JPS59501497A - 不安定に遺伝されたプラスミドの安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不安定に遺伝されたプラスミドの安定化法この発明は、遺伝子及びその産生物を 製造するための組換えＤＮＡの技術分野で有用なプラスミドの安定化法に関する 。

技術背景 大部分の天然のプラスミドがたとえ選択圧（８・Ｌａｏｔｉａｎ　ｐｒｅｓｓｕ ｒｅ）（プラスミドを保持するこれら微生物だけが成育するのを保証するファク ター、−例として抗生物質に対する耐性を伝達する遺伝子を有するプラスミドの 場合の栄養培地中の抗生物質がある）がなくても維持し続けるということは、プ ラスミド維持機能が発現されて、これらの染色体外性要素（ｅｒｔｒａｏｈｒａ ｍｏａｏｍａｌｅｌｅｍｅｎｔ）が高効率で存続しつづけるの３保証しているこ とを示唆している。このプラスミド維持機能は主として、細胞中のプラスミド１ 度を調節する遺伝子コントロールΦサーキットを含む複製遺伝子で構成されてい る。成長′ａ胞中てこの複製コントロール・システムは、プラスミドのコピー数 を監視し、プラスミド複製の確率を増減させることによって平均値からの偏差を 修正する。しかし、いずれの複製コントロール・システムも、プラスミドの著し く少ないコピーもしくはひとつだけのコピーしかもたない細脆が生成するのを防 止できない。したがってかような細胞からプラスミドのない娘細胞が生成する可 能性があるということは明白である。この問題は勿論、低いコピー数のプラスミ ドについて最も重大なことである。さらに細胞分裂時のプラスミド分子の受身分 配（ｐＵｓｉｖｅ　ｄｉａｔ、ｒｉｂｕｔｉｏｎ）によって、ある程度の頻度で プラスミドのない細胞が生成することは避けられない。細胞からのプラスミド分 子の喪失は不可逆なので、かような不安定な状態の結末は、最終的には全集団に プラスミドがなくなるということである。

細胞分裂時のプラスミドの不規則分配（ｒａｚ＋ｄａｍ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉ ｏｎ）のみならず、他のファクターが、プラスミド維持のためのセレクションな しで培養される細胞の培養物からのプラスミドの喪失速度に影響を与えるときが ある。例えばいくつかのプラスミドは２つの新たに複製された分子を分解するた めに特定の組換えシステムを要する（Ａｕｓｔｉｎ　ａｔ　ａｌ、、　０８１１ ２５．１９８１　ｐｐ、　７２９〜５６）。

分解しなければマルチマー（ｍｕｌｔｉｍａｒ）が形成され（組合わされて）、 このようにして、たとえ高いコピー数のプラスミドでさえも娘細胞への分配の段 階で低コピー数のプラスミドとして出現Ｔることがある。というのはプラスミド のない細胞が生成する確率は、マルチマー構造体に組合わされるプラスミド分子 の数が増すにつれて増大するからである。組換えＤＮＡ技術にしばしばみられる もうひとつの現象は、ＤＭＡフラグメントを挿入したために安定なりローニング ベクター（ｏｌｏｍｎｇマｅａｔｏｒ）が不安定なハイブリッドプラスミドに変 換する現象である。そしてこのＤＮＡフラグメントが存在すると、プラスミドコ ピー数の減少を起こすか又は細胞成長を消極的に妨害する有害な産物を生成する 。

かような場合はすべて、プラスミドの分Ｒ（ｓ＠ｇｒｅｇａｔｉｏｎ）と喪失が 、外部からでは容易に制御できない頻度（高頻度もしくは低頻度）で起こる。

天然プラスミド、特に低コピー数プラスミドが安定なのは、その＊製コントロー ル・システムに加つるに、第２セツトの維持機能が存在し、これが細胞分裂時の プラスミド分子の規則的な分配番ζ櫃極的に関与しているということを示唆して いる。かような機能は分配機能（ｐａｒｔｉｔｉｏ社邸ｆｕｎａｔｉｏｎ）と呼 称されている。例えば、Ｍｓａａｏｏｋ　ｓｔ　ａｌ、、　０ｅｌｌ　２０．１ ９８０．　ｎ、　５２９〜４２　＋Ｎ０ｒｄｓｔｒ′６ｍ　ｅｔ　ａｌ　、＊　 ｌ闘社６４　＊　１９８０　＋　Ｗ　−３３２〜４９　ｉ　５ｅｅ−’ｔ　ａｌ 、＋Ｆｌａｇ妃ｄ　７．１９８２．卯、１６３〜７９の研究は、これらの機能が 少なくとも一部分がプラスミド自体によって（ｐａｒ部位（ｐａｒ　ｒｅｇｉｏ ｎり中に〕暗号とされているということを示した。かくして、ある種のプラスミ ド欠失変異株は、通常の野生型複裂挙励な行うにもかかわらずその安定な維持性 もしくは遺伝を失ない、プラスミドの安定性を保証する特定の機能が除去された ことを示したのである（上記Ｎｏｒｄｓｔｒｉ；ｍ　ｅｔ　ａｌ、の文献多照） 。

組換えＤＭＡ技術におけるベクターとして用いられる多くのプラスミドは、野生 ｇＨプラスミドに比べて多量のＤＮＡ　Ｅ除去されているので、これらプラスミ ドは不安定に遺伝されやＴい。

このことは、プラスミドが不安定なことによって結局プラスミドが細胞から完全 になくなりかついずれの場分ちプラスミドに暗号化された遺伝子の産物の相対状 １が減少するので、重大問題を揚起する。この問題は特に、セレクション・プレ ッシャー例えは抗生＠質の雰囲気下での微生物の培養は通常実施不可能でしかも 　環境面刀）らみて少なくとも好ましくないことが多く、その微生物は多改世代 にわたって培養される、大規模生産時に特に著しい。少コピーｌ田胞で存在する にすきないベクターは、不安定に遺伝されそれ故刑胞から失われやすい。プラス ミドの相対的安定性を保証する比較的高いコピー数′５：通常有するプラスミド でも、そのプラスミドに本来間しない（ｎｏｔ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｒｅ−１ ａｔｅｄ　ｉ本来存在していない）遺伝子ご有するＤＩＪＡフラグメントがその 中に挿入されると不安定になることが知られている。

発明の開示 この発明は、そのプラスミドには本来間しない単一もしくは複数の遺伝子が挿入 されて保持され、加つるに分配機能を発揮するＤＮＡフラグメントが挿入されて 保持されているプラスミドに関する。＠浦人される”という用語は、その単一も しくは複式の遺伝子又はＤＭＡフラグメントが、目的とするプラスミドの岨豆で 工管呈中の一段階でプラスミドに導入されたことを意味する。

これに関連して、１分配機能”という用語は、細胞分裂時のプラスミド分子の定 序分配（ｏｒｄａｒｅｄ　ｕａｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を確芙に行い、その機能を 表現するプラスミドのタイプによって、ひとつ以上の遺伝子も含有しつるプラス ミドの部位によって暗号化されている機能を意味する。上記のようにかような部 位は天然に生成する、すなわち野生型プラスミドに見出されるが、Ｐ＆ｒ＋表現 型（ｐｈｓｎｏｔｙｐｅ）を表現Ｔるすなわち分配遺伝子が存在し、そしてその プラスミドには本来間しない単一もしくは複数の遺伝子が挿入されて保持されて いるプラスミドは新規なものであると信じられる。かくして、プラスミドとはよ 生物中に本来存在する染色体外性要素と定義され、その要素はそのもの自体もし くはその透導体として単離することができる。

この発明のプラスミドは、１人された単一もしくは複数の遺伝子によって直接も しくは間接に伝達される工業もしくは医学用の広範囲の産物、特にポリペプチド 項、蛋白類もしくはそのフラグメント、酵素類、酵素、頂の反応による多数の非 蛋白産物、ホルモン類のごとき低分子量産物、及び穣酸頌を得ること？目的とす る組換えＤＮＡ技術分野におけるクローニング・ベクター又は産生ベクターとし て用いることができる。そして真核遺伝子（ｅｕｋ＆ｒｙｏｔｉｏ　ｇｅｎ・） ことに哺乳２遺伝子が特にＭ要である。

この発明の好ましい態様盛こよれば、分配機能とは、野生型耐性プラスミドＲ１ の部位、したかって以下にＲｊｐａｒ部位（Ｒｌｐａｒ　ｒｅｇｉｏｎ）と記載 される部位によって実際に表現される機能である。この発明によって、かような 部位が、そのプラスミドには本来間しない単一もしくは複数の遺伝子を保臀する 不安定なＲ１ミニプラスミドのみならず、そのプラスミドには本来間しない単一 もしくは複数の遺伝子？保有するプラスミドＲ１以外のしばしば分１１Ｔるプラ スミドにも、いくらかのもしくは充分な安定性を付与することが見出されたので ある。特に有益な分配機能のもうひとつの例は、その受容体プラスミド（ｒｅｏ ｉｐｉｅｎｔｐｌａ＠ｍ１ｄ）に高い安定性を付与する野生型のプラスミドＩＦ 　（Ｓｅｅｌｋｅａｔ　ａｌ、上記文献）に見出されたということである。以下 において、土としてＲｉｐａ１″機能（Ｒ１ｐａｒ　？ｕ閲ｔｉｏｎ）について 述べられるが、Ｒ１ｐｙａ能に関連する多（の現象は他のｐａｒ機能にも適用さ れ、かつ広い範囲のこの発明の一般思想がＲ１ｐａｒ機能に限定さｆ’、ｆｌい ということは理解されるべきである。

プラスミドＲ１の分配、幾能はいわゆるＥａｏＲｌ−フラグメントによって発揮 されるということはすでに提示されｆ：　（Ｎｏｒｄ１１Ｉｔｒ’６ｍ５ｔ　ａ ｌ、　、　Ｐｌａｅｍｉｄ　４．１９８０．　ｐｐ、　３３２〜４９　’ｊ照） 。この発明に至る研究過程において情くべきことにはｉｔ＋１１９ｋｂの長さく 　１９，０００のｉｆ、対）’ｒｎするＥａｏＲｌ−Ａフラグメントが、その受 容体プラスミドにＰａｒ＋表現型を付与する２つのしかも２つだけの異なった部 位からなることか見出されたのである。これらの部位は３１；ｏｏＲｌ−Ａフラ グメントの両端に位！しており、冨たＥａｏＲｌ−Ａフラグメント中の他のＤＮ Ａ配列はいずれも、プラスミドを安定化する機能をなんら有していないと現在信 じられている。このため、この二つの部位をそれぞれｐａｒ部位Ａ　（ｐａｒ　 ｒｅｇｉｏｎ　Ａ）とｐａｒ部位Ｂ　（ｐａｒ　ｒｅｇｔｏｎ　Ｂ）と命名し、 それぞれｐａｒ　Ａ及びｐａｒ　Ｂと略称した。

小さいフラグメントはプラスミドに挿入しや丁（し力）も得られたプラスミドは 宿主列胞に形質低損しやすいので、できるだけ小さいＤＮＡフラグメントで作動 させるのが有利であることから、この発明はひとつの態様として、プラスミドλ １のｍｃｏＲ１フラグメントより短かくてＲｉｐａｒｉ位を有するＤＩＪＡフラ グメントが挿入されてこれを保持するプラスミドを提供するものである。この挿 入されたＤＢｒＡフラグメントは通常、その主な要素として！ｔ１ｐａｒ部位入 部位、Ｒ１ｐａｒ部位Ｂ部位、又はＲ１ｐａｒ部位八とへ１ｐａｒ４位Ｂの両者 からなる。このことは、宿主プラスミドに挿入されたＤＮＡフラグメントのすべ てが実Ａ的に、両方の部位のいずれか一つもしくは両者で構成されていることを 意味する。そのフラグメント上の残りのＤ？ｒＡは主して適切な制限厘位（ｒｅ ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）を提供するためのものであり、受容体プラスミ ド上の対応又は１合性制限座位と容易に適合する所望の端部を有するＤＮＡフラ グメントで提供する。かような端部もリンカ−によって提供できる。しかし、　 ｐａｒ　”３位人からなるＤＮＡフラグメント及びｐａｒ部位３カ）らなるＤ１ ｉＡフラグメントは、同じプラスミドに別々ｌこもしくは連続的に１人できて、 そのプラスミドは、同−ＤＨ人フラグメント上にあるｐａｒ部位Ａとｐ＆ｒ部位 Ｂとを・雀入することによって表現型ＰａｒＡ”　、ＰａｒＢ＋を樹立したプラ スミドと表現型；こついて同一であるということに留意することが１要である。

例えば、ｐａｒＢ部位のごときｐａｒ部位をすでにｆｌ持しているプラスミドを さらに安定化したいならばそのプラスミドは適切な制限酵素で制限して、そして この制限座位と１・１合性の端部を臀しかつ声部位のごとき他の声部位ご有する ＤＮＡフラグメントを挿入してもよい。また逆の方法丁ｔわち、すでにｐａｒＡ 部位を有するプラスミドにｐａｒＢ部位を同様にして挿入する方法を採用しても よい。

したがって臭味あるプラスミドは、Ｒ１ｐａｒ部位ＡとＲ１％ｒＢ部位とからな る挿入されたＤｔｌＡフラグメントが約６　ｋｌ）を超えない長さ、侍に約４　 ｋｔｌを超えない長さ、ことに３　ｋｔｌ　Ｅ超えない長さを有するプラスミド である。挿入されたＤＮＡフラグメントが１１ｐａｒ部位Ａを有するときは通常 約４　ｋｂを超えない長さ？有し、特に約２．５３＝ｂ　を超えない長さ、こと に約２　ｋｌ）を超えない長さ％ｑする。挿入されたＭＡフラグメントがＲ１ｐ ａｒ部位Ｂからなるときは通常約２　ｋｌ）　；：超えない長さを有し、特に約 １．５ｋｌ）を個えない長さ、ことに約ｊ　ｋｔｌを超えない長さ’Ｅ−Ｗする 。上記の理由から小さいＤＮＡフラグメントを選択しているがＢｌｏｏＲｌ−Ａ フラグメント全体？挿入することによってプラスミドの安定性ご得る可能性ご除 外するものではない。このことは例えば、安定化させるべきプラスミドの大きさ が余り重要でない場合には許容することができる。フラグメント全体が挿入され る際は、抗生物質耐相を伝達する遺伝子を持つＤｌｉＡフラグメントを有するこ とがスクリーニングするのに有利である。しかしある種の理由からＥａｏＲｌ− Ａ　フラグメントの大きさを小さくしたい際は、ＫｃｏＲｌ−Ａ　フラグメント を制限酵素ｐｓｔｌで部分的に制限するか、又はその大きなフラグメントから各 Ｒ１ｐａｒ部位を切除し次いで各部位を同じＤＮＡフラグメントに逐次転、）さ せ、久いでこＯフラグフッ１ド安定化させるべきプラスミド：Ｃせるなどのごと き種々の方法で行うことができる。

