JPS5878589A - プラスミド含有微生物の培養法 - Google Patents
プラスミド含有微生物の培養法Info
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- JPS5878589A JPS5878589A JP56178724A JP17872481A JPS5878589A JP S5878589 A JPS5878589 A JP S5878589A JP 56178724 A JP56178724 A JP 56178724A JP 17872481 A JP17872481 A JP 17872481A JP S5878589 A JPS5878589 A JP S5878589A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phage
- plasmid
- lysogenic
- microorganism
- repressor
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、有用な遺伝情報を担うデオキシリポ核酸（以
下ＤＮＡと記す）フラグメントを含有するプラスミドを
微生物に形質転換し、有用な微生物を育成する場合にお
いて、溶原性ファージの溶原化の維持に必要な蛋白質（
以下レプレッサー蛋白質と記す）の遺伝情報を担うファ
ージＤＮＡを該プラスミドに組み込み、レプレッサー蛋
白質の遺伝情報を担うファージ遺伝子（以下レプレッサ
ー遺伝子と記す）ＤＮＡに変異を生じた溶原性ファージ
との関係を利用することによシ該プラスミドを含有する
微生物のみを生育させる培養法である。
下ＤＮＡと記す）フラグメントを含有するプラスミドを
微生物に形質転換し、有用な微生物を育成する場合にお
いて、溶原性ファージの溶原化の維持に必要な蛋白質（
以下レプレッサー蛋白質と記す）の遺伝情報を担うファ
ージＤＮＡを該プラスミドに組み込み、レプレッサー蛋
白質の遺伝情報を担うファージ遺伝子（以下レプレッサ
ー遺伝子と記す）ＤＮＡに変異を生じた溶原性ファージ
との関係を利用することによシ該プラスミドを含有する
微生物のみを生育させる培養法である。
近年、有用な遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを含有
するプラスミドを微生物に形質転換し、有用な遺伝子産
物を微生物に生産させることによって微生物育種を行な
う試みがなされている。しかしながら、有用な遺伝情報
を担うＤＮＡ７ ラクメントを含有する組み換え型プラ
スミドは微生物内では一般に不安定であシ、脱落しやす
いことが知られている。したがって上記方法で有用遺伝
子産物を工業的レベルで生産する場合、微生物内でのプ
ラスミドの不安定さは生産性の低下をまねくことになる
。
するプラスミドを微生物に形質転換し、有用な遺伝子産
物を微生物に生産させることによって微生物育種を行な
う試みがなされている。しかしながら、有用な遺伝情報
を担うＤＮＡ７ ラクメントを含有する組み換え型プラ
スミドは微生物内では一般に不安定であシ、脱落しやす
いことが知られている。したがって上記方法で有用遺伝
子産物を工業的レベルで生産する場合、微生物内でのプ
ラスミドの不安定さは生産性の低下をまねくことになる
。
この問題点を解決するため、プラスミドが脱落した菌株
が生育できない状況をつくることによってプラスミドを
含有する菌株のみを培養する方法がいくつか報告されて
いる（特開昭５６−１５６９６ 、特開昭５５−１５６
５９１）。その多くはプラスミド上に特定の抗生物質に
対する耐性を担う遺伝子を存在せしめ、培地中に上記特
定の抗生物質を添加する培養方法を用いたものである。
が生育できない状況をつくることによってプラスミドを
含有する菌株のみを培養する方法がいくつか報告されて
いる（特開昭５６−１５６９６ 、特開昭５５−１５６
５９１）。その多くはプラスミド上に特定の抗生物質に
対する耐性を担う遺伝子を存在せしめ、培地中に上記特
定の抗生物質を添加する培養方法を用いたものである。
しかしながら、抗生物質を添加する培養方法では抗生物
質を大量に培養液中に添加しなければならない点や抗生
物質を除くための余分な精製過程を必要とする点など工
業的に有利といえない。さらに培養後の排水−中に含ま
れる抗生物質によっておこる自然界での耐性菌の不必要
