HU197043B - Process for the stabilization and selection of host-cells comprising recombinant dna - Google Patents

Description

A találmány olyan szelektív rendszerre vonatkozik, amelynél lehetőség nyílik rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat hordozó gazdasejtek stabilizálására és szelektálására egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektorban lévő gén által represszált letális kromoszomális marker használatával. Ez igenfontos, mivel a rekombináns dezoxi-ribcnuklcinsavklónozó vektorok, például a plazmidok, gyakran igen gyorsan elvesznek a baktériumpopulációból, ugyanakkor az ipari méretű fermentációk több mint 1Ó^IS sejtet igényeinek. így. ha egyszer az adott terméket meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat beépítjük egy plazmidba, előnyös, ha nem alapvetően lényeges, hogy a plazmidot tartalmazó mikroorganizmus-tenyészetet oly módon stabilizáljuk, hogy a tenyészetben lévő összes sejt tartalmazza ezt az adott plazmidot. Ez azért döntő, mivel az idegen dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó rekombináns plazmidok közismerten instabilak, és a tenyészetben lévő sejtek gyakran több mint 90%-a nem tartalmazza a rekombináns plazmidot egy éjszakán át való növesztést követően, így a termelőképesség drámaian csökken, mivel az adott gén kifejeződése csak azokban a sejtekben lehetséges, amelyek a plazmidot tartalmazzák.

Kuangés munkatársai a Muci. Acids Proteins Proc. Symp. (1979) előadásukban lambda bakteriofág DNS-ből származó restrikciós fragmens klónozását ismertetik, mely DNS többek között a d és a crogént is tartalmazza, klónozó vektorként pBR322 plazmidot alkalmazva. Az így nyert, lambda-fragrnenst tartalmazó plazmid megfelelő gazdasejtbe transzformálva képes arra, hogy’ megakadályozza a behatoló lambda bakteriofág DNS átírását, és így immunitást okoz a transzformált gazdasejtben. Ugyanakkor azonban, a Kuang ás munkatársai-féle plazmid nem képes funkciós polipeptid kifejezésére. Ugyanakkor a találmány szerinti eljárásban olyan klónozó vektorokat használunk, melyek tartalmazzák a cl represzszor gént, de egyáltalán nem a cm gént, és a rex génnek csupán egy részét, és így kiválóan alkalmasak rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelektálására, és ezzel egyidejűleg maximalizálják a gén kifejezést és a funkcionális polipeptid bioszlntézisét,

A találmány tárgya eljárás funkcionális polipeptidet kifejező rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó E. coll gazdasejtek stabilizálására és szelektálására. Ügy járunk el, hogy a lambda bakteriofág cl represszort tartalmazó Pstl-Hincll restrikciós fragrnensét és egy funkcionális polipeptidet kifejező gént tartalmazó rekombináns DNS klónozó plazmáddal E. coli gazdasejteket transzformálunk, és a transzformáit E. coli gazdasejteket funkcionális cl represszort nem termelő lizogén organizmussal llzogenizáljuk, amely azonban a transzformált gazdasejtekben levő rekombináns DNS klónozó vektorban jelenlevő represszor gén által represszált állapotban van, azzal a feltétellel, hogy a rekombináns DNS klónozó vektor a represszorra nem érzékeny rephkont és promotert tartalmaz.

Λ találmány’ tárgya továbbá eljárás a gazdasejtek stabilizálására & szelektálására használt módszer során alkalmazott rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektorok és a vektorokkal transzformált gazdasejtek előállítására.

9.

Igen kevés hatékony módszer ismeretes a rekombináns plazmidok stabilizálására, és minden ismert eljárásnak komoly hátrányai vannak. Az egyik módszer szerint a rekombináns plazmidokba antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket építünk be, és ezután a tenyészethez hozzáadjuk a megfelelő antibiotikumot. A plazmidot tartalmazó és antibiotikum rezisztenciát meghatározó gént hordozó sejtek szelektálódnak, ugyanakkor azok a sejtek, amelyek a plazmidot elvesztik, elpusztulnak és így eliminálódnak a tenyészetből. Ennek az eljárásnak a legnagyobb hátránya az, hogy nagy térfogatban kell növesztenünk antibiotikumra rezisztens baktériumokat, a fermentációs táptalajban drága antibiotikumok vannak jelen, továbbá az adott terméktől az antibiotikumot el kell különítenünk.

A másik ismert módszer szerint a rekombináns plazmidok stabilizálására úgy járunk el, hogy kromoszomális auxotróf mutációt komplementálunk. Ez szerint eljárva, a fermentációs táptalaj összetételét igen gondosan kell megválasztanunk, és olyan táptalajban kell tenyésztenünk, amely nem tartalmazza a gazdabaktérium számára szükséges tápanyagot. Ezen felül a szintrofizmus miatt a sejtek a plazmid elvesztését követően is növekszenek. így a szelekció a táptalaj specifikus manipulációjától függ. Az ilyen eljárások növelik a fermentációs költséget, és limitálják a termelőképesség fokozásának lehetőségeit.

Szükségünk van olyan más szelekciós módszerekre, amelyek függetlenek a táptalaj összetételétől, amelyek lehetővé teszik az összes fermentációs körülmény között a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektor megtartását, és amelyek lehetővé teszik a polipeptid termék fokozott bioszintézisét. Ezt az igényt kielégítik az olyan önpusztító sejtek, amelyekben a kromoszóma letális markért tartalmaz, és amelyek rekombináns dezoxi-ribonuklelnsavklónozó vektoraiban egy represszor vagy egy komplemen táló gén van jelen. Ilyen körülmények között azok a sejtek, amelyek elvesztik a vektort, elpusztulnak. A jelen szabadalmi leírás szerinti eljárás során továbbfejlesztjük ezt az alapgondolatot oly módon, hogy nemcsak gyakorlatilag az összes tenyészetben jelenlévő sejt hordozza az adott rekombináns klónozó vektort, de a klónozó vektorban lévő gének kifejeződése is fokozódik.

Különben előnyös a gének termékeinek fokozott kifejeződése és a plazmid szegregációjának megszüntetése, ez k ülönbözteti meg a jelen találmány szerisiti eljárást más, szintén a lambda cl bakteriofág represzszort felhasználó szelektív rendszerektől. Leírnak olyan szelektív rendszert, amely tartalmazza mind a lambda bakteriofág 2,5 kb BglII, cl represszort tartalmazó restrikciós fragmensát, mind pedig egy' funkcionális polipeptidet kifejező gént. Bár a funkcionális polipeptidet kifejező gén kifejeződik, a plazmid bizonyos szegregációt szenved, és nem következik be a termék fokozott és optimális termelése. A találmány szerinti új eljárás ezeket a nehézségeket áthidalja oly módon, hogy lehetővé teszi a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó gazdasejtek stabilizálását és szelektálását, ugyanakkora gén kifejeződése maximális mértékben bekövetkezik, és a funkcionális polipeptid bioszintézise fokozódik.

Transzformáció alatt azt értjük, hogy dezoxi-ribo-2197043 nukleinsavat juttatunk egy befogadó gazdasejtbe, ezáltal változik a genotípus, és így öröklődő változás következik be a befogadó sejtben.

A transzformáns olyan befogadó sejt, amelyet transzformáltunk.

Represszor alatt olyan gént értünk, amely egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektoron helyezkedik el, és amely egy letális vagy kondicionáiisan letális, a gazdasejt kromoszómájában lévő gén kifejeződését repressziója és akadályozza meg.

A funkcionális polipeptid alatt kinyerhető, biológiailag aktív, heterológ polipeptidet vagy prekurzort, kinyerhető, biológiailag aktív, heterológ polipeptidből álló polipeptidet és egy homológ polipeptid egy részét vagy teljes egészét, egy kinyerhető, biológiailag inaktív fúziós, heterológ polipeptidből és egy biológiailag inaktív, homológ polipcptidből álló polipeptidet értünk, amely specifikusan hasítható; ide tartoznak továbbá azok a biológiailag aktív polipeptidek is, amelyek jelenléte kimutatható.

A fuzionált géntermék olyan kinyerhető, heterológ polipeptid, amely fuzionálva van egy homológ polipeptid részével vagy teljes egészével.

A marker egy gén vagy génkombináció, amelynek funkciója ismert, és amely egy kromoszómán, rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektoron vagy víruson helyezkedik el.

Ap^r: ampicillin rezisztens fenotípus.

Ap⁵:ampicillin érzékeny fenotípus.

Te/: tetraciklin rezisztens fenotípus.

Te¹: tetraciklin érzékeny fenotípus.

Ahogy azt a fentiekben megadtuk, a találmány szerinti eljárással rekombináns dezoxi-ribonukleinsav által meghatározott termékek előállítására sejteket tenyésztünk. Hatékonyan működő szelektív rendszer nélkül az ilyen tenyészetek sejtjeinek nagy része elveszti az adott plazmidot, és így az adott termék termelése jelentősen csökken.

A találmány szerinti eljárás nem csak azt biztosítja, hogy gyakorlatilag az összes tenyészetben jelen lévő sejt hordozza a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektort, de az eljárás biztosítja azt is, hogy a gén kifejeződése fokozódjon, és így nagyobb mennyiségű funkcionális polipeptid bioszintetizálódik. így a találmány szerinti eljárás különösen előnyös, és az eddidi eljárásokkal szemben biztosítja a plazmidszegregálódás kiküszöbölését, a génkifejeződés fokozott mértékét és a funkcionális polipeptid jelentősen nagyobb mennyiségben való termelését.

A találmány szerinti eljárás igen rugalmasan alkalmazható, mivel bármely olyan termék előállításakor alkalmazható, ahol a szintézist rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó plazmid határozza meg. Mivel a találmány szerinti eljárás használhatósága független a funkcionális polipeptidet kifejező génektől, a találmány szerinti eljárást használhatjuk egy vagy több gyakorlati értékkel rendelkező gént hordozó rekombináns törzsek esetén. Ezenfelül az előzőekben leírt génkifejeződést elősegítő eljárást nem korlátozzuk bármely adott géntermékre. így a találmány szerinti továbbfejlesztett módszer előnyösen használható bármely funkcionális polipeptid vagy géntermék rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-technikával való előállítása során.

A rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat hordozó gazdasejtek fenntartására és stabilizálására felhasználható sejtönpusztftást a lambda bakteriofág és az E. coli K12 rendszeren szemléltetjük. A lambda bakteriofág egy temperált fág, amely E. coli K12 sejteket fertőzve két cikluson megy át. A lírikus fázisban a bakteriofág dezoxi-ribonukleinsava autonóm replikálódik, szabályozza a bakteriofág komponenseinek szintézisét és összeállását, és ezután elpusztítja a sejtet, amikor az érett bakteriofágok kiszabadulnak. A lizogén fázisban a bakteriofág beépül a gazdasejt kromoszómájába, ez a profág, ekkor a kromoszómában markerként replikálódik cs nem következik be a bakteriofág komponenseinek szintézise. A lambda cl bakteriofág gén egy olyan represszor szintézisét határozza meg, amely 'ehetővé teszi a lizogén állapot fenntartását, és gátolja a bakteriofág komponenseinek szintézisét meghatározó gének kifejeződését és a fág érését, la a represszort inaktiváljuk, vagy eltávolítjuk a sejtből, a profág kiszakad a kromoszómából, belép a lírikus ciklusba, és megöli a sejtet. A sérült lambda cl gént tartalmazó bakteriofág nem képes a lizogén állapotot fenntartani, és letális a sejtre nézve, kivéve, ha egy másik forrásból származó, funkcionális represszort biztosítunk.

A találmány szerinti eljárás egy szemléltető kivitelezési változatában a lambda cI90-et használjuk Íepresszortól függő profágként, és egy olyan cl gént alkalmazunk, amely egy restrikciós fragmenst tartalmaz, és amelyet egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektorba klónozunk, és így ez funkcionális represszorként viselkedik.

