Gel ausschneidet. Jedes Gelfragment gibt man zusammen mit 300 μΐ 0,IxTBE in einen Dialyseschlauch und unterzieht das Ganze hierauf einer Elektrophorese bei 100 V über eine Zeitdauer von 1 Stunde in 0,lxTBE-Puffer. (TBE-Puffer enthält 10,8 g Trisbase, 5,5 g Borsäure, 0,09

g Na„EDTA in 1 Liter'H-O). Die wäßrige Lösung wird vom Dialyseschlauch gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform'extrahiert und bezüglich Natriumchlorid auf eine Molarität von 0,2 eingestellt. Nach entsprechender

"J Ausfällung mittels Ethanol gewinnt man die DNA in' Wasser. Das trp Promotor/Operator enthaltende Gen mit klebrigen Enden EcoRI wird nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren identifiziert, das in einer Insertion von Fragmenten in ein tetracyclinsensitives Plasmid besteht, welches nach erfolgter Promotor/Operator-Insertion tetracyclinresistent wird. Alle später beschriebenen Isolierungen von DNA-Fragmenten werden unter Anwendung des oben erwähnten PAGE-Verfahrens durchgeführt, denen sich- dann die oben beschriebene Elektroelutionsmethode anschließt.

* Entsprechende Restriktionsenzyme und sonstige.Enzyme sind von folgenden Firmen erhältlich:- Bethesda Research Laboratories, Inc.,Box 6010, Rockville, Maryland 20850

Boehringer Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Drive, P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250, Research Products, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana 46 515

B. Aufbau des Tetracyclinresistenz :exprimierenden Plasmids pBRH trp unter Steuerung durch den Trp Promotor/Operator und Identifizierung sowie Vermehrung des gemäß obige Stufe A isolierten DNA-Fragments, welches den Trp Promotor/Operator enthält

Das Plasmid pBRHl (Nucleic Acids Research 6, 3267 bis 3287 (1979)) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält

^ das Gen für die Tetracyclinresistenz, exprimiert diese Resistenz jedoch nicht, da es mit keinem Promotor in Verbindung steht. Das Plasmid ist daher tetracyclinsensitiv. Durch Einführung eines Promotor/Operator-Systems in die EcoRI-Stelle kann das Plasmid tetracyclinresistent ge-

^ macht werden.

Das Plasmid pBRHl wird mit EcoRI verdaut. Das Enzym wird durch Extraktion mit Phenol und anschließende Extraktion

mit Chloroform entfernt, worauf man die DNA nach Ausfällung mittels Ethanol in Wasser gewinnt- Das jeweils in getrennten Reaktionsgemischen erhaltene DNA-Molekül wird mit jedem der drei nach obigem Beispiel IA erhaltenen DNA Fragmente vereinigt und in der bereits beschriebenen Weise mit T, DNA-Ligase verknüpft. Mit der im Reaktionsgemisch vorhandenen DNA transformiert man dann einen leistungsfähigen Stamm 294 von Escherichia coli K12 (Proc, Nat. Acad. Sei. USA 73:4174 bis 4198 (1976), ATCC Nr. 31446)

]0 unter Anwendung herkömmlicher Techniken (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71:3455 bis 3459 (1974), worauf man die Bakterien auf LB-Platten (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York (1972) von Miller) aufträgt, die 2Q μg/ml Ampicillin und 5 μg/ml

T5 Tetracyclin enthalten.

Mehrere.tetracyclinresistente Kolonien werden selektiert und das Plasmid DNA wird isoliert und als pBRHtrp bezeichnet. Die Anwesenheit des gewünschten Fragments wird durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt, Das Plasmid pBRHtrp exprimiert ß-Lactamase, verleiht Ampicillinresistenz und enthält ein DNA-Fragment,, welches den trp Promotor/Operator enthält. Das DNA-Fragment codiert ferner auch für ein erstes Protein (welches als LE¹ bezeichnet wird), das aus einer Verschmelzung der ersten sechs Aminosäuren des trp-Führungsglieds und etwa dem letzten Drittel des trp E-Polypeptids, einem zweiten Protein (das als D' bezeichnet wird), welches etwa der. ersten Hälfte des trp D~ Polypeptids entspricht, und einem dritten Protein besteht, welches für das tetracyclinresistente Gen codiert.

C. Aufbau des Plasmids ρ3ΟΜ7Δ2

Das Plasmid pBRHtrp wird mit dem EcoRI Restriktionsenzym verdaut, und das erhaltene Fragment wird nach Isolierung unter Anwendung der PAGE-Methode und Elektroelution mit dem durch EcoRI verdauten Plasmid pSÖMlT"(Sei. 198 ; 1056 (1977),GB-OS 2 007 676A) vereinigt. Das erhaltene Gemisch

wird mit T₄ DNA-Ligase verknüpft und die dabei angefallene DNA in der bereits beschriebenen Weise in Escherichia co il K12 Stamm 294 transformiert. Die transformierten Bakterien werden auf ampicillinhaltigen Platten selektiert, und die erhaltenen ampicillinresistenten Kolonien werden durch Koloniehybridisierung (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72:3951 bis 3965 (1975)) einem Screening unterzogen. Das dabei erhaltene trp Promotor/Operator enthaltende Fragment,

32

welches aus pBRH trp isoliert und dann mit P radioaktiv markiert worden ist, wird als Probe bei obigem Verfahren verwendet. In der Koloniehybridisierung erweisen sich mehrere Kolonien als positiv, und diese werden daher ausgewählt. Das Plasmid DNA wird isoliert, und die Orientierung der inserierten Fragmente wird durch Restriktionsana- lyse unter Verwendung der Enzyme BgIII und BamHI in einer Doppelverdauung bestimmt. Die Kolonien, die das gewünschte Plasmid mit dem trp Promotor/Operator-Fragment in der geeigneten Orientierung enthalten, läßt man in LB-Medium (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York (1972)) wachsen, welches 10^g/ml Ampicillin enthält. Das gewünschte Plasmid wird als pSOM7A2 ;bezeichnet, und dieses Plasmid wird für die im folgenden beschriebenen Aufbaumethoden verwendet.

D. Aufbau des Plasmids pTrp24

1. Aufbau eines Genfragments aus Codonen für die Distalbereiche des LE'-Polypeptids mit den Restriktionsstellen BgIII bzw. EcoRI an den Enden 5.' bzw. 3' des Codie- ^ou rungsstrangs

Man verdaut das Plasmid pS0M7A 2 zuerst mit Hindi11 und dann mit .λ-Exonuclease (einer 5'- bis 3'-Exonuclease) unter solchen Bedingungen, daß sich eine Verdauung nach der BgIII Restriktionsstelle im LE'-Codierungsbereich ergibt.

Man löst etwa 20 ^g von mit Hindlll verdautem ρ30Μ7Δ2 in einem entsprechenden Puffer (20 mM Glycinpuffer, pH'9,6, 1 mM.MgCl₂,.l mM ß-Mercaptoethanol). Das erhaltene Gemisch

] wird 60 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 Einheiten A_-Exonuclease behandelt. Das erhaltene Reaktionsgemisch v/ird dann mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und anschließend in Ethanol gefällt,

Zur Bildung eines Rests EcoRI am distalen Ende des LE'-

32 Genfragments synthetisiert man einen Primer pCCTGTGCATGAT unter Anwendung der verbesserten PhQsphotriestermethode (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75:5765 (1978)) und hybridisiert

]0 das Ganze dann an das einzelsträngige Ende des. durch Verdauung mit λ,-Exonuclease erhaltenen LE'-Genfragments. Zur Hybridisieruhg löst man 20 μg des mit X-Exonuclease behandelten HindiII-Verdauungsprodukts des Plasmids pSOM7A2 in 20 μΐ Wasser und vereinigt die erhaltene Lösung mit 6 μΐ einer Lösung, die etwa 20 pico-Mol des oben beschriebenen 5'-phosphorylierten Oligonucleotids enthält. Das synthetisierte Fragment wird an das 3'-Ende der LE'-Codierungssequenz hybridisiert, und der. verbleibende einzelsträngige Anteil des LE'-Fragments wird mit Klenow-Polymerase I unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Bei Klenow-Polymerase I handelt es sich um das durch proteolytische Spaltung von DNA-Polymerase I erhaltene Fragment. Es verfügt über die 5' -»· 3' -Polymerisationsaktivität , die 3' * 5'-exonucleoiytische Aktivität, nicht jedoch über die 5' ·» 3'-exonucleoiytische Aktivität des Stammenzyms (Kornberg, Verlag W.H. Freeman und Co,., SFO, 98 (1974.) ) .