な増加をまねく恐れがある。
質を大量に培養液中に添加しなければならない点や抗生
物質を除くための余分な精製過程を必要とする点など工
業的に有利といえない。さらに培養後の排水−中に含ま
れる抗生物質によっておこる自然界での耐性菌の不必要
な増加をまねく恐れがある。
これに対して本発明者らは、溶原性ファージのレプレッ
サー遺伝子ＤＮＡを、宿主微生物内で増殖可能なプラス
ミドに組み込み、この組み換え型プラスミドをレプレッ
サー遺伝子に変異の生じた該溶原性ファージの溶原化状
態にある微生物に含有せしめ、該溶原性ファージ変異株
の誘発条件下で培養することにより、プラスミドを含有
する微生物のみを培養することに成功した。
サー遺伝子ＤＮＡを、宿主微生物内で増殖可能なプラス
ミドに組み込み、この組み換え型プラスミドをレプレッ
サー遺伝子に変異の生じた該溶原性ファージの溶原化状
態にある微生物に含有せしめ、該溶原性ファージ変異株
の誘発条件下で培養することにより、プラスミドを含有
する微生物のみを培養することに成功した。
すなわち、本培養法はプラスミドを含有する微生物を培
養する場合−、プラスミド上に組み込んだレプレッサー
遺伝子の発現によシ、宿主菌染色体上に溶原化している
レプレッサー遺伝子変異ファージの誘発をおさえること
ができるので該プラスミドを含有する微生物は生育でき
るが、該プラスミドの脱落した微生物ではレプレッサー
遺伝子変異ファージの誘発が生じるので該微生物は死減
し、その結果培地中で生存している微生物はすべてプラ
スミドを保持しているという原理を利用したものである
。
養する場合−、プラスミド上に組み込んだレプレッサー
遺伝子の発現によシ、宿主菌染色体上に溶原化している
レプレッサー遺伝子変異ファージの誘発をおさえること
ができるので該プラスミドを含有する微生物は生育でき
るが、該プラスミドの脱落した微生物ではレプレッサー
遺伝子変異ファージの誘発が生じるので該微生物は死減
し、その結果培地中で生存している微生物はすべてプラ
スミドを保持しているという原理を利用したものである
。
°上記培養法を用いることによって抗生物質の添加を行
なう培養方法に比べてコスト的に安価に培養でき、かつ
培養後の精製工程等の処理についても問題は少なくなる
。さらに、抗生物質の添加を行なう培養方法に比べて微
生物の生育が非常に速い点は注目すべき特徴である。ま
た本培養法では、微生物の生育可能な培地ならばどのよ
うな培地を用いてもよいことも利点の一つである。
なう培養方法に比べてコスト的に安価に培養でき、かつ
培養後の精製工程等の処理についても問題は少なくなる
。さらに、抗生物質の添加を行なう培養方法に比べて微
生物の生育が非常に速い点は注目すべき特徴である。ま
た本培養法では、微生物の生育可能な培地ならばどのよ
うな培地を用いてもよいことも利点の一つである。
したがって、レプレッサー遺伝子ＤＮＡフラグメントを
組み込んだプラスミドに、有用な遺伝子ＤＮＡ フラグ
メントを組み込み本培養法を用いて培養を行なえば、該
プラスミドを含有する微生物のみを選択的に増殖させる
ことができ醗酵生産における生産性の低下を防ぐことが
できる。
組み込んだプラスミドに、有用な遺伝子ＤＮＡ フラグ
メントを組み込み本培養法を用いて培養を行なえば、該
プラスミドを含有する微生物のみを選択的に増殖させる
ことができ醗酵生産における生産性の低下を防ぐことが
できる。
本培養法は溶原性ファージとその宿主微生物、例えば細
菌ではニジエリシア・コリ（Ｅｓ’ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏ１ｉ） トソｏ溶原性７７−ｓ／φｓｏ、 λ、
λ””３４等、枯草菌とその溶原性ファージρ１１．φ
１０５等、放線菌ではノカルディア・メデイテラニ（Ｎ
ｏｃａ？ｄｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ ＡＴＣＣ
１３６８５）とその溶原性ファージβ、ｒ等の関係にあ
る微生物に応用可能である。さらに今後発見される溶原
性ファージとその宿主にも応用“可能と考えられる。溶
原性ファージのレプレッサー遺伝子変異株、例えばレプ
レッサー欠損株、レプレッサ一温度感受性株などはファ
ージ粒子を変異処理、例えば紫外線照射、ＮＴＧ処理等
を行なうことによって容易に得ることができる。スファ