Részletesebben szólva, a találmány szerinti továbbfejlesztett és felhasználható szelektív rendszer szemléltetését úgy végezzük, hogy a trpE-inzulin A láncát meghatározó gént hordozó ρ!Α7Δ4Δ1 plazmid 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmensét klónozzuk egy új, pPR12 plazmádba. Ezt úgy végezzük, hogy kivágjuk a pPR12 plazmid C,4 kb nagyságú EcoRI-BamHI szegmensét. A I PR 12 plazmid általánosan használható vektor, mivel a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid 1,3 kb nagyságú restr kciós fragmens helyére bármely adott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst beépíthetünk. A pPR12 plazmid előállítására a pPR3 plazmid 0,9 kb nagyságú Pstl-Hincll restrikciós fragmensét, amely tartalmazza a lambda c!857 bakteriofág represszort, beépítjük a pBR322 plazmidba. A pPR3 plazmid előállítására a lambda c!857 bakteriofág 2,5 kb nagyságú BgUI fragmensét beépítjük a ρ1Β7Δ4Δ1 plazmid egyetlen BamHI restrikciós helyére. A lambda cI857 bakteriofág 2,5 kb nagyságú BgUI restrikciós fragmense a cl represszor génen kívül tartalmazza a rex gént, és a cro gén egy részét is. Ügy tapasztaltuk, hogy meglepő módon, ha a cl represszor. gént tartalmazó restrikciós fragmensből kihasítjuk a cro gént és a rex gén legnagyobb részét, úgy nagymértékben növekszik és fokozódik a genetikát kifejeződés, és így a funkcionális polipcptiJ termelése. A találmány szerinti eljárás szemléltetése során bemutatott hasított, lambda cl-t tartalmazó és cro és rex törölt restrikciós fragmensek

-3197 043 közül különösen előnyös a pPR3 plazmid 0,9 kb nagyságú Pstl-HinclI restrikciós fragrnense. Az 1—4. mellékelt ábrákon sorrendben bemutatjuk a ρ1Α7Δ4Δ1, ρΙΒ7Δ4Δ1, pi’R3 és pPR12 plazmidok restrikciós és funkcionális térképét.

A ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid tartalmazza az E. coli triptofán promoterjét, antibiotikum rezisztencia markereket és egy olyan gént, amely kifejez egy, az E. coli trpE protein és a humán inzulin A polipeptid láncából álló fuzionált génterméket. A ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid hasonló az előzőhöz, azzal a különbséggel, hogy a fuzionált génterméket kifejező gén tartalmazza a trpE protein egy részét fuzionálva az A helyett a B humán inzulin poíipeptid lánccal.

A ρϊΑ7Δ4Δ1 plazmid a pBR322 plazmidból származik, és az 1A-I. példában megadottak szerint állítjuk elő. A konvencióknak .megfelelően a „Δ” jel deléciót jelez. így például az „AEcoRI-Xbal” kódszám azt a plazmidot jelenti, amelyből restrikciós enzimekkel eltávolítottuk az EcoRI és Xbal restrikciós helyek által felismerhető helyek között lévő nukleotid-szekvenciát. Kényelmi szempontból bizonyos deléciókat számokkal jelzünk. így például a pBR322 szülőpiazmid tetraciklin rezisztenciát meghatározó génjét megelőző EcoRI felismerési hely első bázispárjából (BP) kezdődően a Δ1 jel azt jelenti, hogy az 1—30: bázispár (azaz AEcoRIHindHI) kieseit, és fgy a tetraciklin promoter/operátor rendszer Úhasadt; a Δ2 jel az 1—375. bázispár (azaz a AEcoRI-BamHI) delécióját jelenti, és így nincs jelen a tetraciklin promoter/operátor rendszer és a tetraciklin rezisztenciát meghatározó struktúrgén egy része; a Δ4 jel azt jelenti, hogy a 900—1500. bázispár közötti szakasz kihasadt a trp operon fragmensből, így nincs jelen a trp D poüpeptid struktúrgénje.

Ha a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid 1,3 kb nagyságú, trp E-inzulin A láncot meghatározó gént hordozó EcoRI-BamHI restrikciós fragmensét klónozzuk a pPR12 plazmid 4,7 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmenséhez;, amelyet a következőkben pPR12A2 jellel jelölünk, úgy az új pPR17 plazmidot kapjuk. A ρ1Α7Δ4Δ1 plazmid 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragrnense tartalmazza a Δ2 egy részét; így a klónozáskor visszaáll a Λ2-Δ1 szekvencia. A pPR17 plazmid tartalmazza a larnbda cI857 bakteriofág 0,9 kb nagyságú Pstl-HinclI restrikciós fragmensét, és fgy lizogentzált gazdasejtekben gátolja a lambda bakteriofág lírikus kifejlődését. Ezenkívül a pPR17 plazmid meghatározza és kifejezi az előzőekben ismertetett trp E-inzulin A lánc fuzionált géntermékét, a kifejeződés mértéke pedig lényegesen nagyobb, mint más, az irodalomból ismert lambda cl gént hordozó más plazmidok esetében. A pPR17 plazmid funkcionális és restrikciós térképét a mellékelt 5. ábrán adjuk meg.

Az pPRI7 rekonibináns plazmid E. coli sejtekbe transzformálható, például az E. coli K12 294 [Goeddel és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 106 (1979)], E. coli K12 RV308 [Mauer és munkatársai, J. Mól. Bioi., 139, 147—161 (1980)], E. coli K12 C600 [Bachman, Bacteriol. Rév., 36, 526-557 (1972)], E. coli K12 C600R_kM_k— [Chang és Cohen, Proc. Nat. Acad. Sci., 71,

1030—1034 (1974)], és más sejtekbe, majd a kapott törzseket bármilyen lambda bakteriofággal lizogenizálhatjuk, amely fágok nem termelnek funkcionális cl represszort, ilyen például a lambda cl9ü bakteriofág. így az előállított E. coli K122941ambdacl90/pPR17, E. coli K12 RV3081ambdacI90/pPR17, E. coli Ki 2 C6001ambdacI90/pPR17 és az E. coli K12.

C600R_k-M_k-lambdacI90/pPR17 sejtek a pPR17 plazmid megtartását igénylik, ugyanakkor az előállított E. coli K12 294/pPR17, E. coli K12 RV308/pPR17, E. coll K12 C600/pPR17 és az E. coli K12 C600R₂-M_k-/pPR17 sejtek plazmid nélkül is túlélők A törzsek plazmidmegtartási képességének összehasonlításakor világosan kiderül, hogy gyakorlatilag az összes élő sejt a találmány szerinti eljárással előállított törzsek esetén tartalmazza a plazmidot. Az E, coli K12 294!amlx!ac!90/pPR17, E. coli K12 RV308iambdací90/ pPR17, és az E. coli K12 C6001ambdacI90/ pPR17, valamint az E. coli K12 C600R_K -M_k-!anibdac!90/pPR17 sejtek ezenkívül nemcsak megtartják a pPR17 plazmidot, de termelik az adott fuzionált génterméket is.

A találmány szerinti továbbfejlesztett szelektív rendszer és ennek felhasználása szemléltethető oly módon is, hogy a trp E-inzulin B láncot meghatározó gént tartalmazó ρ!Β7Δ4Δ1 plazmid 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmenst klónozzuk a pPR17 esetén megadott módon a pPR12 plaztnidba. A ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid a pBR322 plazniidból származik a ρίΑ7Δ4Δ1 plazmid esetén megadottakhoz hasonlóan. A ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid előállítását az alábbiakban a 2. példában ismertetjük.

A ρ!Β7Δ4Δ1 plazmid 1,3 kb nagyságú, EcoRIBamHI trp E-inzulin B láncot meghatározó gént hordozó restrikciós fragmensének klónozása a pPR12 plazmid 4,7 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmenséhez az új pPRIS plazmidot eredményezi. A pPR18 plazmid tartalmazza a lambda c!857 bakteriofág 0,9 kb nagyságú PstlHinclI restrikciós fragmensét, és így a lizogenizált gazdasejtekben gátolja a lambda bakteriofág lírikus fejlődését. Azonkívül a pPR18 plazmid meghatározza és kifejezi az előzőekben ismertetett trp E-inzulin B lánc fuzionált génterméket, mégpedig az irodalomból ismert lambda cl géni tartalmazó plazmidokhoz képest jelentősen nagyobb mértékben. A pPR18 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 6. ábrán mutatjuk be.

Az új pPR18 rekonibináns plazmidot E. coli sejtekbe transzformálhatjuk, például az alábbiakban: E. coli K12 294, E. coli K12 RV308, E. coli K12 C600, E. coli K12 C600R_k-M_k- és mások. A kapott törzseket bármilyen olyan lambda bakteriofággal lizogenizálhatjuk, amelyek nem tartalmaznak funkcionális cl represszort, jréldául a lambda cí90 bakteriofággal. így, ahogy azt a pPR17 lizogenizált töízsek esetén megadtuk, az előállított E. coli K12 294 IambdacI90/pPR18, E. coli K12 RV3O8Iambdncl90/pPRI8, E. coli K12 C600!nmbdacI90/ pPR18 és az E. coli K12 C600R_k-M_k-lambdacl90/ pPR18 törzsek igénylik a pPR18 plazmid megtartását, ugyanakkor az E. coli K12 294/pPR18, E.

-4197043 coli K12 RV308/pPR18, E. coli K12 CÓÜO/ pPR18 és az E. coli K12 C600R_k-M_k-/pPR18 sejtek plazmid nélkül nem túlélők. A törzsek plazmidmegtartási képességének összehasonlításakor világosan kiderül, hogy a találmány szerinti törzsek gyakorlatilag összes élő sejtje tartalmazza az adott píazmidot. Ezenkívül az E. coli K12 2941ambdacl90/pPR18, E. coli K12 RV3081ambdacl90/ pPR18, E. coli K12 C6001ambdacI90/pPR18 és az E. coli K12 CöOORfcNVlambdacWO/pPRlS törzsek nemcsak megtartják a plazmidokat, de termelik az adott fuzionált génterméket is.

Az új pPR12 plazmid transzformálható több gazdasejtbe, például az E. coli K12 C600R_k-M_ksejtekbe. A kapott törzseket a pPR17 és pPRIS transzformánsokhoz hasonlóan lizogenizálhatjuk, amikor plazmid nélkül elpusztuló törzseket kapunk. így az előállított E. coli K12 C600R_K-M_KlambdacI90/pPR12 törzs igényli a pPR12 plazmid. megtartását, míg az előállított E. coli K12 C600R_kM_k-/pPR12 törzs plazmid nélkül is túlélő. A törzsek plazmidmegtartásának összehasonlításakor világosan kiderül, hogy a találmány szerinti élő sejtek mindegyike tartalmazza az adott píazmidot.