この発明の原理にしたがって安定化されるプラスミドは、挿入され７：Ｒ１ｐａ ｒ部位によって安定化されるＲ１　ミニプラスミド（Ｒ１４ニブラスミドはオリ ジナルのＲｌＭＡの多くが除去され、その結果通常Ｒｊ　ｐＨｕ”部位を含有し ていない）のごとき、挿入された分配部位と本来の関係（ｍｔｕｒａｌ　ｒ・１ ａｔｉｏｎ）を持つプラスミドであってもよく、又は分配機能と本来の関係を持 たないプラスミドであってもよい。この発明に係る有用で有効な分配機能によっ て　１１ｐ＆１”部位によってＲ１ミニプラスミドを安定化する場合のように本 来の関係にあるプラスミドのみならず、分配機能が本来の関係にないプラスミド についても充分な安定性を保証しつるということは興味深いことである。後者の 例は、ｐＭＢｊプラスミドもしくはその透導体やｐＢＲ３２２プラスミドもしく はその透導体のととき非Ｒ１プラスミドにＲ１ｐａｒ部位を挿入するものである （これらのプラスミドは通常安定であるが、そのプラスミドと本来関係でない単 一もしくは複数の遺伝子が挿入されると不安定になりやすい）。一方の例は、そ のプラスミドを宵する用菌を培養中の少なくとも一段階に３いて、低コピー数で 広い宿主域を有するプラスミド類（多くの異なった宿主菌株もしくは植中に複製 できるプラスミド類であり、このクラスのものは２以上のタイプの微生物に複製 しつるいわゆるシャトルベクターを含む）及びその透導体、例えばＲＫ２のとと さ、低コピー数例えば０．５〜５コピー／ａ胞を倚するある棟のプラスミドの安 定化にＲ１ｐａｒ部位を用いる場合である。

Ｒ１とは別に、安定化を要する不適合性（ｉｗｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔ７）グル ープ−ａＦｌの他のプラスミドには例えばＲ１００とＲ６が含まれる。不安定な プラスミド７ｆｉ導体の安定化にＲ１ｐａｒ部位ご用いることもこの発明の範囲 に含まれる。

この発明の安定化法が重要であるプラスミドのひとつの例は条件ランアウェイＪ ｉ製プラスミド（ａｏｎｃｕｔｉｏｍｌ　！’ｕｎ＆ｗａ７　ｒｅｐｌｉａａｔ ｉ−ｏｎ）である。すなわち、そのプラスミドな有する宿主微生物がある条件下 で培養される際に一定の低いプラスミドコピー数を有し、またそのプラスミドを 有する宿主微生物がある異なる条件で培養される際その復製のコントロールを失 い、そのプラスミドコピー数が、宿主剥胞の成長が停止するまで指数関数的に増 大するプラスミド類である。この発明の安定化法が特に必要なランアウェイ複製 プラスミドは、約３〜５コピー／ａａを超えないコピー数を有するランアウェイ 復製プラスミドであり、特にかようなプラスミドはそのプラスミドを有する微生 物がかような低コピー数を保証する条件下で培養されると、約０．５〜１コピー ／細胞を超えないコピー数を有しく０．５という数字は複製頻度が１１細胞周期 以下であることを意味すると理屏される）、その宿主微生物がプラスミドコピー 数を英１的に増大Ｔるのを保証するある異なる条件下で培養されると少なくとも 約５００〜１０００コピー／ｍ飽の範囲のコピー数な有するランアウェイ復製プ ラスミドである。

しくは致死性の産物の遺伝情報を指定する外来迩伝子を宿！−＃挿入するための ベクターとして用いるときに望ましいことである。というのは、例えば低温でプ ラスミド復製速度が低いことからその遺伝子はたとえ表現されるとしても少漬表 現されるだけであるので、細胞は培養の増殖過程で損傷しないままで存続するか らである。しかし、低温で細胞を培養するがごとき増殖過程の条件下で上記のよ うに極端に低いコピー数を有するプラスミド中にｐ＆ｒ部位がないと、このプラ スミドを３〜５コピー数／’［！を超えないような低コピー数？保証Ｔる条件下 で培養すると３〜５コピー／ｉ胞を超えないコピー数？有Ｔるプラスミドについ て約１％／世代の頻度で微生物集団からプラスミドが失われる精巣になる。約０ ．５〜１コピー／ａ胞を超えないコピー数を胃するプラスミド喪失の頻度は約５ ％／刑胞／世ラスミドは、ランアウェイ：Ｊｌｉｔ秀導Ｔるのに経済的であるよ うな朱書培地中の密度にその１胞が到達Ｔる前に、その細胞から失われてし亘う ことは明白である。このことは、量産規模の＠４に到達するために何百世代もの 納置培養５：要する大量生産の場合に特に明白である。

かようなランアウェイ複製は、そのプラスミドの８コントロール遺伝子（単一も しくは連数）　（ｍｔｉマ＠　ｒｅｐｌｉａａｔｉ血ａｏｎｔｒｏｌ　ｇｏｎｏ （ａ）：ｌの上流側（ｕｐａｔｒｅａａ）にＪ節しうるプｏ　モーター（ｒａｇ ｕｌａｔａ’ｏｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を挿入することによって条件付きにす ることができる（この混染の詳細な記載は、＠Ｆｌａｇ社ｄａ　ｗｉｔｈ　０ａ ｎｄｉ−ｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｏｏｎｔｒｏｌｌｓｄ　Ｒｅｐｌｉａａｔｉｏｎ　 Ｂｅｈａマ１眞２の標題で本願と同じ日に出願された不ｄ出願人の係続中の出願 にある）。ランアウェイ復製挙ｊｈ　ｆ　Ｗ　Ｔるプラスミドとしては多くの異 なるタイプのものであってもよいか、好ましいランアウェイ複製プラスミドはＲ １タイプのプラスミドである。

この明ＮＵ沓において１安定性１という用語（及び関連用語）は、宿主重砲から のプラスミドの喪失のｌＪ！ｌＩＦ！Ｌが２Ｘ１０−’／ａ胞／世代より少ない ことを意味するよう意図されている。野生型プラスミドと同様に安定な、すなわ ち遺伝子の突然変異率のレベルに相当する３Ｘ１０　／細胞／世代より少ない喪 失頻度を有するプラスミドを得ることは、そのプラスミドに篇機能を組込むこと によって可能なことは明白である。この後者の喪失頻度（ｆｒｅｑｕｅｍｙ　ｏ ｆ　１ｏｓｓ、　ＬＰ）値は、Ｅ！ｏｏＲｊ−＾フラグメントの全体がプラスミ ド中に挿入されたときのようにＲ１ｐａｒ部位ムとＲｌｐａｒ　部位Ｂの両方で プラスミドが安定化される際にみとめられる。

しかし、上記のように、プラスミドＲ１のＰａｒ”　表現型はＥｅ。

Ｒ１−Ａフラグメントの各々別個のｐ＆ｒ部位に位１している。これらのｐ＆ｒ 部位は各々、安定化機能もしくは分配機能を欠くプラスミドと定義される不安定 なプラスミドに安定化効果を与えることが見出された。Ｐａｒ−表現型のかよう なプラスミドは通常、調い頻度もしくは低い頻度で宿主細胞から失われる。刀） ＜シて、例えばそのｐａｒ部位の欠失したプラスミドｎ１ｌＪ体は、宿主細胞か ら約１．５　Ｘ　１０　／細Ｉｌｌ／世代の頻度で失われる。同げに、Ｐａｒ− 表現型のプラスミドル１５誘導体は約Ｉ　Ｘ　１０−２／罰胞／世代の頻度で失 われ、いくつかのプラスミド’ｐＭＢｉ　０ＢＲ３２２）ｔ７Ｉ導体（実施例３ ．３に記載した１例のごとき）は約６Ｘ１０−３／’ａｉＩｉ！！／ｆｌｉｔ代 の頻度で失われることかある。逆にｐａｒＡもしくはｐａｒＢだけで安定化され たＲ１　プラスミドは約Ｉ　Ｑ　−’　／　北ｔｉＡ　／世代のＬＩＦ　値ご有 し、これらのｐａｒ部位のいずれ刀）を有ＴるＤＩ人フラグメントが不安定なベ クターに挿入されると１００倍安定化されることｆこ相当Ｔる。対応するｐ１５ 　ｓ４体についての数値は約８　Ｘ　１０　（ＰａｒＡ　）、　Ｉ　Ｘ　１０　 （ＰａｒＢ　）であり、対応スルｐＭＢ１襦４体についての数値は５　Ｘ　１Ｏ −５（ＰａｒＢ”）である。ｐａｒＡとｐａｒＢの部位の両者を有するプラスミ ドは約１０−６／細施／世代の１７値すなわち１０４倍の安定性を有する。容易 に３照するため、異なるオリジンの安定化されたレプリコンと不安定なレプリコ ンについて得られた結果を第１表に示した。これは各ｐａｒ部位が他のｐａｒ部 位と独豆して作動し、そのｐａｒ　品位は少なくともＲ１プラスミドとｐ１５プ ラスミド？安定化するのにほぼ同等に有効であり、またそれらの作動もしくは効 果は累積的であることを示している。この知見は不安定なプラスミド？安定化す るのに必要な度合を決定するときに利用できる。余りにも著しい安定化を必要と しない場合、すなわち安定化されるべきプラスミドが極端に不安定でないと評価 さｎｒ＝　（１０−２／　ｍ胞／世代より小さいＬＰ値を有Ｔる）場合は、充分 な安定性を得るため、すなわち数百世代にわたる大量生産用細菌集団からプラス ミドが徐々に失われるのを防止するためには、ｐａｒｉ位のひとつを有するＤｌ ｉＡフラグメントを挿入Ｔれば充分であろう。一方プラスミドが著しく不安定な 場合は（１０よりも大きいＩＩ？値とｎする）、そのプラスミドの著しい安定性 を保証するためには円方のｐａｒ部位部位式１人ことが必要であるか又は少なく とｂ−ｉ利であろう。

表　１ 異なるレプリコンの喪失ｉ４［（／ａｆｆｉｄ／世代）レプリコンのタイプ　会 「表現型 Ｒ１１５００，６１，００，０４ ｐ１５　１００　８．０　０．０１　０．０１ｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２）　６０ 　ＮＤ”　０．５　０．１１ＮＤはデータなし これらの測定可能なＬＰ値は、上記定義のタイプのいずれのプラスミドが、遺伝 子産物の４Ｂにベクターとして使用できて、その結果そのプラスミドには本来存 在しない少なくともひとつの遺伝子を有すべきである場合に利用できる。、刀λ くしてこの発明は別の態様として、上記特性のいずれか分有するｐａｒで安定化 されたプラスミドを有する。１８　渭を培誓し次いでそのプラスミドの遺伝子産 物をその細菌培養吻刀）ら収潰する、プラスミドＤＮＡからＪ伝子産吻を生産す る方法を提供するものである。培％目体は、問題のａｌ菌種に最適なことか知ら れている通常の栄誉場地を含む通常の技術を用いて適切に行われる。その安定化 法について、特定の組成の栄養培地を殖しないということは特筆に値する。また 遺伝子産物の収穫は、製造される特定の遺伝子産物の同一性（アイデンティティ ）と性質、宿生ｉ菌の性質などに適する公知の方法にしたがって行われる。陪従 は、＋１１菌の少なくとも１００世代にわたって続けられる。大−１生産時、細 菌を増殖するのに必要なｄＩａ世代数は１００世代？超えてもよい。このような 環境下に３いて、プラスミドのＬ１値は、プラスミドの漿失が２　Ｘ　１０　、 　／　Ｍｍ　／世代より小さいように、その中のｐｌＬｒ部位の存在によって選 択される。このＬ１値はひとつのｐａｒ部位だけで通常得ることができる。しか しいくつかの場合には、１０−５／細胞／世代より小さい、特に５Ｘ１ｏ　／細 廁／世代より小さいプラスミドのＬＰ値な得ることが好ましい。

これらの非常に小さなＬ？値は、いくつかの例ではひとつだけのｐａｒ部位（特 に１１ｐａｒ部位Ｂ）の挿入によって得ることができるが、通常両方の１１ｐａ ｒ部位の存在が必要である。

この発明は他の態様として上記定義のタイプのプラスミドご有Ｔる細菌を提供す るものである。プラスミド維持を保証するのにいずれの特定の突然変異株もしく は菌株ご必要としないということはこの発明のプラスミド特有の利点である。か くして、グラム陰性菌のごとくかようなプラスミドを保有しうる到菌の種と菌株 のいずれ分も用いることができる。この発明のプラスミドが複製できてそれらの 安定性を維持できるａ菌の特例は大誕菌（エシェリヒア・コリ）である。