ージでは、レプレッサー欠損株の単離［、Ａ、Ｄ、カイ
ゼル（Ａ、Ｄ、Ｋａｉｓｅｒ ） ＋ ウ゛イロロジ−
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）３巻、４２ページ（１９５７）］
、レプレッサ一温度感受性株の単離ＣＭ、リーグ（Ｍ
、Ｌｉθｂ）。
菌ではニジエリシア・コリ（Ｅｓ’ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏ１ｉ） トソｏ溶原性７７−ｓ／φｓｏ、 λ、
λ””３４等、枯草菌とその溶原性ファージρ１１．φ
１０５等、放線菌ではノカルディア・メデイテラニ（Ｎ
ｏｃａ？ｄｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ ＡＴＣＣ
１３６８５）とその溶原性ファージβ、ｒ等の関係にあ
る微生物に応用可能である。さらに今後発見される溶原
性ファージとその宿主にも応用“可能と考えられる。溶
原性ファージのレプレッサー遺伝子変異株、例えばレプ
レッサー欠損株、レプレッサ一温度感受性株などはファ
ージ粒子を変異処理、例えば紫外線照射、ＮＴＧ処理等
を行なうことによって容易に得ることができる。スファ
ージでは、レプレッサー欠損株の単離［、Ａ、Ｄ、カイ
ゼル（Ａ、Ｄ、Ｋａｉｓｅｒ ） ＋ ウ゛イロロジ−
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）３巻、４２ページ（１９５７）］
、レプレッサ一温度感受性株の単離ＣＭ、リーグ（Ｍ
、Ｌｉθｂ）。
ジャーナル、オプ・モレキュラー・バイオロジ＝ （Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ） １６巻。
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ） １６巻。
１４９ページ（１９６６））などが既に行なわれている
。
。
溶原性ファージの精製とＤＮＡの抽出は、従来から知ら
れているセシウムクロライド密度勾配遠心法とローリン
グ法〔Ｆ、フランケル（Ｆ、 Ｆｒａｎｋθ１）、プロ
シーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オプ・サイエンスＵ、Ｓ、 Ａ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ
ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ、 Ｓ、 Ａ ） ４９
巻、３６６ベージ（１９６３）〕を珀いればよい〇溶原
性ファージのレプレッサー遺伝子をプラスミドに組み込
むには、ファージＤＮＡ とプラスミドＤＮＡを制限エ
ンドヌクレアーゼで処理した後にＤＮＡ連結酵素を用い
て両者を結合させればよい。制限エンドヌクレアーゼは
プラスミドを開裂できるような酵素であればどのような
ものでもよいが、レプレッサー遺伝子を分断しないもの
が望ましい。またプラスミドとしては、微生物の菌体内
で自己増殖しうるプラスミド、例えば細菌ではニジエリ
シア・コリのｐＢＲ３２２，，８０１０１等、枯草菌の
、ＵＢ、１１０ 。
れているセシウムクロライド密度勾配遠心法とローリン
グ法〔Ｆ、フランケル（Ｆ、 Ｆｒａｎｋθ１）、プロ
シーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オプ・サイエンスＵ、Ｓ、 Ａ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ
ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ、 Ｓ、 Ａ ） ４９
巻、３６６ベージ（１９６３）〕を珀いればよい〇溶原
性ファージのレプレッサー遺伝子をプラスミドに組み込
むには、ファージＤＮＡ とプラスミドＤＮＡを制限エ
ンドヌクレアーゼで処理した後にＤＮＡ連結酵素を用い
て両者を結合させればよい。制限エンドヌクレアーゼは
プラスミドを開裂できるような酵素であればどのような
ものでもよいが、レプレッサー遺伝子を分断しないもの
が望ましい。またプラスミドとしては、微生物の菌体内
で自己増殖しうるプラスミド、例えば細菌ではニジエリ
シア・コリのｐＢＲ３２２，，８０１０１等、枯草菌の
、ＵＢ、１１０ 。