Zur Durchführung obiger Umsetzung erwärmt man das Reaktionsgemisch auf 50⁰C und läßt es dann langsam auf 10⁰C abkühlen, worauf man 4 μ.1 Klenow-Enzym zugibt. Das Ganze wird zuerst 15 Minuten bei Raumtemperatur und dann 30 Minuten bei 37⁰C bebrütet, worauf man die Reaktion durch Zugabe von 5 μΐ 0,25 molarer EDTA unterbricht. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Im Anschluß daran spaltet man die DNA mit dem Restriktionsenzym BgIII und trennt die Fragmente unter Anwendung der PAGE-Methode auf..

Ein vom Gel erhaltenes Autoradiogramm ergibt ein mit P markiertes Fragment mit der erwarteten Länge von etwa 470 bp, das durch Elektroelution gewonnen wird. Dieses Fragment LE' (d) hat, wie bereits erwähnt, ein Bglll-Endstück und ein stumpfes Ende, das mit dem Anfang des Printers zusammenfällt.

2. Aufbau des Plasmids

Zum Aufbau des Plasmids ρΊΉα.1 inseriert man ein synthetisiertes Gen für Thymosincol in das Plasmid pBR322. Die Synthese der für Tymosincöl codierenden DNA besteht in einer Synthese und anschließenden Verknüpfung der 16 Oligonucleotide (T, bis T,,), die in Fig. 7 der Zeichnung durch Doppelpfeile angegeben sind. Am N-terminalen Ende wird ein Met Codon ATG inseriert, und die 5'-Endstücke sind mit einsträngigen kohäsiven Enden versehen, um eine Anbindung an Plasmide zu erleichtern, die mit EcoRl und BamHl gespalten werden. Die Stelle BgIII im Zentrum des Gens unterstützt dabei selbstverständlich die Analyse der rekombinierenden Plasmide.

Die Oligodesoxyribonucleotide T-, bis T., werden unter Anwendung der modifizierten.Phosphotriestermethode .und Einsatz vollständig geschützter Tridesoxyribonucleotid-Aufbaublöcke synthetisiert (Science 198: 1056 (1978), Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75: 5 76 5 (1978)). Die verschiedenen Oligodesoxyribonucleotide gehen aus der folgenden Tabelle

I hervor

30

TABELLE I

Synthetische Oligonucleotide für das Thymosinctl-Gen

Ver bindung	Sequenz	Länge	HPLC-Analyse Retentions- zeit (min)*
Tl	A-A-T-T-C-A-T-G-T-C	10	17,4
T2	T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A	15	24,3
Τ3	T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A	12	20,3
Τ4	G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A	13	22,0
T	G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G	15	24,8
T	G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A	12	20,1
T 7	A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A	13	. 22,6
Τ8	A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T	12	20,2
Τ9	G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G	12	20,4
Τ10	A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T	• 12	21,1
τ 11	G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T	12	20,5
τ 12	G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G	12	20,4
τ 13	C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T	12	19,9
τ 14	T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C	12	. 20,5
Τ15	G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C	12	20,2
Τ16	G-A-T-C-C-T-A-T-T-A	10	17,2

*) Bei Umgebungstemperatur

Die obige Synthese wird anhand des folgenden.Herstellungsbeispiels für das Fragment -T,,-- erläutert, und dieses Ver-' fahren geht aus Fig. 8 der Zeichnung hervor. Die zur Synthese von T, j- verwendeten verschiedenen Nucleotidf ragmente sind in dieser Figur durch Zahlen bezeichnet. Die darin enthaltenen Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:

TPSTe = 2 , 4,6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazol BSA = Benzolsulfonsäure TLC = Dünnschichtchromatographie HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

DMT	= 4,4'-Dimethoxytrityl
CE	= 2-Cyanoethyl
R	= p-Chlorphenyl
Bz	= Benzoyl
An	= Anisoyl
iBu	= Isobutyryl
Py	= Pyridin
AcOH	= Essigsäure
Et3N	= Triethylamin.

Die vollständig geschützten Tridesoxyribonucleotide 4 (85 mg, 0,0 5 mMol) und 2 (180 mg, 0,1 mMol) werden an den in Stellung 5' befindlichen Hydroxylgruppen durch Behandlung mit 2 %-iger BSA in einem Lösungsmittelgemisch aus 7 Vol.-Teilen Chloroform und 3 VoI.-Teilen Methanol (10 ml bzw. 20 ml) über eine Zeitdauer von 10 Minuten bei O⁰C von den Schutzgruppen befreit. Die Umsetzungen werden durch Zugabe von gesättigtem wäßrigen Ammoniumbicarbonat (2 ml) beendet, worauf man das Ganze mit Chloroform (25 ml) extrahiert und dann mit Wasser (2 χ 10 ml) wäscht. Die organischen Schichten werden getrocknet (Magnesiumsulfat), auf geringe Volumina (etwa 5 ml) eingeengt und durch Zugabe von Petrolether (Siedebereich 35 bis 60⁰C) ausgefällt. Die farblosen Niederschläge werden abzentrifugiert und in ei-ηem Exsikkator unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 6 bzw. 8. gelangt, und hierbei handelt es sich aufgrund einer dünnschichtchromatographischen Untersuchung unter Verwendung von Siliciumdioxidgel jeweils um homogene Produkte (Merck 6 0 F2 54, Chloroform/Methanol,. 9:1).

Die Trimeren 1 und 3 (270 mg, 0,15 mMol bzw, 145 mg, 0,075 mMol) werden in ihre Phosphodiester (5 bzw. 7) überführt, indem man sie mit Gemischen aus Triethylamin, Pyridin und Wasser (1 : 3 : 1, Vol./Vol., 10 ml) über eine Zeitdauer von 25 Minuten bei Umgebungstemperatur behandelt. Die Reagenzien werden in einem Rotationsverdampfer entfernt und die Rückstände durch wiederholte Verdampfungen mittels wasserfreiem Pyridin (3 χ 10 ml) getrocknet. Das Trimere

(0,05 mMol) und das Trimere 7 vereinigt man mit TPSTe (50 mg, 0,15 mMol) in wasserfreiem Pyridin (3 ml), worauf man das Reaktionsgemisch bei Umgebungstemperatur 2 Stunden unter Vakuum stehen läßt. Eine anschließende dünnschichtchromatographische Analyse zeigt, daß hiernach 95 % des Trimeren 8 in das hexamere Produkt umgewandelt worden sind (was durch Sichtbarmachung der DMT-Gruppe durch Besprühung mit 10 %-iger wäßriger Schwefelsäure und Erwärmen auf 6O⁰C gezeigt wird). Die Reaktion wird durch Zugabe von Wasser (1,0 ml) abgebrochen und das Lösungsmittel dann unter verringertem Druck eingedampft. Das nach Entfernen des Pyridins durch gleichzeitige.Verdampfung mit Toluol erhaltene Hexamer wird in der Stellung 5' unter Verwendung von 2 %-iger BSA (8 ml) in der oben bereits für die Trimeren 4 und 2 beschriebenen Weise von den Schutzgruppen befreit. Das Produkt (10) wird unter Verwendung einer mit Siliciumdioxidgel gefüllten Säule (Merck 60 H₇ 3,5 x. 5 cm) und Anwendung einer stufenweisen Gradientenelution mit Chloroform/Methanol (98 : 2 bis 95 : 5, V/V) gereinigt, Diejenigen Fraktionen, die das gewünschte Produkt 10 enthalten, werden zur Trockne eingedampft.