さいごにこの発明は主要素としてＲｊｐａｒ部位からなるＤＮＡフラグメントを 提供するものである。これは、宿主プラスミドに挿入されたＤＮＡフラグメント の丁べてが実質的に両方のｐ＆ｒ部位のいずれかによって構成され、そのＤＮＡ の残りの部分は受容体プラスミドの適合性制限座位への挿入用の適切な制限座位 を備えている。Ｒｊ　ｐａｒ部位ＡとＲ１ｐａｒ部位Ｂを有Ｔる挿入されたＤＮ Ａフラグメントは、この原理によって約６　ｋｂを超えない長さであるべきで特 に約４　ｋｋｌを超えずことに３　ｋｂを超えない長さであるべきである。その ＤＢｉＡフラグメントがＲ１ｐａｒ人を含む際は、通常的４　ｋｂを超えない長 さ分有し、特に約２．５ｋｌ＋を超えない長さことに約２　ｋｂを超えない長さ を有Ｔる。そのＤＮＡフラグメントがＲ１ｐａｒ部位Ｂを有する際は、通常的２ 　ｋｂを超えない長さを有し、特に約１．５ｋｌ）を超えない長さことに約１　 ｋｔ）を超えない長さを有する。制限酵素マツピングによってｐａｒＡ部位が約 １８００ｂｐ　（４基対）の長さの部位に狭められ、ｐ＆１″Ｂ部位が約９００ 　ｂｐに狭められた、小さくてそれ故に容易に挿入しうるＤＮＡフラグメントが それらの安定化機能を保持していたということは驚（べき知見である。Ｐａｒ＋ 表現型全現型に有する単一もしくは連数の遺伝子はさらに小さくすることが可能 である。

Ｐａｒ　表現型分有する：ＪｉＷでハイブリッドプラスミド（ｃｏｎａ−ｔｒｕ ｏｔｉｏｎ　ｈｙｂｒｉ　ｐｌａａｍｌ）について重要な問題は、こ０）Ｒ現型 をスクリーニングアジ早（て１＝ｆｉ早な万、去がないことであった。一般に進 上なハイブリッドプラスミドは、セレクション圧なしてのプラスミドの堵掻甲の プラスミドの高い安定性ごもたらすＰａｒ”　ｉ現型によって同定Ｔることかで きる。し刀）しこのタイプのスクリーニング法は冗長であり、いずれの４ｅもそ の親プラスミドが不安定に遺伝されているさいをこ適切であるに過ぎない。いま や下記に概説するような別のスクリーニング法か開発さｎたのである。

ａ）　ｐａｒＡ＋フラグメント伸大のためのスクリーニング法ｐａｒＡ”　ｔｇ 侃をともに有している２つの異なるプラスミド（別個の非Ａ＠牲グループ刀）ら の）が同じ」嵐中に存在すると、多分それらプラスミドが細弛中の分配袋直分争 い合うからある頻度で互に排斥し会うものである。（不適合圧）。ｐａｒによっ て伝達された不適合性表現型のこのタイプのものはｐａｒハイブリッド牙スタス クリーニングのに利用できる。例えばＰａｒＡ”プラスミドは１ａａ遺伝子とｐ ａｒＡ＋部位ご持つ他のプラスミドを有するΔ１ａａエシェリヒア・コリ菌株（ 例えば０８Ｈ５０）に形質転換することができる。通常入ってくるプラスミドは ｐａｒ”で伝達された不適合性ご常在性ＰａｒＡ＋プラスミドに対して発揮する 。常在性プラスミドのＬａａ”表現型によって、かような不適合性は、もし形質 転換Ｉ１１］Ｉｉｌが入ってくるプラスミドにだけ認められる壽性僚識（ｒｅｓ ｉｓｔａｎｃｅ　ａｉｒｋｅｒ）に基づいて選択されるならば容易に検出される 。一方その常在性プラスミドが存在するか合力）はマ゛ンコン牛イラクドースプ レー）　（！Ａｃ０ｏｎｋｓｙ　１ａｃｔｏｓｅｐｌａｔｅｓ）のような指示２ Ｊ、　ｉ　（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ　５ｕｂｓｔｒａｔｅｓ）にスコアされる。か ようなプレートから新しい同、陳なプレートへ移Ｔレプリカ平扱法のコロニイは 、ＬｉＬＱ−ａｍの発生と示す無着色のコロニイとして、常在性プラスミドの移 転のごく低いレベルでも提示する。もうひとつの安定性試験もしくはより広範囲 の不適合性試験か潜在するｐａｒＡ＋ハイブリッドプラスミドの性質を試験Ｔる のに必要なときかめる。このようにして入って（るプラスミドと常在性プラスミ ドとの過圧な（ｉｉ４＠性の）組合わせを行うことによって、工ｎｏ”　（Ｐａ ｒ”）フラグメントをプラスミドに一人しプラスミドが不安定か安定かＴｅａや かにスクリーニングすることが可能である。

ｂ）　ｐａｒＢ＋７ラグメント伸入のためのスクリーニング法まｆｐａｒＢ部位 をともに有Ｔる２つの無縁のプラスミドが互に不＝０であることも示されたので 、ｐａｒＡ＋ハイブリッドの作製について述べられたのと同じスクリーニング法 がｐａｒＢ＋ハイブリッドの作製薔こ適合する。

ａ）　ｐａｒＡ”　、　Ｂ＋７ラグメント伸入のためのスクリーニング法Ｔｙｓ ５　Ｔｅ挿入されたＥｉａｏＲｌ−Ａフラグメントは上記記載によってｐａｒＡ ＋ハイブリッドとｐａｒＢ＋ハイブリッドの両者を移転さＴポテンシャルを−ｆ ｉＴるだけでなく　、ｐａｒＡ”　、　ｐａｒＢ＋７ラグメントを有するプラス ミドの直接選択（ＫｍＲ）　８行わせる。かくしてそのフラグメントが大きいに もかかわらず、極めて／Ｊ）数のハイブリッドでも容易に選択される。両方のｐ ａｒ＋部位からなる小さい方のＤｌｉＡフラグメントも勿論ｐａｒＡ＋プラスミ ドとｐａｒＢ＋プラスミドの両者に対して不Ｊｌａ性を示す。

図面の説明 図面について以下に説明する。

第１〜５図と第７〜１７図は各実１例に記載のプラスミドの制限マツプを示す。

第６因はＲ１からのＰｓｔｌ−Ｄフラグメントの詳細なマツプ（比例尺に合わせ て作図されていない）を示し、及び第１８図は異なるｐ＆ｒ部位を有する異なる タイプのレプリコン；ｔ　ｐａｒ−レプリコンと比・咬した安定性曲線３示す。

、４１−５図と’３４７−１７図には各実施例に記載のプラスミドの直線状制限 マツプが示され、そのマツプに、プラスミドの表現型と遺伝子型とが親プラスミ ドを示Ｔ水平線の上に示されている。か（してｐａｒＡはプラスミドの維持を保 証するプラスミドＲ１の部位のうちのひとつを示し、ｐａｒＢ　はプラスミドの 維持を保証するプラスミドＲ１の他の部位を示す、　１ａｖｌはコリシンｍ１　 に対する免疫性を伝達する遺伝子を示す。ｏｒｉもしくはｏｒＬ■はプラスミド 復製のオリジンを示す。ｂｌａはアンピシリンに対する耐性の遺伝情報を指定す る遺伝子を示す。工ＲはＴｎＳ上の逆方向反復構造な示す。ＫｍＲはカナマイシ ン耐性を示す。ＯｍＲはクロラムフェニコール耐性を示す。Ａｐｌはアンピシリ ン耐性を示す。Ｔｏ　はテトラサイクリン耐性な示Ｔｏ　ｒｅｐＡはＲ１複製に 必要な蛋白の合成の遺伝情報ご指定する遺伝子を示す。１ａａＺ、　１ａａＹ及 び１ａｃＡは伸入されたｌａａオペロンを示し、その１ａｅＺはβ−ガラクトシ ダーゼの遺伝情報す指定し、１ａＯ’ｒはパーミアーゼのコ樗伝情＠を指定し、 １ａｏＡはトランスアセチラーゼの遺伝情報を指定する。ｒｅｐＡ−１ａａＺは ｒｅｐＡ４伝子と１ａＱＺ　Ｊ伝子間の融合体（？ｕｓｉＯｎ）　ｆ示す。ｃｏ ｐＢはｒｅｐＡプロモーター（Ｒ１プラスミドの）からの転写を抑制Ｔるポリペ プチドのゴ→伝情報を指定する遺伝子？示す。ａ　ｏｐＡはＲｅｐＡ−ＲＮＡの 翔訳を抑制するＲＭ人分子の遺伝情報を指定Ｔる遺伝子を示す。ＣＩ。５．はλ ＰＲプロモーターの活性を制御する感熱住人リプレッサー合成の遺伝情報を指定 する遺伝子な示す。ＰｄＯ２はｄｅｏプロモーターを示す。矢印は転写の方向を 示し、三角形はＤＮＡの１申入を意味Ｔる。フィルドイン部分とブランク部分は 挿入された遺伝子ご示す。点諜は欠失を示す。

水平線の下により限酵素に対Ｔる座位が示され、ＥはＫｏｏＲｌを意味し、Ｐは Ｐｓｔｌを意味する。３．は第１図と第５図を除いてＢａｍＨＩ　ｆ　意味し、 これらの図に詔いて１″！１５ＤＮＡを除いてＥｌはＢａ１１を意味する。Ｈ， はＨｐａｌを意味する。Ｒ７はＩＩｔｏｏＲｖを意味する。Ｂ２はＢｇｌｌ［’ ？意味し、Ｓ工はＳ＆ｌＩ　′？：意味する。

Ｒ３はＨ１瑣ｌを意味し０は０１ａｌを意味する。

第６図に右いて、Ｐｓｔｌ−Ｄフラグメントがさらにマツピングされた。水平線 より上の数字は制限座位間の４基対の数を示す。

水平線の下に、制限酵素のための座位が示され、Ｒ工はＲｅａｌを、ＰはＰｓｔ ｌ　ｅ、Ｈ，はＨｐａＪ　ｙｉ：示す。

第１８図に、実施例に＄いて作製され試、倹され７’：Ｅｔｌ、ｐ１５及びｐＢ Ｒ３２２それぞれの透４体の安定性曲壕が示す。各曲線は１００世代以上ｉ疏け た少な（とも２つの孜体場％吻について平均したものを示す。この１力）ら、ｐ ａｒＡとｐａｒＢの両方？含むプラスミドは著しく安定に遺伝されていることか 分力）る。またｐａｒＢだけを含むプラスミド及びｐａｒＡだけで安定化された ミニ−Ｒ１プラスミドの場合も同様である。

Ｐａｒ−プラスミドの曲線から、一定の】失速度のために、予想と２つに、プラ スミドを保有する細胞の頻度か最初から指数函数的に減少することが分かる。後 の段階で、プラスミド保有細胞の頻度はプラスミドのないａ胞の成長速度かわ丁 刀）に早くなったことから明らかにより急運に減少している（実巌で示す）。

点線はこのより早い成長速度についてＪ整され長失の芙際の頻度を示す曲線を示 す。

対照的に、表現型面にＰａｒ−でめるプラスミド＠は、すなわちＲ１プラスミド は１．５Ｘ１０　／ｉＢ記／世代の頻度で、ｐ１５プラスミドは１ｘ１０　／ａ 胞／世代の頻度で、いくつかのｐＢＲ６２２プラスミド類（実Ｍ３．３に記載の 例〕は６Ｘ１０　／細ＩＩｇ／世代の頻度で喪失する。事実、ｐ１５ｊ’ａｒ− ：Ａ導体とｐＢＲ３２２Ｐａｒ−ｊ！’Ｊ体の喪失頻度は、これらのベクターの コピー数を考慮すると着くほど誦い。例えばｐ１５のコピー数は１５−２０７細 肥のオーダーであり、プラスミドが二項分布すると仮定するなら１０−９／細Ｂ ４／世代の喪失速度が予想される。そｎにもかかわらず高い喪失速度がｉｓさ４ るのは、ｐ１５レプリコンが、多分１ｏｘＰ［の分解機能（１億ト１１ｋｓ　ｒ ｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｆ’ｕｎａｔｉｏｎ）を欠いているので、ｒａｏＡ依存の コーインテグノイト（ｒｅａＡ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｏｉｎＱｇｒａｔｅｓ） 　＠形成Ｔるという事実（Ａｕｓｔ、ｉｎ　ｅｔ　＆１．　、０ｅＬｌ　２５゜ １ １９８１、　ｐｐ、　７２９〜５６）によって容易に説明される。またｐＢＲ３ ２２考導体はコーインテグレイトを形成Ｔることが知られており、そしてコピー 数か例えは大きなりローン化されたフラグメント（ｌａｒｇｅ　ｃｌｏｎ＠ｄ　 ｆｒａｐ＠ｄ）のために４少すると、ｐなり不安定になる。

原料と方法 用いたエシェリヒア争コリに一１２Ｊ株は０３Ｈ５０である（Δｐｒ。

−１ａｏ、　ｒｐａＬ　ｉ　Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｒ　：　＆１ｐｓｒｔｍｅｎｔｓ 　話ＭＯ１６０ｕｌ＆ｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｅ、　ＯｏｌｄＳｐｒｉｇ　Ｈａｒｋ ＋ｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７２　参照〕。いくつかのプラスミドとバ クテリオファージを使用した（第２表）。

用いた実験技術は鑞生吻逮伝字（Ｊ、　Ｍｉｕｅｒ目呻ｇｒｉｍ・ｎｔｓ江：Ｊ ｏｌａｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉａｇ、　Ｃｏ１ｄ　ｓ′ｐｒｉｑ　Ｂａｒｂｅ ｒ、　Ｎｏｗ　Ｙａｒｋ、　１９７２）及び遺伝子操作（Ｄａｖｉａ、　Ｅａｔ ｓｔｅｉｚ＞　ａｎｄ　Ｒｏｔｈ　：　Ａ　ｍｘｍｓｌ　ｆｏｒ　ｇｏｎｅｔｉ ｏ　ｅｎｇｉｎａｅ−ｒｈ＜　；Ａａｖａｎｏｅｄ　Ｂａａｔｓｒｉａニーｎｅ ｔｉｃｓ、　０ｏｌｃＬ　８ｐｒｌｘｈｇ　１ｉａｒｂｏｒ、　Ｒｅｎｔ　Ｙｏ ｒｋ。