ｐ Ｔ Ｐ ５等、放線菌ではストレプトマイセス・セ
リカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉ℃ｏ
ｄｏｒ ）のｐｓａ １゜ｐ ｓ ｃ ２等であればど
のようなものでもよい。こうして得られた溶原性ファー
ジのレプレッサー遺伝子を組み込んだプラスミドを宿主
微生物に含有せしめる方法も従来知られているすべての
形質転換方法が、効率の良否があってもいずれも使用で
きる。−例としてニジエリシア・コリでは、塩化カルシ
ウム処理を行なった細胞とプラスミドＤＮＡを反応させ
る方法〔Ｆ、ポリバー等（Ｆ、Ｂｏｌｉｖｅｒ ｅｔ
ａｌ、 ） ＊ジーン（Ｇｅｎｅ）２巻、９５ページ（
１９７７）］ 、枯草菌ではコンピテｙ）な細胞に、又
はプロトプラスト化した細胞とポリエチレングライコー
ルの共存下にプラスミドＤＮＡを導入させる方法〔Ｃ，
アナグツストポラス等（Ｃ６Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕ
ｌｏｓ ｅｔａｌ、Ｌ ジャーナル・オプ・バクテリオ
ロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ’ｌ
ｏｇｙ ） ８１巻、７４１ページ（１９’６１）、Ｓ
、チャン等（Ｓ、 Ｃｈａｎｇｅｔａｌ、）、 モレ
キュ゛ラー・ジェネラル・ジエネテイクス（’ Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉ０８ ）
１６８巻１１１ページ（１９７′９）〕、放線菌ではプ
ロトプラスト化した細胞にポリエチレングライコール共
存下でプラスミドＤＮＡを反応させる方法ＣＭ、Ｊ、ビ
ブ等（Ｍ、Ｊ、 Ｂｌｂｂ ｅｔ ａｌ、 ）。
リカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉ℃ｏ
ｄｏｒ ）のｐｓａ １゜ｐ ｓ ｃ ２等であればど
のようなものでもよい。こうして得られた溶原性ファー
ジのレプレッサー遺伝子を組み込んだプラスミドを宿主
微生物に含有せしめる方法も従来知られているすべての
形質転換方法が、効率の良否があってもいずれも使用で
きる。−例としてニジエリシア・コリでは、塩化カルシ
ウム処理を行なった細胞とプラスミドＤＮＡを反応させ
る方法〔Ｆ、ポリバー等（Ｆ、Ｂｏｌｉｖｅｒ ｅｔ
ａｌ、 ） ＊ジーン（Ｇｅｎｅ）２巻、９５ページ（
１９７７）］ 、枯草菌ではコンピテｙ）な細胞に、又
はプロトプラスト化した細胞とポリエチレングライコー
ルの共存下にプラスミドＤＮＡを導入させる方法〔Ｃ，
アナグツストポラス等（Ｃ６Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕ
ｌｏｓ ｅｔａｌ、Ｌ ジャーナル・オプ・バクテリオ
ロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ’ｌ
ｏｇｙ ） ８１巻、７４１ページ（１９’６１）、Ｓ
、チャン等（Ｓ、 Ｃｈａｎｇｅｔａｌ、）、 モレ
キュ゛ラー・ジェネラル・ジエネテイクス（’ Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉ０８ ）
１６８巻１１１ページ（１９７′９）〕、放線菌ではプ
ロトプラスト化した細胞にポリエチレングライコール共
存下でプラスミドＤＮＡを反応させる方法ＣＭ、Ｊ、ビ
ブ等（Ｍ、Ｊ、 Ｂｌｂｂ ｅｔ ａｌ、 ）。
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ） ２７４巻、３９８ペー
ジ（１９７Ｂ））、等を用いればよい。レプレッサー遺
伝子ＤＮＡ フラグメントが組み込まれたプラスミドを
含有する形質転換株は、溶原性ファージのレプレッサー
欠損株に対して耐性を示し、溶原性ファージのヴイルレ
ント変異株に対して感受性を示すので容易に選択できる
。
ジ（１９７Ｂ））、等を用いればよい。レプレッサー遺
伝子ＤＮＡ フラグメントが組み込まれたプラスミドを
含有する形質転換株は、溶原性ファージのレプレッサー
欠損株に対して耐性を示し、溶原性ファージのヴイルレ
ント変異株に対して感受性を示すので容易に選択できる
。
このようＫして得られる形質転換株のプラスミドをレプ
レッサー遺伝子に変異を有する溶原性ファージの溶原化