In ähnlicher Weise kuppelt man auch das Trimer 5 an das Trimer 6 und reinigt das erhaltene vollständig geschützte Produkt dann direkt über Siliciumdioxidgel. Sodann wird die erhaltene Verbindung an ihrem Endstück 3' unter Verwendung von Triethylamin, Pyridin und Wasser in der oben beschriebenen Weise von den Schutzgruppen befreit, wodurch man zum "Fragment 9 gelangt. '

Abschließend kuppelt man die Hexameren 9 und 10 in wasserfreiem Pyridin (2 ml) unter Verwendung von TPSTe (75 mg, 0,225 mMol) als Kondensationsmittel. Nach beendeter Kondensation (4 Stunden, Umgebungstemperatur) wird das Reaktionsgemisch auf einem Rotationsverdampfer eingedampft und der Rückstand über Siliciumdioxidgel chromatographiert. Das durch Ausfällung mit Petrolether erhaltene. Produkt (160 mg) erweist sich im Dünnschichtchromatogramm als ho-

Ί mögen. Einen Teil der Verbindung 11 (20 mg) in Pyridin (0,5 ml) befreit man durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (7 ml, 8 Stunden, 60⁰C) und anschließende Behandlung in 80 %-iger Essigsäure (15 Minuten, Umgebungstemperatur) vollständig von den Schutzgruppen. Der nach Verdampfen der Essigsäure erhaltene feste Rückstand wird in 4 %-igem wäßrigem Ammoniumhydroxid (Vol./Vol., 4 ml) gelöst und mit Ethylether (3 χ 2 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase wird auf 1 bis 2 ml eingeengt, und eine Teilmenge davon unterzieht man zur Reinigung der Verbindung 12 einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Die dem überwiegenden Maximum entsprechenden Fraktionen werden zusammengefaßt (etwa 2,0 Einheiten mit einer optischen Dichte von 254) und auf ein Volumen von etwa 5 ml eingeengt. Das erhaltene Endprodukt 12 wird unter Verwendung von Biogel P-2 (1,5 χ 100 cm) und Elution mit 20 %-igem wäßrigem Ethanol von Salz befreit, worauf man das Ganze zur Trockne eindampft und wieder in Wasser (200 μΐ) suspendiert und so zu einer Lösung von A„c-₄ = 10 gelangt. Die Sequenz der Verbindung 12 wird durch zweidimensionale Sequenzanalyse bestätigt.

Das vollständige Thymosinal-Gen wird aufgebaut aus 16 synthetischen Oligonucleotiden unter Anwendung der Methoden, wie sie im einzelnen beschrieben sind für Somatostatin (Sei. 198:1056 (1977)), Insulin (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76:106 (1979)) und Wachstumshormon (Nature 218:544 (1979)). Eine Menge von 10 μg der Oligonucleotide T₀ bis

- 32 T,_ phosphoryliert man quantitativ mit /T- P/-ATP (New England Nuclear) in Gegenwart von T. Polynucleotidkinase (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76:106 (1979)), wodurch man zu spezifischen Aktivitäten von etwa 1 Ci/mMol gelangt. Radiomarkierte Fragmente werden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 20 %-igem Polyacrylamid und 7 Mol Harn-

^OJ stoff gereinigt, und die Sequenzen der eluierten Fragmente werden durch zweidimensionale' Elektrophorese/Homochromatographie (Nucleic Acids Res. 1: 331 (1974)) von Schnekkenvenomteilverdauungsprodukten bestätigt. Die. Fragmente

T, und T,g werden nicht phosphoryliert, um so eine unerwünschte Polymerisation während anschließender Verknüpfungsreaktionen möglichst gering zu halten. Diese Oligonucleotide (2 μg jeweils) werden in vier Gruppen aus jeweils vier Fragmenten (siehe Fig. 9 der Zeichnung) durch T. DNA-Ligase unter Anwendung bekannter Methoden zusammengefaßt (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76:106 (1979)). Die Reaktionsprodukte werden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 15 %-igem Polyacrylamid,gel, das 7 Mol Harnstoff enthält, gereinigt (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71: 3455 (1977)). Die vier isolierten Produkte werden miteinander verbunden, und das erhaltene Reaktionsgemisch wird elektrophoretisch unter Verwendung von 10 %-igem PoIyacrylamidgel aufgetrennt. Durch Elektroelution gewinnt man dann DNA im Größenbereich des Thymosinoo 1-Gens (90 bis 105 Basenpaare).

Man behandelt das Plasmid pBR322 (0,5 μg) mit BamHI und EcoRI Restriktionsendonucieasen und trennt die Fragmente durch Elektrophorese mittels Polyacrylamidgel auf. Das große Fragment wird vom Gel durch Elektroelution, gewonnen und dann an synthetische DNA (Nature 281:544 (1979)) gebunden. Mit dem so erhaltenen Gemisch transformiert man dann Escherichia coli K12 Stamm 294, ATCC Nr......3L446 < 5 % des Transformationsgemisches gibt man dann auf LB-Platten, die 20 μ9/πι1 Ampicillin enthalten. Die erhaltenen vier ampicillinresistenten Kolonien sind gegenüber Tetracyclin sensitiv, was zeigt, daß eine Inserierung in das Gen für die Tetracyclinresistenz erfolgt ist. Eine Analyse der Plasmide aus diesen vier Kolonien zeigt, daß das Plasmid, welches als pThal bezeichnet wird, jeweils enthält (a) eine BgIII Stelle, die im pBR322 selbst nicht zu finden ist, was auf die Anwesenheit des ThymosinCtl-Gens gemäß Fig. hinweist, und (b) ein Fragment mit etwa 105 Basenpaaren, 3_as durch BamHI/EcoRI Spaltung gebildet worden ist, Der Aufbau des Plasmids pThOfl. (nicht maßstabsgetreu) geht aus Fig. 9 der Zeichnung hervor, in.welcher die starken Punkte die in Stellung 5' befindlichen Phosphatgruppen an-

ι ο ο o ο ι ο - >

- 27 geben.

3. Umsetzung von behandeltem pThcXl mit dem Fragment LE' (d)

Das Plasmid pThal enthält ein Gen, das für die Ampicillinresistenz spezifisch ist, und ein Strukturgen, welches für Thymosin&l spezifisch ist, und dieses ist an seinem in Stellung 5' befindlichen Codierungsstrangende an eine Stelle EcoRI und an seinem in Stellung 3¹ befindlichen Ende an eine Stelle BamHI geklont. Das Thymosingen enthält ebenfalls· eine Bglll-Stelle. Zur Bildung eines Plasmids, das zur Aufnahme des in obiger Weise hergestellten LE' (d) Fragments befähigt ist, verdaut man pThal mit EcoRI und unterzieht das Ganze dann einer Klenow-Polymerase I-Reaktion mit dTTP und dATP zum Abstumpfen der Reste EcoRI.

Durch anschließende Verdauung des erhaltenen Produkts mit BgIII ergibt sich ein lineares DNA-Fragment, das das Gen für die Ampicillinresistenz enthält und das an seinen entgegengesetzten Enden über einen klebrigen· Rest BgIII und ein stumpfes Ende verfügt. Das erhaltene Produkt läßt sich.wieder zu einem Ring schließen, indem man es mit dem LE¹ (d)-Fragment, das ein klebriges Ende 'Bcjl.II und ein stumpfes Ende enthält, in Gegenwart von Τ,-Ligase umsetzt, wodurch man zum Plasmid pTrp24 gelangt. Auf diese Weise wird an der Stelle, an der es zu einer Verknüpfung des stumpfen Endes kommt, wieder eine Stelle EcoRI gebildet.

E. Aufbau des Plasmids

Durch aufeinanderfolgende Verdauung von pTrp24 mit BgIII und EcoRI, anschließende Umsetzung nach der PAGE-Methode und Elektroelution gelangt man zu einem Fragment, das Codone aufweist für das LE¹ .(d) Polypeptid mit einem klebrigen Ende Bg[J₁II und einem klebrigen Ende EcoRI, das sich, an dem 3'-Codierungsende befindet. Das LE' (d)-Fragment kann in die Stelle BCjI₁II des Plasmids pSOM7A2 geklont werden, wodurch ein LE'-Polypeptid/Somatostatin-Fusionsprotein gebildet wird, das unter Steuerung durch den Tryptophanpro-

motor/Operator exprimiert wird. Zu diesem-Zweck braucht man (1) eine Eco_RI-Teilverdauung von pSom7A2 zur Spaltung der distal zum Tryptophanpromotor/Operator angeordneten Stelle EcoRI und (2) eine geeignete Auswahl der Primärsequenz zur sauberen Beibehaltung des Codonleserahmens und zur erneuten Bildung einer EcoRI-SpaItstelIe,