１９８のの各分野に用いられるａ４技術である。

すべての細胞は、０．２％グルコースと１μｆｉｌｌのチアミンを含有するＩ、 Ｂａ地（Ｂｅｒｔｓ社、　Ｊ、　Ｂａａｔ　６２．１９５１．　ｐ、　２９３） 又は０．２％グルコースと１％カサミノ１１！コ補充したＡ＋Ｂミニマル培地（ Ｑｌａｒｋ　ａｍ　１４１φｍ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２３．１９６ ７、　ｐ、　９９）中で培養した。

用いたプレートは］、ＩＢ　ｉｌｌ地と１．５％の寒天を含有するＬムプレート である。

マツコンキイラクトース指示プレートは製造メーカー（ＤｉｒＯＯ）が推せんＴ るとおりにしてｒＦ−裂した。そしてＸ−ｇａｌプレートは、２０−４０μｙノ ーの５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを、０．２　 ％のグルコースと１μｆｅｄのチアミン蕾補充したＡ”Ｂミニマル培地に添加す ることによって作製した。

ｙＪ理化学的方法 透明な溶解物（１ｙ８ａｔｆｌ）は０１ｅｖｒｓｌｌ　ａｎｃＬ　Ｈｅ１ｉ朋ｋ ｉ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａａａｄ。

３ｏ１．ＵＳＡ　６２．１９６９．　ｐｐ、　１１５９〜６６１こ記４の方法に したがって作製された。

プラスミドＤＮＡの小規模製造はＢｉｒｎｂｏｉｍ　ａｔ　ａｌ、、　Ｎｕｏｌ 、ＡａｉｄｓＲｅｌｌ、　７．１９７９．　ｐｐ、　１５１３−２３の方法で行 った。

ブラスミドシＨＡの大規模製造と分析は、Ｓｔ眞鴎ａａａ鳳玉ｏ１１ｍ。

朧ｌ、　Ｂ１ｏｏｈｅ＋ｏ、　１１３．１９８１．　ｐ、　１８１にしたがって ｄｙｅ　ｂｏｙａｎｌ　ｄａｎｓｉｔ７ｇｒａａｉｅｎｔ　ａｅ：ｎｔｒｉｆｕ ｇａｔｉｏｎを用いて行った。

ＤＮＡ調製吻のポリアクリルアミドゲル′へ気泳劾法とアガロースゲル−気隊ｓ ＯＪ　’６による分針は侍に′Ａｏｌｉｎ　ａｎｄ　ＺＪｃｒｄｓｔｒｉ：ｉｍ 、　−ｔｈｏｄｇｉｎ　Ｐｌａａｍｉ、ｄ　Ｂ１０１０ｇ７．　Ｏｃ＠佃ａσｎ ｉ＝、ｅｒｓｉｔ７１９８２に記載のと２９にして行った。

制限エンドヌクレアーゼ類は、製造メーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　。

Ｍａｎｎｈｓｉｍ　ｏｒ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｎｅｗ　４ａｈｄ）の戊明−１に したがって６７℃で由いた。二１及び三重のダイジェスト（ｄｉｇｅｓｔ）は、 最低の環１４度を要する酵素で開始し次の前案２添加する前に模衝ン反を添加し てａ襲することζこよって行った。

エクソヌクレアーゼＢＩＬ１３１での処理は次のように行った。

０．１Ｍ位のＢａ１３１を５０μｍの線状ＤＮＡに温和し、試゛科として１分、 ２分、４分、８分、１６分、３２分及び６０分後に６Ｑ　ｍＭコＤＴＡ　４７　 ｉこ採取しフニノーノνで抽出しエタノールで沈設とし、次いで２０μ／／ＴＦ ｌｉ：段倫液に傅反慈１１ぎせた。２０μｇの半２を適切な制限ｂ＃素でダイジ ェストし、アガロースゲル電気泳動性１こ付して欠失したＤＮＡの欠失都の平均 サイズを測定した。一方の半ｔ１こは過切なリン刀−を添加し、その混賃吻を過 動のＴ４ＤＩＩＡ　ＩＪガーゼとともに４８侍間遠箱反応に付した。

制限されたプラスミドＤＮｋ　ＯＪ　Ｍ　ｍ反応は、プラントエンドの連結反″ ６を除いては裂漬メー７一の存てんするとおりＧこ、過剰のＴ４ＤＩＪＡリガー セこＡＴＰ−ｒ：添加して行つに。

微生物学的方法 分配試’Ｊ　（ｐａｒｔ、ｉｏｎｉｎｇ　＋、５ｓｔ）　ｌ　、　Ｌａｏ　ベク ターの作製によって、葬選択的マツコン牛イ・ラクトースル−トもしくはＸ−ｇ ａｌプレートエに単にストリークすることに風ってプラスミドのＰ堪ｒ＋表現型 の測定が可能になった。これらのプラスミドモスミドのない細胞は−ａｉ表現型 を有し、誤希色コロニーとして出曳する。

分配試ｌ９ｉｌ：（Ｌａｏ−プラスミドに用いるン；湛沢プレート（抗生物質を 含有するプレート）からのコロニーをもうひとつの選択プレート上にストリーク しに。このプレートから、ひとツ０）コロニイをＬＡプレート上にストリークし 単果落を形成させた。このＬＡプレートｐらの約１０のコロニイを１−の０．９ ％Ｎ＆０４中に懸濁させ、１０　と１０　とのそれぞれの希釈率まで希釈した。

０．１ｄづつの１０−４希択仮と１０−５希訳孜ごＬＡ７’レート上にひろげた 。こ几らのル−トかう５０　コロニィの１万性パターン（弱い；６゛ス定性か予 想される際は２００コロニイ）は−■冗選択プＬ／−ト上で試験された。次いで 表失系並（Ｌ”Ｊ渭）が式： ％式％） （式ぞ、νはプラスミドモスミドす、る訓ｊ＋Ｊの詔７ｚであり、ひとつのコロ ニイが２７は代、、／）、ｐ３に成長する′と、ざ定しでいる）に法づいて計算 される。この方法に、９胃’Ａの）ト元計的揺動（ｓｔａ−ｔｉａ：１ｏａｌ　 ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）　：；’大きいここでδ）る。

分配試−９Ｉ：Ｌａｃ″プラスミドとＬａｃ−プラスミドの安定性の疋を法。ひ とつの完全コロニイ（ｃｏｍｐ１ａｔ＋３　ｃ＊ｌｑ邸）を選択プレートｐら採 Ｒし、Ｉ　Ｋ＆　；、）　０　、９　；１＋　ｆ（ａＣｇ　ｒこ再、３濁して１ ０−　ｉ＝Ｂ　膿／ｉの、温度と丁、：１゜その１０−３．；Ｒ’沢液の２ＸＯ ，１Ｍを２　Ｘ　１０　ｘｉのＩ、Ｂ層地へのｊ到Ｍに用い、３’Ｊ”Ｃで及劾 ぎｔ、了から培１された。約５　’Ｘ　１（ｌｉ”　：、酊・・ａｄｄの、岨＆ 上」二こイ３いて、ぞの堵］ｑ加ま１［！’＠トｉ０’　ｉｉト１ｃ４ｊｉ沢Ｅ 　Ｊ’Ｌ　ｆコ。１０”　２ｉｆ　’ｊ＜ｉｕ）　Ｄ、ＬＪ　（５Ｘ１０３ｄ胞 ）か祈しいＬＢ層地の１０ゴに依値するのに用いられ、１０５８釈、＆はマツコ ンキー「ラクトースプレート上曇こひろげ１こ。

そしてこ几らのプレートｆ　７．Ｑ　”（て−夜４４ｔ　した。５Ｘ　１０　／ １ｄから５×１０２／、？Ｚへの希釈は・創立・つ２０計代（２Ｆ０）＋と相当 する。その結果ひとつの希釈り１ら欠の、ｈ沢までのプラスミド呆有訓胞の頻度 の麦比は、増２゛立Ｉ／）２０工戊の間に起こる麦化唾こ相当する。より一段ｈ ′グに、電１ｊｆ　４．を仄のように計算することができる。

（式中ν、とν２：ま亡、ｔどイ’Ｌ１ｉ／工１文びｙ２註代後（υプラスミド 保有罰胞の頻度であり、ＬＰは丑失頻度／旧胞／世代である。

そのｉも欠のようになる。

この式ご用いることによって、最初に接種するａ＠数の揺動が原因の誤差は回避 される。この式のより面便な近似式は、ＬＬＦ　＝ｌ！ｌ　（ν、／ν２）／Ｃ １２４，）　である。

不適合性試験 抑大されたｐａｒ部位牙有Ｔると信じられるプラスミドは、同じｐａｒ部位？有 し、他の点では適合性のレプリコンが互いに不適合性であり選択圧がないと２つ のうちのいずれかが喪失するに至るという観察事実を利用することによってスク リーニングされた。この試験は、試験すべきプラスミドな他のプラスミドを保有 する細菌株に形質転換し、両プラスミドご二重選択プレート上で選択することに よって行われる。二重選択プレート（２つの異なる抗生＠質′５：有するプレー ト）上にストリークした後、不適合性が定性的もしくは定速的に測定される。

不迩當性の定性試験のために、二重選択プレートからのコロニイをＩ＋Ａプレー ト上にストリークし単集落（単コロニイ）ご形成させた。このプレートから得た 約１０のコロニイを０．９％Ｎ＆Ｑｌ溶液の０．１−に溶解し１０　と１０　の それぞれに希釈した。１０　希釈液と１０　希釈液の０．１ｄづつｅ　ＴＪＡプ レート上にひろげた。これらのプレートから、５０コロニイ（モジくは弱い不適 合性が予想される際は２００コロニイ）が適切な選択プレート上で試験された。

Ｌａａ＋プラスミドが検体中に含まれでいる場合、マツコンキイ・ラクトースプ レートが選択プレート上でのレプリカプレート法の代りに用いられる。３Ｉ＋Ｆ ＬＱ＋プラスミドの場合、そのスクリーニングはか（して、サスペクトされたｐ ａｒ＋プラスミドを、Ｌａａ＋表現型表現型子伝達ａｒ＋ハイブリッドプラスミ ドごすでに有する菌株に形質転換することによって行われる。プラスミド不適合 性及びその結果入ってくるプラスミドの特定のＰａｒ＋表現型のプルーフは、マ ツコンキイプレート上のＬａａ−コロニーをスクリーニングし常在性ｈ？プラス ミドが不安定化されたことを示Ｔことによって容易に検出される。このスクリー ニング手順の１例が実施例４に記載されている。

不適合性の定１測定は、上記のごとく異種のプラスミド集団を樹立した後のＬａ ｏ＋プラスミドの喪失頻度を測定することによって行われる。そのＴＪＦ値は１ 分配試験Ｍ”に記載されたのと同様にして測定した。

遺伝子技術 細菌の形質転換は、０ｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏａ、　Ｎａｔｌ、Ａｏ ａｃＬ、　Ｓ０１．　ＵＢＡ６２、１９７２．　ＰＩ）、　２１１０−２１１４ にしたがって行われ、低い形質転換頻度が予想されるとき、コンピテント′ａ胞 の氷上に２けるＤＮＡでの処理ご数時間延長し、熱ショックの後、その細胞を再 び氷上で５〜３０分間冷却するという改変がなされた。この処理によって形質転 換頻度が著しく増加した。

バクテリオファージλによる感染は０．２％のマルトースを補充したＬＢ培地中 で（λ受容体であるｍａｌＢ蛋白分透導するため）振盪しながら一夜１０ｄ（Ｄ 培養物を培養することによって行った。その′ａ胞モ０．９％Ｎａｐ／溶液で洗 浄し２ｄの０．０１　ＭＭｙＳ０４　中に再録濁し１時１間培養した。λ懸濁物 の希釈吻（１０°、１０−１．１Ｏ−２）牙作裂し、そのファージ希Ｒ液の０． １：ｄｆ用いてｆｉ譲旧胞の；牙層液の０．２ｄに感染させた。この１感染混合 吻の１０°、１０−１及び１０−２希釈液？遺沢プレート上にひろげた。

Ｔａ２　（Ｋ♂）２有するプラスミドごトランスポーズさせるためのソースはフ ァージλｂ２２１；：Ｔｎ５であり、その付着品位が削除されていたので、それ は溶原化できず、そのファージの４１．　ｔａ液が、トランスポジション（ｔｒ ａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）の望ま几るプラスミド含；に澗胞に感染させるために 用いられた。、洒染は上記のようにして行われ、カナマイシン尉性踊譲が選択さ れた。数千のＫｍＲコロニーが採１反され、これらの１０　希釈該Ｊ）０．１ゴ を用いて１ＱＱｍ　Ｉ＋Ｂ　Ｘ４Ｊｉこ、妾種した。層撞−勿は一夜；イ４され 、この刻す品、昆せ、！男からプラスミドＤＮＡが製造され、Ｅｉ、　０ｏｌｉ 　Ｋ　１２艷味ａｓｎ５０をカナマイシン４ｄ性に形ｆｔＭ’＆するのに用いら れた。

第　２　−＆ プラスミドとファージ ｐＫＮ１８４　Ｎｏｒｄｇｔｒｉ６ｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｓｍｉａ　４． １９８０．　ｐ、　３２２、ｐｓ？２１２４　３ｏ　ｅｔ　ｚｌ、、　Ｍｏ１． Ｇｅｎ、　Ｇｏｎｅｔ、　１４２．１９７５　ｐｐ−２３９−４９゜ｐＧＡ４６ 　Ａｎ　ａｎｄ　Ｆｒ１ｅａｓｎ、　Ｊ、　ｈａｔ、　１４０．１９７９．　Ｐ ｐ、　４００−４０７゜第　２　衰　（涜幻 ｐｘｈｓａｉ　°、１ｃｌｉｘ　Ｑｔ　ａｌ、、、Ｔ、ｘ＝ｔ、１３８．　１７ ９７．　ｐＴｌ、７０−７９゜ｐＦ１４０３−１１　１ラスミドテの基本的レプ リコンからのＡｌｕｌ−Ｎａｅｌフラグメント；ｐＭＧｉ４０３のＳｒ！Ｉａｌ 　Ｊ位；こ」入しくＯａｓ＆ｄＰ、ｂａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　、Ｔ、　Ｂａｃ ｔ、　１４３．１９８０．　ｐ。