A találmány szerinti eljárás szemléltetéséhez használt lambdací857 represszor gén hőmérsékletérzékeny, és 38—44 ’C hőmérsékleten, vagy ennél magasabb hőmérsékleten inaktiválódik. így, ha 38 ’C hőmérséklet és 44 ’C közötti hőmérsékletre helyezzük a sejteket, azok a lambdaprofág lírikus ciklusának indukálódása következtében lizálnak, mivel a találmány szerinti eljárás értelmében a gazdasejtek ezt a profágot tartalmazzák. Ahogy az könnyen érthető, ha a gazdasejt lízisét okozó letális vagy kondicionálisan letális markert represszáló hőmérséklet-érzékeny represszort használunk, továbbá, ha a gazdasejteket a represszort inaktiváló hőmérsékleten tenyésztjük, úgy kondicionálisan letális marker esetén azon a hőmérsékleten, amely nem esik a gazdasejt szaporodását lehetővé tevő hőmérsékletértékek közé, a találmány szerinti továbbfejlesztett szelekciós módszer egyszerű, kényelmes és olcsó eljárást biztosít a sejten belüli termékek tisztításához a sejtek lízisével. Ahogy' azt leírjuk, a találmány szerinti eljárás során olyan plazmidon lévő gént használunk fel, amely egy letális kromoszomális markert represszál. A sejtek szelektálása független a replikontói, és ugyancsak független a plazmidon lévő többi géntől, bár a találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint előnyösen a lambdacI857 bakteriofág cl-t tartalmazó 0,9 kb nagyságú Pstl-HÍncII restrikciós fragmensét használjuk, használhatjuk azonban bármely más, olyan lambda bakteriofág törzs 0,9 kb nagyságú PstlHindcII, cl-t hordozó restrikciós fragmensét, amely funkcionális represszort határoz meg. Továbbá, a találmány szerinti eljárás szemléltetésekor lambda cI90 mutációt hordozó profágot használunk, és így az nem termel funkcionális lambda cl represszort, használhatunk bármilyen olyan lambda bakteriofág mutánst is, amely funkcionális cl represszor gént nem tartalmaz. Nyilvánvaló, hogy ezek a mutánsok a lizogen állapot fenntartására más represszorforr.lst igényelnek. ,

A találmány szerinti szelektív módszerrel egy funkcionális polipeptid kifejeződése fokozódik, és ?z eljárás kiterjeszthető különböző termékeket kifejező plazmidon lévő géneket tartalmazó gazdasejtíkre is. A plazmidon lévő gén például lehet egy természetben előforduló gén, nem természetes gén vagy egy olyan gén is, amely részben természetes, részben pedig szintetikus vagy nem természetben előforduló. Részletesebben szólva, a találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk humán pre-proinzu1 nt, humán proinzulint, humán inzulin A-láncot, humán inzulin B-láncot, humán növekedési hormont, nem humán növekedési hormont, nem humán inzulint, humán interferont, nem humán interferont, vírus antigént, urokinázt, bármely peptid hormont, bármely enzimet, bármely polipeptidet vagy gyakorlatilag bármely kutatási vagy gyakorlati értékű gén terméket meghatározó gént hordozó píazmidot tartalmazó sejtek szelektálására és fenn1 irtására.

A találmány szerinti eljárás egy adott kivitelezési változata szerint a plazmidreplikációt és a géntermékek kifejeződését sorrendben a pMBl-ből származó replikonnal (lásd Bolivár, Life Sci., 25, 807— 818, 1979) és a trp promoterrel határozzuk meg. f4ás replikonokat és promotereket is felhasználhatunk mindaddig, míg azok E. coli K12 sejtekben működnek, és a használt adott represszorra nem érzékenyek. A szakemberek számára érthető és könnyen meghatározható, hogy mely replikonok és promoterek funkcionálnak E. coli K12-ben, és melyek érzékenyek egy adott represszorra. Más rcplikonok például — de nem limitáló jelleggel — az alábbiak: a ColEl, NR1, PK2, RK6, psCIOl, RP1, RP4, F és más, például E. coli K12 sejtekben íeplikálódó bakteriofágokból származó replikonok. Promotorként használhatunk például — de nem limitáló jelleggel — lac promotert, lipoprotcin promotert, riboszomális protein vagy ribonukleinsav promotereket, illetve gyakorlatilag bármely más promotert. Érthető módon előállíthatunk más replikonokat és promotereket is.

Azonkívül, hogy az E. coli K12 előnyös gazdája a lambda bakteriofágnak, a törzsről több genetikai és biokémiai ismeretünk van, így ez a találmány rzerinti eljárás során előnyösen használható. Bár e lőnyösen az E. coli K12 RV308 törzset használjuk, a találmány szerinti eljárás nem korlátozódik egy nemre, fajra vagy törzsre, de alkalmazható bármely E. coli-ra, amelyben a lambda bakteriofág lisogén, és amelybe funkcionális represszor klónozható.

A találmány szerinti eljárás összes kivitelezési változata azzal a közös tulajdonsággal rendelkezik, hogy nem érzékeny a táptalajra. így a találmány izerinti eljárást alkalmazva a termelés fokozására nagyszámú fermentációs változtatást végezhetünk.

Az alábbi példákkal tovább szemléltetjük a találmány szerinti eljárást. A példák előnyös kivitelezési áltozatok, de a találmány oltalmi körét nem szűkítik.

-5197043

1. példa

A ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid előállítása

A) A pBRHtrp plazmid előállítása

A pGMl plazmid hordozza az E. coli triptofán □peront, amely viszont ΔΕΕ1413 deléciót tartalmaz [Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 1457— 1466 (1978)] és ezáltal kifejez egy olyan fúziós proteint, amely tartalmazza a trp vezető szakasz első 6 aminosavát, és körülbelül a trp E polipeptid utolsó harmadát (a továbbiakban LE jellel jelöljük), tartalmazza továbbá a teljes trp ü polipeptidet, és ezek mind a trp promoter operator rendszer szabályozása alatt állnak. Az E. coli K12 W311Otna2trpA102/pGMl törzset az Americal Type Culture Collection törzsgyűjteményében letétbe helyeztük ATCC 31622. sorszám alatt. A pGMl plazmidot a törzsből könnyen elkülöníthetjük, és felhasználjuk az alábbi kísérlethez.

pg plazmidot Pvull restrikciós enzimmel kezelünk, az enzim a plazmidot öt helyen hasítja.

A restrikciós és más enzimeket az alábbi forrásokból szerezzük be:

Bethesda Research Laboratories Inc.

Box 6010,

Rockville, Maryland 20850.

Boehringer Mannheim Biochemicals

7941 Castleway Drive

P.O. Box 50816,

Indianapolis, Indiana 46250.

Research Products

Miles Laboratories Inc.,

Elkhart, Indiana, 46515.

A génfragmenseket EcoRI linkerekke! kombináljuk (ezek önmagukkal komplementer alábbi oligonukleotid-szekvenciát tartalmaznak: pCATGAATTCATG), ily módon egy EcoRI hasítási helyet kapunk, és így a későbbiekben a plazmidba klónozhatunk.

A pGM 1-ből kapott 20 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 10 egység T₄ dezoxi-ribonukieinsav-ligázzal kezeljük, 20 pikomól 5’-foszforilezett, szintetikus oligonukleotid (pCATGAATTCATG) és 20 pl T₄ dezoxi - ribonukleinsav - ligáz - puffer jelenlétében. A ligáz-puffer összetétele a következő:

mmól/1 trisz, ρΙ1=·7,6 0,5 mmól/1 ATP, mmól/1 magnézium-klorid, mmói/1 ditio-treitol.

Egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. Ezután 10 percen át 70 °C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, a ligálás megállítására. A linkereket EcoRI enzimmel való emésztéssel hasítjuk, és az EcoRI végekkel rendelkező fragmenseket 5% poliakrilamidot tartalmazó gélen elektrofo rézissei szeparáljuk. A három legnagyobb fragmenst oly módon izoláljuk a gélről, hogy először etidium-bromiddal festjük, és ezután a íragmense6 két ultraibolya fényben megfigyelve kihasítjuk a gélből. A fragmenseket 300 pl 0,1 XTBE-vel dialízis zsákba helyezzük, és 1 órán át Ο,ΐΧΤΒΕ-pufferban 100 V-on elektroforézist végzünk. A TBE-puffer összetétele a következő:

10,8 g trisz-bázis,

5,5 g bórsav,

0,09 g dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsav, és

Ívíz.

A vizes oldatot összegyűjtjük a dialízis zsákokból, fenollal extraháljuk, az extrakciót kloroformmal megismételjük, és 0,2 mól nátrium-klorid végtérfogatot alakítunk ki. Etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat és vízben okijuk. Áz alábbiakban megadottak szerint azonosítjuk az EcoRI ragadós végekkel rendelkező trp promoter/operatorrendszert tartalmazó gént. Az azonosítást úgy végezzük, hogy a fragmenseket tetraciklinre érzékeny plazmidba építjük be, amely a promoter/operator beépülést követően tetraciklin rezisztenciát fog meghatározni. Az összes dezoxi-ribonukleinsavfragmenst a továbbiakban poliakril-amid gél-elektroforézissel és a fentiekben megadott elekíro-eluciós módszerrel izoláljuk.

B) A Trp promoter/operator szabályozása alatt tetraciklin rezisztenciát kifejező pBRH trp plazmid előállítása és az előzőekben az A) példában megadottak szerint izolált Trp promoter/operator rendszert tartalmazó dezoxi-ribonuklein-fragmens azonosítása és sokszorosítása

A pBRIIl plazmid (Rodriquez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3267—3287, 1979) ampicíllin rezisztenciát határoz meg, és tartamazza a tetraciklin rezisztencia gént, de — mivel nincs promoterhez kötve — ezt a rezisztenciát nem fejezi ki. így a plazmid tetraciklin-érzékeny. Az EcoRI helyre promoter/operator rendszert beépítve a plazmid tetraciklin rezisztenciát fog meghatározni.

A pBRHl plazmidot EcoRI enzimmel hasítjuk. Az enzimet fenolos extrakcióval távolítjuk el, majd kloroformos extrakciót követően a dezcxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással izoláljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav molekulát egy másik reakcióelegyben az IA) példában megadottak szerint előállított három dezoxi-ribonukleinsav-fragmenssel kötjük össze, az előzőekben megadott módon T₄ dezoxi-ribónukleinsav ligázt használva. A reakcióelegyben jelenlévő dezoxi-ribonukleinsawal kompetens E. coli K12 294 sejteket (Backman és munkatársai, Proc. nat. Aead. Sci., USA, 73, 4174-4198, 1976; ATCC 31.446.) transzformálunk ismert módszerrel (Hershfield és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 71, 3455—3459, 1974) és a baktériumokat LB-lemezekre (Miller, 1972) szélesztjük, a táptalaj ml-enként 20 pg ampicillint és 5 pg tetraciklint tartalmaz.

Több tetraciklinre reziszíens telepet szelektálunk, és ezekből izoláljuk a pBRH trp jeliel jelölt plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. Az adott fragmens jelenlétét restrikciós enzim-analízissel bizonyítjuk. A pBRH trp plazmid β-laktamáz-aktivitást határoz meg, ampicíllin rezisztenciát biztosít és a trp pro-611 moter/operator rendszert tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst hordoz. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmens kódolja az első proteint (LE’ jellel jelöljük), ez a trp vezető szakaszának első 6 aminosavát és a trp E polipeptid utolsó harmadát, továbbá egy második proteint (D’ jellel jelöljük), amely megfelel a trp D polipeptid első felének; továbbá egy harmadik, a tetraciklin rezisztencia gén által meghatározott proteinből áll.

C) A pSOM7A2 plazmid előállítása

A pBRH trp plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, és a kapott fragmenseket poliakrilamid gél-elektroforézissel és elektroelucióval izoláljuk. A fragmenseket EcoRl-cnzimmel emésztett pSOMll plazmiddal kombináljuk [ltakura és munkatársai, Sci., 198, V)56 (1977); 2007676A. számú brit szabadalmi leírás]. Az elegyet T₄ dezoxi-ribonukleinsav ligázzal kezeljük, és a kapott dezoxiribonukleinsawal az előzőek szerint eljárva E. coli K12 294 jelű törzset transzformálunk. A transzformáit baktériumokat ampicillint tartalmazó lemezeken szelektáljuk, és a kapott, ampicillinre rezisztens telepeket telep-hibridizációval vizsgáljuk [Gruenstein és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 72, 3951—3965 (1975)]. A pBRH trp plazmádból izolált, és ezután radioaktívan P³²-vel jelzett trp promoter/operator rendszert tartalmazó fragmenst használjuk a hibridizációkor próbaként. Több telep pozitív telep-hibridizációt mutat, ezeket kiválasztjuk. Izoláljuk belőlük a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és a beépített fragmens orientációját restrikciós analízissel meghatározzuk. Az analízist Bglll és BamHI enzimekkel végezzük, kettős emésztéssel. A trp promoter/operator rendszert hordozó fragmenst megfelelő orientációban tartalmazó plazmidot hordozó telepeket LB-táptalajban [Miller (1972)] növesztjük 10 pg/ml ampicillin jelenlétében. Az előállított plazmidot pSOM7A2 jellel jelöljük, és az alábbi kísérletekben használjuk fel.