Im einzelnen verdünnt man hierzu 16 μg des Plasmids pSom?A2 in 200 μΐ eines Puffers aus 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 0,02 NP40 Detergens und 100 mM NaCl und behandelt das Ganze dann mit 0,5 Einheiten EcoRI. Nach 15 Minuten langer Umsetzung bei 37⁰C wird das Reaktionsgemisch mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt, worauf man das Ganze mit BgIII verdaut. Das größere erhaltene Fragment wird unter Anwendung der PAGE-Methode isoliert und dann einer Elektroelution unterzogen. Dieses Fragment enthält die Codone LE' (p) für das proximale Ende des LE¹-Polypeptids, nämlich die Codone, die nach der Stelle BgIII folgen, Sodann knüpft man dieses Fragment in Gegenwart von T. DNA-Ligase an das obige LE' (d)-Fragment,wodurch man zum Plasmid pSom7A2A4 gelangt, welches nach Transformation in Escherichia coli Stamm 294 unter Steuerung durch den Tryptophanpromotor/ Operator in ausreichender Menge ein Fusionsprotein bildet; das aus dem völlig wiederhergestellten LE-Polypeptid und Somatostatin besteht. -

F.. Aufbau von linearer DNA mit einem Rest Pstl am Ende

3' und einem Rest Bg^II am Ende -5 ' unter Bindung ei nes eine Tetracyclinresistenz ergebenden Gens

Man verdaut das Plasmid pBR322 mit Hindlll und verdaut die herausstehenden Enden Hindlll dann mit Sl-Nuclease, Die' Verdauung mit Sl-Nuclease besteht in einer Behandlung von 10 ag· von mit Hindlll gespaltenem pBR322 in 30 μΐ S.l-Puffer (0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl₃₇ 25 mM Natriumacetat, pH' 4,5) mit 300 Einheiten Sl-Nuclease über eine Zeitdauer von Minuten bei 15⁰C. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 1 μΐ

30 χ Si-Nucleaseunterbrechungslösung (0,8 M Trisbase, 50 mM EDTA) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und dann in der beschriebenen Weise mit EcoRI verdaut. Das nach Anwendung der PAGE-Methode und durch anschließende Elektroelution erhaltene Fragment hat ein klebriges Ende EcoRI und ein stumpfes Ende, dessen Codierungsstrang mit dem Nucleotid Thymidin beginnt. Der mit Thymidin beginnende und mit Sl verdaute Rest Hindlll kann an einen durch Behandlung mit Klenow-Polymerase I erhaltenen Rest BgIII gebunden werden, wodurch nach entsprechender Verknüpfung die B_cj\L_II-Restriktionsstelle wieder gebildet wird.

15 Das gemäß Beispiel 1 C. hergestellte Plasmid pSOM7A 2 wird daher mit BgIII verdaut, worauf man die erhaltenen klebrigen Enden BgIII durch Behandlung mit Klenow-Polymerase I unter Verwendung aller vier Desoxynucleotidtriphosphate doppelsträngig macht. Durch Spaltung des erhaltenen Produkts mit EcoRI und anschließende Behandlung des kleinen Fragments unter Anwendung der PAGE-Methode und Elektroelution gelangt man zu einem linearen Stück an DNA, das den Tryptophanpromotor/Operator enthält und für die proximale LE'-Sequenz codiert, die sich nach der Stelle BgIII (LE¹ (p)) befindet. Das erhaltene Produkt hat ein Ende EcoRI und ein stumpfes Ende, das vom Auffüllen an der Stelle Bg 111 herrührt. Die Stelle Bcjl_II wird jedoch durch Verknüpfung des Stumpen Endes mit dem' stumpfen Ende des oben erwähnten und mit Sl verdauten HindiII-Fragments wieder aufgebaut. Die zwei Fragmente werden daher in Gegenwart von T. DNA-Ligase miteinander verknüpft, wodurch man zum rezirkularisierten Plasmid pHKYlO gelangt, das durch Transformation in leistungsfähige Zellen des Stammes 294 von Escherichia coli propagiert wird. Die tetracyclinresistenten Zellen, die das rekombinierende Plasmid pHKYlO enthalten, werden selektiert, und das Plasmid DNA wird extrahiert. Durch Verdauung mit B'glll und Pstl und anschließende Isolierung des großen Fragments unter Anwendung der

PAGE-Methode und der Elektroelution gelangt man zum gewünschten linearen Stück der. DNA mit den klebrigen Enden Pstl und BgIII. Dieses in der angegebenen Weise aus pHKYlO hergestellte DNA-Fragment enthält den Replikations-Ursprung und eignet sich daher als Komponente zum Aufbau des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ, bei welchem die Gene, die sowohl für das trp LE' Polypeptidverschmelzungsprotein als auch die Tetracyclinresistenz codieren, durch den trp Promotor/Operator gesteuert werden. 10

G. Aufbau von linearer DNA, die den Trp Promotor/Operator enthält

Das gemäß Beispiel IE hergestellte Plasmid pSOM7A2A4 unterzieht man einer Teilverdauung mit EcoRI und einer anschließenden Verdauung mit Pstl. Das erhaltene Fragment, das den trp Promotor/Operator enthält, wird unter Anwendung der PAGE-Methode und durch anschließende Elektroelution isoliert. Die Teilverdauurig mit EcoRI ist für die Bildung eines Fragments notwendig, das neben dem Ende 5' des Somatostatingens gespalten wird, jedoch nicht gespalten wird an der Stelle EcoRI, die sich zwischen dem Gen für die Ampicillinresistenz und dem trp Promotor/Operator befindet. Die durch den Schnitt mit Pstl im Gen für die Ampicillinresistenz verlorengegangene Ampicillinresistenz läßt sich durch Verknüpfung mit dem fertigen pHKYlO linearen DNA-Derivat wieder.herstellen, das gemäß obigem Beispiel IF. gebildet worden ist.

H. Isolierung des Strukturgens für die Α-Kette von Insulin

Das Strukturgen für die Α-Kette von Insulin wird hergestellt durch Verdauung des Plasmids ρIAl mit EcoRI und BamHI, und der Aufbau des hierzu benötigten Plasmids wird in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76:106 (1979) beschrieben. Das gewünschte Fragment wird unter Anwendung der PAGE-Methode und durch Elektroelution gereinigt, und es verfügt

- 31 über die Endstücke EcoRI und BamHI.

I. Gegenseitige Verknüpfung des Strukturgens für die Α-Kette von Insulin, des Trp Promotors/Operators und des pHKYlO linearen DNA-Fragments mit den Enden PstI und BgIII

Man verknüpft das Strukturgen der Α-Kette von Insulin, das lineare DNA-Fragment, welches den trp Promotor/Operator enthält (hergestellt gemäß Beispiel IG) und das pHKYlO lineare DNA-Fragment (hergestellt gemäß'Beispiel IF) in geeigneter Orientierung miteinander, wie dies im einzelnen aus Fig. 1 der Zeichnung hervorgeht, wodurch man zum gewünschten Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ gelangt. Das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ,ΐ läßt sich ohne weiteres selektieren, da es wieder über eine Ampicillinresistenz und eine Tetracyclinresistenz verfügt.

Beispiel 2

Aufbau des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ

Zum- Aufbau des gewünschten Plasmids geht man wie in Beispiel IA bis I beschrieben vor, wobei man für die abschließende Verknüpfung hier jedoch das Strukturgen für die B-Kette von Insulin verwendet und nicht das Strukturgen für die·Α-Kette von Insulin. Zur Herstellung des Strukturgens für die B-Kette von Insulin unterzieht man 'das Plasmid pIBi, dessen Aufbau in Proc. Nat. Acad. Sei.

USA 76:106 (1979) beschrieben wird, einer Verdauung mit' EcoRI und BamHI. Das den Code für die B-Kette von Insulin tragende DNA-Fragment wird unter Anwendung der PAGE-Methode und durch Elektroelution gereinigt, und weist die Enden EcoRI und BamHI auf. ..

Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ geht aus Fig. 2 der Zeichnung hervor, und es läßt sich infolge seiner wiederhergestellten Ampicillinresistenz und Tetracyclinresistenz ohne weiteres

- 32 selektieren.