９７１）、プラスミド７のＥ遺伝子とｐ！（０１４０３の１　＆　ＣＺ　ｉ；： 　ｉ云子閂に融合セ呂させて組立てられた。

ｐ）ＴＰ３４　？ｒｅｎｔｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　１７．　１９８２． 　ｐｐ、１８９−９６゜ＰＭＯ９０３０ａａａａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｔＴ 、　Ｂａｅｔ、　１４３．１９８０．　ｐ、　９７１゜ｐＫＮｉ５．５２　？、 １ｏｌ−１ｎ　ｑｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｆａｃｔ、１３８．　１９７９．　ｒｒｐ、 　７０−７ヲ。

ｐｖＨ１４２４Ｐ、　Ｖａｌｅｎｔｉｒ＋−Ｈａｎｓｓｈにより、プラスミドｐ ＶＨ１７−：Ｊ）；ｌのｊｏｏプロモーターを有する５ａｕ３Ａフラグメン）　 （ｖａ１３ｎ：ｉｎ→ｈｎａｅｎ　ａｔ　ＩＱ、、　ＢＭＢＯ、Ｔ、。

１９８２、３１７）　８、プラスミドｐＭ０１４０３のＢａｍＨ工厘泣：こ（Ｏ ａａａａｚｂａ：ｘ　ｑｔ　ａｍ、　ｏｐ、　ａｉｔ、、　９７１）　４？ｒ入 することによって１−豆てら几た。

ｐ３に３１０４　Ｍ、りａｓａｄａｂａｎ　ｉこより、ｌａｃプロモーターとｐ ＢＡ　ｉ　３”＋ｐ　７からの通訳イニシェーション部位と′ｆ：＠むＰｖｕｉ ［フラグメント（Ｍｅｓｓｉｑ　ｅｔ　ａｌ、。

ＩｈｘａｌｅｌＣＡｃｉｄｓ　Ｒｅｅ、　９．１９８１．３０９）を、ｐＭＯ１ ４０３のｓｍａＩｆｆ１位に挿入し、次いでｌ　Ａ　Ｑ　Ｚセグメント間の耐応 組換えご行うことによって組立てられた。

９ ５Ｎ　２　表　（侵き） ｂＢＲ３２２Ｂｏｌｉｖａｒ　ａｔ　ａｌ、、　Ｇｅｍ５２．１９７７、　ｐ、 　９５゜ｎＭＢｌＢｅｔＬａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｅｄ、　ｐｒｏＣ，３５ ，１９７６、り１：１．２０３７−４３゜λｂ２２１　ｉ：Ｔａ２　Ｂｓｒｇ、 　Ｄ、　Ｌ、　”ｎ田５ｒｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｘｃｉｓｉａｎ　ｏｆ　ｔｈｅ 　ｔｒａ−ＭｐＱｓａ’ｂｌＧ　ｂｑＱｂ　ｒｅｓｉｓｔａｎｅｅ　ｄｅｔｅｎ ｎｉｍｎｔ　Ｔａ２　’ｉｎ　ＤＮＡ　ＩｎｓｅｒｔｉｏｎＥｎｅｍｅｎｔｓ、 ｎａｓｍｉ＋ｉｓ　ａｎｄ　Ｅｐｉｓｍｅｇ（ｅｄ、　Ａ、　Ｌ　Ｂｕｋｈａｒ ｉ　ａｔ　Ｒ１，）。

ＦＤλ４Ｄ＠ｎｙ８＠７　ａｎｄＷｉｌｌｅｔｔｇ、　１．　Ｂａａｔ、　１２ ６．１９７６、１）、　１６６゜−Ｉ施例１ Ｒ１から得られるｇｏ　ｏＲ１−ＡフラグメントへのＴａ５（ＫｆｆｉＲ）の挿 入プラスミドｐＫＮｉ８４　、すなわちプラスミドｐ！１ｌｌＦ２１２４と、プ ラスミドｕ１　（Ｍｏｒｄｇｔｒ’ｃｉｍ　ａｔ　ｔｘ、、　Ｐｌａｇｍｌ　Ｊ 、　１９８０．　ｐ、　３２２）からの１９ｋｂ　！ｎａｏＲ１−Ａフラグメン ト（７ｅ、ｒム部位とｐａｒＢ部位を持つ）とで構成されたプラスミドを有する Ｅ、　０ｏｌｉ　Ｋ−１２菌株０８Ｈ５０の細胞２１原料と材料”の項で述べた ようにしてバクテリオファージλｂ２１１ＦｌＴｎ５の”Ｉ！ｆ！１液で１染さ せた。２００　ＰＩ／−のカナマイシン含有のＬＡプレート上でカナフィシン耐 性を選択した後、コロニーを採取し混合した。これらの１０−２希釈液の０．１ ｙｄを用いて１００ｄのＬＢ　ｊ＠地に接種した。その培養物を一夜培養した。

その培養物から得られたプラスミドＤＮＡを用いて、２ＣＯμｆ／−のカナマイ シン含有のプレート上でカナマイシン耐性を選択するＬ　ＱＯｌｉ　Ｋ−１２菌 株に形質転換した。

このようにして、カナマイシンに対する耐性モ伝達し、約５ｋｂ　（５０００塩 Ｍ対〕に相当するファージＤＮＡの挿入されたプラスミドｐｏｔｒ１が見出され た。このプラスミドは、プラスミドＤＮＡを作製しアガロースゲル上で分析する ことによって測定される大きさが３４　ｋｂのひとつの分子−纏を有し、またＫ ｍＲｌＡｐＲ，Ｐ＆ｒＡ　及びＰ＆ｒＢの表現型を有する。

プラスミドＤＮＡはｐｏｌｌから作製され、そしてそのプラスミドは、そのプラ スミドＤＮＡを精製し単一もしくは復致の制［艮酵素で切断し得られたフラグメ ントをアガロースゲル電気泳動性で分析することによって、制限酵素でマツピン グされた（第１図参照）。このようにして、ｐＫＮ１８４のＥａｏＲｌ−Ａ　フ ラグメントに挿入されたλ：　：　Ｔｎ５　フラグメントはに！ＩＩＲのｉ伝情 報を指定する遺伝子を有Ｔることが同定されまたそのフラグメントの位濯が４１ 図に示すように決定された。プラスミドｐＯＵ１は他の分析やプラスミド組立て にもｊ−Ｊいられた。

Ｌ　０Ｏ１ｉ　０３Ｈ５０／ｐＯＵ１の菌株は、ドイツの（Ｄｅｕｔｓｏｈｅ　 ＳａａｍｌｌｘＷｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇｍａｍｅｎ、　Ｇｒｌａｅｂａｏｈ− ｓｔｒａ８ｇｅ　ｓ、　＞３４ｏｏ　Ｇｃｉｔｔｉｎｇｏｎ　、以下ＤξＭと略 称）に寄託番号（Ａａｅａｓｉｏｎｙｊｌｉ）　２７１２で寄託されている。

実施例２ ｐａｒ＋７ラグメントのクローニングに有用なプラスミドの組立て プラスミドｐＪＬ９９（Ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｉｎ、　Ｍｏ１．　Ｇ＠ｎ 、　（ｈａｎｄ、　１８４．１９８１゜ｐｐ、　５６−６１）は、プラスミドＲ １からのｒｅｐＡ　遺伝子とｌａｏオペロンとの融合体を臀し、そのプラスミド はＬａａ＋表現型全現型する。　ｒ　ｅ　ｐ　Ａ−１ａＣ？／１合体を有するＰ ｓｔＪ−８ａｉｌフラグメントはｐＪＬ９９から切り収られてｐ１５レプリコン であるｐＧＡ４６に挿入され（Ａｎ　ａｎｄ　Ｆ’ｒｉｅｓｓｎ、　Ｊ、　Ｂａ ｏｔ、　１４０．１９７９．１９ｐ、　４００−４０７）、プラスミドｐＪＬ１ ２４か組立てられる。このプラスミドのマツプ牙第２図に示す。プラスミドｐ、 ＴＬ１２４もマツコンキイラクトース指示プレート上にＬａａ＋表現型全現型す る。しかしｐＪＬ　１２４のＰｓｔｉ座位に、プロモーター活性とわずかにもし くは全くもたないＤＮＡフラグメントを１１．４１人すると、ｒｅｐＡ　プロモ ーターの活性をＥＩＪ害し、これらのハイブリッドはマツコンキイのラクトース 指示プレート上にＬａａ＋とじてもはや出現しないということが見出された。し かしより鋭敏なＸ−ｇａｌ　指示プレート上で、形質減少するがそのハイブリッ ド中で全く抑制されているわけではないということを指示するＬａｏ＋である。

それ故にｐＪ’Ｌ１２４は、ハイブリッドプラスミドがマツコンキイラクトース 指示プレート上でＩ＋ａｏ−形質転換細胞として容易に検出されるから、Ｉ’ｓ ｔｉフラグメント牙クローンするのに用いることができる。さらにｐＪＬ１２４ は、ｐ１５レプリコンでありしたがって不安定なので（このプラスミドは、その プラスミドの喪失した細胞がセレクション圧なしでラクトース指示プレート上に 無着色のコロニイを形成するから容易に検出される）、ＰＪＬ１２４を安定化し うるｐａｔ、Ｉ　フラグメントはＸ−ｇａｌ　プレート上でスクリーニングでき る。

したがってｐｓｔＩ−ｐａｒ＋フラグメントを車４Ｔる手順は次の工程でズ成さ れる。

リ　ｐａｔ、Ｉで制限され７．：ｐＪＬ１２４と他のプラスミドｒＪ）らのＰａ ｔｌフラグメントとの連結反応 ２）クロラムフェニコール含有のマツコンキイーラクトースプレート上でブレー ティングＴる０８Ｈ５０への形質転換３）　Ｘ−ｇａｌ指示プレート上のＬａｏ ”Ｊ現型の安定した遺伝の代りにマツコンキイーラクトースプレート上のＬａａ −とじて出現するクロンの試験（１原料と方法２の項参照）＝、ａｏｌｌ　０Ｓ Ｈ５０／１）、Ｔ！１１２４誦株はＤＳＭニ寄託番号２７６ｏで寄託されている 。

す６厖例３ 不安定なプラスミド；２　ｐ＆ｒＡ部位とｐａｒＢ部位とで安定化Ｔる方法 １、　ミニ−Ｒ１レプリコン プラスミドＰＯＵ７１　（ＤＳＭ奇託番号２４７１　）、ＴｊゎちプラスミドＲ １の基本的レプリコン、ファージＫＤλ、２＞らのλＰ８プロモーターと０１． ５７　レプレッザー遺伝子、Ｔｎ３トランスポゾンからのβ−ラクタマーゼの遺 伝情報を指定する遺伝子及び特異なｇａｏＲｌ　鷹位（ｐｏｔＴ７１　の組立て に関する詳細な記載は、”　Ｐｌａａｍｉｄａ　ｗｉｔｈ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｌυｎａｏｎｔｒｏＬｌｅｄ　Ｒｅｐｌｉｏａｔｉｏｎ　Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ 　’というＳ題で本：顛と同じ日に出自された不願出願人の関連出願中にある） とυ）らなＺ、プラスミドｐＫＮ１５６２　のランアウェイ復製３樽体２Ｚａｏ ａ１　で制限した。そしてｐｏｔｒ１刀）らの１ｏｏＲ１−Ａ：＋Ｔｎ５７ラグ メント（実施例１多照）ご挿入した。次いで連給反応、ｉ、ｏｏｌｌｉ、：株０ ８Ｈ５０への形質転換、５０μｆ／ｒｌｌのカナマイシン含有のＬＡプレート上 でのカナマイシン尉性細胞の選択が行われた。

これら形質転換細胞は、５０μｌ／−のカナマイシン含有のＬＡプレート上にス トリークし４２℃で培−ｉｆ’Ｔることによって、ｐＯＵ７１のランアウェイａ ｍＲＥ４　型についてのスクリーニングがなされた。ランアウェイ楓裂プラスミ ド含有ａ胞は、これら条件下では最後にはａ［を停止する。このようにしてプラ スミドｐＯυ７１−１８４が同定され、こｎは２５．５　ｋｂの大きさで、Ｐａ ｒＡ”、ＰａｒＢ”、ＡｐＲｌＫｍＲの表現４ｆＭする。

このプラスミドは実施例１に記載のようにして制限酵素でマツピングを行った（ 第３図参照）。その制限マツプからＥｏ　ｏＲ１−Ａ　：　：　Ｔｎ５フラグメ ントがｐＯＵ７１のＥｏｏＲＩ座位に正しく挿入されていることか分、０）る。

このプラスミドを有Ｔる細胞は、選択圧なしで、Ｔなゎち抗生＠質を含むプレー ト上で培養することなしで、ＬＡ　プレート上で１００世代場誓８れた。１原料 と方法”に記載の方法（分配試験ＩＩ）の方法にしたがってそのａ飽ご測定した ところ、プラスミドを喪失していないことが観察された。一方、　ｐｏｔ７７１ は同様な条件下で培養された細胞から１％／世代の頻度で喪失した。Ｐ　＜　Ｉ 、ｒ　ｐＯＴＪ７１−１８４　ハ約１０−’　／　ＭＵ　／世代（Ｄ９失頻度で 安定に遺伝されていることが測定された。

Ｅ、　０ｏ１１０８Ｈ５０／ｐｏｔＴ７１−１８４　（Ｄｉｍ株は、寄託４号２ ７６３テＤｓＭに寄託されている。

２、ｐ１５レプリコン Ｐａｒ−ｐ１５レプリコンであるプラスミドｐＪＸ＋１２４　（％：９例２）川 ）？制限淋紫Ｐｓｔｌで１所し、Ｐｓｔｌ　−（’部分的に制限されたプラスミ ドＰ１１１８４　（実施列１姿魚ンと混合さ４を次いで運、吉反応に寸した。こ の連−１吉反！５混合吻は、５０μｆｅｄのクコラムフェニコール含ｉのマツコ ン牛イラクドース看示板上でクロラムフエニコールタ・付性を選択すＳコ、　Ｃ ａ１．菌株０ＳＨ５０に形スミ喚されに。