状態にある微生物に含有せしめ、該ファージの誘発条件
下に培養すればプラスミドを含有する微生物のみが生育
してくるので、有用遺伝子ＤＮＡ フラグメントを、こ
のプラスミドに組み込み醗酵生産を行なう場合、安定し
た高い生産性が期待できる。
レッサー遺伝子に変異を有する溶原性ファージの溶原化
状態にある微生物に含有せしめ、該ファージの誘発条件
下に培養すればプラスミドを含有する微生物のみが生育
してくるので、有用遺伝子ＤＮＡ フラグメントを、こ
のプラスミドに組み込み醗酵生産を行なう場合、安定し
た高い生産性が期待できる。
次に、実施例を記載して本発明を説明する。
実施例１
ニジエリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｌ
）の溶原性ファージφ８０のレプレッサー遺伝子（以下
ＣＩ遺伝子と記す）ＤＮＡフラグメントをプラスミドに
組み込み、レプレッサーが温度感受性であるφ８０（以
下φＢ０Ｃ工ｔｓと記す）の溶源菌に形質転換し、高温
で培養することによってプラスミドを含有する微生物の
みを選択的に培養できた。
）の溶原性ファージφ８０のレプレッサー遺伝子（以下
ＣＩ遺伝子と記す）ＤＮＡフラグメントをプラスミドに
組み込み、レプレッサーが温度感受性であるφ８０（以
下φＢ０Ｃ工ｔｓと記す）の溶源菌に形質転換し、高温
で培養することによってプラスミドを含有する微生物の
みを選択的に培養できた。
（１）溶原性ファージφ８０の変異株の取得ニジエリシ
ア・コリＷ３１１０を宿主としてφ８０゛ファージを増
殖させ、溶菌液（６Ｘ１０１０ＰＦ′Ｕ／１ｌｊ）を得
た。この溶菌液から２５０００Ｘｆ。
ア・コリＷ３１１０を宿主としてφ８０゛ファージを増
殖させ、溶菌液（６Ｘ１０１０ＰＦ′Ｕ／１ｌｊ）を得
た。この溶菌液から２５０００Ｘｆ。
６０分の遠心によりファージ粒子を集め１０ｍＭＭ（Ｉ
Ｓ Ｏａ溶液に懸濁した。約１ｘ、ｔ ｏ” Ｐ Ｆ
Ｕ ／ｍｌのファージ溶液に紫外線（東芝１５Ｗ ＵＶ
ｌａｍｐ ）ｆ５０ｃ１４の距離で６分間照射した。こ
の時のファージの生存率は０７％であった。このファー
ジを、あらかじめ紫外線を短時間（３０秒）照射したＷ
３１１０に感染させ、軟寒天上でプラークを形成させた
。レプレッサー欠損株（以下−８０Ｃ工と記す）は透明
なプラークを形成するファージとして単離した。また、
レプレッサ一温度感受性株φ８０ ＣＩｔｓは低温（３
０℃）で濁ったプラークを形成し、その溶原菌が高温処
理（３５℃〜４５で）でファー、ジを誘発するファージ
として単離した。′（２） φ８０のＣＩ遺伝予めク
ローニングニジエリシア・コリＷ３１１Ｄを宿主として
φ８０ ファージを増殖させ溶菌液（６×１ｏ１０ｐｒ
Ｕ／ｓ＋／）を得た。この溶菌液から２５０００Ｘｆ。
Ｓ Ｏａ溶液に懸濁した。約１ｘ、ｔ ｏ” Ｐ Ｆ
Ｕ ／ｍｌのファージ溶液に紫外線（東芝１５Ｗ ＵＶ
ｌａｍｐ ）ｆ５０ｃ１４の距離で６分間照射した。こ
の時のファージの生存率は０７％であった。このファー
ジを、あらかじめ紫外線を短時間（３０秒）照射したＷ
３１１０に感染させ、軟寒天上でプラークを形成させた
。レプレッサー欠損株（以下−８０Ｃ工と記す）は透明
なプラークを形成するファージとして単離した。また、
レプレッサ一温度感受性株φ８０ ＣＩｔｓは低温（３
０℃）で濁ったプラークを形成し、その溶原菌が高温処
理（３５℃〜４５で）でファー、ジを誘発するファージ
として単離した。′（２） φ８０のＣＩ遺伝予めク
ローニングニジエリシア・コリＷ３１１Ｄを宿主として
φ８０ ファージを増殖させ溶菌液（６×１ｏ１０ｐｒ
Ｕ／ｓ＋／）を得た。この溶菌液から２５０００Ｘｆ。
６０分の遠心によシファージ粒子を集め、さらにセシウ
ムクロライド密度勾配遠心法によってファージ粒子を精
製した。得られたファージ粒子をローリング法で抽出す
ることによシφ８０ＤＮＡを得た。
ムクロライド密度勾配遠心法によってファージ粒子を精
製した。得られたファージ粒子をローリング法で抽出す
ることによシφ８０ＤＮＡを得た。
テトラサイクリン耐性及びアンピシリン耐性遺伝子を有
する。ＢＲ３２２をベクタープラスミドとして用いた。
する。ＢＲ３２２をベクタープラスミドとして用いた。
ｐＢＲＳ２２の調製は既知の方法ＣＤ、Ｂ、フレウェル
（Ｄ、 Ｂ、Ｃ！ｌｅｗｅｌｌ ） 。
（Ｄ、 Ｂ、Ｃ！ｌｅｗｅｌｌ ） 。