Beispiel 3 Aufbau des Plasmids pPR3

A. Isolierung eines -^2.5 kb BgIII Restriktionsfragments des Bakteriophags λ., das Gene fürel, rex und einen Teil von cro enthält

Die verschiedenen BgIII Restriktionsstellen im Bakteriophag A.CI857 und eine einzelne BamHI Restriktionsstelle im Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 ermöglicht eine Klonierung der Bakteriophagf ragmente in den Klonierungsvektor ρΙΒ7Δ 4Δ1. Das Bakteriophag Xc1857 enthält sechs Stellen, die gegenüber BgIII sensitiv sind.- Eines der Fragmente BgIII enthält 2.5 kb unter Einschluß des Gens A-cI und ferner auch des Gens Xrex (Gene 7:217 bis 280 (1979) und Genetic Maps, Band 1, NIH, (1980), Verlag O'Brien). Die Fragmente BgIII enthalten 5'-Extensionen mit der Sequenz GATC, die komplementär sind zu den 5'-Extensionen an den Fragmenten BamHI. Das Humaninsulinplasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ enthält eine einzelne Stelle, die durch BamHI gespalten wird. Eine Klonierung in· die Stelle BamHI führt zu einer Inaktivierung des Gens für die T_c-Resistenz , das am ΡΙΒ7Δ4Δ1 getragen wird. Die Verknüpfung von BgIII Fragmenten mit BamHI Fragmenten führt

AGATCC GGATCT zu Rekombinanten mit den Sequenzen _TGTAGG oder _GCTAGA ^an den Verbindungsstellen. Diese Sequenzen werden durch BgIII oder BamHI nicht - gespalten. Durch Restriktion mit 30' beiden Enzymen kommt es daher zu einer Eliminierung aller Verknüpfungsprodukte mit Ausnahme derjenigen, bei denen ein λ-ΒαΙ11-Fragment an die Stelle BamHI von ρΙΒ7Δ4Δΐ gebunden ist.

Entsprechende Restriktionsenzyme sind von den in Beispiel IA angeführten Firmen erhältlich, und sie werden unter Anwendung bekannter Methoden eingesetzt. Darüber hinaus liefern auch die Hersteller zusätzliche Instruktionen. Hier-

nach wird das BakteriophagacI857 sus S DNA bei 37 ⁰C in einem Reaktionsgemisch vollständig restriktiert, das 100 μg DNA, 12 mM Tris.HCl, pH 7,5, 12 mM MgCl₃, 12 mM 2-Mercaptoethanol und 100 Einheiten (in einem Volumen von 1 ml) BgIII Restriktionsenzym enthält. Die Restriktionsfragmente werden durch Agarose-Gel-Elektrophorese (im folgenden abgekürzt als AGE bezeichnet) aufgetrennt. Die aufgetrennten Fragmente werden im Gel durch Anfärben mit Ethidiumbromid und Sichtbarmachung von fluoreszierenden Banden mit einem Ultraviolettlicht lokalisiert. Das interessierende ~2. 5 kb Fragment wird aus dem Gel ausgeschnitten und nach den Angaben des Beispiels IA in TBE elektroeluiert. Die wäßrige Lösung wird aus dem Dialyseschlauch gesammelt und über eine DEAE-Cellulosesäule * (0,5 ml Whatman DE52) geführt, die mit einem Äquilibrierungspuffer (0,1 m KC1> 10,0 mM Tris.HCl, pH 7,8) äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit 2,5 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen und die DNA (etwa 5 μg) mit 1,5 ml Elutionspuffer (1 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7,8) elüiert. Das Eluat wird bezüglich der Na -Ionenkonzentration auf eine Molarität von etwa 0,35 eingestellt, worauf man die DNA durch Zugabe von 2 Volumina (etwa 9 ml) 100 %-igem Ethanol und anschließende 16 Stunden lange Abkühlung auf -2O⁰C ausfällt. Der Niederschlagen DNA wird durch Zentrifugieren pelletisiert, mit 75 %-igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Die Isolierung des DNA-Fragments erfolgt durch die AGE-Methode, Elektroelution, DEAE-CeIlulosechromatographie und Ausfällung mit Ethanol nach dem oben beschriebenen Verfahren. Die erhaltene DNA wird wieder in TE-Puffer gelöst (1 mM EDTA, 10 mM Tris.HCl, pH 7,8).

*) Die benötigte. DEAE-Cellulosesäule und DE52 sind erhältlich von Whatman Inc., 9 Bridewell Place, Clifton, New Jersey 07014, V.St.A

35

B. Verdauung des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ mit dem Restriktionsenzym BamHI

Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 wird bei 37°C in einem 50 μΐ Reaktionsgemisch vollständig restriktiert, das 20 mM Tris.HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 7mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 10 Einheiten BamHI-Restriktionsendonuclease enthält.

C. Bindung des Fragments XcI mit den Enden BgIII an das mit BamHI verdaute ρΙΒΤΔ 4Δ.1

Die Verknüpfung mit T₄ DNA-Ligase wird in 100 μΐ eines Reaktionsmediums aus etwa 1,4 μ9 2.5 kb BgIII Fragment (hergestellt gemäß Beispiel 3A), etwa 1,5 μς mit BamHI restriktiertem' pIB7A-4Al (hergestellt gemäß Beispiel 3B), 50 mM Tris.HCl, pH 7,8, 10 mM Dithiothreit, 5 % Glycerin, 10 mM MgCl₂, 0,ImM ATP und 0,1 Einheiten T₄ DNA-Ligase durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei 4°C bebrütet, worauf man die Umsetzung durch 5 Minuten langes Erwärmen auf 65⁰C beendet. Das auf diese Weise hergestellte Plasmid pPR3 wird bis zur späteren Verwendung bei einer Temperatur von 4⁰C aufbewahrt.

Beispiel -4' —

Transformation des Plasmids PR3 in Escherichia coli K12

C600R, -M₁-k k

Frische, über Nacht gebildete Kulturen von Escherichia co-Ii K12 C600R_k-M_k- (Proc. Nat. Acad. Sei. 71: 1030 bis 1034 (1974)) unterteilt man in 1 : 10 -Subkulturen in frischer L-Brühe (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor,New York (1972) von Miller) und läßt sie 1 Stunde bei 37⁰C wachsen. Die hiernach insgesamt geernteten 660 Klett-Einheiten an Zellen werden mit 2,5 ml 100 mM Natriumchlorid gewaschen, in 150 mM Calciumchlorid mit 10 % Glycerin suspendiert und 20 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet. Die Zellen werden durch Zen-

trifugieren geerntet, in 0,5 ml CaCl^-Glycerin resuspendiert, 3 bis 5 Minuten auf Eis abgeschreckt und dann eingefroren. Die Zellsuspensionen werden bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Durch diese Konservierung und Aufbewahrung kommt es zu keiner Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit oder Häufigkeit der Transformation durch kovalent geschlossene zirkuläre DNA. Die Zellen werden in einem Eisbad aufgetaut und in einem Verhältnis von 0,1 ml Zellen zu 0,05 ml DNA (5 μΐ pPR3), hergestellt gemäß Beispiel 3C und verdünnt mit 45 μΐ O₇IX SSC /Standard Kochsalzcitrat/) vermischt. Die auf diese Weise hergestellten Proben werden 20 Minuten auf Eis abgekühlt, 1 Minute einem Wärmeschock von 42⁰C unterzogen, weitere 10 Minuten auf Eis abgekühlt, mit 0,85 ml L-Brühe verdünnt, 2 Stunden bei 32⁰C bebrütet, auf L-Agar (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New

9 York (1972) von Miller) mit etwa 1 χ 10 an jeweils /LKH54hX und XKH.54h80 (Science 196: 182 (1977)) aufgetragen und bei 32⁰C bebrütet. Die Transformanten werden hin- ' sichtlich ihrer Immunität gegenüber den Bakteriophagen ,\KH54hX und \KH54h80 bei 32⁰C selektiert, Durch entsprechende Untersuchung der Rekombinanten ergibt sich eine A]3^r, Tc^S, XKH54h\ und "XKH54h80 Immunität bei 32⁰C und eine XKH54hX. und \KH54h80 Sensitivität bei 42°C. Ein Trans-. formant wird selektiert und als Escherichia coli K12 C600R -M -/pPR3 bezeichnet. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenotypen untersucht und zur Vermehrung und Isolierung des aufgebauten rekombinierenden Plasmids pPR3 verwendet. Durch Restriktionsenzymanalyse, des Plasmids pPR3 ergibt sich, daß nicht das Gen Xc_I, sondern das Gen Xrex am nächsten zum Gen trp E für die B-Kette des Insulins liegt.