１以上のＰｅｔ　ｌフラグメントを泣つｐＪＬｉ２４を再する細胞（：￥ｌＩ２ 苔照）は、Ｘ−９１プレート上Ｌａａ“表現型の安定した４伝ｅこついて試ｄが なされた。安定にコ」伝したプラスミドのひとつかｐａｒＡ部位とｐａｒＢ部位 の両吉Ｔｉ：ｆｆすることが分力・つπ。

このプラスミドｐＯσ２は２４　ｋｂのサイズで、Ｃ♂、Ｌａ　Ｏ”、ＰａｒＡ ”、ＰｈｒＢ＋の表現型を有する。

このグラスミドはＡ施例１１こ記載のようにして制御ｄ　ｄ　４でマツプ比さ几 た（第４１２１参照）。この痢限マツプからｐｓｔｉフラグメントがＥＣｌ０Ｒ Ｉ−Ａフラグメントつ）ら削１余されていることか分２ノ）る。

このプラスミドを有する紹砲シュ、；Ａ大王なしで１００旨代Ｘ−ｇ＋−１プレ ート上で成胃した６ｐｏσ２ζこは、０．５〜１多／佃威／世代の頻度で細胞か ら喪失するｐＪＬ１２４と対照的に１０　／ＪＩｉａ　／　ｆＡ代より小さいＬ Ｐ　須で安定して遺伝されていることが測定さ几た。

１Ｂ、　０ｏｌｉ　Ｏ８■５０／′ｐＯＵ２　ｒ’ＡＱは寄託番号２７１３でＤ ＳＭに寄託されている。

３．１ｉＢｉレプリコン プラスミドｐＦ’１４０３−１１　（第２表参照）はプラスミドアからの遺伝子 とｌａａオペロンとの励合渾ご有するｐＢＲ３２２の不安定に遺伝された誘導体 （ｐＭＢｉ　レプリコン）である。このプラスミドはＡ　ｐ　ｓ　ｗ　＆　ｅ　 ”　表現型を伝達する。プラスミドｐｏ１１からのＥｃｏＲｌ−Ａ：；Ｔｎ５フ ラグメント（実施例１）？、上記ノペ伝子−ｎ　９ＥのＴぐ上流【こある（ｉｒ ａｅｄｉａｔｅｌｙ　ｕｐｓｔｒｅａｍ）プラスミドｐＦ１４０３−１１の特異 なＥＱＯＲｌ　座位に伸入し、次いで連結反応と、５μｆ／！ｄのアンピシリン 含有のフ゛レート上でＡＰＲｅ、５０μｆｅｄ　のカナマイシン含有のプレート 上でＫｍＲを、マツコン牛イ指示プレート上でＩ＋ａａ＋をそれぞｎ選択するＥ 、０ｅ１１７株０８Ｈ５０への形質転換を行つん。

、４られたプラスミドｐＯＵｊＯは実施例１に記載と１司様にして剰：ｒｌ　Ｅ ？素でマツプ化しく　！８５　囚ａ照）、ＥｏｏＲｌ−Ａ：：Ｔｎ５フラグメン トの挿入か禿認された。このプラスミドは５４　ｋｂの大ささでありＫｍ”、Ａ ｐＰ′、Ｌａｏ”　、ＰａｒＡ”、　ＰａｒＢ”の表現型を−ＮＴる。

このプラスミドは笑凡例３．１に記載したのと同様にして安定な遺伝について試 験した。その結果、ｐＯＵｉＱ　が１０／細胞／は代より小さいＩＩＩ！値で安 定に遺伝されており、−万ＩＩＦ１４０３−１１は６×１ａ　ｌｔ代の頻度で細 胞刀）ら喪失していることが示された。

Ｅ、　０ｏｌｉ　０３ａ５ｉ１／ｐｏｆｆ１０　Ｇ！寄託ａ号２７１４　ｒＤｓ Ｍ　ｉｎ寄託されている。

実Ｉｖｉ列４ ｎＪＩ＋１２４７ｉ：安定化するＦ！ｃｏＲ１−ＡフラグメントからノＰｓｔＩ ７ラグメントのクローニング ＥｏｏＲｌ−Ａフラグメントを多数の制限酵素で制限し、得られた物理的地図ご 第１図に示した。この図から分更るように、このフラグメントは多数のＰｓｔｌ フラグメントで構成されている。

Ｐａｒ”　表現型を伝達するフラグメントの大きさを小さくするために、スクリ ーニングベクターｐＪＬ　１２４中の１以上のＰａｔ）フラグメント上に多分保 有されるｐａｒ部位をサブクローンする（ａＵ−ｂａｌｏｎｓ）することを試み た（実施例２＃照）。正しい表現型−マツコンキイラクトースプレート上のＬａ ｏ−と選択圧なしでの安定した遺伝−で多数のクローンを分析した結果、Ｐａｔ Ｉ−Ｄフラグメント（第１図多照）がこの表現型を伝達していること？示した。

他のいずれの単一のＰ日ｔ１７ラグメントもｐＪＬ１２４　ｆ安定化することは できなかった。１．８ｋｋ＋のｐｓｔｌフラグメント中に位置する、ｐＪＩ＋１ ２４安定化の原因である部位をｐａｒＢ　と名付けた。

さらにＰｓｔｌ−Ｄフラグメツ１２分析するために、このフラグメントをｐＯＵ ９３　に生成する、ｐＢＲ３２２のｂｌａ　ｉ伝子牛の特異なＰｓｔｌ座位にク ローンされた（茅７図参照、このプラスミドは寄託番号２７２４でＤ８Ｍに寄託 されている）。このプラスミドのマツピングによって、そのＰｓｔｌ−Ｄフラグ メントが３つのＲｓａｉ座位５：有することが示された（第６図参照）。Ｒｓａ ｌ　はプラントエンドを生成し、それ故にその９００　ｂｐ　Ｒｅａｌ　フラグ メントが次のようにしてプラスミドｐＨＰ３４のＳｍａＩ座位（Ｐｒｅｎ−ｔｋ ｉ　ｏｔ　ａｌ、、　Ｑｅｎｅ　１７．１９８２．１Ｍｐ、　１８９−９６）に 挿入された。ｐｏ［ｒ９３がＲｓａｌで制限され、Ｓｍ＆ｌで制限されたｐｉ（ Ｐ３４と混合され、次いで連結反応に付された。連結反応混合物は丁でにプラス ミド、）ＯＨ９４（表現型的にｂａａ＋とＰａｒＢ＋であるｐ１５の誘４体、第 ８１Ａ谷照、このプラスミドは寄託番号２７２５号でＤＳＭに寄託されている） ？有し、５０μｆ１ｍｇのアンピシリン含有のプレート上でアンピシリン、対性 を選択しているに、０ｏｌｉ菌株に形Ａ互換した。

異なるプラスミドに保有されているｐａｒＢ”部位≦こよって表現される不適合 性によって、ｐ　ＯＨ２４は、表現型がｐａｒＢ＋である他のプラスミドがＥ、 　ａｏｌｉ　ａ胞に導入されると失われる。したがってマツコンキイプレート上 にその細胞テストリークし、無看色コロニー（Ｌａａ”）−ｉスクリーニングす ることによって正しい挿入と形質耘侠訓側を選択Ｔることか可能になる。９００ 　ｂｐＲｅａｌフラグメントご含むことが見出されたひとつの不適合性プラスミ ドｐＨＰ３４　：Ａ４体をｐＯＴｒ１３　と命名した。このプラスミドは５．３ ｋｂのサイズで、次の表現型ＴｏＲ，ＡｐＲＳＰａｒＥ”　ｆ有する。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制限酵素によってマツピン グした（第９図参照）。このマツピングによってＰ、ｓａｌ　フラグメントは、 　ｐＨＰ３４のＳｍａ　ｌ座位が２つのＥｅｏＲ１座位の側にあるので９００　 ｂｐ　ＥｉｏｏＲ１フラグメントに変換された。

Ｅ、　０Ｏ１１ｏｓａ５０／ｐＯＵ１３のｍ＆は寄託ミリ２７１６号でＤＳＭに 寄託されている。

ｐＯＵ１３からの９００　ｂｐ　ＥａｏＲ１フラグメントが、ｏａｔ　ｄ伝子（ ａｆｆｉＲの遺伝情報全指定する遺伝子）中に特異なＥｃｏＲｌ　座位？有する 、ＡｐＲ，ＯｎＲランアウェイミニＲ１誘１体であるｐＯＵｌｏｌのＫｃｏＲＩ 　座位：こ（ｐｏσ１０１の組立ての説明は”　ＰｌａｓｍｌｄＪｗｉｔｈ　０ ｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｔｒｎｃｏｎｔｒｏｕｅａ　Ｒｅｐｉｉｃａｔｉｏｎ　 Ｂｅｈａｕｉｏｕｒ　’の標領で本畑と司じ日に出願された太朝出謔人の・史辿 出、串中にある。）Ｒ３人され、８．２ｋｂの大きさでＣｍｓ、　ＡｐＲ，ｐａ ｒＢ＋の表現型？有するプラスミドｐＯＵ１４　’Ｅ！立てた。

このプラスミドと実施例１に記載したのとユ司碌にして硼ｊ限酵諧によってマツ プ「ヒした（第１０図３４６）。

このプラスミドは実施ｐ４３．１に記載したのと同様にして安定な」伝について 試１夜した。その嫡果、３０　℃に２いてｐｏｔｌｒ１４はｉ　Ｘ　１０−’　 ／訓胞／は代より小さいＬＦ燗を有し安定に遺伝され、−万ｐｏｔｒ　１０１　 は１渇／叶代の頻度で：ｆｔｌ　Ｋｇから失わｎることか示された。

Ｂ、　Ｏｏ１土０８Ｈ５０／１）Ｏσ１’、ｔ”ｆ＋＾は寄託命号２７１７でＤ ＳＭに寄託さｎている。

尖７１１ｉしｌｊ　５ ｐａｒＢ　フラグメントによるミニ−Ｒ１プラスミドの安定化プラスミドｐＯＵ ９０　、すなわちプラスミドＲ１の基本的レプリコン、ファージ■λ４からのλ ＰＲプロモーターとＣ１，５ワ　リプレッサー、閣トランスポゾンからのβ−ラ クタマーゼの遺伝情報全指定するｊ伝子、及びｐＫＭ　１８４　からの！！１ｃ ｏＲ１−Ａフラグメントつ）らなる、ｐＫＮ１５６２のランアウェイａｙ　秀ｓ 体（ｐＯＵ９０の＋ｌ立ての詳二ＦＩＹＡ説明は、＠Ｐｌａｓｍ工ｍ　ｗｉｔｈ 　０ｏｎｉｉｔｉ＊ｍ１ＵｎＯＯｎｔｌ”０１ｌｅｄ　Ｒｅｐｉｉｃａｔｉｏｎ 　Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ　’　Ｑ；　＄　５で本願と、司じ日に出願されπ不１Ａ ｔＢ−人の闇連出藁中にある）にはｐ工ｋＴ　ｉ　８４Ω１らの２ｏｏＲ１−Ａ フラグメントが挿入されているか、このプラスミド’１ｓａｌｉで制限し連結反 応に付してプラスミドｐＯＵ６１　を作製した。このプラスミドごマツコンキイ プレート上でＬａど表現型を選択するＢ、　ｔｌｏｌｉ　０ＳＨ５０４株に形質 庶洟さぜた。

ｐＯＵ６１を実施例１に記載したのと同様にして１ダ１限；４素でマツピングし た（茅１１　図参照）。この制限地図からｐＯＵ６１はその右端部にｐａｒＢ部 位を待つｓ、６ｋｂのサイズのＥＯＯＲｌ−Ａフラグメントを有することが分か る。このプラスミドは安定な遺伝について実施例３．１に記載しπのと同様）こ して試ネタした。

その結果、　ｐＯＴ１６１はｌＸ１ｏ　／細胞／世代よりも小さいＬＩＦ値を有 し安定に遺伝されていることご示した。

Ｋ、　０ｏｌｉ　０８Ｈ５０／ｐｏｔ＋６１７ｉｎは奇託脅号２７２３でＤＳＭ に寄託されている。

実施例６ ｐａｒｌｌフラグメントによるプラスミドｐＦ１４０３−１１の安定化プラスミ ドｐＯσ１（実施例１参照）を８ｄｌｌで制限し、Ｓａｌ　ｌですでに制限され たプラスミドｐｌＦ１４０３−１１と混合し、次いで連結反応に付し、マツコン 牛イラクドース指示プレート上アンピシリン耐性コロニーを選択ＴるＥ、　０ｏ ｌｉ　ＩＲ株０８１５０　に形質私憤した。これらＬａｏ＋クローンのい（つか で、原料と方法の項に記載したのと同様にして、マツコンキイプレート上でＩａ ｏ”表現型が安定に遺伝されているものをスクリーニングした。

この安定に遺伝されたプラスミドを実施例１に記載しｔのと同様にして制御Ｊｉ 酵素で地図化しＴ−（第１２　図参照）。この制限地図から、このプラスミドは ｐａｒＢ　１６ａか入っているｐＯＵｌの３ａ１１　フラグメント？有している ことが分かる。ｐ？１４０３−１１とｐｏｔＴｌ　２７’らの３ａｌ　ｌフラグ メントで、Ｉ＃Ｉ成されるこのプラスミドｆ　ｐＯＵｌ２　と命名した。こｎは １６ｋｂの大きさで、ＰａｒＢ”、ＩＩａＯ＋、ＡｐＲの表現型を仔する。ｐＯ ［２は５　Ｘ　１０−５／　ｑｔｆｌｉＪ　／世代より小さいＩｉＦ値をｎし安 定に１伝されていた。

ｘ、　０ｏｌｉ　Ｇ３Ｈ３Ｏ／ｐＯ（Ｔ１２ｉ１株は寄託ｊ号２７１５でＤＳＭ に寄託さｎている。

実施例７ ｐａｒＡフラグメントによるｐ１５１ラスミドの安定化プラスミドｐＭＯ９０３ （Ｏａｓａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｍ、、　Ｊ、　１３ａｏｔ、　１４．３．１９ ８０．　ｐ。