D) A pTrp24 plazmid előállítása

1. Az LE’ polipeptid távolabbi régióit meghatározó kodonokat és a kódoló szál 5’-, illetve 3’- végein Bglll, illetve EcoRI restrikciós helyet tartalmazó gén-fragmens előállítása

A pSOM7A2 plazmidot HindlII enzimmel emésztjük, majd úgy emésztjük Iambda-exonukleázzal (5’->3’-exonukleáz), hogy az emésztés az LE’-t meghatározó régión belül a Bglll restrikciós hely mellett következzen be. 20 pg HindlII enzimmel emésztett pSOM7A2-t pufferban oldunk. A puffer összetétele a következő:

mmól/1 glicin-puffer, pH=9,6, mmól/1 magnézium-klorid, mmól/1 β-merkapto-etnnol.

A kapott elegyet 5 egység lambda-exonukleázzal egészítjük ki, és 60 percen át szobahőmérsékleten tartjuk. A kapott reakcióelegyet fenollal, majd ezután kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjak.

Az LE’-gén-fragmens távolabbi végére EcoRI helyett felismerési hely készítése céljából továbbfejlesztett foszfo-triésztcr-módszerrel [Crea és munkatársai, Proc. Nat, Acad. Sci., 75, USA, 5765 (1978)] ³²pCCTGTGCATGAT prímért szintetizáljuk, és a lambda-exonukleázos emésztés után ka;>ott LE’-gén-fragmens egyszálú végéhez hibridizáljuk. A hibridizáció elvégzésére 20 pg lambda-exonukleázzal kezelt HindlII emésztett pSOM7A2 plazmidot 20 pl vízben oldunk, és az oldathoz a fentiek szerint eljárva 80 pikomól 5’-foszforilezett oligonukleotidot tartalmazó 6 pl oldatot adunk. A ízintetikus fragmenst az LE’-t meghatározó szekvencia 3’-végéhez hibridizáljuk, és a megmaradó egyszálú LE’-fragmensen lévő rész dATP, dTTP, <1GTP és dCTP nukleotidokat és Klenow-polimeláz 1 enzimet használva kitöltjük. A Klenow-polineráz I a dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I enzimből proteolitikus hasítással kapott fragmens. íhrtalmazza az 5’-*3’-pölimcrizálást elősegítő fehérjét, a 3’—5’-exonukleotikus aktivitást, de nem rendelkezik a szülőenzim 5’—3’-exonukleotikus akivitásával [Kornberg, 1974; Freeman és Co., SFO, 98],

A reakcióelegyet 50 °C hőmérsékletre melegítjük fol, majd lassan 10 “C hőmérsékletre hűtjük, miután 4 pl Klenow-enzimet adunk. 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd az inkubációt 30 percen át 37 °C hőmérsékleten folytatjuk, és a reakciót 5 pl, 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsav adagolásával állítjuk le. Fenollal, majd ezután kloroformmal extraháljuk az elegyet és etanollal kicsapjuk. A dezoxí-ribonukleinsavat ezután Bglll restrikciós enzimmel hasítjuk, és a fragmenseket poliakrilamid-gélen elkülönítjük. A gélről készült autoradiogram szerint 470 bázispárból álló, várt hosszúságú ³²P-jelzett fragmenst kapunk, ezt elektroelúcióval elkülönítjük. A kapott LE’ (d)fragmens Bglll véggel rendelkezik, és egy olyan tompa véggel, amely a primer kezdetével esik egybe.

2. A pThal plazmid előállítása

A pThal plazmid előállítására a pBR322 plazmidba egy szintetizált, timozin-a-1 terméket meghatározó gént építünk be. A timozln-a-l-et meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szintézise egy szintézist és egy ezt követő ligációt jelent, amelynek során 16 oligonukleotidot (Tj— T₁₆) kapcsolunk a molekulához. Ezeket az oligonukleotidokat a mellékelt 7. ábrán kétfejű nyilakkal jelöljük. Az N-terminális véghez egy Met-kodont (ATG) építünk, és az 5’-végeket egyszálú kohézív végekkel látjuk el abból a célból, hogy az EcoRI és a BamHI enzimekkel hasított plazmidhoz kapcsolhassuk. Ahogy az várható, a gén közepén lévő Bglll hely segítséget jelent n rekoinbináns plnznrdok analíziséhez.

A Τ,—T_le oligo-dezöxi-ribonukleotidokat módosított foszfo-triészter-módszerrel állítjuk elő, teljesen védett tridezoxi-ribonukleotid építőköveket 7

-713 használva [Itakura és munkatársai (1977), Science, 198, 1056 és Crea és munkatársai (1978)]. A különböző oligo-dezoxi-ribonukleotidokat az I. táblázatban mutatjuk be.

I. táblázat

A íimozin-a-1 génhez használt szintetikus oligonukleotidok

Vegyület	Szekvencia	Hosszúság	Retenciós idő a HPLC analíziskor (perc)*
Tt	A-A-T-T-C-A-T-G-T-C	10	17,4
T2	T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A	15	24,3
T3	T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A	12	20,3
T4	G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A	13	22,0
T5	G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G	15	24,8
T6	G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A	12	20,1
T7	A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A	13	22,6
T8	A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T	12	20,2
Τ»	G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G	12	20,4
T,o	A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T	12	21,1
T„	G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T	12	20,5
T12	G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G	12	20,4
T,3	C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T	12	19,9
T14	T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C	12	20,5
T15	G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C	12	20,2
T,6	G-A-T-C-C-T-A-T-T-A	10	17,2

* = szobahőmérsékleten.

A fenti szintézist ^ΓΓ',₅ fragmens előállításával szemléltetjük a mellékelt 8. ábrán. A T₎₅ szintézisekor használt különböző nukleotid fragraenseket az ábrán számokkal jelöljük. A rövidítések a következő jelentésiek:

TPSTe:	2,4,6 - tri - izopropil - benzol - szulfonil - tetrazol;
BSA:	benzol-szulfonsav;
TLC:	vékonyréteg-kromatográfia;
HPLC:	nagy felbontású folyadékkromatográfia;
DMT:	4,4’-dimetoxi~tritil-csoport;
CE:	2-ciano-etil-csoport;
R:	p-klór-fenil-csoport;
Bz:	benzoilcsoport;
An:	anizoil-csoport;
iBu:	izobutirilcsoport;
Py:	piridin;
AcOH:	ecetsav;
Et,N:	trietil-amin.

mg (0,05 mmól) 4 és 180 mg (0,1 mmól) 2 teljesen védett tridezoxi-ribonukleotidot az 5’hidroxilcsoportokon hasítunk, és ezzel eltávolítjuk a védőcsoportokat. A reakciót úgy végezzük, hogy a vegyületeket 10 percen át 0 ’C hőmérsékleten tartjuk, kloroform és metanol 7:3 térfogatarányú elegyének 20 ml-ébcn és 10 ml, 2%-os bcnzolszulfonsavban. A reakció leállítására telített, vizes ammónium-bikarbonátot adagolunk 2 ml oldatban, majd 25 ml kloroformmal extraháljuk az elegyet, és végül kétszer 10 ml vízzel mossuk. A szerves oldószeres fázisokat magnézium-szulfáttal víz.mcntcsítjük, körülbelül 5 ml térfogatra töményítjük, és petroléter (35 ’C—60 ’C-os frakció) adagolásával kicsapjuk. A színtelen csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és vákuum-szárítóban csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután megkapjuk a 6 és 8 termékeket. A termék a szilikagél vékonyré teg-kromatográfiás vizsgálat (Merck 60 F254, kloroform és metanol 9:1 arányú elegye) vizsgálatok szerint homogén.

Az 1 és 3 trimerek 270 mg-nyi (0,15 mmól), illetve 145 mg-nyi (0,075 mmól) mennyiségét az 5, illetve 7 foszfe-diészterekké alakítunk oly módon, hogy 10 ml alábbi összetételű elegyben kezeljük 25 _Kg percen át, szobahőmérsékleten:

trietil-amin, piridin és víz 1:3:1 arányú elegye.

A reagenseket rotavaporban eltávolítjuk, és a desztillációs maradékot háromszor 10 ml vízmentes piridinnel való desztíllációval vízmentesítjük. 0,05

P5 mmól 8 trimert és 7 trimert 50 mg (0,15 mmól)

2,4,6 - tri izopropil - benzol - szulfonil - tetrazollal egyesítünk 3 ml vízmentes piridinben, és a reakcióelegyet csökkentett nyomású térben hagyjuk állni 2 órán át, szobahőmérsékleten. A vékonyréteg-kro(;θ matográfiás vizsgálatok szerint a 8 trimer 95%-a hexameter termékké alakult (ezt úgy muztatjuk ki, hogy a 4,4’ - dirnetoxi - tritil - csb|xnlot 10%-os, vizes kénsavai reagáltatjuk, és 60 ’C hőmérsékleten hevítjük a bepermetezett kromatogramot). A reak65 ciót 1,0 ml víz adagolásával állítjuk le, és az oldó-815 szert csökkentett nyomású térben desztillálva eltávolítjuk. A piridint toluollal együtt desztilláljuk, a hexametert pedig 8 ml, 2%-os benzol-szulfonsavval kezeljük, amikor az 5’-csoport lehasad. Ezt a reakciót a 4 és 2 trimerek előállításakor megadottak szerint végezzük. A 10 terméket szilikagélen (Merck 6OH, 3,5X5 cm) tisztítjuk, a gradiens elúciót kloroform és metanol 98:2—95:5 arányú elegyével végezzük. A 10 terméket tartalmazó frakciókat szárazra desztilláljuk.

Hasonlóképpen, az 5 trimert a 6 vegyülethez kapcsoljuk, és a teljesen védett terméket szilikagélen közvetlenül tisztítjuk. Ez utóbbi vegyületet a 3'végen védőcsoport-hasítjuk, a hasítást a 9 fragmens előállításakor megadottakhoz hasonlóan, trietilamin, piridin és víz elegyében végezzük.

Végül a 9 és 10 hexametereket 2 ml vízmentes piridinben, kondezálószerként 75 mg (0,225 mmól) 2,4,6 - tri - izopropil - benzol - szulfonil tetrazolt használva összekapcsoljuk. A reakciót 4 órán át szobahőmérsékleten végezzük, ezután rotavaporban desztilláljuk, és a desztillációs maradékot szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk. A 160 mg súlyú 11 terméket petroléteres kicsapással izoláljuk. A tennék a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint homogén. 20 mg 11 vegyületet 0,5 ml piridinben védőcsoport-hasítunk 7 ml tömény ammónium-hidroxiddal kezelve. A reakciót 8 órán át 60 °C hőmérsékleten végezzük. Ezután a terméket 80%-os ecetsavval kezeljük 15 percen át, szobahőmérsékleten. Az ecetsav desztillációja után a szilárd desztillációs maradékot 4 ml 4%-os, vizes ammónium-hidroxid-oldatban oldjuk és háromszor 2 ml etil-éterrel extraháljuk. A vizes fázist 1-2 ml térfogatúra töményftjük, és egy részét a 72 tisztítására nagy felbontású foíyadékkromatográfiának vetjük alá. A nagy csúcsot mutató frakciókat összegyűjtjük (körülbelül 2,0 O.D,₂₅₄ egység) és 5 ml térfogatúra töményftjük. A 72 végterméket Bio-gel P—2 1,5X100 cm-es oszlopon sómentesftjük, az eluálást 20%-os, vizes etanollal végezzük. A frakciókat szárazra desztilláljuk és 200 pl vízben szuszpendáljuk, ezután A₂₅₄:10 oldatot kapunk. A 72 vegyület szekvenciáját kétdimenziós szekvenciaanalízissel bizonyítjuk.