Beispiel 5 35

Vermehrung und Isolierung des Plasmids PR3

Das Plasmid DNA von Escherichia coli K12 C6O0R_K-M_K~/pPR3

wird mit Chloramphenicol vermehrt und nach dem sogenannten geklärten Lysatverfahren (J. Mol. Biol. 36:185 bis 194. (1968)) isoliert. Die kovalent geschlossene zirkuläre DNA wird durch Gleichgewichtsultrazentrifugierung in CsCl und Propidiumdiiodid gereinigt. Das Propidiumdiiodid wird mit 2-Propanol extrahiert, und die erhaltene DNA wird bei -20⁰C in CsCl aufbewahrt. Entsprechende Arbeitslösungen der DNA werden durch Chromatographie mittels Sephadex (PD1O*)-Säulen in SSC/10-Puffer (0,015 M NaCl₇ 0,0015 M Natriumeitrat, pH 7,5) ausgetauscht.

*) Erhältlich von Pharmacia, 800 Centennial Ave, . Piscataway, New Jersey 08851, V.St.Ao

Beispiel 6

Aufbau des Plasmids pPRl2

A. Isolierung eines Gens XcI, das lineare DNA mit Enden Pstl und Hindi enthält.

Man löst etwa 70 μg des Plasmids pPR3 (isoliert unter Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens) in .70 μΐ 1OX Pstl-Puffer (200 mM Tris.HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl₂, 500 mM (NH₄J₂SO₄), 5.0 μΐ (1 mg/ml).. BSA (Rinderserumalbumin) und 555 μΐ H-O und bebrütet das Ganze etwa 15 Minuten bei 65°C. Sodann gibt man etwa 25 μΐ Restriktionsenzym Pstl (1 Einheit/μΐ) zu und bebrütet das erhal- tene Gemisch etwa 4,5 Stunden bei 37⁰C.. Hierauf werden die erhaltenen PstΓ-Restriktionsfragmente unter Anwendung der AGE-Methode in üblicher Weise isoliert. Im Plasmid pPR3 sind zwei Pstl-Restriktionsstellen vorhanden, so daß eine vollständige Verdauung von Pstl zu einem -~3.6 kb Fragment und ferner auch zu einem ~4.2 kb Fragment führt. Das letzte Fragment enthält das interessierende Bakteriophag XcI Gen. Das ~4.2 kb Fragment wird daher in der oben beschriebenen Weise gewonnen. Das erhaltene DNA-Pellet, welches das gewünschte 4.2 kb Restriktionsfragment enthält,

wird in 50 μΐ TE -Puffer suspendiert. Die DNA-Suspension wird dann 15 Minuten bei 65⁰C bebrütet und anschließend bis zur weiteren Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt.

Etwa 50 μΐ des ^4.2 kb Pstl Restriktionsfragments (in obiger Weise hergestellt), 10 μΐ 1OX Hincil-Puffer (100 mM Tris.HCl, pH 7,9, 600 mM NaCl, 66 mM MgCl₃., 10 mM Dithiothreit), 38 μΐ H₃O und 2 μΐ (10 Einheiten/μΐ) Hindi .Restriktionsenzym bebrütet man zuerst etwa 20 Minuten bei 3 7°C und dann etwa 5 Minuten bei 65⁰C. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird auf etwa 20 ⁰C abgekühlt und mit etwa 200 μΐ TBE versetzt, worauf die Restriktionsfragmente in üblicher Weise unter Anwendung der AGE-Methode isoliert werden. Das gewünschte ^0.9 kb Pstl-HincII Restriktionsfragment,· welches das Bakteriophag XcI Gen enthält, wird in 10 μΐ TE-Puffer gelöst und bei 4⁰C aufbewahrt.

r B. Isolierung eines Replikons und eines Gens te , das lineare DNA mit Enden HincII und Pstl enthält

Ein Gemisch aus etwa 100 μΐ (3,2 μg) Plasmid pBR322, 15 μΐ 1OX HincII-Puffer, 34 μΐ H₃O und 1 μΐ (10 Einheiten/μΐ) an HincII Restrikti.onsenzym bebrütet man zuerst etwa 20 Minuten bei 37°C und dann etwa 5 Minuten bei 65⁰C, Das Reaktionsgemisch wird dann auf 4⁰C abgekühlt und wie in Beispiel 3 angegeben mit Ethanol gefällt. Das gewünschte und durch Teilverdauung mit HincII- erhaltene Plasmid pBR322 wird in einer Lösung aus 10 μΐ 10X PstT-Puffer und 79 μΐ H-O suspendiert, worauf man die erhaltene Suspension 5 Minuten bei 65°C bebrütet und dann auf 4°C abkühlt. Sodann versetzt man das Ganze mit 10 μΐ (1 mg/ml) BSA und 2 μΐ Pstl' (10 Einheiten/ml) Restriktionsenzym, Das erhaltene Reaktionsgemisch wird zuerst 1 Stunde bei 37°C und dann 5 Minuten bei 6 5⁰C inkubiert, worauf man es auf 4⁰C abkühlt.Das auf diese Weise hergestellte HincII-Pstl Restriktionsfragment wird in üblicher Weise unter Anwendung der AGE-Methode isoliert. Die DNA wird in TE-Puffer gelöst und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C aufbewahrt.

] C. Verknüpfung des Fragments mit dem Gen Xc_I und dem linearen pPBR322 DNA Fragments mit Enden Pstl und HincII

.Man vermischt etwa 10 μΐ (1,8 μg) ^ 0.9 kb HincII-Pstl Fragment (hergestellt gemäß Beispiel 6A) und 10 μΐ (0,9 μg! ^ 4 kb Pstl-HincII Fragment (hergestellt nach Beispiel 5B) miteinander und fällt das Ganze zweimal mit Ethanol. Die erhaltene DNA wird in einer Lösung von 2 μΐ 5X Ligationspuffer (250,mM Tris.HCl, pH 7,8, 50 mM MgCl₃, 25 mM Dithiothreit und 25 % Glycerin) und 4,67 μΐ H₂O gelost. Die Lösung wird 10 Minuten bei 65⁰C bebrütet und dann mit etwa .3 μΐ 0,66 mM ATP und 0,33 μΐ (2 Einheiten/μΐ) T₄ DNA-Ligase versetzt. Das erhaltene Ligationsgemisch wird 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur umgesetzt, wodurch man zum gewünschten Plasmid pPRl2 gelangt. Das auf diese Weise hergestellte Plasmid pPR12 DNA wird bis zur weiteren Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt.

B e i s ρ i e 1 7

Transformation des Plasmids pPRl2 in Escherichia coli K12

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pPR3 hier jedoch das Plasmid pPR12 verwendet. Die Transformanten werden bezüglich ihrer Immunität gegenüber den Bakteriophagen KH54h und KH54h80 bei 32°C selektiert. Eine entsprechende Untersuchung der Rekombinanten ergibt eine Ap^S, Tc^r, λΚΗ54η.λ und XKH54h80 Immunität bei 32°C und eine Χ.ΚΗ54ηλ und XKH54h80 Sensitivität bei 42°C. Ein Transformant wird selektiert und als Escherichia coli K12 C600R, -M, -/pPRl2 bezeichnet. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenotypen Untersucht und zur Vermehrung sowie Isolierung des Plasmids pPRl2 verwendet.

- 39 Beispiel-8.

Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPR12

Die gewünschte Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl2 wird praktisch wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 9 10

Aufbau des Plasmids pPR17

A. Isolierung des ^4.7 kb EcoRI-BamHI linearen Fragments des Plasmids pPRl2, das das Gen XcI sowie

"!5 das Replikon enthält.

Ein Gemisch aus etwa 150 μΐ (20 μς) Plasmid pPRl2 DNA (hergestellt gemäß Beispiel 8) 20 μΐ 1OX BamHI Puffer (200 mM Tris.HCl, pH 7,0, 1 M NaCl, 70 mM MgCl₂, 20 mM

2-Mercaptoethanol), 2 μΐ (20 Einheiten/μΐ) BamHI-Restriktionsenzym und 28 μΐ H-O bebrütet man zuerst 30 Minuten bei 37⁰C, dann 1,3 Stunden bei Umgebungstemperatur und schließlich 5 Minuten bei 65⁰C. Das Reaktionsgemisch wird auf 4⁰C abgekühlt und dann mit etwa 4 μΐ (10 Einheiten/μΐ)

" EcoRI-Restriktionsenzym versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37⁰C bebrütet, wodurch man zum gewünschten ~4.7 kb · Restriktionsfragment gelangt. Nach herkömmlicher Isolierung unter Anwendung der AGE-Methode wird das gewünschte DNA-Pellet in TE-Puf'fer suspendiert und dann bis zur wei-

teren Verwendung bei -4⁰C aufbewahrt.