９７１）　’Ｅ：　ＥｃｏＲｌで制限し、ブラスミ〆ｐＯＵ４３　（＄　１５　 ｒＡ参照、Ｄｉ９Ｍ寄託番号２７２０）２１１’ｘらの、ｐａｒＡ　４位を有す るＥｃｏＲｌ　フラグメント企挿入し、次いで連結し、Ｋ、　０ｏｌｉ菌体０ｉ ９Ｈ５０に形頁転換した。得られたプラスミドはｐＯυ４５　と命名され、１３ ．４ｋｔｌのサイズでＰａｒＡ”、Ｌａａ−、ＡｐＲ，ＫｍＲの表現型を＝ｒる 。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した（第 １４図参照）。この制限地図たら、ｐａｒＡ部位が、その挿入によって不活化さ れる１ａａ　ｆペロン中に挿入されたことが分かる。

原料と方法の項に記載したのと同様にして安定性な菰イしたところ、このプラス ミドか８Ｘ１０　／刑Ｅａ／世代のＩＩＦ　ｊ厘で安定に遺伝されていることが 分かつた。−万ｐＭＯ９０３は１％／咄砲／世代のＬＦＩ直を有Ｔる。

ｗ、　０ｏ１１　ｏｓａｓｏ／ｐｏｔｒ、ａｓ哨株は寄託ｉ号２７２１号でＤＳ Ｍに寄託されているう 実施例８ ｐａｒＡ部位によるミニ−Ｒ１プラスミドの安定化ｐＯＵ４３からのＫａｏＲ１ フラグメント牙、ミニ−Ｒ１プラスミド（７）　ｐｏｔ７８２　（ＤＳＭ寄託去 号２４８２号〕薔こ挿入した。このプラスミドはプラスミドＲ１の基本的レプリ コン、ファージＭＤλ４からのλＰＲプロモーターとＣＩリプレッサー通遺伝、 Ｔａ２）ランスポゾンからのβ−ラクタマーゼの遺伝情報を指定する遺伝子、ｐ ＶＨ１４２４からのｄｓｏプロモーターと１ａｏＺ遺伝子のアミノターミナｈ　 ４　（ａｍｉｎｏｔｓｒｍｌｎａｌ　ｅｎｄ）　、及びｐｓＫｓ１０４刀）らの 残余のｌａｃ　、ｔペロンと刀）らなる（　ｐｏｔｒａ２組立ての詳細な説明は 、”　Ｐｌ＆５ｍ１ｄｓ　ｖｄｔｈ　Ｏｏ吐ｔｉｏｎａｌ　Ｕｎａｏｎｔｒｏｌ ｌｅｄ　Ｒ１１ｐｌｉＯ＆ｔｉＯｎ　Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ　’の標」で本願と同 じ日に出願された本願出願人の関連出願中にある）。プラスミドｐＯＵ８２はＡ ｐＲとＬａｏ＋表現型を伝達し１、ＫａｏＲ１フラグメントをクローンするのに ｎ用である特異なｚ６ｏ１１座位分有する。このプラスミドは選択圧なしで１％ １世代の＠度で喪失される。

２．４１ｃｂのＩＣａｏＲ１フラグメントが１配同に挿入されたプラスミドをｐ ＯＵ４７　と命名した。このプラスミドは　１４ｋｔ）のサイズで、ＰａｒＡ” 、Ｌａｐ”　、ＡｐＲの表現型を有する。

ｐＯＵ４７　’Ｅ”冥１列１に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した（ 第１５．鎖嘗照）。

Ｅ、０Ｏ１ｉ　ＱＳＨ５０／ｐＯＵ４７　”、ｉ株は寄託−ｆ号２７２２号でＤ ＡＭに寄託されている。

Ｐ　ａ　ｒ　Ａ　９位を・釘するＫｃｏＲ１フラグメント云、エクソヌクレアー ゼＢａ１３１　ｌこよって４０Ｑ　ｂｐまでさらに小さくしに０この削除処理は 、ｐＯＵ４７の特異なりａｍＨｌ　座位：２：中ｊ用し、“１坑１斗と方法”の 項に記載したのと向碌にして打った。組立てられたプラスミドはｐＯＵ４７２と 命名された。このプラスミドは１３ｋｌ）　のサイズでＰａｒＡ”、Ｉ＋ａａ” 　、ＡｐＲの表現型を有する。

ｐＯＵ４７２ご実施例１に記載したのと同様にして制限酵素でマツピングした（ 第１６図多照）。この制限マツプ刀）らｐＯＵ４７２はＢａ１３１での削除によ って生成した２、［］　ｋｌ）のｌ：ａｏＲｌ　フラグメントを汀することか分 、０）る。

１ノ京會と方法”の項に記載したのと同様ｌこして安定性を試験しｅ　漬ｇ４４ 、このプラスミドつ１全ｐａｒ入部位が２．０　）：ｂ　ＥｃｏＲ１フラグメン トに含スれていることを、Ｘ味し安定に退任されていることが分かった。

Ｅ、　０ｏｌｌ　０３Ｈ５０／ｐＯＵ４７２菌株は寄託ｊ号２７２６号でＤＳＭ に寄託されている。

実施例９ ｐａｒＡ　ｉ４位を有するミニ−Ｒ１プラスミドの組立てプラスミドｐｏσ９０ （実施例５参照）を、　Ｂａｗｌ（ｌで切断しモして３ａｕ３Ａで部分的に切断 してＩａ　ｏＲ１−Ａ　フラグメントの一部を切りとり、左端の６　ｋｌ＋が保 持され連結反応に付された。

得られたプラスミドのｐＯＵ９１　はＥ、　ＪＯｌｉ−株Ｏ６′１１５０１こ形 質転換された。ｐＯＵ９１　＋ｉ　＋ｉ３．７５　ｋｂのサイズでＰａｒ”　、 Ａｐ”、Ｌａａ＋の表置、型を・ｎする。このプラスミド牙実施例１のｉ記載と 同様にして制限酵素で地図化された（弔１７図参照）。

プラスミド安定性は、ｐＯＵ９　ｉ含有）ｂ凰を（苅魚としてｐＯＵ８２含倭Ｕ ｌａを用い）マツコン千イブレート上選択圧なしで３０“Ｃで２５世代培Ａする ことによって測定された。ｐＯυ９１で形質転換され７：細胞は赤いコロニーを 化成したか（Ｌａａ”）　、一方ｐＯＵ８２で形質転換された３Ｉ＋３は赤と日 の両方のコロニーを生成し、これは選択がない期間はｐＯＵ８２　がいくつかの 細胞から失われたこと牙示す。

Ｋ、　ａｏｌｘ　ａｓＨ１ｐｏｒｓｑ１ａ株は寄託ｉ号２４８３でＤＳＭに寄託 されている。

芙」例１０ ｐａｒＡ”、ｐａｒＢ＋ミニ−１１プラスミドの組立てプラスミドｐＯＵ８２　 （実施例８ン照）がｒｉ、ａｏＲｉで洒Ａｉさｎ１次いでｐａｒＡ部位を有する 、ｐｏｖ４３からのＡ　ＯＯＲ１フラグ２ント（実施例７と第１３図参照）が浦 入ざ几る。この１ｃｏＲ１フラグメントは、エクソヌクレアーゼＥａ１３１　に よって左端部のｓｏｏ　、ｂｐが切りとられ、ひとつの　Ｆ；ａｏＲｌを有して いる。このプラスミドの特異的ＥｔｏｏＲ１座位に、ｐＱｆｆ１＋　Ｄ）らの１ ｃｏＲ１フラグメント（実施例４と第り図挙照）が挿入される。得られたプラス ミドは、ＰａｒＡ”、　ＰａｒＢ＋の表現型を伝；Ｊするが、次いでプラスミド ｐＯＵ９４　なすでに宵しているＸｉ、　０Ｏ１ｉ閑株０３ｋ１５０に形質互換 でき、またこのｐＯＵ８ノ　透導体は、マツコアキイラクトース指示プレート上 で培ろ１すると、このプラスミドのみを有する１冗胞のコロニーが中心品に赤色 を呈し、周縁部が無色を呈すること？１味する弱いＩＩａａ＋表現型を伝達する こと以外は、実Ａ例４に記載したのと美質的に＋ｏｊ様にスクリーニングできる 。

実施例１１ ｐａｒＡ１ｐａｒＢ＋ミニ−Ｒ１プラスミドの組立てプラスミドｐＯＵ６１　（ 実施例５套照）をＩ！ｆ＋）ｏＲｉ　で哨限し、ｐａｒＡ　９位を有する、ｐＯ σ４３からの　ＥａｏＲｌ　７ラグメントヲ１４人し連線した。得られたプラス ミドは、ＰａｒＡ”　、ＰａｒＢ“表現型ご伝達するか、丁でにプラスミドｐＱ Ｕ２を仔するＢｉ、　０ｏｌｉ　ｄ抹ｏｓａｓｏに含ｙ耘侠でさそして冥：、百 ゾ４４１こ記１の方ａ菰こ対応するしかたでスクリーニングでさる。所ミの１ラ スミドごイＴる■１１ａのコロニーはマツコン午イラクドースプレート上でＪ着 色コロニー（Ｌａａ−）として出現Ｔる。

（この明；１３連及び請求の範囲ご通じて、ｐａｒ−、Ｐｚｒ−、ｐａｒ＋又は Ｐａｒ＋はイ〒別に指示がない場合、　ｐａｒとＰａｒの用語は分配機能の表現 を意味Ｔる。） −、ｉ　区 所■旦 補正書の写しく翻訳文）促出店 （待＋ｉＴ法第１８４条の７第１項ン 昭８１５９年５月１６Ｅｌ 特許庁長官　若杉　和夫　殿 １、国際出願番号　ＰＣＴ／ＤＫ８３／’０００８６２　発明の名称　不安定に 遺伝されたプラスミドの安定化法３、特許出願人 住　所　デンマーク、ディケイ−１７００コペンハーゲン　ライ、ハルムトルペ ット　２つ 名　称　エイ、ニス　アルフレッド　ｌ＼レンツン代表者　ニールセン、エイチ 　ブイ 国　籍　デンマーク ４、代理人〒５３０ 住　所　大阪市北区西天満５丁目１−３クォーター・ワンビル６、添付書類の目 録 （１）補止Ｂの写しく翻訳文）　１通 請求の範囲 １、そのプラスミドに本来間しない挿入された単一もしくは複数の遺伝子と分配 機能を表視する挿入されたＤｌｉＡフラグメントとを有するプラスミド。

２、分配機能か１１　ｐａｒ部位で発揮される請求の範囲第１項のプラスミド。

３、ＤＮＡフラグメントか、その王な要素として、　Ｒ１ｐａｒ　ｆ！Ｂ位ム、 ＲＩ　ｐａｒ　Ｎ位Ｂ、又はＲ１ｐａｒ部位ムとＲ１ｐａｒ部位Ｂの両者からな る請求の１曲部２ＸＪ４のプラスミド。

４゜Ｒ１ｐａｒ　％位ムと１１ｐａｒｇ位Ｂとからなる挿入されたＤＮＡフラグ メントが約６　ｋｂｔ−超えない長さ、特に１４ｋｂを超えない長さ、ことに３ 　ｋｂを超えない長さを有する請求の＠−′ｍ６項のプラスミド。

５、Ｒｊ　ｐａｒ　５位ムからなる挿入されたＤＪｉム７ラグメントが約４　ｋ ｂを超えない長さ、特に約２．５　ｋｂを超えない長さ、ことに約２　ｋｂを超 えない長さを有Ｔる請求の範囲第３項のプラスミド。

６、Ｒ１ｐａｒ部位Ｂからなる挿入されたＤｌｒｌツムグメントが約２　ｋｋ％ 特に約１．５ｋｂｔ−超えない長さ、ことに約１ｋｂを超えない長さを有Ｔる請 求の＠囲Ｉ８３項のプラスミド。

７、仇住ｑ？Ａ箕耐性を伝達する進伝子を追加して有する請求の範囲第１〜６項 のいずれかのプラスミド。

８、分配機能を発揮する挿入されたＤＮＡ　７ラグメントかない場合、不安定１ こ遺伝される請求の範囲第１〜７項のいずれかのプラスミド。

９、ｐ１５プラスミドもしくはその誘導体、又は高いコピー液で宿主範囲の広い プラスミドもしくはその通導体である請求の範囲第８項のプラスミド。

１０、そのプラスミドには本来間しない単一もしくは複数の遺伝子からなるＤＮ ＡフラグメントをｆｌＴることから、不安定に遺伝される請求の範囲第８項のプ ラスミド。

１１、９ＢＲ３２２プラスミドもしくはその通導体のごと！ｐＭＢ１プラスミド もしくはその誘導体である請求の範囲４１０項のプラスミド。

１２、そのプラスミドを有する細菌を培薄中の少なくとも一段階に２いて、低い コピー数を有する請求の範囲第８項のプラスミ　ド。

１３、約０．５〜５コピー／釧胞のコピー数Ｎ−ＨＴる請求の範囲第１２項のプ ラスミド。

１４、　Ｒ１とその通導体を含む不適合性グループエｍａＩＰｌの１ラスミド、 １とその誘導体、及び低コピー数で宿主範囲の広いプラスミドとその、＄１４体 から選択される請求の範囲第１２積もしくは第１３項のプラスミド。

１５、条件ランアウェイａ！１プラスミドである請求の範囲第１２項もしくは４ １３項のプラスミド。

１６、そのプラスミドを有する宿主錆生物がある棟の条件下で培養される嘩約３ 〜５コピー／ａ胞を超えないコピー数を有し、その宿主産生物がある檀の；４！ なる条件下で培養される際少なくとも約５００〜１０００コピーｌ細胞の範囲の コピー数を有Ｔる請求の範囲第１５項のプラスミド。

１７、ひとつの温度で約３〜５コピー／ａ９を超えないプラスミドコピー数を有 し、そしてより高温では少なくとも約５ｏｏ〜１０００　コピーｌ細胞の範囲の プラスミドコピー数を有する請求の＠１第１６項のプラスミド。