ジャーナル・オプｅバクテリオロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
） １１０巻、６６７ページ（１９７２）〕に従った
。すなわちｐＢＲ３２２を含有するＷ３１１０ Ｃ以下
Ｗ ３．１１０ （ｐＢＲ３２２）と記す〕を０５％カ
ザミノ酸％ ０２％グルコース、０．１％酵母エキヌを
含む無機塩培地（Ｎａｍ’ＨＰＯ４６ｆ、 ＫＨｔＰ
Ｏ＜ ３ｆ、 ＮａＣ１０，５ｆ＋ＮＨＮＨ４Ｃ１
ｌを１４の純水に溶解し、１２０℃１気圧２０分間で殺
菌を行なった後、別に同条件で殺菌した０、０１ Ｍ
０ａＣ１ｓと０．１ Ｍ ＭｇＳＯ４をそれぞれ１０Ｗ
ｌづつ加えた培地を用いて３７℃で培養を行なった。Ｗ
３１１０ （、ＥＲ３２２）が対数増殖期まで増殖した
ときに１７０μＩ／ｍｅになるようにクロラムフェニコ
ールを添加し、さらに１７時間３７℃で培養を行なった
。集菌後、リゾチーム−ｎｒｉｊ５Ｂ−デオキシコール
酸処理によって溶菌させ、ｊ８０００ＸＬ ３０分の遠
心後、上清を得た。この上清からフェノール処理、工、
タ５．ノール沈殿によ〕プラスミＦ ＤＮＡ ｋｌｌｋ
ｌｌａしセシウムクロライド−エチジウムブロマイド平
衡、密度勾配遠心法によって精製ｐＢＲ５２２Ｄ Ｎ
Ａを得た。
） １１０巻、６６７ページ（１９７２）〕に従った
。すなわちｐＢＲ３２２を含有するＷ３１１０ Ｃ以下
Ｗ ３．１１０ （ｐＢＲ３２２）と記す〕を０５％カ
ザミノ酸％ ０２％グルコース、０．１％酵母エキヌを
含む無機塩培地（Ｎａｍ’ＨＰＯ４６ｆ、 ＫＨｔＰ
Ｏ＜ ３ｆ、 ＮａＣ１０，５ｆ＋ＮＨＮＨ４Ｃ１
ｌを１４の純水に溶解し、１２０℃１気圧２０分間で殺
菌を行なった後、別に同条件で殺菌した０、０１ Ｍ
０ａＣ１ｓと０．１ Ｍ ＭｇＳＯ４をそれぞれ１０Ｗ
ｌづつ加えた培地を用いて３７℃で培養を行なった。Ｗ
３１１０ （、ＥＲ３２２）が対数増殖期まで増殖した
ときに１７０μＩ／ｍｅになるようにクロラムフェニコ
ールを添加し、さらに１７時間３７℃で培養を行なった
。集菌後、リゾチーム−ｎｒｉｊ５Ｂ−デオキシコール
酸処理によって溶菌させ、ｊ８０００ＸＬ ３０分の遠
心後、上清を得た。この上清からフェノール処理、工、
タ５．ノール沈殿によ〕プラスミＦ ＤＮＡ ｋｌｌｋ
ｌｌａしセシウムクロライド−エチジウムブロマイド平
衡、密度勾配遠心法によって精製ｐＢＲ５２２Ｄ Ｎ
Ａを得た。
φ８０ＤＮＡ０．９μｆとｐＢＲ５２２ＤＮＡ Ｏ，７
μｆに制限エンドヌクレアーゼの一種であるＥｃｏＲ］
を３７℃で３時間作用させてＤＮＡ鎖を切断した。６５
℃、５分間の熱処理後、ＡＴＰ、ジチオスレイトール存
在下、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼによって１０１：１
９時間のＤＮＡ鎖連結反応を行なった。反応液に２倍量
のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ遠心によってＤ
ＮＡを回収した。
μｆに制限エンドヌクレアーゼの一種であるＥｃｏＲ］
を３７℃で３時間作用させてＤＮＡ鎖を切断した。６５
℃、５分間の熱処理後、ＡＴＰ、ジチオスレイトール存
在下、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼによって１０１：１
９時間のＤＮＡ鎖連結反応を行なった。反応液に２倍量
のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ遠心によってＤ
ＮＡを回収した。
連結後のＤＮＡを０．１Ｍ ０ａＯ１２処理によって調
製したＷ′５１１０株のコンピテント細胞懸濁液に加え
、口℃１時間反応させた後、４２℃７５秒の処理を行な
った。その後、Ｌ倍地（バクトドリプトン１０Ｆ、パク
ト酵母エキス５ｐ、ＮａＣ１１０ｊｌを１１の純水に溶
解した培地）を加え３７℃で２時間培養した。次にｍｏ
ｌｌになるようにφ８００工を感染させ、さらに１５分
間培養後２０μＩ ／ ｍｌアンピシリン、１５μＩ
／ ｍｅテトラサイクリンヲ含有スるＬ借地プレートに
接種した。３７℃で一夜培養後４７個のコロニーが出現
した。各コロニーを純粋に一分離後４７株すべてが両薬
剤耐性と、φ８００Ｉ耐性、φ８０ Ｖｉｒ感受性の性
質を有することを確認した。これら４７株すべてがφ８
０’Ｏ工遺伝子がｐＢＲ３２２にＢｃＯＲ工部位で挿入