B. Isolierung des ^1.3 kb ScoRI-BamHI linearen Fragments des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ, das das Gen für ein Fusionspolypeptid von tr.p 1 ' E' und eine Α-Kette für

Humaninsulin enthält

Die gewünschte Isolierung wird praktisch wie in Beispiel 9 A beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids

pPRl2 hier jedoch das Plasmid ρΙΑ7Δ 4Δ1 verwendet. Ferner setzt man das EcoRI Restriktionsenzym auch nur etwa 0,5 Stunden um, da man lediglich eine Teilverdauung durch . EcoRI haben möchte. Das nach herkömmlicher Isolierung unter Anwwendung der AGE-iMethode erhaltene gewünschte ^l,3 kb EcoRI-BamHI-Restriktionsfragment wird sofort beim folgenden Verknüpfungsverfahren verwendet.

C. Verknüpfung des insulinverschmolzenen Gens und des . linearen pPRl2 DNA-Fragments mit Enden EcoRI und BamHI

Man vermischt etwa .1,5 μg der ~- 4.7 kb DNA enthaltenden Lösung von Beispiel 9A und 1,5 μg des ^1.3 kb DNA enthaltenden Gemisches von Beispiel 9B miteinander und unterzieht das Ganze einer zweimaligen Fällung mit"Ethanol. Das erhaltene Pellet wird in einer Lösung aus β μΐ Wasser und 2 μΐ 5X Ligationspuffer gelöst und dann 10 Minuten bei 65⁰C bebrütet. Nach erfolgter Bebrütung wird das Gemisch auf 15⁰C abgekühlt und mit etwa 2 μΐ 0,66 mM ATP und 0,1 μΐ (1 Einheit/μΐ) T. DNA-Ligase versetzt. Die Verknüpfungsreaktion wird etwa 18 Stunden bei 15⁰C durchgeführt, wodurch man zum gewünschten Plasmid pPRl7 gelangt.

Beispiel 10

Transformation des Plasmids pPRl7 in Escherichia coli K12

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pPR3 hier jedoch das Plasmid pPRl7 verwendet * Die Transformanten werden bezüglich ihrer Immunität gegenüber den Bakteriophagen λΚΗ54ηλ und \KH54h80 bei 32⁰C selektiert.

Durch Untersuchung der Rekombinanten ergibt sich eine Ap^s, Tc^r, X.KH54hX_ und XKH54h80 Immunität bei 32°C und eine XKH54h\ und XKH54h80 Sensitivität bei 42⁰C Ein Transformant wird selektiert und als Escherichia coli K12 C600R,-

. K

M, -/pPRl7'bezeichnet. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenotypen untersucht und zur Vermehrung sowie Isolierung des Plasmids pPR17 verwendet.

Beispiel 11

Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl7

Die gewünschte Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPR17 wird praktisch wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 12 Aufbau des Plasmids pPR18

Der gewünschte Aufbau wird praktisch wie in Beispiel 9A bis C beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon anstelle des Plasmids ΡΙΑ7Δ4Δ1 hier jedoch das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ zur Bildung des ^ 1 .3 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragments verwendet.

Beispiel 13

Transformation des Plasmids pPRl8 in. Escherichia coli K12 C600R,-M,-

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pPR3 hier jedoch das Plasmid pPRl8 verwendet. Die Transformanten werden bezüglich ihrer Immunität gegenüber den Bakteriophagen λΚΗ5 4ηλ und \KH54h80 bei 32⁰C selektiert. Die Rekombinanten werden entsprechend untersucht, wodurch sich eine Ap^S, Tc^r, \KH54hX und \KH54h80 Immunitat bei 32⁰C und eine \KH5 4h\. und \£H54h80 Sensitivität bei 42⁰C ergibt. Ein Transformant wird selektiert und als Escherichia coli K12 CoOOR₁ -M, -/pPRl8 bezeichnet. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenoty-

- 42 -

pen untersucht und zur Vermehrung sowie Isolierung des Plasmids pPRl8 verwendet.

Beispie. 1 14 5

Transformation des Plasmids pPRl7 in Escherichia coil K12 294

Erfindungsgemäße Plasmide werden gegenüber dem K-Restriktionssystem durch Transformation in Escherichia coli K12 modifiziert. Escherichia coli Kl2 294 ist R, -M, , so daß nach entsprechender Transformation nichtmodifiziertes Plasmid DNA modifiziert und resistent gegenüber einer Restriktion durch Stämme mit R, M₁ .Spezifitat.wird. Escherichia coli K12 294 Transformanten werden zur Vermehrung und Isolierung erfindungsgemäßer Plasmide für eine anschließende Transformation in Stämme von.R, M, Escherichia coli verwendet. Zu solchen Stämmen gehört beispielsweise Escherichia coli K12 RV308

20

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle von Escherichia coli K12 C600R,-M, - hier jedoch Escherichia coli K12 294 und anstelle des Plasmids pPR3 hier jedoch das Plasmid pPRl7 verwendet. Die Transformanten werden

r bezüglich Tc selektiert. Die Rekombinanten werden ent-

s r

sprechend untersucht, wodurch sich eine Ap , Tc Immunität bei 32 ⁰C gegenüber X.KH54hX und X.kH54h80 und eine Sensitivität bei 42⁰C gegenüber \KH54h>~ und ^KH54h80 ergibt. Die Transformanten verfügen über eine 100 %-ige genetische Verknüpfung der vermeintlichen plasmidgeborenen Marker. Ein Transformant wird selektiert und als Escheri-. chia coli K12 294/pPR17 bezeichnet. Diese Kolonie wird zur Verifizierung der erwarteten Phenotypen untersucht

⁰^ und dann zur Vermehrung sowie Isolierung des Plasmids pPRl7 verwendet.

- 43 Beispiel 15 .

Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl7

Die gewünschte Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl7 wird praktisch wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, wobei abweichend davon hier jedoch Escherichia coli K12 294/pPRl7 verwendet wird.

TO B e i s ρ i e 1 16

Transformation des Plasmids pPRl8 in Escherichia coli K12 294

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt, wobei anstelle des Plasmids pPR17 hier jedoch das Plasmid pPRl8 verwendet wird.

Beispiel 17

Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl8

Die gewünschte Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPR18 wird praktisch wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, wobei abweichend davon hier jedoch Escherichia coli K12 294/pPRl8 verwendet wird.

Beispiel 18 30

Transformation des Plasmids pPRl7 in Escherichia coli K12 RV308

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt, wobei hier abweichend davon jedoch das Plasmid pPRl7 von Beispiel 15 und Escherichia coli K12 RV308 verwendet werden.

- 44 B e i s ρ i e 1 19

Transformation des Plasmids pPRl8 in Escherichia coli K12 RV308

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt, wobei hier abweichend davon jedoch das Plasmid pPRl8 von Beispiel 17 und Escherichia coli Kl2 RV3 08 verwendet werden. 10

Beispiel 20.

Aufbau von Escherichia coli K12 RV308XCI90/PPR17- durch ' Lysogenisierung mit Xcl90

Man läßt Escherichia coli K12 RV308/pPRl7 (hergestellt gemaß Beispiel 18) bei 32⁰C so lange wachsen, bis 35 Klett-Einheiten vorhanden sind, worauf man das Ganze 60 Minuten auf 45⁰C hält. Die Zellen werden mit XcI90 unter einem moe-Wert von 20 infiziert und 40 Minuten bei 45⁰C bebrütet. Man läßt entsprechende Kolonien bei 32⁰C auf L-Agar, wachsen, der 10 μ9/ΐη1 Tetracyclin enthält. Die erhaltenen Kolonien Escherichia coli K12 RV30sX£l9 0/pPRl7 werden entsprechend untersucht, wodurch sich ein Wachstum bei 32⁰C und eine Sensitivität bei 42⁰C ergeben.