A teljes timozin-a-1 gént a 16 szintetikus oligonukleotidból állítjuk elő a szomatosztatin [Itakura és munkatársai (1977)} inzulin [Goeddel és munkatársai (1979)} és a növekedési hormon [Goeddel, Heyneker és munkatársai, Natúré, 281, 544 (1979)} előállítása kapcsán megismert módszereket használva, 10 pg-nyi mennyiségű T₂—T₁₅ oligonukleotidot kvantitatív foszforilezünk (gammaP³²)-ATP [New England Nuclear] vegyületet használva T₄ polinukleotid kináz [Goeddel és munkatársai (1979)} jelenlétében, amikor 1 Ci/mmól specifikus aktivitású anyagot kapunk, A radioaktívan jelzett fragmenseket 20% poliakrilamid/7 mól karbamid gélen elektroforézist végezve tisztítjuk, és az eluált fragmensek szekvenciáját kétdimenziós elektroforézis/homokromatográfiával bizonyítjuk [Jay és munkatársai, Nucleic Acids, Rés., 7, 331 (1974)], illetve részleges kígyóméreg-emésztéssel. A T, és T_JÉ fragmenseket nem foszforilezzük a következő íigációs reakciók során bekövetkező, előnytelen polimerizációs reakciók elkerülésére. 2-2 pg fenti oligonukleotidot a 4 fragmens 4 csoportja szerint összekapcsolunk T₄-dezoxi-ribonuklrinsav ligázzal, ismert módszerek szerint [Goeddel <s munkatársai ¢1979)] a mellékelt 9. ábra szerint eljárva. A reakcíóterméket 15% poliakrilamid gélen 7 mól karbamid jelenlétében gél-elektroforézissel tisztítjuk [Maxam és Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 77, 3455 (1977)]. A négy izolált termé1 et egymáshoz kapcsoljuk, és a reakcióelegyet 10% poliakrilamidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve szétválasztjuk. A timozin-a-1 génnek megfelelő dezoxi-ribonukleinsavat (90—105 bázispár) dektroeluáljuk.

0,5 pg pBR322 plazmidot BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázzal kezelünk, és a fragmenseket iX)liakrilamid-gél-elektroforézÍssel elkülönítjük. A gélről elekíroelúcióval izoláljuk a legnagyobb fragucnst, és ezután a szintetikus dezoxi- ribonukleinsavhoz Egáljuk [Goeddel, Hayneker és munkatársai (1979)]. Az eleggyel E. coli K12294 (ATCC 31446.) törzset transzformálunk. A transzformáci5s elegy 5%-át 20 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-iáptalajra szélesztünk. A kapott négy ampicilinre rezisztens telep tetraciklinre érzékeny, ez azt elenti, hogy a beépülés a tetraciklin rezisztenciát meghatározó génbe történt. A négy telepből izolált plazmidok analízise szerint (ezeket pThal jellel jelöljük) a plazmidok tartalmaznak

a) a pBR322-ben nem található BglII restrikciós helyet, ami — ahogy a 7. ábrán is látjuk — a timozin-a-1 gén jelenlétére utal, és

b) egy körülbelül 105 bázispártról álló fragmenst, amely a BamHI/EcoRI hasítás során jön létre.

A pThal plazmid előállítását a mellékelt 9. ábrán mutatjuk be, az ábra nem méretarányos, és a vastagon kihúzott vonalak az 5’-foszfát-csoportokat reprezentálják.

3. A kezelt pTHal és az LE’ (d)-fragmens reakciója

A pTHal plazmid ampicillin rezisztencia gént tartalmaz, és tartalmaz a timozin-a-l-el meghatározó struktúrgént az 5’-kódoló végén egy EcoRI helyen, illetve a 3’-végen egy BamHI helyen. A timozin gén tartalmaz BglII helyet is. A fentiek szerint előállított LE’ (d)-fragmenst befogadni képes plazmid előállítására a pTHal dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI enzimmel hasítjuk, és ezután az EcoRI fragmensek végeinek tompa végekké való alakítására dTTP és dATP jelenlétében Klenowpolimeráz I enzimmel kezelünk. A kapott terméket BglII enzimmel hasítva olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst kapunk, amely tartalmazza az amplicillinrezisztenciát meghatározó gént, és az ellenkező végen egy ragadós BglII szakaszt és egy tompa véget. A kapott terméket BglII ragadós véget és egy tompa véget tartalmazó LE’-(d)fragmenssel reagáltatva újra körré zárhatjuk T₄ ligáz jelenlétében, amikor megkapjuk a pTrp24 pkizmidot. Ily módon azon a helyen, ahol a tompa végek ligálása bekövetkezik, újra létrejön az EcoRI hely.

-917

E) A pSOM7A2A4 plazmid előállítása

A pTrp24 plazmidot BglH és ezután EcoRi enzimmel hasítjuk, majd poliakrilamid-gélen elektroforézist és ezt követően elektroelúciót végzünk, amiután olyan LE’(d)-polipeptidet meghatározó kodonokat tartalmazó fragmenst kapunk, amely BglII ragadós véggel és a 3’-kódoló véggel szomszédosán egy EcoRi ragadós véggel rendelkezik. Az LE’ (d)-fragmensí a pSOM7A2 plazmid BglII helyére kiónozhatjuk, amikor olyan LE’ polipeptid/szomatosztatin fúziós proteint kifejező terméket kapunk, amely a triptofán promoter/operator szabályozása alatt áll. Ennek érdekében

1. a pSOM7A2-t EcoRi enzimmel részlegesen emésztjük a triptofán promoter/operatortól távol eső EcoRi hely hasítására, és

2. megfelelően választjuk ki a primer-szekvenciát, annak érdekében, hogy megtartsuk a kodon leolvasási fázisát, és újra létrehozhassunk egy EcoRi hasítási helyet.

pg pSOM7A2 plazmidot 200 pl, 20 mmól/1 íriszt, pH — 7,5, 5 mmól/1 magnézium-klorklot, 0,02 NP40 detergenst és 100 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazd pufferral hígítunk, és 0,5 egység EcoRi restrikciós endonukleázzal hasítunk. 15 percen át 37 ’C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd fenollal extraháljuk, az extrakciót kloroformmal megismételjük, etanollal kicsapjuk, és ezután BglII endonukleázzal emésztjük. A nagyobb fragmenst poliakrilamid-gélen elektroforézist végezve és ezután eíektroelúcióval izoláljuk. A fragmens tartalmazza az LE’ polipeptid proximális végét leíró „LE’(p)” kodonokat, azaz ez a BglII helytől felfelé haladva helyezkedik el. A fragmenst a fenti LE’(d)-fragmenshez ligáljuk T₄-dezoxi-ribonukleínsav ligázt használva amikor megkapjuk a pSOM7A2A4 plazmidot. Ezzel E. coli 294 törzset transzformálunk, így fúziós protein létrehozására alkalmas sejtet kapunk, amely protein áll az LEpolipeptidből és a szomatosztatinból, és amely kifejeződés a triptofán promoter/operator szabályozása alatt áll.

F) A 3’-végen PstI csoportot és az 5’-vágen BglII csoportot és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó lineáris dezoxi ribonukleinsav előállítása

A pBR322 plazmidot Hindlll enzimmel emésztjük, és a kapott Hindlll végeket SÍ nukleázzal emésztjük. Az SÍ nukleázos kezelés során 10 pg Hindlll enzimmel hasított pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat 30 pl Sl-pufferban (0,3 mól/1 náírium-klorid, 1 mmól/1 cink-klorid, 25 mmól/1 nátrium-acetát, pH — 4,5) 300 egység SÍ nukleázzal kezelünk 15 ’C hőmérsékleten, 30 percen át. A reakciót 1 pl 30XS1 nukíeáz stop-oldattal állítjuk le. Az oldat összetétele a következő:

0,8 mól/1 trisz-bázis és mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav.

Az elegyet fenollal és ezután kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és ezután az előzőek

Q szerint eljárva EcoRi enzimmel hasítjuk. A fragmenst poliakrilamid gél-elektroforézist követő eíektroelúcióval izoláljuk, a fragntens EcoRi ragadós véggel és egy tompa véggel rendelkezik, kódoló szálja íimidin nukleotiddal kezdődik. A timidinnel kezdődő Sí enzimmel emésztett Hindlll fragmenst hozzá kapcsoljuk Klenow-polimeráz I enzimmel kezelt BglII fragmenshez, így ligációí követően újra létrejön a BglII restrikciós hely.

Az IC) példában megadottak szerint előállított pSOM7A2 plazmidot tehát BglII endonukleázzal hasítjuk, és a kapott BglII ragadós végeket kétszálúvá alakítjuk a négy dezoxi-nukleotid-írifoszfát jelenlétében Klenow-polimeráz 1 enzimmel. A kupott terméket EcoRi enzimmel hasítjuk, majd a kis fragmenst poliakrilamid-gélen elektroforézist végezve, és elektroeluálva izoláljuk, amikor olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav-molekulát kapunk, amely tartalmazza a triptofán promoter/operator rendszert, és a BglII helytől felfelé haladva az LE’ proximális szekvenciát („LE’/p/”). A termék egy EcoRi véggel és a BglII hely feltöltése révén egy tompa véggel is rendelkezik. A BglII helyet újralétrehozzuk oly módon, hogy a tompa véget hozzákapcsoljuk a fentiek szerint SÍ enzimmel emésztett Hindiit fragmens tompa végéhez. így a két fragmenst T₄ dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenlétében összekapcsoljuk, amiután megkapjuk a pHKYlO kör alakú plazmidot, amit E. coli 294 kompetens sejtekbe transzformálva szaporítunk. A tetraciklinre rezisztens sejtek hordozzák a pHKYlO rekombináns plazmidot, ezeket szelektáljuk, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izoláljuk. A terméket BglH és PstI restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, majd a nagy fragmenst poliakrilamid gélen elektroforézist végezve és eíektroelúcióval izoláljuk, amiután megkapjuk a PstI és BglII ragadós végekkel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsav-molekulát Ez a pHKY10-ből előállított dezoxi-ribonukleinsavfragmens replikációs origint tartalmaz, és így felhasználható a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid előállítására, amelyben mind a trp LE’-polipeptid fúziós proteint meghatározó gének, mind pedig a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén a trp promoter/operator rendszer szabályozása alatt áll.

G) A trp promoter/operator rendszerrel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása

Az 1E) példában megadottak szerint előállított pSOM7A2A4 plazmidot EcoRi, majd ezután PstI enzimmel hasítjuk. A kapott fragmens tartalmazza a trp promoter/operator rendszert, a fragmenst poliakrilamid gél-elektroforézissel és az ezt követő eíektroelúcióval izoláljuk. A részleges EcoRi enzimmel való emésztés azért szükséges, hogy olyan fragmenst kapjunk, amely a szomatosztatint meghatározó gén 5’-végéveI szomszédosán hasított, de nincs hasítva az ampicÍllin rezisztenciát meghatározó gén és a triptofán promoter/operator szabályozó szakasz között jelenlévő EcoRi helyen. A PstI enzimmel való hasítást követően az ampicillin rezisztenciát meghatározó gén hasad, ezt az IF/ pél-1019 dában megadottak szerint előállított végső pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav-származékkal való ligációval újra létrehozhatjuk.