１８、約３〜５コピー／佃膿を超えないプラスミドコピー数が約０．５〜１コピ ーｌ洲胞の１＠囲にある請求の範囲第１６項もしくは４１７項のプラスミド。

１９、ｓｇＢＬ、つるプロモーターがそのプラスミドに単一もしくはにｉ数の本 来の遺伝子の上流側に一浦入された請求の範囲第１．１６．１７又は１Ｂ４Ａの プラスミド。

２０．１１−ｔＭプラスミドである請求の範ｖＢ第１６〜１８項のいずれかのプ ラスミド。

２１、プラスミドＲ１のＩａｏＲｌ−Ａフラグメントより埴カ（カっＲ１ｐａｒ 部位と含む、挿入されたＤＮＡフラグメントをＩ＝ＩＴるプラスミド。

η、揮入されたＤＮＡフラグメントがＲｉ　ｐａｒ部位Ａ、　Ｒ１ｐａｒ部位Ｂ 、又はＲｊｐａｒｉ位人とＲｊ　ｐａｒ部位３との両者からなる請求の＠曲＠２ １項のプラスミド。

２３、　ＤＮＡフラグメントが、その生な要素として、Ｒｊ　ｐａｒ　１４位人 、Ｒｌｐａｌ”　ａｌｉ位Ｂ、又はＲｌｐａｒ　４位ＡとＲｉ　ｐａｒ　：Ｊ４ 位Ｂとの両者とからなる請求のａｔ！１４２２項のプラスミド。

２４、１１ｐａｒ部位ムとＲ１ｐａｒ部位Ｂとがらする・申入されたＤＮＡフラ グメントが約６　ｋｂを超えない長さ、待に約４　ｋｔｌ牙超えない長さ、こと に３　ｋｂ　ｆ−超えない長さを有Ｔる請求４ の＠聞第２３項のプラスミド。

２５、　Ｒ１ｐａｒ部位Ａからなる挿入されたＤＩｉＡフラグメントが約４　ｋ ｋｌ　を超えない長さ、特に約２．５ｋｔ）ｒｔ超えない長さ、ことに約２　ｋ ｔｌ　を超えない長さを仔Ｔる請求の＠開渠２３項記載のプラスミド。

２６、　Ｒｌｐａｒ　５５位Ｂからなる挿入されたｎＮＡ　７ラグメントが約２ 　ｋｂ　ｆ超えない長さ、特（こ約１．５ｋｂを超えない長さ、ことに約１　ｋ ｋｌ　を超えない長さを有する請求の範囲第２３項のプラスミド。

２７、前記請求の＠囲のいずれかのプラスミドを有する細菌。

２８、グラム鴎性菌である請求の範囲′４２７項の細菌。

２９、エシェリヒア・コリである請求のｇＡ囲第２８項のＭＢ菌。

犯、請求の範囲第１〜２０項又は第２１〜２６項のいずれかのプラスミドを有す る細菌を啼イし、そのプラスミドの遺伝子ｆ物をその′＠繭壇−吻がら得る、プ ラスミドＤＮＡの遺伝子産物の″Ａ遣方法。

３１、　Ｊ！婁が、細菌の少なくとも１００世代行ゎｎる請求の範囲第３０項の 方法。

３２、プラスミドの喪失が２　Ｘ　１０−’　／硼胞１世代より少ない請求の範 囲第３０項の方法。

３３、プラスミドの喪失が　１０−’／細ｔ、３／世代より少ない請求の範囲第 ３２　項の方法。

馴、プラスミドの喪失が５Ｘ１０−’／（社）胞／世代より少ない請求の範囲第 ３３項の方法。

５、王な要素としてＲ１ｐａｒ部位からするＤＮＡフラグメント。

３６、その主な要素に、Ｒ１ｐａｒ部位人、Ｒ１ｐａｒ部位Ｂ、又はＲｊ　ｐａ ｒ部位人とＲ１ｐａｒ部位Ｂとの両者を有する請求の範囲第３５項のＤＮＡフラ グメント。

３７、　Ｒ１ｐａｒ部位ＡとＲ１ｐａｒ部位Ｂとからなり、そして約６ｋｌ＋を 超えない長さ、特に約４ｋｂを超えない長さ、ことに３ｋｂｉ超えない長さをも つ請求の範囲第３６項のＤＮＡフラグメント。

３８、　Ｒ１ｐａｒ部位人からなり、約４ｋｂを超えない長さ、特に約２．５ｋ ｂを超えない長さ、ことに約２ｋｂｉ超えない長さを有する請求の範囲第３６項 のＤＮＡフラグメント。

３９、１１　ｐａｒ部位Ｂからなり、約２に’ｂ　を超えない長さ、特に約１． ５ｋｂを超えない長さ、ことに約ｊ　ｋｂを超えない長さを有する請求の範囲第 ３６項のＤＮＡフラグメント。

４０、挿入されたｐａｒ部位をＷＴると思われるプラスミドを、同じｐａｒ部位 を有しかつ適当な培地上で認識しつる表現型を伝達する他の無関係のプラスミド をすでに有する′ａ菌に形質゛転換し、その形質転換された細菌を前記培地上で 培養し、そしてｐａｒ部位の正しい挿入な表現型の喪失として同定する、プラス ミド中のｐａｒ部位の正しい挿入をスクリーニングする方法。

４１、認識しつる表現型が抗生物耐性である請求の範囲第４０項の方法。

４２、認識しつる表現型がＩ＋ａｏ＋である請求の範囲第４０項の方法。

４３、前記他のプラスミド上のｐａｒ部位がｐａｒムである請求の範囲第４０項 の方法。

４４、前記他のプラスミド上のｐａｒ部位がｐａｒＢである請求の範囲下４０項 の方法。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．そのプラスミドに本来間しない挿入された単一もしくは復数の遺伝子と分配 機能ご表現する挿入されたＤＭＡフラグメントとを有するプラスミド。 ２、分配機能がＲ１ｐａｒ部位で発揮される請求の範囲第１項のプラスミド。 ３、ＤＮＡフラグメントか、その主な要素として、Ｒ１１）＆ｒ　部位Ａ％　Ｒ １ｐａｒ部位Ｂ、又はＲ１ｐａｒ部位Ａと１１ｐａｒ部位Ｂの両者からなる請求 の範囲第２項のプラスミド。 ４．１ｉ　ｐａｒ部位ＡとＲ１ｐａｒ部位Ｂとからなる挿入されたＤＮＡフラグ メントが約６　ｋｂｉ超えない長さ、特に約４　ｋｂを超えない長さ、ことに３ ｋｌ＋を超えない長さを有する請求の範囲第３項のプラスミド。 ５、Ｒ１ｐａｒ部位Ａからなる挿入されたＤＮＡフラグメントが約４　ｋｂを超 えない長さ、特に約２．５　ｋｌ）を超えない長さ、ことに約２　ｋｌ）を超え ない長さをＷＴ”る請求の範囲′Ｉ４３項のプラスミド。 ６、ＲＩ　Ｔｌ＆ｒ部位Ｂからなる挿入されたＭ人フラグメントが約２ｋ１５． 特に約１．５ｋｔｌを超えない長さ、ことに約１ｋｂを超えない長さを有する請 求の範囲第３項のプラスミド。 ７、抗生ｇＪ質耐性を伝達する遺伝子を追加して有する請求の範囲第１〜６項の いずれかのプラスミド。 ８、分配機能を発揮する挿入されたＤＮＡフラグメントがなむ１場合、不安定に 遺伝される請求のｋＡ囲第５１〜７項し１ずれかのプラスミド。 ９、ｐｉ５プラスミドｂ　Ｉ、　＜はその透導体、又は高いコピー数で宿主範囲 の広いプラスミドもしくはその誘導体である請求の範囲第８項のプラスミド。 １０、そのプラスミドには本来間しない単一もしくは＠Ｌ数の遺伝子からなるＤ ＮＡフラグメントモｎすること力）ら、不安定に遺伝される請求の足囲′４８項 のプラスミド。 １１、　ｐＢＲ３２２プラスミドもしくはその誘導体のごときｐＭＢ１プラスミ ドもしくはその透導体である請求の範囲第１０項のプラスミド。 １２、そのプラスミドを有する線菌を４Ａ中の少なくとも一段階に２いて、低い コピーａご有する請求の範囲第８項のプラスミド。 １３、約０．５〜５コピーｌ細飽のコピー数を有する請求の範囲第１２項のプラ スミド。 １４、　Ｒ１とその透導体を含む不適合性グループエｎａｌＦｌのプラスミド、 ？とその透導体、及び低コピー数で宿主範囲の広いプラスミドとその誘導体から 選択される請求の範囲第１２項もしくは第１３項のプラスミド。 １５、条件ランアウェイ復製プラスミドである請求の範囲ｇ４１２項もしくは第 １３項のプラスミド。 １６、そのプラスミドを有する宿主微生物がある種の条件下で培養される際約３ 〜５コピー／ｍ胞を超えないコピー数を有し、その宿主微生物がある種の異なる 条件下で培養される際少なくとも約５００〜１０００コピーｌ″ａ胞の範囲のコ ピー数を有する請求の範囲第１５項のプラスミド。 １７．ひとつの温度で約３〜５コピー／細胞を超えないプラスミドコピー数′Ｉ ｔｗし、そしてより高温では少な（とも約５００〜１０００　コピー／ａ胞の範 囲のプラスミドコピー数を有する請求の範囲第１６項のプラスミド。 １８、約３〜５コピー／細胞を超えないプラスミドコピー数が約０．５〜１コピ ーｌ細胞の範囲にある請求の範囲第１６項もしくは第１７項のプラスミド。 １９、−節しつるプロモーターかそのプラスミドに単一もしくは複数の本来の遺 伝子の上流側暑こ挿入された請求の範囲第１．１６．１７又は１８項のプラスミ ド。 ２０、１１−型プラスミドである請求の範囲第１６〜１８項のいずれかのプラス ミド。 ２１、プラスミドＲ１のＥｏｏＲｌ−Ａフラグメントより短刀）くかつＲｌｐａ ｒ　＠位を含む、挿入されたＤＮＡフラグメント企有Ｔるプラスミド。 ２２、ｆ４人されたＤＮＡフラグメントがＲ１ｐａｒ部位Ａ、　Ｒ１ｐａｒ部位 Ｂ、又はＲｊ　ｐａｒ部位ＡとＲｉ　ｐ＆ｒ部位Ｂとの両者からなる請求の範囲 ′Ｓ２１項のプラスミド。 ２３、　ＤＮＡフラグメントが、その主な要素として、Ｒ１ｐａｒ　部位人、Ｒ １）ａｒ部位Ｂ、又はＲ１ｐａｒ部位ムとＲ１ｐａｒ部位Ｂとの両者とからなる 請求の範囲第２２項のプラスミド。 ２４、１１ｐａｒ部位ムとＲ１ｐａｒ部位Ｂとρ）らなる挿入されたＤＮＡフラ グメントが約６　ｋｌ）を超えない長さ、特に約４　ｋｔ＋を超えない長さ、こ とに３　ｋｂを超えない長さを有Ｔる請求の範囲＠２３項のプラスミド。 ２５、　Ｒ１ｐａｒ部位Ａからなる挿入されたＤＮＡフラグメントが約４ｋｂを 超えない長さ、特に約２．５　ｋｂを超えない長さ、ことに戸２１【ｂを超えな い長さご有する請求の範囲第２３項配本のプラスミド。 ２６、　Ｒ１ｐａｒ部位３からなる挿入されたＤＮＡフラグメントが約２ｋｂを 超えない長さ、特に約１．５ｋｂを超えない長さ、ことに約１ｋｌ）ｉ超えない 長さを有する請求の範囲第２３項のプラスミド。 ２、特許請求の範囲のいずれかのプラスミドを有する細菌。 ２８、グラム陰性菌である請求の範囲第２７項の細菌。 ２９、エシェリヒア・コリである請求の範囲第２８項の細菌。 ３０、。−請求の範囲第１〜２０項又は第２１〜２６項のいずれＤ）のプラスミ ドを有Ｔる細菌を培礎し、そのプラスミドの遺伝子産物？その訓禰培）吻力１ら 得る、プラスミドＤＮＡの〕バ伝子厘物の製造方法。 ３１、培養が、細菌の少なくとも１００世代行われる請求の範囲第３０項の方法 。 ３２、プラスミドの喪失が２Ｘ１０　／ａＦｒＦＩ／世代より少ない請求の範囲 第３１項の方法。 ３３、プラスミドの喪失が　１０　／Ｍｆｈｒａ／世代より少ない請求の範囲＄ ３２項の方法。 ３４、プラスミドの喪失か５Ｘ１０　／ｍ胞／世代よつ少ない請求の範囲第３３ 項の方法。 ３５、主な要素としてＲｉ　ｐａｒ部位力）らなるＤＮＡフラグメント。 ５６、その上７ｊ　４　％に、Ｒ１ｐａｒ　部位Ａ、Ｒｉ　ｐａｒ耶位Ｂ１又は Ｒ１ｐａｒ品位人とＲｉ　ｐａｒ部位Ｂとの両番を有する請求の範囲第　３５項 ゛のＤＮＡフラグメント。 ３７、　Ｒ１ｐａｒ部位ＡとＦ１１ｐａｒ部位Ｂとからなり、そして約６ｋｂを 超えない長さ、持に約４　ｋｂで超えない長さ、こと１こ３ｋｋ＋を超えない長 さをもつ。請求の範囲第６６項のＤＮＡフラグメント。 ３８、Ｒ１ｐａｒ；Ｊ泣Ａからなり、約４　ｋｂを超えない長さ、待に約２．５ 　ｋ’ｏ　ｔｉえない長さ、ことに約２　ｋｂ牙詔えない長さ２有する。請求の 和１第３６項のｐ　：ｉＡフラグメント。 ３９、　ＲＩ　ｐａｒ　Ｊ位Ｂ７Ｊ）らｔフ、約２ｋｂ＋ｉ、ｉえない長さ、特 に約１．３ｋｂをζＢえない長さ、ことｊこ約１ｋｂを望えない長さをＨする請 求の・ｍｍＳ　３６項のＤ１ｉＡフラグメント。