されているプラスミドを含有していた。このうち１，７
メガダルトンのＣＩ遺伝子フラグメントが唯−ｐＢＲ１
１２２に組み込まれているプラスミドを、ＫＮ３１９と
呼ぶ。、ＫＮ３１９は上記ｐ Ｂ Ｒ３″２２の調製法
に準じて精製した。
製したＷ′５１１０株のコンピテント細胞懸濁液に加え
、口℃１時間反応させた後、４２℃７５秒の処理を行な
った。その後、Ｌ倍地（バクトドリプトン１０Ｆ、パク
ト酵母エキス５ｐ、ＮａＣ１１０ｊｌを１１の純水に溶
解した培地）を加え３７℃で２時間培養した。次にｍｏ
ｌｌになるようにφ８００工を感染させ、さらに１５分
間培養後２０μＩ ／ ｍｌアンピシリン、１５μＩ
／ ｍｅテトラサイクリンヲ含有スるＬ借地プレートに
接種した。３７℃で一夜培養後４７個のコロニーが出現
した。各コロニーを純粋に一分離後４７株すべてが両薬
剤耐性と、φ８００Ｉ耐性、φ８０ Ｖｉｒ感受性の性
質を有することを確認した。これら４７株すべてがφ８
０’Ｏ工遺伝子がｐＢＲ３２２にＢｃＯＲ工部位で挿入
されているプラスミドを含有していた。このうち１，７
メガダルトンのＣＩ遺伝子フラグメントが唯−ｐＢＲ１
１２２に組み込まれているプラスミドを、ＫＮ３１９と
呼ぶ。、ＫＮ３１９は上記ｐ Ｂ Ｒ３″２２の調製法
に準じて精製した。
（３） プラスミドｐＫＮ３１９の安定性φ８．ＯＣ
工ｔ、ｓ ’ｒ低温（３０℃）でニジエリシア・コリＷ
３１１０に溶原化させ溶原菌Ｗ３１１０（φ８．０ Ｃ
Ｉｔｓ ）を分離した。Ｗ３１１０（φ８０Ｃ工ｔｓ
）株のコンピテント細胞懸濁液を０，１坦０ａＯ１１処
理によシ調製し、 ｐＫＮ３１９を加え０℃１時間反応
させた。
工ｔ、ｓ ’ｒ低温（３０℃）でニジエリシア・コリＷ
３１１０に溶原化させ溶原菌Ｗ３１１０（φ８．０ Ｃ
Ｉｔｓ ）を分離した。Ｗ３１１０（φ８０Ｃ工ｔｓ
）株のコンピテント細胞懸濁液を０，１坦０ａＯ１１処
理によシ調製し、 ｐＫＮ３１９を加え０℃１時間反応
させた。
次にＬ培地を加え、３３℃１３５分間培養した後、２０
μｆ／ｍｌアンピシリン、１５μＩ ／ｄテトラサイク
リンを含有するＬ培地プレート［ＦｐＲＭＢＰ’−６’
ｊ ］を分離した。
μｆ／ｍｌアンピシリン、１５μＩ ／ｄテトラサイク
リンを含有するＬ培地プレート［ＦｐＲＭＢＰ’−６’
ｊ ］を分離した。
第１表は、Ｗ３１１０（φ８００工ｔｓ ） （ＥＩＫ
Ｎ３１９）を高温（４３℃）でＬ培地プレート上で４回
継植を行なった時のプラヌミド含有株の割合（％）を示
したものである。プラスミド含有株は、本プラスミド上
にテトラサイクリン耐性とアンピシリン耐性遺伝子を有
しているので両薬剤耐性を示す。よってプラスミド含有
株の割合（％）は各線種時にＬ培地プレート上でコロニ
ーを分離した後、１００株を１５μｆｌａ！テトラサイ
クリン、２０μｆ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地プレ
ートに移植し、同培地上での生育の有無を観察すること
によって行なった。対照としてＷ３１１０ （ｐＫＮ３
１９ ）とＷＢ２１０（、ＢＲ３２２）を用いた。いず
れも継植前は、すべての株がプラスミドヲ含有していた
。
Ｎ３１９）を高温（４３℃）でＬ培地プレート上で４回
継植を行なった時のプラヌミド含有株の割合（％）を示
したものである。プラスミド含有株は、本プラスミド上
にテトラサイクリン耐性とアンピシリン耐性遺伝子を有
しているので両薬剤耐性を示す。よってプラスミド含有
株の割合（％）は各線種時にＬ培地プレート上でコロニ
ーを分離した後、１００株を１５μｆｌａ！テトラサイ
クリン、２０μｆ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地プレ
ートに移植し、同培地上での生育の有無を観察すること
によって行なった。対照としてＷ３１１０ （ｐＫＮ３
１９ ）とＷＢ２１０（、ＢＲ３２２）を用いた。いず
れも継植前は、すべての株がプラスミドヲ含有していた
。
第１表から明らかなように、Ｗ３１１０（φ８００工ｔ
８）的に培養できることを示している。
８）的に培養できることを示している。
第１表
特許出願人 鐘淵化学工業株式会社
代理人弁理士浅野真−
Claims (4)
- （１）溶原性フ、アージの溶原化の維持に必要な蛋白質
の遺伝情報を担うファージ遺伝子デオキシリポ核酸フラ
グメントを、薮ファージの宿主微生物内で増殖可能なプ