Beispiel 21

Aufbau von Escherichia coli Kl-2" RV308AcI90/pPRl8 30

Der gewünschte Aufbau wird praktisch wie in Beispiel 20 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle von Escherichia coli K12 -RV308/pPRl7 hier jedoch Escherichia coli K12

RV308/pPRl8 (hergestellt gemäß Beispiel 19) verwendet. 35

- 45 !Beispiel 22

Aufbau von Escherichia coli K 12 C6 0 0R., -M, -XcI9 0/pPRl2

Der gewünschte Aufbau wird wie in Beispiel 20 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle von Escherichia coli K12 RV308/pPRl7 hier jedoch Escherichia coli K 12 C600R, -M,-/ pPRl2 (hergestellt gemäß Beispiel 7) verwendet.

Zu Beispielen für andere Stämme, die sich erfindungsgemäß aufbauen lassen, gehören folgende:

Beispiel Nr. Bezeichnung

23 Escherichia coli K12 C600/pPR17

24 Escherichia coli K12 C600/pPRl8

25 Escherichia coli K12 RV308/pPRl2

26 Escherichia coli K12 RV308XcI90/pPRl2

27 Escherichia coli K12 C600XcI90/pPRl7

28 Escherichia coli K12 C600XCI90/PPR18

29 Escherichia ccli K12 29 4A_cl90/pPRl7

30 Escherichia coli K12 294A_cJ90/pPRl8

31 Escherichia coli K12 C600RV-M, -XcI90/pPRl7

32 Escherichia coli K12 C600'R₁^-M₁ -^cI90/pPR18

Verfahren zur Bestimmung dar Stabilität von Wirtszellen, die rekombinante Plasmide enthalten, mit und ohne Selektion; _s

Zur Bestimmung der Häufigkeit der Zellen, die die Plasmide enthalten, verwendet man das Gen Tc an den rekombinierenden Plasmiden. Reihenverdünnungen der Kultur sprüht man auf L-Agar und läßt sie darauf bei 32°C mit und ohne 10 Tetracyclin wachsen. Die Häufigkeit der Plasmid -Zellen ist der Wert aus dem Verhältnis der tetracyclinresistenten Kolonien zur Gesamtanzahl an Kolonien, die auf L-Agar ohne Tetracyclin wachsen. Bei einem anderen Versuch trägt man die Kolonien auf L-Agar auf, der 10 μg/ml Tetracyclin ent-

hält, und läßt das Ganze bei 32°C wachsen. Die Häufigkeit der Plasmid^-Zellen stellt den Wert aus dem Verhältnis der tetracyclinresistenten Kolonien zur Gesamtanzahl der Kolonien dar, die auf L-Agar ohne Tetracyclin wachsen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Form entsprechender Prozentwerte zusammengestellt in Tabelle II für die Stämme Escherichia coli K12 RV30 8/pIA7A4Al und Escherichia coli K12 RV308Xcl90/pPRl7, in Tabelle III für die Stämme Escherichia coli K12 RV30 8/pIB7A 4Δ1 und Escherichia coli K12 RV30 8XcIWpPRl8 und in Tabelle IV für die Stämme Escherichia coli K12 C600R, -M, -/pPRl2 und Escherichia coli K12 C600R, -M₁ -Xcl90/pPRl2.

κ κ —

TABELLE II

Stabilitäten von rekombinanten Plasmiden

Anzahl der . ' Prozentuale Plasmidretention

.Kulturver- Escherichia coli K12 Escherichia coli K12

aoppeiungen _RV3 08/pIA7A 4Δ1 RV3 08\cI90/pPR17

9 96 100

30 95 100

Stabilitäten von rekombinanten Plasmiden

Anzahl der Prozentuale Plasmidretention Kulturver- Escherichia coil K12 Escherichia coli K12 doppelungen RV3 0 8/pIB-7A4Al RV308.Xcl90/pPRl8

9 96 100

30 79 100

- 47 TABELLE IV

Stabilitäten von rekombinanten Plasmiden

Anzahl der Prozentuale Plasmidretention

Kulturver- Escherichia coli K12 Escherichia coli K12 doppelungen C600R_k-M_k-/pPR12 C600R_k-M_k-XcI90/pPRl2

33 87 10.0

Die in den Tabellen II bis IV enthaltenen Ergebnisse zeigen deutlich die Wirksamkeit des vorliegenden selektiven Systems zur Aufrechterhaltung rekombinierender Plasmide in Bakterienpopulationen. Etwa 5 % der Zellen in der KuI-tür von Escherichia coli K12 RV3 0 8/pIA7A 4Δ1 und etwa 21 % der Zellen in der Kultur von Escherichia coli K12 RV30 8/pIB7A4A 1 sind nach 30 Kulturverdoppelungen plasmidminus. Keine der Zellen in den Kulturen von Escherichia coli K12 RV308XcI90/pPRl7 und Escherichia coli K12 RV308- ^c_I90/pPRl8 , bei denen sich das selektive System an Ort und Stelle befand, waren plasmidminus, Die Kultur von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-XcI90/pPR12 zeigte darüber hinaus auch eine ausgezeichnete Plasmidstabilität. Es waren daher 13 % der Zellen _in der Kultur von Escherichia coil K12 C600R_k~M_k-/pPRl2 nach 33 Kulturverdoppelungen plasmidminus, während alle Zellen in der Kultur von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-XcI90/pPR12_/ bei der sich das selektive System an Ort und Stelle befand/ plasmidplus waren.

Keines der erfindungsgemäßen Plasmide zeigt irgendeine Plasmidsegregation. Die erfindungsgemäßen verbesserten . Plasmide unterscheiden sich daher, von den Plasmiden, die über keine derartige Verbesserung verfügen, durch ein Fehlen an Rekombination mit dem Prophag. Nach Wachsenlassen mit dem verbesserten selektiven System an Ort und Stelle ließ sich keine einzige Plasmidminus-Kolonie fest-. . stellen.

Claims (10)

1. - 48 Erfindungsansprüche:

   1. Verfahren zur Stabilisierung und Selektion von Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten, welche ein funktionelles Polypeptid exprimiert, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) die Wirtszellen mit einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor, der das den Pstl-Hincl £l Repressor enthaltende Restriktionsfragment des Bakteriophagen λ und ein Gen enthält, das ein funktionelles Polypeptid exprimiert, transformiert und

   b) die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus lysogenisiert, der einen Marker enthält, der in den Wirtszellen letal oder bedingt letal ist, in den transformierten Wirtszellen jedoch durch das Repressorgen, das im rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthalten ist, reprimiert wird,.

   mit der Maßgabe, daß der rekombinierende. DNA-Klonierungsvektor ein Replikon und einen Promotor enthält, die gegenüber dem Repressor nicht sensitiv sind, und mit der weiteren Maßgabe, daß, falls die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus, der ein Gen enthält, welches bedingt letal ist, lysogenisiert werden, die erhaltenen Wirtszellen dann unter restriktiven Bedingungen gezüchtet werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß das ein funktionelles Polypeptid exprimierende Gen ein natürlich vorkommendes Gen, ein nicht natürlich vorkommendes Gen oder ein Gen ist, welches zum Teil natürlich vorkommt und zum anderen Teil synthetisch oder nicht natürlich vorkommend .ist.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch

   g e k e η η ζ e i c h η e t , daß das ein funktionelles Polypeptid exprimierende Gen ein Gen ist, das codiert für Humaninsulin, Humanpräproinsulin, Humanproinsulin, Humaninsulin Α-Kette, Humaninsulin B-Kette, Nichthumaninsulin,

   Humanwachstuiushormon, Nichthumanwachstumshormon, Kumaninterferon, Nichthumaninterferon, virales Antigen, Urokinase, irgendein Polypeptid oder irgendein Peptidhormon oder Enzym.

   ' - ' '; .
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß der el Repressor cI857 ist.
5. 5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, d a durch gekennzeichnet, daß der lysogene Organismus ein Bakteriophag λοί Gen enthält, das keinen funktioneilen c_I-Repressor produziert.
6. 6. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß der lysogene Organismus das Bakteriophag Xc:I9Q ist.
7. 7. Verfahren nach, einem der Punkte 1 bis 4, d a -

   durch gekennzeichnet, daß der lysogene Organismus das Bakteriophag Xcl857 ist.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß beim lysogenen Organismus das c_I Gen ausgelöscht ist.
9. 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der rekom-' binierende Klonierungsvektor Plasmid pPRl2, Plasmid pPR17 oder Plasmid pPRl8 ist.
10. 10. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, d a .durch gekennzeichnet, daß der rekombinierende Klonierungsvektor ein Bakteriophag ist.

    Hierzu . 7 Seilen Zeicrmunaen