H) Az inzulin A lánc struktúrgénjének izolálása

Az inzulin A lánc struktúrgénjét a plAl plazmid EcoRI és BamHI emésztésével kapjuk. A plazmid előállítását Goeddel és munkatársai írják le {Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 106 (1979)]. Az előállítandó fragmenst poliakrilamid gélen elektroforézist és ezután elektroelúciót végezve tisztítjuk, a fragmens EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik.

I) Az inzulin A lánc struktúrgénjének, a triptofán promoter/operator rendszernek és a PstI és BglII végekkel rendelkező pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmens ligálása

Az inzulin A láncot meghatározó stuktúrgént, a triptofán promoter/operator rendszert tartalmazó, az 1G) példa szerint előállított lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst és az 1F) példában megadottak szerint előállított pHKYlO lineáris dezoxi-rubonukleinsav-fragmenst megfelelő orientációban összekapcsoljuk, ahogy azt az 1. ábrán megadjuk, így megkapjuk a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmidot. A ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid könnyen szelektálható, mivel az apicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó szakaszok újra képződnek.

2. példa

A ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid előállítása

Az 1A/-I/ példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az inzulin A láncot meghatározó stniktúrgén helyett az inzulin B láncot meghatározó struktúrgént használjuk a végső ligáláskor. Az inzulin B láncot leíró struktúrgént a pIBl plazmid EcoRI és BamHI emésztésével kapjuk, a plazmidot Goeddel és munkatársai írják le (1979). Az inzulin B láncot meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst poliakrilamid gél-elektroforézissel és elektroelúcióval tisztítjuk, a fragmens EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik.

A ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmidot a 2. ábrán mutatjuk be, a plazmid könnyen szelektálható, mivel ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó génjei újra létrejönnek.

3. példa

A pPR3 plazmid előállítása

A) A cl, rex és a cro gén egy részét meghatározó lambda bakteriofág 2,5 kb nagyságú BglII restrikciós fragmensének izolálása

A lambda c!857 bakteriofágban lévő több BglII restrikciós hely és a ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmidban lévő egyetlen BamHI restrikciós hely lehetővé teszi azt, hogy a bakteriofág fragmenseit klónozzuk a ρΙΒ7Δ4Δί klónozó vektorba. A lambda c!857 bakteriofág hat olyan helyet hordoz, amely érzékeny BglII enzimre. A BglII fragmensek egyike 2,5 kb nagyságú, tartalmazza a lambda cl gént és a lambda rex gént is {Szybalski és Szybalski, Gene, 7,217—280 (1979); és O’Brien, Genetic Maps, 1. kötet (1980 március); NIHJ. A BglII fragmensek 5’-irányban meghosszabbított GATC-szekvenciát tartalmaznak, ezek komplementerek a BamHI fragmensek 5’vágéveL A ρΙΒ7Δ4Δ1 humán inzulint meghatározó plazmid egyetlen olyan helyet tartalmaz, amely BamIII endonukleázzal hasítható. A BanrHI helybe klórt ózva a tetraciklin rezisztencia gén a ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmidban inaktiválódik. A BglII fragmensek és a BamEI fragmensek ligációját követően az alábbi szekvencákat tartalmazó rekombinánsok jönnek létre:

AGATCC GGATCT

TCTAGG ⁷³⁸⁷ CCTAGA.

Ezek a szekvenciák BglII vagy BamHI enzimekkel nem hasfthatók. Ezért a két enzimmel való hasításkor mindegyik ligácíós fragmens eliminálódik, kivéve azt, amelyik egy lambda BglII fragmenst tartalmazó a ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid BamHI helyébe építve.

A restrikciós enzimeket ismert forrásokból szereztük be, ezeknek a cégeknek a címét az 1 A) példában adjuk meg; az enzimeket ismert módszerek szerint használjuk. Megemlítjük, hogy a használatukkal kapcsolatban az előállítható is mellékel utasításokat.

A lambda cI857 sus S, dezoxi-ribonukleinsavat 37 ’C hőmérsékleten hasítjuk olyan reakcióelegyben, at íely 100 pg dezoxi-ribonukleinsavat, 12 nuuót trssz-hidrogén-kloridot (pH — 7,5), 12 mmól magnézium-kloridot, 12 mmól 2-merkapto-etanolt és 100 egység BglII restrikciós enzimet tartalmaz 1 ml térfogaiban. A restrikciós fragmenseket agaróz gélen végzett elcktroforézisscl különítjük el. Az elkülönült fragmenseket a gélen etidium-bromiddal festjük meg, és ultraibolya fényben fluoreszcencia alapján figyeljük meg. A számunkra érdekes, 2,5 kb nagyságú fragmenst kihasítjuk a gélből, és TBE-oldatba elektródra áljuk, ahogy azt az IA) példában megadtuk. A vizes oldatot összegyűjtjük a dialízis után, és DEAE-cellulór oszlopon vezetjük át. Gyantaként 0,5 ml Whatman DE52 gyantát használunk (Whatman Inc., 9 Bridewell Piacé, Clifton, New Jersey 07014). Az oszlopot egyensúlyozó pufferral egyensúlyozzuk ki, ennek összetétele a következő:

0,1 mól/1 kálium-klorid, '0,0 mmól/I trisz-hidrogén-klorid, pH — 7,8.

Az oszlopot 2,5 ml egyensúlyi pufferral mossuk, és a k örülbelül 5 pg súlyú dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 ml, az alábbiakban megadott összetételű eluáló pufferral eluáljuk:

mól/J nátrium-klorid,

Í0 mmól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH =· 7,8.

Az eluátumhoz annyi nátrium-kloridot adunk, hogy a nátrium-ion koncentrációja 0,35 mól/1 legym. Ezután 2 térfogat (körülbelül 9 ml) 1(K)%-os etanol adagolásával kicsapjuk adezoxi-ribonukleinsavi.t, majd 16 órán át—20 ’C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót. A dezoxi-ribonukleinsav csapadékot

-1121

1S7043 centrifugálással ülepítjük, 75%-os etanollal mossuk és szárítjuk A dezoxi-ribonukleínsav-fragmens izolálását poliakrilamid gél-elektroforézissel, elektroeluálással, DEAE-cellulóz kromatográfiával és etanolos kicsapással végezzük, ahogy azt az előzőekben megadtuk

A dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetételű TE-pufferban újra oldjuk:

mmól/l etilén-diamin-tetraecetsav, mmól/l trisz-hidrogén-klorid, pH — 7,8.

Β) A ρ!Β7Δ4Δ1 plazmid emésztése Bambii restrikciós enzimmel

A ρ!Β7Δ4Δ1 plazmid hasítását 37 ’C hőmérsékleten végezzük 50 pl, 20 mmól/l trisz-hidrogén-kloridot, pH — 7,0, 100 mmól/l nátrium-kloridot, 7 mmól/l magnézium-kloridot, 2 mmól/l 2-merkaptoetanolt és 10 egység BamHI restrikciós endonukleázt tartalmazó reakcióelegyben.

C) A lambda cl fragmens ligálása a BamHI enzimmel emésztett ρΙΒ7Δ4Δ1 Bglll végeihez

A T₄ dezoxi-ribonukleinsav ligázzal való ligálást 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben végezzük:

1.4 pg, 2,5 kb nagyságú Bglll fragmens (a 3A) példa szerint állítjuk elő),

1.5 pg, a 3B) példa szerint előállított, BamHI enzimmel hasított ρΙΒ7Δ4Δ1 dezoxi-ribonukleinsav, mmól/l trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8, mmól/l ditio-treitol,

57o glicerin, mmól/l magnézium-klorid,

0,1 mmól/l ATP és

0,1 egység T₄ dezoxi-ribonukleinsav ligáz.

A reakcióelegyet 4 ’C hőmérsékleten inkubáljuk órán át, majd a reakció leállítására 5 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk Az, így előállított pPR3 plazmidot további felhasználásig 4 ’C hőmérsékleten tároljuk

4. példa

A PR3 plazmid transzformálása E. coli K12 C600R_K—M_K-sej lekbe

Az E. coli K12 C600R_K-M_K- friss, 16 órás tenyészetével [lásd Chang és Cohen, Proc. Nat. Acad. Sci., 77, 1030-1034 (1974)] 1:10 arányban friss Lűevest oltunk [lásd Miller, Experiments in Molecular Geneíics, Coki Spring Harbor Labs,, Cold Spring Harbor, New York (1972)], és a tenyésztést 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten végezzük. A 660 Klett-egységnyi sűrűségű sejttenyészeteí centrifugáljuk, a sejteket 2,5 m! 100 mmó!/l koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal mossuk, és ezután 150 mmólos, 10% glicerint tartalmazó kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk Ezután 20 percen át szobahőmérsékleten inkubálunk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 0,5 ml kalcium12 klorid-glicerin-oldatban szuszpendáljuk, 3—5 percen át jégfürdőben tartjuk, majd lefagyasztjuk. A sejtszuszpenziót felhasználásig folyékony nitrogén alatt tartjuk. Az előkészítés és a tárolás nem befolyásolja az élőképességet vagy a kovalensen kapcsolt, kör alakú dezoxi-ribonukleinsawal végzett transzformálást. A sejteket jégfürdőben felolvasztjuk és 0,1 m! sejtszuszpenziót 0,05 ml dezoxi-ríbonukleinsawal elegyítünk (5 pl, a 3C) példában megadottak szerint előállított pPR3 dezoxi-ribonukleinsavat 45 pl 0,lxSSC-oldattal ístandard nátriuni-klorid-citrát-oldat) elegyítünk. Az így előállított mintákat 20 percen át jégfürdőben hűtjük, 1 percen át 42 “C-ra helyezzük, további 10 percen át hűtjük jégfüidőben, majd 0,85 ml Lrlevessel hígítjuk, és ezután 2 órán át 32 ’C hőmérsékleten inkubálunk. A tenyészeteket L-agarra (lásd Miller, 1972) szélesztjük, ügy, hogy IX10’ lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 egységet kapjunk [lásd Backman és munkatársai, Science, 196, 182 (1977)]. z\ tenyészeteket 32 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A transzforniánsokat úgy szelektáljuk, hogy 32 ’C hőmérsékleten vizsgáljuk a lambdaKH54hIambda és a . lambdaKH54h8ö bakteriofágokkal szembeni immunitást. A rekombinánsokat 32 ’C hőmérsékleten Ap', Te⁵ karakterre, IambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 immunitásra, továbbá 42 ’C hőmérsékleten lambdaKH54hlambda és IambdaKH54h80 érzékenységre vizsgáljuk. Egy transzformánst szelektálunk, és E. coli K12 C60ÓR_K-M_K-/pPR3 jellel jelöljük. Ezt a túlélő telepet a várt fenotípusra vizsgáljuk, és felhasználjuk az előállított pPR3 rekombináns plazmid sokszorosítására és izolálására. A pPR3 plazmid restrikciós enzimes analízise azt jelzi, hogy nem a lamda cl, hanem a lambda rex gén esik közelebb a triptofán E-inzulin B lánc génjéhez.

5. példa

A PR3 plazmid sokszorosítása és izolálása

Az E. coli K12 C600R_K-M_K-/pPR3 plazmid dezoxi-ribonukle insavát klóra mfen ikollal sokszorosítjuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat tisztított lizátummódszerrel izoláljuk [lásd Bazaraí és Helinski, J. Mól. Biok, 36, 185—194 (1968)]. A kovalensen zárt, kör alakú dezoxi-ribonukleinsavat céziumklorid és propidium-dijodid egyensúlyi ultra-centrifugálással tisztítjuk. A propidium-jodidot 2-propanollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat cézium-kloridban tároljuk —20 ’C hőmérsékleten. A dezoxi-ribonukleinsav munkaoldatait SSC/10 pufferban oldjuk (0,015 mól/1 nátrium-klorid, 0,0015 mói/1 nátrium-citrát, pH = 7,0), oly módon, hogy Sephadex PD10 gyantán kromatografáljuk (Phármacia, 800 Centennial Ave, Piscataway, New Jersey 08851).