ラスミドに組み込み、この組み換え型プラスミドを該フ
ァージの溶原化の維持に必要な蛋白質の遺伝情報に変異
の生じた変異ファージの溶原化状態にある微生物に含有
せしめ、該溶原性ファージの誘発条件で培養することを
特徴とするプラスミド含有微生物の培養法。 - （２）宿主微生物がニジエリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ）属に属する微生物である特許請求の範囲第１項
記載の培養法。 - （３）溶原性ファージがφ８０である特許請求の範囲第
１項記載の培養法。 - （４）溶原性ファージの溶原化の維持に必要な蛋白質が
温度感受性である特許請求の範囲第１項記載の培養法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56178724A JPS5878589A (ja) | 1981-11-06 | 1981-11-06 | プラスミド含有微生物の培養法 |
| GB08231516A GB2109408B (en) | 1981-11-06 | 1982-11-04 | Method for cultivating a micro-organism containing a recombinant plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56178724A JPS5878589A (ja) | 1981-11-06 | 1981-11-06 | プラスミド含有微生物の培養法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5878589A true JPS5878589A (ja) | 1983-05-12 |
Family
ID=16053455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56178724A Pending JPS5878589A (ja) | 1981-11-06 | 1981-11-06 | プラスミド含有微生物の培養法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5878589A (ja) |
| GB (1) | GB2109408B (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4436815A (en) * | 1981-11-27 | 1984-03-13 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells |
| US4650761A (en) * | 1981-11-27 | 1987-03-17 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cell |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57132885A (en) * | 1980-10-03 | 1982-08-17 | Lilly Co Eli | Stabilization and selection of rearranged dna host cell |
-
1981
- 1981-11-06 JP JP56178724A patent/JPS5878589A/ja active Pending
-
1982
- 1982-11-04 GB GB08231516A patent/GB2109408B/en not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57132885A (en) * | 1980-10-03 | 1982-08-17 | Lilly Co Eli | Stabilization and selection of rearranged dna host cell |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2109408A (en) | 1983-06-02 |
| GB2109408B (en) | 1985-03-20 |
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