-1223

ő. példa

A pPR12 plazmid előállítása

A) Lineáris, Pstl és Hinclí végekkel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó íambda cí gén izolálása

Az 5. példában megadott módon előállított 70 pg mennyiségű pPR3 plazmidot 70 μΐ alábbi összetételű 1OX Pstl-pufferba oldunk:

200 mmól/1 trisz-hidrogén-kíorid, pH = 7,5,

100 mmól/1 magnézium-klorid,

500 mmól/i ammónium-szulfát.

Az oldathoz 50 μί, 1 mg/ml koncentrációjú marhaszérum albnmin-oklatot és 555 gl vizet adunk, majd 15 percen át 65 'C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután 25 μί (1 egység/μί) Pstl restrikciós enzimet adagolunk, és a kapott reakcióelegyet 4,5 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott Pstl restrikciós fragmenseke ismert módon izoláljuk poliakrilamid gél-elektroforézissel. Mivel a pPR3 plazmid két Pstl restrikciós helyet tartalmaz, teljes Pstl emésztést követően egy 3,6 kb nagyságú fragmenst és egy 4,2 kb nagyságú fragmenst kapunk. Az utóbbi fragmens tartalmazza a számunkra érdekes Íambda cl bakteriofág gént. így a 4,2 kb nagyságú fragmenst a fentiekben megadott módon izoláljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav üledék tartalmazza a számunkra fontos 4,2 kb nagyságú restrikciós fragmenst, így ezt az üledéket 50 μΐ TEpufferban szuszpendáljuk. A dezoxi-ribonukleinsav szuszpenziót ezután 15 percen át 65 ‘C hőmérsékleten inkubáljuk, majd felhasználásig 4 ’C hőmérsékleten tároljuk.

pl fenti, 4,2 kb nagyságú Pstl restrikciós fragmenst, löm μ! 1 ΟΧ HincH-puffert (100 mmól/i trisz-hidrogén-kíorid, pH = 7,9, 600 mmól/1 nátrium-klorid, 66 mmól/1 magnézium-klorid, 10 mmól/1 ditio-treitetol), 38 μΐ vizet és 2 μΐ, 10 egység/μΐ töménységű Hindi restrikciós enzimet elegyítünk, és az elegyet 20 percen át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 5 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk. 20 ’C hőmérsékletre hűtjiik az elegyet, és ezután 200 μΐ TBE-oldatot adagolunk, és a restrikciós fragmenseket poliakrilamid gélelektroforézissel izoláljuk. A kapott 0,9 kb nagyságú Pstl-HinclI restrikciós fragmens tartalmazza a Íambda cl bakteriofág gént. A terméket 10 μΐ TEpufferban oldjuk és 4 ’C hőmérsékleten tároljuk.

B) A Hindi és a Pstl végekkel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó td gén és egy replikon izolálása

100 pl (3,2 pg) pBR322 plazmidot, 15 pl 1 ΟΧ HincH-puffert, 34 μΐ vizet és 1 pl (10 egység/μΐ) Hinclí restrikciós enzimet elegyítünk, és az elegyet 37 ’C hőmérsékleten, 20 percen át inkubáljuk. Ezután 5 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk. 4 ’Cra hűtjük a reakcióelegyet, és a 3. példában megadottak szerint eljárva, etanollal kicsapjuk. A kapott Hinclí enzimmel részlegesen emésztett pBR322-í az alábbi oldatban szuszpendáljuk:

pl 1 ΟΧ Pstl-puffer, és pl víz.

A kapott szuszpenziót 5 percen át 65 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 4 ’C-ra hűtjük. Ezután 10 pl, 1 mg/ml töménységű boíjúszérum-albumint és 2 μί Pstl restrikciós enzimet (10 egység/ml) adagolunk. A kapott reakcióelegyet 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 5 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk, végül 4 ’C hőmérsékletre 1 ütjük. A kapott HincII-PstI restrikciós fragmenst ismert módon izoláljuk poliakrilamid gél-elektroforézisseí. Az elektroelűcióval kapott dezoxi-riborukleinsavat TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig a ’C hőmérsékleten tároljuk.

C) A Íambda cl gént tartalmazó fragmens és a Pstl és Hinclí végekkel rendelkező lineáris pBR322 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens ligálása μί (1,8 pg), a 6A) példában megadottak szerint előállított 0,9 kb nagyságú HinclI-Pstl fragmenst, 10 pl (0,9 pg) 4 kb nagyságú, a 6B) példában megadottak szerint előállított Pstl-Hindl-fragmensf elegyítünk, és kétszer etanollal kicsapunk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 2 μί 5X-ügációs pufferban oldunk (a ligációs puffer összetétele a következő: 250 mmól/1 trisz-hidrogén-kíorid, pH — 7,8, 50 mmól/1 magnézium-klorid, 25 mmól/1 Jitio-treitol és 25% glicerin), és az oldathoz 4,67 μί vizet adunk. Ha 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd 3 pl, 0,66 mmól-os ATP és 0,33 pl (2 egység/pl) T dezoxi-ribonukleínssv ligáz-oldatot adagolunk. A kapott ligációs elegyet 1,5 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, amiután megkapjuk a pl’R12 plazmidot. Λζ így előállított plazmid dezoxi-ribonukleinsavat felhasználásig 4 ’C hőmérsékleten tároljuk.

7. példa

A pPR12 plazmid transzformálása E. coli K12 C600R_k-M_k-sejtekbe

A transzformációt a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pPR3 plazmid helyett a pPR12 plazmidot használjuk. A transzformánsokat úgy szelektáljuk, hogy vizsgáljuk immunitásukat lambdaKH54h!ambda és lambdaKH54h80 bakteriofágokkal szemben. A vizsgálatokat 32 ’C hőmérsékleten végezzük. A rekombinánsok Ap’ és Te¹ karakterét vizsgáljuk, és 32 ’C hőmérsékleten megállapítjuk lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 immunitásukat és megvizsgáljuk 42 ’C hőmérsékleten érzékenységüket lambdaKH54hlambda és IanibdaKH54h&0 bakteriofágokkal szemben. Egy transzformánst kiválasztunk, és E. coli K12 C600R_k-M_k-/pPRl2 jellel jelöljük. Ezt a túlélő telepet megvizsgáljuk a várt fenotípusra, és fehasználjuk a pPR12 plazmid sokszorosítására és izolálására.

-1325

8. példa

A pPR12 plazmid sokszorosítása és izolálása

A pPR12 plazmid sokszorosítását és izolálását az

5. példában megadottak szerint végezzük.

9. példa

A pPR17 plazmid előállítása

A) A lambda cl gént és egy replikont tartalmazó pPR12 plazmidból származó 4,7 kb nagyságú EcoRI-BamHI lineáris fragmens izolálása

A 8. példában megadottak szerint előállított pPR12 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 150 μΐ-ét (20 pg), 20 μΐ 1 ΟΧ BamHl-puffert (200 mmól/I trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,0, 1 mol/1 nátriumklorid, 70 mmól/1 magnézium-klorid, 2 mmól/l 2-merkapto-etanol), 2 μΐ (20 egység/μΐ) BamHI restrikciós enzimet és 28 μΐ vizet inkubálunk 30 percen át, 37 ’C hőmérsékleten, majd 1,3 órán át szobahőmérsékleten, végül 65 ’C hőmérsékleten, 5 percen át. 4 ’C hőmérsékletre hűtjük a reakcióelegyet, 4 μΐ (10 egység/μΐ) EcoRI restrikciós enzimet adagolunk. A kapott reakcióelegyet 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, amiután megkapjuk a 4,7 kb nagyságú restrikciós fragmenst. A fragmenst poliakrilamid gél-elektroforézissel és elektroelucióval izoláljuk, a kapott dezoxi-ribonukleinsavat TE-pufferban szuszpendáljuk, és felhasználásig —4 ’C hőmérsékleten tároljuk.

B) A triptofán 1’ E’ és a humán inzulin A láncát tartalmazó fúziós polipeptidet meghatározó gént hordozó, ρΙΑ7Δ4Δί plazmidból származó 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI lineáris fragmens izolálása

Az izolálást a 9A) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pPR12 plazmid helyett a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmidot használjuk. Ezenkívül az EcoRI restrikciós enzimmel csak félórán át végezzük a reakciót, mivel részleges EcoRI emésztésre van szükségünk. A dezoxi-ribonukleinsavat poliakrilamid gél-elektroforézissel, elektroelúcióval és kicsapással izoláljuk, és az fgy kapott

1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmenst az alábbi ligációs reakcióban azonnal felhasználjuk.

C) Az inzulin fuzionált génjének és az EcoRI és BamHI végekkel rendelkező lineáris pPR12 dezoxí-ribonukleinsav-fragmens ligálása

A 9A) példában megadottak szerint előállított

1,5 pg-nyi mennyiségű, 4,7 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot és a 9B) példában megadottak szerint előállított 1,5 pg mennyiségű, 1,3 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsavat elegyítünk, és kétszer etanollal kicsapjuk. A csapadékot 6 pl vizet és 2 pl 5X-ligációs puffért tartalma14 zó elegyben oldjuk, és ezután 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubációt követően 15 ’C-ra hűtjűk az elegyet, és 2 μΐ, 0,66 mmól/1 koncentrációjú ATP-oldatot és 0,1 μΐ (1 egység/μΐ) T₄ dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adagolunk. A ligációs reakciót 15 ’C hőmérsékleten végezzük 18 órán át, amiután megkapjuk a pPR17 plazmidot.

10. példa

A pPR17 plazmid transzformálása E. coli K12 CőOORx-Mk-sejtekbe

A transzformációt a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pPR3 plazmid helyett a pPR17 plazmidot használjuk. A transzformánsokat 32 ’C hőmérsékleten lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 bakteriofágokkal szembeni immunitásuk alapján szelektáljuk. A rekombinánsok Ap’ és Te¹ fenotfpusát bizonyítjuk, 32 ’C hőmérsékleten vizsgáljuk lambdaKH54hlambda és !ambdaKH54h80 immunitásukat, illetve 42 ’C hőmérsékleten bizonyítjuk lambdaKH54hiambda és lambdaKH54h8ü bakteriofágokkal szembeni érzékenységüket. Egy transzformánst szelektálunk, és E. coli K12 C600R_K-M_k/ pPR17 jellel jelöljük. Ezt a túlélő telepet vizsgáljuk a várt fenotípusra, és a pPR17 plazmid sokszorosítására és izolálására használjuk fel.

példa

A pPR17 plazmid sokszorosítása és izolálása

A pPR17 plazmid sokszorosítását és izolálását az

5. példában megadottak szerint végezzük.

12. példa

A pPR18 plazmid előállítása

Az előállítást a 9A(—9C) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid helyett a ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmidot használjuk az 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmens elkészítéséhez.

13. példa

A pPR18 plazmid transzformálása az E. coli K12 C600I\-M_k-sejtekbe

A transzformációt a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a •pPR3 plazmid helyett a pPR18 plazmidot használjuk A transzformánsokat 32 ’C hőmérsékleten, a lambdaKH54hlambda és a lambdaKH54h80 bakteriofágokkal szembeni immunitás alapján szelektáljuk. A rekombinánsok Ap’ és Tcr fenotfpusát bizonyítjuk, és meghatározzuk 32 ’C hőmérsékleten

-142?

a lambdaKH54hiambda és a lainbdaKH54h80 iátokkal szembeni immunitást. 42 ’C hőmérsékleten határozzuk meg a lambdaKH54híambda és a lambdaKH54h80 bakteriofágokkal szembeni érzékenységet. Egv transzformánst szelektálunk, és E. coli K12 C6ÜOR_k-M_k-/pPR18 kódszámrnal jelöljük. Ezt a túlélő telepet a várt fenotípusra vizsgáljuk, és felhasználjuk a pPR18 plazmid sokszorosítására és izolálására.

14. példa

A pPR17 plazmid transzformálása az E. coli K12 294 sejtekbe

A találmány szerinti plazmidokat módosítjuk a Κ-restrikciós rendszerre! szemben oly módon, hogy E, coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk. Az E. coli K12 294 R_t-M_k ⁺, így transzformációt követően a nem módosított dezoxi-ribonukleinsav plazmid módosul és rezisztenssé válik Rj.⁺Mk⁺ specificitású törzsek restrikciós hatásával szemben. így az E. coli K12 294 transzformánsokat felhasználjuk a találmány szerinti plazmidok sokszorosítására és izolálására az ezt követő Rk⁺M_k ⁺ E, coli transzformálásokhoz. Ilyen törzs például az E. coli K12 RV308.

A transzformációt a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 G600R_k-M_k-sejtek helyett az E. coli K12 294 sejteket használjuk, és a pPR3 plazmid helyett pedig a pPRÍ7 plazmidot. A transzformánsokat Tc^r fenotípusra szelektáljuk. A rekombinánsok Ap³ és Tc^r fenotfpusát bizonyítjuk, és 32 ’C-on megállapítjuk lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 immunitásukat, illetve 42 ’C hőmérsékleten a lambdaKH54híambda és a lambdaKK54h80 bakteriofágokkal szembeni szenzitivitásukat. A transzformánsok 100%-os genetikai kapcsolatot mutatnak a plazmidon lévő markerek tekintetében. Egy transzformánst szelektáltunk és E. coli K12 294/pPR17 jellel jelöltünk. A telep várt fenotfpusát vizsgáljuk, és felhasználjuk a pPR17 plazmid sokszorosítására és izolálására.

15. példa

A pPR17 plazmid sokszorosítása és izolálása

A pPR17 plazmid sokszorosítását és izolálását az

5. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 294/pPR17 törzset használjuk.

16. példa

A pPRl8 plazmid transzformálása az E. coli KI2 294 sejtekbe

A transzformációt a 14. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pPR17 plazmid helyett a pPR18 plazmidot használjuk.

17. példa

A pPR18 plazmid sokszorosítása és izolálása

A pPR18 plazmid sokszorosítását és izolálását az

5. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 294/pPR18 törzset használjuk.

18. példa

A pPR17 plazmid transzformálása az E. coli K12 RV308 sejtekbe

A transzformációt a 14. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 15. példában megadottak szerint előállított pPR17 plazmidot és az E. coli K!2 RV308 sejteket használjuk.

19. példa

A pPR18 plazmid transzformálása az E. coli K12 RV308 sejtekbe

A transzformációt a 14. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 17. jéldában megadottak szerint előállított pPR18 plazmidot és az E. coli K12 RV308 sejteket használjuk.

20. példa

Az E. coli K12 RV308!ambdací90/pPR17 törzs előállítása lambdacl90-nel való lizogenizálással

A 18. példában megadottak szerint előállított E. coli K12 RV3O8/pPR17 törzset 32 ’C hőmérsékleten növesztjük mindaddig, míg 35 Klett-egységet nem érünk el, ezután 60 percig 45 ’C hőmérsékleten tartjuk a tenyészetet. A sejteket lambdacI90 fágokkal fertőzzük (20 fág/sejt) és 40 percen át 45 ’C hőmérsékleten inkubálunk. A telepeket 32 ’C hőmérsékleten növesztjük olyan L-agaron, amely ml-enként 10 pg íetraciklint tartalmaz.. A kapott E. coli K12 RV3081ambdacI90/pPR17 telepeket 32 ’C hőmérsékleten való növekedési képességük és 42 'C hőmérsékletre való érzékenységük alapján vizsgáljuk.

21. példa

Az E. coli K12 RV3081ambdacI90/pPR18 előállítása

A kísérletet a 20. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 RV308/pPR17 helyett a 19. példában megadottak szerint előállított E. coli K12 RV308/ pPR18 sejteket használjuk.

-1511. táblázat

22. példa

Az E. coli

K12 C600R_k-M_k-lambdacI90/pPR12 előállítása

A kísérletet a 20. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 RV308/pPR17 helyett a 7. példában megadottak szerint előállított E. coli K12 CőOOR^Mj./pPR12 törzset használjuk.

Az előzőekben megadottak szerint még az alábbi törzseket állítjuk elő:

Rekombináns plazmidok stabilitása

Osztódások száma	A plazmid megtartásának százaléka
	E. coli K12 RV308/ ΡΙΑ7Δ4Δ1	E. coli K12 RV3081ambda- cI90/pPR17
9	96	1(M)
30	95	100

23. E. coli K12 C600/pPR17

24. E. coli K12 C600/pPR18

25. E. coli K12 RV308/pPR12

26. E. coli K12 RV3081ambdacl90/pPR12

27. E. coli K12 C6001ambdacI90/pPR17

28. E. coli K12 C600IambdacI90/ppR18

29. E. coli K12 294 lambdacI90/pPR17

30. E. coli K12 294 lambdac!90/pPR18

31. E. coli

K12 C600R_t-M_k-lambdacI90/pPR17

32. E. coli

K12 C600R_k-M_k-lambdacI90/pPR18.

111. táblázat

Rekombináns plazmidok stabilitása

Osztódások A plazmid megtartásának száma százaléka

	E. coli K12 RV308/ ΡΙΒ7Δ4Δ1	E. coli K12 RV3081ambdacl9ü/pPRÍ8
9	96	100
30	x 79	100

Rekombináns plazmidokat tartalmazó gazdasejtek stabilitásának meghatározása szelekcióval és anélkül

A plazmidot tartalmazó sejtek frekvenciájának mérésére a rekombináns plazmidokon lévő Te/ gént használjuk fel. A tenyészet sorozathígításait 10 pg/ ml tetraciklint, illetve antibiotikumot nem tartalmazó L-agarra szélesztjük, és a tenyészeteket 32 ’C hőmérsékleten növesztjük. A plazmid^4- sejtek frekvenciáját úgy határozzuk meg, hogy viszonyítjuk a tetraciklinre rezisztens telepek számát a tetraciklint nem tartalmazó L-agaron növekvő telepek számához. Eljárhatunk úgy is, hogy az L-agaron növekvő telepeket replikázzuk 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agarra, és a tenyészeteket 32 ’C hőmérsékleten növesztjük. A plazmid⁺ sejtek frekvenciáját úgy határozzuk meg, hogy a tetraciklinre rezisztens telepek számát viszonyítjuk az L-agaron tetraciklin nélkül növekvő telepek számához. Az E. coli K12 RV308/pIA7A4Al és az E. coli K12 RV308Iambdac!90/pPR17 törzsekkel kapott eredményeket a

11. táblázatba adjuk meg, a III. táblázatban ismertetjük az E. coli K12 RV308/plB7A4Ál és az E. coli K12 RV3081ambdacI90/pPR18 tenyészetekkel kapott eredményeket, míg a IV. táblázatban megadjuk az E. coli K12 C600R_t-M_k-/pPR12 és az E. coli K12 C600R_k-M_k-lambdacl90/pPR12 törzs eredményeit.

IV. táblázat

Rekombináns plazmidok stabilitása

Osztódások száma	A plazmid megtartásának
százt	iléka
	E. coli K12 C600Rk-Mk-/ pPRÍ2	E. coli K12 C600Rv-Mt-/ !ambdacI9ü/ pPR12
33	87	100

A II—IV. táblázatokba megadott eredmények világosan szemléltetik, hogy a találmány szerinti szelektív rendszer hatékony baktériumpopulációkban való rekombináns plazmid fenntartása szempontjából. Az E. coli K12 RV308/pIA7Á4Al tenyészet sejtjeinek 5%-a, az E. coli K12 RV308/pIB7A4Al tenyészet sejtjeinek 21 %-a plazmid mínusz 30 osztódást követően. Ugyanakkor a szelektív rendszerrel rendelkező E. coli K12 RV3081ambdacI90/ pPR17 és az E. coli K12 RV3081ambdacl90/ pPR18 tenyészetek egyik sejtje sem plazmid mínusz. Az E. coli K12 C600R_k-M_k-lambdacI90/ pPR12 tenyészet plazmid stabilizása szintén kitűnő. Az E. coli K12 C600R_k-M_k-/pPR12 tenyészet sejtjeinek 13%-a plazmid mínusz 33 osztódást követő-163ί en, ugyanakkor a szelektív rendszerrel rendelkező E. coli K12 CóOORfc-Mjj-lanibdacIPO/pPR^ tenyészet összes sejtje plazmid plusz.

A találmány szerinti plazmidok egy ike sem mutat plazmid szegregációt. így a találmány szerinti ₅ továbbfejlesztett plazmidok megkülönböztethetők a profággal nem rekombinálődott plazmidoktól.

Tény, hogy a továbbfejlesztett szelektív rendszert tartalmazó sejtek növekedése után egyetlen egy plazmid mínusz telepet sem figyeltünk meg. iq

Szabadalmi igénypontok

Claims (12)

1. Eljárás funkcionális polipeptidet kifejező re- 15 kombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó E.

coli gazdasejtek stabilizálására és szelektálására, azzal jellemezve, hogy a lambda bakteriofág cl re presszóit tartalmazó Pstl-Hinclí restrikciós fragmensét és egy funkcionális polipeptidet kifejező 20 gént tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó plazmiddal E. coli gazdasejteket traszformáluuk, és a transzformált E. coli gazdasejteket funkcionális cl represszort nem termelő lizogén organizmussal lizogenizáijuk, amely azonban a 25 transzformált gazdasejtekben levő rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektorban jelenlevő represszor gén által represszált állapotban van, azzal a letétellel, hogy a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor a represszorra nem érzékeny 39 replikont és promotert tartalmaz.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a funkcionális polipeptidet kifejező génként egy természetben előforduló gént, egy természetben nem előforduló gént vagy részben tér- 35 mészetes, részben szintetikus vagy nem természetes gént alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a funkcionális polipeptidet kifejező génként a humán inzulin A-láncot vagy a hu- 49 mán inzulin B-láncot meghatározó gént alkalmazunk.

4. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cl represszorkéní a cI857-eí alkalmazzuk.

5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljáás, azzal jellemezve, hogy a lizogén organizmusként funkcionális cl represszort nem termelő lambda cl bakteriofág gént tartalmazó organizmussal lizogenizálunk.

6. Az 5. igénypont szerint eljárás, azzal jellemezve, hogy a lizogén organizmusként lambda cl90 bakteriofággal lizogenizálunk.

7. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szénái eljárás, azzal jellemezve, hogy a lizogén organizmusként cl génben deíéciót szenvedett organizmust alkalmazunk.

8. Az 1—7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejteket rekombináns klónozó plazmádként a pPR12, a pPRl7 '/agy' a pPR18 plazmiddal transzformáljuk.

9. Eljárás stabilizálható heterológ dezoxi-ribouukleinsavat tartalmazó E. coli gazdasejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy E. coli sejteket az 1. vagy 8. igénypont szerint előállított klónozó plazmiddal transzformálunk.

10. Eljárás a pPR12 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pPR3 plazmid 0,9 kb nagyságú Uincll-Pstl restrikciós fragmensét és a pBR322 plazmid 4 kb nagyságú Pstl-Hinclí restrikciós fragmensét Egáljuk.

11. Eljárás a pPR17 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pPR12 plazmid 4,7 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmensét és a ρ!Α7Δ4Δ1 plazmid 1,3 kb nagyságú EcoRÍ-BamHI restrikciós fragmensét ligáljuk.

12. Eljárás a pPRJ8 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pPR12 plazmid 4,7 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmensét és a ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmensét ligáljuk.